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KR101106963B1 - Ｐ１ 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 ｐｃｒ 프라이머와 프로브 및 이를 이용한 실시간 ｐｃｒ 방법 - Google Patents

Ｐ１ 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 ｐｃｒ 프라이머와 프로브 및 이를 이용한 실시간 ｐｃｒ 방법 Download PDF

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KR101106963B1
KR101106963B1 KR1020090081654A KR20090081654A KR101106963B1 KR 101106963 B1 KR101106963 B1 KR 101106963B1 KR 1020090081654 A KR1020090081654 A KR 1020090081654A KR 20090081654 A KR20090081654 A KR 20090081654A KR 101106963 B1 KR101106963 B1 KR 101106963B1
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mycoplasma pneumoniae
oligonucleotide
pcr
probe
detecting
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유재연
이혜경
정상운
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대한민국
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Abstract

본 발명은 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균에 특이적인 표적 서열을 증폭할 수 있는 P1 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 PCR 프라이머 세트 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 그에 상보적인 올리고뉴클레오티드에서 선택되는 하나 이상의 마이코플라스마 뉴모니아로부터 유래한 핵산에 특이적인 올리고뉴클레오티드 검출용 프로브를 제공한다. 상기한 구성에 의해, 호흡기환자 검체로부터 마이코플라스마 뉴모니아균(Mycoplasma pneumoniae)을 우수한 특이도와 민감도로 신속하게 검출할 수 있는 이점이 있다.
마이코플라스마 뉴모니아, 검출, PCR 프라이머, 프로브, 실시간 PCR

Description

Ｐ１ 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 ＰＣＲ 프라이머와 프로브 및 이를 이용한 실시간 ＰＣＲ 방법{PCR primer and probe for detection of Mycoplasma pneumoniae using P1 gene and real-time PCR method using the same}
본 발명은 P1 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 PCR 프라이머와 프로브 및 이를 이용한 실시간 PCR 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 호흡기환자 검체로부터 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)을 우수한 특이도와 민감도로 신속하게 검출할 수 있는 P1 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 PCR 프라이머와 프로브 및 이를 이용한 실시간 PCR 방법에 관한 것이다.
의료기관을 방문하는 가장 흔한 요인인 호흡기감염질환은 임상증상만으로 원인 병원체를 구분하기 어렵고 고전적인 실험실 진단법으로는 오랜 시간이 소요되는 제한점으로 인해 경험적인 항생제 처방이 빈번하게 이루어지고 있다. 한편, 이러한 항생제 사용량의 증가는 항생제 내성균의 출현 및 확산이라는 점에서 국민보건에 큰 악영향을 미치고 있다.
마이코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae)는 증상이 경미한 상기도 감염부터 기관지염이나 폐렴과 같은 중증 호흡기질환을 유발한다. 특히, 지역사회 폐렴 환자의 10∼30%에 해당하는 원인으로 알려져 있으며 기침이 심하며 오래가고 38도 이상의 고열이 주증상으로 초기에는 머리가 아프고 열이 나며 콧물이 흐르고 목이 아프다가 점점 목이 쉬고 기침이 나며 2주 이상 마른 기침이 지속되다 가래 섞인 기침을 하기도 한다. 특히, 15세 이하의 학동기 아동에서 자주 발생하는 것으로 알려졌으나 최근 점차 발병 연령이 낮아지고 있으며, 연중 발생하지만 대개 3∼4년을 주기로 유행 경향을 보이기도 한다.
특히, 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)은 일반적인 세균과는 달리 세포벽이 없어 현재 호흡기감염질환 치료 시 가장 흔하게 사용되는 페니실린을 비롯한 베타락탐계 및 세팔로스포린계 항생제가 효과가 없으며 일차 치료제로 마크로라이드계를 선택하여야 한다. 하지만, 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae) 감염은 환자의 임상증상이나 방사선 소견만으로 다른 원인균과 감별하기가 어려워 감염 초기에 원인균이 규명되어 적절한 항생제가 선택되어 치료에 사용되는 것이 무엇보다 중요하다.
마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae) 감염의 진단 방법으로 주로 혈청학적 방법에 의존하고 있지만 특이도와 민감도가 낮고 위양성 반응을 보일 뿐 아니라 감염 후 3-4주 이후의 회복기 항체가를 측정하여 확진을 하므로 조기 진단 방법으로는 한계가 있다. 또한, 분리배양법은 특수 배지를 사용하며 3-4주 동안 시간이 소요되는 단점으로 임상 진단에 적용하는 것은 불가능하다. 이에 최근에는 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae) 감염의 조기 진단을 위해 기존 혈청학적 방법과 더불어 호흡기검체를 대상으로 PCR법을 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae) 검출을 시도하고 있으며 이러한 방법은 혈청학적 방법에 비해 소요 시간이 짧고 높은 민감도와 특이도를 제공하여 임상에서의 응용이 증가하고 있다.
종래의 PCR법은 16S rRNA 유전자를 타겟 유전자로 하며, 사용 중인 DD5B와 DD54B 프라이머 및 프로브는 표 1과 같다(참고문헌 Journal of Clinical Microbiology(1997) 35(6):1592-1594).
Name Sequence (5' → 3') Product size
DD50B 5'-gca aag tta tgg aaa cat aat gga ggt t(서열번호 1)
427bp
DD54B 5'-ggt tag caa cac gtt ttt aaa tat t (서열번호 2)
종래 PCR법은 Taq DNA 중합효소 (Solgent SG1002), 각 프라이머 (20pmol/μl), Positive DNA 및 멸균 3차 증류수를 eliquot하여 -20℃ 보관한 후, PCR 반응시 마다 얼음 상에서 녹여 준비한 후 PCR 튜브에 혼합하여 표 2의 반응액 조성을 만들고 표 3에서 제시한 반응 조건에 따라 PCR을 실시하였다. 상기 PCR 결과는 5㎕ PCR 반응액을 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인하였다(도 1 참조).
성 분 부피
DNA template (검체 DNA) 5㎕
10 x reaction buffer (2.5mM MgCl2 포함) 5㎕
dNTP mixture (each 10mM) 1㎕
DD50B (20pmol/㎕) 1㎕
DD54B (20pmol㎕) 1㎕
Taq DNA polymerase (0.5U) 0.5㎕
Band doctor 1㎕
멸균 증류수 35.5㎕
총 부 피 50㎕
반응온도 시간 반복주기
94℃ 4분 1회
94℃ 30초
30회
62℃ 30초
72℃ 1분
72℃ 10분 1회
상기 종래의 PCR법에 의한 마이코플라스마 뉴모니아균을 검출하는 방법은 전기영동을 하여야 하는 번거로움이 있고 오염가능성이 크며 정량분석이 어려운 문제점들이 있었다.
본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하는 동시에 호흡기환자 검체로부터 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae) 검출의 특이도와 민감도를 개선하고자 P1 유전자 특이 프라이머와 프로브를 고안하고 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae) 특이 실시간(real-time) PCR법을 확립하여 호흡기 검체에 적용하였다.
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 호흡기환자 검체로부터 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)을 검출할 수 있는 특이도와 민감도가 우수한 P1 유전자 특이 프라이머와 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 전기영동을 하여야 하는 번거로움이 없고 오염가능성이 적으며 정량분석이 가능한 동시에 특이도와 민감도가 우수한, 상기 프라이머와 프로브를 이용하는 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae) 특이 실시간 PCR 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 사용이 용이하며 단시간 내에 신속 정확하게 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)을 검출할 수 있는 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균에 특이적인 표적 서열을 증폭할 수 있는 P1 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검 출용 PCR 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 그에 상보적인 올리고뉴클레오티드에서 선택되는 하나 이상의 마이코플라스마 뉴모니아로부터 유래한 핵산에 특이적인 올리고뉴클레오티드 검출용 프로브를 제공한다.
본 발명은 호흡기 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 하여 상기 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균에 특이적인 표적 서열을 증폭할 수 있는 P1 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 PCR 프라이머 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 얻어진 PCR 산물을 사용하여 검체 중의 표적 서열을 검출하는 단계를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균을 검출하는 실시간 PCR 방법을 제공한다.
상기 실시간 PCR 방법은 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 그에 상보적인 올리고뉴클레오티드에서 선택되는 하나 이상의 마이코플라스마 뉴모니아로부터 유래한 핵산에 특이적인 올리고뉴클레오티드 검출용 프로브를 사용하여 검체 중의 표적 서열을 검출하는 것이 바람직하다.
본 발명은 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균에 특이적인 표적 서열을 증폭할 수 있는 P1 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 PCR 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 그에 상보적인 올리고뉴클레오티드에서 선택되는 하나 이상의 마이코플라스마 뉴모니아로부터 유래한 핵산에 특이적인 올리 고뉴클레오티드 검출용 프로브를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 상기 종래 PCR 방법에 의한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출 방법의 문제점들을 해결하는 동시에 호흡기환자 검체로부터 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae) 검출의 특이도와 민감도를 개선하고자, P1 유전자 특이 프라이머와 프로브를 고안하여 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae) 특이 실시간 PCR 방법을 확립하고 호흡기 검체에 적용하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 호흡기검체로부터 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)만을 특이적으로 검출하기 위해 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)의 P1 유전자(Infection and Immunity, 67(9):4557-4562(1999); GenBank No. NC_000912)의 도 2와 같은 반복서열들(repetitive sequences)에 특이적인 부위에 결합하는 프라이머와 프로브 조합을 고안하고 이를 BLAST 서치를 통하여 다른 호흡기감염질환 유발 병원성세균 및 상재균과 반응하지 않음을 확인하여 최종적으로 아래 표 4와 같이 선정하였다. 즉, 표 4는 본 발명에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 나타낸다.
Name Sequence (5' → 3')
repMP1b-F AACGAAAAAGAATTCCATGACATG(서열번호 3)
repMP1b-R AATTCCACACTGTTGTTCTCTG(서열번호 4)
Probe FAM 5'-ACGATGTATCAACCTGAAAAAGTGCCCT-3' TAMRA(서열번호 5)
본 발명은 호흡기 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 하여 상기 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균에 특이적인 표적 서열을 증폭할 수 있는 P1 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 PCR 프라이머 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 얻어진 PCR 산물을 사용하여 검체 중의 표적 서열을 검출하는 단계를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균을 검출하는 실시간 PCR 방법을 제공한다.
상기 실시간 PCR 방법은 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 그에 상보적인 올리고뉴클레오티드에서 선택되는 하나 이상의 마이코플라스마 뉴모니아로부터 유래한 핵산에 특이적인 올리고뉴클레오티드 검출용 프로브를 사용하여 검체 중의 표적 서열을 검출하는 것이 바람직하다.
이때 프로브는 검출가능한 수단으로 표지될 수 있으며, 특히 2종을 함께 사용하는 경우에는 서로 상이한 검출 가능한 수단으로 표지된다. 상기 검출 가능한 수단은 프로브에 연결, 결합, 또는 부착되어 통상적인 방법으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체분자 또는 생체 분자 모방체 등을 의미한다. 그 예로 통상적으로 사용되는 형광표지 인자, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로 형광표지 인자가 바람직하다.
상기 형광표지 인자는 현재 시중에 다수 종이 시판되고 있으므로 용이하게 입수 가능하다. 형광표지 인자의 예로는, FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED, HEX 및 TET, SYBR Green, Cy3, Texas Red, Cy5TM 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광표지 인자에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본원발명에 속하는 기술 분야의 당업자들에게 자명한 것이다.
상기 형광표지 인자는 통상의 방법으로 상기 프로브에 표지될 수 있는데, 예를 들어 인터킬레이팅(interchelating) 방법, TaqManTM 프로브법 및 분자 비콘(Molecular beacon) 방법 등이 있다. 상기 방법들은 당업계에서 공지된 것이므로, 반응효율, 시간, 형광표지 인자 타입 등을 적절히 고려하여 특정 방법을 선택할 수 있다. 본 발명에서는 일 예로, TaqManTM 프로브 방법을 사용할 수 있다.
상기 TaqManTM 프로브 방법은 5' 말단은 리포터인 형광표지 인자(FAM 등)로 3' 말단은 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, 상기 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, TaqManTM 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqManTM 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. 즉 상기 방법은 프로브의 양끝의 상기 리포터와 quencher가 근접하여 존재하면 형광을 서로 상쇄하여 리포터의 형광이 감지되지 않으나 증폭이 진행됨에 따라 중합효소에 의해 리포터가 quencher로부터 떨어져 나가면 리포터의 형광이 감지되고 이를 정량하게 되는 원리이다.
상기 PCR 방법은 PCR 마스터 혼합물(master mix) 10㎕, 프라이머 repMP1b-F (10pmol/㎕) 1㎕, 프라이머 repMP1b-R (10pmol/㎕) 1㎕, 프로브 (2.5pmol/㎕) 1㎕, 검체 DNA 2㎕, 멸균 증류수 5㎕를 포함하여 총 부피가 20 ㎕가 되는 것이 바람직하다(표 5 참조).
또한, 상기 PCR 방법은 정화(Decontamination) 50℃ 2분 1회, 초기변성(Initial denaturation) 95℃ 10분 1회, 변성(Denaturation) 95℃ 15초 40회, 연장(Extension) 60℃ 1분 40회를 실시하는 것이 바람직하다(표 6 참조).
상기 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭산물을 비특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.
본 발명에 사용가능한 실시간 PCR 기기로는 ABI사의 Real-time PCR 기기 7900, 7700, 7500, 7300, Stratagene 사의 Mx3000p 및 BioRad사의 Chromo 4 기기 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. PCR 종료시 이러한 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광표지 인자를 감지하여 도 3과 같은 피크를 구현한다. 이에, 전기영동 과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다.
따라서, 본 발명의 P1 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 프라이머 세트, 프로브 및 실시간 PCR 방법에 의해, 종래 검출 방법에 비해 신속하고 정확하게 그 결과를 실시간으로 확인할 수 있다.
나아가 이러한 방법은 전기영동법으로 분별하기 어려웠던 적은 농도의 DNA 절편의 유무나 100 bp 미만의 PCR 산물의 확인을 레이저 감광으로 구분할 수 있고, PCR 산물에 의한 오염에 대한 우려가 없으며, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
특히 본 발명에 의해 개발한 프라이머와 프로브를 이용한 실시간 PCR 방법은 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)에 대한 특이도가 높고(표 7 참조), 그 민감도가 1 CCU/㎖로 확인되어 기존에 16S rRNA 유전자를 검출하던 일반적인 PCR법의 민감도인 10 - 100 CCU/㎖보다 민감도가 더 높은 검출법이다(표 8 참조). 또한, 임상 검체 적용 시에도 종래의 PCR법보다 본 발명에 의한 실시간 PCR 방법이 민감도가 더 높은 것으로 나타났다(표 9 참조).
또한, 본 발명은 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균에 특이적인 표적 서열을 증폭할 수 있는 P1 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 PCR 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 그에 상보적인 올리고뉴클레오티드에서 선택되는 하나 이상의 마이코플라스마 뉴모니아로부터 유래한 핵산에 특이적인 올리고뉴클레오티드 검출용 프로브를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 프라이머 세트 및 프로브는 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에서 공지된 방법으로 패키징된다. 또한, 본 발명의 키트는 택 중합효소(Taq polymerase), MgCl2를 포함한 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당업계에 공지된 다른 시약을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 키트는 사용이 용이하며, 단시간 내에 신속 정확하게 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)을 검출할 수 있다.
상술한 바와 같은 구성을 갖는 본 발명에 의한 호흡기환자 검체로부터 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)을 우수한 특이도와 민감도로 신속하게 검출할 수 있는 효과를 도모할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 전기영동을 하여야 하는 번거로움이 없고 오염가능성이 적으며 정량분석이 가능한 효과를 도모할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하면서 본 발명의 구성에 대해 상세하게 살펴본다.
실험재료 및 방법
(1) 대상 검체
- 인후 또는 비인두 분비물(Throat or nasopharyngeal swab)
- 비인두 흡입물(Nasopharyngeal aspirates)
- 객담(Sputum)
- 기관지폐포세척물(BAL, bronchoalveolar lavage)
(2) 사용균주 및 임상검체
표준균주로 M. pneumoniae ATCC15531을 사용하였으며 Glucose-Hayflick's media (PPLO broth + 20% horse serum + 10% yeast extract)에서 배양하였다. 한편, 호흡기환자로부터 수집한 인후 도찰물을 확인시험에 사용하였다.
(3) DNA 추출법
검체가 접종된 수송배지 1ml을 멸균 마이크로튜브(microtube)에 옮기고 15,000rpm으로 60분간 원심분리하여 침전시킨 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 침 사를 포함하여 100μl 정도를 남긴다. GENTRA사의 Puregene Tissue core kit에서 제시된 상세 방법에 따라 DNA를 추출하여 PCR 반응의 주형(template)으로 사용하였다.
(4) 프라이머(Primer)와 프로브(probe)
Primer Express Ver. 2.0 software (PE Applied Biosystem)을 이용하여 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)의 P1 유전자(Infection and Immunity, 67(9):4557-4562(1999); GenBank No. NC_000912)의 반복서열들(repetitive sequences; repMP1 & repMP2)을 기반으로 하여 BLAST 서치(BLAST search)를 통하여 호흡기감염 병원성 세균 및 상재균과의 교차-반응(cross-reaction)을 보이지 않는 프라이머와 프로브 조합을 선정하였다.
(5) 실시간(Real-time) PCR법
TaqMan probe 방법을 사용하여 프로브에는 FAM을 부착하고 실시간 PCR (ABI PRISM 7700 Sequence Detector, Perkin Elmer)로 측정하였다. RT-PCR 반응액은 2x Taqman universal PCR 마스터 혼합물(master mix) 10㎕, 프라이머 repMP1b-F (10pmol/㎕) 1㎕, 프라이머 repMP1b-R (10pmol/㎕) 1㎕, 프로브 (2.5pmol/㎕) 1㎕, 주형 DNA 2㎕로 최종 부피가 20㎕가 되도록 멸균수를 첨가하여 제작하였다. 반응 조건은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분간 40회 증폭하였다.
실시예 1. 마이코플라스마 뉴모니아균( M. pneumoniae )의 P1 유전자 검출용 프라이머 및 프로브 세트 고안
호흡기검체로부터 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)만을 특이적으로 검출하기 위해 Primer Express Ver. 2.0 software (PE Applied Biosystem)을 이용하여 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)의 P1 유전자(Infection and Immunity, 67(9):4557-4562(1999); GenBank No. NC_000912)의 도 2와 같은 반복서열들(repetitive sequences)에 특이적인 부위에 결합하는 프라이머와 프로브 조합을 고안하고 이를 BLAST 서치를 통하여 다른 호흡기감염질환 유발 병원성세균 및 상재균과 반응하지 않음을 확인하여 최종적으로 아래 표 4와 같이 선정하였다.
실시예 2. 실시간 PCR의 최적화
마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae) 표준균주 ATCC15531의 DNA를 대상으로 위에서 고안한 프라이머와 프로브 세트가 정확하게 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae) DNA에 결합하여 PCR 산물을 정확하게 생성하는지를 확인하고 이에 대한 최적화를 수행하여 아래의 표 5 및 표 6과 같은 최적 조건을 결정하였다. 도 3은 본 발명에 의한 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae) 검출을 위한 최적조건의 실시간 PCR에 의한 유전자 검출 곡선을 나타낸다.
Components Volume (㎕)
TaqMan universal PCR master mix 10
Primer repMP1b-F (10pmol/㎕) 1
Primer repMP1b-R (10pmol/㎕) 1
Probe (2.5pmol/㎕) 1
검체 DNA 2
멸균 증류수 5
Total volume (㎕) 20
Stage Temperature Duration time Cycles
Decontamination 50℃ 2 min 1
Initial denaturation 95℃ 10 min 1
Denaturation 95℃ 15 sec
40
Extension 60℃ 1 min
실시예 3. 실시간 PCR의 특이도 조사
본 발명자들이 고안한 프라이머와 프로브를 이용한 실시간 PCR법의 특이도를 알아보기 위해, 아래 표 7과 같이 호흡기질환을 유발할 수 있는 세균 및 호흡기계 부위 상재균 등의 32종 세균으로부터 정제한 DNA를 대상으로 위에서 기술한 실시간PCR의 최적화 조건에 따라 PCR을 수행하였다. 그 결과 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)를 제외한 호흡기32종에서는 증폭 산물이 검출되지 않아 고안한 프라이머와 프로브를 이용한 실시간 PCR 방법이 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)를 특이적으로 검출함을 확인하였다.
Groups Bacteria
Other Mycoplasma spp.
Mycoplasma salivarium
Mycoplasma orale
Mycoplasma bovis
Mycoplasma fermentants
Mycoplasma hominis
Mycoplasma lipophilum
Atypical pathogens of community-acquired pneumonia
Chlamydia pneumoniae
Chlamydia psittaci
Legionella pnemophilla
Causative bacteria of community-acquired pneumonia
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Staphylococcus aureus
Moraxella catarrhalis
Pseudomonas aeruginosa
Other respiratory pathogens
Streptococcus pyogens
Neisseria meningitidis
Bordetella pertusis
Oral commensal bacteria and other bacteria
Streptococcus agalactiae
Streptococcus bovis
Streptococcus cremolis
Streptococcus dysagalactiae
Streptococcus epidermis
Streptococcus euqi
Streptococcus lactis
Streptococcus mitis
Streptococcus mutans
Streptococcus oralis
Streptococcus sanguis
Streptococcus uberis
Acinetobacter baumannii
Escherichia coli
Enterococcus faecalis
실시예 4. 실시간 PCR의 민감도 조사
본 발명에 의해 개발한 프라이머와 프로브를 이용한 실시간 PCR법의 유용성과 검출한계 (detection limit)를 검증하고자 하였다. 배양액 (1010 CCU, color change unit)을 1/10씩 단계별로 희석한 후 DNA를 정제하여 반응 주형으로 사용하였다. 실시간 PCR은 위에서 기술한 PCR 반응 조건과 동일하게 수행하였으며, 반응 산물의 확인은 Ct 값을 기준으로 하였으며 1 CCU/㎖로 확인되어 기존에 16S rRNA 유전자를 검출하던 일반적인 PCR법의 민감도인 10 - 100 CCU/㎖보다 민감도가 더 높은 검출법임을 확인하였다. 표 8은 본 발명에 의한 프라이머와 프로브를 이용한 실시간 PCR법의 민감도 조사 결과를 나타낸다.
CCU/㎖ 1010 109 108 107 106 105 104 103 102 101 100 10-1
Ct value 19.8 22.8 25.5 29.3 32.4 34.9 36.9 37.5 38.8 39.1 39.9 -
실시예 5. 임상 검체 적용 시 실시간 PCR법과 일반 PCR법의 비교
호흡기환자의 인후도찰물로부터 추출한 DNA를 이용하여 실시간 PCR법과 일반적인 PCR법을 적용하여 마이코플라스마 뉴모니아균(M. pneumoniae)를 검출한 결과, 실시간 PCR법에 의한 양성은 27.9%였고, 일반 PCR법은 23.4%로 실시간 PCR법이 4.5%정도 검출률의 증가가 확인되어, 실제 임상검체에 적용하였을 때도 실시간 PCR법 사용 시 민감도가 높음을 알 수 있었다. 표 9는 임상 검체 적용시 본 발명에 의한 실시간 PCR법과 일반 PCR법과의 민감도를 비교한 결과를 나타낸다.
Results No. of cases (%)
Real-time PCR Conventional PCR
Positive 43 (27.9%) 36 (23.4%)
Negative 111 (72.1%) 118 (76.6%)
Total 154 (100.0%)
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 도면에 의해 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
도 1은 종래의 PCR법에 의해 PCR한 결과를 보인 전기영동 사진이다.
Lane M. 1kb plus DNA ladder (Invitrogen 12308-011), Lane 1. Negative control (멸균 증류수), Lane 2. M. pneumoniae genomic DNA (ATCC29085)
도 2는 마이코플라스마 뉴모니아(M. pneumoniae strain M129)에서 repMP1 반복 부위를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명에 의한 프라이머 및 프로브를 이용한 최적 조건의 실시간 PCR 방법에 의한 유전자 검출 곡선을 나타내는 도면이다.
<110> korea Center for Disease Control and Prevention <120> PCR primer and probe for detection of Mycoplasma pneumoniae using P1 gene and real-time PCR method using the same <130> P11-090626-01 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 1 gcaaagttat ggaaacataa tggaggtt 28 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 2 ggttagcaac acgtttttaa atatt 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 aacgaaaaag aattccatga catg 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 4 aattccacac tgttgttctc tg 22 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 5 acgatgtatc aacctgaaaa agtgccct 28

Claims (9)

  1. 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균에 특이적인 표적 서열을 증폭할 수 있는 P1 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 PCR 프라이머 세트.
  2. 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 그에 상보적인 올리고뉴클레오티드에서 선택되는 하나 이상의 마이코플라스마 뉴모니아로부터 유래한 핵산에 특이적인 올리고뉴클레오티드 검출용 프로브.
  3. 호흡기 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 하여 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    얻어진 PCR 산물을 사용하여 검체 중의 표적 서열을 검출하는 단계를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균을 검출하는 실시간 PCR 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 표적 서열을 검출하는 단계는 제2항에 따른 프로브를 사용하여 검체 중의 표적 서열을 검출하는 것을 특징으로 하는 마이코플라스마 뉴모니아균을 검출하는 실시간 PCR 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단이 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED, HEX 및 TET로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광인자로 표지되는 것을 특징으로 하는 마이코플라스마 뉴모니아균을 검출하는 실시간 PCR 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 PCR 방법은 PCR 마스터 혼합물(master mix) 10㎕, 프라이머 repMP1b-F (10pmol/㎕) 1㎕, 프라이머 repMP1b-R (10pmol/㎕) 1㎕, 프로브 (2.5pmol/㎕) 1㎕, 검체 DNA 2㎕, 멸균 증류수 5㎕를 포함하여 총 부피가 20 ㎕가가 되는 것을 특징으로 하는 마이코플라스마 뉴모니아균 검출하는 실시간 PCR 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 PCR 방법은 정화(Decontamination) 50℃ 2분 1회, 초기변성(Initial denaturation) 95℃ 10분 1회, 변성(Denaturation) 95℃ 15초 40회, 연장(Extension) 60℃ 1분 40회를 실시하는 것을 특징으로 하는 마이코플라스마 뉴모니아균 검출하는 실시간 PCR 방법.
  8. 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균에 특이적인 표적 서열을 증폭할 수 있는 P1 유전자를 이용한 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 PCR 프라이머 세트; 및
    서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 그에 상보적인 올리고뉴클레오티드에서 선택되는 하나 이상의 마이코플라스마 뉴모니아로부터 유래한 핵산에 특이적인 올 리고뉴클레오티드 검출용 프로브를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 프로브의 3' 말단 또는 5'말단이 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED, HEX 및 TET로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광인자로 표지되는 것을 특징으로 하는 마이코플라스마 뉴모니아균 검출용 키트.
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