CN113563488A - 一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，包括以下步骤：(1)在裂褶菌发酵接种阶段添加内切葡聚糖酶和/或内切纤维素酶，发酵完成后获得海洋真菌发酵液；(2)高压均质海洋真菌发酵液，使菌丝体破壁，得海洋生物多糖均浆液；(3)调节海洋生物多糖均浆液的pH值，并加入复合酶酶解；(4)将步骤(3)中复合酶酶解后的海洋生物多糖均浆液加热灭酶活，过滤灭酶活后的产物，向滤液中加入无水乙醇搅拌均匀过滤，向过滤所得醇沉物中加入水加热搅拌复溶，将醇沉复溶液过树脂柱，利用离子交换层进一步脱去海洋生物多糖中的色素和蛋白质，利用制备型凝胶柱色谱分级，获得不同分子量的海洋生物多糖滤液，干燥即可。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物工程技术领域，具体涉及一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法。
背景技术
生物多糖(polysaccharides)具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗辐射、降低胆固醇、降血糖等多种功能，其中多糖的抗肿瘤及免疫调节作用倍受关注，已经成为肿瘤治疗的热点之一。目前，从海洋生物中获得了越来越多结构新颖、作用独特的生物活性多糖，有望成为肿瘤治疗中新的药物资源。海洋中的生物多糖主要分为三大类：海洋动物多糖、海藻多糖和海洋微生物代谢产生的多糖。海洋动物多糖包括贝类、刺参、海胆等生物中所含有的多聚糖及酸性粘多糖。海藻多糖是指海藻中所含的各种高分子碳水化合物，包括褐藻酸、褐藻酸胶、绿藻中的硫酸多糖、红藻中的琼胶、卡拉胶等。海洋微生物多糖主要指的是微生物胞外多糖，多从海泥、海水和海藻中的细菌分离出来。
海洋微生物多糖是由细菌、真菌(不含大型真菌)等微生物所生成的多糖，它们生产周期短、不受季节、地域和病虫害条件限制、原料来源丰富廉价、成本相对较低，可以在人工控制条件下进行大规模工业化生产，且产量高、纯化简单，对环境无污染，因而具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。
海洋真菌多糖不易溶于水、粘度较大、分子量分布范围广，发酵液含有大量的菌丝体，成分、结构复杂，寻找一种有效、合理的医药级海洋真菌多糖制备方法是迫切需要解决的问题。目前食药用菌多糖的提取技术主要有：(1)水提醇沉法； (2)碱提取法；(3)酸提取法：(4)微波提取法；(5)酶提取法；(6)超声提取法等。这些方法中水提醇沉法的提取率低；碱(或酸)提取法在提取过程中要严格控制酸碱度，否则可能引起多糖中糖苷键的断裂；超声波和微波提取法对多糖的组成和活性有较大的影响。酶工程技术是近年来用于天然植物有效成分提取的一项生物工程技术在海洋多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解组织，提高多糖的提取率。
研究表明海洋生物多糖的分布并非完全线性的，在10kD以下的小分子较多，10kD-100kD的多糖含量较少，100kD以上的大分子多糖也较多，大分子多糖往往结合蛋白。为了更多的获得小分子多糖，一方面需要完成分离，另一方面考虑对大分子多糖进行水解，脱去蛋白。
发明内容
本发明的目的为解决上述现有技术中存在的不足之处，提供一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，达到降低生产成本、提高生物多糖活性、纯度，实现工厂生产医药级小分子海洋生物多糖的目的。
为实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)在裂褶菌发酵接种阶段添加内切葡聚糖酶和/或内切纤维素酶，发酵完成后获得海洋真菌发酵液；
(2)高压均质海洋真菌发酵液，使菌丝体破壁，得海洋生物多糖均浆液；
(3)调节海洋生物多糖均浆液的pH值，并加入复合酶酶解；加入复合酶酶解实现脱色、脱蛋白质、脱单糖、脱寡糖、脱纤维素、脱脂肪、提高小分子海洋生物多糖含量、提高海洋生物多糖纯度的功能；
(4)将步骤(3)中复合酶酶解后的海洋生物多糖均浆液加热灭酶活，过滤灭酶活后的产物，向滤液中加入无水乙醇搅拌均匀过滤，向过滤所得醇沉物中加入水加热搅拌复溶，将醇沉复溶液过树脂柱，利用离子交换层进一步脱去海洋生物多糖中的色素和蛋白质，利用制备型凝胶柱色谱分级，获得不同分子量的海洋生物多糖滤液，干燥海洋生物多糖滤液得医药级小分子海洋生物多糖。
上述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)中，在裂褶菌发酵接种阶段，以发酵物料总投料计添加内切葡聚糖酶1- 8‰和/或内切纤维素酶0.5-5‰，发酵温度28-30℃，发酵周期5-7日。可将二级种子罐扩大培养至10吨发酵灌。
上述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，作为一种优选的实施方案，步骤(2)中，高压均质海洋真菌发酵液的均质压力为85-120MP，均质温度为10- 30℃，均质次数为2-5次。高压均质得到均一、流动性好、低粘度的海洋生物多糖均浆液。
上述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，采用浓度为40％-60％的氢氧化钠调节海洋生物多糖均浆液的pH至6- 8，再加入复合酶酶解。
上述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，所述复合酶为中性蛋白酶和/或葡聚糖酶和/或葡萄糖氧化酶和/或蔗糖酶和/或纤维素酶和/或脂肪酶复合而成。
上述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，复合酶中各种酶的添加量以投入的海洋真菌发酵液计，投入中性蛋白酶1-5‰和/或葡聚糖酶1-10‰，和/或葡萄糖氧化酶1-10‰，和/或蔗糖酶1-5‰，和/或纤维素酶1-5‰，和/或脂肪酶1-3‰，酶解时长为2-6h，酶解温度为40-60℃。
上述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，作为一种优选的实施方案，步骤(4)中，加热灭酶活的温度为80-120℃，灭酶活的时长为15-30min。
上述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，作为一种优选的实施方案，步骤(4)中，采用板框式过滤对灭酶活后的产物进行过滤，向滤液中加入无水乙醇搅拌均匀过滤，加入无水乙醇的体积为滤液体积的1-3倍；向醇沉物中加入水的量为醇沉物重量的1-3倍，加热复溶的温度为75-90℃，搅拌的时长为1-3h。
上述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，作为一种优选的实施方案，步骤(4)中，醇沉复溶液过树脂柱，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去海洋生物多糖中的色素和蛋白质。
上述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，作为一种优选的实施方案，步骤(4)中，获得海洋生物多糖的分子量为：＜1KD、1-10KD、10-50KD、50- 100KD；所述干燥为低温喷雾干燥或冷冻真空干燥。所得医药级小分子海洋生物多糖具有较强免疫活性、抗肿瘤活性、易溶于水、低粘度、人体易吸收、纯度高 (95.0-99.9％)、四种梯度分子量的海洋生物多糖。作为一种优选的实施方案，冷冻干燥的温度为-20℃至-40℃。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明在裂褶菌菌株发酵起始阶段添加内切葡聚糖酶和/或内切纤维素酶利用酶促反应提高了多糖的产量、纯度以及更小的分子量，并利用海洋真菌发酵液反复高压均质降低多糖粘度、增强均浆液流动性、便于物料后处理，均浆液一锅法投料、借助不同酶复合一次酶解脱去了大部分蛋白质、色素、单糖、寡糖、纤维素、脂肪等杂质，使得细胞壁内的多糖释放进一步提高小分子海洋生物多糖的得率，伴随过滤醇提复溶、弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法二次提纯，再用制备型凝胶柱色谱分级，获得高纯度分子量＜1kD、1-10kD、10-50kD、50-100kD的四种小分子海洋生物多糖。
本发明制备的海洋生物多糖分子量小，具有较好的增强免疫力功能、抗肿瘤活性，粘度低易溶于水，人体易吸收，纯度高。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明实施例所述内切葡聚糖酶和内切纤维素酶为市售产品。
所述裂褶菌的保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期为：2016年1月18，保藏编号为： CCTCC NO：M2016055，分类命名：裂褶菌XNY20151228(Schizphylhls commne Fr.XNY20151228)。
实施例1
在裂褶菌发酵接种阶段，不添加内切葡聚糖酶和内切纤维素酶，二级种子罐扩大培养至10吨发酵罐，发酵温度28℃，发酵周期7日，发酵液过滤清液多糖含量为4.5‰，纯度62％，以分子量1-10kD和＞100kD的生物多糖为主。
实施例2
在裂褶菌发酵接种阶段，以发酵物料总投料计添加内切葡聚糖酶4‰，二级种子罐扩大培养至10吨发酵罐，发酵温度28℃，发酵周期6日，发酵液过滤清液多糖含量6.1‰，纯度68％，以分子量＜1kD和1-10kD的生物多糖为主。
实施例3
在裂褶菌发酵接种阶段，以发酵物料总投料计添加内切纤维素酶5‰，二级种子罐扩大培养至10吨发酵罐，发酵温度28℃，发酵周期5日，发酵液过滤清液多糖含量9.7‰，纯度73％，以分子量1-10kD和10-50kD的生物多糖为主。
实施例4
在裂褶菌发酵接种阶段，以发酵物料总投料计添加内切葡聚糖酶4‰和内切纤维素酶3‰，二级种子罐扩大培养至10吨发酵罐，发酵温度28℃，发酵周期6 日，发酵液过滤清液多糖含量17.3‰，纯度81％,以分子量＜1kD、1-10kD和 10-50kD的生物多糖为主。
实施例1-实施例4的发酵液理化指标，如表1所示
表1实施例1-实施例4的发酵液理化指标
综合表1中发酵的结果可以看出，通过酶促反应发酵可以得到分子量更小、纯度更高、产量更高的海洋真菌发酵液。
实施例5
对实施例4中酶促反应发酵的海洋真菌发酵液高压均质3次，均质压力85MPa,均质温度15℃。将制得的海洋生物多糖均浆液用NaOH(浓度为50％)调节 PH值至6.8加入复合酶，复合酶中各种酶的添加量以投入的海洋真菌发酵液计，投入中性蛋白酶2‰、葡聚糖酶2‰、葡萄糖氧化酶4‰，总酶添加量8‰，酶解时长为6小时，酶解温度为40℃。酶解后对酶解液加热灭活，灭活温度80℃，灭活时长30min。
采用板框式过滤对灭酶活后的产物进行过滤，向滤液中加入无水乙醇搅拌均匀过滤，加入无水乙醇的体积为滤液体积的1.2倍；
向醇沉物中加入水进行加热复溶，向醇沉物中加入水的量为醇沉物重量的 1.2倍，加热复溶的温度为75℃，搅拌时长为3h。
将醇沉复溶液过树脂柱，用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法进一步脱去海洋生物多糖中的色素和蛋白质，制备型凝胶柱色谱分级得到4个分子量梯度的海洋生物多糖清液，将所得海洋生物多糖清液冷冻干燥制备小分子海洋生物多糖(纯度95.6，分子量主要分布＜1kD、1-10kD和10-50kD)。
实施例6
对实施例4酶促反应发酵的海洋真菌发酵液高压均质2次，均质压力90mPa, 均质温度30℃。将制得的海洋生物多糖均浆液用NaOH(浓度为55％)调节PH值至 6.5加入复合酶，复合酶中各种酶的添加量以投入的海洋真菌发酵液计，投入中性蛋白酶2‰、葡聚糖酶2‰、葡萄糖氧化酶2‰、蔗糖酶2‰，总酶添加量8‰，酶解时长为4h，酶解温度为48℃。
酶解后对酶解液加热灭活，灭活温度90℃，灭活时长20min。采用板框式过滤对灭酶活后的产物进行过滤，向滤液中加入无水乙醇搅拌均匀过滤，加入无水乙醇的体积为滤液体积的1.5倍；向醇沉物中加入水进行加热复溶，向醇沉物中加入水的量为醇沉物重量的2倍，加热温度为80℃，搅拌时长为3h。
将醇沉复溶液过树脂柱，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去海洋生物多糖中的色素和蛋白质，制备型凝胶柱色谱分级得到4个分子量梯度的海洋生物多糖清液。将所得海洋生物多糖清液喷雾干燥制备小分子海洋生物多糖(纯度96.7，分子量主要分布＜1kD、1-10kD和10-50kD)。
实施例7
对实施例4酶促反应发酵的海洋真菌发酵液高压均质3次，均质压力100mPa, 均质温度25℃。将制得的海洋生物多糖均浆液用NaOH(浓度为60％)调节pH值至 7.0，加入复合酶，复合酶中各种酶的添加量以投入的海洋真菌发酵液计，投入中性蛋白酶3‰、葡聚糖酶5‰、葡萄糖氧化酶5‰、蔗糖酶2‰、纤维素酶3‰，总酶添加量18‰，酶解时长为5h，酶解温度为50℃。
酶解后对酶解液加热灭活，灭活温度85℃，灭活时长30min。采用板框式过滤对灭酶活后的产物进行过滤，向滤液中加入无水乙醇搅拌均匀过滤，加入无水乙醇的体积为滤液体积的1.3倍；向醇沉物中加入水进行加热复溶，向醇沉物中加入水的量为醇沉物重量的2.5倍，加热复溶温度为85℃，搅拌时长为2h。
将醇沉复溶液过树脂柱，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去海洋生物多糖中的色素和蛋白质，制备型凝胶柱色谱分级得到4个分子量梯度的海洋生物多糖清液，将所得海洋生物多糖清液喷雾干燥制备小分子海洋生物多糖 (纯度98.3，分子量主要分布＜1kD、1-10kD和10-50kD)。
实施例8
对实施例4酶促反应发酵的海洋真菌发酵液高压均质4次，均质压力85MPa, 均质温度20℃。将制得的海洋生物多糖均浆液用NaOH(浓度为56％)调节PH值至 7.3，再加入复合酶，复合酶中各种酶的添加量以投入的海洋真菌发酵液计，投入中性蛋白酶4‰、葡聚糖酶5‰、葡萄糖氧化酶6‰、蔗糖酶1‰、纤维素酶2‰、脂肪酶2‰，总酶添加量20‰，酶解时长为4h，酶解温度为52℃。
酶解后对酶解液加热灭活，灭活温度115℃，灭活时长20min。采用板框式过滤对灭酶活后的产物进行过滤，向滤液中加入无水乙醇搅拌均匀过滤，加入无水乙醇的体积为滤液体积的1.3倍；向醇沉物中加入水进行加热复溶，向醇沉物中加入水的量为醇沉物重量的3倍，加热复溶温度为90℃，搅拌时长为1.5h。
将醇沉复溶液过树脂柱，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去海洋生物多糖中的色素和蛋白质，制备型凝胶柱色谱分级得到4个分子量梯度的海洋生物多糖清液，将所得海洋生物多糖清液喷雾干燥制备小分子海洋生物多糖 (纯度99.2，分子量主要分布＜1kD和1-10kD)。
实施例9
对实施例4酶促反应发酵的海洋真菌发酵液高压均质5次，均质压力110MPa, 均质温度15℃。将制得的海洋生物多糖均浆液用NaOH(浓度为54％)调节pH值至 7.5，加入复合酶，复合酶中各种酶的添加量以投入的海洋真菌发酵液计，投入中性蛋白酶5‰、葡聚糖酶6‰、葡萄糖氧化酶6‰、蔗糖酶2‰、纤维素酶3‰、脂肪酶2‰，总酶添加量24‰，酶解时长为5，酶解温度为48℃。酶解后对酶解液加热灭活，灭活温度110℃，灭活时长20min。
采用板框式过滤对灭酶活后的产物进行过滤，向滤液中加入无水乙醇搅拌均匀过滤，加入无水乙醇的体积为滤液体积的1.2倍；向醇沉物中加入水进行加热复溶，向醇沉物中加入水的量为醇沉物重量的2倍，加热复溶温度为85℃，搅拌时长为3h。
将醇沉复溶液过树脂柱，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去海洋生物多糖中的色素和蛋白质，制备型凝胶柱色谱分级得到4个分子量梯度的海洋生物多糖清液，将所得海洋生物多糖清液喷雾干燥制备小分子海洋生物多糖 (纯度99.5，分子量主要分布＜1kD和1-10kD)。
实施例10
对实施例4酶促反应发酵的海洋真菌发酵液高压均质2次，均质压力120MPa, 均质温度为10℃。将制得的海洋生物多糖均浆液用NaOH(浓度为52％)调节pH值至7.4，加入复合酶，复合酶中各种酶的添加量以投入的海洋真菌发酵液计，投入中性蛋白酶5‰、葡聚糖酶7‰、葡萄糖氧化酶7‰、蔗糖酶3‰、纤维素酶3‰、脂肪酶2‰，总酶添加量27‰，酶解时长为6小时，酶解温度为46℃。酶解后对酶解液加热灭活，灭活温度110℃，灭活时长20min。
采用板框式过滤对灭酶活后的产物进行过滤，向滤液中加入无水乙醇搅拌均匀过滤，加入无水乙醇的体积为滤液体积的1.1倍；向醇沉物中加入水进行加热复溶，向醇沉物中加入水的量为醇沉物重量的2.5倍，加热复溶温度为85℃，搅拌时长为3h。。
将醇沉复溶液过树脂柱，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去海洋生物多糖中的色素和蛋白质，制备型凝胶柱色谱分级得到4个分子量梯度的海洋生物多糖清液，将所得海洋生物多糖清液冷冻干燥制备小分子海洋生物多糖 (纯度99.9，分子量主要分布＜1kD和1-10kD)。
表2实施例6-实施例10的理化指标
从表2中可以发现伴随酶种类的及总酶添加量的增加，提纯后得到的海洋生物多糖的纯度进一步提高(可达到99.9％纯度)；同时制得的海洋生物多糖分子量显著下降，更易于被人体所吸收。
综合表1、2中的数据可以看出利用酶促反应发酵；高压均质处理发酵液降低粘度、提高得率；多酶复合酶解法脱杂质、脱色、提高纯度、降低分子量；过滤无水乙醇提复溶；阴、阳离子交换树脂二次提纯；制备型凝胶柱色谱分级等工艺制备的海洋生物多糖具备具有较强免疫活性、抗肿瘤活性、易溶于水、低粘度、人体易吸收、纯度高、分子量小等优点。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在裂褶菌发酵接种阶段添加内切葡聚糖酶和/或内切纤维素酶，发酵完成后获得海洋真菌发酵液；
(2)高压均质海洋真菌发酵液，使菌丝体破壁，得海洋生物多糖均浆液；
(3)调节海洋生物多糖均浆液的pH值，并加入复合酶酶解；
(4)将步骤(3)中复合酶酶解后的海洋生物多糖均浆液加热灭酶活，过滤灭酶活后的产物，向滤液中加入无水乙醇搅拌均匀过滤，向过滤所得醇沉物中加入水加热搅拌复溶，将醇沉复溶液过树脂柱，利用离子交换层进一步脱去海洋生物多糖中的色素和蛋白质，利用制备型凝胶柱色谱分级，获得不同分子量的海洋生物多糖滤液，干燥海洋生物多糖滤液得医药级小分子海洋生物多糖。
2.根据权利要求1所述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，在裂褶菌发酵接种阶段，以发酵物料总投料计添加内切葡聚糖酶1-8‰和/或内切纤维素酶0.5-5‰，发酵温度28-30℃，发酵周期5-7日。
3.根据权利要求1所述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，高压均质海洋真菌发酵液的均质压力为85-120MPa，均质温度为10-30℃，均质次数为2-5次。
4.根据权利要求1所述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，采用浓度为40％-60％的氢氧化钠调节海洋生物多糖均浆液的pH至6-8，再加入复合酶酶解。
5.根据权利要求1所述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述复合酶为中性蛋白酶和/或葡聚糖酶和/或葡萄糖氧化酶和/或蔗糖酶和/或纤维素酶和/或脂肪酶复合而成。
6.根据权利要求5所述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，复合酶中各种酶的添加量以投入的海洋真菌发酵液计，投入中性蛋白酶1-5‰和/或葡聚糖酶1-10‰，和/或葡萄糖氧化酶1-10‰，和/或蔗糖酶1-5‰，和/或纤维素酶1-5‰，和/或脂肪酶1-3‰，酶解时长为2-6h，酶解温度为40-60℃。
7.根据权利要求1所述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，加热灭酶活的温度为80-120℃，灭酶活的时长为15-30min。
8.根据权利要求1所述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，采用板框式过滤对灭酶活后的产物进行过滤，向滤液中加入无水乙醇搅拌均匀过滤，加入无水乙醇的体积为滤液体积的1-3倍；向醇沉物中加入水的量为醇沉物重量的1-3倍，加热复溶的温度为75-90℃，搅拌的时长为1-3h。
9.根据权利要求1所述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，醇沉复溶液过树脂柱，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去海洋生物多糖中的色素和蛋白质。
10.根据权利要求1所述一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，获得海洋生物多糖的分子量为：＜1KD、1-10KD、10-50KD、50-100KD；所述干燥为低温喷雾干燥或冷冻真空干燥。
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