ES2606688T3 - Ácidos nucleicos de control para parámetros múltiples - Google Patents

Abstract

Un proceso para aislar y amplificar simultáneamente al menos un primer y un segundo ácido nucleico diana que pueden estar presentes en una o más muestras líquidas, comprendiendo dicho proceso las etapas automatizadas de: a. añadir un ácido nucleico de control interno mezclado, seleccionado del grupo de SEQ ID NO: 45 a 49, a cada una de dichas muestras líquidas, en el que la secuencia de dicho ácido nucleico de control interno es idéntica para dicho al menos primer y segundo ácido nucleico diana b. combinar a la vez un material de soporte sólido y dicha una o más muestras líquidas en uno o más recipientes durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para permitir a los ácidos nucleicos que comprenden los ácidos nucleicos diana y el ácido nucleico de control interno, inmovilizarse en el material de soporte sólido c. aislar el material de soporte sólido del otro material presente en las muestras líquidas en una estación de separación d. purificar los ácidos nucleicos en dicha estación de separación y lavar el material de soporte sólido una o más veces con un tampón de lavado e. poner en contacto los ácidos nucleicos diana purificados y el ácido nucleico de control interno purificado con reactivos de amplificación que comprenden una polimerasa con actividad transcriptasa inversa y al menos un conjunto de cebadores distinto para cada uno de dichos ácidos nucleico diana y para dicho ácido nucleico de control interno en al menos dos recipientes de reacción, en el que al menos un primer recipiente de reacción comprende cebadores para al menos dicho primer ácido nucleico diana y al menos un segundo recipiente de reacción comprende cebadores para al menos dicho segundo ácido nucleico diana y en el que los cebadores para el segundo ácido nucleico diana no están en el primer recipiente de reacción e2. incubar en dichos recipientes de reacción dichos ácidos nucleicos purificados con dichos reactivos de amplificación durante un periodo de tiempo y en condiciones adecuadas para que se produzca la transcripción del ARN por dicha polimerasa con actividad transcriptasa inversa, en el que el periodo de tiempo es de hasta 10 minutos f. incubar en dichos recipientes de reacción dichos ácidos nucleicos diana purificados y dicho ácido nucleico de control interno purificado con dichos reactivos de amplificación durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para que se produzca una reacción de amplificación indicadora de la presencia o de la ausencia de dichos ácidos nucleicos diana g. detectar y medir las señales generadas por los productos de amplificación de dichos ácidos nucleico diana y que son proporcionales a la concentración de dichos ácidos nucleico diana, y detectar y medir una señal generada por dicho ácido nucleico de control interno, en el que las condiciones para la amplificación y la detección en las etapas e. a g. son idénticas para dichos al menos primer y segundo ácidos nucleicos diana purificados y dicho ácido nucleico de control interno, y en el que el primer y/o el segundo ácido nucleico diana es un ácido nucleico bacteriano, y en el que los al menos dos ácidos nucleicos diana comprenden ARN y ADN.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

15

25

35

45

55

65

estar presentes. En el comercio también se dispone del vidrio poroso magnético que contiene partículas magnéticas en una matriz de vidrio porosa, particular y que se cubre con una capa que contiene estreptavidina. Este producto puede usarse para aislar materiales biológicos, por ejemplo proteínas o ácidos nucleicos, si se modifican en una etapa de preparación compleja de manera que se unan de manera covalente con biotina. Los adsorbentes particulares magnetizables han demostrado ser muy eficaces y adecuados para la preparación automatizada de muestras. Los pigmentos ferrimagnéticos y ferromagnéticos así como superparamagnéticos se usan para esta finalidad. En el documento WO 01/37291 se describen las partículas de vidrio magnéticas más preferidas y los métodos que las usan. Particularmente útil para el aislamiento de ácidos nucleicos en el contexto de la invención es el método de acuerdo con R. Boom et al. (J. Clin Microbiol., 28 (1990), 495-503).

La expresión “material de soporte sólido” comprende cualquiera de los materiales sólidos mencionados anteriormente en relación con la inmovilización de ácidos nucleicos, por ejemplo, partículas de vidrio magnéticas, fibras de vidrio, filtros de fibra de vidrio, papel de filtro etc., aunque el material de soporte sólido no está limitado a estos materiales.

Por tanto, un aspecto preferido de la invención es el proceso descrito anteriormente, en el que el material de soporte sólido comprende uno o más de los materiales seleccionados de sílice, metal, óxidos metálicos, plástico, polímeros y ácidos nucleicos. En una realización muy preferida de la invención, el material de soporte sólido son partículas de vidrio magnéticas.

“Inmovilizar”, en el contexto de la invención, significa capturar objetos tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos de una manera reversible o irreversible. Particularmente, “inmovilizado en el material de soporte sólido”, significa que el objeto o los objetos se asocian con el material de soporte sólido para separarlos de cualquier medio circundante y que pueden recuperarse, por ejemplo, separando el material de soporte sólido en un punto más adelante. En este contexto, “inmovilización” puede comprender, por ejemplo, la adsorción de ácidos nucleicos a superficies de vidrio o a otras superficies adecuadas de materiales sólidos como se ha descrito anteriormente. Además, los ácidos nucleicos pueden “inmovilizarse” específicamente uniéndose a sondas de captura, donde los ácidos nucleicos se unen a esencialmente ácidos nucleicos complementarios fijados a un soporte sólido por emparejamiento de bases. En el último caso, dicha inmovilización específica conduce a la unión predominante de ácidos nucleico diana.

Después de la purificación o del aislamiento de los ácidos nucleicos, incluyendo los ácidos nucleicos diana, de su ambiente natural, puede realizarse un análisis, por ejemplo, mediante la amplificación simultánea descrita anteriormente.

“Simultáneamente”, en el sentido de la invención, significa que dos acciones, tal como la amplificación de un primer y un segundo ácido nucleico o más, se realizan al mismo tiempo y en las mismas condiciones físicas. En una realización, la amplificación simultánea de al menos un primer y un segundo ácido nucleico diana se realiza en un recipiente. En otra realización, la amplificación simultánea se realiza con al menos un ácido nucleico en un recipiente y al menos un segundo ácido nucleico en un segundo recipiente, al mismo tiempo y en las mismas condiciones físicas, particularmente con respecto a la temperatura y al tiempo de incubación en el que el ácido nucleico de control interno mencionado anteriormente está presente cada uno en dichos recipientes.

El “primer ácido nucleico diana” y el “segundo ácido nucleico diana” son ácidos nucleicos diferentes. Una “muestra líquida” es cualquier material líquido que pueda someterse a un ensayo de diagnóstico dirigido a ácidos nucleicos y procede preferentemente de una muestra biológica. También preferentemente, dicha muestra líquida procede de un ser humano y de un fluido corporal. En una realización preferida de la invención, la muestra líquida es sangre humana, orina, esputo, sudor, un frotis, heces tratadas con pipeta o líquido cefalorraquídeo. Más preferentemente, la muestra líquida es sangre humana.

La expresión “recipiente de reacción” comprende, pero sin limitación, tubos o pocillos de placas tales como micropocillos, pocillos profundos u otros tipos de placas multipocillo, en los que tiene lugar una reacción para el análisis de la muestra líquida, tal como, por ejemplo, transcripción inversa o reacción en cadena de la polimerasa. Los límites externos o las paredes de dichos recipientes son químicamente inertes de tal manera que no interfieren con la reacción analítica que se produce en su interior. Preferentemente, el aislamiento de los ácidos nucleicos, como se describe anteriormente, también se realiza en una placa multipocillo.

En este contexto, las placas multipocillo en sistemas analíticos permiten la separación en paralelo y analizar o conservar muestras múltiples. Las placas multipocillo pueden optimizarse para una captación máxima de líquido o para una transferencia máxima de calor. Una placa multipocillo preferida para su uso en el contexto de la presente invención se optimiza para incubar o separar un analito en un analizador automático. Preferentemente, la placa multipocillo se construye y dispone para establecer contacto con un dispositivo magnético y/o con un dispositivo calefactor. Dicha placa multipocillo preferida, que en el contexto de la divulgación, se denomina indistintamente “placa de procesamiento” comprende:

-una superficie de cubierta que comprende recipientes múltiples con aberturas en la parte superior dispuesta en filas. Los recipientes comprenden una parte superior, una parte central y una parte inferior. La parte superior está

imagen7

5

15

25

35

45

55

65

tiene un volumen grande, preferentemente de 4 ml. Otra ventaja es que debido al grosor de la pared esencialmente constante, la producción es muy económica. Una ventaja adicional es que los recipientes (103) se afianzan entre sí y, por tanto, puede obtenerse una alta estabilidad de la forma.

Entre las filas de los recipientes (103), se localiza un espacio (121) continuo (Fig. 6, Fig. 7). El espacio (121) puede alojar imanes (202, 203) o dispositivos calefactores (128) (Fig. 11). Estos imanes (202, 203) y dispositivos calefactores (128) son preferentemente dispositivos sólidos. Por tanto, las partículas magnéticas (216) incluidas en los líquidos (215) que pueden estar contenidas en los recipientes (103) pueden separarse del líquido (215) ejerciendo un campo magnético en los recipientes (103) cuando los imanes (202, 203) se ponen muy cerca los recipientes (103). O bien, el contenido de los recipientes (103) puede incubarse a una temperatura elevada, controlada cuando la placa (101) de procesamiento se coloca en el dispositivo calefactor (128). Dado que los imanes (202, 203) o los dispositivos calefactores (128) pueden ser sólidos, puede obtenerse una alta densidad de energía. La forma casi rectangular de la parte central (120) de los recipientes (103) (Fig. 10) también optimiza el contacto entre la pared del recipiente (109) y un imán (202) o dispositivo calefactor (128) con forma plana optimizando la superficie de contacto entre el recipiente (103) y el imán (202) o dispositivo calefactor (128) y por tanto potenciando la transferencia de energía en el recipiente (103).

En la zona de la parte inferior cónica (111) de los recipientes, el espacio (121) es aún más pronunciado y puede alojar imanes (203) adicionales. La combinación de imanes (202) grandes en la zona superior y de imanes más pequeños (203) en la zona cónica de los recipientes permite la separación de partículas magnéticas (216) en volúmenes más grandes o más pequeños de líquido (215). Los imanes pequeños (203), por tanto, facilitan que se secuestren las partículas magnéticas (216) durante la transferencia del eluato con la pipeta. Esto posibilita transferir con pipeta el eluato con una pérdida mínima reduciendo el volumen muerto del sedimento de las partículas magnéticas (216). Adicionalmente, la presencia de partículas magnéticas (216) en el eluato transferido se minimiza.

En el extremo superior de los recipientes (103), una de las paredes laterales más cortas (109) del recipiente (103) comprende un canal de entrada de reactivo (105) que se extiende a la costilla (104) circunferencial (Figs. 3, 4, 7). Los reactivos se transfieren con pipeta sobre el canal de entrada de reactivo (105) y drenan el canal (105) en el recipiente (103). De este modo se impide el contacto entre la aguja o la punta (3, 4) de la pipeta y el líquido contenido en el recipiente. Adicionalmente, se impiden las salpicaduras resultantes del líquido que se dispensa directamente en otro líquido (215) contenido en los recipientes (103), lo que puede causar contaminación de la aguja

o punta (3, 4) de la pipeta, o de vasos adyacentes (103). La transferencia secuencial con pipeta sobre el canal de entrada de reactivo (105) de pequeños volúmenes de reactivos seguido de un mayor volumen de otro reactivo garantiza que los reactivos que solo se añaden en pequeñas cantidades se drenen completamente en el recipiente (103). Por tanto, es posible efectuar una transferencia con pipeta de pequeños volúmenes de reactivos sin pérdida de precisión del ensayo a realizar.

En el interior, en la parte inferior de los recipientes (111, 112), la forma se hace cónica (111) y acaba con una parte inferior esférica (112) (Fig. 6, Fig. 7). La forma interior del recipiente (114), que incluye la parte central rectangular (120), es redondeada. La combinación de la parte inferior esférica (112), la forma interior redondeada (114), la parte cónica (111) y superficie acrisolada de los recipientes (103) conduce a una fluídica favorable que facilita una separación y purificación eficaces de analitos en la placa (101) de procesamiento. La parte inferior esférica (112) permite un uso esencialmente completo del eluato separado y una reducción del volumen muerto que reduce el traspaso de reactivos o la contaminación cruzada de las muestras.

El borde en la base (129) de la placa (101) de procesamiento comprende recesos (107) que se acoplan con clips de cierre (124) en la estación de procesamiento (201) o dispositivo calefactor (128) o instrumento analítico (126) (Fig. 5, Fig. 9). El acoplamiento de los clips de cierre (124) con los recesos (107) permite colocar y fijar la placa (101) de procesamiento en la estación de procesamiento (201). La presencia de los recesos (107) permite que la fuerza de cierre actúe sobre la placa (101) de procesamiento casi verticalmente a la base (129). Por tanto, solo pueden producirse pequeñas fuerzas que actúan lateralmente. Esto reduce la aparición de tensión, y, por tanto, la deformación de la placa (101) de procesamiento. Las fuerzas de cierre verticales también pueden neutralizar cualquier deformación de la placa (101) de procesamiento lo que conduce a una colocación más precisa de las partes inferiores esféricas (111) dentro de la estación de procesamiento (201). En general, la interfaz exacta entre la placa (101) de procesamiento y la estación de procesamiento (201) o dispositivo calefactor (128) dentro de un analizador reduce los volúmenes muertos y también reduce el riesgo de contaminación cruzada de las muestras.

Una “estación de separación” es un dispositivo o un componente de un sistema analítico que permite el aislamiento del material de soporte sólido desde el otro material presente en la muestra líquida. Dicha estación de separación puede comprender, por ejemplo, pero sin limitación, una centrífuga, una rejilla con tubos de filtro, un imán, u otros componentes adecuados. En una realización preferida de la invención, la estación de separación comprende uno o más imanes. Preferentemente, como soporte sólido, se usan uno o más imanes para la separación de partículas magnéticas, preferentemente partículas de vidrio magnéticas. Si, por ejemplo, la muestra líquida y el material de soporte sólido se combinan conjuntamente en los pocillos de una placa multipocillo, entonces uno o más imanes incluidos en la estación de separación pueden, por ejemplo, ponerse en contacto con la propia muestra líquida introduciendo los imanes en los pocillos, o dicho uno o más imanes pueden acercarse a las paredes más externas

5

15

25

35

45

55

65

de los pocillos para atraer a las partículas magnéticas y posteriormente separarlas del líquido circundante. En una realización preferida, la estación de separación es un dispositivo que comprende una placa multipocillo que comprende recipientes con una abertura en la superficie de cubierta de la placa multipocillo y una parte inferior cerrada. Los pocillos comprenden una parte superior, una parte central y una parte inferior, en la que la parte superior está unida a la superficie e cubierta de la placa multipocillo y preferentemente comprende dos lados más largos y dos más cortos. La parte central tiene una sección transversal sustancialmente rectangular con dos lados largos en la que dichos recipientes se alinean en filas. Un espacio continuo se localiza entre dos filas adyacentes para establecer contacto selectivamente de al menos un imán instalado en una fijación con las paredes laterales en al menos dos posiciones en Z. Adicionalmente el dispositivo comprende una estación de separación magnética que comprende al menos una fijación. La fijación comprende al menos un imán que genera un campo magnético. Existe un mecanismo de movimiento que mueve verticalmente dicha al menos una fijación que comprende al menos un imán al menos entre la primera y segunda posición con respecto a los recipientes de la placa multipocillo. Preferentemente, dichas al menos dos posiciones en Z de los recipientes comprenden las paredes laterales y la parte inferior de dichos recipientes. El campo magnético de dicho al menos un imán atrae preferentemente a las partículas magnéticas a una superficie interna del recipiente adyacente a dicho al menos un imán cuando dicho al menos un imán está en dicha primera posición. El efecto de dicho campo magnético es menor cuando dicho al menos un imán está en dicha segunda posición en comparación con cuando dicho al menos un imán está en dicha primera posición. Preferentemente, la fijación que comprende dicho al menos un imán comprende un bastidor. Los recipientes tienen características preferidas como se describe anteriormente en el contexto de una placa multipocillo/placa de procesamiento. Una característica preferida de este tipo es que al menos una parte de dichos recipientes tiene una sección transversal sustancialmente rectangular ortogonal al eje de dichos recipientes.

En dicha primera posición, dicho al menos un imán está adyacente a dicha parte de dichos recipientes. Adyacente se entiende que significa bien en estrecha proximidad, de tal manera que se ejerce un campo magnético en el contenido del recipiente, o bien en contacto físico con el recipiente.

La estación de separación comprende un bastidor para recibir la placa multipocillo, y clips de cierre para unir la placa multipocillo. Preferentemente, la estación de separación comprende dos tipos de imanes. Esta realización preferida se describe adicionalmente más adelante.

A continuación se describe una segunda realización preferida, que comprende un resorte que ejerce una presión en el bastidor que comprende los imanes de tal manera que los imanes se presionan contra los recipientes de la placa multipocillo.

Los primeros imanes están preferentemente construidos y dispuestos para interaccionar con recipientes de una placa multipocillo para ejercer un campo magnético en un gran volumen de líquido que comprende partículas magnéticas contenidas en dichos recipientes. Dichos segundos imanes preferentemente se construyen y disponen para interaccionar con recipientes de una placa multipocillo para ejercer un campo magnético en un pequeño volumen de líquido que comprende partículas magnéticas contenidas en dichos recipientes. Dichos primer y segundo imanes pueden moverse a diferentes posiciones en Z.

Es útil en el contexto de la presente divulgación y en dicha estación de separación un método adicional de aislamiento y purificación de un ácido nucleico. El método comprende las etapas de unir un ácido nucleico con partículas magnéticas en un recipiente de una placa multipocillo. El recipiente comprende una abertura superior, una parte central y una parte inferior. El material unido se separa después del material no unido contenido en un líquido cuando la mayor parte del líquido se encuentra por encima de la sección donde la parte cónica del recipiente se reemplaza por la parte central con la forma rectangular, moviendo un imán desde una segunda posición a una primera posición y, en dicha primera posición, aplicando un campo magnético a la parte central y, opcionalmente, aplicando también un campo magnético en la parte inferior de dicho recipiente. Las partículas magnéticas pueden lavarse opcionalmente con una solución de lavado. Un volumen de líquido pequeño, en el que la mayor parte del líquido se encuentra por debajo de la sección donde la parte cónica de los recipientes se reemplaza por la parte central con la forma rectangular se separa de dichas partículas magnéticas aplicando selectivamente un campo magnético a la parte inferior de dicho recipiente.

También es útil en el contexto de la presente invención una estación de separación magnética para separar un ácido nucleico unido a partículas magnéticas, comprendiendo dicha estación de separación primeros imanes que se construyen y disponen para interaccionar con recipientes de una placa multipocillo para ejercer un campo magnético en un volumen grande de líquido que comprende partículas magnéticas contenidas en dichos recipientes, y segundos imanes construidos y dispuestos para interaccionar con recipientes de una placa multipocillo para ejercer un campo magnético en un volumen pequeño de líquido que comprende partículas magnéticas contenidas en dichos recipientes, y en el que dicho primer y segundo imanes pueden moverse a diferentes posiciones en Z. En el presente documento se describen realizaciones preferidas de la estación de separación magnética. A continuación se describe una primera realización preferida de una estación de separación (201) útil para la presente invención. La primera realización preferida de dicha estación de separación (201) comprende al menos dos tipos de imanes (202, 203). El primer tipo de imán (202) alargado se construye y dispone para ajustarse en el interior del espacio (121) de la placa (101) de procesamiento. De este modo, el imán (202) ejerce un campo magnético en el

imagen8

5

15

25

35

45

55

65

número de hileras (123) de la placa (101) multipocillo descrita anteriormente en el presente documento. Más preferentemente, en la estación de separación (230) se instalan seis fijaciones (231). Al menos un imán (232) se instala en una fijación (231). Preferentemente, el número de imanes (232) es igual al número de recipientes (103) en una fila (123). Más preferentemente, se instalan ocho imanes (232) en una fijación (231). Preferentemente un tipo de imán (232) está comprendido en dicha fijación (231). Más preferentemente, el imán (232) está instalado en un lado orientado hacia los recipientes con los que interacciona el imán.

La fijación (231) está instalada en una base (233). Preferentemente, dicha instalación es flexible. La base (233) comprende resortes (234) instalados en su interior. El número de resortes (234) es al menos un resorte por fijación

(231) instalado en dicha base (233). Adicionalmente la base comprende un bisel (236) que limita el movimiento del resorte y, por consiguiente, la fijación (231) comprende los imanes (232). Preferentemente, uno cualquiera de dichos resortes (234) se construye y dispone para interaccionar con una fijación (231). Más preferentemente, dicho resorte

(234) es un resorte de Yugo. Dicha interacción controla el movimiento horizontal de las fijaciones (231). Adicionalmente, la estación de separación (230) comprende un bastidor (235). La base (233) con fijaciones (231) se conecta al bastidor (235) moviendo un mecanismo como se describe anteriormente en el presente documento para los imanes (232) de la primera realización.

Preferentemente, dicha base (233) y fijación (231) se construye y dispone para moverse verticalmente (en dirección Z).

La placa (101) multipocillo descrita en el presente documento anteriormente se inserta en la estación de separación (230). La fijación (231) que comprende los imanes (232) se mueve verticalmente. Cualquier otra fijación (232) se mueve, por tanto, en un espacio (121) entre dos filas (123) de recipientes (103). El movimiento vertical hace que los imanes (232) instalados en una fijación (231) establezcan contacto con los recipientes (103). La posición en Z se selecciona dependiendo del volumen de líquido (215) dentro de los recipientes (103). Para volúmenes grandes, los imanes (232) se ponen en contacto con los recipientes (103) en una posición central (120) en la que los recipientes

(103) son de una forma casi rectangular. Para volúmenes pequeños de líquido (215) en los que la mayor parte del líquido (215) se encuentra por debajo de la parte central (120) de los recipientes (103), los imanes (232) se ponen preferentemente en contacto con la parte cónica (111) de los recipientes (103).

Un resorte se une a la base (233) de cualquier bastidor (231) (Fig. 9a), b)). El resorte presiona los imanes (232) contra los recipientes (103). Esto garantiza un contacto entre los imanes (232) y los recipientes (103) durante la separación magnética. Preferentemente, el imán (232) establece contacto con el recipiente (103) en la pared lateral

(109) localizada por debajo de la entrada (105). Esto tiene la ventaja de que el líquido que se añade transfiriendo con pipeta fluye sobre las partículas magnéticas secuestradas y garantiza que las partículas se resuspendan y que todas las muestras en todos los recipientes se traten de manera idéntica.

Esta realización es particularmente adecuada para separar un líquido (215), comprendido en una placa (101) multipocillo como se ha descrito anteriormente en el presente documento, de partículas magnéticas (216) cuando diferentes niveles de líquido (215) están contenidos en los recipientes (103) de dicha placa (101) multipocillo.

Un “tampón de lavado” es un líquido que se diseña para eliminar componentes no deseados, especialmente en un procedimiento de purificación. Dichos tampones son muy conocidos en la técnica. En el contexto de purificación de ácidos nucleicos, el tampón de lavado se ajusta para lavar el material de soporte sólido para separar el ácido nucleico inmovilizado de cualquier componente no deseado. El tampón de lavado puede, por ejemplo, contener etanol y/o agentes caotrópicos en una disolución tamponada o soluciones con un pH ácido sin etanol y/o agentes caotrópicos como se ha descrito anteriormente. A menudo la solución de lavado u otras soluciones se proporcionan como soluciones de reserva que tienen que diluirse antes de su uso.

En el proceso de acuerdo con la invención, el lavado requiere un contacto más o menos exhaustivo del material de soporte sólido y de los ácidos nucleicos inmovilizados en su interior con el tampón de lavado.

Para realizar esto, son posibles diferentes métodos, por ejemplo, agitar el tampón de lavado con el material de soporte sólido en, o junto con, el recipiente o recipientes respectivos. Otro método ventajoso es aspirar y dispensar la suspensión que comprende el tampón de lavado y el material de soporte sólido una o más veces. Este método se realiza preferentemente usando una pipeta, en la que dicha pipeta comprende preferentemente una punta de pipeta desechable en la que dicha suspensión se aspira y desde la cual se dispensa de nuevo. Dicha punta de pipeta puede usarse varias veces antes de desecharse y reemplazarse. Las puntas de pipeta desechables útiles para la invención tienen preferentemente un volumen de al menos 10 μl, más preferentemente de al menos 15 μl, más preferentemente al menos de 100 μl, más preferentemente al menos de 500 μl, más preferentemente al menos de 1 ml, incluso más preferentemente de aproximadamente 1 ml. Las pipetas que se usan en el contexto de la invención también pueden ser agujas para pipeta.

Por tanto, un aspecto preferido de la divulgación es el proceso descrito anteriormente, en el que dicho lavado en la etapa d. comprende aspirar y dispensar el tampón de lavado que comprende el material de soporte sólido.

5

15

25

35

45

55

65

Para el procesamiento aguas abajo de los ácidos nucleicos aislados, puede ser ventajoso separarlos del material de soporte sólido antes de someterlos a amplificación.

Por lo tanto, un aspecto preferido de la divulgación es el proceso descrito anteriormente, en el que dicho proceso comprende adicionalmente, en la etapa d. la etapa de elución de los ácidos nucleicos purificados del material de soporte sólido con un tampón de elución después del lavado de dicho material de soporte sólido. Un “tampón de elución” en el contexto de la invención es un líquido adecuado para separar los ácidos nucleicos del soporte sólido. Dicho líquido puede ser, por ejemplo, agua destilada o soluciones salinas acuosas, tales como, por ejemplos, tampones Tris como Tris HCl o HEPES, o cualquier otro tampón adecuado conocido por el experto en la técnica. El valor del pH de dicho tampón de elución es preferentemente alcalino o neutro. Dicho tampón de elución puede contener otros componentes tales como, por ejemplo, quelantes como EDTA, que estabiliza los ácidos nucleicos aislados por inactivación de enzimas degradantes. La elución se realiza preferentemente a temperaturas elevadas, de tal manera que una realización preferida de la invención es el proceso descrito anteriormente, en el que la etapa d. se realiza a una temperatura entre 70 ºC y 90 ºC, más preferentemente a una temperatura de 80 ºC.

“Reactivos de amplificación”, en el contexto de la divulgación, son componentes químicos o bioquímicos que permiten la amplificación de ácidos nucleicos. Dichos reactivos comprenden, pero sin limitación, polimerasas de ácido nucleico, tampones, mononucleótidos tales como nucleósido trifosfatos, oligonucleótidos por ejemplo cebadores oligonucleotídicos, sales y sus respectivas soluciones, sondas de detección, colorantes y otros.

Como se sabe en la técnica, un “nucleósido” es una combinación de base y azúcar. La parte base del nucleósido es normalmente una base heterocíclica. Las dos bases más comunes de dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas

Los “nucleótidos” son nucleósidos que adicionalmente incluyen un grupo fosfato unido por enlace covalente a la parte de azúcar del nucleósido. Para los nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido a cualquiera de los radicales 2’-, 3’-o 5’-hidroxilo del azúcar. Un nucleótido es la unidad monomérica de un “oligonucleótido”, que puede denominarse más generalmente como un “compuesto oligomérico”, o un “polinucleótido”, denominarse más generalmente como un “compuesto polimérico”. Otra expresión general para lo anteriormente mencionado es ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN).

De acuerdo con la divulgación, un “compuesto oligomérico” es un compuesto que consiste en “unidades monoméricas” que pueden ser solo nucleótidos o compuestos no naturales (véase más adelante), más específicamente nucleótidos modificados (o análogos de nucleótido) o compuestos que no son nucleótidos, solos o en combinaciones de los mismos.

Los “oligonucleótidos” y “oligonucleótidos modificados” (o “análogos de oligonucleótidos”) son subgrupos de compuestos oligoméricos. En el contexto de la presente invención, el término “oligonucleótido” se refiere a componentes formados a partir de una pluralidad de nucleótidos como sus unidades monoméricas. Los grupos fosfato comúnmente hacen referencia a la formación de la estructura internucleosídica del oligonucleótido. El enlace

o cadena principal del ARN y ADN es un enlace fosfodiéster 3’ a 5’. Los oligonucleótidos y oligonucleótidos modificados (véase más adelante) útiles para la invención pueden sintetizarse como se describe principalmente en la técnica y como sabe el experto en el campo. En la técnica se conocen métodos para la preparación de compuestos oligoméricos de secuencias específicas, e incluyen, por ejemplo, clonación y restricción de secuencias apropiadas y síntesis química directa. Los métodos de síntesis química pueden incluir, por ejemplo, el método de fosfotriéster descrito por Narang S. A. et al., Methods in Enzymology 68 (1979) 90-98, el método de fosfodiéster desvelado por Brown E. L., et al., Methods in Enzymology 68 (1979) 109-151, el método de la fosforamidita desvelado en Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859, el método del H-fosfonato desvelado en Garegg et al., Chem. Scr. 25 (1985) 280-282 y el método de soporte sólido desvelado en el documento US 4.458.066.

En el proceso descrito anteriormente, los oligonucleótidos pueden modificarse químicamente, es decir, el cebador y/o la sonda pueden comprender un nucleótido o un compuesto que no es un nucleótido, modificado. La sonda o el cebador es entonces un oligonucleótido modificado.

Los “nucleótidos modificados” (o “análogos de nucleótidos”) se diferencian de un nucleótido natural por alguna modificación, pero siguen estando constituidos por una base, un azúcar pentofuranosilo, una parte fosfato, una parte de tipo base, de tipo azúcar pentofuranosilo y de tipo fosfato o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, un marcador puede unirse a la parte base de un nucleótido mediante lo cual se obtiene un nucleótido modificado. También puede reemplazarse una base natural en un nucleótido, por ejemplo, mediante una 7-deazapurina mediante lo que también se obtiene un nucleótido modificado.

Un “oligonucleótido modificado” (o “análogo de oligonucleótido”), que pertenece a otro subgrupo específico de compuestos oligoméricos, posee uno o más nucleótidos y uno o más nucleótidos modificados como unidades monoméricas. Por tanto, el término “oligonucleótido modificado” (o “análogo de oligonucleótido”) se refiere a estructuras que funcionan de una manera sustancialmente similar a la de los oligonucleótidos y puede usarse

5

15

25

35

45

55

65

indistintamente en el contexto de la presente invención. Desde un punto de vista sintético, un oligonucleótido modificado (o un análogo de oligonucleótido) puede prepararse, por ejemplo, por modificación química de oligonucleótidos mediante una modificación apropiada del esqueleto fosfato, unidad de ribosa o las bases de nucleótidos (Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543; Verma S., y Eckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134). Las modificaciones representativas incluyen enlaces fosforotioato, fosforoditioato, metil fosfonato, fosfotriéster, fosforamidato internucleosídicos en lugar de enlaces fosfodiéster internucleosídicos; deaza-o azapurinas y pirimidinas en lugar de bases de purina y pirimidina naturales, bases de pirimidina que tienen grupos sustituyentes en la posición 5 o 6; bases de purina que tienen grupos sustituyentes alterados en las posiciones 2, 6 u 8 o en la posición 7 como 7-deazapurinas; bases que llevan radicales de alquilo-, alquenilo-, alquinilo o arilo, por ejemplo, grupos alquilo inferior tales como grupos metilo, etilo, propilo, butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo o arilo como fenilo, bencilo, naftilo; azúcares que tienen grupos sustituyentes, por ejemplo, en su posición 2’; o análogos de azúcar carbocíclico o acíclico. Los expertos en la técnica conocen otras modificaciones en consonancia con el espíritu de la invención. Dichos oligonucleótidos modificados (o análogos de oligonucleótidos) se describen mejor como siendo funcionalmente intercambiables con, incluso estructuralmente diferentes de, oligonucleótidos naturales. Con más detalle, se desvelan ejemplos de modificaciones en Verma S., y Eckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134 o en el documento WO 02/12263. Además, pueden hacerse modificaciones en las que las unidades de nucleósido se unen mediante grupos que sustituyen los enlaces fosfato internucleosídicos o azúcar fosfato Dichos enlaces incluyen los desvelados en Verma S., y Eckstein F., Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134. Cuando para unir las unidades nucleosídicas se utilizan enlaces que no son fosfato, dichas estructuras también se han descrito como “oligonucleósidos”.

Como sabe el experto en la técnica, un “ácido nucleico”, así como el “ácido nucleico diana”, es un compuesto polimérico de nucleótidos. En el presente documento, la expresión “ácido nucleico diana” se usa para indicar un ácido nucleico en una muestra que debe analizarse, es decir, cuya presencia o no presencia y/o cantidad debe determinarse en una muestra.

En el presente documento el término “cebador” se usa en la manera que conoce el experto en la técnica y se refiere a compuestos oligoméricos, principalmente a oligonucleótidos, pero también a oligonucleótidos modificados que pueden cebar la síntesis de ADN mediante una ADN polimerasa dependiente de molde, es decir, el extremo 3’, por ejemplo, del cebador, proporciona un grupo 3’-OH libre al que pueden unirse otros nucleótidos mediante una ADN polimerasa dependiente de molde estableciendo un enlace fosfodiester 3’-a 5’-fosfodiéster mediante lo cual se usan desoxinucleósido trifosfatos y por lo cual se libera pirofosfato.

Una “sonda” también indica un oligonucleótido natural o modificado. Como se sabe en la técnica, el objetivo de una sonda es detectar un analito o amplificar. En el caso del proceso descrito anteriormente, las sondas pueden usarse para detectar los amplificados de los ácidos nucleico diana. Para esta finalidad, las sondas llevan típicamente marcadores.

Los “marcadores”, que a menudo reciben el nombre de “grupos indicadores”, son generalmente grupos que hacen que un ácido nucleico, en particular oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados, así como cualquier ácido nucleico unido a ellos, sea diferenciable del resto de la muestra (los ácidos nucleicos que tienen unidos un marcador también pueden denominarse ácidos nucleicos marcados de unión a compuestos, sondas marcadas o solo sondas). Los marcadores preferidos de acuerdo con la invención son marcadores fluorescentes, que son, por ejemplo, colorantes fluorescentes tales como un colorante de fluoresceína, un colorante de rodamina, un colorante de cianina y un colorante de coumarina. Los colorantes fluorescentes preferidos de acuerdo con la invención son FAM, HEX, JA270, CAL635, Coumarin343, Quasar705, Cyan500, CY5.5, LC-Red 640, LC-Red 705.

En el contexto de la divulgación, cualquier cebador y/o sonda puede modificarse químicamente, es decir, el cebador y/o la sonda puede comprender un nucleótido o un compuesto que no es un nucleótido, modificado. La sonda o el cebador es entonces un oligonucleótido modificado.

Un método preferido de amplificación de ácido nucleico es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) que se desvela, entre otras referencias, en las Patentes de Estados Unidos n.º 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y

4.965.188. Típicamente, la PCR emplea dos o más cebadores oligonucleotídicos que se unen a un molde de ácido nucleico seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores útiles para el análisis de ácido nucleico incluyen oligonucleótidos capaces de actuar como un punto de inicio de la síntesis de ácido nucleico dentro de las secuencias de ácido nucleico de los ácidos nucleico diana. Un cebador puede purificarse a partir de una digestión con enzimas de restricción mediante métodos convencionales, o puede producirse sintéticamente. Preferentemente el cebador es monocatenario para tener una eficiencia máxima en la amplificación, pero también puede ser bicatenario. Los cebadores bicatenarios se desnaturalizan primero, es decir, se tratan para separar las cadenas. Un método de desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios es por calentamiento. Una “polimerasa termoestable” es una enzima polimerasa que es termoestable, es decir, es una enzima que cataliza la formación de productos de extensión por cebador complementarios a un molde y no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleico molde bicatenarios. Generalmente, la síntesis se inicia en el extremo 3’ de cada cebador y continúa en la dirección 5’ a 3’ a lo largo de la cadena molde. Las polimerasas termoestables se han aislado, por ejemplo, de Thermus flavus, T.

5

15

25

35

45

55

65

ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilus y Methanothermus fervidus. Sin embargo, en los ensayos de PCR también pueden emplearse polimerasas que no sean termoestables siempre que se reponga la enzima.

Si el ácido nucleico molde es bicatenario, es necesario separar las dos cadenas antes de que se use como un molde en la PCR. La separación de las cadenas puede realizarse mediante cualquier método de desnaturalización adecuado, incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos. Un método de separación de las cadenas de ácido nucleico implica el calentamiento del ácido nucleico hasta que esté predominantemente desnaturalizado (por ejemplo, desnaturalizado más del 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %). Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalizar ácido nucleico molde dependerán, por ejemplo, de la concentración salina del tampón y de la longitud y composición de nucleótidos de los ácidos nucleicos que se van a desnaturalizar, pero típicamente varían de aproximadamente 90 ºC a aproximadamente 105 ºC durante un tiempo dependiendo de las características de la reacción, tales como la temperatura y la longitud del ácido nucleico. La desnaturalización se realiza típicamente durante aproximadamente 5 segundos a 9 minutos. Para no exponer la polimerasa respectiva, como por ejemplo la ADN polimerasa Z05, a dichas temperaturas elevadas durante demasiado tiempo, y por tanto arriesgando una pérdida de enzima funcional, se prefiere el uso de etapas cortas de desnaturalización.

En una realización preferida de la divulgación, la etapa de desnaturalización es de hasta 30 segundos, adicionalmente de un modo preferente de hasta de 20 segundos, preferentemente aún de hasta 10 segundos, además preferentemente de hasta 5 segundos, más preferentemente es de aproximadamente 5 segundos.

Si el ácido nucleico molde bicatenario se desnaturaliza con calor, la mezcla de reacción se deja enfriar a una temperatura que promueve la hibridación de cada cebador con su secuencia diana en los ácidos nucleico diana.

Preferentemente, la temperatura de hibridación es de aproximadamente 35 ºC a aproximadamente 70 ºC, más preferentemente de aproximadamente 45 ºC a aproximadamente 65 ºC; más preferentemente de aproximadamente 50 ºC a aproximadamente 60 ºC, más preferentemente de aproximadamente 55 ºC a aproximadamente 58 ºC. Los tiempos de hibridación pueden ser de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 1 minuto (por ejemplo, de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 50 segundos, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 40 segundos). En este contexto, puede ser ventajoso usar diferentes temperaturas de hibridación para aumentar la inclusividad del ensayo respectivo. En resumen, esto significa que a temperaturas de hibridación relativamente bajas, los cebadores también pueden unirse a dianas que tienen emparejamientos erróneos sencillos, de manera que también pueden amplificarse variantes de determinadas secuencias. Esto puede ser deseable si, por ejemplo, un determinado organismo, que también ha de detectarse, tiene variantes genéticas conocidas o desconocidas. Por otro lado, las temperaturas de hibridación relativamente elevadas suponen la ventaja de proporcionar mayor especificidad, ya que contra temperaturas más altas la probabilidad de que el cebador se una a secuencias diana no exactamente emparejadas, disminuye de manera continua. Para beneficiarse de ambos fenómenos, en algunas realizaciones de la invención se prefiere que el proceso descrito anteriormente comprenda la hibridación a diferentes temperaturas, preferentemente primero a una temperatura más baja y después a una temperatura más alta. Si, por ejemplo, se produce una primera incubación a 55 ºC durante aproximadamente 5 ciclos, las secuencias diana no exactamente emparejadas pueden (pre)amplificarse. Esto puede ir seguido de, por ejemplo, aproximadamente 45 ciclos a 58 ºC, proporcionando una mayor especificidad durante la mayor parte del experimento. De esta forma, no se pierden variantes genéticas posiblemente importantes, aunque la especificidad siga siendo relativamente alta.

La mezcla de reacción se ajusta después a una temperatura a la cual la actividad de la polimerasa se intensifica u optimiza, es decir, a una temperatura suficiente para que se produzca la extensión del cebador hibridado para generar productos complementarios al ácido nucleico que se va a analizar. La temperatura debe ser suficiente para sintetizar un producto de extensión de cada cebador que se hibrida con un molde de ácido nucleico, pero no debe ser tan alta como para desnaturalizar un producto de extensión de su molde complementario (por ejemplo, la temperatura para la extensión generalmente varía de aproximadamente 40 ºC a 80 ºC (por ejemplo de aproximadamente 50 ºC a aproximadamente 70 ºC; de aproximadamente 60 ºC). Los tiempos de extensión pueden ser de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 5 minutos, preferentemente de aproximadamente 15 segundos a 2 minutos, incluso preferentemente de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 1 minuto, preferentemente también de aproximadamente 25 segundos a aproximadamente 35 segundos. Las cadenas recién sintetizadas forman una molécula bicatenaria que puede usarse en las etapas sucesivas de la reacción. Las etapas de separación, hibridación y elongación de cadena pueden repetirse cada vez que sea necesario para producir la cantidad deseada de productos de amplificación correspondiente a los ácidos nucleico diana. Los factores limitantes en la reacción son las cantidades de los cebadores, la enzima termoestable, los nucleósido trifosfatos presentes en la reacción. Las etapas de ciclado (es decir, desnaturalización, hibridación y extensión) se repiten preferentemente al menos una vez. Para su uso en la detección, el número de etapas de ciclado dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de ciclado para amplificar la suficiente secuencia diana para la detección. Generalmente, las etapas de ciclado se repiten al menos aproximadamente 20 veces, pero pueden repetirse hasta 40, 60 o incluso 100 veces.

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

5

15

25

35

45

55

65

Dado que la amplificación del ácido nucleico, especialmente aunque no solo en el caso de la PCR, es muy eficaz si se realiza como una reacción de ciclado, un aspecto preferido de la invención es el proceso descrito anteriormente, en el que la reacción de amplificación en la etapa f. consta de etapas de ciclado múltiples.

El experto en el campo conoce métodos de detección de ácido nucleico adecuados y se describen en libros de texto convencionales tales como en Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 y Ausubel F. et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY. También puede haber etapas de purificación adicionales antes de realizar la etapa de detección de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, una etapa de precipitación. Los métodos de detección pueden incluir, pero sin limitación, la unión o intercalación de colorantes específicos, tales como bromuro de etidio que se intercala en el ADN bicatenario y cambia su fluorescencia después de ello. El ácido nucleico purificado también puede separarse por métodos electroforéticos opcionalmente después de una digestión con enzimas de restricción y después de esto visualizarse. Hay también ensayos basados en sondas que aprovechan la hibridación de oligonucleótidos con secuencias específicas y posterior detección del híbrido.

Para evaluar el resultado del análisis, se prefiere detectar los ácidos nucleicos diana amplificados durante o después de la reacción de amplificación. Particularmente para la detección en tiempo real, es ventajoso usar sondas de ácido nucleico.

Por tanto, un aspecto preferido de la divulgación es el proceso descrito anteriormente, en el que una etapa de ciclado comprende una etapa de amplificación y una etapa de hibridación, comprendiendo dicha etapa de hibridación hibridar con sondas los ácidos nucleicos amplificados.

Puede ser favorable monitorizar la reacción de amplificación en tiempo real, es decir, detectar los ácidos nucleicos diana y/o sus amplificados durante la propia amplificación.

Por lo tanto, un aspecto preferido de la invención es el proceso descrito anteriormente, en el que las sondas se marcan con un radical fluorescente donante y un radical fluorescente aceptor correspondiente. Los métodos expuestos anteriormente se basan preferentemente en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre un radical fluorescente donante y un radical fluorescente aceptor. Un radical fluorescente donante representativo es la fluoresceína, y los radicales fluorescentes aceptores correspondientes representativos incluyen LC-Red 640, LC-Red 705, Cy5 y Cy5.5. Típicamente, la detección incluye excitar la muestra a una longitud de onda absorbida por el radical fluorescente donante y visualizar y/o medir la longitud de onda emitida por el radical fluorescente aceptor correspondiente. En el proceso de acuerdo con la invención, la detección viene preferentemente seguida de cuantificación de FRET. Preferentemente, la detección se realiza después de cada etapa de ciclado. Más preferentemente, la detección se realiza en tiempo real. Usando instrumentación PCR en tiempo real disponible en el comercio (por ejemplo, LightCycler™ o Taq-Man®), la amplificación por PCR y la detección del producto de amplificación pueden combinarse en una sola cubeta cerrada con un tiempo de ciclado drásticamente reducido. Dado que la detección se produce simultáneamente con la amplificación, los métodos de PCR en tiempo real obvian la necesidad de manipular el producto de amplificación, y se disminuye el riesgo de contaminación cruzada entre los productos de amplificación. La PCR en tiempo real reduce enormemente el tiempo de respuesta y es una alternativa atractiva a las técnicas de PCR convencionales en el laboratorio clínico.

Las siguientes solicitudes de patente describen la PCR en tiempo real como se usa en la tecnología LightCycler™: WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712. El instrumento LightCycler™ es un termociclador rápido combinado con un fuorómetro de microvolumen que utiliza óptica de alta calidad. Esta técnica de termociclado rápido utiliza cubetas de vidrio fino como recipientes de reacción. El calentamiento y enfriamiento de la cámara de reacción se controlan alternando el aire caliente y ambiental. Debido a la baja masa de aire y a la alta proporción del área de superficie con respecto al volumen de las cubetas, pueden conseguirse velocidades de cambio de temperatura muy rápidas dentro de la cámara térmica.

La tecnología TaqMan® utiliza una sonda de hibridación monocatenaria marcada con dos radicales fluorescentes. Cuando un primer radical fluorescente se excita con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere a un segundo radical fluorescente de acuerdo con los principios de FRET. El segundo radical fluorescente generalmente es una molécula inactivadora. Los colorantes fluorescentes típicos usados en este formato son, por ejemplo, entre otros, FAM, HEX, CY5, JA270, Cian y CY5.5. Durante la etapa de hibridación de la reacción PCR, la sonda de hibridación marcada se une al ácido nucleico diana (es decir, al producto de amplificación) y se degrada por la actividad exonucleasa 5’ a 3’ de la Taq u otra polimerasa adecuada como sabe el experto en la técnica, tal como la polimerasa Z05 mutante preferida, durante la fase de elongación posterior. Como resultado, el radical fluorescente excitado y el radical inactivador comienzan a separarse espacialmente entre sí. Como consecuencia, después de la excitación del primer radical fluorescente en ausencia del inactivador, puede detectarse la emisión de fluorescencia desde el primer radical fluorescente.

En los dos formatos de detección descritos anteriormente, la intensidad de la señal emitida puede correlacionarse con el número de moléculas de ácido nucleico diana originales.

imagen13

5

15

25

35

45

55

65

como UI/ml. La expresión "cp/ml" significa "copias por mililitro", siendo la "copia" una copia del ácido nucleico respectivo. La expresión UI/ml representa "unidades internacionales/ml", refiriéndose a la norma de la OMS.

Un método muy usado para realizar el cálculo de un LDD es el “análisis de Probit”, que es un método que analiza la relación entre un estímulo (dosis) y la respuesta cuántica (todo o nada). En un experimento típico de respuesta cuántica, grupos de animales reciben dosis diferentes de un fármaco. El porcentaje de colorante a cada nivel de dosis se registra. Estos datos pueden después analizarse usando el análisis de Probit. El modelo Probit supone que el porcentaje de respuesta está relacionado con la dosis logarítmica como la distribución normal acumulativa. Esto es, las dosis logarítmicas pueden usarse como variables para leer el porcentaje de colorante a partir del normal acumulado. El uso de la distribución normal, en lugar de otras distribuciones de probabilidad, influye en la velocidad de respuesta prevista en los extremos superior e inferior de posibles dosis, pero apenas influye cerca del centro.

El análisis de Probit puede aplicarse a "índices de acierto" distintos. Como se sabe en la técnica, un “índice de acierto” se expresa normalmente en porcentaje [%] e indica el porcentaje de resultados positivos a una concentración específica de un analito. Por tanto, por ejemplo, un LDD puede determinarse a un índice de acierto de 95 %, lo que significa que la LDD se calcula para una configuración en la que el 95 % de los resultados válidos son positivos.

En una realización preferida, el proceso descrito anteriormente proporciona un LDD de 1 a 100 cp/ml o de 0,5 a 50 UI/ml, más preferentemente de 1 a 75 cp/ml o de 0,5 a 30 UI/ml, más preferentemente de 1 a 25 cp/ml o de 1 a 20 UI/ml.

Con respecto a algunos ejemplos de posibles ácidos nucleicos diana procedentes de determinados virus, el proceso descrito anteriormente proporciona preferentemente los siguientes LDD:

•

HIV: hasta 60 cp/ml, más preferentemente hasta 50 cp/ml, más preferentemente hasta 40 cp/ml, más preferentemente hasta 30 cp/ml, más preferentemente hasta 20 cp/ml, más preferentemente hasta 15 cp/ml

•

HBV: hasta 10 UI/ml, más preferentemente hasta 7,5 UI/ml, más preferentemente hasta 5 UI/ml

•

HCV: hasta 10 UI/ml, más preferentemente hasta 7,5 UI/ml, más preferentemente hasta 5 UI/ml

•

WNV I: hasta 20 cp/ml, más preferentemente hasta 15 cp/ml, más preferentemente hasta 10 cp/ml

•

WNV II: hasta 20 cp/ml, más preferentemente hasta 15 cp/ml, más preferentemente hasta 10 cp/ml, más preferentemente hasta 5 cp/ml

•

JEV: hasta 100 cp/ml, más preferentemente hasta 75 cp/ml, más preferentemente hasta 50 cp/ml, más preferentemente hasta 30 cp/ml

•

SLEV: hasta 100 cp/ml, más preferentemente hasta 75 cp/ml, más preferentemente hasta 50 cp/ml, más preferentemente hasta 25 cp/ml, más preferentemente hasta 10 cp/ml.

A continuación se describe un ejemplo de cómo realizar un cálculo de resultados cuantitativos en el formato TaqMan basándose en un ácido nucleico de control interno que sirve como un ácido nucleico patrón cuantitativo: se calcula un título de datos de entrada de valores de fluorescencia corregidos con el instrumento de un desarrollo de PCR completo Un conjunto de muestras que contiene un ácido nucleico diana y un ácido nucleico de control interno sirve como ácido nucleico patrón cuantitativo sometido a PCR en un termociclador usando un perfil de temperatura específico. A los perfiles de temperatura y tiempo seleccionados durante la PCR las muestras se iluminan con luz filtrada y se recogen datos de fluorescencia filtrados de cada muestra para el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de control interno. Después de completar un desarrollo de PCR completo, las lecturas de fluorescencia se procesan para producir un conjunto de datos de concentración de colorante para el ácido nucleico de control interno y un conjunto de datos de concentración de colorante para el ácido nucleico diana. Cada conjunto de datos de concentración de colorante se procesa de la misma manera. Después de diversas comprobaciones de verosimilitud, se calculan los valores de codo (CT) para el ácido nucleico de control interno y el ácido nucleico diana. El valor de codo se define como el punto en el cual la fluorescencia del ácido nucleico diana o del ácido nucleico interno atraviesa un umbral previamente definido (concentración de fluorescencia). La determinación del título se basa en la hipótesis de que el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de control interno se amplifican con la misma eficacia y que al valor de codo calculado se detectan y amplifican las mismas cantidades de copias de amplicón de ácido nucleico diana y de ácido nucleico de control interno. Por lo tanto, el (CTQS – Ctdiana) es lineal al logaritmo (conc diana/conc QS). En este contexto, QS representa el ácido nucleico de control interno (quantitative standard) que sirve como un ácido nucleico patrón cuantitativo. Después, el título T puede calcularse, por ejemplo, usando una fórmula de calibrado polinómica como en la siguiente ecuación:

T’ = 10 (a(CTQS -CTdiana)2 + b(CTQS -CTdiana) + c)

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

Reactivo de Lisis

Conc. o pH

Tiocianato de Guanidina (M)

4

Citrato de Sodio (mM)

50

Polidocanol (p/v, %)

5

Ditiotreitol (p/v, %)

2

pH

5,8

Tampón de Lavado

Conc. o pH

Citrato de Sodio (mM)

7,5

Metilparabeno (p/v, %)

0,1

pH

4,1

Tampón de Elución

Conc. o pH

Tris (mM)

30

Metilparabeno (p/v, %)

0.2

pH

8,5

5 Después de la etapa final, el cabezal del aparato Star Hamilton del proceso añadió a cada pocillo las mezclas de reacción (Mreac.) respectivas que contenían los reactivos de amplificación, se mezclaron los líquidos que contenían los ácidos nucleicos aislados con las Mreac. y cada mezcla resultante se transfirió a un pocillo correspondiente de una placa de micropocillos en la que se realizó la amplificación.

10 Se utilizaron las siguientes mezclas de reacción (consistiendo cada una de ellas en dos reactivos R1 y R2): Para HIV:

Reactivo R1

Concentración/ 50 μl-PCR [μM]

Agua (de calidad PCR)

Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6,1 ajustado con Ácido Acético)

3’000

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH7 [%]

0,018

Reactivo R2

Concentración/50 μl-PCR [μM]

DMSO [%]

5,000 %

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH7 [%]

0,027 %

Acetato de potasio pH 7,0

110’000

Glicerol [%]

3,000 %

Tricina pH 8,0

50’000

Igepal [%]

0,024 %

dGTP

337,5

dATP

337,5

dCTP

337,5

dUTP

675

Cebadores/sondas seleccionados de las SEQ ID NO 1-35

0,1-0,15

SEQ ID NO 42

0,1

Reactivo R2

Concentración/50 μl-PCR [μM]

SEQ ID NO 43

0,1

SEQ ID NO 44

0,1

Uracil-N-Glicosilasa

10 (U/reacción)

Polimerasa Z05-D

40 (U/reacción)

Aptámero NTQ21-46A

0,222

Agua

Para HBV:

Reactivo R2

Concentración/50 ml-PCR

H20

100 %

Tricina 7,7

40 mM

Tween

0,03 % (v/v)

Glicerol

5 % (v/v)

KOH

25,2 mM

KOAc

121,8 mM

NTQ21-46A (Aptámero)

0,2625 uM

dGTP

0,42 uM

dATP

0,42 uM

dCTP

0,42 uM

dUTP

0,84 uM

SEQ ID NO 36

1,2 uM

SEQ ID NO 37

0,1 uM

SEQ ID NO 38

1,2 uM

SEQ ID NO 42

0,6 uM

SEQ ID NO 43

0,6 uM

SEQ ID NO 44

0,15 uM

Polimerasa Z05D

35 (U/reacción)

Uracil-N-Glicosilasa

2 (U/reacción)

Azida Sódica

0,027 % (m/v)

Reactivo R1

Concentración/50 ml-PCR

H20

100 %

MgOAc

2,5 mM

MnOAc pH6,1

2,5 mM

Azida Sódica

0,018 % (m/v)

Para CT:

Reactivo R1

Concentración/50 ml-PCR

Agua (de calidad PCR)

Mn(Ac)2 (pH 6,5 en Ácido Acético Glacial 0,002% (V/V)

2,7 mM

NaN3

0,0135 % (p/v)

Reactivo R2

Concentración/50 μl-PCR

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH7 [%]

0,0315 %

Acetato de potasio

112,4 mM

Glicerol [%]

3,5%

Tricina

61 mM

Hidróxido de potasio

28,4 mM

dGTP

525 uM

dATP

525 uM

dCTP

525 uM

dUTP

1,05 mM

SEQ ID NO 39

750 nM

SEQ ID NO 40

600 nM

SEQ ID NO 41

116 nM

Aptámero NTQ-46A

175 nM

Uracil-N-Glicosilasa

5 U/reacción

Z05-D Polimerasa

31 U/reacción

Para la amplificación y la detección, la placa de micropocillos se selló con un sellador de placa automático (véase anteriormente) y la placa se transfirió a un LightCycler 480 (véase anteriormente).

Se usó el siguiente perfil de PCR: Perfil de termociclado

Nombre del Programa

Diana (ºC) Modo de Adquisición Tiempo (hh:mm:ss) Índice de Rampa (ºC/s) Ciclos Modo de Análisis

Pre-PCR

50 Ninguno 00:02:00 4,4

94

Ninguno 00:00:05 4,4

55

Ninguno 00:02:00 2,2 1 Ninguno

60

Ninguno 00:06:00 4,4

65

Ninguno 00:04:00 4,4

1ª Medición

95 Ninguno 00:00:05 4,4 5

55

Sencillo 00:00:30 2,2 Cuantificación

2ª Medición

91 Ninguno 00:00:05 4,4 45

Cuantificación

58

Sencillo 00:00:25 2,2

Enfriamiento

40 Ninguno 00:02:00 2,2 1 Ninguno

imagen21

Diana (ºC)

Modo de Adquisición Meseta [hh:mm:ss] Medición [hh:mm:ss] Índice de Rampa [ºC/s]

Enfriamiento

40 ninguno 00:02:00 00:00:00 2,2

Nombre

Ciclos

Pre-PCR

1

1ª Medición

5

2ª Medición

45

Enfriamiento

1

En detalle, se realización los siguientes experimentos:

5 1. Análisis múltiple cualitativo de HBV, HCV y HIV

a. Mezcla de reacción R1:

10

Conc. en 50 ul-PCR [uM]

Mn(Ac)2 *4H2O (pH 6,1 ajustado con Ácido Acético)

3.300

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH7

0,018

pH: 6,41

R2:

Reactivo

Conc. en 50 ul-PCR (uM)

DMSO (%)

5,4

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH7

0,027

KOAc (pH 7,0)

120’000

Glicerol (%)

3

Tween 20 (%)

0,015

Tricina pH 8,0

60’000

Aptámero NTQ21-46A

0,2222

Uracil-N-Glicosilasa (U/ul)

0,2

dGTP

400,0

dATP

400,0

dCTP

400,0

dUTP

800,0

Polimerasa ZO5-D (U/ul)*

0,9

Cebadores/sondas seleccionados de las SEQ ID NO 1-35

0,125-0,3

SEQ ID NO 36

0,100

SEQ ID NO 37

0,100

SEQ ID NO 38

0,150

Cebadores/sondas seleccionados de las SEQ ID NO 60-76

0,050-0,250

imagen22

imagen23

HCV

Tabla 5: Índices de acierto de HCV y LDD Probit de panel individual

Concentración

Número de copias Número de positivos Índice de acierto

24 UI/ml

21 21 100 %

12 UI/ml

21 21 100 %

6 UI/ml

21 21 100 %

3 UI/ml

21 17 81 %

1,5 UI/ml

21 14 67 %

0,75 UI/ml

21 9 43 %

0 UI/ml (control negativo)

18 0 0 %

LDD por análisis PROBIT (índice de acierto 95 %)

4,76 UI/ml

Intervalo de confianza del 95 % para LDD por análisis PROBIT

3,14-11,61 UI/ml

5

2. Análisis cualitativo de WNV

Mezclas de reacción

10

R1:

Reactivo

Conc. en PCR 50 ul [uM]

Mn(Ac)2 *4H2O (pH 6,1 ajustado con Ácido Acético)

3.300

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH7

0,018

pH: 6,41

R2:

Reactivo

Conc. en PCR 50 ul (uM)

DMSO (%)

5,4

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH7

0,027

Acetato sódico pH 7,0

120’000

Glicerol (%)

3

Tween 20 (%)

0,015

Tricina pH 8,0

60’000

Aptámero NTQ21-46A

0,2222

Uracil-N-Glicosilasa (U/ul)

0,2

dGTP

400,0

dATP

400,0

dCTP

400,0

dUTP

800,0

Polimerasa Z05-D (U/ul)*

0,9

Cebadores/sondas seleccionados de las SEQ ID NO 53-59

0,08-0,4

SEQ ID NO 42

0,150

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

MP 6 -1,0E + 04 UI/ml -nivel de concentración intermedio MP 5 -1,0E + 03 UI/ml -nivel de concentración intermedio 5 MP 6a -2,0E + 02 UI/ml -nivel de concentración intermedio (MP 6 diluido a 2,E + 02 UI/ml, usado para la asignación de título del panel de suero) MP 4 -1,0E + 02 UI/ml -nivel de concentración intermedio (también se usó para la asignación de título del panel de plasma) 10 MP 3 -5,0E + 01 UI/ml – por encima del LDQI esperado MP 2 -1,0E + 01 UI/ml – al LDQI esperado 15 MP 1 -4,0E + 00 UI/ml por debajo del LDQI esperado Para cada muestra válida del panel de linealidad, el título del ADN del HBV observado se transformó a un título de log10 y el título de log10 medio se calculó por nivel de concentración. 20 Tabla 13: linealidad en plasma EDTA

Título nominal (UI/ml)

Título asignado (UI/ml) Título Log10 asignado Título Log 10 medio observado Copias

4,00E+00

3,50E+00 0,54 0,52 17

1,00E+01

8,70E+00 0,94 0,91 21

5,00E+01

4,40E+01 1,64 1,69 21

1,00E+02

8,70E+01 1,94 2,04 21

1,00E+03

8,70E+02 2,94 3,01 21

1,00E+04

8,70E+03 3,94 3,9 21

1,00E+05

8,70E+04 4,94 4,88 21

1,00E+06

8,70E+05 5,94 5,87 21

1,00E+07

8,70E+06 6,94 6,92 21

1,00E+08

8,70E+07 7,94 8,01 21

1,00E+09

8,70E+08 8,94 9,04 21

2,00E+09

1,70E+09 9,24 9,38 21

En la Fig. 13 se muestra una representación gráfica de estos resultados.

Tabla 14: Linealidad en suero

Título nominal (UI/ml)

Título asignado (UI/ml) Título Log10 asignado Título Log 10 medio observado Copias

4,00E+00

3,30E+00 0,52 0,7 21

1,00E+01

8,30E+00 0,92 0,99 21

5,00E+01

4,10E+01 1,62 1,73 21

1,00E+02

8,30E+01 1,92 2,03 21

1,00E+03

8,30E+02 2,92 2,93 21

1,00E+04

8,30E+03 3,92 3,8 21

1,00E+05

8,30E+04 4,92 4,78 21

1,00E+06

8,30E+05 5,92 5,75 21

1,00E+07

8,30E+06 6,92 6,73 21

1,00E+08

8,30E+07 7,92 7,78 21

Título nominal (UI/ml)

Título asignado (UI/ml) Título Log10 asignado Título Log 10 medio observado Copias

1,00E+09

8,30E+08 8,92 8,92 21

2,00E+09

1,70E+09 9,22 9,22 21

En la Fig. 14 se muestra una representación gráfica de estos resultados.

Resumen de linealidad:

El rango lineal, definido como el rango de concentración para el cual la desviación log10 de los títulos log10 medios

5 observados está dentro de ± 0,3 del título nominal log10 se determinó como: 3,5E+00 UI/ml – 1,7E+ 09 UI/ml para plasma EDTA y 3,E+00 UI/ml – 1,7E+09 UI/ml para suero. Se encontró que el Límite de Cuantificación Inferior era: 4,0E+00 UI/ml para plasma EDTA y suero.

4. Análisis cuantitativo de HCV

10 Mezcla de reacción

R1:

Reactivo

Conc. Final en PCR 50 ul (uM)

Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6,1 ajustado con Ácido Acético)

3’300

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH7

0,018

pH: 6,41

R2:

Reactivo

Conc. Final en PCR 50 ul

Glicerol (%, p/v)

3 %

Tricina

60 mM

DMSO (%, v/v)

5,4 %

KOAc

120 mM

Tween 20 (v/v)

0,015 %

NTQ21-46 A

0,222 μM

ZO5D

0,9 U/μl (45 U/rxn)

UNG

0,2 U/μl (10 U/rxn)

Azida Sódica (p/v)

0,027

dCTPs

400 μM

dGTPs

400 μM

dATPs

400 μM

dUTPs

800 μM

Cebadores/sondas seleccionados de SEQ ID NO 60-76

0,1 μM

SEQ ID NO 42

0,3 μM

SEQ ID NO 43

0,3 μM

SEQ ID NO 44

μM

imagen28

imagen29

imagen30

R1:

R2:

Reactivo

Conc. Final en PCR 50 ul (uM)

Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6,1 ajustado con Ácido Acético)

3’300

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH7

0,018

pH: 6,41

Reactivo

Conc. Final en PCR 50 ul

Glicerol (%, p/v)

3 %

Tricina

60 mM

DMSO (%, v/v)

5,4 %

KOAc

120 mM

Tween 20 (v/v)

0,02 %

Aptámero NTQ21-46 A

0,222 μM

Polimerasa ZO5D

0,9 U/μl (45 U/rxn)

UNG

0,2 U/μl (10 U/rxn)

Azida Sódica (p/v)

0,027

dCTPs

400 μM

dGTPs

400 μM

dATPs

400 μM

dUTPs

800 μM

Cebadores/sondas seleccionados de SEQ ID NO 1-35

0,1 μM-0,3 μM

SEQ ID NO 50

0,3 μM

SEQ ID NO 51

0,3 μM

SEQ ID NO 52

μM

Sensibilidad analítica/LDD

Se preparó un panel de dilución con un Patrón Secundario HIV-1M en plasma EDTA negativo para HIV-1 para

10 volúmenes de entrada de muestra de 200 μl y 500 μl. Cada nivel de concentración se ensayó con 21 copias. Al menos ≥20 copias debían de ser válidas. El LDD se determinó por análisis PROBIT a un índice de acierto de 95 % y ≥ 95 % por análisis de índice de acierto.

Tabla 21: análisis LDD para un volumen de entrada de 200 μl en plasma EDTA

Concentración

Número de copias Número de positivos Índice de acierto

200 cp/ml

21 21 100 %

100 cp/ml

21 21 100 %

80 cp/ml

21 21 100 %

50 cp/ml

21 20 95,2 %

30 cp/ml

21 18 85,7 %

20 cp/ml

21 17 81,0 %

10 cp/ml

21 8 38,1 %

0 cp/ml (control negativo)

21 0 0 %

imagen31

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2