JPH02167222A

JPH02167222A - 蛋白質の架橋による微小球体の製造方法、得られた微小球体及びその用途

Info

Publication number: JPH02167222A
Application number: JP1210801A
Authority: JP
Inventors: Josiane Allec; ジョシアーヌ、アレク; Godail Florence; フロランス、ゴダイユ; Jean-Claude Jamoulle; ジァン・クロード、ジァムール; Shroot Braham; ブラハム、シュルート
Original assignee: Centre International de Recherches Dermatologiques Galderma
Current assignee: Galderma Research and Development SNC
Priority date: 1988-08-17
Filing date: 1989-08-17
Publication date: 1990-06-27
Also published as: FR2635459A1; DE3927073A1; IT1232917B; ES2018638A6; IT8967705A0; GB2224258B; FR2635459B1; GB8918720D0; GB2224258A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は微小球体の製造方法とかくして得られる微小球
体の用途とに関する。

蛋白質は微小球体重たはマイクカプセルの’ＩＪ　造の
ため広く使用されて来た。得られる微小球体重たはマイ
クロカプセルは、特に薬剤中で、例えば徐放薬物の調製
用または特別な器官への薬物導入のための賦形薬として
用いられている。

微小球体またはマイクロカプセルの乳濁液中での僑かけ
方法は既知であり、それによれば蛋白質は２官能性反応
物例えばグルタルアルデヒド渣たは酸ツクロリドにより
橋かけされる。これらの方法によれば、２官能性反応物
は橋かけされた蛋白質中に残留して橋を形成する。この
方法は蛋白質問に人工的スペーサーを導入すると云う不
利な点を持っている。

更に、カルボキシル基とアミノ基との間の反応は）カル
ボジイミド釦よび（１次は）スクシンイミド誘導体によ
って活性化されることが知られている。特に、蛋白質の
カルボキシル基と遊離アミノ基との反応による蛋白質の
橋かけを活性化させるために、これらの化合物が提案さ
れてきた。この場合インペプチド型の直接的な橋がつく
られる。

この型の橋かけは、スポンゾまたはシート形のコラーケ
°ンに基く、橋かけされたマトリックス製造に関する国
際出願第■８５１０４４１３号に記載されている。この
方法によれば、作業は水性相中で行われ、クラーク９ン
を）カルボジイミド釦よび（ｔたは）２官能性スクシン
イミソルエステルと接触させ、後、その混合物を高温で
加熱してコラーケ゛ンに基く槁かけされたマトリックス
を得゛る。フランス特許出願第Ａ　２，２８０，３５２
号は、ポリスチレンラテックスの不活性粒子を含有する
緩衝されている水性媒質中、）カルボジイミド存在の下
で毒素蛋白質を橋かけし、後、その混合物を加熱渣たは
室温に放置して、ポリスチレンラテックスに吸収された
橋かけ蛋白質を得た。

前記文書中には、乳濁液の形で反応を行ったものはない
し、均一な微小球体を得ているものはない。

本出願によれば、活性化剤としての）カルボジイミド存
在の下、乳化法により、インペプチド型の直接的な橋の
形成により、蛋白質から微小球体を調製できることが発
見された。この微小球体の有利な点は、若し放出される
と生物学的に有害または刺激性であるかもしれない反応
物と蛋白質とを共有結合で結合させていないことである
。従って本発明によれば、必然的に蛋白質問にスペーサ
ーが存在すると云う先行技術の不利さが回避される。

従って、本発明は、連続相が界面活性剤が添加されてい
る有機溶剤からなり、不連続相が少くとも１つの蛋白質
を含有する親水性液体相からなる乳濁液を攪拌し乍ら調
製し、カルボジイミドを前記乳濁液に添加して、蛋白質
の橋かけを活性化し、微小球体の沈澱物を得、前記沈澱
物を分離し、洗浄することを特徴とする、乳濁液中での
橋かけによる蛋白質微小球体の製造方法に関する。

連続相に添加する界面活性剤はこの相に可溶で、乳濁物
を、その親水相が有機相に分散するように配向させる。

この界面活性剤は、例えばソルビ、メンエステルであっ
てもよい。

第１の態様によれば、不連続液体相は水性相であり、そ
の場合、蛋白質と）カルボジイミドとは前記水性相に溶
解している。その水性相は好さしくは限定されたｐＨの
緩衝溶液である。カプセル化金所望する水溶性製品は、
若し適当ならばこの水性相に溶解させる。活性素の溶解
を可能にさせる溶解剤は、若し適当ならば添加してもよ
い。

第２の態様によれば、不連続液体相は水性相と水に混合
する有機溶剤との混合物である。後者は好１しくはジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ　）である。事実、その高い
溶剤力によって、ＤＭＦは水に不溶の分子を溶解させる
ことができ、水に不溶の製品、例えば薬物のカプセル化
を可能にする。

こうしてカプセル化する製品をその有機溶剤を含有する
混合物中に溶解させておくことができる。

還元剤例えばノチオエリトリトールの不連続相−＼の添
加は収率を改善する。

微小球体を形成させるのに用いられる蛋白質はペプチド
型の橋を形成できるどんな蛋白質でもよい。また異る蛋
白質の混合物を用いることもできる。それには、人、動
物または植物由来の蛋白質、例えば酵素、キャリヤー蛋
白質（ヘモグロビンまたは血清アルブミン）、栄養蛋白
質（オバルビンまたはカゼイン）、構造蛋白質（ケラチ
ン、Ｉｎ、ｍｔたは■型のコラーゲンあるいはゼラチン
）、成る種の防衛または抗体蛋白質′または免疫開票蛋
白質および種種な他の蛋白質例えば毒素、膜受容体ある
いはホルモンを挙げてもよい。更に特別には、血清アル
ブミンとリゾチームとが用いられる。

これらの橋はイソペプチド型であり、蛋白質のＮＨ２基
とＣ０ＯＨ基との反応により得られる。ＳＨ基またはＯ
Ｈ基も！たＣ０ＯＨ基と橋を形成することができる。

連続相を構成する溶剤は不連続相と混合しない疎水性溶
剤または疎水性溶剤の混合物である。特に、脂肪族Ｃ５
〜Ｃ１０炭化水素または環式脂肪族Ｃ５〜Ｃ８炭化水素
、更に特別にはシクロヘキサンを用いる。渣た、ポリシ
ロキサン例えばヘキサメチルノシロキサンまたは紙粘度
かまたは流体であるポリメチルシロキサンお・よびポリ
ツメチルシクロシロキサンも用い得る。

橋かけ反応活性化剤として用いられるカルボッイミドは
構造式％式％（この式で、ＲとＲ′とは同一または異り、Ｈ１分枝ま
たは分枝してない脂肪族ＣＩ　−Ｃ１０基、ヘテロ原子
を含有していても、いなくてもよい環式脂肪族基または
芳香族基である）で表わされる。これらの基は反応副生成物の溶解を可能
にする、１つ１次はそれ以上の酸性または塩基性置換基
を持っていることができる。更に特別には１−エチル−
３−（３−ソメチルアミノフ０ロビル））カルボジイミ
ド塩化物、以下ＥＤＣ１，ＨＣｔと記す、を用いる。

好ましい態様によれば、活性化剤としてのカルボジイミ
ドに加えて、触媒を用いることができる。

この触にはスクシンイミド、特別にはＮ−ヒドロキシス
クシンイミドである。触媒は蛋白質と共に不連続相中に
導入する。蛋白質の橋かけを）カルボジイミドとＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドとの存在の下に行う場合、その
橋かけ反応を第１図１に示すごとく画くことができる。

この反応は明らかに、）カルボジイミドは橋の形成に関
与していないことを示していて、それは引続き簡単な洗
浄により除去できる尿素誘導体に変わる。

その反応の終に微小球体の沈澱物が得られ、繰返し水で
洗浄し１副生成物例えば）カルボジイミドから誘導され
る尿素を除去するか、あるいは、特にその微小球体がカ
プセル化されている薬物を含有し、その薬物を抽出した
くない場合には適当な水性の緩衝液で洗浄する。

若し必要ならば、洗浄を２段階で行うことが出来る。副
生成物例えばカルボシイミドおよびＮ−ヒドロキシスク
シンイミドから誘導される尿素を除去するために行う水
での洗浄に加えて、不連続液体相と混合しない連続相を
除去するために水での洗浄の前または後で、無水溶剤で
の洗浄、例えばエチルアルコールでの洗浄を加えてもよ
い。

洗浄後得られる球体は乾燥、適当ならば凍結乾燥し、必
要ならば還元媒質中・ぞ−コール勾配によって精製する
。乾燥球体中に尿素が存在しないことはクロマトグラフ
ィー分析によυ点検できる。

洗浄後得られる微小球体はその微小球体により固定した
い物質の溶液と接触させることができる。

固定に必要な接触時間の後、微小球体を洗浄し、乾燥す
る。

使用される反応物の量は作業条件に従って変えることが
できる。次の例を挙げてもよい。

１、水性不連続相を用いるアルブミンの場合：蛋白質５
００ｍｇ当シＥＤＣ１，ＨＣｔ２００〜６００■用いる
。

２、水中ＩＭＦ’２０重ｉ優で構成される不連続相を用
いるアルブミンの場合：蛋白質５００１！？当りＥＤＣ
Ｉ。

ＨＣｌ　２００〜６００８９用いてもよい。

微小球体製造温度は一般に２〜４０℃で、反応時間は変
えることができ、少くとも５時間である。

本発明は筐た新製品として、イ′ソペプチド型の橋だけ
で橋かけされている１つまたはそれ以上の蛋白質の微小
球体に関し、その微小球体は例えば前記して定義した方
法で潜られる。

得られる微小球体の特性は使用蛋白質の型、不連続相の
本性および使用した反応物の量に従って異ってもよい。

表１は微小球体が異る機械的および物理化学的挙＠を持
つことができることを示している。更に、選択した不連
続相によって、得られる微小球体は消化酵素によ、り多
かれ少がれ劣化される。それ故、多かれ少かれ生分解さ
れる微小球体が期待される適用の型に従って得られても
よい。　　　　　　　　　　　　表　　１蛋白質の等電
点に従い反応媒質のｐｌＩｆ、選ぶことにより、正電荷
重たは負電荷を持つ微小球体を得ることができる。こう
して、本発明に従う微小球体はイオン性の製品例えば薬
物をカプセル化または固定することができる。

得られる微小球体の直径は３μｍから１朋１で変り得る
。得られる微小体の寸法は攪拌の速さと用いられる乳化
システムとに左右される。超音波を用いることにより、
１０μｍ以下の直径を持つ微小球体を高い百分率で得ら
れるかもしれない。また外部有機相中に適当な安定化剤
を導入することにより小さい直径の微小球体余得ること
ができる。

本発明に従う微小球体は数多くの応用をもつ。

荷電を持たない微小球体はマッザーヅ用または皮膚清浄
のため化粧賦形薬中に組入れることができる。この場合
、微小球体ならびに生物学的本質の類似物例えば角膜細
胞の完全に蛋白質的性質が科用される。荷電をもたない
微小球体はまた乾燥薬剤形式中卦よび経口投与すること
ができる組成物中の希釈剤ｌたは流動化剤としても用い
られる。

微小球体は薬学的、化粧品的または生物学的活性を持っ
ている化合物を含有させるために用いることができる。

特にそれは、薬物例えば消毒剤、抗真菌剤、抗菌剤、抗
炎症剤、レチノイドまたはアントラノイド、化粧剤例え
ば頭髪染料または日光フィルターあるいは生活性物質用
の賦形薬として役立てることができる。製品は微小球体
製造時にカプセル化することもできるし、微小球体のイ
オン性を考慮して、カプセルになっている製品の溶液に
微小球体を浸すことにより固定することもできる。

微小球体は不安定な薬物を保護できる。それは特別な皮
膚の訴え例えば成るしたたる様な条件の場合局所的に適
用できる。

薬物を持っている微小球体はまた全身的に投与すること
もできる。

微小球体組成物にふ・いては、球体に生物学的（免疫学
的または酵素的）性質を与える特別な蛋白質を含ませる
こともできる。

微小球体は着色剤を持つことができメイクアラｆ製品に
用いられることができる。

以下に与えられる例は純粋に説明として、何畳限定を意
味することなく、本発明の理解を一層よくさせる。

実施例１　マツサージクリーム次の処方で製造される。

橋かけされているアルブミン微小球体１００　ｐｍ　（φ（２００Ｍ　ｍ　　　　　　　　７
．００７で販売されるもの　　　　　　　　　　　　　
　　　　３７．００　ｆメチルパラ−ヒドロキシベンゾ
ニー）　　　　　　　　　０．０７　　Ｆプロピル　・
ぞラーヒドロキシベンゾエート　　　　　　０．０８　
　ｆ無菌水　　　　　　　　　５５．８５　ｒ均一な外
観をもつ比較的濃厚なりリームを得る。

適用の場合、クリームは脂様の肌合いを持ち、微小球体
は皮膚上で見分けられ、マッサーソ効果を増強する。

実施例２　皮膚清浄クリーム次の処方で製造する。

セチルステアリルアルコール５．００　　ｆセチルステアリルアルコール　　　　　　　　　　　０
．３０　ｆセチルアルコール　　　　　　　　　　　　
　　　　１．５Ｏｒグリセロールモノステアレート　　
　　　　　　　　２．００　　ｆワセリン油　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　６．００　　ｔノテ
ルパラーヒドロキシペンゾエートｏ、ｏｓ　　ｒプロピ
ル・ぐラーヒドロキシベンゾエート　　　　　　０．０
７　　ｆシリコーン油　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１．００　　ｒ無菌水　　　　　　　　　７７
．３５　ｆ皮膚の手入れに用いることができる滑らかな
りリームを得る。微小球体は見分けられるが、その構造
から軟い感触である。

実施例３　キナクリンを持つ微小球体金含有するゼラチ
ンカプセルキナクリ／は通常経口的に投与される駆虫剤であり、抗
マラリア剤である。本実施例に従い、キナクリンを徐放
てきるような微小球体中に持たせて薬学的組成物を製造
することを提案する。キナクリンを持つ微小球体は各微
小球体５００すを含有するゼラチンカプセルの形で提供
される。

問題の微小球体の調製には、キナクリン塩酸塩５０１ｇ
、ついでアルブミン５０ＯＮｇを水２　ｍｌ　Ｋ　溶解
する。それから全体を、Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ社から
ＦｌｕｉｄＤｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　３４４の名の下に
販売され、ｃｙｃ　１　ｏｍｅｔｈｉｃｏｎｅの名で（
以下これを用いる）表はされるこの揮発性シリコ−７に
、商品名５ｐａｎ　８５の下にＩＣＩ社で販売されてい
るソルビタントリオレエートを５重量φ添加したポリツ
メチルシロキサン２０ｍ１中で、実施例４に記載の条件
下に３分間乳化する。ＥＤＣｌ、ＨＣｔ６００　ｍｙを
水１　ｍｌに溶解シ、前’Ｆ＋ｔｔＤ乳濁液を添加する
。橋かけ工程を、攪拌しながら光−′？ｉｌ−遮断して
１２時間続ける。橋かけ終了時、微小球体は強い黄色沈
澱物の形で得られ、遠心分離し、水４０　ｍｌで洗浄し
、凍結乾燥する。

顕微鏡の下で観察すると、凍結乾燥した製品はよく分離
された形の微小球体で、実質的に、微小球体の外側には
結晶を見ることができない。総状率は使用蛋白質重量に
対し７５重ｉｔ％であり、微小球体中のキナクリンのカ
プセル化収率は１重量多である。

実施例４メチレン青を水性不連続相中のアルブミン微小球体中に
カプセル化する。メチレン青２（ｌｙと血清アルブ□ン
５００Ｑとを水２ｍｌ中に溶解し、全体を、５ｐａｎ　
８５　５ｌｉ％添加したＣｙｃ　ｌｏｍｅｔ１１ｉｃｏ
ｎｅ１５　ｍｌ中で乳化する。錨型羽根をもつ攪拌機を
つけ、それを５００回転／分の速さで回転させている、
加ｍｌのフラスコ中で乳濁液を製造する。３分間攪拌後
ＥＤＣ１，ＨＣｔ３００　Ｍｙを含有する水性溶液１　
ｍｌを添加する。この橋かけ工程を一定の攪拌の下、外
部相の蒸発を避けながら５時間続ける。５時間後、得ら
れた微小球体は強い青色の沈澱物の形で、それを遠心分
離し、エタノールで１回、次いで水で２回洗浄する。そ
の洗浄はメチレン青の放出を制限するよう非情に速に行
う。それから微小球体を凍結乾燥する。カプセル化され
たメチレン青の収率は、水性媒質中でその微小球体を磨
砕した後、λ＝　６５５．８　ｎｍ　の分光測光測定に
より測定される。

カプセル化されたメチレン青の収率は微小球体の全重量
に対し１ｌｉ％である。

実施例５メチレン青を無水不連続相中で血清アルブミン中に閉じ
込める。メチレン青（２０ｍｙ　）とＮ−ヒドロキシス
クシンイミド（１（ｌｉとをツメチルフォルムアミド２
　ｍｌ中に溶解する。それに血清アルブミン（５００１
１ｇ）を添加し、超音波タンク中で３分間分散する。全
体を実施例４と同じ作業条件で、５ｐａｎ　８５を５ｉ
量嘩添加しであるＣｙｃｌｏｍｅｔｈ　１ｅｏｎｅ１５
　ｍｌ中に乳化する。ＥＤＣｌ、ＨＣｔｌｏ　１１９　
ｋノメチルホルムア□ド１　ｍｌに溶解し、それからそ
の乳濁液に導入する。橋かけ、洗浄、凍結乾燥によびカ
プセル化されたメチレン青の収率の測定は実施例４にお
けると同様に行う。カプセル化されたメチレン青の収率
は０．５の重量餐である。

水中でのメチレン青放出についての曲＃５！を実施例４
と５との微小球体について比較した。第２図に示す曲線
は、メチレン肯の百分率放出量を分で表わした時間の関
数として示している。曲線１は水中ＥＤＣ１，ＨＣ２の
使用、曲線２はジメチルホルムアミド中ＥＤＣＩ　、Ｈ
Ｃｌの使用に対応している。

メチレン青の放出が不連続水性相を用いて製造したアル
ブミン微小球体の場合非常に遅らされていることが判か
ろう。メチレン青の半量は、無水相中で製造した微小球
体の場合２分間で放出され、水性相中で製造された微小
球体の場合お分間かかつて放出されている。

両方の微小球体の場合、メチレン青の９０φ以上は９０
分後に放出されている。

【図面の簡単な説明】

第１図はカルボッイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドの存在下にｋける蛋白質の架橋反応を説明する線図的
説明図であり、第２図は水中でのメチレン青放出曲線を
示す線図的説明図である。 α／−一一一＼＼

Claims

【特許請求の範囲】

（１）界面活性剤を添加した有機溶剤から成る連続相と
少くとも１種の蛋白質を含有する親水性液体相から成る
不連続相とから成る乳濁液をかきまぜによつて調製し、
得られた乳濁液にカルボジイミドを添加して架橋を活性
化しそして微小球体の沈澱物を得、そして前記沈澱物を
分離し洗浄することを特徴とする、乳濁液中での架橋に
よる蛋白質微小球体の製造方法。
（２）連続相に添加する界面活性剤がソルビタンエステ
ルである前項（１）に記載の方法。
（３）不連続相が水性相である前項（１）または（２）
に記載の方法。
（４）水性相が限定されたｐＨに緩衝されている前項（
３）に記載の方法。
（５）不連続相が水と混合し得る有機溶剤と水性相との
混合物である前項（１）または（２）に記載の方法。
（６）有機溶剤がジメチルホルムアミドである前項（５
）に記載の方法。
（７）カプセル化される製品が不連続相中に溶解されて
いる前項（３）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）不連続相に還元剤を添加する前項（１）〜（７）
のいずれかに記載の方法。
（９）連続相を構成する溶剤が不連続相と混合しない溶
剤である前項（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）連続相を構成する溶剤が脂肪族Ｃ＿５＿〜＿１
＿０炭化水素または環式脂肪族Ｃ＿５＿〜＿８炭化水素
である前項（９）に記載の方法。
（１１）連続相を構成する溶剤がシクロヘキサンである
前項（１０）に記載の方法。
（１２）連続相を構成する溶剤がポリシロキサンである
前項（９）に記載の方法。
（１３）カルボジイミドが構造式Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′ （この式で、ＲとＲ′とは同一または異つていて、Ｈ、
分枝状または非分枝状の脂肪族Ｃ＿１〜Ｃ＿１＿０基、
ヘテロ原子を含有するまたは含有していない環式脂肪族
基、または芳香族基であり、これらの基は１つまたはそ
れ以上の酸性または塩基性置換基を持つていることがで
きる）で表わされる、前項（１）〜（１２）のいずれかに記載
の方法。
（１４）カルボジイミドが１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミドである前項（１３
）に記載の方法。
（１５）活性化剤の他に触媒を導入する前項（１）〜（
１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）触媒がスクシンイミドである前項（１５）に記
載の方法。
（１７）触媒がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである前
項（１６）に記載の方法。
（１８）微小球体沈澱物を水または緩衝液の何れかで洗
浄するか、１つの段階は水での少くとも１回の洗浄から
なり、他の段階は無水の溶剤での洗浄からなる２段階で
洗浄する前項（１）〜（１７）のいずれかに記載の方法
。
（１９）無水の溶剤がエチルアルコールである前項（１
８）に記載の方法。
（２０）少くとも１つの活性物質を微小球体中に組入れ
る前項（１）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）微小球体への活性物質の組入れを、架橋工程の
後で、前記微小球体を、組入れるべき活性物質を含有す
る溶液中に浸すことにより行う前項（２０）に記載の方
法。
（２２）微小球体への活性物質の組入れを、微小球体を
製造する際に達成させる前項（２０）に記載の方法。
（２３）前項（１）〜（１９）のいずれかに記載の方法
により得られる、イソペプチド型の架橋により架橋され
た、１種またはそれ以上の蛋白質の微小球体。
（２４）前項（２０）〜（２２）のいずれかに記載の方
法により得られる、イソペプチド型の架橋により架橋さ
れた、１種またはそれ以上の蛋白質の微小球体。
（２５）前項（２３）に記載の微小球体の、経口投与で
きる組成物中でのおよび乾燥した薬学的形態での、希釈
剤または流動化剤としての使用。
（２６）薬学的、化粧品学的または生物学的活性を持つ
化合物を含有させるための、前項（２４）に記載の微小
球体の使用。