JPH0322997A - 外来プロモーターおよび／またはリーダーペプチドを用いたコレラトキシンｂサブユニットの組換え発現系 - Google Patents
外来プロモーターおよび／またはリーダーペプチドを用いたコレラトキシンｂサブユニットの組換え発現系Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
く産業上の利用分野）
本発明は、組換えＤＮ八法を用いて、コレラトキシンの
結合性サブユニットタンパク質（ＣＴＢ）またはＣＴＢ
へのハイブリッド遺伝子融合タンパク質を含むその誘導
体を外来（非コレラトキシン）プロモーターの制御下に
発現させること、および／または天然リーダーペプチド
ではなく外来リーダーペブチドを有するＣＴＢタンパク
質またはその誘導体を合成して細胞膜の通り抜けを促進
することに関する． （従来の技術） 血清型０１のコレラ＠ （Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒ
ａｅ）は、感染個体の腸内で増殖するとき、腸上皮から
の活性電解質と水の排出を誘発するコレラトキシン（Ｃ
Ｔ）を放出することにより重症の下痢症状を引き起こす
．類似の機構により、他の数種の細菌（例えば大腸菌〉
もＣＴに関係のあるまたは関係のない別のエンテロトキ
シンを放出することにより下痢を起こす． ＣＴは原型の細菌エンテロトキシンである．それは２つ
の型のサブユニット：すなわち分子量２８０００の＾サ
ブユニット１１ｍｌおよびそれぞれが分子量１１６００
のＢサブユニット５個から成るタンパク質である．Ｂサ
ブユニットは強い非共有結合により集合して１個の環を
形威しており、＾サブユニットは弱い非共有相互作用に
よりＢベンタマー環に結合して、恐らくはその璋の中に
部分的に入り込んでいる．これら２つの型のサブユニッ
トは中毒過程において異なる役割を果たしている：すな
わち、Ｂサプユニットは細胞への結合に関与しており、
そして＾サブユニットは直接の毒性活性を担っている．
腸および他の噛乳動物細胞へのトキシン結含、並びに＾
サブユニット（およびその＾１断片）の細胞内作用によ
るアデニル酸シクラーゼの活性化へ導くその後の現象の
分子レベルでの様相はかなり詳細に明らかにされている
（Ｊ．ＨｏｌＢｒｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：４１３
−４１７．１９８１を参照されたい）．コレラ菌による
コレラトキシンの合成、組立ておよび分泌の遺伝学およ
び生化学に関するより最近の情報も利用し得る， ＣＴ
は＾およびＢサブユニットそれぞれの染色体ｍ造遺伝子
によってコードされている．これらの遺伝子はいくつか
の菌株からクローン化され５それらのヌクレオチド配列
が決定された，ＣＴの＾およびＢサブユニットの遺伝子
は単一の転写単位の中に配列されており、＾シストロン
（但＾〉がＢシストロン（ｃｔｘＢ）の上流にある．古
典生物型とエルトール（ＥＩ Ｔａｒ）生物型のコレラ
菌株におけるＣＴ遺伝子の機構に関する研究は、古典生
物型の菌株にＣＴ遺伝子が２コピー数で存在するが、大
部分のエルトール菌株には１コビー数しか存在しないこ
とを示唆している（Ｊ．Ｊ．Ｎｅｋａｌａｎｏｓ ｅｔ
ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ３０８：５５１− ５５７．１９
８３を参照されたい）． ｃ丁の合成はり五発現の多重
性を増大させる遺伝子ｔｏｘＲによりポジティブに調節
される（ＶＬ Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ ＪＪＭｅｋａｌ
ａｎｏｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｉｌ＾Ｃａｄ Ｓｃｉ ｔｌ
ｓ＾，８１ ：３４７１３４７５．１９８４を参照され
たい〉．居捗は転写レベルで作用し、古典生物型とエル
トール生物型の両菌株中に存在している．捷カは恐らく
、リエプロモーター領域とボジティプに相互作用する調
節タンパク質をコードすることによって、０工転写を増
大させるのであろう．大腸菌の熟不安定性エンテロトキ
シン（ＬＴ） （ＬＴのサブユニット構造および機能は
ＣＴと非常に似ているが、同一ではない〉に関する研究
は、＾およびＢサブユニットが初めに成熟サブユニット
タンパク質に先行してリーダーベブチドをもつ前駆物質
として合威されることを明らかにした．これらの前駆物
質はすみやがにプロセッシングを受け（すなわち、リー
ダーへブチドが除去される）、内股を通って細胞周辺腔
（Ｐ ｅｒｉｐｌａｓａ＋）へ移り、そこでＢサブユニ
ット単量体が５量体化され、１〜２分の活性中期（Ｈａ
ｌｆ−ｔｉｍｅ）で＾サブユニットと会合する．トキシ
ン組立ての経路はＢ単量体または小さいオリゴマーと＾
サブユニットとの会合を経て進行すると思われる．ひと
たび完全なトキシンが組み立てられると、トキシンが細
胞周辺腔に残存する大腸菌とは対照的に、コレラ菌にお
いてはトキシンがＢサブユニットドメインと外膜とのあ
る種の相互作用によりコレラ菌ｏ１の外膜を貫通して輸
送（分泌）される（ＴＲ Ｈｉｒｓｔ ＆Ｊ Ｈｏｌａ
ｇｒｅｎ，Ｐｒｏｃ Ｎｉｔｌ＾ｅａｄ Ｓｅｉ ＵＳ
＾ ８４：７４１８７４２２，ｔ９８７； ＳＪＳ Ｈ
ａｒｄｙ ｅｔ ａｌ，ｉｂｉｄ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ，
１９８８を参照されたい）．ＣＴまたはＬＴのＢサブユ
ニットが＾サブユニットの不在下で発現される場合〈数
種のこのような菌株がｃｔｘＡまたはＵ±＾シストロン
における化学的突然変異誘発または組換えＤＮ八法によ
る欠失によってつくられている〉、Ｂサブユニットはペ
ンタマーを形成し、その後完全なトキシンと同じ経路を
通って（ただし、細胞周辺腔での組立てプロセスは明ら
かに少し遅い〉コレラ菌から分泌される（ＴＲ ｌｌｉ
ｒｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ＾ｃｉｄＳｃ
ｉ ｕｓ＾８１：２６４５−２６４９，１９８４；ＳＪ
Ｓ Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ，１逍，ｉｎ ｐｒｅｓｓ
，１９８８を参照されたい）．コレラに対する非経口的
ワクチン注射はささやかな短期間の防御（一般には６ケ
月に満たない期間にわたって５０％を下回る防５ｌｌ）
をもたらしたにすぎなかったので、より効果的に腸免疫
を刺激する経口ワクチンの開発へ注意が向けられた．特
に、このような経口コレラワクチンの一戒分としてのＣ
ＴＢベンタマーに注意が集中した（Ｊ Ｈｏｌｍｇｒｅ
ｎ ｅｔ ａ土．．Ｎａｔｕｒｅ ２６９：６０２−６
０４．１９７７を参照）． Ｃ丁Ｂは、広範囲の実験に
おいてコレラとＬＴエンテロトキシン産生大腸菌が引き
起こす下痢との両方に対して防御を賦与することが分が
った有効な経口免疫化剤である（Ｊ Ｃｌｅｍｅｎｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：１２４−１２７，
１９８６；Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ｉｎ ｐｒｅ
ｓｓ，１９８８を参照）．＾サブユニットからの６サブ
ユニットの分離は毒性への復帰の危険性を排除し、ＣＴ
Ｂは副作用なしで２５０００人以上の人々に経口投与さ
れた．これらの特徴により， ＣＴＢは死滅した全コレ
ラビブリオ菌と共に新しい経口コレラワクチンのｍ要な
成分となった．さらに、ＣＴＢは他の多種多様のペプチ
ドまたは炭水化物抗原用の免疫原性キャリアーとして最
近かなり関心を持たれており、またコレラや大ａ閏によ
る下痢の短期間の予防のためのレセブター遮断薬および
レセプタ一変調薬として用いられている（ＲＩ Ｃｌａ
ｓｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １４９
：４９５−５００，１９８４；ＳＴ ＤｏｎＬａ ｅｔ
ａｌ，ｉｂｉｄ １５７：５５７−５６４．１９８８
・ＳＪ Ｍｃｋｅｎｚｉｅ ａｎｄ ＪＦ Ｈ
ａｌｓｅｙ，Ｊ Ｉｍｓ＋ｕｎｏｌ １３３：１８
１８− １８２４．１９８４．＾−Ｎ Ｓｖｅｎｎｅｒ
ｈｏｌｍ ｅｔ ａ±Ｊ ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ
２４：５８５−５９０．１９８６），これらの発見は
、大規模生産のためにＣＴＢの生産量を高める必要性を
もたらし、理想的にはＣＴＢタンパク質を活性トキシン
から精製しなければならない現行の調製方法（几Ｔａｙ
ｏＬ ｅＬ ａｌ，Ｅｕｒ ＪＢｉｏｅｈｅｍ １１３
：２４９−２５８．１９８１を参照）の欠点をも同時に
回避することを必要とした． 従って、本明細書に開示した戦略および手順を用いて、
本発明者らは、Ｃ丁Ｂ遺伝子〈またはハイブリッド融合
タンパク質の遺伝子〉が強力な外来（非コレラトキシン
）プロモーターの制御下にあるＣＴＢおよびＣＴＢ融合
タンパク質の過剰発現系を構築した．この事に関する我
々の戚功は、我々の実施例の１つに記載されたプロモー
ターの１っ（Ｉ±Ｐ）を用いてこの目的を達成するため
のＪ．Ｊ．Ｍｅｋａｌａｎｏｓら（Ｎａｔｕｒｅ ３０
６＋５５１−５５７．１９８３）の別の方法による以前
の試みが天然リエプロモーターを用いたときよりも少な
いＣＴＢを発現して失敗したと報じられているように、
これらの以前の試みと対照を成すものである． （発明の構成） ＃Ｉ換えＤＮ八法を用いることにより、本発明者らは、
コレラトキシンのＢサプユニット（ＣＴＢ）またはＣＴ
Ｂの融合タンパク質を含むＣＴＢ誘導体のための過剰発
現系を達成した．特徴とし，て、これらの系ではＣＴＢ
またはＣＴＢ誘導体タンパク質をコードする遺伝子の発
現が、広い宿主域のプラスミドベクター中の強力な外来
（非コレラトキシン）プロモーターの制御下に置かれた
．この遺伝子構築物は天然ＣＴプロモーターおよびＬｏ
ｘＲ発現調節系と無関係である．このような過剰発現系
が２つ例示され、これらのうちの一方においてＣＴＢは
ｔａｃＰプロモーターのＩｌ！Ｗ下にあって誘導可能な
または構成的な方法で発現され、そして他方においては
ＣＴＢ発現がＴ７ＲＮ＾ボリメラーゼ依存性プロモータ
ーにより制御される．これらの実施例では、過剰発現を
可能にする遺伝子構築物が広い宿主域のブラスミド中に
存在する．これはこれらのブラスミドを保有するさまざ
まな細Ｅｌ種（例えば大腸菌やコレラ菌）からのＣＴＢ
またはＣＴＢ誘導体の高レベル生産を可能にする．融合
タンパク質の形をしたＣＴＢ誘導体を生産するための外
来プロモーター過剰発現系の利用可能性もまた、大腸薗
の熱安定性エンテロトキシン（ＳＴａ＞から誘導された
非毒性デカベプチドをコードするき成ＤＮ＾配列のＣＴ
Ｂ遺伝子への融き、およびエ，ア。％−９−／１１制御
−Ｆ７ｏヨコフ菌によ。遺伝子融合タンパク質の発現に
よって例示されるであろう． 宅−筏および咥毘 本明細書中で用いる用語“ＣＴＢ”および“ＣＴＢ誘導
体”は、本明Ｍｌにおいて開示したプラスミドｐＪｓ１
６２によってコードされるＣＴＢタンパク質に対して請
導された免疫証清（抗血清）により認識され得る特性を
有するタンパク質またはベブチド（大腸菌ＬＴＤを除く
〉を意味する． “外来プロモーター”なる用開は天然ｃｔｘプロモータ
ーと異なることにより特徴づけられるプロモーターを意
味する． “外来リーダーペプチド”なる用語は、コレラトキシン
サブユニットの天然リーダーベプチドと異なることによ
り特徴づけられ、細胞膜を貫通するタンパク質の輸送（
本明細書ではＣＴＢまたはＣＴ［ｌ誘導体の輸送〉を促
進するタンパク質分子のべブチド配列を意味する． 例えば、Ｅ−Ｌ ｌｌｌｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ
（：ｅｎｅｓ ｔｏ ＣｌｏｎｅｓＶＣＩＩ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）において
用いられる標準命名法はＤＮ八制限エンドヌクレアーゼ
、制限部位および制限配列を定義するために堅持される
．オリゴデオキシヌクレオチドおよびアミノ酸は慣用の
一文字略語および三文字略語を用いて記述される． ここで、図面について説明する． 第１図Ａ：ＬＴＩｌ３１！伝子とＣＴＢ遺伝子との融合
接点．白の正方形で下線が施されているヌクレオチドは
ＬＴＢ３ｆｉ伝子からのＩＩＮ＾を示し、黒の正方形で
下線が施されているものはリンカーの含或オリゴデオキ
シヌクレオチド部分であり、そして三角形で下線が施さ
れているものはＣＴＢ遺伝子のＤＮＡを艮す．アミノ酸
の番号付けはそれぞれの成熟タンパク質の第一アミノ酸
（＋１）に対してそれらの前方の位置を示す．星印は２
つの融合遺伝子のいずれによっても本来コードされない
アミノ酸を示す．合成リンカーはＳａ０１部位を修復し
て、Ｓａｔ ｌ認識配列を導入した．Ｍｌ＆に、ｔａｃ
ＰからＣＴＢをコードするブラスミドが得られたく以下
のＢを参照）．示した配列はジデオキシヌクレオチド塩
基配列決定法により確かめた， ［ｌ：ｔａｃＰプロモ
ーターの制御下にあるＣＴＤ選伝子を有するプラスミド
ｐＪｓ１６２の地図．このブラスミドはＲＳＦ １０１
０９製起点を有し、約１０．２ｋｂの大きさである．大
きい矢印はｔａｃＰプロモーターの位置を示す．星印の
あるボックスは成熟ＣＴＢをコードする遺伝子部分を表
す．リーダーベプチド（ＬＴＢ由来）をコードする部分
は黒のボックスで表される．アンビシリン耐性およびｌ
ａｅＩ 遺伝子のおおよその位置も示される． 第２図：ブラスミドｐＪｓ１６２中のＣＴＢ遺伝子のヌ
クレオチド配列．アンチセンス鎖のみが示されており、
コードされるアミノ酸はそれらのそれぞれのコドンの上
に示す．＋１を付けたＴｈｒ残基は成熟ＣＴＢ中に通常
見られる第一アミノ酸であり、一方＝７位（またはかっ
こ内の＋１位）の＾ｉ残基は成熟ＬＴＢ中の第一アミノ
酸である．２つのタンパク質のどちらにも本来存在しな
いアミノ酸には星印が付いている．存在しうるリボソー
ム結合部位（シャインーダルガルノ配列）には下線が引
いてある（ＳＤ） ，垂直の矢印は成熟組換えＣＴ［ｌ
を放出するた鰭 めに開裂されるペブチド一合を示す．我々のＣ丁ＢＤＮ
Ａ配列によって推定されたアミノ酸と不一致の５８９８
ＣＴＢタンパク質中のアミノ酸はかっこ内に示され、
我々のものおよび古典５６９Ｂ ＣＴＨのものと異なる
エルトール株からのＣＴＢ中のアミノ酸残基は太字でか
っこ内に示される． 第３図：Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＪＢＫ７０（ｐＪＳ
１６２）によるＣＴロ発現ＩＰＴＧ誘導．精製した５６
９８ ＣＴＢタンパク質の均等物として発現されたＣＴ
Ｂのレベル（縦座標〉は特異的モノクローナル抗体を用
いるＧＨ ｌ − ＥＬＩＳ八により測定した．細胞ペ
レット中の実際の濃度はグラフに示されるものより１０
倍低かった（ＩＩｌｌ胞ｘｌＯ），第４図：煮沸および
非煮沸ＣＴＢ試料のＰＡ（；Ｅ，等量の組換えＣ丁Ｂタ
ンパク質（レーンｌおよび２）または標準５６９８ Ｃ
ＴＢ（レーン３および４）は、試料緩衝液中１００℃（
レーン１および３）または室温（レーン２および４）で
５分間処理した後、１３．５％ポリアクリルアミドーＮ
ａＤｏｄＳＯ．ゲルで電気泳動した．タンパク質凛品の
おおよその大きさ（κＤａ）をもつ分子量マーカー（Ｂ
ｉｏ−Ｒｅｄ社〉が示される（１４１１１）， ５６９
８ＣＴＢと比べたときの組換えＣＴＢの比較的遅い泳動
はモノマー（Ｂｍ）として試験したときほんのわずかに
気がつくが、オリゴマー（ベンタマー）体（Ｂｐ）では
より明白である． 第５図：ウサギ抗血清（ウエル＾およびＥ：抗組換えＣ
ＴＢ、ウエルＣ：抗５６９Ｂ ＣＴＢ）と反応させタ５
６９ロＣＴＢ（ウエルＢおよびＦ）および組換えＣ丁Ｂ
（ウエルＣおよび０）のオクテルロニーゲル内二重拡散
分析．第６図： ＣＴＢへのＳＴａ閏連デカベプチドの
融合．Ｓａｃ ｌおよびＸｓａ ｌ制限末端に適合しう
る一本鎖延長部を有する合戒オリゴデオキシヌクレオチ
ド（肉太の大文字で示す）は、ｐＪｓ１６２中のＣＴＩ
１のアミノ末端をコードするＤＮＡ領域に挿入した．合
戒オリゴヌクレオチドの神入はＣＴＢｆｆｉ伝子のもと
の読み枠を維持するように行い、その結果としてＣＴＢ
（第一アミノ酸を番号十ｌで示す）のアミノ末端にＳＴ
ａ関連ペプチド（星印で示す）を含むベプチド延長部を
有する融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子
が得られた．〈＋〉で示されるアミノ酸は、ＳＴａ関連
デカベプチドの部分を構成するとは見なされない上記オ
リゴヌクレオチドによってコードされるアミノ酸である
．第一アミノ酸（＾ｒｇ＞の上流に、ＬＴＢをコードす
る遺伝子由来のＣＴＢのためのリーダーベブチド、リポ
ソーム結合部位（Ｓ／Ｄ）、およびハイブリッド遺伝子
発現のためのｔａｅＰプロモーターが存在する（第ＩＢ
図のブラスミドｐＪｓ１６２を参照〉． 第７図：ブラスミドｐＪＳ８を保有するＶ．ｃｈｏｌｅ
ｒａｅＪＢＫ７０によるＳ’ｂ関連デカベブチドーＣＴ
Ｂハイブリッド遺伝子発現のＩＰＴ（；講導。細胞は誘
導物質の不在下に液体培地中で００１。＝０．５へ増殖
させ、次いで表示した濃度でＩＰＴ（；を加え、細菌培
養をさらに４時間続けた後細Ｅｌｌ細胞と培養上清とを
本文に記載した通りに収穫した．ハイブリッドタンパク
質のレベル（［Ｊ！標》は、特異的モノクローナル抗Ｓ
Ｔａ抗体（スウェーデン国イエーテボリ、＾−Ｈ Ｓｖ
ｅｎｎｅｒｂｏｌｓｉ博士から親切にも提供されたＳ丁
１：３）を用いるＣＮＩ−ＥＬＩＳ＾により測定した．
精製したＳＴａ関連デカベブチドーＣＴＢハイブリッド
タンパク質調製物を標準として使用した．星印は上清中
のハイブリッドタンパク質の濃度を示し、白の正方形は
超音波処理による細胞の破壊後に測定した細胞に関連し
た濃度を表す。
結合性サブユニットタンパク質（ＣＴＢ）またはＣＴＢ
へのハイブリッド遺伝子融合タンパク質を含むその誘導
体を外来（非コレラトキシン）プロモーターの制御下に
発現させること、および／または天然リーダーペプチド
ではなく外来リーダーペブチドを有するＣＴＢタンパク
質またはその誘導体を合成して細胞膜の通り抜けを促進
することに関する． （従来の技術） 血清型０１のコレラ＠ （Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒ
ａｅ）は、感染個体の腸内で増殖するとき、腸上皮から
の活性電解質と水の排出を誘発するコレラトキシン（Ｃ
Ｔ）を放出することにより重症の下痢症状を引き起こす
．類似の機構により、他の数種の細菌（例えば大腸菌〉
もＣＴに関係のあるまたは関係のない別のエンテロトキ
シンを放出することにより下痢を起こす． ＣＴは原型の細菌エンテロトキシンである．それは２つ
の型のサブユニット：すなわち分子量２８０００の＾サ
ブユニット１１ｍｌおよびそれぞれが分子量１１６００
のＢサブユニット５個から成るタンパク質である．Ｂサ
ブユニットは強い非共有結合により集合して１個の環を
形威しており、＾サブユニットは弱い非共有相互作用に
よりＢベンタマー環に結合して、恐らくはその璋の中に
部分的に入り込んでいる．これら２つの型のサブユニッ
トは中毒過程において異なる役割を果たしている：すな
わち、Ｂサプユニットは細胞への結合に関与しており、
そして＾サブユニットは直接の毒性活性を担っている．
腸および他の噛乳動物細胞へのトキシン結含、並びに＾
サブユニット（およびその＾１断片）の細胞内作用によ
るアデニル酸シクラーゼの活性化へ導くその後の現象の
分子レベルでの様相はかなり詳細に明らかにされている
（Ｊ．ＨｏｌＢｒｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：４１３
−４１７．１９８１を参照されたい）．コレラ菌による
コレラトキシンの合成、組立ておよび分泌の遺伝学およ
び生化学に関するより最近の情報も利用し得る， ＣＴ
は＾およびＢサブユニットそれぞれの染色体ｍ造遺伝子
によってコードされている．これらの遺伝子はいくつか
の菌株からクローン化され５それらのヌクレオチド配列
が決定された，ＣＴの＾およびＢサブユニットの遺伝子
は単一の転写単位の中に配列されており、＾シストロン
（但＾〉がＢシストロン（ｃｔｘＢ）の上流にある．古
典生物型とエルトール（ＥＩ Ｔａｒ）生物型のコレラ
菌株におけるＣＴ遺伝子の機構に関する研究は、古典生
物型の菌株にＣＴ遺伝子が２コピー数で存在するが、大
部分のエルトール菌株には１コビー数しか存在しないこ
とを示唆している（Ｊ．Ｊ．Ｎｅｋａｌａｎｏｓ ｅｔ
ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ３０８：５５１− ５５７．１９
８３を参照されたい）． ｃ丁の合成はり五発現の多重
性を増大させる遺伝子ｔｏｘＲによりポジティブに調節
される（ＶＬ Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ ＪＪＭｅｋａｌ
ａｎｏｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｉｌ＾Ｃａｄ Ｓｃｉ ｔｌ
ｓ＾，８１ ：３４７１３４７５．１９８４を参照され
たい〉．居捗は転写レベルで作用し、古典生物型とエル
トール生物型の両菌株中に存在している．捷カは恐らく
、リエプロモーター領域とボジティプに相互作用する調
節タンパク質をコードすることによって、０工転写を増
大させるのであろう．大腸菌の熟不安定性エンテロトキ
シン（ＬＴ） （ＬＴのサブユニット構造および機能は
ＣＴと非常に似ているが、同一ではない〉に関する研究
は、＾およびＢサブユニットが初めに成熟サブユニット
タンパク質に先行してリーダーベブチドをもつ前駆物質
として合威されることを明らかにした．これらの前駆物
質はすみやがにプロセッシングを受け（すなわち、リー
ダーへブチドが除去される）、内股を通って細胞周辺腔
（Ｐ ｅｒｉｐｌａｓａ＋）へ移り、そこでＢサブユニ
ット単量体が５量体化され、１〜２分の活性中期（Ｈａ
ｌｆ−ｔｉｍｅ）で＾サブユニットと会合する．トキシ
ン組立ての経路はＢ単量体または小さいオリゴマーと＾
サブユニットとの会合を経て進行すると思われる．ひと
たび完全なトキシンが組み立てられると、トキシンが細
胞周辺腔に残存する大腸菌とは対照的に、コレラ菌にお
いてはトキシンがＢサブユニットドメインと外膜とのあ
る種の相互作用によりコレラ菌ｏ１の外膜を貫通して輸
送（分泌）される（ＴＲ Ｈｉｒｓｔ ＆Ｊ Ｈｏｌａ
ｇｒｅｎ，Ｐｒｏｃ Ｎｉｔｌ＾ｅａｄ Ｓｅｉ ＵＳ
＾ ８４：７４１８７４２２，ｔ９８７； ＳＪＳ Ｈ
ａｒｄｙ ｅｔ ａｌ，ｉｂｉｄ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ，
１９８８を参照されたい）．ＣＴまたはＬＴのＢサブユ
ニットが＾サブユニットの不在下で発現される場合〈数
種のこのような菌株がｃｔｘＡまたはＵ±＾シストロン
における化学的突然変異誘発または組換えＤＮ八法によ
る欠失によってつくられている〉、Ｂサブユニットはペ
ンタマーを形成し、その後完全なトキシンと同じ経路を
通って（ただし、細胞周辺腔での組立てプロセスは明ら
かに少し遅い〉コレラ菌から分泌される（ＴＲ ｌｌｉ
ｒｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ＾ｃｉｄＳｃ
ｉ ｕｓ＾８１：２６４５−２６４９，１９８４；ＳＪ
Ｓ Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ，１逍，ｉｎ ｐｒｅｓｓ
，１９８８を参照されたい）．コレラに対する非経口的
ワクチン注射はささやかな短期間の防御（一般には６ケ
月に満たない期間にわたって５０％を下回る防５ｌｌ）
をもたらしたにすぎなかったので、より効果的に腸免疫
を刺激する経口ワクチンの開発へ注意が向けられた．特
に、このような経口コレラワクチンの一戒分としてのＣ
ＴＢベンタマーに注意が集中した（Ｊ Ｈｏｌｍｇｒｅ
ｎ ｅｔ ａ土．．Ｎａｔｕｒｅ ２６９：６０２−６
０４．１９７７を参照）． Ｃ丁Ｂは、広範囲の実験に
おいてコレラとＬＴエンテロトキシン産生大腸菌が引き
起こす下痢との両方に対して防御を賦与することが分が
った有効な経口免疫化剤である（Ｊ Ｃｌｅｍｅｎｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：１２４−１２７，
１９８６；Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ｉｎ ｐｒｅ
ｓｓ，１９８８を参照）．＾サブユニットからの６サブ
ユニットの分離は毒性への復帰の危険性を排除し、ＣＴ
Ｂは副作用なしで２５０００人以上の人々に経口投与さ
れた．これらの特徴により， ＣＴＢは死滅した全コレ
ラビブリオ菌と共に新しい経口コレラワクチンのｍ要な
成分となった．さらに、ＣＴＢは他の多種多様のペプチ
ドまたは炭水化物抗原用の免疫原性キャリアーとして最
近かなり関心を持たれており、またコレラや大ａ閏によ
る下痢の短期間の予防のためのレセブター遮断薬および
レセプタ一変調薬として用いられている（ＲＩ Ｃｌａ
ｓｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １４９
：４９５−５００，１９８４；ＳＴ ＤｏｎＬａ ｅｔ
ａｌ，ｉｂｉｄ １５７：５５７−５６４．１９８８
・ＳＪ Ｍｃｋｅｎｚｉｅ ａｎｄ ＪＦ Ｈ
ａｌｓｅｙ，Ｊ Ｉｍｓ＋ｕｎｏｌ １３３：１８
１８− １８２４．１９８４．＾−Ｎ Ｓｖｅｎｎｅｒ
ｈｏｌｍ ｅｔ ａ±Ｊ ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ
２４：５８５−５９０．１９８６），これらの発見は
、大規模生産のためにＣＴＢの生産量を高める必要性を
もたらし、理想的にはＣＴＢタンパク質を活性トキシン
から精製しなければならない現行の調製方法（几Ｔａｙ
ｏＬ ｅＬ ａｌ，Ｅｕｒ ＪＢｉｏｅｈｅｍ １１３
：２４９−２５８．１９８１を参照）の欠点をも同時に
回避することを必要とした． 従って、本明細書に開示した戦略および手順を用いて、
本発明者らは、Ｃ丁Ｂ遺伝子〈またはハイブリッド融合
タンパク質の遺伝子〉が強力な外来（非コレラトキシン
）プロモーターの制御下にあるＣＴＢおよびＣＴＢ融合
タンパク質の過剰発現系を構築した．この事に関する我
々の戚功は、我々の実施例の１つに記載されたプロモー
ターの１っ（Ｉ±Ｐ）を用いてこの目的を達成するため
のＪ．Ｊ．Ｍｅｋａｌａｎｏｓら（Ｎａｔｕｒｅ ３０
６＋５５１−５５７．１９８３）の別の方法による以前
の試みが天然リエプロモーターを用いたときよりも少な
いＣＴＢを発現して失敗したと報じられているように、
これらの以前の試みと対照を成すものである． （発明の構成） ＃Ｉ換えＤＮ八法を用いることにより、本発明者らは、
コレラトキシンのＢサプユニット（ＣＴＢ）またはＣＴ
Ｂの融合タンパク質を含むＣＴＢ誘導体のための過剰発
現系を達成した．特徴とし，て、これらの系ではＣＴＢ
またはＣＴＢ誘導体タンパク質をコードする遺伝子の発
現が、広い宿主域のプラスミドベクター中の強力な外来
（非コレラトキシン）プロモーターの制御下に置かれた
．この遺伝子構築物は天然ＣＴプロモーターおよびＬｏ
ｘＲ発現調節系と無関係である．このような過剰発現系
が２つ例示され、これらのうちの一方においてＣＴＢは
ｔａｃＰプロモーターのＩｌ！Ｗ下にあって誘導可能な
または構成的な方法で発現され、そして他方においては
ＣＴＢ発現がＴ７ＲＮ＾ボリメラーゼ依存性プロモータ
ーにより制御される．これらの実施例では、過剰発現を
可能にする遺伝子構築物が広い宿主域のブラスミド中に
存在する．これはこれらのブラスミドを保有するさまざ
まな細Ｅｌ種（例えば大腸菌やコレラ菌）からのＣＴＢ
またはＣＴＢ誘導体の高レベル生産を可能にする．融合
タンパク質の形をしたＣＴＢ誘導体を生産するための外
来プロモーター過剰発現系の利用可能性もまた、大腸薗
の熱安定性エンテロトキシン（ＳＴａ＞から誘導された
非毒性デカベプチドをコードするき成ＤＮ＾配列のＣＴ
Ｂ遺伝子への融き、およびエ，ア。％−９−／１１制御
−Ｆ７ｏヨコフ菌によ。遺伝子融合タンパク質の発現に
よって例示されるであろう． 宅−筏および咥毘 本明細書中で用いる用語“ＣＴＢ”および“ＣＴＢ誘導
体”は、本明Ｍｌにおいて開示したプラスミドｐＪｓ１
６２によってコードされるＣＴＢタンパク質に対して請
導された免疫証清（抗血清）により認識され得る特性を
有するタンパク質またはベブチド（大腸菌ＬＴＤを除く
〉を意味する． “外来プロモーター”なる用開は天然ｃｔｘプロモータ
ーと異なることにより特徴づけられるプロモーターを意
味する． “外来リーダーペプチド”なる用語は、コレラトキシン
サブユニットの天然リーダーベプチドと異なることによ
り特徴づけられ、細胞膜を貫通するタンパク質の輸送（
本明細書ではＣＴＢまたはＣＴ［ｌ誘導体の輸送〉を促
進するタンパク質分子のべブチド配列を意味する． 例えば、Ｅ−Ｌ ｌｌｌｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ
（：ｅｎｅｓ ｔｏ ＣｌｏｎｅｓＶＣＩＩ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）において
用いられる標準命名法はＤＮ八制限エンドヌクレアーゼ
、制限部位および制限配列を定義するために堅持される
．オリゴデオキシヌクレオチドおよびアミノ酸は慣用の
一文字略語および三文字略語を用いて記述される． ここで、図面について説明する． 第１図Ａ：ＬＴＩｌ３１！伝子とＣＴＢ遺伝子との融合
接点．白の正方形で下線が施されているヌクレオチドは
ＬＴＢ３ｆｉ伝子からのＩＩＮ＾を示し、黒の正方形で
下線が施されているものはリンカーの含或オリゴデオキ
シヌクレオチド部分であり、そして三角形で下線が施さ
れているものはＣＴＢ遺伝子のＤＮＡを艮す．アミノ酸
の番号付けはそれぞれの成熟タンパク質の第一アミノ酸
（＋１）に対してそれらの前方の位置を示す．星印は２
つの融合遺伝子のいずれによっても本来コードされない
アミノ酸を示す．合成リンカーはＳａ０１部位を修復し
て、Ｓａｔ ｌ認識配列を導入した．Ｍｌ＆に、ｔａｃ
ＰからＣＴＢをコードするブラスミドが得られたく以下
のＢを参照）．示した配列はジデオキシヌクレオチド塩
基配列決定法により確かめた， ［ｌ：ｔａｃＰプロモ
ーターの制御下にあるＣＴＤ選伝子を有するプラスミド
ｐＪｓ１６２の地図．このブラスミドはＲＳＦ １０１
０９製起点を有し、約１０．２ｋｂの大きさである．大
きい矢印はｔａｃＰプロモーターの位置を示す．星印の
あるボックスは成熟ＣＴＢをコードする遺伝子部分を表
す．リーダーベプチド（ＬＴＢ由来）をコードする部分
は黒のボックスで表される．アンビシリン耐性およびｌ
ａｅＩ 遺伝子のおおよその位置も示される． 第２図：ブラスミドｐＪｓ１６２中のＣＴＢ遺伝子のヌ
クレオチド配列．アンチセンス鎖のみが示されており、
コードされるアミノ酸はそれらのそれぞれのコドンの上
に示す．＋１を付けたＴｈｒ残基は成熟ＣＴＢ中に通常
見られる第一アミノ酸であり、一方＝７位（またはかっ
こ内の＋１位）の＾ｉ残基は成熟ＬＴＢ中の第一アミノ
酸である．２つのタンパク質のどちらにも本来存在しな
いアミノ酸には星印が付いている．存在しうるリボソー
ム結合部位（シャインーダルガルノ配列）には下線が引
いてある（ＳＤ） ，垂直の矢印は成熟組換えＣＴ［ｌ
を放出するた鰭 めに開裂されるペブチド一合を示す．我々のＣ丁ＢＤＮ
Ａ配列によって推定されたアミノ酸と不一致の５８９８
ＣＴＢタンパク質中のアミノ酸はかっこ内に示され、
我々のものおよび古典５６９Ｂ ＣＴＨのものと異なる
エルトール株からのＣＴＢ中のアミノ酸残基は太字でか
っこ内に示される． 第３図：Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＪＢＫ７０（ｐＪＳ
１６２）によるＣＴロ発現ＩＰＴＧ誘導．精製した５６
９８ ＣＴＢタンパク質の均等物として発現されたＣＴ
Ｂのレベル（縦座標〉は特異的モノクローナル抗体を用
いるＧＨ ｌ − ＥＬＩＳ八により測定した．細胞ペ
レット中の実際の濃度はグラフに示されるものより１０
倍低かった（ＩＩｌｌ胞ｘｌＯ），第４図：煮沸および
非煮沸ＣＴＢ試料のＰＡ（；Ｅ，等量の組換えＣ丁Ｂタ
ンパク質（レーンｌおよび２）または標準５６９８ Ｃ
ＴＢ（レーン３および４）は、試料緩衝液中１００℃（
レーン１および３）または室温（レーン２および４）で
５分間処理した後、１３．５％ポリアクリルアミドーＮ
ａＤｏｄＳＯ．ゲルで電気泳動した．タンパク質凛品の
おおよその大きさ（κＤａ）をもつ分子量マーカー（Ｂ
ｉｏ−Ｒｅｄ社〉が示される（１４１１１）， ５６９
８ＣＴＢと比べたときの組換えＣＴＢの比較的遅い泳動
はモノマー（Ｂｍ）として試験したときほんのわずかに
気がつくが、オリゴマー（ベンタマー）体（Ｂｐ）では
より明白である． 第５図：ウサギ抗血清（ウエル＾およびＥ：抗組換えＣ
ＴＢ、ウエルＣ：抗５６９Ｂ ＣＴＢ）と反応させタ５
６９ロＣＴＢ（ウエルＢおよびＦ）および組換えＣ丁Ｂ
（ウエルＣおよび０）のオクテルロニーゲル内二重拡散
分析．第６図： ＣＴＢへのＳＴａ閏連デカベプチドの
融合．Ｓａｃ ｌおよびＸｓａ ｌ制限末端に適合しう
る一本鎖延長部を有する合戒オリゴデオキシヌクレオチ
ド（肉太の大文字で示す）は、ｐＪｓ１６２中のＣＴＩ
１のアミノ末端をコードするＤＮＡ領域に挿入した．合
戒オリゴヌクレオチドの神入はＣＴＢｆｆｉ伝子のもと
の読み枠を維持するように行い、その結果としてＣＴＢ
（第一アミノ酸を番号十ｌで示す）のアミノ末端にＳＴ
ａ関連ペプチド（星印で示す）を含むベプチド延長部を
有する融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子
が得られた．〈＋〉で示されるアミノ酸は、ＳＴａ関連
デカベプチドの部分を構成するとは見なされない上記オ
リゴヌクレオチドによってコードされるアミノ酸である
．第一アミノ酸（＾ｒｇ＞の上流に、ＬＴＢをコードす
る遺伝子由来のＣＴＢのためのリーダーベブチド、リポ
ソーム結合部位（Ｓ／Ｄ）、およびハイブリッド遺伝子
発現のためのｔａｅＰプロモーターが存在する（第ＩＢ
図のブラスミドｐＪｓ１６２を参照〉． 第７図：ブラスミドｐＪＳ８を保有するＶ．ｃｈｏｌｅ
ｒａｅＪＢＫ７０によるＳ’ｂ関連デカベブチドーＣＴ
Ｂハイブリッド遺伝子発現のＩＰＴ（；講導。細胞は誘
導物質の不在下に液体培地中で００１。＝０．５へ増殖
させ、次いで表示した濃度でＩＰＴ（；を加え、細菌培
養をさらに４時間続けた後細Ｅｌｌ細胞と培養上清とを
本文に記載した通りに収穫した．ハイブリッドタンパク
質のレベル（［Ｊ！標》は、特異的モノクローナル抗Ｓ
Ｔａ抗体（スウェーデン国イエーテボリ、＾−Ｈ Ｓｖ
ｅｎｎｅｒｂｏｌｓｉ博士から親切にも提供されたＳ丁
１：３）を用いるＣＮＩ−ＥＬＩＳ＾により測定した．
精製したＳＴａ関連デカベブチドーＣＴＢハイブリッド
タンパク質調製物を標準として使用した．星印は上清中
のハイブリッドタンパク質の濃度を示し、白の正方形は
超音波処理による細胞の破壊後に測定した細胞に関連し
た濃度を表す。
第８図：ドデシル硫酸ナトリウムーボリアクリルアミド
ゲル電気泳動、それに続くニトロセルロース紙への分離
したタンパク質の電気的移行後のＳＴａ関連デカペブチ
ドーＣＴＢハイブリッドタンパク質のイムノブロッティ
ング分析．レーン＾〜Ｄは非煮沸精１！５６９８ Ｃ丁
Ｂ（ｌｚ − ンＡ）、煮沸ＣＴＢ（レ− ンＢ）、非
煮沸ＳＴａ関連デカベブチドーＣＴＢ （レーンＣ〉お
よび煮沸ＳＴａ関連デカベブチドーＣＴＢ （レーンＤ
〉についての抗コレラトキシンモノクローナル抗体Ｗｉ
７５による発現後の反応パターンを示す．レーンＥ〜Ｈ
は抗ＳＴａモノクローナル抗体１：３による発現後に同
一タンパク質について得られた反応パターンを示す、矢
印は同一ゲル上を泳動させた既知分子量（キロダルトン
で示す）の標準タンパク質の泳動位置を表す． （実施例〉 理論的考察および予備実験に基づいて、我々は、外来〈
非コレラトキシン〉プロモーターからのＣＴロの過剰発
現が、もしもＣＴＢ遺伝子を出来るだけ外来プロモータ
ーの近くに置き、理想的にはそのプロモーターとＣＴＢ
３１！伝子との間にコレラ菌由来の非ＣＴＢコードＤＮ
Ａを存在させないならば、達成しうるかもしれないと考
えた．本実施例では、この戦略を用いて、ＣＴＢ遺伝子
を誘導可能なｔａｃＰプロモーターの発現制御下におく
ことによって、ＣＴＢ生産のための好結果の過剰発現系
を構築する方法について説明する． Ｅ．ｃｏ！ｉのＬＴｔｌリーダーをコードするＤＮＡは
、リボソーム結合部位の上流近傍のその５′末端に１１
１１のＥｃｏＲ Ｉ制限部位を有し、この部位はＬＴＢ
遺伝子を強力なＩ±Ｐプロモーターの後に挿入してプラ
スミド，８８８８８を作製するために最近使用された（
Ｍ Ｓａｎｄｋｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂａｅｔｅ
ｒｉｏｌ １８９：４５７０−４５７６．１９８７）
，この戦略的に存在するＥｅｏＲ Ｉ部位（ＣＴＢ遺伝
子中には存在しない〉を利用してＣＴＢ発現を同一グロ
モーターの制御下におくために、我々は成熟ＣＴＢタン
パク質を広い宿主域のブラスミドｐＮＮ［＋６８中のＬ
Ｔ［＋のリーダーベブチドに遺伝子工学的に融きさせる
ことに決めた，ｐｃＶＤ３０（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ
０１０３９５株，古典生物型、オガワ血清型に由来する
〉からのＣＴＢＩ伝子はそのリーダーベブチドのアミノ
酸（ａａ）１８の位置にＮｄｅ ｌ部位を有し、一方Ｌ
ＴＢｉｔ伝子は成熟タンパク質の始めにＳａｃ Ｉ認識
配列を有する， ＣＴＢ遺伝子をその５ ′Ｎｄｅ ｌ
末端でＬＴＢｉ伝子中（７１３ ′Ｓａｃ ！末端に第
１＾図に示すような合戒リンカーを介して融合させると
． ＣＴＢリンカーペブチドがＬＴＢ中のそれによって
置き換えられた。得られたプラスミドｐＪｓ１８２（第
１Ｂ図参照）はｔａｅＰプロモーターの下流にＥｃｏＲ
Ｉ −ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮ＾セグメントとしてハイ
ブリッドＣＴＢ３ｆｉ伝子を含んでいた．以下の手順は
前記の構築物を得るために用いられた， Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩ株中のｐＮＭ８８８プラスミドは親切にも
ウメア（ＵｍｅＡ）大学のＭ．Ｓａｎｄｑｕｉｓｔ氏か
ら提供された。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ株中のプラス
ミドｐＣＶＤ３０は米国ボルチモア、メリーランド大学
のＪ．Ｋａｐｅｒｊｌ士から得られた。（これらのブラ
スミドの詳細な記述については、Ｍ．Ｓａｎｄｑｕｉｓ
Ｌ ｅｔ ａｌ ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒａｔ １６９：４
５７０−４５７６．１９８７およびＪｕｌ Ｋａｐｅｒ
ｅｔ ａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ８ｙ ２：３４５
−３４９．１９８４を参照されたい．〉ＬＴＢリーダー
のＳａｃ １ ３ ′末端をＣＴＢの５ ′Ｎｄｅ ｌ
配列へ接合するために用いた非リン酸化オリゴデオキシ
ヌクレオチドはウプサラ大学、バイオメディカルセンタ
ー、免疫学部から一本鎖として購入した。
ゲル電気泳動、それに続くニトロセルロース紙への分離
したタンパク質の電気的移行後のＳＴａ関連デカペブチ
ドーＣＴＢハイブリッドタンパク質のイムノブロッティ
ング分析．レーン＾〜Ｄは非煮沸精１！５６９８ Ｃ丁
Ｂ（ｌｚ − ンＡ）、煮沸ＣＴＢ（レ− ンＢ）、非
煮沸ＳＴａ関連デカベブチドーＣＴＢ （レーンＣ〉お
よび煮沸ＳＴａ関連デカベブチドーＣＴＢ （レーンＤ
〉についての抗コレラトキシンモノクローナル抗体Ｗｉ
７５による発現後の反応パターンを示す．レーンＥ〜Ｈ
は抗ＳＴａモノクローナル抗体１：３による発現後に同
一タンパク質について得られた反応パターンを示す、矢
印は同一ゲル上を泳動させた既知分子量（キロダルトン
で示す）の標準タンパク質の泳動位置を表す． （実施例〉 理論的考察および予備実験に基づいて、我々は、外来〈
非コレラトキシン〉プロモーターからのＣＴロの過剰発
現が、もしもＣＴＢ遺伝子を出来るだけ外来プロモータ
ーの近くに置き、理想的にはそのプロモーターとＣＴＢ
３１！伝子との間にコレラ菌由来の非ＣＴＢコードＤＮ
Ａを存在させないならば、達成しうるかもしれないと考
えた．本実施例では、この戦略を用いて、ＣＴＢ遺伝子
を誘導可能なｔａｃＰプロモーターの発現制御下におく
ことによって、ＣＴＢ生産のための好結果の過剰発現系
を構築する方法について説明する． Ｅ．ｃｏ！ｉのＬＴｔｌリーダーをコードするＤＮＡは
、リボソーム結合部位の上流近傍のその５′末端に１１
１１のＥｃｏＲ Ｉ制限部位を有し、この部位はＬＴＢ
遺伝子を強力なＩ±Ｐプロモーターの後に挿入してプラ
スミド，８８８８８を作製するために最近使用された（
Ｍ Ｓａｎｄｋｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂａｅｔｅ
ｒｉｏｌ １８９：４５７０−４５７６．１９８７）
，この戦略的に存在するＥｅｏＲ Ｉ部位（ＣＴＢ遺伝
子中には存在しない〉を利用してＣＴＢ発現を同一グロ
モーターの制御下におくために、我々は成熟ＣＴＢタン
パク質を広い宿主域のブラスミドｐＮＮ［＋６８中のＬ
Ｔ［＋のリーダーベブチドに遺伝子工学的に融きさせる
ことに決めた，ｐｃＶＤ３０（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ
０１０３９５株，古典生物型、オガワ血清型に由来する
〉からのＣＴＢＩ伝子はそのリーダーベブチドのアミノ
酸（ａａ）１８の位置にＮｄｅ ｌ部位を有し、一方Ｌ
ＴＢｉｔ伝子は成熟タンパク質の始めにＳａｃ Ｉ認識
配列を有する， ＣＴＢ遺伝子をその５ ′Ｎｄｅ ｌ
末端でＬＴＢｉ伝子中（７１３ ′Ｓａｃ ！末端に第
１＾図に示すような合戒リンカーを介して融合させると
． ＣＴＢリンカーペブチドがＬＴＢ中のそれによって
置き換えられた。得られたプラスミドｐＪｓ１８２（第
１Ｂ図参照）はｔａｅＰプロモーターの下流にＥｃｏＲ
Ｉ −ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮ＾セグメントとしてハイ
ブリッドＣＴＢ３ｆｉ伝子を含んでいた．以下の手順は
前記の構築物を得るために用いられた， Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩ株中のｐＮＭ８８８プラスミドは親切にも
ウメア（ＵｍｅＡ）大学のＭ．Ｓａｎｄｑｕｉｓｔ氏か
ら提供された。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ株中のプラス
ミドｐＣＶＤ３０は米国ボルチモア、メリーランド大学
のＪ．Ｋａｐｅｒｊｌ士から得られた。（これらのブラ
スミドの詳細な記述については、Ｍ．Ｓａｎｄｑｕｉｓ
Ｌ ｅｔ ａｌ ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒａｔ １６９：４
５７０−４５７６．１９８７およびＪｕｌ Ｋａｐｅｒ
ｅｔ ａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ８ｙ ２：３４５
−３４９．１９８４を参照されたい．〉ＬＴＢリーダー
のＳａｃ １ ３ ′末端をＣＴＢの５ ′Ｎｄｅ ｌ
配列へ接合するために用いた非リン酸化オリゴデオキシ
ヌクレオチドはウプサラ大学、バイオメディカルセンタ
ー、免疫学部から一本鎖として購入した。
これらの鎖は等モル量の各鎖を混合して室温で一晩イン
キユベートすることにより対合させた。得られた二本鎖
オリゴヌクレオチドはＳａｃ ＩおよびＮｄｅ ｌ適合
性の一本鎖延長部を有し、こうしてＳａｃ ｌ旧ｎｄ［
ｌ制限ｐＭＭＢ６８に直接連結できるだろう．連結反応
はプラスミドＤＮＡに対して１０倍過剰モルのオリゴヌ
クレオチドを４℃て一晩Ｔ４リガーゼと共にインキユペ
ートすることにより行った．その擾、この連結混合物に
ＣＴＢ遺伝子を含むプラスミドｐｃＶＤ３０由来の精製
済みＨｄｅ ｌ−旧ｎｄＩＩＩ＠片を、ベクタープラス
ミドＯＮ八に対し等モル量で加え、次いでリガーゼ反応
を４℃でさらに１８時間続けた．ソ（７１ ｆｌ、連＃
ａＤＮＡハ：７ ンヒテ７ トＥ．ｅｏｌｉ ＨＢＩＯ
ＩＩＩＩ胞に形質転換し、アンピシリン耐性《１０Ｇμ
ｔ／ｍＧについて選別した．これらの手法において用い
た酵素はすべてＦＲＧ， （；ｍＢＬＢｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ一社から購入し、供給者の勧める
とおりに使用した．ブラスミドＤＮＡの精製はアルカリ
溶菌法を用いて行い、大腸閑への形質転換はＴ．Ｎａｎ
ｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，１９８２の詳細な記述に従って塩化力ルシウム
ールビジウム法を用いて行った． 予測した配列がクローニング後に生成されたことを確か
めるために、ハイブリッド遺伝子は８１３にサブクロー
ニングしてＦ．Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシヌクレオチ
ド法（ＰｒｏＣＮａｔｌ＾ｅａｄ Ｓｅｉ，ＬＩＳ＾７
４：５４８３−５４６７Ｊ９７７）によりその塩基配列
を決定した．決定された配列はＬＴＢリーダ一部分につ
いて報告された配列を確証するものであり（Ｊ Ｌｅｏ
ｎｇ ｅｔ ａｔ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ４８：
７３−７７．１９８５）、かつ以前に報じられたエルト
ールおよび古典ＣＴＢ成熟配列との高度な全体的相同を
示すものであった（ＭＬ Ｇｅｎｎａｒｏ＆Ｐ Ｃｒｅ
ｅｎａｗａｙ，Ｎｕｃｌｅｉｅ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
１１：３８５５−３８６１．１９８３；Ｈ Ｌｏｃｋ
＋ａａｎ＆ＪＢ Ｋａｐｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃ
ｈｅｗ ２５８：１３７２２−１３７２６，１９８３
；ＪＪ Ｍｅｋａｌａｎｏｓ ｅｔ ｍｌ，Ｎａｔａｕ
ｒｅ３０６：５５１−５５７，１９８３；＾κｕｒｏｓ
ｋｙ ｅＬ ａｔ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｗ２５２：７
２５７−７２６４，１９７７；ＣＹ Ｉ．ａｉ，Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｓｉ ２５２：７２４９−７２５６．１
９７７）．我々の組換えＣＴＢ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ
Ｏ３９５古典株から〉とこれらの他の配列との比較を第
２図に示す． １．２コレラ によるｔａｃＰ ＣＴＢ の
ｔａｃＰの制御下にＣＴＢ遺伝子を含むブラスミドｐＪ
Ｓ１６２（第１図参照）はヘルパーＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１
７−１株（ＲＳｉ＋＊ｏｎ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：７８４−７９１．１９８
３）からＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ０１ Ｊｆｌκ７０株
（エルトール生物型）（ＪＢＫａｐｅｒ ｅＬ ｍｌ，
ｔ４ａＬｕｒｅ ３０８：８５５−６５８．１９８３）
または他のエルトールもしくは古典コレラ菌株へ接合に
より転移させた．この転移を達或するために、ｐＪＳ１
６２ブラスミドＤＮ＾は初めにＥ．ｃｏｌｉ ＨＢＩＯ
Ｉから再度ＩＮし、そして上記セクション１．１におい
て記載したＭａｎｎｉａｔｉｓら（１９８２）からの同
じ手法を用いて形質転換によりＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−
１に導入した．その後形質転換したＳ１７−１ｍ胞は種
々のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ受容菌株との接合実験におい
て供与菌として使用した．接合は次のように行った．形
質転換Ｓ１７−１供与細胞およびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ
受容ｍ胞は、適当な抗生物質を補給したＬＢ培地１０ａ
ｌ中で振とうせずに３７℃で一晩生育させた．それぞれ
の培養物から、細． Ｒ 菌懸濁体３ｍｌをミリボア（Ｎｉｌ口ｐａｒｅ ）フィ
ルターＧＳ Ｏ．２２型を通してシリンジを使って、初
めに供与細胞培養物を、その後受容細胞培ＩＩ物を押し
出し、これによりフィルター表面上でこれらの細胞を互
いに緊密接触させた．その後、このフィルターを抗生物
質不含ＬＢ寒天平板上に靜置し、３７℃で約３時間イン
キユベートした．次いで、フィルターはＬＢ培地５ｍｌ
を含む試験管の中に移し、その試験管を振とうして細菌
を懸濁化し、その後混合細菌懸濁体約０．１ｍＮは供与
細胞の適当な抗生物質による逆選択を可能にするＬＢ培
地中でインキユベートした．エルトール生物型のＶ．ｃ
ｈｏｌｅｒａｅ菌株がｐＪ３１８２の受容菌である場合
、細菌混合物は供与菌の逆選択のために５００／ｙｊＪ
？リミキシンＢおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを
含むＬ［ｌ培地中で生育させた．ブラスミドが古典生物
型のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ菌株に転移される場合は、初
めにこれらの閏株のりファンビシン耐性ビブリオ株を単
離し、その後これらの場合における受容リファンピシン
耐性ビブリオ株についての選択を、５０ＬＬｇ／ｚＺリ
ファンビジンおよび１００μｇ／ｍｌアンビシリンを含
むＬＢ培地を用いて行った． ｐＪｓ１６２ブラスミドを保有するＶ．ｃｈｏｌｅｒｉ
ｅ菌株がらのＣＴＢの生産は次のようにして調べた．イ
ソプルヒルーβ−Ｏ−チオーガラクトビラノシド（ＩＰ
ＴＧ）による誘導のために、抗生物質を補給したＬＢ培
地中３７℃で培ｎ物を所望の光学密度（＾，。。）へ増
殖させ、その後ＩＰＴＧを所望の濃度で加えた．増殖を
４時間続け、細胞と培養上清を遠心により分離した。
キユベートすることにより対合させた。得られた二本鎖
オリゴヌクレオチドはＳａｃ ＩおよびＮｄｅ ｌ適合
性の一本鎖延長部を有し、こうしてＳａｃ ｌ旧ｎｄ［
ｌ制限ｐＭＭＢ６８に直接連結できるだろう．連結反応
はプラスミドＤＮＡに対して１０倍過剰モルのオリゴヌ
クレオチドを４℃て一晩Ｔ４リガーゼと共にインキユペ
ートすることにより行った．その擾、この連結混合物に
ＣＴＢ遺伝子を含むプラスミドｐｃＶＤ３０由来の精製
済みＨｄｅ ｌ−旧ｎｄＩＩＩ＠片を、ベクタープラス
ミドＯＮ八に対し等モル量で加え、次いでリガーゼ反応
を４℃でさらに１８時間続けた．ソ（７１ ｆｌ、連＃
ａＤＮＡハ：７ ンヒテ７ トＥ．ｅｏｌｉ ＨＢＩＯ
ＩＩＩＩ胞に形質転換し、アンピシリン耐性《１０Ｇμ
ｔ／ｍＧについて選別した．これらの手法において用い
た酵素はすべてＦＲＧ， （；ｍＢＬＢｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ一社から購入し、供給者の勧める
とおりに使用した．ブラスミドＤＮＡの精製はアルカリ
溶菌法を用いて行い、大腸閑への形質転換はＴ．Ｎａｎ
ｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，１９８２の詳細な記述に従って塩化力ルシウム
ールビジウム法を用いて行った． 予測した配列がクローニング後に生成されたことを確か
めるために、ハイブリッド遺伝子は８１３にサブクロー
ニングしてＦ．Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシヌクレオチ
ド法（ＰｒｏＣＮａｔｌ＾ｅａｄ Ｓｅｉ，ＬＩＳ＾７
４：５４８３−５４６７Ｊ９７７）によりその塩基配列
を決定した．決定された配列はＬＴＢリーダ一部分につ
いて報告された配列を確証するものであり（Ｊ Ｌｅｏ
ｎｇ ｅｔ ａｔ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ４８：
７３−７７．１９８５）、かつ以前に報じられたエルト
ールおよび古典ＣＴＢ成熟配列との高度な全体的相同を
示すものであった（ＭＬ Ｇｅｎｎａｒｏ＆Ｐ Ｃｒｅ
ｅｎａｗａｙ，Ｎｕｃｌｅｉｅ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
１１：３８５５−３８６１．１９８３；Ｈ Ｌｏｃｋ
＋ａａｎ＆ＪＢ Ｋａｐｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃ
ｈｅｗ ２５８：１３７２２−１３７２６，１９８３
；ＪＪ Ｍｅｋａｌａｎｏｓ ｅｔ ｍｌ，Ｎａｔａｕ
ｒｅ３０６：５５１−５５７，１９８３；＾κｕｒｏｓ
ｋｙ ｅＬ ａｔ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｗ２５２：７
２５７−７２６４，１９７７；ＣＹ Ｉ．ａｉ，Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｓｉ ２５２：７２４９−７２５６．１
９７７）．我々の組換えＣＴＢ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ
Ｏ３９５古典株から〉とこれらの他の配列との比較を第
２図に示す． １．２コレラ によるｔａｃＰ ＣＴＢ の
ｔａｃＰの制御下にＣＴＢ遺伝子を含むブラスミドｐＪ
Ｓ１６２（第１図参照）はヘルパーＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１
７−１株（ＲＳｉ＋＊ｏｎ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：７８４−７９１．１９８
３）からＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ０１ Ｊｆｌκ７０株
（エルトール生物型）（ＪＢＫａｐｅｒ ｅＬ ｍｌ，
ｔ４ａＬｕｒｅ ３０８：８５５−６５８．１９８３）
または他のエルトールもしくは古典コレラ菌株へ接合に
より転移させた．この転移を達或するために、ｐＪＳ１
６２ブラスミドＤＮ＾は初めにＥ．ｃｏｌｉ ＨＢＩＯ
Ｉから再度ＩＮし、そして上記セクション１．１におい
て記載したＭａｎｎｉａｔｉｓら（１９８２）からの同
じ手法を用いて形質転換によりＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−
１に導入した．その後形質転換したＳ１７−１ｍ胞は種
々のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ受容菌株との接合実験におい
て供与菌として使用した．接合は次のように行った．形
質転換Ｓ１７−１供与細胞およびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ
受容ｍ胞は、適当な抗生物質を補給したＬＢ培地１０ａ
ｌ中で振とうせずに３７℃で一晩生育させた．それぞれ
の培養物から、細． Ｒ 菌懸濁体３ｍｌをミリボア（Ｎｉｌ口ｐａｒｅ ）フィ
ルターＧＳ Ｏ．２２型を通してシリンジを使って、初
めに供与細胞培養物を、その後受容細胞培ＩＩ物を押し
出し、これによりフィルター表面上でこれらの細胞を互
いに緊密接触させた．その後、このフィルターを抗生物
質不含ＬＢ寒天平板上に靜置し、３７℃で約３時間イン
キユベートした．次いで、フィルターはＬＢ培地５ｍｌ
を含む試験管の中に移し、その試験管を振とうして細菌
を懸濁化し、その後混合細菌懸濁体約０．１ｍＮは供与
細胞の適当な抗生物質による逆選択を可能にするＬＢ培
地中でインキユベートした．エルトール生物型のＶ．ｃ
ｈｏｌｅｒａｅ菌株がｐＪ３１８２の受容菌である場合
、細菌混合物は供与菌の逆選択のために５００／ｙｊＪ
？リミキシンＢおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを
含むＬ［ｌ培地中で生育させた．ブラスミドが古典生物
型のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ菌株に転移される場合は、初
めにこれらの閏株のりファンビシン耐性ビブリオ株を単
離し、その後これらの場合における受容リファンピシン
耐性ビブリオ株についての選択を、５０ＬＬｇ／ｚＺリ
ファンビジンおよび１００μｇ／ｍｌアンビシリンを含
むＬＢ培地を用いて行った． ｐＪｓ１６２ブラスミドを保有するＶ．ｃｈｏｌｅｒｉ
ｅ菌株がらのＣＴＢの生産は次のようにして調べた．イ
ソプルヒルーβ−Ｏ−チオーガラクトビラノシド（ＩＰ
ＴＧ）による誘導のために、抗生物質を補給したＬＢ培
地中３７℃で培ｎ物を所望の光学密度（＾，。。）へ増
殖させ、その後ＩＰＴＧを所望の濃度で加えた．増殖を
４時間続け、細胞と培養上清を遠心により分離した。
細胞ペレットを静かに洗い、等容量の冷リン酸榎ｍｉ７
７液（，１１７．２）中に再懸濁し、そしてミニブロー
ブを使って２回の３０秒音波処理（Ｏｒｉｎｓｏｎソニ
ファイアー〉により細胞を破壊した．培養上清および破
Ｉ１！細胞中のＣＴＢの含量はその後モノクローナル抗
１４ＬＴ３９を用いて（：ＭＩ−ＥＬＩＳ八法により測
定した（＾Ｍ Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ＆ Ｊ ｌｌ
ｏｌｍｇｒｃｎ，Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１：１
９−２３．１９７８＞， ｝−キシン欠損ＪＢκ７０
Ｖ．ｃｈｏＩｅｒａｅ閉株へのｐＪｓ１６２の接含転移
は、ＬＢ培地での増殖およびＩＰＴ（：による誘導後に
、この菌株からの４０〜５０ｔｔｇ／ａｔのＣＴＢの生
産へ導いた．このＣＴＢのうち９５％以上は培地中に分
泌されたく第３図参照〉．また、５０〜１００μｇ／ｍ
ｌｉでのＣＴＢの発現レベルも、ｐＪ５１６２プラスミ
ドを転移させた他のトキシン欠損またはＣＴ＾欠損古典
およびエルトール菌株をＩＰＴ（：の存在下で増殖させ
る場合に、これらの薗株によって達成されたく表１参照
）．これは試験された多くの野生型または組換えＶ．ｃ
ｈｏｌｅｒａｅ菌株（ワクチン製造用のＣＴＢの生産の
ために現在用いられている高毒素産土性５６９Ｂ株を含
む〉により生産されたレベルと比較してＣＴＢの著しい
過剰発現を表していた．９ＪＳ１６２によってコードさ
れる組換えＣＴＢは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅによって生
産されるとき細胞外に分泌されたので、その後例えばリ
ゾーＣＮ１ガングリオシド（１７〉によるレセブター特
異的アフィニティーク口マトグラフィーを用いて、これ
らの菌株のいずれの培養上清からも高収率で容易に精製
することができた〈以下の実施例４を参照されたい）．
青」一 閏株 表現型 ＣＴＢ（ノ１ｇｈｌ） か？，のＣＴロの発現 ｊｌｌκ７０（ｐＪｓＩ６２） エルトールイナバ
７５ＣＴ＾−★ＣＴロ ．ＩＳＩ５６９ ＋ （ｌｌＪｓＩ６２）古典イナバ
７５ＣＴ＾− ＣＴ［ｌ＋ および／または１ｐａ能的（ＣＴＢ−）またはＷ能的（
ＣＴＢ＋）ＣＴＢ遺伝子を示す．菌株は遺伝子欠損によ
りつくられた． ｝ ＪＳ１５６９株およびＪＳ１３９５株はそれぞれＣ
ＶＤ １０３およびＣＶＤ １０１（０３９５ ＣＴ＾
一誘導株〉からのりファンビシン耐性誘導株である，
ＩＰＴＧ不在下でのこれらの菌株のＣＴＢ生産量は０．
５μｇ／ｍｌより少なく、従って１３導物質の存在下で
のその値に有意に寄与しなかった． ＣＴロの発現 ５６９Ｂ 古典イナバ １．２
８ＣＴ＾ナ ＣＴＢナ ＣＶＤ１０３ 古典イナバ ０．
８８（５６９［１誘導体） ＣＴ＾−ＣＴＢ◆全
菌株は３０℃で同一期間増殖させた。ｐＪｓ１６２を保
有する閏株は＾．．．＝ １．０まで増殖させ、その後
１００μｇ７ｍｌのＩＰＴＧを加えてさらに４時間イン
キユベートした． ★非機能的（ＣＴ＾−）または機能的（ＣＴＡ◆）ＣＴ
Ａ遺伝子この構築においては、上記実施例１に記載した
プラスミドｐＪｓｌ８２中のＣＴｌ）遺伝子を切り出し
て、い±Ｐプロモーターを含むがＩＰＴ（：依存に応答
しうるｐＪｓ１．６２中に存在するＩｇｇＪ一遺伝子を
含まないブラスミドベクター，ＫＫ２２３− １に挿入
した，ブラスミドＤＮ＾の単離、ＤＮ八の切り出し、連
結、Ｅ．ｃｏｌｉへの形質転換、およびＶ．ｃｈｏｌｅ
ｒａｅへの接合には実施ｒＮ１に記載した方法と同じ標
準方法が用いられた．ブラスミドｐＪｓ１６２中のＣＴ
Ｉｌｊｆｉ伝子はＥｃｏＲ Ｉ１１ｉｎｄｌ［［［！Ｊ
ｒ片として切り出し、そのｆｊ）ＥｃｏＲ１部位の上流
にＬａｃＰプロモーターを含むＥｅｏＲ Ｉ一旧ｎｄｌ
ｌｌ制限プラスミドρＫＫ２２３−１ （スウェーデン
、ウプサラ、Ｐｌ＋ａｒｍａｃｉａ社）に連結させた．
ｆ％られたブラスミドｐＪｓ７５２３ − １はＥ．ｅ
ｏｌ ｉ ＩＩＢＩＯＩへ形質転換し、またヘルパーＥ
．ｃｏｌｉ ＳＩ７−１株の助けをかりて接きによりＶ
．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＪＢＫ７０およびＪＳ１３９５株
へ移入させた， ｐ Ｊ Ｓ １ ６ ２中のｌａｃ
Ｉ一遺伝子は大量のｂ±Ｉリアレッサーをコードしてお
り、プラスミドｐＪＳ７５２３−１中の二の遺伝子の不
在はｐＪＳ７５２３− １１ラスミドを保有する細菌株
によるｔａｃＰの制御下のＣＴＢの発現をほとんど！Ｐ
ＴＣ：非依存性にする．これはｐＪＳ７５２３− １を
有するＥ．ｃｏｌｉ ｔｏ１＋ｔ４１胞を２通りの組の
試験管にて１００μｇ／ｍｌアンビシリンを補給したＬ
Ｂ培地中３７℃で＾，。。−１，Ｏの光学密度へ増殖さ
せ、その後１つの組へ１００μｇ／ｚｌのＩＰＴＧを加
え、他の組へは加えず、そして細＠培養物のインキュベ
ーションを３７℃でさらに４時間続けることにより試験
した．その後、培ＩＩ￥＠のサンプルはミニプローブを
用いて２回の３０秒音波処ＦＪ（Ｂｒａｎｓｏｎソニフ
ァイアー）により超音波にさらして細胞を破壊し、遠心
後に超音波処理培養物のＣＴＢ含量を実施例１−に記載
したＧＨ １ − ＥＬｔＳ＾法を用いて分析した．得
られた結果は、比較的高レベル（２〜７ ）ｔ ｇ／
ｇ＋４！）のＣＴＢがＴＰＴＣの不在下で生産され、こ
れらのレベルがＩＰＴＧの存在下で得られたものよりほ
んの２〜３倍低いだけであることを示した．このことは
、ＩＰＴＧの不在下でＣＴＩＩＩのレベルが検出不能で
あるｐＪＳ１８２中のＬ！ｃＰの制御下でのＣＴＢ発現
に対するＩＰＴＧの効果と劇的に対照を或すものである
（実施例１、第２図参照）．従って、ｐＪＳ７５２３−
１でのＣＴＢ発現はまだハ±１ラクトースオベロンリ
ブレッサーによって調節されているが、これらの結果は
その発現が実際８Ｅ楕戚的であることを示している。こ
れは恐らく染色体によってコードされるｌａｃｌリブレ
ッサーが染色体中のｌａｃオペレーターと高コピー数プ
ラスミドｐＪＳ７５２３〜１中のり±Ｐの両方に効果的
に結合するのに十分な量で生産されないためであると考
えられる． ３．７７ＲＮ＾ポリメラーゼ ブ口モーＺ二』コ！
Ｑ交』力Ｊｕ史 本実施胸では、別の強力な外来（非コレラトキシン〉プ
ロモーターであるＴ７ ＲＮ＾ポリメラーゼ依存性１１
″Ｊモーターの発現制御下にＣ丁！＋遺伝子をおくこと
によって、ＣＴＨの過剰発現を達戊できることを証明す
る． ブラスミド，ＪＳ１６２に含まれるＣＴＢの構造逍伝子
（１．ＴＢリーダーペプチドのコード配列を含む〉は切
り出して、高度に特異的でかつ強力なＴ７−ＲＮ＾ポリ
メラーゼ依存性プロモーターを含むＴ７−５アラスミド
ベクターに挿入した（Ｓ Ｔａｂｏｒ ａｎｄ ＣＣ
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ＾ｃａｄ
Ｓｅｉ ＩＪＳ＾８２：１０７４− １０７８１９８５
），このプロモーターからの発現は補助ブラスミド（９
（：Ｐｉ − ２）の助けを借りて供給されるＴ７暉＾
ボリメラーゼの存在を必要とし、このプラスミドによっ
てコードさ扛るＲＮ＾ボリメラーゼそれ自体は、生育温
度の変化（通常３０℃から４２℃ｌ＼〉により講導され
るプロモーターの制御下で発現される． ブラスミドＤＮＡの単離、ＤＮ＾の切り出し、連結、Ｅ
．ｅｏｌｉへの形質転換、およびＬｃｈｏｌｅｒａｅへ
の接合転換のために用いた方法は本質的に実施例１に記
載した方法と同じであった， ｐＪｓ１６２中のＣＴＢ
はεｃｏＲ Ｉ Ｈｉｎ（１１［１断片として切り出
し、その後１：ｃｏＲ Ｉ一旧ｎｄ（［消化プラスミド
ベクターｐＴ７−５（米国マサチューセッツ州、ハーバ
ード大学のＳ．Ｔａｂｏｒ博士から入手）に挿入した．
得られた新しいプラスミドは次いでブラスミドｐＧＰ１
．−２を含むＥ．ｃｏｌｉ１０１ （Ｓ．Ｔａｂｏｒ博
士から入手）に形質転換した．これらの形質転換Ｅ．ｃ
ｏｔｉを細胞中に含まれる２１’ｉｌ類のブラスミドに
関して適当な抗生物質（カナマイシ７５０）．ｔ ｇ／
ｍｌ；７ ’ｌビシリン１００μｇ／ｄ）を補給した
ＬＢ培地中で生育させたとき、細胞は３０℃において検
出可能なレベルのＣＴＢを生産しながったが、生育温度
を３０℃から４２℃に変えると， ＧＭＩ −ＥＬｒＳ
＾で検定してＥ．ｃｏｌｉによる２〜３μｇ／ｍｌのＣ
ＴＢの発現が得られた．その後、Ｔ７ ＲＮ＾ポリメラ
ーゼ依存性プロモーターと組み合わせたＣＴＢ遺伝子は
Ｐｖｕ■一旧ｎｄｎｙｌｌ入物としてＥｃｏＲＶ−１１
ｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドｐｌ３Ｒ３２５にサブクロ
ーニングした．次いでこの新しいブラスミド（ｐＪＳ７
５２５）はｐＲκ２０１３を含むＥ．ｃｏｌｉ株からＶ
．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＪＢＫ７０（ブラスミドｐＧＰ
１−２を同一のＥ．ｃｏｌｉ供＋菌から接合により前も
って転移されている）へ移した．２つの１ラスミドの存
在は、それらが適合性の複製起点を有し、しかもｐＪＳ
７５２５がクロラムフェニコール（およびアンビシリン
〉耐性をコードし、一方ｐ（；Ｐｉ−２がカナマイシン
耐性遺伝子を有するために可能であった．ブラスミドｐ
ＪＳ７５２５およびｐＧＰ１−２を含むＬｃｈｏｌｅｒ
ａｅ ＪＢＫ７０は、２５μｙ／ａｔのクロラムフェニ
コールと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補給したＬＤ
培地中で高光学密度へ３０℃において生育させた場合、
検出可能なレベルのＣＴ［ｌを生産しなかったが、生育
温度を４２℃に変えると、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ培養−
Ｅ清中に７５〜１００μｇ／ａｒｔのＣＴＢレベルの予
測されｆ．：Ｔ７ ＲＮＡ；ｆ？リメラーゼ依存性ＣＴ
Ｂ発現の増加が見られた，本実施例の結果は明らかに、
種々の外来（非コレラトキシン）プロモーターによるＣ
ＴＢの過剰発現が実際に可能であること、および過剰発
現がｔｏｘＲ調節系に依存しないこと（包リが作用する
場合、ＣＴＢの高発現Ｉ＼導く要因の１つは約３０℃の
生育温度である〉の両方を立証した（ＭＪ ＢｅＬｌｅ
ｙ ｅｔａｌ，八ｎｎ ｎｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
４０：５７７−６０５．１９８６），ここに記載しｆ，
−誘導可能な発現系はＬｏｘＲのＲＭ４度において最少
であり、そしてＬｏｘＲ一非最適温度において最高であ
った． 我々は、先の実施例に記載した構築物により生産された
組換えＣＴＢの性質の一部を決定した。我々の結果は、
ブラスミドｐＪｓ１６２によりコードされ、Ｖ．ｅｈｏ
ｌｅｒａｅ Ｊ８Ｋ７０により発現されて精製されたＣ
ＴＢについてここに例示するように、組換えＣＴ［ｌが
、数個のアミノ酸の相違にもかかｉ）らず、試験した横
造機能特性および免疫学的特性のいずれにおいても、野
生型Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ５６９Ｂ：７レラトキシン
から精製されたＣＴＩＩとあまり違っていないことを示
している． ４．Ｉ ＣＴロの およびアミノ の゛Ｌｃｈｏｌ
ｅｒａｅエルトールＪＢκ７０（プラスミドｐＪｓ１６
２を保有する）は１００μｇ／ｍｌのアンビシリンと１
００ｔ．ｉ ｇ／ ｄのＩＰＴＧを含むＬＢ培地２ｌ中
で連続振とう下に３０℃で生育させた．培養後、細閏と
細菌破片を遠心により除き、組換えＣＴＢは几Ｔａｙｏ
Ｌ ｅＬ ａｌ，ＥｕｒＪ Ｂｉｏｅｈｅ論１１３：２
４９−２５８４９８１に記載の方法を用いてリゾーＣＭ
１ガングリオシドースフエロジルＲ 一 （Ｓｐｂｅｒｏｓ ｉ ｌ ）カフムでのアフィニティ
ークロマトグラフィーによって８ｌ製した．精ｌ ＣＴ
ＢはＨ ｖｏｎロａｌ＋ｒ−Ｌｉｎｄｓｔｒ６ｍ ｅ
Ｌ ａｌｊ Ｐｒｏｔ Ｃｌ＋ｅｍ １ ＋
２５７−２６２，１９８２に記載されるとおりにアミノ
末端残基を決定した． 組換えＣ丁Ｂの前駆体ベブチドの開裂は、ＬＴＢまたは
Ｃ丁１１巾の本来のリーダーベブナダーゼ認Ｎ．Ｗ （
１の１つまたは両方において起こることが当然予測され
た．精製タンパク質の第一アミノ酸の同定はＴｙｒ残基
と＾ｌａ残基の両方を与えた．この事実および組換えＣ
Ｔ［ｌがドデシル硫酸ナトリウム／ボリアクリルアミト
ゲル電気泳動（ＮａＤｏｄＳＯ．／ＰＡＩＩ；Ｅ）テ測
定したとき天然ＣＴＢよりもゎずがに大きいく第４図参
照）という事実は、リーダーペプチドの加水分解プロセ
ッシングがリンカーによってコードされるＣｌｙ（ −
５位〉とＴｙｒ（−４位）の間、および後者のアミノ酸
と＾ｌａ（−３位）の間で起こったことを示唆したく第
２図参照）．処理したＣＴＢの残部を再びアミノ末端決
定に付したとき、今度は＾１ａ残基とＩＩ ｉ ｓ残基
とが同定され、これは仮定した開裂位置が正しかったこ
とを確信させ、また組換えＣＴ［ｌが３または４ｌｌｌ
ｉｌのアミノ酸から成る短いベプチド延長部をそのアミ
ノ末端にもつ証拠を提供する．４．２レセブター お
よびレセブターＣＴＩｌ中の数涸の追加アミノ酸の存在
はＧＭＩレセプターのその！！！識に影響を与えなかっ
た。プラスチックに被覆したＧＮＩガングリオシドに対
する結合親和性は、（；Ｍｌ −ＥＬＩＳ八法を用いて
異なる濃度を試験することにより、組換えＣＴロと５６
９Ｂ株由来の清製標準ＣＴ［１ （仏国Ｍ６ｒｉｅｕｘ
研究所、Ｊ．＾ｒｍａｎｄ博士から贈与〉とを比較した
．差異は全く現れながった，Ｇ８１ガングリオシドに対
する高い結合親和性の保持は実際に、上記のようなリゾ
ーＣＨＩ−スフエＲ ロジルによるＣＴＢの精製にも有利であった，さらに、
ウサギの腸内でコレラトキシンレセブターを遮断する組
換えＣＴＢの能力を、５６９８ ＣＴＢと比較して調べ
る実験も行った．これらの実験は、ＣＴＢ調製物のいず
れかを動物の結紮した腸ループの中に注入し、その約ｌ
Ｏ分後に特異的レセプター遮断の不在下で大量の腸液分
泌（実験的コレラ）を誘導することが知られている精製
コレラトキシンの一定用量（０．２ノｔｇ）を注入する
という手順で行った（詳細な方法はＪ ＩｌｏｌｍＢｅ
ｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｒｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ３８：４２
４−４３３．１９８２に記載されている）．得られた結
果は、組換えＣＴＢおよび５８９Ｂ ＣＴＢの調製物が
同様のレセブタ−３１！断活性をもっことを示した．両
調製物はループへのコレラトキシン（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒ
ａｅ５６９Ｂ由来）の注入直前にｈ１容量中５０μ９の
量で長さ約５ＣＪｌの結紮した腸ループに加える場合、
コレラによる分泌を完全に陪止することができた。ＣＴ
Ｂの代わりにＭＷｌ液単独で予備処理し、その後同一用
量のコレラトキシンを注入した対照ループにおいては著
しい腸液の蓄積〈１．７±０．２ｚＺ／ｃｍ）が見られ
たが、トキシンチャレンジ前に１０μｇまたはそれ以下
の量のＣＴ［ｌで予備処理したループでは、緩衝液予備
処理対照と比べて腸液蓄積の部分的減少が見られたか、
または蓄積が全く見られなかった．４．３ ｌゴマー
および＾ ブユニット の Δ能一 他の実験において、組換えＣＴＢはそのオリゴマー化能
力およびコレラトキシンの＾サブユニット（ＣＴ＾）と
の会合能力の両方に影響を受けていないことが明らかに
なった．これらの実験のために、精製ＣＴ＾（５６９Ｂ
Ｃ丁からｌｌｌＫｉ ；Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を精製組換えＣＴＢ
または５８９８ ＣＴ［ｌと、完全なＣＴ中に通常見ら
れるＣＴＢ対ＣＴ＾のモル比で混きし、２００μｇ７ｍ
ｌの総タンパク質濃度を得た．混合後、試料を０．２Ｍ
グリシンＭ箇液（ｐＨ２．７＞で酸性化し、次いで０．
０５Ｎ｝リスＵＳ液（ｐＨ８．０） （数回取り換えた
〉に対して一晩透析することにより中和した．中和した
試料はその後ＳＪＳ Ｉ！ａｒｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｐｒ
ｏｃＮａｔｌ＾ｃａｄＳｃｉＵＳ＾，ｉｎ ｐｒｅｓｓ
１９８８に記載されるとおりにサブユニット特異的モ
ノクローナル抗体を用いた（；Ｍ １ − ＥＬＩＳ＾
により試験した．ホロトキシンを与えるべく組換えＣＴ
Ｂまたは５６９Ｂ ＣＴＢと会合した５６９８ ＣＴ＾
の量は、標準として未処理の相同コレラトキシンを用い
て算出した．結果を表２に示す．それらは、検出用ＣＴ
Ｂ特異的モノクローナル抗体がＢペンタマ一体とのみ反
応することが知られているので、モノマーＣＴＢよりも
むしろベンタマーＣＴＢの直接的測定である免疫反応性
ＣＴＢの高い回収を示す．それらはまた免疫反応性ＣＴ
＾の高い回収を示し、これは非会合ＣＴ＾がＣ８１被覆
プラスチックウエルに結きしないために検出されないの
で、ＣＴＢと会合したＣＴＡ量の直接的測定である。
７液（，１１７．２）中に再懸濁し、そしてミニブロー
ブを使って２回の３０秒音波処理（Ｏｒｉｎｓｏｎソニ
ファイアー〉により細胞を破壊した．培養上清および破
Ｉ１！細胞中のＣＴＢの含量はその後モノクローナル抗
１４ＬＴ３９を用いて（：ＭＩ−ＥＬＩＳ八法により測
定した（＾Ｍ Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ＆ Ｊ ｌｌ
ｏｌｍｇｒｃｎ，Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１：１
９−２３．１９７８＞， ｝−キシン欠損ＪＢκ７０
Ｖ．ｃｈｏＩｅｒａｅ閉株へのｐＪｓ１６２の接含転移
は、ＬＢ培地での増殖およびＩＰＴ（：による誘導後に
、この菌株からの４０〜５０ｔｔｇ／ａｔのＣＴＢの生
産へ導いた．このＣＴＢのうち９５％以上は培地中に分
泌されたく第３図参照〉．また、５０〜１００μｇ／ｍ
ｌｉでのＣＴＢの発現レベルも、ｐＪ５１６２プラスミ
ドを転移させた他のトキシン欠損またはＣＴ＾欠損古典
およびエルトール菌株をＩＰＴ（：の存在下で増殖させ
る場合に、これらの薗株によって達成されたく表１参照
）．これは試験された多くの野生型または組換えＶ．ｃ
ｈｏｌｅｒａｅ菌株（ワクチン製造用のＣＴＢの生産の
ために現在用いられている高毒素産土性５６９Ｂ株を含
む〉により生産されたレベルと比較してＣＴＢの著しい
過剰発現を表していた．９ＪＳ１６２によってコードさ
れる組換えＣＴＢは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅによって生
産されるとき細胞外に分泌されたので、その後例えばリ
ゾーＣＮ１ガングリオシド（１７〉によるレセブター特
異的アフィニティーク口マトグラフィーを用いて、これ
らの菌株のいずれの培養上清からも高収率で容易に精製
することができた〈以下の実施例４を参照されたい）．
青」一 閏株 表現型 ＣＴＢ（ノ１ｇｈｌ） か？，のＣＴロの発現 ｊｌｌκ７０（ｐＪｓＩ６２） エルトールイナバ
７５ＣＴ＾−★ＣＴロ ．ＩＳＩ５６９ ＋ （ｌｌＪｓＩ６２）古典イナバ
７５ＣＴ＾− ＣＴ［ｌ＋ および／または１ｐａ能的（ＣＴＢ−）またはＷ能的（
ＣＴＢ＋）ＣＴＢ遺伝子を示す．菌株は遺伝子欠損によ
りつくられた． ｝ ＪＳ１５６９株およびＪＳ１３９５株はそれぞれＣ
ＶＤ １０３およびＣＶＤ １０１（０３９５ ＣＴ＾
一誘導株〉からのりファンビシン耐性誘導株である，
ＩＰＴＧ不在下でのこれらの菌株のＣＴＢ生産量は０．
５μｇ／ｍｌより少なく、従って１３導物質の存在下で
のその値に有意に寄与しなかった． ＣＴロの発現 ５６９Ｂ 古典イナバ １．２
８ＣＴ＾ナ ＣＴＢナ ＣＶＤ１０３ 古典イナバ ０．
８８（５６９［１誘導体） ＣＴ＾−ＣＴＢ◆全
菌株は３０℃で同一期間増殖させた。ｐＪｓ１６２を保
有する閏株は＾．．．＝ １．０まで増殖させ、その後
１００μｇ７ｍｌのＩＰＴＧを加えてさらに４時間イン
キユベートした． ★非機能的（ＣＴ＾−）または機能的（ＣＴＡ◆）ＣＴ
Ａ遺伝子この構築においては、上記実施例１に記載した
プラスミドｐＪｓｌ８２中のＣＴｌ）遺伝子を切り出し
て、い±Ｐプロモーターを含むがＩＰＴ（：依存に応答
しうるｐＪｓ１．６２中に存在するＩｇｇＪ一遺伝子を
含まないブラスミドベクター，ＫＫ２２３− １に挿入
した，ブラスミドＤＮ＾の単離、ＤＮ八の切り出し、連
結、Ｅ．ｃｏｌｉへの形質転換、およびＶ．ｃｈｏｌｅ
ｒａｅへの接合には実施ｒＮ１に記載した方法と同じ標
準方法が用いられた．ブラスミドｐＪｓ１６２中のＣＴ
Ｉｌｊｆｉ伝子はＥｃｏＲ Ｉ１１ｉｎｄｌ［［［！Ｊ
ｒ片として切り出し、そのｆｊ）ＥｃｏＲ１部位の上流
にＬａｃＰプロモーターを含むＥｅｏＲ Ｉ一旧ｎｄｌ
ｌｌ制限プラスミドρＫＫ２２３−１ （スウェーデン
、ウプサラ、Ｐｌ＋ａｒｍａｃｉａ社）に連結させた．
ｆ％られたブラスミドｐＪｓ７５２３ − １はＥ．ｅ
ｏｌ ｉ ＩＩＢＩＯＩへ形質転換し、またヘルパーＥ
．ｃｏｌｉ ＳＩ７−１株の助けをかりて接きによりＶ
．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＪＢＫ７０およびＪＳ１３９５株
へ移入させた， ｐ Ｊ Ｓ １ ６ ２中のｌａｃ
Ｉ一遺伝子は大量のｂ±Ｉリアレッサーをコードしてお
り、プラスミドｐＪＳ７５２３−１中の二の遺伝子の不
在はｐＪＳ７５２３− １１ラスミドを保有する細菌株
によるｔａｃＰの制御下のＣＴＢの発現をほとんど！Ｐ
ＴＣ：非依存性にする．これはｐＪＳ７５２３− １を
有するＥ．ｃｏｌｉ ｔｏ１＋ｔ４１胞を２通りの組の
試験管にて１００μｇ／ｍｌアンビシリンを補給したＬ
Ｂ培地中３７℃で＾，。。−１，Ｏの光学密度へ増殖さ
せ、その後１つの組へ１００μｇ／ｚｌのＩＰＴＧを加
え、他の組へは加えず、そして細＠培養物のインキュベ
ーションを３７℃でさらに４時間続けることにより試験
した．その後、培ＩＩ￥＠のサンプルはミニプローブを
用いて２回の３０秒音波処ＦＪ（Ｂｒａｎｓｏｎソニフ
ァイアー）により超音波にさらして細胞を破壊し、遠心
後に超音波処理培養物のＣＴＢ含量を実施例１−に記載
したＧＨ １ − ＥＬｔＳ＾法を用いて分析した．得
られた結果は、比較的高レベル（２〜７ ）ｔ ｇ／
ｇ＋４！）のＣＴＢがＴＰＴＣの不在下で生産され、こ
れらのレベルがＩＰＴＧの存在下で得られたものよりほ
んの２〜３倍低いだけであることを示した．このことは
、ＩＰＴＧの不在下でＣＴＩＩＩのレベルが検出不能で
あるｐＪＳ１８２中のＬ！ｃＰの制御下でのＣＴＢ発現
に対するＩＰＴＧの効果と劇的に対照を或すものである
（実施例１、第２図参照）．従って、ｐＪＳ７５２３−
１でのＣＴＢ発現はまだハ±１ラクトースオベロンリ
ブレッサーによって調節されているが、これらの結果は
その発現が実際８Ｅ楕戚的であることを示している。こ
れは恐らく染色体によってコードされるｌａｃｌリブレ
ッサーが染色体中のｌａｃオペレーターと高コピー数プ
ラスミドｐＪＳ７５２３〜１中のり±Ｐの両方に効果的
に結合するのに十分な量で生産されないためであると考
えられる． ３．７７ＲＮ＾ポリメラーゼ ブ口モーＺ二』コ！
Ｑ交』力Ｊｕ史 本実施胸では、別の強力な外来（非コレラトキシン〉プ
ロモーターであるＴ７ ＲＮ＾ポリメラーゼ依存性１１
″Ｊモーターの発現制御下にＣ丁！＋遺伝子をおくこと
によって、ＣＴＨの過剰発現を達戊できることを証明す
る． ブラスミド，ＪＳ１６２に含まれるＣＴＢの構造逍伝子
（１．ＴＢリーダーペプチドのコード配列を含む〉は切
り出して、高度に特異的でかつ強力なＴ７−ＲＮ＾ポリ
メラーゼ依存性プロモーターを含むＴ７−５アラスミド
ベクターに挿入した（Ｓ Ｔａｂｏｒ ａｎｄ ＣＣ
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ＾ｃａｄ
Ｓｅｉ ＩＪＳ＾８２：１０７４− １０７８１９８５
），このプロモーターからの発現は補助ブラスミド（９
（：Ｐｉ − ２）の助けを借りて供給されるＴ７暉＾
ボリメラーゼの存在を必要とし、このプラスミドによっ
てコードさ扛るＲＮ＾ボリメラーゼそれ自体は、生育温
度の変化（通常３０℃から４２℃ｌ＼〉により講導され
るプロモーターの制御下で発現される． ブラスミドＤＮＡの単離、ＤＮ＾の切り出し、連結、Ｅ
．ｅｏｌｉへの形質転換、およびＬｃｈｏｌｅｒａｅへ
の接合転換のために用いた方法は本質的に実施例１に記
載した方法と同じであった， ｐＪｓ１６２中のＣＴＢ
はεｃｏＲ Ｉ Ｈｉｎ（１１［１断片として切り出
し、その後１：ｃｏＲ Ｉ一旧ｎｄ（［消化プラスミド
ベクターｐＴ７−５（米国マサチューセッツ州、ハーバ
ード大学のＳ．Ｔａｂｏｒ博士から入手）に挿入した．
得られた新しいプラスミドは次いでブラスミドｐＧＰ１
．−２を含むＥ．ｃｏｌｉ１０１ （Ｓ．Ｔａｂｏｒ博
士から入手）に形質転換した．これらの形質転換Ｅ．ｃ
ｏｔｉを細胞中に含まれる２１’ｉｌ類のブラスミドに
関して適当な抗生物質（カナマイシ７５０）．ｔ ｇ／
ｍｌ；７ ’ｌビシリン１００μｇ／ｄ）を補給した
ＬＢ培地中で生育させたとき、細胞は３０℃において検
出可能なレベルのＣＴＢを生産しながったが、生育温度
を３０℃から４２℃に変えると， ＧＭＩ −ＥＬｒＳ
＾で検定してＥ．ｃｏｌｉによる２〜３μｇ／ｍｌのＣ
ＴＢの発現が得られた．その後、Ｔ７ ＲＮ＾ポリメラ
ーゼ依存性プロモーターと組み合わせたＣＴＢ遺伝子は
Ｐｖｕ■一旧ｎｄｎｙｌｌ入物としてＥｃｏＲＶ−１１
ｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドｐｌ３Ｒ３２５にサブクロ
ーニングした．次いでこの新しいブラスミド（ｐＪＳ７
５２５）はｐＲκ２０１３を含むＥ．ｃｏｌｉ株からＶ
．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＪＢＫ７０（ブラスミドｐＧＰ
１−２を同一のＥ．ｃｏｌｉ供＋菌から接合により前も
って転移されている）へ移した．２つの１ラスミドの存
在は、それらが適合性の複製起点を有し、しかもｐＪＳ
７５２５がクロラムフェニコール（およびアンビシリン
〉耐性をコードし、一方ｐ（；Ｐｉ−２がカナマイシン
耐性遺伝子を有するために可能であった．ブラスミドｐ
ＪＳ７５２５およびｐＧＰ１−２を含むＬｃｈｏｌｅｒ
ａｅ ＪＢＫ７０は、２５μｙ／ａｔのクロラムフェニ
コールと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補給したＬＤ
培地中で高光学密度へ３０℃において生育させた場合、
検出可能なレベルのＣＴ［ｌを生産しなかったが、生育
温度を４２℃に変えると、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ培養−
Ｅ清中に７５〜１００μｇ／ａｒｔのＣＴＢレベルの予
測されｆ．：Ｔ７ ＲＮＡ；ｆ？リメラーゼ依存性ＣＴ
Ｂ発現の増加が見られた，本実施例の結果は明らかに、
種々の外来（非コレラトキシン）プロモーターによるＣ
ＴＢの過剰発現が実際に可能であること、および過剰発
現がｔｏｘＲ調節系に依存しないこと（包リが作用する
場合、ＣＴＢの高発現Ｉ＼導く要因の１つは約３０℃の
生育温度である〉の両方を立証した（ＭＪ ＢｅＬｌｅ
ｙ ｅｔａｌ，八ｎｎ ｎｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
４０：５７７−６０５．１９８６），ここに記載しｆ，
−誘導可能な発現系はＬｏｘＲのＲＭ４度において最少
であり、そしてＬｏｘＲ一非最適温度において最高であ
った． 我々は、先の実施例に記載した構築物により生産された
組換えＣＴＢの性質の一部を決定した。我々の結果は、
ブラスミドｐＪｓ１６２によりコードされ、Ｖ．ｅｈｏ
ｌｅｒａｅ Ｊ８Ｋ７０により発現されて精製されたＣ
ＴＢについてここに例示するように、組換えＣＴ［ｌが
、数個のアミノ酸の相違にもかかｉ）らず、試験した横
造機能特性および免疫学的特性のいずれにおいても、野
生型Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ５６９Ｂ：７レラトキシン
から精製されたＣＴＩＩとあまり違っていないことを示
している． ４．Ｉ ＣＴロの およびアミノ の゛Ｌｃｈｏｌ
ｅｒａｅエルトールＪＢκ７０（プラスミドｐＪｓ１６
２を保有する）は１００μｇ／ｍｌのアンビシリンと１
００ｔ．ｉ ｇ／ ｄのＩＰＴＧを含むＬＢ培地２ｌ中
で連続振とう下に３０℃で生育させた．培養後、細閏と
細菌破片を遠心により除き、組換えＣＴＢは几Ｔａｙｏ
Ｌ ｅＬ ａｌ，ＥｕｒＪ Ｂｉｏｅｈｅ論１１３：２
４９−２５８４９８１に記載の方法を用いてリゾーＣＭ
１ガングリオシドースフエロジルＲ 一 （Ｓｐｂｅｒｏｓ ｉ ｌ ）カフムでのアフィニティ
ークロマトグラフィーによって８ｌ製した．精ｌ ＣＴ
ＢはＨ ｖｏｎロａｌ＋ｒ−Ｌｉｎｄｓｔｒ６ｍ ｅ
Ｌ ａｌｊ Ｐｒｏｔ Ｃｌ＋ｅｍ １ ＋
２５７−２６２，１９８２に記載されるとおりにアミノ
末端残基を決定した． 組換えＣ丁Ｂの前駆体ベブチドの開裂は、ＬＴＢまたは
Ｃ丁１１巾の本来のリーダーベブナダーゼ認Ｎ．Ｗ （
１の１つまたは両方において起こることが当然予測され
た．精製タンパク質の第一アミノ酸の同定はＴｙｒ残基
と＾ｌａ残基の両方を与えた．この事実および組換えＣ
Ｔ［ｌがドデシル硫酸ナトリウム／ボリアクリルアミト
ゲル電気泳動（ＮａＤｏｄＳＯ．／ＰＡＩＩ；Ｅ）テ測
定したとき天然ＣＴＢよりもゎずがに大きいく第４図参
照）という事実は、リーダーペプチドの加水分解プロセ
ッシングがリンカーによってコードされるＣｌｙ（ −
５位〉とＴｙｒ（−４位）の間、および後者のアミノ酸
と＾ｌａ（−３位）の間で起こったことを示唆したく第
２図参照）．処理したＣＴＢの残部を再びアミノ末端決
定に付したとき、今度は＾１ａ残基とＩＩ ｉ ｓ残基
とが同定され、これは仮定した開裂位置が正しかったこ
とを確信させ、また組換えＣＴ［ｌが３または４ｌｌｌ
ｉｌのアミノ酸から成る短いベプチド延長部をそのアミ
ノ末端にもつ証拠を提供する．４．２レセブター お
よびレセブターＣＴＩｌ中の数涸の追加アミノ酸の存在
はＧＭＩレセプターのその！！！識に影響を与えなかっ
た。プラスチックに被覆したＧＮＩガングリオシドに対
する結合親和性は、（；Ｍｌ −ＥＬＩＳ八法を用いて
異なる濃度を試験することにより、組換えＣＴロと５６
９Ｂ株由来の清製標準ＣＴ［１ （仏国Ｍ６ｒｉｅｕｘ
研究所、Ｊ．＾ｒｍａｎｄ博士から贈与〉とを比較した
．差異は全く現れながった，Ｇ８１ガングリオシドに対
する高い結合親和性の保持は実際に、上記のようなリゾ
ーＣＨＩ−スフエＲ ロジルによるＣＴＢの精製にも有利であった，さらに、
ウサギの腸内でコレラトキシンレセブターを遮断する組
換えＣＴＢの能力を、５６９８ ＣＴＢと比較して調べ
る実験も行った．これらの実験は、ＣＴＢ調製物のいず
れかを動物の結紮した腸ループの中に注入し、その約ｌ
Ｏ分後に特異的レセプター遮断の不在下で大量の腸液分
泌（実験的コレラ）を誘導することが知られている精製
コレラトキシンの一定用量（０．２ノｔｇ）を注入する
という手順で行った（詳細な方法はＪ ＩｌｏｌｍＢｅ
ｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｒｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ３８：４２
４−４３３．１９８２に記載されている）．得られた結
果は、組換えＣＴＢおよび５８９Ｂ ＣＴＢの調製物が
同様のレセブタ−３１！断活性をもっことを示した．両
調製物はループへのコレラトキシン（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒ
ａｅ５６９Ｂ由来）の注入直前にｈ１容量中５０μ９の
量で長さ約５ＣＪｌの結紮した腸ループに加える場合、
コレラによる分泌を完全に陪止することができた。ＣＴ
Ｂの代わりにＭＷｌ液単独で予備処理し、その後同一用
量のコレラトキシンを注入した対照ループにおいては著
しい腸液の蓄積〈１．７±０．２ｚＺ／ｃｍ）が見られ
たが、トキシンチャレンジ前に１０μｇまたはそれ以下
の量のＣＴ［ｌで予備処理したループでは、緩衝液予備
処理対照と比べて腸液蓄積の部分的減少が見られたか、
または蓄積が全く見られなかった．４．３ ｌゴマー
および＾ ブユニット の Δ能一 他の実験において、組換えＣＴＢはそのオリゴマー化能
力およびコレラトキシンの＾サブユニット（ＣＴ＾）と
の会合能力の両方に影響を受けていないことが明らかに
なった．これらの実験のために、精製ＣＴ＾（５６９Ｂ
Ｃ丁からｌｌｌＫｉ ；Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を精製組換えＣＴＢ
または５８９８ ＣＴ［ｌと、完全なＣＴ中に通常見ら
れるＣＴＢ対ＣＴ＾のモル比で混きし、２００μｇ７ｍ
ｌの総タンパク質濃度を得た．混合後、試料を０．２Ｍ
グリシンＭ箇液（ｐＨ２．７＞で酸性化し、次いで０．
０５Ｎ｝リスＵＳ液（ｐＨ８．０） （数回取り換えた
〉に対して一晩透析することにより中和した．中和した
試料はその後ＳＪＳ Ｉ！ａｒｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｐｒ
ｏｃＮａｔｌ＾ｃａｄＳｃｉＵＳ＾，ｉｎ ｐｒｅｓｓ
１９８８に記載されるとおりにサブユニット特異的モ
ノクローナル抗体を用いた（；Ｍ １ − ＥＬＩＳ＾
により試験した．ホロトキシンを与えるべく組換えＣＴ
Ｂまたは５６９Ｂ ＣＴＢと会合した５６９８ ＣＴ＾
の量は、標準として未処理の相同コレラトキシンを用い
て算出した．結果を表２に示す．それらは、検出用ＣＴ
Ｂ特異的モノクローナル抗体がＢペンタマ一体とのみ反
応することが知られているので、モノマーＣＴＢよりも
むしろベンタマーＣＴＢの直接的測定である免疫反応性
ＣＴＢの高い回収を示す．それらはまた免疫反応性ＣＴ
＾の高い回収を示し、これは非会合ＣＴ＾がＣ８１被覆
プラスチックウエルに結きしないために検出されないの
で、ＣＴＢと会合したＣＴＡ量の直接的測定である。
組換えＣＴＢおよび精製した標準５６９８ ＣＴＢはこ
れらの実験において非常に類似した挙動を示す（表２参
照〉． 宍；翻 ＣＴ＾との会合 ＣＴ＾ｕｇ／＋ｙｅ ＣＴＢ
）Ｈｈ！５６９８ ＣＴ［ｌ ４３．３（
６！ｄ） ＋ １１４．０（８６１）ＣＴ＾に
対する組ｊ奥えＣＴＩＩまたは５６９Ｂ ＣＴＢの親和
性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで会合してコレラホロトキシン
を形成するそれらの能力により試験した。モル比１５の
ＣＴ＾とＣＴＢの混合物はｐＨ２ ． ７に酸性化して
ＣＴＢペンタマーを解離させた， ＣＴ＾と添加ＣＴＩ
Ｉとの会合はトリス（ｐＨ８．０）に対する透析による
溶液の中和により有利に行われた．中和した試料はＣＴ
＾−およびＣＴ［ｌ一特異的モノクローナル抗体を用い
たＧｌ４１ＥＬＩＳ＾により直接検定した． ｔ％で表される値は理論的にホロトキシンを形成しうる
最大里に対し，て計算されたＣＴとして見出されたサブ
ユニットの部分を意味する．４，４ えＣＴＢの 成熟ウサギに３０μｇの組換えＣＴＢまたは５６９Ｂ
ＣＴＢによる皮下免疫感作を２週問おきに３回与えた．
タンパク質は第１回目の接種では完全フロインドアジュ
バン１・と共に投与し、その後は不完全アジュバントと
共に投与した．３回目の免疫感作の２週間後に、動物か
ら血液を採取し、そして分析のために血清を集めた． 二重ゲル内＃．ｐＩＬ免疫沈降分析法、とりわけオクテ
ルロニー法（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）がＣＪａｄｓｗ
ｏｒＬｈ，Ｉｎｔ＾ｒｃｈ＾ｌｌｅｒ＋ｒｙ １７：１
６５−１７７．１９５７に記載のマイクロチャンバ一系
を用いて行われた．この実験は反応体として精製組換え
Ｃ丁Ｂおよび５６９Ｂ ＣＴＢ並びに対応するウサギ免
疫血清を用いて実施された．結果は組換えＣＴＢと天然
ＣＴＢとの間でいかなる“支線（ｓｐｕｒ）”もない融
合の沈降線を示し、免疫学的同一性を示した（第５図参
照）． 組換えＣＴＢおよび５６９Ｂ ＣＴＢのそれぞれに対す
るウサギ免疫血清中の抗毒素抗体の滴定は、ＧＮ１ｌＩ
Ｉ．覆プレートに結合させた抗原としての精製組換えＣ
ＴＢおよび５６９８ ＣＴＢを用いた（：Ｍ１−ＥＬＩ
Ｓ＾により行われた（＾−Ｈ Ｓｖｅｎｎｅｒｂｏｌｍ
ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ１４７：５１
４−５２ｆ，１９８３）．Ｇ）４１ −ＥＬＩＳ＾での
抗ＣＴＢの力価は、固相抗原として２種類のＣＴｆｌ調
′＃物のいずれかを用いて試験した抗組換えＣＴ［ｌお
よび抗５６９ＢＣ丁Ｂに関して類似しており、４Ｘ１０
’へＩＸＩＯ’の範囲であった． 中和抗体は試験トキシンとして精製５６９８ ＣＴを用
いてＪ．Ｐ．Ｃｒａｉｇの皮膚テスト（Ｎａｔｕｒｅ
２０７：６１４６１６，１９６５１）により検定した．
熱不活化血清は１０ｘｇ／ａｔのウシ血清アルブミンを
補給した生理学的リン酸緩衝溶液中の４０ｎｇ／ｍｅの
精製５６９８ ＣＴの等容量と連続希釈により混合し、
その後この混合物０．１ｄは皮肉注射により残留毒性に
ついて試験した．中和抗毒素の力価も組換えＣＴｔｌま
たは５６９ＢＣＴＢに対ずる血清間に差異がなかった。
れらの実験において非常に類似した挙動を示す（表２参
照〉． 宍；翻 ＣＴ＾との会合 ＣＴ＾ｕｇ／＋ｙｅ ＣＴＢ
）Ｈｈ！５６９８ ＣＴ［ｌ ４３．３（
６！ｄ） ＋ １１４．０（８６１）ＣＴ＾に
対する組ｊ奥えＣＴＩＩまたは５６９Ｂ ＣＴＢの親和
性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで会合してコレラホロトキシン
を形成するそれらの能力により試験した。モル比１５の
ＣＴ＾とＣＴＢの混合物はｐＨ２ ． ７に酸性化して
ＣＴＢペンタマーを解離させた， ＣＴ＾と添加ＣＴＩ
Ｉとの会合はトリス（ｐＨ８．０）に対する透析による
溶液の中和により有利に行われた．中和した試料はＣＴ
＾−およびＣＴ［ｌ一特異的モノクローナル抗体を用い
たＧｌ４１ＥＬＩＳ＾により直接検定した． ｔ％で表される値は理論的にホロトキシンを形成しうる
最大里に対し，て計算されたＣＴとして見出されたサブ
ユニットの部分を意味する．４，４ えＣＴＢの 成熟ウサギに３０μｇの組換えＣＴＢまたは５６９Ｂ
ＣＴＢによる皮下免疫感作を２週問おきに３回与えた．
タンパク質は第１回目の接種では完全フロインドアジュ
バン１・と共に投与し、その後は不完全アジュバントと
共に投与した．３回目の免疫感作の２週間後に、動物か
ら血液を採取し、そして分析のために血清を集めた． 二重ゲル内＃．ｐＩＬ免疫沈降分析法、とりわけオクテ
ルロニー法（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）がＣＪａｄｓｗ
ｏｒＬｈ，Ｉｎｔ＾ｒｃｈ＾ｌｌｅｒ＋ｒｙ １７：１
６５−１７７．１９５７に記載のマイクロチャンバ一系
を用いて行われた．この実験は反応体として精製組換え
Ｃ丁Ｂおよび５６９Ｂ ＣＴＢ並びに対応するウサギ免
疫血清を用いて実施された．結果は組換えＣＴＢと天然
ＣＴＢとの間でいかなる“支線（ｓｐｕｒ）”もない融
合の沈降線を示し、免疫学的同一性を示した（第５図参
照）． 組換えＣＴＢおよび５６９Ｂ ＣＴＢのそれぞれに対す
るウサギ免疫血清中の抗毒素抗体の滴定は、ＧＮ１ｌＩ
Ｉ．覆プレートに結合させた抗原としての精製組換えＣ
ＴＢおよび５６９８ ＣＴＢを用いた（：Ｍ１−ＥＬＩ
Ｓ＾により行われた（＾−Ｈ Ｓｖｅｎｎｅｒｂｏｌｍ
ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ１４７：５１
４−５２ｆ，１９８３）．Ｇ）４１ −ＥＬＩＳ＾での
抗ＣＴＢの力価は、固相抗原として２種類のＣＴｆｌ調
′＃物のいずれかを用いて試験した抗組換えＣＴ［ｌお
よび抗５６９ＢＣ丁Ｂに関して類似しており、４Ｘ１０
’へＩＸＩＯ’の範囲であった． 中和抗体は試験トキシンとして精製５６９８ ＣＴを用
いてＪ．Ｐ．Ｃｒａｉｇの皮膚テスト（Ｎａｔｕｒｅ
２０７：６１４６１６，１９６５１）により検定した．
熱不活化血清は１０ｘｇ／ａｔのウシ血清アルブミンを
補給した生理学的リン酸緩衝溶液中の４０ｎｇ／ｍｅの
精製５６９８ ＣＴの等容量と連続希釈により混合し、
その後この混合物０．１ｄは皮肉注射により残留毒性に
ついて試験した．中和抗毒素の力価も組換えＣＴｔｌま
たは５６９ＢＣＴＢに対ずる血清間に差異がなかった。
両方の型の抗血清はＩＸＩＯ−’までの濃度で２０ｇの
ＣＴを完全に中和することができた． ５．ハイブリッドＣＴＢ 人タンパクのｔ＆ｃ
Ｐｔ゛ ＣＴＢＭ伝子をｔａｃＰｉｌｆｔｉｆ下におくための実
施例ｌに記載した操作は、設計により、ＣＴＢアミノ末
端への遺伝子融合用の単一酵素制限部位の導入を含んで
いた。これらの部位へのクローニングは、先の実施例に
おいてＣＴＢそれ自体について記載したものと同じ外来
プロモーター（例． ＬａｅＰ）の発現制御下にある、
例えば推定上のワクチンベプチド抗原を有するＣＴ［ｌ
誘導ハイブリッドタンパク質の構築を可能にする．この
方法の実施可能性は、ｔａｃＰ誘導過剰発現系中のＣＴ
Ｂのアミノ末端への合成オリゴデオキシヌクレオチドに
よりコードされる熱安定性Ｅ．ｃｏｌｉエンテロトキシ
ン（Ｓｔａ）関連ベブチドの融合によってここに例示さ
れる． ５．１１１一第！目４聖一 リーダーベプチドと戒熟ＣＴＢとの接合点に１つのＳａ
ｃ ｌおよびＸｍａ Ｉ （Ｓｅａ Ｉ ）制限部位（
第ＩＢ図参照）を含むブラスミドｐＪｓｌ６２は対応す
る２つの酵素で消化し、ＳＴａ関連デカベブチドＣｙｓ
一八ｌｍ−（；ＩＩＩ一Ｌｅｕ−Ｃｙｓ − Ｃｙｓ−
＾ｓｎ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ｃｙｓをコードする合成オリ
ゴデオキシヌクレオチドにＳａｃ ［およびＸｍａ ｒ
適合性末端を介して連結したく第６図参照）．これによ
り得られたｐＪＳ ８ブラスミドはい±Ｐプロモーター
の制御下にある融合タンパク質（両端に数個のｉｌｌ加
アミノ酸をもつＳＴａ関連デカベプチドが、第６図に示
すように成熟ＣＴロのアミノ末端に共有結合で連結され
たもの）をコードするハ１ イブリッド遺伝子わもたらした．融合されたＳＴａ間連
デカベプチドの配列は、システイン残基がアラニンによ
って置換されたことを除いて、天然ＳＴａ中の領域と同
じであった．！！ばれた配列は、このアミノ酸置損を含
む！Ｉｌ！毒性合成ノナデカベプチドがＥ．ｃｏｌｉ
ＳＴａを中和する能力のある抗ＳＴａモノクーナル抗体
と特異的に結合することができるという以前の発見に基
づいていた（＾−Ｎ Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌ＋＊ｅｔ
ａｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，ｉｎ
ｐｒｅｓｓ １９８８）． Ｌ−かしながら、ここで
融合された配列はそれよりも短く、４個のシステイン含
む１０個のみのアミノ酸から成っていた。
ＣＴを完全に中和することができた． ５．ハイブリッドＣＴＢ 人タンパクのｔ＆ｃ
Ｐｔ゛ ＣＴＢＭ伝子をｔａｃＰｉｌｆｔｉｆ下におくための実
施例ｌに記載した操作は、設計により、ＣＴＢアミノ末
端への遺伝子融合用の単一酵素制限部位の導入を含んで
いた。これらの部位へのクローニングは、先の実施例に
おいてＣＴＢそれ自体について記載したものと同じ外来
プロモーター（例． ＬａｅＰ）の発現制御下にある、
例えば推定上のワクチンベプチド抗原を有するＣＴ［ｌ
誘導ハイブリッドタンパク質の構築を可能にする．この
方法の実施可能性は、ｔａｃＰ誘導過剰発現系中のＣＴ
Ｂのアミノ末端への合成オリゴデオキシヌクレオチドに
よりコードされる熱安定性Ｅ．ｃｏｌｉエンテロトキシ
ン（Ｓｔａ）関連ベブチドの融合によってここに例示さ
れる． ５．１１１一第！目４聖一 リーダーベプチドと戒熟ＣＴＢとの接合点に１つのＳａ
ｃ ｌおよびＸｍａ Ｉ （Ｓｅａ Ｉ ）制限部位（
第ＩＢ図参照）を含むブラスミドｐＪｓｌ６２は対応す
る２つの酵素で消化し、ＳＴａ関連デカベブチドＣｙｓ
一八ｌｍ−（；ＩＩＩ一Ｌｅｕ−Ｃｙｓ − Ｃｙｓ−
＾ｓｎ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ｃｙｓをコードする合成オリ
ゴデオキシヌクレオチドにＳａｃ ［およびＸｍａ ｒ
適合性末端を介して連結したく第６図参照）．これによ
り得られたｐＪＳ ８ブラスミドはい±Ｐプロモーター
の制御下にある融合タンパク質（両端に数個のｉｌｌ加
アミノ酸をもつＳＴａ関連デカベプチドが、第６図に示
すように成熟ＣＴロのアミノ末端に共有結合で連結され
たもの）をコードするハ１ イブリッド遺伝子わもたらした．融合されたＳＴａ間連
デカベプチドの配列は、システイン残基がアラニンによ
って置換されたことを除いて、天然ＳＴａ中の領域と同
じであった．！！ばれた配列は、このアミノ酸置損を含
む！Ｉｌ！毒性合成ノナデカベプチドがＥ．ｃｏｌｉ
ＳＴａを中和する能力のある抗ＳＴａモノクーナル抗体
と特異的に結合することができるという以前の発見に基
づいていた（＾−Ｎ Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌ＋＊ｅｔ
ａｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，ｉｎ
ｐｒｅｓｓ １９８８）． Ｌ−かしながら、ここで
融合された配列はそれよりも短く、４個のシステイン含
む１０個のみのアミノ酸から成っていた。
この構築において用いた実験方法および試薬類は以下で
詳述するとおりであった。Ｅ．ｃｏｌｉ ８８１０１株
はブラスミド単離のための一時的宿主として使用した，
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＪＳ １５６９株はＣＶＤ
１０３株リファンピシン耐性誘導株である， Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｓ１７ − １はＪＳ１５６９株へのブラスミド
の接合転移のために使用した．これらの菌株の供給源お
よびさらなる特性は実施例１に記載した， Ｃｓα／エ
チジウムブロミド勾配での遠心を含むアルカリ溶菌法に
よるプラスミドＤＮＡの単離、Ｅ．ｃｏｌｉへのＯＮ＾
形質転換およびＶ．ｅｈｏｌｅｒａｅへの接合はＮａｎ
ｉａｔｉｓ ｅｔ ａｔ（１９８２）に従って行われ、
実施例１に詳述したとおりであった．ＤＮ＾の制限およ
び連結のために用いた条件はそれぞれの酵素の供給者の
勧めに従った．酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｎａｎｎ
ｈｅｉａ＋社およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｅｓ社から購入した， ＳＴａ関連デカペプチド
および隣接アミノ酸をコードする合成オリゴデオキシヌ
クレオチドはスウェーデン国ウプサラ、バイオメディカ
ルセンター、免疫学部（Ｌｅａａ Ｓａｓｕｅｌｓｓｏ
ｎ博士）Ｎ から相補浦な一本鎖として購入した．実施例ｌに記載の
条件下に室温で対合させた後、合成二本鎖オリゴデオキ
シヌクレオチドはその５′末端にＳａｃ Ｉと適合しう
る一本鎖末端およびその３′末端にκｍｍｌと適合しう
る一本鎖末端を有していた．ｐ．ｔｓ ８プラスミドを
保有するＥ．ｃｏｌｉ １０１またはＶ．ｅｈｏｌｅｒ
ａｅ ＪＳ１５６９の培養物は、適宜にアンビシリン（
１００μＩＦ／ ＩＮ＞および／またはりファンビシン
（５０Ａｔｙ／ ｍｅ＞を含む液状ＬＤ培地中３７℃（
Ｅ．ｃｏｌｉ）でまたは３０℃（Ｖ．ｅｈｏｌｅｒａｅ
）で連続振とうしながら、一晩あるいは希望の光学密度
（Ｂｏｏｎｓ）に達するまで増殖させた．イソブロビル
ーβ一ローチオーガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によ
るｔａｃＰプロモーターからの発現誘導は、培養開始時
にそれを加える（最終濃度０．４ｍＮ）ことにより、あ
るいは初めに誘導物質の不在下で０［１．。。＝０．５
へ閑株を増殖させ、次いでＩＰＴＧを加えて収穫前にさ
らに４時間培養を続けることにより達成した．増殖後、
ｍｍａ胞と培養上清とは微量遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ ）で５分間遠心することにより分離した．４１胞ベ
レットは冷リン酸緩衝溶液（ｐｌ１７．２）中に再懸濁
し、２回の３０秒音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎソニファイ
アー）により破壊した．Ｅ清および音波処理細胞中のＳ
ＴａとＣＴＢ抗原の検出は、天然ＳＴａおよびＣＴＢに
対してそれぞれ誘導されたモノクローナル抗体を用いて
（；Ｍｌ − ＥＬＩＳ＾により行った（Ｊ Ｓａｎｃ
ｈｅｚ ｅＬ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０
８：１９４１９８，１９８６） ． ｐＪｓ８によりコード′されるＳＴａ関連デカペプチド
ーＣＴＢハイブリッドは初めに、上記のようにＩＰＴＧ
の存在下で増殖させた形質転換Ｅ．ｅｏｌｉ １０１に
おいて同定された．その後、ブラスミドｐＪＳ ８はヘ
ルパーＥ．ｃｏｌｉ株（Ｓ１７−１＞からＶ．ｃｈｏｌ
ｅｒａｅ ＪＳ１５６９へく実施例１に記載の同一方法
を用いて）接合により転移させた．この生物によるハイ
ブリッド遺伝子の発現は、対数増殖期の間さまざまな濃
度のｒＰＴｌｌ；を加えて培養した後に試験し、そして
デカベプチドーＣＴｔｌタンパク質の細胞局在化も実施
例ｌでＣＴＢ単独について記載した方法と類似した方法
により調べた．第７図に示す結果は、ハイブリッドタン
パク質が明らかにＩＰＴＣに依存した関係で生産され、
細胞外環境に十分に分泌されたことを表している。
詳述するとおりであった。Ｅ．ｃｏｌｉ ８８１０１株
はブラスミド単離のための一時的宿主として使用した，
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ ＪＳ １５６９株はＣＶＤ
１０３株リファンピシン耐性誘導株である， Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｓ１７ − １はＪＳ１５６９株へのブラスミド
の接合転移のために使用した．これらの菌株の供給源お
よびさらなる特性は実施例１に記載した， Ｃｓα／エ
チジウムブロミド勾配での遠心を含むアルカリ溶菌法に
よるプラスミドＤＮＡの単離、Ｅ．ｃｏｌｉへのＯＮ＾
形質転換およびＶ．ｅｈｏｌｅｒａｅへの接合はＮａｎ
ｉａｔｉｓ ｅｔ ａｔ（１９８２）に従って行われ、
実施例１に詳述したとおりであった．ＤＮ＾の制限およ
び連結のために用いた条件はそれぞれの酵素の供給者の
勧めに従った．酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｎａｎｎ
ｈｅｉａ＋社およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｅｓ社から購入した， ＳＴａ関連デカペプチド
および隣接アミノ酸をコードする合成オリゴデオキシヌ
クレオチドはスウェーデン国ウプサラ、バイオメディカ
ルセンター、免疫学部（Ｌｅａａ Ｓａｓｕｅｌｓｓｏ
ｎ博士）Ｎ から相補浦な一本鎖として購入した．実施例ｌに記載の
条件下に室温で対合させた後、合成二本鎖オリゴデオキ
シヌクレオチドはその５′末端にＳａｃ Ｉと適合しう
る一本鎖末端およびその３′末端にκｍｍｌと適合しう
る一本鎖末端を有していた．ｐ．ｔｓ ８プラスミドを
保有するＥ．ｃｏｌｉ １０１またはＶ．ｅｈｏｌｅｒ
ａｅ ＪＳ１５６９の培養物は、適宜にアンビシリン（
１００μＩＦ／ ＩＮ＞および／またはりファンビシン
（５０Ａｔｙ／ ｍｅ＞を含む液状ＬＤ培地中３７℃（
Ｅ．ｃｏｌｉ）でまたは３０℃（Ｖ．ｅｈｏｌｅｒａｅ
）で連続振とうしながら、一晩あるいは希望の光学密度
（Ｂｏｏｎｓ）に達するまで増殖させた．イソブロビル
ーβ一ローチオーガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によ
るｔａｃＰプロモーターからの発現誘導は、培養開始時
にそれを加える（最終濃度０．４ｍＮ）ことにより、あ
るいは初めに誘導物質の不在下で０［１．。。＝０．５
へ閑株を増殖させ、次いでＩＰＴＧを加えて収穫前にさ
らに４時間培養を続けることにより達成した．増殖後、
ｍｍａ胞と培養上清とは微量遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ ）で５分間遠心することにより分離した．４１胞ベ
レットは冷リン酸緩衝溶液（ｐｌ１７．２）中に再懸濁
し、２回の３０秒音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎソニファイ
アー）により破壊した．Ｅ清および音波処理細胞中のＳ
ＴａとＣＴＢ抗原の検出は、天然ＳＴａおよびＣＴＢに
対してそれぞれ誘導されたモノクローナル抗体を用いて
（；Ｍｌ − ＥＬＩＳ＾により行った（Ｊ Ｓａｎｃ
ｈｅｚ ｅＬ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０
８：１９４１９８，１９８６） ． ｐＪｓ８によりコード′されるＳＴａ関連デカペプチド
ーＣＴＢハイブリッドは初めに、上記のようにＩＰＴＧ
の存在下で増殖させた形質転換Ｅ．ｅｏｌｉ １０１に
おいて同定された．その後、ブラスミドｐＪＳ ８はヘ
ルパーＥ．ｃｏｌｉ株（Ｓ１７−１＞からＶ．ｃｈｏｌ
ｅｒａｅ ＪＳ１５６９へく実施例１に記載の同一方法
を用いて）接合により転移させた．この生物によるハイ
ブリッド遺伝子の発現は、対数増殖期の間さまざまな濃
度のｒＰＴｌｌ；を加えて培養した後に試験し、そして
デカベプチドーＣＴｔｌタンパク質の細胞局在化も実施
例ｌでＣＴＢ単独について記載した方法と類似した方法
により調べた．第７図に示す結果は、ハイブリッドタン
パク質が明らかにＩＰＴＣに依存した関係で生産され、
細胞外環境に十分に分泌されたことを表している。
デカベブチドーＣＴＢのこの所在は、実施ＩＭ４に組換
えＣＴ！ＩＱｌ独について記載した方法と同じ方法でリ
ゾーＧＭＩアフィニティーク口マトグラフィーによりそ
れを精製することを可能にした。
えＣＴ！ＩＱｌ独について記載した方法と同じ方法でリ
ゾーＧＭＩアフィニティーク口マトグラフィーによりそ
れを精製することを可能にした。
デカペブチドーＣＴＢの性質を調べるために、ハイブリ
ッドタンパク質はＪＬ Ｔａｙｏｔ ｅＬ ａｌ，Ｅｕ
ｒ ＪＢｉｏｅｈｅｍ，１１３：２４９−２５８．１９
８１に記載Ｖ）一段階アフィニティーク口マトグラフィ
ーによりブラスミドｐＪＳ８を保有するＶ．ｃｌ＋ｏ！
ｅｒａｅ ＪＳ１５６９株の培ｉ−Ｅ清から精製した． ５μｇの精製タンパク質または漂準ＣＴＢはその後β−
メルカプトエタノールの不在下で１３．５％ＳＯＳボリ
アクリルアミドゲル電気泳動にがけた．タンパク質試料
はそれらのベンタマーおよびモノマ一体を分析するため
に、電気泳動前に煮沸するが、あるいは試料緩衝液中に
室温で静置した（ＴＲ ｌｌｉｒｓｔ＆Ｊ Ｈｏｌ邦ｒ
ｅｎ，ＰｒｏＣＮａｔｌ＾ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ＾８４
：７４１８− ７４２２ ． １９８７を参照されたい
）．分離したタンパク質はそｖ）後抗ＳＴａ ′ｉたは
抗Ｃ’ＴＢモノク口ーナル抗体との反応、続いてベルオ
キシダーゼに結きした抗マウスＩＨＧ（Ｊａｅｋｓｏｎ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）とのインキエベーション
のために、ニトロセルロースに電気科行させた．最後に
、免疫反応性タンパク質バンドはα−クロロナフ｝−−
ル基質を用いて発現させた。
ッドタンパク質はＪＬ Ｔａｙｏｔ ｅＬ ａｌ，Ｅｕ
ｒ ＪＢｉｏｅｈｅｍ，１１３：２４９−２５８．１９
８１に記載Ｖ）一段階アフィニティーク口マトグラフィ
ーによりブラスミドｐＪＳ８を保有するＶ．ｃｌ＋ｏ！
ｅｒａｅ ＪＳ１５６９株の培ｉ−Ｅ清から精製した． ５μｇの精製タンパク質または漂準ＣＴＢはその後β−
メルカプトエタノールの不在下で１３．５％ＳＯＳボリ
アクリルアミドゲル電気泳動にがけた．タンパク質試料
はそれらのベンタマーおよびモノマ一体を分析するため
に、電気泳動前に煮沸するが、あるいは試料緩衝液中に
室温で静置した（ＴＲ ｌｌｉｒｓｔ＆Ｊ Ｈｏｌ邦ｒ
ｅｎ，ＰｒｏＣＮａｔｌ＾ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ＾８４
：７４１８− ７４２２ ． １９８７を参照されたい
）．分離したタンパク質はそｖ）後抗ＳＴａ ′ｉたは
抗Ｃ’ＴＢモノク口ーナル抗体との反応、続いてベルオ
キシダーゼに結きした抗マウスＩＨＧ（Ｊａｅｋｓｏｎ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）とのインキエベーション
のために、ニトロセルロースに電気科行させた．最後に
、免疫反応性タンパク質バンドはα−クロロナフ｝−−
ル基質を用いて発現させた。
結果を第８図に示す．抗ＣＴＢとの反応は、対照ＣＴ［
ｌまたはＳＴａ関連デカベプチドーＣＴＢハイブリッド
タンパク質のベンタマ一体について予期された泣置にバ
ンドを出現させた．それぞれの煮沸および非煮沸試料と
抗ＳＴａモノクローナル抗体とのインキュベージョンは
、デカベフ゜チドーＣＴロタンパク質のぺ〉・タマーお
よびモノマ一体に相当するバンドを発現させたが、対照
ＣＴＤのベンタマーまたは七ノマ一体の場合にはネガテ
ィブな反応を与えた。ＣＴｒｌのモノマ一体は抗ＣＴＢ
と反応しなかったが、デカベプチドーＣＴＢのモノマ一
体とこの抗体とのわずかな反応が観京された． デカベブチド−ＣＴＢタンパク質は、＾−Ｈ Ｓｖｅｎ
ｎｅｒｌ＋ｏｌｍ ｅＬ ａｌ， ＦＥＮＳ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ，１９
８８に記載のとおりに行った未成熟マウス胃内注入検定
において１０μｇまでの量で試験したとき、毒性を全く
示さなかった．平行して試験した精製天然ＳＴａ （八
−Ｍ Ｓｙｅｎｎｅｒｌ＋ｏｌ一博士から入手〉は下限
１１１ｇの量（すなわち、１０，０００倍低い用ｍ−＞
でポジティブの未成熟マウステストを与えた。ＳＴａ関
連デカベプチドーＣＴ［ｌハイブリッドタンパク質はＧ
ＭＩ一εＬＩＳ＾およびイムノブロツｌ・分析の両方に
おいて抗Ｓ丁ａモノクローナル抗体と効率よく結合する
ことができたく第７および８図参照）。さらに、ハイブ
リッドタンパク質はＣＴＢｒｇ．分に特徴的な数多くの
竹質、例えば５−ｔ体化する能力、ＣＮ１レセブターに
結きする能力、およびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅから分泌さ
れる能力を示した。これらの性質は組喚えＣＴＢ単猟に
ついて実施例４に記載した方法を用いて調べた、猜製し
たタンパク質をウサギの免疫感作に用いたとき、天然Ｓ
Ｔａと交差反応する抗体が誘起された。固相抗原として
き成のプラスチック被覆ＳＴａを用いてＥＬＩＳ＾によ
り測定した抗ＳＴａの力価は、前免疫感作血清における
検出不能レベルから３回の皮下免疫感作後に１ ：２０
００の力価に上昇し、これは化学的に誘導された天然Ｓ
Ｔａ含有ハイブリッドタンパク質を用いてウサギを免疫
化したときに得ｔ，れた力価と比べて優れていた。ＳＴ
ａ関連デカベブチドーＣＴＩＩタンパク質の免疫原性を
、その毒性のＩｔ’｛失およびＣＩ４１腸レセプターを
ｉ！識するその能力と合わせて考えると、このハイブリ
ッドタンパク質は動物およびヒｌ一におけるＳＴａ関連
大腸菌下的に対する経口免疫感作用の候補トキソイドと
なるであろう。
ｌまたはＳＴａ関連デカベプチドーＣＴＢハイブリッド
タンパク質のベンタマ一体について予期された泣置にバ
ンドを出現させた．それぞれの煮沸および非煮沸試料と
抗ＳＴａモノクローナル抗体とのインキュベージョンは
、デカベフ゜チドーＣＴロタンパク質のぺ〉・タマーお
よびモノマ一体に相当するバンドを発現させたが、対照
ＣＴＤのベンタマーまたは七ノマ一体の場合にはネガテ
ィブな反応を与えた。ＣＴｒｌのモノマ一体は抗ＣＴＢ
と反応しなかったが、デカベプチドーＣＴＢのモノマ一
体とこの抗体とのわずかな反応が観京された． デカベブチド−ＣＴＢタンパク質は、＾−Ｈ Ｓｖｅｎ
ｎｅｒｌ＋ｏｌｍ ｅＬ ａｌ， ＦＥＮＳ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ，１９
８８に記載のとおりに行った未成熟マウス胃内注入検定
において１０μｇまでの量で試験したとき、毒性を全く
示さなかった．平行して試験した精製天然ＳＴａ （八
−Ｍ Ｓｙｅｎｎｅｒｌ＋ｏｌ一博士から入手〉は下限
１１１ｇの量（すなわち、１０，０００倍低い用ｍ−＞
でポジティブの未成熟マウステストを与えた。ＳＴａ関
連デカベプチドーＣＴ［ｌハイブリッドタンパク質はＧ
ＭＩ一εＬＩＳ＾およびイムノブロツｌ・分析の両方に
おいて抗Ｓ丁ａモノクローナル抗体と効率よく結合する
ことができたく第７および８図参照）。さらに、ハイブ
リッドタンパク質はＣＴＢｒｇ．分に特徴的な数多くの
竹質、例えば５−ｔ体化する能力、ＣＮ１レセブターに
結きする能力、およびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅから分泌さ
れる能力を示した。これらの性質は組喚えＣＴＢ単猟に
ついて実施例４に記載した方法を用いて調べた、猜製し
たタンパク質をウサギの免疫感作に用いたとき、天然Ｓ
Ｔａと交差反応する抗体が誘起された。固相抗原として
き成のプラスチック被覆ＳＴａを用いてＥＬＩＳ＾によ
り測定した抗ＳＴａの力価は、前免疫感作血清における
検出不能レベルから３回の皮下免疫感作後に１ ：２０
００の力価に上昇し、これは化学的に誘導された天然Ｓ
Ｔａ含有ハイブリッドタンパク質を用いてウサギを免疫
化したときに得ｔ，れた力価と比べて優れていた。ＳＴ
ａ関連デカベブチドーＣＴＩＩタンパク質の免疫原性を
、その毒性のＩｔ’｛失およびＣＩ４１腸レセプターを
ｉ！識するその能力と合わせて考えると、このハイブリ
ッドタンパク質は動物およびヒｌ一におけるＳＴａ関連
大腸菌下的に対する経口免疫感作用の候補トキソイドと
なるであろう。
４，〔図面の簡単な説明〕
第１図＾は、ＬＴＢ３１！伝子とＣＴ［ｌ遺伝子との融
き接点の配列を示す配列図である． 第１図ロは、ｔａｃＰプロモーターの制御下にあるＣＴ
８遺伝子を有するプラスミドｐＪｓ１６２を表わす模式
同である． 第２図は、ブラスミドｐＪｓ１６２中のＣＴＳ遺伝子の
ヌクレオチド配列を示す配列図である．第３図は、コレ
ラ菌をＩＰＴＧ：誘導した場合のＣＴＢ発現を表わす図
面である． 第４図は、種々のＣＴ［ｌ試刺のＰＡ（；Ｅの結果を表
わす模式図である． 第５図は、５８９８ ＣＴＢ及び組換えＣＴＢとウサギ
抗血清のオクテル口二一分析の結果を表す模式図で１）
る。
き接点の配列を示す配列図である． 第１図ロは、ｔａｃＰプロモーターの制御下にあるＣＴ
８遺伝子を有するプラスミドｐＪｓ１６２を表わす模式
同である． 第２図は、ブラスミドｐＪｓ１６２中のＣＴＳ遺伝子の
ヌクレオチド配列を示す配列図である．第３図は、コレ
ラ菌をＩＰＴＧ：誘導した場合のＣＴＢ発現を表わす図
面である． 第４図は、種々のＣＴ［ｌ試刺のＰＡ（；Ｅの結果を表
わす模式図である． 第５図は、５８９８ ＣＴＢ及び組換えＣＴＢとウサギ
抗血清のオクテル口二一分析の結果を表す模式図で１）
る。
第６図は、ＣＴＢにＳＴａ関連デカベプチドを融合した
場合の融合部の配列を示す配列図である．第７図は、ｐ
ＪＳ ８を有するコレラ菌をＩＰＴ（４，ｉ導した場合
のデカベブチドーＣＴ［ｌハイブリッド蛋内質の発現を
示す図面である。
場合の融合部の配列を示す配列図である．第７図は、ｐ
ＪＳ ８を有するコレラ菌をＩＰＴ（４，ｉ導した場合
のデカベブチドーＣＴ［ｌハイブリッド蛋内質の発現を
示す図面である。
第８図は、デカベブチドーＣＴＢハイブリッド蚤白質の
イムノブロッティングの結果を表わす模式図である． 砧百の浄書（丙雰に変史ない １ 凹 ＩＰＴ６のａ 窪，ＡＡｇ ／ｍｌ 第１頁の続き ＠Ｉｎｔ． ＣＩ，５ 識別記号 庁内整理？ ＠発 ＠出 ホアキン・サンチェ ス●カステイジョ ホアキン●サンチェ ス・カステイジョ メキシコ合衆国 ６２０２０ モレロス，クエルナバ
カ，コノいサン・アントン，ブリバダ・イクスエーホタ
セー・ヌメロ １４ メキシコ合衆国 ６２０２０ モレロス，クエルナバ
カ，コル・サン・アントン，ブリバダ・イクスエーホタ
セー・ヌメロ １４ −７７７一 手続補正書（方式） １。事件の表示 平成１年特許願第２３９７３３号 ２．発明の名称 外来プロモーターおよび／またはリーダーペブチドを用
いたコレラトキシンＢサブユニットの組換え発現系３．
補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 氏 名 ヤン・ホルムグレン （外ｌ名） ４．代理人 住 所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大
手町ビル２０６区 ５．補正命令の日付 平成 １年１２月２６日 （発送
日）６．補正の対象 適正な図面 明細書の図面の簡単な説明の濶 補正の内容 （１）明細書ＰｔＳ５４頁第１行ないしｆ：ＩＩＪ５行
の記載「第４図は、・・・模式図である．Ｊを次の通り
補正する。
イムノブロッティングの結果を表わす模式図である． 砧百の浄書（丙雰に変史ない １ 凹 ＩＰＴ６のａ 窪，ＡＡｇ ／ｍｌ 第１頁の続き ＠Ｉｎｔ． ＣＩ，５ 識別記号 庁内整理？ ＠発 ＠出 ホアキン・サンチェ ス●カステイジョ ホアキン●サンチェ ス・カステイジョ メキシコ合衆国 ６２０２０ モレロス，クエルナバ
カ，コノいサン・アントン，ブリバダ・イクスエーホタ
セー・ヌメロ １４ メキシコ合衆国 ６２０２０ モレロス，クエルナバ
カ，コル・サン・アントン，ブリバダ・イクスエーホタ
セー・ヌメロ １４ −７７７一 手続補正書（方式） １。事件の表示 平成１年特許願第２３９７３３号 ２．発明の名称 外来プロモーターおよび／またはリーダーペブチドを用
いたコレラトキシンＢサブユニットの組換え発現系３．
補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 氏 名 ヤン・ホルムグレン （外ｌ名） ４．代理人 住 所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大
手町ビル２０６区 ５．補正命令の日付 平成 １年１２月２６日 （発送
日）６．補正の対象 適正な図面 明細書の図面の簡単な説明の濶 補正の内容 （１）明細書ＰｔＳ５４頁第１行ないしｆ：ＩＩＪ５行
の記載「第４図は、・・・模式図である．Ｊを次の通り
補正する。
『 第４図は種々のＣＴＩ３拭料について、ドデシル硫
酸ナトリウムーボリアクリルアミドデルＭｌ気泳動の結
果を示す写真である。
酸ナトリウムーボリアクリルアミドデルＭｌ気泳動の結
果を示す写真である。
Ｐｔ４５図は５６９ＢＣＴＢ及び組換えＣＴＢとウサギ
抗血清とについてのオクテルロニー分析の結果を示す写
真である。」 （２）明ＩＩ書第５４頁第１１〜１３行の記載「第８図
は、・・・模式図である。」を次の通り補正する。
抗血清とについてのオクテルロニー分析の結果を示す写
真である。」 （２）明ＩＩ書第５４頁第１１〜１３行の記載「第８図
は、・・・模式図である。」を次の通り補正する。
「第８図は種々のＣＴＢ拭料について、ドデシル硫酸ナ
トリウムーボリアクリルアミドデル電式泳動じ、引続い
て分離した蛋白試料をニトロセルロース紙上で電気的移
行した後のＳＴａｌｌ連デカベブチド一〇ＴＢハイブリ
ッド蛋白質の免疫プロッテング分析の結果を示す写真で
ある。」以 」ニ
トリウムーボリアクリルアミドデル電式泳動じ、引続い
て分離した蛋白試料をニトロセルロース紙上で電気的移
行した後のＳＴａｌｌ連デカベブチド一〇ＴＢハイブリ
ッド蛋白質の免疫プロッテング分析の結果を示す写真で
ある。」以 」ニ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、コレラトキシンの結合性サブユニットタンパク質（
ＣＴＢ）またはその誘導体の生産方法であつて： 組換えＤＮＡ法によって、ＣＴＢ遺伝子またはＣＴＢ誘
導体遺伝子の発現が外来（非コレラトキシン）プロモー
ターの転写制御下にあり、且つＣＴＢ遺伝子またはＣＴ
Ｂ誘導体遺伝子と上記外来プロモーターとの間の結合鎖
が該プロモーターとリボソーム結合部位（いわゆるシャ
イン−ダルガルノ配列）との間にコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏ
ｌｅｒａｅ）由来のＤＮＡを含まないように操作された
ＤＮＡを用いることを特徴とした上記方法。 ２、ＣＴＢまたはＣＴＢ誘導体タンパク質が外来（非コ
レラトキシン）リーダーペプチドと共に合成されるよう
に遺伝子操作されたＤＮＡを用いることを特徴とした、
請求項１記載の方法。 ３、ＣＴＢまたはＣＴＢ誘導体遺伝子の発現が誘導可能
な形態あるいは構成的形態のいずれかで￥ｔａｃ￥プロ
モーターの制御下におかれていることを特徴とした、請
求項１または２記載の方法。 ４、ＣＴＢまたはＣＴＢ誘導体遺伝子の発現がＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼ依存性プロモーターの制御下におかれて
いることを特徴とした、請求項１または２記載の方法。 ５、成熟ＣＴＢ（すなわち、その天然リーダーペプチド
を含まないＣＴＢ）の遺伝子を、ＬＴＢのリーダーペプ
チドのような外来（非コレラトキシン）リーダーペプチ
ドをコードするＤＮＡに結合させるために合成オリゴデ
オキシヌクレオチドを用いることを特徴とした、請求項
１〜４のいずれか１項記載の方法。 ６、オリゴヌクレオチド５′−ＣＣＣＧＧＧ−３′およ
び５′−ＴＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＴ−３′（合成または
天然由来のもの）のいずれか一方または両方を用いるこ
とを特徴とした、請求項１〜４のいずれか１項記載の方
法。 ７、オリゴヌクレオチド５′−【遺伝子配列があります
。】−３′お よび５′−【遺伝子配列があります。】 −３′のいずれか一 方または両方を用いることを特徴とした遺伝子クローニ
ング法。 ８、デカペプチドＮＨ＿２−【遺伝子配列があります。 】−ＣＯＯＨをコードするオリゴ ヌクレオチド配列を用いることを特徴とした遺伝子クロ
ーニング法。 ９、請求項７および８に記載のオリゴヌクレオチドのい
ずれか１つを用いることを特徴とした遺伝子融合タンパ
ク質の生産方法。 １０、請求項８記載のデカペプチド配列を含むいずれか
の鎖長の合成ペプチドを用いることを特徴とした方法。 １１、請求項８記載のデカペプチド配列を含むいずれか
の鎖長の合成ペプチドを用いることを特徴とした生産物
。 １２、請求項１〜９のいずれか１項によってコードされ
且つ転写制御されたＣＴＢまたはＣＴＢ誘導体を生産す
るために、コレラトキシン合成能を生来もたないか、あ
るいは遺伝子操作により無くしたコレラ菌（Ｖｉｂｒｉ
ｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）または他のビブリオナセア（Ｖ
ｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）細菌を用いることを特徴とし
た方法。 １３、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法によっ
て生産されたＣＴＢまたはＣＴＢ誘導体を含むことを特
徴としたワクチン、診断薬およびレセプター遮断薬。 １４、請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法によっ
て得られたペプチドを含むことを特徴としたワクチン、
診断薬または他の製品。 １５、ワクチンまたはワクチン成分として請求項１〜９
のいずれか１項に従って操作されたＤＮＡを保有する細
菌またはウイルスを用いることを特徴とした方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8803291-7 | 1988-09-16 | ||
| SE8803291A SE462285B (sv) | 1988-09-16 | 1988-09-16 | Expression av koleratoxinets bindande subenhet med hjaelp av fraemmande promotor- och/eller ledarpeptidstrukturer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0322997A true JPH0322997A (ja) | 1991-01-31 |
| JP2790333B2 JP2790333B2 (ja) | 1998-08-27 |
Family
ID=20373364
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1239733A Expired - Lifetime JP2790333B2 (ja) | 1988-09-16 | 1989-09-14 | 外来プロモーターおよび／またはリーダーペプチドを用いたコレラトキシンｂサブユニットの組換え発現系 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0368819B1 (ja) |
| JP (1) | JP2790333B2 (ja) |
| AT (1) | ATE161885T1 (ja) |
| AU (1) | AU633842B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340577C (ja) |
| DE (1) | DE68928529T2 (ja) |
| DK (1) | DK175694B1 (ja) |
| ES (1) | ES2113342T3 (ja) |
| FI (1) | FI104496B (ja) |
| GR (1) | GR3025846T3 (ja) |
| IS (1) | IS1804B (ja) |
| NO (1) | NO301175B1 (ja) |
| SE (1) | SE462285B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03187383A (ja) * | 1989-09-04 | 1991-08-15 | Takeda Chem Ind Ltd | 発現プラスミドおよびその用途 |
| US5356797A (en) * | 1991-11-15 | 1994-10-18 | Board Of Regents, The University Of Texas | Membrane expression of heterologous genes |
| EP0613500A1 (en) * | 1991-11-15 | 1994-09-07 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Membrane expression of heterologous genes |
| US5932714A (en) * | 1995-02-23 | 1999-08-03 | Connaught Laboratories Limited | Expression of gene products from genetically manipulated strains of Bordetella |
| US5998168A (en) * | 1995-06-07 | 1999-12-07 | Connaught Laboratories Limited | Expression of gene products from genetically manipulated strains of bordetella |
| US6008329A (en) * | 1998-03-06 | 1999-12-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Method for purifying cholera toxin |
| WO2007117339A2 (en) * | 2006-01-11 | 2007-10-18 | The United States Of America As Respresented By The Secretary Of The Navy | Adhesin-enterotoxin chimera based immunogenic composition against entertoxigenic escherichia coli |
| DE102011111688A1 (de) * | 2011-08-24 | 2013-02-28 | Bioserv Analytik Und Medizinprodukte Gmbh | Verfahren zur schnellen Isolation bzw. Aufreinigung von rekombinanten Proteinen mit einer (nicht toxischen) Choleratoxin-Domäne |
| CN109096403B (zh) * | 2018-07-04 | 2020-06-30 | 浙江工商大学 | 一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4666837A (en) * | 1982-05-24 | 1987-05-19 | Smithkline-Rit | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing the A and B subunits of cholera toxin and preparations containing so-obtained subunit or subunits |
| US5135862A (en) * | 1983-03-04 | 1992-08-04 | University Of Maryland | Method of isolating restriction fragment deletions in vibrio cholerae, products thereof |
| US4882278A (en) * | 1983-04-29 | 1989-11-21 | President And Fellows Of Harvard College | Non-toxinogenic vibrio cholerae mutants |
| EP0251579A3 (en) * | 1986-06-24 | 1989-03-22 | Enterovax Research Pty. Ltd. | Non-antibiotic marker system |
| DE3856199T2 (de) * | 1987-04-29 | 1999-02-04 | The President and Fellows of Harvard College, Cambridge, Mass. | Impfstoff gegen cholera |
-
1988
- 1988-09-16 SE SE8803291A patent/SE462285B/sv not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-09-04 IS IS3505A patent/IS1804B/is unknown
- 1989-09-11 ES ES89850295T patent/ES2113342T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-11 AT AT89850295T patent/ATE161885T1/de not_active IP Right Cessation
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