CN107686854B - 利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法；该方法先将裂褶菌斜面菌种采用PDA培养基重新接种活化及培育，得发酵种子液；接入发酵种子液，在搅拌速度为100～250rpm，通气速率为0.2～0.7vvm，培养温度为26‑29℃条件下连续培养和发酵，然后进行陶瓷微滤膜分离，滤液中的多糖由酶解改性，改性多糖经分离，得改性多糖；本发明改性多糖的分子量由4000kDa以上降解为1500kDa以下，24小时内在蒸馏水中完全溶解。本发明方法利用菌体自身分泌的酶对多糖进行降解，不仅解决了专一性酶难以获得的问题，而且工艺大大简化，降低了生产成本，是一种具有工业化潜力获得可溶性多糖的方法。
Description
技术领域
本发明涉及裂褶多糖，特别是涉及一种利用裂褶菌发酵体系自产酶对发酵多糖进行酶解改性的方法；获得的裂褶多糖分子量适宜，溶解度好，可应用于生物医药、保健品、化妆品等行业领域。
背景技术
裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.)是一种十分重要的食药兼用真菌，含有丰富的生理活性物质。裂褶多糖(SPG)是从裂褶菌子实体、菌丝体或发酵液中提取出来的水溶性多糖，结构以β-(1-3)糖苷为主链，具有β-(1-6)糖苷为侧链的β-D-葡聚糖。SPG具有抑制肿瘤、抗菌消炎、抗辐射、提高机体免疫力等多种生理活性。但由于裂褶多糖的分子量大、水溶性差，不利于生物吸收入体内发挥生物活性，极大的限制了多糖的应用。尤其是，该多糖进行干燥后，很难复溶，影响了其应用。对其进行适度降解，降低分子量，可提高水溶性和生物利用度；但降解分子量最好不低于50kDa，否则裂褶多糖将失去活性。
目前裂褶多糖降解方法主要有化学降解法、物理降解法和生物降解法。化学降解法主要是酸降解，由于化学降解法分子量不易控制，且易降解成小分子，因此难以产业化；物理降解主要是超声波降解，然而超声降解效率较低，成本较高。
生物酶解法由于条件温和，是一种较好的降解方法。通常采用的方法是先从发酵液纯化得到多糖，再添加外源酶进行降解，由于裂褶多糖是β-(1-3)糖苷为主链，因此要对它进行酶解必须采用内切β-1,3葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)。由于不同来源的内切β-1,3葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)的酶切特性有很大的区别，很多酶解产物为寡糖，有的为小分子多糖，有的为裂褶多糖的酶解改性产物所需要的较大分子量的多糖。若酶将裂褶多糖酶降至50kDa以下的产物则会使多糖失去活性。例如Grandpierre等报道的利用哈茨木霉(Trichoderma harzianum)来源的内切β-1,3葡聚糖酶液水解可得然多糖，在90h内，反应液中的可得然多糖几乎全部被水解为可溶性低聚糖，其聚合度分布在DP1-4(Grandpierre etal.,2008)。总体来讲，目前商业化的内切β-1,3葡聚糖酶不多，价格较昂贵，而且一般活性较低，水解效率较差、水解时间较长，水解过程不易调控，水解产物中以小分子为主。因此，针对裂褶多糖的酶解改性，要找到满足要求将难溶的大分子裂褶多糖(分子量在4000kDa以上)降解为溶解性较好的分子量较小的裂褶多糖(分子量在50-1500kDa)的内切β-1,3葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)很难。
发明内容
针对目前对于裂褶多糖降解改性一般是先分离提纯获得多糖后，再进行降解，且专一性酶难于获得的现状，本发明提供一种基于裂褶菌在发酵产裂褶多糖过程中体系自身分泌的一种内切β‐1,3‐葡聚糖酶对裂褶多糖进行降解的方法，从而获得分子量相对较低(分子量一般在1500kDa以下)，水溶性较好(即多糖经干燥后再复溶时溶解性较好)的降解改性裂褶多糖；将难溶的大分子裂褶多糖(分子量在4000kDa以上)降解为溶解性较好的分子量较小的裂褶多糖。
本发明利用裂褶菌在发酵过程中发酵体系本身产生的内切葡聚糖酶对发酵多糖进行降解，首次提出基于裂褶菌在培养过程中自身分泌一种内切β‐1,3‐葡聚糖酶对发酵产生的裂褶多糖进行降解改性。该发明方法要点：采用液体深层培养法培养裂褶菌，通过调整培养基成分，控制初始pH值、温度、培养时间，并调控培养过程中搅拌转速和通氧量的变化，采用分段控温工艺，分别使裂褶多糖和内切β‐1,3‐葡聚糖酶产生和积累，然后分离除去菌丝体，并在一定条件下利用含β‐1,3‐葡聚糖酶的发酵液进一步酶解，降低裂褶多糖的分子量。
本发明目的通过如下技术方案实现：
利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法，于包括如下步骤：
1)发酵种子液的制备：将裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.)斜面菌种采用PDA培养基重新接种活化培育，得活化的斜面种子；取经活化的斜面种子在液体培养基中摇瓶培养，得发酵种子液；其中，裂褶菌菌种(Schizophyllum commune Fr.)于2014年10月购自于广东省微生物菌种保藏中心。
2)裂褶菌深层发酵，裂褶多糖及内切β‐1,3‐葡聚糖酶的积累：接入发酵种子液，在搅拌速度为100～250rpm，通气速率为0.2～0.7vvm，培养温度为26-29℃条件下连续培养72-96小时；监测发酵罐中还原糖的残留量，当还原糖的残留量在15-18g/L时，调节pH至4.6-5.0，提高温度至29‐32℃，通气速率控制为0.5～1.0vvm，继续发酵24-48小时，发酵结束；
3)陶瓷微滤膜分离：发酵液进入陶瓷微滤膜分离器，将裂褶菌菌丝体与液体培养基分开；
4)多糖酶解改性：除去裂褶菌菌丝体的发酵液利用自身体系的内切β‐1,3‐葡聚糖酶在酶解罐中进行酶解，酶解温度为40‐50℃，调节pH至5.0‐5.5，酶解时间为6‐12小时；酶解结束，升温至70℃以上，保温，灭酶；
5)改性多糖的分离：将酶解液过分子量为2‐10万的超滤膜，除去体系的盐及小分子物质；然后浓缩至原体积的20‐30％，加入乙醇沉淀，得改性多糖。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.)斜面菌种采用PDA培养基培育将接种好的裂褶菌菌种(Schizophyllum commune Fr.)斜面放入26‐28℃的培养箱，在PDA斜面培养基中培养5-7天。
优选地，所述PDA斜面培养基有如下方法制备：将马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸30‐40分钟，用双重纱布过滤，滤汁中加白糖与琼脂，煮沸使琼脂溶解，补足水量至1000mL，分装后0.1MPa灭菌20‐30分钟；每1000mL水中，马铃薯用量为200g，白糖用量为20g，蛋白胨用量为5g，琼脂用量为20g。
优选地，以营养成分浓度计，所述液体培养基的组成为：葡萄糖25‐40g/L，酵母膏2.5‐3g/L，KH2PO4 0.5‐1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.4‐0.5g/L。
优选地，所述取经活化的斜面种子在液体培养基中培养是用接种针挑取菌丝接入装有液体培养基中，在恒温摇床中26-28℃，180-200rpm条件下培养3-4天。
优选地，所述发酵种子液以发酵罐装液量体积的8-10％接种量接入发酵罐培育，装料系数控制为0.6-0.7。
优选地，所述发酵液进入陶瓷微滤膜分离器是发酵液通过与发酵罐底部相连的管道进入陶瓷微滤膜分离器；管道及陶瓷膜分离系统在发酵前事先灭菌。
优选地，步骤4)所述保温的时间为30‐40min。
优选地，所述乙醇的体积浓度为95％；乙醇的加入量为步骤5)浓缩液体积的3‐4倍。
优选地，步骤5)所述改性多糖的分子量由4000kDa以上降解为1500kDa以下，24小时内在蒸馏水中完全溶解(将100mg该多糖溶解于100mL蒸馏水中，多糖先溶胀，并在24小时内完全溶解)。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
1)本发明首次提出利用裂褶菌发酵后期体系自身产内切β‐1,3‐葡聚糖酶对发酵得到的裂褶多糖进行降解从而获得分子量较小多糖的方法。该发明方法采用液体深层发酵法，通过调整培养温度、搅拌转速、溶氧量等参数，提高裂褶多糖产率，在发酵后期促进内切β‐1,3‐葡聚糖酶的产生，并在发酵结束后利用所产生的内切葡聚糖酶对裂褶多糖进行降解改性。
2)与现有裂褶多糖的降解方法相比，本发明方法利用菌体自身分泌的酶对多糖进行降解，不仅解决了专一性酶难以获得的问题，而且与传统的分离提纯多糖后再进行降解的工艺大大简化，降低了生产成本，是一种具有工业化潜力降解方法。
附图说明
图1为实施例1条件下酶降解前裂褶多糖的GPC洗脱曲线；
图2为实施例1条件下酶降解后裂褶多糖的GPC洗脱曲线；
图3为实施例2条件下酶降解前裂褶多糖的GPC洗脱曲线；
图4为实施例2条件下酶降解后裂褶多糖的GPC洗脱曲线；
图5为实施例3条件下酶降解前裂褶多糖的GPC洗脱曲线；
图6为实施例3条件下酶降解后裂褶多糖的GPC洗脱曲线；
图7为实施例1、2、3条件下酶降解后裂褶多糖与未酶解前裂褶多糖的溶解性能对比图。
具体图实施方式
为更好地支持本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式不限如此。
实施例1
1)培养基组成及发酵种子液制备：
(1)裂褶菌菌种(Schizophyllum commune Fr.)斜面菌种活化，采用PDA培养基；裂褶菌菌种(Schizophyllum commune Fr.)于2014年10月购自于广东省微生物菌种保藏中心，该菌种的保藏编号为GIM5.43。
PDA斜面培养基组成：将马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸30分钟，用双重纱布过滤，滤汁中加白糖与琼脂，煮沸使琼脂溶解，补足水量至1000mL；每1000mL水中，马铃薯用量为200g，白糖用量为20g，蛋白胨用量为5g，琼脂用量为20g。分装后0.1MPa灭菌20分钟。
种子的活化：取预告制备好的冷却后的试管斜面，在超净台中采用取样环从购买的试管斜面菌种中取菌丝然后在新制备的试管斜面上划线接种。然后将接种好的斜面放入26℃的培养箱中培养7天。
(2)液体培养基的配制：葡萄糖25g/L，酵母膏3g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，按比例配制后在121℃灭菌20min备用；
(3)种子液摇瓶培养：在超净台中取经活化的斜面菌种，用接种针挑取菌丝接入装有100mL液体培养基的250mL的三角瓶中，在恒温摇床中26℃，180rpm条件下培养3天，作为发酵种子液。
2)裂褶菌深层发酵，裂褶多糖及内切β‐1,3‐葡聚糖酶的积累：摇瓶培养的发酵种子液以发酵罐装液量体积的10％的接种量接入7L发酵罐，发酵罐的装料系数0.67(即发酵罐加入培养基及种子液共计7*0.67＝4.69L)。搅拌速度150r/min，通气速率0.4vvm，培养温度27℃，连续培养90小时时监测到发酵罐中还原糖的残留量17g/L时，采用浓度为0.5mol/LNaOH调节pH至4.6，提高温度至29℃，通气速率0.8vvm，继续发酵30小时。发酵结束。
3)陶瓷微滤膜分离：培养结束，发酵液通过与发酵罐底部相连的管道进入陶瓷微滤膜分离器(管道及陶瓷膜分离系统在发酵前事先灭菌)，将裂褶菌菌丝体与液体培养基分开。
4)多糖酶解改性：经陶瓷微滤膜分离除去裂褶菌菌丝体的透过液被引入至酶解罐中，利用自身体系的内切葡聚糖酶在酶解罐中酶解(采用酶活测定方法测得酶活为10.8u/mL)。酶解条件为：温度为40℃，采用0.5mol/L NaOH碱调节体系pH至5.0，酶解时间为6小时。酶解结束，升温至70℃，保温30min灭酶。
5)改性多糖的分离：将酶解液过市售的Millipore密理博Pellicon XL切向流超滤膜包pxb050A50(分子量50kD)，除去体系的盐及小分子物质。然后浓缩至原体积的30％，加入3倍体积95％乙醇沉淀，得改性多糖15.1g。
通过对酶解前后的多糖的分子量进行GPC分析，结果分别如图1、图2所示。由GPC洗脱曲线中大分了先出峰的规律可知，降解改性前的多糖的分子量(GPC洗脱曲线如图1所示)要显著高于酶解后多糖的分子量(GPC洗脱曲线如图2所示)。经计算，降解改性前的多糖的平均分子量为5340kDa，分散性系数为2.15，酶解后多糖的平均分子量为1232kDa，分散性系数为2.89。
为了比较酶解前后多糖的溶解性能，分别取20mg酶解前后经干燥的多糖样品，加蒸馏水20mL进行溶解，发现酶解改性后多糖的干燥样品溶解性能较好，而酶解前的溶解性差(如图7所示)，可以看出图中最左边的试管中的裂褶多糖样品依然没有溶解(试管中存在米黄色不溶物)，而酶解后的样品则溶解，试管中呈现清澈透明的溶液。
实施例2
1)培养基组成及发酵种子液制备：
(1)裂褶菌菌种(Schizophyllum commune Fr.)斜面菌种活化，采用PDA培养基；裂褶菌菌种(Schizophyllum commune Fr.)于2014年10月购自于广东省微生物菌种保藏中心，该菌种的保藏编号为GIM5.43。
PDA斜面培养基组成：将马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸35分钟，用双重纱布过滤，滤汁中加白糖与琼脂，煮沸使琼脂溶解，补足水量至1000mL；每1000mL水中，马铃薯用量为200g，白糖用量为20g，蛋白胨用量为5g，琼脂用量为20g。分装后0.1MPa灭菌25分钟。
种子的活化：取预告制备好的冷却后的试管斜面，在超净台中采用取样环从购买的试管斜面菌种中取菌丝然后在新制备的试管斜面上划线接种。然后将接种好的斜面放入27℃的培养箱中培养6天。
(2)液体培养基的配制：葡萄糖30g/L，酵母膏2.9g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，按比例配制后在121℃灭菌25min备用；
(3)种子液摇瓶培养：在超净台中取经活化的斜面菌种，用接种针挑取菌丝接入装有100mL液体培养基的250mL的三角瓶中，在恒温摇床中27℃，190rpm条件下培养3天，作为发酵种子液。
2)裂褶菌深层发酵，裂褶多糖及内切β‐1,3‐葡聚糖酶的积累：摇瓶培养的种子液以发酵罐装液量体积的10％的接种量接入7L发酵罐,装料系数0.60。搅拌速度200r/min,通气速率0.5vvm，培养温度28℃，连续培养84小时时监测到发酵罐中还原糖的残留量15g/L时，采用浓度为0.5mol/L NaOH调节pH至4.8，提高温度至30℃，通气速率0.8vvm，继续发酵36小时。发酵结束，进行菌体分离。
3)陶瓷微滤膜分离：培养结束，发酵液通过与发酵罐底部相连的管道进入陶瓷微滤膜分离器(管道及陶瓷膜分离系统在发酵前事先灭菌)，将裂褶菌菌丝体与液体培养基分开。
4)多糖酶解改性：经陶瓷微滤膜分离除去裂褶菌菌丝体的透过液被引入至酶解罐中利用自身体系的内切β‐1,3‐葡聚糖酶在酶解罐中酶解(采用酶活测定方法测得酶活为10.2u/mL)。酶解条件为：温度为45℃，采用0.5mol/L NaOH碱调节体系pH至5.2，酶解时间为10小时。酶解结束，升温至70℃，保温30min灭酶。
5)改性多糖的分离：将酶解液过购置的Millipore密理博U650605 Pellicon XL超滤膜包Pellicon XL切向流超滤膜包pxb030A50(分子量30kD)，除去体系的盐及小分子物质。然后浓缩至原体积的30％，加入3倍体积95％乙醇沉淀，得改性多糖14.6g。
通过对酶解前后的多糖的分子量进行GPC分析，结果分别如图3、图4所示。由GPC洗脱曲线中大分了先出峰的规律可知，降解改性前的多糖的分子量(GPC洗脱曲线如图3所示)要显著高于酶解后多糖的分子量(GPC洗脱曲线如图4所示)。经计算，降解改性前的多糖的平均分子量为5260kDa，分散性系数为2.23，酶解后多糖的平均分子量为1150kDa，分散性系数为2.97。
为了比较酶解前后多糖的溶解性能，分别取20mg酶解前后经干燥的多糖样品，加蒸馏水20mL进行溶解，发现酶解改性后多糖的干燥样品溶解性能较好，而酶解前的溶解性差(如图7所示)，可以看出图中最左边的试管中的裂褶多糖样品依然没有溶解(可见试管中存在米黄色不溶物)，而酶解后的样品则溶解，试管中呈现清澈透明的溶液。
实施例3
1)培养基组成及发酵种子液制备：
(1)裂褶菌菌种(Schizophyllum commune Fr.)斜面菌种活化，采用PDA培养基；裂褶菌菌种(Schizophyllum commune Fr.)于2014年10月购自于广东省微生物菌种保藏中心，该菌种的保藏编号为GIM5.43。
PDA斜面培养基组成：将马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸40分钟，用双重纱布过滤，滤汁中加白糖与琼脂，煮沸使琼脂溶解，补足水量至1000mL；每1000mL水中，马铃薯用量为200g，白糖用量为20g，蛋白胨用量为5g，琼脂用量为20g。分装后0.1MPa灭菌30分钟。
种子的活化：取预告制备好的冷却后的试管斜面，在超净台中采用取样环从购买的试管斜面菌种中取菌丝然后在新制备的试管斜面上划线接种。然后将接种好的斜面放入28℃的培养箱中培养7天。
(2)液体培养基的配制：葡萄糖35g/L，酵母膏2.8g/L，KH2PO4 0.8g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，按比例配制后在121℃灭菌30min备用；
(3)种子液摇瓶培养：在超净台中取经活化的斜面菌种，用接种针挑取菌丝接入装有100mL液体培养基的250mL的三角瓶中，在恒温摇床中27℃，200rpm条件下培养4天，作为发酵种子液。
2)裂褶菌深层发酵，裂褶多糖及内切β‐1,3‐葡聚糖酶的积累：摇瓶培养的种子液以发酵罐装液量体积的10％的接种量接入7L发酵罐,装料系数0.65。搅拌速度240r/min,通气速率0.6vvm，培养温度29℃，连续培养78小时时监测到发酵罐中还原糖的残留量16g/L时，采用浓度为0.5mol/L NaOH调节pH至5.0，提高温度至31℃，通气速率1.0vvm，继续发酵48小时。发酵结束，进行菌体分离。
3)陶瓷微滤膜分离：培养结束，发酵液通过与发酵罐底部相连的管道进入陶瓷微滤膜分离器(管道及陶瓷膜分离系统在发酵前事先灭菌)，将裂褶菌菌丝体与液体培养基分开。
4)多糖酶解改性：经陶瓷微滤膜分离除去裂褶菌菌丝体的透过液被引入至酶解罐中利用自身体系的内切β‐1,3‐葡聚糖酶在酶解罐中酶解(采用酶活测定方法测得酶活为11.4u/mL)。酶解条件为：温度为50℃，采用0.5mol/L NaOH碱调节体系pH至5.5，酶解时间为12小时。酶解结束，升温至70℃，保温30min灭酶。
5)改性多糖的分离：将酶解液过购置的Millipore密理博U650603 Pellicon XL超滤膜包Pellicon XL切向流超滤膜包pxb010A50(分子量10kD)，除去体系的盐及小分子物质。然后浓缩至原体积的28％，加入3倍体积95％乙醇沉淀，得改性多糖14.1g。
通过对酶解前后的多糖的分子量进行GPC分析，结果分别如图5、图6所示。由GPC洗脱曲线中大分了先出峰的规律可知，降解改性前的多糖的分子量(GPC洗脱曲线如图5所示)要显著高于酶解后多糖的分子量(GPC洗脱曲线如图6所示)。经计算，降解改性前的多糖的平均分子量为5290kDa，分散性系数为2.19，酶解后多糖的平均分子量为1150kDa，分散性系数为3.02。
为了比较酶解前后多糖的溶解性能，分别取20mg酶解前后经干燥的多糖样品，加蒸馏水20mL进行溶解，发现酶解改性后多糖的干燥样品溶解性能较好，而酶解前的溶解性差(如图7所示)，可以看出图中最左边的试管中的裂褶多糖样品依然没有溶解(可见试管中存在米黄色不溶物)，而酶解后的样品则较易溶解，试管中最终呈现清澈透明的溶液。
Claims (10)
1.利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）发酵种子液的制备：将裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）斜面菌种采用PDA培养基重新接种活化培育，得活化的斜面种子；取经活化的斜面种子在液体培养基中摇瓶培养，得发酵种子液；
2）裂褶菌深层发酵，裂褶多糖及内切β-1,3-葡聚糖酶的积累：接入发酵种子液，在搅拌速度为100～250rpm，通气速率为0.2～0.7vvm，培养温度为26-29℃条件下连续培养72-96小时；监测发酵罐中还原糖的残留量，当还原糖的残留量在15-18g/L时，调节pH至4.6-5.0，提高温度至29-32℃，通气速率控制为0.5～1.0vvm，继续发酵24-48小时，发酵结束；
3）陶瓷微滤膜分离：发酵液进入陶瓷微滤膜分离器，将裂褶菌菌丝体与液体培养基分开；
4）多糖酶解改性：除去裂褶菌菌丝体的发酵液利用自身体系的内切β-1,3-葡聚糖酶在酶解罐中进行酶解，酶解温度为40-50℃，调节pH至5.0-5.5，酶解时间为6-12小时；酶解结束，升温至70℃以上，保温，灭酶；
5）改性多糖的分离：将酶解液过分子量为2-10万的超滤膜，除去体系的盐及小分子物质；然后浓缩至原体积的20-30%，加入乙醇沉淀，得改性多糖。
2.根据权利要求1所述的利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法，其特征在于，所述裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）斜面菌种采用PDA培养基培育将接种好的裂褶菌菌种（Schizophyllum commune Fr.）斜面放入26-28℃的培养箱，在PDA斜面培养基中培养5-7天。
3.根据权利要求1所述的利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法，其特征在于，所述PDA斜面培养基由如下方法制备：将马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸30-40分钟，用双重纱布过滤，滤汁中加白糖与琼脂，煮沸使琼脂溶解，补足水量至1000mL，分装后0.1MPa灭菌20-30分钟；每1000mL水中，马铃薯用量为200g，白糖用量为20g，蛋白胨用量为5g，琼脂用量为20g。
4.根据权利要求1所述的利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法，其特征在于，以营养成分浓度计，所述液体培养基的组成为：葡萄糖25-40g/L，酵母膏2.5-3g/L，KH2PO4 0.5-1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.4-0.5g/L。
5.根据权利要求1所述的利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法，其特征在于，所述取经活化的斜面种子在液体培养基中培养是用接种针挑取菌丝接入装有液体培养基的摇瓶中，在恒温摇床中26-28℃，180-200rpm条件下培养3-4天。
6.根据权利要求1所述的利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法，其特征在于，所述发酵种子液以发酵罐装液量体积的8-10%接种量接入发酵罐培育，装料系数控制为0.6-0.7。
7.根据权利要求1所述的利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法，其特征在于，所述发酵液进入陶瓷微滤膜分离器是发酵液通过与发酵罐底部相连的管道进入陶瓷微滤膜分离器；管道及陶瓷膜分离系统在发酵前事先灭菌。
8.根据权利要求1所述的利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法，其特征在于，步骤4）所述保温的时间为30-40min。
9.根据权利要求1所述的利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法，其特征在于，所述乙醇的体积浓度为95%；乙醇的加入量为步骤5）浓缩液体积的3-4倍。
10.根据权利要求1所述的利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法，其特征在于，步骤5）所述改性多糖的分子量由4000kDa以上降解为1500kDa以下，24小时内在蒸馏水中完全溶解。
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