JP3490444B2

JP3490444B2 - 昆虫類の唾液からのトロンビン阻害剤

Info

Publication number: JP3490444B2
Application number: JP51365794A
Authority: JP
Inventors: ネースケ−ユングブルート，クリスティアーネ; シュロイニング，ヴォルフ−ディーター; アラゴン，アレハンドロ; ポッサニ，ロウリヴァル; クウェヴァス−アグイエレ，デリア; ドナー，ペーター; ヘンドラー，ベルナルト; ヘヒラー，ウルリケ
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1992-12-04
Filing date: 1993-12-03
Publication date: 2004-01-26
Anticipated expiration: 2019-01-26
Also published as: FI952712L; AU680643B2; ATE156519T1; JPH08507200A; KR950704488A; FI110669B; RU2183214C2; WO1994013807A1; ES2107790T3; US5876971A; GR3025015T3; HUT71210A; NO952215L; CA2150909A1; HU220301B; NO952215D0; HU9501626D0; AU5560394A; EP0677107A1; EP0677107B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、昆虫類の唾液からのトロンビン阻害剤であ
る蛋白質に関する。

従来の技術：トロンビンは、血管中での血栓形成の際に１つの重要
な機能を有する。このトロンビンは、フィブリノーゲン
からのフィブリンの分解を触媒する。更に、このトロン
ビンは、血小板の凝固を誘発する。酵素は、例えば動脈
および静脈の血栓症または動脈硬化のような種々の疾患
の病因に包含されている。

そのために、血栓症の治療のためのトロンビン阻害剤
の使用は、有望である。これまでに知られた最も重要な
トロンビン阻害剤は、抗トロンビンIII−ヘパリンおよ
びヒルジンである。抗トロンビンIIIは、血漿中に存在
する58kDaの分子量を有する蛋白質である。抗トロンビ
ンIIIは、まず多糖類であるヘパリンに結合する。次
に、抗トロンビンIII−ヘパリン複合体は、トロンビン
に結合し、かつこのトロンビンを阻害する。１つの極め
て安定な複合体は、トロンビンおよび抗トロンビンIII
から生成され、抗トロンビンIIIはトロンビンと分離さ
れる。抗トロンビンIIIは、トロンビンとともに例えば
因子X aのような別のセリンプロテアーゼをも阻害する
（Pratt,C.W.およびChurch,F.C.（1991）“Antithrombi
n:Structure and Function",Seminaris in Hematology
28:3〜９）。

血液ゲルのヒルドメディシナリス（Hirudo medicin
alis）から、蛋白質のヒルジンは単離される。このヒル
ジンは、約7kDaの分子量を有し、かつイオン交換作用に
よりトロンビンに結合する。このヒルジンは、トロンビ
ンに対して特異性を有している（Johnson,P.H.他（198
9）“Biochemistry and Genetic engineering of hirud
in",Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15:302〜
315）。

発明の詳細：従来の技術に挙げられている前記のトロンビン阻害剤
とともに、別の作用機構または増大された活性を有する
他の阻害剤が必要とされる。

本発明は、天然からかまたは合成により得ることがで
きる蛋白質を供給し、この場合この蛋白質は、トロンビ
ン阻害剤でありかつ哺乳動物の血液を吸う昆虫類の唾液
から単離可能である。

好ましいのは、本発明によれば、サシガメTriatoma p
allidipennisから単離可能である蛋白質である。

本発明による蛋白質は、天然に由来することができ
る。同様に、蛋白質を唾液腺から単離するかまたは蛋白
質を合成する細胞を唾液腺から取りかつ培養に維持する
ことは、可能である。この細胞培養によって生産される
上澄み液は、収穫されかつ後処理される。細胞の上澄み
液は精製され、本発明による蛋白質は、単離されかつ含
量が増大される。単離および精製の全ての含量増大工程
は、本発明の一部である。好ましいのは、単離および精
製の含量増大工程であり、この場合本発明による蛋白質
は、製薬学的目的に使用することができる。即ち、全蛋
白質に対するトロンビン阻害剤の50％の精製は達成さ
れ、好ましいのは、全蛋白質に対するトロンビン阻害剤
の85％であり、よりいっそう好ましいのは、95％であ
り、最も好ましいのは、99％である。

本発明は、サシガメTriatoma pallidipennisから単離
可能である蛋白質を包含するだけでなく、別の昆虫種に
よって合成させることができる蛋白質をも包含する。即
ち、最も好ましい群に数えられるサシガメTriatoma pal
lidipennisから単離可能である蛋白質とともにトリアト
マ・インフェスタンスTriatoma infestans、トリアトマ
・ジミジアタTriatoma dimidiata、トリアトマ・マクラ
タTriatoma maculata、ロドニウス・プロリクサスRhodn
ius prolixus、パンストロンギラス・メギストゥスPans
trongylus megistusおよびパンストロンギラス・インフ
ェスタンスPanstrongylus infestansに由来する他の蛋
白質も有利である。

同様に、本発明による蛋白質を合成により得ることも
できる。そのために、セワート（J.M.SEWART）およびヤ
ング（J.D.YOUNG）、サンフランシスコ、1969およびマ
イエンホッファー（J.MEIENHOFER）、ホーモナル・プロ
テインズ・アンド・ペプタイズ（Hormonal Proteins an
d Peptides）、第２巻、第46頁、アカデミック・プレス
社（Academic Press,ニューヨーク在）、1973年および
ショーダー（E.SCHODER）およびラブケ（K.LUBKE）、ザ
・ペプタイズ（The Peptides）、第１巻、アカデミック
・プレス社（Academic Press,ニューヨーク在）、1965
年による合成法が挙げられる。また、合成により得られ
る蛋白質には、公知方法により得られる組換え蛋白質も
挙げられる。宿主微生物に応じて、本発明による蛋白質
は、グリコシル化されていてもよいか、または原核生物
中で合成される場合には、グリコシル化されていなくと
もよい。

阻害剤の機能は、種々の試験系で測定することができ
る。例２〜４および例９には、通常の試験方法が記載さ
れている。

本発明による蛋白質は、哺乳動物の血液を吸う昆虫類
の吻中に確認することができる。この蛋白質は、通常、
唾液腺の細胞によって合成される。従って、蛋白質は、
吻から単離され得る。本発明による蛋白質は、この製造
方法および単離に限定されるものではない。むしろ、合
成により得られた本発明による全てのトロンビン阻害剤
が一緒に包含されており、この場合このトロンビン阻害
剤は、吻中で検出することができかつこれから単離する
ことができる。

成熟蛋白質のＮ−末端配列更に、本発明は、トロンビン阻害剤でありかつ哺乳動
物の血液を吸う昆虫類の吻、有利にサシガメTriatoma p
allidipennisから単離可能である天然でかまたは合成的
に得ることができる蛋白質を含有し、ａ）この場合蛋白質は、活性蛋白質として次のようなＮ
末端配列：を有するかまたはｂ）この場合蛋白質は、活性蛋白質として先にａ）で記
載されたＮ−末端アミノ酸配列の対立遺伝子の修飾を有
し、この場合Ｎ−末端アミノ酸配列の１つまたは２つの
アミノ酸は、置換されているか、欠失されているか、ま
たは挿入されており、この場合には、活性蛋白質の活性
は、本質的に影響を及ぼされない。

かまたはｃ）この場合蛋白質は、活性蛋白質としてａ）および
ｂ）でのＮ末端配列の翻訳後修飾を有し、この場合に
は、本質的に活性蛋白質は影響を及ぼされない。

成熟蛋白質の配列更に、本発明は、トロンビン阻害剤でありかつｄ）活性成熟蛋白質として次の配列：ｉ）配列アイデンティファイアーNo.1（配列プロトコ
ールNo.1） ii）配列アイデンティファイアーNo.2（配列プロトコ
ールNo.2） iii）配列アイデンティファイアーNo.3（配列プロト
コールNo.3）および iv）配列アイデンティファイアーNo.4（配列プロトコ
ールNo.4）の１つを有するかまたはｅ）活性の成熟蛋白質として先にｄ）で記載されたアミ
ノ酸配列の１つを有し、この場合アミノ酸配列の少なく
とも１つのアミノ酸は、置換されているか、欠失されて
いるか、または挿入されており、この場合活性蛋白質の
活性は、本質的に影響を及ぼされないかまたはｆ）活性の成熟蛋白質としてｄ）およびｅ）での配列の
１つの翻訳後修飾を有し、この場合本質的に活性蛋白質
の活性は影響を及ぼされないような蛋白質を包含する。

30個までのアミノ酸の置換、欠失および／または挿入
を包含する全ての対立遺伝子の修飾は、本発明による蛋
白質の群に属する。好ましいのは、20個までのアミノ酸
の欠失、置換および／または挿入にあり、よりいっそう
好ましいのは、10個までのアミノ酸の欠失、置換および
／または挿入にあり、最も好ましいのは、１、２、３、
４、５、６、７、８または９個のアミノ酸の欠失、置換
および／または挿入にある。

信号配列を有する成熟蛋白質の配列本発明による蛋白質のもう１つの実施態様は、１つの
信号配列および１つの本発明による成熟蛋白質からなる
１つの蛋白質にあり、ｇ）この場合この蛋白質は、次の配列：ｉ）配列アイデンティファイアーNo.5（配列プロトコ
ールNo.5） ii）配列アイデンティファイアーNo.6（配列プロトコ
ールNo.6） iii）配列アイデンティファイアーNo.7（配列プロト
コールNo.7）および iv）配列アイデンティファイアーNo.8（配列プロトコ
ールNo.8）の１つを有するかまたはｈ）この場合この蛋白質は、先にｇ）で記載されたアミ
ノ酸配列の対立遺伝子の修飾を有し、この場合アミノ酸
配列の少なくとも１つのアミノ酸は、置換されている
か、欠失されているか、または挿入されており、この場
合成熟の活性蛋白質の活性は、本質的に影響を及ぼされ
ない、かまたはｉ）この場合のこの蛋白質は、ｇ）およびｈ）での配列
の１つの翻訳後修飾を有し、この場合には、活性の成熟
蛋白質の活性は、本質的に影響を及ぼされないような１
つの蛋白質にある。

32個までのアミノ酸の置換、欠失および／または挿入
を包含する全ての対立遺伝子の修飾は、本発明による蛋
白質の群に属する。好ましいのは、21個までのアミノ酸
の欠失、置換および／または挿入にあり、よりいっそう
好ましいのは、11個までのアミノ酸の欠失、置換および
／または挿入にあり、最も好ましいのは、１、２、３、
４、５、６、７、８または９個のアミノ酸の欠失、置換
および／または挿入にある。

最も好ましいのは、組換え蛋白質である本発明による
蛋白質である。この場合、この蛋白質は、グリコシル化
されていてもよい。

本発明による蛋白質は、“信号配列”および成熟蛋白
質の配列から構成されている成熟蛋白質および相応する
前駆体蛋白質を包含する。この場合、“信号配列”は、
成熟蛋白質の配列から出発する。成熟蛋白質は、前記
ａ）で先に記載されたＮ−末端配列を用いて開始され
る。“信号配列”は、小胞体への浸透に必要とされる。

本発明による蛋白質をコーディングするcDNAまたはDNA 更に、本発明は、成熟トロンビン阻害剤をコーディン
グするcDNAまたはDNAをも包含し、 aa）この場合、cDNAまたはDNAは、次のアミノ酸配列を
コーディングする：ｉ）配列アイデンティファイアーNo.1（配列プロトコ
ールNo.1） ii）配列アイデンティファイアーNo.2（配列プロトコ
ールNo.2） iii）配列アイデンティファイアーNo.3（配列プロト
コールNo.3）および iv）配列アイデンティファイアーNo.4（配列プロトコ
ールNo.4）かまたは bb）この場合cDNAまたはDNAは、aa）でのアミノ酸配列
の１つの対立遺伝子の修飾をコーディングし、この場合アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸
は、置換されているか、欠失されているか、または挿入
されており、この場合には、この活性蛋白質の活性は、
本質的に影響を及ぼされない。

対立遺伝子の修飾は、先の“成熟蛋白質の配列”の項
目に定義されている。

更に、本発明は、トロンビン阻害剤をコーディングす
るcDNAまたはDNAを包含し、 cc）この場合cDNAまたはDNAは、次のヌクレオチド配列
の１つを有する：ｉ）配列アイデンティファイアーNo.9（配列プロトコ
ールNo.9） ii）配列アイデンティファイアーNo.10（配列プロト
コールNo.10） iii）配列アイデンティファイアーNo.11（配列プロト
コールNo.11）および iv）配列アイデンティファイアーNo.12（配列プロト
コールNo.12）かまたは dd）この場合cDNAまたはDNAは、cc）でのヌクレオチド
配列の１つの対立遺伝子の修飾を有し、この場合少なく
とも１つのヌクレオチドは、置換されているか、欠失さ
れているか、または挿入されており、この場合には、c
c）でのヌクレオチド配列の対立遺伝子の修飾によって
コーディングされる蛋白質の活性は、本質的に影響を及
ぼされない。

全てのDNA構成は、同じアミノ酸の縮重されたコード
のためにコーディングするようなヌクレオチドを交換す
る場合にも枚挙された本発明による配列に数えられる。
この種のヌクレオチドの交換は、明らかなことであり、
相応するアミノ酸は、全ての生化学の教科書に開示され
ている。（R.KNIPPERS,1982,第３版、Molekulare Genet
ik,Georg Thieme Verlag）アミノ酸配列の変化を生じる全ての対立遺伝子の修飾
は、この修飾が30個までのアミノ酸の置換、欠失および
／または挿入を包含する限り、本発明に属する。好まし
いのは、20個までのアミノ酸の欠失、置換および／また
は挿入であり、よりいっそう好ましいのは、10個までの
アミノ酸の欠失、置換および／または挿入であり、最も
好ましいのは、１、２、３、４、５、６、７、８または
９個のアミノ酸の欠失、置換および／または挿入であ
る。

更に、本発明は、成熟蛋白質をコーディングする配列
とともに同様に信号配列をも含有する遺伝物質をも包含
する。この信号配列は、cDNAバンク中に見い出されたも
のであり、また、蛋白質の発現および分泌を可能にする
別の信号配列も考えられる。

従って、本発明は、信号配列を有するトロンビン阻害
剤をコーディングするcDNAまたはDNAを包含し、 ee）この場合cDNAまたはDNAは、次のヌクレオチド配
列：ｉ）配列アイデンティファイアーNo.13（配列プロト
コールNo.13） ii）配列アイデンティファイアーNo.14（配列プロト
コールNo.14） iii）配列アイデンティファイアーNo.15（配列プロト
コールNo.15）および iv）配列アイデンティファイアーNo.16（配列プロト
コールNo.16）を有するかまたは ff）この場合cDNAまたはDNAは、ee）でのヌクレオチド
配列の１つの対立遺伝子の修飾を有し、この場合少なく
とも１つのヌクレオチドは、置換されているか、欠失さ
れているか、または挿入されており、この場合には、成
熟蛋白質の信号配列を含めてee）でのヌクレオチド配列
の対立遺伝子の修飾によってコーディングされる成熟蛋
白質の活性は、本質的に影響を及ぼされない。

対立遺伝子の修飾は、先にdd）に定義されている。

対立遺伝子の修飾が本発明による蛋白質の群に数えら
れるか否かを確認するために、蛋白質の活性を記載する
場合には、信号配列が同様に記載される場合であっても
常に成熟蛋白質を測定することができる。信号配列が記
載される場合には、信号配列の除去後に得られる蛋白質
についての機能を常に測定することができる。

更に、本発明は、本発明の成熟蛋白質上のドメインが
認められる結合分子（例えば、ペプチドまたはその誘導
体）、一本鎖蛋白質、抗体または抗体の断片を包含す
る。精製された本発明による蛋白質が存在する場合に
は、当業者にとってモノクローナル抗体を得ることは、
容易に可能である。この場合には、ケーラー（Koehle
r）およびミルシュタイン（Milstein）の公知方法およ
びその後の継続法が使用される。この場合、詳細には、
常法で１匹のマウスは、精製された蛋白質で数回免疫化
され、脾臓細胞が取り出され、かつ適当な腫瘍細胞と融
合される。引続き、ハイブリッドは選択される。

本発明の蛋白質は、サシガメTriatoma pallidipennis
の唾液から単離することができる。精製は、ゲル濾過お
よびトロンビン−セファロースを用いての引き続くアフ
ィニティークロマトグラフィー処理によって行なわれる
（例１参照）。この蛋白質は、先に記載されたアミノ酸
配列を有する。この蛋白質は、約18000±3000Daの分子
量を有する（例６参照）。等電点は、例８に記載の方法
を使用する場合には、pH4.5〜5.2の範囲内にある。

本発明の蛋白質は、血液凝固の場合および血小板の活
性化の場合ならびにアミド分解においてトロンビンの効
果を抑制する。これらの試験系は、例２、３、４および
９に記載されている。蛋白質は、1.27ナノモル/lのトロ
ンビン濃度の際に８ナノモル/lの濃度で凝固を抑制す
る。この蛋白質は、15ng/mlの濃度でトロンビン誘発さ
れた血小板凝集を100％抑制する。この濃度は、0.06IU/
ml＝0.812ピコモル/ml（IU＝国際単位）の使用されるト
ロンビン濃度の際にトロンビン対本発明による蛋白質の
モル比薬1:1に相当する。これとは異なり、本発明の蛋
白質は、アミド分解試験においてトロンビン対本発明に
よる蛋白質の比1:87の際にトロンビンの活性を約50％だ
け抑制する。本発明の蛋白質は、35ナノモル/lの濃度で
トロンビン時間（1IU/ml）を５倍だけ延長する。

本発明の蛋白質は、トロンビンに対して特異性を有す
る。別のセリンプロテアーゼ（例えば、因子X aまたは
トリプシン）は、40倍の過剰量の場合であっても検出に
より抑制されない（例７参照）。

本発明によるDNAを有するベクター本発明の他の部分は、本発明によるcDNAまたはDNA、
さらに適当なプロモーターおよび場合によっては適当な
エンハンサーを含有するベクターである。同様に、なお
“信号配列”を包含することもできる。ベクターは、欧
州特許第0480651号明細書、欧州特許第0462632号明細書
および欧州特許第0173177号明細書に詳細に記載されて
いる。

本発明のもう１つの実施態様は、本発明によるベクタ
ーで形質転換されている真核または原核宿主細胞にあ
る。

対立遺伝子の修飾多くの場合の欠失、挿入および置換は、本発明の蛋白
質の特性において徹底した変化を結果として生じないよ
うに思われる。置換、欠失または挿入の正確な効果を予
め記載することは困難であるので、変化された蛋白質の
機能は、本発明による蛋白質の機能と比較されなければ
ならない。このために使用すべき方法は、例示的に例２
〜４および９に記載されている。標準として、Seq.Id.N
o.1〜４に記載された蛋白質が使用され、同様に例１に
より精製される蛋白質も使用され、ならびに比較蛋白質
のために例１の精製法が使用される。

遺伝コードは、縮重されており、このことは、多くの
場合のアミノ酸が３個のヌクレオチドからなる１つ以上
のコドンによってコーディングされていることを意味す
る。従って、ヌクレオチドの平面上での若干の対立遺伝
子の修飾は、アミノ酸配列の変化を生じない。従って、
対立遺伝子の修飾は、主にDNAの平面上で生じ、かつア
ミノ酸配列に二次的に影響を及ぼしうる。

本発明による蛋白質をコーディングするcDNA−または
DNA配列は、本発明の記載されかつ特性を有する蛋白質
と同じ活性を本質的に有する本発明による蛋白質の変形
を得るために、常用の技術により修飾させることができ
る。この場合、活性は、例２〜４および９の記載と同様
に測定される。

アミノ酸は、第１表に表わされたように置換されてい
てもよく、しかし、この場合には、蛋白質の機能は、本
質的に影響を及ぼされることがない。全ての個々の場合
には、蛋白質の機能に対する変化に、如何なる影響が及
ぼされるのかについては、活性度試験によって決定する
ことができる。

置換の際に第１表に示したアミノ酸よりもあまり保守
的でない置換基を選択する場合には、機能または免疫学
的同一性は、本質的に変化される。この種の本質的な変
化は、多くの場合に構造および官能基の点で区別される
アミノ酸で置換することによって達成することができ
る。本質的な変化により、三次元的構造を変化させるこ
とおよび／または例えば折り畳まれた本のような構造ま
たは螺旋構造に影響を及ぼすことが生じる。また、負荷
の相互作用および疎水性鎖は、変化の際に注目すること
ができる。

突然変異は、比較のために問題となっている２つの蛋
白質の相同性によって定義することができる。相同性の
発現は、アミノ酸の配列において類縁のアミノ酸（例え
ば、第１表）および脱落個所を包含する。本発明による
蛋白質は、本発明による構造少なくとも80％、有利に90
％、よりいっそう有利に95％、最も有利に98％の相同性
を有するアミノ酸配列を有しており、例えばこの構造
は、ｄ）またはｇ）の配列（Seq.1d No.1〜８）によっ
て定義されており、かつさらに精製後に例１の記載によ
り得ることができる。

前記の述べたように、本発明は、DNAまたはcDNAの改
質をも包含する。この改質された配列は、本発明による
蛋白質をコーディングするDNA配列を用いて苛酷な条件
下でハイブリッド化される（aa）;cc）およびee）に記
載の配列参照）。cDNA−またはDNA配列は、ヌクレオチ
ド配列を有し、このヌクレオチド配列は、少なくとも70
％、有利に82％、よりいっそう有利に90％、最も有利に
95％の短い（15個までのヌクレオチド）欠失および挿入
を含めて本発明によるcDNA−またはDNA配列との同一性
を有している（aa）、cc）およびee）参照）。短い（15
個までのヌクレオチド）欠失および挿入を含む同一性
は、例えばクニッパーズ（R.KNIPPERS）、モレクラーレ
・ゲネティーク（Molekulare Genetik）、1982、第３
版、Georg Thieme Verlag社（Stuttgart,New York）刊
に記載されているようにハイブリッド化によって測定す
ることができる。

翻訳後修飾先に述べた翻訳後修飾とは、翻訳中または翻訳後に生
じる変化のことである。これには、グリコシル化、ジス
ルフィド橋の形成、アミノ酸の化学的変性、例えばヒル
ジンと関連して記載されている硫酸化が挙げられる。
（J.W.FENTON（1989）“Thrombin Interaction with Hi
rudin",Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15:26
5−268）グリコシル化は、内質細網および／またはゴルジ体の
１つの本質的な機能である。オリゴ糖の配列および分枝
は、内質細網中に形成され、かつゴルジ体中で変化され
る。オリゴ糖は、Ｎ−結合したオリゴ糖（アスパラギン
結合した）またはＯ−結合したオリゴ糖（セリン−、ト
レオニン−またはヒドロキシリシン結合した）であるこ
とができる。グリコシル化の形は、生産する細胞型およ
び種類に依存し、この場合相応する細胞型は、この種類
に由来する。グリコシル化の程度および種類は、欧州特
許第0222313号明細書に記載されているような物質によ
って影響を及ぼされることができる。グリコシル化の変
動により、蛋白質の機能を変化させることができる。

蛋白質は、しばしば共有結合を鎖内に形成する。この
ジスルフィド橋は、２つのシステイン間に得られる。こ
の場合、蛋白質は特異的に倍加される。ジスルフィド橋
は、蛋白質の三次元構造を安定する。

更に、アミノ酸は、国際公開番号WO91/10684に記載さ
れているように変化させることができる。同様に、蛋白
質は硫酸化されていてもよい。この変化は、ヒルジンと
関連して記載されている。

本発明による蛋白質の単離および製造更に、本発明は、次の工程を有する本発明による蛋白
質の製造法を包含する：本発明によるcDNAまたはDNAを含有する、ベクトルで形
質転換されている宿主細胞の培養、ならびに蛋白質の単
離および精製。

蛋白質は、有利に例１の記載により精製される。しか
し、別の単離方法および精製方法も可能である：メソッズ・オブ・エンザイモロジー（Methods of Enzym
ology）、第182巻：ガイド・トゥ・プロテイン・ピュー
リフィケーション（Guide to Protein Purificatio
n）、ドイチャー（Murray P.DEUTSCHER）編、アカデミ
ック・プレス（Academic Press）社刊、1990; プロテイン・ピューリフィケーション・アプリケーショ
ン（Protein Purification Application）、ア・プラク
ティカル・アプローチ（A Practical Approach）、ハリ
ス（E.L.V.HARRIS）およびエンジェル（S.ANGEL）、ア
イアールエル−プレス（IRL−Press）社刊1990; プロテイン・ピューリフィケーション、プリンスプルス
・アンド・プラクティス（Protein Purification,Princ
iples and Practice）、スコープス（Ropert SCOPE
S）、スプリンガー（Springer−Verlag）社刊1982;およ
びプロテイン・ピューリフィケーション、プリンスプル
ス、ハイ・レゾルーション・メソッズ・アンド・アプリ
ケーションズ（Protein Purification,Principles,High
Resolution Methods and Applications）、ジャンソン
（H.−C.JANSON）およびライデン（L.RYDEN）編、ブイ
・シー・エイッチ（VCH）社刊1989。

本発明は、同様に本発明による蛋白質を精製するため
の方法を包含し、この場合蛋白質は、単離され、少なく
とも１つのカラムを介して精製され、かつ引続き濃縮さ
れる。好ましいのは、クロマトグラフィーカラムまたは
吸着クロマトグラフィーカラムである。

更に、本発明は、本発明による蛋白質を精製する方法
を包含し、この場合この方法は、次の工程からなる： “スペロース（SUPEROSE）12HR−カラム”上への唾液の
塗布および溶離ならびに先にトロンビンがカップリングされたCH活性化されたセ
ファロース（Sepharose）−カラム上への再度の塗布お
よび溶離。

この精製については、例１に詳細に記載されている。

医薬品としての使用本発明による蛋白質は、薬理効果を有し、かつしたが
って製薬学的作用物質として使用可能である。本発明
は、同様に本発明による蛋白質の１つまたはその混合物
を含有する医薬品を包含する。更に、本発明には、製薬
学的に認容性で受容可能な化合物および担持剤の存在下
で、本発明による蛋白質の１つまたは本発明による蛋白
質の混合物を含有する製薬学的組成物が属する。同様
に、本発明は、製薬学的に活性の本発明による蛋白質の
１つまたはその混合物および製薬学的に認容性の塩また
は製薬学的に認容性の担持剤を包含する製薬学的組成物
を包含する。

殊に、本発明による蛋白質は、配列実験記録No.1〜４
によれば、トロンビン活性の阻害を示す。

トロンビン活性の阻害は、凝固試験（例２参照）、血
小板凝集試験（例３参照）、アミノ分解試験（amidolyt
ischer Test）（例４参照）およびトロンビン時間の測
定（例９参照）によって検出することができる。トロン
ビン時間の測定は、好ましい試験系である。

本発明による蛋白質は、トロンビン時間の延長を10〜
60ナノモル/lの濃度で示す（トロンビン濃度1IU/ml）。
58ナノモル/lの濃度で、９倍の延長が生じる。よりいっ
そう高い濃度は、試験系を損なうことなしに使用するこ
とができる。従って、本発明による蛋白質は、10〜200
ナノモル/lの濃度で使用可能である。

この試験管内試験の試験結果は、本発明による蛋白質
が医薬品として使用されることができるかまたは医学的
処置に使用されることができることを示す。この試験結
果は、試験管内試験系から生体内系へ転用することがで
きる。それというのも、凝固試験の場合には、確立され
た試験装置が重要であるからである（M.TALBOT（1989）
“Biology of Recombinant Hirudin,A New Prospect in
the Treatment of Thrombosis"Sminars in Thrombosis
and Hemostasis 15:293−301）。従って、本発明の蛋
白質は、血栓症、不安定なアンギナまたは動脈硬化症の
治療および予防、またはPTCA/PTA（バルーンカテーテル
を用いての血管形成術）による血管の再閉塞の予防また
は血液透析の際の血液凝固の阻止に使用することができ
る。本発明の蛋白質は、哺乳動物、殊にヒトの場合に血
栓症および／または動脈硬化症の後遺症の治療のために
抗血栓症薬および／または抗動脈硬化症薬として使用す
ることができる。このことは、動脈硬化症の凝集による
激痛（斑）、内皮細胞組織の破壊、例えば敗血症、移植
または不安定なアンギナの際に起こりうる。本発明によ
る蛋白質は、心筋梗塞の治療後および／または繊維素溶
解または血管形成術の際の再度の閉塞を阻止するため
に、同様に使用することができる。この場合、本発明に
よる蛋白質は、カテーテルの導入前、導入時および／ま
たは導入後に投与することができる。

更に、本発明は、（ｉ）血栓症、不安定なアンギナまたは動脈硬化症を治
療するか、PTCA/PTA後の血管の再閉塞を予防するか、ま
たは血液透析の際に血管凝固を阻止するための薬剤の製
造への本発明による蛋白質またはその混合物の使用；（ii）本発明による蛋白質量の投与を包含し、この場合
この量は、疾患を緩和させ、かつこの蛋白質量は、かか
る薬物を必要とする患者に与えられる、血栓症、不安定
なアンギナまたは動脈硬化症を治療するか、PTCA/PTA後
もしくは血栓崩壊後の血管の再閉塞を予防するか、また
は血液透析の際に血管凝固を阻止する方法；（iii）本発明による蛋白質の１つまたはその混合物お
よび少なくとも１つの製薬学的に認容性の担持剤および
添加剤を治療の際に包含する、血栓症、不安定なアンギ
ナまたは動脈硬化症を治療するか、PTCA/PTA後もしくは
血栓崩壊後の血管の再閉塞を予防するか、または血液透
析の後に血液凝固を阻止するための製薬学的組成物を供給する。

この治療の効果のためには、種々の投与量が適当であ
る。投与量は、例えば使用される蛋白質、宿主、投与の
種類ならびに治療すべき状態の種類および重さに依存す
る。

しかし、一般に日用量が体重1kg当たり２μｇ〜2000
μｇの範囲を包含する場合には、動物において満足な結
果を予想することができる。大型の哺乳動物、例えばヒ
トにおいて、例１により精製された蛋白質を使用する場
合には、望ましい日用量は、体重1kg当たり２〜2000μ
ｇの範囲内にある。例えば、この投与量は、有利に４回
までの部分的投与量で毎日投与される。急性の血栓症を
短時間で治療する場合の日用量は、体重1kg当たり20〜2
000μｇであり、体重1kg当たり２〜200μｇでの慢性的
治療の際の投与量の場合よりも高い結果となる。同様
に、本発明の蛋白質を皮下投与する場合には、満足な結
果を予想することができる。好ましくは、血栓が形成さ
れた身体の部分に意図的に注射される。

本発明による蛋白質は、全ての常法で、殊に注射溶液
または懸濁液の形で投与することができる。

本発明は、本発明による蛋白質の１つまたはその混合
物および少なくとも１つの製薬学的に認容性の担持剤ま
たは添加剤を包含する製薬学的組成物を提供する。この
ような組成物は、公知方法により得ることができる。こ
の場合には、レミントンズ・ファーマシューティカル・
サイエンス（Remington's Pharmaceutical Science）15
thマック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publish
ing Company）、イーストペンシルバニア（East Pennsy
lvania）（1980）が指摘される。

試験結果は、図面に明示されており、詳細には、次の
ことを示す：図1:サシガメTriatoma pallidipennisからの本発明によ
る蛋白質を添加した際のトロンビン時間の延長。

図2:アミド分解試験におけるトロンビン活性の阻害（ト
リアトマ（Triatoma）＝サシガメTriatoma pallidipenn
isからのトロンビン阻害剤）図3:凝固試験におけるトロンビン活性の阻害実施例例１サシガメTriatoma pallidipennisからの唾液の取得およ
び本発明による蛋白質の精製唾液を分泌させるためにサシガメの吻に機械的刺激を
与える。この唾液をガラス板上に捕捉し、かつシリコー
ン処理された引き出されたパスツールピペットを用いて
捕集する。

この唾液を凍結乾燥し、かつ2.5mg/mlの濃度で蒸留水
中に溶解する。この溶液2mlを“Superose 12 HR 16/50"
カラム（Pharmacial）上でトリス/HCl 10ミリモル/l、
pH7.4、“Pluronic F68"中で濾過する。凝固試験（例２
参照）で活性の画分を合わせ、かつ製造業者の記載によ
れば先にトロンビンをカップリングさせたCH活性された
セファロース（Pharmacia）上に塗布する。本発明の蛋
白質は、トロンビンを備えた前記カラムに結合する。ま
ず、このカラムをタイロード緩衝液（血漿アルブミンな
し）で洗浄し、次に初めてNa酢酸塩10ミリモル/l、pH4.
5と一緒に溶離し、次いでグリセリン10ミリモル/l、pH
2.5と一緒に溶離する。溶離液のpHを７に調節する。グ
リシン溶離液10ミリモル/lは、本発明の精製された蛋白
質を含有する。この溶離液は、凝固試験（例２参照）、
血小板凝集試験（例３参照）、アミド分解試験（例４参
照）において活性であり、かつトロンビン時間（例９参
照）を延長する。調製液は、SDSゲル電気泳動で検出可
能な不純物を含有していない。

例２凝固試験におけるトロンビン活性の阻害ウシ血清アルブミンで被覆されている（NaHCO₃0.1モ
ル/l中0.1％、pH9.5）微量滴定板中にHEPES 80μｌ 2
0ミリモル/l、pH7.4;NaCl 0.15ミリモル/l;CaCl₂20μ
ｌ 20ミリモル；本発明の蛋白質の希釈した溶液100μ
ｌ（５〜50ng）およびトロンビン20μｌ（0.03 IU＝0.
03国際単位）をピペットで注入する。37℃で２分間の恒
温保持後、フィブリノーゲン100μｌ（5mg/ml）を添加
し、かつ37℃で40分間恒温保持する。引続き、吸収を40
5nmで測定する。本発明の精製された蛋白質45ng（＝８
ナノモル/l）は、フィブリノーゲン分解を完全に阻害す
る。同じ試験条件下で、ヒルジンは、同じ作用を示す
（８ナノモル/lでの完全な阻害）。（図３参照）例３血小板凝集試験におけるトロンビン活性の阻害濾過された血小板500μｌ（300000/ml）を本発明の蛋
白質（５〜100ng/ml）と一緒に37℃で１分間恒温保持す
る。次に、凝集をトロンビン（0.06IU/ml）で誘発さ
せ、凝集を凝集測定器（Aggregometer）中で記録する。
本発明の精製された蛋白質を用いての測定は、15ng/ml
の濃度で凝集を100％阻害することを示す。

例４アミド分解試験におけるトロンビン活性の阻害微量滴定板中でトリス/HCl 80μｌ 100ミリモル/
l、pH7.4;NaCl 150ミリモル/lおよびトロンビン0.03IU
（1.35ナノモル/l）ならびに本発明の蛋白質の希釈した
溶液100μｌ（32〜630ng）を37℃で10分間恒温保持し、
次いで基質S2238（Kabi Vitrum）100μｌ（50ナノモ
ル）を添加する。37℃で30分間の恒温保持後、吸収を40
5nmで測定する。630ng（117ナノモル/l）は、トロンビ
ン活性をほぼ50％に阻害する。ヒルジンは、６ナノモル
/lの濃度でトロンビンの活性を85％に阻害する。（例２
参照）例５Ｎ−末端アミノ酸配列の測定本発明の精製された蛋白質を自動アミノ酸シークエネ
ーター（Applied Biosystems,Inc.）中で製造業者の使
用説明書に従い配列決定した。アミノ酸１〜21の配列
（Ｎ末端から）は次の通りである:Ala−Glu−Gly−Asp
−Asp−Cys−Ser−Leu−Glu−Lys−Ala−Met−Gly−Asp
−Phe−？−Pro−Glu−Glu−Phe−Phe。“?"は、完全な
確実さをもって同定することができないものを表わす。
このアミノ酸は、恐らくリシンである。

例６ SDS−電気泳動および分子量の測定本発明の蛋白質を還元状態（ジチオトレイトを用いて
の還元）および非還元状態で分子量標識（Pharmacia社
の電気泳動較正キット）ホスポリラーゼｂ（94kDa）、
アルブミン（67kDa）、卵アルブミン（43kDa）、カルボ
ニックアンヒドラーゼ（30kDa）、トリプシン阻害剤（2
0.1kDa）およびラクトアルブミン（14.4kDa）と一緒に1
2.5％のSDSポリアクリルアミドゲル上に塗布し、かつラ
エッムリ（Laemmli）（1970、Nature 227,680−685）に
よる電気泳動後にクーマシーブリリアントブルーで着色
した。還元状態の場合には、本発明の蛋白質は、電気泳
動の間に僅かにのみトリプシン阻害剤の上方で移動す
る。これは、約21000Daの分子量に相当する。非還元状
態の場合には、本発明の蛋白質は、トリプシン阻害剤と
ラクトアルブミンとの間で移動し、このことは、約1800
0Daの分子量に相当する。

例７本発明の蛋白質は、セリンプロテアーゼ因子X aおよび
トリプシンを阻害しない。

因子X aおよびトリプシンの活性を次の試験で測定す
る。トリス/HCl 80μｌ 50ミリモル/l、pH8.0、NaCl
227ミリモル/lに、因子X a測定のために因子X a0.004
IU（0.653ピコモル）（American Diagnostica）および
本発明の蛋白質0.5μｇ（28ピコモル）を添加し、かつ
トリプシン測定のためにトリプシン（σ）0.004IU（0.0
19ピコモル）および本発明の蛋白質0.016μｇ（0.817ピ
コモル）を添加し、37℃で２分間恒温保持する。基質S2
222（Kabi Vitrum）0.05マイクロモルの添加後、37℃で
20分間恒温保持し、引続き吸収を405nmで測定する。こ
の配合物の吸収は、本発明の蛋白質なしの配合物とまさ
に同様の高さであり、即ち蛋白質は、因子X aの活性を
阻害しないし、トリプシンの活性も阻害しない。

例８等電点電気泳動本発明の蛋白質を等電点電気泳動のためのゲル上にpH
3〜９の範囲内（Pharmacia）で塗布し、かつ標準蛋白質
（Pharmaciaの較正キットpH3〜10）と一緒に焦点的に濃
縮されて分離される。本発明の蛋白質の焦点位置は、ダ
イズトリプシン阻害剤の焦点位置（I.P.＝4.55）とβ−
ラクトグロブリンＡの焦点位置（I.P.＝5.2）との間に
あった。

例９トロンビン時間の延長トロンビン時間により、外因性トロンビンの活性を測
定し、この外因性トロンビンを試験血漿に添加する。血
漿0.1mlに本発明の蛋白質の溶液50μｌを種々に希釈
（６〜58ナノモル/l）して添加し、かつpH7.6を有する
バルビツール酸ジエチル−酢酸塩緩衝液50μｌを添加
し、かつ37℃で１分間恒温保持する。トロンビン溶液0.
1ml（3IU/ml）の添加後、凝固が発生するまでの時間を
測定する（SarstedtのBiomatic 2000 Coagulometer）。
35ナノモル/lの濃度で存在する本発明の蛋白質は、対照
の配合物と比較して凝固時間を５倍延長する（図１参
照）。

例10 Lys Ｃでの分解による内部アミノ酸配列の測定本発明の精製された蛋白質（59μｇ）を２−メルカプ
トエタノール10％で還元し（N₂雰囲気下で室温で２時
間）、かつ次いで４−ビニルピリジンと反応させる（N₂
雰囲気下で室温で２時間）。トリス/HCl 25ミリモル/
l、pH8.5;EDTA １ミリモル/lに対する透析後、試料にL
ys Ｃ１μｇ（Boehringer Mannheim）を添加し、か
つ37℃で６時間恒温保持する。この分解配合物をスーパ
ースペル（Supersper）RP−18,4μｍ（250×4mm、MZ−A
nalysen−thchnik,Mainz）カラム上に塗布し、かつH₂O
中のTFA 0.1％〜アセトニトリル70％中のTFA0.08％の
勾配で溶離する（WatersのHPLC装置）。280nmおよび214
nmでの吸収を記録し、溶離液を分画する。吸収ピークに
相当する画分を乾燥し、かつH₂O 30μｌ中に入れる。
個々の画分を自動アミノ酸シークエネーター（Applied
Biosystems,Inc.）中で製造業者の使用説明書に従い配
列決定する。この場合には、次の配列が明らかになる
（それぞれＮ末端からの出発、“?"は、明らかに同定さ
れないものを表わす）：例11 本発明によるcDNAsの分子クローン化本発明による蛋白質のＮ末端の配列が公知である場合
には、相応するヌクレオチド配列を測定することができ
る。（国際公開番号WO90/07861参照） aa）PCRの場合の特異的試料の製造本発明によるcDNAを測定するために、先にエドマン分
解で測定されたアミノ酸配列によって導出されるプライ
マー（オリジナル、出発片）をまず合成させる。PCR
（ポリメラーゼ連鎖反応）で本発明によるcDNAの断片を
増幅させるために、プライマーの合成されたオリゴヌク
レオチド配列を利用する。（米国特許第4800159号明細
書参照）２つのオリゴヌクレオチド−プライマーを、完全な本
発明による蛋白質のＮ末端範囲およびその断片の先に部
分的に測定されたアミノ酸配列からヌクレオチド配列を
誘導することにより製造する。この場合には、次のアミ
ノ酸配列を使用する：完全な蛋白質のＮ末端配列：および断片のＮ末端配列：マトリックス（鋳型）は、先にサシガメTriatoma pal
lidipennisの唾液腺から単離されているポリ−A⁺−RNA
に由来するcDNAからなる。（SAMBROCK他:Molekular Clo
ning（Chapter 7,第18〜22頁）,Cold Spring Harbor La
boratory Press,1989）マトリックス−出発片（センス
プライマー（Sense primer））：非マトリックス−出発片（アンチセンスプライマー（An
tisense primer））：Ａ＝デスオキシアデノシン;C＝デスオキシシチジン;G＝
デスオキシグアノシン;T＝デスオキシチミジンおよびＩ
＝デスオキシイノシン PCRは、40の作業周期から構成されている。１つの作
業周期は、次のものからなる：ａ）94℃で２分間の変性ｂ）52℃で90秒間のハイブリッド化およびｃ）72℃で２分間の延長。

先に記載された方法によって得られたPCR増殖生産物
は、アガロースゲル上で１つのバンドを有する。このバ
ンドは、低い融点を有するアガロースゲルによって分離
され、直接にPCRプラスミド（Stratagene）中に移さ
れ、かつサブクローン化される。この方法は、製造業者
の実験記録からの記載に相当する（StratageneのpCR−S
cript^TMSK（＋）クローン化キット）。挿入生産物のDNA
配列は、PCR生産物の配列に相当し、かつサンジャー（S
ANGER）他、Proc Natl Acad Sci USA（1977）74:5463−
5467の記載と同様に測定される。

bb）cDNA−バンクの選択方法および本発明によるcDNA−
クローンの単離サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺−cDNA−バ
ンクからの約400000個の一次クローン（cDNAライブラリ
ー）を、製造業者の使用説明書の記載のようにナイロン
膜（Pall Biosupport East Hills,NY,USA）上に移し、
かつスクリーニングする。この場合には、先に記載され
たPCR増殖法により得られた標識化された試料を使用す
る。選択方法を２回実施し、プラスミド−DNAへのファ
ージ−DNAの変換およびこのプラスミドの挿入断片（導
入されたDNA）の配列分析を行なう。それによって、配
列中でアイデンティファイアー13〜16を形成している４
個のcDNA配列を測定し、この場合には、専らアミノ酸−
17〜−９の三重項（Triplika）をTi28およびTi45で欠
き、かつアミノ酸−18の三重項をTi12で欠いている。

単離されたDNAのそれぞれ２本の鎖を配列決定する。
コーディングするDNAによって導出されたアミノ酸配列
は、先にエドマン分解により本発明による精製された蛋
白質から見い出されたアミノ酸配列と完全に一致する。

最も長いcDNAクローン（Ti12）は、メチオニンのため
の不完全な出発コドンに相当するヌクレオチドTGを用い
て開始する。このことは、他の単離されたクローン（Ti
5）を考慮する場合に明らかとなり、このクローンは、T
i12、Ti28およびTi45の選択の際に使用されたのと同じc
DNAバンクの600000個のファージを用いての選択方法の
場合に見い出された。

本発明による蛋白質の４つのcDNA配列を先に記載した
方法により選択し、同定し、かつ配列決定する。専ら９
個の位置が導出されたアミノ酸配列の区別を有する。こ
の区別は、第２表に記載されている。

４個の本発明による円熟蛋白質の同定および類似性
は、如何なる比較成分が選択されるかに応じて約95また
は98％である。

例12 本発明による蛋白質をコーディングするプラスミドの製
造ならびに大腸菌中で得られる蛋白質の発現および精製 DNA配列が公知である場合には、適当なプロモーター
および場合によっては適当なエンハンサーは、それぞれ
のDNA配列と結合することができ、したがってさらに使
用可能なベクターが存在する。（M.WIRTH,L.SCHUMACHER
およびH.HAUSER著、H.S.CONRADT編Protein Glycosylati
on,Cellular Biotechnical and AAnalytical Aspects第
15巻、49−52,VCH社（Weinheim在）刊、1991）；同様に
J.KRAETZSCHMAR他（1992）Gene 116:281−284。このよ
うなベクターの発現は、真核生物（例えば、幼児のハム
スターの腎臓細胞）の場合に可能である。更に、適当な
原核ベクター中のDNA配列は、大腸菌の菌株において発
現するために導入することができる。

ａ）プラスミドの製造（ｉ）予備計画原核生物において本発明による組換え蛋白質を発現さ
せるための構成を、IPTG誘発可能なtrcプロモーターを
含有する商業的に入手可能なプラスミドpKK233−２を使
用することにより得る。発現に適当なベクターは、この
プラスミドpKK233−２を包含し、この場合には、本発明
による蛋白質のコーディング配列ならびに信号配列が挿
入されている。信号配列は、分泌された大腸菌の蛋白質
シクロフィリンａに帰因する修飾された信号配列であ
る。信号配列およびコーディングDNAは、下流に向かっ
てプロモーターによって使用され、それによってpKK/cp
hが生じる（T.HAYANO（1991）Biochemistry 30:3041−3
048）。

本発明による蛋白質のコーディング配列は、発現プラ
スミド中に挿入され、こうして得られた構成体（pKK/cp
h蛋白質）は、能力細胞の大腸菌JM105細胞の形質転換に
利用される。

（ii）プラスミドpKK/cphの構成次の１対の部分的に重なりかつ相補的オリゴデスオキ
シヌクレオチドは、シクロフィリンａの信号配列のため
のコーディングDNAを後形成させるために使用される。
この場合、シクロフィリン配列の相応するＣ末端は、細
菌性信号ペプチダーゼに最適な分解位置を形成するため
に修飾される。この修飾は、Ｃ末端の最後の７個のトリ
プレット（Triplika）を次のアミノ酸配列をコーディン
グするトリプレット（Triplika）と交換することにあ
る:Phe−Ser−Ala−Ser−Ala−Leu−Ala（R.E.DALBEYお
よびG.von HEIJNE（1992）TIBS 17:474−478）。

センスを有するオリゴヌクレオチド配列：（センスオリ
ゴ）センスを有しないオリゴヌクレオチド配列：（アンチセ
ンスオリゴ）出発配列の付着およびTaqポリメラーゼの使用下での
姉妹部分の引き続く完全化の後、DNA断片は、Af/IIIお
よびHind IIIで切断される。切断位置は、下線が引かれ
ている。その後に、DNAは、プラスミドpKK233−２のNco
l位置とHind III位置との間でサブクローニングされ
る。Hind III位置と一緒にcDNA部分の他のサブクローニ
ングを簡易化するNhel位置は、脂肪圧力（Fettdruck）
によって認められる。

（ii）本発明による蛋白質を用いてのプラスミドの構成本発明による成熟蛋白質（Ti28＝Seq.Id.No.2）のた
めにコーディング配列を増殖させるために、次の１対の
出発配列（プライマー）を使用する。この場合には、下
線が引かれているNhelおよびHind III切断位置は、プラ
スミドpKK/cph中への挿入に必要とされる。

センスを有するオリゴヌクレオチド配列：（センスオリ
ゴ）センスを有しないオリゴヌクレオチド配列：（アンチセ
ンスオリゴ） 94℃で２分間、30℃で２分間および72℃で2.5分間か
らなる10回の作業周期をPCR（ポリメラーゼ鎖反応）の
ために実施し、この場合には、マトリックス鎖２μｇ
（鋳型）が使用される。増殖されたDNAを低融点アガロ
ースゲル上に単離し、NhelおよびHind IIIで切断され、
かつ先に同じ制限エンドヌクレアーゼで切断されたプラ
スミドpKK/cph中に移す。こうして得られた構成体をコ
ーディングDNAの全配列化およびコーディングDNAをフラ
ンキングするDNAを用いて試験する。

（iii）大腸菌の形質転換大腸菌JM105細胞をCaCl₂法を使用しながら形質転換す
る。この場合には、本発明による蛋白質をコーディング
するpKK/cph １μｇを使用する。

ｂ）大腸菌を用いて得られた本発明による蛋白質の精製
および特性決定形質転換された大腸菌細胞の培養基にIPTG（１ミリモ
ル/l）を添加し、かつ37℃で６時間恒温保持する。（IP
TG＝イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）この細
胞を遠心分離し、かつ浸透圧ショック（サッカロース処
理および引き続くH₂O処理）を受けさせる。こうして得
られたペリプラズマ画分は、凝固試験（比較例２）にお
いてトロンビンの活性を阻害する。阻害活性をDE−52セ
ルロースを用いてのイオン交換クロマトグラフィーおよ
びトロンビンアフィニティークロマトグラフィーによっ
て精製する。

（比較例１）精製された画分は、唾液蛋白質と同じ阻害活性を有す
る。この画分は、SDSポリアクリルアミド電気泳動法の
場合と同一の挙動を示す（比較例６）。更に、この画分
は、Ｎ末端アミノ酸配列において成熟唾液蛋白質と一致
する。

50811AWOM1XX00＋Ｐ 1993年11月25日 SEQ ID NO:1 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:142個のアミノ酸分子の種類：成熟蛋白質Ti12 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:2 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:142個のアミノ酸分子の種類：成熟蛋白質Ti28 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:3 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:142個のアミノ酸分子の種類：成熟蛋白質Ti45 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:4 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:142個のアミノ酸分子の種類：成熟蛋白質Ti5 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:5 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:160個のアミノ酸分子の種類：信号配列Ti12を有する成熟蛋白質出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:6 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:160個のアミノ酸分子の種類：信号配列Ti28を有する成熟蛋白質出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:7 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:160個のアミノ酸分子の種類：信号配列Ti45を有する成熟蛋白質出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:8 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:160個のアミノ酸分子の種類：信号配列Ti5を有する成熟蛋白質出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:9 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:429個のヌクレオチド分子の種類：成熟蛋白質をコーディングするcDNA Ti12 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：コーディングするcDNA SEQ ID NO:10 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:429個のヌクレオチド分子の種類：成熟蛋白質をコーディングするcDNA Ti28 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：コーディングするcDNA SEQ ID NO:11 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:429個のヌクレオチド分子の種類：成熟蛋白質をコーディングするcDNA Ti45 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：コーディングするcDNA SEQ ID NO:12 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:429個のヌクレオチド分子の種類：成熟蛋白質をコーディングするcDNA Ti5 出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：コーディングするcDNA SEQ ID NO:13 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:483個のヌクレオチド分子の種類：信号配列をコーディングするcDNA Ti12を
有する成熟蛋白質出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：コーディングするcDNA SEQ ID NO:14 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:483個のヌクレオチド分子の種類：信号配列をコーディングするcDNA Ti28を
有する成熟蛋白質出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：コーディングするcDNA SEQ ID NO:15 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:483個のヌクレオチド分子の種類：信号配列をコーディングするcDNA Ti45を
有する成熟蛋白質出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：コーディングするcDNA SEQ ID NO:16 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:483個のヌクレオチド分子の種類：信号配列をコーディングするcDNA Ti5を
有する成熟蛋白質出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：コーディングするcDNA SEQ ID NO:17 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:15個のアミノ酸分子の種類:N末端蛋白質断片出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:18 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:21個のアミノ酸分子の種類:N末端蛋白質断片出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:19 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:21個のアミノ酸分子の種類:N末端蛋白質断片出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:20 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:18個のアミノ酸分子の種類:Lys Ｃを有する切断後のＮ末端蛋白質断片出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 “?"不定;Arg（？）＝不確実さを有する SEQ ID NO:21 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:12個のアミノ酸分子の種類:Lys Ｃを有する切断後のＮ末端蛋白質断片出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:22 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:8個のアミノ酸分子の種類:Lys Ｃを有する切断後のＮ末端蛋白質断片出所：サシガメTriatoma pallidipennisの唾液腺性質：成熟蛋白質として：トロンビン阻害剤 SEQ ID NO:23 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:44個のヌクレオチド分子の種類：マトリックス−出発部分／センスプライマ
ー出所：アミノ酸配列から導出された性質：プライマー SEQ ID NO:24 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:32個のヌクレオチド分子の種類：非マトリックス−出発部分（アンチセンス
プライマー）出所：アミノ酸配列から導出された性質：アンチセンスプライマー SEQ ID NO:25 配列の種類：アミノ酸配列配列の長さ:7個のアミノ酸分子の種類：ペプチド断片性質：修飾されたシクロフィリンａのＣ末端 SEQ ID NO:26 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:57個のヌクレオチド分子の種類：マトリックス−出発部分（センスプライマ
ー）出所：修飾されたシクロフィリンのアミノ酸配列から導
出された性質：センスプライマー SEQ ID NO:27 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:58個のヌクレオチド分子の種類：非マトリックス−出発部分（アンチセンス
プライマー）出所：修飾されたシクロフィリンのアミノ酸配列から導
出された性質：アンチセンスプライマー SEQ ID NO:28 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:28個のヌクレオチド分子の種類：マトリックス−出発部分（センスプライマ
ー）出所：本発明による蛋白質のアミノ酸配列から導出され
た性質：センスプライマー SEQ ID NO:29 配列の種類：ヌクレオチド配列配列の長さ:43個のヌクレオチド分子の種類：非マトリックス−出発部分（アンチセンス
プライマー）出所：本発明による蛋白質のアミノ酸配列から導出され
た性質：アンチセンスプライマー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/64 (31)優先権主張番号Ｐ４３２８３３６．５ (32)優先日平成５年８月17日(1993．8．17) (33)優先権主張国ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号Ｐ４３４０７９８．６ (32)優先日平成５年11月25日(1993．11．25) (33)優先権主張国ドイツ（ＤＥ） (72)発明者アラゴン，アレハンドロメキシコ国モレロス 62271 クエルナヴァカ（番地なし）ウニバーシダッドナショナルアウトノマデメキシコ内 (72)発明者ポッサニ，ロウリヴァルメキシコ国モレロス 62271 クエルナヴァカ（番地なし）ウニバーシダッドナショナルアウトノマデメキシコ内 (72)発明者クウェヴァス−アグイエレ，デリアメキシコ国モレロス 62271 クエルナヴァカ（番地なし）ウニバーシダッドナショナルアウトノマデメキシコ内 (72)発明者ドナー，ペータードイツ連邦共和国Ｄ―12169 ベルリンシュテークリッツァーダム７アー (72)発明者ヘンドラー，ベルナルトドイツ連邦共和国Ｄ―10627 ベルリンシラーシュトラーセ 11ベー (72)発明者ヘヒラー，ウルリケドイツ連邦共和国Ｄ―10627 ベルリンカントシュトラーセ 63 (56)参考文献ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，1995年, 270（48），28629−28634 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/435 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】分子量が18000±3000Daであり、以下のＮ
末端配列：を有し、内部アミノ酸配列（それぞれＮ末端からの出発
“?"は、明らかに同定されないものを表す）：を有し、トロンビン活性を阻害し、セリンプロテアーゼ
因子X aおよびトリプシンを阻害しない、Triatoma pall
idipennisに由来の蛋白質。
【請求項２】次の配列：ｉ）配列表の配列番号１ ii）配列表の配列番号２ iii）配列表の配列番号３ iv）配列表の配列番号４の１つを有し、アミノ酸配列において１つ以上のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されていてよい、トロンビ
ン活性を阻害し、セリンプロテアーゼ因子X aおよびト
リプシンを阻害しない蛋白質。
【請求項３】信号配列および請求項１又は２記載の成熟
蛋白質からなる蛋白質において、次の配列：ｉ）配列表の配列番号５ ii）配列表の配列番号６ iii）配列表の配列番号７ iv）配列表の配列番号８の１つを有し、アミノ酸配列において１つ以上のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されていてよい、信号配列
及び請求項１又は２記載の成熟蛋白質からなる蛋白質。
【請求項４】蛋白質が組み換えタンパク質である、請求
項１から３までのいずれか１項記載の蛋白質。
【請求項５】蛋白質がグリコシル化されている、請求項
１から４までのいずれか１項記載の蛋白質。
【請求項６】請求項１又は２記載の成熟蛋白質をコード
するcDNAまたはDNA。
【請求項７】次のヌクレオチド配列：ｉ）配列表の配列番号９ ii）配列表の配列番号10 iii）配列表の配列番号11 iv）配列表の配列番号12 の１つを有し、ヌクレオチド配列について１つ以上のヌ
クレオチドが欠失、置換もしくは付加されていてよい、
請求項１又は２記載の成熟蛋白質をコードするcDNAまた
はDNA。
【請求項８】次のヌクレオチド配列：ｉ）配列表の配列番号13 ii）配列表の配列番号14 iii）配列表の配列番号15 iv）配列表の配列番号16 の１つを有し、ヌクレオチド配列において１つ以上のヌ
クレオチドが欠失、置換もしくは付加されていてよく、
請求項３記載の信号配列及び成熟蛋白質からなる蛋白質
をコードするcDNAまたはDNA。
【請求項９】請求項６または８までのいずれか１項記載
のcDNAまたはDNA、更に適当なプロモーターおよび、場
合により適当なエンハンサーを含有するベクター。
【請求項１０】請求項９記載のベクターで形質転換され
ている真核または原核宿主生物。
【請求項１１】請求項１から５までのいずれか１項記載
の蛋白質を製造する方法において、次の工程：請求項６から８までのいずれか１項記載のcDNA又はDNA
を含有する、ベクターで形質転換されている宿主細胞の
培養、ならびに蛋白質の単離および精製を有する請求項１から５までの
いずれか１項記載の蛋白質の製造法。
【請求項１２】請求項１から５までのいずれか１項記載
の蛋白質を精製する方法において、蛋白質を単離し、少
なくとも１つのカラム上で精製し、かつ引続き濃縮す
る、請求項１から５までのいすれか１項記載の蛋白質の
精製法。
【請求項１３】請求項１から５までのいずれか１項記載
の蛋白質を精製する方法において、この方法が次の工
程： “スペロース（SUPEROSE）12HR−カラム”上への唾液の
塗布および溶離ならびに先にトロンビンがカップリング
されたCH活性化されたセファロース（Sepharose）−カ
ラム上への再度の塗布および溶離からなる、請求項１か
ら５までのいずれか１項記載の蛋白質の精製方法。
【請求項１４】血栓症または不安定なアンギナまたは動
脈硬化症を治療するか、またはPTCA/PTAによる欠陥の再
閉塞を予防するか、または血液透析の際の血液凝固を阻
止する、請求項１から５までのいずれか１項記載の蛋白
質の１つまたはその混合物を含有する医薬品。
【請求項１５】血栓症または不安定なアンギナまたは動
脈硬化症を治療するか、またはPTCA/PTAによる血管の再
閉塞を予防するか、または血液透析の際の血液凝固を阻
止する、請求項１から５までのいずれか１項記載の蛋白
質の１つまたはその混合物を、製薬的に認容性で相容性
の化合物および担持剤の存在下で含有する医薬品。