JPH05227958A - セルラーゼの精製方法およびセロビオースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 セルラーゼ中に含まれるβ−グルコシダーゼ
を選択的に除去する。 【構成】 キトサンが可溶となるようにｐＨを調製して
なる水性媒体中に、上記キトサンとセルラーゼとを溶解
して溶液を調製し、該溶液を一定時間保温した後に、該
溶液ｐＨを変化させ、不溶化した固形画分を生ぜしめ、
しかる後に、上記固形画分と溶液とを分離することによ
り、上記セルラーゼ中に含有されるβ−グルコシダーゼ
を選択的に除去してセルラーゼを精製する。得られた上
記固形画分とセルロースとを水性媒体中に添加して懸濁
液とし、該懸濁液を一定時間保温して、該懸濁液中にセ
ロビオースを生成蓄積せしめ、該セロビオースを採取す
ることによりセロビオースを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、セルラーゼの精製方法
およびセロビオースの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】セロビオースは、Ｄ−グルコースが、β
−１，４結合した二糖類のオリゴ糖である。このセロビ
オースは松葉，トウモロコシの茎中にも存在する天然物
で甘味を伴うが、人間によって分解されない。したがっ
て、経済的にセロビオースを製造することができれば、
ダイエット食品，健康食品あるいは糖尿病患者に対する
甘味料として有効であると考えられる。

【０００３】ここで、従来、セロビオースの製造は、セ
ルロースを希塩酸などで酸化分解し、糖化した後、これ
をゲルクロマトグラフィー等で精製することにより行わ
れてきた。しかし、このような酸化分解法は、糖化速度
が比較的速いものの、高圧，耐酸性設備を必要とし、ま
た２次的分解によりセロビオースの収率が減少するなど
の欠点がある。これに対して、酵素を利用した分解法が
考えられ、該分解法は、糖化速度が比較的遅いものの、
温和な条件下で実施できるため装置上有利であり、かつ
触媒となる酵素の回収再利用が可能となるなどの利点が
ある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、セルロース分
解酵素として市販されているセルラーゼ製剤は複合酵素
系であり、セロビオースの製造にとって好ましくない酵
素成分も含まれている。より詳しくいうと、セルラーゼ
製剤は大別して３種類の酵素成分が含まれている。ま
ず、このうち、エンドグルカナーゼは、結晶性の低いセ
ルロース分子を不規則に切断し、重合度のより低いセル
ロースを生じる。次いで、セロビオハイドロラーゼは、
セルロース分子を非還元末端から逐次セロビオース単位
に分解する。最後に、β−グルコシダーゼは、セロビオ
ースをさらに加水分解する酵素成分である（Ｚ．Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．ｃｈｅｍ．，７８，２６６（１９１２），
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．５９，４８５（１９５０），
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．ｓｏｃ．，３３，１８１（１９７
９）等参照）。このように、セルラーゼ製剤には、β−
グルコシダーゼが含まれているので、このようなセルラ
ーゼ製剤を使用して、酵素法によりセロビオースを生産
する場合には、セルラーゼ成分中から選択的にβ−グル
コシダーゼを除去した後、あるいはβ−グルコシダーゼ
のみを選択的に阻害・失活させた後、セルロースに作用
させる必要がある。

【０００５】一方、このためのβ−グルコシダーゼの分
離方法については、イオン交換樹脂などを分離剤として
分離する方法が報告されている（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，６，３３６（１９８４），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，１４６，３０１（１９８５），Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，３０１（１９９
０））。しかし、イオン交換樹脂等の分離抽出剤は高価
でありかつ操作が複雑であるため、実用的でない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に対して、β−グルコシダーゼを選択的に除去する方法
について、鋭意検討を行った。

【０００７】特に、本発明者らは、タンパク質吸着剤と
して既知の高分子であるキトサンに着目した。キトサン
は、種々の化学修飾を施す多孔質ビーズの原料であり、
固定化酵素法（フードケミカル ２（１１），６５（１
９８６），Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６
５，４９３（１９８７））、あるいはキトサンをカプセ
ル化し、それを用いた微生物の高密度培養法（Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ ３，９（１９８
１）、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
４，４８（１９８８）、３ｒｄ Ｉｎｔ Ｃｏｎｆ．ｏ
ｎ ｃｈｉｔｉｎ／ｃｈｉｔｏｓｏｎ（１９８５））な
どに近年採用されている。ただし、キトサンに対するセ
ルラーゼ酵素成分の選択的な吸着性については、全く研
究されていなかった。

【０００８】本発明は第１に、キトサンが可溶となるよ
うにｐＨを調製してなる水性媒体中に上記キトサンとセ
ルラーゼとを溶解した溶液を調製し、該溶液を一定時間
保温した後に、該溶液のｐＨを変化させ、不溶化した固
形画分を生ぜしめ、しかる後に、上記固形画分と溶液と
を分離することにより、上記セルラーゼ中に含有される
β−グルコシダーゼを選択的に除去するようにしたセル
ラーゼの精製方法を要旨とする。

【０００９】本発明は第２に、上記セルラーゼの精製方
法によって、得られた上記固形画分とセルロースとを水
性媒体中に添加して懸濁液とし、該懸濁液を一定時間保
温して、該懸濁液中にセロビオースを生成蓄積せしめ、
該セロビオースを採取することにより成るセロビオース
の製造方法を要旨とする。

【００１０】本発明において用いる脱アセチル化キチン
であるキトサンは、β−１，４ポリグルコサミン構造を
有し、その脱アセチル化度が６０％以上で、ｐＨ６以上
のｐＨ条件により水溶性を可逆的に失うｐＨ応答性可溶
不溶可逆高分子である。かかるものとして、アブシデア
属，チコール属，カンジダ属，ネウロスポラ属，モルチ
エレラ属，フィコミセス属，リソプス属，リゾプス属，
アスベルジルス属，ペニシリウム属，アガリスクス属，
スポロポロミセス属，アロミセス属などの糸状菌の細胞
壁、あるいはカイコガ，ゴミムシダマシ，バッタ，ゴキ
ブリなどの昆虫類、およびオキアミ，カニ，エビなどの
甲殻類の外骨格より得られたキチンを濃アルカリ溶液中
で脱アセチル処理したものを例示できる。

【００１１】本発明に用いられる酵素、すなわちセルラ
ーゼとしてはトリコデルマ属，アスベルギルス属，ペニ
シリウム属，ペリキュラリア属，アクレモニウム属，フ
ミコラ属などの糸状菌より得られたもの、バチルス属，
セルロモナス属などの好気性細胞，クロストリジウム
属，ルミノコッカス属などの好気性細菌，あるいはスト
レプトマイセス属などの放線菌などから得られたものを
例示できる。

【００１２】本発明にかかるセルラーゼ精製方法におい
ては、キトサンの添加量を水性媒体に対して０．１〜１
重量％とし、セルラーゼの添加量を水性媒体に対して
０．２〜２重量％とし、キトサンに対するセルラーゼの
比率を１〜３とすることが好適である。

【００１３】また、上記セルラーゼの精製方法において
は、ｐＨ２〜５好ましくはｐＨ３〜５の水性媒体中にキ
トサンおよびセルラーゼを溶解し、１〜６０℃好ましく
は５〜１０℃で０．１〜１０時間、好ましくは１〜３時
間保温した後、溶液内のｐＨをｐＨ６〜９、好ましくは
ｐＨ６〜７に変化させて不溶化した固形画分を生ぜしめ
ることが好適である。

【００１４】上記セルラーゼの精製方法においては、上
記不溶化した固形画分は遠心分離、ろ過などの手段によ
って分解され、回収される。以上の操作をおこなうこと
により、原料セルラーゼ成分中の９５％以上のβ−グル
コシダーゼを除去できる。すなわち、β−グルコシダー
ゼを除去したセルラーゼの残余の精製（有効）酵素成分
は、不溶化した固体担体としてのキトサン（固形画分）
に結合され、いわゆる固定化酵素として固形画分中に担
持されることとなる。

【００１５】本発明にかかるセロビオースの製造方法に
おいて原料として用いられるセルロースとしては、広葉
樹および針葉樹の木質部より得られたものの他、農業廃
棄物であるワラ，単糖系原料となるサトウキビ，炭化水
素植物であるゴム，水性植物であるホテイアオイなどよ
り得られたものを例示できる。

【００１６】上記セロビオースの製造方法において、上
記懸濁液におけるセルロースの添加量は水性媒体に対し
て１〜２０重量％好ましくは３〜１５重量％、上記固形
画分の添加量は水性媒体に対して０．１〜２重量％好ま
しくは０．５〜２重量％、セルロースに対する上記固形
画分の比率は０．０５〜０．２とすることが好適であ
る。

【００１７】また、上記懸濁液は、ｐＨ３〜５好ましく
はｐＨ４〜５とし、２０〜６０℃の条件で一定時間保温
されることが好適である。保温時間としては、少なくと
も１時間以上であることが好適である。

【００１８】上記セロビオースの製造方法では、上記の
ように懸濁液を一定時間保温した後、固形画分と溶液と
を遠心分離，ろ過などで分離し、この溶液画分を回収し
てセロビオース溶液を得る。この溶液中の全生成糖中の
セロビオース含量は８５重量％以上である。上記溶液画
分をｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ６〜７に変化させ、溶
液中のキトサンを不溶化し、遠心分離，ろ過などにより
固形画分を溶液画分と分離する。この溶液画分から公知
の方法によりセロビオースが精製される。

【００１９】上記固形画分は、精製酵素成分を担持した
キトサンであり、これを繰り返し再利用し、セロビオー
スを製造することができる。このような固形画分の回収
・再利用により、連続的なセロビオースの製造が可能と
なる。

【００２０】本発明にかかるセルラーゼの精製方法およ
びセロビオースの製造方法で用いることができる水性媒
体としては、水あるいはＮａＣｌ，ＫＣｌ等の塩溶液，
リン酸，酢酸，クエン酸等を含む緩衝液を例示すること
ができる。なお、水性媒体のこれらの塩または酸等の濃
度は、０．０１Ｍ〜１Ｍとすることが好ましい。

【００２１】

【作 用】本発明にかかるセルラーゼの精製方法では、
β−１，４ポリグルコサミン構造を有し、酸可溶型であ
るキトサンとセルラーゼ製剤とが、酵素の至適ｐＨ範囲
でかつキトサンが可溶化するｐＨ条件の水性媒体中に加
えられる。これらは、十分混合された後、酵素が失活し
ない範囲でｐＨがアルカリ側へ移行され、そのキトサン
を不溶化して固形画分とした後、遠心分離あるいはろ過
などの方法を用いて、上清液を取り除くことによりβ−
グルコシダーゼがこの上清液中に選択的に除去されるこ
ととなる。すなわち、セルラーゼ成分中に含まれている
β−グルコシダーゼを高価な分離抽出剤を用いることな
く、他の成分酵素が失活しない程度のわずかなｐＨ変化
を行なうことによって容易に取り除くことができる。な
お、上記固形画分中の精製酵素成分は当業者にとって公
知の手段により、固形画分中から抽出して利用すること
も勿論できる。

【００２２】本発明にかかるセルロースの製造方法で
は、β−グルコシダーゼを除去した精製酵素成分が吸着
しているキトサン不溶化物（固形画分）とセルロースと
を酵素の至適ｐＨ範囲で、この不溶化物が可溶化するｐ
Ｈ条件の水性媒体中で反応させることにより、高収率で
セロビオースを製造できる。

【００２３】さらに、セロビオースの製造方法におい
て、上記のように、キトサンに吸着した状態で固定化酵
素として精製酵素成分を使用した場合には、固定化担体
となるキトサンがセルラーゼにより分解されず安定であ
り、かつ、水に可溶な状態で酵素反応がおこなわれるた
め、近年広く試みられている不溶性担体（ポリアクリル
アミド，ポリスチレン，イオン交換樹脂）に酵素を包括
する固定化法の最大の欠点である担体内部への基質の拡
散の悪化に起因して起こる見かけ活性の低下という問題
点を解消できる。したがって、酵素の繰り返し再利用が
可能となるため、従来の酸分解と比べ、十分な経済的効
果が得られる。

【００２４】

【実施例】実施例１ キトサン（カニ甲羅由来、シグマ・ケミカル
（Ｃｏ．）製０．５ｇとトリコデルマ起源のセルラーゼ
製剤（メイセラーゼ ＣＥＰ−６１３０、明治製菓株式
会社）１ｇを１００ｍｌの０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．
０に溶解１．５℃で２時間保温した後、溶液内のｐＨを
ｐＨ７．０に調製し、キトサンを不溶化状態として固形
画分と溶液を遠心分離し、固形画分を回収した。固形画
分中に含まれたβ−グルコシダーゼの残存活性比は３．
７％であり、９５％以上のβ−グルコシダーゼを除去す
ることができた。その後、該固形画分１ｇと市販品であ
るセルロース粉末１０ｇを１００ｍｌの同緩衝液ｐＨ
５．０に懸濁して３０℃で１０時間保温した。比較例と
してキトサンによるセルラーゼの精製を行わないセルラ
ーゼ製剤０．５ｇとセルロース粉末１０ｇを１００ｍｌ
の同緩衝液ｐＨ５．０に懸濁して３０℃で１０時間保温
し、得られたそれぞれの糖化液中のセロビオース含量を
定量した。結果を表１に示す。

【００２５】

【表１】

【００２６】実施例２ 実施例１と同じ条件でセルラ
ーゼを精製した後、糖化反応を行ない得られた糖化液の
ｐＨをｐＨ７．０に調製し、キトサンを不溶化状態とし
て固形画分と溶液を遠心分離し、該固形画分を回収した
後、再び実施例１と同様の条件で糖化反応を繰り返し、
セロビオース含量を定量した。その結果を表２に示す。

【００２７】

【表２】

【００２８】上記実施例１，２におけるセロビオースの
定量は、高速液体クロマトグラフィーを用いた。すなわ
ちＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＣＬＣ−ＮＨ₂ （φ６．０ｍｍ
×１５ｃｍ）カラムを用いて溶出させ、示差屈折計を用
いて行った。またβ−グルコシダーゼ活性の測定は、ｐ
−ニトロフェニル−β−グルコピラノシドを基質として
生成するｐ−ニトロフェノールをＯ．Ｄ．４２０での吸
光度を測定することにより行なった。また、生成された
全還元糖の定量はソモジーネルソン法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，１９５，１９（１９５２））によりＯ．
Ｄ．６６０での吸光度を測定して行った。

【００２９】

【発明の効果】本発明にかかるセルラーゼの精製方法に
よれば、酸可溶型の脱アセチル化キチンであるキトサン
を使用することにより、イオン交換樹脂などの高価な分
離抽出剤を使用せずに、しかも、酵素活性が失活しない
程度のわずかなｐＨ変化で容易にセルラーゼ成分中から
β−グルコシダーゼのみを活性比で９５％以上除去でき
るため、精製のための煩雑な操作が省略でき、精製工程
に要する時間が従来の半分以下に短縮される。

【００３０】また、本発明にかかるセロビオースの製造
方法によれば、β−グルコシダーゼを除去した精製セル
ラーゼ成分とセルロースを反応させることにより８５重
量％以上の高収率でセロビオースを製造することができ
る。

【００３１】さらにキトサンに吸着した状態で固定化酵
素として精製したセルラーゼを使用した場合には、見か
け活性の低下という問題点を解消でき、酵素の繰り返し
再利用も可能となるため、従来の酸分解法によるセロビ
オースの製造法と比べ、十分な経済的効果が得られ、健
康食品，ダイエット食品，あるいは糖尿病患者に対する
甘味料として、セロビオースの工業用途への利用拡大に
つながる。また、原料であるセルロースは地球全体で生
産されるバイオマス（木材，ふん尿，農業廃棄物，海草
など）の大半を占めており、それらの有効的な利用法と
いう点でも本発明は効果的である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 キトサンが可溶となるようにｐＨを調整
   してなる水性媒体中に上記キトサンとセルラーゼとを溶
   解した溶液を調製し、該溶液を一定時間保温した後に、
   該溶液のｐＨを変化させ、不溶化した固形画分を生ぜし
   め、しかる後に、上記固形画分と溶液とを分離すること
   により、上記セルラーゼ中に含有されるβ−グルコシダ
   ーゼを選択的に除去するようにしたセルラーゼの精製方
   法。
2. 【請求項２】 キトサンが脱アセチル化キチンであり、
   その脱アセチル化度が６０％以上であり、ｐＨ６以上の
   ｐＨ条件により水溶性を可逆的に失うｐＨ応答性可溶不
   溶可逆高分子であることを特徴とする請求項１に記載の
   セルラーゼの精製方法。
3. 【請求項３】 キトサンの添加量が水性媒体に対して
   ０．１〜１重量％であり、セルラーゼの添加量が水性媒
   体に対して０．２〜２重量％であり、キトサンに対する
   セルラーゼの比率が１〜３であることを特徴とする請求
   項１または２のいずれかに記載のセルラーゼの精製方
   法。
4. 【請求項４】 上記溶液を保温する際のｐＨが２〜５で
   あり、温度が０〜６０℃であり、保温時間が０．１〜１
   ０時間であることを特徴とする請求項１ないし３のいず
   れか一に記載のセルラーゼの精製方法。
5. 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれか一に記載の
   セルラーゼの精製方法により得られた上記固形画分とセ
   ルロースとを水性媒体中に添加して懸濁液とし、該懸濁
   液を一定時間保温して、該懸濁液中にセロビオースを生
   成蓄積せしめ、該セロビオースを採取することにより成
   るセロビオースの製造方法。
6. 【請求項６】 上記懸濁液におけるセルロースの添加量
   が水性媒体に対して１〜２０重量％であり、上記固形画
   分の添加量が水性媒体に対して０．１〜２重量％であ
   り、セルロースに対する上記固形画分の比率が０．０５
   〜０．２であることを特徴とする請求項５に記載のセロ
   ビオースの製造方法。
7. 【請求項７】 上記懸濁液を保温する際のｐＨが３〜５
   であり、温度が２０〜６０℃であることを特徴とする請
   求項５または６のいずれか一に記載のセロビオースの製
   造方法。