JPH03178997A - 抗凝血物質特性を有するタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血液凝固の役割は止血栓の硬着と安定化に対して不溶性
フィブリンマトリックスを与えることである。架橋した
フィブリン血餅の形成はある範囲の十分特徴のある血漿
タンパク質を含む一連の生化学相互作用に起因する。

相互作用はフィブリン形成に必要な物質量てが循環血漿
中に前駆体として存在する”内因系機序”と組織由来プ
ラスミノーゲンが数段階の過程を迂回し血餅形成を促進
する外因系機序と言われるものに分類される。この２つ
の機序は、非常に相互依存しており、■因子、ＩＸ因子
及びＸ因子は相互に活性化される（Ｊ、Ｃ，ギディング
ス（Ｇｉｄｄｉｎｇｓ）　”血液凝固の分子遺伝と免疫
分析”フィリスホアウッド社、チヂエスター、英国１９
８８年、　　１７頁）。

凝固カスケードに於けるＸ因子の役割は、ズア（Ｚｕｒ
ｌ等によって再検討されている。゛血液凝固の組織因子
機序”止面と血栓症初版（ブルーム（Ｂｌｏｏｍ１等編
）、チャーチルリビングストーン、ニブインバーブ、１
２４〜１３９頁（１９８１年）、ジャクソン（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ）、°゛プロトロンビン活性化の生化学”止血と
血栓症、第２版（ブルーム等、編）、チャーチルリビン
グストーン、ニブインバーブ、１６５〜１９１頁（１９
８７年）及びスタインバークｆｓｔｅｉｎｂｅｒｇ）等
。”Ｘ因子の活性化”止血と血栓症、初版（コルマン（
Ｃｏｌｍａｎｌ等、編）、リッピンコット、フィラデル
フィア、９１〜１１１頁（１９８２年）。

ヒトＸ因子は血漿中にドデシル硫酸ナトリウムの存在下
ゲル電気泳動によって測定した分子量約６７０００を有
する２本鎖の糖タンパク質として循環する（ジ　スキビ
オ（Ｄｉ　５ｃｉｐｉｏ等）、°゛ヒトプロトロンビン
■因子（クリスマス因子）、Ｘ因子（スチュアート因子
）及びプロティンＳの比較”生化学第１６巻、６９８〜
７０６頁）。

わずかに低いＭｒ値約５９０００は沈降平衡分析によっ
て得られる。正常な血漿濃度はｌβ当り約７〜ＪＯＢで
あり、タンパク質は約１５％のカルボキシル基を含む。

Ｘ因子の’１’ＪｖｉＭｒ＝　４２００ｆｌはブレトロ
ンビン２と高度の相同性を示し、活性部位セリンを含む
。ジスルフィド架橋によって軽鎖、Ｍｒ　＝　１７［］
Ｏｆｌに共相結合する。軽鎖は、ａ−カルボキシル化グ
ルタミン酸残基を含み、プロトロンビン断片１と著しい
相同性を示す。［Ｘ　ａ因子と■ａ因子の複合体による
又は組織因子／　Ｖｌｌ　ａ因子によるＸ因子の活性化
は少なくと４３２種のベブグド切断を含む１．主要な機
序は、アルギニン−イソロイシン結合の加水分解によっ
て重鎮の分−ｒから活性化中ベブヂドを遊離する。この
よう番１ニジて生した活性産物はａＸａ因子と吋ばれる
。これは更にカルボキシ末端近くのアルギニン−グリシ
ン結合の切断により修飾されてβＸａ因子を生しる。α
−Ｘａ及びβ−Ｘ、ａは共に同し凝固活性を示す。

Ｘ因子の軽鎖は活性化過程に影響されず、ジスルフィド
架橋によって分子の重鎮に結合したままである。このよ
うにして活性物質は、リン脂性ミセル又は細胞物質に対
してカルシウムを介した結合に必要なγ−カルボキシグ
ルタミン酸ド、メイン１ を保持する。従って基本的には、Ｘａ因子はトロンビン
と対照的にリン脂質と血小板膜と結合したままである。

米国特許筒４．５８８．５８７号はへメンテリアオフィ
シナリス（ｌｌａｅｍｅｎｔｅｒｉａ　０ｆｆｉｃｉｎ
ａｌｉｓｌ　ヒル唾液の抗凝血物質活性を記載している
。

バームｌ／ン（ｖ（４４７ｍｕｌｅｎ）等、Ｉｎｔ、Ｊ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、第２０巻、Ｎｏ、　６．６２１〜３
１頁（１９８８年）は、Ｒ，エバーライ（ｅｖｅｒｔｓ
ｉｌ　、　Ｉ３　、デコロラツス（ｄｅｃｏｌｏｒａｔ
ｕｓ）　、　Ｂ　、　　ミクロブルス１ｍ１ｃｒｎｐｌ
ｕｓ）及びＦ）、ツルンカッムｆｔｒｕｎｃａｔｕｍ）
から分離したダニ南の相対的プロプアーゼ阻害活性を記
載している。これらはトリプシンとキモ１−リブシンの
急速結合又は緩慢結合阻害剤であることがわかった。

ウィラドソン（Ｗｉ　ｌ　１ａｄｓｅｎｌ及びライジン
グ（Ｒｉｄｉｎｇｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、第１８９
巻、２９５〜３０３頁（１９８０年）は、外部寄生虫ダ
ニブーフィルスミクロブルス（Ｂｏｏｐｈｊ、］ｕｓ　
ｍ１ｃｒｏｐｌｕｓ）からのタンパク質分解酵素咀害剤
の活性及び血液凝固バラン２ ターに関する明害剤の効果を記載している。

先行の研究は、ダニ唾液のＸａ因子の阻害剤マクワルツ
（Ｍａｒｋｗａｒｄｔ、）　、Ｆ　、等（１９５８年）
、自然科学（Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｃｎｓｃｈａｆｔｅｎ
）第４５巻、３９８〜３９９頁及びマークワルツ、Ｆｏ
等（１９６１年）、自然科学、第４８巻、４３３頁及び
トロンビンの阻害剤ハウキンス（Ｈａｗｋｉｎｓｌ　、
　Ｒ，等（１９６７年）英国学士院の議事録７０頁を同
定一部精製している、唾液がＩＸ　ａ因子の阻害剤を含
むことは示唆している（ハウキンス）。（ヘルマン（Ｈ
ｅｌｌｍａｎｎ）、　Ｋ及びハウキンス（１９６７年）
　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｄｉａｔｈ、＋ｌａｅｍｏｒｒｈ、第
１８巻、６１７〜６２５頁）、リベイロ（Ｒｉｂｅｉｒ
ｏｌ等はダニ唾液が内因系機序を阻害することによって
血餅の形成を阻止することを報告している（リベイロＪ
、　（１９８５年）　、　Ｊ　、　Ｆ、ｘｐ、Ｍｅｄ、
第１６１巻、３３２〜３４４頁）が阻害部位を確認して
いない。この研究はまたＡＤＰ、コラーゲン又は血小板
活性化因子によって誘発される血小板凝集を阻止する抗
血小板活性を始めて証明した（リベイロ、Ｊ、　　（１
９８５年）　、　、Ｊ　、　Ｅｘｐ、Ｍｃｄ、第１６１
巻、３：１２〜３４４頁）。

これらの因子はいずれもその構造又は作用機序を解析す
ることができる精製は試みられていない。

Ｓ、セレビシｓ−（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ａ−接合
型因子プレプロリーダー配列は酵母に於ける分泌産物と
して非相同遺伝子の発現に利用されている（ブレイク（
Ｂｒａｋｅ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ　、米国、第８１巻、４６４２〜４６４６頁（
１９８４年）、ミャジマ等ジーン、第３７巻、１５５〜
１６１頁ｆ１９８５年）、ブラスク（Ｖｌａｓｕｋ）等
、Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、第２６１巻、４７８９
〜４７９６頁（１９８６年）、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔ
ｚ）等、ジーン、第５４巻、１１３〜１２３頁（１９８
７年）、シュルツ等、シーン、第６１巻、１２３〜１３
３頁（１９８７年）、バイオ（Ｂａｙｎｅ）等、ジーン
、第６６巻、２３５〜２４４頁（１９８８年）及びレー
ソン（Ｌａｉｓｏｎ）等、バイオテクノロジー第６巻、
７２〜７７頁（１９８８年））。融合生産物として生産
されるタンパク質は、ＫＥＸ２遺伝子によってエンコー
ドされたＬｙｓ−Ａｒｇ切断エンドペプチダーゼ（ＫＩ
ＥＸ２）によりタンパク質分解的に処理され生産物は培
地に分泌される。ＫＥＸ２はｐｐＬ配列と非相同遺伝子
間に存在するＬｙｓ−Ａｒｇ残基のＣ４ 末端側で切断する。

本発明は詳細には凝固Ｘａ内因子ＩＸ■害するタンパク
質及び関連の変異体を含む１．これらのタンパク質は低
分子量セリンプロプアーゼ阻害剤である。

これらのタンパク質の１つは計算分子質量６９８４．９
を有する６０個のアミノ酸残基の１本のポリペプチドで
ある。これはＸａ内因子Ｋｉ＝０．５８ｎｌＪｌ　に非
常に特異的であり、■ａ因゛ｒ、カリクレイン、トリプ
シン、キモトリプシン、トロンビン、ウロキナゼ、プラ
スミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、エラスター
ゼ、ＸＩ　ａ因子又はＳ、アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）
　Ｖ８プロテアーゼを阻害しない。この阻害剤はカルシ
ウムを必要としない。これらのタンパク質の完全なアミ
ノ酸配列を決定し、セリンプロテアーゼの他の阻害剤と
比較した。これらはクニッツ型Ｉｌｌ害剤と限定された
相同性を有する。しかしながら、全てトリプシンを阻害
するこの種の他の既知阻害剤と異なり、これはＸａ内因
子ほとんど独占的に阻害する。

本発明はまた患者のＸａ内因子阻害し、凝固を明　５ 七する本発明のタンパク質を包含している組成物を含む
。

本発明はオルニトドロスモウバタ （Ｏｒｎｉｔ、ｈｏｄｏｒｏｓ　ｍｏｕｂａｔａ）ダニ
抽出物から本発明のタンパク質を得る方法を含む。

本発明はまた酵母−大腸菌シャトルベクターに導入され
、大腸菌で増殖されたクローン化ＤＮＡ断片で酵母細胞
を形質転換し、本発明の分泌タンパク質を発現させる方
法を含む。

本発明はまた本発明のタンパク質をエンコードする遺伝
子又は修飾した等価物及びそのタンパク質を大腸菌で生
産する方法を含む。

本発明はまた合成手段によって本発明のタンパク質を製
造する方法及び適当な遺伝子配列を含む発現ベクターに
対して絹換え工学を用いて本発明のタンパク質を製造す
る方法及び酵母細胞から発現ベクターを用いて組換え体
阻害剤を製造する方法を含む。

本発明はまたＰＣＲ変顕変光誘発クンケル変異誘発によ
りタンパク質変異体を産生じ、それによっ６ てＸａ因子明害活性を有するタンパク質変異体を得る方
法を含む。

本発明はまた本発明の組成物の治療−」二有効な量を患
者に投与することを特徴とする血液凝固を阻止するため
に患者を治療する方法を含む。

本発明のタンパク質は、オルニトドロスモウバタダニ抽
出物から得るか合成するか又は組換え工学を用いて生産
することができる。本発明の好適なタンパク質は次のア
ミノ酸配列を有する。

２ ＮＨ２−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−工
１ｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＡＡ１−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−工１
ｅ−４ Ａｓ　ｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｓ　ｅ　ｔ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒ　ｇ−Ａｌ
ａ−６ ＡＡ２−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−ＡＡ３−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−５ｅ　ｒ−Ｐｈｅ−８ Ｔｒｐ−工１　ｅ−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｇｌｕ−Ａ
ｓ　ｐ−Ｈｉ　５−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓ　ｐ
−Ｔｙｒ　−０ Ｔｙｒ−５ｅ　ｒ−５ｅ　ｒ−Ｔｙｒ−ＡＡ４−Ａｓｐ
−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−工１ｅ−
ＧＯＯＨＡＡ、、ＡＡ２、ＡＡ、及びＡＡ４は各々Ａｒ
ｇ、Ｔｙｒ、　Ｇｌｙ及びＡｒｇである（以後”ＴＡＰ
−１”と呼ぶ）か又はＡＡ、、ＡＡｚ、ＡＡ３及びＡＡ
４は各々Ｇｉｎ、　Ｐｈｅ、Ａｓｐ及びＧｉｎである（
以後”’Ｉ’ＡＰ−２”と呼ぶ）。

また９、２３．２７及び５３番の１個以上のアルギニン
アミノ酸をアスパラギンに置き換えた丁ＡＰ−１の変異
体及び２３及び２７番の１個以上のアルギニンアミノ酸
をアスパラギンに置き換えたＴＡＰ−２の変異体が好適
である。

また１６番のアスパラギン酸をアルギニンに置き換えた
ＴＡＰ−１の変異体が好適である。

またＴＡＰ−１タンパク質活性を有する−」二連の配列
を包含しているポリペプチド配列を有する二価性のタン
パク質は本発明の範囲内であり、トリペプチド配列、ア
ルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）が本明
細書に含まれる。ＲＧＤ　ｌ−リペプチドの存在は、例
えばＡＡ、がアルギニンである９番と１０番のアミノ酸
の間に又はＡＡ、がアルギニンである５３番と５４番の
アミノ酸の間にグリシンを挿入することによって得られ
る。

二価性分子は、特に本発明のタンパク質を構築されたプ
ロトロンビナーゼ複合体がある活性化血小板の標的とす
るのに適している。Ｌｘ因子、Ｖａ因子適当なリン脂質
表面及びプロ１〜ロンビンから構成されるプロトロンビ
ナーゼ複合体は生体内のプロトロンビンからトロンビン
へのＸａ因子変換に関与する。この複合体のリン脂質成
分はいずれの細胞表面によっても供給されることができ
る。しかしながら、活性化のときに、血小板がＶａ因子
結合部位をさらすミクロ粒子に小胞形成することは証明
されている。これらの活性化血小板ミクロ粒子は、プロ
トロンビナーゼ複合体を支持するのに非常に有効である
。非粘着タンパク質の適当な場所にＲＧＤ配列を挿入す
ると糖タンパク質ＩＩ　ｂ／ＩＩＩ　ａタンパク質のよ
うなペプチド配列を確認するインテグリンに結合するこ
とができるタンパク質を産生ずる（マエダ、］゛９等、
（１９８９年）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｂｅｍ、第２６４巻、１５１６５〜１．５１６８頁）
。活性化のときに血小板ＩＩ　ｂ／ＩＩＩ　ａ複合体が
あられになり以後のフィブリノーゲンを介した凝集に決
定的である。適当なＴＡＰ領域にＲＧＤ配列を挿入する
と（例えば部位特異的変異誘発により）、プロトロンビ
ナーゼ複合体を構築する活性化血小板を標的とする二価
性分子を産生ずる。

９ ＴＡＰ−１の阻害Ｋｉは０．５８ｎＭである。

本発明のタンパク質及びそのイソ型タンパク質及び自然
変異体は ａ）　オルニトドロスモウバタダニ抽出物をホモジナイ
ズし、このホモジネートを遠心分離してＬ清タンパク質
浮遊画分を生成し、この画分を凍結乾燥し、 ｂ）　この凍結乾燥画分を水に溶解し、この溶液をゲル
濾過クロマトグラフィーカラムに注いでＸａ因子明害活
性を含む両分を分離し、Ｃ）　このＸａ因子阻害活性を
含む画分をＮａＣｌ勾配で溶離されるアニオン交換カラ
ムに注いでＸａ因子を阻害する両分を集める ことによって得られる。

本発明はＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２の活性のようなＸａ
因子に対して非常に特異的な阻害活性を有する全ての自
然同族体、イソ型タンパク質又は遺伝変異体を包含する
。

タンパク質 本発明のタンパク質は、開示された配列の活性０ を保存する開示された精製タンパク質配列による種類を
含み断片又はサブユニット、天然変異、対立変異、ラン
ダムに産生じた人為的変異体及び活性を保存する企図配
列変種を含む。断片又はザブユニットは完全なタンパク
質より少ないアミノ酸を含む配列のいずれかの部分例え
ば完全なタンパク質のＮ−及び／又はＣ−末端の部分を
排除している部分配列を意味する。

本発明のタンパク質はまた精製タンパク質配列の活性を
保存する開示された組換え体タンパク質配列を含む。ま
た発現ベクターの中の同義遺伝子の発現によって生じる
融合タンパク質のようなハイブリッドタンパク質を含み
、ペプチド結合によって第２ポリペプチドに結合した開
示されたタンパク質の比活性を有するポリペプチドを含
むことができる。

本発明の未変性タンパク質のいずれかの他の変異体は特
に保存的アミノ酸置換によってのみ分離したタンパク質
と異なるいかなる変異体ち含まれることは理解されるで
あろう。保存的アミノ酸置換は、テーラ−ｆＴａｙｌｏ
ｒｌ、　Ｗ、　Ｒ，Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｒｉｏｔ、第１８８巻、２３３頁（１９８６年）の表１
で゛セット”と定義される。本出願に於てタンパク質又
はその断片はアミノ酸置換、欠失又は他の過程でのいか
なる変異も含み、但し、精製後タンパク質は上述の阻害
剤タンパク質に特異的な抗体と免疫化学的に反応させる
。

本発明のタンパク質はメリフィールド （Ｍｅｒｒｉｆｊｅｌｄｌ、　　Ｊ、　Ａｍ、Ｃｈｅｍ
、Ｓｏｃ、第８５巻、２１４９頁ｆ１９６４年）に記載
されるような固相合成又はＨＦ切断によるタンパク質含
有溶液の処理に特に注意を払っているホウテン（Ｈｏｕ
ｇｈｔｅｎ）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、１．　Ａｃａ
ｌ　。

Ｓｃｉ、第８２巻、５１３２頁（１９８５年）の合成の
ような当業界で既知の他の等価の化学合成を用いて製造
することができる。同相合成はリビア（Ｒｉｖｉｅｒ）
等に１９８２年】月２１日登録された米国特許第４．２
４４．９４６号に一般的に示される保護アミノ酸の適当
な樹脂へのカップリングによってペプチドのＣ末端から
始まり、この引例の開示を引用する。この−Ｍ的な合成
の具体例は米国特許第４．３０５．８７２号及び同第４
．３１６．８９］号に示される。

ポリペプチドの合成としては、適当に保護されたａ−ア
ミノ基を有するカルボキシル末端アミノ酸をクロロメチ
ル化ポリスチレン樹脂等に結合する。塩化メチレン中ト
リフルオロ酢酸を用いてのようにａ−アミン保護基を除
去した後、合成の次の工程は容易に進行する。個々のア
ミノ保護基の除去に対し７ては、公開文献に記載される
他の標準の切断試薬や条件を使用することができる。

次いで残りのα−アミノ及び側鎖保護アミノ酸は縮合に
よって所望の順序で段階的に結合して樹脂に結合した中
間体化合物を得る。各アミノ酸を別々に加える合成の別
法としていくつかは生長する同相鎖に加える前に互に結
合することができる。適当なカップリング試薬の選択は
当該技術の範囲内である。

２個のアミノ酸又はアミノ酸とペプチド又はペプチドと
ペプチド間の縮合は、アジド法、混合酸無水物法、ＯＣ
Ｃ（シンクロヘキシルカルボジイミド）法、活性ニスデ
ル法（ｐ−ニトロフェニルエ３ ステル法、ＢＯＰ　［ベンゾトリアゾール−１−イルオ
キシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフ
ルオロホスフェ−１・］法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イ
ミドニスデル法等）、ウッドワード試薬に法のような通
常の縮合法に従って行なうことができる。同相法として
ペプチド鎖を延長する場合、ペプチドはＣ末端アミノ酸
で不溶性担体に結合する。Ｃ末端アミノ酸のカルボキシ
基と反応させて後に容易に切断される結合を生成さぜる
不溶性担体としては具体例としてハロメチル樹脂例えば
クロロメチル樹脂及びブロモメチル樹脂、ヒドロキシメ
チル樹脂、アミノメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂及びｔ−アルキルオキシカルボニルヒドラジド樹脂を
使用することができる。

種々のアミノ酸部分の反応性側鎖基を適当な保護基で連
鎖が完全に構築された後にその基が最後には除去される
までその部位で保護することはペプチドの化学合成に一
般的である。またアミノ酸又は断片のα−アミノ基も保
護するが、その実体をカルボキシル基で反応させて、次
にα−アミノ４ 保護基を選択除去してその場で次の反応を行なうことも
一般的である。従って合成の工程として側鎖保護基を有
する種々のこれらの残基を持ったペプチド鎖中に所望の
配列に位置したアミノ酸残基の各々を含む中間体化合物
が生しることは一般的である。これらの保護基は次いで
一般的には精製により生じる所望の生成物を生成させる
と同時に除去される。

α−及びω−側鎖アミノ基を保護するのに適用できる保
護基としては、ベンジルオキシカルボニル（以後Ｚと略
される）、イソニコチニルオキシカルボニルｆｉＮＯｃ
）、　Ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル［Ｚ　（２
Ｃ１）　］　、　］ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニ
ルｚ　［ｏ２）　］　、　］ｐｐ−メトキシベンジルオ
キシカルボニル　ｆｌｕｅ）　］　、　　］ｔ−ブトキ
シカルボニルＢｏｃ）　、　ｔ−アミルオキシカルボニ
ル（Ａｏｃ）　、イソボルニルオキシカルボニル、アダ
マンチルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−
２−プロピルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）　。

９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃｌ、メ
チルスルホニルエトキシカルボニル（ｕｓｅ）　、　　
トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニト
ロフェニルスルフェニル（ＮＰＳＩ　、ジフェニルホス
フィノチオイル（Ｐｐｔ、ｌ　、ジメチルホスフィノチ
オイル（Ｍｐｔｌ等が例示される。

カルボキシ基の保護基としては例えばベンジルエステル
（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルエステル（ＣｈｘＬ４−
ニトロベンジルエステル（ＯＮｂＬｔ−ブチルエステル
（Ｑｂｕｔｌ、　４−ピリジルメチルエステル（ＯＰｉ
Ｃｌ等を例示することができる。アミノ及びカルボキシ
ル基以外の官能基を有するアルギニン、システィン及び
セリンのような個々のアミノ酸を必要な場合に応じて適
当な保護基で保護することが望ましい。例えば、アルギ
ニンのグアニジノ基はニトロ、ｐ−トルエンスルホニル
、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカル
ボニル、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、４−メ１−
キシー２，６−シメチルベンゼンスルホニルｆＭｄｓ）
　、　　ｌ　、　３．５−　ｔ−リメチルフェニルスル
ホニル（Ｍｔｓｌ等で保護することができる。システイ
ンのチオール基は、ｐ−メトキシベンジル、トリフェニ
ルメチル、アセデルアミノメチル、エヂルカルバモイル
、４−メチルベンジル、２，４゜６−ドリメチルペンシ
ル（Ｔｍｂ）等で保護することができ、セリンのヒドロ
キシル基はベンジル、Ｌブチル、アセチル、デトラヒＦ
ロピラニル等で保護することができる。

スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔｌ及びヤング（Ｙｏｕｎ
ｇ）、°゛固相ペプチド合成゛ビアスク゛ミヵルカンパ
ニー、ロックホード、アイルランド（１９８４年）はペ
プチドの製造方法に関して詳細な情報を提供する。ａ−
アミノ基の保護は１４〜１８ｊ’Ｔに記載され、側鎖閉
塞は、１８〜２８真に記載される。アミン、ヒドロキシ
ル及びスルフヒドリル官能基の保護基の表は、１４９〜
１５１頁に示される。これらの説明をここに引用する。

望ましいアミノ酸配列が完了した後中間体ペプチドは、
液体肝のような試薬及び１種以上のチオ含有スカベンジ
ャーで処理して樹脂支持体から除去されるが、ペプチド
を樹脂がら切断するだけで　７ なく、残りの側鎖保護基金でも切断する。ＨＦ切断の後
、タンパク質配列をエーテルで洗浄し、多量の希酢酸に
移し、水酸化アンモニウムでｐＨ約８．０に調整して撹
拌する。

好適には、ポリペプチド内の残基のアルキル化（例えば
メチオニン、システィン及びチロシン残基のアルキル化
）を避けるために、チオクレシル及びクレゾールスカベ
ンジャー混合液を使用する。この樹脂をエーテルで洗浄
し、直ちに多量の希酢酸に移して溶解し、分子内架橋を
最小にする。２５０１ｔＭポリベブヂド濃度を０．１Ｍ
酢酸溶液約２ｌに希釈する。次いでこの溶液を撹拌し、
水酸化アンモニウムを用いてｐＨ約８．（ｌに調整する
。

ｐＨ調整の際、ポリペプチドは望ましい高次構造の配列
を取る。

麩豫、ｔ　ＤＮ／ヒ畿術 組換えＤＮＡ技術は本発明のタンパク質を製造するため
に使用することができる。この技術は異種細胞通常異種
生物体からの遺伝情報ＤＮＡセグメントをＤＮＡが得ら
れる生物体の外部に端と端をっな　８ いで結合させこのハイブリッドＤＮＡを最初のＤＮＡが
エンコードするタンパク質を生産させる細胞に取り込ま
せる。遺伝情報ＤＮＡ又はｍＲＮＡを分離し、適当なり
ローニングベクターに取り込み適当な宿主細胞に導入す
る。

この技術に有用なりローニングベクターは個々の実験の
異種ＤＮＡに適合するＤＮＡ配列を含む。このベクター
は、安定な方法で存在することができ、実験ＤＮＡによ
って指令されるタンパク質を発現することができる宿主
細胞に導入される。クローニングベクターはプラスミド
、バクテリオファージ、ウィルス及びコスミドを含むこ
とができる。

発現ベクターは、適当な宿主に於て遺伝子のクローン化
コピーの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされ
るＤＮＡ配列である。これらのベクタは種々の細胞例え
ば細菌酵母昆虫及び哨乳類細胞中で原核あるいは真核遺
伝子を発現させることができる。

タンパク質はまた多数のウィルス系で発現させることか
できる。適当に構成された発現ベクターは宿主細胞に於
ける自己複製に刻する複製開始点、選択マーカー、限定
数の有用な制限酵素部位、高コピー数及び強力プロモー
ターを含む。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼをＤＮ
Ａに結合させるよう番こし、　ＲＮＡ合成を開始するＤ
ＮＡ配列であり強力プロモーターは高頻度でこのような
開始を生ずる。発現ベクターには修飾クローニングベク
ターがあるがクローニングベクターに限定されず、詳し
くはプラスミド又はウィルスを示す。

及現五 原核生物はしばしば大腸菌の種々の菌株によって表わさ
れる。細菌例えばバシラスサヂリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）の種々の菌種又は他の細菌株のような他
の微生物菌株を使用することができる。このような原核
系では複製部位と宿主と適合し得る菌種由来の制御配列
を含むプラスミドベクターを使用する。例えば大腸菌は
典型的にはｐＢＲ３２２の誘導体ポリバー（Ｉｌｏｌ　
１ｖａｒ）等、ジーン（１９７７年）第２巻９５頁によ
る大腸菌種由来プラスミドを用いて形質転換される。本
明細書でリポソーム結合部位配列と共に任意にオペレー
ターを有する転写開始のためのプロモーターを含むこと
が定義される一般に使用される原核制御配列としてはβ
−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）及びラクトース（ｌ
ａｃ）プロモーター系（ヂャング（ｃｈａｎｇ等）ネイ
チコーア（］、９９７７年第１９８巻１０５６頁）及び
トリフｌ−ファンｆＴｒｐ）プロモーター系（ゲデル（
Ｇｏｅｄｄｅｌ１等核酸Ｒｅｓ、　（１９８０年）第８
巻、４０５７頁）及び人由来ＰＬプロモーター及びＮ−
遺伝子リポソーム結合部位（シマタフ−等、ネイヂュア
（１９Ｂ１年）第２９２巻、１２８頁）のような一般に
使用されるプロモーターを含む。しかしながら原核生物
と適合し得る入手し得るいかなるプロモーター系も使用
することができる。

本発明の真核系に有用な発現系は適当な真核遺伝子由来
プロモーターを包含している。酵母に有用なプロモータ
ーの１種は例えば３−ホスホグリモレ−１〜キナーゼを
含む解糖酵素の合成のプロ１ モーターを含む（ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）等
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　（１９８０年）、第２５
５巻、２０７３頁）。

他のプロモーターはエノラーゼ遺伝子（ホランド（ｔ（
ａｌｌａｎｄ）　、　Ｍ、、Ｊ、等、Ｊ　、Ｂｉｏｌ、
Ｃｂｅｍ、　　（１９８１年）第２５６頁、１３８５頁
）又はＹＥｐ１３から得られるＬｅｕ２遺伝子（ブロー
チ（ＢｒｏａｃｈＬ、Ｊ、等、ジーン（１，９７８年）
第８巻１２１頁）からのものを含む。

適当な哺乳類プロモーターはＳＶ４０からの初期及び後
期プロモーター又はポリオーマ、アデノウィルスＴＩ　
、ウシ乳頭腫ウィルス又はトリ肉腫ウィルス由来のよう
な他のウィルスプロモーターを含む。適当なウィルス及
び補乳類エンハンザ−は」二に引用されている。植物細
胞が発現系として使用される場合には、ツバリン合成プ
ロモーターが適当である（デビッカ−（Ｄｅｐｉｃｋｅ
ｒ、　Ａ、等、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ、　（１９８２年）第１巻５６１頁）
６タンパク質を発現するのに有用な昆虫細胞発現系は、
スミス（Ｓｍｉｔ、ｈ１等米国特許第４，７４５，０５
１号に記載される系の修飾型を含む。バクロウィルス遺
伝子又はバクロウィルス遺伝子のプロモーター２ を含むその一部を包含しているバクロウィルスＤＮＡを
切断して少なくともプロモーターを含むＤＮＡ断片を得
る。所望の産生タンパク質は発現ベクターがバクロウィ
ルスポリヘトリンプロモーターの転写調節下山なくとも
１種の非相同産生タンパク質ポリペプチド構造遺伝子を
包含している組換え体バクロウィルスゲノムである組換
え体バクロウィルス発現ベクターを感受性のある宿主昆
虫細胞に感染して作製する。

宿主昆虫細胞に於て選択遺伝子を発現することができる
組換え体バクロウィルス発現ベクターはバクロウィルス
ポリヘトリンブロモターと相同組換え体を十分促進する
だけのフランキングＤＮＡ配列を包含しているＤＮＡフ
ラグメントを作製しバクロウィルスＤＮＡフラグメント
なりローニングビヒクルに挿入して修飾クローニングベ
クターを作成し、バクロウィルスポリヘトリンプロモー
ターの転写調節によるクローン化バクロウィルスＤＮＡ
断片の選択制限部位を同定し、バクロウィルスポリヘト
リンプロモーターの転写調節下バクロウィルスＤＮＡ断
片の別の制限部位を修飾クローニングベクターから欠失
させ、選択非相同遺伝子をユニク制限部位に挿入して組
換え体シャトルベクタを作成し組換えを行なうようにバ
クロウィルス１）ＮＡを接触させて組換え体と非相換え
体バクロウィルスの混合物を作製し、組換え体バクロウ
ィルス発現ベクターをこの混合物から分離することによ
って作製する。

オリゴヌクレオチドブライマー 所望の配列の別々のストランドにその配列に沿った相対
的位置でハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドブラ
イマーは、１つのブライマーから合成される伸長産物が
、その鋳型（神体）から分離されるとき別のブライマー
を決った長さの核酸に伸長する鋳型として役立つことが
できるように調製される。ブライマーは、例えばナラン
グ（Ｎａｒａｎｇｌ、　Ｓ、Ａ、等Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、第６８巻９０頁ｆ１９７９年）及びブラウン
（Ｂｒｏｗｎ）　、　Ｅ、Ｌ、等Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、第６８巻１０９頁　（１９７９年）に
各々記載されるホスホトリエステル及びホスホジエステ
ル法又はその自動化された実施態様のような適当ないず
れの方法を用いても製造することができる。このような
自動化された実施態様としては出発物質としてジエチル
ホスホルアミタイトを使用し、ビュウケージ（Ｂｅａｕ
ｃａｇｅ）等テトラヘドロンレターズ（１９８１年）第
２２巻、１８５９〜１８６２頁に記載される通り合成す
ることができる。変性固体支持体によりオリゴヌクレオ
チドを合成する方法は米国特許第４．４５８．０６６号
に記載される。また生物原料（制限エンドヌクレアーゼ
消化物等）から分離されたブライマーを使用することも
できる。

ブロービングｃＤＮＡライブラリ ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをコロニー又はプラー
クハイブリッド形成操作を用いて選抜する。

細菌コロニー（又は組換え体ファージ感染細菌）を含有
するプレートを複製ニトロセルロースフィルター紙（Ｓ
＆Ｓ型ＢＡ−８５）に複製し細菌コロニースクリーンに
対してコロニーをＡｍｐ　５０μｇ／ｍｌを含有するＬ
寒天上で３７°Ｃで１４〜１６時間増殖させる。細菌に
プラスミド又はファージを溶解し５ ０．２Ｎ　ＮａＯＨ、１，５Ｍ　ＮａＣ１次いで０．５
Ｍ　ｌ−リスｐＨ７，５，１，５Ｍ　ＮａＣ１次いで２
回標準食塩水クエン酸塩（２ＸＳＳＣ）で各々５分間順
次処理してＤＮＡをフィルターに固定する７フイルター
を風乾し８０℃で２時間焼付ける。この複製フィルター
をＤＮＡハイブリッド形成緩衝液（５ＸＳＥＣ、ｐＨ７
，０，５Ｘデンハートの溶液（ポリビニルピロリジンと
フィコール及びウシ血清アルブミン、ＩＸ＝各々０．０
２％１．５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０，
０，２％ＳＯ５，２０μｇ／ｍｌポリＵ及び５０μｇ／
ｍｌ変性サーモン精液ＤＮＡを１フイルターにつき１０
ｍ１で４２°Ｃに於て６〜８時間前ハイブリッド形成す
る。

この試料を望ましい緊縮に依存する条件下キナーゼ化プ
ローブでハイブリッド形成する。典型的な中程度の緊縮
条件はプローブを含むＤＮＡハイブリッド形成緩衝液１
〜５ｍ１／フイルターと４２°Ｃの温度で２４〜３６時
間を用いる。高緊縮に対しては高温で時間を短くする。

フィルターを２ＸＳＳＣ１０，２％ＳＯ３及び５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７で３７℃に於て各々３０
分間洗浄し次いで２ＸＳＳＣ及び６ ０．２％ＳＯ３で２回洗浄し、風乾、−７０℃で２〜３
日間オートラジオグラフにかける。

ポリメラーゼ鎖　応１ＪＬＭ タンパク質をコードする多量のＤＮＡをムリスｆＭｕｌ
ｌｉｓ）等に記載されるポリメラーゼ鎖反応ｆＰｃＲ）
を用いて得ることができる。ブライマーの伸長産物は、
別のブライマーに対合されるとき、核酸配列の作製の鋳
型になる。

核酸配列ストランドは、鋳型の個々の位置で相補性スト
ランドに結合するオリゴヌクレオチドブライマーの存在
下で分離するまで加熱する。ブライマー鋳型複合体はＤ
ＮＡポリメラーゼの基質として作用し、その複製機能を
行なう場合にブライマーを伸長する。変性の際両プライ
マー伸長と共通の領域は繰り返しブライマー伸長の鋳型
として働く。この過程は一連の加熱冷却サイクルで続け
、加熱はストランドを分離し冷却は再アニールして配列
を伸長する。ストランドのコピーが多く生じるほどサイ
クルが繰り返される。増幅によりコーディングドメイン
及び別のいかなるブライマーエンコード情報、例えば制
限部位又は翻訳シグナル（シグナル配列開始コドン及び
／又は停止コドン）も得られる。

望之ｌ二璽域 所望のコーディング制御配列を含む適当なベクターの構
成は当業界で十分理解されている標準の連結反応及び制
限技術を用いる。分離プラスミドＤＮＡ配列又は合成オ
リゴヌクレオチドを切断し適合させ所望の形に再連結さ
せる。

部位特異性ＤＮＡ切断は当業界で一般に理解されている
条件下適当な制限酵素（又は酵素）で処理して行なわれ
この詳細はこれらの市販で人手される制限酵素の製造業
者によって規定されている。

例えばニューイングランドバイオラプス、プロダクトカ
タログ参照。一般にプラスミド又はＤＮＡ配列約ｌＬＬ
ｇを緩衝液約２０ＬＬβ中で１単位の酵素によって切断
する。典型的にはＤＮＡ基質を完全に消化させるために
過剰の制限酵素を使用する。

約３７℃に於て）品置時間約１〜２時間が実行可能であ
るが、変更は可能である。各々温度した後タンバク質を
フェノール／クロロボルムで抽出して除去し次いでセフ
ァデックス■Ｇ−５０スピンカラムにかけることができ
る。所望により切断断片のサイズ分離をポリアクリルア
ミドゲル又はアガロースゲル電気泳動により標準技術を
用いて行なうことができる。サイズ分離の一般的説明は
メソツズインエンザイモロジ−（１９８０年）第６５巻
４９９〜５６０頁に作られている。

制限切断断片は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ
）の大きな断片で４個のデオキシヌクレオチド三リン酸
塩（ｄＮＴＰ）の存在下５０ｍＭ　トリス、ｐＨ７，６
、５０ｍＭ　Ｎａ１１．６　ｍＭ　ＭｇＣ１□、６ｍＭ
ＤＴＴ及び５〜ｌｏｕ　Ｍ　ｄＮＴＰｓ中２０〜２５°
Ｃで約１５〜２５分の温置時間を用いて処理することに
より平滑末端化することができる。フレノウフラグメン
トは５′突出部で挿入するが４個のｄＮＴＰの存在下で
さえも突出している３′　１本鎖を除去する。所望によ
り選択修復はｄＮＴＰ又は選択されたｄＮＴＰの１個だ
けを粘着末端の種類によって指令される制限の範囲内で
供　９ 給することにより行なうことができる。フレノウで処理
した後、混合物をフェノール／クロロボルムで抽出し、
エタノール沈殿した後セファデックス■Ｇ−５０スピン
カラムにかける。適当な条件下ＳＬヌクレアーゼで処理
するといずれかの１本鎖タンパク質も加水分解が生じる
。

上述した通りオリゴヌクレオヂドはマッテウチ（Ｍａｔ
ｔｅｕｃｃｉｌ等（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　（
１９８１年）第１０３巻３１８５頁）のトリエステル法
によって又は市販で入手される自動化オリゴヌクレオヂ
ドシンセサイザーを用いて製造することができる。アニ
ーリング前の又は標識化の１本鎖のキナーゼ化は５０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣ１□、
５ｍＭジチオトレイトール、１〜２　ｍＭ　ＡＴＰ、１
．７ピコモル３２Ｐ−ＡＴＰ（２，９ｍ（：ｉ／ミリモ
ル）　、０．１＋ｎ＆４スパーミジン、０．１ｍ１ＡＥ
ＤＴＡの存在下０．１ノナモルの基質に対して過剰の例
えば約ＩＯ単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いて得
られる。

連結反応は次の標準条件と温度、２０ｍ＆４トリスー１
１ＣＩ　　、　　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．
１０ｍＭ　ＤＴＴ、３３　ｌｚｇ／ｍ１ＢｓＡ、１０ｍ
Ｍ−５０ｍＭ　Ｎａ（：１　、及び１　ｍＭ　ＡＴＰ、
０．３〜０．６（ワイス）単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１４
℃に於て１５〜３０μ℃容量で行なわれる（°“平滑末
端“°連結反応に対して）。分子内゛粘着末端”連結反
応は通常全ＤＮＡ濃度３３〜１００　μｇ／ｍｌ　（５
〜１１００ｎ全末端濃度）で行なわれる６分子内平滑末
端連結反応（通常１０〜３０倍モル過剰量のリンカ−を
使用する）はＩｔＬＭ全末端濃度で行なわれる。

゛°ベクター断片゛を使用するベクター構成については
ベクター断片は一般に５′　リン酸を除去しベクターの
再連結を妨止するために細菌アルカリ性ホスファターゼ
（ＢＡＰ）で処理される。ＢＡＰ消化はｐｉｔｓに於て
約１５０ｍＭ　トリス中でＮａ＋とＭｇ２＋の存在下ベ
クターｌｕ、ｇ当り約１単位のＢＡＰを用いて６０℃で
約１時間行なわれる。核酸断片を回収するためにこの作
製試料をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノー
ル沈殿し、セファデックス■Ｇ−５０スピンカラムにか
けることにより脱塩する。また再連結反応は、望まれな
い断片の別の制限酵素消化によって２重に消化されたベ
クターに於て妨止することができる。

配列修飾を必要とするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来ベ
クタ一部分に対しては変異誘発に向けられた部位特異性
ブライマーが用いられる。これは望ましい変異を表わす
、限られた不適正を除いて変異誘発される１本鎖プラス
ミド又はファージＤＮＡに相補的なブライマー合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて行なわれる。簡単には合成オリ
ゴヌクレオチドはファージに相補的なストランドの合成
に向けるブライマーとして用いられ、得られた二重鎖Ｄ
ＮＡをファージ支持宿主細菌に形質転換する。形質転換
された細菌の培養株は寒天上面に塗布しファジを含む単
一細胞からプラークを形成させる。

理論的には５０％の新しいプラークは１本鎖として変異
された形のファージを含み５０％は元の配列である６得
られたプラークは厳密に適正なバイブリド形成を可能に
する温度でキナーゼ化合成ブライマーとハイブリッド形
成されるが、もとのス１−ランドとの不適正はハイブリ
ッド形成を防止するのに十分である。次いでプローブと
ハイブリッド形成するプラークを集め培養しＤＮＡを回
収する。

数置り並よ 以下に示される構成についてはプラスミド構成の正しい
連結反応は大腸菌ジュネディックストックセンターＣＧ
ＳＣ＃６１３５から得た大腸菌株ＭＭ２９４又は他の適
当な宿主を連結混合物でまず形質転換することによって
確認される。満足な形質転換体は当業界で理解されてい
る通りアンピシリン、テ１〜ラザイクリン又は他の抗生
物質耐性によって又はプラスミド構成方式に依存する他
のマーカーを用いて選択される。次いで形質転換体から
のプラスミドをフレウェル（（：ｌｅｗｅｌｌ）、Ｄ、
Ｈ，等Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、米国（１９６９年）第６２巻、１１
５９頁の方法次いで任意のクロラムフェニコール増幅（
フレウェル、Ｄ、Ｂ、、１．バタテリオール（１９７２
年）第１１０巻、　６６７頁）に従って作製する。分離
したＤＮＡは制限による分析及び／又はメシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）等核酸Ｒｅｓ　　（１９８１年）第９巻３
０９頁に３ も記載されるザンガー［Ｓａｎｇｅｒｌ、　　Ｆ％Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ　。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、米国（１９７７年）第７４巻５４６
３頁のジデオキシ法又はマクサム（Ｍａｘａｍ１等メン
ツズインエンヂモロジー　（１９８０年）第６５巻、　
４９９頁の方法によって配列が決定される。

形質転換 使用される宿主細胞に依存して形質転換はこのような細
胞に適当な標準の技術を用いて行なわれる。コーエン（
Ｃ：ｏｈｅｎ）　、Ｓ、Ｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

米国（１９７２年）第６９巻２１．　Ｉ　０頁に記載さ
れる塩化カルシウムを使用するカルシウム処理又はマニ
アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等モレキュラークローニン
グニアラボラトリ−マニュアル（１９８２年）コールド
スプリングハーバ−プレス、　２５４頁に記載されるＲ
ｂＣ１法は原核生物又は実質的な細胞壁バリヤーを含む
他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウムツメ
ファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓｌ（ショー　（Ｓｈａｗ）　、　Ｃ，Ｈ
，等ジーン（１９８３年）第２３巻３１５頁）による感
染はある種植物細胞に対して用いられる。このような細
胞壁のない哺乳類細胞に４ 対してはグラハム（Ｇｒａｈａｍ）及びパンデルイブ１
Ｅｂ）ウィルス学　（１９７８年）第５２巻５４６頁の
リン酸カルシウム沈殿法が好適である。酵母への形質転
換はパンゾリゲン（Ｓｏｌｉｎｇｅｎｌ、　Ｐ、等、Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒ。

（１９７７年）第１３０巻９４６頁及びヒシアオｆＨｓ
ｉａｏｌ。

（：、Ｉ−、等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、米国　（１９７９年）第７６巻３８２９頁の方
法に従って行なわれる。

阻害剤をコードする合成遺伝子はオリゴヌクレオチドを
用いて作成した。合成遺伝子は大腸菌中融合タンパク質
を作成するためにｃｈｅＹに融合し更にタンパク質を大
腸菌周縁細胞質に挿入するためにｏｍｐＡシグナルペプ
チドに融合した。

実施例１ オルニトドロスモウバタダニは南アフリカからアンチボ
ディアソシエイテス社（ベツドフォト、テキサス）によ
り入手した。比色基質はへレナラブス、アメリカンジア
グノスチ力及びケミカルダイナミクスから購入した。ヒ
トＸａ因子はエンザイムリサーチラボラトリーズから入
手した。ヒトプラスミン、ウロキナーゼ及びウシトロン
ビンはカルビケミ、ウシトリプシン、キモトリプシン及
び膵臓エラスターゼはつオーシントンエンザイム社から
人手した。血漿カリクレイン、カルボキシペプチダーゼ
Ｙ、Ｓ、アウレウス■８プロテアゼ及びプロテアーゼ阻
害剤はシグマから入手した。２木調ｔＰＡはアメリカン
ジアグノスチ力から人手した。

肚豊里塁里選奎 ５０匹のダニ（０，８ｇ　）を０．１．５Ｍ　ＮａＣ１
と５０μＭ　Ｅ−６４を含む２０ｍＭビス−トリス（ｐ
Ｈ７，ｏ）　３ｍ１．５０μＭペプスタチン及び５０Ｉ
ＬＭキモスタチンにすりガラスホモジナイザーでホモジ
ナイズした。ホモジネートを３０．０００ｘｇで３０分
遠心分離し生した沈降物を緩衝液３ｍｌに再浮遊させ再
び遠心分離した。上清を合わせスクロースを最終濃度１
０ｍｇ／ｍｌまで加え抽出液を凍結乾燥した。この物質
をＨ２Ｏ２ｍ１に溶解し、２５ｍＭ　ＮａＣ１と０．１
ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２０ｍＭビス−トリス−ＨＣｌ　
（ｐＨ７，４）で平衡にしたセファデックスＧ−７５ス
ーパーフアイン（ファーマシア）カラム（１，５ｃｍＸ
　９５ｃｍ）に注いだ。２ｍ１画分を集め選択した画分
からのアリコートをＸａ内因子びトロンビンについての
効果を検定した。

Ｘａ因　の■−剤の枦製 ゲル濾過後、ｘａ因子阻害活性を含む両分をプルし２０
ｎｔｌビス−トリス−１１ｃｌ　ｆｐＨ６、０）で平衡
にしたモノＱ（ファーマシア）カラム（０，５ｘ　５　
ｃｍ）に注いだ。このカラムをＮａＣ１の勾配（０〜Ｉ
　Ｍ　ＮａＣ］−。

全量６０ｍＬ）で溶離し画分１ｍｌを集めた。Ｘａ内因
子阻害する両分を透析して塩を除去し凍結乾燥した。こ
の物質を１１２０２ｍ１に溶解し、０．１％トリフルオ
ロ酢酸で平衡にした。バイダック［１８カラム（４，６
ｘ　２００ｍｍ１に注いだ。タンパク質を０．１％トリ
フルオロ酢酢酸デアセトニトリル０’−６０％）の１分
当り１％に於ける直線勾配で溶離した。画分１ｍｌを集
め、溶媒を真空下で除去した。画分を２０ｍＭトリス−
ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）１０．１５ＭＮａ（：ｌ　（Ｔ
ＤＳＩ　Ｏ，５〜Ｉに溶解し、検定した。阻害活性を含
むものをプールし、増量アセトニトリル（０〜４０％）
のコンベックス勾配により同じカラムで再クロマトグラ
フィー処理した。ピークを手で集め乾燥した。

　７ ダニ全部の粗可溶性抽出液をセファデックスＧ−７５に
よるゲル濾過で分画した。選択したカラム画分をＸａ内
因子阻害能力に対して検定したとき、見掛けの分子量８
．０００〜１０．０００で溶離する１本のピークが見ら
れた。

Ｘａ因子阻害活性のピークをプールしモノＱのカラムに
直接注いだ。阻害剤は０．２５Ｍ　ＮａＣ１の１本のピ
ークで溶離した。この阻害剤を精製する前の試みとして
低いイオン強度で溶離する活性の第２のピークが見られ
た。同様の方法で精製した（以下参照）。

この物質を透析して塩を除去し凍結乾燥した。

少量の１１□０に再溶解した後アリコートを逆相ＨＰ　
Ｌ　Ｃで分画した。阻害活性は１本のピークで溶離した
（第１Ａ図）。この物質を再クロマトグラフィー処理し
てタンパク質の均一ピークを得た（第１Ｂ図）。

我々は精製阻害剤の２００〜２５０μｇが５００匹のダ
ニから得ることができることを推定する。

ＳＯ３−ＰＡＧＥによりＭｒ二６０００と推定されるタ
ンパク質の１本のバンドが見られた（第２図）。

８ 地！どＬ法 タンパク質を標準としてウシ血清アルブミンを用いるロ
ーリ一方法によって評価した。５Ｏ３ＰＡＧＥを１６％
アクリルアミドと　０５％ビスアクリルアミドを含むス
ラブゲルにより行なった。染色面分子量標準をＢ肚から
得た。タンパク質をクーマシーブルーで染色して検出し
た。

酵素検定 検定を室温に於て９６ウエルミクロタイタープレートで
行なった。ペプチド−ニトロアニリド基質の加水分解に
よる発色をＶｍａｘマシン（モレキュラーデバイシイズ
）の４０５ｎＭに於て連続して監視した。Ｘａ内因子濃
度を活性部位滴定により定量した。実験に使用している
他のプロテアーゼの溶液濃度は発表されている吸光係数
を用いて分光光度的に定量した。精製阻害剤の濃度はア
ミノ酸定量分析によって定量した。典型的には定量には
全量２００〜２２０μβ中５００ｐＭタンパク質分解酵
素、２０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐｔ（７，４）、０．
１５Ｍ　ＮａＣ１，０，２〜０．３ｍＭ基質及び選択さ
れたカラム画分又は精製阻害剤のアリコートを含む。ヒ
トＸａ因子の場合、緩衝液には０．１％ＢＳＡも含み、
Ｓ、アウレウスＶ８プロテアーゼに対する緩衝液は５０
ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ，である。使用される基質はスベク
ロザイムＸａ　（Ｘａ内因子　、Ｓ−２２３８（トロン
ビン）　、Ｓ−２３５６（ギモトリブシン）　、　Ｓ−
２３６６（Ｘｌａ因子）　、　Ｂｏｃ−ＡｌａＡｌａＰ
ｒｏ　−Ａｌａ　−ｐＮａ　　（エラスターゼ）、スベ
クトロザイムＰＫａｌ　（カリクレイン）スベクトロザ
イムＰ１４（プラスミン）、スベクトロザイムＵＫ　（
ウロキナーゼ）　Ｚ−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ　−
ｐＮＡ　　（Ｓ、アウレウスｖ８プロテアーゼ）及びｔ
ＰＡに対してスベクトロザーｒムｔＰＡである。Ｖｌｌ
ａ因子はヒトＸ因子から３Ｈ−活性化ペプチドの解離を
測定することによって検定した。速度論的分析としては
１０分以下で行ない次いで添加基質の５％以下が利用さ
れる初速度を評価した。

豊遺迭よ プロテアーゼによる消化又は配列決定分析の前に阻害剤
を５０ｍＭジチオトレイトール、０．２５Ｍ　ｌ−リス
−ＨＣｌ　（ｐＨ８，２）及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含
も６Ｍグアニシン塩酸塩中で３７°Ｃに於て１時間装置
して変性した。ヨードアセタミドを最終濃度０．１Ｍま
で加えこの混合液を室温で３０分間放置してスルフヒド
リル基を閉塞した。反応混合液をバイダックＣＩ８カラ
ムに直接注ぎ０．１％トリフルオロ酢酢酸デアセトニト
リル勾配で溶離してタンパク質を再び分離した。タンパ
ク質を真空下で乾燥し、アプライドバイオシステム気相
配列決定装置により直接配列決定した。

還元アルキル化した阻害剤を５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３
１００μ℃に溶解し、トリプシン（５０：　ｌ　、　Ｗ
／Ｗ）と室温で装置した。４時間後同量のトリプシンを
加え反応を一晩進行させた。次でこの混合液をＣ＋ａカ
ラムに直接注ぎ消化産物を分画した。緩衝液が５０ｍＭ
酢酸アンモニウムであるほかは同様にしてＳ、アウレウ
スＶ８プロテアーゼによるタンパク質分解を行なった。

ピークを手で集め配列決定分析にかけた。

還元カルボキシアミドメチル化後阻害剤を直接配列決定
した。表１に示される通り最初の５３残基１ の配列をこのようにして決定したがいくつかのアミノ酸
の同定は不明であった。この配列を伸長するために還元
アルキル化タンパク質をトリプシンで処理し、断片を逆
相ＨＰＬＣで分離した。ポリペプチド配列はＴＡＰ−１
の配列であることがわかった。

及−１ ＰＴＩＩ　　　　　　　　成句１　　　　　　サイクル
　　　　　ＰＴＩＩ　　　　　　　サイクルＬ主Ｚ菰　
ユロ聾ル　　隔　　Ｌｉ２地　　陽Ｔｙｒ　　　　　　
　　　　４８８　　　　　　　２１　　　　　　　Ｇｌ
ｙ　　　　　　　　　４１Ａｓｎ　　　　　　　　　　
５６５　　　　　　　２２　　　　　　　Ｇｌｕ　　　
　　　　　　４２Ａｒｇ　　　　　　　　　２０２　　
　　　　　２３　　　　　　　Ａｒｇ　　　　　　　　
　４３Ｌｅｕ　　　　　　　　　　８９１　　　　　　
　２４　　　　　　　Ａｌａ　　　　　　　　　４４ｅ
ｍ−Ｃｙｓ　　　　　　　　４６１　　　　　　　２５
　　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　　　　４５１１ｅ　
　　　　　　６５５　　　　２６　　　　　Ｐｂｅ　　
　　　　４６Ｌｙｓ　　　　　　　　　　４２６　　　
　　　　２７　　　　　　　Ａｒｇ　　　　　　　　４
７Ｐｒｏ　　　　　　　　　　４１５　　　　　　　２
８　　　　　　　Ａｓｎ　　　　　　　　　４８Ａｒｇ
　　　　　　　　　　２４７　　　　　　　２９　　　
　　　　Ｇｌｙ　　　　　　　　４９Ａｓｐ　　　　　
　　　　　３２６　　　　　　　３０　　　　　　　Ｌ
ｙｓ　　　　　　　　５０’Ｉ’ｒｐ　　　　　　　　
　　１４９　　　　　　　３１　　　　　　　　Ｇｌｙ
　　　　　　　　　５１１１ｅ　　　　　　　　　　３
６８　　　　　　　３２　　　　　　　Ｇｌｙ　　　　
　　　　　５２Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　３３　　　　　　Ｃｍ−Ｃｙｓ　　　　　　
５３Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
３４　　　　　　　ＡｓｐＣｍ−Ｃｙｓ　　　　　　　
　　　　　　　　　　３５　　　　　　５ｅｒＡｓｐ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ａ６　　　　
　　　ＰｈｅＳｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　３７　　　　　　　ＴｒｐＡｓｎ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　３８　　　　　　　　Ｔ
ｉｅに１１１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
３９　　　　　　Ｃｍ−ＣｙｓＧｌｙ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　Ｐｒ。

フェニルヂオヒダントイン誘導体のおよその収量は、ピ
ークから計算した。

Ａｒｇ ■円、Ｃによる 実」１硼２ 実施例１と同様の方法により、ビクトリア湖ジンバブエ
近くのいぼいのししの穴から得たオルニトドロスモウバ
タダニ（亜種ポルシヌス（ｐｏｒｃｉｎｕｓ）ウオルト
ン）を用いてＴＡＰ−１のようなＸａ因子明阻害を有す
る別のポリペプチド配列を決定した。このペプチドをＴ
ＡＰ−２と同定した。

丈思班旦 Ｂｏｃ−１１ｅ−０−Ｐａｍ樹脂で開始して、α−アミ
ノＢｏｃ保護基（ｔ、ｅｒｔ−ブチルカルボニル）をト
リフルオロ酢酸と塩化メヂレンを用いて除去し、脱保護
したイソロイシンをジイソプロピルアミンで中和する。

次いでＢｏｃ保護Ｃｙｓ　ｆＰＭＢ）　（システィンは
ｐ−メトキシベンジルで保護される）をシンクロヘキシ
ルカルボジイミドによって仲介されトリフルオロ酢酸と
塩化メチレンで脱保護されたインロイシンに結合する（
アブライドバイオシステムズ社ペプチドシンセサイザー
用プロトコール）。次いでＣｙｓをジイソブロビルエヂ
ルアミンで中和する。シンクロヘキシルカルボジイミド
によるカッブリング、ｌ・リフルオロ酢酸と塩化メチレ
ンによる脱保護のこの段階的方法により６０個のアミノ
酸のＢｏｃ保護Ａｌａ、　Ａｓｎ及び残りの５６個のア
ミノ酸を逐次結合する２種々のアミノ酸は当業者に周知
の通常のペプチド合成実施に従って適当に保護すること
ができる、 ペプチドの樹脂からの切断はＩＩＦ／アニソール（９：
１　（ｖ／ｖ）　）を用いて得られる。システィン及び
チロシン残基のアルキル化を避けるためにチオクレゾー
ル及びクレゾールスカベンジャー混合液を使用した。樹
脂をエーテルで洗浄し２５０ｇＭポリペプチド濃縮物を
直ちに０．１Ｍ酢酸溶液約２ｆ２に希釈する。次いでこ
の溶液を撹拌し、水酸化アンモニウムを用いてｐＨ約８
．０に調整する。０．１％ＴＦＡ　Ｈ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮ
勾配中分取用Ｈｌ’　Ｉ−Ｃを用いて精製を行なう。

阻害剤の最終アミノ酸配列は ２ ＮＨ２−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−工
１ｅ−Ｌｙｓ−Ｐｔｏ−Ａｔｇ、−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−工
１ｅ−４ Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓ　ｐ−５ｅ　ｒ−Ａｓｎ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−
６ Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｒ　ｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｓ　ｅ　ｔ　−Ｐ
ｈｅ−８ Ｔｒｐ−工１　ｅ−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓ
　ｐ−Ｈｉ　５−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓ　ｐ−
Ｔｙｒ　−０ Ｔｙｒ　−Ｓ　ｅ　ｒ−５ｅ　ｒ　−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−
Ａｓ　ｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−
工１ｅ−ＣＯＯＨである。

々のプロテアーゼに関するＴＡＰ−１の　室活性第３図
はＴＡＰ−１（７）存在下（Ｖｉｌ及び不在下（Ｖｏｌ
で初速度による増加量阻害剤の効果を示す、ＴＡＰ−１
をヒトＸａ因子と予め渦層して基質不在下で平衡を得た
ため機序と無関係の固有Ｋｉ値はモーリソン（Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎｌ　、　Ｊ、　Ｆ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔ
ａ第１８５巻２６９頁（１９６９年）による論文に記載
される密着結合阻害の等式を用いて計算した（実線）。

種々のプロプアーゼに関するＴＡＰ−１の効果も試験し
た。各プロテアーゼより３００倍モル過剰量に於てＶＩ
Ｔ　ａ因子トロ ０ンビン、キモトリプシン、エラスターゼ、トリプシン
、カリクレイン、ウロキナーゼ、プラスミン又はＳ、ア
ウレウスＶ８プロテアーゼの阻害は検出されなかった。

Ｋｉは０．５８ｎＭであった。１５　ｍＭｃａ＋＋の封
入体は１’ＡＩ’−１のＸａ内因子阻害する能力に関し
て効果がなかった。プロトロンビン、活性化部分トロン
ボプラスチン及び変性スチブベンの存在下凝血時間に関
するＴＡＰ−１の効果は表ＩＩに示される。

表　　　■ に関するＴＡＰ の効果 ＝（対照） １．１５ピコモル ２８．９ピコモル ５７．８ピコモル １５　　ピコモル １５．１ １５．１ ２８．９ ３１．２ ４８．７ ２８．９ピコモル ５７．８ピコモル １１５　　ピコモル 性スチブベン時間 （正常ヒト血漿） ４５．２ ５７．７ ９２．２ ２８．９ピコモル ５７．８ピコモル １１５　　ピコモル ■７，７ ３１．２ ６５．１ ＤＮＡ技術を用いて本発明のタンパク質の種ノＪの誘導
体の製造が可能であり、例えば基礎にあるＤＮＡの変異
誘発に向けられた部位によって生しる１個又は複数のア
ミノ酸置換、欠失、付加又は置換で様々に修飾される、
これらの誘導体を生しるこのような対立遺伝子の変更及
び修飾は全てこれらのタンパク質の実質的特徴的Ｘａ因
子阻害活性が性質に影響を及ぼさない限り本発明の範囲
内に含まれる。タンパク質はｆｌ）最初のアミノ酸とし
てメチオニンを有して（構造遺伝子の前にＡＴＧ開始シ
グナルコドンを挿入することによって存在させる）又は
（２）メチオニンが細胞内又は細胞外で切断される場合
に標準的な最初のアミノ酸を有して又は（３）シグナル
ポリペプチド又は複合体が細胞内又は細胞外条件で特別
に切断可能である通常のシグナルポリペプチド以外のシ
グナルポリペプチド又は複合タンパク質と共に（英国特
許出願公報第２．００７．６７６Ａ号）又は（４）余分
ないかなる外来ポリペプチドも切断する必要のない成熟
形で直接発現して作製される。後者は、与えられた宿主
がシ９ グナルベブチドを除去することができないか効率よく除
去しない場合に特に重要でありその場合、発現ベヒクル
はタンパク質をそのシグナルペプチドと共に発現するよ
う作られる。いかなる場合にも、こうして作製したタン
パク質を種／７の形で回収し、Ｘａ因子を　　−　　　
゛− 阻害する場合に用いるのに適合するレベルに精製する。

以下の実施例は阻害剤を自然に折りたたまれた生物学的
に活性な形で作製する組換え技術である。

実１０」４ 酵母に於ける阻害剤の発現 阻害剤をエンコードする組換え体遺伝子を合成し、ＴＡ
Ｐ−１の一次アミノ酸配列に基づいて構成した。適切に
変性された合成遺伝子を分泌発現させる酵母発現ベクタ
ーに挿入した。酵母細胞は合成遺伝子を含むベクターで
形質転換した。

ＴＡＰ−１のアミノ酸配列を同定したため、適当に選択
された合成オリゴヌクレオチドを使用して阻０ Ｉ。

害剤をエンコードする遺伝子を構成した。８種のオリゴ
ヌクレオチドを合成し、合成遺伝子なアニーリング及び
連結反応によって構成した。

５’　ＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡ　　　　　　　　　
　　　　　３’４５−＋ｎｅｒ ＩＩ。

５′ ＴＴＣＧＡ　３’ ＩＩＩ。

ＩＶ。

２−ｍａｒ ５’　　ＴＣＧＡＣＧＡＡ １−ｍａｒ ５’　　ＣＴＴＴＡＣＣＧＴＴＡＣＧＧＡＡＧＴＡＡ０
−ｍｅｒ にＴＣＧＣＡＴ　３ ０３′ ２−ｍｅｒ ＶＩ。

５′ ＧＡＡＧＧＡＧＴＣＧＣＡＡＣＣＡＣ３２−ｍａｒ ＶＩｌ、５’ ＧＣＴＴＧＡＡＴｒＣＡＴ　３　’ ８−ｍａｒ 、Ｇ　３ 各々のオリゴヌクレオチドを１５％ポリアクリルアミド
ゲルによる電気泳動分離及び電気溶離によって精製した
。ＩＩ　−ＶＴＩのオリゴヌクレオチドをポリヌクレオ
チドキナーゼで処理し、相補的対合（ＩＩＩと■）及び
（Ｖと■）でアニールした。オリゴヌクレオチドＩと■
を各々キナーゼ化ＩＩとｖ■で直接アニールした。オリ
ゴヌクレオチドをキナゼ反応緩衝液中で８０℃に２分間
加熱し、１時間にわたって徐々に冷却してアニールした
。４種のアニール化オリゴヌクレオチド対合をプールし
Ｔ４リガーゼで処理した。得られた生産物をＥｃｏＲＩ
で消化した。合成遺伝子を表わす生産物を２００ｂｐ断
片として分離し、混合物を２％アガロースゲルで電気泳
動にかけた後、同定した断片を切除し電気溶離した。

合成遺伝子を表わすＤＮＡ断片を予めＥｃｏＲｌで消化
したｐＪｃ２６４　（ガン（Ｇａｎ）、　Ｚ、−Ｒ，等
（１９８９年）ジーン、第７９巻１５９〜１６６頁）に
連結し、アルカリ性ホスファターゼで処理してプラスミ
ド２７６−２Ｅを得た。

連結混合液を使用して受容能のある大腸菌（ストラタジ
ェン、カリフォルニア、米国）を形質転換した。アンピ
シリン耐性細胞を得、アンピシリンプレート」二に選択
した。得られたプラスミドクローン中正しい挿入配列を
ＤＮＡ配列分析で確認した。

この合成遺伝子を構築するために用いられる方策は以下
に示される。更に得られた読み取り枠とその翻訳を示す
。

１０　　　　　　　　　　　　３０　　　　　　　　　
　　　５００ ０ １０ ３０ ５０ ７０ ＡＣＧＣＴＴＧＣＡＴＣ’ｒＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣ
ｓｎＡ１ａｃｙｓ１１ｅＥｎｄ Ｂ。

合成遺伝子を次の方法で酵母発現ベクターに挿入した。

１つのプラスミド２７６−２Ｅを選択しオリゴヌクレオ
ヂドプライマーを用いる反応に於てポリメラーゼ鎖反応
産物を得た。

１ ＴＡＧ　にＡＴ　ＣＣＴ　ＣＴＣＴｒｒ　ＧＧＡ　ＣＡ
Ａ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＣＡＡ　ＣＱＧτＣＴ　（ｍ　Ｃ
ＡＴ　ＣＡＡ　ＡＣＣ３’５’　　　ＡＣＴ　ＧＧＡ　
ＴＣＣＧＡＡ　ＴｒＣＡＡＣＣＴｒ　ＡＧＡτＧＣＡＡ
Ｇ　ＣＧＴ　３’阻害剤ＤＮＡは増幅が達成されるポリ
メラーゼ鎖反応（ＰにＲ）にかけた（米国特許第４．８
００．１５９号第２欄３６〜６８行第３．４．５欄ｌ〜
２０行を引用する）。ＤＮＡ鎮を各ストランドに結合す
るブライマーの存在下で加熱変哲した。ブライマーはス
トランドの特定部分をコピーするために複製機能を行な
うＤＮＡポリメラーゼを指図した。このプロ七　４ 又は、ス１〜ランドを分離するために加熱し、アニーリ
ング及び所望配列のコピーを作成するブライマーエクス
テンションするために冷却する一連の加熱冷却サイクル
で続けた。このサイクルを繰り返すと特定配列のコピー
がまずまず生じた。増幅により末端制限部位が付加され
るコーディングドメインが得られた。

ＰＣＲ産物は、ｐＫＨ４・ＴＡＰを生産するために使用
した。

ひ几１５しｌ匪危 ｐ　Ｋ　Ｈ４の構成は、シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）等
、ジーン、第６１巻（１９８７年）１２３〜１３３頁に
記載され、これを引用する。プラスミドＩ）Ｊに１９７
　（シュルツ等、ジーン第５４巻（１９８７年）１１３
〜１２３頁）は、最初に同書クルヤン（Ｋｕｒｊａｎ）
及びヘルスコウィッ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）　（１９
８２年）で誘導された酵母ＭＦａｌブレープロリ〜グー
と転写ターミネータ−間のユニークＢａｍＨＩクローニ
ング部位を含む大腸菌−８，セレビシェシャトルベクタ
ーである。ｐＪｃ１９７をＥｃｏＲＩ　＋　ＰｓｔＪで
消化し、ＭＦａｌプレプロリーグ−の一部、３枠の翻訳
ターミネータ−及びＭＦα１転写ターミネータ−を含む
０．７＝Ｋｂ　Ｐｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ断片をゲル精製し
た。ＧＡＬｌｏｐをＹＥＰ５１から、５ａｕ３Ａで消化
し、Ｐｏ１ＩＫでフラッシュエンデイング、オクタメリ
ックＢａｍＨＩ　リンカ−で連結し、Ｓａｌ　Ｉで消化
して分離した。

得られた６ＡＬ１０ｐを持つ０．５−ｋｂ　ＢａｍＨＩ
−３ａｌＩ断片をゲル精製し最初の１ｌｂｐのＩＦα１
非翻訳リーグとＡＴＧ及び最初の８ａａのＭＦαｌプレ
ープローリーダーをエンコードする３５−ｂｐ　５ａｌ
Ｉ−Ｐｓｔ１合成オリゴデオキシヌクレオチドアダプタ
ーに連結した。

得られた０、　５−ｋｂフラグメントをＢａｍＨＩで消
化し、ゲル精製し、前述の０．７−ｋｂ　ＰｓｔＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片とｐＢ８３２２由来４．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲ
Ｉ−１３ａｍＨＩベクター断片と一緒に連結した。得ら
れたプラスミドｐＫＨ２０７−１はＭＦαｌプレープロ
ーリーダーとＢａｍＨＩクローニング部位に融合したＧ
ＡＬ１０１’ｌ、翻訳終結コドン及びＭＦａ１転写ター
ミネータ−を含む。ＥｃｏＲＩで消化し、ＢａｍＨＩで
一部消化する際酵母ＭＦα１プレープローリーダーに融
合したＧＡＬｌｏｐ、ユニークＢａｍＨＩクローニング
部位、全部で３種の読み取り枠の翻訳終結コドン及びＭ
Ｆα１転写ターミネータ−配列の発現カセットを酵母に
於けるプラスミドの安定な伝播として酵母２４ｚ　ＤＮ
Ａを高コピー数で含む酵母シャトルベクターｐｃ１／１
　（ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）等、ネイチ
ュア第３１２巻ｆ１９８４年）７７〜８０頁）に挿入し
てｐＫＨ４を作成した。

ａａ９−７９のｐｐｌ、をエンコードする２１３ｂｐ　
ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片をプラスミドｐａ２　（バイ
ネ（Ｂａｙｎｃｌ等、ジーン第６６巻（１９８８年１２
３５〜２４４頁）から作製した。プラスミドｐα２はコ
ドン８０と８１で修飾した酵母ＭＦαｌブレープロ配列
（７９ａａ）の一部を含みＫＥＸ２プロセッシング部位
から上流に１１ａｍＨＩ部位６ａａを生じる。ｐＫＨ，
のＢａｍＨＩ部位に対するｐｐｌ、のコドン９　（Ｐ　
ｓ　ｔ　Ｉ　ｌに対応する領域をＢａｍＨＩで消化し次
いでＰｓＬＴで部分消化した後ｐＫＬから除去した。こ
の切り取った配列をｐα２からのＢａｍ旧−Ｐｓｔ、Ｉ
断片で置換して修飾ベクタｐＫＩＩ４α２を作製した。

プラスミドｐＫＨ４α２は酵母ＧＡＬＩＯプロモーター
、１ＪＦａｌブレープロリーダ７ の一部（７９ａａ）　、　３枠の翻訳ターミネータ−及
びＭＦａ１転写ターミネータ−５酵母ＬＥＩ＋　２遺伝
子、酵母２　Ｈ，配列ＡｐＲ遺伝子とＤＮＡ複製起点（
ｏｒｉ）を含むｐＢＲ３２２由来配列を含む。

びムニＢＬ里贋羞 ポリメラーゼ鎖反応はＢａｍＨＩで消化する常法で再生
される平滑末端断片を生した。２％アガロースゲルによ
る電気泳動バンドの除去及び電気溶離後に正しい断片を
得た。精製フラグメントを予めＢａｍＨＩで消化した酵
母発現ベクターｐＫＨ４α２　（ヤコブソン（Ｊａｃｏ
ｂｓｏｎ）、Ｍ、Ａ、等（１９８９年）ジーン、第８５
巻、５１３〜５１８頁）と連結し、子ウシアルカリ性ホ
スファターゼで処理した（第４図）。正しい配向のプラ
スミドクローンの正しい配列をＤＮＡ配列分析で確認し
た。ｐＫＨ４・ＴＡＰから作成した融合産物をＫＥＸ２
遺伝子でエンコードしたＬｙｓ−Ａｒｇ−切断エンドペ
プチダーゼ（ＫＥＸ２）でタンパク質分解的に処理し、
生産物を培地に分泌した。ＫＥＸ２はＬｙｓ−Ａｒｇ残
基のＣ末端側で切断する。

ＤＭＹ６の形質転換 　８ 二倍体酵母株ＤＭＹ６　ｆシュルツ、Ｌ、Ｄ、　＋１９
８７年）ジーン、第６１巻１２３〜１３３頁）を標準プ
ロトコルを用いてｐ　Ｋ　Ｈ４・ＴＡＰで形質転換した
（ヒンネンｆＨｉｎｎｅｎ１等（１９７８年ＩＰｒｏｃ
、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、米国第７５巻１９２９
〜１９３３頁）。１つの分離物を選択し、Ｓ、セレビシ
ェＭＹ２０３０９７１８Ｐ２８１−３を示した。この分
離物をアメリカンタイプ力ルチュアコレクションに寄託
しＡＴＣＣＮｏ、２０９８４を確認した。

酵母形質転換体を含むプレートから単一コロニー分離物
を得た。これらの分離物を５　Ｘ　ＣＭ１ｅｕ培地（０
８５％のアミノ酸及硫酸アンモニウムを含まない酵母窒
素塩基）、１％のコハク酸、０．６％のＮａ０Ｔ（，０
，５％の硫酸アンモニウム、０．０６％のイソロイシン
、０．０６％のフェニルアラニン、０．０４％のりシン
、０．０４％のトリプトファン、０．０２５％のチロシ
ン、０．０２％のアデニン、０．０２％のウラシル、０
．０１％のアルギニン、０．旧％のヒスチジン、０．０
１％のメチオニン、０．０４％のＦｅＣＥｓ　’６＋１
２０．０．０３％のＺｎ５Ｏ，−７１１２０及び４％グ
ルコース）中３０℃で増殖させた。選択培地（５Ｘ　Ｃ
Ｍｌ、、ｅｕ−１５００ｍｌを接種する前に２８１−３
の凍結培養株をロイシンを含まない寒天培地に２８℃で
３日間接種して細胞を増殖させた。１．５１２のＢｉｏ
−Ｆｌｏ　ＩＩＩ発酵槽にューブルンスウィック　サイ
エンティフィック）中４％（ｗ／ｖｌがラクト−又を含
む５　Ｘ　（：ＭＬｅｕ−ブイヨン２．５℃に接種する
前に回転振盪機を用いて３０［］ｒｐｍで２ｌの三角フ
ラスコ中２８℃で１６〜１８時間５００　ｍｌの種子培
養を増殖した。発酵槽を２８℃、　９００ｒｐｍ、２．
５１２／分空気で１１０〜１２０時間操作した。

全ての作業は２〜８°Ｃで行なった。酵母細胞を組換え
体ＴＡＰ−１を分泌する酵母培養（２８１−３株）のブ
イヨン（８β組換え体ＴＡＰ−１１，６９ｇを含む）か
らアミコンＤ（：１０単位を用いる５００．０００　ｕ
ｗｃｏ中空繊維カートリッジ（ロミコン、ＰＭ５００　
、５フイト）により液体をシアフィルター処理して分離
した。次いで清澄化ブイヨンを約５００　ｍｌの液体が
貯蔵器に残るまでｉ　ＤＯ，ＯＯＯＭＷＣＯ中空繊維カ
ートリッジ（アミコン、）１５Ｐ１００−４３１により
シアフィルター処理した。保持液体を２０ｍＭビス−ト
リス、ｐＨ６，０（緩衝液Ａ）８℃とシアフィルター処
理した。

１００、　ＯＯＯＭＷＣＯ繊維の流出液をｐｌ＋６．０
に調節し、冷緩衝液６３ｆｆで希釈した。希釈したブイ
ヨンは組換え体ＴＡＩ”１１．６７ｇを含有した。希釈
発酵ブイヨンを２つの４０１２部分に分け、各々を緩衝
液Ａで平衡にしたＱ−セファロース高速液体ＴＭｆファ
ーマシア１４ｃｍｘ　１０ｃｍ　ｒ、Ｄ、）の別ノＩの
カラムに２β／時間でくみにげた。希釈したブイヨンの
全部をカラムにポンプでくみ七げた後に、緩衝液Ａ８ｊ
２で各々洗浄して非結合物質を溶離して仕−Ｌげた。結
合タンパク質は緩衝液Ａ中０〜５００ｍＭＮａｃｌの直
線力配置６Ｉ２で溶離した。両分４００　ｍｌを集めＡ
２８０及びヒ１−Ｘａ因子の阻害を監視した。組換え体
ＴＡＰ−１は１７５ｍＭＮａｃｌで溶離した。

組換え体ＴＡＰ−１を含む両分を合わせ緩衝液Ｂで平衡
にしたＳ−セファロース高速液体１′（ファマシア、２
４．５ｃｍＸ７．５ｃｍ　１．Ｄ、）のカラムに２ｌ／
時間でくみ−にげる前に４容量の５０ｍ１Ｊ酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ４，０（緩衝液Ｂ）で希釈した。全試料なカ
ラムにくみ上げたとき緩衝液Ｂ８ｆ２で洗浄し、次いで
結合タンパク質を緩衝液Ｂ中Ｏ〜４００ｍ１ＪＮａｃ１
１ の直線力配置６ｆｆで溶離した。画分をＡ２８０及びヒ
トＸａ因子明害活性を監視し、組換え体ＴＡＰ−１を１
９０　ｍＭＮａｃｌで溶離した。カラムから溶離した組
換え体ＴＡＰ−１の量は１．５８ｇであった。阻害活性
を含むプールした画分を水性０．１％ｆｖ／ｖ）　ＣＦ
３ＣＯＯＨで平衡にした４、５　Ｘ３０ｃｍプレブバッ
クＣ，８ＨＰＬにカラム（ウォーターズアソシエイテス
）にデルターブレブ分取用ＨＰ　Ｌ　Ｃ系（ウォーター
ズＡｓ５ｏｃｌを用いて５０ｍ１／分として充填した。

試料を同じ流速で注ぐことによりカラムを０〜４０％（
ｖ／ｖｌの水性０．１％（ｖ／ｖ）　ＣＦｌ（：００ｔ
（ｒｐＣＨａＣＮ勾配を１％／分で展開する前に水性０
．１％（ｖ／ｖ）　ＣＦ３ＣＯＯＨで１００　ｍ１７分
として５分間洗浄した。約３１％（Ｖ／Ｖｌの（１，＋
１．（：Ｎ濃度で溶離した２８０ｎｍに於ける吸光度ピ
ークを手で集め、凍結乾燥して乾燥した６ゲル濾過クロ
マトグラフイーを逆相旧）１．Ｃの代わりとして使用し
て脱塩組換え体ペプチドを作製することができる。ゲル
濾過としては、セファデックスＴ′Ｇ−１０（ファーマ
シア）をＭｉｌｌｉ−ＱＴｌｌＨｚＯで膨潤さぜ２．５
ｃｍ　（１，Ｄ、）Ｘ９３ｃｍガラスカラムに充填し、
Ｓ−セファロ−スフ２ ０マドグラフイーで精製した組換え体ＴＡＰ−１の溶液
９０ｍ１をこれでクロマトグラフィー処理した。画分１
２．５ｍｌを集めＡ２８０と伝導率を監視した６タンパ
ク質をＶｏで溶離し塩から良好に分離した。組換え体’
ｒＡｐ−ｔの回収は１００％であった。この物質を凍結
乾燥により乾燥した。いずれかの方法で作製した精製組
換え体ポリベブヂドは分析用逆相Ｃ，，ＨＰＬＣ、アミ
ノ酸定量分析及び自動化アミノ末端配列分析によって純
度９９％以］二であることがわかった。組換え体阻害剤
の典型的な比含有縫はチロシンで開始する均一アミノ末
端を有する１１５〜１２０ナノモル／ｍｇであった。組
換え体ＴＡＰ−１の電気泳動移動度は還元条件下ドデシ
ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を評
価した未変性阻害剤と同一であった。組換え体ＴＡＰ−
１のＸａ因子阻害活性は第３図で示したものと同様であ
りＫｉは０．２ｎＭであると決定された。

組換え体ＴＡＰ−１の一゛効。

Ｘａ因子阻阻害組換え体ＴＡＰ−１の効能を求めるため
にバンラインーマクケンナ等（１９８９年）血栓症と止
血第６１巻７〜９頁と同様のトロンボプラスチン誘発血
餅形成の生体内モデルを使用した。ウサギを組換え体Ｔ
ＡＩ’−１を６０分間注入して前処理し、この時頚静脈
のセグメントを分離し、吸蔵した。

トロンボプラスチンと頚静脈から取った全血を血餅形成
を誘発させるためにセグメントに注入した。残った頚静
脈を血餅を除夫し定量する前に３０分間吸蔵した。

抗凝血物質の前処理を受けないウサギの血餅形成は血餅
値２９．２±３．４％を標準化した。組換え体ＴＡＰ−
１７ｕ　ｇ　／　ｋｇ／分、３７　ｕ　ｇ　／　ｋｇ／
分及び６４μｇ／ｋｇ／分を静脈内注射した血餅形成は
各）７２７．０±７．５％及び７．９±２．０％及び１
．９±１．０％であった。これらの投与量は活性化部分
トロンボプラスチン時間及びプロトロンビン時間を著し
く増加しなかった。

ＴＡＰ−１変異誘発 ＴＡＰ読み取り枠の所望の変異は２種のＪ、髪本的方法
：ポリメラーゼ鎖反応変異誘発及びクンケル変異誘発の
１つ−Ｃ作製した。

ＰＣＲ変異誘発 部位特異性変異誘発に対してＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
によって触媒されるポリメラーゼ鎖反応の使用はカドワ
キ等、ジーン、第７６巻Ｆ１９８９年１１６１〜１６６
頁に記載される。カドワカ等はこの方法を変異誘発に向
けられた部位にｎｌいるために不適正なものをポリメラ
ーゼ鎖反応（ザイキ等、ザイエンス第２３０巻（１９８
５年）１３５０〜１３５４頁及びザイキ等、→Ｊイエン
ス第第２３看 を開始するために使用されるＡリボに導入することを記
載している。

ＰＣＲ変異講発−末端に近い変異 ＴＡＰ−１コ一デイング配列の末端近くに生じる変異を
ＴＡＰ−１鋳型のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲＩ増幅に
より脩飾した。末端に近い変異はアルギニンのアスパラ
ギンによる置換を生じる５３位残基に於けるＴＡＰ−１
変異を含む。オリゴマーブライマー（増幅されるＤＮＡ
末端に相補的）を’「Ａｒ”−エンコーディングＤＮＡ
に加え、この反応混合液を加熱することによってＤＮＡ
　＆＃が分離し鋳型に対してブライマー　５ をアニーリングする。ブライマーは反対のストランドを
結合し延長、ストランド分離及び再アニノングの多くの
ザイクルに於てＴａｑポリメラーゼ（セラスパーキン・
エルマー）と反応する際ブライマー間の領域が複製され
る。１個以上のブライマーが不適正領域を含む場合、そ
の変異は反応産物に組込まれる。ｒＡＰ変異体は変異原
性ブライマー内の適当なコドン変化を用いてこの増幅に
より１１シた。ＰＣＲ産物をＢａｍＨｌで切断し、ゲル
精製し１次いでＢａｍＨＩ部位に於てｐＫＨ．　ａ　２
に挿入した，。

ＰＣＲ　変異」１発二二辻」（嬢」Ｅ異この方法の変法
をユニーク丁ａｑｌ又はＸｈｏｌ制限部位近くで生じる
非末端に望まれる変異に使用した。非末端変異はアルギ
ニンのアスパラギンによる置換が生じる９及び２３位残
基に於ける］”ＡＰｉ変異とアスパラギン酸のアルギニ
ンによる置換が生しる１６位残基に於けるＴＡＰ−１変
異を含む。ブライマーはＴＡＰをコードする配列を増幅
し、前の通りに変異を取り入れて作製した。ブライマー
はＴＡＰ６ 遺伝子に存在する制限部位を含むように十分に伸長した
。遺伝子の残りの配列と同じ制限部位を増幅するために
別゛のブライマーのセットを使用した。得られた断片を
その酵素で消化し連結して変異により完全なＴＡＰ遺伝
子を再生した。この物質を精製し、Ｂａｍ１（１を上述
の通りｐＫ＋１４０２に挿入するために消化した。

クンケル変異誘発 クンケルＰｒｏｃ．ＮａＬ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国
第８２巻（１９８５年）４８８〜４９２頁は元の変化し
ていない遺伝子型に対して強力な生物学的選択の利点を
利用する部位特異的変異誘発を記載している。大腸菌（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ｄｕｔ−ｕｎｇ−株
（クイ（Ｔｙｅ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．米国第７５巻（１９７８年）２３３〜２３７頁
）で増殖した後標準の操作（サガ（Ｓａｇｈｅｒｌ及び
ストラウス（ＳｔｒａｕｓＳ）バイオケミストリー第２
２巻（１９８３年）４５］８〜４５２６頁によって作製
した比較的標準のウラシル含有ＤＮＡを使用することに
よって部位特異的変異誘発操作を用いると、選択するこ
となく２、３時間で効率良く変異が生しる。

変異体は１木調ｐ２７６ー２ＥプラスミドＤＮＡが所望
の変異原性配列を含む相補的ブライマーでアニルされる
クンケル法の変法を用いて作製した。クンケル法は詳細
には、アルギニンのアスパラギンによる置換が生じる２
７位残基に於てＴＡＰ−１変異を得るために使用した。

この複合体をＤＮＡポリメラーゼで伸長し、ＤＮＡリガ
ーゼで共有結合し、この生産物を使用して大腸菌ＤＨ５
細胞（ベテスダリサーチラボラトリース）を形質転換し
た。変異回収は大腸菌宿主ＣＡＧ６２９　ｆｄｕｔ．−
ｕｎｇ−バイオラド）を用いて元のストランドに対して
選択することによって改良されて１本鎖鋳型を作製した
。Ｍ１３ＫＯ７ヘルバーフアージ（ファーマシア）の存
在下、１つのプラスミドＤＮＡ鎖をコピーし、ファージ
キャプシドに詰込み上清に分泌し、１本鎖ＤＮＡを分離
した。このストランドはウラシルを含むため、変異誘発
反応ミックスを大腸菌ＤＨ５（Ｄｕｔ″Ｕｎｇ”　ｌを
形質転換するために使用するとき分解され複製の鋳型と
して変異されたストランドを切断する。この修飾された
ＴＡＰ配列をＢａｍ１ｌｌカセツトとしてｌ１ｌＫＨ４
α２ベクターに移した。

この方法はまた変異誘発反応の鋳型として発現ベクター
を用いて使用した。

痘ユ このタンパク質は１〜ロンビンを阻害するよりむしろＸ
ａ因子機序を阻害することによって凝固を阻害する。Ｘ
ａ因子機序阻害はタンパク質をその組成がトロンビンの
プロトロンビンからの生成を誘発することからＸａ因子
を１ｌｆｌ　ｌｈする望ましい効果を得るような適当な
医薬組成相体例えば食塩水と適当なｐＨ例えば７．４で
併用して連続静脈投与又はポラス投与して達成される。

Ｘａ因子阻害活性を有する本発明のタンパク質性物質は
多くのタンパク質／ペプチドのようにいずれの無毒性ｆ
１機又は無機酸とも医薬的に使用し得る塩を形成するこ
とができる。適当な塩を形成する無機酸の具体例として
は塩酸、臭化水素酸硫酸及びリン酸及びオルトリン酸ｌ
水素ナトリウム及び硫酸水素カリウムのような酸金属塩
がある。適　ｇ 当な塩を形成する有機酸の具体例としてはモノ、ジ及び
トリカルボン酸がある。このような酸の具体例は例えば
酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コ
ハク酸、トリフルオロ酢酸、グルタル酸、フマル酸、リ
ンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン
酸、ヒドロキシマレイン酸、安、Ｑ香酸、しドロキシ安
息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、ザリヂル酸、２−フ
ェノキシ安息香酸及びメタンスルホン酸及び２−ヒドロ
キシェタンスルホン酸のようなスルホン酸である。カル
ボキシ末端アミノ酸部分の塩としては適当ないずれの無
機又は有機塩基でも生成される無毒性のカルボン酸塩が
ある。具体的にはこれらの塩はナトリウム及びカルシウ
ムのようなアルカリ金属、カルシウム及びマグネシウム
のようなアルカリ土類金属、アルミニウムを含むＩＩＩ
　Ａ族の軽金属及びトリエチルアミン、プロ力イン、ジ
ベンジルアミン、１−エテナミン、Ｎ、Ｎ′−ジベンジ
ルエチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミン、Ｎ−
（低級）アルキルピペリジン及び適当な　０ いずれのアミンも含むトリアルキルアミンのような有機
第一、第二、第三アミンがある。

Ｘａ因ｆ阻害活性を（ｊ−する本発明のタンパク質性物
質の抗凝血物質投与量は、例えば患者及び治療される血
栓症状の程度に依佇してＩＲにつき患者の体重１ｋｇ当
り０．２〜２５０１Ｄである。個々の患者に適当な投−
！ｊ量は、容易に決定することができる。奸適にはＩ　
Ｂに１〜４同典型的には、ｌ投ｊｊ量当り有効化合物５
〜１００　ｍｇで投与される。貯蔵血液のような媒質牛
血液凝固又はＸａ因子を阻害するために使用されるとき
Ｘａ因子を阻害するのに必要とされるＸａ因子阻害活・
けを有する本発明のタンパク質性物質の濃度は当業書に
容易に決定することができる。

抗凝血物質療法は、様々な血栓症状、特に冠状動脈及び
脳血管性疾患の治療及び予防に必要とされる。この分野
に経験のある者は抗凝血物質療法を必要とする状況は容
易に気がつく。本明細書で用いられる゛″患者−とはヒ
ト、羊、馬、牛、豚、犬、猫、ラット及びマウスを含む
霊長類のような哨乳頽を意味している。Ｘａ因子の阻害
は血栓症状を有する個々の抗凝血物質療法に有用である
ばかりでなく、貯臓全血の凝固を阻止したり試験又は貯
蔵用の他の生物試料の凝固を阻止するといった血液凝固
の阻ＩＩ：を必要とするときにも有用である。従ってＸ
ａ因子阻害活性を有する本発明のタンパク質性物質は、
Ｘａ因子を含むか又は含むと思われる血液凝固を阻止す
ることが望まれるいずれの媒質にも添加又は接触させる
ことができる６Ｘａ因子明害活性を有する本発明のタン
パク質性物質は経口投与により腸を通過してしまうが、
出願人は非経口投与、例えば皮下、静脈内、筋肉内又は
腹腔内投与、蓄積注入又は充填製剤による投与を好んで
用いる。

非経口投与としてはＸａ因子阻害活性を有する本発明の
タンパク質性物質を水及びＭｈのような滅菌液体である
ことができる医薬担体と界面活性剤及び他の医薬的に使
用し得る補助剤を加えて又は加え１″に生理的に使用し
得る希釈剤中の溶液又は懸濁液の注射用投薬として投−
Ｌうすることができる。

これらの製剤に使用することができる油の具体例は、石
油、動物、植物又は合成からの例えば落花生油、大豆油
及び鉱油である。−・般に水、食塩水、水性デキストロ
ース及び関連の糖液、エタノール及びグリコール例えば
プロピレングリコール又はポリエチレングリコールが特
に注射用液剤に好ましい液体担体である。

Ｘａ因子阻害活性を有する本発明のタンパク質性物質は
、有効成分を持続して放出させるような方法で処方する
ことができる蓄積注入又は植込製剤の形で投与すること
ができる。有効成分をペレット又は小さな円柱に圧縮し
て蓄積注入剤又は植込剤として皮下又は筋肉内に植込む
ことができる。

植込剤は、生物分解可能な重合体又は合成シリコーン、
例えばシラスチック、シリコーンゴム又ハタウーコーニ
ングコーポレーションによって製造される他の重合体の
ような不活性物質を使用することができる。

タンパク質は、狛独で又は他のタンパク質と併用して使
用することができる６例えばＴＡＰは組織　３ プラスミノーゲン活性化因子を介した血栓再潅流の効率
を高める。’Ｉ’ＡＰは血栓形成によりまず投与するこ
とができ、組織プラスミノーゲン活性化因子または他の
プラスミノーゲン活性化因子はその後投与される。

進迂 アメリカンタイプ力ルチュアコレクション。

ロックビルＭＤ、米国に寄託されたＳ　セレビシェＭＹ
２０３０９７１８Ｐ２８１−３はＡＴＣＣ２０９８４と
示される。寄託は、特許手続きの目的とその条項に対す
る微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規
定によって１９９０年２月２１日になされた（ブダペス
ト条約）。生存可能な培養の維持は寄託の日から３０年
間保証される。生物体はブダペスト条約によるＡＴＣＣ
によって人手可能となり、出願人と関連する米国特許の
登録の際に無制限の利用可能性を保証するＡＴＣＣ間の
固定に委ねられることになる６寄託菌株の利用可能性は
特許法に従っていずれかの政府の代理権によって許可さ
れる権利に違反して本発明を実施するライセンスと解釈
されるべきで４ はない。

【図面の簡単な説明】

第１図はダニ抽出物のイオン交換クロマトグラフィー　
（Ａ）及び有効ピークの再クロマトグラフィー（角括弧
）による本発明のヒトＸａ因子咀書剤（ＴＡＰ−１）の
逆相ＨＰ　１．Ｃ図を示す。 第２図は、ＴＡＰＩの５Ｏ５−ＰＡＧＥ　Ｉレーンｌ：
阻害剤、レーン２：分子量標準）を示す。 第３図は、基質不在下でＴＡＰ−１をヒ１〜Ｘａ因子と
前装置することによるＴＡｌ”ｌの存在（Ｖｊ）及び不
在（Ｖｏｌ下初速度に関するＴＡＰ−１の増量の効果を
示す。 第４図は、［］ＫＨ４・ＴＡＰを生成するα−接合因子
・ＴＡＰ遺伝子の挿入及びＫＥＸ２プロセシング部位の
個々の同定を示す。 手続補正書 （方式） 事件の表示 平成２年特許願第２３５９９４号 発明の名称 抗凝血物質特性を有するタンパク質 手続をした者 事件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、凝固Ｘａ因子を阻害し、トリプシンを阻害しないタ
   ンパク質。 ２、凝固Ｘａ因子を阻害し、トリプシンを阻害しない分
   子量約７０００を有する１本のポリペプチド又はその断
   片である請求項１記載のタンパク質。 ３、配列： 【遺伝子配列があります】 又はその保存的アミノ酸置換（ＡＡ＿１、ＡＡ＿２、Ａ
   Ａ＿３及びＡＡ＿４は各々、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ及
   びＡｒｇであるか又はＡＡ＿１、ＡＡ＿２、ＡＡ＿３及
   びＡＡ＿４は各々Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ及びＧｌｎで
   あるか又はその保存的アミノ酸置換である） を有する請求項２記載のタンパク質。 ４、配列： 【遺伝子配列があります】 又はその保存的アミノ酸置換（ＡＡ＿５、ＡＡ＿６、Ａ
   Ａ＿７及びＡＡ＿８は独立してアルギニン又はアスパラ
   ギン又はその保存的アミノ酸置換であり、ＡＡ＿９はア
   スパラギン酸又はアルギニン又はその保存的アミノ酸置
   換である） を有する請求項２記載のタンパク質。 ５．配列： 【遺伝子配列があります】 又はその保存的アミノ酸置換（ＡＡ＿６及びＡＡ＿７は
   独立してアルギニン又はアスパラギン又はその保存的ア
   ミノ酸置換であり、ＡＡ＿８はアスパラギン酸又はアル
   ギニン又はその保存的アミノ酸置換である） を有する請求項２記載のタンパク質。 ６、請求項１記載のタンパク質の有効量を包含している
   血液凝固を阻止する治療組成物。 ７、ａ）Ｂｏｃ保護システインをイソロイシンにカップ
   リングし、これをＯ−Ｐａｍ樹脂に シンクロヘキシルカルボジイミドの存在 下で結合させ、 ｂ）システインをジイソプロピルエチルア ミンで中和し、 ｃ）システインをトリフルオロ酢酸と塩化 メチレンで脱保護し、 ｄ）タンパク質のアミノ酸を順次カップリ ング、中和及び脱保護して６０個のアミノ 酸タンパク質を生成し、 ｅ）生成したタンパク質をチオクレゾール とクレゾールの存在下ＨＦで切断し、 ｆ）直ちに２５０μＭタンパク質を０．１Ｍ酢酸約２ｌ
   に移し、 ｇ）この溶液を撹拌しｐＨ約８．０に調整することを特
   徴とする請求項１記載のタンパク質又はＴＡＰの製造方
   法。 ８、請求項６記載の組成物の有効な投与量を哺乳類に投
   与することを特徴とする哺乳類の血液凝固を阻止する方
   法。 ９、請求項１記載のタンパク質を投与してＸａ因子を阻
   害し、その後組織プラスミノーゲン活性化因子又は他の
   プラスミノーゲン活性化因子を投与することを特徴とす
   る患者の血栓形成後に血栓溶解再潅流を得る方法。 １０、ａ）オルニトドロスモウバタダニ抽出物をｐＨ約
   ７．０を有する緩衝塩を包含している水溶液に均一に溶
   解してホモジネートを 生成し、 ｂ）このホモジネートを遠心分離して上清 タンパク質浮遊液画分を生成し、 ｃ）この画分を合わせ、この画分の凍結乾燥抽出物を溶
   解し、得られた溶液をイオン交 換クロマトグラフィーカラムに注ぎ、 ｄ）凝固Ｘａ因子の阻害が特徴の生成物画分を選択する 工程を特徴とするオルニトドロスモウバタダニ抽出物由
   来の凝固Ｘａ因子の阻害能を有するタンパク質の製造方
   法。 １１、生成物画分が凝固Ｘａ因子の試験管内阻害を特徴
   とする請求項１０記載の生成物。 １２、請求項１のタンパク質をコードするＤＮＡを有す
   る遺伝子。 １３、実質的に凝固Ｘａ因子を阻害するポリペプチドの
   宿主に於ける発現をコードするＤＮＡ配列からなり、Ｄ
   ＮＡ配列がＤＮＡ分子内の発現制御配列に操作上結合さ
   れている請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡ
   を包含している組換え体分子。 １４、ａ）分子が請求項１記載のタンパク質をコードす
   るＤＮＡを包含し、ＤＮＡが実質的に凝固Ｘａ因子を阻
   害するポリペプチドの 宿主に於ける発現をコードするＤＮＡ配列 からなり、ＤＮＡ配列がＤＮＡ分子内の発現制御配列に
   操作上結合されている組換え 体ＤＮＡ分子で形質転換された分子宿主を 培養し、 ｂ）ポリペプチドを集める 工程を包含している凝固Ｘａ因子を阻害するポリペプチ
   ドの製造方法。 １５、分子宿主が酵母であり、ＤＮＡ分子がｐＫＨ＿４
   −ＴＡＰである請求項４記載の方法。 １６、凝固Ｘａ因子を阻害し、トリプシンを阻害せず、
   トリペプチド配列アルギニン−グリシン−アスパラギン
   酸をインテグリンに結合することができるタンパク質。 １７、配列： 【遺伝子配列が有ります】 又はその保存的アミノ酸置換（独立して ＡＡ＿１はＡｒｇ又はＧｌｎであり、 ＡＡ＿９はＡｓｐ又はＡｒｇであり、 ＡＡ＿６はＡｓｎ又はＡｒｇであり、 ＡＡ＿２はＴｙｒ又はＰｈｅであり、 ＡＡ＿７はＡｒｇ又はＡｓｎであり、 ＡＡ＿３はＧｌｙ又はＡｓｐであるか又は その保存的アミノ酸置換である） を有する請求項１６記載のタンパク質。