KR100439532B1

KR100439532B1 - 포도상구균 균종의 항생제 내성의 신속 검출을 위한멀티플렉스 ｐｃｒ

Info

Publication number: KR100439532B1
Application number: KR10-2001-0039493A
Authority: KR
Inventors: 윤병수; 김승한; 이동건; 최정현; 신완식
Original assignee: 주식회사 코메드
Priority date: 2001-07-03
Filing date: 2001-07-03
Publication date: 2004-07-09
Also published as: KR20030003576A

Abstract

본 발명은 포도상구균 균종에 감염된 시료로부터 포도상구균 균종에 항생제 내성을 부여하는 4종의 유전자(mecA, aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝), aph(3´)-Ⅲa및ant(4´)-Ia)를 신속, 정확하게 검출하기 위한 멀티플렉스 PCR 기법(multiplex polymerase chain reaction-based method), 이를 위한 PCR 프라이머 및 이 프라이머를 포함하는 항생제 내성 검사용 키트에 관한 것이다.

Description

포도상구균 균종의 항생제 내성의 신속 검출을 위한 멀티플렉스 ＰＣＲ{Multiplex polymerase chain reaction for rapidly detecting antibiotic resistance of Staphyllococcus strains}

본 발명은 포도상구균 균종에 의해 감염된 시료로부터 포도상구균 균종에 항생제 내성을 부여하는 4종의 유전자(mecA, aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝), aph(3´)-Ⅲa및ant(4´)-Ia)를 신속, 정확하게 검출하기 위한 멀티플렉스 PCR 기법, 이를 위한 PCR 프라이머 및 이 프라이머를 포함하는 항생제 내성 검사용 키트에 관한 것이다.

일반적으로 병원내 감염의 주요 원인균인 황색포도상구균(17.2%)은 수술부위감염(28.3%), 폐렴(23.5%), 균혈증(15.5%) 등을 유발시키므로, 이를 치료하기 위한 많은 항생제들이 개발되어 있다.

그러나, 최근에 이들 항생제에 대한 내성을 갖는 균주가 증가하고 있어 감염치료에 많은 어려움이 있다. 예를 들면, 미국의 경우에는 병원에서 분리된 황색포도상구균 중 메티실린 내성균의 비율이 1975년 2.4%에서 1996년에 35%로 증가하는 추세이고, 우리나라의 경우에도 1960년대까지는 메티실린 내성 황색 포도상구균의 보고가 없었으나, 1977년 박 등의 보고에서 메티실린 내성 황색 포도상구균이 약 5%를 차지한다고 보고되었고, 1980년 이후 그 비율이 급격히 증가하여 최근에는 70~80%를 상회하고 있는 실정이다(참고문헌 1).

또한, 황색 포도상구균과 마찬가지로 대다수의 코아귤라제 음성 포도상구균도 메티실린 내성을 보여 invasive monitoring, 혈관내 카테터(intravascular catheters), 인공심판막(prosthetic heart valves) 또는 관절(joint)과 관련된 원내 균혈증(bacteremia)에 중요한 원인균으로 증가추세에 있다.

따라서, 내성균들에 대해서도 감수성을 갖는 새로운 항생제의 개발이 요구되었고, 그 결과, 메티실린 내성 포도상구균 균종에 대한 항생제로서 반코마이신 (vancomycin)과 같은 글리코펩티드계 항생제가 개발되어 선택약제로서 사용되고 있다.

그러나, 메티실린 내성 황색 포도상구균에 의한 심내막염과 같은 심부 감염에서는 반코마이신을 단독 사용할 경우에는 치료되지 않는다는 보고가 있었다. 따라서, 반코마이신과 병합사용할 때 높은 상승효과를 나타내어 내성 포도상구균에높은 감수성을 갖는 리팜핀(Rifampin)에 대한 연구가 행해졌는데, 이들 연구에 대한 결과는 매우 다양하게 보고되고 있다(참고문헌 9~15).

한편, 30S 리보솜의 서브유닛(Ribosomal subunit)에 결합하여 감염균내의 단백질 생합성을 억제하여 항생제 효과를 나타내는 것으로 알려진 아미노글리코시드계 항생제가 유럽 등에서 중증 포도상구균증의 치료에 이용될 수 있다는 것이 알려져 있다(참고문헌 19~21). 특히, 아미노글리코시드계 항생제 중에서 젠타마이신 (Gentamycin)과 토브라마이신(Tobramycin)은 포도상구균증에 대한 가장 강력한 항생제로서, 감염균의 세포벽 생합성을 억제하는 β-락탐계 항생제(예를 들면, 페니실린, 세팔로스포린, 모노백텀(monobactam), 카르바페넴(carbapenem)) 또는 글리코펩타이드계 항생제(반코마이신, 테이코플라닌(teicoplanin))와 같이 사용하는 경우 높은 상승효과를 나타내며, 더욱이, 아미노글리코시드계 항생제는 주로 초기 6시간이내에 살균효과를 보이기 때문에, 후기효과가 주를 이루는 β-락탐계 항생제 또는 글리코펩타이드 항생제와 병용하여 사용하는 경우 세균의 재성장을 억제하는데 탁월하다고 알려져 있다(참고문헌 22~23).

따라서, 환자가 포도상구균 균종에 감염되었을 경우 β-락탐계 항생제 또는 글리코펩타이드계 항생제와 아미노글리코시드계 항생제를 병용하여 치료에 사용하여왔다. 그러나, 아미노글리코시드계 항생제에 대해서도 내성을 갖는 세균이 존재하여 치료에 많은 장애를 초래하고 있으므로, 감염된 균이 아미노글리코시드계 항생제에 대하여 내성을 갖는 균인지를 확인하여 적합한 항생제를 선택하여야 한다.

결국, 환자가 포도상구균 균종에 감염되었을 경우, 이들이 β-락탐계 항생제또는 글리코펩타이드계 항생제에 내성을 갖는 균인지 또는 아미노글리코시드계 항생제에 내성을 갖는 균인지를 정확하고 신속하게 판정하여야만 감염환자들의 치료시 적합한 항생제를 선택하여 치료할 수 있다.

이를 위하여 종래에는 감염이 의심되는 환자로부터 채취한 시료에서 균을 분리하여 배양하고, 동정한 다음, 다시 생화학적 검사에 의해 항생제에 대한 감수성 검사를 실시하였다. 그러나, 이 방법은 시료로부터 균을 분리하고 배양하는데 하루 이상이 소요되고, 또한 감수성 검사에도 하루 이상이 소요되므로(참고문헌 29), 빠르고, 신속하게 환자를 진단하고 치료할 수 없는 문제점이 있다.

따라서, 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 포도상구균 균종에 항생제 내성을 부여하는 유전자를 중합효소 연쇄반응법(polymerase chain reaction: 이하 ˝PCR˝이라 함)으로 검출하는 방법이 제안되었고, 구체적으로 예를 들면, 포도상구균에 메티실린 내성을 부여하는mecA유전자를 PCR로 검출하는 방법이 제안되었다(참고문헌 30~33).

그러나, 이 방법은 β-락탐계 항생제인 메티실린에 대한 내성여부만을 판단할 수 있으므로, 아미노글리코시드계 항생제에 대한 내성은 별도로 판정을 해야하는 번거로움이 있다.

이에, 본 발명자들은 감염환자가 지닌 포도상구균 균종이 메티실린 및 아미노글리코시드계 항생제에 대하여 내성을 갖는지를 동시에 판정할 수 있는 방법을 연구하게 되었다.

그 결과로, 아미노글리코시드계 항생제의 활성을 나타내는 아미노글리코시드의 구조를 변형시켜 내성을 유발하는 효소들로서, 아세틸트랜스퍼라제 (acetyltransferase)를 코딩하는aac,o-뉴클레티딜트랜스퍼라제(o-nucletidyl-transferases)를 코딩하는ant및o-포스포트랜스퍼라제(o-phosphotransferases)를 코딩하는aph를 PCR로 검출하는 방법을 착안하였다.

이러한 유전자로는aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝), aph(3´)-Ⅲa, ant(4´)-Ia등이 있는데,aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝)은 2관능성 효소를 코딩하는 유전자로서, 포도상구균과 코아귤라제 음성 포도상구균에 젠타마이신(gentamicin), 토브라마이신 (tobramycin) 및 카나마이신(Kanamycin)에 대한 내성을 부여하며, 플라즈미드인 pSK1, pSK41군 내에 Tn4001의 의한 트랜스포존(transposon) 형태로 존재하고, 다양한 플라즈미드 및 염색체 DNA에서 발견되는 유전자이다.ant(4´)-Ⅰa은 네오마이신(Neomycin) 카나마이신, 토브라마이신 및 아미카신(amikacin)에 대한 내성을 부여하고, 초기에는 작은 플라즈미드에서 pSK41과 같은 큰 플라즈미드로 삽입된 후 추측컨데 IS-257 재조합의 결과로 연속적으로 황색포도상구균의 염색체상의 메티실린 내성 유전자인 mecA 부근으로 삽입되어지는 유전자이다(참고문헌 25~27). 또한,aph(3´)-Ⅲa는 포도상구균에서 네오마이신과 카나마이신에 대한 내성을 부여하며, Tn5405에 의한 트랜스포존 형태로 존재하고, 염색체와 플라스미드 모두에 존재하는 유전자이다(참고문헌 28).

따라서, 감염환자가 지닌 포도상구균 균종의 아미노글리코시드계 항생제에 대한 내성을 확인하기 위하여aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝), aph(3´)-Ⅲa및ant(4´)-Ⅰa유전자도 mecA 유전자와 마찬가지로 PCR 방법으로 검출하고자 하였으나, 이 또한 각각의 유전자들에 대한 검출이 별도로 이루어져야 하는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 4종의 유전자에 대한 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있도록 공통의 반응조건을 갖는 프라이머를 개발하고자 하였고,mecA, aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝), aph(3´)-Ⅲa및ant(4´)-Ⅰa유전자 각각의 PCR용 프라이머를 합성하였으며, 4쌍의 프라이머 모두를 한번의 PCR 반응에 동시에 적용하여 1회의 PCR 수행으로 포도상구균 균종에 항생제에 대한 내성을 부여하는 4종의 유전자를 동시에 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 포도상구균 균종에 항생제 내성을 부여하는 4종의 유전자mecA, aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝), aph(3´)-Ⅲa및ant(4´)-Ⅰa각각에 대한 PCR용 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있는 4종의 유전자mecA, aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝), aph(3´)-Ⅲa및ant(4´)-Ⅰa각각에 대한 PCR용 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 4쌍의 프라이머를 동시에 이용하여 포도상구균 균종에 항생제 내성을 부여하는 유전자를 동시에 검출하기 위한 멀티플렉스 PCR 기법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 4쌍의 검출 프라이머를 포함하는 항생제 내성 검사용 키트를 제공하는 것이다.

도 1은 12 균주에 대하여 본 발명의 멀티플렉스 PCR 기법을 수행한 결과 및 감수성 시험결과를 나타낸 도면이다(괄호는 젠타마이신과 옥사실린의 최소억제농도 (㎍/㎖)이다).

레인 M ... 표지 DNA

레인 1 ... 유전자aph(3´)-Ⅲa와aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝)를 가지고 있는 엔테로콕쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis) BM6217 균주

레인 2 ... 유전자mecA를 갖고 있는 황색 포도상구균 USS1504

레인 3 ... 유전자ant(4´)-Ⅰa를 가지고 있는 황색 포도상구균 BM 3002/ pIP524

레인 4 ... 4종의 유전자형을 모두 포함한 성모병원 분리주 SM 16

레인 5 ... 메티실린 감수성 황색 포도상구균

(젠타마이신(GM) > 128 ㎍/㎖, 옥사실린(Ox): 0.25 ㎍/㎖)

레인 6 ... 메티실린 내성 황색 포도상구균

(GM: 0.25 ㎍/㎖, Ox > 256 ㎍/㎖)

레인 7 ... 메티실린 내성 황색 포도상구균

(GM: 64 ㎍/㎖, Ox: 16 ㎍/㎖)

레인 8 ... 메티실린 감수성 황색 포도상구균

(GM: 32 ㎍/㎖, Ox: 0.25 ㎍/㎖)

레인 9 ... 메티실린 감수성 코아귤라제 음성 포도상구균

(GM < 0.125 ㎍/㎖, Ox < 0.125 ㎍/㎖)

레인 10... 메티실린 내성 코아귤라제 음성 포도상구균

(GM > 256 ㎍/㎖, Ox > 256 ㎍/㎖)

레인 11... 메티실린 감수성 코아귤라제 음성 포도상구균

(GM < 0.125 ㎍/㎖, Ox < 0.125 ㎍/㎖)

레인 12... 메티실린 감수성 코아귤라제 음성 포도상구균

(GM < 0.125 ㎍/㎖, Ox: 2 ㎍/㎖)

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 유전자mecA, aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝), aph(3´)-Ⅲa및ant(4´)-Ⅰa각각의 PCR용 프라이머는 NCBI Genebank에서 찾은 각각의 유전자의 염기서열을 기초하여 합성한 것이다.

포도상구균 균종에 항생제 내성을 부여하는 유전자 검출을 위한 PCR기법은 한쌍의 프라이머 - Forward 프라이머와 Reverse 프라이머 -를 이용하게 되는데, 이들 프라이머의 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머의 복합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg²⁺의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.

또, 본 발명에서와 같이 4종의 유전자에 대한 PCR 프라이머를 혼합하여 동시에 한번의 PCR을 수행함으로써 분리한 항생제 내성 부여 유전자를 한번에 확인하는 멀티플렉스 PCR 반응에서는, 프라이머의 설계시 단독 PCR의 경우와 같은 조건이 더욱 엄격하게 요구되며, 또한 반응완료 후 겔상에서 증폭된 유전자 산물의 구별을 위해서는 유전자 산물의 크기가 각각 구별이 되어야 하는 크기의 제약까지 따른다. 반응조건의 설정에 있어서도 4쌍의 프라이머 모두에 대한 공통의 반응조건이 설정되어야 하므로 단독 PCR에 비해서 매우 어려운 조건 설정 과정이 요구된다.

본 발명에 의해 제공되는 4종의 유전자에 대한 4쌍의 프라이머들은 이러한 멀티플렉스 PCR 기법에 적합하도록 개발된 것으로서, 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있어 1회의 PCR 수행으로 4종의 유전자를 동시에 고감도로 검출할 수 있다. 본 발명에서 개발된 포도상구균 균종에 항생제 내성을 부여하는 4종의 유전자에 대한 PCR용 프라이머들은 다음의 표 1과 같다.

항생제 내성 부여 유전자	5´→ 3´ 염기서열	증폭산물의 크기
mecA	F: CCTAGTAAAGCTCCGGAA(서열번호 1)R: CTAGTCCATTCGGTCCA(서열번호 2)	314bp
aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝)	F: GAAGTACGCAGAAGAGA(서열번호 3)R: ACATGGCAAGCTCTAGGA(서열번호 4)	491bp
aph(3´)-Ⅲa	F: AAATACCGCTGCGTA(서열번호 5)R: CATACTCTTCCGAGCAA(서열번호 6)	242bp
ant(4´)-Ⅰa	F: AATCGGTAGAAGCCCAA(서열번호 7)R: GCACCTGCCATTGCTA(서열 번호 8)	135bp

본 발명의 4종의 유전자에 대한 각쌍의 프라이머들은 공통의 PCR 조건을 갖고 있어 한번의 PCR 반응에 동시에 적용하는 것을 가능케한다. 본 발명의 프라이머들의 PCR 조건은 다음의 표 2와 같다.

반응 혼합물
10×완충액	2.5 ㎕
10 mM의 dNTP	0.5 ㎕
프라이머 (100 pmols/㎕)	각 0.5 ㎕
주형 DNA	50~100 ng
Taq 폴리머라제	0.5 unit
총 25 ㎕

PCR 반응은 특별한 언급이 없는 한, 우선 주형이 되는 DNA를 1본쇄로 변성시키기 위하여 95℃에서 5분간 열처리를 한 후, 95℃에서 2분간 DNA를 변성하는 단계 (denaturation); 58℃에서 30초간의 어닐링(annealing)단계; 72℃에서 30초간 DNA합성단계(extension)를 총 30회 반복하여 PCR 증폭을 실시하며, 마지막 DNA 합성단계는 72℃에서 7분간 실시한다. 반응이 끝난 PCR 증폭 산물을 브로모에티듐 2.5 ㎍/㎖를 가한 0.5×TAE를 전기영동 완충액으로 하여 2.5%의 한천겔에서 전기영동을 실시한 다음, UV 트랜스일루미네이터(transilluminator)하에서 관찰한다.

본 발명의 방법이 적용되는 포도상구균 균종은 그 종류가 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 황색 포도상구균, 코아귤라제 음성 포도상구균, 메티실린 황색 포도상구균, 메티실린 내성 코아귤라제 음성 포도상구균 등이 바람직하다.

본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 기법은 단 한번의 PCR을 수행함으로써 포도상구균 균종에 메티실린 내성과 아미노글리코시드계 항생제 내성을 부여하는 4종의 유전자의 존재 유무를 확인할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 기법의 결과를 토대로 하여 포도상구균 균종에 감염된 환자에게 적합한 항생제를 선정할 수 있으므로, 포도상구균 감염환자를 정확하고 신속하게 치료할 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>멀티플렉스 PCR 기법의 표준균주 적용시험:

4종의 균주에 대하여 본 발명의 멀티플렉스 PCR 기법을 수행하였다. 균주 엔테로콕쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis) BM6217(프랑스 파스퇴르 연구소의 Dr. P. Courvalin로부터 입수)는 유전자aph(3´)-Ⅲa와aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝)갖고 있는 균주이고, 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) USS1504(프랑스 파스퇴르 연구소의 Dr. P. Courvalin로부터 입수)는 유전자mecA를 갖고 있는 균주이며, 황색 포도상구균 BM 3002/pIP524(프랑스 파스퇴르 연구소의 Dr. P. Courvalin로부터 입수)는 유전자ant(4´)-Ⅰa를 갖고 있는 균주이다. 또한, 카톨릭대학 카톨릭중앙의료원에서 분리한 SM 16 균주(메티실린 내성 황색포도상구균)는 상기한 4가지 유전자를 모두 가지고 있는 균주이다. 이들 균주로부터 주형이 되는 유전자를 추출하여 상기한 PCR 조건으로 PCR 증폭을 실시하였다. 반응 종료후 브로모에티듐을 0.5 ㎍/㎖를 가한 0.5×TAE를 전기영동 완충액으로 하여 2.5%의 한천겔에서 전기영동을 실시한 다음, UV 트랜스일루미네이터(transilluminator)하에서 관찰하였다. 그 결과는 도 1의 레인 1~4에 나타내었다.

유전자aph(3´)-Ⅲa밴드는 242bp에서,aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝)는 491bp에서, mecA는 314bp에서, ant(4´)-Ⅰa는 135bp에서 확인되었다.

<실시예 2>

(1) 가검물로부터 균주 분리 및 균종의 동정

카톨릭대학교 카톨릭중앙의료원 각과에서 임상병리과에 의뢰된 상처부위, 혈액, 소변, 가래(sputum)등에서 채취한 균주를 MicroScan Pos Combo Panel Type 6(Baxter Diagnostics, USA)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 동정하였다.

그 다음, 옥사실린이 함유된 디스크를 이용하여 디스크확산법으로 메티실린 내성을 갖는 균주를 동정하였다.

동정된 균주를 20% 글리세롤이 포함된 BHI(Brain-heart infusion, Difco, USA) 액체배지에 풀어서 -70℃로 보관하면서, 이중 무작위로 8개의 균주(메티실린 내성 황색 포도상구균 2종, 메티실린 감수성 황색 포도상구균 2종, 메티실린 내성 코아귤라제 음성 포도상구균 1종 및 메티실린 감수성 코아귤라제 음성 포도상구균3종)를 선택하여 사용하였다.

(2) 최소억제농도(Minimum Inhibitory Concentration; MIC) 측정

항생제에 대한 감수성 시험은 National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)의 지침에 따라 한천 희석법으로 시행하였다(참고문헌 34). 상기 (1)에서 동정된 균주들을 계대배양하고, 18∼24시간 후에 성장한 균집락을 0.5의 McFarland 혼탁도를 갖는 균 부유액으로 만들었다. 항생제로서 메티실린과 옥사실린을 0.125 ㎍/㎖에서 512 ㎍/㎖까지의 농도로 Mueller-Hinton 한천 배지(BactoR Muller-Hinton Agar, Difco, USA)에 첨가하여 준비하고, 0.5 McFarland의 균 부유액을 10배 희석한 후 2 ㎕를 취하여 성장 대조군부터 시작하여 저농도, 고농도의 배지 순으로 접종하였다. 이것을 37℃에서 24시간 배양한 후 투명 조명하에서 균 성장의 증거가 있는지 관찰하였다. 상기 과정을 1회 반복하여 최소억제농도를 확인하였다. 한편, 여기서 메티실린 대신에 옥사실린을 사용한 것은 메티실린이 불안정하기 때문에 메티실린 감수성 세균을 내성으로 잘못 판단할 수 있기 때문이다.

그 결과, 황색 포도상구균 중, 젠타마이신(이하, ´GM´이라함) > 128 ㎍/㎖이고, 옥사실린(이하, ´Ox´이라함)이 0.25 ㎍/㎖인 균주, GM이 0.25 ㎍/㎖이고, Ox > 256 ㎍/㎖인 균주, GM이 64 ㎍/㎖이고, Ox가 16 ㎍/㎖인 균주 및 GM이 32 ㎍/㎖이고, Ox가 0.25 ㎍/㎖인 균주와, 코아귤라제 음성 포도상구균 중, GM < 0.125 ㎍/㎖이고, Ox < 0.125 ㎍/㎖인 균주, GM > 256 ㎍/㎖이고, Ox > 256 ㎍/㎖인 균주, GM < 0.125 ㎍/㎖이고, Ox < 0.125 ㎍/㎖인 균주 및 GM > 0.128 ㎍/㎖이고, Ox > 2 ㎍/㎖인 균주를 하기의 시험에 사용하였다.

(3) DNA의 분리

상기 (2)의 황색 포도상구균 및 코아귤라제 음성 포도상구균들을 brain heart infusion agar에서 36~48시간 동안 배양한 후, 그 중 한 집락을 마이크로루프를 이용하여 채취한 후, BHI(Brain-heart infusion, Difco, USA) 액체배지 1 ㎖에 접종하여 24시간 진탕배양하였다.

배양한 균주들로부터 QIAamp DNA mini kit(QIAGEN # 51306)를 사용하여 DNA를 분리하였다. 분리방법을 간략히 기술하면 다음과 같다.

균주를 1 ㎖의 액상 BHI배지에 접종한 후, 37℃에서 100 rpm의 속도로 회전하며 24시간 동안 배양하였다. 배양후 7,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 균의 펠렛을 얻었다. 그 다음, 상층액을 제거한 후, 20 ㎕의 리소자임(20 ㎎/㎖)이 함유된 인산완충용액 PBS 200 ㎕로 균의 펠렛을 잘 혼합하고, 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 1시간 후, 20 ㎕의 단백질분해효소 K와 200 ㎕의 Lysis buffer를 각각 첨가한 후, 잘 섞어 56℃에서 30분간 배양하였다. 배양후 여기에 200 ㎕의 에탄올을 첨가하고 잘 섞은 후 용해질(lysate)을 QIAamp spin column에 중층한 후, 6,000×g(8,000 rpm)에서 1분간 원심분리하였다. 그 다음, kit에서 제공하는 방법으로 세척 및 DNA를 분리하였다.

(4) 멀티플렉스 PCR법

멀티플렉스 PCR을 수행하여 상기에서 분리한 DNA의 유전형을 결정하였다. 즉, 10×반응 완충액 2.5 ㎕, dNTP(2.5 μM) 0.5 ㎕, 서열번호 1~8의 각각의 프라이머(100 pM) 0.5 ㎕, Taq polymerase(GIBCO-BRL, USA) 0.5 ㎕씩, 완충액인 소혈청알부민을 농도가 0.05%되게 하여 50~100 ng의 각 분리된 주형 DNA에 첨가한 후, 최종적으로 25 ㎕가 되게 멸균된 증류수로 혼합하였다. 혼합된 반응액을 GeneCycler (BioRad, USA)를 이용하여 증폭하였다. 반응조건은 95℃에서 5분간 열처리를 한 후, 95℃에서 2분간의 DNA 변성단계(denaturation); 58℃에서 30초간의 어닐링(annealing)단계; 72℃에서 30초간 DNA 합성단계(extension)를 총 30회 반복하여 PCR 증폭을 실시하며, 마지막 DNA 합성단계는 72℃에서 7분간 실시하였다. PCR 증폭 산물을 확인하기 위하여 전체 결과물중 10 ㎕를 취하여 0.5 ㎍/㎖의 농도로 브로모에티듐을 가한 0.5×TAE를 전기영동 완충액으로 하여 2.5%의 한천겔에서 100 V로 1시간 동안 전기영동을 실시한 다음, UV 트랜스일루미네이터 하에서 관찰하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

(5) 멀티플렉스 PCR결과와 항생제 감수성 시험결과의 연관성 분석 상기

상기 (2)의 메티실린(GM)과 옥사실린(Ox)의 최소억제농도 결과와, 상기 (4)의 멀티플렉스 PCR에 의해 결정된 항생제 내성 유전자의 표현형과의 연관성을 분석하였다.

그 결과, 메티실린 감수성 황색포도구균인 레인 8의 경우 젠타마이신에 대한 최소억제농도가 32 ㎍/㎖에서aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝)가 관찰되지만, 옥사실린에는 낮은 최소억제농도(0.25 ㎍/㎖)를 보이므로mecA가 관찰되지 않았다. 반면에, 메티실린 내성 포도구균인 레인 6의 경우 낮은 젠타마이신 최소억제농도(0.25 ㎍/㎖)와 높은 옥사실린 최소억제농도(256 ㎍/㎖)를 보이므로mecA가 관찰되었다. 이로부터, 젠타마이신 내성을 부여하는aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝),메티실린 내성을 부여하는mecA의 유전형과 각각의 항생제 감수성 시험의 결과가 밀접한 연관성을 보인다는 알 수 있다.

또한, 레인 7의 경우에는ant(4´)-Ia가aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝)및mecA와 함께 관찰되었는데, 이는ant(4´)-Ia가 염색체 상에 메티실린 내성 유전자인 mecA 부근에 함께 존재하는 이유에 기인하기 때문인 것으로 해석될 수있다. 메티실린 감수성 코아귤라제 음성 포도상구균인 레인 11의 경우에는 최소억제농도가 모두 0.125 ㎍/㎖이하이므로, 관련된 내성 유전자가 관찰되지 않았다.

또한,aph(3´)-Ⅲa유전형의 경우 젠타마이신과 같이 아미노글리코시드계 항생제 내성과 밀접한 관계가 있다고 알려져있으며 유전자상에서aac(6´)- Ⅰe+aph(2˝)와 밀접한 관련이 있어 이 유전형이 보통의 경우aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝)에 의해 가리워질 수 있다고 알려져있다. 감수성 결과시 정확히 옥사실린이나 젠타마이신에서 보인 것과 같은 유형을 보이지 않고 산발적으로 발견된다.

따라서, 항생제 내성 검사를 위해 일반적으로 널리 이용되는 항생제 감수성 검사(한천 희석법)와 본 발명의 멀티플렉스 PCR 결과에서 확인된 항생제 내성 유전자와는 밀접한 연관관계가 있음이 확인되었으므로, 본 발명의 방법은 신속하고 정확하게 포도상구균 균종에 대한 항생제 내성을 검사할 수 있는 방법이다.

더구나, mecA는 감수성 결과 옥사실린 4 ㎍/㎖ 이상이면 황색포도구균 또는 코아귤라제 음성포도구균 상관없이 PCR결과물에 mecA유전형을 보이며 마찬가지로aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝)는 젠타마이신 감수성결과가 32 ㎍/㎖ 이상이면 유전형을 보이는데, 레인 12의 경우 옥사실린 감수성결과가 2 ㎍/㎖이고, 분류도 메티실린 감수성 코아귤라제 음성 포도상구균으로되어 있으나, 본 발명의 방법에 따르면 메티실린 내성 코아귤라제 음성 포도상구균으로 판명할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 기존 항생제 감수성 결과에 비해 보다 민감하며 정확하다는 것을 알 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 포도상구균 균종에 항생제 내성을 부여하는 4종의 유전자에 대한 각쌍의 프라이머들은 공통의 PCR 조건을 갖고 있어 한번의 PCR 반응에 동시에 적용하는 것을 가능케하며, 이들 4쌍의 프라이머 모두를 동시에 이용하는 본 발명의 멀티플렉스 PCR 기법은 단 한번의 PCR을 수행함으로써 감염환자로부터 분리된 포도상구균에 대한 항생제 내성을 신속, 정확하게 확인 할 수 있으므로, 신속, 정확하게 감염환자를 맞는 항생제를 선정하여 치료할 수 있다.

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Claims

포도상구균 균종의 항생제 내성을 검출하는데 있어서,mecA, aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝), aph(3´)-Ⅲa및ant(4´)-Ⅰa의 4종 유전자를 증폭하는 서열번호 1∼8의 염기서열을 갖는 프라이머를 동시에 사용하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR기법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 포도상구균 균종은 황색 포도상구균, 메티실린 내성 황색 포도상구균, 코아귤라제 음성 포도상구균 또는 메티실린 내성 코아귤라제 음성 포도상구균임을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 기법.
제 1항에 기재된 멀티플렉스 PCR 기법에 사용되는 메티실린 내성 유전자mecA를 검출하기 위한 서열 번호 1 내지 2의 PCR용 프라이머.
제 1항에 기재된 멀티플렉스 PCR 기법에 사용되는 아미노글리코시드계 항생제 내성 유전자aac(6´)-Ⅰe+aph(2˝)를 검출하기 위한 서열 번호 3 내지 4의 PCR용 프라이머.
제 1항에 기재된 멀티플렉스 PCR 기법에 사용되는 아미노글리코시드계 항생제 내성 유전자aph(3´)-Ⅲa를 검출하기 위한 서열 번호 5 내지 6의 PCR용 프라이머.
제 1항에 기재된 멀티플렉스 PCR 기법에 사용되는 아미노글리코시드계 항생제 내성 유전자ant(4´)-Ⅰa를 검출하기 위한 서열 번호 7 내지 8의 PCR용 프라이머.
서열번호 1 내지 8의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 포도상구균 균종의 항생제 내성을 검출하기 위한 키트.