JPH02209890A - 新規なペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 し産業上の利用分野］ 本発明は、新規なペプチドに関する。

本発明によって提供されるペプチドは担体上に容易に固
定化され、次いで熱処理されることにより、ニコチン性
アセチルコリンレセプターに対するヒト抗体と特異的に
反応し、該抗体を選択的に吸着しつる性能を発現する。

従って、本発明によって提供されるペプチドは、神経筋
接合部のシナプス後膜上に存在、するニコチン性アセチ
ルコリンレセプターに対する自己抗体に原因する神経筋
伝達障害が病態の中心であるとされている重症筋無力症
の治療において有用である。

［従来の技術］ ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、第２９９巻、第７９３
〜７９７！（１９８２年）には、シビレエイの１種であ
るトルベト・カリホルニカ（４ｃａｌｉｒｏｒｎｉｃａ
）の電気器官から取得されるニコチン性アセチルコリン
レセプターのα−サブユニット前駆体が４６１個のアミ
ノ酸から構成されており、その−次構造を解明し得たこ
とが報告されている。この報告によれば、該α−サブユ
ニット前駆体の一次構造における第１８３〜２００位の
アミノ酸配列は式−Ｇｌｙ　−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ　−Ｈ４
ｓ　−Ｔｒｐ　−Ｖａｔ　−Ｔｙｒ　−Ｔｙｒ　−Ｔｈ
ｒ　−Ｃｙｓ　−ス抗体およびウサギ抗体と結合するこ
とが報告されている。バイオケミカル・アンド・バイオ
フィジカル−リサーチ−コミュニケーションズ（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　
ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）　、
第１３５巻、第８２〜８９頁（１９８６年）には、トル
ベト・カリホルニ力から取得されたニコチン性アセチル
コリンレセプターのα−サブユニットをプロテアーゼで
分解することによつカ　　（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　
　ｏｒ　　　ｔｈｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　　Ａｃａ
ｄｅｍｙ　　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ　　ｏｆ　　ｔｈｅ
　　Ｕｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔｅｓ　　ｏｒ　　Ａｍｅ
ｒｉｃａ）　　、第８４巻、第３６３３〜３６３７頁（
１９８７年）には、トルベト・カリホルニ力の電気器官
から取得されるニコチン性アセチルコリンレセプターの
α−サブユニットの一次構造における第１８２〜１９８
位のアミノ酸配列に対応するペプチドが合成され、この
ペプチドをアガロース系担体［ＣＮＢｒ−活性化セファ
ロースＣＬ　−４８（ＣＮＢｒ　−ａｃｔｉｖａｔｅｄ
　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂ）］に固定化して形
成させた吸着剤が、ニコチン性アセチルコリンレセプタ
ーに対するマウセプターのリガンド結合部位に対するマ
ウスモノクローン抗体およびα−ブンガロトキシンと結
合することが報告されている。

［゛発明が解決しようとする課題］ 重症筋無力症の治療において重症筋無力症の主たる原因
物質であるとされているニコチン性アセチルコリンレセ
プターに対するヒト自己抗体を除去する手段の確立が望
まれているが、その実用的な手段はまだ確立されていな
いのが実状である。

しかして、本発明の目的は、ニコチン性アセチルコリン
レセプターに対するヒト抗体を有効に吸着する能力を有
する吸着剤を効率的に製造するために有用な新規なペプ
チドを提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明によれば、上記の目的は、−数式Ｈ−Ｘ−Ｇｌｙ
　−Ａ　−Ｌｙｓ　−ｔ（ｉｓ　−Ｂ　−！／ａｌ　−
Ｔｙｒ　−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｐｒ
ｏ　−Ａｓｐ　−Ｔｈｒ　−Ｐｒｏ　−Ｔｙｒ＝　Ｌｅ
ｕ　−Ａｓｐ　−Ｙ　−Ｚ　　　　　　　　　　　　　
　　（１）［式中、ＡおよびＢはそれぞれＰｈｅまたは
Ｔｙｒを表わし、ＸおよびＹはそれぞれ単結合を表わす
か、くは該鮮から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残
基の、２〜ｌｏＩ［ｉがペプチド結合によって形成する
ペプチド残基を表わし、Ｚは水酸基またはアミ７基を表
わし、上記アミノ酸配列のＣｙｓ　−Ｃｙｓにおいて各
々のＣｙｓが有するメルカプト基は相互に結合してジス
ルフィド結合を形成していてもよい。］で示されるペプ
チドを提供することによって達成される。

本明細書においては各種アミノ酸残基を慣例の略号で記
述する。略号は本発明の技術分野においてよ（知られた
ものであるが、本発明に関係あるものを以下に列記する
。

Ａｓｐ　：　　Ｌ−アスパラギン酸残基Ｃｙｓ　：　　
Ｌ−システィン残基 Ｇｌｕ　：　　Ｌ−グルタミン酸残基 ＧＬｙ　　　：　　　グ　　リ　　　シ　　ン　　残　
　基旧ｓ　：　Ｌ−ヒスチジン残基 Ｌｅｕ　：　　Ｌ−ロイシン残基 Ｌｙｓ　：　Ｌ−リジン残基 Ｐｈｅ　：　　Ｌ−フェニルアラニン残基Ｐｒｏ　：　
　Ｌ−プロリン残基 Ｔｈｒ：Ｌ−）レオニン残基 Ｔｙｒ　：　　Ｌ−チロンン残基 Ｖａｔ　’：　Ｌ−バリン残基 また本明細書においては、常法に従ってアミノ酸配列を
Ｎ末端のアミノ酸が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸が
右側に位置するように記述する。

一般式（［）におけるＸおよびＹは上記のとおり定義さ
れるが、ＸおよびＹの両方が単結合であるペプチドなら
びにＸおよびＹのいずれかが上記で定義されたものと異
なるアミノ酸残基またはペプチド残基であるペプチドは
、担体上に効率よく固定化されない場合があるだけでな
く、担体上に固定化され熱処理されることによってもニ
コチン性アセチルコリンレセプターに対するヒト抗体を
吸着する能力が充分には発現しない場合がある。−般式
（＋）におけるＸおよびＹが表わすペプチド残基として
は、例えば、次のペプチド残基を挙げることができる。

一＾ｓｐ−＾ｐｓ−，−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−、−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ　−−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ− ＮＨ（ＣＨ，）　、Ｃ−Ｇｌｕ− −Ｎ）Ｉ（Ｃｕｔ）ｔｔｃ　　Ｌｙｓ−■ −Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ− （Ａｓｐ）ｓ、　　＋Ｇｌｕ）ｓ、　　（Ｌｙｓ）ｓ、
　　４Ｇ１ｙ）ｓ。

−Ｌｙｓ　−Ａｓｐ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ　−ＮＨ（Ｃ
Ｈ，）　ｔ　ｔｃ　−雷 −Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−−Ａｓｐ
　−Ｇｌｕ　−ＮＨ（Ｃｕｔ）　ｔｔｃ　−Ｌｙｓ　−
Ｇｌｙ　−Ｌｙｓ　−＋Ａｓ１））＋ｏ、４Ｇｌｕ）＋
ｏ、（Ｌｙｓ）ｔｏ、４ＧＩＶ）ｔｏ。

−Ａｓｐ−Ｇｌｕ　＋、　　−Ａｓｐ−Ｇｌｙ　＋、　
　−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　−−Ｌｙｓ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ
　−ＮＨ（ＣＨ，）　＋　ｒｃ　−Ａｓｐ　−Ａｓｐ　
−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ　−−Ｌｙｓ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾ｓｐ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−一般式（［）で示されるペプ
チドの合成は、ペブ基からそれぞれ水素原子を除いて得
られるアシルオキシ基またはアシルアミノ基を結合させ
たスチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの反応溶媒
に不溶性の重合体に、目的とするペプチドのＮ末端の方
向に向って、対応するアミノ酸を該アミノば、ジャーナ
ル・オブ俸ジＯアメリカン−ケミカル−ソサエティー（
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ’Ｃ
’ｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）　、第８５巻、第
２１４９〜２１５４頁（１９６３年）；日本化化学会ｌ
ｓ「生化学実験講座１タンパク質の化学■化学修飾とペ
プチド合成」（昭和５２年目月１５日株式会社東京化学
同人発行）、第２０７〜４９５頁；日本生化学金線「続
生化学実験講座２　タンパク質の化学（下）」（昭和６
２年５月２０日株式会社東京化学同人発行）、第６４１
〜６９４頁など参照］。

一般式（１）で示されるペプチドの固相合成法による製
造は、例えば、目的とするペプチドのＣ末端に対応する
アミノ酸またはアミノ酸アミドが有するα−カルボキシ
ル基またはα−カルバモイル゛′有する保護基を除去す
る操作を順次繰返すことによって、ペプチド鎖を伸長さ
せ、目的とするペプチドに対応するペプチド鎖を形成し
、次いで該ペプチド鎖を重合体から脱離させ、かつ保護
されている官能基から保護基を除去することにより目的
とするペプチドを得、次いでこれを精製゛することによ
って実施される。ここで、ペプチド鎖の重合体からの脱
離および保護基の除去は、フッ化水素を用いて同時に行
うのが副反応を抑制する観点から好ましい。また、得ら
れたペプチドの精製は逆相液体クロマトグラフィーで行
うのが効果的である。

一般式（１）で示されるペプチドは担体上に効率的に固
定化することができる。担体上に固定化された一般式（
１）で示されるペプチドは、熱処理を受けることによっ
て、自涜などの体液中のニコチン性アセチルコリンレセ
プターに対するヒト抗体を吸着する能力を顕著に発現す
る。一般式（１）で示されるペプチドを固定化する際に
使用する担体としては、親水性の表面を有し、かつペプ
チドとまたは平均細孔径が約５０〜１０００ナノメート
ルの範囲内であるものを使用するのが好ましい。担体は
粒子状、繊維状、シート状、中空糸状などの任意の形状
であることができる。かかる担体としては、例えば、Ｃ
Ｍ−セルロファインＣＨ（排除限界タンパク質分子量：
約３Ｘ　１０＠、生化学工業株式会社販売）などのセル
ロース系担体；　ＣＭ−トヨバール６５０Ｃ（排除限界
タンパク質分子量：　５Ｘ　ｔｏ’　；東ソー株式会社
製）などのポリビニルアルコール系担体、ＣＭ−ｈリス
アクリルＭ　（ＣＭ　−ＴｒｉｓａｃｒｙｌＭ）［排除
限界タンパク質分子１　：　ＩＸ　１０’；スウェーデ
ン国ファルマシアーＬ　Ｋ　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
に対するヒト抗体を吸着させるための吸着剤として使用
する場合には、上記の担体はさらに体液に、二不溶性で
あり、多孔性であるものが好ましい。多孔性の担体はニ
コチン性アセチルコリンレセプターに対するヒト抗体を
吸着させうる有効表面積が広いことから、このような担
体としては排除限界タンパク質分子量が約１０６〜１０
１の範囲内であるか−ＬＫＢ）社製］などのアガロース
系担体などの有機質担体；およびｃ　ｐ　ｃ　−ｌｏ−
＋ｏｏｏ　［排除限界タンパク質分子量：１Ｘ１（１’
；平均細孔径：　ｌＱＯｎｍ”；米国エレクトロ一二ュ
ークレオニクス（Ｅ　ｌ　ｅ　ｃ　ｔ　ｒ、。

ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）社製コなどの多孔性ガラスなど
の無機質担体が挙げられる。

一般式（＋）で示されるペプチドの担体上への固定化は
、一般にペプチドまたはタンパク質を担体上に固定化す
る場合に採用される方法に従って行われる。その固定化
方法としては、例えば、担体が有するカルボキシル基を
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させることによっ
てスクシンイミドオキ７カルボニル基に変換し、これに
一般式（［）で示されるペプチドをアミン基の部分で反
応させる方法（活性エステル法）、担体が有するアミノ
基またはカルボキシル基にシンクロヘキシルカルボジイ
ミドなどの縮合試薬の存在下で一般式（１）で示される
ペプチドのカルボキシル基またはアミン基を縮合反応さ
せる方法（縮合法）、担体と一般式（１）で示されるペ
プチドとをグルタルアで示されるペプチドの担体上への
固定化量は、得られる吸着剤がニコチン性アセチルコリ
ンレセプターに対するヒト抗体の有意量を吸着しつるた
めＪｇは通常約３Ｘ　ＩＱ”モル／ｇ（担体）以上が必
要であり、担体上に固定化された一般式（１）で示され
るペプチドがヒト抗体の吸着に有効に利用されるために
は約ＩＸ　１０−’〜２Ｘ　ｔｏ−’モル／ｇ（担体）
の範囲内であるのが好ましい。

担体上に固定化された一般式（１）で示されるペプチド
は、前述のとおり熱処理を受けることによってニコチン
性アセチルコリンレセプターに対スるヒト抗体を吸着す
る高い活性を発現する。熱処理温度は６０°Ｃ以上であ
ることが好ましいが、熱処理温度が高すぎる場合にはペ
プチドおよび／または担体が分解する場合があるので、
該熱処理湯度は１８０℃以下に抑えることが好ましい。

また熱処理時間は約５分間以上であることが好ましいが
、熱処理時間が長すぎる場合にはペプチドおよび／また
は担体が分解する場合があるので、該熱処理時間は約１
時間以内とするのが好ましい。熱処理するのがペプチド
の分解を抑制しうる点から好ましい。

ニコチン性アセチルコリンレセプターに対する抗体の除
去は、−数式（１）で示されるペプチドを担体に固定化
して得られる吸着剤を該抗体を含有する血液、血漿、直
情などの体液と接触させて、吸着剤に該抗体を吸着させ
ることによって行われる。例えば、吸着剤はカラムに充
填して使用する。

この目的で使用するカラムは、血液回路と容易に接続し
得る形状の人口部と出口部を有し、かつ人口部と吸着剤
層の間および出口部と吸着剤層の間にそれぞれポリエス
テルなどの材質のフィルターを備えていることが望まし
い。カラムの材質としては、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリメチルメ
タクリレートなどが例示される。これらのうちポリプロ
ピレンおよびポリカーボネートが、吸着剤を充填したカ
ラムを使用前にオートクレーブ滅菌、γ−線滅菌などの
滅菌に付することができる点において特に好適である。

ることができる。

（１）患者の血管から取り出した血液を吸着剤を、−４
，充填したカラムに送り、そこで血液からニコチン性ア
セチルコリンレセプターに対する抗体を吸着により除去
し、次いでカラムを通過した処理された血液を患者の血
管に循環する。

（２）患者の血管から取り出した血液をまず血球成分と
血漿成分に分離し、分離された血漿成分を吸着剤を充填
したカラムに送り、そこで血漿成分か、らニコチン性ア
セチルコリンレセプターに対する抗体を吸着により除去
し、カラムを通過した処理された血漿成分を上記の分離
された血球成分と混合し、次いで得られた混合物を患者
の血管に循環する。

［実施例コ 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は実施
例により限定されるものではない。

実施例１ 式Ｈ−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙ
ｓ　−Ｈｉｓ　−Ｐｈｅ　−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社
製モデル４３０Ａ　（Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａ　）　］を
用いて固相合成法により合成した。４〜［Ｎ−（１−ブ
トキシカルボニル）グリシルオキシメチル゛］フェニル
アセトアミドメチル 基を０．７８ミリモル／　ｇ　（樹脂）の割合で有する
スチレンーンビニルベンゼン共重合体［スチレンとジビ
ニルベンゼンの構成比（モル比）・９９対１］からなる
粒状樹脂［米国アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製　ＰＡＭグリシ
ン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）　、　　ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙコを
０．６４ｇ用い、これに第１表に示す一連の操作に従っ
て目的とするペプチドのＮ末端の方向に向って対応する
Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システィン、グリシン、Ｌ−
ヒスチジン、し−ロイシン、し−リジン、Ｌ−プロリン
、Ｌ−ルオニン、シー７エニルアラニン、Ｌ−チロシン
およびし一バリンを順次結合させた。縮合反応において
上記のアミノ酸はそれぞｔＬＮ−（ｔ−ブトキシカルボ
ニル）−０’−ベンシカ１ルボニル’）　−Ｎ″−１−
シル−し一ヒスチジン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカル
ボニル）−Ｌ−ロ／イ１シン無水物、Ｎ″−（ｔ−ブト
キンカルボニル）Ｉ＠−ベンジルオキシカルボニル−し
−リジン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ
−７’ロリン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）
−□３−ベンジルーＬ−）レオニン無水物、Ｎ’−（１
−ブトキシカルボニル）−し−フェニルアラニン無水物
、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−０’−ベンジル−
し−チロシン無水物およヒＮ−（を−ブトキシカルボニ
ル）−Ｌ−バリン無水物として用い、それらの使用量は
基質に対して約２倍モル量とした。縮合反応は室温下で
行い、反応時間は縮合させるアミノ酸の種類によって異
なるが１８〜３０分間の範囲内であった。またＮ”−（
Ｌ−ブトキシカルボニル）−Ｎ’ｍ′−トシル−Ｌ−ヒ
スチジン無水物を用いる縮合反応では変換率が低いため
に、第１表に示す一連の操作を終了したのち、さらに第
１表における工程４〜６の操作を繰り返すことによって
縮合反応を再度実施した。

全てのアミノ酸についての反応操作が終了したのち、得
られた樹脂をグラスフィルター上でジエチルエーテル、
ジクロロメタンおよびメタノールを用いて順次洗浄し、
次いで真空乾燥すること１ごよって２．１ｇの乾燥樹脂
を得た。ポリトリフルオロモノクａｏエチレン製の反応
容器（株式会社ペプチド研究所製ＨＦ−反応装置Ｉ型）
中で、乾燥相混合物からフッ化水素、アニソールおよび
エチルメ：チルスルフイドを減圧下に除去し、残留物を
グラ２スフイルター上でジエチルエーテルを用いて充′
分洗浄した。得られた残留物を２規定の酢酸水溶液で抽
出し、抽出液を凍結乾燥することによりペプチドの粗製
物を０．５ｍｇ得た。

得られた粗製物を分取用逆相高速液体クロマトグラフィ
ー［カラム：オクタデシル化シリカゲル（粒径：５μｍ
）充填カラム（内径：　ｌｏｍｓ、長さ＝３０ｈａ）　
　（株式会社ケ゛ムコ製デベロシル（Ｄｅｖｅｌｏｓｉ
ｌ）　ＯＤ　Ｓ　　１ｏａｎφＸ　３０Ｇｍｓ’）　　
；移動相トリフルオロ酢酸を０．０５容量％含有するア
セトニトリルと水の混合溶媒（アセトニトリルの濃度は
２０分間で２０容量％から３５容量％になるように漸次
変化させた）］で精製することによって、目的とするペ
プチドの精製物を５０　ｔ＠ｇ　１４た。

得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィ
ー［カラム：オクタデシル化シリカゲル（粒径：５μｍ
）充填カラム（内径：　４ｍ＋ｅ、長さ＝１５０ｍｍ）
　　（東ソー株式会社！ｌ！ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−：流
速：　１ｍ１２／分；検出法二波長２ｉ０ｎｍにおける
吸光度］に付したところ、１８．１分に単一の鋭いピー
、２が示された。ＦＡＢ　（、高速原子衝撃）法マスス
ペクトルにより求められた精製物の分子量は２７３７で
あった（理論値：　２７：（７，１５）。また、精製物
を塩酸を用いて加水分解して得られた生成物をアミノ酸
組成分析に付した結果は次のとおりであった（括弧内の
数字は理論値を示す）。リジン：５．２２（５）、グリ
シン・１．９５（２）、フェニルアラニン＝２、０ｆ（
２）、　　ヒスチジン：　０，９７（１）、バリン：０
．９３（１）、チロシン：　３．０７（３）、　　トレ
オニン：　２．０５（２）。

シスチン：　０．８７（１）、プロリン：　２．１３（
２）、アスパラギン酸：　２．１０（２）、　　ロイシ
ン：　１．０１（１）。

実施例２〜１６ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより第２表に示すペプチドを得た
。ただし、固相用の樹脂として、実施例２および実施例
１０では４−［Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）グリシ
ルオキシメチル］フェニルアセトアミドメチル基を０．
７８　ミリモル／ｇ国、アプライド・バイオシステムズ
（Ａｐｐ！ｉｅｄ［３ｉＨｙｓｔｅｌＩｓ）社製ＰＡＭ
　グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）　＋ｔ　−Ｂｏｃ　−Ｇ
ｌｙｌを用い、実施例３、実施例５、実４−１施例８、
および実施例１２では４−［Ｎ−（ｔブトキシカルボニ
ル）−ｏ’−ベンジル−α−Ｌ−アスバルチルオキシメ
チルコフェニルアセトアミドメチル基を０．７８　ミリ
モル／　ｇ　（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニ
ルベンゼン共重合体［スチレンとジビニルベンゼンの構
成比（モル比）：９９対ｌ］からなる粒状樹脂［米国ア
プライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）社製ＰＡＭアスパラギン酸（Ａｓｐａ
ｒｔｉｃ　ａｃｉｄ）　、　　ｔ　−ＢｏａＬ　−Ａｓ
ｐ　（ＯＢＺＩ）　］を用い、実施例４および実施例６
では４−［Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−０５−ベ
ンジル−α−Ｌ−グルタミルオキシメチル］フェニルア
セトアミドメチル基を０．７８　ミリモル／ｇ（樹脂）
の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体［
スチレンとジビニルベンゼンの構成比（モル比）、９９
対ｌ］からなる粒状樹脂［米国アプライド・バイオシス
テムズ（Ａｐｐｌｉｅｄンージルオキシカルボニル）−
Ｌ−リジルオキシメチル］フェニルアセトアミドメチル
基を０．７８　ミリモル／　ｇ　（樹脂）の割合で有す
るスチレン−ジビニルベンゼン共重合体［スチレンとジ
ビニルベンゼンの構成比（モル比）、９９対ｌ］からな
る粒状樹脂［米国アプライド・バイオシステムズ（＾ｐ
ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製ＰＡＭリジン（
Ｌｙｓｉｎｅ）　、　　ｔ　−Ｂｏｃ　−Ｌ　−Ｌｙｓ
　（Ｃ１２−Ｚ　）　］を用い、また実施例１３〜１６
ではα−アミノ−ｐ−メチルベンジル基を０．７８　ミ
リモル／ｇ（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニル
ベンゼン共重６体［スチレンとジビニルベンゼンの構成
比（モル比）・９９対１］からなる粒状樹脂［米国アプ
ライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ
ｙｓＬｅａ＋ｓ）社！ｆ！ｐ−メチルＢＨＡレジン（ｐ
−Ｍｅｔｈｙｌ　Ｂ　ＨＡ　　Ｒｅ５ｉｎ）　］を用い
た。また縮合反応においてし一グルタミン酸、１２−ア
ミノドデカン酸および１８−アミノオクタデカン酸はそ
れぞれ、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）ＯＳ−ベンジ
ル−し−グルタミン酸無水物、１２−（ｔ−ブトキシカ
ルボニルアミノ）ドデカン酸無てＦＡＢ法マススペクト
ルにより求められた分子量および塩酸を用いて加水分解
して得られた生成物のアミノ酸組成分析値をそれぞれ第
３表に示す。

第 表 括弧内の数字は理論値を示す。

第 表 （続き） 括弧内の数字は理論値を示す。

表（続き） 表（続き） 括弧内の数字は理論値を示す。

第 表（続き） 相合底および精製を行うことにより第４表に示すペプチ
ドを得た。ただし、固相用の樹脂として、実施例１７、
実施例１８および実施例２６では４″ｒ−（Ｎ−（ｔ−
ブトキシカルボニル）グリシルオキシメチルコフェニル
アセトアミドメチル基を０７８ミリモル／ｇ（樹脂）の
割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体［ス
チレンとジビニルベンゼンの構成比（モル比）＝９９対
１］からなる粒状樹脂［米国アプライド・バイオシステ
ムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製Ｐ
ＡＭ　　グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）　、　　ｔ　−Ｂ
ｏａ　−Ｇｌｙｌを用い、実施例１９、実施例２１、実
施例２４および実施例２８では４−［Ｎ−（ｔ−ブトキ
シカルボニル−０４＝ベンジル−α−Ｌ−アスバルチル
オキンメチル］フェニルアセトアミドメチル共重合Ｋ　
ヲ０．７８　ミルモル／ｇ（樹脂）の割合で有するスチ
レン−ジビニルベンゼン共重合体Ｅスチレンとジビニル
ベンゼンの構成比（モル比）：９９対ｌ］からなる粒状
樹脂し米国アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製ＰＡＭ　アスパラギ
１フェニルアセトアミドメチル基を０．７８ミリモル／
ｇ（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン
共重合体［スチレンとジビニルベンゼンの構成比（モル
比）＝９９対ｌ］からなる粒状樹脂［米国アプライド・
バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｔｏｓｙｓ＋ｔｅ
ｍｓ）社製ＰＡＭ　　グルタミン酸（Ｇ１ｕｔａａ＋ｉ
ｃ　ａｃｉｄ）　、　　ｔ　−Ｂｏａ　−Ｌ−Ｇｌｕ　
（ＯＢｚｌ）　］を用い、実施例２３、実施例２５およ
び実施例２７では４−［Ｎ’−（ｔ−ブトキンカルボニ
ル）Ｎ＠　　（クロロベンジルオキシカルボニル）−Ｌ
−リジルオキシメチル］フェニルアセトアミドメチル基
を０．７８ミリモル／ｇ（樹脂）の割合で有するスチレ
ン−ジビニルベンゼン共重合体［スチレンとジビニルベ
ンゼンの構成比（モル比）＝９９対１］からなる粒状樹
脂［米国アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔａ＋＊ｓ）社製ＰＡＭリジン（Ｌｙ
ｓｉｎｅ）　、　ｔ　−Ｂｏａ　−Ｌ−Ｌｙｇ　（Ｃ１
２−Ｚ　）　］を用い、また実施例２４〜３２ではα−
アミノ−ｐ−メチルベンジン基を０．７１１ミリモル／
ｇ（樹脂）の割合で宵するスチレン−ジビニルベンゼン
共電社製ｐ−メチルＢＨＡレジン（ｐ　−Ｍｅｔｈｙｌ
　Ｂ　ＨＡ　Ｒｅ５ｉｎ）　］を用いた。また縮合反応
においてＬ−グルタミン酸、１２−アミノドデカン酸お
よび１８−アミノオクタデカン酸はそれぞれ、Ｎ−（ｔ
−ブトキシカルボニル）　　Ｏ５−ベンジル−し−グル
タミン酸無水物、１２−　（ｔ−ブトキシカルボニルア
ミノ）ドデカン酸無水物および１８−（ｔ−ブトキシカ
ルボニルアミノ）オクタデカン酸無水物として用いた。

　得られたペプチドの精製物を分析用逆相高速液体クロ
マトグラフィーに付したところ、いずれも単一のピーク
が示された。それらの精製物についてＦＡＢ法マススペ
クトルにより求められた分子量および塩酸を用いて加水
分解して得られた生成物のアミノ酸組成物分析値をそれ
ぞれ表５に示す。

第 表 第 表 （続き） 括弧内の数字は理論値を示す。

表（続き） 表（続き） 括弧内の数字は理論値を示す。

第 表（続き） 括弧内の数字は理論値を示す。

実施例３３および３４ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式Ｈ−Ｇ［Ｙ−Ｐｈｅ　−
Ｌｙｓ　−Ｈｉｓ　−Ｐｈｅ　−Ｖａｌ−Ｔｙｒ　−Ｔ
ｙｒ　−Ｔｈｒ−Ｏｌｌで示されるペプチド（実施例３
３）および式８式％ を得た。ただし、固相用の樹脂として、４−［Ｎ（ｔ−
ブトキシカルボニル）−０’−ベンジン−α−Ｌ−アス
パルチルオキシメチル］フェニルアセトアミドメチル基
を０．７８　ｔリモル／ｇ（ｍ脂）社製ＰＡＭ　アスパ
ラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ）、ｔＢ　−Ｂ
ｏｃ　−Ｌ　−Ａｓｐ　（０Ｂｚｌ）　］を用いた。

１得られたペプチドの精製物を分析用逆相高速液体クロ
マトグラフィーに付したところ、いずれも量および塩酸
を用いて加水分解して得られた生成物のアミノ酸組成分
析値をそれぞれ第６表に示す。

インＣＨ）ｌｏｇを懸濁し、得られた懸濁液にＮ−ヒド
ロキシコハク酸イミド０．５ｇおよびジシクロへキシル
カルボジイミド１．ｏｇを加え、混合物を室温下で１晩
振盪撹拌した。得られた混合物を０．０２モル／Ｑのリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ：　７．４）で洗浄し、吸引濾過し
た。得られた粒子を、実施例１で得られたペプチドの２
０１１Ｅを含有する０、０２モル／Ｑのリン酸塩緩衝液
（ｐＨ：　７．４）　２０−と混合し、この混合物を４
℃の温度でｌ晩撹拌した。得られた混合物を吸引が過し
た。１戸液を分析用逆相高速液体クロマトグラフィーに
付したが、残存する未反応のペプチドは認められなかっ
た（担体上のペプチドの固定化率：約１００％）。この
ようにして、実施例１で得られたペプチドの２０ｍｇが
固定化されたセルロース粒子を約ｌａｇ得た。

（ｂ）　　上記のようにして得られたペプチドが固定化
されたセルロース粒子の１ｇずつを、塩化ナトリウムを
０．１５モル／Ｑ金含有る０、０２モル／Ｑのリン酸塩
緩衝液（ｐＨ・７．４）５−中に懸濁し、オートクレー
ブ滅菌器中で加圧下で１２１　’Ｃの１度で２０分間熱
−クレオニクス（１：１ｅｃｊｒｏ−ｎｕｃｌｅｏｎｉ
ｃｓ）社製ＣＰ　Ｇ　−１０−１０００コｌｏｇを、γ
−アミノプロピルトリエトキシシラン５−含有するトル
エン溶ｉ＆１ｏｏａ＋Ｉ２中で２４時間加熱還流下に反
応させた。得られた混合物を、金属ナトリウムの存在下
で蒸留することによって得られたジオキサンで洗浄し、
吸引が過した。得られた粒子を、金属ナトリウムの存在
下で蒸留することによって得られたジオキサン１０〇−
Ｑ中に懸濁し、この懸濁液に無７にコハク酸３ｇを加え
、混合物を室温下で１晩撹拌した。得られた混合物を、
金属ナトリウムの存在下で蒸留することによって得られ
たジオキサンで洗浄し、吸引が過した。得られた粒子を
、金属ナトリウムの存在下で蒸留することによって得ら
れたジオキサン５０ａ＋Ｑ中に懸濁し、この懸濁液にＮ
−ヒドロキンコハク酸イミド０．５ｇおよびジシクロへ
キシルカルボジイミド１０ｇを加え、混合物を室温下で
１晩撹拌した。

得られた混合物を０．０２モル／Ｑのリン酸塩緩衝液（
ｐＨ：　７．４）で洗浄し、吸引濾過した。得られた粒
子を、実施例３で得られたペプチド２０Ｂを含有ラス粒
子を約１０ｇ得た（ペプチドの固定化率：約１００％）
。

（ｂ）　　上記のようにして得られたペプチドが固定化
された多孔性ガラス粒子のＩｇをペプチドが固定化され
たポリビニルアルコール粒子１ｇの代りに用いる以外は
参考例２（ｂ）におけると同様な方法により、吸着剤を
得た。

参考例４〜１６ （ａ）　　第７表に示すペプチドの２０ｍｇを用いる以
外は参考例！　（ａ）、参考例２（ａ）または参考例３
（ａ）のいずれかにおけると同様な方法によりペプチド
が固定化された粒子状担体をそれぞれ得た。使用した粒
子状担体および担体上へのペプチドの固定化率をそれぞ
れ第７表に示す。

（ｂ）　　上記のようにして得られたペプチドが固定化
された粒子状担体の１ｇを参考例２（ａ）で得られたペ
プチドが固定化されたポリビニルアルコール粒子１ｇの
代りに用いる以外は参考例２（ｂ）におけると同様な方
法により、吸着剤をそれぞれ得た。

第 実施例　５で得られたちの 実施例　６で得られたちの 実施例　７で得られたちの 実施例　８で得られたもの 実施例　９で得られたちの 実施例１Ｏで得られたちの 実施例１１で得られたちの 実施例１２で得られたちの 実施例１３で得られたちの 実施例１４で得られたもの 実施例１５で得られたちの 表 セルロース粒子　　　　　　約　９７ セルロ一ス粒子　　　　　　約１００ ポリビニルアルコール粒子約９４ ポリビニルアルコールｔｎ子約９６ セルロース粒子　　　　　　約　９４ セルロ一ス粒子　　　　　　約　９９ セルロ一ス粒子　　　　　　約　９９ セルロ一ス粒子　　　　　　約　９８ ポリビニルアルコ一ルｆｎ子約９２ ポリビニルアルコール粒子約１００ 多孔性ガラス粒子　　　　　約　９６ ＣＭ−セルロファインＣＨ ポリビニルアルコール粒子；東ソー株式会社製ＣＭ−ト
ヨパール６５０Ｃ 多孔性ガラス粒子：米国エレクトロ一二ュークレオニク
ス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）社製ＣＰ
Ｇ−１０−１０００参考例１７ （ａ）　　参考例１　（ａ）において実施例１で得られ
たペプチド２Ｑ＋ｉｇの代りに実施例３３で得られたペ
プチド２０ｍｇを用いる以外は同様な方法により、実施
例３３で得られたペプチドの１５．０ｍｇが固定化させ
たセルロース粒子を約ｌｏｇ得た（ペプチドの固定化率
：約７５％）。

（ｂ）　　上記のようにして得られたペプチドが固定化
されたセルロース粒子の１ｇをペプチドが固定化された
ポリビニルアルコール粒子ｔｇの代りに用いる以外は参
考例２（ｂ）におけると同様な方法により、吸着剤を得
た。

参考例１８ （ａ）　　参考例２（ａ）において実施例２で得られた
ペプチド２０ｍｇの代りに実施例３４で得られたペプチ
ド２０ｍｇを用いる以外は同様な方法により、実施例３
４で得られたペプチドの１５．２Ｂが固定化された、、
、！！ポリビニルアルコール粒子約ｌｏｇ得た（ベブチ
１ドの固定化率・約７６％）。

（ｂ）　　上記の固定化操作に付して得られたポリビニ
、ルアルコール粒子の１ｇを参考例２（ａ）で得られた
；ペプチドが固定化されたポリビニルアルコール粒子１
ｇの代りに用いる以外は参考例２（ｂ）におけると同様
な方法により、吸着剤を得た。

参考例１９〜３４ 第８表に示すペプチドを３０ｍｇ用いる以外は参考例１
　（ａ）、参考例２（ａ）または参考例３（ａ）のいず
れかにおけると同様な方法によりペプチドが固定化され
た粒子状担体をそれぞれ得た。使用した粒子状担体およ
び担体上へのペプチドの固定化率をそれぞれ第８表に示
す。

（ｂ）　　上記のようにして得られたペプチドが固定化
された粒子状担体の１ｇを参考例２（ａ）で得られたペ
プチドが固定化されたポリビニルアルコール粒子１ｇの
代りに用いる以外は参考例２（ｂ）におけると同様な方
法により、吸着剤をそれぞれ得た。

第 ｍ−２３実施例２１で得られたもの ２４　　実施例２２で得られたもの ２５　　実施例２３で得られたもの ２６　　実施例２４で得られたもの ２７　　実施例２５で得られたもの ２８　　実施例２６で得られたもの ２９　　実施例２７で得られたもの ３０　　実施例２８で得られたもの ３１　　実施例２９で得られたもの ３２　　実施例３０で得られたもの ３３　　実施例３１で得られたちの 表 セルロース粒子 セルロース粒子 ポリビニルアルコール粒子 ポリビニルアルコール粒子 セルロース粒子 セルロース粒子 セルロース粒子 セルロース粒子 ポリビニルアルコール粒子 ポリビニルアルコール粒子 多孔性ガラス粒子 約９８ 約１００ 約９５ 約９５ 約９５ 約９８ 約１００ 約１００ 約９０ 約ｉｏ。

約９５ ＣＭ−セルロファインＣＨ ポリビニルアルコール粒子：東ソー株式会社製ＣＭ−ト
ヨバール６５０Ｃ 多孔性ガラス粒子・米国エレクトロ一二ュークレオニク
ス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）社製ＣＰ
　Ｇ　−１０−１０００試験例１ 重症筋無力症患者の血清０．５−に参考例１で得られた
吸着剤５０Ｂを加え、３７℃の温度で３時間懸濁させた
。得られた懸濁物を遠心分離し、上清を渇た。得られた
上清中におけるニコチン性アセチルコリンレセプターに
対するヒト抗体の濃度をＣｏｎ　Ａ法［蛋白質核酸酵素
、第２６巻、第１５７８−’１５９１頁（１９８１年）
など参照］により求めた。すなワチ、被検液をニコチン
性アセチルコリンレセプターおよび放射線標識したα−
ブンガロトキシンと順次接触させ、得られた処理液をコ
ンカナバリン、Ａ（Ｃｏｎ　Ａ）を固定化さたセファロ
ース（（Ｓ″６ｐｈ３ｒｏｓｅ）を充填したカラムに通
したのちカラムの放射活性を計測することによって、該
被検液中に含まれていたα−ブンガロトキシンとニコチ
ン性アセチルコリンレセプターとの結合を阻害するヒト
抗体の量をトキシン結合阻害活性度（カラムの放射活性
の減少率）として定量した。結果を第９表に示す。なお
、比較のために、参考例１（ａ）で得られたペプチドが
固定化されたセルロース粒子（熱処理せず）を使用した
場合に得られた結果、ならびに実施例！で得られたペプ
チドの代りにグリシンを用いる以外は参考例１（ａ）に
おけると同様な方法により得られたグリシンが固定化さ
れたセルロース粒子、およびこのグリシンが固定化され
たセルロース粒子をペプチドが固定化されたセルロース
粒子の代りに用いる以外は参考例＋　（ｂ）におけると
同様な方法により１２１℃で熱処理して得られた吸着剤
を使用した場合に得られた結果をあわせて第９表に示す
。

試験例１において参考例１で得られた吸着剤の代わりに
参考例２〜１８で得られた吸着剤を用いる以外は同様な
方法により、血清の懸濁処理を行い、得られた上清中に
おけるニコチン性アセチルコリンレセプターに対するヒ
ト抗体の１度を求めた。得られた結果を第１０表に示す
。なお、試験例１で比較のために使用したものと同じグ
リシンが固定化されたセルロース粒子を１２　ｔ　’ｃ
で熱処理して得られた吸着剤を使用した場合に得られた
結果を第１θ表にあわせて示す。

１実施例１で得られたペプチド　　　８０２８一実施例
１で得られたペプチド　　　ｔｏｏ　　　　　　２４、
実施例１で得られたペプチド　　　１２１　　　　　２
０４−グリシン 熱処理せず 試験例２ 参考例 参考例 参考例 参考例 参考例 参考例 参考例 参考例 参考例１ 参考例１ 参考例１ 参考例１ 参考例１ 参考例１ 参考例１ 参考例１ 第 表 ２で得られたもの ３　　　〃 ４　　　〃 ５　　　〃 ６　　　〃 ７　　　〃 ８　　　〃 ９　　　〃 ０　　　〃 １　　　〃 ２　　　１／ ３　　　〃 ４　　　〃 ５　　　〃 ６　　　〃 ７　　　〃 試験例３ 試験例１において参考例１で得られた吸着剤の代りに参
考例１９〜３４で得られた吸着剤を用いる以外は同様な
方法により、血清の懸濁処理を行い）、得られた上清中
におけるニコチン性アセチルコ１リンレセプターに対す
るヒト抗体の濃度を求めた。得られた結果を第１１表に
示す。試験例１で比較のために使用したものと同じグリ
シンが固定化されたセルロース粒子を１２１　’Ｃで熱
処理して得られた吸着剤を使用した場合に得られた結果
を第１１表にあわせて示す。

参考例２１ 参考例２２ 参考例２３ 参考例２４ 参考例２５ 参考例２６ 参考例２７ 参考例２８ 参考例２９ 参考例３０ 参考例３１ 参考例３２ 参考例３３ するヒト抗体を有効に吸着する能力を有する吸着剤を効
率的に製造するために有用な新規なペプチドが提供され
る。

特許出願人　工業技術院長　飯塚　十三［発明の効果］

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一般式 Ｈ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ａ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｂ−Ｖａｌ−Ｔ
   ｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓ
   ｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｙ−Ｚ ［式中、ＡおよびＢはそれぞれＰｈｅまたはＴｙｒを表
   わし、ＸおよびＹはそれぞれ単結合を表わすか、または
   Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓおよび式▲数式、化学式、表等
   があります▼（式中、ｎは１〜１７の整数を表わす。）
   で示される二価の基からなる群から選ばれるアミノ酸残
   基もしくは該群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸
   残基の２〜１０個がペプチド結合によつて形成するペプ
   チド残基を表わし、Ｚは水酸基またはアミノ基を表わし
   、上記アミノ酸配列のＣｙｓ−Ｃｙｓにおいて各々のＣ
   ｙｓが有するメルカプト基は相互に結合してジスルフィ
   ド結合を形成していてもよい。］で示されるペプチド。