JP7618581B2 - ９番染色体オープンリーディングフレーム７２遺伝子発現のモジュレーターおよびその使用 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月２３日に出願された米国特許出願第６２／８３７，５２３号および２０２０年１月２３日に出願された同６２／９６４，８４４号の優先権を主張する。これらの優先出願の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２０年４月２１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０２５２９７＿ＷＯ０１７＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、１９，８８０バイトの大きさである。

９番染色体オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ｏｒｆ７２）遺伝子は、ニューロンにおいて豊富に見出されるタンパク質をコードする。Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質は、エンドソーム輸送において重要な役割を果たすと考えられている。Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質の機能は、十分に理解されていないが、最近のデータにより、Ｒａｂタンパク質の機能を調節することによってエンドリソソーム経路に沿った膜輸送において役割を果たすということが示唆されている。

Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子は、イントロン１中にヘキサヌクレオチドセグメント（Ｇ_４Ｃ_２；配列番号１）を含有する。このセグメントは、識別可能な生物学的効果を伴うことなく、最大３０回タンデムに反復し得る。しかし、３０回より多いリピート、ヘキサヌクレオチド拡大と呼ばれる現象は、Ｃ９ｏｒｆ７２関連障害につながることがある（Ｒｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ （２０１１） ７２：２５７－６８；Ｄｏｕｇｌａｓ， Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ Ｒｅｓ． （２０１８） ３：１７８－８７）。この拡大は、常染色体優性表現型をもたらし、患者は通常、拡大されたアレルについてヘテロ接合性である。ヘキサヌクレオチド拡大は、細胞内でのＲＮＡフォーカスの形成を引き起こし、これが、ＲＮＡ結合タンパク質の隔離およびＲＮＡ代謝の破壊につながると思われる。また、非ＡＵＧ依存性翻訳によって、ヘキサヌクレオチド拡大は、潜在的にセンスおよびアンチセンス両方向の６つのフレームすべてからのジペプチドリピート（ＤＰＲ）を含有する非天然タンパク質の産生につながると思われる（Ｆｒｅｉｂａｕｍ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ， Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１７） １０：３５； Ｄｏｕｇｌａｓ、前掲）。これらのタンパク質は、凝集する傾向がある（Ｇｅｎｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． （２０１３） １２６：８２９）。ＤＰＲは、Ｃ９ｏｒｆ７２関連疾患を有する患者の死後脳材料中に含まれていると報告されている（Ｒｉｅｍｓｌａｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｃｏｍｍｕｎ． （２０１９） ７：３９）。

Ｃ９ｏｒｆ７２関連障害として、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびＣ９家族性前頭側頭型認知症認知症（Ｃ９ＦＴＤ）が挙げられる。ＡＬＳは、進行性の筋肉低下、筋量の減少ならびに動き、話し、飲み込み、および／または呼吸する能力が徐々に低下することを特徴とする。ＡＬＳは、１００，０００人あたり１～３症例の年間発生率を有し、最も一般的な成人発症型運動ニューロン障害である。この疾患は、最初の症状の３～５年以内にほとんどの患者にとって致死的である。米国および欧州では、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子における突然変異が、家族性ＡＬＳの約３０～４０パーセントに関与しており、弧発性ＡＬＳの５～１０％を占める。Ｃ９ｏｒｆ７２関連ＡＬＳを有する一部の患者は、Ｃ９前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）またはＣ９ＦＴＤと呼ばれる状態である、人格、行動および言語に影響を及ぼす神経変性性疾患も発症する（Ｂｅｎｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１５） ７：１７１）。両状態を発症している個体は、ＡＬＳ－ＦＴＤを有すると診断される。

Ｃ９ｏｒｆ７２関連障害の有効な処置はなかった。したがって、これらの障害のための効果的な療法を開発することが緊急に必要である。

本開示は、ヒトＣ９ｏｒｆ７２のジンクフィンガータンパク質ベースの転写モジュレーターおよびＣ９ｏｒｆ７２関連障害の処置におけるこれらのモジュレーターの使用を提供する。一態様では、本開示は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写リプレッサードメインを含み、ＺＦＰドメインは、ヒトＣ９ｏｒｆ７２遺伝子の突然変異体アレルのエキソン１ａと１ｂの間のイントロンセグメント（イントロン１ａ）中の標的領域に結合する融合タンパク質を提供する。突然変異体アレルは、イントロン１ａ中に拡大されたＧ_４Ｃ_２（配列番号１）リピート領域を有し、融合タンパク質は、この拡大されたリピート領域を標的とする。突然変異体アレルは、３０より多いタンデムＧ_４Ｃ_２リピート（例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００より多いリピート）を含み得る。野生型アレルは、３０以下のこのようなリピート（例えば、２５、２０、１５、１０または５リピート以下）を含み得る。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、突然変異体アレルからのリピート含有ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の転写を抑制し、その遺伝子からの野生型ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の転写を抑制しない。

一部の実施形態では、ＺＦＰドメインは、標的領域中のセンス配列に結合し、センス配列は、ヘキサヌクレオチドＧＧＧＧＣＣ（配列番号１）、ＧＧＧＣＣＧ（配列番号２）、ＧＧＣＣＧＧ（配列番号３）、ＧＣＣＧＧＧ（配列番号４）、ＣＣＧＧＧＧ（配列番号５）、またはＣＧＧＧＧＣ（配列番号６）の１～３のタンデムリピートを含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ヒト細胞において突然変異体アレルからのセンス転写を抑制する。特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ９ｏｒｆ７２ １ａプロモーターからのセンス転写を抑制し、Ｃ９ｏｒｆ７２ １ｂプロモーターからのセンス転写を抑制しない。

一部の実施形態では、ＺＦＰドメインは、標的領域中のアンチセンス配列に結合し、アンチセンス配列は、ヘキサヌクレオチドＧＧＣＣＣＣ（配列番号７）、ＧＣＣＣＣＧ（配列番号８）、ＣＣＣＣＧＧ（配列番号９）、ＣＣＣＧＧＣ（配列番号１０）、ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１１）、またはＣＧＧＣＣＣ（配列番号１２）の１～３のタンデムリピートを含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ヒト細胞において突然変異体アレルからのアンチセンス転写を抑制する。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、ヒト細胞において突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルからのセンス転写およびアンチセンス転写の両方を抑制する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２アレルと比較して、突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルを優先的に抑制する。

さらなる実施形態では、融合タンパク質は、突然変異体アレルからのセンスおよび／またはアンチセンス転写を少なくとも約３０％、４０％、７５％、９０％または９５％抑制する。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つまたは複数のＺＦＰドメインを有し、その各々は、６つのジンクフィンガーを含んでもよく、表１に示される標的配列に結合する、および／または６つのジンクフィンガー（順序付けられたＦ１～Ｆ６）を含み、各ジンクフィンガーは、表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、表１に示されるような認識ヘリックス領域の外側の残基に対して１つまたは複数の突然変異を含んでもよい。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含み、ジンクフィンガーは、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号は、７８０２１、７５１１４、７５１１５、７４９６９、７９８９５、７９８９８、７４９８６、７９８９９、７９９０１、７９９０２、７９９０４、７９９１６、７５０２７または７９９２１である。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つまたは複数の転写リプレッサードメインを有し、その各々は、ヒトＫＯＸ１由来のＫＲＡＢドメインアミノ酸配列、例えば、以下にさらに記載されるものを含んでもよい。特定の実施形態では、ＺＦＰドメインは、ペプチドリンカーを介して転写リプレッサードメインに連結される。

別の態様では、本開示は、本明細書において記載される融合タンパク質のうち１つまたは複数のコード配列を含む核酸コンストラクトを提供し、コード配列は、転写調節エレメントに作動可能に連結されてもよい。一部の実施形態では、転写調節エレメントは、脳細胞において構成的に活性であるかまたは誘導性である哺乳動物プロモーターを含み、プロモーターは、ヒトシナプシンＩプロモーターであってもよい。一部の実施形態では、コンストラクトは、組換えアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」）コンストラクトである。また、組換えＡＡＶコンストラクトと、血清型１～１０のカプシドとを含むｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９）またはそれに由来する偽型のカプシドとを含むｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／６またはＡＡＶ２／６／９）も提供される。

別の態様では、本開示は、本明細書において記載される、１つもしくは複数の融合タンパク質および／または１つもしくは複数の核酸コンストラクトを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、例えば、ヒト細胞、例えば、ニューロンまたは多能性幹細胞（例えば、胚幹細胞または人工多能性幹細胞）であり得る。

また、本明細書において記載されるような、融合タンパク質のうち１つもしくは複数、１つもしくは複数の核酸コンストラクト（例えば、ＡＡＶコンストラクト）、核酸コンストラクトを含む組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）および／または１つもしくは複数の宿主細胞を、通常、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物も提供される。

さらに別の態様では、本開示は、ヒト細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞または神経上皮細胞）において、突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルの転写を阻害する方法であって、突然変異体アレルが、イントロン１ａ中に拡大されたＧ_４Ｃ_２リピート領域を含み、細胞に、本明細書において記載されるような、１つもしくは複数の融合タンパク質、１つもしくは複数の核酸コンストラクト（例えば、ＡＡＶ）、１つもしくは複数の組換えウイルス、１つもしくは複数の宿主細胞および／または１つもしくは複数の医薬組成物を導入することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、Ｃ９ｏｒｆ７２関連障害、例えば、ＡＬＳまたはＣ９ＦＴＤを患っている患者の脳または脊髄中にある。

関連態様では、本開示は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびＣ９家族性前頭側頭型認知症（Ｃ９ＦＴＤ）から選択されてもよいＣ９ｏｒｆ７２関連障害を患っている患者を処置する方法であって、患者に、本明細書において記載されるような、１つもしくは複数の融合タンパク質、１つもしくは複数の核酸コンストラクト（例えば、ＡＡＶ）、１つもしくは複数の宿主細胞および／または１つもしくは複数の医薬組成物を導入することを含む方法を提供する。

本処置方法では、融合タンパク質は、融合タンパク質を発現する組換えウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）を使用して導入され得る。一部の実施形態では、組換えウイルスは、脳室内、くも膜下腔内、頭蓋内、後眼窩（ＲＯ）、静脈内、鼻腔内および／または大槽内経路によって患者に投与される。一部の実施形態では、本開示の２つ以上の異なる融合タンパク質が導入され、２つ以上の融合タンパク質のコード配列は、同一または異なる組換えウイルスベクターに保持され得る。

また、本明細書において記載される処置方法において使用するための、および本明細書において記載される処置方法において使用するための医薬の製造のための、融合タンパク質、核酸コンストラクトおよび組換えウイルスの使用のための、１つもしくは複数の融合タンパク質および／または１つもしくは複数の核酸コンストラクト、１つもしくは複数の組換えウイルスおよび１つもしくは複数の医薬組成物も本開示において提供される。

本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかし、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示すが、制限ではなく単に例示として示されるということは理解されるべきである。本発明の範囲内で種々の変法および改変は、詳細な説明から当業者にとって明らかとなる。

図１Ａ～Ｃは、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子および産生される転写物の模式図を表す。 図１Ａは、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２アレルおよび拡大された突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルの両方の構造を示す。拡大された突然変異体アレル上のＧ_４Ｃ_２拡大の位置が、示されている（エキソン１ａと１ｂの間のゲノム領域、すなわち、イントロン１ａ中）。エキソンは、四角として示されている。Ｄｏｕｇｌａｓ、前掲から適応された；Ｒｉｚｚｕ ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４：３７も参照のこと。 図１Ｂは、Ｇ_４Ｃ_２拡大付近の突然変異体拡大されたＣ９ｏｒｆ７２アレルの領域の拡大図であり、拡大されたアレルと関連するプロモーターおよび転写物を表す。センス鎖転写に関与しているプロモーター（実線矢印）およびアンチセンス転写に関与しているプロモーターのおよその位置（中白矢印）が示されている。また、これまでに記載されている５つの異なるセンス転写物ならびにアンチセンス方向にあるおよその位置および転写物も示されている。同書。 図１Ｃは、拡大された領域を標的とするＺＦＰ－ＴＦによる１ａプロモーターおよびアンチセンスプロモーターの抑制のモデルを示し、ＺＦＰ－ＴＦは、両プロモーターの下流であり、プロモーター調節にとって最適である位置において結合する。このモデルにおける１ｂプロモーターは、ＺＦＰ－ＴＦの結合が１ｂプロモーターの上流であるので抑制されない。 図２Ａ～Ｄは、示されたＺＦＰ－ＴＦを使用する示された細胞種におけるＣ９ｏｒｆ７２発現（「総Ｃ９」）の抑制を示す。さらに、図は、拡大された突然変異体アレルによって主に産生される（「リピート含有アイソフォーム特異的」）、イントロン１ａを含むより長いｍＲＮＡアイソフォーム（拡大された）の発現の抑制を示す。拡大されたアイソフォームは、Ｃ９患者株において主に発現される。 図２Ａは、総Ｃ９アッセイのために使用されるＰＣＲアッセイならびにセンスおよびアンチセンスリピート含有アイソフォーム特異的アッセイを例示する。図の上部は、野生型および拡大されたアレルのゲノム構造を表し、図の下部は、各アレルから作成されるｍＲＮＡ産物を示す。ｍＲＮＡ図上の矢印セットは、総Ｃ９アッセイにおいて使用されるＰＣＲ標的を表す。 図２Ｂ～Ｄは、健常個体由来の野生型細胞株およびＡＬＳ患者由来の線維芽細胞細胞株「Ｃ９」における異なる例示的ＺＦＰ－ＴＦのＣ９ｏｒｆ７２発現アッセイの結果を示すグラフである。Ｃ９細胞株は、野生型アレル上（５）および拡大されたアレル上（８５０）のＧ_４Ｃ_２リピートの数を指す「５／８５０」として特徴づけられる。最も左のグラフ：スクリーニングの第３ラウンド（「ラウンド３」）における野生型細胞における総Ｃ９ｏｒｆ７２発現（「総Ｃ９」）。左から２番目のグラフ：ラウンド３におけるＣ９細胞における総Ｃ９。右から２番目のグラフ：スクリーニングの第２ラウンド（「ラウンド２」）におけるＣ９細胞における総Ｃ９。最も右のグラフ：アイソフォーム特異的Ｃ９ｏｒｆ７２アッセイによって決定されるような拡大されたＣ９ｏｒｆ７２アレルからの発現。ラウンド２スクリーニングは、ＺＦＰ－ＴＦ処置後の、アイソフォーム（または疾患）特異的Ｃ９ｏｒｆ７２転写物レベル対総Ｃ９転写物レベルを評価するためにＣ９細胞で実施された。ラウンド３では、総Ｃ９は、Ｃ９細胞の野生型（ＷＴ）アレルに対するＺＦＰ－ＴＦの効果を評価するためにＣ９細胞および野生型細胞において決定された。各ＺＦＰ－ＴＦについて、１、３、１０、３０、１００および３００ｎｇの濃度のｍＲＮＡが左から右に示されている。図２Ｂは、上部グラフではＺＦＰ－ＴＦ７４９４９、７４９５１、７４９５４、７４９５５および７４９６４の結果を、ならびに下部グラフでは７４９６９、７４９７１、７４９７３、７４９７８および７４９７９の結果を示す。図２Ｂは、出現順にそれぞれ配列番号１、１および３を開示する。図２Ｃは、上部グラフではＺＦＰ－ＴＦ７４９８３、７４９８４、７４９８６、７４９８７および７４９８８の結果を、ならびに下部グラフでは７４９９７、７４９９８、７５００１および７５００３の結果を示す。図２Ｃは、出現順にそれぞれ、配列番号４および５を開示する。図２Ｄは、上部グラフではＺＦＰ－ＴＦ７５０２３、７５０２７、７５０３１、７５０３２、７５０５５および７５０７８の結果を、ならびに下部グラフでは７５０９０、７５１０５、７５１０９、７５１１４および７５１１５の結果を示す。図２Ｄは、出現順にそれぞれ、配列番号８～１１を開示する。グラフの下部の配列は、そのＺＦＰ－ＴＦのＤＮＡ結合モチーフを表す。各ＺＦＰ－ＴＦは、そのモチーフを含有する３つのヘキサヌクレオチドリピートに結合する。転写物レベルは、ＺＦＰ－ＴＦ ｍＲＮＡとともにトランスフェクトされたＧＦＰ ｍＲＮＡから発現された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のものに対して正規化した。グラフ中の水平方向の点線は、示されるような５０％または７０％抑制を示す。例えば、ＺＦＰ－ＴＦ７５１１５について、Ｃ９株では、総アイソフォーム転写物のおよそ５０％が抑制され、リピート含有アイソフォーム特異的転写物の約７０％が抑制されたが、一方で、ＷＴ株では総アイソフォームの最小の抑制があった。グラフは、転写物の３０％が残っていることを示し、これは、７０％が抑制されたことを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図３は、Ｃ９ｏｒｆ７２拡大されたアレルにおけるセンスおよびアンチセンス転写物のプロモーター領域の図を示す。センス、総およびアンチセンス転写物の特異的検出のためのプライマー対が示されている。ＡＳ：アンチセンス。ｄｄＰＣＲ：液滴デジタルＰＣＲ。図は、出現順にそれぞれ、配列番号１、１および７を開示する。 図４Ａおよび４Ｂは、イントロン１ｂを標的とするプライマーが、アンチセンスプレｍＲＮＡを特異的に検出することを示す。鎖特異的ＰＣＲを使用して、健常対照（Ｃｏｎ）またはＣ９細胞（Ｃ９）からセンス（Ｓ）またはアンチセンス（ＡＳ）ｃＤＮＡ鋳型を作成した。例えば、Ｃ９－ＡＳは、Ｃ９細胞から単離されたＲＮＡから生成されたアンチセンスｃＤＮＡ鋳型を用いて得られたｄｄＰＣＲ結果を示す。図４Ａは、ｃＤＮＡ鋳型Ｃ９－ＡＳのみがＰＣＲ産物を生成することを示し、これは、アンチセンスプレｍＲＮＡの検出のためのプライマーの特異性を示す。図４Ｂは、図４Ａにおける実験を、異なるＧ_４Ｃ_２リピート長を有する７つの異なるＣ９ｏｒｆ７２患者に由来する細胞株に、および６種の異なる健常対照株に拡張する。 図５Ａ～Ｃは、リピート含有アイソフォーム特異的アッセイを使用するＣ９細胞における転写物の抑制を示すグラフである。図５Ａは、ＺＦＰ－ＴＦ７４９４９、７４９７８、７５００３、７５０２７、７５１０９、７５１１４、７５１１５、７４９６０および７４９６７が、３つの異なる用量（３０、１００または３００ｎｇ）で与えられ、次いで、疾患センス転写物の量が測定された３実験を示す。図５Ｂは、疾患アンチセンス転写物を測定する３実験を示す。図５Ｃは、総Ｃ９ｏｒｆ７２転写物を測定する３回の実施を示す。 同上。 同上。 図６は、その拡大されたアレルに異なるＧ_４Ｃ_２リピート数（それぞれ、約６００、８００および８５０リピート）を各々含有する、異なるＡＬＳ患者から得た３つの異なる線維芽細胞株における拡大されたセンスおよびアンチセンス転写物（疾患アイソフォーム）とともに総Ｃ９転写物の抑制を示す。細胞が、１００ｎｇのＺＦＰ－ＴＦ７５１０９、７５１１４および７５１１５に曝露された後に、アイソフォーム選択的アッセイを使用して、抑制のレベルを評価した。３種のＺＦＰ－ＴＦすべてが、３種の細胞株すべてにおいて選択的抑制を維持した。 図７は、そのアレルでの通常のＧ_４Ｃ_２リピート数よりも大きい、健常個体から得た２つの細胞株における総Ｃ９転写物の抑制を示す。健常個体は、通常、そのＣ９ｏｒｆ７２アレルの各々に２～５のＧ_４Ｃ_２リピートを有する。しかし、一部の健常個体は、より多くのリピートを含有する。ＺＦＰ－ＴＦの十分な結合部位が提供されることを確実にするために、通常よりも多いリピート数（５／８および５／２０リピート）を含有する細胞株を使用した。これらの細胞株では、総Ｃ９転写物は、最小にしか影響を受けない。 図８Ａ～８Ｃは、ＡＬＳ患者由来一次線維芽細胞（Ｃ９２１、Ｃ９０２１とも呼ばれる）における、マウス一次ニューロンにおける、およびヒト一次ニューロンにおけるマイクロアレイ分析の結果を示し、示されたリプレッサー（７５０２７、７５１０９、７５１１４および７５１１５）の特異性を示す。ＺＦＰ－ＴＦ７５０２７は、反復されたＧＣＣＣＣＧ（配列番号８）モチーフを標的とし、一方で、ＺＦＰ－ＴＦ７５１０９、７５１１４および７５１１５は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子のアンチセンス鎖中のＣＣＧＧＣＣ（配列番号１１）モチーフを標的とする。 図８Ａは、そのデータベース中に２１，０００ウェルの注釈付き遺伝子を含有するＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｌａｒｉｏｍ（商標）Ｓアッセイを使用する患者由来一次線維芽細胞（Ｃ９０２１）におけるマイクロアレイ分析の結果を示す。解析は、３００ｎｇのｍＲＮＡ形態でのリプレッサーのＣ９０２１細胞への投与の２４時間後に実施された。グラフは、示されたＺＦＰ－ＴＦに応じて上方または下方制御された遺伝子を例示する。 図８Ｂは、そのデータベース中に１４０，０００の注釈付きおよび注釈なしコーディングおよび非コーディング転写物を含有するＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｌａｒｉｏｍ（商標）Ｄアッセイを使用するマウス一次ニューロンにおけるマイクロアレイ分析の結果を示す。分析は、ＡＡＶ形質導入の７日後に実施した。すべての細胞を３，０００のＭＯＩで形質導入した。グラフは、示されたＺＦＰ－ＴＦに応じて上方または下方制御された遺伝子を例示する。 図８Ｃは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｌａｒｉｏｍ（商標）Ｄアッセイを使用するヒト一次ニューロンにおけるマイクロアレイ分析の結果を示す。分析は、３，０００のＭＯＩでの細胞のＡＡＶ形質導入の１９日後に実施した。グラフは、示されたＺＦＰ－ＴＦに応じて上方または下方制御された遺伝子を例示する。 図９は、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＢＡＣトランスジェニックマウスにおけるＺＦＰのインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）標的関与を示す。パネルＡは、注射に使用されたＡＡＶコンストラクトを示す。コンストラクトは、シナプシンプロモーター、ＺＦＰ－ＫＲＡＢコード配列およびＶｅｎｕｓタグを含有する。パネルＢおよびＣは、新生仔にＺＦＰ－ＫＲＡＢ発現コンストラクトを含有するＡＡＶが脳室内に（ＩＣＶ）注射され、下流分析のために注射の１カ月後に解体される研究デザインを示す。パネルＤは、海馬および皮質におけるＺＦＰ－ＫＲＡＢ（７５０２７）を注射された動物におけるセンス、アンチセンスおよび総Ｃ９ＲＮＡのレベルを示す。パネルＥは、センスおよびアンチセンスＲＮＡフォーカスの代表的な画像ならびにＺＦＰ－ＫＲＡＢ（７５０２７）を注射された動物における海馬のアンモン角（ＣＡ）および歯状回（ＤＧ）領域からの定量化を示す。 同上。

本開示は、拡大されたＧ_４Ｃ_２リピート領域を有するヒトＣ９ｏｒｆ７２遺伝子アレルを優先的に標的とし、これらの突然変異体アレルのＲＮＡへの転写を抑制するジンクフィンガータンパク質ベースの転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）を提供する。このような拡大された領域は、３０より多いＧ_４Ｃ_２リピートを有し得る。本ＺＦＰ－ＴＦは、（ｉ）突然変異体アレルのセンスまたはアンチセンス鎖いずれかのリピート内のＤＮＡモチーフに特異的に結合する少なくとも１つのジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインならびに（ｉｉ）センスおよびアンチセンス方向のいずれかまたは両方でアレルの転写を低減する少なくとも１つの転写リプレッサードメインを含有する融合タンパク質である。ＺＦＰ－ＴＦを患者の神経系（例えば、脳および脊髄）中に導入することによってニューロンにおいて突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２転写物のレベルを低減することは、細胞内での疾患が引き起こす細胞傷害性材料の形成を阻害（例えば、低減または停止）すると予測される。本ＺＦＰ－ＴＦは、Ｃ９ｏｒｆ７２関連障害、例えば、ＡＬＳおよびＣ９ＦＴＤの、予防および軽減を含む処置のために使用され得る。

ＡＬＳおよびＦＴＤを診断、予防および／または処置するための方法および組成物が本明細書において開示される。特に、遺伝子操作された転写因子リプレッサーおよびヌクレアーゼの使用を含む、特定の遺伝子を修飾して（例えば、その発現を調節して）、これらの疾患を処置するための方法および組成物が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、発現の調節は、センスおよび／またはアンチセンス発現の両方を調節することを含む。

したがって、細胞（例えば、ニューロン）においてＣ９ｏｒｆ７２遺伝子のリピートが拡大された突然変異体アレルのセンスおよび／またはアンチセンス転写を抑制する方法（インビボ、エキソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）および／またはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ））が、本明細書において記載される。方法は、細胞を、突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子アレルの１つまたは複数のリプレッサーを用いて処置することを含み、１つまたは複数のリプレッサーは、転写抑制ドメインおよび突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子アレル中の標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。リプレッサー（複数可）は、１つもしくは複数のジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＰ－ＴＦ）、１つもしくは複数のＴＡＬエフェクタードメイン転写因子（ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥ－ＴＦ）および／または１もしくは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子系（シングルガイドＲＮＡ ＤＮＡ結合ドメインを含む）を含み得る。ある特定の実施形態では、２つ以上の異なるリプレッサー（例えば、２つ以上の異なるリプレッサーを含む１つまたは複数の医薬組成物）が使用される。ある特定の実施形態では、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子は、１つまたは複数の（Ｇ_４Ｃ_２）リピートを含む突然変異体アレルを含み、リプレッサーのＤＮＡ結合ドメインによって結合される標的部位は、１または複数の（Ｇ_４Ｃ_２）リピート内であってもよい。したがって、本発明は、それを必要とする対象（例えば、疾患が処置される、および／または症状が寛解される、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤを有する対象）における、センスおよび／またはアンチセンス転写のリプレッサー（例えば、未処置細胞／対象と比較して５０％、７０％まで、またはそれより多い）のための、１つまたは複数の（Ｇ_４Ｃ_２）リピートを含む突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２拡大されたアレルに結合する１または複数のＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦリプレッサー（例えば、１つまたは複数のリプレッサーを含む１つまたは複数の医薬組成物に製剤化される）の使用を提供する。ある特定の実施形態では、センスおよび／またはアンチセンス転写は、正常（対照）レベルの９０％を超えて抑制されない。ある特定の実施形態では、アンチセンスおよびセンス両方の転写は、同一または異なるレベルで抑制される（例えば、アンチセンスおよびセンス転写は、同様に抑制される）；アンチセンス転写は、センス転写よりも多く抑制される、またはセンス転写は、アンチセンス転写よりも多く抑制される。ある特定の実施形態では、特定のセンス転写物が抑制され、一方で他のものは抑制されない。一部の実施形態では、１ｂイントロンセグメント中のプロモーターからの転写は、抑制されず、一方で、１ａイントロン中のプロモーターからの転写およびアンチセンス転写物は抑制される。ある特定の実施形態では、拡大されたリピートを含む転写物が選択的に抑制される（例えば、アンチセンス転写が抑制され、１ａプロモーターからのセンス転写が抑制され、および／または１ｂプロモーターからのセンス転写は抑制されない）。ある特定の実施形態では、本明細書において記載される方法および使用において、１つまたは複数の異なるリプレッサー（例えば、追加の異なるＺＦＰ－ＴＦ、例えば、表１に示されるようなＺＦＰを含む１つまたは複数の追加のＺＦＰ－ＴＦ）と組み合わせてもよい、表１に示されるような、認識ヘリックス領域を含む１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが使用される。ある特定の実施形態では、リプレッサーのうち１つまたは複数が、１つもしくは複数の非ウイルスベクター（例えば、ｍＲＮＡとして）および／またはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ２／９などのＡＡＶ）を使用して細胞に投与される。１つまたは複数のモジュレーター（例えば、リプレッサー）の複数のコピーが、同一または異なる様式（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはＡＡＶ）を使用して投与され得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の異なるモジュレーター（例えば、リプレッサー）を送達するために、同一または異なる様式が使用され得る。生存対象（例えば、ヒト）におけるインビボ法および使用は、それだけには限らないが、脳室内、くも膜下腔内、頭蓋内、後眼窩（ＲＯ）、静脈内、鼻腔内および／または大槽内静脈内を含む、任意の適した手段による投与（例えば、リプレッサーおよび／またはリプレッサーをコードするポリヌクレオチドを含む、１つまたは複数の医薬組成物の）を含み得る。脳投与は、片側性である場合も、両側性（例えば、海馬へ）である場合もある。任意の量（投与量）、例えば、１Ｅ１０～１Ｅ１３（例えば、６Ｅ１１）ｖｇ／半球が投与され得る。本明細書において記載される方法および使用のいずれかでは、対象においてＡＬＳおよび／またはＦＴＤが処置される（および／またはこれらの疾患の１つもしくは複数の症状が処置される）。

Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の遺伝子モジュレーター、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子中の少なくとも１２ヌクレオチドの標的部位と結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＴＡＬエフェクタードメインタンパク質（ＴＡＬＥ）またはシングルガイドＲＮＡ）および転写調節ドメイン（例えば、抑制ドメイン）を含むモジュレーターが本明細書において提供される。１つまたは複数の本明細書において記載される遺伝子モジュレーターをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、ウイルス性または非ウイルス性遺伝子デリバリー媒体、例えば、ＡＡＶベクター）も提供される。他の態様では、本明細書において提供されるような１つもしくは複数のポリヌクレオチドおよび／または１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体を含む医薬組成物が本明細書において記載される。いくつかの実施形態では、遺伝子モジュレーターはレギュレータードメインを含み、遺伝子モジュレーター（および１つもしくは複数の遺伝子モジュレーターまたは１つもしくは複数の遺伝子モジュレーターをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物）は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の発現を調節する（例えば、抑制するかまたは活性化する）。遺伝子のセンスおよび／またはアンチセンス鎖は、結合および／または調節され得る。また、本明細書において記載されるような１つもしくは複数の遺伝子モジュレーターを含む単離された細胞（細胞集団を含む）、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体および／または１つもしくは複数の医薬組成物も本明細書において提供される。細胞において［インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）またはエキソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）］Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子を発現すること（例えば、抑制すること）を調節するための方法および使用も提供され、方法は、［それだけには限らないが、脳室内、くも膜下腔内、頭蓋内、後眼窩（ＲＯ）、静脈内または大槽内を含む任意の方法によって］、本明細書において記載されるような１つもしくは複数の遺伝子モジュレーター、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体および／または１つもしくは複数の医薬組成物を細胞に投与することを含む。方法は、対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の処置および／または予防のために使用され得る。対象におけるＡＬＳまたはＦＴＤの処置および／または予防のための１つもしくは複数の遺伝子モジュレーター、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体および／または１つもしくは複数の医薬組成物の使用も提供される。また、本明細書において記載されるような１つもしくは複数の遺伝子モジュレーター、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体および／または１つもしくは複数の医薬組成物ならびに適宜、使用のための説明書を含むキットも提供される。

したがって、一態様では、１つまたは複数の遺伝子の遺伝子操作された（天然に存在しない）遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）が提供される。これらの遺伝子モジュレーターは、アレルの発現を調節する（例えば、抑制する）系（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ－ＴＦ）を含み得る。野生型および／または突然変異体アレルの発現は、一緒にまたは別個に調節され得る。ある特定の実施形態では、突然変異体アレルの調節は、野生型アレルよりも大きいレベルでである（例えば、野生型アレルは、正常の５０％以下抑制されるが、突然変異体アレルは、未処置対照と比較して少なくとも７０％抑制される）。一部の実施形態では、発現の調節は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子のセンスおよびアンチセンス両転写物を調節することを含み得る。一部の実施形態では、発現の調節は、センス転写物を主に調節する場合があり、他の実施形態では、発現の調節は、アンチセンス転写物を主に調節する場合がある。

Ｃ９ｏｒｆ７２アレルにおける拡大突然変異は、ＡＬＳおよびＦＴＤに関連するセンスおよびアンチセンスＲＮＡ産物両方の発現をもたらし、そのため、一実施形態では、ＡＬＳまたはＦＴＤの処置のために、これらの突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルの発現を抑制するように設計された遺伝子操作された転写因子が提供される。遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、認識ヘリックスまたはＲＶＤ）が予め選択された標的部位と結合するように変更されている（例えば、選択および／または合理的設計によって）天然に存在しないジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質である。本明細書において記載されるジンクフィンガータンパク質のいずれも、１、２、３、４、５、６つ以上のジンクフィンガーを含んでもよく、各ジンクフィンガーは、選択された配列（例えば、遺伝子）中の標的部分部位と結合する認識ヘリックスを有する。ある特定の実施形態では、ＺＦＰ－ＴＦは、表１の単一列に示されるような認識ヘリックス領域を有するＺＦＰを含む。同様に、本明細書において記載されるＴＡＬＥタンパク質のいずれも、任意の数のＴＡＬＥ ＲＶＤを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＶＤは、非特異的ＤＮＡ結合を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの認識ヘリックス（またはＲＶＤ）は、天然に存在しない。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥ－ＴＦは、表１に示されるような標的部位の少なくとも１２塩基対と結合するＴＡＬＥを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦは、標的配列と結合するシングルガイドＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された転写因子は、（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはｓｇＲＮＡ ＤＮＡ結合ドメインを介して）疾患と関連する遺伝子中の少なくとも９～１２塩基対の標的部位、例えば、これらの標的部位（例えば、表１に示されるような標的部位）内の連続または非連続配列を含む、少なくとも９～２０塩基対（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）を含む標的部位と結合する。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、転写抑制ドメインと作動可能に連結された（遺伝子リプレッサーを形成するために）、本明細書において記載されるようなＤＮＡ結合分子（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、シングルガイドＲＮＡ）を含む。

したがって、本明細書において記載されるようなジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣａｓタンパク質またはＴＡＬＥタンパク質は、融合分子の一部として調節ドメイン（または機能的ドメイン）と作動性に連結して配置され得る。機能的ドメインは、例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメインおよび／またはヌクレアーゼ（切断）ドメインであり得る。ＤＮＡ結合分子とともに使用するために活性化ドメインまたは抑制ドメインのいずれかを選択することによって、このような分子は、遺伝子発現を活性化するかまたは抑制するために使用され得る。ある特定の実施形態では、機能的または調節ドメインは、ヒストン翻訳後修飾において役割を果たし得る。いくつかの例では、ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチラーゼ、またはヒストンをＳＵＭＯ化するかもしくはビオチン化する酵素または翻訳後ヒストン修飾によって調節される遺伝子抑制を可能にする他の酵素ドメインである［Ｋｏｕｓａｒｉｄｅｓ， （２００７） Ｃｅｌｌ １２８：６９３－７０５］。いくつかの実施形態では、遺伝子発現を下方制御するために使用され得る転写抑制ドメインに融合された、本明細書において記載されるような遺伝子（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２）を標的とするＺＦＰ、ｄＣａｓまたはＴＡＬＥを含む分子が提供される。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、真核生物を処置するために有用である。ある特定の実施形態では、調節ドメインの活性は、外因性小分子またはリガンドによって調節され、その結果、細胞の転写機構との相互作用は、外因性リガンドの不在下で起こらない。このような外部リガンドは、ＺＦＰ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦまたはＴＡＬＥ－ＴＦの転写機構との相互作用の程度を制御する。調節ドメインは、１つまたは複数のＺＦＰ、ｄＣａｓもしくはＴＡＬＥの間、１つまたは複数のＺＦＰ、ｄＣａｓもしくはＴＡＬＥの外部およびそれらの任意の組合せを含む、ＺＦＰ、ｄＣａｓまたはＴＡＬＥのうち１つまたは複数の任意の部分と作動可能に連結され得る。好ましい実施形態では、調節ドメインは、標的とされる遺伝子（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２）の遺伝子発現の抑制をもたらす。本明細書において記載される融合タンパク質のいずれも、医薬組成物に製剤化され得る。

一部の実施形態では、人工レギュレーターは、遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の上流の（例えば、５’の）プロモーター領域に結合する。一部の実施形態では、人工レギュレーターは、ＴＳＳの下流の領域に結合する。好ましい実施形態では、人工レギュレーターは、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子中の拡大されたリピート領域に優先的に結合する。一部の実施形態では、人工レギュレーターの、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子への結合は、１ａイントロン中のプロモーターの発現を抑制する。一部の実施形態では、人工レギュレーターの、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子への結合は、１ｂイントロン中のプロモーターの発現を抑制する。一部の実施形態では、人工レギュレーターの結合は、１ａプロモーターおよびアンチセンスプロモーターからの発現を抑制するが、１ｂプロモーターを抑制しない。図１Ｂおよび１Ｃも参照のこと。

いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、本明細書において記載されるような２つ以上の融合分子、例えば、２つ以上のＣ９ｏｒｆ７２モジュレーター（人工転写因子）の使用を含む。２つ以上の融合分子は、異なる標的部位と結合し、同一または異なる機能的ドメインを含むこともある。あるいは、本明細書において記載されるような２つ以上の融合分子は、同一標的部位と結合するが、異なる機能的ドメインを含むこともある。いくつかの例では、３つ以上の融合分子が使用され、他方では、４つ以上の融合分子が使用され、他方では、５つ以上の融合分子が使用される。いくつかの実施形態では、２つ以上、３つ以上の、４つ以上または５つ以上の融合分子（またはその構成成分）は、核酸として細胞にデリバリーされる。好ましい実施形態では、融合分子は、標的とされる遺伝子の発現の抑制を引き起こす。いくつかの実施形態では、２つの融合分子は、各分子が自身で活性であるが、組合せでは、抑制活性が相加的である用量で与えられる。いくつかの実施形態では、２つの融合分子は、自身ではいずれも活性ではないが、組合せでは、抑制活性が相乗的である用量で与えられる。

さらに別の態様では、本明細書において記載されるＤＮＡ結合ドメインのいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。いくつかの態様では、ｍＲＮＡは、化学修飾され得る［例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１５４－７］。他の態様では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含み得る（米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照のこと）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、非修飾および修飾ヌクレオチドの混合物を含み得る（米国特許公開第２０１２／０１９５９３６号を参照のこと）。

さらに別の態様では、本明細書において記載されるようなポリヌクレオチド（例えば、リプレッサー）のいずれかを含む遺伝子デリバリーベクターが提供される。ある特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）、組込みコンピテントもしくは組込み欠陥レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）またはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９ベクターまたは偽型ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／９およびＡＡＶ２／６である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、血液脳関門を通過可能なＡＡＶベクターである（例えば、米国特許公開第２０１５／００７９０３８号）。他の実施形態では、ＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃ－ＡＡＶ）または一本鎖（ｓｓ－ＡＡＶ）分子である。また、少なくとも１つのヌクレアーゼ（ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）をコードする配列および／または標的遺伝子への標的化組込みのためのドナー配列を含む、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、ＬＶまたはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）も本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、Ａｄベクターは、キメラＡｄベクター、例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠陥レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）または組込みコンピテントレンチウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ベクターは、ＶＳＶ－Ｇエンベロープを有する、またはその他のエンベロープを有する偽型である。

さらに、核酸および／または人工転写因子（例えば、ＺＦＰ、ＣａｓもしくはＴＡＬＥまたはＺＦＰ、ＣａｓもしくはＴＡＬＥを含む融合分子）などの融合物を含む医薬組成物も提供される。例えば、ある特定の組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わされた、調節配列と作動可能に連結された、本明細書において記載されるＺＦＰ、ＣａｓまたはＴＡＬＥのうち１つをコードする配列を含む核酸を含み、調節配列は、細胞における核酸の発現を可能にする。ある特定の実施形態では、コードされるＺＦＰ、Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥは、野生型および／または突然変異体アレルを調節する。いくつかの実施形態では、突然変異体アレルは、野生型アレルよりも優先的に調節される、例えば、抑制される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、突然変異体アレルを優先的に調節するＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥおよび神経栄養因子を調節するＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥを含む。タンパク質ベースの組成物は、１つまたは複数の本明細書において開示されるＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。

さらに別の態様ではまた、本明細書において記載されるようなタンパク質、融合分子、ポリヌクレオチドおよび／または組成物のいずれかを含む単離された細胞も提供される。単離された細胞は、診断および／もしくはスクリーニング方法のための細胞または動物モデルの提供などの非治療的使用のために、ならびに／またはエキソビボ細胞療法などの治療的使用のために使用され得る。

さらに別の態様ではまた、本明細書において記載されるような１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子デリバリー媒体）および／または１つまたは複数の単離された細胞（例えば、その集団）を含む医薬組成物も提供される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２つ以上の遺伝子モジュレーターを含む。例えば、ある特定の組成物は、本明細書において記載されるような希少疾患と関連する遺伝子のうち１つ（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２）の１つまたは複数の遺伝子モジュレーターをコードする配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーター（例えば、本明細書において記載されるＺＦＰ、ＣａｓまたはＴＡＬＥを含む）は、調節配列に作動可能に連結され、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わされ、調節配列は、細胞における核酸の発現を可能にする。ある特定の実施形態では、コードされるＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥは、突然変異体または野生型アレル（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２）に特異的である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、突然変異体および／または野生型アレル（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２）を調節するＺＦＰ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦまたはＴＡＬＥ－ＴＦを含み、野生型アレルと比較して突然変異体アレルを優先的に調節する（例えば、より大きいレベルで抑制する）ＴＦを含む。タンパク質ベースの組成物は、本明細書において開示されるような１つまたは複数の遺伝子モジュレーターおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。ある特定の実施形態では、２つ以上の遺伝子モジュレーター（同一または異なる種類のベクター、例えば、ＡＡＶベクターに保持される）を含む組成物が使用され、遺伝子モジュレーターのうち１つが、７４９４９、７４９７８、７５０２７または７５１０９と名付けられたＺＦＰを含むＺＦＰ－ＴＦリプレッサーを含んでもよい。

本発明はまた、それを必要とする対象（例えば、本明細書において記載されるような希少疾患を有する対象）において遺伝子発現を抑制するための方法および使用であって、対象に、本明細書において記載されるような１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体および／または医薬組成物を提供することによってを含む方法および使用を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書において記載される組成物は、ＡＬＳもしくはＦＴＤの処置および／または予防のためを含む、対象において突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２発現を抑制するために使用される。本明細書において記載される組成物は、脳（嗅内皮質、海馬、脳幹、線条体、視床、中脳、小脳を含むが、それだけに限らない前頭前皮質、頭頂皮質葉、後頭皮質葉、側頭皮質葉を含むが、それだけには限らない、前頭皮質葉を含むが、それだけには限らない）および脊髄（腰髄、胸髄および頸髄領域を含むがそれだけには限らない）において遺伝子発現を長期間（４週間、３カ月、６カ月～１年以上）抑制する。本明細書において記載される組成物は、対象に、脳室内、くも膜下腔内、頭蓋内、静脈内の、眼窩［後眼窩（ＲＯ）］、鼻腔内および／または大槽内投与を含むがそれだけには限らない任意の投与手段によって提供され得る。本明細書において記載されるような組成物（例えば、遺伝子モジュレーター、ポリヌクレオチド、医薬組成物および／または細胞）のうち１つまたは複数ならびにこれらの組成物の使用のための説明書を含むキットも提供される。

別の態様では、本明細書において記載される方法および組成物を使用してＣＮＳ（例えば、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤ）を処置および／または予防するための方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質が、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）および／またはそれらの組合せを使用してデリバリーされ得る組成物に関与する。いくつかの実施形態では、方法は、人工転写因子（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦまたはｄＣａｓ－ＴＦ）を含む幹細胞集団を含む組成物に関与する。本明細書において記載されるような組成物（タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞ならびに／またはこれらのタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／もしくは細胞を含む医薬組成物）の投与が、それだけには限らないが、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤと関連する臨床症状のいずれかの寛解または排除ならびにＣＮＳ細胞（例えば、ニューロン、星状細胞、ミエリンなど）の機能および／または数の増大を含む治療（臨床）効果をもたらす。ある特定の実施形態では、本明細書において記載される組成物および方法は、標的遺伝子（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２）のセンスおよび／またはアンチセンス転写物の発現を、本明細書において記載されるような人工リプレッサーを受け取っていない対照と比較して、少なくとも３０％または４０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％より多く低減する。いくつかの実施形態では、少なくとも５０％の低減が達成される。ある特定の実施形態では、人工リプレッサーは、野生型アレルと比較して突然変異体アレル（例えば、拡大されたアレル）を例えば、少なくとも２０％優先的に抑制する（例えば、野生型アレルを５０％以下抑制し、突然変異体アレルを少なくとも７０％抑制する）。一部の実施形態では、リプレッサーは、突然変異体アレルでセンス転写物を優先的に抑制し、他の実施形態では、リプレッサーは、突然変異体アレルでアンチセンス転写物を優先的に抑制する。一部の実施形態では、リプレッサーは、突然変異体アレルでセンスおよびアンチセンス転写物を抑制する。

なおさらなる態様では、ウイルスまたは非ウイルスベクターを使用して遺伝子リプレッサーを対象の脳にデリバリーする方法が本明細書において記載される。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ９ベクターである。デリバリーは、カニューレの使用によって、を含む任意の好適な手段による任意の脳領域、例えば、海馬または嗅内皮質へであり得る。直接投与されるベクターではない、脳領域への順行性および逆行性軸索輸送によってを含む、遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）の対象の脳への広範なデリバリーを提供する任意のＡＡＶベクター（例えば、被殻へのデリバリーは、皮質、黒質、視床などといったその他の構造へのデリバリーをもたらす）。ある特定の実施形態では、対象はヒトであり、他の実施形態では、対象は非ヒト霊長類である。投与は、単回用量で、または同時に与えられる一連の用量で、または複数投与（投与間の任意のタイミングで）で、であり得る。

したがって、他の態様では、対象において疾患（例えば、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤ）を予防および／または処置する方法であって、ＡＡＶを使用して遺伝子のリプレッサーを対象に投与することを含む方法が本明細書において記載される。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、対象のＣＮＳ（例えば、海馬および／または嗅内皮質）またはＰＮＳ（例えば、脊髄／液）に投与される。他の実施形態では、リプレッサーは、静脈内に投与される。ある特定の実施形態では、対象においてＡＬＳまたはＦＴＤを予防および／または処置する方法であって、１つまたは複数のＡＡＶベクターを使用してＣ９ｏｒｆ７２アレル（野生型および／または突然変異体）のリプレッサーを対象に投与することを含む方法が本明細書において記載される。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターをコードするＡＡＶは、ＣＮＳ（脳および／またはＣＳＦ）に、それだけには限らないが、脳室内、くも膜下腔内、頭蓋内、静脈内の、鼻腔内の、後眼窩または大槽内デリバリーを含む任意のデリバリー方法によって投与される。他の実施形態では、リプレッサーをコードするＡＡＶが、対象の柔組織（例えば、海馬および／または嗅内皮質）中に直接的に投与される。他の実施形態では、リプレッサーをコードするＡＡＶは、静脈内に（ＩＶ）投与される。本明細書において記載される方法のいずれでも、投与することは、１回行われてもよく（単回投与）、または投与あたり同一または異なる用量で複数回行われてもよい（投与の間の任意の回数を用いて）。複数回投与される場合には、同一または異なる投与量および／または投与様式のデリバリー媒体が使用されてもよい（例えば、ＩＶおよび／またはＩＣＶ投与される異なるＡＡＶベクター）。方法は、すべて方法を受け取っていない対象との比較において、または方法を受け取ることに先立つ対象自体との比較において、筋肉機能の喪失、身体的協調の喪失、筋肉の硬化、筋肉攣縮、言語機能の喪失、嚥下の困難性、認知機能障害を低減する方法、運動機能の喪失を低減する方法および／またはＡＬＳ対象において１つもしくは複数の認知機能の喪失を低減する方法を含む。したがって、本明細書において記載される方法は、以下：筋肉機能の喪失、身体的協調の喪失、筋肉の硬化、筋肉攣縮、言語機能の喪失、嚥下の困難性、認知機能障害、血液ならびに／もしくはＧ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＴＮＦ－αおよびＶＥＧＦレベル［Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１８） ９：２１２２を参照のこと］を含むＡＬＳと関連する脳脊髄液化学物質の変化、ならびに／または当技術分野で公知の他のバイオマーカーのうち１つまたは複数を含む、ＡＬＳまたはＦＴＤなどの希少疾患のバイオマーカーおよび／または症状の低減をもたらす。ある特定の実施形態では、方法は、例えば、ＦＴＤを有する対象において、タウ（ＭＡＰＴ）の１つまたは複数の遺伝子リプレッサーを投与することをさらに含み得る。例えば、米国特許公開第２０１８／０１５３９２１号を参照のこと。

本明細書において記載される方法のいずれにおいても、標的とされるアレルのリプレッサーは、ＺＦＰ－ＴＦ、例えば、アレルと特異的に結合するＺＦＰおよび転写抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）を含む融合タンパク質であり得る。他の実施形態では、標的とされるアレルのリプレッサーは、ＴＡＬＥ－ＴＦ、例えば、遺伝子アレルと特異的に結合するＴＡＬＥポリペプチドおよび転写抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）を含む融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、標的とされるアレルリプレッサーは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦであり、Ｃａｓタンパク質中のヌクレアーゼドメインが不活性化されており、その結果、タンパク質がＤＮＡをもはや切断しない。得られたＣａｓ ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡ結合ドメインは、転写リプレッサー（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）に融合されて、標的とされるアレルを抑制する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された転写因子は、突然変異型アレルの発現を抑制可能であるが、野生型アレルは抑制可能ではない。さらなる実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ヘキサマーＧＧＧＧＣＣ（配列番号１）拡大を優先的に認識する。

いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるような遺伝子リプレッサー（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦ）をコードする配列は、ゲノム中に挿入され（組み込まれ）、他の実施形態では、リプレッサーをコードする配列は、エピソームに維持される。いくつかの例では、ＴＦ融合物をコードする核酸は、プロモーターを含むセーフハーバー部位に挿入され（例えば、ヌクレアーゼ媒介性組込みによって）、その結果、内因性プロモーターが発現を駆動する。他の実施形態では、リプレッサー（ＴＦ）ドナー配列は、セーフハーバー部位中に挿入され（ヌクレアーゼ媒介性組込みによって）、ドナー配列は、リプレッサーの発現を駆動するプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、広く発現されるが、他の実施形態では、プロモーターは、組織または細胞／型特異的である。好ましい実施形態では、プロモーター配列は、神経細胞にとって特異的である。他の実施形態では、プロモーター配列は、筋肉細胞に特異的である。いくつかの実施形態では、選択されるプロモーターは、低発現を有することを特徴とする。有用なプロモーターの非限定的な例として、中性特異的プロモーターＮＳＥ、Ｓｙｎａｐｓｉｎ、ＣＡＭＫｉｉａおよびＭＥＣＰが挙げられる。遍在性プロモーターの非限定的な例として、ＣＭＶ、ＣＡＧおよびＵｂｃが挙げられる。さらなる実施形態は、米国特許公開第２０１５／０２６７２０５号に記載されるような自己調節性プロモーターの使用を含む。さらなる実施形態は、米国特許公開第２０１５／０２６７２０５号に記載されるような自己調節性プロモーターの使用を含む。

本明細書において記載される方法のいずれかにおいて、方法は、対象（例えば、ＡＬＳを有する対象）の１つまたは複数のニューロンにおける標的アレル（例えば、突然変異体または野生型Ｃ９ｏｒｆ７２）の約５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上または約９５％以上の抑制、９８％以上または９９％以上をもたらし得る。ある特定の実施形態では、野生型アレルの発現は、対象において（未処置対象と比較して）５０％以下抑制され、突然変異体アレルは、対象（未処置対象と比較して）において少なくとも７０％（７０％またはそれより上の任意の値）抑制される。一部の実施形態では、アンチセンスプロモーターの発現は、少なくとも７０％抑制される。ある特定の実施形態では、Ｃ９ｏｒｆ７２イントロン１ａ、１ｂおよび／または１ｃの領域において見出されるアンチセンスプロモーターの発現は、少なくとも７０％抑制され、一方で、Ｃ９ｏｒｆ７２イントロン１ｂの領域におけるセンスプロモーターの発現は、５０％以下抑制される。

本明細書において記載される方法のいずれにおいても、レギュレーター（例えば、リプレッサーまたはアクチベーター）は、対象に、タンパク質、ポリヌクレオチドまたはタンパク質およびポリヌクレオチドの任意の組合せとしてデリバリーされ得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のリプレッサーは、ＡＡＶベクターを使用してデリバリーされる。他の実施形態では、レギュレーター（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｓｇＲＮＡ）の少なくとも１つの成分は、ＲＮＡ形態としてデリバリーされる。他の実施形態では、レギュレーターは、本明細書において記載される発現コンストラクト、例えば、１つの発現コンストラクト（ＡＡＶ９）上の１つのリプレッサー（またはその一部）および別個の発現コンストラクト（ＡＡＶまたはその他のウイルス性もしくは非ウイルス性コンストラクト）上の１つのリプレッサー（またはその一部）のいずれかの組合せを使用してデリバリーされる。

さらに、本明細書において記載される方法のいずれにおいても、レギュレーター（例えば、リプレッサー）は、細胞に（エキソビボまたはインビボで）所望の効果を提供する任意の濃度（用量）でデリバリーされ得る。いくつかの実施形態では、レギュレーターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを１０，０００～５００，０００ベクターゲノム／細胞（またはその間の任意の値）で使用してデリバリーされる。ある特定の実施形態では、レギュレーターは、レンチウイルスベクターを、２５０から１，０００の間（またはその間の任意の値）のＭＯＩで使用してデリバリーされる。他の実施形態では、レギュレーターは、プラスミドベクターを０．０１～１，０００ｎｇ／１００，０００個細胞（またはその間の任意の値）で使用してデリバリーされる。他の実施形態では、リプレッサーは、ｍＲＮＡとして１５０～１，５００ｎｇ／１００，０００個細胞（またはその間の任意の値）でデリバリーされる。さらに、インビボ使用のために、本明細書において記載される方法のいずれかにおいて、遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）は、それを必要とする対象において所望の効果をもたらす任意の濃度（用量）でデリバリーされ得る。いくつかの実施形態では、リプレッサーは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを１０，０００～５００，０００ベクターゲノム／細胞（またはその間の任意の値）で使用してデリバリーされる。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、レンチウイルスベクターを２５０から１，０００の間（またはその間の任意の値）のＭＯＩで使用してデリバリーされる。他の実施形態では、リプレッサーは、プラスミドベクターを０．０１～１，０００ｎｇ／１００，０００個細胞（またはその間の任意の値）で使用してデリバリーされる。他の実施形態では、リプレッサーは、ｍＲＮＡとして０．０１～３０００ｎｇ／細胞数（例えば、５０，０００～２００，０００個（例えば、１００，０００）個細胞（またはその間の任意の値）でデリバリーされる。他の実施形態では、リプレッサーは、１～３００μＬの固定容量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、１Ｅ１１～１Ｅ１４ＶＧ／ｍｌで脳柔組織へデリバリーされる。他の実施形態では、リプレッサーは、０．５～１０ｍｌの固定容量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、１Ｅ１１～１Ｅ１４ＶＧ／ｍｌでＣＳＦへデリバリーされる。

本明細書において記載される方法のいずれにおいても、方法は、対象の１つまたは複数の細胞において標的とされるアレルの約５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上または約９５％以上の調節（例えば、抑制）をもたらし得る。いくつかの実施形態では、野生型および突然変異体アレルは、異なって調節される、例えば、突然変異体アレルは、野生型アレルと比較して優先的に修飾される（例えば、突然変異体アレルは、少なくとも７０％抑制され、野生型アレルは、５０％以下抑制される）。

本明細書において記載される方法のいずれかでは、方法は、対象の１つまたは複数の細胞において標的とされたアレル（複数可）のアンチセンス発現の約５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上または約９５％以上の調節（例えば、抑制）をもたらし得る。一部の実施形態では、突然変異体アレルにおけるセンス発現およびアンチセンス発現は、異なって調節される、例えば、アンチセンス転写物の発現は、突然変異体アレルにおけるセンス転写物の発現と比較して優先的に調節される（例えば、アンチセンス発現は、少なくとも７０％抑制され、センス発現は、５０％以下抑制される）。

さらなる態様では、本明細書において記載されるような転写因子、例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ－ＴＦ）、ＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ－ＴＦ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦのうち１つまたは複数、例えば、ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦを含む転写因子が、対象の脳（例えば、ニューロン）において突然変異体および／または野生型アレル（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２）の発現を抑制するために使用される。抑制は、対象の未処置（野生型）細胞と比較した、対象の１つまたは複数の細胞における、標的とされるアレルの約５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、約７５％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上または約９５％以上の抑制であり得る。ある特定の実施形態では、野生型アレルの抑制は、５０％以下（未処置細胞または対象と比較して）であり、突然変異体（罹患またはアイソフォーム変異体）の抑制は、少なくとも７０％である（未処置細胞または対象と比較して）。ある特定の実施形態では、アンチセンス転写は、完全に（十分に）抑制される。ある特定の実施形態では、センス転写物の抑制は、５０％以下（未処置細胞または対象と比較して）であり、アンチセンス転写物の抑制は、少なくとも７０％（未処置細胞または対象と比較して）である。ある特定の実施形態では、標的とされる転写因子の調節は、本明細書において記載される方法のうち１つまたは複数を達成するために使用され得る。

したがって、外因性配列（人工ＴＦなど）の発現を用いるかまたは用いない抑制を含む、本明細書において開示される希少障害と関連する遺伝子の発現を調節するための方法および組成物が、本明細書において記載される。組成物および方法は、インビトロ（例えば、その調節による、薬物発見のためならびに／またはトランスジェニック動物および動物モデルを作製するための、標的遺伝子の研究のための細胞の提供のため）、インビボまたはエキソビボで使用するためである場合があり、適宜、ヌクレアーゼによる切断後に遺伝子中に組み込まれるドナーを有するヌクレアーゼの場合には、希少疾患と関連する遺伝子を標的とするＤＮＡ結合分子を含む人工転写因子またはヌクレアーゼを投与することを含む。いくつかの実施形態では、ドナー遺伝子（導入遺伝子）は、細胞において染色体外で維持される。ある特定の実施形態では、細胞は、疾患を有する患者中にある。他の実施形態では、細胞は、本明細書において記載される方法のいずれによっても修飾され、修飾された細胞は、それを必要とする対象（例えば、希少疾患を有する対象）に投与される。本明細書において記載される方法によって作製された細胞を含む、遺伝的に修飾された遺伝子（例えば、外因性配列）を含む遺伝的に修飾された細胞（例えば、幹細胞、前駆体細胞、Ｔ細胞、筋肉細胞など）も提供される。これらの細胞は、例えば、細胞を、それを必要とする対象に投与することによって、あるいは、細胞によって産生されるタンパク質を単離することおよびタンパク質を、それを必要とする対象に投与すること（酵素置換療法）によって、希少疾患を有する対象に治療用タンパク質を提供するために使用され得る。

また、本明細書において記載されるような遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）および／または標的－モジュレーター（またはその構成成分）の構成成分を含むポリヌクレオチドおよび／または標的－モジュレーター（またはその構成成分）をコードするポリヌクレオチドのうち１つまたは複数を含むキットも提供される。キットは、細胞（例えば、ニューロンまたは筋肉細胞）、試薬（例えば、例えば、ＣＳＦにおいてタンパク質を検出および／または定量化するための）および／または本明細書において記載されるような方法を含む使用するための説明書をさらに含み得る。

本方法および組成物は、以下に詳細にさらに記載される。

Ｉ．ジンクフィンガータンパク質転写因子
本ＺＦＰ－ＴＦは、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写リプレッサードメインを含有する融合タンパク質であり、２つのドメインは、直接ペプチジル連結もしくはペプチドリンカーによって、または二量体化（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメインまたはＦＫ５０６結合タンパク質を介した）によって互いに会合し得る。本明細書において、「融合タンパク質」とは、共有結合によって連結されたドメインを有するポリペプチドならびに非共有結合によって互いに会合しているポリペプチドの複合体を指す。転写リプレッサードメインは、ＺＦＰドメインのＣ末端またはＮ末端を含む任意の適した位置でＺＦＰドメインと会合し得る。

一部の実施形態では、本ＺＦＰ－ＴＦは、ヒト突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の転写を４５％以上（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上）抑制する。一部の実施形態では、患者において本ＺＦＰ－ＴＦのうち２つ以上が同時に使用され、ＺＦＰ－ＴＦは、突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２転写の最適抑制を達成するために、拡大されたＣ９ｏｒｆ７２領域のセンスおよび／またはアンチセンス鎖中の異なるＤＮＡモチーフに結合する。

Ａ．ＺＦＰドメインの標的
本融合タンパク質のＺＦＰドメインは、突然変異体ヒトＣ９ｏｒｆ７２遺伝子アレル中の拡大された領域に優先的に結合する。ヒトＣ９ｏｒｆ７２遺伝子は、９番染色体の短い（ｐ）アームの位置２１．２に（９ｐ２１．２）位置する。染色体上の塩基対２７，５４６，５４６～２７，５７３，８６６にまたがる。ヒトＣ９ｏｒｆ７２のゲノム構造は、図１Ａに示されている。ＺＦＰ－ＴＦのＤＮＡ結合性ＺＦＰドメインは、融合タンパク質を、突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の拡大されたリピート領域に向け、融合タンパク質の転写リプレッサードメインを標的領域にもたらす。次いで、リプレッサードメインは、ＲＮＡポリメラーゼによるＣ９ｏｒｆ７２遺伝子転写を抑制する。

一部の実施形態では、拡大された領域中の標的配列は、少なくとも８ｂｐの長さである。例えば、標的配列は、８ｂｐ～４０ｂｐの長さ、例えば、１２、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、３０、３３または３６ｂｐの長さであり得る。ある特定の実施形態では、本ＺＦＰ－ＴＦの標的配列は、１２～２０（例えば、１２～１８、１５～１９、１５、１８または１９）ｂｐの長さである。一部の実施形態では、標的配列は、連続していない部分配列を含む。

Ｇ_４Ｃ_２リピートは、遺伝子のセンスおよびアンチセンス鎖中に以下のヘキサヌクレオチドＤＮＡモチーフを生じさせる：
センスＣ９ｏｒｆ７２鎖中のモチーフ：
（ｉ） ＧＧＧＧＣＣ（配列番号１）
（ｉｉ） ＧＧＧＣＣＧ（配列番号２）
（ｉｉｉ） ＧＧＣＣＧＧ（配列番号３）
（ｉｖ） ＧＣＣＧＧＧ（配列番号４）
（ｖ） ＣＣＧＧＧＧ（配列番号５）
（ｖｉ） ＣＧＧＧＧＣ（配列番号６）

アンチセンスＣ９ｏｒｆ７２鎖中のモチーフ：
（ｖｉｉ） ＧＧＣＣＣＣ（配列番号７）
（ｖｉｉｉ） ＧＣＣＣＣＧ（配列番号８）
（ｉｘ） ＣＣＣＣＧＧ（配列番号９）
（ｘ） ＣＣＣＧＧＣ（配列番号１０）
（ｘｉ） ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１１）
（ｘｉｉ） ＣＧＧＣＣＣ（配列番号１２）

一部の実施形態では、本ＺＦＰ－ＴＦの標的配列は、これらのＤＮＡモチーフの１つまたは複数の（例えば、２、３または４つの）タンデムリピートを含む。一部の実施形態では、標的配列は、モチーフのうち１つの３つのタンデムリピートからなる。一部の実施形態では、標的配列は、モチーフの１つまたは複数の（例えば、２つまたは３つの）タンデムリピートおよび上流および／または下流の隣接配列から少数の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの）ヌクレオチド（例えば、ＣＣ（Ｇ_４Ｃ_２）_２ＧＧ）（配列番号７５）を含む。

標的配列は、遺伝子のセンス鎖上にある場合も、遺伝子のアンチセンス鎖上にある場合もある。ある特定の実施形態では、患者において使用されるＺＦＰ－ＴＦは、突然変異体アレルのセンスおよびアンチセンス鎖両方に結合する。標的化の正確性を確実にするために、ＺＦＰ－ＴＦによるオフターゲット結合を低減するために、選択されたＣ９ｏｒｆ７２標的領域の配列は、ゲノム中の他の遺伝子中の配列に対して、好ましくは、７５％未満の相同性（例えば、７０％未満、６５％未満、６０％未満または５０％未満の相同性）を有する。

標的セグメントをさらに評価するための他の基準として、このようなセグメントまたは関連セグメントへのＺＦＰ結合のこれまでの利用可能性、所与の標的セグメントに結合する新規ＺＦＰを設計する容易さおよびオフターゲット結合のリスクが挙げられる。

Ｂ．ジンクフィンガータンパク質ドメイン
「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」とは、亜鉛によって安定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を指す。ＺＦＰは、配列特異的にＤＮＡに結合する。個々のＤＮＡ結合ドメインは、「フィンガー」と呼ばれる。ＺＦＰは、少なくとも１つのフィンガーを有し、各フィンガーは、ＤＮＡの２～４の塩基対、通常、ＤＮＡの３または４の塩基対に結合する。各ジンクフィンガーは、通常、およそ３０個のアミノ酸を含み、亜鉛をキレートする。遺伝子操作されたＺＦＰは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有し得る。遺伝子操作法として、それだけには限らないが、合理的な設計および種々の種類の選択が挙げられる。合理的な設計は、例えば、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１個または複数のアミノ酸配列と関連している。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、同５，９２５，５２３号、同６，００７，９８８号、同６，０１３，４５３号、同６，１４０，０８１号、同６，２００，７５９号、同６，４５３，２４２号、同６，５３４，２６１号、同６，９７９，５３９号、同８，５８６，５２６号、同８，８４１，２６０号、同８，９５６，８２８号および同９，２３４，０１６号ならびに国際特許公開ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０１６５３６、ＷＯ０２／０９９０８４およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されるＺＦＰ設計法を参照のこと。

本ＺＦＰ－ＴＦのＺＦＰドメインは、少なくとも３つの（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３またはそれより多い）ジンクフィンガーを含み得る。３つのフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、９～１２ヌクレオチドを含む標的部位を認識する。４つのフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、１２～１５ヌクレオチドを含む標的部位を認識する。５つのフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、１５～１８ヌクレオチドを含む標的部位を認識する。６つのフィンガーを有するＺＦＰドメインは、１８～２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識できる。

ＺＦＰドメインの標的特異性は、例えば、米国特許公開第２０１８／００８７０７２号に記載されるようなＺＦＰ骨格へ突然変異によって改善され得る。突然変異には、ＤＮＡ骨格上のリン酸と非特異的に相互作用できるが、ヌクレオチド標的特異性には関与しないＺＦＰ骨格中の残基に行われるものが含まれる。一部の実施形態では、これらの突然変異は、カチオン性アミノ酸残基を、中性またはアニオン性アミノ酸残基に突然変異することを含む。一部の実施形態では、これらの突然変異は、極性アミノ酸残基を、中性または非極性アミノ酸残基に突然変異することを含む。さらなる実施形態では、突然変異は、ＤＮＡ結合性ヘリックスに対して（－５）、（－９）および／または（－１４）の位置で行われる。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）の位置に１つまたは複数の突然変異を含み得る。さらなる実施形態では、マルチフィンガーＺＦＰドメイン中の１つまたは複数のジンクフィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）の位置に突然変異を含み得る。一部の実施形態では、（－５）、（－９）および／または（－１４）の位置のアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ））が、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）および／またはグルタミン（Ｑ）に突然変異される。一部の実施形態では、（－５）の位置のＲ残基は、Ｑに突然変異される。

あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼ例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩの認識配列は公知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号および同第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９７） ２５：３３７９－８８； Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ （１９８９） ８２：１１５－８； Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９４） ２２：１１２５－７； Ｊａｓｉｎ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． （１９９６） １２：２２４－８； Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． （１９９６） ２６３：１６３－８０； Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． （１９９８） ２８０：３４５－５３；ならびにＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログを参照のこと。

一部の実施形態では、本ＺＦＰ－ＴＦは、１つまたは複数のジンクフィンガードメインを含む。ドメインは、拡大可能な可動性リンカーを介して一緒に連結されることがあり、その結果、例えば、１つのドメインが、１つまたは複数の（例えば、４、５または６の）ジンクフィンガーを含み、別のドメインが、追加の１つまたは複数の（例えば、４、５または６つの）ジンクフィンガーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、標準のフィンガー間リンカーであり、その結果、フィンガーアレイが、８、９、１０、１１または１２またはそれより多いフィンガーを含む１つのＤＮＡ結合ドメインを含む。他の実施形態では、リンカーは、可動性リンカーなどの非定型リンカーである。例えば、２つのＺＦＰドメインは、立体配置（Ｎ末端からＣ末端に）ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＦ－ＺＦＰ－ＺＦＰ、ＺＦＰ－ＴＦ－ＺＦＰまたはＺＦＰ－ＴＦ－ＺＦＰ－ＴＦ（２つのＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質が、リンカーを介して一緒に融合されている）で転写リプレッサーＴＦに連結され得る。

一部の実施形態では、ＺＦＰ－ＴＦは、「両手型」である、すなわち、それらは、介在するアミノ酸によってわけられた２つのジンクフィンガークラスター（２つのＺＦＰドメイン）を含有し、その結果、２つのＺＦＰドメインは、２つの不連続標的部位に結合する。両手型のジンクフィンガー結合タンパク質の一例として、ＳＩＰ１があり、４つのジンクフィンガーのクラスターが、タンパク質のアミノ末端に位置し、３つのフィンガーのクラスターが、カルボキシル末端に位置する［Ｒｅｍａｃｌｅ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． （１９９９） １８（１８）：５０７３－８４を参照のこと］。これらのタンパク質中のジンクフィンガーの各クラスターは、独特の標的配列と結合可能であり、２つの標的配列間の空間は、多数のヌクレオチドを含み得る。

代替実施形態では、機能においてＺＦＰ－ＴＦと同様であるタンパク質が、ＺＦＰ－ＴＦの代わりに使用され得る。例えば、ＺＦＰドメインの代わりに、転写リプレッサー融合タンパク質は、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインに由来するＤＮＡ結合ドメインを含み得る。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号および同９，４５８，２０５号、米国特許公開第２０１３／０１９６３７３号および同２０１３／０２５３０４０号、ＷＯ２０１０／０７９４３０、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ （２００６） １６３（３）：２５６－７２）、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００７） ３１８：６４８－５１、Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００９） ３２６：１５０１およびＢｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００９） ３２６：１５０９－１２を参照のこと。さらに別の例では、転写リプレッサー融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のシングルガイドＲＮＡであるＤＮＡ結合ドメインを含み得る。例えば、米国特許公開第２０１５／００５６７０５号、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１２） ３３７：８１６；Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． （２０１３） １４：１０７；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１３） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１（３）：２２７を参照のこと。

Ｃ．転写リプレッサードメイン
本ＺＦＰ－ＴＦは、突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルの転写活性を弱める、１つまたは複数の転写リプレッサードメインを含む。転写リプレッサードメインの限定されない例として、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメイン、ＫＡＰ－１、ＭＡＤ、ＦＫＨＲ、ＥＧＲ－１、ＥＲＤ、ＳＩＤ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ＥＲＢ－Ａ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、ＲｂおよびＭｅＣＰ２がある。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （１９９９） ９９：４５１－５４；Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （１９９９） ９９：４４３－４６；Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （１９９９） ９９：４４７－５０；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． （２０００） ２５：３３８－４２を参照のこと。さらなる例示的抑制ドメインとして、それだけには限らないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられる。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ （１９９６） ８：３０５－２１； およびＷｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． （２０００） ２２：１９－２７を参照のこと。

一部の実施形態では、転写リプレッサードメインは、ヒトジンクフィンガータンパク質１０／ＫＯＸ１（ＺＮＦ１０／ＫＯＸ１）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿０１５３９４．４）のクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン由来の配列を含む。例示的ＫＲＡＢドメイン配列は以下である：
ＤＡＫＳＬＴＡＷＳＲ ＴＬＶＴＦＫＤＶＦＶ ＤＦＴＲＥＥＷＫＬＬ ＤＴＡＱＱＩＶＹＲＮ ＶＭＬＥＮＹＫＮＬＶ ＳＬＧＹＱＬＴＫＰＤ ＶＩＬＲＬＥＫＧＥＥ ＰＷＬＶＥＲＥＩＨＱ ＥＴＨＰＤＳＥＴＡＦ ＥＩＫＳＳＶ（配列番号１３）

このＫＲＡＢ配列の変異体も、同一または同様の転写リプレッサー機能を有する限り使用され得る。

Ｄ．ペプチドリンカー
本ＺＦＰ－ＴＦのＺＦＰドメインおよび転写リプレッサードメインならびに／またはＺＦＰドメイン内のジンクフィンガーは、ペプチドリンカー、例えば、約５～２００個のアミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれより多いアミノ酸）の非切断性ペプチドリンカーを介して連結され得る。いくつかの好ましいリンカーは、組換え融合タンパク質として合成される可動性アミノ酸配列である。例えば、上記の説明および米国特許第６，４７９，６２６号、同６，９０３，１８５号、同７，１５３，９４９号、同８，７７２，４５３号および同９，１６３，２４５号ならびにＷＯ２０１１／１３９３４９を参照のこと。本明細書において記載されるタンパク質は、適したリンカーの任意の組合せを含み得る。リンカーの限定されない例として、ＤＧＧＧＳ（配列番号１４）、ＴＧＥＫＰ（配列番号１５）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号１６）、ＧＧＲＲ（配列番号１７）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号１８）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号１９）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号２０）、ＬＲＱＫＤ（Ｇ_３Ｓ）_２ＥＲＰ（配列番号２１）、ＴＧＳＱＫＰ（配列番号２２）、ＬＲＱＫＤＡＡＲＧＳ（配列番号２６）、およびＬＲＱＫＤＡＡＲＧＳＧＧ（配列番号７６）がある。

一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、３～２０個のアミノ酸残基の長さであり、Ｇおよび／またはＳが豊富である。このようなリンカーの限定されない例として、Ｇ_４Ｓ型リンカー（配列番号２３として開示される「Ｇ_４Ｓ」）、すなわち、１つもしくは複数の（例えば、２、３または４つの）ＧＧＧＧＳ（配列番号２３）モチーフまたはモチーフの変形（例えば、モチーフ中に１つ、２つまたは３つのアミノ酸挿入、欠失および置換を有するもの）を含有するリンカーがある。

一部の実施形態では、ＺＦＰ－ＴＦは、核局在性シグナル（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原に由来するもの）および／またはエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび血球凝集素）を含む。

ＩＩ．ＺＦＰ－ＴＦの発現
本開示のＺＦＰ－ＴＦは、それをコードする核酸分子によって患者に導入され得る。例えば、核酸分子は、ＲＮＡ分子であり、ＲＮＡ分子は、脂質：核酸複合体（例えば、リポソーム）を含む組成物の注射によって患者の脳中に導入される。あるいは、ＺＦＰ－ＴＦは、ＺＦＰ－ＴＦのコード配列を含む核酸発現ベクターによって患者に導入され得る。発現ベクターは、神経系（例えば、中枢神経系）の細胞におけるＺＦＰ－ＴＦのコード配列の発現を可能にする発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列および転写終結配列を含み得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、安定なエピソームとして細胞中に存在するままである。他の実施形態では、発現ベクターは、細胞のゲノム中に組み込まれる。

一部の実施形態では、脳におけるＺＦＰ－ＴＦ発現を指示するためのベクター上のプロモーターは、構成的に活性なプロモーターまたは誘導プロモーターである。適したプロモーターとして、制限するものではないが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター（ＲＳＶエンハンサーを有してもよい）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶエンハンサーを有してもよい）、ＣＭＶ最初期プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦｌαプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲ、クレアチンキナーゼベースの（ＣＫ６）プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）プロモーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２因子（Ｅ２Ｆ）プロモーター、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ （１９９１） １０８（２）：１９３－９）およびＲＵ－４８６応答性プロモーターが挙げられる。ニューロン特異的プロモーター、例えば、シナプシンＩプロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）プロモーター、メチルＣｐＧ結合性タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーター、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）プロモーターおよびカルビンディン（Ｃａｌｂ）プロモーターも使用され得る。星状細胞特異的プロモーター、例えば、グリア線維性酸性タンパク質タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＬ１（Ａｌｄｈ１Ｌ１）プロモーターも使用され得る。乏突起神経膠細胞特異的プロモーター、例えば、Ｏｌｉｇ２プロモーターも使用され得る。さらに、プロモーターは、それによってＺＦＰ－ＴＦが結合し、自身の発現レベルをプリセットした閾値に抑制できる１つまたは複数の自己調節性エレメントを含み得る。米国特許第９，６２４，４９８号を参照のこと。

それだけには限らないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リポソーム、核局在性シグナルと組み合わせたリポソーム、天然に存在するリポソーム（例えば、エキソソーム）またはウイルス性形質導入を含む、ヌクレオチド配列を細胞中に導入する任意の方法が使用され得る。

発現ベクターのインビボ送達のために、ウイルス性形質導入が使用され得る。本開示における使用のために当技術分野で公知の種々のウイルスベクター、例えば、ワクシニアベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクターおよびハイブリッドウイルスベクターが適応され得る。一部の実施形態では、本明細書において使用されるウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶが分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し、極めて低い免疫原性を有し、ウイルスゲノムが、長期発現のための安定なエピソーム構造として存在するので、ＡＡＶベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）遺伝子送達に特に適している（Ｈａｄａｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． （２０１０） １８：１４５８－６１；Ｚａｉｓｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． （２００８） １５：８０８－１６）。任意の適したＡＡＶ血清型が使用され得る。例えば、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０、または偽型のもの（例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／９またはＡＡＶ２／６／９）であり得る。例えば、米国特許第７，１９８，９５１号および同９，５８５，９７１号を参照のこと。

一部の実施形態では、発現ベクターは、ＡＡＶベクターであり、そのゲノムが、産生系、例えば、昆虫細胞／バキュロウイルス産生系または哺乳動物細胞産生系におけるＡＡＶビリオンの産生を可能にするように両端にＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）配列を有することを含むコンストラクトを含む組換えＡＡＶビリオンによって、標的ヒト細胞に導入される。ＡＡＶは、そのカプシドタンパク質がヒトにおいて低減された免疫原性または増強された形質導入能を有するように遺伝子操作され得る。一部の実施形態では、ＡＡＶ９が使用される。本明細書において記載されるウイルスベクターは、当技術分野で公知の方法を使用して生成され得る。ウイルス粒子を生成するために任意の適した許容またはパッケージング細胞種が使用され得る。例えば、パッケージング細胞株として哺乳動物（例えば、２９３）または昆虫（例えば、Ｓｆ９）細胞が使用され得る。

それを必要とする患者の神経系において、ＺＦＰを含む治療用タンパク質を発現させる方法については、米国特許第６，３０９，６３４号、同６，４５３，２４２号、同６，５０３，７１７号、同６，５３４，２６１号、同６，５９９，６９２号、同６，６０７，８８２号、同６，６８９，５５８号、同６，８２４，９７８号、同６，９３３，１１３号、同６，９５３，５７５号、同６，９７９，５３９号、同７，０１３，２１９号、同７，１６３，８２４号、同７，１８２，９４４号、同８，３０９，３５５号、同８，３３７，４５８号、同８，５８６，５２６号、同９，０５０，２９９号および同９，０８９，６６７号も参照のこと。

ＩＩＩ．医薬適用
本ＺＦＰ－ＴＦは、Ｃ９ｏｒｆ７２発現の下方制御、特に、突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルの発現の下方制御を必要とする患者を処置するために使用できる。患者は、Ｃ９ｏｒｆ７２関連神経変性性疾患、例えば、ＡＬＳおよびＣ９ＦＴＤを患っている、またはそれを発生するリスクにある。リスクにある患者として、遺伝的な傾向があるもの、反復された脳傷害、例えば、脳震盪に苦しんできたものおよび環境的神経毒に曝露されてきたものが挙げられる。本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２関連神経疾患（例えば、ＡＬＳおよびＣ９ＦＴＤ）を、それを必要とする対象、例えば、ヒト患者において処置する方法であって、対象の神経系（例えば、ＣＮＳ）に、ＺＦＰ－ＴＦ（例えば、それを発現するｒＡＡＶベクター）の治療上有効な量（例えば、突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレル発現の十分な抑制を可能にする量）を導入することを含む方法を提供する。「処置する」という用語は、症状の軽減、症状の発症の予防、疾患進行の減速、生活の質の改善および生存の増大を包含する。

本開示は、その組換えゲノムがＺＦＰ－ＴＦの発現カセットを含むウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、水、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、デキストロース、グリセロール、スクロース、ラクトース、ゼラチン、デキストラン、アルブミンまたはペクチンをさらに含み得る。さらに、組成物は、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、分解防止剤または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬を含有し得る。医薬組成物は、送達媒体、例えば、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子および小胞を含有し得る。

本開示の治療薬によって標的とされる細胞は、制限するものではないが、神経細胞（例えば、運動ニューロン、感覚ニューロン、ドーパミンニューロン、コリン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロンまたはセロトニン作動性ニューロン）、グリア細胞（例えば、乏突起神経膠細胞、星状細胞、周皮細胞、シュワン細胞または小グリア細胞）、上衣細胞または神経上皮細胞を含む、脳および／または脊髄中の細胞である。標的とされる脳領域は、皮質領域、前頭側頭型領域、嗅内皮質、海馬、小脳、脳橋および髄質であり得る。これらの領域は、海馬内注射、大脳内注射、大槽内（ＩＣＭ）注射によって、より一般的には、実質内注射、脳室内（ＩＣＶ）注射、くも膜下腔内注射または静脈内注射によって直接到達され得る。他の投与経路として、制限するものではないが、大脳内、脳室内、鼻腔内または眼球内投与が挙げられる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、例えば、くも膜下腔内および／もしくは大脳内の注射または大槽内注射または脳室内注射による脳脊髄液（ＣＳＦ）中への直接投与後、ＣＮＳ組織中に広がる。他の実施形態では、ウイルスベクターは、静脈内投与後に、血液脳関門を通過し、対象のＣＮＳ組織中にわたる広範な分布を達成する。他の実施形態では、ウイルスベクターは、実質内注射によって標的領域に直接デリバリーされる。一部の場合には、ウイルスベクターは、実質内送達後に他の脳領域への逆行性または順行性輸送を受ける場合がある。一部の態様では、ウイルスベクターは、別個のＣＮＳ組織標的化能（例えば、ＣＮＳ組織指向性）を有し、これによって安定な非毒性遺伝子導入を高効率で達成される。

例として、医薬組成物は、脳室内投与を介して患者に、例えば、患者の前脳の脳室領域、例えば、右側脳室、左側脳室、第３脳室または第４脳室中に提供され得る。医薬組成物は、大脳内投与、例えば、脳の大脳、髄質、脳橋、小脳、頭蓋内腔、髄膜、硬膜、くも膜または脳軟膜中またはその付近への組成物の注射を介して患者に提供され得る。大脳内投与は、一部の場合には、薬剤の、脳周囲のくも膜下腔の脳脊髄液（ＣＳＦ）への投与を含み得る。

一部の場合には、大脳内投与は、定位固定手順を使用する注射を含む。定位固定手順は、当技術分野で周知であり、通常、注射を特定の大脳内領域、例えば、脳室領域へガイドするために一緒に使用されるコンピュータおよび三次元スキャニングデバイスの使用を含む。マイクロインジェクションポンプ（例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）も使用され得る。一部の場合には、ウイルスベクターを含む組成物を送達するためにマイクロインジェクションポンプが使用される。一部の場合には、組成物の注入速度は、１μｌ／分～１００μｌ／分の範囲にある。当業者には理解されるであろうが、注入速度は、例えば、対象の年齢、対象の体重／大きさ、ＡＡＶの血清型、必要な投与量および標的とされる大脳内領域を含む種々の因子に応じて変わる。したがって、当業者によって、他の注入速度がある特定の状況において適当であると考えられ得る。

対象へのｒＡＡＶの送達は、例えば、静脈内投与によって達成され得る。ある特定の例では、ｒＡＡＶを脳組織、脊髄、脳脊髄液（ＣＳＦ）、神経細胞、グリア細胞、髄膜、星状細胞、乏突起膠細胞、間質性空間などに局所的に送達することが望ましい場合がある。一部の場合には、組換えＡＡＶ（例えば、１０^７～１０^１５Ｖｇ／用量）が、脳室領域中への、および／または海馬、皮質、小脳小葉または他の脳領域への注射によってＣＮＳに直接送達され得る。ＡＡＶは、当技術分野で公知の神経外科的技術を使用して、例えば、定位固定注射によってニードル、カテーテルまたは関連デバイスを用いて送達され得る。例えば、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒ． （１９９９） ７３：３４２４－９；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ． （２０００） ９７：３４２８－３２；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． （１９９３） ３：２１９－２２３；およびＡｌｉｓｋｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． （２０００） １１：２３１５－２９；米国特許第７，８３７，６６８号および同８，０９２，４２９号を参照のこと。

本明細書において別に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するべきである。例示的方法および材料が以下に記載されるが、本開示の実施または試験において本明細書において記載されるものと同様または等価の方法および材料も使用され得る。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が制御する。一般に、本明細書において記載される神経学、医学、医薬化学および薬学化学ならびに細胞生物学に関連して使用される命名法およびそれらの技術は、当技術分野では周知であり一般的に使用される。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書において記載されるように製造業者の仕様に従って実施される。さらに、文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むべきであり、複数形の用語は、単数形を含むべきである。本明細書および実施形態を通じて、「有す（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語句または「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数または整数の群を含むが、任意の他の整数または整数の群を含まないことを暗示すると理解されるであろう。本明細書において言及されたすべての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照によって組み込まれる。いくつかの文書が本明細書において引用されるが、この引例は、これらの文書のいずれかが当技術分野における共通の一般知識の一部を形成するという承認を構成するものではない。本明細書において、目的の１つまたは複数の値に適用されるような「およそ」または「約」という用語は、記載された参照値と同様である値を指す。ある特定の実施形態では、この用語は、別に記載のない限り、または文脈から別に明らかでない限り、記載された参照値のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）に１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれより小さいもの以内に入る値の範囲を指す。

本発明がより良好に理解され得るように、以下の実施形態および実施例を示す。これらの実施形態および実施例は、単に例示目的であって、いかなる形であれ本発明の範囲を制限すると理解されるべきではない。

ＩＶ．例示的実施形態
本開示の限定されない実施形態を以下に記載する。
１．細胞においてＣ９ｏｒｆ７２遺伝子のセンスおよび／またはアンチセンス転写を抑制する方法であって、細胞を、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の１つまたは複数のリプレッサー、転写抑制ドメインおよびＣ９ｏｒｆ７２遺伝子中の標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む１つまたは複数のリプレッサーを用いて処置することを含み、１つまたは複数のリプレッサーが、１つもしくは複数のジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）、１つもしくは複数のＴＡＬ－エフェクタードメイン転写因子（ＴＡＬＥ－ＴＦ）および／または１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子を含んでもよい、方法。
２．Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子が、１つまたは複数の拡大された（Ｇ_４Ｃ_２）リピートを含む突然変異体アレルを含み、標的部位が、１つまたは複数の（Ｇ_４Ｃ_２）リピート内であってもよい、請求項１の方法。
３．それを必要とする対象におけるセンスおよび／またはアンチセンス転写の抑制のための、１つまたは複数の（Ｇ_４Ｃ_２）リピートを含む突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２拡大されたアレルに結合する、１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦリプレッサーの使用。
４．アンチセンス転写が、未処置細胞と比較して少なくとも５０％抑制される、前記の実施形態のいずれかの方法または使用。
５．アンチセンス転写が、未処置細胞と比較して少なくとも７０％抑制される、前記の実施形態のいずれかの方法または使用。
６．拡大されたリピートを含む転写物が選択的に抑制され、アンチセンス転写が抑制されてもよく、１ａプロモーターからのセンス転写が、抑制されてもよく、および／または１ｂプロモーターからのセンス転写が抑制されなくてもよい、前記の実施形態のいずれかの方法または使用。
７．１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが、表１に示される順序で認識ヘリックス領域を有するＺＦＰを含む、前記の実施形態のいずれかの方法または使用。
８．１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが、ｍＲＮＡとして、またはウイルスベクターを使用して細胞に投与される、前記の実施形態のいずれかの方法または使用。
９．ウイルスベクターが、ＡｄまたはＡＡＶベクターである、実施形態８の方法または使用。
１０．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２／９ベクターである、実施形態９の方法または使用。
１１．細胞が、生存対象中にあり、１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが、対象に投与される、前記の実施形態のいずれかの方法または使用。
１２．１つまたは複数のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが、対象に脳室内、くも膜下腔内、頭蓋内、後眼窩（ＲＯ）、静脈内、鼻腔内および／または大槽内静脈内投与される、実施形態１１の方法または使用。
１３．ＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが、１Ｅ１０～１Ｅ１３（例えば、６Ｅ１１）ｖｇ／半球の用量でＡＡＶベクターを使用してもよく、対象の海馬に片側性にまたは両側性に投与される、実施形態１２の方法または使用。
１４．細胞がニューロンである、前記の実施形態のいずれかの方法または使用。
１５．２つ以上のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが投与される、これまでの実施形態のいずれかの方法または使用。
１６．２つ以上のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーが、同一または異なる非ウイルスまたはウイルスベクターに保持される、実施形態１５の方法または使用。
１７．対象においてＡＬＳおよび／またはＦＴＤが処置される、前記の実施形態のいずれかの方法または使用。
１８．対象においてＡＬＳおよび／またはＦＴＤの１つまたは複数の症状が寛解される、前記の実施形態のいずれかの方法または使用。
１９．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７８０２１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２０．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７５１１４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２１．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７５１１５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２２．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７４９６９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２３．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７９８９５である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２４．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７９８９８である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２５．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７４９８６である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２６．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７９８９９である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２７．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７９９０１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２８．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７９９０２である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
２９．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７９９０４である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３０．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７９９１６である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３１．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７５０２７である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３２．標的配列に結合し、表１に示されるようなＳＢＳ番号に対応するジンクフィンガーを含むＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質であって、ジンクフィンガーが、ＳＢＳ番号について表１の単一列に示されるＤＮＡ結合（認識）ヘリックス配列を含み、ＳＢＳ番号が７９９２１である、ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３３．ＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質が、配列番号１３を含む転写リプレッサードメインを含む、実施形態１９～３２のいずれか１つのＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。
３４．ジンクフィンガードメインおよび転写リプレッサードメインが、配列番号２６を含むペプチドリンカーによって連結される、実施形態１９～３３のいずれか１つのＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質。

［実施例１］
人工転写リプレッサー
ＺＦＰ－ＴＦのパネルを、拡大されたヒトＣ９ｏｒｆ７２アレルを標的とするように作成した。例示的ＺＦＰ－ＴＦは、以下の表１に示されている。これらのＺＦＰ－ＴＦは、６つのフィンガーを有するＺＦＰドメインおよび上記のようなＫＲＡＢドメイン（配列番号１３）を各々含有していた。ペプチドリンカーを使用して、ＺＦＰドメインをＫＲＡＢドメインに連結した。リンカーは以下のアミノ酸配列：ＬＲＱＫＤＡＡＲＧＳ（配列番号２６）を有していた。

表１は、各ＺＦＰ－ＴＦ中の標的部位のＤＮＡ配列および各ジンクフィンガー（Ｆ１～Ｆ６）のＤＮＡ結合ヘリックスのアミノ酸配列を示す。配列番号は、括弧中に示されている。標的部位中のＺＦＰドメインによって結合される標的配列は、大文字で示されており、それぞれの両端に位置する配列は、小文字で示されている。配列番号２４は、遺伝子アレルのセンス鎖上の標的部位であり、配列番号２５は、遺伝子アレルのアンチセンス上の標的部位である。

ＤＮＡ結合ヘリックスは、ジンクフィンガーの可変部分であり、通常、６個または７個のアミノ酸残基を含有する。ＺＦＰドメインの標的特異性は、例えば、米国特許公開第２０１８／００８７０７２号に記載されるようなＺＦＰ骨格への突然変異によって改善され得る。表中の記号「＾」は、示されたヘリックス中の第１のアミノ酸の上流第４位のアルギニン（Ｒ）残基が、グルタミン（Ｑ）に変更されることを示す。各ジンクフィンガーヘリックス配列中、７個のＤＮＡ結合性アミノ酸の位置は、－１、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５および＋６と番号付けられる。したがって、ＲからＱへの置換の位置は、（－５）と番号付けられる。

ＺＦＰ－ＴＦを、標準ＳＥＬＥＸ分析によって評価した（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ． （２０１０） ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１７５５；Ｗｉｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ （２０１１） ７（４）：ｅ１００２０２０を参照のこと）。すべては、その標的部位に結合すると示された。

研究には５種類のヒト細胞株および１種のマウス細胞株を使用した。Ｃ９０２１線維芽細胞細胞株は、コロンビア大学のＡＬＳ研究所（ＡＬＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手し、ＡＬＳ－ＦＴＤ患者に由来していた。その正常アレル上に５つのＧ_４Ｃ_２リピートを含有し、その拡大されたアレル上におよそ８５０のリピートを含有していた。野生型線維芽細胞細胞株（ＮＤＳ０００３５）、３５３ＴＲＡＤおよび２０４ＴＤＰ線維芽細胞株は、神経疾患および卒中の国立研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ）から入手した。野生型株は、各アレル上に２つのＧ_４Ｃ_２リピートを含有する。３５３ＴＲＡＤ株は、一方のアレル上に５つのリピートおよびもう一方のアレル上に８つのリピートを含有する。２０４ＴＤＰは、一方のアレル上に２つのリピートおよびもう一方のアレル上に２０のリピートを有する。すべての線維芽細胞実験のために、ヒトニューロンは、Ｃｅｌｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手した（ｉＣｅｌｌ ＧＡＢＡＮｅｕｒｏｎｓキット、０１４３４；カタログ番号Ｒ１０１３；細胞ロット番号１０４９０１）。マウス皮質ニューロンは、ＧＩＢＣＯ（カタログ番号Ａ１５５８６）から入手した。その標的領域に結合するが、観察可能な抑制効果は有さなかったＺＦＰ ７４９６０は、陰性対照として使用した。

患者由来線維芽細胞において行われたすべての実験のために、ＺＦＰ－ＴＦ ｍＲＮＡの、細胞へのトランスフェクションを、Ｌｏｎｚａ製の９６ウェルのＳｈｕｔｔｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムを使用して実施した。４０，０００個細胞あたり１、３、１０、３０、１００および３００ｎｇのＺＦＰ－ＴＦ ｍＲＮＡを、ＣＡ－１３７プログラムを使用するＡｍａｘａ Ｐ２ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌｓ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを使用してトランスフェクトした。一晩インキュベートした後、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、トランスフェクトされた細胞からｃＤＮＡを作製し、続いて、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して遺伝子発現解析をした。

神経細胞形質導入のために、ＺＦＰをＡＡＶ６プラスミド中に作成した。ニューロンにＡＡＶ６－ＺＦＰ形質導入した。すべての形質導入は、３，０００ＭＯＩで実施した。マウスニューロンは、形質導入の７日後に収集し、一方、ヒトニューロンは、形質導入の１９日後に収集した。細胞を収集した後、それらをマイクロアレイ分析のために処理した。

スクリーニング分析を複数ラウンドで実施した。各ラウンドにおいて、ＺＦＰを複数濃度で試験して、適したオンターゲット（選択的抑制）パターンを有するＺＦＰ－ＴＦを同定した。スクリーニングのラウンド２を、Ｃ９（Ｃ９０２１）細胞において実施して、ＺＦＰ－ＴＦ処置後の、拡大されたセンス転写物（疾患）Ｃ９ｏｒｆ７２対総Ｃ９ｏｒｆ７２（「総Ｃ９」）成熟ｍＲＮＡのレベルを評価した。ＲＴ－ＰＣＲアッセイでは、イントロン領域１ａを標的とするプライマー／プローブセットを使用した。
拡大されたセンスＣ９ｏｒｆ７２転写物：
フォワード：５’ ＣＣＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＡＣＴＡＣＴＴＧ ３’（配列番号６１）
リバース：５’ ＣＴＡＣＡＧＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣＣ ３’（配列番号６２）
プローブ：５’ ＴＣＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡ ３’（配列番号６３）

Ｇ_４Ｃ_２拡大は、非効率的なスプライシングおよび拡大含有プレｍＲＮＡの蓄積につながる（図２Ａ）。対照的に、効率的にスプライシングされる野生型（ＷＴ）プレｍＲＮＡは、桑馬手低いレベルで存在する。Ｃ９０２１細胞においてこのアッセイを使用することによって、本発明者らは、試験されたＺＦＰ－ＴＦが、拡大されたセンス（疾患）Ｃ９ｏｒｆ７２転写物の広範な抑制を呈したことを示した（図２Ｂ～Ｄ）。

総Ｃ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡの抑制を評価するために、「総Ｃ９」として表される異なるプライマー／プローブセット（図２Ａ）を使用した：
総Ｃ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡ：
フォワード：５’ ＣＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＡＴＡＴＧＧ ３’（配列番号５８）
リバース：５’ ＣＴＣＣＡＧＧＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡ ３’（配列番号５９）
プローブ：５’ ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＡＡＡＧＧＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＡＡ ３’（配列番号６０）

このプライマー／プローブセットは、エキソン８および９をまたぐ領域を含むｍＲＮＡを検出できた。この領域は、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡアイソフォームのすべてに存在する。図２ｂに示されるように、多数のＺＦＰ－ＴＦは、総Ｃ９ｏｒｆ７２転写物の中程度の抑制を示した。例えば、ＺＦＰ－ＴＦ７５１１４および７５１１５は、拡大されたセンス（疾患）転写物を７０％よりも多く抑制し、一方で、総Ｃ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡの発現を５０％よりも多く防いだ（図２Ｄ、ラウンド２データ）。

ラウンド３では、総Ｃ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡを評価し、Ｃ９０２１細胞と野生型（ＷＴ）細胞の間で比較して、総Ｃ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡレベルに対する、試験されたＺＦＰ－ＴＦの効果をさらに評価した。データは、突然変異体細胞における総Ｃ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡレベルが、ＷＴ細胞におけるものよりもかなりより劇的に低下し、同一ＺＦＰ－ＴＦによって処置された野生型細胞では、はるかに少なくしか影響を受けなかったことを示す（図２Ｂ～Ｄ）。全体的なデータは、一部のＺＦＰ、例えば、７５１０９、７５１１４および７５１１５について、Ｃ９患者線維芽細胞株では、総Ｃ９転写物の約５０％を維持しながら、拡大されたアイソフォームが大幅に抑制された（約７０％）ことを例示する。

その拡大されたアレル上に異なるＧ_４Ｃ_２拡大リピート（６００、８００および８５０）を含有する３つの異なる患者に由来する線維芽細胞において、ＺＦＰ－ＴＦ７５１０９、７５１１４および７５１１５のアイソフォーム選択的抑制を評価した（図６）。３つのＺＦＰはすべて、リピート拡大長とは独立して同様の挙動を示し、これは、ＺＦＰ－ＴＦの選択的抑制が、Ｇ４Ｃ２リピート長から独立していることを例示した。

そのアレル上に正常Ｇ_４Ｃ_２リピート数よりも大きいものを有する健常個体から得た２つの細胞株において、総Ｃ９転写物の抑制を評価した（図７）。健常細胞株では、総Ｃ９転写物は、最小にしか影響を受けなかった。総Ｃ９ ｍＲＮＡ転写物を検出するために使用したＰＣＲアッセイは、拡大されたおよび拡大されていない（ＷＴ）アイソフォームの両方に存在するエキソン８および９を標的とするので、患者由来細胞株（Ｃ９０２１）における総Ｃ９ ｍＲＮＡ転写物のＺＦＰ媒介性抑制は、ＷＴアイソフォームレベルを真に代表するものではない（図２Ａ）。そのアレル上に異なるＧ_４Ｃ_２リピート長を有する２つの異なる健常株において、アイソフォーム選択的ＺＦＰ－ＴＦ（７５１０９、７５１１４および７５１１５）に応じた総Ｃ９ ｍＲＮＡ転写物の抑制を評価した（図７）。細胞株３５３ＴＲＥＡＤは、一方のアレル上に５つのリピートおよびもう一方のアレル上に８つのリピートを有し、一方で、細胞株２０４ＴＤＰは、一方のアレル上に２リピートおよびもう一方のアレル上に２０リピートを有する。Ｃ９株Ｃ９２１（拡大されていないアレル上に５リピートおよび拡大されたアレル上に８５０リピート）において、総Ｃ９ ｍＲＮＡ転写物は、用量依存的に抑制されたが、拡大されたアレルを有さない２つの他の細胞株では最小にしか影響を受けず、これは、疾患株（５／８５０）における総Ｃ９アイソフォームの抑制は、拡大されたアイソフォームの抑制の結果であり、拡大されていないアイソフォームの発現は、選択的ＺＦＰ－ＴＦによって影響を受けないということを示した（図７）。

理論に捉われようとは思わないが、本ＺＦＰ－ＴＦが協同的に作動して、多数のリピートを有するアレルを選択的に抑制できるということが可能である。それは、高次複合体によって、例えば、ＺＦＰによって連結されたＫＲＡＢドメインと会合するＫＡＰ１コリプレッサーの補充を介して媒介され得る。この仮説の下では、複数のＺＦＰ－ＴＦにわたるＫＡＰ１／ＫＲＡＢ「足場」は、転写抑制機構の安定性を高め、拡大されたＣ９ｏｒｆ７２アレルの、野生型アレルを上回る優先的抑制を可能にする。
［実施例２］

Ｃ９ｏｒｆ７２抑制の特異性
表１に示されたＺＦＰ－ＴＦの全体的な特異性を、３種の細胞株：Ｃ９０２１線維芽細胞、一次マウス皮質ニューロンおよびヒトニューロンにおいてマイクロアレイ分析によって評価した。Ｃ９０２１細胞について、手短には、１００ｎｇのｍＲＮＡをコードするＺＦＰ－ＴＦを、１５０，０００個のＣ９０２１細胞中に４連でトランスフェクトした。２４時間後、全ＲＮＡを抽出し、製造業者のプロトコール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ ＭＴＡ１．０）によって処理した。ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）を使用して、各プローブセットからの生シグナルを正規化した。解析は、「遺伝子レベル差次的発現解析」オプションを備えたトランスクリプトーム解析コンソール３．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して実施した。ＺＦＰ－ＴＦがトランスフェクトされたサンプルを、無関係のＺＦＰ－ＴＦ（Ｃ９ｏｒｆ７２標的部位と結合しないもの）を用いて処理されているサンプルと比較した。変化呼び出しは、対照に対して平均シグナルにおいて＞２倍の相違およびＰ値＜０．０５（各プローブセットについて一元ＡＮＯＶＡ解析、独立Ｔ検定）を有する転写物（プローブセット）について報告された。また、ニューロンについて、それらに３０００のＭＯＩでＡＡＶ６を形質導入し、マウスニューロンについては７日間およびヒトニューロンについて１９日間培養し、その後回収したことを除いて同様の手順を行った。

例示的データが図８Ａ～８Ｃに示されている。データは、ヒトおよびマウスの両方において線維芽細胞およびニューロンの両方において、ＺＦＰ－ＴＦ７５０２７が、Ｃ９ｏｒｆ７２（丸で示される）に加えていくつかのオフターゲットを示した、ＺＦＰ－ＴＦ７５１０９、７５１１４および７５１１５は、Ｃ９ｏｒｆ７２のみを抑制し、最小のオフターゲットを有していたことを示す。これらの結果は、代表的なＺＦＰ－ＴＦは、Ｃ９ｏｒｆ７２に対して高度に特異的であることを実証する。
［実施例３］

アンチセンス特異的抑制の検出
センスおよびアンチセンス転写物は、ＤＮＡの重複する領域によってコードされるので、本発明者らは、転写物の示差的処理に基づく検出戦略を開発した。拡大されたアレルに由来するセンスｍＲＮＡについて、拡大された領域を含有するイントロン（イントロン１ａ）は、ミススプライシングされ、保持されるが、イントロン１ｂを含むすべての他のイントロンは除去される。対照的に、イントロン１ｂ領域は、アンチセンスｍＲＮＡ転写物では予測されたエキソンであり、保持されるべきである。したがって、本発明者らは、イントロン１ｂ内に位置するプライマーを設計し、試験し、以下にさらに記載されるようなアンチセンス転写物の特異的検出を実証した。

Ｃ９ｏｒｆ７２転写物を検出するために、本発明者らは、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用した。手短には、センスまたはアンチセンスｃＤＮＡ鋳型を作出するために、ＲＮＡをＣ９ｏｒｆ７２患者および健常対照細胞（Ｃ９ｏｒｆ７２株：Ｃ９－３、Ｃ９－６、Ｃ９－７、Ｃ９－５、Ｃ９－１０、Ｃ９－１１、Ｃ９－２、Ｃ９－４；対照株：ＫｉｎＡＬＳ６、Ｃｏｎ３、Ｋｉｎ１ＡＬＳ１７、Ｃｏｎ８、Ｃｏｎ１０、Ｃｏｎ１；Ｌａｇｉｅｒ－Ｔｏｕｒｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ （２０１３） １１０（４７）：Ｅ４５３０－９を参照のこと）から精製し、これを使用し、以下のようにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）第１鎖合成システムを使用してｃＤＮＡを合成した：

１）０．５μｇのＲＮＡ、０．５μＬの１０ｍＭ鎖特異的プライマーおよびｄＮＴＰミックスを混合し、水を用いて１０μＬとした。センス鋳型の作成のために、プライマー５’ＣＴＣＴＡＧＣＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＴＧ３’（配列番号６４）を使用した。アンチセンス鋳型を作成するために、プライマー５’ＧＴＧＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＴＴＧＡＡＴＡ３’（配列番号６５）を使用した。
２）この反応物を、変性のために６５℃で５分間インキュベートし、氷上に少なくとも１分間置いた。
３）これらの試薬：１０×ＲＴバッファー（２μＬ）；２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（４μＬ）；０．１Ｍ ＤＴＴ（２μＬ）；ＲＮアーゼＯＵＴ（１μＬ）；Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（１μＬ）を使用して、ｃＤＮＡ合成ミックスを調製した。
４）この反応物の１０μＬを、ＲＮＡミックスに添加し、５０℃で５０分間インキュベートした。次いで、反応物を８５℃で５分のインキュベーションによって不活性化した。

次いで、鋳型を、標識されたプローブを製造業者のプロトコールに従って使用してｄｄＰＣＲに付した。手短には、ＰＣＲ反応を、プローブ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のためのｄＵＴＰ不含ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用してＡＢＩ ＰＣＲ ９６ウェルプレートにおいて行った。ＰＣＲマスターミックスを、製造業者の指示に従って調製した。イントロン１ｂ領域に位置するアンチセンスプライマー－プローブセット（図３）は、以下に示される。
フォワード：５’ ＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡ ３’（配列番号６６）
リバース：５’ ＧＧＡＣＡＴＧＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＣ ３’（配列番号６７）
プローブ：５’ ＣＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＡＧＡＣＣＣＡＡＴＧＡＧＣＡ ３’（配列番号６８）

反応物は以下の通りに設定した：
１）完全マスターミックスを、ＡＢＩ ＰＣＲプレートの８つのウェルの間で均等に分配した。
２）１０μＬの１：１０希釈ＲＴ反応物または水を、サンプルウェルに添加した。
３）１５μＬのマスターミックスを、ＲＴ含有ウェル中に移した。
４）プレートを密閉し、ボルテックス処理し、短時間の間、遠心沈殿させた。

液滴を作成するために、以下のようにカートリッジを使用した：
１）７０μＬのプローブオイルをカートリッジ上のウェル標識されたオイル中に入れ、２０μＬのｄｄＰＣＲ反応物をウェル標識されたサンプル中に入れた。
２）ゴム製ガスケットをカートリッジの頂部に置いた。
３）４０μＬの液滴を、新しいエッペンドルフ９６ウェルプレートに移した。プレートをアルミホイルで密閉し、ＰＣＲを製造業者のプロトコールに従って実施した。

データは、Ｃ９ｏｒｆ７２線維芽細胞株において、これらのプライマーは、アンチセンスの拡大されたプレｍＲＮＡ（Ｃ９－ＡＳ）中のエキソンを増幅したということおよび相補性領域はセンス領域（Ｃ９－Ｓ）になかったということを示す（図４Ａ）。したがって、本明細書においてｄｄＰＣＲアンチセンスプライマーは、アンチセンスプレｍＲＮＡを特異的に検出し、これは、６種の異なる対照線維芽細胞と比較して、７種の異なるＣ９患者由来線維芽細胞において明らかに上昇した（図４Ｂ）。
［実施例４］

拡大されたアレルセンスおよびアンチセンスプレｍＲＮＡ抑制
拡大されたアレルでのＺＦＰ－ＴＦリプレッサーの活性を試験するために、細胞を、上記のようにＺＦＰ－ＴＦ７４９４９、７４９７８、７５００３、７５０２７、７５１０９、７５１１４、７５１１５、７４９６７（表１）または７４９６０（陰性対照）を用いて処置した。２つの別個のＰＣＲアッセイを使用して、サンプル順序を知らされていない研究者によってＺＦＰ－ＴＦ媒介性抑制を評価した。各アッセイは、異なるプライマー／プローブを使用する（図５Ａ～５Ｃ）。

実行番号１および番号２について、当技術分野における標準プロトコールに従ってランダムヘキサマーを用いて、および以下に示されるプライマーを用いて増幅を実施した点を除いて、拡大されたセンス、拡大されたアンチセンスおよび総Ｃ９を測定するためのアッセイを上記のように実施した：
アンチセンスの拡大されたＣ９ｏｒｆ７２プレｍＲＮＡ（図５Ｂ）：上記の実施例３に示されるような。
センスの拡大されたＣ９ｏｒｆ７２プレｍＲＮＡ（図５Ａ）：このプライマー／プローブセットは、エキソン１ａおよびイントロン１ａをまたぐ領域を含むｍＲＮＡを検出できた。
フォワード：５’ ＡＣＴＡＣＴＴＧＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴＣＧ ３’（配列番号６９）
リバース：５’ ＴＡＧＣＧＣＧＣＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣ ３’（配列番号７０）
プローブ：５’ ＡＧＧＧＡＡＡＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＣ ３’（配列番号７１）
総Ｃ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡ（図５Ｃ）：このプライマー／プローブセットは、エキソン２内の領域を含むｍＲＮＡを検出できた。
フォワード：５’ ＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＧＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡ ３’（配列番号７２）
リバース：５’ ＧＣＣＡＣＴＴＡＡＡＧＣＡＡＴＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧ ３’（配列番号７３）
プローブ：５’ ＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＧＣＣＣＡＣＣＧＣＣＡ ３’（配列番号７４）

実行番号３（図５Ａおよび５Ｃ）は、実施例１において上記で示されたプライマー（図２Ｂ～２Ｄ）を使用した。アンチセンス疾患転写物について、イントロン領域１ｂを検出するために以下のプライマー／プローブを使用した（図５Ｂ）。
フォワード：５’ ＣＡＧＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＡＧＡＡＡＴＧＡＧ ３’（配列番号７８）
リバース：５’ ＡＡＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＴＡＧＡＡ ３’（配列番号７９）
プローブ：５’ ＣＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＴ ３’（配列番号８０）

異なるプライマー／プローブセットおよび異なるＰＣＲアッセイを使用した（実行番号１および実行番号２を、同様であるが、実行番号３とは異なるアッセイによって実施した）という事実にもかかわらず、データは、一貫しており、抑制レベルは同等であった。

総合すると、すべての実行は、ＺＦＰ－ＴＦの一部は、３種の転写物すべて（センス、アンチセンスおよび総）を強力に抑えることができた（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ７４９７８、７５００３および７５０２７）が、一部のＺＦＰ－ＴＦ（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ７５１０９、７５１１４および７５１１５）は、総Ｃ９転写物を保ちながら、センスおよびアンチセンス疾患転写物を選択的に抑制した（選択的抑制）ということを一貫して実証した。
［実施例５］

ＢＡＣ Ｃ９ｏｒｆ７２トランスジェニックマウスニューロンにおけるヒトＣ９ｏｒｆ７２の調節
ＢＡＣマウスＣ９ｏｒｆ７２を標的とするすべてのリプレッサーを、発現を駆動するためのＣＭＶプロモーターを使用してｒＡＡＶ６ベクターにクローニングする。組換えＡＡＶは、当技術分野で公知の方法に従って、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生され、ＣｓＣｌ密度勾配を使用して精製され、リアルタイムｑＰＣＲによって力価測定される。 精製されたウイルスを使用して、３Ｅ５、１Ｅ５、３Ｅ４および１Ｅ４ Ｖｇ／細胞で培養一次マウス皮質ニューロンに感染させる。７日後、全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して、Ｃ９ｏｒｆ７２センスおよびアンチセンス転写物ならびに２種の参照遺伝子（例えば、Ａｔｐ５ｂおよびＥｉｆ４ａ２）の発現をモニタリングする。

すべてのＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶベクターは、広範な感染用量にわたってマウス細胞においてその標的を効率的に抑制し、一部のＺＦＰは、複数回用量で標的を９５％よりも多く低減する。対照的に、同等用量で試験されたＣＭＶ－ＧＦＰ ｒＡＡＶ６ウイルスまたは偽処置ニューロンについて遺伝子抑制は観察されない。
［実施例６］

ＡＡＶによってデリバリーされるＺＦＰ－ＴＦによって駆動されるインビボ遺伝子抑制
標的関与研究に使用したＣ９ｏｒｆ７２ ＢＡＣトランスジェニックマウスは、９８ｋｂの、約５００のＧ_４Ｃ_２リピートを有する全長Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子アレルおよび実質的にそれぞれの両端に位置する配列を含有するヒト導入遺伝子を含有する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ （２０１６） ９０（３）：５２１－３４）。種々の効力を有する２種のＺＦＰ－ＴＦ、ＺＦＰ－ＴＦ７５０２７またはＺＦＰ－ＴＦ７５１１４（ＺＦＰ－ＴＦ７５０２７はより強力である；図２Ｄ）をこの研究のために選択した。２種の融合タンパク質の発現カセットを両方とも、発現を駆動するシナプシンプロモーターおよび自己切断可能ペプチド（例えば、２Ａペプチド、例えば、Ｔ２ＡまたはＰ２Ａ）のコード配列と、それに続く体内分布を測定するためのＶｅｎｕｓタグを含有するｒＡＡＶベクター中にクローニングした（図９、パネルＡ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｒＡＡＶを産生し、ＩＴＲ上のプライマーを使用するｄｄＰＣＲによって力価測定した。

インビボで拡大を含有するセンスおよびアンチセンス転写物の抑制に対するＺＦＰ－ＴＦ発現の効果を評価するために、ＺＦＰ－ＴＦ ｒＡＡＶを、脳室内（ＩＣＶ）注射によってＰ０ Ｃ９－ＢＡＣまたはＷＴマウス中に送達した。手短には、媒体（ＰＢＳ）またはＺＦＰ－ＴＦ ７５０２７ ｒＡＡＶもしくはＺＦＰ－ＴＦ ７５１１４ ｒＡＡＶ（脳室あたり２Ｅ１０ Ｖｇの総用量）を、新生仔Ｃ９－ＢＡＣマウス（リピート長について対応している）またはＷＴマウス中に両側性に投与した（脳室あたり２μｌ）（図９、パネルＣ）。注射の４週間後に動物を屠殺し、一方の半球をＲＮＡフォーカス分析のために包埋し、もう一方の半球を、さらなる分析のために皮質、海馬および小脳に顕微解剖した（図９、パネルＢ）。ウイルスゲノムおよびＶｅｎｕｓ ｍＲＮＡおよびタンパク質の定量化によって、同等の形質導入ならびにＺＦＰ－ＴＦ７５０２７およびＺＦＰ－ＴＦ７５１１４両方の発現を有する広範な体内分布が示された。

皮質および海馬組織から全ＲＮＡを抽出し、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ）を使用してｃＤＮＡを作成した。ｄｄＰＣＲを実施して、センスおよびアンチセンスの拡大を含有する転写物の発現ならびにマウスＴＢＰレベルに対して正規化された総Ｃ９ ｍＲＮＡレベルを測定した。このアッセイに使用したプライマーは、以下であった：
総Ｃ９ ｍＲＮＡ：
フォワード：５’ＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＧＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡ３’（配列番号７２）
リバース：５’ＧＣＣＡＣＴＴＡＡＡＧＣＡＡＴＣＴＣＴＧＴＣＴＴＧ３’（配列番号７３）
プローブ：５’ＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＧＣＣＣＡＣＣＧＣＣＡ３’（配列番号７４）
センスの拡大されたプレｍＲＮＡ：
フォワード：５’ ＡＣＴＡＣＴＴＧＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴＣＧ ３’（配列番号６９）
リバース：５’ ＴＡＧＣＧＣＧＣＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣ ３’（配列番号７０）
プローブ：５’ ＡＧＧＧＡＡＡＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＣ ３’（配列番号７１）
アンチセンスの拡大されたプレｍＲＮＡ：
フォワード：５’ＡＧＴＣＧＣＴＡＧＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣ３’（配列番号８１）
リバース：５’ＣＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＧＡＧ３’（配列番号８２）
プローブ：５’ＡＡＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＴＡＧＡＡＧＣＧＧＧＧＧＣ３’（配列番号８３）

データは、ＺＦＰ－ＴＦ７５０２７が、ＰＢＳが注射された対照に対して、Ｃ９－ＢＡＣ動物の海馬および皮質において総Ｃ９ ｍＲＮＡ、センスおよびアンチセンスの拡大を含有する転写物のレベルを抑制したことを示す（図９、パネルＤ）。（トランスジェニックマウスはＷＴヒトＣ９ｏｒｆ７２アレルを含有せず、マウス（ｍｏｕｅ）Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子は、Ｇ_４Ｃ_２リピートを含有しないので、この動物モデルを用いた場合、選択的抑制は観察できなかった）。ＺＦＰ－ＴＦ７５１１４を用いた場合、抑制は観察されなかった。

さらに、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して、ＺＦＰ－ＴＦ注射後に海馬において見出されたセンスおよびアンチセンスＲＮＡ凝集体（フォーカス）のレベルを測定した（図９、パネルＥ）。手短には、１０μｍの切片をフルオロフォア標識されたプローブとハイブリダイズさせた：５’ＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣ－Ｃｙ３（配列番号８４）を使用して、センスＲＮＡフォーカスを測定し、５’ＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣ－Ｃｙ３（配列番号８５）を使用して、アンチセンスＲＮＡフォーカスを測定した。スタック画像は、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ８８０）で４０×ズームで取得した。細胞の総数に対して正規化されたセンスおよびアンチセンスＲＮＡフォーカスの数を、海馬のアンモン角（ＣＡ）領域から定量化した。ＺＦＰ－ＴＦ７５０２７を注射された動物において、より小さいパーセンテージのアンチセンスＲＮＡフォーカスが観察された。

これらの結果は、Ｃ９ｏｒｆ７２を標的化するＺＦＰ－ＴＦは、インビボで疾患を引き起こすＣ９ｏｒｆ７２アレルの発現を効率的に抑制できることおよびＺＦＰ－ＴＦの効力の相違が観察され得ることを示す。

Claims (47)

1. ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写リプレッサードメインを含む融合タンパク質であって、ここでＺＦＰドメインは、ヒトＣ９ｏｒｆ７２遺伝子の突然変異体アレル上のエキソン１ａと１ｂの間のイントロンセグメント中の標的領域に結合する、ここで標的領域は３０より多いＧ_４Ｃ_２（配列番号１）のタンデムリピートを含む、およびここでＺＦＰドメインは、以下の表：
   
   
   
   の各行に示される６つの認識ヘリックス領域を含む（表中、各配列の配列番号を括弧内に示し、表中の記号「＾」は示されたヘリックス中の第１のアミノ酸の上流第４位のアルギニン（Ｒ）残基が、グルタミン（Ｑ）に変更されることを示す）、融合タンパク質。
2. 前記突然変異体アレルからのリピート含有ｍＲＮＡの転写を抑制する、および前記遺伝子からの野生型ｍＲＮＡの転写を抑制しない、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. ＺＦＰドメインが標的領域中のセンス配列に結合する、ここでセンス配列が、ヘキサヌクレオチドＧＧＧＧＣＣ（配列番号１）、ＧＧＧＣＣＧ（配列番号２）、ＧＧＣＣＧＧ（配列番号３）、ＧＣＣＧＧＧ（配列番号４）、ＣＣＧＧＧＧ（配列番号５）またはＣＧＧＧＧＣ（配列番号６）の１つ～３つのタンデムリピートを含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
4. ヒト細胞における突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルからのセンス転写を抑制する、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
5. Ｃ９ｏｒｆ７２ １ａプロモーターからのセンス転写を抑制する、およびＣ９ｏｒｆ７２ １ｂプロモーターからのセンス転写を抑制しない、請求項４に記載の融合タンパク質。
6. ＺＦＰドメインが標的領域中のアンチセンス配列に結合する、ここでアンチセンス配列が、ヘキサヌクレオチドＧＧＣＣＣＣ（配列番号７）、ＧＣＣＣＣＧ（配列番号８）、ＣＣＣＣＧＧ（配列番号９）、ＣＣＣＧＧＣ（配列番号１０）、ＣＣＧＧＣＣ（配列番号１１）またはＣＧＧＣＣＣ（配列番号１２）の１つ～３つのタンデムリピートを含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
7. ヒト細胞において突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルからのアンチセンス転写を抑制する、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
8. ヒト細胞において突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルからのセンス転写およびアンチセンス転写の両方を抑制する、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
9. 突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルからのセンス転写および／またはアンチセンス転写を少なくとも３０％抑制する、請求項１から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
10. 突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルからのセンス転写および／またはアンチセンス転写を少なくとも４０％抑制する、請求項９に記載の融合タンパク質。
11. 突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルからのセンス転写および／またはアンチセンス転写を少なくとも７５％抑制する、請求項１０に記載の融合タンパク質。
12. 突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルからのセンス転写および／またはアンチセンス転写を少なくとも９０％抑制する、請求項１１に記載の融合タンパク質。
13. 突然変異体Ｃ９ｏｒｆ７２アレルからのセンス転写および／またはアンチセンス転写を少なくとも９５％抑制する、請求項１２に記載の融合タンパク質。
14. Ｃ９ｏｒｆ７２ １ｂプロモーターからのセンス転写を抑制しない、請求項９に記載の融合タンパク質。
15. 転写リプレッサードメインがヒトＫＯＸ１由来のＫＲＡＢドメインアミノ酸配列を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
16. ＺＦＰドメインがペプチドリンカーを介して転写リプレッサードメインに連結される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
17. 請求項１から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質のコード配列を含む核酸コンストラクトであって、ここでコード配列は転写調節エレメントに作動可能に連結される、核酸コンストラクト。
18. 転写調節エレメントが、脳細胞において構成的に活性または誘導性である哺乳動物プロモーターである、請求項１７に記載の核酸コンストラクト。
19. プロモーターがヒトシナプシンＩプロモーターである、請求項１８に記載の核酸コンストラクト。
20. コンストラクトがウイルスコンストラクトである、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
21. ウイルスコンストラクトが組換えアデノ随伴ウイルスコンストラクトである、請求項２０に記載の核酸コンストラクト。
22. 請求項１７から２１のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む宿主細胞。
23. ヒト細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
24. ヒト細胞がニューロンまたは多能性幹細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
25. 幹細胞が胚幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２４に記載の宿主細胞。
26. 請求項１７に記載の核酸コンストラクトを含む、組換えウイルス。
27. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である、請求項２６に記載の組換えウイルス。
28. 請求項１７から２１のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトまたは請求項２７に記載の組換えウイルス、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
29. ヒト細胞においてＣ９ｏｒｆ７２遺伝子の突然変異体アレルの転写を阻害する方法における使用のための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、請求項２７に記載の組み換えウイルスまたは請求項２８に記載の医薬組成物であって、
    ここで突然変異体アレルが、エキソン１ａと１ｂの間のイントロンセグメント中に拡大されたＧ_４Ｃ_２（配列番号１）リピート領域を含む、および
    ここで方法が、前記融合タンパク質、前記核酸コンストラクト、前記組み換えウイルスまたは前記医薬組成物を前記細胞に導入することを含む、融合タンパク質、核酸コンストラクト、組み換えウイルスまたは医薬組成物。
30. ヒト細胞が、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞または神経上皮細胞である、請求項２９に記載の融合タンパク質、核酸コンストラクト、組み換えウイルスまたは医薬組成物。
31. 細胞が、Ｃ９ｏｒｆ７２関連障害を患っている患者の脳または脊髄中にある、請求項２９または３０に記載の融合タンパク質、核酸コンストラクト、組み換えウイルスまたは医薬組成物。
32. Ｃ９ｏｒｆ７２関連障害を患っている患者を処置する方法における使用のための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、請求項２７に記載の組み換えウイルスまたは請求項２８に記載の医薬組成物。
33. Ｃ９ｏｒｆ７２関連障害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびＣ９家族性前頭側頭型認知症（Ｃ９ＦＴＤ）から選択される、請求項３１または３２に記載の融合タンパク質、核酸コンストラクト、組み換えウイルスまたは医薬組成物。
34. 請求１から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質が、前記融合タンパク質を発現する組換えウイルスを介して導入される、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、核酸コンストラクト、組み換えウイルスまたは医薬組成物。
35. 組換えウイルスが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項３４に記載の融合タンパク質、核酸コンストラクト、組み換えウイルスまたは医薬組成物。
36. 組換えウイルスが、血清型９のＡＡＶまたは偽型ＡＡＶ２／９もしくはＡＡＶ２／６／９である、請求項３５に記載の融合タンパク質、核酸コンストラクト、組み換えウイルスまたは医薬組成物。
37. 組換えウイルスが、脳室内、くも膜下腔内、頭蓋内、後眼窩（ＲＯ）、静脈内、鼻腔内および／または大槽内経路によって患者に投与される、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、核酸コンストラクト、組み換えウイルスまたは医薬組成物。
38. ２つ以上の請求項１から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質が導入される、請求項２９から３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、核酸コンストラクト、組み換えウイルスまたは医薬組成物。
39. ２つ以上の融合タンパク質のコード配列が同一の組換えウイルスベクター上にある、請求項３８に記載の融合タンパク質、核酸コンストラクト、組み換えウイルスまたは医薬組成物。
40. ＺＦＰドメインが、配列番号３３、３４、３３、３４、３３、および３４をそれぞれ含む６つのフィンガーを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
41. ＺＦＰドメインが、配列番号２９、４１、２９、４１、２９、および４１をそれぞれ含む６つのフィンガーを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
42. ＺＦＰドメインが、配列番号５３、５４、５３、５４、５３、および５４をそれぞれ含む６つのフィンガーを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
43. ＺＦＰドメインが、配列番号５５、４５、５５、４５、５５、および４５をそれぞれ含む６つのフィンガーを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
44. ＺＦＰドメインが、配列番号７７、４５、７７、４５、７７、および４５をそれぞれ含む６つのフィンガーを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
45. ＺＦＰドメインが、配列番号３３、５６、３３、５６、３３、および５６をそれぞれ含む６つのフィンガーを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
46. ＺＦＰドメインが、配列番号５７、４１、５７、４１、５７、および４１をそれぞれ含む６つのフィンガーを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
47. ＺＦＰドメインが、配列番号４６、４１、４６、４１、４６、および４１をそれぞれ含む６つのフィンガーを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

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