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JPH05502031A - Ｒｎａ活性および遺伝子発現を検出および変調するための組成物および方法 - Google Patents

Ｒｎａ活性および遺伝子発現を検出および変調するための組成物および方法

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JPH05502031A
JPH05502031A JP3503393A JP50339391A JPH05502031A JP H05502031 A JPH05502031 A JP H05502031A JP 3503393 A JP3503393 A JP 3503393A JP 50339391 A JP50339391 A JP 50339391A JP H05502031 A JPH05502031 A JP H05502031A
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rna
moiety
group
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エッカー，デービッド・ジェイ
ギノッソ，チャールズ・ジョン
アセベド，オスカー・レオバード
カワサキ，アンドリュー・マモト
ラマサミー，カンダサミー
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Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＲＮＡ活性および遺伝子発現を検出および変調するための組成物および方法 発明の背景 本発明は、ＲＮＡの活性を検出および変調するための材料および方法に関するも のである。本発明は一般に、′アンチセンス′化合物、すなわちＲＮＡのヌクレ オチド配列と特異的にハイブリダイズしうる化合物の分野に関するものである。
好ましい形態においては、本発明は疾病の療法処置の達成、実験系における遺伝 子発現の調節、アンチセンスとＲＮＡの相互作用を利用したＲＮＡおよびＲＮＡ 産生物のアッセイ、疾病の診断、蛋白質産生の変調、ならびに部位特異的なＲＮ Ａ開裂のためのオリゴヌクレオチドの設計、合成および利用ならびにその方法を 目的とする。
大部分の疾病状態を含めて哺乳動物における大部分の身体状態が蛋白質により影 響されることは周知である。直接に、またはそれらの酵素機能により作用するこ れらの蛋白質は、動物およびヒトにおける多くの疾病に大幅に関与する。古典的 な療法は、疾病の原因となる、または疾病を増強する蛋白質の機能を緩和するた めに、一般にそれらの蛋白質との相互作用に注目した。しかし最近では、蛋白質 の合成を指令する分子、すなわち細胞内ＲＮＡとの相互作用によりそれらの蛋白 質の実際の産生を緩和する試みがなされている。蛋白質の産生を妨げることによ り、最大の効果および最小の副作用を伴う療法結果を得ることが期待されている 。このような療法の一般的な目的は、望ましくない蛋白質産生をもたらす遺伝子 の発現を妨げ、または他の形で変調することである。
特異的な遺伝子発現を阻止するための１方法は、オリゴヌクレオチドおよびオリ ゴヌクレオチド類似体を′アンチセンス′剤として用いるものである。特異的な 標的であるメツセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ配列に対し相補的なオリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチド類似体が用いられる。多数の研究者がこのような 試みを報告している。関連の総説には下記のものが含まれる；スタインおよび： ｌ−ｘン（Ｃ，Ａ、５ｔａｉｎ、Ｊ、Ｓ、Ｃｏｈｅｎ）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ、ｖｏｗ、４８．ｐ、２６５９−２６６８　（１９８８）；ワルダー （Ｊ、Ｗａｌｄｅｒ）、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ＶＯｌ、２ ゜ｐ、５０２−５０４　（１９８８）；７−カスーセキユラ（Ｃ，Ｊ、Ｍａｒｃ ｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ）、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ−１７２ ，ｐ２８９−２９５　（１９８８）ニシン（Ｇ、Ｚｏｎ）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ ｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｗ、６．　ｐ、１３１−１４５ 　（１９８７）ｌシン（Ｇ、Ｚｏｎ）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｆｃａｌ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ。
ｖｏｌ、５．　ｐ、５３９−５４９　（１９８８）；ファン・デル・クロル、モ ルおよびシュトライチェ（Ａ、Ｒ，Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ、Ｊ、　Ｎ、　Ｍ ｏ１．　Ａ。
Ｒ，５ｔｕｉｔｊｅ）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｖｏｌ、６．１）、９５ ８−９７３　（１９８８）；ならびにルーズ・ミッチェル（Ｄ、Ｓ、Ｌｏｏｓｅ −Ｍｉｔｃｈｅｌ＋）、ＴＩＰＳ、ｖｏｌ、９．Ｉ）、４５−４７　（１９８８ ）。以上はそれぞれ一般的なアンチセンス理論および先行技術に関連する背景を 提示する。
以上のようにアンチセンス法は、一本鎖ｍＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡに比較的短 いオリゴヌクレオチドを相補的にハイブリダイズし、これによってこれらの細胞 内核酸の正常な本質的機能を混乱させることを目的とする。ハイブリダイゼーシ ョンはＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡのワトソンークリック塩基対へのオリゴヌクレ オチドの配列特異的水素結合である。これらの塩基対を互いに相補的であると言 う。
アンチセンス療法に対する従来の試みにより、特異的ｍＲＮＡにハイブリダイゼ ーションによって特異的に結合すべく設計されたｍ−特異的にハイブリダイズし うる一一オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が提供された。
これらの類似体は多数の機構のいずれかにより、選ばれたｍＲＮＡの活性を阻害 するｍ−そのｍＲＮＡによりコードされる蛋白質が産生される翻訳反応を妨害す るｍ−ごとを目的とする。妨害されたｍＲＮＡ配列によりコードされる特異的蛋 白質の産生を阻害することにより、療法上の利点が得られると期待されている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドにそれらの療法活性を高めるために多数の化学 的修飾が導入された。これらの修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞 浸透を高め、体内でオリゴヌクレオチド類似体の構造または活性を劣化または妨 害するヌクレアーゼその他の酵素からそれらを安定化し、標的ＲＮＡへのそれら の結合を増強し、標的ＲＮＡに配列特異的に結合した時点で破壊モード（終止イ ベント）をもたらし、およびそれらの薬力学的特性を改善すべく設計される。
しかし現在では、−膜化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド療法または診断 の様式は見出されていない。従来の試みの最も重大な欠陥は、適切なハイブリダ イゼーションが起こった時点で終止イベントが全く行われないこと、またはオリ ゴヌクレオチドが有効濃度で細胞に取り込まれないため有用な力価を達成し得な いほど非効率的な終止イベントしか行われないことである。現在得られるアンチ センスオリゴヌクレオチドの活性は、効果的な療法、研究試薬、または診断用に は実際上不十分である。従って効果的な療法および診断用アンチセンスとして利 用しうるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体が長年来要望され 、かつ依然として要望されている。
この長年来の要望は、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法および診断の分野に おける先行技術によっては満たされていない。他は、妥当な利用度において療法 および診断に同時に有効な材料を提供し得なかった。
当初は、療法のためのアンチセンス法には２種類の機構または終止イベントが作 動するにすぎないと考えられていた。これらはハイブリダイゼーション阻止機構 、および細胞性酵素であるリボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）による、ハイブ リダイズしたＲＮＡの開裂である。しかし、標的ＲＮＡの混乱にはさらに′天然 の′イベントが関与している可能性があると思われる。
これらの天然のイベントについてはコーエン（Ｃｏｈｅｎ）により０１１ｇ。
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｊｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆＧ ｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ｉｏｎ％ＣＲＣブレス社、フロリダ州ポカ・レイトン （１９８９）に述べられている。第１のハイブリダイゼーション阻止は、阻害剤 オリゴヌクレオチドが標的核酸に結合し、こうして単純な立体障害により核酸へ トを表す。メチルホスホネート−オリゴヌクレオチド：ミラーおよびツォ（Ｐ。
Ｓ、Ｍｉ　ｌ　ｌｅｒ、Ｐ、Ｏ，Ｐ、Ｔｓ’Ｏ）、Ａｎｔ　１−Ｃａｎｃｅｒ　 Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ、２：１１７−１２８　（１９８７）、ならびにα−ア ノマーオリゴヌクレオチドは２種類の最も広範に研究されたアンチセンス剤であ り、ハイブリダイゼーション阻止により核酸の機能を混乱させると考えられる。
第２の′天然′型の終止イベントは、ＤＮＡ型オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡ の間に形成されるヘテロ二本鎖によるＲＮアーゼＨの活性化、およびこれに続く 酵素による標的ＲＮＡの開裂である。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ チド類似体−一デオキシリボ型でなければならないｍ−は標的ＲＮＡとハイブリ ダイズし、この二本鎖がＲＮアーゼＨ酵素を活性化してＲＮＡ鎖を開裂させ、こ うしてＲＮＡの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエート−オリゴヌクレオチ ドがこの型のアンチセンス終止イベントによる作動すると考えられる最も顕著な 例である。ワルダーおよびワルダー（Ｒ，Ｙ、Ｗａｌｄｅｒ、Ｊ、Ａ、Ｗａｌｄ ｅｒ）がＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｃ ｌｅｒｎｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕ、Ｓ、Ａ、、、Ｖｏｌ 　８５゜ｐ、５０１１−５０１５　（１９８８）に、またスタイン、スバシンゲ 、シェノヅカおよび：ｌ−ｚン（Ｃ，Ａ、５ｔｅｉｎ、Ｃ，Ｓｕｂａｓｉｎｇｈ ｅ、に、５ｈｅｎｏｚｕｋａ、Ｊ、Ｃｏｈｅｎ）がＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、１６．ｐ、３２０９−３２２１　（１９８８）に 、Ｒ，ＮアーゼＨがアンチセンス法において果たす役割につき記載している。
′天然′終止イベントにより力価を高めるために最も多く用いられるオリゴヌク レオチド修飾は、リン原子における修飾である。ハイブリダイゼーション阻止を 保証する試みに際して開発された１オリゴヌクレオチド類似体は、メチルホスホ ネート−オリゴヌクレオチドである。この種類のオリゴヌクレオチド類似体−一 オリゴヌクレオチドの通常の構造が修飾されて１または２以上のメチルホスホネ ート置換構造体になったという意味での類似体−一は広範に報告されている。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏｌ、６．　ｐ、３００９ −ｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ、１８．　ｐ、５１３４−５１４３　（１９７９）； ジャヤラマン、マクバーランドおよびツオ（Ｋ、Ｊａｙａｒａｍａｎ、に、Ｍｃ ｐａｒｌａｎｄ、Ｐ、　Ｏ，Ｐ、　Ｔｓ’ｏ）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ 　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　 ｔｈｅｃｈｅｒｒ＋１ｓｔｒｙ、ｖｏｌ、２０．Ｉ）、１８７４−１８８０　（ １９８１）：ミ遺伝子発現の阻害は、たとえばティラド、ホーレイ、ワレニウス およびギプソンルホスホネート修飾されたオリゴヌクレオチドはＲＮＡにハイブ リダイズした際にＲＮアーゼＨを活性化せず、厳密にハイブリダイゼーション阻 止モードでのみ作動する。この修飾群のオリゴヌクレオチドは一般に標的ＲＮＡ に対する結合性が劣り、これは各リン原子におけるＲ／Ｓ立体異性体、およびホ スフェート結合レオチドのホスフェート主鎖のリン原子に対する他の種類の修飾 を行った。最もル・メイレルおよびファンブーム（ＨＣＰＦ　Ｒｏ、ｅｌｅｎ、 Ｅ、ＤｅＶｒｏ。
ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍａｒｅｌ、Ｊ、Ｈ，ＶａｎＢｏｏｍ）、Ｎｕｃ Ｉｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏｗ、１６．Ｄ、７６３３−７６４ Ｍ、Ｐ、Ｃ１ｖｅｊｒａ、Ａ、Ｈ，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、Ｐ、Ｓ、５ａｒｉｎ、Ｐ 。
Ｃ，Ｚａｍｅｃｎｉｋ）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉ。
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅＵ 、Ｓ、、ｖｏｌ、８４．　ｐ、７７０６−７７１０　（１９８７）；ならびニマ ーカスーセキュラ、ウニルナ−、シノヅカ、シンおよびキナン（Ｃ，Ｊ、　Ｍａ ｒｃｕｓ−５ｅｋｕｒａ、Ａ、Ｍ、Ｗｏｅｒｎｅｒ、に、５ｈｉｎｏｚｕｋａ、 Ｇ。
を果たしている可能性はあるが、ＲＮＡへのハイブリダイゼーションに際してＲ ＮアーゼＨの活性化によりＲＮＡを終結すると考えられる。
このような用途に用いるホスホロジチオエートは、プリル、ヤング、マおよびカ ル−”ｊ−−（Ｗ、　Ｋ、　Ｄ、　Ｂｒｉ　ｌ　１．　Ｊ、　Ｙ、　Ｙａｎｇ、 　Ｙ、　Ｘ、　Ｍａ、　Ｍ。
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏｌ、１４．　ｐ、３４８７ −療法薬としての用途はすべて、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド 類似体が大量に合成されること、細胞膜を通して輸送されること、または細胞に より取り込まれること、標的ＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズすること、次 いで核酸の機能を終結または混乱させることを要求する。これらの重要な機能は ヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの初期安定性に依存する。
これらの目的、特にアンチセンス療法に対するオリゴヌクレオチドの重大な欠陥 は、投与されたオリゴヌクレオチドが細胞内および細胞外に存在する多種多様な 遍在性核酸分解酵素−一以下″ヌクレアーゼ′と呼ぶｍ−により酵素分解される ことである。修飾されていない′野生型′オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに よって速やかに分解されるので、有用な療法薬ではないと思われる。従ってオリ ゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対して抵抗性となすための修飾が、現在ではア ンチセンス研究の主な目標である。
これまでヌクレアーゼ抵抗性を高めるためのオリゴヌクレオチドの修飾は、専ら 糖−ホスフェート主鎖、特にリン原子に対して行われていた。ホスホロチオエー ト、メチルホスホネート、ホスホルイミデートおよびホスホロトリエステル（ホ スフェートメチル化ＤＮＡ）はヌクレアーゼに対して種々の水準の抵抗性をもつ と報告されている。しかし、アンチセンスオリゴヌクレオチドが特異的ＤＮＡま たはＲＮＡに正確に結合しうることがアンチセンス法にとって基本であるが、リ ンにおいて修飾されたオリゴヌクレオチドは種々の程度のヌクレアーゼ抵抗性を 備えているけれどもハイブリダイゼーション特性が劣る。
リン原子における修飾、たとえば前記のメチルホスホネート、ホスホロチオエー トおよびホスホルアミデートはリン原子においてキラリティーを与える。リン原 子のこのブフキラル（ｐｒｏｃｈｉｒａｌ）性のため、リンにおいて修飾された オリゴヌクレオチドの内部リン原子上の修飾はＲｐおよびＳｐ立体異性体を生じ る。立体規則性オリゴヌクレオチド（すべてがＲｐまたはＳｐホスフェート結合 ）の実際上の合成は知られていないので、リン原子において修飾されたオリゴヌ クレオチドは０２個の異性体を含む。ｎはこうして修飾されたオリゴヌクレオチ ドのリン原子数である。さらにリン原子上の修飾はホスホロジエステル結合付近 に不自然な嵩高さを生じ、これが糖−ホスフェート主鎖の立体配座を妨害し、そ の結果二本鎖の安定性に影響を及ぼす。リン原子における修飾の影響によって、 同一標的にハイブリダイズする非修飾オリゴヌクレオチドと比較して標的核酸に 対するハイブリダイゼーションが低下する。
オリゴヌクレオチドが相補的核酸に結合する相対的性能は、そのハイブリダイゼ ーションコンプレックスの融解温度を測定することにより比較される。２重らせ んの特徴的な物理的特性である融解温度（Ｔ、、）は、コイル形（ハイブリダイ ズしていない）に対して５０％のらせん形が存在する温度（’Ｃ）を表す。Ｔ、 はＵＶスペクトルを用いてハイブリダイゼーションの形成および破壊（融解）を 判定することにより測定される。ハイブリダイゼーションに際して起こる塩基の 重なりは、ＵＶ吸収の減少（淡色性）を伴う。従ってＵＶ吸収の減少はＴ、がよ り高いことを示す。Ｔ、が高いほど、鎖の結合強度は高い。非ワトソンークリッ ク塩基対合はＴ、に強い不安定化作用を及ぼす。従ってアンチセンスオリゴヌク レオチドがその標的ＲＮＡに最適な結合を行うためには、絶対的に正確な塩基対 合が必要である。
メチルホスホネートおよびホスホロチオエートのハイブリダイゼーション特性が かなり低下することは、コーエンにより報告された。メチルホスホネートは、Ｒ ＮＡと共に形成された二本鎖が終止イベントとしてのＲＮアーゼＨによる分解を 活性化するのではなく、ハイブリダイゼーション阻止により作用し、これはリポ ソーム上に位置するらせん融解活性（ｈｅｌｉｃａｌ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ａｃｔ ｉｖｉｔｙ）のため逆行する可能性があるという点で、さらに欠点をもつ。ホス ホロチオエートは大部分のヌクレアーゼに対して抵抗性が高い。しがしホスボロ チオエートは一般に非アンチセンスモードの作用、特に非特異的結合による種々 の酵素機能の阻害を示す。配列特異的オリゴヌクレオチドによる酵素阻害はアン チセンス療法の基礎そのものを弱体化する。
オリゴヌクレオチドに対する既知の修飾はそれらの翻訳阻害性の改良に対して若 干の効果をもつことが示され、またそれらの物質はｍＲＮＡによりコードされる 蛋白質の産生に対して若干の阻害活性を示したが、診断または療法に用いるのに 十分な活性は証明されていない。
ヌクレアーゼに対する抵抗性を示し、ＲＮアーゼＨ終止イベントを活性化し、そ の標的ＲＮＡ　（またはＤＮＡ）に適宜な強度および正確さでハイブリダイズす べく修飾されたオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド用とし て依然として強く要望されている。
イケハラ（Ｍ、１ｋｅｈａｒａ）ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３９：４４７−４５０（１９８４）は、１個の２ ′−デオキシ−２′−フルオログアノシン残基または１個の２′−チオキシ−２ ′−フルオロアデニン残基を含む混合オクタマーの合成を報告している。グッシ ュシバウエルおよびヤンコフスキー（Ｗ、Ｇｕｓｃｈｌｂａｕｅｒ、に、Ｊａｎ ｋｏｗｓｋｉ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ、８．ｐ、１ ４２１　（１９８０）は、２′−置換基の電気陰性度に伴ってＮ形（３′　−エ ンド、２′−エキソ）の関与が増大することを示している。たとえば２′−デオ キシ−２′−フルオロウリジンは８５％のＣ３’　−エンド配座異性体を含む。
イケハラ（Ｍ、Ｉｋｅｈａｒａ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅ、ｔｔｅｒ ｓ、Ｖｏｌ。
４２、ｐ、’　４０７３　（１９７９）は、一連の２′−デオキシアデノシンの ２′−置換基の電気陰性度とＮ配座（３′−エンド−２′−エキソ）の％との間 に直線関係があることを示した。イケハラ（Ｍ、Ｉｋｅｈａｒａ）ら、Ｎｕｃｌ ｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、５．ｐ、１８７７　（１９７８ ）は、２′−デオキシ−２′−フルオロアデノシンをその５′−ジホスフェート に化学変換した。次いでこれを酵素重合してポリ（２′−デオキシ−２′−フル オロアデニル酸）を得た。
さらに２′−置換−２′−デオキシアデノシンのポリヌクレオチドはＤＮＡより むしろ二本鎖ＲＮＡに似ていることを示す証拠が提示された。イケハラ（ＭＩｋ ｅｈａｒａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ、５．ｐ。
３３１５　（１９７８）は、ポリＡ、ポリエおよびポリＣがそれらのＵ、Ｃまた はＩ相補体に二本鎖形成したものにおいて２′−フッ素置換基は、標準融解アッ セイにより測定してリボまたはチオキシポリ二本鎖より著しく安定であることを 示している。イケハラ（Ｍ、Ｉｋｅｈａｒａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、４；４３３６　（１９７２）は、ポリ（２′　−デオキシ−アデニル 酸）において２′−クロロまたはブロモ置換基がヌクレアーゼ抵抗性を付与する ことを示している。エックスタイン（Ｆ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、１１．　ｐ、４３３６　（１９７２）は、ポリ（２′− クロロ−２′−チオキシウリジル酸）およびポリ（２′−クロロ−２′−デオキ シシチジル酸）が種々のヌクレアーゼに対して抵抗性であることを示している。
イノウニ（Ｈ，Ｉｎｏｕｅ）　ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ、Ｖｏｌ。
１５、ｐ、６１３１　（１９８７）は、各ヌクレオチド単位に２’　−ＯＭｅを 含む混合オリゴヌクレオチド配列の合成につき記載している。混合２’　−ＯＭ ｅ置換配列はそれらのりボオリゴヌクレオチド相補体（ＲＮＡ）にリボ−リボ二 本鎖（ＲＮＡ、−ＲＮＡ）と同様に強固に結合し、これは同一配列のリボ−デオ キシリボーへテロ二本鎖より著しく強固である（Ｔ、ｓ、ノナマーについての３ ３．０℃に対して４９．０および５０．１℃）。シバハラ（Ｓ、５ｈｉｂａｈａ ｒａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、１７．ｐ 、２３９　（１９８７）には、ヌクレオチド単位毎に２’　−ＯＭｅを含む混合 オリゴヌクレオチド配列の合成が記載されている。混合２’　−ＯＭｅ置換配列 はＨＩＶ複製を阻害すべく設計された。
水素原子の性質に対比したヒドロキシル基の立体効果、その水素結合能、および その電気陰性度を総合したものがＲＮＡとＤＮＡの全体的な構造上の差に関与す ると考えられる。熱融解試験により、２′−メトキシオリゴヌクレオチドの二本 鎖安定性（ハイブリダイゼーション）の順序はＲＮＡ−ＲＮＡ５ＲＮＡ−ＤＮＡ ＳＤＮＡ−ＤＮＡ、の順序であることが示される。数種類の天然ヌクレオシドの ２′−デオキシ−２′−ハロ、アジド、アミノ、メトキシホモポリマーがポリメ ラーゼ法により製造された。必要な２′−修飾ヌクレオシドモノマーは核酸合成 装置によりオリゴヌクレオチド内へ取り込まれなかった。従って各糖に２′−修 飾を含む混合配列（配列特異性）オリゴヌクレオチドは２′−デオキシー２′ア ンチセンス診断および療法に用いるオリゴヌクレオチドの効力を高めるために、 他の合成終止イベントをハイブリダイゼーション阻止およびＲＮＮアーゼ間裂と 比較して調べた。こうしてオリゴヌクレオチドに対する第２ドメインーー一般に ペンダント基と呼ばれるｍ−が導入される研究領域が開発された。
ペンダント基はオリゴヌクレオチド類似体とｍＲＮＡの特異的ワトソンークリッ クハイブリダイゼーションには関与しないが、オリゴヌクレオチド類似体と共に 運ばれ、反応性官能基として作用する。ペンダント基は何らかの様式でより効果 的にｍＲＮＡと相互作用して、ｍＲＮＡが蛋白質に翻訳されるのを阻害するだめ のものである。これらのペンダント基は一本または二本鎖ＤＮＡを標的とする分 子にも結合された。
内位添加剤として知られるこの型のペンダント基は、カゼナブ、ローレウ、ツオ ング、ツルメおよびヘレン（Ｃａｚｅｎａｖｅ、Ｎ　Ｌｏｒｅａｕ、Ｎ、Ｔ、Ｔ ｈｕｏｎｇ、Ｊ、Ｊ、Ｔｏｕｌｍｅ、Ｃ，Ｈｅ１ｅｎｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏｌ、１５．ｐ、４７１７−４７３６　（１９８ ７）ならびにコンスタント、ラウガ、ローケスおよびロンメ（Ｊ、Ｆ、Ｃｏｎ５ ｔａｎｔ、Ｐ、ＩＬａｕｇａａ、Ｂ、Ｐ、Ｒ，ｏｑｕｅｓ、Ｊ、Ｌｈｏｍｍｅ） 、Ｂｊｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｖｏｌ、　２７．　ｐ、　３９９７−４００３ 　（１９８８）に示されている。そこに示されるそれらの内位添加剤の目的は、 オリゴヌクレオチド類似体と標的核酸との間に形成されたハイブリッドに、それ らの間に形成された二本鎖への結合によって結合安定性を付加することである。
架橋性のペンダント基をオリゴヌクレオチド類似体に付与することも示されてい る。たとえばブソラリンなどのペンダント基がエング、ンヨーンズおよびチュ（ Ａ、Ｔ、Ｙｅｕｎｇ、Ｂ、に、Ｊｏｎｅｓ、Ｃ，Ｔ、Ｃｈｕ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ、ｖｏ）、２７．　ｐ、２３０４−３２１０　（１９８８）に示され ている。オリゴヌクレオチド類似体が標的ｍＲＮＡにハイブリダイズしたのち、 プソラリンが光活性化されてｍＲＮＡと架橋し、オリゴヌクレオチド類似体とｒ ｎＲＮＡの間に共有結合を形成し、これによりｍＲＮＡ分子を永久的に不活化し 、そのＲＮＡ部分によりコードされる蛋白質がそれ以上形成されるのを妨害する と考えられる。
下記に示すように診断および療法のためのアンチセンス法に用いるオリゴヌクレ オチドのペンダント基としてアルキル化剤を使用することも提案されている・メ イヤー（Ｒ，Ｂ、Ｍｅｙｅｒ）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈ ｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、Ｖｏｌ、１１１．ｐ、８５１７−８５１９（１ ９８９）ならびにクノルおよびブラソフ（Ｄ、Ｇ、Ｋｎｏｒｒｅ、Ｖ、Ｖ。
Ｖｌａｓｓｏｖ）、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｗ、３２゜ ｐ、２９１−３２０　（１９８５）。
アンチセンス法においてオリゴヌクレオチド類似体中にアルキル化剤およびペン ダント基を用いる目的は、アルキル化剤を標的ｍＲＮＡと不可逆的に反応させる ことである。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドとｍＲＮＡの不可逆的 結合は一般に共有結合であり、ｍＲＮＡが永久的に不活化され、同時にこうして 不活化された部分のｍＲＮＡからの蛋白質産生が停止する。
提示された他の方法は、選ばれた条件下で標的核酸と反応して開裂その他の様式 でそれを不活化するためのラジカル種を生成しうる化学試薬を用いることである 。このカテゴリーの提示されたペンダント基には、会合したリガンドを伴う金属 イオンを含む配位錯体が含まれる。金属イオンは酸化状態が変化して、反応性酸 素含有ラジカルイオンその他のラジカル種を生成することができる。トーン、ペ ルーアルド、チャジグノル、ツォングおよびベレン（Ｐ、Ｌ、　Ｄｏａｎ、ＬＰ ｅｒｒｏｕａｕｌｔ、Ｍ、Ｃｈａｓｓｉｇｎｏｌ、、Ｎ、Ｔ、Ｔｈｕｏｎｇ。
Ｃ，Ｈｅ１ｅｎｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ 。
１５、ｐ、８６４３−８６５９　（１９８７）には、このための鉄／ＥＤＴＡお よび鉄／ポルフィリン種が示されている。銅／フェナントロリン錯体がジグマン （Ｄ、Ｓ、Ｓｉｇｍａｎ）、Ａｃｃｏｕｎｔｓ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ ５ｅａ、ｒｃｈ、Ｖｏｌ、１９．ｐ、１８０−１８６　（１９８６）に示されて いる。ドレヤーおよびダーバン（Ｇ、Ｂ、Ｄｒｅｙｅｒ、Ｐ、Ｂ、Ｄｅｒｖａｎ ）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍ ｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、ｖｏｌ、８２．　ｐ、９６８−９７ ２　（１９８５）は核酸を開裂させるためのＥＤＴＡ、／Ｆｅ部分について研究 した。
アンチセンス診断および療法のためのオリゴヌクレオチドにペンダント基として 架橋剤、アルキル化剤およびラジカル生成種を使用する従来の方法は幾つかの著 しい欠点をもつ。ペンダント基がオリゴヌクレオチドに結合する位置は、療法お よび診断のためのオリゴヌクレオチドの有効性において完全には分かつていない が重要な役割を果たす。従来の研究者らは、大部分のペンダント基をリン原子に 結合したものとして記載しており、これは前記のようにハイブリダイゼーション 特性の劣るオリゴヌクレオチドを与える。従来の試みは感受性が比較的低く、す なわちペンダント基はメツセンジャーＲＮＡ分子上のアルキル化または開裂のた めの部位に有効な割合で効果的に付与されていなかった。さらにこれらの物質の 反応性が完全であっても、すなわち反応性官能基それぞれがメツセンジャーＲＮ Ａ分子と実際に反応したとしても、その効果は化学量論的限界上ではない。すな わちオリゴヌクレオチド分子それぞれにつき１個のｍＲＮＡ分子が不活化される にすぎない。修飾されたオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡ以外の分子との、たと えばアルキル化される可能性がある他の分子、またはラジカル種と反応する可能 性がある他の分子との非特異的相互作用、ならびに自己分解が、アンチセンス処 置の診断および療法効果を低減させるだけでなく、細胞内またはインビトロで不 都合な毒性反応をもたらすこともありうる。これは特異的ハイブリダイゼーショ ンの座を越えて拡散して、非標的物質、他の細胞性分子および細胞代謝産物に不 都合な損傷を与える可能性があると考えられるラジカル種については、特に重大 である。このような従来のアルキル化剤およびラジカル生成型のアンチセンスオ リゴヌクレオチドに見られる特異性の欠如ならびに効果の化学量論的限界は、そ れらの使用に対する著しい欠点である。
従って、不都合な副作用なしに結合およびｍＲＮＡの変調または不活化の双方に おいて改良された特異性および有効性を示しつるアンチセンスオリゴヌクレオチ ド配合物が、依然として強く要望されている。
本発明の主な目的は、アンチセンスオリゴヌクレオチド診断および療法に用いる オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を提供することである。
本発明の他の目的は、アンチセンスオリゴヌクレオチド診断、研究用試薬および 療法に用いるための、ヌクレアーゼ抵抗性である糖修飾されたオリゴヌクレオチ ドまたはオリゴヌクレオチド類似体を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ＤＮＡまたはＲＮＡの活性を変調させるのに有効な オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、不都合または有害な副作用を引き起こす可能性の少 ないオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を提供することである 。
本発明のさらに他の目的は、動物の身体状態、特に病的状態のアッセイのための 研究および診断に用いられる方法ならびに材料を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、核酸の選択的部分において置換を行うために核酸を 修飾する手段を提供することである。
さらに他の目的は、ＤＮＡおよびＲＮＡの活性を変調させることにより疾病を処 置するための療法および研究法ならびに材料を提供することである。
さらに他の目的は、ＲＮＡを選択的に開裂させる手段を提供することである。
これらおよび他の目的は、本明細書および付随する請求の範囲を考察することに より当業者に明らかになるであろう。
発明の要約 本発明によれば、ＤＮＡおよびＲＮＡの活性を変調させるための組成物が提供さ れる。これらの組成物は、予め選ばれたＲＮＡのヌクレオチド配列と特異的にハ イブリダイズしつる標的設定部（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｐｏｒｔｉｏｎ）を含む 。これらの組成物はさらに、ＲＮＡ、特にそのホスホジエステル結合の開裂を触 媒し、アルキル化し、または他の形でそれに影響を及ぼすことができる反応部（ ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｐｏｒｔｉｏｎ）を備えている。これらの組成物は連結部（ ｔｅｔｈｅｒ）、すなわち標的設定部と反応部を互いに結合して組成物を形成す るための手段をも含む。好ましい形態によればこれらの組成物は、ＲＮＡと組酸 物のハイブリダイゼーションにより形成されるハイブリッド構造体の小溝（ｍｉ ｎｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ）部位内へ反応部を挿入するのに適したものに調製される 。
本発明組成物の標的設定部は、好ましくは約３＝約５０塩基ユニツトからなるオ リゴヌクレオチド類似体を含み、８−４０サブユニツトが好ましく、１２−２５ がさらに好ましい。約１５塩基ユニツトを含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴ ヌクレオチド類似体が本発明の特定の形態を実施するために好ましい。他の好ま しい形態によれば、標的設定部はオリゴヌクレオチドの類似体であり、その場合 オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の少なくとも一部は、活性を変調す べきＲＮＡが位置する細胞の細胞内領域へ浸透する組成物性能を高める機能をも つ構造体により置換されている。これらの置換はホスホロチオエート結合または 短鎖のアルキルもしくはシクロアルキル構造体からなることが好ましい。他の好 ましい形態によれば、ホスホジエステル結合が同時に実質的に非イオン性かつ非 キラル性である構造体により置換される。
他の好ましい形態によれば、組成物の反応部はＲＮＡのホスホジエステル結合の 加水分解、すなわち開裂を触媒しうる官能基からなる。これらの官能基は塩基性 、酸性または両性のいずれであってもよい。ペテロ原子種をこの目的のために塩 基性もしくは酸性、または実際に両性となるように調製することができる。
本発明はアルキル化用およびラジカル形成性の官能基を本発明組成物の反応部と して用いることをも包含し、その場合これらのアルキル化用およびラジカル形成 性の物質は、本発明組成物と変調すべきＲＮＡのハイブリダイゼーションにより 形成されるハイブリッド構造体の小満内へ挿入される。
本発明の他の形態によれば、少なくとも１種のＲＮＡ開裂作用部分（ｃｌｅａｖ ｉｎｇ　ｐｏｒｔｉｏｎ）、またはそれに付与されたＲＮＡと相互作用しうる他 の部分を含む特定の複素環式構造体からなる、ＲＮＡ活性を変調するための組成 物が提供される。これらの組成物は、Ｒ，ＮＡ開裂作用部分の結合部位を慎重に 選ぶことにより、反応性のＲＮＡ開裂作用部分または他の反応性部分をＲＮＡと 組成物から形成されたハイブリッド構造体の小満内へ挿入するのに適したものに 調製される。これらの組成物は糖または糖類似体部および新規なヌクレオシド塩 基部を含むことができる。従って新規なヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体 が提供される。これらのヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体は、本発明の実 施に用いられるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体に取り込ま れていてもよい。
本発明は、ＲＮＡを含む生物を以上の考察に従って調製された組成物と接触させ ることよりなる、ＲＮＡ活性の変調法をも対象とする。変調すべきＲＮＡは、好 ましくはその形成を変調すべき蛋白質をコードするメツセンジャーＲＮＡを構成 すべく予め選ばれることが好ましい。本発明はプレメツセンジャーＲＮＡおよび 実際にはＲＮＡ全般、ならびに二本鎖ＤＮＡにも適用しつる。従って用いられる 組成物の標的設定部は、予め選ばれたＲＮＡ部分に相補的となるように、すなわ ちその部分に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとなるように選ばれる。
本発明は、望ましくない蛋白質産生を特色とする疾病を伴う生物の処置法におい て、該生物を上記の考察による組成物と、好ましくはその産生を阻止すべき蛋白 質をコードするメツセンジャーＲＮＡと特異的に結合すべく設計されたものと、 接触させることよりなる方法をも対象とする。
本発明は、反応性官能基を含まない、オリゴヌクレオチドに付加された基を用い ることをも対象とする。これらのペンダント基は、オリゴヌクレオチドの取り込 みを増大させ、ヌクレアーゼによる分解に対してオリゴヌクレオチドの抵抗性を 高め、また標的ＲＮＡへのオリゴヌクレオチドの結合を増強することができる。
これらのオリゴヌクレオチドは、他の反応性官能基によるＲＮＡホスホジエステ ル結合の開裂または他の形でのそれの破壊と同様に、ハイブリダイゼーションの 阻止により、および／またはＲＮアーゼＨの活性化によりＲＮＡを破壊すること ができる。
本発明は、診断の目的でレポーター基、たとえばビオチンおよび種々の発蛍光団 を配列特異性オリゴヌクレオチドに付着させる作用をする官能基をも対象とする 。各オリゴヌクレオチドに２以上の非反応性官能基を付着させることができ、２ 以上の非反応性官能基を１個のヌクレオシドユニットに付着させることができ、 また非反応性官能基および反応性官能基の組み合わせを１個のヌクレオシドユニ ットまたは１個のオリゴヌクレオチドに付着させることができる。配列特異性オ リゴヌクレオチドに付着した非反応性官能基および反応性官能基は、好ましくは へテロ二本鎖の小溝内または小溝側に存在すべく設計される。
本発明の他の好ましい形態によれば、ヌクレアーゼ分解に対しテ抵抗性であり、 かつＤＮＡおよびＲＮＡの活性を変調させる組成物が提供される。これらの組成 物は糖修飾されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を含み、 それらの標的設定部は一本鎖またはは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの予め選ばれた ヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする。糖修飾されたオリゴヌクレオ チドは一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを認識してそれらと二本鎖を形成し、または二 本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを認識してそれらと二本鎖を形成する。
本発明のヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドは結合基により互いに結合され た核酸塩基の一本鎖から構成される。このヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチ ドの標的設定部は、長さ約５−約５０核酸塩基に及びつる。しかし本発明の好ま しい形態によれば、長さ約１５塩基の標的配列が最適である。
核酸塩基は特定の配列に整列したピリミジン類、たとえばチミン、ウラシルもし くはシトシン、またはプリン類、たとえばグアニンもしくはアデニン、または両 者であってもよい。さらにそれらは本発明の新規な塩基のいずれかであってもよ い。それらの塩基の糖部分はデオキシリボース型またはリボース型のいずれであ ってもよい。塩基を互いに結合する基は通常の糖ホスフェート核酸主鎖であって もよいが、糖修飾オリゴヌクレオチド特性をさらに高めるために、５′−メチレ ン基および／または炭素環式糖の除去と共に、ホスホロチオエートメチルホスホ ネートまたはホスフェートアルキル化部分として修飾されていてもよい。
本発明の１形態によれば、標的設定部はヌクレオシドユニットの少なくとも１個 の２′−デオキシリボフラノシル部分が修飾されたオリゴヌクレオチド類似体で ある。水素またはヒドロキシル、ハロ、アジド、アミノ、メトキシもしくはアル キル基を付加することができる。たとえばＨＳＯＨ，低級アルキル、置換低級ア ルキル、Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、ＣＮ５ＣＦ８．０ＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ −アルキル、ＳＯＭＥ、Ｓ０２Ｍｅ、０ＮＯ２、ＮＯ３、Ｎ３、ＮＨ，、ＮＨ− フルキル、０ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２，０ＣＨ＝ＣＨ２、○ＣＨＩＣＣＨＳＯＣＣＨ ，アルアルキル、ヘテロアルアルキル、複素環アルキル、アミノアルキルアミノ 、複素環アルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂作用部 分、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良するための基、またはオリ ゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基を用いることができ、ここで アルキルはＣ１−ＣＩ２の直鎖または分枝鎖であり、炭素鎖内の不飽和、たとえ ばアリルオキシが特に好ましい。
得られた新規なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体はヌクレア ーゼ分解に対して抵抗性であり、野性型（ＤＮＡ−ＤＮＡおよびＲＮＡ−ＤＮＡ ）二本鎖、ならびにホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデ ートおよびホスホロトリエステルを含有するリン修飾されたオリゴヌクレオチド アンチセンス二本鎖と比較して、より質の高いハイブリダイゼーション特性を示 す。
本発明はさらに、生物または細胞における異常なＲＮＡ分子、または正常なＲＮ Ａ分子の異常もしくは不適当な発現の存否を検出するための診断法を対象とする 。本発明は、研究または診断などのためにＲＮＡを選択的に開裂する方法、およ びこうして形成されたＲＮＡをも対象とする。この選択的開裂は、このような開 裂を行いつる反応部および選択性を高めるべ（設計された標的設定部を含む本発 明組成物とＲＮＡを相互作用させることにより達成される。
ＲＮＡの活性を変調させ、またはその存在を検出するために有用な本発明による 組成物は、一般に３部分からなる。第１部、すなわち標的設定部は、変調すべき ＲＮＡの予め選ばれたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズしつる部分で ある。最終的にその合成を変調するかまたは完全に阻止すべき蛋白質の産生をコ ードし、またはそれに関与するＲＮＡ配列を選択することが一般に望ましい。
この組成物の標的設定部はオリゴヌクレオチド類似体である。それはＲＮＡの予 め選ばれたヌクレオチド配列と相補的であるか、または少なくとも特異的にハイ ブリダイズしつるように設計され、既知技術の固相合成によって簡便に製造され る。核酸合成装置は市販されており、それらの使用は当業者に一般に理解されて おり、希望される可能性のある妥当な長さのほぼいかなるオリゴヌクレオチドを も形成することができる。
本発明は、生物を上記の考察に従って調製された組成物と接触させることよりな る、生物による蛋白質の産生を変調する方法をも対象とする。変調すべきＲＮＡ またはＤＮＡ部分は、その形成を変調すべき蛋白質をコードする部分のＤＮＡま たはＲＮＡを構成するように予め選ばれることが好ましい。従って、用いられる 組成物の標的設定部は、ＲＮＡまたはＲ，ＮＡの予め選ばれた部分に対して相補 的である、すなわちその部分に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるよ うに選ばれる。
本発明は、不都合な蛋白質産生を特色とする疾病を伴う生物の処置法をも対象と する。この方法は、生物を上記の考察Ｊこ従って調製された組成物と接触させる ことよりなる。この組成物は好ましくは、その産生を阻止すべき蛋白質をコード するメツセンジャーＲＮＡと特異的に結合すべく設計されたものである。
本発明はさらに、生物または細胞における異常なＲＮＡ分子、または正常なＲＮ Ａ分子の異常もしくは不適当な発現の存否を検出するための診断法を対象とす本 発明は研究および診断のためのＲＮＡの選択的結合法をも対象とする。この選択 的な強固な結合は、分解性ヌクレアーゼに対して抵抗性であって他の既知のオリ ゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体のいずれより強固にかつより正 確にハイブリダイズする本発明組成物と、それらのＲＮＡまたはＤＮＡとの相互 作用によって得られる。
本発明の他の形態によれば、２′位において置換され、本発明のオリゴヌクレオ チドおよび類似体に含有させるのに有用な新規ヌクレオシド類似体を合成するた めの新規方法が提供される。この方法によれば、リポフラノシルヌクレオシドの ３′または５′　ヒドロキシル基をブロッキングすることなしに２′置換基を導 る。グアノシンの環外アミノ基以外は、ヌクレオシド塩基上に保護基を必要とし ない。この反応は室温またはその付近で行われる。これらの条件は、強いアルキ ル化剤、たとえばジアゾメタンを必要とする既知の先行技術法と対照的である。
このような強いアルキル化剤は、ヌクレオシド塩基上のすべての反応性部位なら びに３′および５′糖ヒドロキシルを完全に保護する必要がある。
本発明のさらに他の形態においては、新規な３−デアザヌクレオシドおよびこれ らのヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドを合成するための新規方法が提 供される。この方法においては、５−シアンメチル−１−（２’　−デオキシ− ３’、５’−ジー０−ｐ−ｔ−ルオイルーＤ−エリスローペントフラノシル）イ ミダゾール−４−カルボキンレートまたは５−ノアノー［反応性置換基］メチル −１−（２’−デオキシ−Ｄ−エリスローペントフラノシル）イミダゾール−４ −カルボキシレートなどの化合物が製造される。５−ノアノー［反応性置換基］ −メチル化合物は対応する５−ノアノメチル化合物から、水素化ナトリウムおよ び適宜なハロゲン化アルキルを用いて製造される。これらのカルボキシレートは ブロッキング解除され、対応するカルボキシアミドに転化される。次いでこれら の化合物の５′位が保護され、そして化合物は３′位において適宜なホスホルア ミダイトその他の、ＤＮＡ合成装置での使用に適した活性化ホスフェート基によ り誘導体とされる。合成装置においてオリゴヌクレオチドが構成される。これら のオリゴヌクレオチドはその配列内に１または２以上の５−シアノ−［反応性置 換基］−メチルイミダゾール化合物を含有する。これらのイミダゾール化合物は 、過剰の濃水酸化アンモニウムによる処理に際してオリゴヌクレオチドが合成装 置の支持体から開裂すると同時に環化して、３−デアザプリンまたは３−置換− ３−デアザブリンとなる。
糖部分および／または複素環部分に必要な官能基を備えたこれらの修飾されたヌ クレオチド（修飾されたモノマー）を用いて、目的とする本発明の新規なオリゴ ヌクレオチドおよび類似体を製造することができる。これらの修飾されたヌクレ オチドの構造および合成はこれまで知られておらず、ここに初めて記載された。
糖および複素環における官能基の部位は新規であり、好ましくはこれらの修飾さ れたオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとのへテロ二本鎖により形成される小溝内 または上に官能基が位置するように設計される。これらの修飾されたオリゴヌク レオチドと標的ＲＮＡとの間に形成される二本鎖の小側面または小溝は官能基活 性にとって極めて好ましい部位であることが見出された。
本発明によりＲＮＡまたはＤＮＡの活性を変調するために用いられる１群の組成 物は一般に、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の予め選ばれたヌクレ オチド配列と特異的にハイブリダイズすることができ、かつヌクレアーゼ抵抗性 である標的配列を含む糖修飾されたオリゴヌクレオチドからなる。
最終的にその合成を変調させるかまたは完全に阻止すべき蛋白質を産生ずるか、 またはそれに関与するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を選ぶことが一般に望ましい。組 成物の標的設定部は一般にオリゴヌクレオチド類似体である。それは既知の固相 合成法によって簡便に、ＲＮＡまたはＤＮＡの予め選ばれたヌクレオチド配列に 相補的であるか、または少なくともそれらと特異的にハイブリダイズしうるよう に合成される。核酸合成装置は市販されており、それらの使用は当業者に一般に 理解されており、希望する妥当な長さのオリゴヌクレオチドのほぼすべてを形成 するのに有効である。
本発明に関して′オリゴヌクレオチド′という語は、糖残基を介して天然のホス ホジエステル結合により結合した天然の塩基およびペントフラノシル類から特異 的配列で形成された、複数の結合ヌクレオチドユニットを意味する。これらのヌ クレオチドユニットは核酸塩基、たとえばグアニン、アデニン、シトシン、チミ ンまたはウラシルであってもよい。糖残基はデオキシリボースまたはリポースの いずれであってもよい。この語は、天然種、または天然のサブユニットから形成 された合成種の双方を意味する。
′オリゴヌクレオチド類似体′または′修飾されたオリゴヌクレオチド′は、た は修飾されたオリゴヌクレオチドは、変化した糖部分、変化した塩基、変化した 糖および塩基の双方、または糠間の結合が変化したもの、たとえばホスホチオエ ートおよび当技術分野でその使用が知られている他のイオウ含有種を含みうる。
本発明のオリゴヌクレオチド類似体はオリゴヌクレオチド組成物のヌクレアーゼ 抵抗性を高め、従って本発明組成物のアンチセンス療法、診断における使用、ま たは研究用試薬としての使用を容易にする。
本発明においては、オリゴヌクレオチド自体よりむしろオリゴヌクレオチド類似 体または修飾されたオリゴヌクレオチドを用いる方が極めて好ましい。これに関 してオリゴヌクレオチド類似体は、一般に天然のオリゴヌクレオチドに類似する が、１または２以上の有意の様式で修飾された構造体を意味する。
本発明のある形態に用いるものとしては、オリゴヌクレオチド結合能の一体性を 維持した状態で組成物のヌクレアーゼ抵抗性を高めるために、ヌクレオチド塩基 の一部が置換されていることが一般に好ましい。
本発明のある形態においては、さらに修飾されたオリゴヌクレオチドを用いるこ とが好ましい。これに関して修飾されたオリゴヌクレオチド類似体は、一般に天 然のオリゴヌクレオチドに類似するが、１または２以上の存意の様式で修飾され た構造体を意味する。
組成物全体の標的であるメツセンジャーＲＮＡまたはＤＮＡが存在する細胞の細 胞内空間への浸透を高めるために、本発明の好ましい形態はオリゴヌクレオチド の修飾法を提供する。これらの修飾法によれば、天然形より実質的にイオン性が 低いオリゴヌクレオチドが提供される。これらの修飾法は細胞内空間へのオリゴ ヌクレオチドの浸透を容易にする。この目標を達成しつる既存の、またはまだ見 出されていない方法はいずれも本発明の実施に採用しつる。現在、ホスホロジエ ステル結合に対する置換を採用するのが好ましいことが見出されている。それら の置換は天然の結合よりイオン性が低いだけでなく、実質的に非キラル性でもあ る。
自明のとおり、ホスホジエステル結合におけるリン原子は′ブフキラル性′であ る。メチルホスホネートおよびホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドにおい て行われるリン原子における修飾は、本質的にキラル構造をもたらす。キラリテ ィーのため各キラル中心において２種類の異性体が存在し、それらは細胞分子と の異なる相互作用を示す可能性がある。それらの異性体の未分割混合物は、得ら れた組成物が細胞内空間へ輸送されるのを阻害し、または特異的な標的ＲＮＡも しくはＤＮＡへのハイブリダイゼーションの親和性および特異性を低下させる可 能性がある。従って本発明のある形態においては、ホスホジエステル結合の一部 または全部の代わりに実質的に非イオン性の、実質的に非キラル性のものを用い ることが好ましい。このためには、短いアルキルまたはシクロアルキル構造体、 特にＣ，−Ｃ４構遺体が好ましい。本願と同一の出願人による米国特許出願第５ ５８．６６３号明細書−一この出願は′細胞性数り込みを増大させるためのポリ アミンオリゴヌクレオチド′と題し、１９９９０年７月２７日に出願−一に述べ たように、酸素官能基の１つを除去することを含めた糖構造の修飾により、これ らの実質的に非キラル性、非イオン性の置換基をこの位置に導入することができ る。
このような修飾をより詳細に開示するために、その明細書の記載全体をここに参 考として引用する。
標準的な主鎖修飾、たとえばＰをＳ、Ｍｅ−Ｐ、Ｍｅ○−Ｐ、Ｈ２Ｎ−Ｐなどに 置換することは、本発明の目的と一致する。これらの置換は場合により糖修飾オ リゴヌクレオチドの特性を高めると考えられる。
本発明組成物の標的設定部は、好ましくは約３−約５０塩基ユニツトを含むオリ ゴヌクレオチド類似体である。これらの類似体が約８−約４０塩基ユニツトを含 むことがより好ましく、約１２−約２５を用いることがいっそう好ましい。現在 では、約１５塩基ユニツトを含むオリゴヌクレオチドまたは類似体が本発明のあ る形態の実施に最良であると考えられる。標的設定部が変調のために選ばれたＲ ＮＡの予め選ばれたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするにの適した ものに調製することが望ましい。
現在、本発明の１または２以上の形態の実施に特に適切であると考えられるオリ ゴヌクレオチド類似体は、式１に示す一般構造をもつサブユニット１または２以 上を含む。
式中、Ｂはプリンまたはピリミジン塩基、修飾された塩基または塩基類似体のい ずれかであり、これには天然のオリゴヌクレオチド中に、もしくは修飾オリゴヌ クレオチドに用いるものとして知られているか、または同様な機能を示すものが 含まれる：ＥはＲＮＡ開裂作用部分、オリゴヌクレオチドの薬方学的特性を改良 する基、オリゴヌクレオチドの薬物動態を改良する基、ＨまたはＯＨ，および他 の小型の塩基買換基である：Ｓは糖または糖類似体である。モしてＬは糖連結基 である。糖連結基りは、オリゴヌクレオチドの糖部分または糖類似体を連結して 本発明組成物の標的設定部を形成しうろことが知られている天然のもの、ここに 記載するもの、その他のいずれであってもよい。これらの糖連結性官能基は前記 のようにホスホジエステル構造体、または実質的に非イオン性、実質的に非キラ ル性の構造体、たとえば低級アルキルおよびシクロアルキル、特にＣｍ−Ｃ４ア ルキルからなることが好ましい。低級アルキル構造体を用いる場合は１または２ 以上の糖の５′メチレンを除去しうることを留意されたい。好ましくは上記オリ ゴヌクレオチドのホスホジエステル結合のうち少なくとも若干は、置換されたボ スホロチオエート、メチルホスホネートまたはアルキルポスフェートである。
当業者に自明のとおり、本発明の精神から逸脱することなく本発明組成物の調製 に際して用いられる糖部分の構造を変化させることができる。この場合も、すべ ての糖連結性官能基が修飾された形である必要はない。上記分子の組成物の標的 設定部全体が当該生物の細胞の細胞内空間へ浸透するか、または他の形で標的Ｒ ＮＡと接触し、そしてそれと特異的に結合して、ＲＮＡ活性を検出および変調し うるハイブリッドを形成する有効な性能を示す限り、実質数量の、または大部分 の連結基が天然のホスホジエステル形であってもよい。もちろん全く修飾されて いない天然のホスホジエステル構造体も使用しつる。
本発明の利点を得るために２個以上または恐らく２個のＲＮＡ開裂作用性官能基 、オリゴヌクレオチドの薬物動態を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬 力学的特性を改良する基を本発明によるオリゴヌクレオチドに連結する必要はな い。従ってＲＮＡ開裂作用部分、または薬物動態を改良する基、または薬力学的 特性を改良する基は、本発明組成物の標的設定部であるオリゴヌクレオチド類似 体を構成する比較的小さなサブユニット、一般に１個のみ、または２個に連結す ることが好ましい。しかし本発明の他の形態においては、オリゴヌクレオチド中 のすべてのヌクレオチドが１または２以上のＲＮＡ開裂作用部分、または薬物動 態を改良する基、または薬力学的特性を改良する基を含むべく修飾することがで きる。
本発明の特定の好ましい形態においては、本発明組成物のＲＮＡ開裂作用部分、 または薬物動態を改良する基、または薬力学的特性を改良する基を、標的設定部 のサブユニットを形成するヌクレオチドの１つに付着させることが望ましいと思 われる。この種の付着を式２−７により表す。
これらにおいて、ＧおよびＫは互いに無関係にＣまたはＮであり；ＪはＮまたは ＣＲ３であり： Ｒ３はＯＨまたはＮＨ，であり。
Ｒ７およびＲ３はＨＳＮＨ２、低級アルキル、置換低級アルキル、低級アルケニ ル、アルアルキル、アルキルアミノ、アルアルキルアミノ、置換アルキルアミノ 、複素環アルキル、複素環アルキルアミノ、アミノアルキルアミノ、ヘドロンク ロアルキルアミノ（ｈｅ　ｔ　ｒｏｃｙｃ　］　ｏａ　Ｉｋｙ］　ａｍｉｎｏ） 　、ポリアルキルアミノ、Ｒ，ＮＡ開裂作用部分、オリゴヌクレオチドの薬力学 的特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基で あり、　Ｒ４およびＲ５はＨｌＯＨ，ＮＨ２、低級アルキル、置換低級アルキル 、置換アミノ、ＲＮＡ開裂作用部分、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良 する基、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基であり。
ＲｏおよびＲ７はＨＳＯＨ，、ＮＨ２、ＳＨ、ハロゲン、ＣＯＮ　Ｈ２、Ｃ（’ ＮＨ）ＮＨ２、Ｃ（０）Ｏ−アルキル、Ｃ３ＮＩ−１２、ＣＮ、Ｃ（ＮＨ）ＮＴ （ＯＨ，低級アルキル、置換低級アルキル、置換アミノ、ＲＮＡ開裂作用部分、 オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの 薬物動態特性を改良する基であり： Ｘは糖または糖類似体であり、その際、糖類似体部分はＲＮＡ開裂作用部分、オ リゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬 力学的特性を改良する基からなる少な（とも１個の置換基により置換された糖で あり； ただし、組成物が式２で表され、ＧがＮであり、かつＪがＮである場合、ＸはＦ およびＯＣＨ３以外の少なくとも１個の基により置換された糖類似体部分てあり ： さらに上記オリゴヌクレオチドが修飾されたヌクレオチド１個のみを含み、Ｇ＝ ＮおよびＪ＝Ｎであり、かつすべての糖連結基が非置換ホスホンエステル結合で ある場合、Ｘは２’　−０ＣＨ３または２’　−Ｆを含む糖または糖頚似体部分 ではなく。
式中、Ｑは、○またはＣＨＲ，、であり：さらに組成物が式２で表され、ＧがＮ であり、かつＪかＣＲ３であり、Ｒ３がＨである場合、Ｘは糖類似体部分であり ；さらに組成物が式４で表され、ＧがＮであり、かつＸが上記の糖である場合、 Ｒ２はＨではなく； さらに組成物が弐６で表され、Ｒ６がＨであり、Ｒ２がＮＨ２であり、Ｒ７がＣ ＯＮＨ２、ＣＳ　ＮＨ２、Ｃ（０）Ｏ−アルキル、Ｃ（ＮＨ）ＩＮＨ２またはＣ （ＮＨ）ＮＨＯＨである場合、Ｘは糖類似体部分であり。
さらに組成物が弐６で表され、Ｒ６がＨＳＯＨまたはＳＨであり、Ｒ７がＣ（０ ）Ｏ−アルキルまたはＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、かつＲ２が−ＣＨ２ＣＮである 場合、Ｘは糖類似体部分であり、そして さらに組成物が式７で表され、Ｒ３がＨであり、かつＧがＣである場合、Ｘは糖 類似体部分である。
連結部が本発明組成物とメツセンジャーＲＮＡのハイブリダイゼーションにより 形成される小溝内へ本発明組成物の反応性官能基を挿入するのを可能にするため には、特定の形態においてはＲＮＡ開裂作用性官能基が本発明のオリゴヌクレオ チドのヌクレオシド形成部のフラノシル部分の２′位に付着することが好ましい と思われる。本発明の反応性官能基を組成物とメツセンジャーＲＮＡのハイブリ ダイゼーションにより形成される小溝内に配置するために好ましいと思われる、 本発明のオリゴヌクレオチドを形成するヌクレオシドの′糖′部分における他の 付着部位は、式８および９に示される。これらの部分には、厳密には通常の糖の 定義には含まれないが実質的に同様な機能を果たす糖類似体が含まれる。
はプリレリー９塩基、５−アルキルシトシン、例えば５−メチルシトシン、更に 、Ｚは、天然に存在するまたは合成によって変化し得る塩基ｔｙｔであることが できる結合点であり： Ｒ８およびＲ８は、Ｈ１低級アルキル、置換低級アルキル、ＲＮＡ開裂部分、オ リゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基またはオリゴヌクレオチドの薬動 能＃ｔ４＆ｆ−片自才る某であり： Ｒｇｏは、Ｈ，ＯＨ，低級アルキル、置換低級アルキル、Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、ＣＮ 。
ＣＦ３、ＯＣＦ！、ＯＣＮ、０−アルキル、Ｓ−アルキル、ＳＯＭｅ、ＳＯ２Ｍ ｅ。
ＯＮ　Ｏ２、ＮＯ２、Ｒ９、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、ＯＣＨ２ＣＨ＝　ＣＨ２ 、ＱＣＨ＝ＣＨｘ、０ＣＨ２ＣＣＨ，０ＣＣＨ、アラルキル、ヘテロアラルキル 、ヘテロシクロアルキル、アミノアルキルアミ人へテロンクロアルキル、ポリア ルキルアミ八置換シリル、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性 を改良する基またはオリゴヌクレオチドの薬動態特性を改良する基であり：そし て Ｒ１１は、Ｈ，ＯＨ３、低級アルキル、置換低級アルキル、Ｒ，ＮＡ開裂部分、 オリゴヌクレオチドの薬動態特性を改良する基またはオリゴヌクレオチドの薬力 学的特性を改良する基である。
ＲＩＧは低級アルキル、置換低級アルキル、ＣＮ、ＣＦ３．０ＣＦ３、ＯＣＮ、 ○Ｃ５−Ｃ＋ｚ−フルキル、Ｓ−アルキル、Ｓ　ＯＭ　Ｅ　、　Ｓ　Ｏ２Ｍ　ｅ 　、　ＯＮ　Ｏ２、Ｎｏ２、ＮＨ−アルキル、０ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ，ＣＣＨ ，０ＣＣＨ，７５ルー”Ｆ−ル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクロアルキル、ポ リアルキルアミ人置換シリル、ＲＮＡ開裂部分またはオリゴヌクレオチドの薬力 学的特性を改良する基またはオリゴヌクレオチドの薬動態特性を改良する基であ ることが好ましい。
典型的な塩基部分は、式２〜７で示したものである。糖Ｘは、好ましくは、リボ フラノシルまたは２′−デオキシリボフラノシルである。好ましい糖類似体部分 は、２′−デオキシ−２′−置換リボフラノシルである。他の糖類似体部分は、 式８および９の前記の通りである。式８および９の塩基Ｂは５、ウラシル、チミ ン、シトシン、アデニンおよびグアニンを含む任意の天然のピリミジニル−１− また本発明のアルキル基としては、制限されないが、Ｃ１〜ＣＩ２直鎖および分 枝状鎖アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキ シル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、インプロ ピル、２−ブチル、イソブチル、２−メチルブチル、イソペンチル、２−メチル ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルが ある。
アルケニル基としては、制限されないが、ビニル、アリル、クロチル、プロパル ギルを含むが、制限されない前記のアルキル基から誘導される不飽和部分が挙げ られる。アリール基としては、制限されないが、フェニル、トリル、ベンジル、 ナフチル（ｎａｐｔｈｔｈｙｌ）　、アントラクリ（ａｎｔｈｒａｃ　ｌｙ）　 、フエナントリルおよびキシリルがある。ハロゲンとしては、フッ素、塩素およ び臭素がある。適当な複素環式基としては、制限されないが、イミダゾール、テ トラゾール、トリアゾール、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジンおよびモルホ リンがある。アミンとしては、第一および第二アミンを含む前記のアルキル基、 アルケニル基およびアリール基全部のアミン並びにフタルイミドなどの「マスク されたアミン」がある。更に、アミンとは、ポリアルキルアミノ化合物およびア ミノアルキルアミン、例えば、アミノプロピルアミン、そして更に、ヘテロシク ロアルキルアミン、例えば、イミダゾルー１．２または４−イル−プロピルアミ ンを含む意味である。前記のものに対する置換基としては、制限されないが、他 のアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、チオアルコキシ 基、ハロアルコキシ基およびアリール基、更には、ハロゲン、ヒドロキシル、ア ミノ、アジド、カルボキシ、ノアノ、ニトロ、メルカプト、スルフィド、スルホ ンおよびスルホキシドがある。他の適当な置換基としては、更に、ローダミン、 クマリン、アクリドン、ピレン、スチルベン、オキサゾロブリイドカルバゾール （ＯＸａｚｏｌｏｐｒｙｉｄｏｃａｒｂａｚｏｌｅｓ）、アントラキノン、フエ ナントリジン、フェナジン、アンドベンゼン、ブソラレン、ポリフィリンおよび コレステロールがある。
順次に修飾ヌクレオチドに変換することができるヌクレオシド単位において官能 基を結合することができる部位は、配列特異的破壊または標的ＲＮＡの変調のた めの組成物の設計において臨界的である。官能基は、破壊される所望のＲＮＡの 選択に不可欠な配列特異的認識／結合因子であるので、これがワトソンークリッ ク型塩基対水素結合規則を妨げてはならない。
更に、修飾オリゴヌクレオチドおよび標的ＲＮＡの間の相補性が完全に近付く結 果として、最も安定なヘテロ二重鎖を生じる。これは、ヘテロ二重鎖が、本発明 の反応性または非反応性官能基でＲＮＡ機能の開裂またはさもなければ破壊を開 始させるのに十分な半減期を有していなければならないので望ましい。
完全に形成された二重鎖の半減期は、連結した官能基の位置決定によって大きく 影響される。官能基の不適切な位置決定、例えば、ワトソン／クリック型塩基対 部位への配置は、二重鎖の形成を妨げると考えられる。他の結合部位は、配列特 異的結合を許すことがあるが、安定性が低いことがあるので、反応性官能基がＲ ＮＡ破壊を開始するための時間は不十分である。
ＲＮＡの失活に対して、連結した官能基の配置に関する更に重要な因子は、それ が、標的ＲＮＡに位置した受容性基質、特に、最も感受性の「トリガー」点であ る２′−ヒドロキシル基に対して適切に近接していなければならないということ である。Ｘ線回折、化学反応および分子模型研究などの様々な構造的研究により 、二重鎖またはへテロ二重鎮のＲＮＡの２′−ヒドロキシル基は小さいほうの溝 に残存していることが示唆される。したがって、配列特異的オリゴヌクレオチド に（修飾ヌクレオシドを介して）位置した官能基は、好ましくは、オリゴヌクレ オチドおよび標的ＲＮＡの間に形成された小さいほうの溝に残存していなければ ならないし、二重鎖の形成および安定性を妨げてはならないし、モしてＲ，ＮＡ の開裂または破壊を開始しなければならない。
ここで、二重鎖核酸のヌクレオノド上のある位置は小さいほうの溝に暴露されて おり、そしてワトンンークリック型塩基対または二重鎖安定性に影響を及ぼすこ となく置換されることができることが発見された。本発明によるこれらの位置に 置かれた反応性または非反応性官能基は、標的ＲＮＡの開裂および破壊を最もよ く開始することができるしまたはその活性を妨げることができる。
参考文献で以前に記載されたオリゴヌクレオチドの反応性官能基またはペンダン ト基は、チミンの５位およびプリンの７位であるリン原子に、はぼ独占的に配置 された。リン原子結合部位は、反応性基を大きいはうおよび小さいはう双方の溝 に接近させることができる。しかしながら、内部のリン修飾の結果、ヘテロ二重 鎖安定性が大きく減少する。３′末端および／または５′末端での結合は、１個 または２個の官能基だけがオリゴヌクレオチドに適応することができるというこ とで制限している。複素環（塩基）ピリミジンおよびプリンそれぞれの５位また は７位に置かれた官能基は、二重虻の大きいほうの溝に残存し、ＲＮＡ２’　− ヒドロキシル基質の付近に存在することはない。更に、このような配置はワトソ ンークリック型結合を妨げることがある。
反応性官能基を有していないが、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性および薬動 態特性を増大させるのに役立つペンダント基も、本発明のある種の実施態様にし たがって用いるのに好ましい。この文脈において、薬力学的特性の改良とは、改 良されたオリゴヌクレオチド取込み、増大したオリゴヌクレオチド分解耐性およ び／または強化されたＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを意味する 。この文脈において、薬動態特性の改良とは、改良されたオリゴヌクレオチド取 込み、分布、代謝または分泌を意味する。
このようなペンダント基は、化学反応を開始しない。好ましくは、それらはアル キル鎖、ポリアミン、エチレングリコール、ポリアミド、アミノアルキル鎖、両 親媒性部分、リポータ−基結合のための点および結合に好ましい任意の部位に結 合した挿入部分を含む。
前述の考察によるＲＮＡ開裂部分を結合することは、これらの部分が本発明の組 成物および変調が望まれるメツセンジャーＲＮＡがら生成されたハイブリッドの 小溝に置かれることを可能にすると考えられる。類似の効果を有するＲＮＡ開裂 部分を結合するための他の位置は、特に、当業者によって本発明の精神から逸脱 することなく行われることがあるように、プリンまたはピリミジン構造の別の修 飾を行う場合に見出すことができると考えられる。更に、好ましくは１１種類ま たは多くとも数種類のＲＮＡ開裂部分を用いることが一般的であるということを 理解すべきである。したがって、当業者は、本発明によるＲＮＡ開裂部分、薬力 学的改良性基または薬動学的 改良性基の結合手段をかなり自由に選択できる。
本発明の組成物のＲＮＡ開裂部分は、それらがそのすぐ次の作業を行うのに有効 であることができるような様式で設計され、ＲＮＡ活性の望ましい変調を導く。
これらの分子のＲＮＡ開裂部分、特に、アミドおよびポリアミドにおいてへテロ 原子置換を用いることは有用であると考えられ、実際に、ある種のものは、標的 ｍＲＮＡおよび本発明の組成物の間の一層強い結合を確実にするために好ましい ことがある。
本発明の１種類以上の実施態様の実施に特に適したオリゴヌクレオチド類似体は 、ヌクレオシド単位の１個以上の２′−チオキンリボフラノシル部分が、水素、 ヒドロキシル基、ハロ基、アジド基、アミノ基、メトキシ基若しくはアルキル基 で修飾されている２′−糖修飾オリゴヌクレオチドを含む。例えば、生じること ができる置換としては、ＨＳＯＨ，低級アルキル、置換低級アルキル、Ｆ、ＣＩ 、Ｂｒ、ＣＮ５ＣＦｓ、ＯＣＦ、、ＯＣＮ、０−７Ａ４ル、Ｓ−７／ｌ／キル、 ＳＯＭＥ。
ＳＯｚＭｅ、０ＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ８、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、○ＣＨ２ＣＨ ＝ＣＨ２，０ＣＨ＝ＣＨ！、ＯＣＨ，ＣＣＨ，０ＣＣＨ，アラルキル、ヘテロア ラルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノアルキルアミノ、ヘテロシクロアルキ ルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂部分または、アルキル がアリルオキシなどの炭素鎖中に不飽和を含む０１〜Ｃ＋ｚ直鎖若しくは分枝状 鎖であるオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基若しくはオリゴ ヌクレオチドの薬動態特性を改良するための基がある。
これらの修飾された塩基を互いに且つ残りのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ クレオチド類似体に対して糖結合基を介して結合させる。結合基は、オリゴヌク レオチドの糖部分を互いに結合して本発明の組成物の標的部分を生成することが できる本明細書中に記載したこのような構造のいずれかであることができる。
これらの糖結合基は、ホスホジェステラーゼ構造またはその種の誘導体を含むの が好適である。ホスホジェステラーゼ構造を有する誘導体としては、硫黄、メチ ル、メチルオキシドまたは酸素に対するアミン基の置換を挙げることができる。
糖リン酸核酸主鎖は、ホスホロチオエート、ホスホン酸メチルまたはリン酸アル キル化部分として修飾することができる。
ホスホジェステラーゼ結合は、更に、前記で論及したように、炭素またはエーテ ル結合によって置き換えることができる。
連結した官能基を２′−デオキシアデノシン、２′−デオキシグアノシン並びに 他のプリンおよびプリン類似体の環外の２位に結合するには、下記の典型的な方 法を用いることができる。２，６−ジクロロプリン［アルドリッチ・ケミカル・ カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）コを、５ｙｎｔｈｅ ｔｉｃ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ、第１巻、５２１頁（１９６８）に記載された方法にしたがって、塩化 ３．５−ジー０−　（４−メチルベンゾイル）−α−Ｄ−エリトロベントフラノ シルでチオキシリボシル化し、引き続き、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、第１０６巻、６３７９頁（１９８４ ）の方法にしたがってメタノール性アンモニアでアミノ化する。得られた２−ク ロロ−２−デオキシアデノシンは、選択された核反応性官能基にょる２−クロロ 基の核置換によって一連の２−置換２−デオキシアデノシンに変換される。この 方法において、種々の置換された種、例えば、アミン、酸素、硫黄およびセレン は、二環式環の２位の炭素に直接結合することができる。炭素原子を介して２′ −デオキシアデノシンの２位に結合した反応性官能基は、Ｊｏｕｒｎａｌ　。
ｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、第９０巻、４９６ ２頁（１９７４）の公表された方法にしたがって５−アミノ−１−（２−デオキ シ−β−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミジ ンおよび置換アルデヒドからまたはＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌ ｅｏｔｉｄｅｓ、第８巻、６９９頁（１９８９）に記載されたように、２−ヨー ド−２′−デオキシアデノシンを用いるパラジウムに触媒されたクロスカップリ ング反応から得るこ′とができる。米国特許第４．７１９，２９５号明細書を参 照されたい。２−反応性官能基２′−デオキシグアノシンは、アデノシンデアミ ナーゼまたは亜硝酸で脱アミノ化してデオキシグアノシン対応部分を与えること ができる。下記の選択された実施例により、２−１ｆ換−２−デオキシグアノシ ンおよび２−置換−２−アデノシンは、５′−ジ−メトキシトリチル−３′−シ アノエチルホスホアミダイト（アデニン型に対してはＮｅ−ベンゾイルおよびグ アニン型に対してはＮ２−イソブチル）に変換することができる。これらは、日 常的に、自動固相ＤＮＡ合成機により、周知の方法にしたがってオリゴヌクレオ チドに挿入される。
２′−デオキシグアノシンの３位から発する反応性官能基は、多段階合成法によ り、５−（シアノメチル）−１−（２−デオキシ−３，５−ジー０−ｐ−）ルオ イルーβ−Ｄ〜エリトロベント−フラノシル）イミダゾール−４−カルボン酸メ チルのメチレン残基をハロゲン化反応性官能基でアルキル化することによって出 発して得ることができる。出発イミダゾール物質は、既知の方法によって合成す ることができる。Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｃｉｉｃｉｎａ］　Ｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ、第２７巻、１３８９頁（１９８４）。アルキル化イミダゾールを、メタ ノール性アンモニアで処理して、トルオイル基を除去し且つイミダゾールカルボ キサミドを与える。これらは、日常的固体状態合成法によって５’　−ＤＭＴ− ３′−シアノエチルホスホアミダイトとしてオリゴヌクレオチドに挿入される。
合成に続いて、保護された形態である製造されたオリゴヌクレオチドを固体支持 体から除去し、その際、それらを、例えば、水酸化アンモニウム処理によって生 成する。更に、塩基処理によって、イミダゾールカルボキサミドを脱保護し且つ 環化して所望のオリゴヌクレオチド配列内の３−デアザ−３−（反応性官能基） −グアニン部分にする。或いは、濃水酸化アンモニウムによる支持体からの開裂 により、イミダゾールカルボキサミドを直接環化して３−デアサルグアニンにす る。
イミダゾール活性メチレンのα−ハローα−Ｆ反応性官能基コアセトアルデヒド ジメチルケタールまたはα−ハローメチル−［反応性官能基ｊケトンによるアル キル化と、その後のアミン化とにより、イミダゾールカルボキサミドが得られる 。これらを、５’　−ＤＭＴ−３’　−シアノエチルホスホアミダイトに変換し 且つ配列特異的オリゴヌクレオチドに挿入することができる。前記のような塩基 処理により、固体支持体からオリゴヌクレオチドを除去し且つイミダゾール部分 を環化して、３−デアザ−３−［反応性官能基］−グアニンにする。更に、得ら れたＮ−２−環外アミン基とアルデヒドまたはケトンのカルボニルとの環化によ って、反応性官能基（ピロロ［２，３−β］−イミダゾ［２，３−δコピリジン ー２−オン（５Ｈ）−７−（または８）−し反応性官能基］）を有する三環式複 素環が得られる。
６−インプチルピロロＵ２，３−β］−イミダゾ［２，３−δコピリジン−７− （または８）−口反応性官能基］の直接デオキシリボシル化により、トルオイル 基の塩基性脱保護の後に１−　（２’　−デオキシ−β−Ｄ−エリトロベントフ ラノシル）誘導体が得られる。三環式複素環は、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄ ｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２１巻、１２１２頁（１９７８）の方法 により、α−ハローα−［反応性官能基〕アセトアルデヒドジメチルケタールま たはα−ハロメチル−［反応性官能基］ケトンを用いる５−シアノメチルイミダ ゾール４−カルボン酸メチルのテトラヒドロピラニル誘導体のアルキル化と、引 き続きのアミノ化から得ることができる。酸処理により、テトラヒドロピラニル 保護基を除去し、そして還元条件により、７，８−ジヒドロ−７−（または８） −［反応性官能基コ三環式複素環が得られる。ジヒドロピロール環窒素は、イソ ブチル基で保護することができる。５’　−ＤＭＴ−３’　−ホスホアミダイト −６−インブチルヌクレオシドは、標準自動合成法によ）て配列特異的オリゴヌ クレオチドに挿入することができる。この方法で製造されたオリゴヌクレオチド は、ピロロ［２，３−ｂコーイミダゾ［２，３−ｄ］ピリジン−４−オン（５Ｈ ）−７−（または８）−［反応性官能基］を含み、その７，８−ジヒドロ環は、 正規のグアニン部分と置き代わる。
３−デアザ−アデニンで修飾されたオリゴヌクレオチドの３位に結合した連結官 能基は、例えば、反応性官能基を５−カルボキシメチルイミダゾール−４−カル ボン酸ジメチルのテトラヒドロピラニル誘導体のメチレン部分に結合することを 含む多段階合成法によって得ることができる。Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｈｅ ｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ａ、ワイスバー力―（Ｗｅｉｓｓ ｂｅｒｇｅｒ）監修、イミダゾールおよび誘導体（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ　ａｎｄ 　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、第１部、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉ ｅｎｃｅ）、　ニューヨーク（１９５３）を参照されたい。適肖な脱離基、例え ば、ハロゲン、スルホネート、トリクロロアセトアミドまたは共役二重結合系を 有する反応性官能基を用いる。修飾されたイミダゾールは、アンモニウム／３− デアザ−３−（反応性官能基）−１（または３）−テトラヒドロピラニルキサン タニンの熱生成によってアミン化することができる。
これらは、塩化ホスホリルで塩素化して、３位に置換した２、６−ジクロロ−３ −デアザプリンを与えることができる。これらの化合物を、アンモニアで選択的 にアミノ化し、接触水添分解を行って塩素原子を除去した後、慣用的なジフェニ ルカルバモイル基で保護することができる。これらの化合物を塩基性条件下で塩 化３′、５−ジー０−トルオイル−α−Ｄ−エリトロ−ベント−フラノシルを用 いてデオキシリボシル化した後に糖保護基を選択的に脱保護することにより、４ −（ジフェニルカルバモイル’）−１−（２−デオキシ−β−り一エリトロベン トフラノシル）−７−［反応性官能基］イミダゾ［４，５−ｄ］ピリジンが得ら れる。これらを、慣用的な様式でそれらの５’　−ＤＭＴ−３’　−シアノエチ ルホスホアミダイトに変換し且つオリゴヌクレオチドに取り込むことができる。
連結した官能基をリボ−オリゴヌクレオチドの２′位に結合するために、いくつ かの典型的な合成法が考案された。
合成法１．　アラビノプリンヌクレオシドの２′−脱離基の核置換。
アデニン若しくはグアニンまたはそれらのヌクレオシド類似体の２′位上方の脱 離基（２′−デオキシ−２′−（脱離基）アラビノｌｉ）の核置換を用いること ができる。この種類の一般的な合成法は、Ｍ、イケハラ（Ｉｋｅｈａｒａ）ら、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、第３４巻、１１３３〜１１３８頁（１９７８）；同第 ３頁（１９７８）：同第２６巻、２４０〜２４４頁（１９７８）；Ｍ、イケハラ Ａｃｃｏｕｎｔｓ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、第２巻、４７ 〜５３頁（１９６９）；およびＲランガナタン（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ）Ｔｅ ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、第１５巻、１２９１〜１２９４頁（１９ ７７）に記載された。したがって、グアニン、アデニン、シトシンおよびチミン のβ−Ｄ−アラビノフラノシル誘導体（アルドリッチ・ケミカル・カンパニー） は、既知の方法によってそれぞれ、Ｎ２−イソブチル、Ｎｅ−ベンゾイルおよび Ｎ４−ベンゾイルとして保護することができる。アラビノフラノシルヌクレオシ ドの３’　、５’−ヒドロキシルの同時保護は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｉｄＣｈ ｅｍｉｓｔｒｙ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐ ｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。
３部、２２９頁（１９８６）に示された既知の方法によって１，３−ジクロロ− １、１，３，３−テトライソプロピルジシロキサンを用いて達成することができ る。２′−ヒドロキシ基は、トリクロロアセトニトリルおよび水素化ナトリウム ［Ｔｅ、ｔｒａｂｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、、第２３巻、４０９〜４１２頁 （１９’８２）］またはトリフルオロメチルスルホン酸無水物および水素化ナト リウムでの処理によって核置換に対して活性化される。これらの脱離基は、置換 へテロ原子、例えば、窒素、硫黄、酸素またはセレンによる転化を伴って置換さ れ、３’、５’−シリルに保護されたヌクレオシドの２′位の連結した反応性官 能基を与えることができる。次に、これらのヌクレオシドを、例えば、フッ化物 イオンによって脱保護し且つオリゴヌクレオチドに挿入するためのそれらの５′ −ＤＭＴ−３’　−シアノエチルホスホアミダイトに変換することができる。
合成法２．２．２’　−アンヒドロピリミジンの核置換。
ヌクレオシドチミン、ウラシル、シトシンまたはそれらの類似体を、Ｊ、Ｊ。
フォックス（Ｆ　ｏ　ｘ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍ ｉ　ｓ　ｔｒｙ、第２９巻、５５８〜５６４頁（１９６４）に記載の２．２′− シアノヒドロヌクレオシドの仲介によって２１−置換ヌクレオシドに変換する。
合成法３．２′　−カップリング反応。
非保護２′−ヒドロキシル基を有する、適当に３’、５’　−糖および塩基で保 護されたプリンおよびピリミジンヌクレオシドを、イノウニ（Ｉｎｏｕｅ）ら、 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｒｓｅａｒｃｈ、第１５巻、６１３１〜６１４ ８頁（１９８７）の方法により請求電子試薬、例えば、ヨウ化メチルおよびジア ゾメタンと結合させて、２’　−ＯＭｅ基Ｈを含む混合配列を与える。
合成法４．２−デオキシ−２−置換リボシル化。
適当に保護された核酸塩基および核酸塩基類似体の２−置換−２−デオキシリボ シル化は、Ｅ、Ｔ、ジャーヴイ　（Ｊａｒｖｉ）ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆ 　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、第８巻、１１１１〜１１１４頁（１９８９）および り、　Ｗ、　バーチル（Ｈｅｒｔｅｌ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎ ｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５３巻、２４０６〜２４０９頁（１９８８）に報 告された。
合成法５．２′−デオキシ−２′−置換ヌクレオシドの酵素的合成法。　ピリミ ジンおよびプリンのリポまたはデオキシリポ加すン酸分解の助けによる一方のヌ クレオシドから他方への２−デオキシ−２−置換グリコシル転位は、Ｊ、　Ｒ。
ライドアウト（Ｒｉｄｅｏｕｔ）およびＴ、　Ａ、クレニツキ（Ｋｒｅｎｉｔｓ ｋｙ）、米国特許第８４．３８１，３４４号明細書（１９８３）に記載された。
合成法６．　新規の置換基への２′　−置換基の変換。
２′−置換−２′−チオキンヌクレオシドを、標準化学操作によって新規の置換 基に変換する。例えば、Ｓ、クラデク（Ｃｈｌａｄｅｋ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌｏ ｆ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ、Ｎｕｃｌｅｓｉｄｅｓ　＆　Ｎｕｃｌｅｔｉ ｄｅｓ、第７巻、６３〜７５頁（１９８０）に、アラビノフラノシルアデニンか ら製造された２′−デオキシ−２′−アジドアデノシンの２′−チオキシ−２′ −アミノアデノンンへの変換が記載されている。　合成法７　フリーラジカル反 応。
フリーラジカル反応によるハロゲン置換ヌクレオシドの２′−チオキシ−２′− 置換ヌクレオシドへの変換は、Ｋ、Ｅ、Ｂ、バー’）ス（Ｐａｒｋｅｓ）および に、ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、第 ２９巻、２９９５〜２９９６頁（１９８８）に記載された。
合成法８　リボヌクレオシドの２′−デオキシ−２′−置換ヌクレオシドへの変 換。
非保護２′−ヒドロキシル基を有する、適当に３’、５’　−糖および塩基で保 護されたブ１ルおよびピリミジンヌクレオシドを、２′−ケト基に対する酸化処 理、求核試薬との反応、そして最後に２′−脱酸素化によって、２′−デオキシ −２′　−置換ヌクレオシドに変換するーこの種類の方法は、Ｆ、デ・ラス・ヘ ラス（Ｄｅ　Ｉａｓ　Ｈｅｒａｓ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ。
第２９巻、９４１〜９４４頁（１９８８）に記載された。
２′−デオキシリボフラノシル部分の１′位の官能基は、１′位にヒドロキシル メチル基を有することがアデノシンとは異なるヌクレオシド抗生物質であるブシ コフラニンから得ることができる。３’、５’−ヒドロキシルは、１．３−ジク ロロ−１，、１，３，３−テトライソプロピルジシロキサンによって保護した後 、トリフェニルメチル基で１′−ヒドロキシメチルを保護することができる。２ ′−ヒドロキシ基は、既知の方法にしたがって、チオカーボネートの生成および 引き続きの水素化トリーｎ−ブチルでの処理によって脱酸素化することができる 。
Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、第１０５巻、４０５９〜４０６５頁（１９ ８３）を参照されたい。Ｎ６−アミノ基はベンゾイル化することができ、トリチ ル基は酸によって除去され、そして得られた第一ヒドロキシ基は、水素化ナトリ ウムおよびトリクロロアセトニトリルによってトリクロロアセトアミデートに変 換される。種々の連結／反応性官能基との置換反応は、次の段階で容易に達成す ることができる。ジシリル保護基は、フッ化物イオンで除去することができ、そ して得られた２′−デオキシヌクレオシドは、既知の方法によってオリゴヌクレ オチドに挿入 するための５’−ＤＭＴ−３’−ホスホルアミダイトに変換することができる。
４′位の反応性官能基は、ｔ−ブチルジメチルシリル基で５′−ヒドロキシルを 、テトラヒドロピラニル基で３′−ヒドロキシルを選択的に保護することによっ て２′−チオキンヌクレオチド（シグマ・ケミカル・カンパニー）から得ること ができる。シリル基は、フッ化物イオンによって除去される。フィッッナー・モ フ７ット（Ｐｆｉｔｚｎｅｒ−Ｍｏｆｆａｔｔ）酸化法［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、第８５巻、３０２７頁 （１９６３）を用いて、５′−アルデヒドを得た後、ホルムアルデヒドで処理し て４′−ヒドロキソメチル誘導体を与えることができる。
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、４３５　（１９７７）ｏこれらのデ オキシヌクレオシドは、それらの５′−トリチルとして、トリクロロアセトニト リルおよび水素化ナトリウムによって４′−トリクロロアセトアミドに変換する ことができる。次に、反応性官能基をアセトアミデートの核置換によって４′位 に配置する。酸処理により、５′位および３′位の保護基を除去する。これらを 、引き続き５’　−ＤＭＴ−３’−シアノエチルホスホアミダイトとして製造し 、そして修飾されたオリゴヌクレオチドに自動固相ＤＮＡ合成機によって挿入す ることができる。
２′−デオキシ−２−イミダシロン−４−カルボキサミド−５−反応性官能基な どの反応性官能基で置換した短縮されたグアノシンヌクレオシド（単環式）の合 成は、２−ブロモメチル−２−イミダシロン（ＩＨ，３Ｈ）−４−カルボン酸エ チルと反応性官能基求核試薬、例えば、ヒスタミン、ヒドロキシエチルイミダゾ リルおよびメルカプトエチルイミダゾリルとの反応から製造することができる。
反応性官能基に結合した中性または陰イオン性の他のへテロ原子求核試薬も同様 に用いることができる。これらの化合物を、塩化ジフェニルカルバモイルおよび 塩基によって２−ｏ−ジフェニルカルバモイル誘導体として保護し、そして塩化 ３．５−ジー０−（４−メチルベンゾイル）−α−り一エリトロベントフラノシ ルで２′−デオキシリボシル化する。糖の３’、５’　−ジヒドロキシは、塩基 によって選択的に脱保護され、５’　−ＤＭＴ−３’　−シアノエチルホスホア ミダイトとして再度保護される。これらのイミダゾールヌクレオシドは、既知の 方法によってオリゴヌクレオチドに挿入することができる。シトシン、アデニン 、グアニンおよびイミダゾール塩基上のアシル保護基を除去するのに必要な強塩 基条件は、カルボン酸４−イミダゾールを４−カルボキサミド部分に変換する。
４−アミノイミダゾール−２−オンで修飾されたオリゴヌクレオチドの５位の反 応性官能基は、２．５−ジブロモ−４−二トロイミダゾール［Ｊｏｕｒｎａｌｏ ｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、第１２１巻、９４７頁（１９２２）コ を、塩化３．５−Ｏ−（ｐ−メチル−ベンゾイル）−α−り一エリトロベントフ ラノシを用いて塩基性条件下でデオキシリボシル化することによって製造するこ とができる請求核反応性官能基にょる５−ブロモ基の選択的置換により、種々の ブロモニトロデオキシヌクレオチドが得られた。２−ブロモ基の置換および引き 続きの４−二トロ基の還元により、４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−り一 エリトロベントフラノシ）イミダゾール−２−オン（３Ｈ）が得られて、それを 、それらの５’　−ＤＭＴ−３’　−シアノエチルホスホアミダイトを介してオ リゴヌクレオチドに挿入することができる。
２−アザ−３−デアザ−２′−デオキシアデノシンの３位に位置した反応性官能 基は、４，７−ジクｃｏｏイミダゾ０　［４，５−ｄ］　ピリダジン［Ｊ、　Ｏ ｒｇ。
Ｃｈｅｍ、、第２３巻、１５３４頁（１９５８）］を、］塩化３，５−ジー○− メチルベンゾイル）−α−Ｄ−エリトロペントフラノシルを用いて塩基性条件下 でデオキシリボシル化することから製造することができる。これを液体アンモニ アでアミノ化して、４−アミノ−７−クロロ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エ リトロ−ペントフラノシル）イミダゾ［４，５−ｄ］　ピリダジンを与える。次 に、反応性官能基を、塩素原子の核置換によって７位に挿入する。例として、７ −炭素位に位置した反応性官能基に結合した窒素、酸素、硫黄、セレン等のよう なヘテロ原子がある。４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペン トフラノシル）−７−クロロイミダゾ−［４，５−ｄ］　ピリダジンをｔ−ブチ ルジメチルシリル基で保護した後、塩素原子をトリフェニルポスポラン試薬を用 いて置換することにより、炭素架橋反応性官能基が得られる。次に、７位に連結 した反応性官能基である４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペ ントフラノシル）−７−クロロイミダゾ［４，５−ｄ］　ピリダジンを、５’　 −ＤＭＴ−３′　−ホスホルアミダイトを介してオリゴヌクレオチドに挿入する 。
σ−アラビノフラノシルオリゴヌクレオチドの２′位に反応性官能基を結合させ るために、ソリル化複素環を、ルイス酸触媒を用いて１−０−アセチル−２゜３ ．５−４リーＱ−ベンゾイル−Ｄ−アラビノフラノース［ファンステイール・ラ ボラトリーズ・インコーホレーテッド（Ｐｆａｎｓｔｉｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）］でグリコジル化することができる。得られたα−ヌクレ オシドの糖のベンゾイル基を、メタノール性アンモニアで選択的に除去し１次に 、３’　、５’　−ヒドロキシルを１．　１．　３．　３−テＦ・ライソブロピ ルジシロキサンで再度保護する。反応性官能基をミツノブ（ＦｖＮ　ｔ　５ｕｎ ｏｂｕ）反応によって２′−ヒドロキシル基に結合させる。合成法１（１９８１ ）。次に、フ・ソ化物イオンによる脱保護により、２′−［連結反応性官能基］ 　−１−（ａ−Ｄ−アラビノフラノース）ヌクレオシドが与えられ、それらをそ れらの５’　−ＤＭＴ−３′−シアノエチルホスホロアミダイトを介してオリゴ ヌクレオチドに挿入することができる。
官能基は、天然に存在するヌクレオシドまたはそれらの塩基類似体の６′位に対 して、Ｋ、ビガダイク（Ｂｊｇｇａｄｊｋｅ）ら、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、。
Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１０８３　（１９８７）に記載されたように、炭素 環式３．５−ジーＯ−ベンジルー２−デオキシ−α−１，６−ニポキシーＤ−エ リトロベントフラノースの保護された複素環を直接求核攻撃することによって結 合することができる。この種類の反応は、炭素環式２′−デオキシヌクレオシド を与え、ヒドロキシル基はシクロペンタン環のα面上の６′位に置かれる。ここ で、官能基を、直接カップリング（すなわち、ミツノブ条件、トリフェニルホス フィン／ＤＥＡＤ）または二重置換反応によって非保護ヒドロキシル基に結合す ることができる。この種類の化合物の脱ベンジル化に続いて５’　−ＤＭＴおよ び３′−β−シアノエトキンジイソプロピルホスホアミダイトを標準法によって 生成することによりモノマーが得られ、それを固相自動ＤＮＡ合成機によってオ リゴヌクレオチドに挿入することができる。
４位に位置したチオキンリボフラノシル部分を有するピリミジンＣ−ヌクレオシ ド型化合物は、官能基を結合するのに利用できる３位の環窒素原子を有する。
これらの種類のヌクレオシドは、保護されたピリミジンの４−カルバニオンを介 して、３．５−ジー〇＝トルオイルー２−デオキシーα−エリトロペントフラノ シル塩化物の塩素原子を置換することによって合成することができる。Ｇ、　Ｄ 。
デヴス（Ｄａｖｅｓ）およびＣＣ，チェノ（Ｃｈｅｎｇ）、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉ ｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ、第１４巻、３０４−３４９頁（１９７８）、適当な官能基を、一般 的に既知の方法によって保護されたピリミジンの３位に配置することができる。
トルオイル基とそれに続＜ＤＭＴの選択的除去およびホスフィチル化により、オ リゴヌクレオチドに挿入するだめの望ましいモノマーが得られる。
８位に位置した官能基を有するキナゾリンデオキシリボンドは、Ｒ，Ｏ，アラテ ン（Ｏｕｔｔｅｎ）およびＧＤ、デヴス・ジュニア（Ｄａｖｅｓ、Ｊｒ）、ｔｈ ｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５２巻、 ５０６４ページ（１９８７）に記載されたように、フラノイドグリカールと７− トリブチルスタニル化複素環とのパラジウムに媒介されたカップリングによって 得ることができる。
操作についての何等かの特別な理論によって結合させるのを望むのでなければ、 本発明で記載した反応性ＲＮＡ開裂官能基は、１、酸／塩基触媒によるホスホジ エステル結合開裂；２、主鎖糖開裂； ３、塩基アルキル化開裂、かまたは ４、糖アルキル化、すなわち、２′　−ヒドロキシル架橋に関与する機序によっ て作用すると考えられる。
本発明の一つの重要な態様は、本発明の標的設定部分と標的ＲＮＡとの間に形成 された適当な反応性官能基の小溝または側面の位置および配向である。この要約 を表１に与え、各反応性官能基を示唆された作用機序にしたがって記載する。
Ｉｌｅ　電　ミ　支　夏　定 ホスホジエステル結合開裂は、スキーム１でそれぞれＸ１ＹおよびＺで表わされ たプロトン受容性、プロトン供与性かまたは電子受容性の官能基を、このような ホスホンエステル結合に隣接して計画的に配置することによって達成することが できる。
式中、Ｂ、およびＢ２は塩基単位である。ある種の用途にお０て、化学基の内の 一つは十分にＲＮＡ開裂を触媒する。しかしながら、本発明の他の用途１こおし λては、２種類の基の組み合わせまたは３種類でも好ましいことがある。当業者 １ま、特定の反応性官能基ＸＳＹおよび／またはＺを極めて自由に選択できる。
更Ｉこ、同一分子内で１種類以上の反応性官能基を用いることも極めて自由；こ 選択できる。
本発明によるホスホジエステル結合開裂反応性部分を形成することができるプロ トン受容性官能基の例としては、ホスホジエステル結合の塩基触媒作用が可會詮 であるヘテロ原子の塩基がある。概して、アンモニア住棟、例えば、アリールお よびアルキルアミン並びにアルキルおよびアルキルヒドラジンが好ましく１゜複 素環式窒素組成物、特に、イミダゾール、ピリジン、アジン、オキサゾール、チ アゾールおよび類似のものが更に好ましい。これらの種の内、１−１２−および ５−イミダゾールは最も好ましい。これらの組成物はそれぞれ、塩基触媒作用１ こ対して利用可能な種々の窒素原子の電気陰性度を変化させるため１こ広範囲１ こ置換することができる。更に、アルキルおよびアリールアミジウム種ｉｔ最も 好まし０゜カルボン酸および前記のアンモニア住棟のそれらの誘導体は最も好ま しい。
本発明の組成物および方法においてプロトン受容性機能として有用であることが できる種の別の種類は配位錯体である。これらを表１の実施例２として表わす。
配位錯体は、この点において、金属イオンと、その金属上の配位部位全部がリガ ンドによって占められているのではなく、したがって１か所以上の空の部位が残 っているように設計されたりガントとを一緒に有することにより有用である。溶 液中では、空の部位が水分子によって占められて、金属に対して配位される部分 −ＯＨを導く。基−ＯＨは塩基として働いて、２′プロトンを奪い且つホスホジ オステル結合開裂を行うことができる。金属イオンとの配位のためのリガンドの 選択は、三つの重要な要件に従わなければならない。第一に、それらは金属を標 的Ｒ，ＮＡ付近で保持することができなければならないし、そして奪われる２′ プロトンの付近に配位錯体上のヒドロキシル基（ＨＯ−ＭＬとして表すことがで きる）を「進ませ」なければならない。リガンドは本発明の組成物と標的ＲＮＡ との間に形成された二重鎖と好都合に相互作用するように設計される。
リガンドの第二の重要な機能は、加水分解した金属のｐＫａを調節することであ る。配位錯体であるＨＯ−ＭＬは、プロトンを奪うための適当な配向でヒドロキ シル基を与えるのみならず、適当なｐＫａでヒドロキシル基を与えることによっ て標的ＲＮＡの開裂を触媒する働きをすることができる。適当なｐＫａは、本発 明の方法を実施する際に存在するｐＨに依存する。保持される適当なｐＫａは、 ヒドロキシル基がプロトンを奪うために十分にイオン化されているようにあるの が好ましいが、ヒドロキシル基のプロトンを奪う性質がなくなるほど低くはない 。
リガンドは、好ましくは、加水分解された金属錯体のｐＫａを調整して、これら の目的を達成するように本発明にしたがって選択される。
リガンドの第三の重要な機能は、レドックス反応を調節することである。２種類 以上の酸化状態を有する金属イオンの場合、リガンドは一つの酸化状態を他に優 先して安定化し、そして拡散性で毒性の、通常は酸素を含有するラジカルの発生 を妨げるかまたは遅延させる。
拡散性の酸素含有ラジカルを発生させるためのものを含む他の配位錯体を本発明 の他の実施態様によって用いることができるが、これらは、以下に記載した種々 の機序によって標的ＲＮＡを開裂すると考えられる。
本発明で用いるのに好ましい金属イオンとしては、Ｃａ＋２、Ｓｃ＋３、Ｃｒ＋ ３、Ｍｎ″″２、Ｆｅ″″３／“２、（：ｏ＋７＋ｌ、Ｚｎ”、ＡＩ”３、Ｇａ ”、Ｒｈ”！、Ｍｇ′″２がある。リガンドとしては、多座配位子、カルボン酸 塩、アミ人ヒドロキサム酸、カテコレート、複素環式アミンおよびペプチドがあ る。これらの種類のりガントとしては、制限されないが、ＥＤＴＡＸＮＴＡ、ビ ピリジル、フェナントロリン、デスフエフキサミン、エンテロバクチン（および その類似体）、ｇＩｙ　ｇｌｙ　ｈｉｓおよびｇｌｙ　ｇａｙ　ｇｌｙがある。
　これらの反応性官能基を、任意の好都合な方法で、通常はアミドの働きによっ て本発明の組成物を含む分子の残りに結合させる。当業者にとって、好都合な連 結手段によってこれらの発明の組成物の標的設定部分に対して反応性官能基を結 合させるのに適当な手段を選択するのは難しいことではない。　本発明の他の実 施態様により、プロト　゛ン供与性の酸性媒質を、ホスホジエステル結合の加水 分解の酸触媒作用を行なわせるために反応性官能基として用いることができる。
このような官能基をスキーム１の基Ｙとして示し、特定の実施態様を表１の実施 例３に示す。多数の酸のいずれもが、本発明によるホスホジエステル結合の酸触 媒による加水分解のためのプロトンを供与するのに有効であると考えられる。こ のような酸機能としては、カルボン酸および複素環式酸がある。
複素環式酸性官能基の種類の内、テトラゾールおよびトリアゾールが好ましい。
テトラゾールおよびトリアゾールの窒素原子のいくつかは実質的酸性度を有する ことが知られている。それらは、このような加水分解反応の触媒作用に用いるこ とができると考えられる。酸性官能基は、本発明による全ての反応性種と同様に 、組成物の標的設定部分に結合する。
ヌクレオチド中のホスホジエステル結合の加水分解は、三方ビピリミダル（ｂｉ ｐｙｒｉｍｉｄａｌ）の幾何学的形を有し且つ電荷が−２であるリン原子での５ 座配位構造によって進行すると考えられる。この遷移状態を安定化することがで きる電気陽住棟の存在は、触媒作用によって開裂反応を助けると考えられる。
このような種は、電気陽性残基であると考えることができ、スキーム１の基Ｚと して表わされる。このような官能基の例を、表１の実施例４に示す。これらの反 応性官能基は、２か所の空の部位を有する配位錯体を含むことができる。２か所 の空の部位は、リンの遷移状態に関して配位し且つそれを安定化させると考えら れる。この目的に有用であることができる反応性官能基の中には、Ｃａ＋２、Ｓ ｃ”、　Ｃｒ”、Ｍｎ”２、　ｌ；”　ｅ　＊　３　／　４　ｌ、　Ｃｏ＋２／ ”Ｉ、Ｚｎ”、　Ａ　１１３、　Ｇａ”、Ｒｈ”、ｙｌ　ｇ−２などの金属イオ ンを含むものがある。このような配位錯体を生成するのに適当であるリガンドと しては、多座配位のカルボン酸塩、アミン、ヒドロキサム酸、カテコレート、複 素環式アミンおよびペプチドがある。
ラジカル生成残基、特に、酸素ラジカルを生成するものを、本発明の組成物の反 応性官能基として用いることもできる。ラジカル発生種を本発明の組成物の反応 性部分として用いる場合、それらは、組成物と標的設定ＲＮＡとの間に生成され た錯体の小溝に送られることが不可欠であると考えられる。小溝への送出は、不 利益で且つ潜在的に有害な副作用を伴うことなく、高収率でのそれらの有効な操 作に対して不可欠であると考えられる。ラジカル発生種を優先して用いることは 、生成されたラジカルを含むかまたはそれに関連した毒性化合物の移動によって 果たされて、他の細胞内の種に対して毒性および損傷を結果として生じることが 知られている。これらの種の小溝への送出は、これらの負の効果を未然に防ぐか または少なくとも実質的に減少させると考えられる。多数の有機ラジカル発生種 、例えば、キノン、クマリン、および活性酸素を生じることができる他の物質を 用いることができる。
配位錯体は、更に、小溝のラジカル発生物質として用いることもできる。適当な りガントによって錯体が作られた場合に並びに還元剤および酸素の存在下におい て利用できる酸化状態が２種類以上あるある種の金属は、オリゴ核酸標的を開裂 することができる酸素ラジカル種を生じることが知られている。有機ラジカル発 生種の場合と同様に、配位錯体を、組成物と標的ＲＮＡとの間に形成されたハイ ブリッドの小溝に送出することは不可欠である。
ラジカル種を発生するのに有用な配位錯体としては、鉄、銅およびモリブデンと 、リガンド、例えば、カルボン酸、アミン、複素環式窒素含有種、例えば、フェ ナントロリン、ジピリジル、イミダゾールまたはペプチジルリガンド、例えば、 ｇａｙ　ｇｌｙ　ｈｉｓＳｇａｙ　ｇｌｙ　ｈｉｓ　Ｉｙｓおよびｇｌｙ　ｇｌ ｙｇｉｙ　ｇｌｙ並びにヒドロキサム酸との錯体がある。これらのリガンドを混 合して、本発明の範囲内の一層有効な組み合わせを生じることができる。
本発明の組成物の反応性部分として役立つことができる更に別の群の残基はアル キル化剤である。いくつかの種類のアルキル化剤が当業者に知られており、一般 的にはβ、β−ハロエチルアミンであるＮ−マスターＶ種が挙げられる。他のア ルキル化剤、例えば、α−ハロケトン、ハロゲン化スルホニル、アジリジン、ア リル型ハロゲン化物、エポキシド、アルキル／アリールハロゲン化物並びにブソ ラリンなどの光活性化アルキル化剤を用いることもできる。マイケル反応許容組 成物も、本発明の実施に用いることができる。
小溝または側面に暴露された標的ＲＮＡの２′−ヒドロキシル基は、ヘテロ二重 鎖の小溝に更に残っている連結した電子性官能基と一緒に結合を生成するための 核中心として役立つ。ヌクレオチドに対して適当に結合するための電子性の種類 は前記に記載されている。標的ＲＮＡは、修飾されたオリゴヌクレオチドとＲＮ Ａ　２’　−ヒドロキシル基との間の共有結合の生成によって失活する。
ここで、構造活性関係の研究により、ある種の２′−糖で修飾されたオリゴヌク レオチドのそのＲＮＡ標的（相補体）に対する結合性（Ｔｍ）の有意の増加は、 ヘテロ二重鎖の増大したｒＡＪ型コンホメーションに相関することが発見された 。
更に、修飾されたオリゴヌクレオチドの絶対適合度が維持される。本出願人の２ ′−糖で修飾された配列特異的オリゴヌクレオチドの増大した結合性によって、 リンで修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、文献で知られてい るようなホスホン酸メチル、ホスホロチオエート、リン酸トリエステルおよびホ スホアミダイトと比較して優れた力価および特異性が得られる。
ＤＮＡおよびＲＮＡ二重鎖の間の唯一の構造的な違いは、ＤＮＡリポフラノシは ヒドロキシル基であることである（ウラシル理系のメチル基の存在または不在は 影響しない）。しかしながら、全体のフンホメーション上の違いがＤＮＡおよび ＲＮＡ二重鎮間に存在する。
核酸繊維のＸ線回折分析［アーノット（Ａｒｎｏｔｔ）およびハキンス（Ｈｕｋ ｉｎｓ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅ ａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、第４７巻、１５０４〜１５１０頁（１ ９７０）］および二二重鎖酸の結晶分析により、ＤＮＡは、ｒＢＪ型構造をとり 、ＲＮＡだけがより一層剛性のｒＡＪ型構造をとることが知られている。ＤＮＡ およびＲＮＡのヌクレオシドモノマー単位の糖のひだ（「Ｂ」型ＤＮＡのＣ２’ 末端およびｒＡＪ型ＲＮＡのＣ３’末端）の間の違いが、二重鎖核酸の主要なフ ンホメーション上の違いである。
ベントフラノノル残基コンホメーションに対する主要因は、２′位の置換基の性 質である。例えば、Ｃ３’末端型の群は、２′−置換基の電気陰性度が増大する ので、Ｃ２’末端に関連して増大する。例えば、２′−チオキシ−２′−ハロー アデニンヌクレオシドの内の２′−フルオロ誘導体は、Ｃ３’末端について最大 の群（６５％）を示し、２′−ヨードは最低（７％）を示す。アデノシン（２’ −０Ｈ）およびデオキシアデノシン（２’−Ｈ）のそれらは、それぞれ、３６％ および１９％である。更に、アデニンジヌンレオチド（２′　−デオキシ−２′ 〜フルオロアデノシン−２′−チオキシ−２′−フルオロアデノシンまたはウリ ジン）の２′−フルオロ基の効果は、リポまたはデオキシリボで修飾された二量 体以上の積み重ねられたコンホメーションの安定化に更に相関する。研究により 、ジヌクレオシドリン酸は、Ａ−Ａの場合と同様の幾何学的形であるが、Ａ、− Ａよりも大きい塩基−塩基オーバーラツプを有する積み重ねられたコンホメーシ ョンを冑することが示される。Ｃ２’　−Ｆ結合の高度に極性の性質およびＣ３ ’末端のひだのための極端な優先は、ｒＡＪ構造の積み重ねられたコンホーメヨ ンを安定化することができると考えられる。
紫外線淡色性、円二色性およびＩＨ−ＮＭＲからのデータにより、積み重ねの程 度は、ハロゲンの電気陰性度が減少するに従い減少することが示される。更に、 ２′位の立体的嵩高性は、ｒＢＪ型二重鎖よりもｒＡＪ型二重鎖においてよりよ く適合する。
したがって、ジヌクレオシド−リン酸の３′−ヌクレオチジル単位上の２′−置 換基は、積み重ねコンホメーションに対する多数の効果、すなわち、立体折力、 フラノースひだの優先、静電折力、疎水性引力および水素結合能力を示すと考え られる。これらの置換基の効果は、分子の大きさ、電気陰性度および置換基の疎 水性によって決定されると考えられる。
２′−ヨード置換ヌクレオシドは、ハロゲン系列の最低のＣ３’　−末端群（７ ％）を有する。例えば、立体効果単独では、２′−ヨードが予想されるかまたは 類似の基が積み重ねの不安定性に寄与すると考えられ、したがって、アンチセン スオリゴヌクレオチドに対する結合性（Ｔｍ）ｓが減少する。しかしながら、ヨ ウ素原子および類似の基の一層低い電気陰性度および高い疎水性引力は、積み重 ねの安定性および結合強度を予想する能力を複雑にする。　２′−デオキシアデ シン、シチジンおよびウリジンジヌクレオシドリン酸の２’　−ＯＭｅ修飾に関 する研究により、対応する非メチル化種（２’　−０Ｈ）に関して増大した積み 重ねの効果が示される。この場合、メチル基の疎水性引力は、その立体的嵩高性 （妨害）の不安定化作用を克服するのに役立つ。
２′−フルオロ−２′・−デオキシアデノシンは、ヌクレオシドの中に極めて多 数の群の３′−末端ひだを有することが確認された。アデノシン、２′−デオキ シアデノシンおよび他の誘導体の群は、典型的に、３′末端コンホーマーの４０ ％未満である。十分に積み重ねられたオリゴヌクレオチドのヌクレオシド残基に は３′末端リポフラノースひだが有利であることが知られている。
融解温度（相補的結合）は２′−置換アデノシンニリン酸にしたがって上昇する 。コンホメーションの３′末端優先または置換基の存在が、増大した結合性の原 因であるかどうかは明らかではない。しかしながら、記載したように、隣接する 塩基の一層大きいオーバーラツプ（積み重ね）は、３′末端コンホメーシヨンで 達成することができる。
一層強い結合を得るためのこの新規の方法は、標的ＲＮＡに対して結合するアン チセンスＲＮＡ擬態を製造することである。したがって、ランダム構造−活性関 係の方法では、適当にハイブリダイゼーション性が維持されているヌクレアーゼ 耐性アンチセンスオリゴヌクレオチドを発見することを行った。
アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびこれらの塩基のある種の類似体 の一連の２′−デオキシ−２′−修飾ヌクレオシドを製造し、そして修飾された ヌクレオシドとして固相核酸合成法によって配列特異的オリゴヌクレオチドに挿 入した。新規のア ンチセンスオリゴヌクレオチドについて、ヌクレアーゼによる分解に耐える能力 および非修飾親オリゴヌクレオチドに匹敵するハイブリダイゼーション性を有す るそれらの能力について検定した。最初に、電気陰性度が小さい原子または基の 種類は、必要なワトソンークリック型塩基対水素結合（ハイブリダイゼーション ）を立体的に妨げるとは考えられないのでこれらを選択した。しかしながら、２ ′位の原子または基の電気陰性度による電子変化は、糖のコンホメーションに深 く影響することがある。本出願人の構造活性関係の研究中に、本出願人は、糖で 修飾されたオリゴヌクレオチドが、非修飾のもの（２′−デオキシリボシル型） よりも強ぐ標的ＲＮＡに対してハイブリッド形成したことを発見した。
本発明のもう一つの実施態様において、修飾された単位が修飾されたオリゴヌク レオチドの３′−末端の末端位置に直接結合するように、結合残基を考案した。
例えば、エステルまたは、更に好ましくは、ブロモメチルケト基を、５′−ヒド ロキシルがジメトキントリフェニルメチル基で保護され且つシトシン系列の複素 環ベンシイレートを有する修飾された２′−修飾ヌクレオシドの３′−ヒドロキ シルに結合させる。必要な標的配列が末端の３′−チミンまたはシトシン塩基を 有する場合、ブロモメチルケトリンカ−を含む所望の修飾チミンまたはシトシン 塩基を第一のモノマーとして用いて、通常のヌクレオチドのその３′−ヒドロキ シル基を介して結合したものを含むコントロールポアガラス（ＣＰＧ）固体支持 体に結合させる。ＣＰＧに結合したヌクレオシドに対して２′−修飾ヌクレオシ ドを結合させている塩基感受性エステル結合は、オリゴヌクレオチドをＣＰＧ支 持体から除去するのに利用される通常の濃水酸化アンモニウム条件下で開裂され る。これは、修飾されたオリゴヌクレオチドがその末端の３′末端に２′−修飾 単位を有することを可能にするものである。
核溶解酵素によるオリゴヌクレオチドの開裂には、酵素−基質錯体または、特に 、ヌクレアーゼ−オリゴヌクレオチド錯体の生成を必要とする。ヌクレアーゼ酵 素は、概して、適当に結合するためのオリゴヌクレオチドに位置した特異的結合 部位を必要とする。オリゴヌクレオチド結合部位が除去されまたは妨害されるこ とによって、ヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドに結合できない場合、ヌクレア ーゼ耐性オリゴヌクレオチドが結果として生じる。配列特異的回文二重鎖ＤＮＡ を開裂する制限エンドヌクレアーゼの場合、ある種の結合部位、例えば、３位お よび７位の環窒素が、必要な結合部位として同定された。これらの部位の１か所 以上を除去するかまたは識別配列内のこれらの特定の位置に接近するヌクレアー ゼを妨害することにより、特定のヌクレアーゼに対する様々な水準の耐性が得ら れた。
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、診断、治療に おいて並び」こ研究用試薬およびキットとして用いることができる。治療用の使 用に対して、オリゴヌクレオチドは、ある種のタンパク質に冒された疾患に罹患 している動物に対して投与される。このような疾患に罹患していると疑われる患 者に対して、その疾患の症状を減少させるのに有効なオリゴヌクレオチド量を与 えるのが好ましい。このような治療法に最適な投与量および治療計画を決定する ことは当業者の技術の範囲内である。
概して、本発明による治療薬を体内に、例えば、経口によって、静脈内にまたは 筋肉内に与えるのが一般的に好ましい。経皮的に、局所的にまたは病変内部など に投与する他の形態も有用であることがある。全剤中に封入することも有用であ ることがある。薬理学的に許容し得る担体の使用も、ある種の実施態様に好まし い。
下記の操作および実施例で、本発明の実施を例証する。これらの操作および実施 例は、本発明を制限するものとして解釈されるものではない。
本発明のヌクレオチドを製造したら、次に、引き続きそれらを本発明のオリゴヌ クレオチドに取り込ませることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、標準固相自動核酸合成機、たとえば、アプライ ド・バイオシステムズ・インコーホレーテッド（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ、Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）３８０Ｂまたはミリジエン（Ｍｉ　１　］ 　ｉｇｅｎ）／バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）７５００または８８００に よって合成される。トリエステル、ホスホアミダイトまたはホスホン酸水素塩カ ンブリング化学［Ｍ　カルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、０１　ｉｇ。
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇ ｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、、７〜２４頁。
Ｊ、Ｓ　コーエン（Ｃｏｈｅｎ）監修（ＣＲＣブレス・インコーポレッテッド（ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、）、ポカ・ラドン、フロリダ州、１９８９）］をこれらの 合成機で用いて、所望のオリゴヌクレオチドを提供する。ボウケージ（Ｂｅａｕ ｃａｇｅ）試薬［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、第１１２巻、１２５３〜１２５５頁（１９９０）］または元素 の硫黄［Ｓ、ボウケージら、Ｔｅｔｒ、ａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２ ２巻、１８５９〜１８６２頁（１９８’ｌ）］を、ホスホアミダイトまたはホス ホン酸水素塩化学と一緒に用いて、置換ホスホロチオニーチオリボヌクレオチド を提供する。
本発明の若干の化合物の製造では、一時的な保護基を用いた。このような保護基 は、化合物の合成の容易さについて考慮される。保護基は、引き続き望ましい官 能基に変換される。このような変換は、後の方の反応の標準脱保護工程中に生じ るのが好ましい。この方法を用いる一つの例として、アミノ官能基を導入するた めにフタルイミド基を用いることがある。アルキルフタルイミドは、問題の化合 物、例えば、ヌクレオシドの適当な位置に、適当な中間体、たとえば、Ｎ−（ハ ロアルキル）フタルイミドを介して結合される。次に、問題の化合物の合成を完 了したら、それを、ヌクレオチド合成機で標準オリゴヌクレオチド合成法を用い るオリゴヌクレオチド合成用の構造ヌクレオチドとして用いる。所望のオリゴヌ クレオチドが完成した後、それを合成様支持体から開裂させ、そしてその場合、 開裂試薬がアルキルフタルイミドを所望のアルキルアミンに更に変換するように する。前記の方法を発展させて、更に長鎖のポリアミノ官能基を本発明のオリゴ ヌクレオチドに対して結合させることができる。最初のアルキルアミノ官能基を 有するヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを、追加のＮ−（ハロアルキル） フタルイミドで処理する。次に、延長された官能基を処理して、末端アミン基を 生じる。これを繰り返して、所望通りにポリアミノ官能基を更に延長することが できる。或いは、延長されたポリアミノ官能基を最初に合成し、そして最初のア ルキルアミノ官能基と反応させて、ポリアミノ官能基を生成する。
操作１−ハイプリダイセーンヨン分析。
Ａ　修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシヨンの熱力学についての評価 本発明の修飾オリゴヌクレオチドの、それらの相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列に 対してハイブリッド形成する能力を、熱融解分析によって決定した。ＲＮＡ相補 体を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび、アプライド・パイオンステムズ・インコ ーホレーテッド３８０Ｂ核酸合成機で合成されたＤＮＡの鋳型プロモーターから 合成した。ＲＮＡ種は、ＦＰＬＣ［ＬＫＢファーマシア・インコーホレーテッド （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ、）］を用いるイオン交換によって精製された。
天然のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは特定の位置に修飾を含むものをＲ ＮＡかまたはＤＮＡの相補体に対して化学量論的濃度で加え、ランダムコイル転 移に対する二重鎖の吸光度（２６０ｎｍ）淡色性を、ギルフォード・レスポンス （Ｇｉｌｆｏｒｄ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ）ＩＩ分光光度計を用いて監視した。これ らの測定は、１０ミリモルＮａ−リン酸塩、ｐＨ７，４，０，１ミリモルＥＤＴ Ａおよび、イオン強度１０を生じる０、１モルかまたは１．０モルのＮａＣ１の 緩衝液中で行った。データは、１／Ｔｍ対Ｉｎ［Ｃｔ］を表わすグラフによって 分析され、但し、［Ｃｔ］は全オリゴヌクレオチド濃度であった。この分析から 、熱力学パラメーターを決定した。生成されたヘテロ二重鎖の二重鎖の安定性に 関して得られた情報に基づいて、オリゴヌクレオチドへの修飾ピリミジンの配置 を、ヘリックス安定性に対するそれらの効果に対して評価した。ハイブリッドの 安定性を激しく変化させる修飾により、自由エネルギー（デルタＧ）の減少およ び、アンチセンスオリゴヌクレオチドが製造された場合のそれらの有用性に関す る判断が示される。
Ｂ、修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイモーションの適合度本発明の修飾ア ンチセンスオリゴヌクレオチドの、標的ｍＲＮＡに対して絶対特異性によってハ イブリッド形成する能力を、全細胞のＲＮＡ存在下での精製標的ｍＲＮＡのノー ザンプロット分析によって示した。標的ｍＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプ ロモーターから下流に位置した標的ｍＲＮＡに対するｃ　ＤＮＡを含むベクター から合成された。合成されたｍＲＮＡは、アガロースゲル中で電気泳動を行って 、適当な支持体膜（すなわち、ニトロセルロース）に移した。支持体膜をブロッ クし且つ［！２ｐｌ−標識アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて探査した。
緊縮は、高温度かまたは洗浄緩衝液の低イオン強度での反復プロットおよび洗浄 によって決定された。オートラジオグラフィーを行ってヘテロ二重鎖生成の存在 を評価し、オートラジオグラムは、レーザーデンシトメトリー（ＬＢＫファーマ シア・インコーホレーテッド）によって定量された。ハイブリッド生成の特異性 は、標準法による全細胞のＲＮＡの単離し、そしてそれをアガロース電気泳動、 層転写および標識された修飾オリゴヌクレオチドを用いる探査によって分析する ことにより決定された。緊縮は、非修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに対し て予め決定され、そしてその条件を、特異的標的ｍＲＮＡのみが２′−修飾オリ ゴヌクレオチドとへテロ二重鎖を生成することができるように用いた。
操作２−ヌクレアーゼ耐性 Ａ、血清および細胞質ヌクレアーゼに対する修飾オリゴヌクレオチドの耐性の評 価。
天然のホスホロチオエートおよび本発明の修飾オリゴヌクレオチドの、血清ヌク レアーゼに対するそれらの耐性について、種々の濃度のウシ胎児血清または成人 血清を含む培地中でオリゴヌクレオチドをインキュベートすることによって評価 した。標識オリゴヌクレオチドを種々の時間でインキュベートし、プロテアーゼ にで処理した後、２０％ポリアクリルアミン−尿素変性ゲル上でのゲル電気泳動 によって分析し、そして引き続きオートラジオグラフィーを行った。オートラジ オグラムはレーザーデンシトメトリーによって定量された。修飾および既知の長 さのオリゴヌクレオチドの位置に基づいて、特定の修飾によるヌクレアーゼ分解 に対する効果を決定することが可能である。細胞質ヌクレアーゼに対しては、Ｈ Ｌ６０細胞系を用いた。ポストミトコンドリア上澄みを示差遠心分離によって製 造し、標識オリゴヌクレオチドを、この上澄み中、種々の時間でインキュベート した。インキュベーション後、オリゴヌクレオチドの分解について、血清の核溶 解分解に対して前記に概説したように評価した。オートラジオグラフィーの結果 について、非修飾、ホスホチオエートおよび修飾オリゴヌクレオチドを比較して 定量した。
Ｂ、特異的エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼに対する修飾オリゴヌ クレオチドの耐性の評価。
天然および２′−修飾オリゴヌクレオチドの特異的ヌクレアーゼ（すなわち、エ ンドヌクレアーゼ、３’、５’　−エキソヌクレアーゼおよび５’、３’　−エ キソヌクレアーゼ）に対する耐性の評価は、分解に対する修飾の正確な効果を決 定することを行った。
修飾オリゴヌクレオチドを、種々の選択されたヌクレアーゼに特異的な規定の反 応緩衝液中でインキュベートした。生成物をブロティナーゼにで処理した後、尿 素を加え、そして尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル上での分析を行った 。
ゲル生成物をスティング・オール（Ｓｔａｉｎｓ　Ａ１１）（シグマ・ケミカル ・カンパニー）を用いて染色することによって可視化した。レーザーデンシトメ トリーを用いて、分解の拡大を定量した。修飾の効果を、特定のヌクレアーゼに 対して決定し、そして血清および細胞質系から得られた結果と比較した。
操作３−５−リボキンゲナーゼ分析法、治療法および検定法人−治療法 治療使用に対しては、５−リポキンゲナーゼの過剰または異常供給を特徴とする 疾患を有すると疑われる動物を、本発明によるオリゴヌクレオチドを投与するこ とによって処置する。当業者は、最適の投薬量、投薬方法論および反復率を容夙 に決定することができる。このような処置は、治療効果がもたらされるかまたは 罹患状態の減少が達成されるまで続けるのが一般的である。長期間の処置は若干 の疾患に対して考えられる。
Ｂ、研究用試薬 本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、粗製細胞溶解産物または部分精製若しく は完全精製したＲＮＡ調製試料中の５−リポキンゲナーゼｍＲＮＡを開裂するか 、さもなければ変調するのに用いた場合、研究用試薬としても有用である。本発 明のこの用途は、例えば、標準法によって細胞を溶解し、最適には、ＲＮＡを抽 出し、次に、それを以下の実施例で記載したように、例えば、５０ミリモルリン 酸塩から成り、ｐＨが約３０〜約５０℃の温度で約４〜］０である緩衝液中の全 ＲＮＡ１０Ｋｇ当り、例えば約１００〜約５００ｎｇの範囲の１度での組成物で 処理することによって達成される。開裂した５−リポキノゲナーゼＲＮＡは、ア ガロースゲル電気泳動および放射性標識したＤＮＡプローブとのハイブリダイモ ーションによってまたは他の標準法によって分析することができる。
Ｃ１診断法 本発明の化合物は、更に、診断用途において、特に、種々の組織中の特定のｍＲ ＮＡ種の発現または異常な若しくは突然変異体のＲＮＡ種の発現の決定に有用で ある。この実施例において、オリゴヌクレオチド化合物は、異常な配列に対して 相補的に設計されることによって、仮説的異常ｍＲＮＡを標的とするが、正常の ｍＲＮＡに対してハイブリッド形成することまたはそれを開裂することはなかっ た。
組織試料は均一にすることができ、場合により、ＲＮＡを標準法によって抽出し た。粗製ホモゲネートまたは抽出物を処理して、例えば、標的ＲＮＡの開裂を行 うことができる。次に、生成物を、開裂部位の５′側の領域に対して相補的な結 合オリゴヌクレオチドを含む固体支持体にハイブリッド形成させることができる 。ｍＲＮＡの正常および異常の５′領域双方が、固体支持体に結合した。本発明 の化合物によって開裂した異常ＲＮＡの３′領域は、支持体に結合することはな かったし、したがって、正常ｍＲＮＡから分離された。
本発明の若干の好ましい実施態様を、下記の実施例によって例証する。変調のた めの標的ｍＲＮＡ種は５−リポキシゲナーゼに関する。当業者は、本発明がそれ に制限されないこと、しかしながら、それは一般的に応用できることを理解する 。５−リポキンゲナーゼ酵素の産生の阻害または変調は、疾患の処置において有 意の治療上の利点を有すると予想される。組成物の有効性を評価するために、１ 種類または一連の検定法が必要である。
Ｄ、インビトロの検定法 ５−リポキンゲナーゼに対する細胞検定法では、ヒト前骨髄球白血病細胞系ＨＬ −６０を用いる。これらの細胞は、種々の既知の試薬によって誘発させて、単球 様細胞かまたは好中球様細胞に分化させることができる。１．３％ジメチルスル ホキシド、すなわちＤＭＳＯによる細胞の処理は、細胞が好中球に分化するのを 促進することが知られている。ここで、基礎ＨＬ−５Ｑ細胞は、検出可能な水準 の５−リポキシゲナーゼタンパク質を合成しないしまたはロイコトリエン（５− リポキシゲナーゼの下流性成物）を分泌しないことが発見された。ＤＭＳＯによ る細胞の分化は、ＤＭＳＯを加えて４８時間後に５−リポキシゲナーゼタンパク 質の出現およびロイコトリエンの生合成を引き起こす。したがって、５−リポキ シゲナーゼタンパク質合成の誘発を、これらの細胞中の５−リポキシゲナーゼ合 成を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの分析用試験システムとして用い ることができる。　アンチセンスオリゴヌクレオチドについての第二の試験シス テムは、５−リポキシゲナーゼが、基質との反応によってそれ自体を失活させる という点でそれが「自殺」酵素であるという事実を用いる。分化したＨＬ−５Ｑ または５−リポキシゲナーゼを発現する他の細胞を、１０マイクロモルＡ２３１ ８７、すなわち、カルシウムイオノフオアで処理することは、酵素が引き続き活 性化することによって、５−リポキシゲナーゼが細胞質ゾルから膜へ転座するの を促進する。活性化および数回の触媒作用の後、酵素は触媒としては失活する。
したがって、カルシウムイオノオアによる細胞の処理は、内因性５−リポキシゲ ナーゼを失活させる。細胞がＡ２３１８７処理から回復するには、ロイコトリエ ンＢ４を合成するそれらの能力によって測定したところ、約２４時間を要する。
５−リポキシゲナーゼに対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 下記の定量的検定法を用いて２種類のＨし一６０モデルシステムの活性について 試験することができる。検定法は、完全な細胞での５−リポキシゲナーゼタンパ ク質合成の阻害についての最も直接的測定から更に下流の場合、例えば、完全な 細胞での５−リポキノゲナーゼの測定までを記載する。
容易に定量することができる完全な細胞に対してアンチセンスオリゴヌクレオチ ドが作用する最も直接的な効果は、５−リボキンゲナーゼタンパク質合成の特異 的阻害である。この方法を行うために、細胞に、３５Ｓ−メチオニン（５０μＣ ｉ／ｍＬ）を３７℃で２時間用いて標識して、新規に合成されたタンパク質を標 識することができる。細胞を抽出して全部の細胞タンパク質を可溶化し、５−リ ポキシゲナーゼを５−リポキシゲナーゼ抗体で免疫沈降させた後、プロティンＡ セファロースビーズから溶離する。免疫沈降したタンパク質を５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動によって解析し且つオートラジオグラフィーに対して暴 露する。免疫沈降した５−リポキシゲナーゼの量を走査デンシトメトリーによっ て定量する。
これらの実験から予測された結果は下記の通りであると考えられる。対照細胞か ら免疫沈降した５−リポキシゲナーゼタンパク質の量を１００％に規格化した。
１マイクロモル、１０マイクロモルおよび３０マイクロモルの有効なアンチセン スオリゴヌクレオチドによる４８時間の細胞処理により、免疫沈降した５−リポ キシゲナーゼはそれぞれ対照の５％、２５％および７５％に減少した。
細胞ホモゲネートの５−リポキシゲナーゼ酵素活性の測定を更に用いて、ロイコ トリエンを合成することができる存在する酵素の量を定量することができた。
ここで、ラジオメトリックアッセイが、逆相高速液体クロマトグラフィーを用い て細胞ホモゲネート中の５−リポキシゲナーゼ酵素活性を定量するために開発さ れた。細胞を、プロテアーゼ阻害剤およびＥＤＴＡを含む緩衝液中で音波処理す ることによって破壊する。細胞ホモゲネートを１０．０００Ｘｇで３０分間遠心 分離し、その上澄みの５−リポキシゲナーゼ活性について分析した。細胞質ゾル のタンパク質を、１０マイクロモル１４Ｃ−アラキドン酸、２ミリモルＡＴＰ。
５０マイクロモル遊離カルシウム、１００μｇ／ｍｌホスファチジルコリンおよ び５０ミリモルのビストリス緩衝液、ｐＨ７，０と一緒に３７℃で５分間インキ ュベートする。反応を、等量のアセトンの添加によって急冷し、脂肪酸を酢酸エ チルで抽出する。基質および反応生成物を、ツババック（Ｎｏｖａｐａｋ）Ｃ１ ８カラムＦウオーターズ・インコーホレーテッド（Ｗａｔｅｒｓ　Ｉｎｃ、）、 ミルフォード、ＭＡ］での逆相高速液体クロマトグラフィーによって分離する。
放射性ピークを、ベックマン１７１型ラジオクロマトグラフイー検出器によって 検出する。ジーＨＥＴＥ’　ｓおよびモノ−ＨＥＴＥ’　ｓに変換されたアラキ ドン酸の量を、５−リポキシゲナーゼ活性の尺度として用いる。
ＤＭＳＯで分化したＨＬ−６０細胞の、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチド を１マイクロモル、１０マイクロモルおよび３０マイクロモルで用いる７２時間 の処理で予測された結果は下記の通りであると考えられる。対照細胞は、２００ ピコモルのアラキドン酸１５分／１０６細胞を酸化する。１マイクロモル、１０ マイクロモルおよび３０マイクロモルの有効なアンチセンスオリゴヌクレオチド で処理された細胞は、それぞれ１９５ピコモル、１４０ピコモルおよび６０ピコ モルのアラキドン酸１５分／１０６細胞を酸化すると考えられる。
細胞中の全部の５−リポキシゲナーゼタンパク質を測定するために、定量的競合 的酵素結合免疫吸着アッセイ（エライザ）が開発された。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ）で発現され、そして抽出、Ｑ−セファロース、ヒドロキシアパタイトおよび逆 相高速液体クロマトグラフィーによって精製されたヒト５−リポキシゲナーゼを 、標準としておよび微量滴定プレートにコートする第一抗体として用いる。精製 ５−リポキシゲナーゼ２５ｎｇを微量滴定プレートに４℃で一晩中固定させる。
ウェルを、１５０ミリモルＮａＣ１存在下、ｐＨ７，４の２０ミリモルトリスＨ Ｃ１緩衝液（ＴＢＳ）中に稀釈した５％ヤギ血清を用いて９０分間ブロックする 。
細胞抽出物（０，２％）！Ｊ　ト：／Ｘ−１００，１２０００ｘｇで３０分間） ＊たｌ；！精製５−リポキシゲナーゼを、微量滴定ウェル中、総量１００マイク ロリツトルにおいて稀釈度１：４０００の５−リポキシゲナーゼ多クローン性抗 体と一緒に９０分間インキュベートした。抗体は、精製ヒト組換え体５−リポキ シゲナーゼでウサギを免疫化することによって製造された。ウェルを００５％ト ウイーン（ｔｗｅｅｎ）２０を含むＴＢＳ　（ＴＢＳＴ）で洗浄した後、稀釈度 １　：　１０００のペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ［カベル・ラボラ トリーズ（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、フルノく−ン、ＲＡコ 　１００マイクロリ、ットルと一緒に２５℃で６０分間インキュベートした。ウ ェルをＴＢＳＴで洗浄し、ペルオキシダーゼで標識された第二抗体の量を、テト ラメチルベンジンで展開することによって決定した。
３０マーのアンチセンスオリゴヌクレオチドを１マイクロモル、１０マイクロモ ルおよび３０マイクロモルで用いるこのような検定から予測された結果は、未処 理細胞が５−リポキンゲナーゼを約３４ｎｇ含むのに対して、それぞれ、１０６ 細胞当り５−リポキシゲナーゼ３０ｎｇ、１８％ｇおよび５ｎｇであると考えら れる。
５−リポキンゲナーゼ生合成阻害の正味の効果は、刺激された細胞から放出され たロイコトリエンの量を減少させることである。ＤＭＳＯで分化したＨＬ−６０ 細胞は、カルシウムイオノフオアＡ２３１８７による刺激によってロイコトリエ ンＢ４を放出する。細胞培地中に放出されたロイコトリエンＢ４は、商業的に入 手可能な診断用キット［ニュー・イングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン、マサチューセ・ｙツ州コを用（、ｚるラジ オイムノアッセイによって定量することができる。ロイコトリエンＢ４産生は、 細胞を好中球様細胞に分化させるＤＭＳＯを加えて４８時間後のＨＬ−６０細胞 で検出することができる。細胞（２Ｘ１０５細胞／　ｍ　Ｌ　）を、増加濃度の アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて１．３％ＤＭＳＯ存在下で４８〜７２ 時間処理する。細胞を洗浄し且つ１％脱脂（ｄｅｌｉｐｉｄａｔｅ）ラン血清ア ルブミンを含むダルベツコリン酸緩衝溶液中２Ｘ１０’細胞／ｍＬの濃度で再懸 濁させる。
細胞を１０マイクロモルカルシウムイオノフオアＡ２３１８７で１５分間刺激し 、５Ｘ１０’細胞から産生されたＬＴＢ４の量を、製造業者によって記載のラジ オイムノアッセイによって決定する。
この検定法を用いることにより、下記の結果は、おそらく、５−ＬＯｍＲＮＡに 対して向けられた１５マーのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＧＣＡＡＧＧＴ ＣＡＣＴＧＡＡＧ）に関して得られたものと考えられる。細胞を、１．３％ＤＭ ＳＯ存在下で１マイクロモル、１０マイクロモルかまたは３０マイクロモルのオ リゴヌクレオチドで７２時間処理する。５Ｘ１０５細胞から産生されたＬ　Ｔ　 Ｂ　４の量は、未処理の分化した細胞が７５ｐｇのＬＴＢ、を産生するのに対し て、それぞれ、約７５ｐｇ、５０ｐｇおよび３５ｐｇであることが予測されると 考えられる。
Ｅ、インビボ検定法 ラットにおける５−リポキシゲナーゼ産生の阻害を、下記のプロトコルにしたが って実証することができる。アラキドン酸の局所適用の結果、皮膚においてロイ コトリエンＢ４、ロイコトリエンＣ４およびプロスタグランジンＥ２が急速に産 生され、続いて、水腫および細胞浸潤が生じる。５−リポキンゲナーゼのある種 の阻害剤は、この検定において活性を示すことが分かった。検定に対して、アラ キドン酸２ｍｇをラットの耳に適用し、対何の耳を対照とする。多形核細胞浸潤 を、アラキドン酸を投与して１時間後の生検から得られたホモゲネートでのミエ ロベルオキシダーゼ活性によって検定する。水腫性反応は、耳の厚みおよびパン チ生検の湿量を測定することによって定量される。生検試料で産生されたロイコ トリエンＢ４の測定は、組織での５−リポキシゲナーゼ活性の直接測定のように 行う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラキドン酸を投与する１２〜２４ 時間前に両耳に対して局所に適用して、化合物の最適の活性を可能にする。
ヌクレオチド８０〜９７に対応するラット５−リポキシゲナーゼに対して向けら れた１５マーのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて予測された結果を以下 に記載する。両耳を０．　１マイクロモル、０．３マイクロモルかまたは１０マ イクロモルのアンチセンスオリゴヌクレオチドで２４時間前処理した後、アラキ ドン酸を試験投与する。値は３兎の動物についての濃度あたりの平均として表さ れた。０１マイクロモル、０．３マイクロモルおよび１．０マイクロモルに対す る多形核細胞浸潤の阻害は、それぞれ、対照活性の約１０％、７５％および９２ ％であると予測される。水腫の阻害は、それぞれ約３％、５８％および９０％で あると予測され、そしてロイコトリエンＢ４産生の阻害は、それぞれ約１５％、 ７９％および９９％と予測されると考えられる。
実施例 実施例１ ２′−〇−（ノニル）アデノシン（１）アデノシン１０ｇのジメチルホルムアミ ド４００ｍ１中溶液に対して、６０％水素化ナトリウム（油）２．２５ｇを加え る。一時間後に、１−プロモーノナン８．５ｍｌを加える。反応を１６時間攪拌 する。氷を加え、溶液を真空中で蒸発させる。水および酢酸エチルを加える。有 機相を分離し、乾燥させ、そして真空中で蒸発させて、白色固体を得、それをエ タノールから再結晶させて、標題化合物４．８ｇ５Ｍ、Ｐ、１４３〜１４４℃を 生じる。Ｃ＋ｓＨｓ＋Ｎ５０４の分析、計算値：Ｃ，５７，９９：Ｈ，７，９ ４；Ｎ、１７．７９、実測値：Ｃ，５８，１３；Ｈ，７，９３；Ｎ、１７．８３ ゜実施例２ ２’−〇−Ｃノニル）−Ｎｅ−ベンゾイルアデノシン（２）２’　−０−（ノニ ル）アデノシン（１）を、Ｂ、　Ｌ、ガフネイ（Ｇａｆｆｎａｙ）およびＲＡ、 ジョーンズ（Ｊ　ｏｈｎ　ｅ　ｓ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、第 ２３巻、２２５７頁（１９８２）の方法と同様の方法で塩化ベンゾイルを用いて 処理する。シリカゲル（酢酸エチル−メタノール）でのクロマチグラフィーの後 、標題化合物が得られた。Ｃ２６Ｈ３５Ｎ５０５の分析：計算値：Ｃ，６２，７ ５，Ｈ，７，０９；Ｎ。
１７．０７、実測値：Ｃ，６２，７３；Ｈ，１４，０７；Ｎ、１３．８７゜実施 例３ ２’　−０−（ノニル）−５′　−〇−ジメトキントリチルーＮ６−ペンゾイル アデノシン（３） ２’　−０−（ノニル）−Ｎｅ−ベンゾイルアデノシン（２）４．０ｇのピリジ ン２５０ｍ１中溶液に対して、塩化４．４′−ジメトキシ−トリチル３．３ｇを 加える。反応を１６時間攪拌する。反応を氷／水／酢酸エチルに加え、有機層を 分離し、乾燥さ也そして真空中で濃縮してガムにする。標題化合物５．８ｇが、 シリカゲル（酢酸エチル−メタノールトリエチルアミン）でのクロマチグラフィ ーの後得られた。Ｃ４ｔ　Ｈ５３Ｎ　ｓ　Ｏ□の分析・計算値　Ｃ，７０，５６ ；Ｈ，６，６８；Ｎ、８．７５、実測値・Ｃ，７０，２６；Ｈ，６，７０；Ｎ、 ｓ、７１゜実施例４ Ｎｅ−ペンゾイルー５′−〇−ジメトキントリチルー２’　−０−（ノニル）ア デノノン−３’　−０，Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミ ダイト（４） ２’　−０−（ノニル）−５’　−０−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイルア デノシン（３）を、Ｆ、ンーラ（Ｓｅｅｌａ）およびＡ　ケーン（Ｋｅｈｎｅ） 、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６巻、２２３３頁（１９８７）の方法と同様 の方法で、（β−ンア ノエトキン）クロロ（Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル）アミンホスファンを用いて処 理する。シリカゲル（Ｅ＝○Ａｃ／ヘキサン）でのクロマトグラフィーの後、標 題化合物が白色泡として得られた。
実施例５ ２’　−０−（ペンチル）アデノシン（５）標題化合物を、実施例１により、１ −ブロモペンタンを１−ブロモノナンの代わりに用いて製造する。Ｍ、Ｐ、−１ ０８〜１０９℃を生じる。
Ｃｌ５Ｈ２４Ｎ５０４の分析：計算値：ｃ、５３．　２４：Ｈ，７，１５；Ｎ。
２０６９、実測値：Ｃ，５３，３７；Ｈ，６，８６；Ｎ、２０．５１゜実施例６ ２’　−０−（ペンチル）−Ｎｅ−ベンゾイルアデノシン（６）実施例２による 、２’　−０−（ペンチル）アデノシンのベンゾイル化によって標題化合物が得 られる。Ｃｚ２Ｈ２９Ｎ　ｓ○５の分析、計算値：Ｃ，５９，５８；Ｈ。
６．５９；Ｎ、１ｓＪ　７９、実測値　Ｃ，５９，３４：Ｈ，６，２７；Ｎ、１ ５゜５３゜ 実施例７ ２’　−０−（ペンチル）−５’　−０−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイ ルアデノシン（７） 標題化合物を、実施例３によって、２’　−０−（ペンチル）　ｌ、Ｊ６−ベン ゾイルアデノシン（６）から製造する。Ｃ＜　ｓ　Ｈ４ａ　Ｎ　５０７の分析： 計算値：Ｃ，５９゜３４、；Ｈ，６，２２；Ｎ、９．　４０、実測値・Ｃ，６８ ，９７；Ｈ，６，０７；Ｎ、　９．　１２゜ 実施例８ Ｎ６−ベンゾイル−５’　−０−ジメトキシトリチル−２’　−０−（ペンチル ）アデノシン−３’　−０，Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホス ホアミダイト（８） 標題化合物を、実施例４によって、２’　−０−（ペンチル）　−５’　−０− ジメトキシトＪノチルーＮ６−ペンゾイルアデノシン（７）から製造する。
実施例９ ２’　−〇−（ベンジル）アデノシン（９）標題化合物を、実施例１により、臭 化ベンジルを１−ブロモノナンの代わりに用いて製造する。シリカゲル（Ｅ＝Ｏ Ａｃ−ｍｅｏｈ）でのクロマトグラフィーの後、白色固体が得られる。Ｍ、Ｐ、 　−８７〜８８℃。
Ｃ＋７ＨｉｅＮｓＯ＜−２５ｍＨ２ｏの分析、計算値：Ｃ，５６，４２；Ｈ。
５．４３；Ｎ、１９．３５、実測値：Ｃ，５６，４６；Ｈ，５，２３＋Ｎ、１， ９５０゜ 実施例１０ ２’　−０−（ベンジル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（１０）実施例２によ る、２’　−０−（ベンジル）アデノシンのベンゾイル化によって標題化合物が 得られる。Ｃ２４Ｈｚ３ＮｓＯ５−２５ｍＨ２Ｏの分析二計算値、Ｃ１６１，８ ６：Ｈ，５，０８：Ｎ、１５．０３、実測値・Ｃ，６１，８９：Ｈ，５０１；Ｎ 、１４．８８゜ 実施例１１ ２’　−０−（、ベンジル）　−５’　−０−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベン ゾイルアデノシン（１１） 標題化合物を、実施例３によって、２’　−０−（ベンジル）−Ｎ−ベンゾイル アデノシン（１０）から製造する。Ｃａ　ｓ　Ｈ４１Ｎ　ｓ　Ｏ７の分析：計算 値：Ｃ，７０゜７６；Ｈ，５，４１；Ｎ、９．１７、実測値・Ｃ，７０，８４； Ｈ，５，３５；Ｎ、８．　９０゜ 実施例１２ Ｎ６−ペンゾイルー５’−０−ジメトキシトリチル−２′−〇−（ベンジル）ア デノシン−３’　−０，Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミ ダイト（１２） 標題化合物を、実施例４によって、２’　−０−（ベンジル）−５′　−〇−ジ メトキシトリチルーＮ６−ペンゾイルアデノシン（１１）から製造する。化合物 は白色泡である。３１Ｐ−ＮＭＲ，（ＣＤＣＮ）Ｓ１５１．０８．１５１．２５ ゜実施例１３ ２’　−０−（ブチル）アデノシン（１３）標題化合物を、実施例１により、１ −ブロモブタンを１−ブロモノナンの代わりに用いて製造する。シリカゲル（Ｅ ＝ＯＡｃ−ＭＥｏＨ）でのクロマトグラフィーの後、白色固体が得られた。
ＩＨ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：　５．９７　（ｄ、ＩＨ，Ｃ，Ｈ）。
実施例１４ ２′−○−（ブチル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（１４）実施例２による、 ２’　−０−（ブチル）アデノシン（１３）のベンゾモル化ｊ二よって標題化合 物が白色泡として得られる。
ＩＨ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−６，６）＋　６．１１　（ｄ、ＩＨ，Ｃ，Ｈ）。
実施例１５ ２’　−０−（ブチル）　−５’　−０−ジフトキントリチル−Ｎ６−ペンゾイ ルアデノシン（１５） 標題化合物を、実施例３によって、２’　−〇−（ブチル）−Ｎ６−ベンゾイル アデノシン（１４）から製造する。シリカゲル（Ｅ＝○Ａｃ−ヘキサン−ＴＲＡ ）でのクロマトグラフィーの後、黄色泡が得られた。Ｃ４□Ｈ４ｓ　Ｎ　ｓ　Ｏ ７の分析：計算値：Ｃ，６９，１２＋Ｈ，５，９４；Ｎ、９．５９、実測値：Ｃ ，６９，２１、Ｈ，５，９９；Ｎ、９．　４３゜ 実施例１６ Ｎ６−ペンゾイルー５′−〇−ジメトキシトリチルー２’　−０−（ブチル）ア デノシン−３′　−〇、　Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホ アミダイト　（１６） 標題化合物を、実施例４によって、２′−〇−（ブチル）　−５’　−０−ジメ トキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（１５）から製造する。化合物は 白色泡である。
実施例１７ ２’　−０−（プロピル）アデノシン（１７）標題化合物を、実施例１により、 １−ブロモプロパンを１−ブロモノナンの代わりに用いて製造する。Ｍ、Ｐ、１ ２７〜１２８℃。Ｃｌ　３　Ｈ＋　ｓ　Ｎ　５０４の分析：計算値：Ｃ，５０， ４８；Ｈ，６，１９，Ｎ、２２．６４、実測値：Ｃ，５０，５８；Ｈ，６，２１ ；Ｎ、２２．５６゜ 実施例１８ ２’　−〇−（プロピル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（１８）実施例２によ る、２’　−０−（プロピル）アデノシン（１７）のベンゾイル化によって標題 化合物が得られる。Ｃ２゜Ｈ２ｓ　Ｎ　ｓ　Ｏｓの分析二計算値：Ｃ，５８，１ ０；）（，５，６１；Ｎ、１６．９４、実測値：Ｃ，５８，１２：Ｈ，５，５８ ；Ｎ、１６．７９゜ 実施例１９ ２’　−０−（プロピル）　−５’　−０−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾ イノげデノシン（１９） 標題化合物を、実施例３によって、２’　−０−（プロピル）−Ｎ６−ベンゾイ ルアデノシン（１８）から製造する。
ＩＨ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：　６．１３　（ｄ、ＩＨ，Ｃ，Ｈ）。
実施例２Ｏ Ｎ６−ペンゾイルー５′−〇−ジメトキシトリチルー２’−０−（プロピル）ア デノシン−３’　−０，Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミ ダイト（２０） 標題化合物を、実施例４によって、２’　−０−（プロピル）　−５’　−０− ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（１９）から製造する。化合 物は白色泡である。
実施例２１ ２′−〇−（アリル）アデノシン（２１）標題化合物を、実施例１により、臭化 アリルを１−ブロモノナンの代わりに用いて製造する。標題化合物は、シリカゲ ル（Ｅ＝ＯＡｃ−メタノール）でのクロマトグラフィーの後の白色固体である。
ＩＨ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：　６゜０３　（ｄ、ＬＨ，Ｃ，Ｈ）。
実施例２２ ２’　−〇−（アリル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（２２）実施例２による 、２′−〇−（アリル）アデノシン（２１）のベンゾイル化によって標題化合物 が白色泡として得られる。
’Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ（ｉｇ）：　６．１７　（ｄ、ＩＨ，Ｃ，Ｈ）。
実施例２３ ２′−〇−（アリル）−５’　−〇−ジメトキシトリチルーＮ６−ペンゾイルア デノシン（２３） 標題化合物を、実施例３によって、２’　−０−（アリル）−Ｎ６−ベンゾイル アデノシン（２２）から製造する。Ｃ４１Ｈｓ　ｅ　Ｎ　ｓ　Ｏ？の分析・計算 値：Ｃ，５８゜９９；Ｈ，５，５１，Ｎ、９．８１、実測値：Ｃ，６８，６８； Ｈ，ｓ、４３；Ｎ、９．　７０゜ 実施例２４ Ｎ６−ペンゾイルー５′−〇−ジメトキシトリチルー２′−〇−（アリル）アデ ノシン−３’　−０，Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルポスポアミダ イ標題化合物を、実施例４によって、２’　−０−（アリル）−５’−０−ジメ トキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（２３）から製造する。化合物は 白色性である。
”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）Ｓ１５１．１１，１５１．３２゜実施例２５ ２’　−０−（プロピルフタルイミド）アデノシン（２５）標題化合物を、実施 例１により、Ｎ−（３−ブロモプロピル）フタルイミドを用いて製造する。シリ カゲルでのクロマトグラフィーにより、白色固体が得られる。Ｍ、Ｐ、１２３〜 １２４℃。Ｃ！１Ｈ２２Ｎ６０．の分析：計算値　Ｃ，５５，０３：Ｈ，４，８ ８；Ｎ、１８．４９、実測値：　ｃ、５５’、３８　；Ｈ，４，８５；Ｎ、１８ ．４６゜ 実施例２６ ２’　−０−（プロピルフタルイミド）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（２６） 実施例２による、２’　−０−（プロピルフタルイミド）アデノシン（２５）の ベンゾイル化によって標題化合物が得られる。Ｃ２ｓＣ２５ＨｚａＮの分析：計 算値　Ｃ１６０，２１；Ｈ，４，６９；Ｎ、１５．０５、実測値　Ｃ１５９，９ ４；Ｈ，４，６６；Ｎ、１４．７’６゜実施例２７ ２′−〇−（プロピルフタルイミド）　−５’　−〇−ジメトキシトリチルーＮ −ベンゾイルアデノシン（２７） 標題化合物を、実施例３によって、２’−０−（プロピルフタルイミド）−Ｎ６ −ベンゾイルアデノシン（２６）から製造する。Ｃ４ｅ　Ｈ４＜　Ｎ　ｅ　Ｏｅ の分析−計Ｘ（ｉ：Ｃ，６８，３６；Ｈ，５，１５；Ｎ、９．７６、実測値：Ｃ ，６８，１６；Ｈ，５，０３：Ｎ、９．４３゜ 実施例２８ Ｎ６−ペンゾイルー５′−〇−ジメトキシトリチルー２’　−０−（プロピル） アデノシン−３’　−０，Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホア ミダイト（２８） 標題化合物を、実施例４によって、２’　−０−（プロピルフタルイミド）−５ ′−〇−ジメトキシトリチルーＮ６−ペンゾイルアデノシン（２７）から製造す る。白色性が得られた。
実施例２９ ２′−〇−（ブチルフタルイミド）アデノシン（２９）標題化合物を、実施例１ により、Ｄ−（４−ブロモブチル）フタルイミドを１−ブロモノナンの代わりに 用いて製造する。シリカゲル（Ｅ＝ＯＡＣ−ＭｅＯＨ）でのクロマトグラフィー により、白色固体が得られる。Ｍ、Ｐ、１９９〜２００℃。Ｃ２□Ｈ２４Ｎ　６ ０６の分析・計算値　Ｃ，５６，４２；Ｈ，５，１６；Ｎ、１７．９４、実測値 ：Ｃ，５６，３１；Ｈ，５，０４；Ｎ、１７．９５゜実施例３０ ２’　−０−（ブチルフタルイミド−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン）（３０）実 施例２による、２’　−０−（ブチルフタルイミド）アデノシン（２９）のベン ゾイル化によって標題化合物が得られる。ＣｚｅＨｚＮａＯｔの分析：計算値コ ｃ。
６０．８３：Ｈ，４，９３；Ｎ、１４．６８、実測値：Ｃ，６０，４８；Ｎ、１ ４．４１゜ 実施例３１ ２’−０−（ブチルフタルイミド）−５’　−０−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベ ンゾイルアデノシン（３１） 標題化合物を、実施例３によって、２’　−０−（ブチルフタルイミド）−Ｎ６ −ベンゾイルアデノシン（３０）から製造する。Ｃｓ　ｏ　Ｈ４６Ｎ　ｅ　Ｏ９ の分析：計算値：Ｃ，６８，６４；Ｈ，５，２９：Ｎ、９．６０、実測値二〇。
６８．４７：Ｈ，５，１２；Ｎ、９．３７゜実施例３２ Ｎ６−ベンゾイル−５’　−０−ジメトキシトリチル−２’　−０−（ブチルフ タルイミド）アデノシン−３′−〇、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチ ルホスホアミダイト（３２） 標題化合物を、実施例４によって、化合物（３１）から製造する。
”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ、ＣＮ）Ｓ１５０．８８．１５１．２２゜実施例３３ ２′−〇−（ペンチルフタルイミド）アデノシン（３３）標題化合物を、実施例 １により、Ｎ−（５−ブロモペンチル）フタルイミドを１−ブロモノナンの代わ りに用いて製造する。Ｍ、Ｐ、１５９〜１６０℃。
分析　Ｃ，５７，２６；Ｈ，５，４３；Ｎ、１７．４２、実測値　Ｃ１５７，０ ３；Ｈ，５，４６；Ｎ、１７．３３゜実施例３４ ２′−〇−（ペンチルフタルイミド−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン）（３４）実 施例２による、２’　−〇−（ペンチルフタルイミド）アデノシン（３３）のベ ンゾイル化によって標題化合物が得られる。’Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳ○−ｄｓ）　 ６゜１０　（ｄ、ＩＨ，Ｃ１，Ｈ）　。Ｃ３ｏＨｓａＮｅ○７の分析：計算値： Ｃ，６１，４３、Ｈ，５，１６；Ｎ、１４．３３、実測値・Ｃ，６１，５１；Ｈ ，４，９７，Ｎ。
１４．１０゜ 実施例３５ ２’　−０−（ペンチルフタルイミド）−５′　−ジメトキシトリチル−Ｎ６− ベンゾイルアデノシン（３５） 標題化合物を、実施例３によって、２’　−０−（ペンチルフタルイミド）−Ｎ ｇ−ベンゾイルアデノシン（３４）から製造する。シリカゲル（酢酸エチル、ヘ キサン、トリエチルアミン）でのクロマトグラフィー後に、標題化合物が得られ た。Ｃｓ　１Ｈ４ｓ　Ｎ　ｅ　Ｏｓの分析：計算値　Ｃ，６８，９１＋８．　５ ．　４４；Ｎ、９４５、実測値・Ｃ１６８，６５；Ｈ，５，４５；Ｎ、９．６１ ゜実施例３６ Ｎ１−ベンゾイル−５′−〇−ジメトキシトリチルー２’　−０−（ペンチルフ タルイミド）アデノシン−３’−０，Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアンエチ ルホスホアミダイト（３６） 標題化合物を、実施例４によって、２’　−０−（ペンチルフタルイミド）−５ ′−〇−ンメトキントリチルーＮ６−ペンゾイルアデノシン（３５）から製造す る。化合物は白色性である。
実施例３７ ２′−○−（エチル）アデノシン（３７）標題化合物を、実施例１により、臭化 エチルを１−ブロモノナンの代わりに用いて製造する。標題化合物は白色固体で ある。ＩＨ−ＮＭＲ（ＤＭＳ○−ｄ６）・６、　００　（ｄ、＋Ｈ，Ｃ＋、　Ｈ ）。
実施例３８ ２’　−０−（エチル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（３８）実施例２による 、２’　−０−（エチル）アデノシン（３７）のベンゾイル化によって標題化合 物が得られる。化合物は白色性である。
実施例３９ ２′−〇−（エチル）−５′−〇−ジメトキシトリチルーＮ６−ペンゾイルアデ ノシン（３９） 標題化合物を、実施例３によって、２’　−０−（エチル）　Ｎ６−ベンゾイル アデノシン（３８）から製造する。化合物は白色性である。
実施例４Ｏ Ｎ６−ペンゾイルー５′−〇−ジメトキシトリチルー２’　−０−（エチル）ア デノシン−３’　−０，Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホア ミダイト（４０） 標題化合物を、実施例４によって、２’　−０−（エチル）−５’　−０−ジメ トキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（３９）から製造する。化合物は 白色性である。
実施例４１ ２′−〇−［イミダゾ−１−イル−（プロピル）コアデノンン（４１）標題化合 物を、実施例１により、１−（３−ブロモプロピル）イミダゾールを１−ブロモ ノナンの代わりに用いて製造することができる。
実施例４２ ２’　−０−［イミダゾ−１−イル−（プロピル）］　−］Ｎ’Ｎノーゾイルア デノシン４２） 実施例２による、２’　−０−［イミダゾ−１−イル−（プロピル）］アアデノ シン４１）のベンゾイル化によって標題化合物が得られる。
実施例４３ ２’　−０−［イミダゾ−１−イル−（プロピル）コー５′　−〇−ジメトキン トリチルーＮ６−ペンゾイルアデノンン（４３）標題化合物を、実施例３によっ て、２’　−０−［イミダゾ−１−イル−（プロピル）］アデノシン（４２）か ら製造することができる。
実施例４４ Ｎ６−ペンゾイルー５′−〇−ジメトキシトリチルー２’　−０−［イミジゾー １−イル−（プロピル）］−］アデノシンー３’−０，Ｎ、Ｎ−ンイソプロビル ーβ−ンアノエチルホスホルアミダイト（４４）標題化合物を、実施例４により 、２′−〇−「イミダゾ−１−イル−（プロピル）］−］５’−０−ジメトキシ トリチルーＮ６ベンゾイルアデノシン（４３）から製造することができることが できる。
実施例４５ ２’　−０−（フェニルプロピル）アデノシン（４５）標題化合物を、実施例１ により、３−ブロモプロピルベンゼンを１−ブロモノナンの代わりに用いて製造 することができる。
実施例４６ ２’　−０−（フェニルプロピル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン（４６）実施 例２による、２’　−０−（フェニルプロピル）アデノシン（４５）のベンゾイ ル化によって標題化合物が得られる。
実施例４７ ２’−０−（フェニルプロピル）−５′　−〇−ジメトキントリチルーＮ６−ベ ンゾイルアデノシン（４７） 標題化合物を、実施例３によって、２’　−０−（フェニルプロピル）アデノシ ン（４６）から製造することができる。
実施例４８ Ｎ６−ペンゾイルー５’−〇−ジメトキントリチルー２’　−０−（フェニルプ ロピル）−アデノシン−３′　−〇、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアンエチ ルホスホアミダイト（４８） 標題化合物を、実施例４により、２’　−０−（フェニルプロピル）−５’−０ −ジフトキノトリチル−Ｎ６〜ベンゾイルアデノシン（４７）から製造すること ができることができる。
実施例４９ ２′−〇−〇ナフトー１−イルー（プロピル）］アアデノシン４９）標題化合物 を、実施例１により、１−（３−ブロモプロピル）ナフタレンを１−ブロモノナ ンの代わりに用いて製造することができる。
実施例５０ ２’　−０−［ナフト−１−イル−（プロピル）］−］Ｎ’Ｎノーゾイルアデノ シン５０） 実施例２による、２’　−０−［ナフト−１−イル−（プロピル）］アデノシン （４９）のベンゾイル化によって標題化合物が得られる。
実施例５１ ２′　−〇−［ナフト−１−イル−（プロピル）］−］５’−０−ジメトキシト リチルーＮ６ベンゾイルアデノシン（５１）標題化合物を、実施例３によって、 ２’　−０−［ナフト−１−イル−（プロピル）］−］Ｎ’Ｎノーゾイルアデノ シン５０）から製造することができる。
実施例５２ Ｎ６−ペンゾイルー５′−〇−ジメトキントリチルー２’　−０−［ナフト−１ −イル−（プロピル）コーアデノンン−３’　−０，Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル− β−シアノエチルホスホアミダイト（５２）標題化合物を、実施例４により、２ ’　−０−［ナフト−１−イル−（プロピル）］−］５’−０−ジメトキシトリ チルーＮ６ベンゾイルアデノシン（５１）から製造することができることができ る。
実施例５３ ２′−〇−［アントラセン−２−イル−（プロピル）］アアデノシン５３）　標 題化合物を、実施例１により、２−（３−ブロモプロピル）アントラセンを１− ブロモノナンの代わりに用いて製造することができる。
実施例５４ ２’−０−［アントラセン−２−イル−（プロピル）］　−］Ｎ’Ｎジーゾイル ーアデノシン５４） 実施例２による、２’　−０−［アントラセン−２−イル−（プロピル）コアデ ノンン（５３）のベンゾイル化によって標題化合物が得られる。
実施例５５ ２’　−０−［アントラセン−２−イル−（プロピル）：ｌ−５’−０−ジメト キシトリチル−Ｎ６−ペンゾイルアデノシン（５５）標題化合物を、実施例３に よって、２′−〇−［アントラセン−２−イル−（プロピル）］−］Ｎ’Ｎノー ゾイルアデノシン５４）から製造することができる。
実施例５６ Ｎ６−ペンゾイルー５′−〇−ジメトキシトリチルー２’　−０−［アントラセ ン−２−イル−（プロピル）コアデノシン−３′　−〇、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピ ルーβ−シアノエチルホスホアミダイト（５６）標題化合物を、実施例４により 、２’　−〇−［アントラセン−２−イル−（プロピル）］−５’　−○−ンメ トキントリチルーＮ６−ペンゾイルアデノシン（５５）から製造することができ ることができる。
実施例５７ ２’　−０−［ビス（フタルイミドブチル）−（アミノブチル）］　−］Ｎ’Ｎ ノーゾイルアデノシン５７） 化合物（３０）を、ＴＩＰＳ試薬（テトライソプロピルージシリルニ塩化物）で 処理して、３’、５’　−ヒドロキシル基をＴＩＰＳ保護基で保護する。水酸化 アンモニウムでの処理によってフタルイミド基を開裂させて、２’　−０−アミ ノブチルで保護されたアデノシンを生じる。この化合物を、実施例２９により、 ｎ−（４−ブロモブチル）フタルイミドで更に処理して、２′−〇−ポリアルキ ルアミノで保護されたアデノシンを生じることができる。フッ化テトラブチルア ンモニウムを用いるＴＩＰＳ保護基の脱保護によって標題化合物が生じる。標題 化合物を実施例３１および３２によって用いて、オリゴヌクレオチドに組み込む のに適当な、適当に保護されたヌクレオチドを生成することができる。
実施例５８ ２’　−０−［ビス（アミノブチル）−（アミノブチル）］　−］Ｎ’−ベンベ ンルアデノンン５８） 化合物５７を水酸化アンモニウムで処理してフタルイミド基を開裂して、表題化 合物を得る。この化合物をさらに実施例５７のように処理すると、ポリアルキル アミノ鎖をさらに延長することができる。
実施例５９ Ｎ６−ベンゾイル−［２′　−デオキシ−２′−フルオロ−５’　−０−（４， ４’−ジ−メトキシトリチル）コ　アデノシン−３’　−〇、Ｎ、Ｎ−ジイソプ ロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト（５９）Ｎ６−ペンゾイルー９−　 （２’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニンを、Ｍ、イケハラ等、「 ヌクレオシド及びヌクレオチド」、第２巻、ｐｐ、３７３−３８５　（１９８３ ）の方法の変形法を用いて５工程合成で９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニ ンから製造した。これによって、クロロトリメチルシランで一時的に保護する方 法を用いて、Ｎ６−ベンゾイル誘導体を良好な収率で得た。Ｒ，Ａ、ジョーンズ 、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ　第１０４巻、ｐｐ、１３１６　（１９８２）。
Ｎ６−ペンゾイルー９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンの３′及び５′− ヒドロキシル基のテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）での選択的な保護を、「核酸 化学」、第３部、ｐｐ、１４９−１５２、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、　Ｌ、　Ｂ、及び Ｔｉｐｓｏｎ、Ｒ，Ｓ、編集（Ｊ、Ｗｉ　ｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓ。
ｎｓ、ニューヨーク、１９８６）のＢｕｔｋｅ等の方法の変形法によって行って 、Ｎ６−ペンゾイルー９−　［３’　、５’　−ジーＯ−テトラヒドロピランー ２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル〕アデニンを良好な収率で得た。Ｎ６ −ベンゾイル−９−［３’　、５’　−’）−０−テトラヒ）’ｏヒ５：ｚ−２ −イｈ）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニンをジクロロメタン中、トリフ ルオロメタンスルホン酸無水物で処理して２′−トリフレート誘導体であるＮ６ −ペンゾイルー９−［２’−０−トリフルオロメチルスルホニル−３’、５’　 −ジーＯ−テトラヒドロビランー２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］ア デニンを得た。これは不安定なため単離しなかった。２′−トリフレート基の置 換は、テトラヒドロフラン中、弗化テトラブチルアンモニウムと反応させること によって行い、中程度の収率で２′−フルオロ誘導体であるＮ８−ベンゾイル− ９−［２’　−フルオロ−３’、５’−ジーＯ−テトラヒドロビランー２−イル ）−β−Ｄ−アラビノフラノツル］アデニンを得た。Ｎ６−ペンゾイルー９−　 ［２’−フルオロ−３′。
５′−ジーＯ−テトラヒドロビランー２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル コアデニンのＴＨＰ基の脱保護は、メタノール中のダウエックス−５０Ｗで処理 して行い、Ｎ６−ペンゾイルー９−　（２’　−デオキシ−２′−フルオロ−β −り一すボフラノシル）アデニンを中程度の収率で得た。’Ｈ−ＮＭＲスペクト ルは文献の値と一致した。Ｍ、イケハラ及びＨ，ミキ、Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、 Ｂｕｌｌｏ、第２６巻、ｐｐ、２４４９−２４５３　（１９７８）。前記実施例 ３及び４のような標準的な方法を用いて、５′−ジメトキシトリチル−３′−ホ スホアミダイト中間体であるＮ６−ペンゾイルー９−　［２’　−フルオロ−５ ′−〇−（４，４′　−ジメトキントリチル］−β−Ｄ−リボフラノシル］アデ ニン及びＮ６−ベンゾイル−［２″　−デオキシ−２′　−フルオロ−５’　− ０−（４，４’　−ジメトキシトリチル）コアデノンン−３’　−０−（Ｎ、Ｎ −ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイトを得た。Ｋ、に、Ｏｇｉ 　ｌｖｉ’ｅ、Ｃａｎ　ＪＣｈｅｍ、、　第６７巻、ｐｐ、８３１−８３９　（ １９８９）。
実施例６Ｏ Ｎ６−ペンゾイルー９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（６０）９−β− Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（１，０７ｇ、４．Ｏ○ｍｍｏｌ）を無水ピリ ジン（２０ｍｌ）及び無水ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）にアルゴン雰囲気 下で溶解した。溶液を氷温層に冷却し、クロロトリメチルシラン（３，８８ｍ１ ．３０、　６ｍｍｏｌ）を注射器によって反応混合物へ徐々に加えた。反応混合 物を氷温層で３０分間撹拌した後、塩化ベンゾイル（２，３２ｍ１．２Ｑ　ｍｍ ｏｌ）を徐々に加えた。反応混合物を２０℃に温め、２時間撹拌した。反応混合 物を氷温層に冷却した後、冷水（８ｍｌ）を加え、混合物を１５分間撹拌した。
濃水酸化アンモニウム（８ｍｌ）を反応混合物に徐々に加えて、最終濃度２Ｍの アンモニアにした。冷反応混合物を３０分間撹拌した後、溶媒を真空（６０トル ）中、２０℃で蒸発させ、次に真空（１トル）中、４０℃で蒸発させて油を得た 。この油をジエチルエーテル中で粉砕して固体を得、これを濾過し、ジエチルエ ーテルで３回洗浄した。
この粗製固体を還流温度のメタノール（１００ｍｌ）中で３回粉砕し、溶媒を蒸 発させて、Ｎ６−ペンゾイルー９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（６０ ）を固体（１，５ｇ、１００％）として得た。
実施例６１ Ｎ６−ペンゾイルー９−　［３’　、５’　−ジーＯ−テトラヒドロピランー２ −イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル〕アデニン（６１）Ｎ６−ペンゾイルー ９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（６０）（２゜６２ｇ、７．　０６ｍ ｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（１５０ｆｆｉｌ）にアルゴン雰囲気下で 溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸−水化物（１，３２ｇ、６．　９２ｍｍｏｌ） を加えた。この溶液を氷温層に冷却し、ジヒドロビラン（１，２６＋ａｌ、１３ ゜８ｍｍｏｌ）を注射器によって加えた。反応混合物を２０℃に温めた。５時間 にわたって全部で１０当量のジヒドロピランを２当量の混合物に記載のように加 えた。反応混合物を氷温層に冷却し、飽和水性炭酸水素ナトリウムを徐々に加え てｐＨ８にし、次いで水を加えて７５０ｍ１にした。水性混合物を塩化メチレン で４回（４Ｘ　２０　Ｑｍｌ）抽出し、有機相を合わせ、硫酸マグネシウムで乾 燥した。固体を濾過し、溶媒を真空（６０トル）中、３０℃で蒸発させて、少量 の液体を得た。これを真空（１トル）中、４０℃で蒸発させて油を得た。この油 をｐ−キシレンと共に真空中、４０℃にて蒸発させて油を得、これを塩化メチレ ン（１００ｍｌ）に溶解した。ヘキサン（２００ｍ１）を溶液に加え、低沸点溶 媒を真空中、３０℃にて蒸発させたところ、ヘキサンに懸濁した白色固体が残っ た。この固体を濾過し、ヘキサンで３回（３Ｘ　１０ｍ１）洗浄し、次に、シリ カ及び溶離剤としての塩化メチレン−メタノール（９３・７、Ｖ　／　Ｖ　）を 用いて、カラムクロマトグラフィーによって精製した。第１のフラクションから 、表題化合物（６１）を白色フオーム（ｆｏａｍ）（３，１９ｇ、８３％）とし て、第２のフラクションから、Ｎ６−ペンゾイルー９−β−Ｄ−アラビノフラノ シルアデニンの５′−モノ−テトラヒドロピラニル誘導体の特徴を有する白色フ オーム（０，８１ｇ）を得た。
実施例６２ Ｎ６−ペンゾイルー９−　［２’−〇−トリフルオロメチルスルホニル−３′。
５′　−ジーＯ−テトラヒドロピランー２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシ ル］アデニン（６２） Ｎ６−ペンゾイルー９−　［３’　、５’　−ジーＯ−テトラヒドロビランー２ −イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル〕アデニン（６１）’（２，６５ｇ、４ ．９１ｍｍｏ１）を無水ピリジン（２０ｍｌ）に溶解し、溶媒を真空中（１ｍｍ Ｈｇ）中、４０℃で蒸発させた。得られた油を無水塩化メチレン（１３０Ｉｌｌ ）にアルゴン雰囲気下で溶解し、無水ピリジン（３，３４ｍ１．４１３龍０１） 及びＮ、　Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１，９５ｇ、１６．　Ｏｍｍｏｌ）を 加えた。反応混合物を氷温層に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（ １，３６ｍＬ　８．　０５ｍｍｏｌ）を注射器によって徐々に加えた。反応混合 物を氷温層で１時間撹拌した後、これを冷飽和水性炭酸水素ナトリウム（１４０ ｏ１）に注いだ。混合物を振盪し、有機相を分離し、氷温層に保った。水性相を 塩化メチレンでさらに２回（２Ｘ１４０ｍｌ）抽出した。絶えず冷たく保った有 機抽出物を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥した。
溶媒を真空（６０トル）中、２０℃で蒸発させ、次いで真空（１トル）中、２０ ℃で蒸発させてＮ６−ペンゾイルー９−　［２’　−０−トリフルオロメチルス ルホニル−３’、５’−ジー０−テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−ア ラビノフラノシル］アデニン（６２）を粗製油として得た。これはさらに精製を 行わなかった。
実施例６３ Ｎ６−ペンゾイルー９−　［２’−フルオロ−３’、５’　−ジーＯ−テトラヒ ドロピランー２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン（６３）粗製 油としてのＮ６−ペンゾイルー９−　［２’　−０−トリフルオロメチルスルホ ニル−３’、５’−ジーＯ−テトラヒドロピランー２−イル）−β−Ｄ−アラビ ノフラノシル］アデニン（６２）（４，９ｗｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（ １２０１ｏ１）に溶解し、この溶液をアルゴン雰囲気下で氷温層に冷却した。水 化物としての弗化テトラブチルアンモニウム（１２，８ｇ、　４９．　１ｍｍｏ ｌ）を無水テトラヒドロフラン（５０＋ｎｌ）に溶解し、これの半分を注射器で 冷反応混合物に徐々に加えた。氷温層で１時間撹拌した後、試薬の残りを徐々に 加えた。反応混合物を氷温層でさらに１時間撹拌し、次に溶媒を真空（６０トル ）中、２０℃で蒸発させて、油を得た。この油を塩化メチレン（２５０ｍｌ）に 溶解し、ブラインで３回洗浄した。有機相を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥し た。固体を濾過し、溶媒を蒸発させて油を得た。粗生成物を、焼結ガラス漏斗（ ６００ｍｌ）中のシリカを用いてカラムクロマトグラフィーで精製し、酢酸エチ ルを溶離剤として用いた。Ｎ６−ペンゾイルー９−　［２’−フルオロ−３’、 ５’　−ジー０−テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシ ル］アデニン（６３）を油（２，０３ｇ、７６％）として得た。
実施例６４ Ｎ６−ペンゾイルー９−　（２’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニ ンＮ６−ペンゾイルー９−［２’　−フルオロ−３’　、５’　−ジー０−テト ラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン（６３） （１゜３１　ｇ、　２．　４２ｍｍｏ１）をメタノール（６０１１１）に溶解し 、ダウエックス５０Ｗｘ　２　１００　（４ｃｍ’、２．４ミリ当量）を反応混 合物に加えた。反応混合物５ｍ１）を冷反応混合物に徐々に加え、ｐＨ１，２に した。樹脂を濾過し、洗浄液がもはやＵＶ吸収物質を含まなくなるまでメタノー ル中の３０％トリエチルアミンで洗浄した。トルエン（５０口１）を洗浄物に加 え、溶媒を真空（６０トル、次いで１トル）中、２４℃で蒸発させて残留物を得 た。この残留物を一部塩化メチレン（３０ｍｌ）に溶解し、溶媒を分液漏斗に移 した。残留物の残りを熱（６０℃）水に溶解し、溶媒を冷却した後、やはり分液 漏斗に加えた。この二相系の抽出を行い、有機層を分離し、水で３回（３Ｘ　１ ００ｍ１）抽出した。合わせた水性抽出物を真空（６０トル、次いで１トルＨｇ ）中、４０℃で蒸発させて、油を得た。
これを無水ピリジン（５０ｍｌ）と共に蒸発させた。この油をさらに真空（１ト ルＨｇ）中、２０℃、五酸化燐の存在下で一晩乾燥して、Ｎ６−ペンゾイルー９ −２′−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニン（６４）を黄色フオーム （１、，０８ｇ、１．００％）として得た。これは少量の不純物を含有していた 。
実施例６５ Ｎ６−ペンゾイルー９−　Ｉ２’　−フルオロ−５’　−０−（４，４’　−ジ メトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（６５）少量の不純物 を含有するＮ６−ペンゾイルー９−　（２’　−フルオロ−β−り一すボフーｙ ノシル）アゾ、＝ン（１，０８ｇ、２．　８９ｍｍｏｌ）　（６４）をアルゴン 雰囲気下で無水ピリジン（２０ｍｌンに溶解し、乾燥トリエチルアミン（０，５ ２ｍ１．３．７６のｍｏｌ、）を加え、次いで塩化４．４′−ジメトキシトリチ ル（１，１，３ｇ。
３、　３２１１１１１１０１）を加えた。２０℃で４時間撹拌した後、反応混合 物を分液漏斗に移し、ジエチルエーテル（４０ｍｌ）を加えたところ、白色懸濁 液が得られた。この混合物を水で３回（３Ｘ　１０ｍ１）洗浄し、有機相を分離 し、硫酸マグネシウムで乾燥した。トリエチルアミン（１ｍｌ、）を溶液に加え 、溶媒を真空（６０トルＨｇ）中、２０℃で蒸発させて油を得、これをトリエチ ルアミン（１ｍｌ）を含有するトルエン（２０ｍｌ）と共に蒸発させた。この粗 生成物を、シリカ及び酢酸エチル−トリエチルアミン（９９１、Ｖ／Ｖ）、次い で酢酸エチル−メタノール−トリエチルアミン（８０：１９　：　１．）を用い てカラムクロマトグラフィーで精製して、２つのフラクションの生成物を得た。
これらのフラクションを真空（６０トル、次いで１トルＨｇ）中、２０℃で蒸発 させてフオームを得た。これをさらに真空（１トルＨｇ）中、２０℃、水酸化ナ トリウムの存在下で乾燥させて、Ｎ６−ペンゾイルー９−　［２’　−フルオロ −５’　−０−（４，４’　−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル ］アデニン（６５）をフオーム（１０２ｇ１５２％）として得た。
実施例６６ Ｎ６−ベンゾイル−［２′　−デオキシ−２′−フルオロ−５’　−０−（４， ４’・−ジメトキシトリチル）コアデノシン−３′　−〇、Ｎ、Ｎ−ジイソプロ ピル−β−シアノエチルホスホアミダイト（６６）Ｎ６−ペンゾイルー９−　［ ２’　−フルオロ−５’　−０−（４，４’　−ジメトキシトリチル）〜β−Ｄ −リボフラノシル］アデニン（６５）（１，２６ｇ、１゜８９ｍｍｏｌ）をアル ゴン雰囲気下で無水ジクロロメタン（１３ＩＩ１１）に溶解し、ジイソプロピル エチルアミン（０，８２ｍＩ、４．　６６ａ＋ｍｏｌ）を加え、反応混合物を氷 温度に冷却した。クロロ（ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエトキシホスフ ィン（０，８８ｍ１４．　０３ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、これを２０℃に 冷却し、３時間撹拌した。酢酸エチル（８０ｍｌ）及びトリエチルアミン（１ｎ ＋１）を加え、この溶液をブライン溶液で３回（３Ｘ　２５＋ｍｌ）洗浄した。
有機相を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥した。固体を濾過した後、溶媒を真空 中、２０℃で蒸発させて油を得た。これを、シリカ及び溶離剤としてのヘキサン −酢酸エチル−トリエチルアミン（５０：　４９　：　１）を用いてカラムクロ マトグラフィーによって精製した。フラクションを真空中、２０℃で蒸発させて フオームを得た。これを無水ピリジン（２Ｑｍｌ）と共に真空（１トル）中、２ ６℃で蒸発させ、さらに真空（］トルＨｇ）中、２０℃、水酸化ナトリウムの存 在下で２４時間乾燥して、Ｎ６−ベンゾイル〜［２′　−デオキシ−２′　−フ ルオロ−５’　−０−（４，４’　−ジメトキシトリチル）コアデノシン−３′ −○、　Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト（６６ ）をフオーム（１，０５ｇ、６３％）として得た。
実施例６７ ２′　−チオキシ−２′−フルオロ−５’　−０−（４，４’　−ジメトキシト リチル）−ウリジン−３’　−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアンエチ ルホスホアミダイト）　（６７） Ｊ、フｔックス等、Ｌ　Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、、　、第２９巻、ｐｐ、５５８−５ ６４（１９６４）に記載の方法の変形法によって、表題化合物を製造する。すな わち、２．２′　−シクロウリジン（５，６５ｇ１２５ｍｍｏｌ）を、密閉した 鋼容器中て２０時間、１２０℃の無水ジオキサン（５００ｍｌ）に７０％弗化水 素／ピリジン（６５ｍｌ）を含む溶液で処理する。反応混合物を氷温度に冷却し 、氷（４００ｍｌ）に注ぎ、固体ＣａＣ０，’を添加することによってｐＨを７ にする。溶媒を真空（１トル）中で蒸発させ、残留物をメタノールに溶解し、シ リカゲル１こ吸着させ、そしてシリカ及び溶離剤としての酢酸エチル−メタノー ル（Ｖ／Ｖ、２０・ｌ）を用いてカラムクロマトグラフィーを行うことによって 精製して、２′−デオキシ−２′−フルオロ−ウリジンを白色固体（４，，８１ ｇ、７９％）として得る。５’　−ＤＭＴ及び３′　−シアノエトキシ−ジイソ プロピルホスホアミダイト誘導体化ヌクレオシドは、実施例６５及び６６の手順 で得られる。
実施例６８ ２′−チオキシ−２′−フルオロ−５’　−０−（４，４’　−ジメトキシトリ チル）シチジン−３’　−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホ スホアミダイト）　（６８） ２′−デオキシ−２′−フルオロウリジン（２，５１ｇ、　１０．　３ｍｍｏｌ ）をＣＢ　リース等、Ｊ、Ｃ’ｈｅｍ、Ｓｏｃ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ　 Ｉ、ｐｐ。
１１７’ｌ−１１７６（１９８２）に記載の方法により、室温の無水ピリジン（ ２６ｍｌ）中の無水酢酸（３，１ｍｌ、３２．　７ｍｍｏｌ）でアセチル化する ことによって、相当するンチジン類似体に変える。反応混合物をメタノールで急 冷し、溶媒を真空（１トル）中で蒸発させて油を得る。これをエタノール及びト ルエンと共に蒸発させる。３’　、５’　−０−ジアセチル−２′〜デオキシー ２′−フルオロウリジンをエタノールから結晶化して無色の結晶（２，３８ｇ、 ８１％）を得る。
３’　、５’　−０−ジアセチル−２′−デオキシ−２′−フルオロウリジン（ ２７５ｇ、９．　６１ｍｍｏｌ）を１．　２．　４−トリアゾール（５，９７ｇ 、８６．５市ｏ１）、オキシ塩化燐（１，７３ｍ１．１８．　４ｍｍｏｌ）及び トリエチルアミン（１１５ｍｌ、８２．　７ｍｍｏｌ）と、室温の無水アセトニ トリル中で反応させることによって、Ｎ−４−（１，２，４−トリアゾール−１ −イル）−３’　、５’　−０−ジアセチル−２′−デオキシ−２′−フルオロ ウリジンを７０％の収率（２，３７ｇ）で得る。９０分後、反応混合物を氷温度 に冷却し、トリエチルアミン（７，９８ｍ１．５６．　９ｍｍｏｌ）を加え、次 に水（４，０ｆｆｌｌ）を加える。溶媒を真空（１トル）中で蒸発させて油を得 、これを塩化メチレンに溶解し、飽和水性炭酸水素ナトリウムで洗浄する。水性 相を塩化メチレンで２回（２Ｘ　１００ｍ１）抽出し、有機抽出物を硫酸マグネ シウムで乾燥する。溶媒を蒸発させて油を得、これをエタノールから結晶化する ことによって生成物Ｎ−４−（１，２，４−１−リアゾール−１−イル）　−３ ’　、５’　−０−ジアセチル−２′−チオキシ−２′−フルオロウリジンを得 る。２′−デオキシ−２′−フルオロシチジンは、室温のジオキサン中で６時間 、保護トリアゾール−１−イル誘導体を濃水酸化アンモニウム（４２６ｍ１．８ １．　２ｍｍｏｌ）で処理することによって得られる。溶媒を蒸発させた後、油 を、メタノールに加えた半飽和（氷温度で）アンモニア中で１６時間撹拌する。
溶媒を蒸発させ、２′−デオキシ−２′−フルオロシチジンを酢酸エチル−メタ ノール（ｖ　／　ｖ、７５：２５）から結晶化して無色の結晶（１，２４ｇ、７ ５％）を得る。Ｖ、Ｂｈａｔ等、ヌクレオシド及びヌクレオチド、第８巻、ｐｐ 、１７９−１８３　（１９８９）に記載の方法により、無水ジメチルホルムアミ ド中の無水安息香酸で選択的ベンゾイル化を行うことによフて、Ｎ−４〜ベンゾ イル−２′−デオキシ−２′−フルオロシチジンを製造する。５’　−０−（４ ，４’　−ジメトキシトリチル）−３’　−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−ｂ −シアノエチルホスホアミダイト）は実施例６５及び６６に従って製造しつる。
実施例６９ Ｎ−２−フェノキンアセチル−２′−デオキシ−２′−フルオロ−５’　−〇− （４，４′−ジメトキシトリチル）−グアノシン−３’　−０−（Ｎ、Ｎ−ジイ ソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）（６９）Ｍ、イケハラ等、Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ、第 ２９巻、ｐｐ、１０３４−１０３８及びｐｐ、３２８１−３２８５　（１９８１ ）の手順に従って、２′−デオキシ−２′−フルオログアノンンを製造する。９ −β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発物質として用いる（Ｍ、Ｊ、ｏビ ンス、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、第４０巻、ｐｐ、１２５−１３５　（１９８４ ））。２′−デオキシ−２′−フルオログアノシンを得た後、これをＮ−２−フ ェノキシアセチル誘導体として保護しくＫ、　Ｋ、Ｏｇｉ　１ｖｉｅ１核酸の研 究、第１７巻、ｐｐ、３５０１−３５１７）　、実施例６５及び６６のように５ ’　−ＤＭＴ−３’　−ホスホアミダイトに変えることができる。
実施例７Ｏ Ｎ６−ベンゾイル−［２′−デオキシ−２′−シアノ−５’　−０−（４，４’ 　−ジメトキシトリチル）−アデノシン−３′−〇−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル −β−シアノエチルホスホアミダイト）（７０）Ｋ、Ｅ、Ｂ　バークス及びに、 ティラー、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２９巻、Ｉ）ｐ、２９ ９５−２９９６　（１９８８）！、一記載のものと同様な手順で、２′−デオキ シ−２′−ヨード−３’　、５’　−０−（ジンロキシテトライソプロビル）− Ｎ６−ペンゾイルーアデノンンの２′−ヨード基の遊離基置換を行うことによっ て、２′　−デオキシ−２′−シアノアデノシンを製造する。
２′−デオキシ−２′−ヨードアデノシンは、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ ｔｅｒｓ、第１５巻、ｐｐ、１２９１−１２９４　（１９７７）に記載のような Ｒ。
ランガナタンの方法によって製造し、Ｗ、Ｔ、Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ及びＭ。
Ｗｉｅｗｉｏｒｏｗｓｋｉ、核酸化学、第３部、ｐｐ、２２２−２３１、Ｔｏｗ ｎｓｅｎｄ、Ｌ、Ｂ、；Ｔｉｐｓｏｎ、Ｒ，Ｓ、Ｗ集（Ｊ、Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ 　５ｏｎｓ、ニューヨーク、１９８６）に記載のようにジシリル化した。この物 質をヘキサメチルニスズ、ＡＩＢＮ及びｔ−ブチルイソシアネートをトルエンに 加えたもので処理して保護２′−デオキシ−２′−シアノアデノシンを得る。
選択的脱保護を行った後、この物質を実施例６５及び６６のようにその５’　− ＤＭＴ−３’　−ホスホアミダイトに変える。
実施例７１ ２′−デオキシ−２′　−シアノ−５’　−０−（４，４’　−ジメトキシトリ チル）−ウリジン−３’　−０−（Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチ ルホスホアミダイト）　（７１） 上記のように３’、５’　−ジンリル化した２′−デオキシ−２′−ヨードウリ ジン（又は５−メチルウリジン）を、Ｋ、Ｅ、Ｂ　バークス及びＫ　ティラー、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２９巻、ＰＰ、２９９５−２９９ ６　（１９８８）に記載のようなトリフェニルホスホニウムメチルヨウ化物処理 することによって２′−ヨード誘導体に変える。Ｋ、　Ｅ、Ｂ、バークス及びに 、ティラー、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２９巻、ＰＰ、２９ ９５−２９９６　（１９８８）に記載のような遊離基反応条件を用いると、保護 ヌクレオシドの２′−シアノ基が得られる。この物質を脱保護し、その後上記実 施例６５及び６６のように保護単量体に変えると、必要な核酸合成様物質が得ら れる。
実施例７２ ２′−デオキシ−２′−シアノ−５′−〇−（４，４′　−ジメトキシトリチル ）−シチジン−３’　−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホス ホアミダイト）　（７２） ２′−デオキシ−２′−ヨードシチジンを一般的なケトのアミノへの転換によっ て得る。
実施例７３ ２′　−デオキシ−２′　−シアノ−５’　−０−（４，４’　−ジメトキシト リチル）−グアノシン−３’　−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエ チルホスホアミダイト）　（７３） ２′−チオキシ−２′−シアノグアノシンを、３’、５’　−ジシリル化Ｎ２− イソブチリルグアノシンの２′−上の位置（アラビノ糖）のトリフレート基の置 換によって得る。実施例６５及び６６の方法によるような標準的な脱保護及びそ の後再保護によって表題の単量体を得る。
実施例７４ ２′−デオキシ−２’−（トリフルオロメチル）修飾オリゴヌクレオチドの製造 核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ　（Ｔ）及びＣの必要な２′−デオキシ−２′−トリフルオ ロメチルリボソドを、Ｑ、−Ｙ、　Ｃｈｅｎ及びＳ、Ｗ、Ｗｕ、Ｊｏｕｒｎａｌ 　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓａｃｔ 　１ｏｎｓ、ｐｐ、２３８５−２３８７　（１９８９）に記載の方法を変えて製 造する。実施例６５及び実施例６６に記載の標準法を用いて、以下に挙げる５′ −ＤＭＴ及び３′−ホスホアミダイトを製造する。
Ａ　Ｎ６−ベンゾイル−し２′　−デオキシ−２′−トリフルオロメチル−５’ 　−０−（４，４’　−’）、Ｉ　ト＋シ）Ｊチル）］　］７デ／ンンー３’− ０−（Ｎ。
Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）Ｂ、２′−デオキシ −２′−トリフルオロメチル−５′　−〇−（４，４’−ジメトキシトリチル） −ウリジン−３’　−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホ アミダイト） Ｃ９２′　−デオキシ−２′−トリフルオロメチル−５’　−０−（４，４’− ジメトキシトリチル）−シチジン−３’　−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β −シアノエチルホスホアミダイト） Ｄ、２′−デオキシ−２′−トリフルオロメチル−５’　−０−（４，４’−ジ メトキシトリチル）−グアノシン−３’　−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β −シアノエチルホスホアミダイト） 実施例７５ ２′−デオキシ−２’−（）リフルオロメトキシ）修飾オリゴヌクレオチドの製 造 核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｕ　（Ｔ）及びＣの必要な２′−デオキシ−２’　−〇−）リ フルオロメチルリボシドを、Ｂ、Ｓ、　５ｐｒｏａｔ等、核酸研究、第１８巻、 ｐｐ、４１−４９　（１９９０）及びＨ，イノウニ等、核酸研究、第１５巻、ｐ ｐ６１３１−６１４８　（１９８７）に記載の方法を変えて製造する。実施例Ｉ Ａに記載の標準法を用いて、以下に挙げる５’　−ＤＭＴ及び３′−ホスホアミ ダイトを製造する。
Ａ、　Ｎ’−ベンゾイル−［２′−デオキシ−２’−（トリフルオロメトキシ） 　−５’　−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）コアデノシン−３′−〇− （Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）Ｂ　２′−デ オキシ−２’−（トリフルオロメトキシ）−５’−０−（４゜４′−ジメトキシ トリチル）−ウリジン−３′−〇−（Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエ チルホスホアミダイト）０　２′−デオキシ−２’−（トリフルオロメトキシ） −５’　−０−（４゜４′−ジメトキシトリチル）−シチジン−３′−〇−（Ｎ 、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）Ｄ　２′　−デオ キシ−２’　−（トリフルオロメトキン）−５’　−〇−（４゜４′−ジメトキ シトリチル）−グアノシン−３′　−〇−（Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル−β−シ アノエチルホスホアミダイト）実施例７６ ２′−デオキシ−２’　−（１−プロプロキシ）修飾Ｇ、Ｕ　（Ｔ）及びＣオリ ゴヌクレオチドの製造 核酸塩基Ｇ、Ｕ　（Ｔ）及びＣの必要な２′−デオキシ−２’　−０−プロピル リボシドを、実施例１７及び１８のいつものような変形法で製造する。Ｂ、Ｓ、 ５ｐｒｏａｔ等、核酸研究、第１８巻、ｐｐ、４１−４９　（１９９０）及びＨ ，イノウニ等、核酸研究、第１５巻、ｐｐ、６１３１−６１４８　（１９８７） も参照。
実施例６５及び６６又は実施例１９及び２０に記載の方法を用いて、以下に挙げ る５’−ＤＭＴ及び３′−ホスホアミダイトを製造する。
Ａ、２′−デオキシ−２’−（１−プロプロキン）−５’　−０−（４゜４′− ジメトキシトリチル）−ウリジン−３′−〇−（Ｎ、Ｎ−ジインプロピル−β− シアノエチルホスホアミダイト）Ｂ、２′−デオキシ−２’−（１−プロプロキ シ）−５′−〇−（４゜４′−ジメトキシトリチル）−シチジン−３’　−０− （Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）Ｃ１２′　− デオキシ−２’　−（１−プロプロキシ）　−５’　−０−（４゜４′−ジメト キシトリチル）−グアノシン−３’　−０−（Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルーβ− シアノエチルホスホアミダイト）実施例７７ ２′〜デオキシ−２′−（ビニルオキシ）修飾オリゴヌクレオチドの製造核酸塩 基Ａ、Ｇ、Ｕ　（Ｔ）及びＣの必要な２′−デオキシ−２′−〇−ビニルリボシ ドを、実施例１の方法を変えて製造する。この場合、１．２−ノブロモエタンを ２′−ヒドロキシルにつなぎ、その後脱臭化水素化して希望のブロックした２′ −ビニルヌクレオシドを得る。実施例６５及び６６に記載の標準法を用いて、以 下に挙げる５’　−ＤＭＴ及び３′−ホスホアミダイトを製造する。
八　Ｎ６−ベンゾイル−し２′−チオキシ−２′−（ビニルオキシ）−５’　− ０−（４，４′−ジメトキシトリチル）〕〕アデノシン−３′−〇−Ｎ。
Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）Ｂ、２′　−チオキ シ−２’　−（ビニルオキシ）−５’　−０−（４，４’　−ジメトキシトリチ ル）−ウリジン−３’　−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホ スホアミダイト） Ｃ１２′　−チオーｔ−シー２’　−（ｌｘ’二／ｌｚオ！ン）　−５’　−０ −（４，４’　−ジメトキシトリチル）−シチジン−３′　−〇−（Ｎ、Ｎ−ジ イソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト） Ｄ、２′−チオキシ−２’−（ビニルオキシ）　−５’　−０−（４，４’　− ジメトキシトリチル）−グアノシン〜３′　−〇−（Ｎ、Ｎ−ンイソブロピルー β−シアノエチルホスホアミダイト） 実施例７８ ２′−デオキシ−２′−（アリルオキシ）修飾Ｇ、Ｕ　（Ｔ）及びＣオリゴヌク レオチドの製造 核酸塩基Ｇ、Ｕ　（Ｔ）及びＣの必要な２′−チオキシ−２′−〇−アリルリボ シドを、実施例２１の方法を変えて製造する。Ｂ、Ｓ、　５ｐｒｏａｔ等、核酸 研究、第１８巻、ｐｐ、４１−４９　（１９９０）及びＨ，イノウニ等、核酸研 究、第１５巻、ｐｐ、６１３１−６１４８　（１９８７）も参照。実施例６５及 び６６又は実施例２３及び２４に記載の方法を用いて、以下に挙げる５′−ＤＭ Ｔ及び３′−ホスホアミダイトを製造する。
Ａ、、Ｎ’−ベンゾイル−［２′　−デオキシ−２′−（アリルオキシ）−５’ 　−０−（４，４’　−ジメトキシトリチル）］　］７デ／シンー３’−０−（ Ｎ。
Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト）Ｂ、２′−チオキシ −２′−（アリルオキシ）−５′−〇−（４，４’　−ジメトキシトリチル）− ウリジン−３’　−０−（Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル−β−シアンエチルホスホ アミダイト） Ｃ，２’　−チオキシ−２’　−（７！Ｊ／１ｚｔ−Ｆ：／）　−５’　−０− （４，４’　−ジメトキシトリチル）−シチジン−３’　−０−（Ｎ、Ｎ−ジイ ソプロピル−β−シアノエチルホスホアミダイト） Ｄ２′　−チオキシ−２’　−（７’Ｊルオキシ）　−５’　−０−（４，４’ 　−ジメトキシトリチル）−グアノシン−３′　−〇−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピ ル−β−シアノエチルホスホアミダイト） 実施例７９ チミン又はシトシン（ピリミジンタイプの塩基）のそのβ−Ｄ−２′−デオキシ ー２′−置換エリス置換エリフロベントフラノシルヌクレオシド換（２′　−置 換リポシル化） チミン又はシトシンタイプの類似体を、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）及 び酸触媒（すなわち、塩化アンモニウム）のような標準条件下でトリメチルシリ ル化し、次いでルイス酸触媒（すなわち、塩化第二スズ、ヨウ素、テトラフルオ ロ硼酸硼素等）の存在下で、塩化３．５−０−リトル置換用−２−デオキシ−２ −置換一α−Ｄ−エリスロベントフラノシルで処理する。詳細な方法は新しくは 、Ｊ、Ｎ、フレスコス、ヌクレオシド及びヌクレオチド、第８巻、ｐｐ、１０７ ５−１０７６　（１９８９）に記載されており、ここではヨウ化銅（Ｉ）が用い られる触媒である。
実施例８０ アデニン又はグアニン（プリンタイブの塩基）のそのβ−Ｄ−２′　−デオキシ −２′　−置換エリスロベントフラノシルヌクレオシドへの化学変換（２′　− 置換リボンル化） 保護されたプリンタイブの類似体を、アセトニトリル中の水素化ナトリウムでそ れらのナトリウム塩に変え、次に周囲温度にて塩化３，５−○−ントルオイルー ２−デオキシー２−置換−α−り一エリスロベントフラノシルで処理する。詳細 な方法は新しくはＲ，Ｋ、　Ｏビンス等、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、第１０６巻、ｐ、６３７９　（１９ ８４）に記載されている。
実施例８１ ２′−デオキシ−２−置換チミジンの相当する２′　−デオキシ−２′−置換ノ チジンへの変換（ピリミジンタイプ４−ケト基の４−アミノ基への化学変換）２ ′修飾ヌクレオシドタイプの３’、５’　−糖ヒドロキシルは、酸塩化物又は無 水物及びピリジン／ジメチル−アミノピリジン溶媒及び触媒の標準条件を用いて 、トルオイル、ベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイル、アセチル、インブチリル、 トリフルオロアセチルのようなアシル基によって保護される。ここで保護された ヌクレオシドはピリジン又は他の適当な塩基性溶媒中、塩化チオニル又は塩化ホ スホリルで塩素化される。ピリミジンタイプ４−クロロ基はここでメタノール中 のアンモニアで置換される。糖ヒドロキシルの脱保護も行われる。アミノ基は完 全ベンジル化（糖ヒドフキンル及びアミノ基）の標準的な２工程法でベンゾイル 化され、アンルは水酸化ナトリウム水溶液で選択的に除去される。あるいは、そ の場でヌクレオシドをクロロトリメチルシラン及び塩基でまず処理して糖ヒドロ キシルをその後のアシル化から保護する方法を用いてもよい。Ｋ、　Ｋ、　Ｏｇ ｉ　１ｖｉｅ、Ｃａｎ　Ｊ、Ｃｈｅｍ、、第６７巻、ｐｐ、８３１−８３９　（ １９８９）。別の変換法は、ピリミジンタイプの４−クロロ基を、ＤＮＡ合成機 でのオリゴヌクレオチド合成の間、無傷のままである１、２．　４−トリアゾー ル基で置き換え、オリゴヌクレオチドをＣＰＧ支持体から除く水酸化アンモニウ ム工程及びヘテロサイクルの脱保護の間にアンモニアで置換される。さらに、多 くの場合、ピリミジンタイプの４−クロロ基は上記のように用い、そしてオリゴ ヌクレオチド合成の終わりで置き換えることができる。
実施例８２ メチル　５−（シアノメチル）　−１−（２’−チオキシ−３，５−ジー０−ｐ −トルオイル−β−り一エリスロベントフラノシル）イミダゾール−４−カルボ キシレート（８２−Ａ）及び５−シアノメチル−１−（２’　−デオキシ−β− Ｄ−エリスロベントフラノシル）イミダゾール−４−カルボキンレート（８２− Ｂ）メチル　５−（シアノメチル’）　−１−（２’−デオキソ−３，５−ジー ０−ｐ−トルオイル−β−〇−エリスロベントフラノシル）イミダゾール−４− カルボキシレート（８２−Ａ）の大規模な合成は、Ｇ、Ｒ，Ｒｅｖａｎｋａｒ等 、ＪＭｅｄ、Ｃｈｅｍ、　、第２７巻、ｐｐ、１３８９−１３９６　（１９８４ ）のナトリウム塩グリコジル化法によって行う。以下の実施例８３−８５では、 この出発物質のアルキル化生成物はアルキル化炭素における形とは異なるジアス テレオマーａ合物である。というのは、これらの混合物はＩＨ−ＮＭＲにおいて 各プロトンに対し二重共鳴を示すからである。８２Ａと液体アンモニアの１００ ℃での反応生成物である５−シアノメチル−１−（２’　−デオキシ−β−り一 エリスロベントフラノシル）−イミダゾール−４−カルボキサミド（８２−Ｂ） はこの同じ文献の方法に従って製造した。
実施例８３ メチル　５−（シアノ［ノニルコメチル）−１−（２’−デオキシ−３，５−ジ ー０−ｐ−トルオイル−β−り一エリスロベントフラノシル）イミダゾール−４ −カルボキシレート（８３） 無水アセトニトリル（７５ｍｌ）に８２−Ａ　（５，７ｇ、　ｌｌｍｍｏｌ）を 含む溶液を、室温の水素化ナトリウム（０，８８ｇ、油中に６０％、ヘキサンで 洗浄）でアルゴン雰囲気下にて処理した。この懸濁液を１５分間撹拌し、次に注 射器を用いてヨードノナン（７，５ｍｌ、３７．　４ｍｍｏｌ）で処理した。反 応混合物をこれらの条件下で６時間撹拌した：薄層クロマトグラフィープレート （酢酸エチル／ヘキサン、３　：　２、ｖ／ｖ）から、出発物質のヌクレオシド がなくなり、２種の移行のより速い生成物が現れていることが分かった。反応混 合物を氷酢酸を加えて急冷してｐＨ５にし、次に真空中で蒸発させて乾燥して、 黄色のシロップを得た。
シロップを冷Ｑ、ＩＮ−ＨＣＬ水で洗浄し、そして硫酸マグネシウムで乾燥した 。乾燥剤を濾過し、溶媒を蒸発させて、黄色のガムを得た。これを酢酸エチル− ヘキサン（１・４、次いで１：１）を用いてシリカゲル（１２０ｇ）上でフラッ シュクロマトグラフィーした。アルキル化生成物に相当するフラクションをプー ルし、蒸発させて、黄色のフオームとして８３を得た、２．９８ｇ　（４７％） 。
ＩＨＮＭＲ（ＭｅｚＳＯ−ｄ６）：δ、８．１８及び８．　１５　（ｓ、ｓ　； Ｃ−２Ｈ，ＬＨ）＋６．４８及び６．３７　ｃｔ、ｔ　；Ｈ−１’　、　ＩＨ） 　：　１．１８及び０．　０９　（２ｍ、ノニル、１９Ｈ）。
実施例８４ メチル　５−（アリル［シアノコメチル）　−１−（２’−デオキシ−３，５− ジー０−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−エリスロベントフラノシル）イミダゾール− ４−カルボキシレート（８４） 無水アセトニトリル（７５ｍｌ）に８２−Ａ（５，０ｇ、９　、　７　ｍｍｏｌ ）を含む溶液を、８３について記載したように水素化ナトリウム（０，４６ｇ、 １１．６ｍｍｏｌ）、次いで臭化アリル（２，５ｍｌ、　２９ｍｍｏｌ）で処理 した。反応混合物を処理し、上記の溶媒系を用いてシリカゲル（７５ｇ）上でク ロマトグラフィーして、黄色のフオームとして８４を得た、３．６６ｇ　（６８ ％）。ＩＨ−ＮＭＲ（Ｍｅ　２Ｓｏ−ｄ６）：δ、８．１５及び８．　１３　（ ｓ、５ａｃ−２Ｈ，ＩＨ）　；６゜３８　（ｍ＋Ｈ−１’　、ＩＨ）；５．７５ 及び５．　０８　（２ｍ、ビニル、３Ｈ）。
実施例８５ メチル　５−（ベンジル［シアノコメチル）　−１−（２’−デオキシ−３，５ −ジー０−ｐ−１ルオイルーβ−Ｄ−エリスロベントフラノシル）イミダゾール −４−カルボキンレート（８５） 無水アセトニトリル（７５ｍｌ）に８２−Ａ　（５，０ｇ、９．　５ｍｍｏｌ） を含む溶液を、室温の水素化ナトリウム（０，４６ｇ、ｌｌｍＩＩｏｌ）でアル ゴン下にて処理し、室温で１５分間撹拌した。混合物を水浴中で４℃に冷却し、 アセトニトリル（１５ｍｌ）に臭化ベンジル（１，２６ｍ１．１０．　６ｍｍｏ ｌ）を含む溶液を７０分にわたって滴加した。水浴を除き、反応混合物をさらに 室温で２５時間撹拌した。
反応混合物を処理し、生成物をシリカゲル上で精製して、白色フオームとして８ ５を得た、３．　４．ｇ　（５８％）　。ＩＨＮＭＲ（ＭｅｚＳＯｄ６）：δ、 ８゜１０及び８．０５　（ｓ、５ａｃ−２Ｈ，ＬＨ）　；７．３０−７．　１０ 　（ｍ、　７゜ニル、５Ｈ）：５．３３及び及び６．　０１　（ｔ、ｔ　；Ｈ− １’　、ＩＨ）。
実施例８６ ５−（シアノ［ノニルコメチル）−１−（２’　−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ ペントフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド（８６）ノニル−イミダ ゾールヌクレオシド８３　（２，９８ｇ、　４．’　６ｍｌｌ１ｏｌ）を無水メ タノール（５ｍｌ）に溶解し、ステンレス鋼ボンベへ移した。溶液をドライアイ ス／イソプロパツール洛中で冷却し、次に無水液体アンモニア（４５ｍｌ）で処 理した。ボンベをシールし、そして油浴中で２１１時間、１００℃に加熱した。
ＴＬＣ（酢酸エチル／メタノール、４　：　Ｌ　ｖ／ｖ）から、トルオイル保護 基が完全に除去されたことが分かった。過剰のアンモニアを室温で蒸発させ、得 られたこは（色のガムを酢酸エチル／メタノール（９５５、次いで９：１）を用 いてシリカゲル（８０ｇ）上でフラッシュクロマトグラフィーした。脱ブロツク 生成物に相当するフラクションをプールし、真空中で蒸発させて白色フオームと して８６を得た、１．１４ｇ（６３％）、ＩＨ−ＮＭＲ（ＭｅｚＳＯｄ６）：δ 、８゜０９及び８．０５　（ｓ、５ａｃ−２Ｈ，ＩＨ）　：６．１４　（ｔ；Ｈ −１’　、　ＩＨ）；１．４０−１．０５及び０．　９５　（２ｍ、ノニル、１ ９Ｈ）。
実施例８７ ５−（アリル［シアノコメチル）　−１−（２’　−デオキシ−β−Ｄ−エリス ロベントフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド（８７）アリルーイミ ダゾールヌクレオシド８４　（３，９５ｇ、７．０８市ｏ１）をステンレス鋼ボ ンベ中で液体アンモニアで処理し、１００℃に８時間加熱した。化合物８６と同 様な方法で、この反応生成物を処理し、シリカゲル（８０ｇ）上で精製した。脱 ブロックした化合物８７を白色フオームとして単離した、１．　２９ｇ（５８％ ）、ＩＨＮＭＲ（Ｍｅ２ＳＯｄ６）：６．８．０９及び８．０７（ｓ、５ａｃ− ２Ｈ，ＩＨ）；６．１５（ｔ、Ｈ−１’、ＩＨ）；５．７５及び５、　１０　（ ２ｍ、ビニル、３Ｈ）。
実施例８８ ５−（ベンジル［シアノコメチル’Ｉ　−１−（２’　−チオキシーβ−Ｄ−エ リスロベントフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド（８８）ペンジル ーイミダゾールヌクレオシド８５　（３，０ｇ、　４．　９３ｍｍｏＬ）をステ ンレス鋼ボンベ中で液体アンモニアで処理し、１００℃に６時間加熱した。化合 物８６と同様な方法で、この反応生成物を処理し、シリカゲル（８０ｇ）上で精 製した。脱ブロックした化合物８８を白色フオームとして単離した、１０３ｇ（ ５９％）、ＩＨ−ＮＭＲ（Ｍｅ２Ｓ○−ｄ６）：６．８．０３及び８０４（ｓ、 ｓ　；Ｃ−２Ｈ，ＩＨ）　；　７．　２５　（ｍ、フェニル、５Ｈ）；６．１７ 及び６．０７　（ｔ、ｔ　；Ｈ−１’　、ＩＨ）。
実施例８９ ５−（シアノメチル）−１−（２’−デオキシ−５′−〇−ジメトキシトリチル ーβ−Ｄ−エリスロベントフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド（８ ヌクレオシド８２−Ｂ　（１，９５ｇ、　７’、３ｍｍｏｌ）をピリジン（３０ １ｎｌ）と共に蒸発させることによって乾燥した。得られたガムを無水ピリジン にアルゴン下で溶解し、次いで塩化ジメトキシトリチル（２，９０ｇ、　１２． 　４ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を室温で２時間撹拌し、その後、ＴＬＣ（酢 酸エチル：メタノール、１９：１、Ｖ　／　Ｖ　）から出発物質が完全に変換し ていることが分かった。トリチル化生成物を発煙Ｈ，Ｓｏ４を用いてオレンジス ポットとして目に見えるようにした。反応混合物をメタノール（２ｍｌ）を加え て急冷し、そして１５分間撹拌した。
混合物を真空中で蒸発させて薄いオレンジ色のシロップを得た。これをトルエン と共に蒸発させた（３Ｘ２５＋ｏｌ）。シロップに、１％ＥｔｓＮ／ＣＨｚＣ］ ２中のメタノールの段階的勾配（０−５％メタノール）を用いるシリカゲル（１ ００ｇ）上でのフラッシュクロマトグラフィーを行った。適したフラクションを プールし、蒸発させて白色フオームとして８９を得た、３．６４ｇ　（８７％） 。ＩＨ−ＮＭＲ（ＭｅｚＳＯｄ６）　δ、７．　９６　（ｓａｃ−２Ｈ，ＩＨ） 　；６．　８５−７．３５　（ｍ、ＤＭＴ、１３Ｈ）：６．１３　（ｔ　；Ｈ− １’　、ＬＨ）。
実施例９０ ５−（シアノ　［ノニルコメチル）　−１−（２’　−デオキシ−５′−〇−ジ メトキシトリチルーβ−Ｄ−エリスロベントフラノシル）イミダゾール−４−カ ルボキサミド（９０） ヌクレオシド８６　（１，２０ｇ、３．　１ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（３０ｏ ＋１）と共に蒸発させることによって十分に乾燥した。得られたシロップをアル ゴン下、無水ピリジンに再溶解し、塩化ジメトキシトリチル（１，０ｇ、　３． 　１ｗｏｌ）で処理した。反応混合物を室温で３．５時間撹拌した。この後、Ｔ ＬＣ（酢酸エチル）から、出発物質が完全に変換していることが分かった。反応 混合物を２Ｉｎ１の無水メタノールで処理し、１５分間撹拌し、次いで真空中で 蒸発させて鮮やかなオレンジ色のシロップを得た。このシロップをトルエン（２ Ｘ５０ｍｌ）と共に蒸発させ、ジクロロメタン／１％トリエチルアミン中のメタ ノールの段階的勾配（〇−３％メタノール）を用いるシリカゲル（８０ｇ）上で のフラッシュクロマトグラフィーを行った。適したフラクションをプールし、真 空中で蒸発させて白色フオームとしてンメトキシトリチル化化合物９０を得た、 １．４６ｇ　（６９％）。ＩＨＮＭＲ（Ｍｅ２ＳＯｄ６）：δ、７．９８及び７ ．　９３　（ｓ、ｓ　；Ｃ−２Ｈ１ＬＨ）；７．３０及び６．９２　（２ｍ、Ｄ ＭＴ、１３Ｈ）；　６．２１　（ｔ＋Ｈ−１’　、ＩＨ）：　１．２０及び０． ９２　（２ｍ、ノニル、１９Ｈ）。
実施例９１ ５−（アリル［シアノコメチル）　−１−（２’　−デオキシ−５′−Ｏ−ジメ トキシトリチル−β−り一エリスロベントフラノシル）イミダゾール−４−カル ボキサミド（９１） ヌクレオシド８７　（１，２５ｇ、４．　０８ｗｏｌ）をピリジンと共に蒸発さ せることによって乾燥し、無水ピリジン（５０ｍｌ）に再溶解し、アルゴン雰囲 気下、塩化ジメトキシトリチル（１，３８ｇ、４．０８■ｏｌ）で処理した。反 応混合物を２５時間撹拌し、次いで化合物８９と同様な方法でシリカゲル（９０ ｇ）上でのフラッシュクロマトグラフィーを行うことによって生成物を単離した 。適したフラクションをプールし、真空中で蒸発させて白色フオームとしてジメ トキシトリチル化化合物９１を得た、１．８６ｇ　（７５％）　。ＩＨＮＭＲ（ Ｍｅ２ＳＯ−ｄ６）：δ、７．９８及び７．９５　（ｓ、ｓ　；Ｃ−２Ｈ，ＬＨ ）　；７．　２５及び６．９３　（２ｍ、ＤＭＴ、１３Ｈ）：６．２１　（ｍ； Ｈ−１’　、ＬＨ）；５．７８及び５．　１０　（２ｍ、ビニル、３Ｈ）。
実施例９２ ５−（ベンジル［シアノコメチル）−１−（２’−チオキシ−５′−〇−ンメト キシトリチルーβ−Ｄ−エリスロベントフラノシル）イミダゾール−４−カルボ キサミド（９２） ヌクレオシド８８　（９３０ｍｇ、　２．　６ｍｍｏｌ）をピリジンと共に蒸発 させることによって乾燥し、無水ピリジン（５０ｍｌ）に再溶解し、アルゴン雰 囲気下、塩化ジメトキシトリチル（８８４ｍｇ、２　、　６　ｍｍｏｌ）で処理 した。反応混合物を４時間撹拌し、次いで化合物８９と同様な方法でシリカゲル Ｃ８０ｇ）上でのフラッシュクロマトグラフィーを行うことによって生成物を単 離した。適したフラクションをプールし、真空中で蒸発させてピンク色のフオー ムとして１５０ｇの９２を得た（８７％）　。ＩＨＮＭＲ（ＭｅｚＳＯｄ６）： δ、７．　７０　（ｓ　：Ｃ−２８，ＬＨ）ニア、４０及び６．　７０　（２ｍ 、　ＤＭＴ、フェニル；１’８Ｈ）；６．１０　（ｔ、Ｈ−１’　、ＩＨ）。
実施例９３ ５−（シアノメチル）−１−（５’−０−ジメトキシトリチル−３’　−０−［ ２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル］ホスホアミダイト−２′−デオ キシ−β−り一エリスロベントフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド （９トリチル化ヌクレオシド８９　（１，８２ｇ、　３．　２ｍｍｏｌ）をアル ゴン下で無水テトラヒドロフラン（５０ｍｌ）に溶解し、次にジイソプロピルエ チルアミン（１ｍｌ）で処理した。溶液を水浴中で４°Ｃに冷却し、２−シアノ エチル−Ｎ、　Ｎ−イソプロピルホスホロクロリデート（１，２ｇ、　５．　１ ２ｍｍｏｌ）で１度に処理した。
水浴を除き、反応混合物を室温で３時間撹拌した。この後、ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ 　２／ユ％ＭｅＯＨ／１％Ｅｔ、Ｎ）がら、出発物質が完全に変換していること が分かった。反応生成物を発煙Ｈ２ＳＯ４を用いて目に見えるようにした。反応 混合物を真空中で蒸発させて粘稠なシロップを得た。これを直ちにジクロロメタ ン（１００ｍｌ）に再溶解し、冷飽和炭酸水素ナトリウム（２Ｘ５０ｍｌ）及び ブライン（５０ｍｌ）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し 、蒸発させて黄色フオーム（２，８ｇ）を得た。このフオームに、１％Ｅｔ３Ｎ 含有酢酸エチル／入キサンの段階的勾配（１，４ないし１１）を用いるシリカゲ ル上でのフラッシュクロマトグラフィーを行った。適当なフラクションをプール し、蒸発させて白色フオームとして９３を得た、１．６５ｇ　（５９％）。フオ ームを少量のジクロロメタンに溶解し、これを多量部（１：５０）のへキサンに 加えることによって、この物質のアリコートを沈殿させた。ＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤ ３ＣＮ）：δ。
７．７８及び７．７２　（ｓ、ｓ　；Ｃ−２Ｈ，ＩＨ）　ニア、　２５及び６９ ５（ｍ、ＤＭＴ、１３Ｈ）；　６．１２　（ｔ、Ｈ−１’　、ＩＨ）　。３１Ｐ −ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）：δ、１５０．０２，１４９．９８゜実施例９４ ５−（シアノ［ノニルコメチル）−１−（５’　−〇−ジメトキシトリチルー３ ′−Ｏ−［２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソブロピルコホスポアミダイト−２ ′−デオキシーβ−Ｄ−エリスロベントフラノシル）イミダゾール−４−カルボ キサミド（９４） トリチル化ヌクレオシド９０．１．　４６ｇ　（２，１ｍｍｏｌ）をアルゴンの 下で無水テトラヒドロフラン（５０ｍｌ）に溶解し、次いでジイソプロピルエチ ルアミン（１、５ｍｌ）で処理した。混合物を水浴中で４℃に冷却し、２−シア ノエチル−Ｎ、　Ｎ−ジイソブロピルアミノホスホロクロリダイト（４８８ｍｇ 、　２．１ｍｍｏｌ）で１度に処理した。水浴を除き、反応混合物をさらに室温 で合計３時間撹拌した。
さらにホスホロクロッダイト（４８ｍｇ）を第１及び第２反応の終わりで加えた 。
この後、ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃ１ｘ／３％ＭｅＯＨ／１％ＥｔｓＮ）がら、出発物質 が完全に変換したことが分かった。反応混合物を９３で記載のように処理し、１ ％Ｅｔ３Ｎを含有する酢酸エチル／ヘキサンの段階的勾配（２３ないし３：２） を用いてシリカゲル（８０ｇ）上で生成物を精製した。適当なフラクションをプ ールし、蒸発させて９４を無色のフオームとして得た、１．３７ｇ　（７３％） 。
この物質のアリコートを化合物９３についての手順を用いて沈殿させた。ＩＨ− ＮＭＲ（ＣＤ、ＣＮ）：δ、７．７５　（ｓａｃ−２Ｈ）；７．２５及び６８５ 　（２ｍ、ＤＭＴ、１３Ｈ）；　６．２５及び６．２０　（２ｍ、　Ｈ−１’　 、ＩＨ）。
”ｐ　ＮＭＲ（ＣＤｓＣＮ）　δ、１５０．１，１５０．０及び１４９９゜実施 例９５ ５−（アリル［ノアノ］メチル）−１−（５’　−〇−ジメトキントリチルー３ ′−〇−Ｌ２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル〕ホスホアミダイト−２ ′−チオキシーβ−Ｄ−エリスロベントフラノシル）イミダゾール−４−カルボ キサミド（９５） トリチル化ヌクレオシド９１．１．　８６ｇ　（３，１ａ＋ｍｏｌ）を無水ＴＨ Ｆ　（５０■１）に溶解し、次いで化合物９４と同様の方法でジイソプロピルエ チルアミン（１、５ｍ１）及び２−シアノエチル　Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルア ミノホスホクロリダイ）（７０５ｍｇ、３．　１ｍｍｏｌ）で処理した。混合物 を室温で合計３時間撹拌した。２時間の反応時間の後、さらにホスホクロリダイ ト（１４，０ｍｇ）を加えた。
反応混合物を処理し、段階的勾配の酢酸エチル／ヘキサン（２：３ないし４：１ 、Ｖ　／　Ｖ　）を用いるシリカゲル（８０ｇ）上のフラッシュクロマトグラフ ィーで単離した。適当なフラクションをプールし、蒸発させて２．１８ｇ　（８ ８％）の９５を白色固体フオームとして得た。この物質のアリコートを化合物９ ３についての手順を用いて沈殿させた。ＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤＩＣＮ）：δ、７． ７７及び７７５　（ｓ、５ａｃ−２Ｈ，ＩＨ）；７．４５及び６．８５　（２ｍ 、　ＤＭＴ、１３Ｈ）　；６．２５及ヒ６．２０　（ｔ、ｔ　；Ｈ−１’　、　 ＩＨ）。”Ｐ　−ＮＭＲ（ＣＤ、ＣＮ）・δ、１５０．０５．１４９．９８及び １４９．８５゜実施例９６ ５−（ベンジル［ノアノ］メチル）−１−（５’−０−ジメトキシトリチル−３ ’　−０−［２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソブロピルコホスホアミダイトー ２′−デオキシ−β−〇−エリスロベントフラノシル）イミダゾール−４−カル ボキシアミド（９６） トリチル化ヌクレオシド９２．１．　５０ｇ　（２，３ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ （５０ｍｌ）に溶解し、次いで化合物９３と同様の方法でジイソプロピルエチル アミン（１、５ｍ１）及び２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ−ジイソブロピルアミノ ホスホクロリダイト（５３９ｍｇ、　２．　３ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を 室温で合計３時間撹拌した。２時間の反応時間の後、さらにホスホロクロリデー ト（１１０ｍｇ）を加えた。
反応混合物を処理し、生成物を段階的勾配の酢酸エチル／ヘキサン（１・４ない し３２、Ｖ　／　Ｖ　）を用いてシリカゲル（４０ｇ）上のフラッシュクロマト グラフィーで単離した。適当なフラクションをプールし、蒸発させて１．０３ｇ （５５％）の９６を無色のフオームとして得た。この物質のアリコートを化合物 ９３についての手順を用いて沈殿させた。ＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）　・δ、 ７．７２　（ｓ、５ａｃ−２Ｈ，ＩＨ）　；７．　３０及び６．　８０　（２ｍ 、　ＤＭＴ、ベンジル；　１８Ｈ）；　６．１０　（ｍ、Ｈ１’　、ＩＨ）　。
”Ｐ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）・δ、１５０．００．１４９．９０及び１４９．８ ５゜実施例９７ オリゴマーの合成 実施例９３．９４．９５及び９６のヌクレオチドを混合したオリゴマーを、Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８ＱＢ合成機で標準的なホスホアミダイ ト化学を用いて製造した。各オリゴヌクレオチド上の５′−ジメトキシトリチル 基を残す方法を用いた平均カップリング効率は９４％であった。固体支持体から の開裂の後、オリゴマーを過剰の濃水酸化アンモニウムで処理し、密封容器中で ５５℃にて最低１５時間加熱した。この方法によつて全ての保護基がＡＳＧ及び Ｃ塩基から除かれ、５−ノアノ［アルキルツメチルイミダゾールは３−デアザ− ３−アルキル（又はアリール）へテロサイクルに環化された。各ヌクレオチドの 場合、この環化は単一の３−デアザ−３−置換２′−デオキシグアノシン塩基を 含有するＴＧ３Ｃトリマーの１１（−ＮＭＲスペクトル分析で証明された。これ らのトリチルが上にあるオリゴマーの精製は、５０ＩＩＩＭトリエチルアンモニ ウムアセテート（ｐＨ７，０）中のアセトニトリルの勾配溶離を用いる（６０分 にわたりて４−４８％）Ｃ−４ウオーターズ・プレバック・カートリッジ（１０ ｍｌ）を使用して行った。トリチル基を１５％酢酸で処理することによって除き 、次にオリゴマーを７０％エタノールから沈殿させた。
実施例９８ ５−（シアノ［プロピルフタルイミドコメチル）−１−（５’　−０−ジメトキ シトリチル−３’　−０’　［２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル］ ホスホアミダイト−２′−チオキシーβ−り一エリスロベントフラノシルーイミ ダゾール−４−カルボキサミド（９８） 実施例８３の方法で、化合物８２−Ａを、ヨードノナンの代わりにＮ−（３−ブ ロモプロピル）フタルイミドを用いて処理することができる。実施例８３に従っ て処理した後、生成物を実施例８９及び９３に従って処理すると表題化合物が得 られる。オリゴヌクレオシド合成機固体支持体からの開裂の際の閉環に加えて、 フタルイミドはまた他の上記実施例に従ってアミノに開裂する。さらに、アルキ ルアミノ生成物は実施例５７及び５８に従ってポリアルキルアミンに連鎖延長さ せることができる。
実施例９９ ５−（シアノ［イミダゾー１−イル（プロピル）］メチル’）−１−（５’　− ０−ジメトキシトリチル−３’　−０’　［２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソ プロピル］ホスホアミダイト−２′−デオキシ−β−Ｄ−エリスロベントフラノ シルーイミダゾール−４−カルボキサミド（９９）実施例８３の方法で、化合物 ８２−Ａを、ヨードノナンの代わりに１−　（３−ブロモプロピル）イミダゾー ルを用いて処理することができる。実施例８３に従って処理した後、生成物を実 施例８９及び９３に従って処理すると表題化合物が得られる。
実施例１００ ５−（シアノ［アントラセン−２−イル（プロピル）］メチル）−１−（５’　 −Ｏ−ジメトキシトリチル−３’　−０’　［２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−シイ ソプロビルコホスホアミダイト−２′−チオキシーβ−Ｄ−エリスロベントフラ ノソルーイミダゾール−４−カルボキサミド（１００）実施例８３の方法で、化 合物８２−Ａを、ヨードノナンの代わりに２−（３−ブロモプロピル）アントラ センを用いて処理することができる。実施例８３に従って処理した後、生成物を 実施例８９及び９３に従って処理すると表題化合物が得られる。
実施例１０１ ２−クロロ−６−アリルオキソ−９−２′−デオキシプリン（１０１，）アリル アルコール（１５０ｍｌ）に２．６−ジクロｏ−９−（２’　−デオキシ−３’ 、５’−ジー○−トルイル）−プリン（１０，３ｇ、　１９゜０４ｍｍｏｌ）を 含む撹拌懸濁液に、少量の水素化ナトリウム（０，８ｇ、２０關０１）を１０分 間にわたって室温で加えた。水素化ナトリウムの添加後、反応混合物を５５℃の 予熱油浴に２０分間置き、水分を除いた。反応混合物を冷却し、濾過し、アリル アルコール（１００ｍ１）で洗浄した。溶液のｐＨが４−５となるまで、濾液に ＩＲＣ−５０（弱酸性’）Ｈ（＋）樹脂を加えた。樹脂を濾過し、メタノール（ １００ｍｌ）で洗浄し、濾液を蒸発させて乾燥した。残留物をシリカゲル（１０ ｇ、６０−１００メツシユ）に吸着させ、蒸発させて乾燥した。乾燥シリカゲル を、ジクロロメタン中に詰めたシリカカラム（５ｘ２５ｃｍ、１００−２５０メ ツシユ）の頂部に置いた。カラムをＣＨ２Ｃｌ２→アセトンで溶離した。生成物 を含有するフラクションを共にプールし、蒸発させて乾燥し、６ｇ（９６％）の 表題化合物をフオームとして得た。
実施例１０２ ２−り四ロー２′−デオキシイノシン（１０２）エチルアルコール（２００ｍｌ ）に（１０１）（６ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）　、ｐｄ／ｃ（１０％、Ｉｇ）及び トリエチルアミン（１，９２ｇ、　１９ｍｍｏｌ）を含む混合物を大気圧にて、 ３０分間、室温で水素添加した。反応混合物を濾過し、ＭｅＯＨ（５０ｍ］、） で洗浄し、濾液を蒸発させて乾燥した。生成物（５，２６ｇ、１００％）は水分 に敏感であることが分かった。これは油として残った。この油を精製せずにその ままその後の反応に用いた。
実施例１０３ Ｎ２−［イミダゾール−１−イル−（プロピル）］−２’　−デオキシグアノシ ンヌクレオシド１０２　（１０，３１ｇ、３５ｍｍｏｌ）及び１−（３−アミノ プロピル）イミダゾール（９ｇ、　７２ｍｍｏｌ）を２−メトキシエタノール（ ６０ｍｌ）ｌこ含む溶液を鋼ボンベ中で１２０℃（油浴）で２４時間加熱した。
ボンベを０℃（こ冷却し、注意深く開き、沈殿した固体を濾過した。固体をメタ ノール（５０＋ｏｌ）及びアセトン（５０ｍｌ）で洗浄し、水酸化ナトリウムで 乾燥して９ｇ（６７％）の純粋な１０３を得た。分析のため少量をＤＭＦから再 結晶した。融点２４５−４７°。
実施例１０４ Ｎ２　３’、５’　Ｔｎ　Ｏ−インブチリル−Ｎ２−［イミダゾール−１−イル （プロピル）］−２’　−デオキシグアノシン（１０４）乾燥ピリジン（３０ｍ ｌ）及び乾燥ＤＭＦ　（３０ｍ１．）に基質１０３　（１，５ｇ。
４　ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１，６２ｇ、　１６ｍｍｏｌ）を含む十 分１こ乾燥した溶液に、室温で塩化イソブチリル（１，６９ｇ、１６　ｍｍｏｌ 、）を加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌し、蒸発させて乾燥した。残留 物をジクロロメタンと水（１００ｍｌ）との間で分配し、ＣＨ２Ｃ１ｚ　（２Ｘ 　２００ｍ１）で抽出した。有機抽出物をブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無 水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥した有機抽出物を蒸発させて乾燥し、残留 物を溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２→ＭｅＯＨを用いるフラッシュクロマトグラフィ ーによって精製した。純粋なフラクションをプールし、蒸発させて乾燥したとこ ろ、１．８ｇ　（７７％）の表題化合物力（無色結晶としてＣＨｚＣ１ｘ／Ｍｅ ＯＨから得られた。融点２１０−１２℃。
実施例１０５ ６−０−　［２−ニトロフェニル、エチルコーＮ２．３’　、５’　Ｔｎ−〇− イソブチリルーＮ、−［イミダゾール−１−イル（プロピル）　］　−２’　− デオキシグアノシン（１０５） 乾燥ジオキサンに１０４　（２，０ｇ、　３．　４２ｍｍｏｌ）、トリフェニル ホスフィ”Ｊ　（２，５８ｇ、　１０．　２６ｍｍｏｌ）及びｐ−ニトロフｘニ ルエタノール（１，７２ｇ、１０．２６ｍｍｏｌ）を含む撹拌溶液に、室温でジ エチルアゾジカルボキシレ−ｈ　（１，７８ｇ、１０．２６關ｏ１）を加えた。
反応混合物を室温で１２時間撹拌し、蒸発させて乾燥した。残留物を溶離剤とし てＣＨ，ＣＩ、→アセトンを用いるフラッシュクロマトグラフィーによって精製 した。純粋なフラクションを一緒にプールし、蒸発させて乾燥したところ、２． ４ｇ（９６％）の６が非晶質固体として得られた。
実施例１０６ ６−０−　［２−（４−ニトロフェニル）−エチルゴーＮ２−イソブチリル−Ｎ 、−［イミダゾール−１−イル（プロピル）］　−２’　−デオキシグアノシン （１０６）　メタノール（２５０ｍｌ）に１０５　（９ｇ、１２．２６ｍｍｏｌ ）を含む撹拌溶液を、室温の水酸化アンモニウム（３０％、１５０ｍ１）で処理 した。反応混合物を室温で１２時間撹拌し、蒸発させて乾燥した。残留物を溶離 剤としてＣＨ，ＣＩ　。
→アセトンを用いるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋なフ ラクションを一緒にプールし、蒸発させて乾燥したところ、２．４ｇ　（９６％ ）の１０５が非晶質固体として得られた。
実施例１０７ ５’　−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−０−［２−（４−ニトロ フェニル）エチルゴーＮ２−イソブチリル−Ｎｚ　［イミダゾール−１−イル（ プロピル）　］　−］２’−デオキシグアノシン１０７）基質１０６　（５，９ ４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（７５ｏ＋１）に溶解し、蒸発させて乾燥 した。これを３回繰り返して微量の水分を除去した。乾燥ピリジン（１００ｍｌ ）に基質を含むこの十分に乾燥した溶液に、乾燥トリエチルアミン（４，０４ｇ 、４０＋ｎｏｌ）　、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１０，１４ｇ’、３Ｑ ｍｍｏｌ）に室温で加えた。反応混合物を室温で］２時間、アルゴンの下で撹拌 した。メタノール（５０１１１）を加え、１５分間撹拌し続けた。混合物を蒸発 させて乾燥した。残留物を、溶離剤として１％トリエチルアミンを含有するＣＨ ２Ｃ，１２→アセトンを用いてシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーす ることによつて精製した。純粋なフラクションを一緒にプールし、蒸発させて乾 燥したところ、７．２ｇ（８０％）の１０７が無色のフオームとして得られた。
実施例１０８ ３’　−０−［Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）（β−シアノエトキシ）ホスフ ァニル］　−５’　−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−０−１２− （４−ニトロフェニル）エチル］−Ｎ２−イソブチリル−Ｎ２−［イミダゾール −１−イル（プロピル）］−］２’−デオキシグアノシン１０８）基質Ｉ０７　 （２，５ｇ、　２．　７ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（３０ｍｌ）に溶解し、蒸発 させて乾燥した。これを３回繰り返して残っている微量の水分を除去し、固体水 酸化ナトリウムで一晩乾燥させた。この乾燥させた１０７を乾燥ジクロロメタン （３０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下で０℃に冷却した。この冷却撹拌溶液 ヲＮ、　Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０，７２ｇ１５．　６ｍｍｏｌ）を 加え、次いで（β−シアノエトキシ）クロロ（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ） ホスファン（１，３２ｇ、５　、　６　ｍｍｏｌ）を１５分間にわたって滴加し た。反応混合物を０℃で１時間、そして室温で２時間撹拌した。反応混合物をジ クロロメタン（１００ＩＩｌｌ）で希釈し、ブライン（５０ｍｌ）で洗浄した。
有機抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて乾燥させた。残留物を 溶離剤として１％トリエチルアミンを含有するヘキサン→アセトンを用いてシリ カゲル上でフラッシュクロマトグラフィーすることによって精製した。主なフラ クションを集め、蒸発させて乾燥した。残留物を乾燥ジクロロメタン（１０ｍｌ ）に溶解し、そしてヘキサンの撹拌溶液（１５ｍｌ）へ３０分間滴加した。添加 後、さらに撹拌を１時間、室温でアルゴン下にて続けた。沈殿固体を濾過し、固 体ＮａＯＨで真空下−晩乾燥したところ、２ｇ（６５％）の表題化合物が無色粉 末として得られた。
実施例１０９ Ｎ、−［イミダゾール−１−イル（プロピル）］−２’　−デオキシアデノシン （２−メトキンエタノール（８０＋ｎｌ）に２−クロロ−２′−デオキシアデノ シン（１０，６８ｇ、　３７．　４ｍｍｏｌ）及び１−（３−アミノプロピル） イミダゾール（１２，５ｇ、１００關０１）を含む懸濁液を、鋼ボンベ中で１２ ５℃にて４５時間加熱した。ボンベを０℃に冷却し、注意深く開き、蒸発させて 乾燥した。残留物を数回エタノール及びトルエンと共に蒸発させた。残留物をエ タノールに溶解し、冷却したところ、沈殿物が得られた。沈殿物を濾過、乾燥し た。濾液を蒸発させて乾燥し、残留物を特性決定することなく次の反応に用いた 。
実施例１１０ ３’　、５’　−０−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）− Ｎ２−［イミダゾール−１−イル（プロピル）］　−２’　−デオキシアデノシ ン（１１実施例１０９からの粗生成物（１４，０３ｇ）を乾燥ＤＭＦ　（１００ ＩＩｌｌ）及び乾燥ピリジン（５０１６１））に溶解し、蒸発させて乾燥した。
これを３回繰り返して全水分を除去した。乾燥基質を乾燥ＤＭＦ　（７５ｍｌ） 及び乾燥ピリジン（７５ｍｌ）に溶解しアルゴンの下で室温にて撹拌した。この 撹拌溶液に乾燥トリエチルアミン（１０，１ｇ、１００ｍｍｏｌ）及びジクロロ −１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（Ｔｉｐｓｉｃｌ）（１５ ，７ｇ、５０ｍｍｏｌ）を１５分間加えた。Ｔｉｐｓｉｃｌの添加後、反応混合 物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を蒸発させて乾燥した。残留物をトルエン （１００ｍｌ）と混合し、再び蒸発させた。残留物を溶離剤として塩化メチレン →メタノールを用いてシリガゲル上でフラッシュクロマトグラフィーすることに よって精製した。純粋なフラクションをプールし、蒸発させて乾燥したところ、 １２．５ｇ　（５４％）の１１０が非晶質粉末として得られた。
実施例１１１ ３’　、５’　−０−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）　 Ｎ２゜Ｎ６−ジイツブチルオイルーＮｚ−［イミダゾール−１−イル（プロピル ）］−］２′−デオキシアデノンン１１１） 化合物１１０　（１２，０ｇ、１９．４２ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン雰囲気下 、室温でトリエチルアミン（１０，１ｇ、　１００ｍＩｌｌｏｌ）と共に撹拌し た。ピリジン（１００ｍｌ）中のこの撹拌溶液に塩化イソブチリル（６，３６ｇ 、　６０ｍｍｏｌ）を１５分間滴加した。この反応混合物をアルゴンの下で１０ 時間撹拌し、蒸発させて乾燥した。残留物をジクロロメタン／水の間で分配し、 ジクロロメタン（２×１５０ｍ１）で抽出した。有機抽出物をブライン（５０ｍ ｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機抽出物を蒸発させて乾燥 し、残留物を溶離剤として塩化メチレン−アセトンを用いてシリガゲル上でフラ ッシュクロマトグラフィーすることによって精製して、純粋な１１１をフオーム として得た。
実施例１１２ Ｎ２．Ｎ、−ジイソブチリル−Ｎ２−［イミダゾール−１−イル（プロピル）］ −］２′−デオキシアデノンン１１２） 化合物１１１を室温で乾燥テトラヒドロフラン中の弗化テトラブチルアンモニウ ム（５当量）にさらすことによって、表題化合物を製造する。反応混合物を蒸発 させ、シリカカラムクロマトグラフィーで精製すると、１１２が得られる。
実施例１１３ ５’　−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２．Ｎ６−ジイツブチリル ーＮ２−［イミダゾール−１−イル（プロピル）］−２’　−デオキシアデノシ ン化合物１１３は、上記実施例１０７に従って化合物１１２から製造される。
実施例１１４ ３’　−０−［（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）（β−シアノエトキシ）プロ スファニル］　−５’　−０（４，４’−ジメトキシトリチル）Ｉ’ｈ、Ｎ６− ジイソブチリルーＮ２　［イミダゾール−１−イル（プロピル）：］−２’　− デオキシアデノシン（１１３） ホスホアミダイト単量体１１３を、実施例１０９の手順に従って化合物１１２か ら製造する。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
実施例１１５ Ｎ２−ノニル−２′−デオキシグアノシン（１１５）化合物１１５を、実施例１ ０３に従って化合物１０２　（９，５ｇ、２２闘０１）及びノニルアミン（９， ５８ｇ、６７１１０１０１）から製造する。粗生成物を蒸発させて乾燥し、残留 物をエタノール及びトルエンの混合物と共に蒸発させた（３回）。
得られた残留物をエタノールに溶解し、冷却して、少量の生成物を得た。これを 濾過し、濾液を蒸発させて乾燥した。残留物を特性決定せずに用いた。
実施例１１６ ３’、５’、Ｎ２　ｈリインブチオイル−Ｎ２−ノニル−２′−デオキシグアノ シン（１１６） 表題化合物１１６を、化合物１１５（１８ｇ、３２．　９ｍｍｏｌ）　、ＴＥＡ 、　（３０゜３ｇ、３００ｍｍｏｌ）　、塩化イソブチリル（２１，２ｇ、２０ ０　ｗｏｏｌ）及び乾燥ピリジン（１５０ｍｌ）を用いて実施例１１１の手順に 従って製造した。粗生成物を溶離剤として塩化メチレン→酢酸エチルを用いてシ リガゲル上でフラッシュクロマトグラフィーすることによって精製した。純粋な 生成物をフオームとして４０％の収率で得た。
実施例１１７ Ｎ２−インブチリル−Ｎ２−ノニル−２′−デオキシグアノシン（１１７）メタ ノール（１００ｉ１）に化合物１１６　（５ｇ、　６．　６１ｍｍｏｌ）を含む 撹拌溶液を室温にて濃水酸化アンモニウム（３０％、１００ｍ１）で処理した。
８時間後、反応混合物を蒸発させて乾燥し、残留物を溶離剤として塩化メチレン →メタノールを用いてフラッシュクロマトグラフィーすることによって精製した 。純粋なフラクションを一緒にプールし、蒸発させて残留物を得た。残留物を塩 化メチレン／アセトンから結晶化したところ、１．５ｇ　（４９％）の１１７が 得られた。
実施例１１８ ５’　−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ！−インブチリル−Ｎ、− ノニル−２′−デオキシグアノシン（１１８）化合物１１８は、化合物１１７　 （２，２ｇ、４．７５ｍｍｏｌ）　、ＤＭＴＣ１（１゜６９　ｇ、　５ｍｇ＋ｏ ｌ）　、乾燥ＴＥＡ　（１，Ｏｌｇ、１０ｍｍｏｌ）及び乾燥ピリジン（７０ｍ ｌ）を用いて実施例１０７の手順に従って化合物１１７から製造した。粗製化合 物を溶離剤として塩化メチレン／メタノール／ＴＥＡを用いてフラッシュクロマ トグラフィーすることによって精製した。２ｇ（５５％）の純粋な生成物がフォ −ムとして得られた。
実施例１１９ ３′−０−［Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）（β−シアノエトキシ）プロスフ ァニル］　−５’　−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）Ｎ２．Ｎ６−ジイ ツブチリルーＮ、−ノニル−２′−デオキシアデノシン（１１９）ホスホアミダ イト単量体化合物１１９は、実施例１０９の手順に従ってコ１８から製造する。
粗生成物をシリカゲルクロマトグラフイーによって精製する。
実施例１２０ ３’　、５’　−０−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）− ２−クロロ−２′−デオキシアデノシン（１２０）化合物１２０は、２−クロロ −２′−デオキシアデノシン（４，３ｇ、１５゜Ｑ９ｍｌｌ１ｏｌ）　、１．　 ３−シクロロー１．　１．　３．　３−テトライソプロピルジシロキサン（４， ７４ｇ、１５．１ｗｏｌ）　、乾燥ＴＥＡ　（３，’０５ｇ、　３０．　２ｍｍ ｏｌ）及び乾燥ピリジン（１００ｍｌ）を用いて実施例１１０の手順に従って２ −クロロ−２′　−デオキシアデノシンから製造した。純粋な生成物を、溶離剤 として塩化メチレン−アセトンを用いてフラッシュクロマトグラフィーすること によって精製したところ、７．３ｇ　（９２％）の純粋な１２０が非晶質固体と して得られた。
実施例１２１ ３′、５’　−０−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２ −クロロ−Ｎ６−ペンゾイルー２′−デオキシアデノシン（１２１）乾燥ピリジ ンに化合物１２０（８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を含む十分に乾燥した溶液をアルゴン 雰囲気下、トリエチルアミン（４，５５ｇ、　４５ｍｍｏ１．）及び塩化ベンゾ イル（６，３ｇ、　４５ｍｍｏｌ）と室温で１２時間反応させた。反応混合物を 蒸発させて乾燥し、残留物を塩化メチレン／水の間で分配し、塩化メチレン（２ Ｘ１５０ｍ１）で抽出した。有機抽出物をブライン（６０ｍｌ）で洗浄し、乾燥 し、そして蒸発させて乾燥した。残留物を７リカゲルカラムで精製したところ、 ８２ｇ（８６％）の１２１がフオームとして得られた。
実施例１２２ Ｎ６−ペンゾイルー２−クロロ−２′−デオキシアデノシン（１２２）乾燥ＴＨ Ｆ　（１０Ｑｍｌ）に化合物１２１（７，９ｇ、　！、２．　５ｍｍｏｌ）を含 む撹拌溶液に、ＴＨＦ　（５０ｍｌ、５ｍａ＋ｏｌ）に弗化テトラブチルアンモ ニウムを含む１Ｍ溶液を、室温で１５分間徐々に加えた。反応混合物をさらに６ 時間撹拌し、蒸発させて乾燥した。残留物を塩化メチレン−アセトンを用いてシ リカゲルクロマトグラフィーで精製したところ、３．８８ｇ　（８０％）の純粋 な１２２が得られた。
実施例１２３ ５’　−Ｃ）−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ６−ペンゾイルー２−ク ロロ−２′−デオキシアデノシン（１２３）化合物１２３は、化合物１２２　（ ２，５ｇ、６．　４３ｍｍｏｌ）　、ＤＭＴＣｌ　（２゜３７　ｇ、　７ｍＩｏ ｏｌ）　、乾燥ＴＥＡ　（０，７１ｇ、７ｍｍｏｌ）及び乾燥ピリジン（１００ １１１）を用いて実施例１０７の手順に従って化合物１２２から製造した。粗製 化合物を溶離剤として１％ＴＥＡを含有する塩化メチレン−酢酸エチルを用いて フラッシュクロマトグラフィーすることによって精製したところ、３ｇ（６８％ ）の純粋な１２３がフオームとして得られた。
実施例１２４ ３’　−０−［Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）（β−シアノエトキシ）プロス ファニルコ−５’　−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ６−ペンゾイ ルー２−クロロ−２′−デオキシアデノシン（１２４）ホスホアミダイト単量体 １２４は、化合物１．２３　（２，４ｇ、　３．　４７ｍｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ−ジ イソプロピルエチルアミン（１，２２ｍ１．７ｍｍｏｌ）　、２−シアンエチル −Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルクロロ−ホスホアミド（１，６５ｇ、　７ｍｍｏｌ ）及び乾燥塩化メチレン（３０ｆｆｌｌ）を用いて、実施例１０９の手順に従っ て化合物１２３から製造する。粗生成物を溶離剤としてＴＥＡ　（１に）含有ヘ キサン→酢酸エチルを用いてフラッシュクロマトグラフィーすることによって精 製した。純粋なフラクションを共にプールし、蒸発させて乾燥した。残留物を１ ０ｍ１の乾燥塩化メチレンに溶解し、十分に撹拌したヘキサン（１５００ｍｌ） にアルゴン下で滴加した。添加後、撹拌をさらに１時間続け、沈殿固体を濾過し 、ヘキサンで洗浄し、固体水酸化ナトリウムで３時間乾燥した。乾燥粉末は３１ ｐスペクトルから微量の不純物を含まないことが分かった。
実施例１２５ Ｎ２−［イミダゾール−４−イル（エチル）］−］２’−デオキシグアノンン１ ２−メトキシエタノール（６０１１１）に２−クロロ−２′−チオキシイノシン （６、０ｇ、　２０．　９７ｍｏ＋ｏｌ）及びヒスタミン（４，４ｇ、　４０ｍ ｍｏｌ）を含む混合物を鋼ボンベ中で１１０℃にて１２時間加熱した。ボンベを ０℃に冷却し、注意深く開き、沈殿固体を濾過した。固体をメタノール及びアセ トンで洗浄し、ＤＭＦ／水から結晶化したところ６ｇ　（７９％）の純粋な１２ ５が得られた。融点２２０−２２２℃。
実施例１２６ ３’　、５’　−０−（テトライソプロピルジシロキサン−］、］３−ジイル− Ｎ２−［イミダゾール−４−イル（エチル）］−２’　−デオキシグアノシン（ １２６）　乾燥ＤＭＦ　（５０ｍｌ）及び乾燥ピリジン（２０ｍｌ）に化合物１ ２５（２，４ｇ、　６．　６５ｍｍｏｌ）を含む撹拌溶液に、トリエチルアミン （４，０４ｇ、４０ｍｍｏ１）次いで１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テト ライソプロピルジシロキサン（４，１８ｇ、　１３．　３ｍｍｏｌ）を室温で加 えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、蒸発させて乾燥した。残留物を溶離剤と して塩化メトキシエタノールを用いてシリカゲルクロマトグラフィーすることに よって精製したところ、３．２ｇ（８０％）の１２６が非晶質固体として得られ た。
実施例１２７ ３’　、５’　−０−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）− ６−〇−ジフェニルカルバモイルーＮ２　［１−ジフェニルカルバモイルイミダ ゾール−４−イル−（エチル）］　−］２’−デオキシグアノシン１２７）乾燥 ピリジン（５０１１）及び乾燥ＤＭＦ　（２００ｍｌ）に化合物１２６（１２゜ ３４　ｇ、　２０ｍ＋ｏｏｌ）を含む溶液に、Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルエチル アミン（７゜７４　ｇ、　６０ｍｍｏｌ）及び塩化ジフェニルカルバモイル（１ １，５５ｇ、　５０ｍｍｏｌ）を室温で加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下 で１２時間室温にて撹拌した。
これを蒸発させて乾燥し、残留物を塩化メチレン（４，００ｍ１）に溶解した。
有機抽出物を水（１００ｍｌ）及びブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ、 さらに蒸発させて乾燥した。残留物を溶離剤として塩化メチレン−アセトンを用 いてシリカゲル上でクロマトグラフィーすることによって精製した。純粋なフラ クションを共にプールし、蒸発させて乾燥したところ、１５ｇ（７５％）の１２ ７がフオームとして得られた。
実施例１２８ ６−０−ジフェニルカルバモイル−Ｎ、−［１−ジフェニルカルバモイルイミダ ゾール−４−イル−（エチル）：ｌ−２’　−デオキシグアノシン（１２８）化 合物１２８は、室温にて弗化テトラブチルアンモニウム／ピリジン／ＴＨＦで“ ＴＩＰ“基を選択的に脱ブロッキングすることによって化合物１２７から製造す ることができる。
実施例１２９ ５’　−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−０−ジフェニルカルバモ イル−Ｎ２−　［１−ジフェニルカルバモイルイミダゾール−４−イル−（エチ ル）ツー２′−デオキシグアノンン（１２９）化合物１２９は、実施例１０７の 手順に従って化合物１２８から製造することができる。
実施例１３０ ３’　−０−［Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）（β−シアノエトキシ）プロス ファニルコ−５’　−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−０−ジフェ ニルカルバモイル−Ｎｔ　［１−ジフェニルカルバモイルイミダゾール−４−イ ル−（エチル）］−］２’−デオキシグアノシン１３０）化合物１３０は、実施 例１０８の手順に従って化合物１２９から製造することができる。
実施例１３１ 本発明の修飾５′−ジメトキシトリフェニルメチルリボヌクレオシドをＣＰＧ支 持体に結合したヌクレオシドの５′−ヒドロキシルへ結合する手順特定のアンチ センスオリゴヌクレオチドの末端３′位置にある修飾ヌクレオシドを、それらの ５’　−ＤＭＴとして保護しくシトシン及びアデニン環外アミノ基はベンゾイル 化し、グアニンアミノはイソブチル化する）、そしてピリジン及びジメチルアミ ノピリジン中のトリフルオロ酢酸／ブロモ酢酸混合無水物で５０℃にて５時間処 理する。減圧下、溶液を蒸発させて薄いシロップにし、これを酢酸エチルに溶解 し、シリカゲルのカラムに通す。均質なフラクションを集め、蒸発させて乾燥す る。アセトニトリル１Ｑｒａｌ、３′−〇−ブロモメチルーエステル修飾ピリミ ジンヌクレオシド１０ミクロモル及びピリジン／ジメチルアミノピリジン（１・ １）１１１１の溶液を、遊離５′−ヒドロキシ基をもたらす標準的な条件に従っ て酸で予備処理したＣＰＧチミジンの１ミクロモルカラム（アプライドバイオシ ステムス社）に徐々に（６０−９０秒）注ぐ。他のヌクレオシド結合ＣＰＧカラ ムを用いることもできる。溶離剤を集め、再びカラムに注ぐ。このプロセスを３ 回繰り返す。ＣＰＧカラムを１０ｍ１のアセトニトリルでゆっくり洗浄し、ＡＢ Ｉ　３８０Ｂ核酸合成機に取り付ける。オリゴヌクレオチド合成をここで開始す る。チミジンエステル結合をＣＰＧ支持体から開裂する濃水酸化アンモニウム脱 保護の標準条件はまた、初めにＣＰＧヌクレオシドに結合したピリミジン修飾ヌ クレオシドをチミジンにつないでいる３’　、５’エステル結合を開裂する。こ のように、どのような修飾ヌクレオシドも又は一般に複素環に修飾のあるどのよ うなヌクレオシド及び／又は糖も、オリゴヌクレオチド配列のその３′末端で結 合することができる。
実施例１３２ 修飾ヌクレオシド−５’　−ＤＭＴ−３’　−ホスホアミダイトのオリゴヌクレ オチドへの変換法 Ｂ、Ｓ、５ｐｒｏａｔ等の核酸研究、第１７巻、ｐｐ、３３７３−３３８６　（ １９８９）のポリリボヌクレオチド固相合成法を用いて、修飾オリゴヌクレオチ ドを製造する。
実施例１３３ 修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの製造Ｓ、Ｂｅａｕｃａｇｅ等のＪ ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、 第１１２巻、ｐｐ、１２５３−１２５５　（１９９０）及びＢ、Ｓ、５ｐｒｏａ ｔ等の核酸の研究、第１７巻、ｐｐ、３３７３−３３８６　（１９８９）に記載 のように、上記実施例に従って製造した置換５′−ＤＭＴヌクレオシド　３′− ホスホアミダイトを、配列特異的オリゴヌクレオチドホスホロチオエートに入れ る。
実施例１３４ 修飾ホスフェートメチル化オリゴヌクレオチドの製造り、Ｈ，Ｋｏｏｌｅ等のＪ ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５４巻、ｐｐ、 １６５７−１６６４　（１９８９）　に記載の保護、塩化トシルによるメタノー ル分解及び穏やかな脱保護を置換オリゴヌクレオチドに行って、ホスフェート− メチル化置換オリゴヌクレオチドを得る。
実施例１３５ 本発明の修飾ヌクレオチドがそれらの相補的ＲＮＡ又はＩ）ＮＡ配列ヘハイブリ ダイズする能力を、熱融解分析によって測定する。天然アンチセンスオリゴヌク レオチド又は特異的部位での修飾を含むこれらを理論濃度で、ＤＮＡ又はＲＮＡ 補体のいづれかに加えた。ヘリックスのコイルへの転移は、２６０ｎｍでの吸光 度対温度を測定することによってモニターした。測定は１００ｍＭ　Ｎａ＋、１ ０ｍＭホスフェート、ｐＨ７及び０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で行った；オリゴヌク レオチド濃度は４ＩＩＭであった。融点又はＴ１は、分子の半分が二重鎖状態で あり、そして半分が一重鎖である温度である。記録したＴ、はｄ吸光度／ｄ温度 が最大の温度である。二重鎖形成の熱力学的パラメーターは、直線勾配ベースラ インを有する２つの状態モデルに対する吸光度対温度曲線についての非直線最小 二乗フィツト（ｎｏｎ−１ｉｎｅａｒ　１ｅａｓｔ　５ｑｕａｒｅｓ　ｆｉｔ） から得た。
各修飾を、長さが１５−２１残基のいくつかのオリゴヌクレオチド配列に加えた 。試験配列は、様々な１５−１５−２ｌの乳頭腫ウィルス、ヘルペスウィルス、 ５−ＬＯ，ＨＩＶ及び他の試験配列を含めた標的有機体であった。
十分に修飾した配列の他に、１−５個の修飾を含むオリゴヌクレオチドを試験し た。各変更オリゴヌクレオチドについて、Ｔ、を、非修飾ＤＮＡ類似体のＴｏと 比較した。さらに、ホスホロチオエート置換によって修飾したホスホンエステル 結合をもつオリゴヌクレオチドを比較した。
この実施例では、融点を調べることにより、いくつかの本発明の新規な修飾オリ ゴヌクレオチドの熱力学的安定性を測定した。下記の表２に示すいくつかの調査 から、長さが１５−２１塩基のオリゴヌクレオチド配列内に特異的に置かれた５ 以下の側基は、一般に修飾されない出発オリゴヌクレオチドに較べてＴ、にわず かな影響を及ぼすのみであることが分かる。Ｔ、への影響は配列内の位置に関係 し、３′−末端付近に置かれた修飾は５′−末端に置いたものよりも不安定化効 果が少なかった。
表２ 熱力学的安定性 試験配列　Ａ’　ＣＣＧＡ’　ＣＧ’　ＡＴ　Ｃ’　ＡＴ　ＧＴＣＧＴＡ’ＣＧ Ｃ（２１ｍｅｒ、位置１．５、訳１１及び１８を修飾）Ｐ＝Ｓ　（１−２０）　 ５７　（−１０）２′−〇−ノニル　５１（−１６） ２′−〇−アミノプロピル　６１（−６）２′−Ｏ−フルオロ　６７（０） ２′−〇−アリル　５８（−９） 試験配列　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＧＣＡＡＧ　ＴＡ’　Ｃ（１５ｍｅｒ、位置１４ を修飾） Ｐ＝Ｓ　（１−１４）　４６　（−７）２′−〇−ノニル　５４（＋１） ２′−ｔ−ブチルジメチルシリル　５２（−１）２′−〇−アミノプロピル　５ ３（０）２′−〇−アミノブチル　５３（０） ＲＮＡ　４６ ２′−〇−アリル　４５（−１） ２′−〇−ベンンル　４５（−１） 試験配列　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＧＣＡＡＡ’　Ａ’　Ａ’　Ｃ１５ｍｅｒ、位置 １２．１３．１４を修飾）Ｐ＝Ｓ　（１−１４）　４５　（−１７）２′−０− ノニル　４９（−３） ２′−ｔ−ブチルジメチルシリル　４５（−１７）２′−〇−アミノプロピル　 ５４（＋２）２′−〇−アリル　５１（−１） 実施例１３に の試験では、ハイブリダイゼーションの特異性を、単一残基で修飾したオリゴヌ クレオチドとその補体とを含む二重鎖の安定性及び、同じ単一修飾オリゴヌクレ オチドと修飾に対して非相補的な塩基を含有する相補的配列とを含む二重鎖の安 定性を較べることによって測定した。例えば、非修飾アデノシンの特異性は、配 列ＧＧＡ、ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＹＧＧ　ＴＡＣＧＡＧ（Ｙストランド）（式中、Ｙ ＝ＡＳＣ，ＧＳＴ又はなし）ニハイブリダイズした配列ＣＴＣＧＴＡ　ＣＣＡ　 ＴＣＣＣＣＧ　ＴＣＣ（Ｘストランド）のＴ、を測定することによって判定した 。適合対二重鎖（Ｙ＝Ｔ）を、単一の不適合対又はバルジを含む二重鎖（Ｙ＝Ａ 、ＣＳＧ又はなし）と較べた場合のＴ、、の差は、非修飾Ａ−Ｔ対の特異性の程 度である。同様な実験を、Ｘストランドの位置９のＡの代わりに、修飾アデノシ ンを用いて行った。修飾配列のデルタＴ、（不適合対対適合対）を非修飾類似体 のこれらと較べると、その修飾の特異性の程度が得られる。
この試験では、修飾アデノシンの、チミジンを有するワトソンークリック塩基対 に対する特異性を、ＹストランドとしてＴ（ワトソンークリック相補鎖）、Ａｌ Ｇ、　Ｃ（不適合対）を有する１８ｍｅｒをつくることによって又は９位置（バ ルジループ）でヌクレオチドを除くことによって測定した。Ｘ相補鎖ストランド は９番目の位置に２′−修飾アデノシンを含む。データは表３に示す。表３の通 り、修飾アデノシンの特異性は維持される、すなわち、ＡＳＧＳＣ又はバルジル ープの不適合状態ではなくＴと対をなしたときに、それらのＴ、はより大きい。
修飾の特異性 Ｘストランド　５’−ＣＴＣＧＴＡ　ＣＣＡ’　ＴＴＣＣＧＧ　ＴＣＣＹストラ ンド　３’　−ＧＡＧ　ＣＡＵ　ＧＧＹ’　ＡＡＧ　ＧＣＣＡＧＧ（１８ｍｅｒ 、９位置を修飾） Ｙ＝Ｔ　（ワトソンークリック相補鎖）Ｙ＝Ａ、Ｃ又はＧ（不適合対） Ｙ＝なしくバルジループ、”Ｂｕ”） Ｔ、（デルタ　Ｔ、、Ｃ） 勢尊Ａ−Ｔ、Ａ−Ａ、Ａ−Ｇ、Ａ−Ｃ，Ａ−Ｂｕ天然　６３　−９　−６　−］ 、４　−１２２′−〇−ノニル　５８　−３　−３　−６　−３２′−ｔ−ブチ ル ジメチルシリル　５８　−４　−４　−２　−４２′−〇−アミノプロピル　６ ０　−６　−６　−１２　−．７２′−〇−フルオロ　６１　−１０’　−７− １４−１０２’　−０−７’）ｋ　６０　−８　−６　−１３　−１０２′−〇 −ベンジル　５９　−６　−６　−１２　−７２′−〇−メチル　６０　−８　 −６　−１３　−１０２′−〇−クロロ　６０　−４　−４　−１３　−７Ｇ− Ｃ，Ｇ−ＡＸ　Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ｔ、Ｇ−Ｂｕ天然　６３　−７　−６　−４　−１ １３−デアザグアノシン　５９　−２　＋１　−１　−７実施例１３７ この実施例では、ヌクレアーゼ分解耐性を測定する。ＤＭＥＭ媒体中の１０％ウ シ飴児血清のアリコートを、５０ｇＭのオリゴヌクレオチドを含有させて３７℃ でインキュベートした。様々な時間で、１５μｌのアリコートを取り出し、１ｘ ＴＢＥ中の９Ｍ尿素１５μｌと混合した。タイムポイントを２０％ポリアクリル アミド／７Ｍ尿素電気泳動による分析まで凍結した。ゲルを”スティン・オール （Ｓｔａｊｎｓ　Ａ１１）”　（ングマ・ケミカル社、ミズーリ州セントルイス ）で染色し、次に脱染色し、ＬＫＢレーザーデンシトメーターを用いて走査した 。ピークの山の積分及び完全な長さのオリゴヌクレオチド（ｎ）から２つの塩基 残基の減少（ｎ−２）への分解％の計算によって、走査を分析した。データを分 解％対時間としてプロットし、ホスホジエステル（ＰＯ）及びホスホロチオエー ト（ＰＳ）オリゴヌクレオチドについて得られた曲線と比較した。
この実施例についてのデータは表４に示す。このデータの通り、本発明の修飾オ リゴヌクレオチドは少なくとも非修飾配列と同様な耐性を示し、ある場合にはホ スホロチオエート修飾配列よりも大きな耐性を示す。
表４ ヌクレアーゼ耐性 試験配列　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＧＣＡＡＧ　ＴＡ’　Ｃ（１５ｍｅｒ、位置１４ を修飾） Ｐ＝Ｓ　（１−１４）　２．３ ２′−〇−ノニル　５．８ ２′−ｔ−ブチルジメチルシリル　７ ２′−〇−アミノプロピル　マ 試験配列　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＧＣＡＡＡ’　Ａ’　Ａ’　Ｃ（１５ｍｅｒ、位 置１２．１３．１４を修飾）修飾　Ｔｌ／２（時間） 天然　１．０ Ｐ＝Ｓ　（１−１４）　２０ ２′−〇−ノニル　〉６４ ２′−ｔ−ブチルジメチルシリル　８．０２′−〇−アミノプロピル　１７．７ ２′−〇−アリル　１０ 試験配列　ＣＧＡ　ＣＡＡ　ＴＧＣＡＡＧ’　Ｇ’　Ｇ’　Ｔ（１５ｍｅｒ、位 置１２．１３．１４を修飾）修飾　Ｔｌ／２（時間） 天然　２５ ３−デアザデオキシＧ１，０ ３−デアザ−３−ノニルデオキシＧ４．４３−デアザ−３−アリルデオキシＧ　 ２０＋３−デアザ−３−ベンジルデオキシＧ　２０実施例１３８ 一般に、修飾オリゴヌクレオチドと非修飾類似体との間のデルタＴ、は修飾残基 の数に比例する。さらに行った試験で、１つの修飾当たりのデルタＴ、を示した 。１つの修飾当たりのデルタＴ、の値は、試験全修飾配列の平均であり、表５に 示す。データは、ＤＮＡ標的及びＲＮＡ標的両者について野生型ＤＮＡと比較し た、１つの修飾当たりの平均デルタＴ１である。さらに、特異性対ＤＮＡ標的を 任意評点（１は特異的、４は非特異的）として示した。
表５ オリゴヌクレオチドの生理学的評価 安定性　安定性 特異性　対ＤＮＡ　対ＲＮＡ　対ＤＮＡ修飾　標的　標的　標的 天然ノＤＮＡ　Ｏ０１ 天然のＲＮＡ　十１１　＋１．７　１ ホスホロチオエート−０，５−０，５１＋２′−クロロ−２′− デオキシＡ　−３，２−５，２３ ３−デアザ−２′− デオキシＧ　−３，３−２，９５ ２′−〇−ノニルＡ　−２，５−２，２４２′−ｔ−ブチルジメチル− シリルＡ　−４，５３ ２′−〇−アリルＡ　−１，６−０，７２２′−〇−ベンジルＡ　−２，７−１ ，０２２′−〇−プロピルアミン　−０，９−０，３３２′−〇−ブチルアミン 　−１，２−０，６実施例１３９ さらに、ヌクレアーゼ耐性を、ホスホロチオエート及びホスホジエステルの耐性 と比較した。実施例１３７の方法を用いて、ホスホジエステルオリゴヌクレオチ ドの分解曲線を測定し、５と評価した。ホスホジエステルオリゴヌクレオチド分 解は約１時間で約５０％であり、約４時間で完了した。ホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドは１と評価した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド分解は 約４時間で約２０％、約２０時間で約５０％であった。修飾オリゴヌクレオチド は、ホスホジエステル及びホスホロチオエート曲線の目による比較に基づいて値 を決定した。これらの値は表６に示す。
表６ ウシ胎児性血清ヌクレアーゼに対する相対耐性修飾　位置（＃）　相対評価 天然のＲＮＡ　全部　５ ホスホロチオエート　全部　１ ホスホジエステル　全部　５ ２′−〇−ノニルＡ　３’　（１）　３３’　（３）　１ ２′−ｔ−ブチルジメチル− シリルＡ　３’　（３）　１ ２’　−０−７１Ｊ／Ｉ／Ａ　３’　（１）　３２′−〇−ベンジルＡ　３’　 （１）　３２′−〇−プロピルアミン　３’　（１）　２２′−〇−フルオロー ２′〜 デオキシＡ　３’　（３）　５ 内部　５ 全部　５ ２′−〇−メチルＡ　全部　１ 実施例１４０ 実施例１３５及び１３８の方法を用いて、上記実施例のいくっかによって製造し た新規なヌクレオチドを有する本発明のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ又はＲＮ Ａ配列に対するそれらのＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖安定性又はＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖 安定性について試験した。Ｔｏ、デルタＴ、及び１つの修飾当たりのデルタＴ１ に基づ（ハイブリダイゼーション分析を行った。これらの試験結果を以下の表６ に示す。
試験配列は、公知の病原体又は試験配列の比活性を示すために選んだ様々な配列 である。ＪＭ−１２は、自己相補的（ｓｅ］ｆ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ） な合成配列である。これは自己相補的であるため、相補的配列に１つ出てくるご とに、各修飾は２倍であることを表す。Ｈ３Ｖ−２１は、ヘルペスウィルスから の２１ｍｅｒ配列である。ＧでキャップされたＰＡＰは、合成の間、結合ヌクレ オチドである、３′末端にＣヌクレオチドを有する乳頭腫ウィルスからの配列で ある。この後に３つのキャッピングＧヌクレオチドが続く。このキャッピングは 特異的に加わって、配列のヌクレアーゼ耐性を増加させる。ＸＹ配列は、相補的 ストランド間のワトソンークリック結合の立体障害の測定に特に有用である。
５ＬＯはヒト５−リボキシゲノースのｍＲＮＡからの１６ｍａｒである。
これらの試験の場合、”２　クロロ　ｄＡ”ヌクレオチドは上記実施例１２４に ついての合成化学配列停止によって製造し、２　プロピルイミダゾイル　ｄＧ′ ヌクレオチドは実施例１０７についての合成化学配列停止によって製造した。
表７ 二重鎖安定性 ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖安定性 相補的ストランド−ＹＸ：　ＧＧＡ　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＣＧ　ＡＧ試 験ヌクレオチド−２クロロ　ｄＡ ３　８　９　１３　１６　３５．０　−２４　−５．２相補的ス）ラン）’−Ｈ ３Ｖ−２１：　ＡＣＣＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＧＴＣＧＴＡ　ＣＧＣ 試験ヌクレオチド　−２クロロ　ｄＡ ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖安定性 相補的ストランド−Ｈ３Ｖ−２１ＧＣＣＧＡＧ　ＧＴＣＣＡＴ　ＧＴＣＧＴＡ　 ＣＧＣ 試験ヌクレオチド　−２プロピルイミダゾイル　ｄＧ１３　６９．０　０．４　 ０．４ ４　１３　２０　７０．３　＋１．３　＋０．２１　４　６　７　１３　１６　 ２Ｃ）　７０．４　＋１．３　＋０．２相補的ストランド　−　Ｈ８Ｖ−２１： 　ＡＣＣＧＡＧ　ＧＴＣＣＡＴ　ＧＴＣＧＴＡ　ＣＧＣ 試験ヌクレオチド　−２′−フルオロ−２′−デオキシ　Ａ（末端　ＡＣ不適合 対）　＋２．５　＋０．６１　５　１１　１８　７０、（１ （末端　ＡＣ不適合対） 相補的ストランド　−　Ｈ３Ｖ−２１：　ＡＣＣＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＧＴ ＣＧＴＡ　ＣＧＣ 試験ヌクレオチド　−２′−フルオロ−２′−デオキシ　Ａ修飾の位置　Ｔ、デ ルタＴ、　デルタＴ、、／修飾ＤＮＡ　６３．１　−　− １　５　８　１１　１８　６７．７　＋４．５　＋０．９相補的ストランド　− 　ＰＡＰ：　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＧＣＡＡＧ　ＴＡＣ試験ヌクレオチド　−２′ −フルオロ−２′−デオキシ　Ａ修飾の位置　ｈ　デルタＴ、　デルタＴ、／修 飾天然　４５．１　−　− ３　６　１０　１１　１４　５３．０　＋７．９　＋１．６１３　１４、　５８ ．９　＋１．３．８　＋１．７１０　１３　１４　６５．２　＋２０．１　刊、 ８相補的ストランド　−　ＰＡＰ：　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＧＣＡＡＧ　ＴＡＣ試 験ヌクレオチド　−２′−フルオロ−２′−デオキシ　Ａ修飾の位置　−デルタ Ｔ１　デルタＴａ／修飾全部ＰＳ　３３．９　−　− 全部が１３４５６７ ９　１０　１１　１３　１４に ２′−フルオロを有するＰＳ　６０．９　＋２７．０　＋２．５相補的ストラン ド　−　ＸＹ：　ＧＧＡ　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＣＧ　ＡＧＣ試験ヌクレ オチド−２′−フルオロ−２′−デオキシ　Ａ修飾の位置　Ｔ、　デルタＴ４　 デルタＴ、／修飾天然　５６．９　−　− ３　８　９　１３　１７　６５．９　＋９．０　＋１．８相補的ストランド　− 　ＸＹ：　ＣＴＣＧＴＡ　ＣＣＴ　ＴＣＣＧＧＴＣＣ試験ヌクレオチド　−２′ −フルオロ−２′−デオキシ　Ａ修飾の位置　Ｔ、デルタＴ、　デルタＴ、／修 飾天然　６５．０　−　− ２　５　９　１０　１．５　６８．５　＋３．５　＋０．７相補的ストランド　 −５ＬＯ：　Ｔｃｃ　ＡＧＧ　ＴＧＴ　ＣＣＧ　ＣＡＴ試験ヌクレオチド　−２ ′−フルオロ−２′−デオキシ　Ａ修飾の位置　Ｔ１　デルタＴ、　デルタＴ、 ／修飾天然　６２．０　−　− １　７　９　１５　６４．７　＋２．８　＋ｏ、７ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖安定性 相補的ストランド　−　Ｈ８Ｖ−２１：　ｃｃｃ　ＧＡＧ　ＧＴＣＣＡＴ　ＧＴ ＣＧＴＡ　ＣＧＣ 試験ヌクレオチド　−２プロピルイミダゾイル　ｄＧ修飾の位置　Ｔ１　デルタ Ｔ、、　デルタＴａ／修飾全部　６９．７　−　− １３　７２．３　２．６　２．６ ４　１３　２０　７５．８　６．１　２．０２０　８３．３　＋１３．６　＋１ ．９相補的ストランド　−　ＪＭ−１２：　ｃｃｃ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＧＧＣ試 験ヌクレオチド　−２プロピルイミダゾイル　ｄＧ修飾の位置　ユ＊　デルタＴ 、、デルタＴ、、／修飾天然　５０．８　−　− ｓ　６３．４　＋１２．６　＋６．３ 相補的ストランド　−　ＧでキャップしたＰＡＰ：　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＧＣＡ ＡＧ　ＧＧＣ 試験ヌクレオチド　−２プロピルイミダゾイル　ｄＧ修飾の位置　Ｔ、デルタＴ 、　デルタＴａ／修飾全部　５６．５　−　− １２　１３　１４　６４．９　＋８．４　＋２．８相補的ストランド　−　ＸＹ ：　ｃＴｃ　ＧＴＡ　ＣＣＡ　ＴＴＣＣＧＧ　ＴＣＣ 試験ヌクレオチド　−２′−フルオロ−２′−デオキシＡ修飾の位置　Ｔ、デル タＴ、　デルタＴ、、／修飾天然　６２．６　−　− ９　６０．６　−２．０　−２．０ 相補的ストランド　−　ＸＹ：　ＧＧＡ　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＣＧ　Ａ 試験ヌクレオチド　−２′　−フルオロ−２′−デオキシＡ相補的ストランド　 −　ＸＹ：　ｃ”ｒｃ　ＧＴＡ　ＣＣＴ　ＴＴＣＧＧＴＣ試験ヌクレオチド　− ２′−フルオロ−２′−デオキシＡ修飾の位置　Ｔ、デルタＴ、　デルタＴ、／ 修飾天然　６０．６　−　− ２　５　９　１０　１５　５５．９　−３．９　−０．８相補的ストランド　− 　ＸＹ：　ｃ’ｒｃ　ＧＴＡ　ＣＣＴ　ＴＴＣＣＧＧ　ＴＣＣ 試験ヌクレオチド　−２′−フルオロ−２′−デオキシＡ９　６０．７　−１． ０　−１゜ 相補的ストランド　−　Ｈ３Ｖ−２１＋　ＡＣＣＧＡＧ　ＧＴＣＣＡＴ　ＧＴＣ ＧＴＡ　ＣＧＣ 試験ヌクレオチド　−２′−フルオロ−２′−デオキシＡ修飾の位置　Ｔ、　デ ルタＴＷ、デルタＴ、／修飾天然　６８，９　−　〜 １　５　１１　１８　６７．０　−１．８　−〇、５相補的ストランド　−　Ｈ ３Ｖ−２１：　ＡＣＣＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＧＴＣＧＴＡ　ＣＧＣ 試験ヌクレオチド　−２′−フルオロ−２′−デオキシＡ修飾の位置　Ｔ、　デ ルタＴ、、デルタＴ、／修飾天然　６６．１−− １　５　８　１１　１８　６６．４　＋０．３　＋０．１相補的ストランド　− 　ＰＡＰ：　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＧＣＡＡＧ　ＴＡＣ試験ヌクレオチド　−２′ −フルオロ−２′−デオキシＡ修飾の位置　Ｔ、デルタＴ１　デルタＴ、、／修 飾天然　５３．２　−　− ３　６　１０　１１　１４　５３．０　−０．２　０．０相補的ストランド　− 　Ｆ）ＡＰ：　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＧＣＡＡＧ　ＴＡＣ試験ヌクレオチド　−２ ′−フルオロ−２′−デオキシＡ５　７　１３　５２．１　−０．２　〜０１１ ３　１４　５５．４　＋３．２　＋０．５相補的ストランド　−　Ａでキャップ したＰＡＰ：　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＧＣＡＡＧ　ＴＡＣ 試験ヌクレオチド　−２′−フルオロ−２′−デオキシＡ修飾の位置　Ｔ、デル タＴ１　デルタＴ、／修飾天然　５０．４　−　− １２　１３　１４　４３．６　−６．８　−２Ｊ相補的ストランド　−　Ａでキ ャップしたＰＡＰ：　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＧＣＡＡＧ　ＴＡＣ 試験ヌクレオチド　−２′−フルオロ−２′−デオキシＡ修飾の位置　Ｔ、デル タＴ、　デルタＴ、、／修飾全部ＰＳ　４３．２　−　− １２　１３　１４に２′−フ ルオロＡを有するＰＳ全部　４７．３　＋４．１　＋１．４相補的ストランド　 −　ＰＡＰ−ｍｏｄ：　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＴＧＣＡＡＧＴＡＣＡＡＡ　Ｔ 試験ヌクレオチド　−２′−フルオロ−２′−デオキシＡ修飾の位置　５　デル タＴ、デルタＴ、／修飾天然　５６．５　−　− １６　１７　１８　５６．０　−０．５　−０．１相補的ストランド　−５Ｌ○ ・　ＴＣＣＡＧＧ　ＴＧＴ　ＣＣＧ　ＣＡＴ試験ヌクレオチド　−２′−フルオ ロ−２′　−デオキシＡ１　７　９　１５　、　６１．２　−１．３　−０．３ 実施例１４１ タンパク質である５−リポキシゲナーゼの生産をコードするメツセンジャーＲＮ Ａの活性を変調するための組成物を、この実施例およびこの後に続くその他の実 施例により構成する。配列ＣＧＵＵＣＣＡＧＵＧＡＣＵＵＣは、翻訳の開始“Ａ ”をゼロと数えることによって定義したヌクレオチド１０６５で始まる５−リポ キシゲナーゼｍＲＮＡ中にあられれる。有効なアンチセンス剤を導くと考えられ るその他の領域を選択することもできる。上記の領域については、５〜リポキシ ゲナ一ゼｍＲＮＡを目的とする標的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＧＣＡＡ ＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧ）は、本発明に従う有効な組成物を導（標準的な固相技 術によって構成することができる。２−イミダゾリルエチル　アミノ−２−デオ キシアデニンによって置き換えられている特定のアデニンを含む５Ｌ○配列５’ 　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３’　は、ジャーナル・オブ・ジ ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）　第１０６巻、第６３７９ペ ージ（１９８４）の２−クロロ−２°−デオキシアデノシン（５，７２ｇ、、　 ２０ミリモル）から、実施例１０９ないし１１４により製造することができる。
適当な量のこの物質を乾燥ＴＨＦに溶解させて、５Ｌ○配列５°　−ＧＡＡ　Ｇ ＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３°の自動固相合成法に使用する。
合成される変更配列は： ＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ Ｇａａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧ 　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧ［ここでａ＝２−（イミダゾー ル−４−イル−エチルアミノ）アデニン〕であろう。
実施例１４２ 特定グアニジン位置にＮ２−イミダゾリルエチルグアニン（２−イミダゾリルア ミノピポキサンチン）を含む５ＬＯ−配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴＧＧＡ 　Ａ、ＣＧ−３°の合成を、１−（３−アミノプロピル）−イミダゾールの代り に１−（２−アミノエチ）−イミダゾールを使用して、実施例１０１ないし１０ ８により実施する。適当な量のこの物質を、乾燥ＴＨＦに溶解させて、５Ｌ０　 ５’　−配列５−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３’　の自動合成法 に使用する。合成される変更配列は：ｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧ ＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇＧＡ、Ａ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧｇＡ　ＡＣＧ ｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇ 　およびｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ｇｇＡ　ＡＣｇにこでｇ＝Ｎ２−（イミダゾリ ルエチル）グアニン（（２−イミダゾール−４−イルエチルアミノ）ピポキサン チン］であろう。
実施例１４３ 特定位置に２′−デオキシ−２′−（イミダゾール−４−イル−プロピル）アデ ニンを含む５Ｌ○配列５′−配列ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３° の合成を行なう。乾燥ピリジン２００ｍ１中の３’　、５’　−０−（テトライ ソプロピル　ジシロキサン−１，３−ジイル）−９−β−Ｄ−アラビノフラノシ ルアデニン（１０，２ｇ、２０ミリモル）の溶液を、水浴中で冷却して、トリメ チルクロロシラン（６ｍｌ）で処理する。０．５時間後に、塩化ベンゾイル（６ ｍｌ）を加えて、水浴を除去する。周囲温度に２時間おいた後、反応物を冷却し 、冷水２０ｍ１で処理し、１５分後に濃水酸化アンモニア２０ｍ１で処理する。
反応物を減圧下で蒸発させて油とし、この油をシリカゲルクロマトグラフィーに よって精製して９ｇの３°、５″、Ｎ６でブロックされたヌクレオシドを得る。
この物質を、乾燥アセトニトリル（２００ｍｌ）および乾燥ＤＭＦ　（５０ｍｌ ）に溶解させて、水浴中で冷却し、水素化ナトリウム（４００ｍｇ）で処理し、 続いて３０分後に、乾燥アセトニトリル（５０ｍｌ）中の無水トリフルオロメチ ルスルホン酸（５ｇ）を滴加して処理する。反応物を減圧下で蒸発させる。残留 物を酢酸エチルに溶解させ、水で洗浄し、そしてＭｇ５Ｏ，で乾燥させる。溶媒 を減圧下で除去すると、硬い泡沫として２゛−トリフルオロスルホネートが得ら れる。
この物質の試料（４ｇ、５．　５ミリモル）を乾燥酢酸エチル（１０Ｑｍｌ）お よびジイソプロピルエチルアミン（８００ｍｇ）に溶解させ、水浴中で冷却し、 そして１−（４−イミダゾリル）−３−ヒドロキシ−ｎ−プロパン（７５０ｍｇ ）で処理する。周囲温度で２時間後に、反応物を冷水５０ｍ１で洗浄して、Ｍ　 ｇ　Ｓ　Ｏ＜で乾燥させる。減圧下で溶媒を除去すると、３°、５′　およびＮ ６−位でブロックされた２′−（イミダゾリルプロポキシ）アデノシンが得られ る。
この物質を５０ｍ１の乾燥ＴＨＦに溶解させて、室温で２時間弗化テトラブチル アンモニウム（ＴＨＦ中ＩＭのもの１０ｍ１）で処理する。溶媒を減圧下で除去 して、シリカゲル上に吸収させた残留物をクロロホルム／メタノール混合物で溶 出させるシリカゲル上のクロマトグラフにかける。この物質の５°　−ＤＭＴお よび３゛−シアノエトキシホスホアミダイトを上記の実施例１０７および１０８ によって製造して、適当な量のこの物質を乾燥アセトニトリルに溶解させて、５ ＬＯ配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧの自動固相合成法に使 用する。
合成される変更配列は ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａ、ＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ、Ａ、 ＣＧＧＡＡ、ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　Ａ ＣＧ　およびＧａ、ａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａ、ＣＧ［ここでａ＝２’−０ −（イミダゾール−４−イル−ｎ−プロピル）アデニン］であろう。
実施例１４４ 特定位置に２′−（イミダゾール−４−イル−プロピル）チミジンを含む５ＬＯ 配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３′の合成を記載する。
３°、５°　−〇−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−９ −β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン（９，７ｇ、２０ミリモル）の溶液を、乾 燥アセトニトリル（２００ｍｌ）および乾燥ＤＭＦ　（５０ｍｌ）に溶解させ、 水浴中で冷却し、そして水素化ナトリウム（４００ｍｇ）で処理し、続いて３０ 分後に乾燥アセトニトリル（５０ｍｌ）中の無水トリフルオロメチルスルホン酸 （５ｇ）を滴加して処理する。反応物を減圧下で蒸発させる。残留物を酢酸エチ ルに溶解させ、水で洗浄し、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ＜で乾燥させる。減圧下で溶媒を除 去すると、硬い泡沫として２′−トリフルオロスルホネートが得られる。この物 質の試料（４ｇ、５．　５ミリモル）を乾燥酢酸エチル（１００ｍｌ）およびジ イソプロピルエチルアミン（８００ｍｇ）中に溶解させ、水浴中で冷却しモして １−（イミダゾール−４−イル）−３−ヒドロキシ−ｎ−プロパン（７５０ｍｇ ）で処理する。周囲温度に２時間おいた後、反応物を５０ｍ１の冷水で洗浄し、 ＭｇＳＯ４で乾燥させる。この物質をさらに上記の実施例１０７および１０８に よって反応させて、５’　−ＤＭＴ−３’　シアノエトキシホスホアミダイトを 得る。適当な量のこの物質を、乾燥アセトニトリルに溶解させて、５ＬＯ配列５ ’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧの自動固相合成法に使用する。
合成される変更配列は ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣｔ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧｔＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ 　およびＧＡＡ　ＧｔＣＡＣｔ　ＧＧＡ　ＡＣＧ［ここでｔ＝２゛　−〇−（イ ミダゾール−４−イル−ｎ−プロピル）チミン］であろう。
実施例１４５ 特定の位置に３−デアザ−３−（イミダゾール−４−イル−プロピル）グアニン ヲ含む５ＬＯ−配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧの合成を記 載する。５．２ｇ、１０ミリモルの５−（シアノメチル）−１−（２−デオキシ −３，５−ジー０−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシル）イ ミダゾール−４−カルボキンレート、　［ジャーナル・オン・メデイシナル・ケ ミストリイ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｙ ）。
第２７巻、第１３８９ページ（１９８４）コの溶液を、乾燥ＴＨＦ　（１００ｍ ｌ）に溶解させて、室温で水素化ナトリウム（８４０ｍｇ）で処理する。水素の 発生がやんだ後、４−（２−ブロモエチル）イミダゾール臭化水素酸塩（２，６ ｇ）。
［Ｒｅｃ、Ｔｒａｖ、Ｃｈｉｍ、＋’第第８看を加え、溶液を周囲温度で５時間 撹拌する。反応物を蒸発乾燥させる。残留物を酢酸エチルに溶解させ、水で洗浄 し、ＭｇＳ○，を用いて乾燥させる。濾過および溶媒除去後に得られる残留物を 液体アンモニアに溶解させて、周囲温度で圧力容器内に２４時間保ち、１時間１ ００℃まで加熱する。アンモニアをガス抜きして残留物を、２回メタノールと共 蒸発（ｃｏｅｖａｐｏｒａ　ｔ　ｅ）させる。この物質をメタノールに溶解させ 、シリカゲル上に吸収させて、シリカゲルカラム上に置く。クロロホルム／メタ ノールで溶出させると、２．０ｇの１−　（２　−チオキシ−β−Ｄ−エリトロ −ペントフラノシル）−５−　（１−シアノ−３−［イミダゾール−４−イル］ プロプー１ーイル）−４−カルボキサミドが得られる。この物質を上記の実施例 １０７および１０８によって５′−ＤＭＴ−３’　−シアノエトキシイソプロピ ルホスホアミダイトに変えて、硬い泡沫を得る。適当な量のこの物質を乾燥アセ トニトリルに溶解させて、５ＬＯ配列５°　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　 ＡＣＧの自動固相合成法に使用する。
合成される変更配列は： ｇＡＡ　ＧＴＣ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇｇＡＡ　ＧＴＣ　ＡＣＴ　ｇＧＡ　Ａ ＣｇｇＡＡ　ｇＴＣ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇＧＡＡ　ＧＴＣ　ＡＣＴ　ＧＧＡ 　ＡＣｇＧＡＡ　ＧＴＣ　ＡＣＴ　ｇｇＡ．ＡＣＧＧＡＡ　ｇＴＣ　ＡＣＴ　Ｇ ＧＡ　ＡＣＧｇＡＡ　ＧＴＣ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣ　ＡＣＴ 　ＧｇＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ｇＴＣ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　およびｇＡＡ　ｇ ＴＣ　ＡＣＴ　ｇＧＡ　ＡＣｇ［ここでｇ＝３−デアザ−３−（４−イミダゾリ ルエチル）グアニン］であろう。
実施例１４６ 特定部位に７−（イミダゾール−４−イル−メチル）−７’．８−ジヒドロ−イ ミダゾ−［４．　５−ｃ］ビＯＯ［３．２−ｅ］　ピリジン−４　（５Ｈ）−オ ンを含む５ＬＯ配列５’ーーＧＡＡ　ＧＴＣ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧの合成を 行なう。
１−（３．５−ジー０−１−ルオイルーβ−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシル） −５−シアノメチル−イミダゾール−４−カルボン酸メチル（１０．３４ｇ，２ ０ミリモル）［ジャーナル・オン・メディシナル・ケミストリイ（Ｊｏｕｒｎａ ’１ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７巻、第１３８９ ベージ（１９８４）］および乾燥アセトニトリルの溶液を水素化ナトリウム（５ ００ｍｇ）で処理する。周囲条件で３０分間撹拌した後、この溶液を１−ブロモ −３−（１−ｔ−Ｂｏｃ−イミダゾール−４−イル）−２−オキソエチレンケタ ール（７．２４ｇ）で処理して、撹拌を１６時間続ける。反応物を減圧下で蒸発 させ、残留物を酢酸エチルと水との間に分配させる。溶媒を乾燥させ、減圧下で 除去する。残留物を液体アンモニアとともにパール（Ｐａｒｒ）圧力容器中に入 れる。
反応を８０℃で８時間実施して冷却しガス抜きする。残留物を数回メタノールと 共蒸発させ、熱水性エタノール中に溶解させ、塩酸でｐＨ４に調整する。１時間 後にこの溶液を、ラネーニッケルの存在において選択的に水素化する。１当量の 水素が吸収された後、反応物を濾過して、ｐＨ７に調整する。溶液を減圧下で蒸 発乾燥させる。この物質をメタノールの助けによってシリカゲル上に吸収させ、 メタノール／クロロホルムで溶出させるシリカゲル上のクロマトグラフにかけて 、３．２ｇの１−（２−チオキシーβ−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシル）−７ −（イミダゾール−４−イル−メチル）−７，８−ジヒドロ−イミダゾ［４，５ −Ｃ］　ピロロ［３，２−ｅ］　ピリジン−４（５Ｈ）−オンを得る。この物質 を上記実施例１０７および１０８の手順に従って５°−ＤＭＴ−３’　−シアノ エトキシホスホアミダイト−５，６−ジイツブトリルに変えて、自動固相ＤＮＡ 合成法により５Ｌ〇−配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ中に 挿入する。
合成される変更配列は： ｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇＧＡ　ＡＣｇ ｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇｇＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧｇＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　およびｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ｇｇＡ 　ＡＣｇであろう。ここでｇは、７−（イミダゾール−４−イル−メチル）−７ ，８−ジヒドロ−イミダゾ−［４，５−ｃｌ　ピロロ［３，２−ｅコピリジン− ４（５Ｈ）−オンであろう。
実施例１４７ オリゴヌクレオチド内に８−（イミダゾール−４−イル−メチル）−７，Ｌ−ジ ヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃコビロロ［３，２−ｅコピリジン−４（５Ｈ）− オンを含む５Ｌ〇配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧの合成を 行なう。乾燥アセトニトリル中の１−　（３，５−ジー０−トルオイル−β−Ｄ −エリトロ−ペントフラノシル）−５−シアノメチルイミダゾール−４−カルボ ン酸メチル（１０，３４ｇ、２０ミリモル）の溶液を水素化ナトリウム（５００ ｍｇ）で処理する。周囲温度で３０分間撹拌した後、この溶液を２−ブロモ−３ −（１−ｔ−Ｂｏｃ−イミダゾール−４−イル）−プロパノンエチレンケタール （７，２４ｇ）で処理し、撹拌を１６時間続ける。反応を進めさらに上記のよう に反応させて、１−　（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロベント−フラノシル） −８−（イミダゾール−４−イル−メチル）−７，８−ジヒドロ−イミダゾ−［ ４゜５−ｃ：］　ピロロ１３．　２−ｅ］　ピリジン−４（５Ｈ）−オンを得る 。この物質を、上記の実施例１０７および１０８に従って５’　−ＤＭＴ−３° 　−シアノエトキシホスホアミダイト−５，６−ジイツブトリルに変えて自動固 相ＤＮＡ合成法により５ＬＯ−配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　Ａ ＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は・ ｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇＧＡ　Ａ、Ｃ ｇｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ｇＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇｇＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ＧｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧｇＡ　ＡＣ ＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　およびｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ｇｇ Ａ　ＡＣＧであろう。ここでｇ＝８−（イミダゾール−４−イル−メチル）−７ ，８−ジヒドロ−イミダゾ−［４，５−Ｃ］　ピＯＯ［３，２−ｅ］　ピリジン −４（５Ｈ）−オン 実施例１４８ 配列内に５−（イミダゾール−４−イル−エトキシメチル）イミダゾール−２（ Ｈ）オン４−カルボキサミドを含む５Ｌ〇配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴＧ ＧＡ　ＡＣＧの合成を行なう。５−ブロモメチル−２−オキソ−イミダグロール −４−カルボン酸エチル（５，４ｇ、２０ミリモル）、イミダゾール−４−イル −２−エタノール（２，３ｇ）、乾燥アセトニトリル（１００ｍｌ）の混合物を 水素化ナトリウム（７５０ｍｇ）で処理し、周囲温度で５時間撹拌する。この溶 液を、　酢酸でほぼｐＨ７に調整し、蒸発乾燥させる。クロマトグラフィーによ って精製すると、所望物質が３０％の収率で得られる。この物質を乾燥ピリジン （１００ｍｌ）およびＮ−エチル−ジイソプロピルアミン（８ｍｌ）に溶解させ て、塩化ジフェニルアミノカルボニル（５ｍｌ）で処理する。撹拌を５時間続け る。この溶液を減圧下で蒸発乾燥させて、残留物を酢酸エチルと水との間に分配 させる。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発乾燥させる。シリカゲルク ロマトグラフィーによって精製して、ビス（ジフェニルカルバモイル）で保護さ れたイミダゾール（３，５ｇ、５ミリモル）を得る。このものを乾燥アセトニト リル（５０ｍｌ）に溶解させて、周囲温度で３０分間撹拌した後水素化ナトリウ ム（１３０ｍｇ）で処理し、塩化３．５−ジー０−（ｐ−トルオイル）−α−り 一エリトローペントフランシルを加える。混合物を８時間撹拌し、濾過する。
濾液を蒸発乾燥させ、濾過した残留物を水で洗浄する。残る残留物を酢酸エチル に溶解させ、濾液残留物と合わせる。この物質をシリカゲル上のクロマトグラフ ィーによって精製して、４ｇのブロックされたヌクレオシドを得る。これを２０ ℃でアンモニアで飽和したメタノールに溶解させる。この溶液を周囲温度で一晩 撹拌する。減圧蒸発およびそれに続くシリカゲルクロマトグラフィーにより、糖 が脱保護されたヌクレオシドを得る。この物質を、上記の実施例１０７および１ ０８の手順によってその５’　−ＤＭＴ−３’　−β−シアノエチルホスホアミ ダイトに変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法によって５ＬＯ−配列５’　−ＧＡ Ａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ内に挿入する。
合成される変更配列は： ｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇＧＡ　ＡＣｇ ｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ、ＡＣｇＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇｇＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧｇＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　およびｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ｇｇＡ 　ＡＣｇであろう。ここでｇ＝５−（イミダゾール−４−イル−エトキシメチル ）−イミダゾール−２（Ｈ）−オン４−カルボキサミド実施例１４９ 特定の部位に４−アミノ−５−（イミダゾール−４−イル−エトキシメチル）− イミダゾール−２（３Ｈ）オンを含む５Ｌ〇配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ 　ＧＧＡ　ＡＣＧの合成を記載する。２．４−ジブロモ−５−ニトロイミダゾー ル（５，４ｇ、２０ミリモル）イミダゾール−４−イル−２−エタノール（２゜ ３ｇ）、乾燥アセトニトリル（１００ｍｌ）の混合物を水素化ナトリウム（７５ ０ｍｇ）で処理し、周囲温度で５時間撹拌する。溶液を酢酸でほぼｐＨ７に調整 して、蒸発乾燥させる。クロマトグラフィーによって精製すると、所望の物質が ３０％の収率で得られる。この物質を乾燥ピリジン（１００ｍｌ）およびＮ−エ チル−ジイソプロピルアミン（８ｍｌ）に溶解させて、これを塩化ジフェニルア ミノカルボニル（５ｍｌ）で処理する。５時間撹拌を続ける。溶液を、減圧下で 蒸発乾燥させ、残留物を酢酸エチルと水との間に分配させる。有機層を硫酸マグ ネシウムで乾燥させ、蒸発乾燥させる。シリカゲルクロマトグラフィーによって 精製すると、ビス（ジフェニルカルバモイル）保護されたイミダゾール（３，５ ｇ＋　５ミリモル）が得られる。このものを、乾燥アセトニトリル（５０ｍｌ） に溶解させ、周囲温度で３０分間撹拌した後、水素化ナトリウム（１３０ｍｇ） で処理し、塩化３．５−ジー０−（ｐ−トルオイル）−α−り一エリトローベン トフランシルを加える。混合物を８時間撹拌し、濾過する。濾液を蒸発乾燥させ る。
濾過した残留物を水で洗浄し、残る残留物を酢酸エチルに溶解さ也濾液残留物と 合わせる。この物質をシリカゲル上のクロマトグラフィーによって精製して、４ ｇのブロックされたヌクレオシドを得る。このものを２０℃でアンモニアで飽和 させたメタノールに溶解させる。溶液を周囲温度で一晩撹拌する。減圧下での蒸 発とそれに続くシリカゲルクロマトグラフィーにより、糖が脱保護されたヌクレ オシドを得る。この物質を上記の実施例１０７および１０８の手順によりその５ ’　−ＤＭＴ−３’　−β−シアノエチルホスホアミダイトに変え、これを自動 固相ＤＮＡ合成法１：より５ＬＯ−配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は・ ｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ、ＡＣｇｇＡＡ、ＧＴＣＡ、ＣＴ　ｇＧＡ　ＡＣ ｇｇＡＡ　ｇＴＣＡ、ＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　Ａ ＣｇＧＡ、Ａ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇｇＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　 ＡＣＧｇＡ、Ａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧｇＡ 、ＡＣＧＧＡＡ　ｇＴＣＡ、ＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　およびｇＡＡ　ｇＴＣＡＣ Ｔ　ｇｇＡ　Ａ、Ｃｇにこでｇは４−アミノ−５−（イミダゾール−４−イル− エトキノメチル）−イミダゾールー２（Ｈ）−オンである］であろう。
実施例１５０ 特定部位に４−アミノ−５−（イミダゾール−４−イル−エトキシメチル）−イ ミダゾールを含む５ＬＯ配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧの 合成を記載する。２，４−ジブロモ−５−ニトロイミダゾール（５，４ｇ、２０ ミリモル）、２−（１−ペンジル−イミダゾール−４−イル）−エタノール、乾 燥アセトニトリル（１００ｍｌ）の混合物を水素化ナトリウム（７５０ｍｇ）で 処理し、周囲温度で５時間撹拌する。溶液を酢酸でほぼｐＨ７に調整し、蒸発乾 燥させる。クロマトグラフィーによる精製によって所望の物質を３０％の収率で 得る。このものを乾燥アセトニトリル（５０ｍｌ）に溶解させて、周囲温度で３ ０分間撹拌した後、水素化ナトリウム（１３０ｍｇ）で処理し、塩化３．５−ジ ー０−（ｐ−トルオイル）−α−Ｄ−エリトロ−ペントフランシルを加える。
混合物を８時間撹拌して、濾過する。濾液を蒸発させて乾燥させる。濾過した残 留物を水で洗浄し、残る残留物を酢酸エチルに溶解させて、ろ液残留物と合わせ る。この物質を、シリカゲル上のクロマトグラフィーによって精製して、４ｇの ブロックされたヌクレオシドを得る。このものを２０℃でアンモニアで飽和させ たメタノールに溶解させる。溶液を周囲温度で一晩撹拌する。減圧下での蒸発お よびそれに続くシリカゲルクロマトグラフィーにより糖が脱保護されたヌクレオ シドを得る。水素でこの物質を触媒還元すると、２−アミノ−１−（２−デオキ シ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−（イミダゾール−４−イル−エ トキシメチル）イミダゾールが得られる。一時的なベンゾイル化により、４−ベ ンゾイルアミノ−５−（１−ベンゾイル−イミダゾール−４−イル−エトキシメ チル）誘導体が得られる。この物質を、上記の実施例１０７および１０８の手順 によってその５’　−ＤＭＴ−３’　−ｂ−ノアノエチルーホスホアミダイトに 変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法により５ＬＯ−配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣ ＡＣＴＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は・ ｇＡＡ　ＧＴＣＡ、ＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇＧＡ　ＡＣ ｇｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ｇＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇｇＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ、ＡＣ ＧｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧｇＡ　ＡＣ ＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　およびｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ｇｇ Ａ、ＡＣｇ［ここでｇは４−アミノ−５−（イミダゾール−４−イル−エトキシ メチル）−イミダゾールであるコであろう。
実施例１５１ 特定部位に５−（イミダゾール−４−イル−エトキシメチル）イミダゾール−２ （Ｈ）オンを含む５ＬＯ配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧの 合成が実施されるであろう。４−ブロモイミダゾール−２（Ｈ）オン（２０ミリ モル）、および塩化ジフェニルアミノカルボニルの混合物を、水素化ナトリウム （７５０ｍｇ）で処理して、周囲温度で５時間撹拌する。溶液を、酢酸でほぼｐ Ｈ７に調整し、蒸発乾燥させる。クロマトグラフィーによって精製すると所望の 物質が３０％の収率で得られる。これを乾燥アセトニトリル（５０ｍｌ）に溶解 さ氷水素化ナトリウム（１３０ｍｇ）で処理する。周囲温度で３０分間撹拌した 後、塩化３．５−ジー０−（ｐ−トルオイル）−α−Ｄ−エリトロ−ベントフラ ンシルを加える。混合物を８時間撹拌して、濾過する。次に濾液を蒸発乾燥させ る。濾過した残留物を水で洗浄し、残っている残留物を酢酸エチルに溶解させて 、濾液残留物と合わせる。この物質をシリカゲル上のクロマトグラフィーによっ て精製して４ｇのブロックされたヌクレオシドを得る。これを２０℃でアンモニ アで飽和させたメタノールに溶解させる。この溶液を一晩周囲温度で撹拌する。
減圧下での蒸発とそれに続くシリカゲルクロマトグラフィーにより糖が脱保護さ れたヌクレオシドを得る。次にこの物質を５−位でヒドロキシメチル化する。
この物質を水素で水素化分解することにより１−（２−デオキシ−β−り一エリ トロベントフラノシル）−５−ヒドロキシメチルイミダゾールが得られる。一時 的なベンゾイル化によって４−ベンゾイルアミノ−５−（１−ベンゾイルイミダ ゾール−４−イル−エトキシメチル）誘導体が得られる。この物質を上記実施例 １０７および１０８の手順によってその５’　−ＤＭＴ−３’　−β−シアノエ チルホスホアミダイトに変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法によって５ＬＯ＝配 列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は・ ｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇＧＡ　ＡＣｇ ｇＡＡ、ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇｇＡ、ＡＣＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡ、ＣＴ　ＧｇＡ　ＡＣ ＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　およびｇＡＡ、ｇＴＣＡＣＴ　ｇｇ Ａ　ＡＣｇにこでｇ＝４−アミノ−５−（イミダゾール−４−イル−エトキシメ チル）−イミダゾール］であろう。
実施例１５２ 特定部位に２−アミノ−５−（イミダゾール−４−イル−エトキシメチル）−イ ミダゾールを含む５ＬＯ配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧの 合成を記載する。４−ブロモ−２−ニトロイミダゾール（２０ミリモル）、アセ トニトリル（１００ｍ、１）、および水素化ナトリウムの混合物を５０℃で３０ 分間撹拌し、冷却して、塩化３．５−ジー０−ｐ−メチルベンゾイル−α−Ｄ− エリトロペントフラノシルで処理する。溶液を周囲温度で８時間撹拌し、濾過し て塩化ナトリウムを除去する。濾液を蒸発乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフ ィーによって精製する。この物質を５−位でタロロメチル化する。続いて塩基触 媒作用下で２−（イミダゾール−４−イル）エタノールを用いて核置換を行なう と５−（イミダゾール−４−イル−エトキシメチル）誘導体が得られる。臭素原 子の水素化分解およびこの基の還元を、水素および木炭上のパラジウム条件で行 なう。５−位イミダゾール誘導体を保護するために一時的なベンゾイル化を用い る。この物質を上記実施例１０７および１０８の手順によってその５°−ＤＭＴ −３’−ｂ−シアノエチルホスホアミダイトに変えて、これを自動固相ＤＮＡ合 成法１：よ−、て５Ｌｏ−配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ 中に挿入する。
合成される変更配列は： ＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ、ＡＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ Ｇａａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ａ、Ｃ ＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ＧＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧ ａ　ａＣＧにこでａは２−アミノ−５−（イミダゾール−４−イル−エトキシメ チル）イミダゾールである］であろう。
実施例１５３ 特定部位に１−（イミダゾール−４−イル−エチル）チミン−６−イルを含む５ Ｌ〇配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧの合成を記載する。
アセトニトリル中の塩化３．５−ジー０−ｐ−メチルベンゾイル−α−Ｄ−エリ トロペントフラノシルの混合物を０℃まで冷却して、６−リツー１−　（１−［ ベンゾイルツーイミダゾール−４−イル）エチル−３−ベンジルチミンで処理す る。
溶液を放置して室温まであたため、周囲温度に３時間おいた後、混合物を減圧下 で蒸発乾燥させる。クロロホルムおよびメタノールを用いるシリカゲルクロマト グラフィーによって得た物質を次に、室温で一晩アンモニアのメタノール溶液で 脱ベンゾイル化する。エタノールからの再結晶により、６’−（２−チオキシー β〜Ｄ−エリトロベントフラノツル）−１−（イミダゾール−４−イル−エチル ）チミンを得る。この物質を、上記実施例１０７および１０８の手順によってそ の５“−ＤＭＴ−３°　−β−シアノエチルイソプロビルホスホアミダイトに変 え、このものを自動固相ＤＮＡ合成法により５ＬＯ−配列５°−ＧＡＡ　ＧＴＣ ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は： ＧＡＡ　ＧｔＣＡＣｔ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣｔ　ＧＧＡ　Ａ、Ｃ Ｇ　およびＧＡＡ　ＧｔＣＡＣｔ　ＧＧＡ　ＡＣＧにこでｔ＝１−　（イミダゾ ール−４−イル−エチル）チミン−６−イルコであろう。
実施例１５４ 特定部位に２−アミノ−４−オキソ（３Ｈ）−８−（イミダゾール−４−イル［ プロピル］−力ナゾリン−７−オキシを含む５Ｌ〇配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣ ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧの合成を記載する。２−イソブトリアミド−４−ジフェ ニルアミノカルボニル−オキシ−８−［１−（ベンゾイル）イミダゾール−４− イルプロピルカナゾリン−７−オールの溶液を、室温で１時間、水素化ナトリウ ムで処理した後、１０分間５０℃に加熱する。この溶液を塩化３．５−ジー〇− ｐ−メチルベンゾイル−α−Ｄ−エリトロペントフラノシルで処理する。溶液を 周囲温度で３時間撹拌し、減圧下で蒸発乾燥させる。シリカゲルクロマトグラフ ィー（クロロホルム／メタノール）に続いて、室温で一晩アンモニアのメタノー ル溶液で選択的脱ベンゾイル化を行なう。エタノールからの再結晶によって、７ −（２−デオキシ−β−Ｄ−エリチオペントフラノシル）−８−（１−［ベンゾ イルコイミダゾール−４−イル−プロピル）−２−イソブトリアミド−４−ジフ ェニルアミノカルボニルオキシプロビルカナゾリン−７−イルを得る。この物質 を上記実施例１０７および１０８の手順によってその５’　−ＤＭＴ−３’　− ｂ−シアノエチルホスホアミダイトに変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法によっ て５Ｌ〇−配列５′−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は・ ｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ、ＡＣｇｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇＧＡ　ＡＣｇ ｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ、ＡＣｇＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇ ＧＡＡ　ＧＴＣＡ、ＣＴ　ｇｇＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ＧｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧｇＡ　ＡＣ ＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　およびｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ｇｇ Ａ　ＡＣｇ［ここでｇは２−アミノ−４−オキソ（３Ｈ）−８−（イミダゾール −４−イル−〔プロビルコー２−カナゾリン−７−オキシであるコであろう。
実施例１５５ 特定部位に４−アミノ−７−（イミダゾール−４−イル）−エトキンイミダゾ［ ４，５−ｄｌ−ピリダジンを含む５Ｌ〇配列５°−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴＧＧＡ 　ＡＣＧ−３’　の合成を記載する。アセトニトリル（１００ｍｌ）中の４゜７ −ジクロロイミダゾ−［４，５−ｄｌ　ピリダジン［ジャーナル・オン・オーガ ニック・ケミストリイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ）、第２３巻、第１５３４ベージ（１９５８）］の溶液を１時間水素化ナ トリウムで処理した後、１０分間５０°Ｃに加熱する。この溶液を塩化３．５− ジー０−（メチルベンゾイル）−α−り一エリトローペントフラノシルで処理す る。
周囲温度で３時間撹拌した後、混合物を濾過する。濾液を減圧下で蒸発乾燥させ て泡沫を得て、これをシリカゲル上のクロマトグラフにかける。純粋な生成物を 液体アンモニアでアミノ化すると、４−アミノ−７−りロロー１−（２−デオキ シ−β−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシル）イミダゾ［４，５−ｄｌ　ピリダジ ンが得られる。この物質を、エタノール／水から再結晶させて純粋な脱ブロック したヌクレオシドを得る。この物質をＤＭＦに溶解させて、２−（イミダゾール −４−イル）エタノールの二六トリウム塩で処理する。この溶液を１時間１００ ℃に加熱した後、減圧下で蒸発乾燥させる。残留物を水から再結晶させる。１０ ０”Ｃ（０，１トル）で２時間乾燥後、この物質を先に述べたようにして４−ア ミノ基および７−位イミダゾール環を一時的にベンゾイル化する。エム・ジエイ ・ガイド（Ｍ、Ｊ、　Ｇａ　ｉ　ｔ）　、オリゴヌクレオチド・シンセシス（Ｏ ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、［アイ・アール・エル ・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）１９８５］、この物質を上記実施例１０７およ び１０８の手順によりその５“−ＤＭＴ−３’　−β−シアノエチルホスホアミ ダイトに変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法により５ＬＯ−配列５’　−ＧＡＡ 　ＧＴＣＡＣＴＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は： ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡｃＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ 　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧにこでａは４−アミノ−７−（ イミダゾール−４−イル）−エトキシイミダゾ［４，５−ｄｌ−ピリダジンであ る］ であろう。
実施例１５６ 特定位置に２°−デオキシ−２′−（イミダゾール−４−イル）−エトキシアデ ノシンを含む５Ｌ〇配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３° の合成を記載する。ピリジン中の３°、　５’　−（１，１，３，３−テトライ ソプロビルジシロキサニル’）−９−（β−Ｄ−アラビノフラッジ）−アデニン の溶液を、クロロトリメチルシラン、塩化ベンゾイル、およびアンモニアメタノ ール溶液で続いて処理することによって一時的ｉこベンゾイル化する。得られる 溶液を蒸発乾燥させ、エタノールから再結晶させる。純粋な生成物を乾燥アセト ニトリルに溶解させて、０℃で無水トリフルオロメチルスルホン酸および水素化 ナトリウムで処理する。溶液を、０℃で１時間撹拌した後、放置して周囲温度ま であたためる（１時間）。溶液を蒸発乾燥させて、シリカゲルクロマトグラフィ ー（塩化メチレン／メタノール）により精製する。この物質、Ｎ６−ペンゾイル ー３″、５°　−（１，１，３，３−テトライソプロビルジシロキサニル）−２ “　−トリフルオロメチルスルホニル−９−（β−Ｄ−アラビノフラッジ）アデ ニンは、２゛位が種々の官能基および束縛された官能基で置換されているアデノ ンンの合成のための出発物質となる。常法によって各々Ｎ２−イソブトリル基、 およびＮ６−ベンゾイル基によるように保護されている、グアニジン、シトシン 、およびチミンのβ−Ｄ−アラビノフラノシル誘導体［アルドリッチ・ケミカル 社（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）］　（類似塩基と同様）は、 今述べたように２′−修飾することができる。２°　−修飾リボヌクレオチドは 上記実施例１０７および１０８のような配列−特異性オリゴヌクレオチド中に挿 入することができる。Ｎ６−ペンゾイルー３゛、５°　−（１，１，３，３−テ トライソプロビルジシロキサニル）−２’−トリフルオロメチルスルホニル−９ −（β−Ｄ−アラビノフラッジ）アデニンおよびアセトニトリルの溶液を０℃に 冷却して、アセトニトリル中の２−（イミダゾール−４−イル）エタノールの二 ナトリウム塩で処理する。この懸濁液を放置して室温まであたため、周囲温度で ２時間撹拌する。
懸濁液を酢酸で中和し、室温で５時間弗化テトラブチルアンモニウムで処理し、 そして減圧下で蒸発乾燥させる。残留物をピリジンに溶解させ、一時的に上記の ようにベンゾイル化する。溶媒を除去した後、残留物をシリカゲルクロマトグラ フィーによって精製する。得られるＮ６−ベンゾイル−２“　−デオキシ−２″ −（１−［ベンゾイル］−イミダゾールー４−イルエトキシ）アデノシンを上記 手順によってその５’　−ＤＭＴ−３”　−β−シアノエチルホスホアミダイト に変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法によって５ＬＯ−配列５’　−ＧＡＡ　Ｇ ＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は。
ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡ、Ａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ Ｇ　およびＧａ、ａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧ［ここでａは２°　−デオ キシ−２”−（イミダゾ−４−イル）エトキシアデノシンである］であろう。
実施例１５７ 特定位置に２′−デオキシ−２°　−（９−［３−クロロ−６−メドキシアクリ ジニルコアミノーｎ−ペンチルオキシ）アデノシンを含む５Ｌ〇配列５’　−Ｇ ＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３’　の合成を記載する。Ｎ６−ペンゾ イルー３゛、５°　−（１，１，３，３−テトライソプロビルジシロキサニル） −２゛−トリフルオロメチルスルホニル−９−（β−Ｄ−アラビノフラッジ）− アデニン、３−クロロ−６−メドキシアクリジニルー９−アミノ−ｎ−ペンタノ ール、およびアセトニトリルの溶液を、０℃に冷却して、水素化ナトリウムで処 理する。この溶液を、放置して室温まであたためた後、周囲温度で２時間撹拌し 、モして弗化テトラブチルアンモニウムで２時間処理する。溶液を蒸発乾燥させ 、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。この物質を上記実 施例１０７および１０８の手順によってその５’　−ＤＭＴ−３’　−β−シア ノエチによッＴ：　５　Ｌ　Ｏ−配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　 ＡＣＧ中に挿入する。合成される変更配列は： ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　Ａ、Ｃ ＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　Ａ、 ＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　Ａ ＣＧ　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧ［ここでａは、２゛−デオ キシ−２°　−（９−［３−クロロ−６−メドキンアクリジニル］アミノ−ｎ− ペンチルオキシ）アデノシンである］であろう。
実施例１５８ 特定位置に２°−デオキシ−２’　−（Ｎ１．Ｎｌ、Ｎ２−トリメトキンカルボ ニル−Ｎ２−メチルカルバモイルエトキシ）エチレンジアミンアデノシンを含む ５Ｌ〇配列５“　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３°の合成を記載 する。Ｎ６−ベンゾイル−３’　、５’　−（１，１，３，３−テトライソプロ ビルジシロキサニル）−２′　−トリフルオロメチルスルホニル−９−（β−ア ラビノフラッジ）アデニンおよびアセトニトリルの溶液を０℃に冷却して、アセ トニトリル中の（Ｎｌ、Ｎ１．Ｎ２−トリメトキシカルボニル−Ｎ２−メチルカ ルバモイル−エタノール）エチレンジアミンのナトリウム塩で処理する。この溶 液を放置して室温まであたためた後、周囲温度で２時間撹拌し、弗化テトラブチ ルアンモニウムで２時間処理する。溶液を蒸発乾燥させ、残留物をシリカゲルク ロマトグラフィーによって精製する。この物質を、上記実施例１０７および１０ ８の手順によってその５’　−ＤＭＴ−３’　−β−シアノエチルホスホアミダ イト誘導体に変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法により５ＬＯ−配列５″−ＧＡ Ａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は： ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡ、Ａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａ、ＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ、Ａ 、ＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ、 ＡＣＧ　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧ［ここでａは、２゛　− デオキシ−２’　−（Ｎｌ、Ｎｌ、Ｎ２−トリメトキシカルボニル−Ｎ２−メチ ルカルバモイルエトキン）エチレンジアミンアデノシンである］であろう。
実施例１５９ 特定位置に２°−デオキシ−２′　−ノナノキシアデノシンを含む５Ｌ〇配列５ °−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３’　の合成ヲ行ナウ。Ｎ６−ベ ンゾイル−３’　、５’　−（１，１，３，３−テトライソプロビルジシロキサ ニル）−２’−）リフルオロメチルスルホニル−９−（β−Ｄ−アラビノフラッ ジ）アデニンおよびアセトニトリルの溶液を０℃に冷却し、アセトニトリル中の ノナノールのナトリウム塩で処理する。溶液を放置して室温まであたためた後、 周囲温度で２時間撹拌し、モして弗化テトラブチルアンモニウムで２時間処理す る。
溶液を蒸発乾燥させ、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する 。
この物質を、上記実施例１０７および１０８の手順によってその５’　−ＤＭＴ −３°−ｂ−シアノエチルジイソプロピルホスホアミダイト誘導体に変え、これ を自動固相ＤＮＡ合成法によって５Ｌ〇−配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴＧ ＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は： ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａ、ＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ Ｇ　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧ（ここでａは２゛　−デオキ シ−２′−ノナノキシアデノシンである）であろう。
実施例１６０ 特定位置に２′−デオキシ−２゛　−ジメチルアミノ−トリス（エチルアミノ） アデノシンを含む５Ｌ〇配列５“　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ− ３゛の合成を記載する。０℃の、Ｎ６−ベンゾイル−３’　、５’　−（１，１ ，３゜３−テトライソプロビルジシロキサニル）−２°　−トリフルオロメチル スルホニル−９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラッジ）アデニン、ジメチルアミノ−ト リス（エチルアミン）、エチルイソプロピルアミンおよびアセトニトリルの溶液 を放置して室温まであたため、周囲温度で３時間撹拌した後、弗化テトラブチル アンモニウムで２時間処理する。溶液を蒸発乾燥させ、残留物をシリカゲルクロ マトグラフィーによって精製する。この物質を上記実施例１０７および１０８の 手順によって、ソ（７）５’　−ＤＭＴ−３’　−β−シアノエチルホスホアミ ダイト誘導体に変え、コレを自動固相ＤＮＡ合成法＋：、ヨＦ）　５　Ｌ　Ｏ− 配列５°　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は。
ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａ、Ａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ Ｇ　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧにこでａは、２′−デオキシ −２′−ジメチルアミノ−トリス（エチルアミノ）アデノシンである］であろう 。
実施例１６１ 特定位置に２°−デオキシ−２′−（メトキシトリス−エトキシ）アデノシンを 含む５Ｌ〇配列５“−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３”の合成を記 載する。０℃のＮ６−ペンゾイルー３°、５°　−（１，１，３，３−テトライ ソプロビルジシロキサニル）−２°　−トリフルオロメチルスルホニル−９−（ β−Ｄ−アラビノフラノシンアデニン、メトキシビスエトキシエタノールおよび アセトニトリルの溶液を、水素化ナトリウムで処理し、放置して室温まであたた めて、周囲温度で３時間撹拌した後、弗化テトラブチルアンモニウムで２時間処 理する。この溶液を蒸発乾燥させて、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーに よって精製する。この物質を上記実施例１０７および１０８の手順によってその ５”　−ＤＭＴ−３°　−ｂ−シアノエチルジイソプロピルホスホアミダイト誘 導体に変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法によって５Ｌ〇−配列５°−ＧＡＡＧ ＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は： ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡ’ＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ Ｇ　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧにこでａは２゛−デオキシ− ２゛−（メトキシトリス−エトキシ）アデノシンである］であろう・ 実施例１６２ 特定位置に２°−デオキシ−２’　−（Ｎｌ、Ｎｌ、Ｎ２−トリメトキシカルボ ニル−Ｎ２−メチルカルバモイルエトキシ）エチレンジアミンアデノシンを含む ５Ｌ〇配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３’　の合成を記 載する。２−クロロ−２′−デオキシアデノシン［ジャーナル・オン・ン・アメ リカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）、第１０６巻、第６３７９ベージ（ １９８４）］、ＤＭＦ、およびカリウムチオメチラートの溶液を、１００℃に１ 時間加熱し、室温まで冷却して、メタ−クロロベルベンゾエートで処理する。室 温で３時間撹拌した後、この溶液を減圧下で蒸発乾燥させる。残留物をシリカゲ ルクロマトグラフィー精製する。得られる２−メチルスルホニル−２′−デオキ シ−アデノシンを、上記実施例１０７および１０８のような一時的方法によって ベンゾイル化する。このようにして製造されるＮ６−ベンゾイル−２′　−デオ キシ−２−メチルスルホニルアデノシンは、２位で置換されている種々の２′− デオキシアデノシンおよび２′　−デオキシグアノシンの製造のための出発物質 として使用される。ＤＭＦ中のＮ６−ペンゾイルー２′−デオキシ−２−メチル スルホニルアデノシンの溶液を、アセトニトリル中の（Ｎｌ、Ｎｌ、Ｎ２−トリ メトキンカルボニル−Ｎ２−メチルカルバモイルエタノール）エチレンジアミン のナトリウム塩の溶液で処理する。この溶液を３０分間１００℃に加熱し、減圧 下で蒸発乾燥させる。残留物の再結晶により、２位にエチレンジアミン誘導体を もつＮ６−ペンゾイルー２′−デオキシアデノシンを得る。この物質を、上記実 施例１０７および１０８の手順によって、その５’　−ＤＭＴ−３’　−ｂ−シ アノエチルホスホアミダイト誘導体に変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法により ５ＬＯ−配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は。
ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ 　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧにこでａは、２°　−デオキシ −２’　−（Ｎｌ、Ｎｌ、Ｎ２−トリメトキシカルボニル−Ｎ２−メチルカルバ モイルエトキシ）エチレンジアミンアデノシンである］であろう。
実施例１６３ 特定位置に２“　−デオキシ−２’　−（９−［３−クロロ−６−メドキシアク リジニルコーアミノーｎ−ペンチルアミノ）アデノシンを含む５Ｌ〇配列５’　 −ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３’　の合成を行すう。Ｎ６−ペン ゾイルー２′−デオキシ−２−メチルスルホニルアデノシン、エチルジイソプロ ピルアミン、９−［３−クロロ−６−メドキシアクリジニル］アミノ−ｎ−ペン チルアミン、およびＤＭＦの溶液を、３０分間１００℃に加熱し、減圧下で蒸発 乾燥させる。残留物の再結晶により、２−位にアミノアクリジン誘導体をもつＮ ６−ペンゾイルー２′−ドキシーアデノシンを得る。この物質を、上記実施例１ ０７および１０８の手順によってその５’　−ＤＭＴ−３’　−β−シアノエチ ルホスホアミダイト誘導体に変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法によって５Ｌ〇 −配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は： ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ Ｇａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧ［ここでａは２゛　−デオキシ−２−’ （９−［３−クロロ−６−メドキシアクリジニル］アミノ−ｎ−ペンチルアミノ ）アデノシンであるコであろう。
実施例１６４ 特定位置に２−ジメチルアミノ−トリス（エチルアミノ）アデノシンを含む５Ｌ Ｏ配列５°−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３’　の合成を記載する 。Ｎ６−ベンゾイル−２′　−チオキシ−２−メチルスルホニルアデノシン、エ チルジイソプロピルアミン、２−ジメチルアミノ−トリス（エチルアミン、およ びＤＭＦの溶液を３０分間１００℃に加熱し、減圧下で蒸発乾燥させる。残留物 の再結晶により、２−位にポリアミン誘導体をもつＮ６−ベンゾイル−２゛　− ドキンアデノシンを得る。この物質を、上記実施例１０７および１０８の手順に よりその５”　−ＤＭＴ−３’　−β−シアンエチルジイソプロビルホスホアミ ダイト誘導体に変え、これを自動面相ＤＮＡ合成法によって５ＬＯ−配列５’　 −ＧＡＡＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ、ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は： ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ 　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ、ａＣＧにこでａは、２−ジメチルアミ ノートリス（エチルアミノ）アデニンである］であろう。
実施例１６５ 特定位置に２−（メトキシビスエトキシエチルアミノ）アデニンを含む５ＬＯ配 列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３’　の合成を記載する。
Ｎ６−ペンゾイルー２°−デオキシ−２−メチルスルホニルアデノシン、エチル ジイソプロピルアミン、メトキシビスエトキシエチルアミン、およびＤＭＦの溶 液を、３０分間１００℃に加熱し、減圧下で蒸発乾燥させる。残留物の再結晶に より、２−位にエチレングリコール誘導体をもつＮ６−ベンゾイル−２゛　−ド キシアデノシンを得る。この物質を、上記実施例１０７および１０８の手順によ ってその５’　−ＤＭＴ−３’　−β−シアノエチルホスホアミダイト誘導体に 変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法により５ＬＯ配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡ ＣＴＧＧＡ　ＡＣ’Ｇ中に挿入する。
合成される変更配列は： ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　、ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣ ＧＧａＡ’　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　Ａ ＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡ、ＣＴ　ＧＧＡ　 ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　 ＡＣＧ　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧにこでａは、２−（メト キシビスエトキシエチルアミノ）アデニンである］であろう。
実施例１６６ 特定位置に２−オクタノキシアデニンを含む５ＬＯ配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣ ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３’　の合成を記載する。Ｎ６−ベンゾイル−２°　 −チオキシ−２−メチルスルホニルアデノシン、エチルジイソプロピルアミン、 オクタノイルアミン、およびＤＭＦの溶液を３０分間１００℃に加熱し、減圧下 で蒸発乾燥させる。残留物の再結晶により、２−位に炭素鎖を有するＮ６−ペン ゾイルー２°−デオキシアデノシンを得る。この物質を上記実施例１０７および １０８の手順によってその５°−ＤＭＴ−３’　−β−シアンエチルジイソプロ ビルホスホアミダイト誘導体に変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法により５ＬＯ −配列５°−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する。
合成される変更配列は ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　、ＡＣ Ｇ　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ’　ａＣＧ（ここでａは、２−オクタ ノイルアミノアデニンである）であろう。
実施例１６７ 特定位置に２゛−デオキシ−６′−（イミダゾール−４−イル−エトキン）炭素 環グアノシンを含む５ＬＯ配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ −３°の合成を記載する。２°　−デオキシ−３’　、５’　−ジーＯ−ベンジ ルー６′−ａ−ヒドロキシ−Ｎ６−メドキンエトキシ炭素環グアノシン〔ジャー ナル・オン・ケミカル・ソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｓ。
ｃｉｅｔｙ）、ケミカル・コミューケーションズ（Ｃｈｅｍｉ　ｃａＩ　Ｃｏｍ ｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロンドン、第１０８３−１０８４ページ（１９８７ ）］の溶液を一時（ｔｒａｎｓ　ｉ　ｔｅｎｔ）法（ピリジン、クロロトリメチ ルシラン、次に塩化イソブトリル、次にメタノール／アンモニアによってイソブ トリル化する。この物質を室温で３時間、２−（１−ベンゾイルイミダゾール− ４−イル）エタノール、トリフェニルホスフィン／ＤＥＡＤ、およびアセトニト リルと反応させる。溶液を減圧下で蒸発乾燥させる。残留物をエタノールから再 結晶させて生成物を得て、これをパラジウム／木炭、水素、および塩酸で脱ベン ジル化および脱ブロックして、２“−デオキシ−６“−α−（イミダゾール−４ −イル−エトキシ）−Ｎ２−インブトリル炭素環グアノシンを得る。この物質を 上記実施例１０７および１０８の手順により、その５°　−ＤＭＴ−３”　−β −シアノエチルホスホアミダイト誘導体に変え、これを自動固相ＤＮＡ合成法に より５ＬＯ−配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ中に挿入する 。
合成される変更配列は・ ｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇＧＡ　ＡＣｇ ｇＡＡ　ｇＴＣＡ、ＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ｇＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇｇＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ＧｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧｇＡ　ＡＣ ＧＧＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　およびｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ｇｇ Ａ　ＡＣｇ［ここでｇは２゛−デオキシ−６′−（イミダゾール−４−イル−エ トキシ）炭素環グアノシンである］であろう。
実施例１６８ ２′　−デオキシ−６゛−α−（Ｎｌ、Ｎｌ、Ｎ２−）リントキシ力ルポニルー Ｎ２−メチルカルバモイルエトキシ）エチレンジアミン）炭素環グアノシンを特 定部位に含有する５ＬＯ配列である５°−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ Ｇ−３′　の合成を記載する。２′デオキシ−３’、５’　−ジーＯ−ベンジル −６゜−α−ヒドロキシ−Ｎ６−メドキシーエトキシ炭素環グアノシン、Ｊｏｕ ｒｎａｌ　ｏｆＣｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、　Ｃｈｅ＋＊１ｃａｌ　Ｃ ｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｌｏｎｄｏｎ、　ｐｐ　１０８３−１０８４i１ ９８７）、をビ リジン／クロロトリメチルシラン、次いでイソブトリルクロライド次いでメタノ ール／アンモニアの一時法にてイソブトリル化する。精製物質をＮｌ、Ｎｌ、Ｎ ２−トリメトキシカルボニル−Ｎ２−メチルカルバモイルエトキシ）エチレンジ アミンジフェニルジアジン、およびアセトニトリルと室温で３時間反応させる。
溶液を減圧下で蒸発乾燥させる。残渣はエタノールから再結晶され、生成した製 品をパラジウム／木炭、水素、および塩酸で脱ベンジル化および脱保護し２′− デオキシ−６′−α−（Ｎｌ、Ｎｌ、Ｎ２−トリメトキシカルボニル−Ｎ２−メ チルカルバモイルエトキシ）エチレンジアミン）−Ｎ２−イソブトリル炭素環グ アノシンを提供する。生成した物質は、上記実施例１０７および１０８の手順で ５’　−ＤＭＴ−３’　−β−シアノエチルフォスホアミダイト誘導体に転換さ れ、こｈは５Ｌｏ−配列５°　−ＧＡ、Ａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧに自 動化面［ＩＮＡ合成を通じて挿入された。合成された修飾配列は：ｇＡ、Ａ　Ｇ ＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ、ＡＣｇｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇＧＡ　ＡＣｇｇＡＡ　ｇ ＴＣ，ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣｇＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ｇｇＡ　ＡＣＧＧＡＡ　 ｇＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧｇＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　 ＧＴＣＡＣＴ　ＧｇＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ｇＴＣＡ、ＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　およ びｇＡＡ　ｇＴＣＡＣＴ　ｇｇＡ、ＡＣｇここでｇは２゛−デオキシ−６′−α −（Ｎｌ、Ｎ１．Ｎ２−）リントキンカルポニルーＮ２−メチルカルバモイルエ トキシエチレンンアミン）炭素環グアノノンである。
実施例１６９ ２°−デオキシ−２′−（イミダゾ−４−イル）エトキン−α−Ｄ−アデノシン を特定部位に含有する５Ｌ〇配列である５“　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ ＡＣＧ−３°の合成を行った。Ｎ６−ベンゾイル−α−アデノシンの３′、５゜ −位置は同時に１．３．−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシ ロキサンで常法に従って保護される。核酸化学、改良された、ならびに新しい合 成手順、方法および技術、第三部、２２９頁（１９８６）。２゛−ヒドロキシ基 はミツノブ法に従いトリフェニルホスフィン／ＤＥＡＤで（１−ベンゾイルイミ ダゾール−４−イル）エタノールと結合される。合成１　（１９８１）。精製産 物は弗化テトラブチルアンモニウムでシリル脱保護され、生成したヌクレオシド は５’　−ＤＭＴ−３°　−β−ンノアーエチルホスホアミダイト誘導体へ上記 実施例１０７および１０８の手順に従って転換され、これは５Ｌ０−配列５°− ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧに自動化固相ＤＮＡ合成を通じて挿入さ れる。
合成された修飾配列は： ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａ、Ａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣ ＧＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ＧＧＡＡ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　Ａ ＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　Ａ ＣＧ　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａ、ＣＧここでａは２′−デオキ シ−２′（イミダゾ−４−イル）エトキシ−α−Ｄ−アデノシンである。
実施例１７０ ２°　−デオキシ−２’　−（Ｎ１．Ｎ１．Ｎ２−トリメトキシカルボニル−Ｎ ２−メチルカルバモイルエトキシエチレンジアミン）−α−Ｄ−アデノンンを特 定部位に含有する５Ｌ〇配列である５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　Ａ ＣＧ−３′の合成を行った。ミツノブの手順にしたがって、Ｎ６−ベンゾイル− ３′。
５°−（１，１，３，３−テトライソプロビルジシロキサニル）−２’−）リフ ルオロメチルスルホニル−９−（７−α−Ｄアラビノフラッジ）アデニン溶液を （Ｎ１．Ｎ１．Ｎ２−トリメトキシ　カルボニル−Ｎ２−メチルカル）（モイル エタノール）エチレンジアミンに結合させる。この物質は上記実施例１０７およ び１０８の手順でフッ化物イオンで脱保護される。生成した物質は５’　−ＤＭ Ｔ−３”　−β−シアノエチルジイソプロピルフオスホアミダイト誘導体に転換 され、これは５ＬＯ−配列５°　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧに自 動化固相ＤＮＡ合成を通じて挿入された。
合成された修飾配列は： ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ 　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧここでａは２°　−デオキシ− ２’　−（Ｎｌ、Ｎ１．Ｎ２−）リントキシカルボニルーＮ２−メチルカルバモ イルエトキシエチレンジアミン）−α−Ｄ−アデノシンである。
実施例１７１ ２“　−デオキシ−２’　−（９−［３−クロロ−６−メドキシアクリジニル］ アミノ−ｎ−ペンチルオキシ−α−Ｄ−エリスロベントフラノシル）アデニンを 特定部位に含有する５Ｌ〇配列である５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　 ＡＣＧ−３′　の合成を行った。ミツノブの手順にしたがって、Ｎ６−ペンゾイ ル−３゛、５’　−（１，１，３，３−テトライソプロビルジシロキサニル）− ２′　−トリフルオロメチルスルホニル−９−（β−Ｄアラビノフラッジ）アデ ニン溶液をクロロ−６−メドキシアクリジニルー９−アミノ−ｎ−ペンタノール に結合させる。
ジシリル保護基はフッ化物イオンで除去され、生成した物質は上記実施例１０７ および１０８の手順により５’　−ＤＭＴ−３′　−β−シアノエチルジイソプ ロビルフォスホアミダイト誘導体に転換され、これは５Ｌ〇−配列５’　−ＧＡ ＡＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧに自動化固相ＤＮＡ合成を通じて挿入された。
合成された修飾配列は： ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａ、ＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ ＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣ Ｇ　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧここでａは２°−デオキシ− ２’　−（９−［３−クロロ−６−メドキシアクリジニル］アミノーローペンチ ルオキシ）アデノシンである。
実施例１７２ ２゛　−デオキシ−２°−［ジメチルアミノ−ビス（エチルアミノ）エトキシコ ーα−Ｄ−アデノンンを特定部位に含有する５Ｌ〇配列である５’　−ＧＡＡＧ ＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３’　の合成を行った。ミツノブの手順にしたが って、Ｎ６−ペンゾイルー３″、５’　−（１，１，３，３−テトライソプロビ ルジシロキサニル）−２’−トリフルオロメチルスルホニル−９−（−β−Ｄ− アラビノフラッジ）アデニン溶液をジメチル−アミノ−ビス（エチルアミノ）エ タノール］に結合させる。ジシリル保護基はフッ化物イオンで除去され、生成し た物質は上記実施例１０７および１０８の手順により５’　−ＤＭＴ−３’　− β−シアノエチルフォスホアミダイト誘導体に転換され、これは５ＬＯ−配列５ ゛−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧに自動化固相ＤＮＡ合成を通じて挿 入された。
成された修飾配列は。
ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧ ＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　’ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　Ａ、 ＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　Ａ ＣＧ　およびＧａａ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧａ　ａＣＧここでａは２′−デオキシ −２′−［ジメチルアミノ−ビス（エチルアミノ）−エトキシ］−α−Ｄ−アデ ノシンである。
実施例１７３ １′−（イミダゾ−４−イル）エトキンメチルアデノシンを特定部位に含有する ５ＬＯ配列である５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３°の合成 ヲ行った。ビスコフラニン、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ、４４．ｐ 、１２２　（１９７５）は、Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔらの編集（ＩＲＬ出版、ワシント ン、罠、１９８５）によるオリゴヌクレオチド合成−一実際的手引き（Ａ　Ｐｒ ａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）のなかでＲ，Ａ、Ｊｏｎｅｓ　により説明 されているように、一時的な手順を通じてＮ６−ベンゾイル化され、引き続き３ ’　、５’　−水酸基は同時に１，３．−ジクロロ−１，１，３，３−テトライ ソプロピルジシロキサンで常法に従って保護される。核酸化学、改良され、およ び新しい合成手順、方法および技術、第三部、２２９頁（１９８６）。１°　− ヒドロキシメチル基はピリジン中のトリフェニルメチルクロライドで処理され１ 級アルコールの保護を生じる。２′−脱酸素はＭ、Ｊ、　Ｒｏｂｊｎｓらにより Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、Ｖｏｌ、１０５．ｐ４０５９　（１９８３）に 説明されているように行なわれる。生成した２゛　−デオキシヌクレオシドは希 釈されたトリフルオロ酢酸で選択的に脱トリチル化される。１′　−ヒドロキシ メチル基はミツノブ反応条件を通して１−（ベンゾイル−イミダゾ−４−イル） エタノールに結合される。シリル保護基の除去および引き続き生成したヌクレオ シドの５’　−ＤＭＴへの転換および実施例１０７および１０８の手順に従った ３′−シアノエチルジイソプロピルホスフィツトは５ＬＯ−配列５゛−ＧＡＡ　 ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧに自動化固相ＤＮＡ合成を通じて挿入するに適す る単量体を産するであろう。合成された修飾配列は：ＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　Ｇ ＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣａＣＴ　Ｇ ＧＡ　ａＣＧＧＡＡ　ＧＴＣａＣＴ　ＧＧＡ、ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　 ＧＧＡ　ａＣＧＧａＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　 ＧＧａ　ＡＣＧＧＡａ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　およびＧａａ　ＧＴＣ ａＣＴ　ＧＧａ、ａＣＧここでａは１゛−（イミダゾ−４−イル）エトキシメチ ルアデノシンである。
実施例１７４ ４゛−（イミダゾ−４−イル）エトキンメチルチミンを特定部位に含有する５Ｌ Ｏ配列である５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ−３’　の合成を 行った。４′−ヒドロキシメチルチミジン、Ｊ、　Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏ ｌ。
４．４ｐ、１３０９　（１９７９）はＴＩＰＳ基で選択的に４゛５′保護され次 いでその３’−ＴＨＰ誘導体に転換される。この物質はフッ化物イオンでシリル 脱保護を行い、引き続き選択的に５°　−トリチル化される。３゛−ヒドロキシ 基はミツノブ反応条件を通して２−（１−ベンゾイル　イミダゾ−４−イル）エ タノールに結合される。この物質を酸で処理しトリチルおよびＴＨＰ基を除去し 、引き続き上記実施例１０７および１０８のように５’−ＤＭＴおよび３′−ｂ −シアノミトキシジイソプロピルホスホアノダイト基に転換する。この物質を５ ＬＯ配列５’　−ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＧに自動化、固相ＤＮＡ 合成を通じて挿入する。合成された修飾配列は。
ＧＡＡ　ＧｔＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧＧＡＡ　ＧＴＣＡＣｔ　ＧＧＡ　ＡＣＧ 　およびＧＡＡ　ＧｔＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧここでｔ＝４’　−（イミダゾ −４−イル）エトキシメチルチミンとなるであろう。
要約書 ＲＮＡおよびＤＮＡの活性を変調する組成物および方法が開示されている。好適 な態様によれば、アンチセンス組成物は、標的設定部および反応性部分を含み調 製される。択一的にホスホジエステル結合の開裂、主鎖の糖結合の開裂または塩 基修飾を通して作用する反応性部分が好適に採用される。オリゴヌクレオチドの 薬力学的および薬物動態特性を改善する基も本発明の特定の態様に従って有効で ある。組成物と標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションで形成される小溝中に反応 性または非反応性官能基を導入することも好適に達成される。治療、診断および 研究方法も開示される。このような目的のために有用なオリゴヌクレオチドおよ びオリゴヌクレオチド類似体の作成に関して、合成ヌクレオシドおよびヌクレオ シド断片も提供される。
手続補正書 平成４年８月１７日 特許庁長官　麻　生　渡　殿　ｂ利 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９１１００２４３ ２、発明の名称 ＲＮＡ活性および遺伝子発現を検出および変調するための組成物および方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　アイシス・ファーマシューテイカルス・インコーホレーテッド ４、代　理　人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル２０６区 ５、補正の対象 １１表千５−５０２０３１　（４９） （別紙） １、特許請求の範囲を次のとおりに補正する。
「１９式２．３．　４．　５．　６および７：ここでＧおよびＫは独立にＣまた はＮでありＪはＮまたはＣＲ３であり； ＲＩはｏＨまたはＮＨ２であり： Ｒ２およびＲ３はＨ，ＮＨ２，低級アルキル、置換低級アルキル、低級アルケニ ル、アラルキル、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、置換アルキルアミノ、複 素環アルキル、複素環−アルキルアミノ、アミノアルキルアミノ、ヘトロアルキ ルアミン、ポリ−アルキルアミノ、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレオチドの薬物 動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基 ； Ｒ４およびＲ５はＨｌｏＨ，ＮＨ２、低級アルキル、置換低級アルキル、置換ア ミノ、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基、また はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基； Ｒ６およびＲ７はＨ，ＯＨ，ＮＨ２、ＳＨ，ハロゲン、ＣＯＮＨ２、Ｃ（ＮＨ） ＮＨ２、Ｃ（０）Ｏ−アルキル、ＣＳ　Ｎ　Ｈ２、ＣＮ、Ｃ（ＮＨ）ＮＨＯＨ， 低級アルキル、置換低級アルキル、置換アミノ、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレ オチドの薬物動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性 を改良する基； Ｘは糖または糖類似体であり、ここで該糖類似体はＲＮＡ開裂部分、オリゴヌク レオチドの薬力学的特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態特 性を改良する基からなる少なくともひとつの置換基で置換された糖であり；該化 合物が式２で表され、ならびにＧがＮおよびＪがＮの時はＸは少なくともひとつ の基がＦまたは○ＣＨｓ以外の基で置換された該糖類似体部分であり； さらに該化合物が式２で表され、ならびにＧがＮおよびＪがＣＲ３およびＲ３が Ｈの時はＸは該糖類似体部分であり； さらに該化合物が式４で表される時、ならびにＧがＮおよびＸが該糖類似体部分 である時、Ｒ２はＨではなく； さらに該化合物が式６で表され、ならびにＲ６がＨおよびＲ２がＮＨ２およびＲ ７がＣＯＮＨ２、ＣＳ　Ｎ　Ｈ２、Ｃ（０）Ｏ−アルキノベＣ（ＮＨ）ＮＨ２ま たはＣ（ＮＨ）ＮＨＯＨである時、Ｘは該糖類似体部分であり； さらに該化合物が弐６で表され、ならびにＲ８がＨ，ＯＨまたはＳＨおよびＲ７ がＣ（○）Ｏ−アルキルまたはＣ（ＮＨ）ＮＨ２およびＲ２が−ＣＨ２ＣＮの時 、Ｘは該糖類似体部分てあり：そして さらに該化合物が式７で表され、Ｒ３がＨおよびＧがＣて表される時Ｘは該糖類 似体部分てあ２、Ｘが式； のうちのひとって表され、 ここでＱは○またはｃＨＲ＋＋； Ｒ８およびＲ９はＨ１低級アルキル、置換低級アルキル、ＲＮＡ開裂部位、オリ ゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬物 動態特性を改良する基；Ｒ１゜はＨ１○Ｈ１低級アルキル、置換低級アルキル、 Ｆ、Ｃｌ５Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３．０ＣＦ３、○ＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキ ル、ＳＯＭｅ。
ＳＯ２ＭｅＳＯＮＯ□、Ｎ　Ｏ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、０ＣＨ２Ｃ Ｈ＝ＣＨ２， ０ＣＨ＝ＣＨ２，０ＣＨ２ＣＣＨ，○ＣＣＨ，アラルキル、ヘテロアラルキル、 複素環アルキル、アミノアルキルアミノ、複素環アルキル、ポリアルキルアミノ 、置換シリル、ＲＮＡ開裂部位、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する 基、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基：および ＲＩＩはＨ，ＯＨ低級アルキル、置換低級アルキル、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌ クレオチドの薬物動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的 特性を改良する基； 成できる官能基からなる請求項１記載の化合物。
ここてＱはＯまたはＣＲ，□； Ｒ８およびＲ９はＨ１低級アルキル、置換低級アルキル、ＲＮＡ開裂部分、また はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基； Ｒ８゜はＨ，ＯＨ，低級アルキル、置換低級アルキル、Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、ＣＮ、 ＣＦｓ、０ＣＦ３゜ＯＣＮ、Ｏ−フルーｔ−ル、Ｓ−アルキル、Ｓ　ＯＭＥ。
ＳＯｚＭｅ、０ＮＯ２，ＮＯ２，Ｎｓ、ＮＨ２，ＮＨ−アルキル、○ＣＨ２ＣＨ ＝　ＣＨ２゜０ＣＨ＝ＣＨ２，０ＣＨ２ＣＣＨ，０ＣＣＨ，７ラルキル、ヘテロ アラルキル、ヘテロシクロアラルキル、ポリ−アルキルアミノ、置換シリル、Ｒ ＮＡ開裂部位、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基、またはオリゴ ヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基； Ｒ１，はＨ，ＯＨ，低級アルキル、置換低級アルキル、ＲＮＡ開裂部分、または オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基； Ｚは自然に存在する、または合成塩基部分；そして Ｚ＝アデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシン、ならびにＲ８およ びＲｏがＨの時、ＲＩｏはＦ、Ｃ１，、、Ｂ　ｒ、ＮＨ２，Ｎｓ、〇−ＣＨ３゜ ０−ＣＨ２ＣＨ３，○−アリルまたは○−ベンジルあって、その中の少なくとも ひとつの修飾ヌクレオチドが式； ％式％（５１） Ｒ８およびＲｏはＨ７低級アルキル、置換低級アルキル、ＲＮＡ開裂部分、また はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基； ＲＩＧはＨ，ＯＨ，低級アルキル、置換低級アルキル、Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、ＣＮ、 ＣＦ３．０ＣＦｓ。
○ＣＮ、○−アルキル、Ｓ−アルキル、ＳＯＭＥ。
ＳＯ２Ｍｅ、○Ｎ○２＋　ＮＯ２，Ｎ３．ＮＨ２，ＮＨ−アルキル、ＯＣＨ２Ｃ Ｈ＝　ＣＨ２、ＯＣＨ＝　ＣＨｚ、０ＣＨ２ＣＣＨ，ＯＣＣＨ，７ラルキｈ、ヘ テロアラルキル、ヘテロシクロ−アルキル、ポリ−アルキルアミノ、置換シリル 、ＲＮＡ開裂部位、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基、またはオ リゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基； Ｒｌ　ｌはＨ９低級アルキル、置換低級アルキル、ＲＮＡ開裂部分、またはオリ ゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基； Ｚは自然に存在する、または合成塩基部分。
そして もしＢがアデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシン、ならびにＲ８ およびＲ８がともにＨの時、Ｑは○であり、およびすべての糖結合基は非置換ホ スホジエステル結合であり、ならびに、もし該オリゴヌクレオチドが該修飾ヌク レオチドを唯一含有する場合にはＲ１０はＯＣＨ３またはＦではない、化合物。
９、ヌクレオチドの混合配列から成る化合物であって、その中の少なくともひと つの修飾ヌクレオチドが式２．　３．　４．　５．　６および７；によって表わ され、 ここでＧおよびＫは、独立に、ＣまたはＮ；ＪはＮまたはＣＲ２ＣＲ３、Ｒ１は ＯＨまたはＮＨ２゜ Ｒ２およびＲ５はＨＳＮＨ２、低級アルキル、置換低級アルキル、低級アルケニ ル、アラルキル、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、置換アルキルアミノ、複 素環アルキル、複素環−アルキルアミノ、アミノアルキルアミノ、ヘトロアルキ ルアミン、ポリ−アルキルアミノ、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレオチドの薬物 動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基 ； Ｒ４およびＲ５はＨＸＯＨ，、ＮＨ２、低級アルキル、置換低級アルキル、置換 アミノ、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基、ま たはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基； Ｒ６およびＲ７はＨ，ＯＨ，ＮＨ２、ＳＨ，ハロゲン、ＣＯＮＨ２，Ｃ（ＮＨ） ＮＨ２、Ｃ（０）○−アルキル、Ｃ３ＮＨ２，ＣＮ、Ｃ（ＮＨ）ＮＨＯＨ１低Ｏ Ｈルキル、置換低級アルキル、置換アミノ、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレオチ ドの薬物動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改 良する基。
？ｊ表平５−５０２０３１　（５２） Ｘは糖または糖雇似体であり、ここで該糖類似体はＲＮＡ開裂部分、オリゴヌク レオチドの薬力学的特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態特 性を改良する基からなる少なくともひとつの置換基で置換された糖であり；該化 合物が式２で表され、ならびにＧがＮおよびＪがＮの時はＸは少なくともひとつ の基がＦまたはＯＣＨ３以外の基で置換された該糖類似体部分てあり； さらに該化合物が式２で表され、ならびにＧがＮおよびＪがＣＲ３およびＲ３が Ｈの時はＸは該糖類似体部分てあり； さらに該化合物が式４で表される時、ならびにＧがＮおよびＸが該糖である時Ｒ ２はＨではなく　： さらに該化合物が弐６で表され、ならびにＲ６がＨおよびＲ２がＮＨ２およびＲ ７がＣＯＮＨ２゜Ｃ３ＮＨ２，Ｃ（○）Ｏ−アルキル、Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２または Ｃ（ＮＨ）ＮＨＯＨである時、Ｘは該糖類似体部分てあり； さらに該化合物が式６で表され、ならびにＲ６がＨ１○ＨまたはＳＨｌおよびＲ ７がＣ（○）０−アルキルまたはＣ（ＮＨ）ＮＨ２およびＲ２が−ＣＨ２ＣＮの 時、Ｘは該糖類似体部分であり；そして さらに該化合物が式７で表され、Ｒ３がＨおよびＧがＣで表される時、Ｘは該糖 類似体部分であり； さらにもし該オリゴヌクレオチドが該修飾ヌクレオチドを唯一含有し、ならびに 該修飾ヌクレオチドのＧ＝ＮおよびＪ　＝Ｎ、ならびにすべての糖結合基が非置 換ホスホジエステル結合である時、Ｘは２’−０ＣＨ３または２゛−Ｆを含有す る糖ＲＮＡの予め選択されたヌクレオチド配列と特別にハイブリダイズできる標 的設定部；および該ＲＮＡ中のホスホジエステル結合を開裂でＲＮＡの予め選択 されたヌクレオチド配列と特別にハイブリダイズできる標的設定部：および該Ｒ ＮＡと共有結合または開裂できる反応性ＲＮＡの予め選択されたヌクレオチド配 列と特別にハイブリダイズできる標的設定部；およびオリゴヌクレオチドの薬力 学的特性または薬物動態特性を改良できる部分、から成り、該化合惣は該ＲＮＡ および該化合物から形成されたハイブリッド構造の小溝部位中に該ＲＮＡ開裂部 分のズできるヌクレオチド塩基の配列を有し、および少なくともひとつの修飾さ れた２′−デオキシフラノシル部分を有する、ＲＮＡまたはＤＮＡの選置換アル キルアミノ、複素環アルキル、複素環アルキルアミノ、アミノアルキルアミノ、 ヘドロシクロアルキルアミノ、またはポリアルキルアミノ基またはＲＮＡ開裂部 分である式２により表される請求項１．２，９，１１．１２．１４または２以上 国際調査報告

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．式２，３，４，５，６および７： ▲数式、化学式、表等があります▼２▲数式、化学式、表等があります▼２▲数 式、化学式、表等があります▼４▲数式、化学式、表等があります▼５▲数式、 化学式、表等があります▼６▲数式、化学式、表等があります▼７のうちの一つ により表される組成物であって；ここでＧおよびＫは独立にＣまたはＮであり； ＪはＮまたはＣＲ３であり； Ｒ１はＯＨまたはＮＨ２であり； Ｒ２およびＲ３はＨ，ＮＨ２，低級アルキル、置換低級アルキル、低級アルケニ ル、アラルキル、アルキルアミノ，アラルキルアミノ、置換アルキルアミノ、複 素環アルキル、複素環−アルキルアミノ、アミノアルキルアミノ、ヘトロアルキ ルアミノ、ポリーアルキルアミノ、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレオチドの薬物 動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬方学的特性を改良する基 ；Ｒ４およびＲ５はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、低級アルキル、置換低級アルキル、置換 アミノ、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基、ま たはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基； Ｒ６およびＲ７はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ，ハロゲン、ＣＯＮＨ２，Ｃ（ＮＨ） ＮＨ２，Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＳＮＨ２，ＣＮ１Ｃ（ＮＨ）ＮＨＯＨ，低級 アルキル、置換低級アルキル、置換アミノ、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレオチ ドの薬物動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改 良する基；Ｘは糖または糖類似体であり、ここで該糖類似体はＲＮＡ開裂部分、 オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの 薬物動態特性を改良する基からなる少なくともひとつの置換基で置換された糖で あり； 該組成物が式２で表され、ならびにＧがＮおよびＪがＮの時はＸは少なくともひ とつの基がＦまたはＯＣＨ３以外の基で置換された該糖類似体部分であり； さらに該組成物が式２で表され、ならびにＧがＮおよびＪがＣＲ３およびＲ３が Ｈの時はＸは該糖類似体部分であり；さらに該組成物が式４で表される時、なら びにＧがＮおよびＸが該糖類似体部分である時、Ｒ２はＨではなく；さらに該組 成物が式６で表され、ならびにＲ６がＨおよびＲ２がＮＨ２およびＲ７がＣＯＮ Ｈ２，ＣＳＮＨ２，Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２またはＣ（ＮＨ） ＮＨＯＨである時、Ｘは該糖類似体部分であり； さらに該組成物が式６で表され、ならびにＲ６がＨ、ＯＨまたはＳＨおよびＲ７ がＣ（Ｏ）Ｏ−アルキルまたはＣ（ＮＨ）ＮＨ２よびＲ２が−ＣＨ２ＣＮの時、 Ｘは該糖類似体部分であり；そしてさらに該組成物が式７で表され、Ｒ３がＨお よびＧがＣで表される時Ｘは該糖類似体部分である、 組成物。 ２．Ｘが式； ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼のうちの ひとつで表され、 ここでＱはＯまたはＣＨＲ１１； Ｒ８およびＲ９はＨ、低級アルキル、置換低級アルキル、ＲＮＡ開裂部位、オリ ゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬物 動態特性を改良する基；Ｒ１０はＨ，ＯＨ，低級アルキル、置換低級アルキル、 Ｆ，Ｃｌ、Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキ ル、ＳＯＭｅ，ＳＯ２Ｍｅ，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ３，ＮＨ２，ＮＨ−アルキル 、ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２，ＯＣＨ＝ＣＨ２，ＯＣＨ２ＣＣＨ，ＯＣＣＨ，アラル キル、ヘテロアラルキル、複素環アルキル、アミノ−アルキルアミノ、複素環ア ルキル、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂部位、オリゴヌクレオチ ドの薬力学的特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改 良する基；およびＲ１１はＨ，ＯＨ低級アルキル、置換低級アルキル、ＲＮＡ開 裂部分、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレ オチドの薬力学的特性を改良する基；である請求項１記載の組成物。 ３．上記ＲＮＡ開裂部分が該ＲＮＡと反応する部分から成る請求項１記載の組成 物。 ４．上記反応部分がＲＮＡ中のホスホジエステル結合の加水分解を触媒できる塩 基性官能基から成る請求項３記載の組成物。 ５．上記反応部分が金属の配位錯体からなる請求項３記載の組成物。 ６．上記反応部分がＲＮＡのホスホジエステル結合の加水分解中に形成される遷 移状態を安定化できる部分から成る請求項３記載の組成物。 ７．上記部分が二つの空間部位を有する八面体配位錯体を提供することができる 請求項６記載の組成物。 ８．上記反応部分がＲＮＡ中のホスホジエステル結合の加水分解を触媒できる酸 性官能基から成る請求項３記載の組成物。 ９．上記反応部分が複素環から成る請求項３記載の組成物。 １０．上記複素環がテトラゾールまたはトリアゾールのいずれかである請求項９ 記載の組成物。 １１．上記ＲＮＡ開裂部分がイミダゾールから成る請求項３記載の組成物。 １２．上記反応部分がアルキル化官能基からなる組成物。 １３．上記アルキル化官能基が、ハロゲン化スルホニル、アジリジン、窒素マス タード組成物よびミハエル反応受容組成物から成群から選択される請求項１２記 載の組成物。 １４．上記反応部分がフリーラジカルを形成できる官能基からなる請求項３記載 の組成物。 １５．上記フリーラジカル官能基がキノン、ストレプトニグリン、ミトマイシン 、クマリン、および活性酸素生成試薬から成る群から選択される請求項１４記載 の組成物。 １６、上記ＲＮＡ開裂部分がさらに組成物を平衡するために上記反応部分に付く 連結部分から成る請求項１記載の組成物。 １７．上記ＲＮＡ開裂部分が複素環窒素から成る請求項１記載の組成物。 １８．上記ＲＮＡ開裂部分がイミダゾールから成る請求項１記載の組成物。 １９．請求項１記載の少なくともひとつの組成物から成るオリゴヌクレオチド類 似体。 ２０．請求項１記載の少なくともひとつの組成物を含むオリゴヌクレオチドから 成るＲＮＡ活性変調用組成物。 ２１．請求項２記載の少なくともひとつの組成物を含むオリゴヌクレオチドから 成るＲＮＡ活性変調用組成物。 ２２．少なくともひとつの式： ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼により表 される組成物であって、 ここでＱはＯまたはＣＲ１１； Ｒ８およびＲ９はＨ，低級アルキル、置換低級アルキル，ＲＮＡ開裂部分、また はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基；Ｒ１０はＨ，ＯＨ，低級ア ルキル、置換低級アルキル、Ｆ，ＣＬ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ ，Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＳＯＭＥ，ＳＯ２Ｍｅ，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ ３，ＮＨ２，ＮＨ−アルキル、ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２，ＯＣＨ＝ＣＨ２，ＯＣＨ ２ＣＣＨ，ＯＣＣＨ，アラルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクロアラルキル 、ポリーアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂部位、オリゴヌクレオチドの 薬力学的特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬物速度論的性質を改 良する基； Ｒ１１はＨ，ＯＨ，低級アルキル、置換低級アルキル、ＲＮＡ開裂部分、または オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基；Ｚは自然に存在する、または 合成塩基部分；そしてＺ＝アデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシ ン、ならびにＲ８およびＲ９がＨの時、Ｒ１０はＦ，ＣＩ．Ｂｒ，ＮＨ２，Ｎ３ ，０−ＣＨ３，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３，Ｏ−アリルまたはＯ−ベンジルではない、組 成物。 ２３．Ｚがピリミジニル−１またはプリニル−９部分である請求項２２記載の組 成物。 ２４．Ｚがヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基である請求項２２記載 の組成物。 ２５．Ｂがアデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシンまたは５−メチル シトシンである請求項２２記載の組成物。 ２６．混合配列されたオリゴヌクレオチドであって、その中に少なくともひとつ の修飾ヌクレオチドを有し、ここで該修飾ヌクレオチドが式；▲数式、化学式、 表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼のひとつで表わされ、ここ でＱがＯまたはＣＲ１１； Ｒ８およびＲ９はＨ，低級アルキル、置換低級アルキル、ＲＮＡ開裂部分、また はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基；Ｒ１０はＨ，ＯＨ，低級ア ルキル、置換低級アルキル、Ｆ，ＣＩ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＯＣＮ ，Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＳＯＭＥ，ＳＯ２Ｍｅ，ＯＮＯ２，ＮＯ２，Ｎ ３．ＮＨ２，ＮＨ−アルキル、ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２，ＯＣＨ＝ＣＨ２，ＯＣＨ ２ＣＣＨ，ＯＣＣＨ，アラルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクローアルキル 、ポリーアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂部位、オリゴヌクレオチドの 薬力学的特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良す る基； Ｒ１１はＨ，低級アルキル、置換低級アルキル、ＲＮＡ開裂部分、またはオリゴ ヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基；Ｚは自然に存在する、または合成塩 基部分；そしてＢがアデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシン、な らびにＲ８およびＲ９がともにＨの時、ＱはＯであり、およびすべての糖結合基 はホスホジエステル結合に非置換であり、ならびに該オリゴヌクレオチドが該修 飾ヌクレオチドを唯一含有する場合にはＲ１０はＯ−ＣＨ３またはＦではない、 混合配列オリゴヌクレオチド。 ２７．上記オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのホスホジエステル結合が ホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはアルキルホスフェイトで置換さ れている請求項２６記載のオリゴヌクレオチド。 ２８．上記オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのホスホジエステル結合が 実質的に非キラル、実質的に非一イオン性部分で置換されている請求項２６記載 のオリゴヌクレオチド。 ２９．混合配列されたオリゴヌクレオチドであって、その中に少なくともひとつ の修飾ヌクレオチドを有し、ここで該修飾ヌクレオチドが式２，３，４，５，６ および７； ▲数式、化学式、表等があります▼２▲数式、化学式、表等があります▼３▲数 式、化学式、表等があります▼４▲数式、化学式、表等があります▼５▲数式、 化学式、表等があります▼６▲数式、化学式、表等があります▼７のひとつによ って表わされ、 ここでＧおよびＫは、独立に、ＣまたはＮ；ＪはＮまたはＣＲ２ＣＲ３， Ｒ１はＯＨまたはＮＨ２； Ｒ２およびＲ３はＨ，ＮＨ２，低級アルキル、置換低級アルキル、低級アルケニ ル、アラルキル、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、置換アルキルアミノ、複 素環アルキル、複素環−アルキルアミノ、アミノアルキルアミノ、ヘトロアルキ ルアミノ、ポリーアルキルアミノ、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレオチドの薬物 動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基 ；Ｒ４およびＲ５はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、低級アルキル、置換低級アルキル、置換 アミノ、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基、ま たはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基； Ｒ６およびＲ７はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ，ハロゲン、ＣＯＮＨ２，Ｃ（ＮＨ） ＮＨ２，Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＳＮＨ２，ＣＮ，Ｃ（ＮＨ）ＮＨＯＨ，低級 アルキル、置換低級アルキル、置換アミノ、ＲＮＡ開裂部分、オリゴヌクレオチ ドの薬物動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改 良する基；Ｘは糖または糖類似体であり、ここで該糖類似体はＲＮＡ開裂部分、 オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの 薬物動態特性を改良する基からなる少なくともひとつの置換基で置換された糖で あり； 該組成物が式２で表され、ならびにＧがＮおよびＪがＮの時はＸは少なくともひ とつの基がＦまたはＯＣＨ３以外の基で置換された該糖類似体部分であり； さらに該組成物が式２で表され、ならびにＧがＮおよびＪがＣＲ３およびＲ３が Ｈの時はＸは該糖類似体部分であり；さらに該組成物が式４で表される時、なら びにＧがＮおよびＸが該糖である時Ｒ２はＨではなく； さらに該組成物が式６で表され、ならびにＲ６がＨおよびＲ２がＮＨ２およびＲ ７がＣＯＮＨ２，ＣＳＮＨ２，Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２または Ｃ（ＮＨ）ＮＨＯＨである時、Ｘは該糖類似体部分であり； さらに該組成物が式６で表され、ならびにＲ６がＨ、ＯＨまたはＳＨおよびＲ７ がＣ（Ｏ）Ｏ−アルキルまたはＣ（ＮＨ）ＮＨ２およびＲ２が−ＣＨ２ＣＮの時 、Ｘは該糖類似体部分であり；そしてさらに該組成物が式７で表され、Ｒ３がＨ およびＧがＣで表される時Ｘは該糖類似体部分であり； さらに該オリゴヌクレオチドが該修飾ヌクレオチドを唯一含有し、ならびに該修 飾ヌクレオチドのＧ＝ＮおよびＪ＝Ｎ、ならびにすべての糖結合基がホスホジエ ステル結合に非置換である時、Ｘは２′−ＯＣＨ３または２′−Ｆを含有する糖 または糖類似部分ではない、オリゴヌクレオチド。 ３０．上記オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の少なくともいくつかが ホスホロチオネート、メチルホスホネートまたはアルキルホスフェートである請 求項２９記載のオリゴヌクレオチド。 ３１．上記オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのホスホジエステル結合が 実質的に非キラル、実質的に非一イオン性部分で置換されている請求項２９記載 のオリゴヌクレオチド。 ３２．２′−置換ヌクレオシドの製造方法であって、ブロックされいない２′， ３′および５′水酸基を溶媒中の金属水素化物で処理し；そして 該処理されたヌクレオシドをハロゲン化アルキル、置換ハロゲン化アルキル、ハ ロゲン化アラルキルおよび複素環アルキルハライドから成る群から選択された非 活性化ハロゲン化合物と反応させる、工程から成る方法。 ３３．ＲＮＡの活性を変調する組成物であって、ＲＮＡの予め選択されたヌクレ オチド配列と特別にハイプリダイズできる標的設定部；および 該ＲＮＡ中のホスホジエステル結合を開裂できる部分、から成る組成物。 ３４．上記ＲＮＡおよび上記組成物から形成されたハイブリッド構造の小溝部位 中に該ＲＮＡ開裂部分を配置するに適した請求項３３に記載の組成物。 ３５．上記標的設定部が約３個から約５０個の塩基単位からなるオリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチド類似体である請求項３３記載の組成物。 ３６．上記標的設定部が約８個から約４０個の塩基単位からなるオリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチド類似体である請求項３３記載の組成物。 ３７．上記標的設定部が約１２個から約２５個の塩基単位からなるオリゴヌクレ オチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である請求項３３記載の組成物。 ３８．上記標的設定部がオリゴヌクレオチド類似体であって、ここでオリゴヌク レオチドの少なくともいくつかのホスホジエステル結合がホスホチオネート結合 によって置換された請求項３３記載の組成物。 ３９．上記標的設定部がオリゴヌクレオチド類似体であって、ここでオリゴヌク レオチドの少なくともいくつかのホスホジエステル結合が実質的に非キラル、実 質的に非一イオン性部分で置換された請求項３３記載の組成物。 ４０．上記ＲＮＡ開裂部分が該ＲＮＡと反応する部分から成る請求項３３記載の 組成物。 ４１．上記ＲＮＡ開裂部分がさらに組成物を平衡するために上記反応部分に付く 連結部分から成る請求項３３記載の組成物。 ４２．上記ＲＮＡ開裂部分がＲＮＡのホスホジエステル結合の加水分解を触媒す る塩基性官能基から成る請求項３３記載の組成物。 ４３．上記ＲＮＡ開裂部分が金属の配位錯体からなる請求項３３記載の組成物。 ４４．上記ＲＮＡ開裂部分がＲＮＡのホスホジエステル結合の加水分解中に形成 される遷移状態を安定化できる請求項３３記載の組成物。 ４５．上記ＲＮＡ開裂部分が二つの空間部位を有する八面体配位錯体を提供する ことができる請求項３３記載の組成物。 ４６．上記ＲＮＡ開裂部分がＲＮＡ中のホスホジエステル結合の加水分解を触媒 できる酸性官能基から成る請求項３３記載の組成物。 ４７．上記酸性官能基が複素環から成る請求項４６記載の組成物。 ４８．上記酸性官能基が複素環窒素である請求項４６記載の組成物。 ４９．上記複素環がテトラゾールまたはトリアゾールである請求項４７記載の組 成物。 ５０．上記ＲＮＡ開裂部分がアルキル化官能基からなる請求項３３記載の組成物 。 ５１．上記アルキル化官能基が、ハロゲン化スルホニル、アジリジン、窒素マス タード組成物およびミハエル反応受容組成物からなる群から選択される請求項３ ３記載の組成物。 ５２．上記ＲＮＡ開裂部分がフリーラジカルを形成できる官能基からなる請求項 ３３記載の組成物。 ５３．上記官能基がキノン、ストレプトニグリン、ミトマイシン、クマリン、お よび活性酸素生成試薬から成る群から選択される請求項５２記載の組成物。 ５４．ＲＮＡの活性を変調する組成物であって、ＲＮＡの予め選択されたヌクレ オチド配列と特別にハイブリダイズできる標的設定部；および 該ＲＮＡと共有結合または開裂できる反応性部分、から成り、該組成物は該ＲＮ Ａおよび該組成物から形成されたハイブリッド構造の小溝部位中に該ＲＮＡ開裂 部分を配置するに適した組成物。 ５５．上記反応性部分がアルキル化官能基からなる請求項５４記載の組成物。 ５６．上記アルキル化官能基が、ハロゲン化スルホニル、アジリジン、窒素マス タード組成物およびミハエル反応受容組成物からなる群から選択される請求項５ ５記載の組成物。 ５７．上記反応性部分がフリーラジカルを形成できる官能基からなる請求項５４ 記載の組成物。 ５８．上記官能基がキノン、ストレプトニグリン、ミトマイシン、クマリン、お よび活性酸素生成試薬から成る群から選択される請求項５７記載の組成物。 ５９．ＲＮＡの活性を変調する組成物であって、ＲＮＡの予め選択されたヌクレ オチド配列と特別にハイブリダイズできる標的設定部；および オリゴヌクレオチドの薬力学的特性または薬物動態特性を改良できる部分、 から成り、該組成物は該ＲＮＡおよび該組成物から形成されたハイブリッド構造 の小溝部位中に該ＲＮＡ開裂部分を配置するに適した組成物。 ６０．徴生物によるタンパク質の生産を変調する方法であって、該微生物をＲＮ Ａの予め選択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズできる標的設定 部；および 該ＲＮＡ中のホスホジエステル結合の開裂を触媒できる反応性部分、から成る組 成物と接触させることから成る方法。 ６１．上記組成物が上記ＲＮＡおよび該組成物から形成されたハイブリッド構造 の小溝部位中に該反応性部分を配置するに適した請求項６０に記載の方法。 ６２．上記標的設定部が約３個から約５０個の塩基単位からなるオリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチド類似体である請求項６０記載の方法。 ６３．上記標的設定部が約８個から約４０個の塩基単位からなるオリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチド類似体である請求項６０記載の方法。 ６４．上記標的設定部が約１２個から約２５個の塩基単位からなるオリゴヌクレ オチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である請求項６０記載の方法。 ６５．上記標的設定部がオリゴヌクレオチド類似体であって、ここでオリゴヌク レオチドの少なくともいくつかのホスホジエステル結合がホスホチオネート結合 によって置換された請求項６０記載の方法。 ６６．上記標的設定部がオリゴヌクレオチド類似体であって、ここでオリゴヌク レオチドの少なくともいくつかのホスホジエステル結合が実質的に非キラル、実 質的に非一イオン性部分で置換された請求項６０記載の方法。 ６７．上記反応性部分が上記ＲＮＡのホスホジエステル結合の加水分解を触媒で きる塩基性官能基から成る請求項６０記載の方法。 ６８．上記反応性部分が金属の配位錯体からなる請求項６０記載の方法。 ６９．上記反応性部分がＲＮＡのホスホジエステル結合の加水分解中に形成され る遷移状態を安定化できる部分から成る請求項６０記載の方法。 ７０．上記ＲＮＡ開裂部分が二つの空間部位を有する八面体配位錯体を提供する ことができる請求項６９記載の方法。 ７１．上記反応性部分がＲＮＡ中のホスホジェステル結合の加水分解を触媒でき る酸性官能基から成る請求項６０記載の方法。 ７２．上記酸性官能基が複素環から成る請求項７１記載の方法。 ７３．上記酸性官能基が複素環窒素である請求項７１記載の組成物。 ７４．上記複素環がテトラゾールまたはトリアゾールである請求項７３記載の組 成物。 ７５．上記反応性部分がアルキル化官能基からなる請求項６０記載の方法。 ７６．上記アルキル化官能基が、ハロゲン化スルホニル、アジリジン、窒素マス タードおよびミハエル反応受容部分なる群から選択される請求項７５記載の方法 。 ７７．上記反応性部分がフリーラジカルを形成できる官能基からなる請求項６０ 記載の方法。 ７８．上記官能基がキノン、ストレプトニグリン、ミトマイシン、クマリン、お よび活性酸素生成試薬から成る群から選択される請求項７７記載の方法。 ７９．徴生物によるタンパク質の生産を変調する方法であって、該微生物をＲＮ Ａの予め選択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズできる標的設定 部；および 該ＲＮＡを共有結合または開裂できる反応性部分、から成る組成物と接触させ、 該組成物は該ＲＮＡおよび該組成物から形成されたハイブリッド構造の小溝部位 中に該ＲＮＡ開裂部分を配置するに適した組成物である方法。 ８０．さらに上記ＲＮＡの上記ヌクレオチ配列を予め選択することから成る請求 項７９記載の方法。 ８１．タンパク質の所望しない生産により特徴付けられる疾患を有する動物の治 療方法であって、 ＲＮＡの予め選択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズできる標的 設定部；および 該ＲＮＡを共有結合または開裂できる反応性部分、から成る組成物と動物を接触 させることから成る方法。 ８２．タンパク質の所望しない生産により特徴付けられる疾患を有する動物の治 療方法であって、 ＲＮＡの予め選択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズできる標的 設定部；および 該ＲＮＡを共有結合または開裂できる反応性部分、から成る組成物と動物を接触 させることから成り、該組成物は該ＲＮＡおよび該組成物から形成されたハイブ リッド構造の小溝部位中に該ＲＮＡ開裂部分を配置するに適する方法。 ８３．ＲＮＡを含有すると疑われる試料中のＲＮＡの存在または非存在を検出す る方法であって、 ＲＮＡの予め選択されたヌクレオチド配列と特異的にハイプリダイズできる標的 設定部；および 該ＲＮＡを共有結合または開裂できる反応性部分、から成る組成物と試料を接触 させることから成り、該組成物は該ＲＮＡおよび該組成物から形成されたハイブ リッド構造の小溝部位中に該ＲＮＡ開裂部分を配置するに適し；そして該組成物 でＲＮＡの開裂を検出する方法。 ８４．選択された配列と特異的にハイブリダイズできるヌクレオチド塩基の配列 を有し、および少なくともひとつの修飾された２′−デオキシフラノシル部分を 有する、ＲＮＡまたはＤＮＡの選択配列の活性を変調するためのヌクレアーゼ耐 性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。 ８５．上記修飾がＨ，ＯＨ，ハロ、アジド、アミノ、置換アミノ、シアノ、ハロ メチル、イソシアネート、アルコキシル、チオアルコキシル、ハロ−アルコキシ ル、アルキルスルフィド、アルキルスルホネート、硝酸塩、アンモニウム、アリ ルオキシまたはアルケンオキシによる置換から成る請求項８４記載のオリゴヌク レオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。 ８６．上記修飾がＨ，ＯＨ，ハロ、アジド、アミノ、アリルオキシ、メトキシま たはアルキルによる置換から成る請求項８４記載のオリゴヌクレオチドまたはオ リゴヌクレオチド類似体。 ８７．約５個から約５０個のヌクレオチド塩基を有する請求項８４記載のオリゴ ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。 ８８．上記修飾が上記オリニ「ヌクレオチドの３′末端である請求項８４記載の オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。 ８９．少なくともひとつの糖結合基が炭素またはエーテル結合で交換された請求 項８４記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。 ９０．上記オリゴヌクレオチドの少なくともひとつのヌクレオチドが、５′−メ チレン基または４′−酸素が除虫された糖を有する請求項８４記載のオリゴヌク レオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。 ９１．少なくともいくつかの糖結合基がホスホロチオエート、メチルホスホネー トまたはりん酸塩アルキレートから成るようにさらに修飾された請求項８４記載 のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。 ９２．医薬的に受容し得るキャリアー中の請求項８４記載のオリゴヌクレオチド またはオリゴヌクレオチド類似体。 ９３．ＲＮＡまたはＤＮＡの上記選択された配列がＨＩＶゲノムの部分から成る 請求項８４記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。 ９４．ＲＮＡまたはＤＮＡの上記選択された配列はヘルペスウイルスゲノムの部 分から成る請求項８４記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似 体。 ９５．ＲＮＡまたはＤＮＡの上記選択された配列はパピローマウイルスゲノムの 部分から成る請求項８４記載のオリエゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド 類似体。 ９６．徴生物によるタンパク質の生産を変調する方法であって、徴生物と、該タ ンパク質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡの選択された配列に特異的にハイブリ ダイズするヌクレオチド塩基の配列を有し、および少なくともひとつの修飾され たヌクレオシド部分を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似 体とを接触させることから成る方法。 ９７．上記修飾ヌクレオシド部分が２′−修飾−２′デオキシリボフラノシル部 分である請求項９６記載の方法。 ９８．上記修飾がＨ，ＯＨ，ハロ、アジド、アミノ、置換アミノ、シアノ、ハロ メチル、イソシアネート、アルコキシル、チオアルコキシル、ハロ−アルコキシ ル、アルキルスルフィド、アルキルスルホネート、硝酸塩、アンモニウム、アリ ルオキシまたはアルケンオキシによる置換から成る請求項９６記載の方法。 ９９．上記修飾が水酸化物、ハロ、アジド、アミノ、メトキシ、アリルオキシ、 またはアルキル基の水素による置換から成る請求項９６記載の方法。 １００．上記オリゴヌクレオチドが約５個から約５０個のヌクレオチド塩基を有 する請求項９６記載の方法。 １０１．上記修飾が上記オリゴヌクレオチドの３′末端である請求項９６記載の 方法。 １０２．上記修飾されたオリゴヌクレオチドの少なくともひとつの糖結合基が炭 素またはエーテル結合に交換されている請求項９６に記載の方法。 １０３．上記オリゴヌクレオチドの少なくともひとつのヌクレオチドが５′メチ レン基または４′−酸素が除去された糖を有する請求項９６記載の方法。 １０４．上記オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかの糖結合が、ホスホロチ オエート、メチルホスホネートまたはりん酸塩アルキレートを含むように修飾さ れるようにさらに該オリゴヌクレオチドが修飾された請求項９６記載の方法。 １０５．上記オリゴヌクレオチドが医薬的に受容されるキャリアー中にある請求 項９６記載の方法。 １０６．ＲＮＡまたはＤＮＡの上記選択配列がＨＩＶゲノムの部分から成る請求 項９６記載の方法。 １０７．ＲＮＡまたはＤＮＡの上記選択配列がヘルペスウイルスゲノムの部分か ら成る請求項９６記載の方法。 １０８．ＲＮＡまたはＤＮＡの選択配列が乳頭腫ウイルスゲノムの部分から成る 請求項９６記載の方法。 １０９．タンパク質の所望しない生産により特徴付けられる疾患を有する生物の 治療方法であって、該生物を該タンパク質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡと特 異的にハイブリダイズする塩基配列を脅するヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチ ドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させ、ここで少なくともひとつのヌク レオシド部分が修飾されており、単独または医薬的に受容できるキャリアーと混 合されている方法。 １１０．上記修飾がＨ，ＯＨ，ハロ、アジド、アミノ、置換アミノ、シアノ、ハ ロメチル、イソシアネート、アルコキシル、チオアルコキシル、ハロ−アルコキ シル、アルキルスルフィド、アルキルスルホネート、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモ ニウム、アリルオキシまたはアルケンオキシによる置換から成る請求項１０９記 載の方法。 １１１．上記修飾がＨ，ＯＨ，ハロ、アジド、アミノ、メトキシ、アリルオキシ またはアルキルによる置換から成る請求項１０９記載の方法。 １１２．上記修飾ヌクレオシド部分が２′−修飾−２′−デオキシリボフラノシ ル部分である請求項１０９記載の方法。 １１３．該オリゴヌクレオチドが約５個から約５０個のヌクレオチド塩基を有す る請求項１０９記載の方法。 １１４．該修飾が該オリゴヌクレオチドの３′末端である請求項１０９記載の方 法。 １１５．少なくともひとつの該修飾オリゴヌクレオチドの糖結合基が炭素または エーテル結合に交換された請求項１０９記載の方法。 １１６．該オリゴヌクレオチドの少なくともひとつのヌクレオチドが５′−メチ レン基または４′−酸素が除去された糖を有する請求項１１５記載の方法。 １１７．上記修飾オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかの糖結合が、ホスホ ロチオエート、メチルホスホネートまたはりん酸塩アルキレートを含むように修 飾される請求項１０９記載の方法。 １１８．該オリゴヌクレオチドが医薬的に受容されるキャリアー中にある請求項 １０９記載の方法。 １１９．ＲＮＡまたはＤＮＡの上記配列がＨＩＶゲノムの部分から成る請求項１ ０９記載の方法。 １２０．ＲＮＡまたはＤＮＡの上記配列がヘルペスウイルスゲノムの部分から成 る請求項１０９記載の方法。 １２１．ＲＮＡまたはＤＮＡの上記配列が乳頭腫ウイルスゲノムの部分から成る 請求項１０９記載の方法。
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