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JPH04211399A - 核酸の増幅法 - Google Patents

核酸の増幅法

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JPH04211399A
JPH04211399A JP3027815A JP2781591A JPH04211399A JP H04211399 A JPH04211399 A JP H04211399A JP 3027815 A JP3027815 A JP 3027815A JP 2781591 A JP2781591 A JP 2781591A JP H04211399 A JPH04211399 A JP H04211399A
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ジョン・ジェイ・カリノ
Thomas G Laffler
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Abbott Laboratories
Biotechnica International Inc
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Publication of JPH0636760B2 publication Critical patent/JPH0636760B2/ja
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、目的核酸配列の増幅方
法に関する。さらに詳しくは、酵素触媒反応の基質でな
くなるようにプローブまたはプライマーの少なくとも１
種が反応開始部位において可逆的に修飾されている、リ
ガーゼ連鎖反応またはポリメラーゼ連鎖反応増幅法に関
する。修飾の例としては、反応基の化学的ブロッキング
、１または２以上の核酸塩基を付加して「突出（ｏｖｅ
ｒｈａｎｇ）」を生成すること、１または２以上の核酸
塩基を欠失させて「後退（ｒｅｃｅｓｓ）」を生成させ
ることなどが挙げられる。この修飾末端は、目的配列に
依存しない偽のシグナル生成を回避または減少させ、そ
の後に目的配列に依存した仕方で補正して増幅し得るよ
うにする。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】多く
の場合、核酸に基づく診断アッセイを実行できるかどう
かは、わずかしかない目的分子により生成されるシグナ
ルを増幅することができるかどうかに依存している。シ
グナルを増幅することも一つの解決法ではあるが、核酸
に基づくアッセイ法においては目的配列を増幅すること
がしばしば好ましい解決法となる。目的配列の増幅には
、目的とされる核酸の切片を繰り返しコピーまたは複製
することが含まれる。
【０００３】ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」
ともいう）として知られている目的配列の増幅法では、
一対のプライマー（主プライマーおよび従プライマー）
を過剰に用いて目的核酸の相補鎖の外側末端にハイブリ
ダイズさせる。この目的核酸を鋳型として用い、ポリメ
ラーゼによりプライマーをそれぞれ伸長させる。これら
伸長生成物は、それ自体が目的配列となり、その後、最
初の目的鎖から解離される。新たにプライマーをハイブ
リダイズさせてポリメラーゼにより伸長させ、このサイ
クルを繰り返して目的配列分子の数を幾何級数的に増大
させる。ＰＣＲは米国特許第４，６８３，１９５号およ
び同第４，６８３，２０２号各明細書に記載されている
。
【０００４】目的配列増幅の別法は、リガーゼ連鎖反応
（以下、「ＬＣＲ」ともいう）法として知られている。 ＬＣＲでは、２つの主プローブ（第一プローブおよび第
二プローブ）および２つの従プローブ（第三プローブお
よび第四プローブ）を過剰で用いる。第一プローブは目
的鎖の第一の切片に、第二プローブは目的鎖の第二の切
片にそれぞれハイブリダイズし、該第一の切片と第二の
切片とは隣接しており、主プローブがお互いに５’リン
酸−３’水酸基の関係で隣接するように、またリガーゼ
によりこれら２つのプローブを共有結合的に融合または
ライゲートして融合生成物とすることができるようにな
っている。加えて、同様の隣接様式にて、第三（従）プ
ローブは上記第一プローブに、第四（従）プローブは上
記第二プローブにそれぞれハイブリダイズすることがで
きる。もちろん、目的配列が最初に二本鎖である場合に
は、従プローブはまた第一に目的配列の相補鎖にハイブ
リダイズする。従プローブの融合鎖が目的鎖から分離さ
れたら、該融合鎖は第三プローブおよび第四プローブと
ハイブリダイズし、これら第三プローブおよび第四プロ
ーブはライゲートして相補的な従融合生成物を生成し得
る。ＬＣＲおよび本明細書に記載する改良法を理解する
ために、上記融合生成物は目的配列かまたはその相補鎖
のいずれかに機能的に同等であることを認識することが
重要である。ハイブリダゼーションとライゲーションの
サイクルを繰り返すことにより、目的配列の増幅が達成
される。 この方法は、ＥＰ−Ａ−３２０３０８号公報中に一層詳
細に記載されている。
【０００５】増幅反応の大きな強みの一つは、極めて少
数の目的分子を検出することができるということである
。しかしながら、目的としない配列がシグナルとともに
増幅されると増幅反応の信頼性を損なうおそれがあるの
で、増幅法は高度に特異的でなければならないというこ
とは重要である。ＰＣＲおよびＬＣＲの両方とも、非特
異的で偽りのバックグラウンドシグナルを生成し得るし
、増幅しさえもする。ＰＣＲおよびＬＣＲに潜在する原
理が異なるため、バックグラウンドシグナル源もそれぞ
れ異なる（これらについては、以下で別々に説明する）
。
【０００６】リガーゼ連鎖反応に付随する潜在的問題は
、目的配列に依存しないプローブのライゲーションによ
り引き起こされるバックグラウンドシグナルである。 第三プローブは第一プローブに、第二プローブは第四プ
ローブにそれぞれハイブリダイズするので、これらプロ
ーブ（過剰に添加してある）はそれら自体の間で容易に
二本鎖を生成し得る。これら二本鎖は目的配列の存在と
は独立にライゲートされ、融合生成物を生成する。この
ような融合生成物は、所望の増幅された目的配列とは識
別することができないにもかかわらず、さらに増幅を推
し進めていく。これら二本鎖の目的配列に依存しない平
滑末端ライゲーションは比較的まれに起こることではあ
るが、診断アッセイにおいて望ましくない高度のバック
グラウンドシグナルを引き起こすことは充分によくある
ことである。
【０００７】ＰＣＲにおいて一般に認められている偽り
のバックグラウンドシグナルの原因は、増幅を意図して
いないＤＮＡ分子の領域にプライマー配列がハイブリダ
イズすることによるものである。一般にこのようなハイ
ブリダゼーションが起こるのは、目的試料が、目的配列
に加えて該目的配列とのある種の類似性を有する他の配
列を含んでいるためである。これら類似配列にプライマ
ーがハイブリダイズするのは目的配列にハイブリダイズ
するのに比べれば起こりにくいことではあるが、幾らか
のハイブリダゼーションは起こり得る。そのような意図
していない非特異的なハイブリダゼーションが起こった
場合に、もしもプライマー分子の３’末端ヌクレオチド
が目的分子の相補的ヌクレオチドに首尾よくハイブリダ
イズすると、ポリメラーゼ酵素によってプライマー伸長
が首尾よく開始され、目的配列とは異なるオリゴヌクレ
オチドが生成することがあり得る。場合によっては、こ
のヌクレオチドは指数関数的増幅を担いさえもし得る。 増幅されるかどうかにかかわらず、この偽りのヌクレオ
チド配列は、幾つかの分析状況において目的配列を表示
するものと解釈され、従って間違った結果が導かれるこ
とになる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】オリゴヌクレオチドプロ
ーブおよびプライマーは、ＬＣＲおよびＰＣＲにおいて
それぞれ劇的に異なる役割を果たすものであるが、本明
細書では両方法に適用できる一般的な説明をするため「
イニシエーター」および「プローブ／プライマー」なる
語を使用することにする。本発明の主要な目的は、偽り
のシグナルの生成を減少させることにより、核酸に基づ
くアッセイの感度を向上させることにある。この目的は
、少なくとも１種のプローブ／プライマー末端を修飾し
て、プローブ／プライマーが偽りのシグナルの生成に寄
与する可能性を大きく減少させることにより、本発明で
達成される。この修飾したプローブ／プライマーが目的
配列に特異的にハイブリダイズした後にのみ、該修飾末
端を目的配列に依存した仕方で「補正（ｃｏｒｒｅｃｔ
ｅｄ）」して該プローブ／プライマーが酵素増幅反応に
関与し得るようにする。
【０００９】ＬＣＲかまたはＰＣＲに有用な本発明の特
徴の一つとして、増幅反応の酵素触媒工程に関与するこ
とが必須の基を化学的残基でブロッキングまたはマスキ
ングしてある核酸プローブ／プライマーを提供する。こ
の酵素的な工程は、ＬＣＲではライゲーションであり、
ＰＣＲでは伸長である。いずれの場合も、プローブ／プ
ライマーは目的配列とハイブリダイズし酵素反応を開始
することができ（それゆえ、「イニシエーター」と呼ば
れる）、ライゲートした生成物または伸長した生成物は
「増幅生成物」と呼ばれる。ブロッキングする基は、実
質的にプローブ／プライマーが目的配列とハイブリダイ
ズした場合にのみ酵素により除かれ得るように選択する
。別の態様においては、プローブ／プライマーは一方の
末端に付加塩基からなる突出を含んでいる。これら付加
塩基は、後に目的配列に依存した仕方で開裂して増幅反
応が起こり得るようにする。
【００１０】ＬＣＲの場合の他の特徴としては、プロー
ブはライゲーションの部分に関して後退を有しており、
このため目的配列にハイブリダイズしたときにギャップ
を生成する。このギャップは、後に目的配列に依存した
仕方で埋められてプローブがライゲートできるようにす
る。ギャップを埋めることは、１または２以上のプロー
ブの伸長により、または第五プローブまたは第六プロー
ブを用いた後にライゲートすることにより行うことがで
きる。
【００１１】本発明の他の目的は、第一の配列を第二の
配列から識別するための改良法であって、該第一の配列
は第二の配列と目的領域中で１個の塩基のみが相違して
いるものを提供することにある。この第一の配列は目的
配列と考えることができ、また第二の配列は、識別する
ことが可能な潜在的な交差反応性の鎖と考えることがで
きる。
【００１２】簡単に説明すると、本発明は、目的核酸配
列を酵素的に増幅させて増幅生成物を得る方法であって
、酵素が、核酸イニシエーター、核酸イニシエーターが
結合する鋳型としての目的配列または増幅生成物、酵素
的に組み立てて目的配列に相補的な増幅生成物を生成し
得る、構築ブロックとしての少なくとも１種のヌクレオ
シド含有反応物を利用するものであり、該増幅生成物自
体がさらに鋳型として働く方法において、（ａ）目的配
列とハイブリダイズし得る必要なイニシエーターであっ
て、該イニシエーターがハイブリダイズしたときに該酵
素が該酵素の基質としての該イニシエーターに実質的に
作用し得ず増幅生成物が組み立てられないように、少な
くとも１種の該イニシエーターを修飾したものを用意し
、 （ｂ）該イニシエーターを該目的配列とハイブリダイズ
させてイニシエーター−鋳型複合体を生成させ、（ｃ）
鋳型に依存した仕方で該修飾を補正して該酵素が該イニ
シエーター−鋳型複合体に作用し得るようにし、（ｄ）
増幅生成物を酵素的に組み立て、ついで（ｅ）該目的配
列から増幅生成物を解離させ、ハイブリダイゼーション
、補正および組み立て工程を繰り返して所望の目的配列
を増幅させることを特徴とする方法に関する。
【００１３】従って、本明細書で「イニシエーター」と
は、ＰＣＲに使用するプライマーか、またはＬＣＲに使
用する１または２以上のプローブのいずれかをいう。伸
長に関連して使用する場合は、ヌクレオシド含有反応物
は、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体である。ラ
イゲーションと関連して使用する場合は、イニシエータ
ーは一対のパートナープローブの一方（すなわち、一つ
の主プローブおよび／または一つの従プローブ）のみで
あり、ヌクレオシド含有反応物は第二のオリゴヌクレオ
チドプローブ（すなわち、該一対のプローブのもう一方
のプローブであり、これは最終的にイニシエーターとラ
イゲートされる）である。
【００１４】修飾の補正は、行った修飾の仕方に依存す
る。しかしながら、本発明の利点を充分に実現するため
には、修飾イニシエーターが実質的に目的配列かまたは
酵素的組み立ての結果生成した増幅生成物（いずれも適
当な鋳型として働く）にハイブリダイズした場合にのみ
補正が行われなければならない。従って、補正は「鋳型
に依存している」。補正試薬および組み立て試薬につい
ては、以下でさらに詳細に記載する。
【００１５】以下、本発明をさらに詳しく説明する。本
発明の目的のためには、目的配列は一本鎖として記載さ
れる。しかしながら、このことは、目的配列は実際は二
本鎖であるがプローブ／プライマーとハイブリダイズす
る前にその相補鎖から分離される場合も含むことが理解
されなければならない。二本鎖の目的配列の場合は、従
プローブ（ＬＣＲの場合は第三プローブＡ’および第四
プローブＢ’；ＰＣＲの場合は別のプライマーＢ）もま
た目的配列の相補鎖にハイブリダイズすることにより最
初の工程に関与するであろう。一本鎖の目的配列の場合
は、従プローブまたは従プライマーは最初のハイブリダ
イゼーション工程には関与しないであろうが、その後の
ハイブリダイゼーション工程には関与するであろう。目
的配列は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であってもリボ
核酸（ＲＮＡ）であってもよい。
【００１６】本明細書において「プライム」（’）の記
号は、相補的塩基または配列を示すのに用いる。プロー
ブまたはプライマーが他の配列とハイブリダイズすると
きは該配列に対して「相補的」であるといい、該ハイブ
リダイズした領域中に実質的に相補的な塩基対を有する
。従って、プローブＡは、Ａ’とは末端を共有しない場
合でもＡ’に対して相補的であり得る。ＢおよびＢ’に
ついても同じことがいえる。同様に、短配列Ｘｎおよび
Ｙｍも、それぞれＸ’ｎおよびＹ’ｍと称する相補的配
列を有する。 最後に、単一塩基、たとえばＱの相補体はＱ’で表され
る。本明細書において配列に関連して「相補的」という
ときは、ハイブリダイズした領域中にミスマッチの塩基
対を有する配列をも包含する（ただし、アッセイ条件下
でハイブリダイズし得えなければならない）。
【００１７】「４種の塩基」とは、ＤＮＡの場合にはグ
アニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）および
チミン（Ｔ）をいうが、ＲＮＡの場合にはグアニン（Ｇ
）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）およびウラシル（
Ｕ）をいうことも理解されなければならない。この語は
また、上記塩基の類似体および誘導体をも包含する。変
性塩基であるイノシン（Ｉ）を本発明に用いることもで
きるが、本発明によるプローブの修飾部分にＩを用いる
のは好ましくない。
【００１８】 Ｉ．ＬＣＲ： ＬＣＲに関しては、本発明の重要な特徴は、平滑末端の
二本鎖を生成し得る２対のプローブを使用する代わりに
、プローブ対の一方の少なくとも一つのプローブが最初
から「修飾」末端を有しており、そのため得られた二本
鎖が「非平滑末端」となり、および／または該二つのプ
ローブ二本鎖のリガーゼ触媒による融合の基質として適
当でなくなるということである。「修飾末端」は、相補
的プローブに関してよりもライゲーション部分に関して
定義される。「修飾末端」は、（１）通常のＬＣＲ条件
下でリガーゼ触媒融合に関与することが必須である基（
たとえば、５’リン酸基または３’水酸基）上にブロッ
キング残基（または付加塩基残基）を有するか（たとえ
ば、図２Ａまたは図２ＢのプローブＡを参照）、または
（２）塩基が欠失して一方のプローブ末端と次のプロー
ブ末端との間にギャップが生じている（たとえば、図３
のプローブＢ、図４のプローブＡ’およびプローブＢ、
図５のプローブＤおよびプローブＥ）。
【００１９】本明細書では簡便のため、第一のタイプの
修飾末端を「突出」と称する。この突出は、目的配列に
ハイブリダイズしたときにライゲーション部分からはみ
出る付加ブロッキング残基または付加塩基残基である。 この「突出」なる語は、プローブとその相補的プローブ
とが末端を共有する必要がないという事実から、一つの
プローブがその相補的プローブに関して伸長するという
ことと混同すべきでない。第二のタイプの修飾末端は本
明細書では「後退」と称する。後退は、目的配列にハイ
ブリダイズした後の主プローブと従プローブとの間のギ
ャップである。これらの修飾末端の存在により、目的配
列の不在下で相補的プローブがお互いに平滑末端ライゲ
ーションを起こすことにより生成される偽陽性シグナル
が減少する。
【００２０】上記プローブをライゲートすることができ
るように、その後に修飾の「補正」を行う。本明細書に
おいて「補正」とは、目的配列に依存した仕方で、上記
２つの主プローブおよび２つの従プローブをそれらのパ
ートナーにライゲートできるようにする工程をいう。従
って、目的配列、目的配列の相補鎖またはそれらから生
成したポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしたプロ
ーブのみが「補正される」。「補正」は、使用した修飾
末端のタイプにより、種々の方法で行うことができる。
【００２１】本明細書において「ライゲーション部分」
または「ライゲーションを意図する部分」とは、鋳型に
依存した仕方でライゲートすべき２つのプローブパート
ナーの間の特定部位をいう。これは、「補正した」プロ
ーブがそのパートナーと５’リン酸−３’水酸基の関係
で隣接して位置する部位である。４つのＬＣＲプローブ
の各セットについて、２つのライゲーション部分、すな
わち主プローブパートナーのライゲーション部分と従プ
ローブパートナーのライゲーション部分とがある。従来
のＬＣＲでは２つのライゲーション部分はお互いに反対
側にあり、プローブ対がお互いにハイブリダイズしたと
きに平滑末端二本鎖を生成した。本発明では、「突出」
の態様の場合のみ、ライゲーション部分はお互いに反対
側にある。ライゲーション部分は、後退の態様ではギャ
ップのおかげで１または２以上の塩基により置き換えら
れる。 正確なライゲーション部分は態様毎に異なるので、各態
様を説明するときにさらに詳しく定義する。
【００２２】各プローブは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）またはリボ核酸（ＲＮＡ）からなる。従来のヌクレオ
チドホスホールアミダイト化学およびアプライド・バイ
オシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｉｎｃ．（フォスターシティー、ＣＡ））；デュポ
ン（ウイルミントン、ＤＥ）またはミリゲン（Ｍｉｌｌ
ｉｇｅｎ）（ベッドフォード、ＭＡ）から入手可能な装
置を用いて所望のプローブを合成することは日常的な仕
事である。プローブの５’末端のリン酸化は、リガーゼ
によるライゲーションに必要なときに、当該技術分野で
知られているようにキナーゼによって行うことができる
。
【００２３】本明細書において、塩基Ｘ、ＹおよびＱ、
およびそれらの相補体は、４塩基のある種のサブセット
（ＮまたはＭ）から選択されたものとして記載する。実
際は、これらの配列は「選択された」ものでは全然ない
が、目的鎖の配列により指令されたものである。この場
合における「選択された」とは、所望の特性を有する目
的配列が位置しており、目的配列の適当な切片の周りに
プローブが構築されていることを意味する。
【００２４】一般に、本発明の方法は、（ａ）修飾プロ
ーブを目的配列（および、二本鎖からなっていて目的配
列の相補鎖が存在する場合は、該相補鎖）にハイブリダ
イズし、（ｂ）目的配列に依存した仕方で該修飾を補正
してプローブがライゲートできるようにし、（ｃ）補正
したプローブをそのパートナーにライゲートして融合生
成物またはライゲート生成物を生成させ、ついで（ｄ）
該融合生成物を目的配列から解離させ、上記ハイブリダ
イゼーション、補正およびライゲーション工程を繰り返
して所望の目的配列を増幅する、という繰り返し工程か
らなる。 工程（ａ）、（ｃ）および（ｄ）に関してはすべての態
様について本質的に同じであり、一緒に説明することが
できる。これらは、従来のＬＣＲに用いるものと一般に
同じ工程である。工程（ｂ）は使用した修飾方法により
異なるため、各異なるタイプ毎に別々に説明する。
【００２５】修飾プローブの目的配列（および、任意に
目的配列の相補鎖）へのハイブリダイゼーションは、従
来技術、たとえばＥＰ−３２０３０８号明細書に適切に
説明されている。プローブ長、プローブ濃度および条件
の厳重さ（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）のすべてが、ハイブ
リダイゼーションの起こる程度および速度に影響する。 好ましくは、プローブは、所望の特異性を付与するため
、すなわち試料中のランダムな配列とハイブリダイズす
るのを防ぐため充分に長くなければならない。一般に、
１５〜１００塩基のプローブがこの目的を達成する。現
在のところ好ましいプローブは約１５〜約４０塩基の長
さを有するものである。
【００２６】各プローブは、化学量論的に反応すると思
われるので、ほぼ等モル濃度で添加する。各プローブは
、約５ナノモル（ｎＭ）〜約９０ｎＭ、好ましくは約１
０ｎＭ〜約３０ｎＭの範囲の濃度で存在させる。各反応
に使用するプローブの最適量はまた、行わなければなら
ないサイクル数によっても変わる。最適濃度は、当業者
により容易に決定することができる。
【００２７】条件の厳重さは、温度、溶媒および他のパ
ラメーターに依存することが当業者には一般に知られて
いる。これらのパラメーターのうちでおそらく最も制御
し易いのは温度であるので、これは一般にＬＣＲを行う
際に変化させる厳重さのパラメーターである。本発明の
方法を行うのに必要な厳重さの条件は通常のＬＣＲとさ
ほど異ならないので、さらに詳細な説明は必要でないで
あろう。日頃の実験者は、以下に記載する実施例に従っ
て行うことができるであろう。
【００２８】一般的方法の次工程は特別の補正工程の後
に行うものであり、一つのプローブをその隣接するパー
トナーにライゲートするものである。それゆえ、各主プ
ローブをその関連主プローブにライゲートし、各従プロ
ーブをその関連従プローブにライゲートする。「隣接」
プローブとは、隣接した配向で目的配列にハイブリダイ
ズし得るプローブのうちの一つであり、一方のプローブ
はそのパートナープローブの３’水酸基末端に５’リン
酸基末端が隣接して位置している。「隣接」プローブは
、目的配列に依存した仕方で修飾末端を補正して得られ
る。酵素的ライゲーションが、２つの隣接プローブを共
有結合的に結合させる好ましい方法であるので、本明細
書では「ライゲーション」の語を用いることにする。し
かしながら、「ライゲーション」とは一般的な語であり
、２つのプローブを共有結合的に結合するいかなる方法
をも包含するものと理解すべきである。酵素的ライゲー
ションに代わる方法は、ＥＰ−Ａ−３２４６１６号明細
書に記載されているような光ライゲーション（ｐｈｏｔ
ｏ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）である。
【００２９】好ましい酵素的ライゲーション工程を可能
にする条件および試薬は、当業者に一般に知られており
、上記従来技術の説明の際に記載した文献中に開示され
ている。本発明に有用なライゲーション試薬としては、
大腸菌リガーゼ、Ｔ４リガーゼおよびサームス・サーモ
フィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）リガーゼ（たとえば、ＡＴＣＣ２７６３４など）（
ＥＰ−３２０３０８号明細書に開示）などの原核生物の
リガーゼが挙げられる。最後のリガーゼ（サームス・サ
ーモフィルスリガーゼ）はＬＣＲの熱的サイクルの間に
活性を維持することができるので現在のところ好ましい
。熱的に安定なリガーゼが存在しないと、サイクルを繰
り返すたびに毎にリガーゼを加えなければならない。真
核生物のリガーゼもまた有用であり、たとえばラビン（
Ｒａｂｉｎ）らのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１
０６３７〜１０６４７（１９８６）に報告されているよ
うなキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ
）属のＤＮＡリガーゼが挙げられる。
【００３０】ライゲーションが終わったら、融合プロー
ブを目的配列から解離（たとえば、融解）させ、従来の
ＬＣＲと同様、工程を数サイクル繰り返す。繰り返すサ
イクル数は１〜約１００であるが、現在のところ約１５
〜約７０が好ましい。
【００３１】プローブを設計するに際しては、その相補
的（従）プローブにハイブリダイズしたときに、意図す
るライゲーション部位から離れた末端自体が遊離のもの
で、他の必要としないライゲーション反応に関与しない
ようにすることが好ましい。それゆえ、ライゲート可能
な粘着末端または平滑末端は避けるべきである。そのよ
うな末端を使用しなければならない場合は、遊離の５’
リン酸基を回避するかまたは除去すべきである。このこ
とは、（通常、５’末端リン酸基を有しない）オリゴヌ
クレオチドプローブを合成することにより、またはホス
ファターゼ酵素を使用して末端リン酸基を除去する（た
とえば、ＤＮＡの制限消化により生成したオリゴヌクレ
オチドから）ことにより行うことができる。別法として
、プローブの「間違った」外部末端のライゲーションは
、以下に詳述するように、少なくとも一つのプローブの
末端を「フック（ｈｏｏｋ）」またはマーカー残基でブ
ロッキングすることにより防ぐことができる。
【００３２】増幅後は、当該技術分野で知られた多くの
従来法により増幅配列を検出することができる。特に好
ましい態様においては、少なくとも２つのプローブの利
用できる外部末端（融合生成物の反対の末端）、および
好ましくは４つのすべてのプローブの外部末端にフック
を結合させる。「フック」は、特異的リガンド−レセプ
ター親和性を有する残基であればいかなるものであって
もよい。一般に、融合生成物の一方の末端（たとえば、
Ａの５’末端およびＡ’の３’末端）のフックは、固相
上にコーティングした試薬（抗体やアビジンなど）によ
り固定化し得る抗原やハプテンからなる。他方の末端（
たとえば、Ｂの３’末端およびＢ’の５’末端）のフッ
クは、抗体−酵素結合体などの標識または標識系により
認識され得る別の抗原またはハプテンを含む。フックの
例としては、当該技術分野で知られた多くのもののうち
でもビオチン、フルオレセインおよびジゴキシンが挙げ
られる。ついで基質を添加すると、基質は酵素により検
出可能な生成物に変換される。エンゾ（Ｅｎｚｏ）のＥ
Ｐ−Ａ−３３０２２１号明細書には、一方の末端にビオ
チン分子を結合したオリゴヌクレオチドが記載されてい
る。
【００３３】 Ａ．突出修飾末端： すでに述べたように、第一の態様は、少なくとも一つの
プローブに、ライゲーションを意図した部位から延びる
ようにしてブロッキング残基または付加塩基を付加した
修飾末端である。ブロッキング残基または付加塩基は「
突出」からなり、これが平滑末端ライゲーションが不可
能な理由である。第一の変更例では、突出は化学的ブロ
ッキング剤、Ｒからなる。
【００３４】標準的なＤＮＡリガーゼ反応では、ライゲ
ーション部位において基質鎖が３’水酸基と５’リン酸
基を呈示することが必要とされることがよく知られてい
る。幾つかの修飾（特に３’水酸基における）によりＲ
基を導入されることが知られている。Ｒ基は、該修飾末
端がリガーゼ反応に関与できなくするが、修飾鎖が二本
鎖構造の一部であるときは除去することができる。その
ような修飾としては、３’水酸基の酸素原子に水素原子
の代わりに結合した下記Ｒ基が挙げられる；（式中、Ｚ
は−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＯ（式中、ｎは１〜約３、
好ましくは１または２である）、−デオキシリボースお
よび−ジデオキシリボースよりなる群から選ばれた基で
ある）。
【００３５】末端をＲ基で適当に修飾したプローブの合
成法は、当該技術分野でよく知られている。たとえば、
３’リン酸基を有するオリゴヌクレオチドの化学合成は
マーキービッツ（Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ）およびウイア
ズィキービッツ（Ｗｙｒｚｙｋｉｅｗｉｃｚ）のＮｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ．１７：７１４９〜７１５８
（１９８９）に記載されている。より大きなブロッキン
グ基（ある種の試料中に存在しているかもしれない非特
異的なホスファターゼから３’リン酸基を隠す利点を有
するかもしれない）は、末端転移酵素およびｄＵＴＰま
たはｄｄＵＴＰを用いてオリゴヌクレオチドを調製し、
ついでウラシルグリコシラーゼで処理することにより都
合よく調製することができる。ウラシルグリコシラーゼ
の精製法は、リンダール（Ｌｉｎｄａｈｌ）らのＪ．Ｂ
．Ｃ．２５２：３２８６〜３９２４（１９７７）に教示
されている。ｄＵＴＰ付加の場合には、強塩基で処理し
た後、ウラシルグリコシラーゼで処理することによりグ
リコアルデヒド誘導体を調製することができる。上記で
例示したＲ基はあくまでも例を示したものに過ぎず、当
業者であれば、同様に機能し得る多くの変更物を合成す
ることができるであろうことを理解すべきである。
【００３６】酵素のエンドヌクレアーゼＩＶ［シウェク
（Ｓｉｗｅｋ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ．
１６：５０３１〜５０３８（１９８８）］は、ブロッキ
ング基を含む鎖が相補鎖にハイブリダイズしている場合
に（しかも、実質的にハイブリダイズしている場合にの
み）そのようなブロッキング基を除去し、３’水酸基を
暴露する。エンドヌクレアーゼＩＶが二本鎖ＡＡ’また
はＢＢ’に作用することによる、目的配列から独立した
修飾末端の補正は稀ではあるが、必要なら、修飾末端を
有するプローブに相補的にして１または２以上のヌクレ
オチドが後退しているようにプローブを設計することに
より、そのような目的配列から独立した修飾末端の補正
をさらに最小にすることができる。
【００３７】突出末端の他の変更例においては、突出は
付加核酸塩基（プローブが目的配列にハイブリダイズし
たら開裂して除去することができる）からなる。この突
出は、意図するライゲーション部位での嵩高さによりラ
イゲーションを防ぎ、リガーゼ反応に必須に関与する基
を立体化学的にブロッキングまたはマスキングする（ブ
ロッキング末端について記載したように）。この突出と
上記の単なる化学的ブロッキングとの相違は、「ブロッ
キング」基（すなわち、突出）の性質およびサイズにあ
る。これは、本来、プローブ分子とコリニアーにある核
酸残基からなる。しかしながら、該基のサイズは、目的
配列にハイブリダイズしたときに該分子の修飾末端がラ
イゲーション部分の近傍に留まるには余りにも大きすぎ
る。さらに、突出は除去しなければならないので、リガ
ーゼ触媒反応に全く関与し得ないように設計することが
できる（たとえば、５’リン酸基を欠如させることによ
り）。
【００３８】３種の突出を記載するが、これらは単に例
示のために選択したものにすぎない。当業者であれば、
同様に突出を除去し得る他の酵素もまた全く同様に使用
することができることがわかるであろう。その例示とは
、１．本質的にリボヌクレオチドからなる突出（目的配
列がＤＮＡからなる場合）；２．非塩基部位を含む突出
；および３．目的配列中の塩基との塩基対がミスマッチ
となる塩基を含む突出である。しかしながら、一般に、
下記のように突出の除去が鋳型に依存したものとなるよ
うに、突出は目的配列に相補的でなければならない。突
出の長さは、１〜１０塩基、好ましくは１〜５塩基であ
る。
【００３９】 １．リボヌクレオチド修飾： リボヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドの合
成法は、アタベコフ（Ａｔａｂｅｋｏｖ）らのＦＥＢＳ
　　Ｌｅｔ２３２：９６〜９８（１９８８）に記載され
ている。リボヌクレオチド残基伸長からなる修飾末端を
有するＤＮＡプローブを本発明に用いることができる。 このリボヌクレオチドは、リガーゼに対して適当な基質
とはなり得ず、修飾プローブはライゲートされないし、
増幅されないであろう。原則として、これら伸長は、選
択したプローブの５’末端または３’末端のいずれであ
ってもよい。
【００４０】「補正」は、リボヌクレオチドの除去によ
る。リボヌクレアーゼＨと一般に呼ばれる酵素は、天然
に広く分布していることが知られている。そのようなリ
ボヌクレアーゼＨの一つは、シグマ・ケミカルから入手
することができる（Ｃａｔ＃Ｒ６５０１）。そのような
酵素は、鎖がＤＮＡ鎖にハイブリダイズしている場合に
（および、本質的にハイブリダイズしている場合にのみ
）リボヌクレオチドがその中に存在している核酸鎖から
該リボヌクレオチドを選択的に除去する。特定のリボヌ
クレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）が鎖からすべてのリボヌクレ
オチドを除去するのか１以外のすべてのリボヌクレオチ
ドのみを除去するのかについて議論があるが、このこと
は本発明には一般に関係のないことである。というのは
、少なくとも幾つかのリガーゼ（たとえば、Ｔ４リガー
ゼ）がリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに
ライゲートし得ることが知られているからである。いか
なる特定のＲＮＡｓｅＨの場合でも、残されるリボヌク
レオチド残基が０個であるのか１個であるのかをＬＣＲ
の目的のために決定することは極めて容易である。２つ
のリボ修飾したＬＣＲプローブセット（酵素がすべての
リボヌクレオチドかまたは１以外のすべてのリボヌクレ
オチドを除去することに基づいて設計）を調製するだけ
でよく、各場合にＬＣＲ反応の性能を決定する。いった
ん確立されたら、その後は酵素の挙動を所定のものとし
て扱うことができる。実際、異なるＲＮＡｓｅＨ種は、
３’修飾または５’修飾が一層容易なのも一層容易でな
いのもある。このことは、所定のＲＮＡｓｅＨ種につい
て経験的に容易に決定することができる。
【００４１】そのようなリボヌクレオチド修飾プローブ
をＬＣＲ反応に用いる。２つのプローブパートナーが目
的配列上の隣接領域にハイブリダイズすると、これらは
ＲＮＡｓｅＨが修飾プローブを「補正」しない限り（す
なわち修飾プローブからリボヌクレオチドを除去しない
限り）、リガーゼにより結合され得ない。リボヌクレオ
チドがプローブの５’末端にある場合は、内部のリン酸
基が暴露されてリガーゼ反応における基質として働く。 このことは、プローブの製造においてそのような５’リ
ン酸基を付加するという特別の工程の必要性をなくすも
のである。ライゲーションが終わると、融合したプロー
ブは、標準的なＬＣＲの場合と全く同様に新たな目的配
列として機能する。
【００４２】 ２．非塩基部位開裂： 種々の広範囲に分布する酵素（たとえば、エンドヌクレ
アーゼＩＶ；シウェクら、上記）が、実質的に一本鎖Ｄ
ＮＡがその相補鎖とハイブリダイズして二本鎖となって
いる場合にのみ、該一本鎖ＤＮＡを非塩基部位の位置に
て開裂する。非塩基部位を有するオリゴヌクレオチドの
合成法は、タケシタ（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ）らのＪ．Ｂ
．Ｃ．２６２：１０１７１〜１０１７９（１９８７）に
記載されている。修飾オリゴヌクレオチドプローブは、
非塩基部位の位置が、５’末端を寄与することを意図す
るプローブ上のライゲーション部位のすぐ５’側か、ま
たは３’末端を寄与することを意図するプローブ上のラ
イゲーション部位のすぐ３’側になるように合成するこ
とができる。いずれの場合も、プローブが一緒にハイブ
リダイズしたときに、これら２つのプローブが使用酵素
により非塩基部位にて目的配列に依存しないで開裂され
ないように、相補的プローブを設計すべきである。プロ
ーブが真の目的配列にハイブリダイズしたとき以外は非
塩基部位のすぐ近傍で二本鎖構造が生じないように、２
部分のライゲーションの短い分枝（ｏｆｆｓｅｔｓ）を
有するようにプローブのセットを設計することができた
。このようにして、補正は目的配列に依存するものであ
る。
【００４３】目的配列にハイブリダイズする場合は、非
塩基部位での開裂により、（その位置およびその性質の
両方により）リガーゼにより隣接プローブに結合され得
る末端が暴露される。ライゲーション後、融合分子は、
標準的なＬＣＲと同様に新たな目的配列として働く。
【００４４】 ３．ミスマッチ修復： すべての「修飾」オリゴヌクレオチドのうちでおそらく
最も容易であるのは、ハイブリダイズ状態の範囲を越え
ていかなる特別の性質も有しないものである。そのよう
なオリゴヌクレオチドは、標準的な市販試薬を用い、標
準的な合成法により容易に調製することができる。しか
しながら、目的配列にハイブリダイズしたときに、その
ような配列の唯一の修飾が示される、すなわち二本鎖中
にミスマッチの塩基対が存在する。そのようなミスマッ
チ塩基対を補正または修復し得る多くの生物学的系が知
られている。原則的に、そのような系のいずれもＬＣＲ
プローブセット中の修飾を補正するために採用すること
ができるが、ここでは一般的な方法の例示として一つの
系を詳しく説明することとする。
【００４５】Ａ対Ｇのミスマッチを特異的に認識するこ
とのできる酵素（または酵素複合体）が、カリン（Ｋａ
ｒｉｎ）らによって報告されている［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８８７７〜８８８
１０（１９８９）］。そのような「Ａ／Ｇミスマッチ」
では、この酵素は、Ａを含有する鎖を鎖中のＡとその隣
の残基との間で開裂する。それゆえ、突出がプローブの
残りの部分からＡ残基によって分離され、該プローブが
真の目的配列とハイブリダイズしたときに該Ａ残基がＧ
残基の向かい側の位置にくるようにプローブを設計する
ことができる。真の目的配列にハイブリダイズすると、
突出はプローブの残りの部分からミスマッチのＡ残基も
含めて開裂され、その位置およびその性質のために、隣
接して位置する他のプローブにリガーゼによって結合さ
れ得る末端を暴露する。ライゲーション後、得られた融
合分子は、ＬＣＲのその後のサイクルにおいて新たな目
的配列として機能し得る。
【００４６】別の特徴として、上記方法は、対立性（ａ
ｌｌｅｌｉｓｍ）を示しているかもしれない特定の塩基
部位の同定を決定するために用いることができる。特定
のＡＧミスマッチの例においては、たとえば、そのよう
な変化の約５／６を直接アッセイすることができる。特
定部位の最初の同定は、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれか
でなければならない。それがＧであるときは、突然変異
体はＧ以外である。同様に、それがＣであるときは、そ
の相補体はＧであり、突然変異体の相補体はＧではない
。それがＡまたはＴであるときは、そのような突然変異
体の２／３はＧかまたはＣのいずれかである。それゆえ
、単一塩基突然変異体対立因子の１／２は特定Ｇの損失
となり、残りの２／３は特定Ｇ残基が現れる結果となる
。いずれの場合も、ＬＣＲプローブセットの構成員の一
つにＡ残基を有利に配置することにより、融合プローブ
分子の出現割合が大きく影響される。Ｇ残基が失われて
いる場合は、Ａ含有プローブは開裂することができず、
ＬＣＲ反応の進行は著しく損なわれる。新たにＧが出現
している場合は、Ａ含有プローブは開裂することができ
、ＬＣＲ反応の速度は大きく促進される。当業者であれ
ば、上記ＡＧミスマッチ修復系と同様にして特定部位に
て他の単一塩基の変化を同定するため、異なる特異性を
有する他のミスマッチ修復系を容易に適合することがで
きるであろう。
【００４７】 Ｂ．後退による末端修飾： 第二の態様では、１または２以上のプローブから短い塩
基配列を除去し、プローブが目的配列（または目的配列
の相補鎖、またはそれから生成するポリヌクレオチド）
にハイブリダイズしたときに一方のプローブの５’末端
と他方のプローブの３’末端との間に後退またはギャッ
プが残るようにすることにより、修飾末端を生成させる
。目的配列を増幅するためのＬＣＲを行うためには、プ
ローブの間のギャップを埋めなければならない（すなわ
ち、修飾を「補正」しなければならない）。第一の観点
では、このことは、ポリメラーゼまたは逆転写酵素およ
びギャップの反対側の目的配列に相補的なデオキシヌク
レオチド三リン酸の過剰量を用いて行うことができる。 別法としては、目的配列に相補的な第五のプローブおよ
び該第五プローブに相補的な第六のプローブを用いて行
うことができる。これら別の観点については以下で別々
に記載する。
【００４８】しかしながら、この態様を詳しく説明する
前に、セットなる術語を簡単に説明しておくことが便利
であろう。セット（たとえば、Ｓ）は、該セットＳ内に
含まれるすべての要素からなる。「Ｓでない」セットは
、Ｓ内に認められない「ユニバース（Ｕｎｉｖｅｒｓｅ
）」の残りのすべての要素からなる。本明細書において
「ユニバース」は、上記Ｇ、Ｃ、ＡおよびＴまたはＧ、
Ｃ、ＡおよびＵの４塩基からなる。セットＳと他のセッ
ト（たとえば、Ｒ）との交差は、ＳおよびＲの両方に認
められる要素のみからなる。それゆえ、本明細書におい
て「ＮでもＭでもない」セットは、ギャップＸｎおよび
ギャップＹｍのいずれにも存在しない塩基からなる。本
発明では、「ＮでもＭでもない」セットは空のセットで
あってはならない、すなわち、このセット中には「停止
塩基」をコードするため少なくとも１つの塩基が残って
いなければならない。
【００４９】 １．伸長によるギャップ埋め： 本発明の第一の観点では、本発明は、（ａ）プローブを
目的配列（および、二本鎖からなっていて目的配列の相
補鎖が存在する場合は、該目的配列の相補鎖）にハイブ
リダイズし、（ｂ）少なくとも一つのプローブを伸長し
て少なくとも一つのギャップ（Ｘｎと称する）を埋め、
（ｃ）該伸長プローブを隣接プローブにライゲートして
融合生成物またはライゲート生成物を生成し、ついで（
ｄ）該融合生成物を目的配列から解離させ、上記ハイブ
リダイゼーション、伸長およびライゲーションの工程を
繰り返して所望の目的配列を増幅する、という繰り返し
工程からなる。
【００５０】この態様では、「修飾末端」を形成する「
ギャップ」Ｘｎは、ポリメラーゼおよび逆転写酵素を用
いて１または２以上のプローブを伸長することにより「
補正」する。一般に、ＤＮＡ目的配列にハイブリダイズ
したプローブの伸長は、当該技術分野で知られているよ
うにＤＮＡポリメラーゼまたはクレノー断片により行わ
れる。 ＲＮＡ目的配列の場合には、伸長は逆転写酵素により行
われる。逆転写酵素の例としては、一般に当業者に入手
可能なニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）やモロニ
ー（Ｍｏｌｏｎｙ）マウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬ
Ｖ）などからのものが挙げられる。もちろん、Ｔａｑポ
リメラーゼ（熱的に安定であり、ＬＣＲに必要な高温の
サイクルによく耐え得る）などの伸長試薬を利用するこ
とが好ましい。伸長試薬が熱的に安定でなければ、一般
にＬＣＲの各サイクル毎に再添加しなければならない。
【００５１】この方法による補正では、ギャップ領域中
の目的配列の塩基に相補的なデオキシヌクレオチド三リ
ン酸（ｄＮＴＰ’ｓ）が反応混合物中に存在しているこ
とが必要である。さらに詳しく説明すると、配列Ｘｎを
有するギャップに関しては、加えなければならないｄＮ
ＴＰ’ｓはｄＸ’ＴＰ（式中、Ｘ’はギャップＸｎ中の
各塩基の相補体を意味する）で示される。ｄＮＴＰ’ｓ
は多くの市販元から市販されており、たとえばファルマ
シア（ピスカタウエイ、ＮＪ）やベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ（ガイセルスバーグ、ＭＤ）などが挙げ
られる。
【００５２】伸長は、伸長プローブが隣接プローブに隣
接し、該隣接プローブにライゲートし得るようにライゲ
ーション部位で正確に止めなければならない。この目的
のために「停止塩基」を用いる（図３および図４参照）
。 「停止塩基」（Ｑ’と称する）は、その相補体Ｑに基づ
いて定義され、Ｑに相補的なｄＮＴＰ’ｓを反応混合物
から省く、すなわちｄＱ’ＴＰを反応混合物から省くこ
とにより達成される。それゆえ、４種のｄＮＴＰ’ｓの
うちの相補的な３種を反応混合物に加えることができる
ように、４種の塩基のうちの３種のみからなるセットＮ
からギャップ配列用の塩基をいかにして選択しなければ
ならないかがわかる。第四のｄＮＴＰ、すなわちｄＱ’
ＴＰが反応混合物から省かれている場合には、伸長は所
望のライゲーション部位で停止するであろう。従って、
Ｑ’は隣接プローブ中の第一の塩基であり、停止塩基を
コードする目的配列上の塩基は、ギャップに隣接する第
一の塩基であるということになる（図３において５’末
端上）。停止塩基Ｑ’自体（相補体Ｑではなく）はＸｎ
ギャップの３’末端に隣接して存在していることに注意
すべきである。これは、Ｑ’停止塩基がまた、プローブ
Ｂ’の所望でない３’末端伸長を防ぐためにも存在して
いなければならないからである。
【００５３】より単純な特別の場合の方が概念を把握し
易いので、単一ギャップ法についてまず説明する。しか
しながら、単一ギャップ法は後で説明する二重ギャップ
法の単なる特別な場合にすぎないことを理解すべきであ
る。図３は、一つのプローブのみ（すなわち、Ｂ）がそ
の５’末端にギャップを有するので単一ギャップ法の態
様を示すものである。第一プローブＡは、目的配列Ｔの
第一の切片にハイブリダイズしている。第二プローブＢ
は、該目的配列の第二の切片にハイブリダイズし、該第
一の切片の５’末端と該第二の切片の３’末端との間に
１または２以上の塩基のギャップを残している。このギ
ャップをＸｎと称する。第三プローブＡ’は該第一プロ
ーブＡにハイブリダイズすることができ、第四プローブ
Ｂ’は該第二プローブＢにハイブリダイズすることがで
きる。図３に示すように、目的配列Ｔは相補鎖Ｔ’を有
する二本鎖であり得る。この場合には、プローブＡ’お
よびプローブＢ’は、該目的配列の相補鎖の第一の切片
および第二の切片にハイブリダイズすることにより最初
のハイブリダイゼーションに関与する。
【００５４】ポリメラーゼまたは逆転写酵素による伸長
は５’から３’方向に進行する。その後、もし伸長を妨
げるものが何もなければ、ＡおよびＢ’の両方の３’末
端はポリメラーゼにより伸長可能である。Ａ’が目的配
列の相補鎖上にハイブリダイズすれば、Ａ’はＢ’の伸
長を立体的に妨害する。しかしながら、Ａ’が目的配列
の相補鎖にハイブリダイズしなくても、Ｂ’の伸長に必
要なつぎの塩基（この場合はＱ’）が反応混合物からな
くなれば伸長は依然として停止するであろう。逆に、プ
ローブＡは、プローブＢか停止塩基相補体（Ｑ）に目的
配列上で出会うまで伸長されていく。Ａ’はＡの伸長の
ための鋳型として働かないので、プローブＡは目的配列
にハイブリダイズした場合にのみ伸長していく。
【００５５】上記のように、伸長プローブが隣接プロー
ブＢの５’末端にライゲートし得るように、ギャップの
末端（すなわち、ライゲーション部位）でＡの伸長を停
止させることが重要である。それゆえ、反応混合物には
、ギャップＸｎの５’末端に最も隣接する塩基に相補的
なデオキシヌクレオチド三リン酸が省かれている。従っ
て、Ｘｎは、いかなる塩基長であってもよい、すなわち
ｎは１または２以上のいかなる整数であってもよい。Ｘ
の塩基における唯一の制限は、４種の塩基のうちの３種
の塩基からなるセットＮの中から塩基の選択をしなけれ
ばならないということである。停止塩基Ｑ’をコードす
るために、少なくとも１種の塩基を残しておかなかれば
ならない。Ｘｎ配列中に３種よりも少ない塩基を用いた
場合には、残りのいずれの塩基も停止塩基として用いる
ことができることを理解すべきである。それゆえ、Ｑは
「Ｎでない」セットから選択され、ここで「Ｎでない」
とは、４種の塩基（ユニバース）からセットＮに含まれ
る要素を省いた塩基からなることをいう。
【００５６】この態様におけるライゲーション部位は、
常にプローブＡ’およびプローブＢの５’末端であるこ
とが今や明らかである。これら末端が停止塩基Ｑの部位
でもあるということは単なる偶然の一致ではない。
【００５７】詳細な説明は後に記載するとして、一般的
な例示を示すことにする。図３においてギャップＸｎが
配列ＧＡを示すものとする。それゆえ、塩基は、４種の
塩基のうちの２種からなるセットＮ（Ｎ＝｛Ｇ、Ａ｝）
から選択される。プローブ伸長の間に添加しなければな
らないｄＮＴＰ’ｓはｄＣＴＰおよびｄＴＴＰである。 この例では、停止塩基Ｑ’はＧかＡのいずれかであり、
その相補体ＱはＣかＴのいずれかでなければならない。 従って、Ｑが「Ｎでない」セットから選択しなければな
らないという要求がいかにして達成されるかが今や明ら
かである。
【００５８】適当なポリメラーゼの存在下、ＣおよびＴ
の添加によりプローブＡは目的配列を鋳型として用いて
伸長される。しかしながら、鋳型上のＱの位置でポリメ
ラーゼがＣまたはＴと出会うと、反応混合物中にはｄＮ
ＴＰ’ｓとしてＧまたはＡのいずれも添加されていない
のでプローブＡを伸長することはもはやできない。プロ
ーブＡの伸長した３’末端がプローブＢの５’末端と隣
接した状態で、伸長はライゲーション部位にて正確に停
止する。
【００５９】ついで、リガーゼを用いて伸長プローブＡ
の３’水酸基末端をプローブＢの５’リン酸基末端と結
合させ、主プローブと目的配列との間で融合またはライ
ゲートした二本鎖複合体を生成させる。目的配列が二本
鎖であり相補鎖Ｔ’を有している場合には、プローブＡ
’およびプローブＢ’が目的配列の相補鎖にハイブリダ
イズしている場合、リガーゼは該プローブＡ’およびプ
ローブＢ’を最初のサイクルで結合させるであろう。目
的配列の相補鎖ではなく過剰のプローブＡおよびプロー
ブＢにハイブリダイズしている場合には、末端は平滑末
端でも粘着末端でもなくライゲーションの基質とはなら
ないのでライゲーションは抑制される。
【００６０】その後、得られた二本鎖複合体を解離させ
、新たなプローブＡ、Ａ’、ＢおよびＢ’を目的配列、
目的配列の相補鎖、および上記第一のサイクルから得た
両融合ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる。上記
と同様に伸長およびライゲーションを行い、この工程を
繰り返す。
【００６１】Ｘｎ、ＱおよびＱ’の塩基の組み合わせを
表Ｉに示す。本発明はこれらの組み合わせに限定される
ものではなく、これらの組み合わせは多くの可能な組み
合わせの例示にすぎないことが理解されるであろう。表
Ｉはまた、Ｎでないセットにより示される塩基からＱを
選択しなければならないという要求をも示している。こ
のことは、停止塩基Ｑ’は、その相補体として、Ｘｎ配
列中には含まれない塩基を有していなければならないこ
とを意味している。 表Ｉ（単一ギャップ法におけるギャップ配列、必要なｄ
ＮＴＰ’ｓ、およびＱとＱ’との可能な組み合わせ）　
　Ｘｎ／Ｎ　　　　　　　　Ｘ’ＴＰｓ　　　　Ｎでな
い＊　　　　　　　　　　　　停止配列Ｑ’　　Ａ　　
　　　　　　　　　　　　Ｔ　　　　　　　　　　Ｔ、
Ｃ、Ｇ　　　　　　　　　　　　　　　Ａ、Ｃ、Ｇ　　
ＧＴ　　　　　　　　　　　　Ｃ、Ａ　　　　　　　Ｃ
、Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇ、Ｔ　　
ＧＣ　　　　　　　　　　　　Ｇ、Ｃ　　　　　　　Ａ
、Ｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａ、Ｔ　　
ＡＡ　　　　　　　　　　　　Ｔ　　　　　　　　　　
Ｔ、Ｇ、Ｃ　　　　　　　　　　　　　　　Ａ、Ｃ、Ｇ
　　ＧＣＡ　　　　　　　　　　Ｃ、Ｇ、Ｔ　　　　Ｔ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａ　　Ｇ
ＣＡＧ　　　　　　　　Ｃ、Ｇ、Ｔ　　　　Ｔ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａ　　ＡＡＡＴＴ
　　　　　　Ｔ、Ａ　　　　　　　Ｇ、Ｃ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｃ、Ｇ　　ＧＣＡＧＣＡ　　
　　Ｃ、Ｇ、Ｔ　　　　Ｔ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　Ａ　　ＧＡＣＴ　　　　　　　　すべ
て　　　　　　停止塩基がないので空（注）＊Ｎでない
セットは、停止塩基（Ｑ’）の可能な相補体を与える。 実際の停止塩基（Ｑ’）の可能性は次の欄に示してある
。
【００６２】すでに記載したように、単一ギャップ法は
、より一般的な二重ギャップ法の特別の場合（ｍ＝０の
場合）である。二重ギャップ法もまた、４つのプローブ
、すなわちＡ、Ａ’、ＢおよびＢ’を用いる。この方法
の場合も、上記方法の場合と同様、プローブＢの５’末
端は短くなっていて、主プローブＡおよびＢがハイブリ
ダイズする目的配列の第一の切片と第二の切片の間にＸ
ｎ塩基のギャップを生成する。ギャップＸｎの塩基には
、単一ギャップ法の場合と同様の制限が加えられる。
【００６３】さらに、第三プローブＡ’の５’末端もま
た目的配列の相補鎖および第一プローブＡの両方に関し
て短くなっており、従プローブ（第三プローブおよび第
四プローブ）の間で第二のギャップＹｍを生成する。ギ
ャップＹｍはいかなる塩基長であってもよく、Ｘｎと同
じ長さである必要はない（すなわち、ｍはｎと等しい必
要はない）。実際、ｍは０であってもよく、その場合は
、二重ギャップ法は特別な場合である単一ギャップ法に
縮重する。
【００６４】本発明の好ましい態様においては、第四プ
ローブＢ’は、目的配列中のＸｎ配列ギャップと同じ３
’末端配列Ｘｎを含んでいる。しかしながら、このこと
は、プローブ間でギャップが生成されればよいので、本
発明にとって必須ではない。それゆえ、第二プローブＢ
に関して３’末端が後退していなければ、第四プローブ
Ｂ’の３’末端は配列Ｘｎの３’末端より短く停止して
いてよい。伸長は５’末端から３’末端の方向に起こり
ｄＸ’ＴＰを添加するので、ちょうど第一プローブＡが
Ｘｎギャップ中を伸長されるのと同様に、プローブＢ’
はギャップ（ＸｎおよびＹｍの両方）中を伸長されてい
くであろう。
【００６５】二重ギャップ態様に用いる本発明の方法は
、単一ギャップ態様に用いる方法と非常に類似している
。ハイブリダイゼーション、伸長およびライゲーション
の各工程は本質的に同じである。伸長を促進する条件下
、ＡおよびＢ’の両プローブはそれらの３’から伸長し
てそれぞれＸｎおよびＹｍのギャップを埋めていく。停
止配列Ｑ’は両プローブの伸長をライゲーション部位に
て停止させ、これらプローブは新たに隣接したプローブ
とライゲートされる。
【００６６】しかしながら、Ｙｍ配列を構成する塩基配
列には幾つかの制限がある。少なくとも１つの停止配列
Ｑ’を残しておかなければならないので、ＸおよびＹの
可能な配列を表すＮとＭとの組み合わせセットは４種の
うちの３種を越える塩基を含んでいてはならない。従っ
て、Ｙは４種の塩基のうちの０からいずれの３種の塩基
であってもよいが、少なくとも１つの塩基は「ＮでもＭ
でもない」セット中に残っていなければならない。セッ
トＮが４種の塩基のうちの３種未満から構成されている
場合は、少なくとも１つの塩基が残っている限りセット
Ｎ中に含まれない塩基であってよい。それらの補集合が
、プローブ伸長停止のための停止塩基Ｑ’として働き得
る。単一の停止塩基が、ＸｎとＹｍの両ギャップにおい
て伸長を停止させ得る。
【００６７】配列Ｙｍの第二の制限は、ｍがｎに等しい
場合に生じる。これらギャップが同じ長さである場合は
、配列Ｙｍは配列Ｘｎと相補的であってはならない。そ
うでないと、プローブＡの３’末端とプローブＢ’の３
’末端とは「粘着末端」を構成することになる。「粘着
末端」は目的配列に独立して二本鎖複合体を生成させて
しまい、プローブＡはプローブＢ’にハイブリダイズし
てライゲーションおよび増幅を起こさせてしまう。そう
ではなく、ｍがｎに等しい場合はＹｍがＸｎに相補的で
ないのが好ましい。言い換えれば、プローブＡおよびプ
ローブＢ’の末端は、少なくとも、同じ長さであっても
よいが相補的ではない「非粘着（ｓｌｉｐｐｅｒｙ）末
端」でなければならない。
【００６８】にもかかわらず、粘着末端（または、一層
起こりにくいことではあるが非粘着末端）などにより目
的配列に独立してライゲーションおよび増幅が起こった
としても、これらの融合生成物は増幅された目的配列か
ら識別することが可能である。ｍがｎに等しい場合には
、目的配列とは独立してＡ：Ａ’二本鎖複合体がＢ：Ｂ
’二本鎖複合体にライゲートする、小さいが測定可能な
機会がある。これらの複合体は、所望の目的配列よりも
ｍ（またはｎ）だけ短いので長さに基づいて識別するこ
とができる。さらに、末端が「非粘着性」である場合に
は、塩基ミスマッチを検出および／または破壊すること
のできる多くの試薬により塩基ミスマッチを検出するこ
とができる。たとえば、塩基ミスマッチは、コットン（
Ｃｏｔｔｏｎ）らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．８５：４３９７〜４４０１（１９８８）に開示さ
れたヒドロキシルアミン−オスミウムテトラオキシド法
により化学的に決定し、Ｓ１ヌクレアーゼやヤエナリヌ
クレアーゼなどの試薬により酵素的に決定することがで
きる。Ｘ’とＹ’の幾つかの組み合わせ、対応ｄＮＴＰ
および可能なＱおよびＱ’を表ＩＩに示す。
【００６９】表ＩＩ（二重ギャップ法におけるギャップ
配列、必要なｄＮＴＰおよびＱとＱ’の可能な組み合わ
せ） Ｘｎ／Ｎ　　　　　　Ｙｍ／Ｍ　　　　Ｘ’ＴＰｓ　　
Ｙ’ＴＰｓ　　Ｎでもなく　　停止塩基Ｑ’　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　Ｍでもない＊Ａ　　　　
　　　　　　Ａ　　　　　　　　　　Ｔ　　　　　　　
　　Ｔ　　　　　　　　Ｔ、Ｃ、Ｇ　　　　　　Ａ、Ｃ
、ＧＧ　　　　　　　　　　Ｔ　　　　　　　　　　Ｃ
　　　　　　　　　Ａ　　　　　　　　Ｃ、Ａ　　　　
　　　　　Ｇ、ＴＡＴ　　　　　　　　ＡＴ　　　　　
　　　Ｔ、Ａ　　　　　　Ｔ、Ａ　　　　　Ｃ、Ｇ　　
　　　　　　　Ｃ、ＧＡＣ　　　　　　　　ＧＡ　　　
　　　　　Ｔ、Ｇ　　　　　　Ｃ、Ｔ　　　　　Ｔ　　
　　　　　　　　　　ＡＡＴＧ　　　　　　ＡＡＡ　　
　　　　Ｔ、Ａ、Ｃ　　　Ｔ　　　　　　　　Ｃ　　　
　　　　　　　　　ＧＧＧＣＣ　　　　ＡＡＡＣＧ　　
Ｃ、Ｇ　　　　　　Ｔ、Ｇ、Ｃ　　Ｔ　　　　　　　　
　　　　ＡＡＴＴＧＡ　　ＡＧＧＴ　　　　Ｔ、Ａ、Ｃ
　　　Ｔ、Ｃ、Ａ　　Ｃ　　　　　　　　　　　　ＧＣ
ＧＣ　　　　　　ＧＣＧ　　　　　　相補的。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　認
められず。 （注）＊ＮでもなくＭでもないセットは、停止塩基（Ｑ
’）の可能な相補体を与える。実際の停止塩基（Ｑ’）
の可能性は次の欄に示してある。
【００７０】ギャップＸｎおよびＹｍの長さは、０（Ｙ
ｍのみ）、１または１より大きないかなる整数であって
もよい。たとえば、１〜２０塩基のギャップが可能であ
る。 しかしながら、実際ははるかに短い長さ、たとえば１〜
３または５塩基のギャップが好ましい。現在のところ最
も好ましいのは、単一の塩基のみからなるギャップであ
る。単一塩基のギャップはバックグラウンドに対する真
のシグナルの比を大きく増大させること、および停止塩
基およびｄＸＴＰ’ｓに対する選択余地が最も大きいこ
とがわかっている。プローブは、実際は、停止塩基を「
選択する」よりも、すでに存在している目的配列に対し
て設計されるので、たいていの場合は単一塩基ギャップ
が一層有用である。
【００７１】 その他の特徴 　　いずれの「後退」法の態様においても、ギャップを
埋めるのに用いるデオキシヌクレオチド三リン酸はマー
カー残基を含むように修飾してよい。マーカーの例とし
ては、放射性同位体などの直接標識、またはビオチン、
ジゴキシンもしくは固相かまたは標識生成系により認識
され得るその他のハプテンなどのフックが挙げられる。 同位体標識の例としては、とりわけ３２Ｐおよび重水素
などが挙げられる。
【００７２】ｄＮＴＰ’ｓ中にマーカーを取り込むこと
は、一般に通常の有機化学の問題である。リンカーやス
ペーサーを用いることもできるが、必須のものではない
。重要なのは、修飾ｄＮＴＰが、その相補体の向かい側
のギャップ中に取り込まれ、隣接する塩基に共有結合的
に結合され得ることのみである。
【００７３】さらに、第一の（目的）配列および単一の
塩基（Ｚ）において異なる第二の（または目的としない
）配列において、該塩基の相違が第二鎖の２つの位置の
いずれかにあれば、該第一の配列を該第二の配列から識
別するためにいずれの態様も用いることができる。両方
の場合とも、ただ１種の塩基（長さではなく構成成分）
のみを有するギャップを用いて単一の塩基の相違を識別
する。
【００７４】まず、目的としない配列のギャップ領域中
に含まれる相違塩基Ｚは、反応混合物からｄＺ’ＴＰを
省くことにより識別することができる。従って、Ｚはま
たＮでもなくＭでもないセットに属していなければなら
ないともいえる。相違鎖は、適当なヌクレオチド三リン
酸が与えられないのでポリメラーゼにより伸長されるこ
とはない。相違塩基Ｚを識別する最大の可能性があるの
は、単一ギャップがただ１個の塩基の長さであり、Ｎで
もなくＭでもないセットが最も大きくなる場合であるこ
とがわかる。
【００７５】つぎに、相違塩基ＺがＱの位置にある場合
は、伸長が適当に停止することなく、生成する伸長生成
物は余りに長すぎてその関連プローブと目的配列の鎖に
沿ってライゲートできないため、これら鎖を識別するこ
とができる。この態様の場合、識別の最大の可能性があ
るのは、可能な停止塩基がただ１つしかなく、他のすべ
ての塩基では生成物が長すぎるようになる場合である。
【００７６】二重ギャップ態様もまた、単一の塩基相違
をギャップの一方または他方に有する配列を識別するの
に同様に有用である。この態様はまた、停止塩基すなわ
ちＱ’位置に相違塩基を有する配列を識別するのにも有
用であり得る。
【００７７】 ２．別のプローブによるギャップ埋め：この後退態様の
観点においては、本発明は、（ａ）修飾プローブを目的
配列（および、二本鎖からなっていて目的配列の相補鎖
が存在する場合は、該相補鎖）にハイブリダイズし、（
ｂ）第五および第六のギャップ埋めプローブを用意して
主プローブと従プローブとの間のギャップを埋め、（ｃ
）該ギャップ埋めプローブの両末端を隣接プローブにラ
イゲートして融合生成物またはライゲート生成物を生成
させ、ついで（ｄ）該融合生成物を目的配列から解離さ
せ、上記ハイブリダイゼーション、ギャップ埋めおよび
ライゲーション工程を繰り返して所望の目的配列を増幅
する、という繰り返し工程からなる。この態様において
は、上記４つのプローブＡ、Ａ’、ＢおよびＢ’の代わ
りにプローブＤ、Ｄ’、ＥおよびＥ’を用いる（図５参
照）。ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ’ｓの代わりに第五
および第六の「ギャップ埋め」プローブＦおよびＦ’を
用い、後退またはプローブ間のギャップを埋める。
【００７８】この態様では３対のプローブを使用する。 第一プローブＤおよび第二プローブＤ’はお互いにハイ
ブリダイズし、第三プローブＥおよび第四プローブＥ’
もまた同様にお互いにハイブリダイズする（この態様で
はプローブの命名が上記態様とは異なること、すなわち
第二プローブはその関連パートナーではなく第一プロー
ブの相補体である。それゆえ、第一プローブと第三プロ
ーブとが主プローブとなる）。主プローブＤおよびＥが
目的配列にハイブリダイズすると、プローブＤの３’水
酸基末端とプローブＥの５’リン酸基末端との間に少な
くとも１塩基、好ましくは数塩基からなるギャップが生
じる。同様に、プローブＤ’およびプローブＥ’が目的
配列の相補鎖Ｔ’にハイブリダイズすると、これらプロ
ーブ間に同様に１〜数塩基のギャップが生じる（これら
ギャップは整列はしないが）。それゆえ、プローブＤと
Ｅ、およびプローブＤ’とＥ’は、隣接せず（ｎｏｎ−
ａｄｊａｃｅｎｔ）平滑末端でもないように修飾されて
いる（その相補体と二本鎖を生成したときに）。この態
様におけるギャップは、主プローブおよび従プローブの
両方の間で目的配列および目的配列の相補鎖に（および
お互いに）ハイブリダイズする第五プローブＦおよび第
六プローブＦ’を用いてギャップを埋めることにより「
補正」する。
【００７９】図５からわかるように、これらギャップ埋
めプローブのうちの一方は両方の末端とも他方のギャッ
プ埋めプローブよりも短いのが好ましい。言い換えると
、従プローブＤ’およびＥ’の両方ともがそれぞれの主
プローブを越えて延びているか、または主プローブの両
方ともがそれぞれの従プローブを越えて延びている。さ
らに別の態様では、実施例１３に示すように、一方の主
プローブ（Ｄ）はその従プローブ（Ｄ’）を越えて延び
ているが、他方の主プローブ（Ｅ）はその相補体（Ｅ’
）よりも短いところで停止している。しかしながら、こ
の態様では、該修飾末端は「間違った」プローブに関し
て「粘着末端」であってはならない。たとえば、Ｄ’を
越えて延びるＤの３’末端は、Ｆを越えて延びるＦ’の
３’末端とのみ相補的でなければならない。このＤの３
’末端は、Ｆ’を越えて延びるＦの３’末端と相補的で
あってはならないし、またＥを越えて延びるＥ’の３’
末端とも相補的であってはならない。このことに注意し
ないと、真の目的配列の不在下でもプローブ二本鎖の再
編成が行われて高いバックグラウンドシグナルを生じる
。
【００８０】この態様のプローブは、前記態様のプロー
ブと同様にして製造することができる。一般に、この態
様のプローブも前記態様のプローブに匹敵する長さを有
する。最後に、この態様では伸長およびポリメラーゼが
不必要であることを除いて、前記態様において有用な反
応条件はこの態様でも有用である。
【００８１】主プローブ間および従プローブ間のギャッ
プがギャップ埋めプローブにより埋められたら、ギャッ
プ埋めプローブの両末端をそれぞれ従プローブまたは主
プローブにライゲートして連続したポリヌクレオチド鎖
を生成させる。主プローブおよび第一のギャップ埋めプ
ローブＦは、目的配列に相補的な主ポリヌクレオチド鎖
を生成し、従プローブおよび第二のギャップ埋めプロー
ブＦ’は、目的配列の相補鎖に相補的な従ポリヌクレオ
チド鎖を生成する。もちろん、この主ポリヌクレオチド
鎖および従ポリヌクレオチド鎖もまたお互いに相補的で
ある。従って、ハイブリダイゼーションおよびライゲー
ションの工程を繰り返すことにより、従来のＬＣＲと全
く同様に目的配列の増幅が得られる。しかしながら、対
照的に、平滑末端ライゲーションに起因する偽陽性シグ
ナルは、この態様では著しく減少する。というのは、二
本鎖複合体ＤおよびＤ’は二本鎖複合体ＥおよびＥ’に
平滑末端ライゲーションができないからである。これは
、従プローブの両方から、または主プローブの両方から
１または２以上の塩基が省かれているからである。
【００８２】もちろん、所望のポリヌクレオチドの他に
他の生成物も生成されるであろうことは理解される。た
とえば、Ｄ：ＦおよびＤ’：Ｆ’、またはＦ：Ｅおよび
Ｆ’：Ｅ’を含む、短い切片（「ダイマー」）が生成す
ることが予想される。さらに、これらの副生成物または
不完全生成物は所望の試薬を利用する傾向があるであろ
うことも理解される。しかしながら、過剰の試薬を添加
することによって、および不完全な生成物から所望のポ
リヌクレオチドをきれいに分離することにより、この態
様は現在のところ好ましくはないにしても有用ではある
。
【００８３】本発明に従ってライゲートしたプローブの
分離および検出は、当該技術分野で知られたいかなる方
法でも行うことができる。好ましい検出方法は、主プロ
ーブまたは従プローブに結合したマーカーを用いること
である。好ましくは、固相により捕捉し得るフックをプ
ローブＤの５’末端に結合させ、プローブＥ’の５’末
端には標識または標識を捕捉し得るフックを結合させる
。 ついで、第一のフックを固相で捕捉し、固相を溶液から
分離し、固相に結合した標識を検出することにより所望
のポリヌクレオチド鎖を検出することができる。反応中
に生成した不完全な生成物は、固相で捕捉できないか、
標識で検出できないか、またはその両方である。それゆ
え、分離および検出後、目的配列の不在下では平滑末端
ライゲーションは捕捉フックを標識フックと関連付ける
ことができないので、シグナルはほとんど生じないか、
または全く生じない。
【００８４】 ＩＩ．ＰＣＲ ＰＣＲの原理については文献に詳細な記載がある（たと
えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，
６８３，２０２号各明細書参照）。従って、本明細書で
はさらに詳しく説明する必要はない。基本的に、プライ
マーを目的配列にハイブリダイズさせ、ヌクレオチド三
リン酸を組み立てブロックとして用いてポリメラーゼに
より該プライマーを伸長させる。伸長生成物（およびそ
の相補体）は、さらにハイブリダイゼーションのための
鋳型として働く。一般に、伸長が起こるためにはプライ
マーの３’末端は目的配列に完全に相補的でなければな
らない。熱安定ポリメラーゼを含む多くのポリメラーゼ
が知られている。
【００８５】本発明では、ＰＣＲプライマーがポリメラ
ーゼ酵素により伸長されないように、該プライマーの３
’末端が修飾されている。これら修飾を鋳型に依存した
仕方で除去し得る場合には、ポリメラーゼ酵素によりプ
ライマー伸長のためのハイブリダイゼーション要求にさ
らに厳重さのレベルが付加される。この付加されたレベ
ルの厳重さは、とりわけ主プライマーおよび従プライマ
ーの両方が修飾末端を有している場合、ＰＣＲにおける
偽りのシグナル生成を有効に減少させる。
【００８６】ブロッキング基の選択および補正法に関し
てＬＣＲに有用な同じ一般的方法の多くはまた、ＰＣＲ
にも用いることができる。ＬＣＲでは修飾により偽りの
ライゲーションをブロッキングしなければならないが、
ＰＣＲでは修飾により偽りの伸長をブロッキングしなけ
ればならない。それゆえ、修飾またはブロッキングした
３’末端は、目的配列にハイブリダイズしたときにポリ
メラーゼによる伸長を支持してはならない。上記ＬＣＲ
修飾末端態様の記載を適用することができるが、「ライ
ゲーション部位」または「ライゲーションを意図した部
位」なる語の代わりに「伸長開始部位」なる語を用いな
ければならない。
【００８７】 Ａ．突出修飾末端： 突出末端については、ＬＣＲ態様の場合に相補的プロー
ブとの関係において記載した。ＰＣＲの場合には、「突
出末端」なる語は匹敵する意味を有しない。ＰＣＲに関
しては、これらの修飾末端は、より適切に「鋳型に依存
したブロッキング基」と記載することができる。にもか
かわらず、ＬＣＲにおける「突出末端」修飾および補正
法はＰＣＲに一般に適用することができる。
【００８８】化学的ブロッキング修飾として、ＬＣＲに
有用なＲ基におけるすべての可能な「Ｚ」残基（−デオ
キシリボースは例外となり得るが）を、ＰＣＲにおける
重合をブロッキングするために用いることができる。さ
らに、エンドヌクレアーゼＩＶを用いた同じ補正機構を
ＰＣＲにも採用することができる。
【００８９】ＬＣＲの「突出修飾」（ライゲーションを
意図した部位を越えた付加核酸からなる）については上
記で記載した。それら修飾は、１．本質的にリボヌクレ
オチドからなる突出、２．非塩基部位を含む突出、およ
び３．ミスマッチ塩基を含む突出である。これらの修飾
はＰＣＲには不利であるように思われるが、補正（開裂
）する突出自体を伸長酵素（たとえば、ポリメラーゼ）
の基質として不活性にすることができれば、上記各クラ
スの修飾末端を同様にしてＰＣＲにも用いることができ
る。突出を不活化していないと、開裂したときに、その
後の不必要な伸長のプライマーとして働いてしまう。突
出を不活化する一般的な方法は、３’末端が伸長酵素に
よる認識に適しないようにすることである。プライマー
に関連して上記で記載した修飾は、突出の３’末端をも
一般に不活化するであろう。しかしながら、プライマー
修飾の場合と違って、突出の３’末端の修飾は、プライ
マー修飾を補正するのに用いたのと同じ機構により補正
されてしまってはならない。さもないと、両方の修飾が
同時に補正されてしまうからである。容易に補正されな
い適当な修飾の例としては、末端ジデオキシヌクレオチ
ド、コルデセピン（ｃｏｒｄｅｃｅｐｉｎ）、またはプ
ライマーの３’末端からの伸長を実際に永久に防ぐ公知
または発見されるべき他のあらゆる化学的修飾が挙げら
れる。ＬＣＲの場合のように、これらの修飾は鋳型に依
存した仕方で補正する。補正法および試薬は、ＬＣＲの
場合と同じである。
【００９０】 Ｂ．後退により修飾した末端： ＰＣＲにおいて偽りのシグナル生成を減少させるのに後
退末端修飾が有用であるかどうか、またどのように有用
であるかについては、現在のところまだわかっていない
。修飾法を選択した後、修飾末端を有する適当なプライ
マーを調製する。プライマーを目的配列ＤＮＡにハイブ
リダイズさせる条件は、標準的なＰＣＲ法と同じであり
、文献に記載されている。その後の伸長、変性、および
再ハイブリダイゼーションのサイクルも標準的なＰＣＲ
法と同じであるが、修飾末端を鋳型に依存した仕方で補
正するための酵素または他の試薬が含まれていることだ
けが異なっている。
【００９１】つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらに限られるものでは
ない。特にことわらない限り、実施例中のプローブおよ
び目的配列は５’末端が左にくるように記載してある。 実施例１ 　　簡単にするため、下記目的配列ＤＮＡを一本鎖とし
てのみ示す。配列中の「−」は、ＬＣＲプローブのライ
ゲーションを意図する部位を示す。 ３’−．．．ＴＴＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧ−
ＣＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＧＴ
．．．−５’
【００９２】ＬＣＲにより、バックグラウンドレベルを
減少させて上記目的配列を検出するため下記プローブセ
ットを設計した。 Ａ　　５’−ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣｐ
Ａ’　３’−ＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧＢ　　５’
−ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣ
Ａ Ｂ’　３’−ｐＣＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣ
ＴＧ このプローブセットは、末端３’リン酸基ブロッキング
基（下線を引いてある）を有する２つのプローブ（Ａ＆
Ｂ’）を特徴とする。
【００９３】種々の量の目的配列（ｐＵＣ１９）を用い
、ＬＣＲ反応を行う（実質的にＥＰ−Ａ−３２０３０８
号明細書に記載のようにして）。各サイクルのハイブリ
ダイゼーション工程の後に、大腸菌から精製したエンド
ヌクレアーゼＩＶを反応混合物に加える。大腸菌エンド
ヌクレアーゼＩＶは、いくらか熱安定性であるので、上
記添加は標準的なＬＣＲ条件下で行うことができる。コ
ントロールとして、エンドヌクレアーゼＩＶを添加せず
に同数の目的配列分子を用いてＬＣＲを行う。これらの
コントロールにおいて上記と同様のプローブセットを用
いるが、３’末端ヌクレオチド（３’リン酸基含有）だ
けはプローブＡおよびＢ’に含まれていない。
【００９４】実験反応およびコントロール反応の両方と
も、ライゲート生成物の出現頻度を添加した目的配列分
子の最初の数と関連付ける。これら２つのプロトコール
の異なる点は、第二の場合には、目的配列分子を含有し
ない「ブランク」チューブが１０００個の目的配列分子
を含有するチューブとほぼ同じ速度でシグナルを生成す
るのに対して、修飾プローブおよびエンドヌクレアーゼ
ＩＶを使用した場合には、目的配列分子を含有しない「
ブランク」チューブは１０００個の目的配列分子を含有
するチューブに比べてシグナルの生成が有意に一層ゆっ
くりしているということである。このバックグラウンド
の抑制により、アッセイ感度の使用範囲を高める上で有
利となる。
【００９５】ＬＣＲおよびＰＣＲにおいてそれぞれ高度
に熱安定性のリガーゼおよびポリメラーゼが有用で望ま
しいのと同じ理由から、高度に熱安定性のエンドヌクレ
アーゼＩＶを使用することが望ましいことは、当業者に
は直ちに評価されるであろう。さらに、ＤＮＡ鎖の５’
末端または３’末端の修飾を鋳型に依存した仕方で除去
することにより、ブロッキングされていた５’リン酸基
または３’水酸基を完全な形にすることのできる公知ま
たは未知の他の酵素もまた、上記エンドヌクレアーゼＩ
Ｖと全く同様にして用いることができることも当業者に
は評価されるであろう。
【００９６】 実施例２ 　　下記プローブセットを用い、バックグラウンドレベ
ルを減少させて実施例１の目的配列ＤＮＡを検出するこ
とができる。 Ａ　　５’−ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡ
’　３’−ＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧｒＣｒＣＣＣ
Ｂ　　５’−ＴＡＣｒＣｒＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡ
ＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡ Ｂ’　３’−ＣＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴ
Ｇ
【００９７】プローブＡ’およびプローブＢは、キメ
ラリボ／デオキシリボヌクレオチド伸長（下線を引いて
ある）を含む。リボヌクレオチド塩基は、その前に小文
字の「ｒ」を付してある。エンドヌクレアーゼＩＶの代
わりにリボヌクレアーゼＨを用い、実施例１と同様にし
てＬＣＲ反応を行う。コントロールとしては、実施例１
に使用したものと同じプローブセットを用いることがで
きる。結果および解釈は実施例１と同じである。
【００９８】 実施例３ 　　バックグラウンドレベルを減少させて実施例１の目
的配列ＤＮＡを検出するため、下記プローブセットをも
用いることができる。 Ａ　　５’−ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＪ
ＧＡ’　３’−ＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧＢ　　５
’−ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧ
ＣＡ Ｂ’　３’−ＧＪＣＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧ
ＣＴＧ
【００９９】プローブＡおよびプローブＢ’は、非塩基
部位（「Ｊ」）のつぎに標準ヌクレオチドが続くことを
特徴とする伸長（下線を引いてある）を含む。実施例１
と同様にしてＬＣＲを行う。結果および解釈は実施例１
と同じである。
【０１００】 実施例４ 　　バックグラウンドレベルを減少させて実施例１の目
的配列ＤＮＡを検出するため、下記プローブセットをも
用いることができる。 Ａ　　５’−ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡ
’　３’−ＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＢ　　５
’−ＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣ
ＴＧＣＡ Ｂ’　３’−ＣＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴ
Ｇ
【０１０１】プローブＡ’およびプローブＢは、鋳型
ＤＮＡにハイブリダイズしたときに、第一のヌクレオチ
ドＡ／Ｇミスマッチおよびハイブリダイズし得る第二の
ヌクレオチドからなることを特徴とするジヌクレオチド
伸長（下線を引いてある）を含む。エンドヌクレアーゼ
ＩＶの代わりにＡ／Ｇミスマッチ修復酵素（複合体）を
用い、実施例１と同様にしてＬＣＲ反応を行う。結果お
よび解釈は実施例１と同じである。
【０１０２】 実施例５ 　　ハロタイプ３フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）が、あ
るデンマーク研究群におけるすべてのＰＫＵ対立遺伝子
のうちの約３８％の原因となっている。これは、フェニ
ルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードする遺
伝子中のイントロン１２の５’スプライスドナー部位に
おける単一塩基突然変異（Ｇ＞Ａ）により引き起こされ
る。実施例４に記載したバックグラウンド減少のための
ミスマッチ修復法はまた、この特性を有していると思わ
れる個人からの血液や他の流体試料において上記遺伝子
欠損の存否を決定するための感度の高いアッセイとして
も用いることができる。
【０１０３】ＰＡＨ遺伝子のイントロン１２からの下記
目的ＤＮＡに相補的になるように、下記特定末端部分を
有するプローブを調製する。 （正常ＰＡＨ　　ＤＮＡ） ３’−．．．ＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＧＡＣＡＡＴＴＡＣ
ＣＴ．．．−５’ ３’−．．．ＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡＡＴＴＡＣ
ＣＴ．．．−５’ （ＰＫＵ　　ＤＮＡ） Ａ　　５’−．．．ＡＡＡＴＴＡＣＴＴＡＡ’　３’−
．．．ＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＡＡＣＢ　　５’−ＣＴＧ
ＴＴＡＡＴＧＧＡ．．．Ｂ’　３’−ＧＡＣＡＡＴＴＡ
ＣＣＴ．．．プローブＢおよびプローブＢ’には単一ヌ
クレオチド伸長を付加し、標準的なＬＣＲの考察に従い
プローブを設計する（すなわち、１５〜３０量体）。こ
れらの伸長は（目的ＤＮＡに関して）第一のミスマッチ
ヌクレオチドおよびそれに続く２つのハイブリダイズし
得るヌクレオチドからなっている。
【０１０４】ＰＫＵの存在について試験する患者の血液
からヒトＤＮＡを精製する。ＤＮＡを平均サイズ≦１０
Ｋｂに切断するのが望ましい。上記プローブを用いて、
この試料をＬＣＲに供し、各サイクルのハイブリダイゼ
ーション工程の後にＡＧミスマッチ修復系酵素を加える
（実施例４参照）。試料に野生型の対立遺伝子が含まれ
ていないと、ＬＣＲ反応生成物の出現は、もしあったと
しても、非修飾プローブを用いた標準ＬＣＲ反応に比べ
て有意に遅延する。これに対して、野生型の対立遺伝子
が存在していると、ＬＣＲ反応からの融合生成物の出現
が迅速に起こる。
【０１０５】 実施例６ 　　単一ギャップＬＣＲ伸長を８０サイクル行った。各
サイクルは、コイサーモサイクラー（Ｃｏｙ　　ｔｈｅ
ｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）［キー・サイエンティフィック（
Ｋｅｙ　　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）］を用い、８５℃で
３０秒間のインキュベーションおよび５０℃で２０秒間
のインキュベーションからなっていた。 サイクル数は、平滑末端ライゲーションバックグラウン
ドを最大にするように選択した。０かまたは１０６個の
目的ＤＮＡ分子を用いて反応を開始した。目的ＤＮＡは
、ＳｃｒＦ１消化しｐＧＥＭベクター中にクローニング
したＨＰＶ１６ゲノムＤＮＡであった。各反応液にはま
た、１０ｎｇのヒト胎盤バックグラウンドＤＮＡも含ま
れていた。２つの反応は標準平滑末端オリゴヌクレオチ
ドを用いて行い、別の２つの反応は単一のギャップを有
するオリゴヌクレオチドのセットを用いて行った。標準
平滑末端ＬＣＲ反応は、５０ｍＭ　　ＥＰＰＳ（ｐＨ７
．８）、１００ｍＭ　　ＫＣｌ、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ
２、１ｍＭ　　ＤＴＴ、１０ｍＭ　　ＮＨ４Ｃｌ、１０
０μＭ　　ＮＡＤ、１０μｇ／ｍｌＢＳＡ、各５×１０
１１分子のオリゴヌクレオチドＡおよびＢ’（表６ａ）
、各７．５×１０１１分子のオリゴヌクレオチドＢおよ
びＡ”（表６ａ）、および１×サームス・サーモフィル
スＤＮＡリガーゼを含有する緩衝液中で行った。オリゴ
ヌクレオチドＡ”の代わりにオリゴヌクレオチドＡ’を
用い、２５ｍＭ　　２’−デオキシアデノシン５’−三
リン酸および１．２５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
を加えた他は同じ緩衝液中でギャップＬＣＲ反応を行っ
た。これらオリゴヌクレオチドは、ＨＰＶ１６ゲノムの
遺伝子地図の５６９５〜５７４４位に特異的である。す
べての場合において反応液の容量は５０μｌであり、サ
イクルを行う前に２５μｌの鉱油を反応液に被せた。
【０１０６】 表６ａ オリコ゛ヌクレオチト゛ 　　　　Ａ　　ＦＬ−　ＡＡＧＴＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧ
ＧＡＴＧＡＡＴＡＴＧＴ Ａ’　　　　　　　ＣＡＴＡＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＣＴ
ＴＡＣＡＡＣＴ Ａ”　　　　　ＡＣＡＴＡＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＣＴＴ
ＡＣＡＡＣＴ Ｂ　　　　　　ＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＡ
ＴＴＡＴＣＡ−ＢＩＯ Ｂ’　ＢＩＯ−ＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴ
ＧＣＧＴＧＣＡ Ｃ　　ＦＬ−　ＡＴＴＴＡＴＡＣＡＴＴＡＡＡＧＧＣＴ
ＣＴＧＧＧＴＣ Ｃ’　　　　　ＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＴＴＡＡＴＧＴ
ＡＴＡＡＡ−ＦＬ Ｄ　　　　　　ＡＣＴＧＣＡＡＡＴＴＴＡＧＣＣＡＧＴ
ＴＣＡＡ−ＢＩＯ Ｄ’　ＢＩＯ−ＴＴＴＧＡＡＣＴＧＧＣＴＡＡＡＴＴＴ
ＧＣＡＧＴＡ
【０１０７】増幅後、反応液を滅菌ｄＨ２Ｏで１：１に
希釈し、アボットＩＭｘシステムの原型上で行ったサン
ドイッチイムノアッセイにより二重標識ＬＣＲ増幅生成
物を検出した。その結果は、以下の通りであった。
【０１０８】 実施例７ 　　コイサーモサイクラーを用い、二重ギャップＬＣＲ
伸長を３５サイクル行った。インキュベーション時間は
上記実施例６と同じであった。０、１０３または１０６
個の目的分子を用いて反応を開始した。目的ＤＮＡ分子
は、ＳｃｒＦ１消化しｐＧＥＭベクター中にクローニン
グしたＨＰＶ１６ゲノムＤＮＡであった。各反応液には
また、１０ｎｇのヒト胎盤バックグラウンドＤＮＡも含
まれていた。反応条件は、各反応液に各５×１０１１分
子のオリゴヌクレオチドＣおよびＤ’（上記表６ａ参照
）、各７．５×１０１１分子のオリゴヌクレオチドＤお
よびＣ’、および各２５ｍＭの２’−デオキシチミジン
５’−三リン酸および２’−デオキシグアノシン５’−
三リン酸を加えた他は、上記実施例６に記載した単一ギ
ャップ伸長の場合と同じであった。これらオリゴヌクレ
オチドは、ＨＰＶ１６ゲノムの遺伝子地図の６４５７〜
６５０５位に特異的である。
【０１０９】増幅後、反応液を滅菌ｄＨ２Ｏで１：１に
希釈し、アボットＩＭｘシステムの原型上で行ったサン
ドイッチイムノアッセイにより二重標識ＬＣＲ増幅生成
物を検出した。その結果は、以下の通りであった。
【０１１０】 実施例８ 　　１塩基よりも大きいギャップをＬＣＲ伸長に用いる
ことができる。たとえば、実施例６に記載したＨＰＶ１
６配列の増幅に使用するＬＣＲセット（Ａ、Ａ’、Ｂお
よびＢ’）において、表６ａのＨＰＶ１６特異的オリゴ
ヌクレオチドＡ’の代わりにオリゴヌクレオチドＴＡＴ
ＴＣＡＴＣＣＧＴＧＣＴＴＡＣＡＡＣＴ（オリゴＥと称
する）を用いることができた。適当な一本鎖ＨＰＶ１６
目的配列にハイブリダイズしたときに、オリゴヌクレオ
チドＢとオリゴヌクレオチドＥとは３ヌクレオチドギャ
ップを隔てて分離される。増幅条件は、３ヌクレオチド
ギャップを完全に埋めるためにｄＡＴＰに加えて２’−
デオキシシチジン５’−三リン酸を加える必要がある他
は上記と同じである。異なるサイズのギャップについて
も、単一ギャップ態様および二重ギャップ態様の両方に
おいて同様に行うことができる。
【０１１１】 実施例９ 　　嚢胞性線維症（ＣＦ）遺伝子の突然変異対立遺伝子
の約７０％は、エクソン１０中に単一の３ヌクレオチド
欠失を示す［リオーダン（Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．）
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４５：１０６６（１９８９）；ケ
レム（Ｋｅｒｅｍ，Ｂ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４５：
１０７３（１９８９）］。下記表９ａに示すオリゴヌク
レオチドを用い、ＣＦ遺伝子の正常（オリゴヌクレオチ
ドＡ、Ａ’、ＢおよびＢ’）対立遺伝子および突然変異
（オリゴヌクレオチドＣ、Ｃ’、ＢおよびＢ’）対立遺
伝子の両方の単一ギャップＬＣＲ増幅を行うことができ
た。
【０１１２】 表９ａ Ａ　　　　ＦＬ−ＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡ
ＴＣＡＴＣＴＴ Ａ’　　　　ＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡ
ＴＧＧＴＧＣ−ＦＬ Ｂ　　　　ＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡ
ＴＡＧＡ−ＢＩＯ Ｂ’　　ＢＩＯ−ＣＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡ
ＡＡＣＡＣＣＡ Ｃ　　　　ＦＬ−ＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡ
ＡＴＡＴＣＡＴ Ｃ’　　　　ＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＧＧ
ＴＧＣＣＡＧ−ＦＬ
【０１１３】ＬＣＲオリゴヌクレオチドＡ、Ａ’、Ｂお
よびＢ’を、ヒト胎盤ＤＮＡから嚢胞性線維症遺伝子の
野生型配列を増幅するのに用いた。目的／バックグラウ
ンドＤＮＡを用いずに、または１．５μｇのヒト胎盤Ｄ
ＮＡを用いて反応を開始した。各５×１０１１分子のオ
リゴヌクレオチドＡおよびＢ’、各７．５×１０１１分
子のオリゴヌクレオチドＡ’およびＢ、２５ｍＭの２’
−デオキシチミジン５’−三リン酸、および１．２５単
位のＴａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼを含有する、実施例
６に記載のものと同じ緩衝液中で３０サイクルの反応を
２回行った。 二重標識増幅生成物が下記のように検出された。
【０１１４】 実施例１０ 　　オリゴヌクレオチドＡ、Ａ’、ＢおよびＢ’（表６
ａ）は、１７〜３５ヌクレオチドの長さで変えることが
できた。最初の実験は、表１０ａに示す１９量体および
３０量体オリゴヌクレオチドセットに関するものである
。オリゴヌクレオチドのサイズの実際の上限および下限
は実験的に決定することができる。単一ギャップ伸長の
ための表６ａのプローブを用い、実施例６の手順を繰り
返した。二重ギャップオリゴヌクレオチドセットについ
ても同様の研究を行うことができる。
【０１１５】 表１０ａ １９量体セット： Ａ：　　ＦＬ−ＴＡＡＧＣＡＣＧＧＡＴＧＡＡＴＡＴＧ
ＴＡ’：　ＣＡＴＡＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＣＴＴＡＣＢ
：　　ＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＡＴ−ＢＩ
ＯＢ’：　ＢＩＯ−ＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＧＣＧＴ
ＧＣＡ３０量体セット： Ａ：　　ＦＬ−ＴＡＴＣＴＡＡＧＴＴＧＴＡＡＧＣＡＣ
ＧＧＡＴＧＡＡＴＡＴＧＴ Ａ’：　ＣＡＴＡＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＣＴＴＡＣＡＡ
ＣＴＴＡＧＡＴＡＣ Ｂ：　　ＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＡＴＴＡ
ＴＣＡＴＧＣＡＧＧ−ＢＩＯ Ｂ’：　ＢＩＯ−ＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＡＴ
ＧＴＴＴＧＴＧＣＧＴＧＣＡ
【０１１６】 実施例１１ 　　平滑末端ライゲーションバックグラウンドが非常に
減少しているので、単一および二重ギャップＬＣＲ伸長
によりサイクル数を増大させることができる。バックグ
ラウンドの減少とともにＬＣＲのサイクル数を増大させ
ることができることから、ＬＣＲ法の感度を顕著に高め
ることができることが期待される。感度向上の程度を決
定するため、オリゴヌクレオチドＡ、Ａ’、Ａ”、Ｂお
よびＢ’（表６ａ）を種々のサイクル数の平滑末端およ
び単一ギャップＬＣＲに用いることができた。反応条件
は、２０、２５、３０、３５、４０、４５および５０サ
イクル後に複製陽性または陰性反応を調べる他は実施例
６に記載したものと同じである。所望ならサイクル数を
さらに多くし、および／または実施例７に記載した二重
ギャップＬＣＲ伸長セットを用いて同様の実験を行うこ
ともできた。
【０１１７】 実施例１２ 　　合成ＨＰＶ１６オリゴヌクレオチド目的配列を用い
、単一ギャップＬＣＲ伸長が単一塩基ミスマッチを識別
する能力を調べた。増幅に用いるオリゴヌクレオチド（
Ａ、Ａ’、ＢおよびＢ’）は実施例６の表６ａに示して
ある。使用した合成目的配列は、下記表１２ａに示して
ある。目的配列Ａ（表１２ａ）は、ＨＰＶ１６ゲノムの
遺伝子地図の５６９５〜５７４４位に特異的な野生型Ｈ
ＰＶ配列を示す。目的配列Ｂは、塩基位置２５のチミジ
ン（ｄＡＴＰでギャップ埋めをする場合の鋳型として働
く）がアデニンに変わっている他は配列Ａと同じである
。それゆえ、オリゴヌクレオチドＢ’（表６ａ、実施例
６）は、この目的配列にハイブリダイズしたときに実施
例６に記載の条件下では伸長できない。目的配列Ｃは、
停止配列（目的塩基位置２４）においてＧがＴに唯一変
わっている他は配列Ａと同じである。この目的配列にハ
イブリダイズした場合は、オリゴヌクレオチドＢ’は３
塩基だけ伸長するであろう。それゆえ、伸長はギャップ
領域を越えて起こるであろう。
【０１１８】 表１２ａ（合成目的配列） Ａ　　　　ＡＡＧＴＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧＧＡＴＧＡＡ
ＴＡＴＧＴＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＡＴＴ
ＡＴＣＡ Ｂ　　　　ＡＡＧＴＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧＧＡＴＧＡＡ
ＴＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＡＴＴ
ＡＴＣＡ Ｃ　　　　ＡＡＧＴＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧＧＡＴＧＡＡ
ＴＡＴＴＴＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＡＴＴ
ＡＴＣＡ ヒト胎盤バックグラウンドＤＮＡ（目的配列不含のコン
トロール）および１０６分子の所定の合成目的配列を含
有する胎盤ＤＮＡを用い、反応を３回行った。反応条件
は、実施例６に記載したものと同じであった。単一ギャ
ップＬＣＲ伸長は、５０サイクル行った。増幅後、反応
生成物を滅菌ｄＨ２Ｏで１：１に希釈し、アボットＩＭ
ｘシステムの原型上でサンドイッチイムノアッセイを行
うことにより二重標識ＬＣＲ反応生成物を検出したとこ
ろ、下記の結果が得られた。
【０１１９】 実施例１３ 　　ギャップ埋め法の他の態様として、ｄＮＴＰｓおよ
びＤＮＡポリメラーゼを使用することなくギャップを埋
めるため別のプローブを用いることができる。使用した
プローブは下記表１３ａに示すものであり、ＨＰＶ１６
ゲノムの遺伝子地図上の位置５６７０〜５７４３に特異
的である。オリゴヌクレオチドの表示はテキストに従っ
た。 表１３ａ Ｄ　　　　ＦＬ−ＴＡＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＴＡＣＣ
ＴＧＴＡＴＣＴＡ Ｄ’　　　　　　ＡＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧＡＧ
ＧＣＡＧＧＴＡ−ＦＬ Ｆ　　　　　　　ＡＡＧＴＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧＧＡＴ
ＧＡＡＴＡＴＧ Ｆ’　　　　　　　ＡＴＡＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＣＴＴ
ＡＣＡＡＣＴＴＴ Ｅ　　　　　　　　　　ＴＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＡＡＣ
ＡＴＡＴＡＴＴＡＴＣＡ−ＢＩＯ Ｅ’　　　　ＢＩＯ−ＴＧＡＴＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴ
ＧＴＧＣＧＴＧＣＡＡＣ
【０１２０】ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼを用い
る必要がなかった他は実施例６に記載のインキュベーシ
ョン時間および反応条件を用い、ＬＣＲを種々のサイク
ル数で行うことができた。種々の長さ（たとえば、１７
〜３５ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドを用いるこ
ともできることに注意すべきである。オリゴヌクレオチ
ドはすべて、反応液中にそれぞれ５．０〜７．５×１０
１１にて含まれる。増幅後、上記実施例に記載のように
して反応生成物を希釈し検出した。
【０１２１】 実施例１４ 　　下記合成オリゴヌクレオチドを調製し、ｐＵＣ１８
を目的ＤＮＡとするＰＣＲ反応のプライマーとして使用
する。 　　プライマー　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ｐＵＣ１８に対する相補性（ｎｔ）＊Ａ　　５’−ＡＡ
ＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣ　　　　　　　　　
　４９８〜４８１Ｂ　　５’−ＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴ
ＧＴＡＴＧＣ　　　　　　　　　　２２３９〜２２５５
加えて、非塩基部位を含む修飾プライマーＡｍｏｄおよ
びＢｍｏｄを調製する。これらのプライマーは、それぞ
れプライマーＡおよびＢの代わりに用いる。修飾プライ
マーの配列およびｐＵＣ１８　　ＤＮＡに対する相補性
を下記に示す。 　　プライマー　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ｐＵＣ１８に対する相補性（ｎｔ）＊
Ａｍｏｄ　　５’−ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣ
ＣＣＪＧＧＧＡＴＣＣＸ　　　　　　　　　　４９８〜
４７３Ｂｍｏｄ　　５’−ＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴ
ＡＴＧＣＪＧＣＧＸ　　　　　　　　　　　　　２２３
９〜２２５９（注）＊ヌクレオチド（ｎｔ）の番号付け
は、ＤＮＡスター（ＤＮＡ　　Ｓｔａｒ　　Ｉｎｃ．）
（マジソン、ＷＩ）により刊行されたものによる。
【０１２２】実験用オリゴヌクレオチドは、本来の配列
（上記ＡまたはＢ）を修飾して単一の非塩基残基（Ｊ）
および目的ｐＵＣ１８に相補的な付加ヌクレオチドを含
有させたものである。非塩基残基を含有するオリゴヌク
レオチドの調製方法は、タケシタらの上記文献に記載さ
れている。修飾（突出）の３’末端は、バーガー（Ｂｅ
ｒｇｅｒ）らのガイド・トゥ・モレキュラー・クローニ
ング・テクニークス（Ｇｕｉｄｅ　　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
）、ｐ１０４（１９８７）に記載されているように末端
トランスフェラーゼなどによりジデオキシアデノシン（
Ｘ）残基を含有させることにより不活化する。
【０１２３】ＰＣＲはムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らの方法
（たとえば、米国特許第４，６８３，１９５号および同
第４，６８３，２０２号各明細書参照）に従い、ヌクレ
オチド混合物中に３２Ｐ−ｄＣＴＰを存在させて行う。 下記に示すように、各サイクルのハイブリダイゼーショ
ン工程の後にエンドヌクレアーゼＩＶ（ＥｎｄｏＩＶ）
を反応混合物に加える。
【０１２４】ＰＣＲ後、増幅生成物をトリクロロ酢酸（
ＴＣＡ）で沈殿させ、洗浄し、シグナルを測定する。各
反応系に関して予期される相対的なシグナル強度を下記
表に示す。 プライマー混合物　　　　　　　　　　　　目的ＤＮＡ
を含む　　目的ＤＮＡを含まない　　Ａ＋Ｂ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋＋　　　
　　　　　　　　　　　＋＋　　Ａｍｏｄ＋Ｂｍｏｄ＋
ＥｎｄｏＩＶ　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　　
　　　　　−　　Ａｍｏｄ＋Ｂｍｏｄ−ＥｎｄｏＩＶ　
　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　
−　　Ａ＋Ｂ、ポリメラーゼなし　　　　　　　　−　
　　　　　　　　　　　　　　　−
【０１２５】
【図面の簡単な説明】
【図１】　　従来のリガーゼ連鎖反応を示す模式図。
【図２】　　ブロッキング残基（Ｒ）を用いた場合（図
２Ａ）およびリボヌクレオチド伸長（ｒＢｒＢｒＢ）を
用いた場合（図２Ｂ）の、本発明の突出態様による改良
核酸増幅法を示す模式図。
【図３】　　本発明の単一ギャップ態様による改良核酸
増幅法を示す模式図。
【図４】　　本発明の二重ギャップ態様による改良核酸
増幅法を示す模式図。
【図５】　　ギャップ埋めプローブをさらに用いた本発
明の改良核酸増幅法を示す模式図。

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　目的核酸配列を酵素的に増幅させて増
    幅生成物を得る方法であって、酵素が、核酸イニシエー
    ター、核酸イニシエーターが結合する鋳型としての目的
    配列または増幅生成物、酵素的に組み立てて目的配列に
    相補的な増幅生成物を生成し得る、さらに少なくとも１
    種のヌクレオシド含有反応物を利用するものであり、該
    増幅生成物自体がさらに鋳型として働く方法において、
    （ａ）目的配列とハイブリダイズし得る必要なイニシエ
    ーターであって、該イニシエーターがハイブリダイズし
    たときに該酵素が該酵素の基質としての該イニシエータ
    ーに実質的に作用し得ず増幅生成物が組み立てられない
    ように、少なくとも１種の該イニシエーターを修飾した
    ものを用意し、 （ｂ）該イニシエーターを該目的配列とハイブリダイズ
    させてイニシエーター−鋳型複合体を生成させ、（ｃ）
    鋳型に依存した仕方で該修飾を補正して該酵素が該イニ
    シエーター−鋳型複合体に作用し得るようにし、（ｄ）
    増幅生成物を酵素的に組み立て、ついで（ｅ）該目的配
    列から増幅生成物を解離させ、ハイブリダイゼーション
    、補正および組み立て工程を繰り返して所望の目的配列
    を増幅させることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】　　少なくとも１種のイニシエーターの修
    飾（工程（ａ））が、工程（ｄ）で必要な化学基をブロ
    ックするように該イニシエーターに結合したブロッキン
    グ残基からなる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】　　ブロッキング残基が （式中、Ｚは、−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＯ（式中、ｎ
    は１〜約３である）、−デオキシリボース、および−ジ
    デオキシリボースよりなる群から選ばれたものである）
    である請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】　　ブロッキング残基が核酸の突出であり
    、該突出は、工程（ｄ）の酵素的組み立てが伸長による
    場合には伸長不能な３’末端を含むものである、請求項
    ２に記載の方法。
  5. 【請求項５】　　突出が、 （ａ）該イニシエーターがデオキシリボヌクレオチドか
    らなる場合にリボヌクレオチド、 （ｂ）少なくとも一つの非塩基残基を含むオリゴヌクレ
    オチド、および （ｃ）該修飾イニシエーターが目的鎖とハイブリダイズ
    したときに塩基対のミスマッチが生じるように選択した
    残基を有するオリゴヌクレオチドよりなる群から選ばれ
    たものである、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】　　修飾の補正を、 （ａ）ＲＮＡｓｅＨ酵素、 （ｂ）実質的に核酸鎖が相補鎖とハイブリダイズした場
    合にのみ非塩基部位で該核酸鎖を開裂するエンドヌクレ
    アーゼ、 （ｃ）エンドヌクレアーゼＩＶ、および（ｄ）ミスマッ
    チ修復酵素よりなる群から選ばれた薬剤を用いて行う、
    請求項２または４に記載の方法。
  7. 【請求項７】　　酵素がポリメラーゼであり、イニシエ
    ーターがプライマーからなり、ヌクレオシド含有反応物
    が個々のヌクレオシド三リン酸からなり、増幅生成物が
    該プライマーとヌクレオシド三リン酸とから生成した伸
    長生成物からなる、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】　　酵素がリガーゼであり、イニシエータ
    ーが第一のオリゴヌクレオチドプローブであり、ヌクレ
    オシド含有反応物が第二のオリゴヌクレオチドプローブ
    であり、増幅生成物が該第一のオリゴヌクレオチドプロ
    ーブと該第二のオリゴヌクレオチドプローブとが融合し
    たものである、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】　　工程（ａ）の修飾イニシエーターが、
    目的配列の第一の切片とハイブリダイズし得る第一プロ
    ーブ、目的配列の第二の切片とハイブリダイズし得る第
    二プローブ、該第一プローブとハイブリダイズし得る第
    三プローブ、および該第二プローブとハイブリダイズし
    得る第四プローブを含み、修飾として、（ｉ）該目的配
    列の該第一の切片の５’末端は該第二の切片の３’末端
    からＸｎ塩基離れた位置にあり、各Ｘは４種の塩基のう
    ちの１〜任意の３塩基からなるセットＮから独立に選ば
    れたものであり、ｎは１以上の整数であり； （ｉｉ）該第三プローブの５’末端に相補的な該第一プ
    ローブ上の塩基が該第一プローブの３’末端からＹｍ塩
    基離れた位置にあり、各Ｙは４種の塩基のうちの０〜任
    意の３塩基からなるセットＭから独立に選ばれたもので
    あり、ｍは０または１以上の整数であるように、該第三
    プローブは該第一プローブにハイブリダイズし（ただし
    、該ＸｎおよびＹｍ配列において少なくとも１種の塩基
    が使用されないで残ってＮでもＭでもないセットを生成
    し、Ｘｎ塩基の配列はＹｍ塩基の配列と相補的ではない
    ）；（ｉｉｉ）Ｘｎの５’末端に隣接する塩基およびＹ
    ｍの５’末端に隣接する塩基が、ＮでもなくＭでもない
    セットＱから選ばれたものであり；工程（ｃ）を、過剰
    のデオキシＸ’三リン酸およびデオキシＹ’三リン酸（
    Ｘ’およびＹ’はそれぞれＸおよびＹの相補体である）
    を用い、該第一プローブを伸長して該Ｘｎギャップを埋
    め、任意に該第四プローブを伸長して該Ｙｍギャップを
    埋めることにより行う、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】　　ｎが１〜約３である請求項９に記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】　　ｍが０である請求項９に記載の方法
    。
  12. 【請求項１２】　　工程（ｃ）で加えるデオキシＸ’三
    リン酸が、標識、フックおよびハプテンよりなる群から
    選ばれたマーカーを含有するように修飾した塩基を含む
    、請求項９に記載の方法。
  13. 【請求項１３】　　工程（ａ）のイニシエーターが、（
    ｉ）目的配列の第一の切片とハイブリダイズし得る第一
    プローブＤ、および該第一プローブＤとハイブリダイズ
    し得る第二プローブＤ’であって、該第二プローブＤ’
    の３’末端は該第一プローブＤの５’末端から少なくと
    も１塩基だけ突出するもの； （ｉｉ）目的配列の第二の切片とハイブリダイズし得る
    第三プローブＥ、および該第三プローブＥとハイブリダ
    イズし得る第四プローブＥ’であって、該第四プローブ
    Ｅ’の５’末端は該第三プローブＥの３’末端から少な
    くとも１塩基だけ突出するもの；および （ｉｉｉ）目的配列の第三の切片とハイブリダイズし得
    る第五プローブＦ、および該第五プローブＦとハイブリ
    ダイズし得る第六プローブＦ’を含む、目的配列および
    任意に目的配列の相補鎖とハイブリダイズする３対の相
    補的プローブを含み、目的配列の第一の切片、第三の切
    片および第二の切片は連続的に位置しており、第五プロ
    ーブが目的配列とハイブリダイズしたときに、第五プロ
    ーブの３’末端は第一プローブの５’末端と隣接し第五
    プローブの５’末端は第三プローブの３’末端と隣接す
    るようになり、修飾として、第五プローブＦの３’末端
    は、第二プローブＤ’が第一プローブＤから突出した配
    列と同じ長さで該配列に相補的な塩基配列だけ、第六プ
    ローブＦ’から突出し、第五プローブの５’末端は、第
    四プローブＥ’が第三プローブＥから突出した配列と同
    じ長さで該配列に相補的な塩基配列だけ、第六プローブ
    Ｆ’から突出し、工程（ｃ）を、目的配列に依存した仕
    方で第五プローブＦを第一プローブＤと第三プローブＥ
    との両方にライゲートして単一の融合ポリヌクレオチド
    を生成させ、任意に、目的配列に依存した仕方で第六プ
    ローブＦ’を第二プローブＤ’と第四プローブＥ’との
    両方にライゲートして目的配列の相補鎖に相補的な第二
    の融合ポリヌクレオチドを生成させることにより行う、
    請求項８に記載の方法。
  14. 【請求項１４】　　第二プローブＤ’および第四プロー
    ブＥ’の突出が、それぞれ、独立に１〜約３塩基を含む
    、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】　　第二プローブおよび第三プローブの
    ５’末端に結合したハプテンマーカーにより増幅目的配
    列の存在を検出する工程をさらに含む、請求項９または
    １３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】　　（ａ）ＬＣＲにおいてライゲートし
    得るように目的配列とハイブリダイズし得る２対のプロ
    ーブか、またはＰＣＲを開始し得るように目的配列とハ
    イブリダイズし得る１対のプライマーのいずれかから選
    ばれたイニシエーターであって、該プローブまたはプラ
    イマーの少なくとも１種は、イニシエーターがハイブリ
    ダイズしたときにリガーゼまたはポリメラーゼが該イニ
    シエーターに対して基質として実質的に作用し得ないよ
    うに修飾してあるもの； （ｂ）増幅生成物を組み立てるためのリガーゼかまたは
    ポリメラーゼのいずれかから選ばれた組み立て試薬；お
    よび （ｃ）目的配列に依存した仕方で該修飾プローブ／プラ
    イマーを補正して、該プローブ／プライマー−鋳型複合
    体に対して該リガーゼまたはポリメラーゼが作用し得る
    ようにする補正試薬からなる診断キット。
  17. 【請求項１７】　　補正試薬が、 （ａ）ＲＮＡｓｅＨ酵素、 （ｂ）実質的に核酸鎖が相補鎖とハイブリダイズした場
    合にのみ非塩基部位で該核酸鎖を開裂するエンドヌクレ
    アーゼ、 （ｃ）エンドヌクレアーゼＩＶ、および（ｄ）ミスマッ
    チ修復酵素 よりなる群から選ばれた薬剤からなる、請求項１６に記
    載のキット。
  18. 【請求項１８】　　イニシエーターが２対のプローブか
    らなり、組み立て試薬がリガーゼからなり、補正試薬が
    ポリメラーゼからなる、請求項１６に記載のキット。
  19. 【請求項１９】　　第一の目的核酸配列を、少なくとも
    １塩基の同定により該目的配列とは異なる第二の目的で
    ない配列から識別する方法であって、 （ａ）該目的配列の第一の切片に相補的な第一プローブ
    、該目的配列の第二の切片に相補的な第二プローブ、該
    第一プローブに相補的な第三プローブ、および該第二プ
    ローブに相補的な第四プローブの４種の各プローブを過
    剰に用意し、その際、 （ｉ）該目的配列の該第一の切片の５’末端は該第二の
    切片の３’末端からＸｎ塩基離れた位置にあり、各Ｘは
    ４種の塩基のうちの１〜任意の３塩基からなるセットＮ
    から独立に選ばれたものであり、ｎは１以上の整数であ
    り；（ｉｉ）該第三プローブの５’末端に相補的な該第
    一プローブ上の塩基が該第一プローブの３’末端からＹ
    ｍ塩基離れた位置にあり、各Ｙは４種の塩基のうちの０
    〜任意の３塩基からなるセットＭから独立に選ばれたも
    のであり、ｍは０または１以上の整数であるように、該
    第三プローブは該第一プローブにハイブリダイズし（た
    だし、該ＸｎおよびＹｍ配列において少なくとも１種の
    塩基が使用されないで残り、Ｘｎ塩基の配列はＹｍ塩基
    の配列と相補的ではない）； （ｉｉｉ）Ｘｎの５’末端に隣接する塩基およびＹｍの
    ５’末端に隣接する塩基が、ＮでもなくＭでもないセッ
    トＱから選ばれたものであり； （ｉｖ）該目的でない配列は、Ｘｎ領域またはＹｍ領域
    中の少なくとも１つの塩基、Ｚの同定により異なり、（
    ｂ）該４種のプローブを、一本鎖の目的配列または二本
    鎖の目的配列またはその相補鎖から分離した二本鎖の目
    的配列とハイブリダイズ条件下で混合し、（ｃ）目的配
    列にハイブリダイズしている間に、目的でない配列ギャ
    ップ中の単一の異なる塩基に相補的なデオキシＺ’三リ
    ン酸は省いて、過剰のデオキシＸ’三リン酸およびデオ
    キシＹ’三リン酸（Ｘ’およびＹ’はそれぞれ目的配列
    上のＸおよびＹの相補体である）を用い、該第一プロー
    ブを伸長してＸｎギャップを埋め、任意に該第四プロー
    ブを伸長してＹｍギャップを埋め、（ｄ）目的配列にハ
    イブリダイズしている間に、該伸長した第一プローブを
    該第二プローブにライゲートし、任意に、該伸長した第
    四プローブを該第三プローブにライゲートして、該目的
    配列にハイブリダイズしたライゲートプローブの少なく
    とも一つの二本鎖複合体を生成させ、ついで （ｅ）適当に伸長しライゲートしたプローブを、不適当
    に伸長しライゲートしなかったプローブから分離し検出
    することを特徴とする方法。
  20. 【請求項２０】　　第一の目的核酸配列を、少なくとも
    １塩基の同定により該目的配列とは異なる第二の目的で
    ない配列から識別する方法であって、 （ａ）該目的配列の第一の切片に相補的な第一プローブ
    、該目的配列の第二の切片に相補的な第二プローブ、該
    第一プローブに相補的な第三プローブ、および該第二プ
    ローブに相補的な第四プローブの４種の各プローブを過
    剰に用意し、その際、 （ｉ）該目的配列の該第一の切片の５’末端は該第二の
    切片の３’末端からＸｎ塩基離れた位置にあり、各Ｘは
    ４種の塩基のうちの１〜任意の３塩基からなるセットＮ
    から独立に選ばれたものであり、ｎは１以上の整数であ
    り；（ｉｉ）該第三プローブの５’末端に相補的な該第
    一プローブ上の塩基が該第一プローブの３’末端からＹ
    ｍ塩基離れた位置にあり、各Ｙは４種の塩基のうちの０
    〜任意の３塩基からなるセットＭから独立に選ばれたも
    のであり、ｍは０または１以上の整数であるように、該
    第三プローブは該第一プローブにハイブリダイズし（た
    だし、該ＸｎおよびＹｍ配列において少なくとも１種の
    塩基が使用されないで残り、Ｘｎ塩基の配列はＹｍ塩基
    の配列と相補的ではない）； （ｉｉｉ）Ｘｎの５’末端に隣接する塩基およびＹｍの
    ５’末端に隣接する塩基が、ＮでもなくＭでもないセッ
    トＱから選ばれたものであり； （ｉｖ）該目的でない配列は、Ｑ領域中の少なくとも１
    つの塩基、Ｚの同定により異なり、ＺはセットＮ、セッ
    トＭまたはセットＮとセットＭとの両方に含まれる塩基
    であり、 （ｂ）該４種のプローブを、一本鎖の目的配列または二
    本鎖の目的配列またはその相補鎖から分離した二本鎖の
    目的配列とハイブリダイズ条件下で混合し、（ｃ）目的
    配列にハイブリダイズしている間に、過剰のデオキシＸ
    ’三リン酸およびデオキシＹ’三リン酸（Ｘ’およびＹ
    ’はそれぞれＸおよびＹの相補体である）を用い、該第
    一プローブを伸長してＸｎギャップを埋め、任意に該第
    四プローブを伸長してＹｍギャップを埋めることにより
    、Ｚが該第一プローブの伸長および任意に該第四プロー
    ブの伸長を停止できないようにし、 （ｄ）目的配列にハイブリダイズしている間に、該適当
    に伸長した第一プローブを該第二プローブにライゲート
    し、任意に、該適当に伸長した第四プローブを該第三プ
    ローブにライゲートして、該目的配列にハイブリダイズ
    したライゲートプローブの少なくとも一つの二本鎖複合
    体を生成させ、ついで （ｅ）適当に伸長しライゲートしたプローブを、不適当
    に伸長しライゲートしなかったプローブから分離し検出
    することを特徴とする方法。
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