JPH06501147A - 治療用に、組換方法で生産されたリパーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

治療用に、組換方法で生産されたリパーゼ発明の分野 本発明は、治療の用途における組換方法で生産された微生物リパーゼの使用に関 する。更に詳しくは、高純度の微生物リパーゼを、リパーゼ欠乏症の治療用の医 薬組成物の製造に対して提供する。更にこれらのリパーゼを含んでなる医薬組成 物が提供される。 背景 過去１０年間において、組換え技術は、工業的規模で高純度で多種類の製品の生 産を可能ならしめる新規な高収率プロセスを提供している。これらの製品の内の 一つにリパーゼが挙げられる。これらのリパーゼは、例えばエステル加水分解プ ロセス、エーテル合成プロセス、エステル交換プロセス、エーテル交換反応にお いて又は洗剤工業の分野において種々の技術的応用を見出してきている。しかし 、これらの組換え生産微生物リパーゼは、これまで治療的応用には見出すことは できなかった。 膵臓の酵素代替治療に対し、リパーゼ含存医薬製剤が入手可能である。これらの 製剤の大部分は、他の成分と共に、種々の酵素、プロテアーゼ、アミラーゼおよ びリパーゼの混合物である。と言うのは、これらの製剤の製造はブタの膵臓の酵 素の抽出に主に起因しているからである。このような代替製剤は、高価であり、 かつ治療的効果は、各製剤において相当に異なる。特に大抵の製造中のリパーゼ の量は、胃腸管から正常の脂質吸収を達成するためトリグリセリドの十分な酵素 的分解を確保するには余りに低くすぎる。更に、１９９０年５月１６日に発表さ れた出版物（ｐ９０−３１）並びに同日のフエドラル　レジスター　ノーチイス 　オフ　ボロボーズド　ルールメーキング（ＦＲ２０４３４−２０４３８）にお いて、米国のＦＤＡは、消化助剤として販売されている多数のこれらの酵素を禁 止することを提案している。と言うのは、当局がこれらの成分は有効性が認めら れない旨と非難したからである。 他のリパーゼを含有する医薬製剤は、リパーゼ産生真菌を微生物学的に培養し、 次いで培養ブロスから回収することにより産生されたリパーゼに基礎を置く　（ 例えばデンマーク公報第１６４２６５４号および英国公報第１４４２６７７号参 照）、これらのプロセスは低収率のプロセスであり、目的リパーゼのやっかいで 不経済的な単離および精製をもたらす。 国際特許出１１ｆ１１０８６１０１５３２からヒトの胃リパーゼタンパクは公知 である。更に、組換えＤＮＡ技術を用いこのタンパクを製造する方法が記載され ている。胃リパーゼは、勿論動物起源である。微生物における動物起源の遺伝子 の発現に固有に伴う問題は、工業的規模で多くのそのようなプロセスの使用と係 っている。これらの場合、やっかいで非経済的な単離および精製の方法は、十分 に精製されたリパーゼを得るため未だ必要とされる。 外分泌の膵臓の酵素を経口的に置き代えることは、重大な外分泌の膵臓不全症、 例えば嚢胞性線維症および慢性膵炎（これらは、吸収不良および脂肪便をもたら す）を患うヒトの治療において極めて重要である。治療により大便の頻度、性質 および大きさは改善されるが、しかし脂肪便は殆ど止まない。通常の酵素製剤は タンパクおよび炭水化物の吸収不良を著るしく改良しているけれども、それらは 脂肪の消化を部分的にのみ改善し得るだけである。脂肪便を完全に除去するため 、通常の膵臓の酵素製剤を理論的に十分に用いることのこの失敗の主な理由は、 胃酸とペプシンによりリパーゼが失活することにあった。 通常の膵臓の酵素製剤を用いた補助療法に対する他の療法は、酸安定化又は酸保 護製剤である。しかし、嚢胞性線維症を患う患者における十二指腸および小腸に おいて、一般にｐＨが減少しているので、腸溶皮製剤は通常の方法ではこれらの 内容物を放出しないであろう。 全体として、通常の膵臓の酵素製剤による治療は患者に対し重大な不利益をもた らす、と言うのは、不当に高量の粒質物／カプセルが必要とされ、嘔気と食欲減 退をもたらし、全体的に改善をもたらさないからである。 本発明の目的は、リパーゼ含量が増大し、リパーゼ欠乏症の治療用の医薬組成物 の製造のための高純度の組換方法により生産した微生物リパーゼを提供すること によりこれらの欠点を除去することにある。 発明の簡単な開示 今や、次の事実が見出された。すなわち、美味でかつ嘔気をもたらすこともなく ５ないし４０倍の大きさのオーダーでリパーゼ用量を増加させることが可能とな った。更に、驚くべきことに以下の内容が見出された。すなわち、結晶性リパー ゼの溶液は、非結晶性リパーゼの溶液よりもより安定であり、従って胃を通過す る間に活性の損失が少ない。 従って、本発明の第一の！様において、本発明は、リパーゼ欠乏症の治療に対す る医薬組成物の製造に用いる結晶性リパーゼを提供する。好ましいリパーゼは、 リゾムコール　マイへイ　リパーゼおよびフミコラ　リパーゼ、特にフミコラ　 ラヌギノザ　リパーゼである。好ましくは、これらのリパーゼは、組換方法で生 産されたリパーゼである。 第二の態様において、本発明はリパーゼ不全症の治療に対する医薬組成物の製造 用の組換方法で生産されたリパーゼを提供する。好ましくは、これらのリパーゼ は高い純度を有する。高純度のリパーゼを含んでなる、リパーゼ含有医薬組成物 を提供する。好ましくは、このリパーゼは結晶性であり、更に好ましくはリパー ゼはりシムコール　マイへイ　リパーゼ又はフミコラ　リパーゼ、特にフミコラ ラヌギノザ　リパーゼである。 第四の面において、本発明は組換え方法で生産されたリパーゼを含んでなるリパ ーゼ含有医薬組成物を提供する。好ましくは、このリパーゼはりシムコール　マ イセイ　リパーゼ又はフミコラ　リパーゼ、特にフミコラ　ラヌギノザ　リパー ゼである。更に特に、リパーゼは高純度である。 図面の簡単な説明 本発明を添付の図面を参照しつつ更に説明する。 図１は、三種の酵素Ａ、ＢおよびＣの基質の存在下ペプシンに対する安定性の比 較を示す。 図２〜５は、三種の酵素Ａ、　ＢおよびＣの種々の酵素に間する活性の比較を示 す。 基質は次の通り： 図２−大豆油 図３：たらの肝臓油 図４：ココナッツ油 図５ニオリーブ油 図面で言及した３種の酵素は次の通り：Ａ：組換方法で製造したフミコラ　ラヌ ギノザ　リパーゼ、Ｂ：組換方法で生産したりシムコール　マイへイ　リパーゼ 、Ｃ：パンクレアチン（パンクレアチン　ロスコ　エンテログラヌレート） 図６−７は、ｐＨ３〜４で非結晶性リパーゼと比較し結晶化リパーゼの安定性の 効果（残留効果（％）によって測定）を示す（Ａ：結晶性フミコラ　ラヌギノザ 　リパーゼ；Ｂ：非結晶性フミコラ　ラヌギノザ　リパーゼ〕 図６＝リパーゼ濃度　２５００ＬＵ　／　ｍ　ｌ　；インキュベーション　１０ 分。 図７：リバーゼ濃度　２０００ＬＵ／　ｎ＋１　；インキュベーション、３０分 。 発明の詳細な説明 血遼殖来 組換方法で生産された本発明の微生物リパーゼを用いた試験管内実験において以 下の内容が判明した。すなわち、活性の減少は胃腸管内で生起するけれども、本 発明の組換方法で生産された微生物リパーゼの活性は、投与されたリパーゼの量 を基準として比較すると、通常のバンクレアチン製剤と少なくとも同程度に高い 。従って、飲みこむことが不快でない用量で医薬組成物を得ることが可能である 。 胃腸管内で脂質吸収に関する治療効果に対する制限因子は、十二指腸および小腸 の上部で有効な活性リパーゼの量である。 胃を通過後に残存する酵素活性は、主に通過時間、酵素の酸安定性および例えば ペプシンの如き胃液内に存在するタンパク分解酵素の安定性に依存する。種々の 形態の腸溶皮製剤を用い、酵素は多少とも胃液内を通過中に保護されるが、しか し前述のように、腸溶皮製剤は、例えば十二指腸内および小腸の上部では、それ らの内容物を放出しないであろう。これは嚢胞性線維症を患う患者において十二 指腸および小腸内でｐＨが全体的に減少したからである。 図１において胃の状態のもとで行った、試験管内の安定性試験結果が示される。 食事の始めには、胃内のｐＨは約５に上昇し、次いで消化中ｐＨは約ｐＨ２に減 少する。安定性試験に対し、３〜４のｐＨが適切であると考えられる。結果は、 次の内容を示している。すなわち、本発明の組込方法で製造された微生物リパー ゼは通常の方法で製造二指腸に達するや否やその作用を発現し得る。実験的デー タは実施例２に示される。 試験管内試験から、以下の内容が見出された。すなわち、結晶性された。すなわ ち、結晶性リパーゼの溶液（すなわち、前者の結晶性リパーゼは十分に溶解して いる）は、ｐＨ３〜４で非結晶性リパーゼの溶液よりもより安定である。この効 果は、例４で示されている。 胃を通過中、活性の損失はリパーゼが結晶性の場合相当に減少し得る。 十二指腸および小腸において、リパーゼ活性は、存在する胆汁酸塩により大きく 影響される。例３の表２において胆汁酸塩の効果を示す実験結果が示される。更 に、本発明の組換方法で製造された微生物リパーゼと通常の方法で製造されたパ ンクレアチンの２種の特異活性間の比較として実験を行った。期待される如（、 通常の方法で製造されたパンクレアチン組成物は、胆汁酸の存在下、活性の増加 を示す。これは抽出プロセスから起因する補助因子の作用のためである。 驚くべきことに、そして図２〜５に図示するように、本発明の組換方法で生産さ れた微生物リパーゼは、投与したリパーゼの量を基準に比較して、通常の方法で 調製されたバンクレアチンの活性と少なくとも同程度に高いものである。純粋な リパーゼの量を基準にした特性を、例３に記載した方法を用いて測定し、結果を 図２〜５に示す０図２〜４から、ＡとＢの両方ともＣよりも秀れている。図５か ら、三種の製剤は同等の特性を示すことが分かる。 ゛で　れた　リパーゼ 「組換方法で生産された微生物リパーゼ」とは、組換体ＤＮＡ−技術により生産 されたリパーゼを意味し、リパーゼは微生物起源である。 本発明に関し、適当なリパーゼは、比較的低ｐｉで脂肪分解作用を有する組換方 法で生産された微生物リパーゼである。 組換方法で生産されたリパーゼは、天然に産生されるリパーゼと類似の構造的特 徴を有するか、それに機能的に等しいリパーゼ変異体又は突然変異化リパーゼで あってよい。 組換方法で生産された好ましい微生物リパーゼは、真菌、例えばフミコラ（Ｈｕ ｍｉｃｏｌａ）又はリゾムコール（Ｉｉｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）由来のリパーゼ、 又は酵母、例えばカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）由来のリパーゼ、又は細菌、例え ばプソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏ＊ｏｎａｎｓ）由来のリパーゼである。最も好 ましいリパーゼは、フミコラ　ラヌギノザ（ＨｕｍｉｃｏｌａＩａｎｕｇｉｎｏ ｓａ）又はリゾムコール　マイヘイ（Ｒｂｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）株 由来のリパーゼである。 組換方法で生産された微生物リパーゼは、例えばＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）、Ａ 、オリゼ（ｏｒｙｚａｅ）　％又はＡ、ニドランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）の如き アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）属に属する真菌細胞；例えばＳ 、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の如きサツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａ ｒｏｔｍｙｃｅｓ）の菌に属する酵母細胞、又はハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌ ａ）属、例えばＨ。 ポリモルフｙ　（ｐｏｌｙ＋＊ｏｒｐｈａ）　、又はマイシア（ｐｈｉｃｈｉａ ）属、例えばＰ６バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のメチロトロピック（ｍ ｅｔｈｙｌｏｔｒｏ−ｐｈ　ｉｃ）酵母；又は例えば菌株バシラス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ）　、例えばＢ、ズブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はＢ、レングス（Ｉ ｅｎｔｕｓ）に属する細菌細胞；微生物リパーゼをコードする遺伝子で変質転換 された細胞を発酵させることにより得ることができる。最も好ましい宿主生物は 、アスペルギルス　オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）の群であ る。 １．３−位置特異性リパーゼとは、トリグリセリドの外側位置で脂肪酸の加水分 解の方を好むようなリパーゼである。哺乳動物のバンクレアチン　リパーゼは、 １．３−位置特異性リパーゼであり、そしてそのようなリパーゼは、リゾムコー ル（Ｒｈｉｚｏ＋ｗｕｃｏｒ）　ｓｐ、およびフミコラ（Ｈｕ＋ｗｉｃｏｌａ） ｓｐ、由来のリパーゼである。 本発明の微生物起源のリパーゼおよび組換技術によるそれらの生産は、例えばヨ ーロッパ公告番号２３８，０２３および３０５．２１６に記載されており、それ らは参考のため本発明に導入されている。 リパーゼ変異体又は突然変異したリパーゼは、親遺伝子又はその誘導体のＤＮＡ 配列の変更により得ることができる。リパーゼをコードするＤＮＡヌクレオチド 配列を適当な宿主器官内で適当なベクターに挿入する場合、リパーゼ変異体又は −突然変異したリパーゼは発現されてそして生産され得る。宿主生物は、親遺伝 子が起源をもつ生物と同一である必要は必ずしもない、遺伝子に変異を導入する 方法は、周知であり、例えばヨーロッパ特許出＠　４０７．２２５を参照のこと 。 好ましいリパーゼ変異体又は突然変異化リパーゼは、ａ微生物リパーゼから得る ことができる。好ましいＵ様において、親リパーゼは、真菌、例えばフミコラ（ Ｈｕｍｉｃｏｌａ）又はリゾムコール（Ｒｈｉｚｏ−ａ＋ｕｃｏｒ）株、好まし くはフミコラ　ラヌギノザ（Ｈｕｓｉｃｏｌａ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）株又は リゾムコール　マイヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）株から由来す る。他の好ましい態様において、親リパーゼは、酵母から由来し、例えばカンジ ダ（Ｃａｎｄｉｄａ）から由来する。更に好ましい態様において、親リパーゼは 、細菌から由来し、例えばプソイドモナス（Ｐｓｅ−ｕｄｏｍｏｎａｓ）株から 由来する。より好ましいリパーゼ変異体又は突然変異化リパーゼは、リパーゼ分 子の優先的に親油性の延びた結合ポケットに位置する活性セリン残基を含むトリ プシン様触媒性３回対称軸を含んでなるリパーゼ変異体又は親リパーゼであり、 ここにおいて脂質接触帯の静電荷および／又は疎水性は、活性セリン残基を含有 するリパーゼ構造付近に位置する残基を含んでおり、この残基は基質との相互作 用において又は加水分解中に関与しているが、それは、−個以上の負に荷電した アミノ酸を欠失するか又はそれを中性の又は正に荷電したアミノ酸残基により置 換することにより、および／又は正に荷電したアミノ酸残基により１種以上の中 性アミノ酸を１換することにより、および／又は一種以上の疎水性アミノ酸を欠 失するか、それを疎水性アミノ酸により置換することにより変化されている。 単離、精製および結晶化は常法により行うことができる。好ましい態様において 、結晶化は、リパーゼのｐｒ付近のレベルにｐＨを調節することによりかつ低濃 度の塩の存在、すなわち１０ｍ５／ｃｉ又はそれ以下で行なわれる。 Ｋ１■底璽 本発明の医薬組成物には、本発明の組換方法により生産された微生物リパーゼを 含むような通常の医薬組成物および粉末、粒質物および液体を含む経口投与に適 した組成物；用量処方した又は非用量処方した組成物；単一成分もしくは多成分 処方した組成物等が含まれる。本発明の医薬組成物は当業者に公知の補助物質を 含むことができる。 本発明の組換方法により生産された微生物リパーゼは、１日当たり　０．３〜２ ０ミリオン［Ｕ、好ましくは１日当たり０．５〜１０ミリオンＩＵ、より好まし くは１日当たり１〜１０ミリオン■Ｕの範囲内の用量で投与できる。 本発明の好ましい医薬組成物は、用量処方した被包性単一成分の組成物および用 量処方した被包性の多成分の組成物であり、更にプロテアーゼおよび／又はカル ボヒドラーゼを含んでなる。 リパーゼ不全症の治療に対し本発明の組込方法で生産された微生物リパーゼを用 いると、５〜４０倍の大きさのオーダーでリパーゼ用量の増加が達成できる。従 って、通常の製造した組成物に関して１日当たり９０〜９００個カプセルである ことと対比して、１日に２〜２０個のカプセルを採ることにより、適当な１日の リパーゼ単位（１〜１０ミリオン■Ｕ７日）を得ることが今や可能である。 本発明の他の好ましい医薬組成物は、経口投与用の液体組成物を含有するリパー ゼである。このような組成物において、リパーゼはリパーゼ結晶の！ｆＡ濁液と して製剤化できる。所望により、これらの組成物は又、香味剤および甘味剤を含 む、液体経口組成物中に通常存在する添加剤をも含有する。 より特異的な面において、本発明の医薬組成物は、規定食の窒素化合物および／ 又は炭水化物を含んでなる経口投与用の液体組成物を含有するリパーゼである。 規定食の窒素化合物は、タンパク加水分解物、好ましくは植物性タンパク加水分 解物、例えば大豆タンパク加水分解物又は大豆、なたね、からす麦、ごまおよび えんどう又はこれらの混合物からのタンパク加水分解物であってよい、好ましく は、タンパク加水分解物は、液体組成物中でにかみなしであるべきである。好ま しい態様において、この医薬組成物は又香味剤、甘味剤、鉱物、微量物質、ビタ ミン、および／又は電解質を含む経口の規定食製品中に通常存在する添加剤をも 含有する。この方法で、全ての栄養のおよびオルガルシブティク（ｏｒｇａｎｏ 　１ｅｐｔｉｃ）な要求に合致させ得る。 丈ベニ亙棗位 この適用において、リパーゼ活性はリパーゼ単位（Ｌｌｌ）によって記載されて おり、これは、標準の条件（すなわち、トリブチリン基質、３０．０’Ｃ１およ びｐＨ７，０）のもと、毎分１μｍｏｌの適定可能な酪酸を放出する酵素の量と して定義される。フォルターＡＦ９５／　５、（この１０−分析を記載）は要求 によりノボ　ノルディスク社（デンマーク国）から要求により入手可能であり、 参考のため本明細書中に導入されている。 次の実施例は本発明を更に説明するものである。 例１ 微生物起源のリパーゼを、ヨーロッパ公告公報２３８．０２３および３０５．２ １６に記載の如く組込方法技術により得た。限界濾過コンセントレートを８％乾 燥物質まで希釈し、２５０ｇのＮａｚＳＯｎ／ｋｇコンセントレートで沈殿させ た。沈殿物を濾過し、フィルターケークを再熔解した。 リパーゼ溶液を、２０％乾燥物質レベルに限界濾過し、次いで塩をダイアフィル トレージコン（ｄｉａｆｉｌｔｒａＨｏｎ）によって除去し約５１１Ｓ／Ｃ１１ のコンダクタンスを存するコンセントレートを得た。次いでリパーゼ活性過に委 ね次いでジャームマイルトレーシヲン（ｇｅｒｍｆ　ｉ　Ｉ　ｔ−ｒａｔｉｏｎ ）により′ｆｊ！過に委ねた。得られたリパーゼ溶液は約１８％の乾燥物質を含 有していた。得られたリパーゼ溶液は約１８％乾燥物質を含有していた。 非結晶性リパーゼは、このリパーゼ溶液の凍結乾燥によって得られた。 結晶性リパーゼを得るため、リパーゼ溶液のｐＨを、クエン酸を用いて４．３に 調節し、ついで２０℃で１５時間後結晶化を完成した。濾過後、結晶を凍結乾燥 した。 ＳＯ５−ＰＡＧＥと比較すると、二種の調製品、結晶性リパーゼと非結晶性リパ ーゼは、同一のタンパク様相を示した。 例２ 試験管内安定性試験を、胃の条件下、すなわち、ｐ）１３〜４で３７℃で０．５ 時間、並びに基質（オリーブ油）およびペプシンの存在下で行った。本発明の組 換方法で生産した微生物リパーゼ（非結晶性）を通常の方法で得られたパンクレ アチンと比較した。調製は次の如く。 Ａ：組換方法で生産したフミコラ　ラヌギノザ　リパーゼＢ：＆ｌｌ換方法で生 産したりシムコール　マイへイ　リパーゼＣ：パンクレアチン（パンクレアチン 　ロスコ　エンテログラニュレート） モデルの基質／インキュベージテン混合物は次の如く含有ニオリーブ油　３．３ ％ リパーゼ　５００〜１２００Ｌｔｌ／■１ペプシン　１■ ３７°Ｃで０．５時間インキュベージコン後、残留活性をＬＵ分析（トリブチリ ン基質、ｐＨ１，３０°臥フオルダーＡＦ９５１５（ノボ　ノルディスク社（デ ンマーク国）から要求により入手可）により測定した。結果を図面に示す。 例３ 試験管内活性試験におけるこの例において、胆汁酸塩のリパーゼ活性に対する影 響を調べる。更に、本発明の組換方法で生産された微生物リパーゼのリパーゼ活 性を、通常の方法で調製されたパンクレアチン調製品の活性と比較する。 実験は、生体内（−二指腸内）で起こる条件に近い条件、例えば関係ｐＨ５，５ ，３７℃でかつ胆汁酸塩の生理的濃度、すなわち８ａ＋Ｍを用いて行った。胆汁 酸塩組成を表１に示す。 旦辻鼓１組底 グリコケノデオキシコール酸　２４．５％グリコデオキシコール酸　１１．９％ タウロコール酸　１２．６％ タウロケノデオキシコール酸　１３．６％ヒトにおいて、食事中に見出される大 部分のトリグリセリドは、長鎖脂肪酸を含有する。従って、リパーゼ活性は、鎖 長（鎖中炭素の数）の函数として活性を決定するため種々の天然の基質に関して 調査した； オリーブ油（Ｃ，ａ） 精製大豆油（Ｃ１６，旦旦） ココナツツ油（Ｃ１２，Ｃ１４） たら肝油（Ｃ１，６，Ｃ１８，Ｃ２０，Ｃ２２）各トリグリセリドを１０％のア ラビアゴムで３分間乳化し次いで蒸留水で４％の最終オイル濃度に希釈した。 酵素を、基質混合物と共にｐＨ５，５で４分間インキュベトした。完全に遊離な 脂肪酸滴定を、インキュベーションｐＨからｐＨ９，０にシフトさせることによ り行った。ｐＨ９，０での高リパーゼ活性の故に、各測定に対し酵素を用い比較 実験を平行して行った（インキュへ−ノョン時間なし）、次いでその値を分析か ら減じた。 リパーゼ活性は、酵素粉末１■当たりのリパーゼ単位（Ｌｌｌ）としての特異活 性を用いて表わされ、そして結果は表２に示される。 表１ 々の　に・する　゛ オリーブ油　２５００　２４５０　２２００　１５４０　１１　２４．５（１０ ０％）（９８％）（１００％）（７０％）　（１００％）　（２２３％）大豆油 　３０９０　９２０　２７００　１３８０　２．６　１０．５（１００％）（３ ０％）（１００％）（５１％＞　（１００％）　（４０４％）たら肝油　２３７ ５　６３０　１５２０　４１０　５．０　５．６（１００％）（２７％＞　（１ ００％）（２７％）　（１００％）（１１２％）Ａ：組換方法で生産されたフミ コラ　ラヌギノザ　リパーゼＢ：組換方法で生産されたりシムコール　マイへイ 　リパーゼＣ：パンクレアチン（パンクレアチン　ロスコ　エントログラヌ特異 活性は１■の製剤当たりの単位として表わされる。 期待される如く、通常の方法で生産されるパンクレアチン組成物は、抽出プロセ スから由来する補助因子の作用のため、胆汁酸塩の存在下で活性を増加する。 例４ この例は、非結晶性リパーゼと比較して結晶性リパーゼの安定化効果を実証する 。例１に従って得られたフミコラ　ラヌギノザ　リパーゼをこの実験で用いる。 ３．３％のオリーブ油を含有するモデル基質／インキュベーション混合物を用い た。リパーゼをインキュベージコンの最初の２．３分間以内に基質／反応混合物 中に溶解した。３７″Ｃで１０分間および３０分間のそれぞれのインキュベージ コンの後、残留活性を１０分析（トリブチリンｉｔ；ｐＨ７；３０℃、フォルタ ーＡＦ９５１５　（ノボ　ノルディスク、デンマーク国より要求により入手可） に記載の如く）により測定した。 図６および図７において、これらの実験結果を示す（図６：リパーゼ濃度２５０ ０ＬＵ／ｍｌ、インキュベーション１０分；図７：リパーゼ濃度２０００ＬＵ／ 曽１１インキュベーション３０分）。これらの図面において、Ａはフミコラ　ラ ヌギノザ　リパーゼを示し、Ｂは非結晶性フミコラ　ラヌギノザ　リパーゼを示 す。図面から明らかなように、１０分および３０分後に、結晶性リパーゼはｐＨ ３〜４、特にｐＨ３でより安定である。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】 補正書の翻訳文提出署 （特許法第１８４条の８） 平成４年１）−月３日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．リパーゼ欠乏症の治療用の医薬組成物の製造用の結晶性リパーゼ。 ２．リパーゼが１，３−位置特異性である、請求の範囲第１項記載の結晶性リパ ーゼ。 ３．リパーゼが、リゾムコール　マイヘイ　リパーゼである、請求の範囲第２項 記載の結晶性リパーゼ。 ４．リパーゼが、フミコラ　リパーゼである、請求の範囲第２項記載の結晶性リ パーゼ。 ５，リパーゼが、フミコラ　ラヌギノザである、請求の範囲第４項記載の結晶性 リパーゼ。 ６．リパーゼが、組換方法により生産されたリパーゼである、請求の範囲第１〜 ５項のいずれかに記載の結晶性リパーゼ。 ７．リパーゼが、フミコラ　リパーゼをコードする遺伝子で形質転換されたアス ペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｉｉｕｓ）種の菌株の発酵によって得られる組換方 法により生産されたリパーゼである、請求の範囲第１，２，４又は５項のいずれ かに記載の結晶性リパーゼ。 ８．リパーゼが、フミコラ　リパーゼをコードする遺伝子で形質転換されたアス ペルギルス　オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）の菌株の発酵に よって得られる組換方法により生産されたリパーゼである、請求の範囲第７項に 記載の結晶性リパーゼ。 ９．リパーゼ不全症の治療用医薬組成物の製造用の、組換方法により生産された 微生物リパーゼ。 １０．リパーゼが高純度である、請求の範囲第９項記載の組換方法により生産さ れた微生物リパーゼ。 １１．活性リパーゼタンパクが調製品の乾物の５０％（ｗ／ｗ）以上を示すこと を特徴とする、請求の範囲第１０項記載の組換方法により生産された微生物リパ ーゼ。 １２．活性リパーゼタンパクが調製品の乾物の７０％（ｗ／ｗ）以上を示すこと を特徴とする、請求の範囲第１０項記載の組換方法により生産された微生物リパ ーゼ。 １３．活性リパーゼタンパクが調製品の乾物の９０％（ｗ／ｗ）以上を示すこと を特徴とする、請求の範囲第１０項記載の組換方法により生産された微生物リパ ーゼ。 １４．活性リパーゼタンパクが調製品の乾物の９５％（ｗ／ｗ）以上を示すこと を特徴とする、請求の範囲第１０項記載の組換方法により生産された微生物リパ ーゼ。 １５．活性リパーゼタンパクがタンパクの全量の乾物の９９％（ｗ／ｗ）以上を 示すことを特徴とする、請求の範囲第１０項記載の組換方法により生産された微 生物リパーゼ。 １６．リパーゼが結晶性である、請求の範囲第１０項記載の組換方法により生産 された微生物リパーゼ。 １７．リパーゼが１，３位置特異性である、請求の範囲第９〜１６項のいずれか に記載の組換方法により生産された微生物リパーゼ。 １８．リパーゼが、リゾムコール　マイヘイ　リパーゼである、請求の範囲第１ ７項記載の組換方法により生産された微生物リパーゼ。 １９．リパーゼが、フミコラ　リパーゼである、請求の範囲第１７項記載の組換 方法より生産された微生物リパーゼ。 ２０．リパーゼが、フミコラ　ラヌギノザである、請求の範囲第１９項記載の組 換方法より生産された微生物リパーゼ。 ２１．リパーゼがフミコラ　リパーゼをコードする遺伝子で形質転換されたアス ペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種の菌株の発酵によって得られる組換方 法により生産されたリパーゼである、請求の範囲第１９又は２０項のいずれかに 記載の組換方法により生産された微生物リパーゼ。 ２２．リパーゼが、フミコラ　リパーゼをコードする遺伝子で形質転換されたア スペルギルス　オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）の菌株の発酵 によって得られる組換方法により生産されたリパーゼである、請求の範囲第２１ 項に記載の組換方法により生産された微生物リパーゼ。 ２３．リパーゼが変異体又は突然変異化リパーゼである、請求の範囲第９〜２２ 項のいずれかに記載の組換方法により生産されたリパーゼ。 ２４．活性リパーゼタンパクが、リパーゼ調製品の５０％（ｗ／ｗ）以上の乾物 を表わすものであることを特徴とする、リパーゼ含有医薬組成物。 ２５．活性リパーゼタンパクが、リパーゼ調製品の７５％（ｗ／ｗ）以上の乾物 を表わすものであることを特徴とする、リパーゼ含有医薬組成物。 ２６．活性リパーゼタンパクが、リパーゼ調製品の９０％（ｗ／ｗ）以上の乾物 を表わすものであることを特徴とする、リパーゼ含有医薬組成物。 ２７．活性リパーゼタンパクが、リパーゼ調製品の９５％（ｗ／ｗ）以上の乾物 を表わすものであることを特徴とする、リパーゼ含有医薬組成物。 ２８．活性リパーゼタンパクが、リパーゼ調製品のタンパクの全量の９９％（ｗ ／ｗ）以上を表わすものであることを特徴とする、リパーゼ含有医薬組成物。 ２９．リパーゼか結晶性である、リパーゼ含有医薬組成物。 ３０．リパーゼが組換方法により生産されたリゾムコール　マイヘイ　リパーゼ である、請求の範囲第２９項記載のリパーゼ含有医薬組成物。 ３１．リパーゼが組換方法により生産されたフミコラ　リパーゼである、請求の 範囲第２９項記載のリパーゼ含有医薬組成物。 ３２．リパーゼが組換方法により生産されたフミコラ　ラヌギノザリパーゼであ る、請求の範囲第３１項記載のリパーゼ含有医薬組成物。 ３３．リパーゼが、変異体又は突然変異したリパーゼである、請求の範囲第２４ 〜３２項のいずれかに記載のリパーゼ含有医薬組成物。 ３４．更にプロテアーゼおよび／又はカルボヒドラーゼを含んでなる、請求の範 囲第２４〜３３項のいずれかに記載のリパーゼ含有医薬組成物。 ３５．被包されている、請求の範囲第２４〜３４項のいずれかに記載のリパーゼ 含有医薬組成物。 ３６．好ましくは香味剤および／又は甘味剤を含む、経口投与用の液体組成物で ある、請求の範囲第２４〜３４項のいずれかに記載のリパーゼ含有医薬組成物。 ３７．好ましくは香味剤、甘味剤、鉱物、微量元素、ビタミンおよび／又は電解 質を含めて規定食の窒素化合物および／又は炭水化物を含んでなる経口投与用の 液体組成物である、請求の範囲第２４〜３４項のいずれかに記載のリパーゼ含有 医薬組成物。 ３８．リパーゼが、組換方法により生産された微生物リパーゼである、リパーゼ 含有医薬組成物。 ３９．リパーゼが組換方法により生産されたリゾムコール　マイヘイ　リパーゼ である、請求の範囲第３８項記載のリパーゼ含有医薬組成物。 ４０．リパーゼが組換方法により生産されたフミコラ　リパーゼである、請求の 範囲第３８項記載のリパーゼ含有医薬組成物。 ４１．リパーゼが組換方法により生産されたフミコラ　ラヌギノザリパーゼであ る、請求の範囲第３８項記載のリパーゼ含有医薬組成物。 ４２．リパーゼが、組換方法により生産されたフミコラ　ラヌギノザ　リパーゼ にである、請求の範囲第４０項記載のリパーゼ含有医薬組成物。 ４３．リパーゼが高純度である、請求の範囲第３８〜４１項のいずれかに記載の リパーゼ含有医薬組成物。 ４４．活性リパーゼタンパクが、リパーゼ調製品の５０％（ｗ／ｗ）以上の乾物 を表わすものであることを特徴とする、請求の範囲第４２項記載のリパーゼ含有 医薬組成物。 ４５．活性リパーゼタンパクが、リパーゼ調製品の７５％（ｗ／ｗ）以上の乾物 を表わすものであることを特徴とする、請求の範囲第４２項記載のリパーゼ含有 医薬組成物。 ４６．活性リパーゼタンパクが、リパーゼ調製品の９０％（ｗ／ｗ）以上の乾物 を表わすものであることを特徴とする、請求の範囲第４２項記載のリパーゼ含有 医薬組成物。 ４７．活性リパーゼタンパクが、リパーゼ調製品の９５％（ｗ／ｗ）以上の乾物 を表わすものであることを特徴とする、請求の範囲第４２項記載のリパーゼ含有 医薬組成物。 ４８．活性リパーゼタンパクが、リパーゼ調製品のタンパクの全量の９９％（ｗ ／ｗ）以上を表わすものであることを特徴とする、請求の範囲第４２項記載のリ パーゼ含有医薬組成物。 ４９．リパーゼが、リパーゼ変異体又は突然変異したリパーゼである、請求の範 囲第３８〜４７項のいずれかに記載のリパーゼ含有医薬組成物。 ５０．更にプロテアーゼおよび／又はカルボヒドラーゼを含んでなる、請求の範 囲第３８〜４８項のいずれかに記載のリパーゼ含有医薬組成物。 ５１．被包されている、請求の範囲第３８〜４９項のいずれかに記載のリパーゼ 含有医薬組成物。 ５２．好ましくは香味剤および／又は甘味剤を含んだ経口投与用の液体組成物で ある、請求の範囲第３８〜４９項のいずれかに記載の液体含有医薬組成物。 ５３．好ましくは香味剤、甘味剤、鉱物、微量元素、ビタミンおよび／又は電解 質を含めて規定食の窒素化合物および／又は炭水化物を含んでなる経口投与用の 液体組成物である、請求の範囲第３８〜４９項のいずれかに記載のリパーゼ含有 医薬組成物。