JPH05329000A - メシチリン耐性スタフィロコッカスを迅速に検出する方法 - Google Patents
メシチリン耐性スタフィロコッカスを迅速に検出する方法Info
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- JPH05329000A JPH05329000A JP4214968A JP21496892A JPH05329000A JP H05329000 A JPH05329000 A JP H05329000A JP 4214968 A JP4214968 A JP 4214968A JP 21496892 A JP21496892 A JP 21496892A JP H05329000 A JPH05329000 A JP H05329000A
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- aureus
- dna
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 スタフィロコッカスを含有する試料からスタ
フィロコッカスＤＮＡを迅速に放出させる方法、および
試料中のメシチリン耐性スタフィロコッカスの検出法で
あって、スタフィロコッカスｍｅｃＡ遺伝子のコード鎖
および非コード鎖に含まれるＤＮＡ配列を有するＧ＋Ｃ
含量の高いＤＮＡプライマーを用いてポリメラーゼ・チ
ェーン反応（ＰＣＲ）を行いＰＣＲ反応の生成物を分析
することからなる方法。 【効果】 ベータラクタム類全般について耐性を有する
スタフィロコッカスの迅速な検出法を与える。
フィロコッカスＤＮＡを迅速に放出させる方法、および
試料中のメシチリン耐性スタフィロコッカスの検出法で
あって、スタフィロコッカスｍｅｃＡ遺伝子のコード鎖
および非コード鎖に含まれるＤＮＡ配列を有するＧ＋Ｃ
含量の高いＤＮＡプライマーを用いてポリメラーゼ・チ
ェーン反応（ＰＣＲ）を行いＰＣＲ反応の生成物を分析
することからなる方法。 【効果】 ベータラクタム類全般について耐性を有する
スタフィロコッカスの迅速な検出法を与える。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、メシチリン耐性スタフ
ィロコッカスの迅速な検出法に関する。
ィロコッカスの迅速な検出法に関する。
【０００２】
【従来技術と発明が解決すべき課題】メシチリン耐性ス
タフィロコッカス（Staphylococcus；ブドウ球菌)感染
症は病院および老人ケアセンターにおける普遍的かつ重
大な問題である。メシチリン耐性スタフィロコッカス・
アウレウス（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）お
よびスタフィロコッカス・エピダーミディス（Staphylo
coccus epidermidis）（ＭＲＳＥ）の両者が一般的な院
内病原菌である。これらが引き起こす感染症は重篤で治
療困難である［ホランら（Horan） Morbid Mortal Week
ly Rep. 35:1755 (1984)]; マペルら（Mapel） Lancet
i:537 (1989)］。ほんの少しの抗生物質が利用可能であ
り、しかもこれらは望ましくない副作用を有する［ハッ
クバース（Hackbarth）およびチャンバーズ（Chamber
s） Antimicrob. Agents Chemother.33:995 (1989)］。
現在、ＭＲＳＡ／ＭＲＳＥの検出には、通常、時間がか
かり、労働力を要し、信頼性がやや欠ける方法が用いら
れている（前掲）。これらの方法はディスク拡散、ブロ
ス希釈および寒天スクリーニングを含む（前掲）。これ
らの方法は異種の耐性スタフィロコッカスの検出に信頼
性を欠いている。従って、迅速で、標準化された、正確
かつ感度の良いメシチリン耐性スタフィロコッカス検出
法の開発が絶対的に必要であった。
タフィロコッカス（Staphylococcus；ブドウ球菌)感染
症は病院および老人ケアセンターにおける普遍的かつ重
大な問題である。メシチリン耐性スタフィロコッカス・
アウレウス（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）お
よびスタフィロコッカス・エピダーミディス（Staphylo
coccus epidermidis）（ＭＲＳＥ）の両者が一般的な院
内病原菌である。これらが引き起こす感染症は重篤で治
療困難である［ホランら（Horan） Morbid Mortal Week
ly Rep. 35:1755 (1984)]; マペルら（Mapel） Lancet
i:537 (1989)］。ほんの少しの抗生物質が利用可能であ
り、しかもこれらは望ましくない副作用を有する［ハッ
クバース（Hackbarth）およびチャンバーズ（Chamber
s） Antimicrob. Agents Chemother.33:995 (1989)］。
現在、ＭＲＳＡ／ＭＲＳＥの検出には、通常、時間がか
かり、労働力を要し、信頼性がやや欠ける方法が用いら
れている（前掲）。これらの方法はディスク拡散、ブロ
ス希釈および寒天スクリーニングを含む（前掲）。これ
らの方法は異種の耐性スタフィロコッカスの検出に信頼
性を欠いている。従って、迅速で、標準化された、正確
かつ感度の良いメシチリン耐性スタフィロコッカス検出
法の開発が絶対的に必要であった。
【０００３】ＭＲＳＡ／ＭＲＳＥはペニシリン結合タン
パク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）をコードするｍｅｃＡ遺伝子
を有する。このタンパク質がスタフィロコッカスにおけ
るメシチリン耐性の表現的発現にあずかっている［チャ
ンバーズ（Chambers） Antimicrob. Agents Chemother.
33:424 (1989)：ハックバース（Hackbarth）およびチャ
ンバーズ（Chambers） Antimicrob. Agents Chemother.
33:991 (1989):トニン(Tonin)およびトマス(Tomasz) An
timicrob. Agents Chemother.30:577 (1986)］。メシチ
リン感受性スタフィロコッカス株はｍｅｃＡ遺伝子を持
たない。従ってｍｅｃＡ遺伝子はＭＲＳＡ／ＭＲＳＥの
迅速な検出における有用な分子手段である。ＤＮＡハイ
ブリッド形成によるｍｅｃＡの検出により、かなり感度
のよいＭＲＳＡ／ＭＲＳＥ株の同定法が得られている
［アーチャー（Archer)およびペネル(Pennell), Antimi
crob. Agents Chemother.34:1720 (1990):レンカスター
ら(Lencastre) Antimicrob. Agents Chemother.35:575
(1991)]。しかしながら、ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンには幾つかの欠点がある。多数の細胞が必要であり、
ＤＮＡの抽出、および膜への固定化は時間のかかる工程
であり、最近では非放射性標識プローブも利用可能であ
るが、しばしば放射性同位体が用いられる［リゴッジら
（Ligozzi) Antimicrob. Agents Chemother.35:575 (1
991)]。
パク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）をコードするｍｅｃＡ遺伝子
を有する。このタンパク質がスタフィロコッカスにおけ
るメシチリン耐性の表現的発現にあずかっている［チャ
ンバーズ（Chambers） Antimicrob. Agents Chemother.
33:424 (1989)：ハックバース（Hackbarth）およびチャ
ンバーズ（Chambers） Antimicrob. Agents Chemother.
33:991 (1989):トニン(Tonin)およびトマス(Tomasz) An
timicrob. Agents Chemother.30:577 (1986)］。メシチ
リン感受性スタフィロコッカス株はｍｅｃＡ遺伝子を持
たない。従ってｍｅｃＡ遺伝子はＭＲＳＡ／ＭＲＳＥの
迅速な検出における有用な分子手段である。ＤＮＡハイ
ブリッド形成によるｍｅｃＡの検出により、かなり感度
のよいＭＲＳＡ／ＭＲＳＥ株の同定法が得られている
［アーチャー（Archer)およびペネル(Pennell), Antimi
crob. Agents Chemother.34:1720 (1990):レンカスター
ら(Lencastre) Antimicrob. Agents Chemother.35:575
(1991)]。しかしながら、ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンには幾つかの欠点がある。多数の細胞が必要であり、
ＤＮＡの抽出、および膜への固定化は時間のかかる工程
であり、最近では非放射性標識プローブも利用可能であ
るが、しばしば放射性同位体が用いられる［リゴッジら
（Ligozzi) Antimicrob. Agents Chemother.35:575 (1
991)]。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明はメシチリン耐性
スタフィロコッカス感染症の検出方法であって、 ａ）スタフィロコッカス感染が疑われる臨床試料につい
てポリメラーゼ・チェーン反応を行い（ここに該ポリメ
ラーゼ・チェーン反応にはＧ＋Ｃ含量の高い２個のオリ
ゴヌクレオチドで構成されるＤＮＡプライマーであっ
て、１個のプライマーはスタフィロコッカスｍｅｃＡ遺
伝子のコード鎖に含まれるＤＮＡ配列を有し、他のプラ
イマーはスタフィロコッカスｍｅｃＡ遺伝子の非コード
鎖に含まれるＤＮＡ配列を有するものを用いる）、そし
て ｂ）工程ａ）の反応産物を分析することからなる方法を
提供するものである。
スタフィロコッカス感染症の検出方法であって、 ａ）スタフィロコッカス感染が疑われる臨床試料につい
てポリメラーゼ・チェーン反応を行い（ここに該ポリメ
ラーゼ・チェーン反応にはＧ＋Ｃ含量の高い２個のオリ
ゴヌクレオチドで構成されるＤＮＡプライマーであっ
て、１個のプライマーはスタフィロコッカスｍｅｃＡ遺
伝子のコード鎖に含まれるＤＮＡ配列を有し、他のプラ
イマーはスタフィロコッカスｍｅｃＡ遺伝子の非コード
鎖に含まれるＤＮＡ配列を有するものを用いる）、そし
て ｂ）工程ａ）の反応産物を分析することからなる方法を
提供するものである。
【０００５】本発明はまた、スタフィロコッカスからＤ
ＮＡを迅速に放出する方法であって、 ａ）スタフィロコッカスを含有する試料をリゾスタフ
ィン(lysostaphin)で処理し、 ｂ）工程ａ）で得られた試料をプロテイナーゼＫで処理
し、そして ｃ）工程ｂ）で得られた試料を沸騰水浴中でインキュベ
ーションすることからなる方法を提供する。 さらに本発明は興味ある試料中のメシチリン耐性スタフ
ィロコッカス感染を検出する方法であって、 ａ）該試料をリゾスタフィンで処理し、 ｂ）工程ａ）で得られた試料をプロテイナーゼＫで処理
し、 ｃ）工程ｂ）で得られた試料を沸騰水浴中でインキュベ
ーションし、 ｄ）工程ｃ）で得られた試料をポリメラーゼ・チェーン
反応に付し（ここに該ポリメラーゼ・チェーン反応には
Ｇ＋Ｃ含量の高い２個のオリゴヌクレオチドからなるＤ
ＮＡプライマーであって、１個のプライマーはスタフィ
ロコッカスｍｅｃＡ遺伝子のコード鎖に含まれるＤＮＡ
配列を有し、他のプライマーはスタフィロコッカスｍｅ
ｃＡ遺伝子の非コード鎖に含まれるＤＮＡ配列を有する
ものを用いる）、そして ｅ）工程ｄ）の反応産物を分析することからなる方法を
提供するものである。
ＮＡを迅速に放出する方法であって、 ａ）スタフィロコッカスを含有する試料をリゾスタフ
ィン(lysostaphin)で処理し、 ｂ）工程ａ）で得られた試料をプロテイナーゼＫで処理
し、そして ｃ）工程ｂ）で得られた試料を沸騰水浴中でインキュベ
ーションすることからなる方法を提供する。 さらに本発明は興味ある試料中のメシチリン耐性スタフ
ィロコッカス感染を検出する方法であって、 ａ）該試料をリゾスタフィンで処理し、 ｂ）工程ａ）で得られた試料をプロテイナーゼＫで処理
し、 ｃ）工程ｂ）で得られた試料を沸騰水浴中でインキュベ
ーションし、 ｄ）工程ｃ）で得られた試料をポリメラーゼ・チェーン
反応に付し（ここに該ポリメラーゼ・チェーン反応には
Ｇ＋Ｃ含量の高い２個のオリゴヌクレオチドからなるＤ
ＮＡプライマーであって、１個のプライマーはスタフィ
ロコッカスｍｅｃＡ遺伝子のコード鎖に含まれるＤＮＡ
配列を有し、他のプライマーはスタフィロコッカスｍｅ
ｃＡ遺伝子の非コード鎖に含まれるＤＮＡ配列を有する
ものを用いる）、そして ｅ）工程ｄ）の反応産物を分析することからなる方法を
提供するものである。
【０００６】本発明の目的のために以下のとおり語句を
定義する。 高Ｇ＋Ｃ含量：スタフィロコッカスｍｅｃＡ遺伝子の平
均のＧ＋Ｃ含量３０.５％よりも有意に高いこと。ｍｅｃＡ 遺伝子：メシチリン耐性に寄与する、ペニシリ
ン結合タンパク質２Ａをコードする遺伝子。 メシチリン耐性スタフィロコッカス：セファロスポリン
類およびメシチリンおよびオキサシリン等のペニシリン
誘導体を含むベータラクタム類全般に耐性であるスタフ
ィロコッカス。 ＰＢＰ２Ａ：ペニシリン結合タンパク質２Ａ。
定義する。 高Ｇ＋Ｃ含量：スタフィロコッカスｍｅｃＡ遺伝子の平
均のＧ＋Ｃ含量３０.５％よりも有意に高いこと。ｍｅｃＡ 遺伝子：メシチリン耐性に寄与する、ペニシリ
ン結合タンパク質２Ａをコードする遺伝子。 メシチリン耐性スタフィロコッカス：セファロスポリン
類およびメシチリンおよびオキサシリン等のペニシリン
誘導体を含むベータラクタム類全般に耐性であるスタフ
ィロコッカス。 ＰＢＰ２Ａ：ペニシリン結合タンパク質２Ａ。
【０００７】本発明はメシチリン耐性スタフィロコッカ
ス感染症の検出方法であって、 ａ）スタフィロコッカス感染が疑われる臨床試料につい
てポリメラーゼ・チェーン反応を行い（ここに該ポリメ
ラーゼ・チェーン反応にはＧ＋Ｃ含量の高い２個のオリ
ゴヌクレオチドで構成されるＤＮＡプライマーであっ
て、１個のプライマーはスタフィロコッカスｍｅｃＡ遺
伝子のコード鎖に含まれるＤＮＡ配列を有し、他のプラ
イマーはスタフィロコッカスｍｅｃＡ遺伝子の非コード
鎖に含まれるＤＮＡ配列を有するものを用いる）、そし
て ｂ）工程ａ）の反応産物を分析することからなる方法を
提供するものである。
ス感染症の検出方法であって、 ａ）スタフィロコッカス感染が疑われる臨床試料につい
てポリメラーゼ・チェーン反応を行い（ここに該ポリメ
ラーゼ・チェーン反応にはＧ＋Ｃ含量の高い２個のオリ
ゴヌクレオチドで構成されるＤＮＡプライマーであっ
て、１個のプライマーはスタフィロコッカスｍｅｃＡ遺
伝子のコード鎖に含まれるＤＮＡ配列を有し、他のプラ
イマーはスタフィロコッカスｍｅｃＡ遺伝子の非コード
鎖に含まれるＤＮＡ配列を有するものを用いる）、そし
て ｂ）工程ａ）の反応産物を分析することからなる方法を
提供するものである。
【０００８】ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）は
微量のＤＮＡを増幅する方法として当業者に周知の方法
である（例えば米国特許第４，６８３，１９５号、４，
８００，１９５号および４，６８３，２０２号参照）。
この方法は既に、臨床面で様々な異なる病原体の検出に
用いられている［例えばらカッソル(Cassol), J.Cln.Mi
crobiol. 29:667-671 (1991); ロペツら(Lopez), J.Cl
n.Microbiol. 29:578-582 (1991); ブリッソン−ノエル
ら(Brisson-Noel) Lancet ii: 1069-1071(1989); バレ
ンチンら(Valentine, J.Cln.Microbiol. 29:689-695 (1
991); およびグーベら(Gouvea), J.Cln.Microbiol. 29:
529-523 (1991)参照］。この方法はスタフィロコッカス
・アウレウスの毒素を検出するのに用いられたが、本発
明以前にメシチリン耐性スタフィロコッカスの検出に適
用されたことはなかった。
微量のＤＮＡを増幅する方法として当業者に周知の方法
である（例えば米国特許第４，６８３，１９５号、４，
８００，１９５号および４，６８３，２０２号参照）。
この方法は既に、臨床面で様々な異なる病原体の検出に
用いられている［例えばらカッソル(Cassol), J.Cln.Mi
crobiol. 29:667-671 (1991); ロペツら(Lopez), J.Cl
n.Microbiol. 29:578-582 (1991); ブリッソン−ノエル
ら(Brisson-Noel) Lancet ii: 1069-1071(1989); バレ
ンチンら(Valentine, J.Cln.Microbiol. 29:689-695 (1
991); およびグーベら(Gouvea), J.Cln.Microbiol. 29:
529-523 (1991)参照］。この方法はスタフィロコッカス
・アウレウスの毒素を検出するのに用いられたが、本発
明以前にメシチリン耐性スタフィロコッカスの検出に適
用されたことはなかった。
【０００９】ベータラクタム耐性スタフィロコッカス、
特にスタフィロコッカス・アウレウスおよびスタフィロ
コッカス・エピデルミディスは医者にとって重要で確実
に増大している問題である。これらの細菌がもたらし得
る死の速度を鑑みて、患者内に存在する微生物がベータ
ラクタムに関与しないものであるかどうかを迅速に確認
することは利益である。本発明はＤＮＡハイブリッド形
成に基づく方法リゴッジら（Ligozzi)［Antimicrob. Ag
ents Chemother.35:575 (1991)]およびアーチャー（Arc
her)およびペネル(Pennell)［Antimicrob. Agents Chem
other.34:1720(1990)］をも含めて従来法［ハックバー
ス（Hackbarth）およびチャンバーズ（Chambers） Anti
microb. Agents Chemother.33:995 (1989)］よりも有意
に迅速に行うことが出来る方法を提供する。ＰＣＲによ
って得られて極めて高度の感受性は本発明の他の重要な
側面である。メシチリン耐性スタフィロコッカスはしば
しが種々混合の耐性をもつ。即ち、ＤＮＡに基づかない
耐性決定では一致した結果を得られないことがある。
特にスタフィロコッカス・アウレウスおよびスタフィロ
コッカス・エピデルミディスは医者にとって重要で確実
に増大している問題である。これらの細菌がもたらし得
る死の速度を鑑みて、患者内に存在する微生物がベータ
ラクタムに関与しないものであるかどうかを迅速に確認
することは利益である。本発明はＤＮＡハイブリッド形
成に基づく方法リゴッジら（Ligozzi)［Antimicrob. Ag
ents Chemother.35:575 (1991)]およびアーチャー（Arc
her)およびペネル(Pennell)［Antimicrob. Agents Chem
other.34:1720(1990)］をも含めて従来法［ハックバー
ス（Hackbarth）およびチャンバーズ（Chambers） Anti
microb. Agents Chemother.33:995 (1989)］よりも有意
に迅速に行うことが出来る方法を提供する。ＰＣＲによ
って得られて極めて高度の感受性は本発明の他の重要な
側面である。メシチリン耐性スタフィロコッカスはしば
しが種々混合の耐性をもつ。即ち、ＤＮＡに基づかない
耐性決定では一致した結果を得られないことがある。
【００１０】ペニシリン結合タンパク質２Ａはベータラ
クタムとの低親和性によってメシチリン耐性を与える。
このタンパク質はｍｅｃＡ遺伝子によってコードされて
いる。本発明方法によればｍｅｃＡ遺伝子を有するあら
ゆるスタフィロコッカスを検出することができる。臨床
的に関連するスタフィロコッカス株はまずＳ.アウレウ
ス（S.aureus）およびＳ.エピデルミディス（S.epiderm
idis）であり、時にはＳ.ヘモリティカス（S.haemolyti
cs）である。まれに問題を起こす株は Ｓ.シムランス
（S.simulans）、Ｓ.カルノサス（ S.carnosus）および
Ｓ.サプロフィティカス（S.saprophyticus)である。単
離され、配列決定されたｍｅｃＡ遺伝子はすべて、極め
て高度に類似性（＞９９％）を有するので、１または２
組のプライマーを用いてあらゆるｍｅｃＡ含有株を検出
することができる。もしも、異なる供給源から単離さ
れ、ｍｅｃＡ遺伝子に変異を有することが分かっている
遺伝子領域からプライマーが調製されるときは、特異的
なプライミングを確保するために、少なくとも３０ヌク
レオチド長さのプライマーを用いるべきである。これら
の領域は式１：
クタムとの低親和性によってメシチリン耐性を与える。
このタンパク質はｍｅｃＡ遺伝子によってコードされて
いる。本発明方法によればｍｅｃＡ遺伝子を有するあら
ゆるスタフィロコッカスを検出することができる。臨床
的に関連するスタフィロコッカス株はまずＳ.アウレウ
ス（S.aureus）およびＳ.エピデルミディス（S.epiderm
idis）であり、時にはＳ.ヘモリティカス（S.haemolyti
cs）である。まれに問題を起こす株は Ｓ.シムランス
（S.simulans）、Ｓ.カルノサス（ S.carnosus）および
Ｓ.サプロフィティカス（S.saprophyticus)である。単
離され、配列決定されたｍｅｃＡ遺伝子はすべて、極め
て高度に類似性（＞９９％）を有するので、１または２
組のプライマーを用いてあらゆるｍｅｃＡ含有株を検出
することができる。もしも、異なる供給源から単離さ
れ、ｍｅｃＡ遺伝子に変異を有することが分かっている
遺伝子領域からプライマーが調製されるときは、特異的
なプライミングを確保するために、少なくとも３０ヌク
レオチド長さのプライマーを用いるべきである。これら
の領域は式１：
【化４】
【化５】
【化６】 のヌクレオチド６０５−６０７、６１５−６１７、６９
７−６９９、７４６−７４７、８４１、１０１０−１０
１１、１８１９、および１９３３に関連する。
７−６９９、７４６−７４７、８４１、１０１０−１０
１１、１８１９、および１９３３に関連する。
【００１１】既知のｍｅｃＡ遺伝子の平均のＧ＋Ｃ含量
は約３０.５％である。特異的なプライミングを確保す
るために、ＰＣＲに用いられるＤＮＡプライマーのＧ＋
Ｃ含量は３０.５％よりも有意に高い必要があり、好ま
しくは約５０％またはそれ以上である。ＤＮＡプライマ
ーの配列はいかなるｍｅｃＡ遺伝子から導かれたもので
あってもよい。これら遺伝子のいくつかの配列はソンら
（Song)［ＦＥＢＥＳLetters 221:167-171 (1987) (S.a
ureus TK784)］およびライフェルら（Ryffel)[ Gene 9
4:137-38 (1990) (S.aureus BB270 およびS.epidermidi
s WT55)］によって示された。さらに、Ｓ.aureus ２７
ＲｍｅｃＡ遺伝子から得たＤＮＡプライマーは上記の式
１によって示される。
は約３０.５％である。特異的なプライミングを確保す
るために、ＰＣＲに用いられるＤＮＡプライマーのＧ＋
Ｃ含量は３０.５％よりも有意に高い必要があり、好ま
しくは約５０％またはそれ以上である。ＤＮＡプライマ
ーの配列はいかなるｍｅｃＡ遺伝子から導かれたもので
あってもよい。これら遺伝子のいくつかの配列はソンら
（Song)［ＦＥＢＥＳLetters 221:167-171 (1987) (S.a
ureus TK784)］およびライフェルら（Ryffel)[ Gene 9
4:137-38 (1990) (S.aureus BB270 およびS.epidermidi
s WT55)］によって示された。さらに、Ｓ.aureus ２７
ＲｍｅｃＡ遺伝子から得たＤＮＡプライマーは上記の式
１によって示される。
【００１２】当業者ならば特定のプライマーの組み合わ
せにおいて、１個のオリゴヌクレオチドが遺伝子のコー
ド鎖から得られ、もう１個のオリゴヌクレオチドが非コ
ード鎖から得られるべきであることを知っているであろ
う。好ましいＤＮＡプライマーは上記の式１におけるヌ
クレオチド番号１４１−１６０に対応する配列、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド番号１９２９−
１９５２の逆相補配列である。プライマーは完全に保護
されたデオキシリボヌクレオチド構築ブロックを用いて
改良ホスホトリエステル法で合成することができる。そ
のような合成法は当業者に周知であって、実質上、文献
［Itakura et al. Science 198:1056 (1977); Crea et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5765 (1978); Hsi
ung et al.Nucl. Acid Res. 11: 3277 (1989)または Na
rang et al.Methods in Enzymology 68:90 (1980)］記
載の方法に従って行うことができる。特に好ましいのは
自動化ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems 380B DNA
synthsizer(850 Lincln Centre Drive, Foster City, C
A 94404）を用いる方法である。
せにおいて、１個のオリゴヌクレオチドが遺伝子のコー
ド鎖から得られ、もう１個のオリゴヌクレオチドが非コ
ード鎖から得られるべきであることを知っているであろ
う。好ましいＤＮＡプライマーは上記の式１におけるヌ
クレオチド番号１４１−１６０に対応する配列、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド番号１９２９−
１９５２の逆相補配列である。プライマーは完全に保護
されたデオキシリボヌクレオチド構築ブロックを用いて
改良ホスホトリエステル法で合成することができる。そ
のような合成法は当業者に周知であって、実質上、文献
［Itakura et al. Science 198:1056 (1977); Crea et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5765 (1978); Hsi
ung et al.Nucl. Acid Res. 11: 3277 (1989)または Na
rang et al.Methods in Enzymology 68:90 (1980)］記
載の方法に従って行うことができる。特に好ましいのは
自動化ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems 380B DNA
synthsizer(850 Lincln Centre Drive, Foster City, C
A 94404）を用いる方法である。
【００１３】ＰＣＲ反応のプロトコールは以下に記載さ
れている（ＰＣＲ Protocols: A Guide to Methods and
Applications, ed. Michael A., Innis et al., Acade
micPress, Inc., 1990）。特に好ましいプロトコールは
本明細書の実施例に記載されている。反応の結果は所望
の任意の方法で分析することができる。好ましい方法は
アガロースゲル電気泳動である。さらにｍｅｃＡ遺伝子
と反応するスタフィロコッカスの存在を「nested ＰＣ
Ｒ」で確認することが望ましい。この方法では因果関係
のある２つのＰＣＲを行う。第２のＰＣＲをプライムす
るのに用いるオリゴヌクレオチドは最初のプライマーの
基礎となるＤＮＡ配列の内部（内側）のｍｅｃＡ遺伝子
のＤＮＡ配列から導かれる必要がある。第２のＰＣＲに
とって好ましいＤＮＡプライマーはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１のヌクレオチド番号５６８−５９３に対応する配
列、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド番号
１６４７−１６７０の逆相補（inverse complement)配
列である。
れている（ＰＣＲ Protocols: A Guide to Methods and
Applications, ed. Michael A., Innis et al., Acade
micPress, Inc., 1990）。特に好ましいプロトコールは
本明細書の実施例に記載されている。反応の結果は所望
の任意の方法で分析することができる。好ましい方法は
アガロースゲル電気泳動である。さらにｍｅｃＡ遺伝子
と反応するスタフィロコッカスの存在を「nested ＰＣ
Ｒ」で確認することが望ましい。この方法では因果関係
のある２つのＰＣＲを行う。第２のＰＣＲをプライムす
るのに用いるオリゴヌクレオチドは最初のプライマーの
基礎となるＤＮＡ配列の内部（内側）のｍｅｃＡ遺伝子
のＤＮＡ配列から導かれる必要がある。第２のＰＣＲに
とって好ましいＤＮＡプライマーはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１のヌクレオチド番号５６８−５９３に対応する配
列、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド番号
１６４７−１６７０の逆相補（inverse complement)配
列である。
【００１４】本発明はまた、スタフィロコッカスからの
ＤＮＡの迅速な放出方法であって、 ａ）該試料をリゾスタフィンで処理し、 ｂ）工程ａ）で得られた試料をプロテイナーゼＫで処理
し、そして ｃ）工程ｂ）で得られた試料を沸騰水浴中でインキュベ
ーションし、 ｄ）工程ｃ）で得られた試料をポリメラーゼ・チェーン
反応に付し（ここに該ポリメラーゼ・チェーン反応には
Ｇ＋Ｃ含量の高い２個のオリゴヌクレオチドからなるＤ
ＮＡプライマーであって、１個のプライマーはスタフィ
ロコッカスｍｅｃＡ遺伝子のコード鎖に含まれるＤＮＡ
配列を有し、他のプライマーはスタフィロコッカスｍｅ
ｃＡ遺伝子の非コード鎖に含まれるＤＮＡ配列を有する
ものを用いる）、そして ｅ）工程ｄ）の反応産物を分析することからなる方法を
提供するものである。 本発明方法は従来のスタフィロコッカスＤＮＡの抽出法
よりもはるかに迅速な方法である。迅速な放出方法の好
ましい態様の概略は実施例に記載されている。この方法
は本発明のメシチリン耐性スタフィロコッカス検出法と
組み合わせると特に有用である。したがって本発明は目
的の(興味ある)試料中のメシチリン耐性スタフィロコッ
カス感染を検出する方法であって、 ａ）該試料をリゾスタフィンで処理し、 ｂ）工程ａ）で得られた試料をプロテイナーゼＫで処理
し、そして ｃ）工程ｂ）で得られた試料を沸騰水浴中でインキュベ
ーションすることからなる方法を提供するものである。
本発明方法は従来のスタフィロコッカスＤＮＡの抽出法
よりもはるかに迅速な方法である。迅速な放出方法の好
ましい態様の概略は実施例に記載されている。この方法
は本発明のメシチリン耐性スタフィロコッカス検出法と
組み合わせると特に有用である。したがって本発明は興
味ある試料中のメシチリン耐性スタフィロコッカス感染
を検出する方法であって ａ）該試料をリゾスタフィンで処理し、 ｂ）工程ａ）で得られた試料をプロテイナーゼＫで処理
し、 ｃ）工程ｂ）で得られた試料を沸騰水浴中でインキュベ
ーションし、 ｄ）工程ｃ）で得られた試料をポリメラーゼ・チェーン
反応に付し（ここに該ポリメラーゼ・チェーン反応には
Ｇ＋Ｃ含量の高い２個のオリゴヌクレオチドからなるＤ
ＮＡプライマーであって、１個のプライマーはスタフィ
ロコッカスｍｅｃＡ遺伝子のコード鎖を構成するＤＮＡ
配列を有し、他のプライマーはスタフィロコッカスｍｅ
ｃＡ遺伝子の非コード鎖を構成するＤＮＡ配列を有する
ものを用いる）、 ｅ）工程ｄ）の反応産物を分析することからなる方法を
提供するものである。
ＤＮＡの迅速な放出方法であって、 ａ）該試料をリゾスタフィンで処理し、 ｂ）工程ａ）で得られた試料をプロテイナーゼＫで処理
し、そして ｃ）工程ｂ）で得られた試料を沸騰水浴中でインキュベ
ーションし、 ｄ）工程ｃ）で得られた試料をポリメラーゼ・チェーン
反応に付し（ここに該ポリメラーゼ・チェーン反応には
Ｇ＋Ｃ含量の高い２個のオリゴヌクレオチドからなるＤ
ＮＡプライマーであって、１個のプライマーはスタフィ
ロコッカスｍｅｃＡ遺伝子のコード鎖に含まれるＤＮＡ
配列を有し、他のプライマーはスタフィロコッカスｍｅ
ｃＡ遺伝子の非コード鎖に含まれるＤＮＡ配列を有する
ものを用いる）、そして ｅ）工程ｄ）の反応産物を分析することからなる方法を
提供するものである。 本発明方法は従来のスタフィロコッカスＤＮＡの抽出法
よりもはるかに迅速な方法である。迅速な放出方法の好
ましい態様の概略は実施例に記載されている。この方法
は本発明のメシチリン耐性スタフィロコッカス検出法と
組み合わせると特に有用である。したがって本発明は目
的の(興味ある)試料中のメシチリン耐性スタフィロコッ
カス感染を検出する方法であって、 ａ）該試料をリゾスタフィンで処理し、 ｂ）工程ａ）で得られた試料をプロテイナーゼＫで処理
し、そして ｃ）工程ｂ）で得られた試料を沸騰水浴中でインキュベ
ーションすることからなる方法を提供するものである。
本発明方法は従来のスタフィロコッカスＤＮＡの抽出法
よりもはるかに迅速な方法である。迅速な放出方法の好
ましい態様の概略は実施例に記載されている。この方法
は本発明のメシチリン耐性スタフィロコッカス検出法と
組み合わせると特に有用である。したがって本発明は興
味ある試料中のメシチリン耐性スタフィロコッカス感染
を検出する方法であって ａ）該試料をリゾスタフィンで処理し、 ｂ）工程ａ）で得られた試料をプロテイナーゼＫで処理
し、 ｃ）工程ｂ）で得られた試料を沸騰水浴中でインキュベ
ーションし、 ｄ）工程ｃ）で得られた試料をポリメラーゼ・チェーン
反応に付し（ここに該ポリメラーゼ・チェーン反応には
Ｇ＋Ｃ含量の高い２個のオリゴヌクレオチドからなるＤ
ＮＡプライマーであって、１個のプライマーはスタフィ
ロコッカスｍｅｃＡ遺伝子のコード鎖を構成するＤＮＡ
配列を有し、他のプライマーはスタフィロコッカスｍｅ
ｃＡ遺伝子の非コード鎖を構成するＤＮＡ配列を有する
ものを用いる）、 ｅ）工程ｄ）の反応産物を分析することからなる方法を
提供するものである。
【００１５】この方法は上記の迅速なＤＮＡ放出方法と
メシチリン耐性スタフィロコッカスｍｅｃＡ遺伝子の検
出法との組み合わせを表す。これらの２つの方法につい
て述べた様々な考察は、これらを組み合わせた場合にも
同じく適用し得る。本発明方法によるメシチリン耐性ス
タフィロコッカスの検出には３時間を要するにすぎな
い。これに対して、迅速な放出ＤＮＡ抽出法でなく、従
来のＤＮＡ抽出法を用いれば６時間を要する。どれほど
であれ余分な追加の時間は、メシチリン耐性スタフィロ
コッカス感染症のような生死にかかわる状態において重
大である。本発明の迅速性と感度により、高価格、毒性
因子および耐性の拡大等の不利な点を伴う経験的な抗生
物質治療を避けることができる。
メシチリン耐性スタフィロコッカスｍｅｃＡ遺伝子の検
出法との組み合わせを表す。これらの２つの方法につい
て述べた様々な考察は、これらを組み合わせた場合にも
同じく適用し得る。本発明方法によるメシチリン耐性ス
タフィロコッカスの検出には３時間を要するにすぎな
い。これに対して、迅速な放出ＤＮＡ抽出法でなく、従
来のＤＮＡ抽出法を用いれば６時間を要する。どれほど
であれ余分な追加の時間は、メシチリン耐性スタフィロ
コッカス感染症のような生死にかかわる状態において重
大である。本発明の迅速性と感度により、高価格、毒性
因子および耐性の拡大等の不利な点を伴う経験的な抗生
物質治療を避けることができる。
【００１６】本発明方法は血液、尿、髄液、および膿瘍
から得た液等、任意の体内液中のメシチリン耐性スタフ
ィロコッカスの検出に用いることができる。所望によ
り、試料を培養し増殖培地から得た細菌試料についてＰ
ＣＲを行っても良い。体液へのＰＣＲの利用は当業者に
既知である［例、カッソルら(Cassol), J.Cln.Microbio
l. 29:667-671 (1991); ロペツら(Lopez), J.Cln.Micro
biol. 29:578-582 (1991); ブリッソンノエルら(Brisso
n-Noel) Lancet ii: 1069-1071(1989)参照］。
から得た液等、任意の体内液中のメシチリン耐性スタフ
ィロコッカスの検出に用いることができる。所望によ
り、試料を培養し増殖培地から得た細菌試料についてＰ
ＣＲを行っても良い。体液へのＰＣＲの利用は当業者に
既知である［例、カッソルら(Cassol), J.Cln.Microbio
l. 29:667-671 (1991); ロペツら(Lopez), J.Cln.Micro
biol. 29:578-582 (1991); ブリッソンノエルら(Brisso
n-Noel) Lancet ii: 1069-1071(1989)参照］。
【００１７】
【実施例】以下に実施例を挙げ本発明を説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。実施例１ 様々な臨床状況で単離された合計７０のスタフィロコッ
カス株（３３のＳ.aureusと３７のS.epidermidis）を試
験した。種の同定はStaph-identTM Diagnostic Kit (A
nalytab, Sherwood Medical, Plainview, NY)を用いて
行った。ＰＣＲの結果の評価のために、全試料を４％塩
化ナトリウムと６μｇ／mlオキサシリンとを補充したMu
eller-Hinton agar (Difco,Detroit,MI)培地で培養し、
メシチリン耐性に関してスクリーニングした。接種した
プレートを３５℃で２４時間インキュベーションし、増
殖の存在を試験した。この方法でＳ.aureusは３３中１
６が、S.epidermidisは３７中２７がメシチリン耐性に
分類された。
れらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。実施例１ 様々な臨床状況で単離された合計７０のスタフィロコッ
カス株（３３のＳ.aureusと３７のS.epidermidis）を試
験した。種の同定はStaph-identTM Diagnostic Kit (A
nalytab, Sherwood Medical, Plainview, NY)を用いて
行った。ＰＣＲの結果の評価のために、全試料を４％塩
化ナトリウムと６μｇ／mlオキサシリンとを補充したMu
eller-Hinton agar (Difco,Detroit,MI)培地で培養し、
メシチリン耐性に関してスクリーニングした。接種した
プレートを３５℃で２４時間インキュベーションし、増
殖の存在を試験した。この方法でＳ.aureusは３３中１
６が、S.epidermidisは３７中２７がメシチリン耐性に
分類された。
【００１８】実施例２ 上記の実施例１でメシチリン耐性について試験した各株
を以下の方法で試験した。ＴＹ寒天プレート（１白金
耳）またはＴＹブロス培地（１０8細菌／mlに希釈した
一夜培養物１ml）から細菌を収穫した。ブロス培地から
の細胞は微量遠心機（マイクロセントリヒュージ）で３
０秒間遠心して収穫した。いずれかの供給源からの細胞
をリゾスタフィン溶液（水中１００μｇ／ml、Sigma Ch
emical Co., St.Louis, MO)５０μlに再懸濁した。細胞
懸濁液を37℃でインキュベーションした。１０分後、プ
ロテイナーゼＫ溶液５０μl（水中１００μｇ／ml、Sig
ma）と０.１ＭＴris(pＨ７.５）１５０μlを加えた。細
胞懸濁液をさらに３７℃で２０分間インキュベーション
し、沸騰水浴に１０分間保持した。この処理でＳ.aureu
sまたはS.epidermidisが効果的に溶解され、ＤＮase活
性が阻止された。これら細胞溶解液からの１０μlを直
接ＰＣＲ法に用いた。
を以下の方法で試験した。ＴＹ寒天プレート（１白金
耳）またはＴＹブロス培地（１０8細菌／mlに希釈した
一夜培養物１ml）から細菌を収穫した。ブロス培地から
の細胞は微量遠心機（マイクロセントリヒュージ）で３
０秒間遠心して収穫した。いずれかの供給源からの細胞
をリゾスタフィン溶液（水中１００μｇ／ml、Sigma Ch
emical Co., St.Louis, MO)５０μlに再懸濁した。細胞
懸濁液を37℃でインキュベーションした。１０分後、プ
ロテイナーゼＫ溶液５０μl（水中１００μｇ／ml、Sig
ma）と０.１ＭＴris(pＨ７.５）１５０μlを加えた。細
胞懸濁液をさらに３７℃で２０分間インキュベーション
し、沸騰水浴に１０分間保持した。この処理でＳ.aureu
sまたはS.epidermidisが効果的に溶解され、ＤＮase活
性が阻止された。これら細胞溶解液からの１０μlを直
接ＰＣＲ法に用いた。
【００１９】実施例３ ｍｅｃＡ オープンリーディングフレーム内の１.８ｋｂ
によって分離された２個のプライマーをＰＣＲ（ポリメ
ラーゼ・チェーン反応）のために選択した。２個のプラ
イマーの配列は以下の通りである。 ５’−ＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧＧ−
３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド１４１−
１６０）および ５’−ＣＣＡＣＣＣＡＡＴＴＴＧＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴ
ＴＣＴＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオ
チド１９２９−１９５２の逆相補配列） ＰＣＲは、Gene Amp Kit を用い、DNA Thermal Cycler
(Perkin Elmer Cetus,Norwalk, CT)により、業者の指示
にしたがって行った。ＤＮＡ増幅には以下のパラメータ
ーを含む温度工程プログラムを用いた。変性：９４℃で
３０秒間、アニーリング：５５℃で３０秒間、プライマ
ー伸長：７２℃で２分間、合計３０サイクル。ＰＣＲ溶
液１０μlを０.８％アガロースゲル電気泳動にかけて分
析した。１.８ｋｂの増幅されたＤＮＡ断片の存在は陽
性の結果を示唆する。全体として、７０個のスタフィロ
コッカス株の内６９がＰＣＲおよびオキサシリン感受性
試験でまったく同じ結果を与えた。ただ１個の例外につ
いて試験し、それが迅速に増殖するメシチリン感受性株
（ｍｅｃＡ- ）と遅く増殖するメシチリン耐性株（ｍｅ
ｃＡ+ ）とを含有する混合培養物であることが分かっ
た。株を分離すると、感受性試験とＰＣＲは一致した。
次いで、内部ＤＮＡプライマー（それぞれＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１のヌクレオチド５６８−５９３およびＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド１６４７−１６７０
（逆相補鎖）に対応）を用いる最初のＤＮＡ試料につい
てのnested ＰＣＲ分析ではＰＣＲが陽性の結果を得
た。どの単離体もｍｅｃＡ感受性でなく、メシチリン耐
性であった。これらの結果はメシチリン耐性表現型とよ
く一致する。
によって分離された２個のプライマーをＰＣＲ（ポリメ
ラーゼ・チェーン反応）のために選択した。２個のプラ
イマーの配列は以下の通りである。 ５’−ＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧＧ−
３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド１４１−
１６０）および ５’−ＣＣＡＣＣＣＡＡＴＴＴＧＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴ
ＴＣＴＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオ
チド１９２９−１９５２の逆相補配列） ＰＣＲは、Gene Amp Kit を用い、DNA Thermal Cycler
(Perkin Elmer Cetus,Norwalk, CT)により、業者の指示
にしたがって行った。ＤＮＡ増幅には以下のパラメータ
ーを含む温度工程プログラムを用いた。変性：９４℃で
３０秒間、アニーリング：５５℃で３０秒間、プライマ
ー伸長：７２℃で２分間、合計３０サイクル。ＰＣＲ溶
液１０μlを０.８％アガロースゲル電気泳動にかけて分
析した。１.８ｋｂの増幅されたＤＮＡ断片の存在は陽
性の結果を示唆する。全体として、７０個のスタフィロ
コッカス株の内６９がＰＣＲおよびオキサシリン感受性
試験でまったく同じ結果を与えた。ただ１個の例外につ
いて試験し、それが迅速に増殖するメシチリン感受性株
（ｍｅｃＡ- ）と遅く増殖するメシチリン耐性株（ｍｅ
ｃＡ+ ）とを含有する混合培養物であることが分かっ
た。株を分離すると、感受性試験とＰＣＲは一致した。
次いで、内部ＤＮＡプライマー（それぞれＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１のヌクレオチド５６８−５９３およびＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド１６４７−１６７０
（逆相補鎖）に対応）を用いる最初のＤＮＡ試料につい
てのnested ＰＣＲ分析ではＰＣＲが陽性の結果を得
た。どの単離体もｍｅｃＡ感受性でなく、メシチリン耐
性であった。これらの結果はメシチリン耐性表現型とよ
く一致する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:45） (Ｃ１２Ｑ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｑ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:45） (Ｃ１２Ｑ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:44）
Claims (21)
- 【請求項１】 メシチリン耐性スタフィロコッカス感染
症の検出方法であって、 ａ）スタフィロコッカス感染が疑われる臨床試料につい
て、Ｇ＋Ｃ含量の高い２個のオリゴヌクレオチドで構成
されるＤＮＡプライマーであって、１個のプライマーは
スタフィロコッカスｍｅｃＡ遺伝子のコード鎖に含まれ
るＤＮＡ配列を有し、他のプライマーはスタフィロコッ
カスｍｅｃＡ遺伝子の非コード鎖に含まれるＤＮＡ配列
を有するプライマーを用いてポリメラーゼ・チェーン反
応を行い、そして ｂ）工程ａ）の反応産物を分析することからなる方法。 - 【請求項２】 ＤＮＡプライマーのＧＣ含量が約５０％
またはそれ以上である請求項１の方法。 - 【請求項３】 ＤＮＡプライマーの配列が式１： 【化１】 【化２】 【化３】 のヌクレオチド番号１９２９−１９５２の逆相補配列で
ある請求項２の方法。 - 【請求項４】 さらに、最初のポリメラーゼ・チェーン
反応に用いたＤＮＡプライマーの内部ＤＮＡプライマー
を用いて後のポリメラーゼ・チェーン反応を行う請求項
１の方法。 - 【請求項５】 内部ＤＮＡプライマーの配列が上記の式
１におけるヌクレオチド番号５６８−５９３の配列およ
びヌクレオチド番号１６４７−１６７０の逆相補鎖の配
列である請求項４の方法。 - 【請求項６】 ＤＮＡプライマーの配列がスタフィロコ
ッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)およびス
タフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus e
pidermidis) ｍｅｃＡ遺伝子からなる群から選択される
遺伝子のコード鎖または非コード鎖に含まれる請求項１
の方法。 - 【請求項７】 遺伝子が スタフィロコッカス・アウレ
ウス（S.aureus） 27R、スタフィロコッカス・アウレウ
ス（S.aureus ）BB270、スタフィロコッカス・アウレウ
ス（S.aureus） TK784、スタフィロコッカス・エピデル
ミディス（S.epidermidis） WT55 ｍｅｃＡ遺伝子から
なる群から選択される請求項６の方法。 - 【請求項８】 該方法が、スタフィロコッカス・アウレ
ウス（S.aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミデ
ィス（S.epidermidis）、 スタフィロコッカス・ヘモリ
ティカス（S.haemolyticus）、 スタフィロコッカス・
シムランス（S.simulans）、スタフィロコッカス・カル
ノサス（ S.carnosus）および スタフィロコッカス・サ
プロフィティカス（S.saprophyticus)からなる群から選
択されるメシチリン耐性スタフィロコッカスの検出に用
いられる請求項１の方法。 - 【請求項９】 工程ａ）の生成物をゲル電気泳動で分析
する請求項１の方法。 - 【請求項１０】 スタフィロコッカスから迅速にＤＮＡ
を放出する方法であって、 ａ）スタフィロコッカスを含有する試料をリゾスタフィ
ンで処理し、 ｂ）工程ａ）で得られた試料をプロテイナーゼＫで処理
し、そして ｃ）工程ｂ）で得られた試料を沸騰水浴でインキュベー
ションすることからなる方法。 - 【請求項１１】 スタフィロコッカスを含有する試料が
血液、尿、髄液、膿または細菌培養物から得られたもの
である請求項１０の方法。 - 【請求項１２】 興味ある試料中のメシチリン耐性スタ
フィロコッカッス感染を検出する方法であって、 ａ）該試料をリゾスタフィンで処理し、 ｂ）工程ａ）で得られた試料をプロテイナーゼＫで処理
し、 ｃ）工程ｂ）で得られた試料を沸騰水浴中でインキュベ
ーションし、 ｄ）工程ｃ）で得られた試料を、Ｇ＋Ｃ含量の高い２個
のオリゴヌクレオチドからなるＤＮＡプライマーであっ
て、１個のプライマーはスタフィロコッカスｍｅｃＡ遺
伝子のコード鎖に含まれるＤＮＡ配列を有し、他のプラ
イマーはスタフィロコッカスｍｅｃＡ遺伝子の非コード
鎖に含まれるＤＮＡ配列を有するプライマーを用いるポ
リメラーゼ・チェーン反応に付し、そして ｅ）工程ｄ）の反応産物を分析することからなる方法。 - 【請求項１３】 ＤＮＡプライマーのＧＣ含量が約５０
％またはそれ以上である請求項１２の方法。 - 【請求項１４】 ＤＮＡプライマーの配列が上記の式１
におけるヌクレオチド番号１４１−１６０の配列および
ヌクレオチド番号１９２９−１９５２の逆相補鎖の配列
である請求項１３の方法。 - 【請求項１５】 さらに、最初のポリメラーゼ・チェー
ン反応に用いたＤＮＡプライマーの内部ＤＮＡプライマ
ーを用いて続くポリメラーゼ・チェーン反応を行う請求
項１４の方法。 - 【請求項１６】 内部ＤＮＡプライマーの配列が上記の
式１におけるヌクレオチド番号５６８−５９３の配列お
よびヌクレオチド番号１６４７−１６７０の逆相補配列
である請求項１５の方法。 - 【請求項１７】 ＤＮＡプライマーの配列がスタフィロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)および
スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus
epidermidis)の ｍｅｃＡ遺伝子からなる群から選択さ
れる遺伝子のコード鎖または非コード鎖に含まれる請求
項１２の方法。 - 【請求項１８】 ＤＮＡプライマーの配列がスタフィロ
コッカス・アウレウス（S.aureus） 27R、スタフィロコ
ッカス・アウレウス（S.aureus ）BB270、スタフィロコ
ッカス・アウレウス（S.aureus） TK784およびスタフィ
ロコッカス・エピデルミディス（S.epidermidis） WT55
のｍｅｃＡ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の
コード鎖および非コード鎖に含まれる請求項１７の方
法。 - 【請求項１９】 該方法が、スタフィロコッカス・アウ
レウス（S.aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミ
ディス（S.epidermidis）、 スタフィロコッカス・ヘモ
リティカス（S.haemolyticus）、 スタフィロコッカス
・シムランス（S.simulans）、スタフィロコッカス・カ
ルノサス（ S.carnosus）および スタフィロコッカス・
サプロフィティカス（S.saprophyticus)からなる群から
選択されるメシチリン耐性スタフィロコッカスの検出に
用いられる請求項１２の方法。 - 【請求項２０】 工程ｄ）の生成物をゲル電気泳動で分
析する請求項１２の方法。 - 【請求項２１】 興味ある試料が血液、尿、髄液、膿ま
たは細菌培養物から得られたものである請求項１２の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US74477091A | 1991-08-13 | 1991-08-13 | |
| US744770 | 1996-09-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05329000A true JPH05329000A (ja) | 1993-12-14 |
Family
ID=24993930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4214968A Pending JPH05329000A (ja) | 1991-08-13 | 1992-08-12 | メシチリン耐性スタフィロコッカスを迅速に検出する方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
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