KR20160029368A - 황색 포도상구균 검출용 조성물 및 방법 - Google Patents
황색 포도상구균 검출용 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본원에서는 황색 포도상구균의 특이적 유전자로 Spa를 발굴하고, 상기 유전자의 검출을 통해 황색 포도상구균을 특이적으로 검출할 수 있도록 고안된 올리고뉴클레오타이드, 상기 올리고뉴클레오타이들 포함하는 조성물, 키트 및 방법을 개시한다. 본원에 따른 방법, 조성물 및 키트는 세균의 유무를 한 번의 검사로 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.
Description
본원은 뇌수막염 검출 기술에 관한 것이다.
세균성 수막염 (Bacterial meningitis, BM )는 뇌와 척수의 중추 신경계에 영향을 미치는 급성 염증으로, 사망률이 높은 질환으로, 즉각적인 진단과 치료가 요구된다. 세균성 수막염을 일으키는 주요 병원균은 Meningococcus, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, streptococcus agalactiae 등으로 원인균의 정확한 동정이 필요하다.
따라서 즉각 적인 치료가 필요함에도 불구하고, 원인균의 규명 및 이에 적합한 항생제 선택으로 인해 치료가 지연되는 것이 실정이다.
즉, 먼저 원인균의 식별을 위해 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF)을 추출하고, 이로부터 원인균을 동정하고, 이어 항생제 선택을 위해 원인균의 체외 항생제 감수성 검사가 진행된다. 하지만, 이러한 과정은 최소 5일 이상의 기간이 소요되는 치료 지연의 주요 원인을 제공한다.
더욱이 원인균의 동정에 있어, 이전에 항생제 치료에 노출되었거나 천천히 자라는 박테리아의 경우에는 위음성의 결과를 나타내는 문제점이 있다.
이를 해결하기 위해 세균성 뇌수막염 확진에 면역염색법이 사용되기도 한다. 그러나 이는 낮은 민감도와 다른 항원과의 교차 반응의 문제점이 있다.
또한 기존의 16S rRNA 유전자의 보존 지역에 대한 PCR 기술은 광범위한 박테리아를 감별하는 것은 가능하나, 특정 박테리아 종을 구별하는 것에는 어려움이 존재한다.
따라서 박테리아 뇌수막염의 진단과 치료를 위해서는 특정 박테리아 종을 구별할 수 있고 높은 민감도와 정확도를 가진 기술의 개발이 필요하다.
본원은 핵산 검출을 기본으로 하는 신속하면서도 편리성이 증대된 뇌수막염 원인균 검출 기술을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 황색 포도상구균을 특이적으로 검출하는 서열번호 1, 서열번호 2 및 그 상보적 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
일 구현예에서 본원의 올리고뉴클레오타이드는 표적균 유래의 핵산 증폭 예를 들면 PCR에 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 올리고뉴클레오타이드는 뇌수막염(meningitis) 또는 패혈증(sepsis)의 진단에 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 황색 포도상구균 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.
또다른 양태에서 본원은 서열번호 1의 프라이머 또는 그 상보적 서열의 프라이머 및 서열번호 2 또는 그 상보적 서열의 프라이머를 이용하여, 생물학적 시료로부터 인비트로에서 황색 포도상구균을 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.
또다른 양태에서 본원은 뇌수막염 또는 패혈증의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 뇌수막염 또는 패혈증이 의심되는 대상체 유래의 시료에서 서열번호 1의 프라이머 또는 그 상보적 서열의 프라이머 및 서열번호 2 또는 그 상보적 서열의 프라이머를 이용하여, 생물학적 시료로부터 인비트로에서 황색 포도상구균을 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.
본원에 따른 올리고뉴클레오타이드, 조성물, 방법 및 키트는 생물학적 시료로서, 예를 들면 배양된 균, 혈액, 또는 뇌척수액에서 황색 포도상구균 검출에 사용될 수 있으며, 검출은 핵산의 증폭 또는 교잡에 의한 것일 수 있으며, 일 구현예에서는 증폭 예를 들면 PCR에 의해 검출된다.
본원에 따른 검출 방법에서 PCR을 사용하는 경우, 상기 방법은 상기 PCR 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 단계; 및 상기 전기영동 결과를 근거로 시료 중의 황색 포도상구균의 존재 및/또는 양을 판단하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 전기영동 결과 317 bp 산물의 검출은 상기 생물학적 시료에서 황색 포도상구균의 존재를 나타내는 것이다. 상기 시료 중의 황색 포도상구균의 존재는 뇌수막염(meningitis) 또는 패혈증(sepsis)의 진단에 사용된다.
본원의 조성물 및 방법을 이용하면 뇌수막염 세균의 유무를 한 번의 검사로 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따른 S. aureus 특이적 프라이머의 특이성을 PCR 방법으로 검출한 후 전기영동으로 분석한 결과이다. NC는 음성대조군이며, S. aureus 이외에 6종류의 다른 균에 대하여도 동일한 실험을 수행하였다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 S. aureus 특이적 프라이머의 민감도를 측정한 결과로, 상이한 농도의 주형을 사용하여 PCR을 수행한 후 전기영동으로 분석하였다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 S. aureus 특이적 프라이머의 민감도를 측정한 결과로, 상이한 농도의 주형을 사용하여 PCR을 수행한 후 전기영동으로 분석하였다.
본원에서는 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 특이적 유전자로 Spa (Protein A)를 발굴하고, 상기 유전자의 검출을 통해 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus)를 특이적으로 검출할 수 있도록 고안된 올리고뉴클레오타이드, 상기 올리고뉴클레오타이들 포함하는 조성물, 키트 및 방법을 개시한다.
황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)는 신생아에게 패혈증(sepsis), 뇌수막염(meningitis)과 같은 심각한 침투성 질병을 일으키는 대표적인 박테리아이다. 또한 10-30%의 임산부의 생식기 또는 소화기관에 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 감염된 경우, 산도 (birth canal)을 통해 신생아를 감염시킬수 있다.
따라서 이러한 본원에 따른 조성물, 키트 또는 방법은 황색 포도상구균으로 인해 유발되는 다양한 질환 예를 들면 패혈증(sepsis), 뇌수막염(meningitis)와 같은 심각한 침투성 질병을 진단 특히 초기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
황색 포도상구균이 상기 질환의 유발균이라는 사실은 종전에 공지된 것으로 예를 들면 Pathogens associated with sepsis in newborns and young infants in developing countries., Zaidi AK, Thaver D, Ali SA, Khan TA., Pediatr Infect Dis J. 2009 Jan;28(1 Suppl):S10-8; 및 Staphylococcus aureus meningitis. A review of 104 nationwide, consecutive cases., Jensen AG, Espersen F, Skinhøj P, Rosdahl VT, Frimodt-Møller N., Arch Intern Med. 1993 Aug 23;153(16):1902-8을 참조할 수 있다. 따라서 본원에 따른 조성물은 이러한 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
한 양태에서 본원은 서열번호 1 또는 2 또는 그 상보적 서열의 황색 포도상구균 검출용 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본원에서 사용된 용어 “올리고뉴클레오타이드” 는 임의의 길이의 라이보뉴클레오타이드 또는 데옥시라이보뉴클레오타이드를 지칭하는 것으로, 단일가닥 및 이중가닥을 모두 포함하는 것으로, 프라이머, 프로브를 모두 포함하는 개념이다.
본원에서 사용된 용어 “프라이머”는 본원에서 검출하는 균주에 특이한 유전자의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 말하며, 중합효소연쇄반응과 같은 폴리머라제를 사용한 중합반응에서 중합의 시작점이 된다.
본원의 상기 프라이머는 이와 높은 서열유사성을 갖는 것을 또한 포함한다. 높은 서열유사성이란, GCG FastA (Genetics Computer Group, Madison, Wis.USA), MacVector 4.5 (Kodak/iBI software package) 또는 기타 당업계에 공지된 서열분석 방법 또는 프로그램을 이용하여, 적어도 70% 이상의 서열유사성이 있는 것을 말한다. 프라이머는 당업계의 공지된 방법 또는 합성회사를 통하여 합성할 수 있으며, 길이는 적어도 약 5개 뉴클레오타이드이다.
본원의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 검출하는 방법에 따라 시각화 할 수 있는 적절한 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지물질은 방사선동위원소, 폴리펩타이드성 표지물질, 형광물질, 발색물질 등과 같은 것을 포함한다. 이러한 표지물질은 올리고뉴클레오타이드 합성시에 그 자체에 도입될 수 도 있고, PCR을 사용하는 경우 중합과정에서 도입될 수 있다. 방사선물질은 베타, 감마 및 알파선 방출체를 포함하는 것으로, 32P,35S 및 125I를 포함한다. 형광물질은 에너지를 흡수하면 여기되고, 여기상태에서 기저상태로 되돌아가면서 가시광선을 방출하는 물질로 플로세신 및 로다민을 예로 들 수 있다. 폴리펩타이드성 표지물질은 바이오틴, 디그옥시제닌과 같은 항원성 물질과 호스레디쉬퍼옥시다제와 같은 효소를 포함한다. 발색물질은 화학반응으로 흡수한 에너지를 방출하는 화학발광물질 예를 들면 옥시루미네슨스와 같은 것을 포함한다.
본원에서 사용된 용어“검출”은 핵산의 존재여부 또는 존재할 경우 그 양을 검출하는 것을 의미하는 것으로서 핵산 특이적 DNA-DNA, RNA-DNA 혼성화 반응을 기본으로는 하는 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 노던블랏분석, 서던블랏 분석, 마이크로칩분석, PCR (정량적 및 정성적 PCR, 실시간 정량적 정성적 PCR 포함)을 포함하는 증폭과 같은 당업계의 다양한 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
일 구현예에서는 핵산 증폭에 사용되며, 특히 PCR에 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어“PCR (Polymerase Chain Reaction)”은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성하여 개시 핵산물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 당업계에 널리 공지된 방법으로, 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하여 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 PCR을 모두 포함하는 개념이다.
PCR 반응의 경우, 두 개의 프라이머로 구성된 프라이머 쌍이 사용된다. 일 구현예에서는 서열번호 1 또는 그 상보적 서열 및 서열번호 2 또는 그 상보적 서열이 사용된다.
PCR에 의해 증폭된 산물(amplicon)은 주형으로 사용한 분자와 상응하는 서열을 가지며, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지된 것으로서 예를 들면 젤 전기영동, 실시간 PCR 분석, SSCP (single strand conformational polymorphism), RFLP(restriction fragment length polymorphism), CZE(capillary zone electrophoresis), WAVE (HPLC-based nucleic acid analyzing technology), 마이크로칩을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원의 한 구현예에서는 사이즈마커와 함께 PCR 산물을 아가로스 젤에서 전기영동하여 분석한다. 전기 영동 결과 그 산물의 크기로 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus)의 존재 여부를 판별할 수 있으며, 본원에 따른 일 구현예에서 본원의 프라이머 쌍에 의해 증폭되는 산물의 크기는 225bp 이다.
이러한 맥락에서 본원은 본원의 프라이머를 포함하는 황색 포도상구균 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 또는 방법에 관한 것이다.
상기 조성물 또는 키트에 포함되는 프라이머 및 이를 이용한 검출은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다. 본원에 따른 일 구현에서, 본원의 조성물은 핵산 증폭에 사용되며, 특히 PCR을 이용한 증폭에 사용된다. 이 경우 PCR 조성물은 PCR의 반응에 필요한 완충액, Taq 폴리머라제 및 MgCl2를 포함한다. 당업계에 공지된 다양한 완충액이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Tris-HCl, pH 9.0 완충액이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. Taq 폴리머라제는 시중에서 구입할 수 있으며, 예를 들면 AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, USA)와 같은 것을 사용할 수 있으며, 적절한 농도 예를 들면 1.5mM 내지 2.5mM의 MgCl2가 포함될 수 있다.
본원에 따른 키트는 양성대조군, 음성대조군 및 사용설명서를 추가로 포함한다. 음성대조군은 검출대상이 아닌 다른 종류의 그람양성균의 DNA를 사용할 수 있으며, 양상대조군은 검출대상 그람양성균의 게놈 DNA 또는 검출대상 그람양성균의 독력유전자를 포함하는 플라스미드를 사용할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 서열번호 1의 프라이머 또는 그 상보적 서열의 프라이머 및 서열번호 2 또는 그 상보적 서열의 프라이머를 이용하여, 생물학적 시료로부터 인비트로에서 뇌수막염 균 황색 포도상구균을 특이적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
본원의 방법에 사용되는 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.
본원에 따른 조성물, 방법 및 키트는 다양한 생물학적 시료로부터 뇌수막염 균을 검출 할 수 있다. 생물학적 시료란 본원에 따른 프라이머를 이용하여 뇌수막염 균 황색 포도상구균의 존재 또는 그 양을 검출할 수 있는 생물체 유래의 조직, 세포 채액, 및/또는 그 유도물 및 그 배양물을 일컫는 것으로 예를 들면 혈액, 뇌척수액, 배양된 균, 혈액, 뇌척수액을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 배양된 균이란 질환이 의심되는 대상체의 유래의 예를 들면 혈액, 뇌척수액과 같은 시료를 사용하여 배양된 세균으로, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 이용하여 배양된 후 이를 검출에 사용할 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하나, 본 실시예는 예시적인 것일 뿐 어떤 식으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 1994); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley &Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985)을 참고할 수 있다.
실시예
실시예 1 세포 배양 및 유전체 추출
Staphylococcus aureus , Streptococcus pneumoniae , Streptococcus agalactiae , Bacteroides fragilis , Clostridium perfringens , Clostridium difficile , Finegoldia magna 7종의 병원균을 액체 배지 TRYPTICASE SOY AGAR (BD Diagnostics, Germany)에 넣어 37℃ 교반 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 이어 각 균을 3000xg에서 원심분리하여 모은 후 Higene genomic DNA prep kit (BIOFACT)를 이용하여 제조자의 방법대로 추출하였다. 요약하면, 상기 키트의 R1 용액 300μl와 라이소자임 2μl를 넣은 후 혼합하여 37℃에서 1시간 반응하였다. 이어 13,000rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거한 후, SGD1 용액 350μl 를 첨가한 후 볼텍스 하였다. 이어 protease K 8μl를 혼합한후 다시 65℃에서 10분간 배양하였다. 이어 SGD2 용액 400 μl를 첨가한 후 볼텍스를 하고, 1300rpm에서 5분간 원심분리하였다. 이어 상등액을 분리하여 컬럼에 로딩하여 원심분리한 후 2회 세척 후에 증류수로 DNA를 용출하였다.
실시예 2 프라이머 디자인 및 PCR 반응
프라이머는 S. aureus의 Spa (Staphylococcus aureus, Protein A)의 부위에서 디자인 하였으며, 서열은 다음과 같다: forward 5'- AATGACTCTCAAGCTCCAA-3'(서열번호 1), reverse 5'- TTTGTTGAAATTGTTGTCAGC-3' (서열번호 2).
상기 프라이머를 이용하여 다음과 같은 조건에서 PCR을 수행하였다. PCR은 전체 25μl에 2μl 의 실시예 1에서 추출한 DNA, 2.5ul 의 10X PCR buffer, 10pmol forward, reverse primer, 2μl dNTP 혼합물 과 2.5U Taq polymerase를 사용하였다. 전체 PCR 조건은 처음 95℃에서 5분 후, 95℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 45초를 30cycle 수행한 후 마지막으로 72℃에서 10분 수행하였다. 증폭된 DNA는 EtBR이 포함된 아가로스젤 전기영동으로 확인하였다.
실시예 3 황색 포도상구균 검출 특이성 분석
본원에 따른 프라이머를 이용한 S. aureus 검출의 특이성은 실시예 2에서와 같이 PCR을 수행하여 분석하였다. 결과는 도 1에 있다. 이에 나타난 바와 같이 음성대조군의 DNA가 없는 것과 Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Bacteroides fragilis, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Finegoldia magna 의 6개의 박테리아에서는 spa 유전자의 증폭이 되지 않은 반면 Staphylococcus aureus 유전체를 이용한 PCR에서만 특이적으로 증폭이 되었다.
실시예 4 황색 포도상구균 검출 민감도 분석
본원에 따른 프라이머를 이용한 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 검출의 민감도는 실시예 2에서와 같이 PCR을 수행하여 분석하였으며, 0, 10ng, 1ng, 100pg, 10pg, 그리고 1pg으로 각각 희석하여 PCR을 수행하였다. 결과는 도 2에 있다. 이에 나타난 바와 같이 음성대조군을 제외하고 1pg의 DNA부터 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus)를 검출할 수 있다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Composition and method for detecting Staphylococcus aureus
<130> DP201407002P
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus aureus
<400> 1
aatgactctc aagctccaa 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Staphylococcus aureus
<400> 2
tttgttgaaa ttgttgtcag c 21
Claims (11)
- 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus)를 특이적으로 검출하는 서열번호 1, 서열번호 2 및 그 상보적 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 PCR을 포함하는 핵산 증폭에 사용되는 것인, 올리고뉴클레오타이드.
- 제 2 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 뇌수막염(meningitis) 또는 패혈증(sepsis) 의 진단에 사용되는 것인, 올리고뉴클레오타이드.
- 제 1 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 발색, 발광 또는 형광물질로 표지된 것인,올리고뉴클레오타이드.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 뇌수막염 균 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 검출용 조성물.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 뇌수막염 균 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 검출용 키트.
- 서열번호 1의 프라이머 또는 그 상보적 서열의 프라이머 및 서열번호 2 또는 그 상보적 서열의 프라이머를 이용하여, 생물학적 시료로부터 인비트로에서 뇌수막염 균 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus)를 특이적으로 검출하는 방법.
- 제 7 항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 배양된 균, 혈액, 또는 뇌척수액인, 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 검출은 PCR에 의한 것인, 방법.
- 제 9 항에 있어서,
상기 방법은 상기 PCR 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 단계; 및
상기 전기영동 결과를 근거로 시료 중의 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus)의 존재 여부를 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제 10 항에 있어서,
상기 전기영동 결과 225 bp 산물의 검출은 상기 생물학적 시료에서 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus)의 존재를 나타내는 것인, 방법.
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| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20160812 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20160519 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |