JPH0459910B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は骨形成を助長する骨基質の代用品（以
下人工骨材という）に関するものである。

従来の技術及び問題点 一次骨質又は二次骨質物質の損耗又は消失は常
に整形、再形成外科医に対して再形成、復元の問
題を提起してきた。たとえば腸骨稜、骨端及びた
とえば大髄骨及び脛骨を包含する骨中間部（ｍ(e)
ｔ(a)−phys(e)ｓ）のようなある特定の骨部分に
ついてはそれらを提供者に機械的損傷を惹起すこ
となしに該提供者から取出すことができるとして
も、骨組織の全系統についてそれらの交換部材を
無尽蔵に供給することは不可能である。

人間及び動物の骨を包含する骨保存銀行はその
適用技術の問題を提起し、したがつて骨保存銀行
から得られる骨物質は必ずしも満足にその役割り
を果していなかつた。したがつて多少とも有機物
起源の骨代用物質を探求する努力がなされてき
た。これらの骨代用物質は永久的なもので一時的
なものでもよい。永久的な骨代用物質の場合に
は、かゝる物質の使用によつて骨細胞コロニーが
生じそしてこれらのコロニーは無視し得ないかつ
サンゴに類似した初期機械的耐性をもつ。一時的
な骨代用物質の場合には、時間が経過するにつれ
てかつ強制的に骨組織の機械的及び組織的特性を
徐々に取得し得る骨様組織が形成される。

問題点を解決するための手段、作用及び効果 本発明の一目的は上述した第二の場合、すなわ
ち一時的な骨代用物質の場合に該当し、骨質物質
の損耗又は消去が生起した外傷を受けた組織の処
理において骨形成を助長する能力をもつ骨基質に
相当する組成物を形成するバイオ材料を提供する
にある。

本発明の別の目的は骨と縫合材料的に類似のも
のでありかつ骨形成を助長する能力をもつ人工骨
材を提供するにある。

骨が硬い（rigid）連結組織からなり、骨細胞
及び細胞外基質（matrix）を含包するものであ
ることは既知である。基質は本質的にコラーゲン
繊維、プロテオグリカン類（proteoglycans）及
び無機質から構成される。蛋白質部分は主として
きわめて網状化された１型コラーゲンを含有す
る。この顕著な網状化のために該コラーゲンの完
全な抽出はまず最初に酵素処理を行なわなければ
不可能である。ムコ多糖類部分は本質的に酸性コ
ンドロイチン−４−硫酸からなる。無機質部分は
約85％のヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウム
及び少量のフツ化カルシウム及びフツ化マグネシ
ウムを含有する。この基質は二つの作用をもつ。
第一の作用は支持体としての機械的役割であり、
第二の作用は生命を維持するため及び骨細胞、す
なわち造骨細胞の発育のための選択位置を構成す
る生物学的作用である。

コラーゲン−ヒドロキシアパタイトの混合物に
基づいて興味のある実験がこの分野においてすで
に行なわれた（林ら、Arch.Orthop.Traumat.
and Surg.、99、265〜269、1982）。その結果、
この物質はコラーゲンそれ自体よりも大きい骨形
成効果をもたらすことが認められた。この物質は
常に若干の空腔（cavities）を含むことに留意す
る必要がある。特にコラーゲンは、自然のまゝの
形態（native）であつても又は網状構造を理解す
るように処理されたもの（dereticulated）であ
つても、コラーゲン分解酵素（collagenases）の
作用に敏感で、生体内で分解される。

他方、動物起源のコラーゲンはきわめてしばし
ば人間の治療に使用されるバイオ材料の製造に使
用される。

コラーゲンの免疫原性効果はきわめて低く、特
にそれが螺旋状構造をもつ場合に然りであるが、
種々の動物種の蛋白質の人間への適用における使
用はなお宿主生物による拒否反応（rejection）
をもたらし得る。

さらに、グリコサミノグリカン類は細胞の生合
成活性において及び物質移動（migration）及び
細胞増殖において重要な役割りを果す（I.
Yannas、G.Skover及びD.Michaeli）。

本発明者はさらに、コラーゲンの生分解性及び
免疫原性は非熱水的網状化
（dehydrothermicreticulation）処理によつてコ
ラーゲンに結合されたグリコサミノグリカン類を
使用することによつて本質的に減少せしめ得るこ
とを確認することができた。

従つて、第１の本発明の要旨とするところは、
ヒドロキシアパタイトと一緒に、非熱的網状化結
合によりコラーゲンに結合したグリコサミノグリ
カンの複合物（association）から成ることを特
徴とする、骨形成（オステオゲネシス）を容易に
する能力をもつ人工骨材用組成物にある。

第１の本発明において、コラーゲンは網状構造
をなくしたコラーゲンであるのが好ましい。また
ヒドロキシアパタイトの割合は15％乃至25％の間
であり、グリコサミノグリカンの割合は１％乃至
２％の間であるのが好ましい（これらの割合の％
は１％コラーゲン・ゲルの１当りに基づく％で
ある）。

また、コラーゲンは天然産コラーゲンであるこ
ともできる。コラーゲンの割合は、ヒドロキシア
パタイトの割合と同じであつて且つグリコサミノ
グリカンの割合の６倍の量であることができる。
グリコサミノグリカンは酸性のコンドロイチン−
４−硫酸であることができる。

第２の本発明の要旨とするところは、アテロペ
プタイド・コラーゲンと酸性コンドロイチン−４
−硫酸とヒドロキシアパタイトとの複合物よりな
る人工骨材用組成物を製造する方法において、屠
殺したての小牛から取つた小牛の皮を洗い、つき
潰し、皮の毛及び皮下組織を除き、残つた小牛の
皮を細断及び粉砕し、こうして得た細断、粉砕済
みの小牛の皮をPH7.8のリン酸塩緩衝液で洗い、
こうして洗つた細断、粉砕済みの小牛の皮を遠心
分離して皮の細断、粉砕物を採取し、この皮の細
断、粉砕物を良く水で洗い、次に、この皮の細
断、粉砕物をPH14のNaOH溶液を加えて撹拌下
に処理し、このアルカリ処理されている皮の細
断、粉砕物を約８時間放置し、得られたアルカリ
性の混合物をPH２になるまで塩酸で酸性化し、次
にNaCl濃度が10％になるまでNaClを添加し、次
いで得られた混合物を、無菌の脱イオン水に対し
て透析することによつてコラーゲン（溶液）を作
る工程(a)と；小牛の鼻の中隔部をNaClの水溶液
（水1000部当りNaClの９部）で洗い、この洗つた
鼻中隔部物質を細断及び粉砕し、この鼻中隔部物
質の細断、粉砕物を0.5NのKOH溶液を加えて処
理し、得られた混合物を撹拌し、その混合物を24
時間放置して上清液と沈澱とを形成させ、この上
清液を遠心分離で回収し、この上清液に純粋な酢
酸を加えて水酸化カリウム分を中和し、中和され
た上清液を真空蒸発により５倍に濃縮し、この上
清液濃縮物を３倍量（容量）のエタノールの添加
で希釈し、生じた沈澱を傾しやによつて採取し、
この沈澱を脱イオン水に溶かし、得られた水溶液
を凍結乾燥することによつて酸性のコンドロイチ
ン−４−硫酸を作る工程(b)と；0.5MのCaCl₂溶液
と0.5MのNa₂HPO₄溶液との夫々等量を容器中に
撹拌下に注入して沈澱を作り、この沈澱を傾しや
により分取し更にこの沈澱を水で洗つて懸濁物を
作り、この懸濁物を蒸留水に加え、得られた懸濁
液を調製したての40％NaOH溶液の添加で処理
し、得られた混合物を１時間煮沸し、上清液を傾
しやにより捨て、得られた沈澱を水洗後、沈澱を
PH6.8の0.1M燐酸ナトリウム緩衝液の添加で処理
して懸濁液を形成させ、この懸濁液を煮沸し、さ
らに水を除去してヒドロキシアパタイトを採取す
ることによつてヒドロキシアパタイトを作る工程
(c)と；前記の工程(b)で作つた酸性のコンドロイチ
ン−４−硫酸と工程(c)で作つたヒドロキシアパタ
イトとを工程(a)で得たコラーゲン溶液へ添加する
工程(d)と；工程(d)で得られた生成物を凍結乾燥す
る工程(e)とから成ることを特徴とする、アテロペ
プチド・コラーゲンと酸性コンドロイチン−４−
硫酸とヒドロキシアパタイトとの複合物よりなる
人工骨材用組成物の製造法にある。

更に、第３の本発明の要旨とするところは、天
然産コラーゲンと酸性コンドロイチン−４−硫酸
とヒドロキシアパタイトとの複合物よりなる人工
骨材用組成物を製造する方法において、屠殺した
ての小牛から取つた小牛の皮を洗い、つき潰し、
皮の毛及び皮下組織を除き、残つた小牛の皮を細
断及び粉砕し、こうして得た細断、粉砕済みの小
牛の皮をPH7.8のリン酸塩緩衝液で洗い、こうし
て洗つた細断、粉砕済みの小牛の皮を遠心分離し
て皮の細断、粉砕物を採取し、この皮の細断、粉
砕物を良く水で洗い、次に、この皮の細断、粉砕
物に酢酸を加えて処理し、この酢酸処理に際し、
溶液中のコラーゲンの濃度が10％で且つ酢酸の濃
度がコラーゲンについて40％であるようにし、こ
うしてペースト状物を形成し、このペースト状物
を無菌の蒸留水で希釈して３％コラーゲン溶液を
作り、このコラーゲン溶液をホモジナイズ化して
コラーゲン・ゲルを作る工程(a)と；小牛の鼻の中
隔部をNaClの水溶液（水1000部当りNaClの９
部）で洗い、この洗つた鼻中隔部物質を細断及び
粉砕し、この鼻中隔部物質の細断、粉砕物を
0.5NのKOH溶液を加えて処理し、得られた混合
物を撹拌し、その混合物を24時間放置して上清液
と沈澱とを形成させ、この上清液を遠心分離で回
収し、この上清液に純粋な酢酸を加えて水酸化カ
リウム分を中和し、中和された上清液を真空蒸発
により５倍に濃縮し、この上清液濃縮物を３倍量
（容量）のエタノールの添加で希釈し、生じた沈
澱を傾しやによつて採取し、この沈澱を脱イオン
水に溶かし、得られた水溶液を凍結乾燥すること
によつて酸性のコンドロイチン−４−硫酸を作る
工程(b)と；0.5MのCaCl₂溶液と0.5MのNa₂HPO₄
溶液との夫々等量を容器中に撹拌下に注入して沈
澱を作り、この沈澱を傾しやにより分取し更にこ
の沈澱を水で洗つて懸濁物を作り、この懸濁物を
蒸留水に加え、得られた懸濁液を調製したての40
％NaOH溶液の添加で処理し、得られた混合物
を１時間煮沸し、上清液を傾しやにより捨て、得
られた沈澱を水洗後、沈澱をPH6.8の0.1M燐酸ナ
トリウム緩衝液の添加で処理して懸濁液を形成さ
せ、この懸濁液を煮沸し、さらに水を除去してヒ
ドロキシアパタイトを採取することによつてヒド
ロキシアパタイトを作る工程(c)と；前記の工程(b)
で作つた酸性のコンドロイチン−４−硫酸と工程
(c)で作つたヒドロキシアパタイトとを工程(a)で得
たコラーゲン溶液へ添加する工程(d)と；工程(d)で
得られた生成物を凍結乾燥する工程(e)とから成る
ことを特徴とする、天然産のコラーゲンと酸性コ
ンドロイチン−４−硫酸とヒドロキシアパタイト
との複合物よりなる人工骨材用組成物の製造法に
ある。

本発明の人工骨材は骨の形成を容易にし、実
際、コラーゲン−ヒドロキシアパタイトとグリコ
サミノグリカンとの係合により構成される新規な
バイオ材料である。グリコサミノグリカンの濃度
は１％コラーゲンゲル１当り１〜２％であるこ
とが好ましい。より一層好ましい製品においては
ヒドロキシアパタイトとコラーゲンの濃度はほぼ
等しく、この濃度はグリコサミノグリシン成分の
６倍以上である。

本発明の製品はスポンジ状であることが好まし
く、以下にその製造を例示する。

実施例 １ 網状組織を持たないコラーゲン−酸性コンドロ
イチン−４−硫酸−ヒドロキシアパタイトから
なるスポンジ状製品の調製 (a) 網状組織を持たないコラーゲンの調製 屠殺した直後の子牛から得られた子牛皮革を
先ず水で洗浄しついでフラー装置（fuller装
置）内で１時間、擂潰（mash）した。

回転羽根を有する分離装置を使用して毛と皮
下組織を皮革から分離した。

回収した皮革を細断し、粉砕した。粉砕皮革
を３基の連続浴内でPH7.8の燐酸塩緩衝液によ
り洗浄した。各々の浴の間で、4000rpmで連続
的に遠心分離することにより粉砕皮革からなる
材料を緩衝液から分離した。残渣を脱イオン水
を含有する２基の連続する浴中ですすぎついで
粉砕材料から前記洗浄操作と同様の方法で脱イ
オン水を分離した。最初の処理は非コラーゲン
物質を除去する働きをする。ついで皮革組織
（tissue）をPH14のNaOH溶液を含有するバツ
トに装入した。約30分撹拌した後、該材料を８
時間放置した。この混合物を塩酸を用いてPH２
に酸性化した。ついでこの混合物にNaClをそ
の濃度が10％になるまで添加した。ついで沈澱
したコラーゲンを殺菌脱イオン水で透析した。

(b) 酸性コンドロイチン−４−硫酸の調製 この酸は子牛の鼻中隔から抽出した。鼻中隔
を最初、1000部当り９部の塩化ナトリウム溶液
で注意深く洗浄しついで細断し、粉砕した。つ
いで粉砕物を0.5N水酸化カリウム溶液に１
Kg／の割合で添加した。撹拌後、混合物を洗
浄しついで周囲温度で24時間放置した。この時
間の経過後、30000ｇで30分間遠心分離するこ
とにより上澄液から不溶性物質を分離した。上
澄液に純粋な酢酸を添加してアルカリを中和し
た。ついで溶液を真空蒸発により５倍の濃度に
濃縮した。濃縮物をその容量の３倍のエタノー
ルに注入した。沈澱を傾瀉により取出しついで
脱イオン水に溶解した。この溶液を凍結乾燥し
て酸性コンドロイチン−４−硫酸を得た。

(c) ヒドロキシアパタイトの調製 0.5M CaCl₂と0.5M Na₂HPO₄との溶液２容
量（Ｖ）を撹拌下、等しい速度でビーカーに注
入した。生成した沈澱を傾潟しついで容量2V
の水で４回洗浄した。懸濁液を容量2Vの蒸留
水で希釈しついでこの懸濁液に、調製した直後
の40％NaOH溶液を100ml／４の割合で添加
した。得られた混合物を沸点で１時間保持し
た。傾瀉後、上澄液を除去した。回収した沈澱
を４回水で洗浄した。この沈澱に0.01Mの燐酸
ナトリウム緩衝液をPH6.8で添加しついで得ら
れた懸濁液を沸騰させた。傾瀉後、上澄液を除
去しついで新たに緩衝液を添加した。ついで懸
濁液を５分間沸騰させた。傾瀉後、沈澱を上記
と同一の緩衝液中で15分間沸騰させついで
0.001Mの燐酸塩緩衝剤溶液により２回処理し
た。水を除去してヒドロキシアパタイトを粉末
の形で得た。

(d) 混合物の調製およびスポンジ状製品の製造 20ｇのアパタイトと1.6ｇの酸性コンドロイ
チン−４−硫酸を蒸留水中のアテロコラーゲン
ゲル（atelocollagenic gel）１中にPH6.5で
装入した。均質化後、混合物を槽に注入しつい
で凍結乾燥した。ついで凍結乾燥物を35×20×
10mmの寸法の小片に粉砕した。かく得られたス
ポンジ状製品を0.1mmHgの真空下、80℃で48時
間乾燥した。

実施例 ２ 天然産コラーゲン−酸性コンドロイチン−４−
硫酸−ヒドロキシアパタイトを含有するスポン
ジ状製品の製造 (a) 均質なコラーゲン懸濁物の調製 屠殺したての子牛から得られた子牛皮革を先
ず水で洗浄し次いでフラー装置内で１時間擂潰
した。回転羽根を有する分離装置を使用して毛
と皮下組織とを皮革から分離した。

回収した残りの皮革を細断し粉砕した。皮革
よりなる粉砕材料を３基の連続浴内でPH7.8の
燐酸塩緩衝液により洗浄した。各々の洗浄浴の
間で、4000rpmで連続的に遠心分離することに
より粉砕材料を緩衝液から分離した。残渣を脱
イオンを含有する２基の浴中ですすぎ、次いで
前記の洗浄操作と同様の方法で粉砕材料から脱
イオン水を分離した。次いで皮革組織を酢酸溶
液中に装入した。この酢酸溶液中でコラーゲン
の濃度は10％でなければならず酢酸の濃度はコ
ラーゲンに関して40％でなければならない。

次いで得られたペースト状物を３％のコラー
ゲン溶液を得るような仕方で無菌蒸留水で蒸留
した。この新しいコラーゲン溶液をウルトラ−
ツラツクス（Ultra−Turrax）型の粉砕機中で
均質化（ホモジナイズ）した。

(b) 酸性コンドロイチン−４−硫酸の調製は実施
例１の小牛の鼻中隔部により達成された。

(c) ヒドロキシアパタイトの調製は実施例１と同
条件により実施した。

(d) 混合物の調製及びスポンジ状製品の製造 コラーゲンゲルに３ｇの固体ヒドロキシアパ
タイトとグリコサミノグリカンとを添加し、コ
ラーゲンゲルの最終濃度は６倍以下であつた。
最低でも１時間の期間撹拌した後に該混合物を
遠心分離した。次いで残渣を槽又は他の使用可
能な容器に装入し、凍結乾燥した。得られたス
ポンジ材料の硬度は遠心分離の速度及び期間に
正比例して変化した。

スポンジ状製品の試験(1) 実験的な偽関節のモデル（試験体）を用いて動
物による試験を実施した。この試験は20〜25mm分
の大腿骨を犬から取去り、生じた空間に供試バイ
オ材料の試料若干を充填した。かくして得られる
組立体の剛性は分離した骨部分に結合させた金属
板により確保する。犬の若干はコラーゲン−酸可
溶性ヒドロキシアパタイト及びグリコサミノグリ
カンよりなる骨髄栓子片を移植し得るためにドリ
ル及びカツターを用いて大転子が穿孔されてい
る。穿孔されていない他の犬は対照群とする。こ
の試験目的のために、同側性の腸骨稜から取出し
たスポンジ状骨からの骨幹物質の欠損部を補充す
る人工骨材移植物を犬を施用する。骨を取出した
空間にアテロ（天然）コラーゲン−ヒドロキシア
パタイト−グリコサミノグリカンの複合物よりな
る試料を充填した。これらの人工骨材の移植後に
１〜６ケ月の間隔で犬を屠殺した。

これらの試験結果が示す処によればバイオ材料
によつて急性の炎症反応は生起せず、コラーゲン
による免疫反応は生起しなかつた。骨の欠損物質
の充填が達成され、或る場合には均質的に濃密な
且つ放射線学的な外観と繊維学的に純粋な骨化前
線とを有する骨の植接用片が見出された。更には
人工骨材試料は代用が進むにつれて長期の使用中
に骨と人工骨材との一体化を妨害する傷痕線維組
織の形成を排除すると思われる。最後に、人工骨
材試料は骨とバイオ材料との間の接合がガツチリ
したまゝであるならば偽関節の形成は生じない。
前記のバイオ材料は整形外科及び整復外科の分野
に多大の有用性がある。

試験(2) 骨形成を助長するのに有用な本発明のコラーゲ
ンとヒドロキシアパタイトとグリコサミノグリカ
ンとの複合物が、コラゲナーゼ酵素の存在下に、
特開昭58−58041号公報に開示される如きコラー
ゲンとヒドロキシアパタイトとの複合物よりも高
い安定性を有することを確認するために次の試験
を行なつた。

２種の複合材料即ち１種は本発明によるコラー
ゲンとヒドロキシアパタイトとグリコサミノグリ
カンとの材料であり、もう１種はコラーゲンとヒ
ドロキシアパタイトのみを含有する材料であり、
これらに細菌性のコラゲナーゼ（供給源；クロス
トリジウム・ヒストリチカム型式）を作用さ
せ、放出される分解生成物はケルダール
（Kjeldahl）法により窒素の量を測定して定量的
に測定した。

複合材料は7.4のPHで0.1Mクエン酸ナトリウ
ム；0.01モルクエン酸、0.1モルクエン酸及び25
ｍＭ塩化カルシウムの緩衝剤溶液中で150単位の
コラゲナーゼを含有するビスキング（Visking）
透析管中に配置した。

透析管を、管の内容物の２倍の容量を有する以
外は前記と同じ組成の緩衝剤溶液中に浸漬した。
複合材料を透析管中に懸濁して装入した時点から
出発して所与の間隔で５mlの複合材料を透析浴か
ら反復して抜出し、各々の時間に窒素を測定し
た。全量の緩衝剤中に含有される窒素の量は、コ
ラゲナーゼによつて分解されたコラーゲンの量を
確認し得るものである。２種の試験した乾燥成分
の組成は次の如くであつた； 材料（従来技術）；９％コラーゲン、91％ヒ
ドロキシアパタイト； 材料（本発明）；９％コラーゲン、2.6％コン
ドロイチン−４−硫酸及び88.4％ヒドロキシアパ
タイト。

２種の複合材料のコラゲナーゼに対する安定性
の比較結果は添附図面の図表に見られる曲線で示
してあり、該曲線は各々の材料中のコラーゲンの
全量に関して消化されたコラーゲンの百分率を特
徴としている。消化されたコラーゲンの量はコラ
ゲナーゼ浴と各々の供試材料の接触時間に応じて
決まる。曲線は時間を横軸に、コラーゲンの分
解率を縦軸に採つた材料を表わし、曲線は本
発明の材料を表わす。曲線は各々の場合に３回の
実験の平均値に基づいて描いてある。

この曲線から明らかな通り、特開昭58−58041
号公報記載の如きコラーゲン−ヒドロキシアパタ
イト複合物の酵素分解は本発明のコラーゲン−ヒ
ドロキシアパタイト−グリコサミノグリカン複合
物の分解よりも驚く程にずつと迅速である。この
実験はグリコサミノグリカンが“生体内”分解に
関して本発明の新規なバイオ材料に付与する保護
特性を示している。即ちグリコサミノグリカンは
ヒドロキシアパライトと組合せたコラーゲンの
“生体内”効率を高めまた“生体内”の迅速な分
解に対してもコラーゲンを保護する。

試験(3) 培養物中の造骨細胞へのコラーゲン−ヒドロキ
シアパタイトスポンジ中のコンドロイチン−４
−硫酸の影響 ２種のスポンジ即ち１種はコンドロイチン−４
−硫酸とコラーゲンとヒドロキシアパタイトから
なり（CCA）、もう１種はコラーゲンとヒドロキ
シアパタイトからなり（CA）、これらのスポンジ
にラツトの造骨細胞を接種し、10日間培養した。
次いで試料を電子顕微鏡用に調製して造骨細胞に
より生じた石灰化を観察した。

材料及び方法 スポンジ 第１の型式のスポンジの組成は次の如くであ
る； 33.3％ Ｉ型コラーゲン 10％ コンドロイチン−４−硫酸 56.7％ バイオアパタイト （バイオアパタイトはPRED社により販布される
歯科用途のヒドロキシアパタイトである） 第２の型式のスポンジの組成は次の如くであ
る； 28.6％ Ｉ型コラーゲン 71.4％ バイオアパタイト 第１の型式をCCAと呼び、第２の型式をCAと
呼ぶ。

細胞培養：32日令のラツトのアゴを切開した。
ラツトの歯槽骨から得られた移植骨を無菌
DMEM中で３回洗浄し、37℃で１時間粗製のコ
ラゲナーゼ溶液（１mg／ml）中で培養反応した。
ゆすいだ後に、移植骨を37℃で１mlの培地
（BGJ Fitton−Jackon改質した＋アスコルビン
酸＋ペニシリン−ストレプトマイシン＋インシユ
リン−トランスフエリン−セレニウム）中に装入
した。

合流時に、細胞をトリプリン処理により懸濁さ
せた。スポンジに100μの細胞質溶液（60000個
の細胞／100μ）を接種し、培養物を10日間成
長させた。

電子顕微鏡技術：試料をリン酸塩緩衝剤塩水で
ゆすぎ、PH7.4の0.1Mカコジレート緩衝剤中の２
％グルタールアルデヒド溶液で固定した。ゆすい
だ後且つ0.1Mカコジレート緩衝剤中の２％オス
ミン酸で後固定した後に、試料を匂配列のエタノ
ール中で脱水し、エポン（Epon）に埋設した。
極薄部分をHV12Aの日立製電子顕微鏡で観察し
た。

結果： 造骨細胞は２種のスポンジに移植し、典型的な
ミクロフイラメント質の高密度化により特徴付け
られる焦点接着板（focal adhesion plagues）を
介して材料の繊維に接着している。多数の細胞は
アパタイト包有物を食作用し、小器官の普通の濃
密な原形質内模様を示した。

CCAスポンジ繊維においては、スポンジ繊維
中に散乱した濃密な沈着物が全ての極薄部分で見
られた。同じ沈着物は10個及びそれ以上のうち１
個の部分でのみCAスポンジでは見られ、この場
合これらの領域は存在する時には余り濃密ではな
い。これらの濃密な包接物はカルシウム及びリン
を含有することを示した。

この試験はコンドロイチン−４−硫酸がスポン
ジを石灰化する仕方に必須の役割を演じることを
示している。比較すると、 石灰化処理におけるアパタイト結晶の作用は弱
いと思われる。

試験(4) 特開昭58−43908号公報に記載される如きコラ
ーゲンとグリコサミノグリカンとより本質的にな
る組成物は人工骨材として哺乳類に使用した時
は、本発明で記載したバイオ材料とは異なつて骨
基質の石灰化（ミネラリゼーシヨン）を示さない
ことを“生体”内試験により確認した。

ラビツトのアゴの骨で得られた“生体”内試験
では、本発明の３成分複合体とは異なつてコラー
ゲンとグリコサミノグリカンとを含有する２成分
複合体は骨基質の有意な程の石灰化を促進させな
いことが見出された。また３成分複合体は２成分
複合体よりも次の点で優れていることが見出され
た； 補綴の外科治療に重要な機械的特性の改良及び
石灰化の改善。

重要なことは２成分複合体では骨基質の石灰化
は起らず骨の表面で限られた石灰化が見られるだ
けである。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の複合材料と従来技術の複合材料
のコラゲナーゼに対する安定性の比較実験を行な
つた図表である。横軸は時間を表わし、縦軸はコ
ラーゲンの分解率（％）を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒドロキシアパタイトと一緒に、非熱水的網
   状化結合によりコラーゲンに結合したグリコサミ
   ノグリカンの複合物から成ることを特徴とする、
   骨形成（オステオゲネシス）を容易にする能力を
   もつ人工骨材用組成物。 ２ コラーゲンは網状構造をなくしたコラーゲン
   である特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ３ ヒドロキシアパタイトの割合は15％乃至25％
   の間であり、グリコサミノグリカンの割合は１％
   乃至２％の間であり、これらの割合の％は１％コ
   ラーゲン・ゲルの１当りに基づく％である特許
   請求の範囲第１項記載の組成物。 ４ コラーゲンは天然産コラーゲンである特許請
   求の範囲第１項記載の組成物。 ５ コラーゲンの割合は、ヒドロキシアパタイト
   の割合と同じであつて且つグリコサミノグリカン
   の割合の６倍の量である特許請求の範囲第１項記
   載の組成物。 ６ グリコサミノグリカンは酸性のコンドロイチ
   ン−４−硫酸である特許請求の範囲第１項記載の
   組成物。 ７ アテロペプタイド・コラーゲンと酸性コンド
   ロイチン−４−硫酸とヒドロキシアパタイトとの
   複合物よりなる人工骨材用組成物を製造する方法
   において、屠殺したての小牛から取つた小牛の皮
   を洗い、つき潰し、皮の毛及び皮下組織を除き、
   残つた小牛の皮を細断及び粉砕し、こうして得た
   細断、粉砕済みの小牛の皮をPH7.8のリン酸塩緩
   衝液で洗い、こうして洗つた細断、粉砕済みの小
   牛の皮を遠心分離して皮の細断、粉砕物を採取
   し、この皮の細断、粉砕物を良く水で洗い、次
   に、この皮の細断、粉砕物をPH14のNaOH溶液
   を加えて撹拌下に処理し、このアルカリ処理され
   ている皮の細断、粉砕物を約８時間放置し、得ら
   れたアルカリ性の混合物をPH２になるまで塩酸で
   酸性化し、次にNaCl濃度が10％になるまでNaCl
   を添加し、次いで得られた混合物を、無菌の脱イ
   オン水に対して透析することによつてコラーゲン
   （溶液）を作る工程ａと；小牛の鼻の中隔部を
   NaClの水溶液（水1000部当りNaClの９部）で洗
   い、この洗つた鼻中隔部物質を細断及び粉砕し、
   この鼻中隔部物質の細断、粉砕物を0.5NのKOH
   溶液を加えて処理し、得られた混合物を撹拌し、
   その混合物を24時間放置して上清液と沈澱とを形
   成させ、この上清液を遠心分離で回収し、この上
   清液に純粋な酢酸を加えて水酸化カリウム分を中
   和し、中和された上清液を真空蒸発により５倍に
   濃縮し、この上清液濃縮物を３倍量（容量）のエ
   タノールの添加で希釈し、生じた沈澱を傾しやに
   よつて採取し、この沈澱を脱イオン水に溶かし、
   得られた水溶液を凍結乾燥することによつて酸性
   のコンドロイチン−４−硫酸を作る工程(b)と；
   0.5MのCaCl₂溶液と0.5MのNa₂HPO₄溶液との
   夫々等量を容器中に撹拌下に注入して沈澱を作
   り、この沈澱を傾しやにより分取し更にこの沈澱
   を水で洗つて懸濁物を作り、この懸濁物を蒸留水
   に加え、得られた懸濁液を調製したての40％
   NaOH溶液の添加で処理し、得られた混合物を
   １時間煮沸し、上清液を傾しやにより捨て、得ら
   れた沈澱を水洗後、沈澱をPH6.8の0.1M燐酸ナト
   リウム緩衝液の添加で処理して懸濁液を形成さ
   せ、この懸濁液を煮沸し、さらに水を除去してヒ
   ドロキシアパタイトを採取することによつてヒド
   ロキシアパタイトを作る工程(c)と；前記の工程(b)
   で作つた酸性のコンドロイチン−４−硫酸と工程
   (c)で作つたヒドロキシアパタイトとを工程(a)で得
   たコラーゲン溶液へ添加する工程(d)と；工程(d)で
   得られた生成物を凍結乾燥する工程(e)とから成る
   ことを特徴とする、アテロペプチド・コラーゲン
   と酸性コンドロイチン−４−硫酸とヒドロキシア
   パタイトとの複合物よりなる人工骨材用組成物の
   製造法。 ８ 天然産コラーゲンと酸性コンドロイチン−４
   −硫酸とヒドロキシアパタイトとの複合物よりな
   る人工骨材用組成物を製造する方法において、屠
   殺したての小牛から取つた小牛の皮を洗い、つき
   潰し、皮の毛及び皮下組織を除き、残つた小牛の
   皮を細断及び粉砕し、こうして得た細断、粉砕済
   みの小牛の皮をPH7.8のリン酸塩緩衝液で洗い、
   こうして洗つた細断、粉砕済みの小牛の皮を遠心
   分離して皮の細断、粉砕物を採取し、この皮の細
   断、粉砕物を良く水で洗い、次に、この皮の細
   断、粉砕物に酢酸を加えて処理し、この酢酸処理
   に際し、溶液中のコラーゲンの濃度が10％で且つ
   酢酸の濃度がコラーゲンについて40％であるよう
   にし、こうしてペースト状物を形成し、このペー
   スト状物を無菌の蒸留水で希釈して３％コラーゲ
   ン溶液を作り、このコラーゲン溶液をホモジナイ
   ズ化してコラーゲン・ゲルを作る工程(a)と；小牛
   の鼻の中隔部をNaClの水溶液（水1000部当り
   NaClの９部）で洗い、この洗つた鼻中隔部物質
   を細断及び粉砕し、この鼻中隔部物質の細断、粉
   砕物を0.5NのKOH溶液を加えて処理し、得られ
   た混合物を撹拌し、その混合物を24時間放置して
   上清液と沈澱とを形成させ、この上清液を遠心分
   離で回収し、この上清液に純粋な酢酸を加えて水
   酸化カリウム分を中和し、中和された上清液を真
   空蒸発により５倍に濃縮し、この上清液濃縮物を
   ３倍量（容量）のエタノールの添加で希釈し、生
   じた沈澱を傾しやによつて採取し、この沈澱を脱
   イオン水に溶かし、得られた水溶液を凍結乾燥す
   ることによつて酸性のコンドロイチン−４−硫酸
   を作る工程(b)と；0.5MのCaCl₂溶液と0.5Mの
   Na₂HPO₄溶液との夫々等量を容器中に撹拌下に
   注入して沈澱を作り、この沈澱を傾しやにより分
   取し更にこの沈澱を水で洗つて懸濁物を作り、こ
   の懸濁物を蒸留水に加え、得られた懸濁液を調製
   したての40％NaOH溶液の添加で処理し、得ら
   れた混合物を１時間煮沸し、上清液を傾しやによ
   り捨て、得られた沈澱を水洗後、沈澱をPH6.8の
   0.1M燐酸ナトリウム緩衝液の添加で処理して懸
   濁液を形成させ、この懸濁液を煮沸し、さらに水
   を除去してヒドロキシアパタイトを採取すること
   によつてヒドロキシアパタイトを作る工程(c)と；
   前記の工程(b)で作つた酸性のコンドロイチン−４
   −硫酸と工程(c)で作つたヒドロキシアパタイトと
   を工程(a)で得たコラーゲン溶液へ添的する工程(d)
   と；工程(d)で得られた生成物を凍結乾燥する工程
   (e)とから成ることを特徴とする、天然産のコラー
   ゲンと酸性コンドロイチン−４−硫酸とヒドロキ
   シアパタイトとの複合物よりなる人工骨材用組成
   物の製造法。