AT407639B - Modifizierte oligonukleotide, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung als wirkstoffe zur herstellung von arzneimitteln - Google Patents

Description

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   Oligonukleotide bieten vielversprechende neue Ansätze vor allem zur Behandlung von viralen und Krebserkrankungen Ein limitierender Faktor bei ihrer Anwendung besteht darin, dass derartige Verbindungen als Polyanionen Membranen schlecht durchdringen und nur schwer den Wirkort erreichen können. Es gibt eine Reihe von Ansatzpunkten zur Lösung dieses Problems vor allem durch Herstellung entsprechender Konstrukte - etwa durch Einbindung in Liposomen, Kopplung an Polylysin oder Einbau in Virushüllen -, eine einfache Lösung ist bisher nicht gelungen. 



   Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Oligonukleotide, welche durch Anbringung geeigneter Reste, welche basische Gruppen tragen, in der Lage sind, über intramolekulare Ammoniumsalze Zwitterionen zu bilden. Derart veränderte Oligonukleotide verlieren nicht die Fähigkeit, sich mit dem passenden Gegenstrang zu paaren, und sind in ihrer durch CD-Schmelzpunkt ermittelbaren Stabilität den strukturell verwandten modifizierten Oligonukleotiden vom 2'-O-Ethyltyp überlegen. Für solche sich selbst neutralisierende Oligonukleotide kann im Vergleich zu natürlichen Oligonukleotiden sowohl eine höhere Nukleaseresistenz, als auch eine bessere Membrangängigkeit erwartet werden. 



   Dadurch werden wichtige Vorteile in der Antisense-Therapie erzielt. 



   Die erfindungsgemässen Oligonukleotide besitzen die allgemeine Formel 
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 in welcher n = 10 bis 50 ist, in welcher B für eine der natürlichen Nukleotidbasen mit der durch die jeweilige Anwendung bestimmten Abfolge steht, in welcher X = 0 oder S bedeutet, in welcher R = H oder eine basische   Aminoalkoxygruppe,   vorzugsweise mit einem Alkylenrest A in der Länge von 4-7 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise mit einer freien Aminogruppe, oder in einer mit Niederalkyl R' substituierten Aminogruppe in beliebiger Kombination bedeutet, wobei zumindest in einem der Oligonukleotidbausteine   R ungleich   H sein muss, und in welchen die basische Aminoalkoxygruppen in beliebigen Positionen, vorzugsweise am 3'-Ende stehen und in welcher in den Bereichen, in welchen R = H bedeutet, ein für Oligonukleotide typisches Gegenion G+ vorliegt. 



   Natürliche Nukleinsäuren sind Polyanionen, in welchen die Monomere - Zuckerbausteine mit Nukleobasen - über "Phosphatbrücken" miteinander verbunden sind. Diese sind als zweifache Ester der Orthophosphorsäure einfach geladen. 



   Die erfindungsgemässen Oligonukleotide werden vorzugsweise mit Hilfe eines DNA-Syntheseautomaten hergestellt. Sie werden dabei in der Regel als Ammoniumsalze erhalten. Je nach anschliessender Reinigungsmethode werden durch Umsalzung andere Ammoniumsalze, vorzugsweise niedere Trialkylammoniumsalze (z. B. HPLC-Reinigung), oder auch durch Einbringung eines Protons die freien Säuren erhalten. Da die Aminogruppen der unmittelbar an den Zuckern hängenden Reste -O-A-NHR' basisch sind, entstehen an den modifizierten Positionen durch Protonen- übertragung Zwitterionen. Gegenionen zu den Phosphatgruppen können darüber hinaus auch andere pharmazeutisch verträgliche Kationen, wie Natriumionen Na+, Kaliumionen K+ oder Calziumionen   Ca++/2   sein.

   Wenn auch die Oligonukleotide in diesen Fällen bei der Herstellung nicht zwingend Zwitterionen bilden, werden sie dennoch beim Einsatz in Arzneimitteln - weitgehend unabhängig vom Gegenion des eingesetzten Oligonukleotids - bei physiologischem pH-Wert protoniert. Die entstehenden Alkoxyammoniumgruppen sind somit in der Lage, mit den negativen Phosphatgruppen des eigenen Stranges zwitterionische Wechselwirkungen einzugehen. Beim Errei- 

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 chen der "antisense"-Zielsequenz können sich solche ionischen Wechselwirkungen auch zum Gegenstrang ausbilden, wodurch die Stabilität der Doppelstrangbildung, welche Voraussetzung zum therapeutischen "antisense"-Effekt ist, wesentlich verstärkt wird. 



   Beispiele :
Beispiel 1: Allgemeine Herstellungsvorschrift für die Oligonukleotide: Die Oligonukleotidsynthese erfolgt in einem DNA-Syntheseautomaten mit handelsüblichen Amiditreagentien für die Standardnukleotide nach den üblichen Herstellungsvorschriften. Die Kupplungsausbeuten werden durch Messung der Absorption der Detritylierungslösungen bestimmt. Von den modifizierten Nukleotidbausteinen wird eine 0,1 M Lösung in Acetonitril hergestellt, diese mit 100 - 200 mg Molekularsieb 4A versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Synthese der modifizierten Oligonukleotiden erfolgt im 0,2  -molaren Massstab nach einem Protokoll, das hinsichtlich der Förderungszeiten der Amiditlösungen auf 2,4 sec und der Kopplungszeiten auf 300 - 600 sec festgelegt wird.

   Nach Beendigung der Synthese und der Abspaltung vom Trägermaterial werden die Proben 8-12 Stunden bei 55  gehalten, dann wird die ammoniakalische Lösung in EppendorfGefässe transferiert und an der Speed-Vac bei Raumtemperatur bis fast zur Trockene eingedampft. 



  Der Rückstand wird noch zweimal mit je 1 ml Wasser aufgenommen, eingedampft und schliesslich in ca. 500  l Lösung einer Mikrofiltration unterzogen. Das Filtrat wird zur Trockene eingedampft, in 300  l Wasser aufgenommen und die Rohausbeute durch Messung der UV-Absorption bei 260 nm bestimmt. Die so erhaltene Oligonukleotidlösung kann schliesslich durch HPLC gereinigt werden, wobei entweder über eine Vorsäule (z. B. New-guard Rp-8) und eine anschliessende HPLC-Säule (z. B. Aquapore Rp 300) oder über eine Cartridge (z. B. Aquapore Octyl Prep 10) chromatographiert wird. 



   Der als Ausgangsprodukt für die Synthese der Oligonukleotide benötigte Aminoalkyl-modifizierte Baustein kann wie folgt hergestellt werden. 50 g Adenosin werden 20 Stunden bei 80 C im HV über Phosphorpentoxid getrocknet und durch Erwärmen in 200 ml wasserfreiem DMF teilweise gelöst. Die Suspension wird auf 0 C abgekühlt und mit 9 g gewaschenem Natriumhydrid 30 min deprotoniert. Es werden 60,5 g N-(6-iodhexyl)-trifluoressigsäureamid zugegeben und innerhalb einer Stunde auf 40 C erwärmt. Nach 5 Stunden wird die Reaktion abgebrochen und das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mehrmals mit Toluol koevaporiert, in Diethylether digeriert und nicht umgesetztes Edukt durch Vakuum-Flashchromatographie (5-20% Methanol in Dichlormethan) abgetrennt.

   Bei der anschliessenden chromato- 
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 nach bekannten Verfahren an der Adeninaminogruppe mit einer Phenoxyacetylgruppe und an 5'-0 mit einer Dimethoxytritylgruppe geschützt wird und durch Reaktion mit (2-Cyanethoxy)-N,N-diisopropylmonochlophophoramidit zum Baustein für die Oligonukleotidsynthese umgesetzt wird   Beispiel 2 : von basenmodifizierten Oligonukleotiden  
Die Circulardichroismus-Spektren wurden über einen Wellenlängenbereich von 320 - 210 nm bei 10 C und mit einer zweifachen Akkumulation aufgenommen. Die temperaturabhängige Ermittlung der Schmelzkurven erfolgte über einen Temperaturbereich von 0 -80 C mit einem Temperaturanstieg von 50 C/Stunde. Als Pufferlösung wurde 0,15M NaCI, 0,01M Tris, HCI pH 7,0 eingesetzt.

   Die Schmelzpunkte der Oligonukleotide wurden rechnerisch durch Bildung der ersten Ableitung von jener Kurve, die beim Auftragen der Elliptizitätsänderung des Maximums in Abhängigkeit von der Temperaturänderung erhalten wurde, ermittelt. 



   A* = Basenmodifiziertes Adenosin mit Aminohexylrest   A*A*A*A*A*A*A A A A A A   29.5 C   A A A A*A*A*A*A*A*A A A   31.7 C   A*A*A*A*A*A A A A A A A   30.7 C   A*A*A*A*AAAAAAAA   31.3 C
A*A*A*AAAAAAAAA 2.6 C
A*A*AAAAAAAAAA 3.5 C
A*AAAAAAAAAAA 35.7 C   zum Vergleich : = 18,5 , dA7 = 19,0 , dA8 = 22,2 , dA9 = 29,2 , dA10 = 31,3 ,    dA11  = 33,2 C   

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 zum Vergleich:   A(2'-O-Ethyl)     A(2'-O-Ethyl)   A(2'-O-Ethyl)   A(2'-O-Ethyl)     A(2'-O-Ethyl)   A(2'-OEthyl)
A A A A A A = 28,4 C. 



   PATENTANSPRÜCHE: 
1.   Oligonukleotride   der allgemeinen Formel 
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 in welcher n = 10 bis 50 ist, in welcher B für eine der natürlichen Nukleotidbasen mit der durch die jeweilige Anwendung bestimmten Abfolge steht, in welcher X = 0 oder S bedeu- tet, in welcher R = H oder eine basische Aminoalkoxygruppe, vorzugsweise mit einem
Alkylenrest A in der Länge von 4-7 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise mit einer freien
Aminogruppe, oder in einer mit Niederalkyl R' substituierten Aminogruppe in beliebiger
Kombination bedeutet, wobei zumindest in einem der Oligonukleotidbausteine R ungleich
H sein muss, und in welchen die basische Aminoalkoxygruppen in beliebigen Positionen, vorzugsweise am 3'-Ende stehen und in welcher in den Bereichen, in welchen R = H bedeutet, ein für Oligonukleotide typisches Gegenion G+ vorliegt. 



  2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, dadurch gekenn- zeichnet, dass mit einer abspaltbaren Schutzgruppe an der Aminoalkylgruppe versehene
Nukleotidbausteine in eine Oligonukleotidsynthese eingesetzt werden.

Claims (1)

1. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidsynthese eine Festphasensynthese nach dem Phophitamidverfahren ist, bei welcher je nach Wahl der Oxidationsbedingungen Phosphate oder Phophothioate erhalten werden können.

   4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine abspaltbare Schutzgruppe für die Aminoalkoxygruppe gewählt wird, welche selektiv und gegebenenfalls in einem Schritt mit den Aminoschutzgruppen an den Nukleinbasenresten abgespalten werden kann.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die abspaltbare Schutzgruppe für die Aminoalkoxygruppe eine Trifluoracetylgruppe ist.

   6. Verwendung der Oligonukleotide nach Anspruch 1 als Wirkstoffe zur Herstellung von Arz- neimitteln gegen virale und Krebserkrankungen.

   KEINE ZEICHNUNG