FR2635459A1

FR2635459A1 - Procede de fabrication de microspheres par reticulation de proteines, microspheres ainsi obtenues et leurs utilisations

Info

Publication number: FR2635459A1
Application number: FR8810942A
Authority: FR
Inventors: Josiane Allec; Braham Shroot; Florence Godail; Jean-Claude Jamoulle
Original assignee: Centre International de Recherches Dermatologiques Galderma
Current assignee: Galderma Research and Development SNC
Priority date: 1988-08-17
Filing date: 1988-08-17
Publication date: 1990-02-23
Anticipated expiration: 2008-08-17
Also published as: GB2224258A; ES2018638A6; FR2635459B1; JPH02167222A; DE3927073A1; GB2224258B; GB8918720D0; IT8967705A0; IT1232917B

Abstract

Procédé de fabrication de microsphères de protéines par réticulation en émulsion dans lequel on ajoute à l'émulsion un carbodiimide pour activer la réticulation. On obtient des microsphères de protéine(s) réticulée(s) par un pontage de type isopeptidique. Ces microcapsules peuvent être utilisées pour conditionner des composés à activité pharmaceutique ou cosmétique.

Description

PROCEDE DE FABRICATION DE MICROSPHERES PAR

RETICULATION DE PROTEINES, MICROSPHERES AINSI

OBTENUES ET LEURS UTILISATIONS.

La présente invention concerne un procédé de fabrication de microsphères par réticulation de protéines, les microsphères ainsi obtenues et leurs utilisations. Les protéines ont été largement utilisées pour la fabrication de microsphères ou microcapsules. Les

microsphères ou microcapsules obtenues sont, en parti-

culier,utilisées en pharmacie, par exemple pour la fabrication de médicaments retard ou pour servir de vecteur à l'introduction de médicaments dans

un organe précis.

On connaît des procédés de réticulation en émulsion de microsphères ou de microcapsules dans lesquels la protéine est réticulée à l'aide d'un réactif

bifonctionnel tel que le glutaraldéhyde ou dichlo-

rure d'acide. Selon ces procédés, le réactif bifonc-

tionnel reste dans la protéine réticulée pour former

le pontage. Ces procédés ont l'inconvénient d'in-

troduire un espaceur artificiel entre les protéines.

Par ailleurs, il est connu d'activer les réactions entre des groupes carboxyle et des groupes amine à l'aide de carbodiimides et/ou de dérivés de succinimides. En particulier, on a

proposé d'activer à l'aide de ces composés la ré-

ticulation de protéines par réaction des groupes

carboxyle et des groupes amine libre des protéines.

Dans ce cas, on effectue un pontage direct de type isopeptidique. Ce type de réticulation a été décrit dans la demande internationale WO 85/04413 pour la fabrication d'une matrice réticulée à base de collagène sous forme d'éponge ou de feuilles. Selon ce procédé, on opère en phase aqueuse et on met en contact le collagène avec un carbodiimide et/ou un ester bifonctionnel de succinimidyle puis on chauffe

à température élevée pour obtenir la matrice réti-

culée à base de collagène. Dans le brevet FR-A 2 280 352, on décrit un procédé dans lequel on réticule une protéine de toxine en présence d'un carbodiimide dans un milieu aqueux tamponné

contenant des particules inertes de latex de poly-

styrène puis on chauffe ou on laisse reposer à tem-

pérature ordinaire de façon à obtenir une protéine

réticulée absorbée sur le latex de polystyrène.

Dans aucun des documents ci-dessus, la réaction n'est effectuée sous forme d'émulsion et

on n'obtient pas de microsphères homogènes.

Selon la présente demande, on a trouvé

qu'il est possible de préparer, à partir de pro-

téines, par un procédé en émulsion, des micro-

sphères par pontage direct de type isopeptidique en présence d'un carbodiimide comme activateur. On conserve ainsi les avantages des microsphères sans lier de manière covalente la protéine à des réactifs qui, s'ils étaient libérés, pourraient être biologiquement nocifs ou irritants. On évite donc selon l'invention les inconvénients des procédés antérieurs qui imposaient la présence d'un

espaceur entre les protéines.

La présente invention a donc pour objet

un procédé de fabrication de microsphères de pro-

téine (s) par réticulation en émulsion, carac-

3i térisé par le fait que l'on prépare sous agita-

tion une émulsion dont la phase continue est constituée par un solvant organique additionné d'un agent tensio-actif et la phase discontinue est constituée par une phase liquide hydrophile contenant au moins une protéine, que l'on ajoute à ladite émulsion un carbodiimide pour activer la réticulation protéinique et obtenir un précipité

de microsphères, que l'on sépare ledit préci-

pité et qu'on le lave.

L'agent tensio-actif additionné à la phase continue est soluble dans cette phase et oriente l'émulsion de telle sorte que la phase hydrophile soit dispersée dans la phase organique. L'agent

tensio-actif peut être, par exemple, un ester du sorbitan.

Selon un premier mode de réalisation, la phase liquide discontinue est une phase aqueuse; dans ce cas, la protéine et le carbodiimide sont en solution dans ladite phase aqueuse; la phase aqueuse est, de préférence, une solution tamponnée de pH déterminé. On dissout éventuellement dans cette phase aqueuse les produits solubles dans l'eau que l'on désire encapsuler. On peut ajouter éventuellement un agent solubilisant qui facilite

la solubilisation du principe actif.

Selon un second mode de réalisation, la phase liquide discontinue renferme un solvant

anhydre; ce dernier est, de préférence, le dimé-

thylformamide (DMF): en effet, par son grand pouvoir solvant, il peut solubiliser des molécules, qui sont insolubles dans l'eau et permet donc

l'encapsulation de produits, par exemple de médi-

caments qui ne sont pas solubles dans l'eau.

L'addition d'un agent réducteur,tel que le dithio-

érythritol, dans la phase discontinue peut amé-

liorer le rendement.

La protéine utilisée pour former les microsphères peut être toute protéine susceptible de former des pontages de type peptidique. On peut également utiliser des mélanges de différentes protéines. On peut citer les protéines d'origine humaine, animale ou végétale telles que par exemple les enzymes, les protéines de transport (hémoglobine ou sérum- albumine), les protéines nutritives (ovalbumine ou caséine), les protéines structurales (kératine, collagène type I,II,III ou IV, ou gélatine), certaines protéines de défense, anticorps ou protéines immunorégulatrices, et diverses autres protéines telles que toxines, récepteurs membranaires ou hormones. On utilise plus particulièrement la sérum-albumine et le lysozyme. Ces pontages sont de type isopeptidique et sont obtenus par réaction de groupements NH2 de protéine avec des groupements COOH. Les groupements SH et OHpeuvent également former des pontages

avec les groupements COOH.

Le solvant constituant la phase continue est un solvant ou un mélange de solvants hydrophobes non miscibles dans la p.hase discontinue: on utilise notamment un hydrocarbure aliphatiàue en C5-C10 ou un hydrocarbure cycloliphatique en C5.-C8; on utilise plus particulièrement le cyclohexane. On peut aussi utiliser des

Dolysiloxanes, tels que l'hexaméthyldisiloxane ou des polyméthyl-

siloxanes et des polydiméthylcyclosiloxanes de faible viscosité ou fluides. Le carbodiimide utilisé comne activateur de la réaction de réticulation a pour formule:

R N C N R'

o R et R' sont identiques ou différents et représentent H,un

radical aliphatique en C1-C10 ramifié ou non, un radical cyclo-

aliphatique comportant ou non un hetéroatome, ou un radical aromatique. Ces radicaux peuvent porter un ou plusieurs

substituants acides ou basiques facilitant la solubili-

sation des produits secondaires de la réaction. On utilise- plus particulièrement-ie-chlorure de 1-éthyl 3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide

appelé ci-après EDCI, HCl.

Selon un mode de réalisation préféré, on peut uti-

liser en plus du carbodiimide commne activateur, un catalyseur.

Ce catalyseur est un succinimide, en particulier le N-hydroxy-

succinimide. Le catalyseur est introduit dans la phase discontinue avec la protéine. Dans le cas o on effectue la réticulation de protéines en présence d'un carbodiimide et de N-hydroxysuccinimide, la réaction de réticulation Deut s'écrire commine indiaué sur la

figure 1: cette réaction montre bien que la molécule de carbo-

diimide ne particioe pas au oontaze: elle est transform4e en un

dérivé de l'urée que l'on peut éliminer ensuite par simple lavage.

A la fin de la réaction, on obtient un précipité de microsphères, qui est lavé plusieurs fois avec de l'eau pour éliminer les produits secondaires, par exemple l'urée dérivée du

carbodiimide, ou avec un tampon aqueux approprié notam-

ment dans le cas o les microsphères contiennent un médicament encapsulé et o; l'on ne souhaite pas

extraire ledit médicament.

Le lavage peut se faire, si nécessaire, en deux

stades. En plus des lavages à l'eau effectués pour éli-

miner les produits secondaires, par exemple l'urée dérivée du carbodiimide et le N-hydroxy succinimide, on peut ajouter un lavage avec un solvant anhydre, avant ou après les lavages à l'eau, par exemple, l'alcool éthylique, pour éliminer la phase continue non

miscible à la phase liquide discontinue.

Les sphères obtenues après lavage sont séchées, éventuel-

lement lyophilisées etsi nécessaire, purifiées par gradient de Percoll en milieu réducteur. Une analyse chromatographique permet de contrôler l'absence d'urée dans les sphères séchées. Pendant les opérations-de séchage (lyophilisation, par exemple) les sphères, selon leur structure et leur résistance, peuvent être éventuellement déformées. Malgré ces modifications de forme, les microparticules

obtenues seront toujours considérées comme des microsphères.

Les microsphères.obtenues après lavage peuvent être mises en contact avec une solution d'une substance que l'on souhaite fixer par les microsphères. Apres le temps de contact nécessaire à

à la fixation, les microsphères sont lavées puis séchées.

Les quantités de réactifs utilisées sont

variables selon les conditions opératoires.

On peut citer les exemples suivants: 1 - Cas de l'albumine avec une phase discontinue aqueuse:

on utilise une quantité de 200 mg à 600 mg d'EDCI, HCl pour 500mg.

de protéine.

2 - Cas de l'albumine ou du lysozyme avec une phase discontinue anhydre (DMF): on utilise 10 mg d'EDCI, HC1 et 10 mg de N-hydroxysuccinimide pour 500 mg de protéine. 3 - Cas de l'albumine avec une phase discontinue composée de 20 % en poids de DMF dans l'eau; on peut utiliser 200 mg à 600 mg d'EDCI, HCl pour 500 mg de protéine.

La température de fabrication des micro-

sphères est généralement comprise entre 2 et 40 C; le temps de réaction est variable: il est au

minimum de 5 heures.

La présente invention a également pour objet à titre de produit nouveau, les microsphères de protéines réticuléesuniquement par des pontages

de type isopeptidique.

Selon le type de protéine utilisé, la nature de la phase discontinue et les quantités

de réactifs mises en jeu, les caractéristiques des-

microsphères obtenues peuvent être différentes.

Le tableau I montre que les microsphères peuvent être constituées d'un réseau de réticulation interne plus ou moins dense, ce qui leur confère des comportements mécaniques et physicochimiques différents. D'autre part, en fonction de la phase discontinue choisie, les microsphères obtenues sont plus ou moins dégradables par les enzymes digestives. On peut ainsi obtenir des uicrosphères plus ou moins biodégradables selon le type

d'application envisagé.

w w -. --

no en o Ul o

TABLEAU I

PARAMETRES PHASE DISCONTINUE AQUEUSE PHASE DISCONTINUE ANHYDRE

PROTEINES ALBUMINE LYSOZYME ALBUMINE LYSOZYME

QUANTITES

d'EDCI,HC1 * 300 mg 600 mg 1.370 mg 10 mg 10 mg (1)

QUANTITES _

de NHS * 10 mg 10 mg (1) NON

ASPECT SPHERIQUES NNSPHERIQUES

ASPECT. SPHERIQUES RESISTANTES RIES SPHERIQUES FRAGILES

PHYSIOUE FRAGILESFRGLSRAIE

FRAGILES

RENDEMENT 25% 80% - 16% 14%

ENZYMES

DIGESTIVES RESISTANTE - LYSE RAPIDE PAR LA PEPSINE

CHARGE NEGATIVE - NEGATIVE POSITIVE

(1) Quantités pour 500 mg de protéine mis en jeu.

* EDCI, HC1:.Chlorhydrate de 1-éthyl 3- (3- diméthylaminopropyl) carbodiimide

** NHS: N-hydroxysuccinimide.

En choisissant le pH du milieu réactionnel en fonction du point isoélectrique de la protéine, on peut obtenir des microsphères qui portent une charge positive ou négative. Les microsphères selon l'invention sont donc susceptibles d'encap- suler ou de fixer des produits à caractère ionique,

par exemple des médicaments.

Le diamètre des microsphères obtenues

est variable, (3 pm àl mm). La taille des micro-

spheres obtenues dépend de la vitesse d'agitation et du système émulsionnant utilisé. En utilisant des ultrasons, on peut obtenir un fort pourcentage de

microsphères ayant un diamètre inférieur à 10m.

On peut également obtenir des microsphères de faible diamètre en introduisant dans la phase organique

externe un agent stabilisant approprié.

Les applications des microsphères selon

l'invention sont nombreuses.

Les microsphères non chargées

peuvent être incorporées--------------------------

dans des supports cosmétiques de massage ou

de nettoyage de la peau. On utilise alors le carac-

tère entièrement protéique des microsphères et leur similitude avec des entités biologiques telles que les cornéocytes. Les microsphères non chargées peuvent également être utilisées comme agent de

dilution ou de fluidité dans les formes pharmaceu-

tiques sèches.

Les microsphères peuvent servir de support à de nombreux produits, en particulier des médicaments tels que

antiseptiques, antifongiques ou antibactériens antiinflam-

matoires, des rétino:des ou des anthranoIdes, des agents cosmétiques tels que des colorants capillaires ou filtres solaires ou des substances biologiquement actives. Les produits peuvent être encapsulés au moment de la fabrication des microsphères ou fixés par trempage des microsphères dans une solution du produit à encapsuler, compte tenu du caractère

ionique des microsphères.

Les microsphères peuvent protéger des médicaments instables; elles peuvent être appli- quées par voie topique dans le cas d'atteintes

cutanées particulières telles que certaines affec-

tions suintantes. Les microsphères chargées en médicaments peuvent être administrées également

par voie systémique.

On peut inclure, dans la composition des microsphères, des protéines spécifiques conférant

aux sphères des propriétés biologiques (immuno-

logiques ou enzymatiques).

Les microsphères peuvent être chargées en colorants et utilisées dans des produits de maquillage. Les exemples donnés ci-dessous, à titre purement illustratif et non limitatif, permettront

de mieux comprendre l'invention.

EXEMPLE 1: Crème de massage.

On réalise la formulation suivante: - Microsphères d'albumine réticulée oo100 am < 0 2oo00 m............... 7,00 g - Mélange d'alcools de lanoline émulsifs

de cires et d'huiles raffinées à base d'hydro-

carbures vendu sous la dénomination commerciale "Eucerin anhydre" par la Société "BDF"..... 37,00 g - Parahydroxybenzoate de méthyle..... 0,07 g Parahydroxybenzoate de propyle..... 0,08 g - Eau stérile..................

.... 55,85 g On obtient une crème d'aspect homogène et relativement consistante. A l'application, la crème a une texture grasse, les microsphères sont perceptibles sur la peau et renforcent..DTD: l'effet du massage.

EXEMPLE 2: Crime pour le nettoyage de la peau. On réalise la formulation suivante: - Microsphères d'albumine réticulée 0=100D m................... 6,00 g - Alcool cétostéarylique............. 5,00 g - Alcool cétostéarylique polyoxyéthylèné à 23 moles d'oxyde d'éthylène....... 0,70 g

- Alcool cétostéarylique polyoxyp'hv-

lèné à 12 moles d'oxyde d'éthylène.... 0,30 g - Alcool cétylique..........

....... 1,50 g - Monostéarate de glycérol.......... 2,00 g - Huile de vaseline.................. 6,00 g - Parahydroxybenzoate de méthy!e..... 0, 08 g - Parahydroxybenzoate de propyle..... 0,07 g - Huile de silicone.......DTD: ........... 1,00 g - Eau stérile........................ 77,35 g On obtient une crème souple, utilisable pour la toilette de la peau. Les microsphères sont perceptibles mais restent douces au toucher en..DTD: raison de leur morphologie.

EXEMPLE 3: Gélules contenant des microsphères

chargées en quinacrine.

La quinacrine est un anthelmintique et un antimalarien administré habituellement par voie orale. On propose, selon cet exemple, de réaliser une composition pharmaceutique en chargeant la quinacrine dans des microsphères qui assureront sa libération progressive. Les microsphères chargées en quinacrine seront présentées sous la forme de gélules

contenant chacune 500 mg de microsphères.

Pour préparer les microsphères en cause, on solubilise 50 mg de chlorhydrate de quinacrine puis 500 mg d'albumine dans 2 ml d'eau; puis l'ensemble est émulsionné, pendant 3 minutes et dans les con-

ditions décrites à l'exemple 4, dans 20 ml de polydi-

méthylcyclosiloxane vendu par la Société "Dow Corning" sous la dénomination "Fluid Dow Corning 344" et désigné aussi sous le nom "Cyclométhicone" qui sera utilisé ci-après, ce silicone volatil étant additionné de 5 % en poids d'un trioléate de sorbitan vendu par la

Société ICI sous la dénomination commerciale "Span 85".

On solubilise 600 mg d' EDCI, HCl dans 1 ml d'eau et on l'ajoute ainsi à l'émulsion décrite ci-dessus. Le processus de réticulation est poursuivi pendant

12 heures sous agitation et à l'abri de la lumière.

En fin de réticulation, les microsphères sont obtenues sous la forme d'un précipité jaune intense, qui est

centrifugé, lavé avec 40 ml d'eau et lyophilisé.

Observé au microscope, le lyophilisat se

présente sous la forme de microsphères bien indivi-

dualisées; on ne voit pratiquement aucun cristal à l'extérieur des sphères. Le rendement global est de 75 % en poids par rapport à la masse de protéine mise en jeu et le taux d'encapsulation de la

quinacrine dans les sphères est de 1 % en poids.

EXEMPLE 4:

On encapsule du bleu de méthylène dans

des microsphères d'albumine dans une phase dis-

continue aqueuse. 20 mg de bleu de méthylène et 500 mg de sérum albumine sont dissous dans 2 ml d'eau puis l'ensemble est émulsionné dans 15 ml de "cyclomethicone" additionné de 5 % en poids de "Span 85" L'émulsion est faite dans un ballon de 50 ml avec un agitateur muni d'une pale en forme d'ancre tournant à une vitesse de 500 tours/mn. Après 3 minutes d'agitation, on ajoute 1 ml d'une solution aqueuse contenant 300 mg d' EDCI, HCl Le processus de réticulation est poursuivi sous agitation

continue pendant 5 heures en évitant toute éva-

poration de la phase externe. Après 5 heures, les microsphères obtenues se présentent sous la forme d'un précipité bleu intense,qui est centrifugé et lavé successivement une fois avec de l'éthanol et deux fois avec de l'eau. Les lavages sont

effectués très rapidement pour limiter la libé-

ration du bleu de méthylène. Les microsphères sont ensuite lyophilisées. La détermination du taux de bleu de méthylène encapsulé est faite par dosage spectrophotométrique à \= 655,8 nm après broyage des microsphères en milieu aqueux. Le taux de bleu de méthylène encapsulé s'élève à 1 % en poids par

rapport au poids total des microsphères.

EXHALE 5:

On encapsule du bleu de méthylène dans

des microsphères de sérum albumine en phase dis-

continue anhydre. On dissout le bleu de méthylène (20 mg) et la Nhydroxysuccinimide (10 mg) dans 2 ml de diméthylformamide. On y ajoute ensuite la sérum albumine (500 mg) que lion disperse pendant 3 minutes dans

un bac à ultrasons. L'ensemble est ensuite émul-

sionné dans 15 ml de "cyclométhiconett" additionné de 5 % en poids de "Span 85" dans les mêmes conditions opératoires que pour l'exemple 4. On dissout mg d EDCI,HCl dans 1 ml de diméthylformamide et on l'introduit ainsi dans l'émulsion. Le processus de réticulation, les lavages, la lyophilisation et le contrôle du taux de bleu de méthylène

encapsulé sont conduits comme dans l'exemple 4.

Le taux de bleu de méthylène encapsulé s'élève à 0,59 %

en poids.

On a comparé les courbes de libération

du bleu de méthylène dans l'eau pour les micro-

sphères des exemples 4 et 5. Les courbes données

sur la figure 2 montrent le pourcentage de libé-

ration du bleu de méthylène en fonction du temps t

exprimé en mn. La courbe 1 correspond à l'utili-

sation de l'EDCI, HCl dans l'eau et la courbe 2 à l'utilisation de l'EDCI, HC1 dans le diméthylformamide. On voit que la libération du bleu de méthylène est retardée de façon plus importante avec les microsphères d'albumine fabriquées avec une phase discontinue aqueuse. La moitié du bleu de méthylène est libérée en deux minutes avec les microsphères fabriquées en phase anhydre et en

trente-cinq minutes avec les microsphères fabri-

quées en phase aqueuse.

Dans les deux types de microsphères, plus de 90 % du bleu de méthylène est libéré au

bout de quatre-ving-dix minutes.

Claims

REVENDICATIONS I - Procédé de fabrication de micro- sphères de protéine(s) par réticulation en émulsion, caractérisé par le fait que l'on prépare sous agitation une émulsion dont la phase continue est constituée par un solvant organique additionné d'un agent tensioactif et la phase discontinue par une phase liquide hydrophile contenant au moins une protéine, que l'on ajoute à l'émulsion obtenue un carbodiimide pour activer la réticu- lation et obtenir un précipité de microsphères, que l'on sépare ledit précipité et qu'on le lave.

2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'agent tensio-actif additionné à la phase continue est un ester de sorbitan.
3 - Procédé selon l'une des revendi-

cations 1 ou 2, caractérisé par le fait que la

phase liquide discontinue est une phase aqueuse.
4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que la phase aqueuse est

tamponnée à un pH déterminé.

- Procédé selon l'une des revendi- cations 3 ou 4, caractérisé par le fait que la substance à encapsuler est une solution dans la

phase aqueuse.
6 - Procédé selon l'une des revendi-

cations 1 ou 2, caractérisé par le fait que la phase liquide discontinue est un solvant anhydre

ou le mélange d'un solvant anhydre et d'une phase aqueuse.
7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé

par le fait que le solvant anhydre est le diméthylformamide.
8 - Procédé selon l'une des revendi-

cations 6 ou 7, caractérisé par le fait que le produit à encapsuler est en solution dans le

solvant anhydre.
9 - Procédé selon l'une des revendi-

cations 1 à 8, caractérisé par le fait qu'un

agent réducteur est ajouté à la phase discon-

tinue.

- Procédé selon l'une des revendi-

cations 1 à.9,.caractérisé par le fait que le solvant constituant la phase continue est un

solvant non miscible à la phase discontinue.

1i - Procédé selon la revendication , caractérisé par le fait que le solvant est un hydrocarbure aliphatique en C5-C1 ou un -

hydrocarbure cycloaliphatique en C5-C8.
12 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que le solvant est

le cyclohexane.
13 - Procédé selon la revendication , caractérisé par le fait que le solvant est un polysiloxane.
14 - Procédé selon l'une des revendi-

cations 1 à 13, caractérisé par le fait que le carbodiimide a pour formule:

R N_ C -N R'

o R et R' sont identiques ou différents et représentent H, un radical aliphatique en C1-C10, ramifié ou non, un radical cycloaliphatique comportant ou non un hétéroatome, ou un radical aromatique, ces radicaux pouvant porter un ou plusieurs substituants

30.acides ou basiques.

- Procédé selon la revendication 14, caracté-

risé par le fait que le carbodiimide est le 1-éthvl
3- (3-diméthylaminoprop l) carbodiimide.
16 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 15,

; caractérisé par le fait que l'on introduit, en Dlus de l'acti-

vateur, un catalyseur.
17 - Procédé selon la revendication 16, caractérisé

par le fait que le catalyseur est un succinimide.
18 - Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait que le catalyseur est le N-hydroxysuccinimide.
19 - Procédé selon l'une des revendi-

cations 1 à 18; caractérisé par le fait que le précipité de microsphères est lavé soit à l'eau ou avec un tampon, soit en deux stades; aux lavages à l'eau effectués pour éliminer les produits secondaires hydrosolubles, étant ajouté un lavage avec un solvant anhydre pour éliminer la phase continue non miscible à la phase liquide discontinue. 20 - Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait que le solvant anhydre est

l'alcool éthylique.
21 - Procédé selon l'une des revendi-

cations 1 à 20, caractérisé par le fait que la substance active peut être incorporée dans les microsphères après le processus de réticulation par trempage des microsphères dans une solution

contenant la substance à encapsuler.
22 - Microsphères de protéine(s) réticulée (s) par un pontage de type isopeptidique

obtenues par le procédé selon l'une des revendi-

cations 1 à 21.
23 - Utilisation des microsphères selon la revendication 22 comme agent de dilution ou de fluidité dans des compositions administrables par

voie orale.
24 - Utilisation des microsphères selon la revendication 22 pour conditionner des composés à activité pharmaceutique, cosmétique ou

biologique.