JPH03164185A - 改変されたｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皇皇圭旦剋里江旦 本発明は５゛−イノシン酸および５゜−グアニル酸の合
成原料として重要な物質であるイノシンおよびグアノシ
ンの製造法、その製造に用いられる新規微生物および該
新規微生物を造成するに用いられる新規ＤＮＡに関する
。

従来の技術 イノシンおよびグアノシンの製造に関しては、微生物を
用いる発酵法が有利であると考えられ、数多くの製造法
が提案され、実施されている。

今日までの核酸発酵に関する多くの研究の結果イノシン
、グアノシン、キサントシン、アデノシンあるいはその
塩基（たとえばヒボキサンチン）、リン酸化合物（たと
えば５゛〜イノシン酸）等のプリン系物質と総称される
一群の物質の生合成は、最終産物であるアデニン系物質
（アデノシンあるいはそのリン酸化合物であるたとえば
５゜−アデニル酸）、あるいはグアニン系物質（グアノ
シンあるいはそのリン酸化合物であるたとえば５゜−グ
アニル酸）によってフィードバック制御を受けているこ
とが知られている。

従って、発酵法によるプリン系物質の生産に際しては、
アデニン系物質によるこれらプリン系物質の生合成経路
の制御を避ける目的で発酵液中のアデニン系物質の量を
低い状態に保つために培地中のアデニン系物質の量を制
限すると共に、アデニロコハク酸合成酵素を欠損したア
デニン要求性変異株を用いるのが通例である［ワイ・ナ
カオ、マイクロバイアル・テクノロジー（Ｙ．　Ｎａｋ
ａｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
　　Ｖｏｌ．　　ｌ　　ｐ３　１　１〜３５４、エイチ
・ジェイ・ベプラーおよびディ・バールマン編、ニュー
ヨーク、アカデミック・プレス（ｅｄｉｔｅｄ　　ｂｙ
　　Ｈ．　Ｊ．　Ｐｅｐｐｌｅｒ　　ａｎｄ　　Ｄ．Ｐ
ｅｒｌｍａｎ．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ，　
Ｎ８Ｗ　　Ｙｏｒｋ）］。

また、さらにアデニン要求性に加えていわゆる核酸アナ
ログをはじめとする各種の薬剤耐性を付与することによ
ってイノシンおよび／またはグアノシンを有利に生産す
るバチルス属菌（特公昭５５−２９５６号、特公昭５７
−１４１６０号、特公昭５７−４１９１５号、特開昭５
９−４２８９，）号、特公昭５４−１７０３３号、特公
昭５５４５１９９号）、プレビバクテリウム属菌（特公
昭５１−５０７５号、特公昭５Ｂ−１７５９２号）等を
用いる方法が知られている。

このような変異株を取得するには、従来、紫外線照射、
ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異誘起処理を行
い、適当な選択培地を用いて目的とする生育株を取得す
るという方法が行なわれてきた。

発明が解決しようとする課題 しかしながら、プリン系物質は、生物にとって最も重要
な遺伝情報に関与する物質であるために、その生合成経
路には巧妙な制御機構が存在しており、イノシンおよび
／またはグアノシンを過剰に生成させることは必ずしも
容易ではなく、また、変異誘起処理によっては、目的と
するプリン生合戊系酵素をコードする遺伝子の変異以外
にも、染色体上の他の部位における好ましくない変異を
伴っていることが多く、従来の菌株育種法によって得ら
れた変異株は必ずしも満足できるものではなかった。そ
こで、プリン系物質の産業上の重要性から、さらに有利
な製造法が望まれていた。

課題を解決するための手段 生合成系に関与する酵素群をコードする遺伝子（プリン
・オペロン）のアデニン系物質、グアニン系物質による
発現抑制が解除された株の取得について鋭意検討を行っ
た。その結果、組換えＤＮＡ技法を用いて、プリン・オ
ペロンのアデニン系物質による発現抑制に関与するＤＮ
Ａ＠域および／またはグアニン系物質による発現抑制に
関与するＤＮＡｆＪ４域がプリン・オペロンの発現を高
めるように改変され、および／またはプロモータ領域が
他から適当に選ばれたプロモータに置き換えられた構造
を有するＤＮＡを取得することに戊功し、該ＤＮＡを用
いて、プリン・ヌクレオチド生合成系の酵素の発現がア
デニン系物質および／またはグアニン系物質によって抑
制されない新規微生物を作出することに成功した。本手
法を用いてバチルス属菌から選ばれた微生物を受容菌と
して誘導された該新規微生物は多量のイノシンおよび／
またはグアノシンを安定して蓄積することを見出した。

もので、バチルス属菌のプリン・オペロンの発現に関与
するＤＮＡ配列と、該配列の３゛一隣接領域ＤＮＡとを
含む染色体ＤＮＡであって、該プリン・オペロンの発現
に関与するＤＮＡ配列の一部または全部か該発現を高め
るように改変されてなるＤＮＡを提供するものである。

また、本発明は該改変されたＤＮＡが組み込まれたベク
ター、該ＤＮＡまたはベクターで形質転換されたイノシ
ンおよび／またはグアノシン生産能を有する新規バチル
ス属菌および該バチルス属菌を用いるイノシンおよび／
またはグアノシンの製造法も提供するものである。

本明細書において、「改変」にはプリン・オペロンの発
現に関与するＤＮＡ配列の一部を欠失、該ＤＮＡ配列に
他のＤＮＡを挿入することあるいは該ＤＮＡ配列の一部
または全部を他のＤＮＡで置換することを包含する。

本発明に用いられるプリン・オペロンの発現に関与する
領域を含むＤＮＡは、必ずしもプリン・オペロンの全領
域を含む必要はなく、プロモータ配列と、その近辺に位
置する、アデニン系物質たとえばアデニン、アデノシン
、アデノシンーリン酸、アデノシンニリン酸、アデノシ
ン三リン酸の一種以上による発現抑制に関与するＤＮＡ
配列およびグアニン系物質たとえばグアニン、グアノシ
ン、グアノシンーリン酸、グアノシンニリン酸、グアノ
シン三リン酸の一種以上による発現抑制に関与するＤＮ
Ａ配列およびその下流に３′一隣接領域を含んでいるＤ
　Ｎ　Ａであればよく、さらに若干の５’−隣接領域を
含んでいるＤＮＡであれば一層好ましい。該ＤＮＡは、
プリン・オペロンの最初に位置するオープンリーディン
グフレームのＮ末端から３゛一下流域に少なくとも０．
１キロベースベアと５゛一上流域に約０．４キロベース
ペアを含むものである。以下、この部分をプリン・オペ
ロンの発現調節に係る領域と称する。

このようなＤＮＡは微生物の染色体ＤＮＡよりｖＡ換え
ＤＮＡ技法を用いて単離するのが簡便であり、この目的
に用いられるホスト・ベクター系としては通常用いられ
るＥＫ系、すなわち、宿主としてはエシェリヒア・コリ
（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株
由来のたとえばエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　　ｃｏｉｉ）Ｃ　６　０　０　［ティー？ニア
チスら、「モレキュラー・クローニングｊ（Ｔ　．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ，，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ
ｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬ　
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）東大出版会刊　１９８２年、第５
０４頁］、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ）ＪＡ２２１（ＩＦＯ　　１４３５９、Ａ
ＴＣＣ３３８７５）、エシエリヒア・コリ（Ｅ　ｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａリつＭＭ２９４（ＡＴＣ０　　３３６２
５）［プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ（Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ）．　７
　３，　４　１　７　４（１９７６）］あるいはその誘
導体が好適に用いられ、またベクターとしては、ｐＢＲ
３２２、ｐＡｃＹｃ１８４、ｐＡｃＹｃｌ７７、ｐＵｃ
ｌ８、ｐＵｃ１９、ｐＨＳＧ３９６、ｐＨＳＧ２９８な
どが好適に用いられる。

また、Ｃｈａｒｏｎ　４　Ａ（ｒモレキュラー・クロー
ニング」第３１頁）やＥＭＢＬ　　３、Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｌ
　　４　［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジ−（Ｊ．Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．）．　　Ｉ　７　０　
，　８　２　７］などのファージ・ベクターとエシエリ
ヒア・コリ（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｄ　
Ｐ　５　０　ｓｕｐＦ　（「モレキュラー・クローニン
グ」第５０４頁）、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）ＮＭ　５　３　８、Ｎ　Ｍ　
５　３　９　［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（Ｊ　．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．），　　Ｉ　
７　０　，　　８　２　７］、エシェリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）ＬＥ３９２［ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ−（Ｊ　．
　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｗ．），　　２　１　８　．　　
９　７コなどを組合わせたホスト・ベクター系も用いる
ことができる。

また、当然のことながら、バチルス属菌たとえばバチル
ス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）ＭＩｌｌ４［ジーン（Ｇｅｎｅ），　　２　４　，
　　２　５　５］あるいはそれから誘導された変異株を
宿主としてパチルス属菌内で自律複製能を有するブラス
ミドＰ［Ｊｆ３　１　１　０、ｐｃｌ９４、ｐＥ　Ｉ　
９　４、ｐｓ　ｌ　９　４、ｐＳＡ２　１　００．ｐＨ
Ｙ３００ＰＬＫなどをベクタ一とするようなホスト・ベ
クター系も用いることができる。

プリン・オペロンの発現調節に係る領域を含むＤＮＡの
供与菌は、該菌株のプリン・オペロンの発現調節に係る
領域を含むＤＮＡの塩基配列が後記の受容菌として用い
られるバチルス属菌の染色体上の該領域の塩基配列との
相同性が高いものであれば、原則としてその由来につい
ては特別な制限はなく、どのような微生物でも供与菌と
して用いることができる。とりわけ、バチルス属菌を用
いればいわゆるセルフクローニングとなり、取扱いのう
えからも好ましく、また得られた形質転換株も安定であ
ることが期待される。また該供与菌は必ずしもイノシン
、グアノシン、キサントシンあるいは、これらのプリン
塩基を生産する能力を有している必要はない。

このようなＤＮＡ供与菌としては、バチルス・・リケニ
フォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉｓ）のバチルス属菌が挙げられる。たとえば、次
のような菌株が例示される。バチルス・ズプチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｎｏ．　１　６
　８　（Ｂ　Ｇ　Ｓ　ＣＩＡＩ）、バチルス・ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｎｏ．　１　
１　５（Ｉ　ＦＯ　　ｌ　４　１　８　７、ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−１３２７）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ　Ｉ　１　１　４　［
ジーン（Ｇｅｎｅ），　２　４　，　２　５　５］、バ
チルス・プミルスＡＴＣＣ　　　１４５８０ ＢＧＳＣ：ザ・バチルス・ジェネティックク・センター
（Ｔｈｅ　　ＢａｃｉｌｌｕｓＧ　ｅｎｅｔ　ｉｃ　　
Ｓ　ｔｏｃｋ　　Ｃ　ｅｎｔｅｒ）［ＦＯ　　：財団法
人発酵研究所 ＡＴＣＣ：ジ・アメリカン・タイプ・カルチュアー・コ
レクション（Ｔｈｅ　　ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　　
Ｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）供与菌から
の染色体Ｄ　Ｎ　Ａの調製法としては、公知の方法、た
とえばフェノールを用いて染色体・ストッ ＤＮＡを抽出する方法［エイチ・サイトウおよびケイ・
ミウラ、バイ才ヒミカ・工・バイオフイジカ・アクタ（
Ｈ．Ｓａｉｔｏ　ａｎｄ　Ｋ．Ｍｉｕｒａ，　Ｂｉｏｃ
ｈｉａ＋．Ｂｉｏｐｈｙ．　Ａｃｔａ），　７　２　，
　６　１　９コが用いられ、かくして得られた染色体Ｄ
ＮＡは適宜選択された制限酵素で切断され、Ｄ　Ｎ　Ａ
リガーゼを用いてベクターと連結され、この連結反応液
を用いてプリン・オペロン上にコードされているプリン
・ヌクレオタイド生合成系酵素の内から適当に選ばれた
酵素が欠損した宿主菌を形質転換し、該欠損性が相補さ
れた形質転換株を選択する。該宿主菌の形質転換は、宿
主菌がエシエリヒア・コリ（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｔ　ｉ）の場合には公知の方法、たとえばエス・エ
ヌ・コーエン（Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ）らの方法［プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・ユー・エス・エイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ）．　６　９．　２　１　
１　０１に従って、またバチルス属菌の場合には、公知
の方法たとえば、エス・チャンおよびエス・エヌ・コー
エン（Ｓ．ｒ｝１＊ｎｔ　＊ｎＡ　Ｑ　　Ｎ　　ｍｎｈ
ａｎ）の古埃「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジ
エネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．）．
　　１　６　８．　　１　１　５］に従って各々行うこ
とができる。

かくして得られた形質転換株のプリン・ヌクレオタイド
生合成系酵素欠損性が相浦されたか否かは、該菌株のプ
リン系物質を含まず、要すれば、プリン系物質以外の栄
養要求物質を添加した培地での生育の可否によって容易
に判別することができる。

このように、クローン化されたＤＮＡ断片に、プリン・
オペロンの発現調節に係る領域を含むＤＮＡが存在して
いるか否かは、たとえば、公知のバチルス・ズプチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のプリン・
オペロン［ジャーナル・才ブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｗ．）、２６２巻、８
２７４頁〜８２８７頁、ｌ９８７年］と塩基配列、制限
酵素切断点等を比較することによっても判定できるし、
プロモータ・プローブ・ベクター〔ジャーナル・オプ・
バクテリオロジ−（Ｊ　　Ｒｇｅｔｏｒｉｏｌ−１　　
１　４　６１Ｌ　　１　１　６　２百〜１１６５頁］を
用いて判定することもできる。

また、公知のバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のプリン・オペロンの塩基配列デー
タを基に、コロニー・ハイブリダイゼーションあるいは
プラーク・ハイブリダイゼーシタン（モレキュラー・ク
ローニング、第３１２頁〜第３２８頁）を用いてもプリ
ン・才ペロンの発現調節に係る領域を含むＤＮＡをクロ
ーン化することができる。

形質転換株より該遺伝子を含むＤＮＡを大量に得るには
前出の「モレキュラー・クローニング」第８６頁〜第９
３頁に記載の方法に従って行うことができる。

かくして得られたプリン・オペロンの発現調節に係る領
域を含むＤＮＡから本発明の新規ＤＮＡを造或単離する
には組換えＤＮＡ技法を用いるのが簡便であり、たとえ
ばエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃ
ｏｌｉ）のホスト・ベクター系が好適に用いられる。

なお、以後のエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ）中での本発明のＤＮＡの作成過程におい
ては、実験の便宜上、ＤＮＡ断片を新しいベクターにサ
ブクローン化したり、ポリリンカーを利用して連結する
のが好都合であることが多い。この目的のために、たと
えば、エシェリヒア・コリ（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　　ｃｏｌｉ）のベクターであるｐＵＣ１１８、ｐＵｃ
１１９のポリリンカ一部分を利用してサブクローニング
を行えば、新規ＤＮＡの作成の際にも、また、塩基配列
決定の際にも好都合である。

本発明の新規ＤＮＡの造戒単離は、プリン・オペロンの
発現調節に係る領域を含むブラスミドから適当な制限酵
素と、必要に応じて、二本鎖ＤＮＡを末端から順次消化
するエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、たとえば、
ＢＡＬ３１を用いて、プリン・オペロン発現凋節に係る
領域が削られ、短くなったＤＮＡ断片を得ることによっ
て達せられる。この際、アデニン系物質によるプリン・
才ベロンの発現抑制に関与する領域、プリン・才ベロン
・プロモータ領域、グアニン系物質による抑制に関与す
る領域が各々順次削られたＤＮＡ断片を得るには、用い
た制限酵素の種類およびエキソヌクレアーゼ活性を有す
る酵素の量、反応時間を適宜変えて削られた部分の種類
・大きさが種々異なったＤＮＡ断片を得、その内から後
記するような過当な手段で、たとえば、該断片の塩基配
列決定の結果から、目的とするＤＮＡ断片を選び出せば
よい。塩基配列の決定は該ＤＮＡ断片を塩基配列決定に
用いられるベクター、たとえば、Ｍ１３、ｐｔＪｃｌｌ
８あるいはｐＵｃ１１９などにサブクローン化した後、
公知の方法、たとえばエフ・サンガー（Ｆ　．　Ｓ　ａ
ｎｇｅｒ）らの方法［プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス・二一・エス・
エイ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ）．７４．５４６３］を用いて行うことができる
。

この方法｛こよれば、アデニン系物質によるプリン・オ
ペロンの発現抑制に関する領域および／またはグアニン
系物質による発現抑制に関与する領域を除くのみならず
、プロモータ領域を削り取り、新たに他から選ばれた適
当なプロモータに交換することも可能である。この目的
の場合には、バチルス属菌内で発現可能なプロモータ配
列の下流に、プリン・オペロンのプロモータ領域を削り
取ったＤ＼Ａ断片を、たとえばＴ４　　ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結してやればよい。なお、バチルス属菌内で
発現可能なマーカー遺伝子、たとえば薬剤耐性遺伝子を
連結しておけば後記するバチルス属閑の受容菌の形質転
換株選択の際に好都合なことがある。

また、この際、連結されたプロモータの５゜上流にプリ
ン・オペロンのプロモータの５’−隣接領域の一部を連
結しておけば、後記する受容菌の染色体上での組換えの
際にダブルクロス才一バー型の組換えをおこすので好都
合である。

用いられるプロモー夕は後に用いられる宿主菌内で発現
可能なＤＮＡ配列を有するものであればいずれでもよく
、その由来は原核生物、真核生物、あるいは、合成ＤＮ
Ａであるとを問わない。

たとえば、バチルス属菌の染色体由来、バチルス属菌の
ファージ由来またはバチルス属菌体内で自律増殖可能な
ブラスミド由来のプロモータが挙げられる。勿論のこと
、バチルス属菌のプリン・オペロンのプロモータであっ
ても差し支えない。

この場合には、アデニンによる抑制に関与する領域およ
び／またはグアニンによる抑制に関与する領域の改変に
とどまる。

このようなブロモー夕の例としては、具体的には、たと
えば、 ＾＾ＡＡＧＧＴＡＴＴＧ　ＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＧ
ＧＧＴＧＴＧＴＡ　ＡＴ　ＡＡＴＴＴＡＴＡＴＡＣＡＳ
ＰＯＩ−１５［りー．ジイおよびペロ，ジェイ．ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイ才ａシー（Ｌｅｅ，Ｇ
　ａｎｄＰｅｒｏ，Ｊ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．
）．　！　５　２，　２４　７（１９８１）］ Ａ　Ａ　Ａ　ＡＧＴＴＧＴＴＧ　ＡＣＴＴＴＡＴＣＴＡ
ＣＡ　ＡＧＧＴＧＴＧＧＣＡＴＡ　ＡＴＡ　ＡＴＣＴＴ
Ａ　ＡＣＳＰＯＩ−２６［りーら．モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジエネティックス（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａ
ｌ．．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．），　　１　
８　０．　５　７（１　９　８　０）］ＧＡＡＡＡＧＴ
ＧＴＴ臥植＾ＴＴＧＴ　ＣＧＡＡＣＡＧＧＧＴＧＡＴＡ
ＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＴＡφ２９Ｇ３ｂ［マレー．シ
ー・エルおよびロビノビッチ，ジェイ・シー．ジャーナ
ル・オプ・バイオロノヵル・ケミストリー（Ｍａｒｒａ
ｙ，Ｃ．　　Ｌ．　ａｎｄ　Ｒｏｂｉｎｏｗｔｉｚ．Ｊ
Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｗ．），２５７，１０５３
（１９８２）］ ＧＡ　Ａ　ＡＡＧＧＧＴＡＧＡＣＡ　ＡＡＣＴＡＴＣＧ
ＴＴＴＡ　ＡＣＡＴＧＴＴＡＴＡＣＴＡＴＡ　ＡＴＡＧ
Ａ　Ａφ２９Ｇ２［ヨシカワ・エイチら．プロシーディ
ングス・オプ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス・ユー・エス・エイ（Ｙｏｓｈｉｋａｖａ，Ｈ．　
ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　
Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），　７　８，＋３３６（１９８１）
］ ＡＴＴＡＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＣＴＡＴ　ＴＡＣＡＧ
ＡＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＡＴＧＧＴＡＧＴＡＴＣφ２９
＾１［ヨシカワ・エイチら，プロシーディングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・才プ・サイエンス・ユー・
エス・エイ（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．
，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ
ＳＡ），　７　８，１３３６（１９８１）］ などが挙げられる。

これらのプロモー夕は、該プロモータを含むＤ　Ｎ　Ａ
　（プラスミド）から適当な制限酵素を用いて切り出し
て、たとえばアガロース・ゲル電気泳動、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で分別の後、回収して用いることも
できるし、また、市販のＤＮＡ合成装置［たとえばアプ
ライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅａｓ）社製］を用いて、そのプロトコールに従
って、フオスフ中アミダイド法によって前記プロモータ
の塩基配列を有するＤＮＡを合成し、これを用いること
もできる。

次に、本発明の新規ＤＮＡを大量に得るには、前記のＴ
４　　ＤＮＡリガーゼで連結させた反応液を用いて、宿
主菌を形質転換し、選択培地、たとえば薬剤耐性を選択
マーカーにした場合には、該薬剤を含有する培地、に生
育してきた株を取得し、この形質転換株から自体公知の
方法、たとえば前出の「モレキュラー・クローニング」
第８６頁〜第９３頁に記載の方法に従って行うことがで
きる。

かくして得られたプラスミドから改変されたプリン・オ
ペロンの発現調節に係る領域を含むＤＮＡ断片を単離す
るには、常法により制限酵素を用いて該プラスミドを切
断し、アガロースゲル電気泳動で分離した後、たとえば
エレクトロエルータを用いることによって容易に抽出単
離することができる。

次に、かくして得られた新規ＤＮＡを用いて受容菌を形
質転換さｄ・、新規微生物を造成する方法について説明
する。

この形質転換に用いられる受容菌としては、菌体外に与
えられたＤＮＡを取り込み、染色体上において該ＤＮＡ
の塩基配列と相同性の高い部分で組換えをおこし、形質
が変化する性質、いわゆる形質転換能を有する菌であれ
ばよく、その染色体ＤＮＡのプリン・オペロンの発現調
節に係る領域の３゛一下流域の塩基配列がＤＮＡに含ま
れているプリン・オペロンの発現調節に係る領域の３゛
一下流域のものと高い相同性を示しているものであれば
、必ずしも該領域の供与菌と同一である必要はない。イ
ノシンおよび／またはグアノシン生産能の高い形質転挨
株を得る目的からはプリン系物質、たとえばイノシン、
グアノシン、キサントシンの内の２種以上を蓄積するこ
とが知られており、形質転換能を有し、病原性がなく、
工業的にも安全に使用されてきた歴史があるという観点
からは、バチルス属菌、特にバチルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・プミ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）あるいはバ
チルス・りヶニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などの菌が好適である。

また、たとえばこれらの菌に、さらに、プリン系物質の
蓄積に有利とされている公知の性質、たとえば８−アザ
グアニン耐性などのプリンアナログ耐性、ヌクレオシド
ホスフォリラーゼ欠損性、５゜−グアニル酸還元酵素欠
損性、葉酸拮抗剤耐性などが！または２以上付与された
ものを受容菌として用いた場合は、イノシンおよび／ま
たはグアノシン生産性の向上のために一層好適な結果を
得ることが多い。

バチルス属の受容菌としては次のものが例示される。

バチルス・ズブチリス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＢＭｔ０３２（ＩＦＯ　　１４５５９、ＦＥ
ＲＭＢＰ−１２４２） １Ａ３（ＢＧＳＣ　Ｎｏ．ＩＡ３） バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）ＮＡ−６０１１（ＩＦＯ　　１４１８９、ＦＥ
ＲＭＢＰ−２９１） バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）ＮＡ−６０１２（ＩＦＯ　　１４１９０Ｓ　Ｆ
ＥＲＭＢＰ−２９２） バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）ＮＡ−６１２８（［’０　　１４３７３、ＦＥ
ＲＭＢＰ−６１７１＞ バチルス・ズプチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）ＮＡ−７８２１（ＩＦＯ　　１４３６８、ＦＥ
ＲＭＢＰ−６　１　８） パチルス・ズプチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）ＡＴＣＣ　　　１９２２１ バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）ＡＴＣＣ　　　１４６６２ バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕ
ｓ）（ＦＥＲＭ　　Ｐ−２１１６） バチルス・プミルス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕＩＩｌ
ｉｌｕｓ）（ＦＥＲＭ　　Ｐ−４８３２） バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕ
ｓ）（ＦＥＲＭ　　Ｐ−４８２９） パチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ１ｉｃｈ
ｅｎｉｒｏｒｍｉｓ）　Ｉ　Ｆ　０　　１　２　４　８
　５本発明の新規ＤＮＡはパチルス属菌の形質転換に用
いられ、この場合、プラスミドに組み込んだ状態で利用
に供することも可能であるし、また、プラスミドを開裂
させた線状ＤＮＡあるいは本発明のＤＮＡを切り出して
用いることも可能である。

該ＤＮＡ断片を用いてのバチルス属菌の形質転換は公知
の方法［シイ・アナグノストボウロスおよびジェイ・ス
ピツアイツェン、ジャーナル・オプ１バクテリオロジ−
（Ｃ．Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ　ａｎｄＪ　．
Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，　Ｊ　．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）．
　８　１　，　７　４　１（１９６１）１等を用いて行
うことができる。

形質転換株の選択は、たとえば薬剤耐性遺伝子を選択マ
ーカーとしたときには対応する薬剤を含有する寒天平板
を用いるごとによって容易に行うことができる。

このようにして得られた形質転換株が、目的通りの特徴
を有する新規微生物であるか否かは、プリン・オペロン
に＝−ドされているプリン・ヌクレオチド生合成系酵素
活性を測定することによって容易に判定できる。たとえ
ば、アデニン系物質による発現抑制に関与する領域が改
変された本発明のＤＮＡによって形質転換されたバチル
ス属菌の形質転換株においては、培養液中にアデニンを
過剰に添加しても、プリン・ヌクレオチド生合成系酵素
（たとえば、生合威系の初発酵素であるＰＲＰＰアミド
トランスフェラーゼ）生成の抑制がかからず、高い酵素
活性を維持しており、受容菌のそれとの間に大きな差異
があることから容易に判定できる。

このようむ本発明の形質転換株の代表的な例としては、
後記の実施例で得られた、 バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉ
ｌｉｇ）ＢＭ２０３２（ＩＦＯ　　１４９０２、ＦＥＲ
ＭＢＰ−２５３６）あるいはパチルス・ズブチリスＢＭ
２２３２（ＩＰＯ　　Ｉ　５０ｄＯ−　ＰＲＲＭＢＰ−
２９３７）などが挙げられる。

もちろん、プロモー夕や受容菌を選ぶことによって、本
明細書に記載の方法に従って、同様に種々の形質転換株
を容易に作出することができる。

本発明で得られた形質転換株を用いてイノシンおよび／
またはグアノシンを製造するには、従来のイノシンおよ
び／またはグアノシン生産菌の培養方法と同様の方法が
用いられる。

すなわち、培地としては、炭素源、窒素源、金属イオン
類のほか、必要に応じてアミノ酸、核酸、ビタミン類な
どの栄養源を含有する培地が用いられる。たとえば、炭
素源としては、グルコース、シュークロース、マルトー
ス、澱粉、澱粉糖化液、糖蜜などが用いられる。窒素源
としては、ベプトン、コーンスティープリカー、大豆粉
、乾燥酵母、尿素などの有機窒素源のほかに、硫酸、硝
酸、塩酸、炭酸などのアンモニウム塩やアンモニアガス
、アンモニア水などの無機窒素源がそれぞれ単独もしく
は混合して用いられる。その他の栄養源としては、菌の
生育に必要な各種の無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類
などが適宜選択の上、それぞれ単独もしくは混合して用
いられる。アデニン源としては、アデニン、アデノシン
、アデニル酸、核酸はもとより、それらを含有する微生
物菌体やそれらの抽出物などが用いられる。

さらに、培地には必要に応じてシリコンオイル、ボリア
ルキレンゲリコールエーテルなどの消泡剤や界面活性剤
などを添加することができる。

培養は、通常、振盪あるいは通気撹拌深部培養などの好
気条件下に行なわれる。培地のｐＨは通常４ないし９の
範囲が好ましい。培養中にｐＨの変動が観察される場合
は、これを好ましい範囲に修正するために硫酸、炭酸カ
ルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニアガス、アンモ
ニア水などを適宜添加してもよい。培養温度は通常２０
゜Ｃないし４５℃の範囲から、使用される微生物の生育
およびイノシンおよび／またはグアノシンの蓄積に好適
な温度が選択される。培養は実質的にイノシンおよび／
またはグアノシンの蓄積量が最大になるまで行なわれる
が、通常２４時間ないしｌ４４時間の培養で目的を達す
ることができる。

培養物からイノシンおよび／またはグアノシンを分離採
取するには、公知の通常の精製手段、たとえば沈澱法、
イオン交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフィー法な
どの分離精製法が用いられる。

且皇剋 以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明する。

但し、以下の実施例における操作は特に記載する場合を
除き、次の（１）〜（９）の方法に従った。

（１）制限酵素によるＤＮＡの消化 制限酵素（宝酒造（株）製）の緩衝液は酵素メーカー推
薦のものを用い、消化条件はｌＯ単位／μ９ＤＮＡの酵
素を用いて、３７℃で６０分間保温した。次いで、ＴＥ
緩衝液（１０ｇ＋Ｍのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍ
ＭのＥＤＴＡ）で飽和したフェノールで抽出Ｌ，ｌ／ｔ
ｏ倍容の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ６）を加え、２，
５倍容のエタノールを加えて遠心分離してＤＮＡを回収
した。

（２）　プラスミドの大量抽出法 「モレキュラー・クローニング」第８６〜９３頁に記載
の方法に従った。すなわち、プラスミドＤ　Ｎ　Ａを含
むエシェリヒア・コリ（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ笠匹
）を２５０ｍ（７のＬ，Ｂ培地（バクトトリブトン１０
９／（２，酵母エキス５９／Ｑ、塩化ナトリウム５ｇ／
Ｑ）に接種し、一夜培養後、集菌、洗浄した。

次に、洗浄菌体にリゾチームを加え、さらに１％ラウリ
ル硫酸ナトリウムを含む０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液
を加えて溶菌し、５Ｍ酢酸カリウムを加えた後、遠心分
離によりブラスミドを含む上澄液を得た。上澄液に０．
６容のイソプロパノールを加え、プラスミドＤＮＡを沈
澱させ、エタノールで洗浄した後、ＴＥＩＩ衝液に溶解
した。これに比重か１．６０となるように塩化セシウム
を加え、終濃度が６００μ９／ＩＩＱとなるようにエチ
ジウム・プロマイドを加えた。超遠心機（ａ一タＶ．．
Ｔｉ）を用いて２０℃で５０．００Ｏｒｐｍにてｌ２時
間遠心分離し、紫外線によって検出されるプラスミドの
バンドを取り、ｎ−ブタノールを用いてエチジウム・ブ
ロマイドを抽出除去した後、エタノール沈澱を行った。

（３）エシエリヒア・コリ（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ）の形質転換 「モレキュラー・クローニング」第２５０頁に記載の方
法に従った。

３ＩＩＱのＬＢ培地にエシェリヒア・コリ（Ｅ　ｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を植菌し、一夜培養し、そ
のうちの１ｘＱを１００ｚＱのＬＢ培地に植え、３７℃
で菌量が約ｓｘｔｏ’セル／ＨＱになるまで振盪培養し
た。次に、集菌し、水冷した５０ｍＭの塩化カルシウム
と１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８）を含む滅菌水溶液を
５０１１Ｑ加え、懸濁して１５分間水冷した。遠心分離
した菌体を再び上記の水溶液の６　．　７　ｘＱに懸濁
し、この０　．　２　ｚＱにＤＮＡを加え、３０分間水
冷した。これに０　．　８　ｚ（ｌのＬＢ培地を添加し
、３７℃で１時間培養し、薬剤を含むＬＢ寒天平板培地
に塗布し、３７℃で一夜培養した。

（４）Ｂａｌ３１消化処理 ＤＮＡの２本鎖とも両末端から消化するためにＢａｌ３
１消化処理を行った。すなわち、制限酵素処理した１０
μ９のＤＮＡを１００μｌ２のＢａｌ３１緩衝液（１２
ｍＭの塩化カルシウム、１２ｍＭの塩化マグネシウム、
２００ＩｌｌＭの塩化ナトリウム、２０ａＭのトリス塩
酸（ｐＨ８）、２ｏ＋ＭのＥＤＴＡ）に溶解し、１単位
のＢａｌ３１酵素（宝酒造（抹）製）を加え、３０℃で
保温した。反応後フェノール抽出、エタノール沈澱を行
った。次に、消化したＤＮＡの末端を平滑化するために
上記のＤＮＡを２０μＱのＴ４　　ＤＮＡポリメラーゼ
用緩衝液（３３ｏ＋Ｍのトリス酢酸（ｐＨ　７　．　９
　）、１０ｎＭの酢酸マグネシウム、０　．　５　ａ＋
Ｍのジチオスレイトール６６ｍＭの酢酸カリウム、０．
０１％のＢＳＡ，各０　．　１　ＩＩＭのｄＡＴＰ，ｄ
ＧＴＰＳｄＣＴＰ，ｄＴＴＰを含む）に懸濁し、５単位
のＴ４　　ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）を加
え、３７℃で３０分間保温した。反応後、フェノール抽
出、エタノール沈澱を行った。

（５）ＤＮＡの連結反応 ２〜３種のＤＮＡ断片の連結にはＤＮＡライゲ一ション
・キット（宝酒造（株）製）を用いた。連結条件はメー
カー指定の方法に従った。

（６）バチルス・ズプチリス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換 デュブノー（１）　ｕｂｎｏｕ）らの方法に従った。す
なわち、５ｘ（７のＬＢ培地に植菌し、３７℃で一夜培
養し、この０　．　５　ｘＱを２０村のＳＰＩ培地（ｌ
．４％のリン酸二カリウム、０．６％のリン酸一カリウ
ム、０．２％の硫酸アンモニウム、０．１％のクエン酸
ナトリウム、０．０２％の硫酸マグネシウム、０．５％
のグルコース、０．０２％のカザミノ酸、０．１％の酵
母エキス、５０μ９７Ｒ（ｌのトリプトファン、５０μ
９／ＩＩＱのロイシンを含む）に移し、３７℃で４時間
培養した。次に、この１０ｘｆｆの培養液を１００ｍｌ
２のＳＰＩ［培地（！．４％のリン酸二カリウム、０６
６％のリン酸−カリウム、０．２％の硫酸アンモニウム
、０，１％のクエン酸ナトリウム、０．０２％の硫酸マ
グネシウム、０．５％のグルコース、７５μ９／１１（
ｌの塩化カルシウム、５　０　８　ｕ９／ｙｔ（ｌの塩
化マグネシウムを含む）にｎｔ−３７℃で９０分間培養
した。この菌懸濁液ＬｘＱにＤＮＡ１μ２を加え、３７
℃で３０分間振盪した後、薬剤を含むＬＢ寒天平板培地
に塗布し、３７℃で一夜培養した。

（７）ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活性の測定方
法 ５ｘ（ｌのＬＢ培地に形質転換株を植え、３７℃で一夜
培養後、この０　．　２　３１１２を３００μ９／Ｒ（
ｌのアデニンもしくはグアニンを含むＳＰＩ培地の２０
ｚＱに植え、３７℃で３時間培養した。これを集菌し、
０．８５％の塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、菌体をア
セトンで再び洗浄して乾固した。次に、この菌体を反応
液１（１００ｓ＋Ｍのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、３　
．　２　＠Ｍの塩化マグネシウム、２　．　５　ｍＭの
ＰＲＦＰ，１　２ｍＭのし−グルタミン）の１ｘＱに懸
濁し、３７℃で１５分間反応させ、沸騰水中で３分間保
温し、反応を停止した。これを遠心分離して、上澄液の
グルタミン酸濃度をＮＡＤとグルタミン酸脱水素酵素（
ベーリンガマンハイム山之内０！ｋ）劃）本田いア冑優
Ｌｔ・一沃社の量侍はガ１＾ｉグルタミン酸生成員／分
／Ｒ９乾燥菌体量で表示した。

（８）　　コロニーハイプリダイゼーシヲン形質転換さ
れたコロニーを５０μ９ＩＲＱのアンビシリンを含むＬ
Ｂ寒天平板培地上にのせたナイロンフィルター（コロニ
ー／プラークスクリーンＮＥＦ−９７８Ｘ、デュポン（
株）製）上と、マスタープレートとからなるアンピシリ
ンを含むＬＢ寒天平板培地上に菌を植え、３７℃で一夜
培養した。

次に、このナイロンフィルターを平板培地よりはがし、
０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間浸し、
続いて、ＩＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）に１０分間浸
した後、フィルターを室温で乾燥した。

その一方で、プローブの作製を行った。作製にはマルチ
プライムＤＮＡ標識システム（アマシャム・ジャパン（
株）製）を用い、方法はメーカーの指定するプロトコー
ルに従った。

ハイプリダイゼーシヲンの方法は、ナイロンフィルター
指定のプロトコールに従った。

（９）塩基配列決定 ＤＮＡの塩基配列の決定には、シークエナーゼ（東洋紡
（株）製）を用いた。方法は、メーカー指定の方法を用
いた。

なお、以下の微生物に付されているＩＦＯ番号は財団法
人発酵研究所への、またＦＥＲＭ　　ＢＰ番号はブタペ
スト条約に基づく工業技術院微生物工業技術研究所（Ｆ
ＲＩ）への寄託番号を示す。

実施例ｌ ０染色体ＤＮＡの調製 バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）Ｎｏ．１１５［ＩＦＯ　　１４１８７、ＦＥＲ
ＭＢＰ−　１　３　２　７（寄託日：１９８７年３月２
８日）］を４０ｍＱのＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜
培養し、フェノールを用いる染色体ＤＮＡ抽出法によっ
て５１１９の染色体ＤＮＡを得た。

ｉ）プリン生合成遺伝子ｐｕｒＥのクローニングｉ）項
で得られた染色体ＤＮＡＩＱμ９をＣｌａｌで消化し、
アガロースゲル電気泳動で分画し、約３．６〜４　，　
５　ｋｂに相当するＤＮＡをユニディレクショナル・エ
レクトロエルータ［インターナショナル・バイオテクノ
ロジーズ・インコーボレイテッド（　Ｉ　ｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　　Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
　Ｉ　ｎｃ．）製コを用いて回収した。

一方で、０．５μ９のｐＢＲ３２２をＣｌａｌで消化し
、上記のＤＮＡ断片と混合し、連結反応を行った。この
反応液を用いてｐｕｒＥ欠損株のエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｐ　Ｃ　０　１　
３　５株（ＣＧＳＣ５４０３）を形質転換し、アンピシ
リンを含むＭ９ＣＡ（６９／１２のリン酸二ナトリウム
、３　９／１２（７）リン酸−カリウム、０．５９７９
の塩化ナトリウム，１９／１２の塩化アンモニウム、２
９／（ｌのグルコース、２ｍＭの硫酸マグネシウム、０
．１＠Ｍの塩化カルシウム、２９／Ｑのカザミノ酸を含
む）平板寒天培地に塗布して、３７℃で一日保温し、形
質転換株エシェリヒア・コリ　ＰＣＯ１３５（ｐＰＥＣ
３　２）［［Ｆ０　　１　４　８　９　９、ＦＥＲＭＢ
Ｐ−２５３３（寄託日：ｌ９Ｂ９年７月２６日）］を得
た。該形質転換株よりプラスミドＩ）ＰＥＣ？２を得た
。次に、ｐＰＥＣ３２を大量調製し、種々の制限酵素で
切断し、ラムグファージのＨｉｎｄＩ［Ｉ分解物の分子
量を基準にしてアガロース電気泳動パターンより第ｌ図
に示すような制限酵素地図を得た。

ｉｉｉ）　ｐｕｒＥ遺伝子の上流側ＤＮＡの取得ｉ）で
得られた染色体ＤＮＡ　１　０　１ｔ９をＨｉｎｄＩ［
Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動で分画し、約２．
０〜２　．　６　ｋｂに相当するＤＮＡを回収した。

一方で、０．５ｕ９のｐＢＲ３２２をＨｉｎｄＩ［［で
消化し、アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸処理し、
フェノール抽出、エタノール沈澱させたものを用意し、
上記のＤＮＡ断片と混合し、連結反応を行った。この反
応液を用いて、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｄ　Ｈ　１　（ＡＴ　Ｃ　Ｃ３３８
４９）株を形質転換し、アンピシリン耐性株を選択した
。約５００個のコロニーを選び、ブローブとしてｐＰＥ
ｃ３２のＣｌａｌ−ＳｔｕＩ断片（６２０ｂｐ）を用い
て、コロニーハイブリダイゼーシ■ン実験を行った。次
に、プローブとハイブリダイズするコロニーのうちの１
株［エシエリヒア・コリ　ＤＨＩ（ｐＵＨ３２）［ＩＦ
Ｏ　　１４９００、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２５３４（寄託
日：１９８９年７月２６日）コより、プラスミドｐＵＨ
３２を得た。

このｐＵＨ３２を大量抽出し、種々の制限酵素で消化し
、その切断パターンより、第２図に示すような制限酵素
地図を得た。

ｉｖ）プリン・オペロンの上流の塩基配列決定ｉｉｉ）
項で得た［）ＵＨ３２のＥｃｏＲＶ−Ｓｐｈｌ断片（約
５　０　０　ｂｐ）の塩基配列を決定するために、ｌμ
？のｐＵＨ３２をＥｃｏＲＶとＳ　ｐｈ　Ｉで二重消化
し、アガロースゲル電気泳動で分画後、約５００ｂＰの
断片を回収した。次に、０．５μ９のｐＵｃ１１９をＳ
ｍａＩとＳ　Ｉ）ｈ　Ｉで二重消化したものと連結し、
エシェリヒア・コリ（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌ　ｉ）　Ｊ　Ｍｌ０９（宝酒造（抹）製）を形質転換
して、アンピシリン耐性株を得た。そのうちの１株より
ブラスミドを抽出し、塩基配列を決定したところ、第３
図に示したような配列であった。この配列はエボルら（
Ｅｂｂｏｌｅ．Ｄ．Ｊ　．　ｅｔ　ａｔ．）、ジャーナ
ル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（　Ｊ　．　
Ｂ　ｉｏｌ．　Ｃ　ｈｅｍ．）　，２６２．８２７４〜
８２８７に示された配列に一致するものであった。

Ｖ）欠失ブラスミド、ｐＢＸ１１８−９の作製ｉ）項で
調製した１０μ９のｐＰＥｃ３２をＣｌａＩで消化した
後、３０秒間のＢａｌ３１消化処理を行った。次に、Ｘ
ｂａＩで完全消化し、これをアガロースゲル電気泳動で
分画し、約３　．　６　ｋｂに相当するＤＮＡ断片を回
収した。このＤＮＡをＳｍａＩとＸｂａＩで二重消化し
た０．５μ９のｐＵｃ１１８に連結し、エシェリヒア・
コリ（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　１
　０　９株を形質転換し、アンビシリン耐性株を選択し
た。その結果、第４図に示すようなプラスミドｐＢＸ１
１Ｂ−９を得た。

ｖｉ）ｐＳＫＣの作製 ０．５μ９のｐｃＡＴ１５（特開昭６２−８２０９６号
）をＢａａ＋ＨＩとＰｓｔＩで二重消化し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで切断末端を平滑化した。次に、このＤＮ
ＡをＳ　ｍａ　Ｉで切断した０．５μ９のブルースクリ
プトＳＫ（東洋紡（株）製）に連結し、エシエリヒア・
コリ（Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ）　Ｊ　
Ｍ１０９株を形質転換し、アンビシリン耐性かつクロラ
ムフェニコール耐性株を選択し、プラスミドｐＳＫＣを
得た。

ｖｉｉ）ＳＰプロモー夕の作製 第５図に示すような、バチルス・ズプチリス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中で発現可能なプロモー
タをＤＮＡ合成装置（ＤＮＡシンセサイザー３８１Ａ１
アブライド・バイオシステム・ジャパン（株）製）を用
いて作製した。作製方法はメーカーのプロトコールに従
った。次に、これをＥｃｏＲＩとＳａｃ！で切断した０
．５ｕ９のｐＵｃ１９に連結し、エシェリヒア・コリ（
Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　Ｊ　Ｍ１０９
株を形質転換して、ＳＰプロモータが組み込まれたプラ
スミドｐｓｐｔ９を得た。

ｖｉ）ｐＢＸｓｃ１９の作製 ｖｉｉ　）項で作製したｐｓＰｌ９のｏ．ｓμｙをＫｐ
ｎｌとＸｂａｌで二重消化した。一方で、ｖｉ）項で作
製したｐＳＫＣをＸｂａｌで消化し、アガロースゲル電
気泳動で分画し、約１　．　Ｏ　ｋｂのｃａｔ遺伝子を
、また、Ｖ）項で作製したｐＢＸ１１８−９をＫｐｎｌ
とＸｂａｌで二重消化し、アガロースゲル電気泳動で分
画し、約３　．　６　ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。

次に、これら３断片を混合し、連結し、エシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　ｌ
　０　９株を形質転換し、アンビシリン耐性株を選択し
た［エシェリヒア・コリ　ＪＭＩ　Ｏ　９（ｐＢＸＳＣ
　ｌ　９）［ＩＦＯ　　１４９０１１ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−２５３５（寄託日：ｌ９Ｂ９年７月２６日）］。この
結果、第６図に示すようなプラスミドｐＢＸｓｃｌ９を
得た。

実施例２ ｉ）ｐＢＸｓｃｔ９で形質転換されたバチルス・ズプチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）　１　６
　８株のＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活性実施例
１のｖｉ）項で作製したｐＢＸｓｃ１９の１μ２をバチ
ルス・ズプチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）１６８株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性
株を得た。そのうちの！株を、ＳＰＩ培地、アデニンを
含むＳＰ■培地、グアニンを含むＳＰＩ培地で培養し、
ＰＲＰＰアミドトランスフエラーゼ活性を測定した結果
を第１表に示す。なお、対照としてバチルス・ズプチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）　１　６　８
株のものを測定した。

第１表 （単位） ｉ）イノシン・グアノシン生産株パチルス・ズブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ　Ｉ　Ｏ
　３　２の形質転換 実施例ｌのｖｉ）項で作製したｐＢＸＳＣ１９のｌμ９
をバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＢＭ１０３２株（ＩＦ’０　　１４４５９、
ＦＥＲＭＢＰ−１２４２）を形質転換し、クロラムフェ
ニコール（１０μ９／ＩＩ７２）耐性株を得、そのうち
の！株をバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ２０３２［ＩＦＯ　　１４９０２
、ＦＥＲＭＢＰ−２５３６（寄託日：１９８９年７月２
６日）］とした。

ｉｉｉ）バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ２　０　３　２株によるイノシン
およびグアノシン生産性 ５村のＬＢ培地にバチルス・ズプチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ　２　０　３　２株の１
白金耳を接種し、３７℃で１２時間振盪培養した後、そ
の１，ｗｌ２を第２表に示すような培地２０ｘＱに移し
、３７℃で４８時間培養した。培養終了液のイノシンお
よびグアノシンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー
で調べたところ、ｌ　４１１９／ＩＩＱのイノシンと２
ｘｇ／ｚ（ｌのグアノシンが蓄積していた。

一方、バチルス・ズプチリス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ　ｌ　０　３　２株を上記と同一の
条件で培養したところ、８　．　０　Ｒ９／ｚＱのイノ
シンと１．１１９ＩＲＱのグアノシンが蓄積したにすぎ
なかった。

第２表 実施例３ １）欠失プラスミド、ｐＳＢ２２の作製実施例ｌのｉｉ
ｉ　）項で得たＰＵＨ３２の０．５μ９をＳａｃｌとＳ
ｐｈｌとＳ　ｔｕ　Ｉで三重消化し、アガロースゲル電
気泳動で分画後、約８００ｂｐのプロモータを含む断片
を回収した。次に、このＤＮＡを、０．５ｕ９のｐＴＪ
Ｃ１１ＢをＳａｃｌとＳ　ｐｈ　Ｉで二重消化したもの
に連結し、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　　ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　１　０　９株を形質転換し、
アンビシリン耐性株を選択してプラスミドｐＵｓｓ１１
Ｂを得た。

次に、このＰＵＳＳ１１８のｌＯμ９をＳｐｈｌで消化
した後、３０秒間のＢａｌ３１消化処理を行って、Ｓａ
ｃＩで消化し、これをアガロースゲル電気泳動で分画し
、約ｓｏｏｂｐに相当するＤＮＡ断片を回収した。この
ＤＮＡをＳａｃｌとＳａａＩで二重消化した０．５μ２
のｐＵｃｌ１Ｂに連結し、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　１　０　９株
を形質転換し、アンピシリン耐性株を選択した。

その結果、第７図に示すようなブラスミドｐＳＢ２２を
得た。

ｉｉ）ＰＢＥＩ２０３の作製 実施例ｌのＶ）項で作製した１０μ９のｐＢＸｔ　ｔ　
８−９をＫｐｎｌで消化した後、３０秒間、Ｂａｌ３　
１消化処理を行った。次に、これをＥｃｏＲ！で消化し
、アガロースゲル電気泳動で分画し、約３　．　６　ｋ
ｂに相当するＤＮＡを回収した。このＤＮＡを、Ｈｉｎ
ｃｌＩとＥｃｏＲＩで二重消化した０．５μ９のＰＵＣ
ｌ１８に連結し、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　１　０　９株を形質転
換し、アンピシリン耐性株を選択した。その結果、第８
図に示すようなプラスミドｐＢＥＩ２０３を得た。

ｉｉｉ）　ｐＤＴ　３　２の作製 ）項で作製したｐＳＢ２２の０．５μ９をＥｃｏＲ■と
ＨｉｎｄＩｎで消化し、アガロースゲル電気泳動で分画
し、約２ｏｏｂｐの断片を回収した。このＤＮＡをＥｃ
ｏＲＶとＨｉｎｄｌＩ［で切断したブルースクリプトＳ
Ｋに連結し、エシエリヒア・コリアンピシリン耐性株を
選択し、ブラスミドｐＳＫ２２を作製した。次に、０．
５μ９のｐＳＫ２２を、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで二重消
化して約２２０ｂｐの断片を、一方、１１）項で作製し
たｐＢＥＩ２０３の０．５μ９をＰｓｔＩとＨｉｎｄＩ
［［で二重消化して約１　．　２　ｋｂの断片を、また
、０．５μ？のｐＣＡＴ　１　５をＨｉｎｄＩ［［とＢ
ａｍＨＩで二重消化し、約１０ｋｂの断片を、また０．
５）ｔ９のｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで二
重消化して、約３　．　９　ｋｂの断片を、それぞれア
ガロースゲル電気泳動で分画後、回収した。次に、これ
ら４断片を混合し、連結して、エシェリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＭ２９４株（ＡＴ
Ｃ０　　３３６２５）を形質転換して、アンピシリン耐
性株を選択した。その結果、第９図に示すようなブラス
ミドｐＤＴ３２を得た。

実施例４ ｉ）ｐＤＴ３２で形質転換されたバチルス・ズブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）　１　６　８
株のＰＲＰＰアミドトランスフエラーゼ活性 実施例３のｉｉｉ　）項で作製したｐＤＴ３２のｌμ９
をバチルス・ズブチリス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）１６８味に形質転換し、クロラムフエニコ
ール（１０μ９ＩＲＱ）耐性株を得た。そのうちの１株
をＳＰＩ培地、アデニンを含むＳＰＩ培地、グアニンを
含むＳＰＩ培地で培養し、ＰＲＰＰアミドトランスフェ
ラーゼ活性を測定した。その結果を第３表に示す。なお
、対照として、バチルス・ズプチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）　１　６　８味のものを測定し
た。

第３表 （単位） ｉ）イノシン・グアノシン生産株バチルス・ズプチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ　１　０
　３　２株の形質転換 実施例３のｉｉｉ　）項で作製したｐＤＴ３２のｌμ９
をバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）Ｂ？ｖｌｌ０３２株に形質転換し、クロラム
フエニコール（１０μｇ／ＩＱ）耐性株を得、そのうち
の１株をバチルス−ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ２２３２［ＩＦＯ　　１５０４０
、Ｆ’ＥＲＭＨＰ−２９３７（寄託日：１９９０年５月
２８日）コと命名した。

ｉｉｉ　）バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ２　２　３　２株によるイノシ
ンおよびグアノシン生産性 ｉｉ）で得られたバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｇ）Ｂ　Ｍ　２　２　３　２株を実
施例２の市）項と同様の条件で培養し、定量した結果、
１　３　＊ｇ／ｘＱのイノシンと２１９／１１２のグア
ノシンが蓄積していた。

一方、対照としたバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ　１　０　３　２株は、８
　．　０　ｍｙ／ｚＱのイノシンとｌ　．　１　１９／
ＲＱのグアノシンを蓄積したにすぎなかった。

発明の効果 本発明によると呈味性物質として工業上重要な５′−イ
ノシン酸、５゜−グアニル酸の原料であるイノシンおよ
び／またはグアノシンを収率よく工業的に有利に製造す
ることができる。

すなわち、イノシンおよび／またはグアノシンを生産す
る能力を有するバチルス属菌を受容菌として本発明のＤ
ＮＡを用いて形質転換することにより、アデニン系物質
、グアニン系物質による抑制が解除され、および／また
はプロモータが交換されて、プリン・ヌクレオタイド生
合成経路の酵素活性が上昇した新規微生物を得ることが
できる。

該新規微生物は、イノシンおよび／またはグアノシンを
きわめて安定的に多量に生産することができる。

【図面の簡単な説明】

第ｌ図は実施例１　−　ｉｉで得られたプリン生合戊系
酵素をコードする遺伝子（ｐｕｒＥ）を含む組換えブラ
スミドｐＰＥＣ３２の制限酵素切断地図を表わす。図中
の実線部分はｐｕｒＥを含む挿入ＤＮＡ断片を、白ヌキ
の部分はｐＢＲ３２２を表わす。 第２図は実施例１　−　ｉｉｉで得られたｐｕｒＥの５
゜−上流側ＤＮＡ断片を含むｐＵＨ３２およびｐＰＥｃ
３２の制限酵素切断地図を表わす。図中の点線は同一制
限酵素による切断点を表わす。 第３図は実施例１−ｉｖで決定されたｐＵＨ３２のＥｃ
ｏＲＶ−ＳｐｈＩ領域の塩基配列およびブロモー夕、ｐ
ｕｒＥの開始コドンの位置を表わす。 第４図は実施例１−ｖで作製されたプリン・オペロンの
発現調節に係る領域を欠失したプラスミドｐＢＸ１１８
−９の制限酵素切断地図およびその塩基配列の一部を表
わす。図中の実線はｐｕｒＥを含むＤＮＡ断片を、白ヌ
キ部分はｐＵＣｌｌ８を、また、その上部に書かれた制
限酵素名はクローニングサイト上の切断点を表わす。図
中に示された塩基配列はマルチクローニングサイトのＫ
ｐｎｌからｐｕｒＥの開始コドンまでであって、制限酵
素切断地図との対応を図中に示してある。 第５図は実施例１−ｖｉで作製されたＳＰプロモー夕の
塩基配列を表わす。 第６図は実施例１　−ｖｉで作製された組換えプラスミ
ドｐＢＸｓｃｌ９の制限酵素切断地図を表わす。図中黒
の塗りつぶしはＳＰプロモー夕を、斜線部分はクロラム
フエニコール・アセチルトランスフエラーゼ遺伝子部分
を、実線部分はｐｕｒＥを含むＤＮＡ断片を、白ヌキ部
分はｐＵｃ１９を表わす。 第７図は実施例３で作製された組換えプラスミドｐＳＢ
２２の制限酵素切断地図およびその塩基配列の一部を表
わす。図中の白ヌキ部分はｐＵＣ１１８を表わす。 第８図は実施例３で作製された組換えブラスミドＰＢＥ
Ｉ２０３の制限酵素切断地図およびその塩基配列の一部
を表わす。図中の白ヌキ部分はｐＵｃｌｌ８を表わす。 第９図は実施例３で作製された組換えプラスミドｐＤＴ
３２の制限酵素切断地図を表わす。図中の白ヌキ郎分は
ｐＢＲ３２２を、斜線部分はクロラムフェニコール・ア
セチルトランスフェラーゼ遺伝子部分を表わす。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス属菌のプリン・オペロンの発現に関与す
   るＤＮＡ配列と、該配列の３’−隣接領域ＤＮＡとを含
   む染色体ＤＮＡであって、該プリン・オペロンの発現に
   関与するＤＮＡ配列の一部または全部が該発現を高める
   ように改変されてなるＤＮＡ。
2. （２）改変されるＤＮＡ配列部分が、アデニン系物質に
   よる発現抑制に関与するＤＮＡ領域である請求項（１）
   のＤＮＡ。
3. （３）改変されるＤＮＡ配列部分が、グアニン系物質に
   よる発現抑制に関与するＤＮＡ領域である請求項（１）
   のＤＮＡ。
4. （４）改変されるＤＮＡ配列部分が、プリン・オペロン
   のプロモータである請求項（１）のＤＮＡ。
5. （５）プリン・オペロンのプロモータを、発現可能な他
   のプロモータで交換してなる請求項（４）のＤＮＡ。
6. （６）他のプロモータが、バチルス属菌の染色体ＤＮＡ
   由来またはバチルス属菌のファージ由来のプロモータで
   ある請求項（５）のＤＮＡ。
7. （７）請求項（１）、（２）、（３）、（４）、（５）
   または（６）の改変されたＤＮＡが組み込まれたベクタ
   ー。
8. （８）請求項（１）、（２）、（３）、（４）、（５）
   または（６）のＤＮＡあるいは請求項（７）のベクター
   で形質転換されたイノシンおよび／またはグアノシン生
   産能を有するバチルス属菌。
9. （９）請求項（８）のバチルス属菌を培地に培養し、イ
   ノシンおよび／またはグアノシンを生成蓄積せしめ、こ
   れを採取することを特徴とするイノシンおよび／または
   グアノシンの製造法。