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KR20220003561A - 염색체 9 오픈 리딩 프레임 72 유전자 발현의 조정제 및 그의 용도 - Google Patents

염색체 9 오픈 리딩 프레임 72 유전자 발현의 조정제 및 그의 용도 Download PDF

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KR20220003561A
KR20220003561A KR1020217037624A KR20217037624A KR20220003561A KR 20220003561 A KR20220003561 A KR 20220003561A KR 1020217037624 A KR1020217037624 A KR 1020217037624A KR 20217037624 A KR20217037624 A KR 20217037624A KR 20220003561 A KR20220003561 A KR 20220003561A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
zfp
c9orf72
seq
fusion protein
cell
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020217037624A
Other languages
English (en)
Inventor
조셉 에프. 나반
암루타 파타마타
모함마드 사미에
Original Assignee
상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 filed Critical 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Publication of KR20220003561A publication Critical patent/KR20220003561A/ko
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Abstract

본 개시내용은 C9orf72-관련 질환, 예컨대 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 전두측두엽 치매 (FTD)를 갖는 환자를 포함한, C9orf72 유전자의 전사의 조정을 필요로 하는 환자에서 C9orf72 유전자의 전사를 조정하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

염색체 9 오픈 리딩 프레임 72 유전자 발현의 조정제 및 그의 용도
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 4월 23일에 출원된 미국 특허 출원 62/837,523 및 2020년 1월 23일에 출원된 62/964,844를 우선권 주장한다. 이들 우선권 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2020년 4월 21일에 생성된 상기 ASCII 카피는 025297_WO017_SL.txt로 명명되고, 19,880 바이트 크기이다.
염색체 9 오픈 리딩 프레임 72 (C9orf72) 유전자는 뉴런에서 풍부하게 발견되는 단백질을 코딩한다. C9orf72 단백질은 엔도솜 트래픽킹에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. C9orf72 단백질의 기능은 잘 이해되지 않지만, 최근 데이터는 이것이 Rab 단백질의 기능을 조절함으로써 엔도리소솜 경로를 따라 막 트래픽킹에서 역할을 한다는 것을 시사한다.
C9orf72 유전자는 인트론 1 내에 헥사뉴클레오티드 절편 (G4C2; 서열식별번호(SEQ ID NO): 1)을 함유한다. 이 절편은 식별가능한 생물학적 효과 없이 30회까지 탠덤으로 반복될 수 있다. 그러나, 헥사뉴클레오티드 확장으로 불리는 현상인 30회 초과의 반복부는 C9orf72-관련 장애를 유발할 수 있다 (Renton et al., Neuron (2011) 72:257-68; Douglas, Non-coding RNA Res. (2018) 3:178-87). 이러한 확장은 상염색체 우성 표현형을 발생시키고, 환자는 전형적으로 확장된 대립유전자에 대해 이형접합성이다. 헥산뉴클레오티드 확장은 세포 내에서 RNA 병소의 형성을 유발하고, 이는 RNA-결합 단백질의 격리 및 RNA 대사의 파괴로 이어지는 것으로 보인다. 또한, 비-AUG 의존성 번역을 통해, 헥산뉴클레오티드 확장은 센스 및 안티센스 방향 둘 다에서 잠재적으로 모든 6개의 프레임으로부터의 디펩티드 반복부 (DPR)를 함유하는 비천연 단백질의 생산으로 이어지는 것으로 보인다 (Freibaum and Taylor, Front Mol Neurosci. (2017) 10:35; Douglas, 상기 문헌). 이들 단백질은 응집하려는 경향이 있다 (Gendron et al., Acta Neuropathol. (2013) 126:829). DPR은 C9orf72-관련 질환을 갖는 환자의 사후 뇌 물질 내의 봉입체로서 보고되어 있다 (Riemslagh et al., Acta Neuropathol Commun. (2019) 7:39).
C9orf72-관련 장애는 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 C9 가족성 전두측두엽 치매 (C9FTD)를 포함한다. ALS는 진행성 근육 약화, 근육 질량의 손실, 및 점차적으로 저하되는 이동, 말하기, 삼키기, 및/또는 호흡 능력을 특징으로 한다. ALS는 100,000명당 1-3명의 사례의 연간 발생률을 갖고, 가장 흔한 성인-발병 운동 뉴런 장애이다. 이 질환은 최초 증상의 3 내지 5년 내에 대부분의 환자에게 치명적이다. C9orf72 유전자 내의 돌연변이는 미국 및 유럽에서 가족성 ALS의 약 30 내지 40 퍼센트의 요인이고, 산발성 ALS의 5-10%를 차지한다. C9orf72-관련 ALS를 갖는 일부 환자에서는 또한 인격, 행동, 및 언어에 영향을 미치는 신경변성 질환인 C9 전두측두엽 치매 (FTD) 또는 C9FTD로 불리는 상태가 발생한다 (Benussi et al., Front Aging Neurosci. (2015) 7:171). 둘 다의 상태가 발생한 개체는 ALS-FTD를 갖는 것으로 진단된다.
C9orf72-관련 장애에 대한 유효 치료는 존재하지 않았다. 따라서, 이들 장애에 대한 효과적인 요법을 개발할 시급한 필요가 있다.
본 개시내용은 인간 C9orf72의 아연 핑거 단백질-기반 전사 조정제 및 C9orf72-관련 장애를 치료하는데 있어서의 이들 조정제의 용도를 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 아연 핑거 단백질 (ZFP) 도메인 및 전사 리프레서 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기서 ZFP 도메인은 인간 C9orf72 유전자의 돌연변이체 대립유전자의 엑손 1a와 1b 사이의 인트론 절편 (인트론 1a) 내의 표적 영역에 결합한다. 돌연변이체 대립유전자는 인트론 1a 내에 확장된 G4C2 (서열식별번호: 1) 반복부 영역을 갖고, 융합 단백질은 이러한 확장된 반복부 영역을 표적화한다. 돌연변이체 대립유전자는 30개 초과의 탠덤 G4C2 반복부 (예를 들어, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개 초과의 반복부)를 포함할 수 있다. 야생형 대립유전자는 30개 이하의 이러한 반복부 (예를 들어, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 이하의 반복부)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 돌연변이체 대립유전자로부터의 반복부-함유 RNA 전사체 (예를 들어, mRNA)의 전사를 억제하고, 유전자로부터의 야생형 RNA 전사체 (예를 들어, mRNA)의 전사는 억제하지 않는다.
일부 실시양태에서, ZFP 도메인은 표적 영역 내의 센스 서열에 결합하며, 여기서 센스 서열은 헥사뉴클레오티드 GGGGCC (서열식별번호: 1), GGGCCG (서열식별번호: 2), GGCCGG (서열식별번호: 3), GCCGGG (서열식별번호: 4), CCGGGG (서열식별번호: 5) 또는 CGGGGC (서열식별번호: 6)의 1 내지 3개의 탠덤 반복부를 포함한다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 인간 세포에서 돌연변이체 대립유전자로부터의 센스 전사를 억제한다. 특정한 실시양태에서, 융합 단백질은 C9orf72 1a 프로모터로부터의 센스 전사를 억제하고, C9orf72 1b 프로모터로부터의 센스 전사는 억제하지 않는다.
일부 실시양태에서, ZFP 도메인은 표적 영역 내의 안티센스 서열에 결합하며, 여기서 안티센스 서열은 헥사뉴클레오티드 GGCCCC (서열식별번호: 7), GCCCCG (서열식별번호: 8), CCCCGG (서열식별번호: 9), CCCGGC (서열식별번호: 10), CCGGCC (서열식별번호: 11) 또는 CGGCCC (서열식별번호: 12)의 1 내지 3개의 탠덤 반복부를 포함한다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 인간 세포에서 돌연변이체 대립유전자로부터의 안티센스 전사를 억제한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 인간 세포에서 돌연변이체 C9orf72 대립유전자로부터의 센스 전사 및 안티센스 전사 둘 다를 억제한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 야생형 C9orf72 대립유전자와 비교하여 돌연변이체 C9orf72 대립유전자를 우선적으로 억제한다.
추가 실시양태에서, 융합 단백질은 돌연변이체 대립유전자로부터의 센스 및/또는 안티센스 전사를 적어도 약 30%, 40%, 75%, 90%, 또는 95% 억제한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 1개 이상의 ZFP 도메인을 가지며, 이는 각각 임의로 6개의 아연 핑거를 포함하고/거나; 표 1에 제시된 표적 서열에 결합하고/거나; 6개의 아연 핑거 (F1에서 F6으로 정렬됨)를 포함하며, 각각의 아연 핑거는 임의로 표 1에 표시된 바와 같은 인식 헬릭스 영역 외부의 잔기에 대해 1개 이상의 돌연변이를 포함하는, 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 융합 단백질은 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 78021, 75114, 75115, 74969, 79895, 79898, 74986, 79899, 79901, 79902, 79904, 79916, 75027, 또는 79921이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 각각이 임의로 인간 KOX1로부터의 KRAB 도메인 아미노산 서열, 예컨대 하기에 추가로 기재된 것을 포함하는, 1개 이상의 전사 리프레서 도메인을 갖는다. 특정한 실시양태에서, ZFP 도메인은 펩티드 링커를 통해 전사 리프레서 도메인에 연결된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 융합 단백질 중 1종 이상에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 구축물을 제공하며, 여기서 코딩 서열은 전사 조절 요소에 임의로 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 전사 조절 요소는 뇌 세포에서 구성적으로 활성 또는 유도성인 포유동물 프로모터를 포함하고, 여기서 프로모터는 임의로 인간 시냅신 I 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 구축물은 재조합 아데노-연관 바이러스 ("AAV" 또는 "rAAV") 구축물이다. 또한, 혈청형 1-10 (예를 들어, AAV2, AAV6, 또는 AAV9), 또는 그 안에서 유래된 유사형 (예를 들어, AAV2/9, AAV2/6, 또는 AAV2/6/9)의 재조합 AAV 구축물 및 캡시드를 포함하는 rAAV가 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 융합 단백질 및/또는 1종 이상의 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 예를 들어 인간 세포, 예컨대 뉴런 또는 만능 줄기 세포 (예를 들어, 배아 줄기 세포 또는 유도성 만능 줄기 세포)일 수 있다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질 중 1종 이상, 1종 이상의 핵산 구축물 (예를 들어, AAV 구축물), 핵산 구축물을 포함하는 재조합 바이러스 (예를 들어, rAAV), 및/또는 1종 이상의 숙주 세포를, 전형적으로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 인간 세포 (예를 들어, 뉴런, 신경교 세포, 상의 세포, 또는 신경상피 세포)에서 돌연변이체 C9orf72 대립유전자의 전사를 억제하는 방법을 제공하며, 여기서 돌연변이체 대립유전자는 인트론 1a 내에 확장된 G4C2 반복부 영역을 포함하고, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 융합 단백질, 1종 이상의 핵산 구축물 (예를 들어, AAV), 1종 이상의 재조합 바이러스, 1종 이상의 숙주 세포 및/또는 1종 이상의 제약 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 C9orf72-관련 장애, 예컨대 ALS 또는 C9FTD를 앓고 있는 환자의 뇌 또는 척수 내의 것이다.
관련 측면에서, 본 개시내용은 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 C9 가족성 전두측두엽 치매 (C9FTD)로부터 임의로 선택된 C9orf72-관련 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 환자에게 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 융합 단백질, 1종 이상의 핵산 구축물 (예를 들어, AAV), 1종 이상의 숙주 세포 및/또는 1종 이상의 제약 조성물을 도입하는 것을 포함한다.
본 치료 방법에서, 융합 단백질은 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 (예를 들어, AAV 벡터)를 사용하여 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 뇌실내, 척수강내, 두개내, 안와후 (RO), 정맥내, 비강내 및/또는 수조내 경로를 통해 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 상이한 본 개시내용의 융합 단백질이 도입되며, 여기서 2종 이상의 융합 단백질에 대한 코딩 서열은 동일하거나 상이한 재조합 바이러스 벡터 상에 보유될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 치료 방법에 사용하기 위한 1종 이상의 융합 단백질, 및/또는 1종 이상의 핵산 구축물, 1종 이상의 재조합 바이러스, 및 1종 이상의 제약 조성물, 및 본원에 기재된 치료 방법에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 융합 단백질, 핵산 구축물, 및 재조합 바이러스의 용도가 본 개시내용에 제공된다.
본 발명의 다른 특색, 목적, 및 이점은 하기 상세한 설명에서 명백하다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 실시양태 및 측면을 나타내지만, 제한이 아닌 단지 예시로서 제공되는 것임이 이해되어야 한다. 본 발명의 범주 내의 다양한 변화 및 변형은 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다.
도 1a-c는 C9orf72 유전자 및 생산된 전사체의 개략도를 도시한다.
도 1a는 야생형 C9orf72 대립유전자 및 확장된 돌연변이체 C9orf72 대립유전자 둘 다의 구조를 보여준다. 확장된 돌연변이체 대립유전자 상의 G4C2의 확장 위치가 표시된다 (엑손 1a와 1b 사이의 게놈 영역, 즉, 인트론 1a 내). 엑손은 박스로 제시된다. 상기 문헌 [Douglas]으로부터 개조된 것으로; 또한 문헌 [Rizzu et al., (2016) Acta Neuropathologica Communications 4:37]을 참조한다.
도 1b는 G4C2 확장 근처의 돌연변이체 확장된 C9orf72 대립유전자 상의 영역의 확대도이고, 확장된 대립유전자와 연관된 프로모터 및 전사체를 도시한다. 센스 가닥 전사에 수반되는 프로모터 (흑색 화살표) 및 안티센스 전사에 수반되는 프로모터의 대략적인 위치 (백색 화살표)가 제시된다. 또한, 이전에 기재된 5종의 상이한 센스 전사체, 및 안티센스 방향으로의 대략적인 위치 및 전사체가 제시된다. 상기 동일 문헌.
도 1c는 확장된 영역을 표적화하는 ZFP-TF에 의한 1a 프로모터 및 안티센스 프로모터의 억제 모델을 보여주고, 여기서 ZFP-TF는 둘 다의 프로모터의 하류이고 프로모터 조절에 최적인 위치에서 결합한다. ZFP-TF의 결합이 1b 프로모터의 상류에 있기 때문에 이러한 모델에서 1b 프로모터는 억제되지 않는다.
도 2a-d는 표시된 ZFP-TF를 사용한 표시된 세포 유형에서의 C9orf72 발현 ("총 C9")의 억제를 보여준다. 또한, 도면은 확장된 돌연변이체 대립유전자 ("반복부-함유 이소형 특이적")에 의해 우세하게 생산되는 인트론 1a를 포함하는 보다 긴 mRNA 이소형 (확장된 것)의 발현의 억제를 보여준다. 확장된 이소형은 C9 환자 세포주에서 우세하게 발현된다.
도 2a는 총 C9 검정에 사용된 PCR 검정 및 센스 및 안티센스 반복부-함유 이소형 특이적 검정을 예시한다. 도면의 상부는 야생형 및 확장된 대립유전자의 게놈 구조를 도시하며, 도면의 하부는 각각의 대립유전자로부터 제조된 mRNA 생성물을 보여준다. mRNA 도면 상의 화살표 세트는 총 C9 검정에 사용된 PCR 표적을 도시한다.
도 2b-d는 건강한 개체로부터 유래된 야생형 세포주 및 ALS 환자-유래 섬유모세포 세포주 "C9"에서의 상이한 예시적인 ZFP-TF에 대한 C9orf72 발현 검정의 결과를 보여주는 그래프이다. C9 세포주는 야생형 대립유전자 (5) 및 확장된 대립유전자 (850) 상의 G4C2 반복부의 수를 지칭하는 "5/850"으로 특징화된다. 가장 좌측 그래프: 스크리닝의 제3 라운드 ("라운드 3")에서 야생형 세포에서의 총 C9orf72 발현 ("총 C9"). 좌측에서 두 번째 그래프: 라운드 3에서 C9 세포에서의 총 C9. 우측에서 두 번째 그래프: 스크리닝의 제2 라운드 ("라운드 2")에서 C9 세포에서의 총 C9. 가장 우측 그래프: 이소형-특이적 C9orf72 검정에 의해 결정된 바와 같은 확장된 C9orf72 대립유전자로부터의 발현. 라운드 2 스크린을 C9 세포에서 수행하여 ZFP-TF 처리 후 이소형 (또는 질환) 특이적 C9orf72 전사체 수준 대 총 C9 전사체 수준을 평가하였다. 라운드 3에서, C9 세포의 야생형 (WT) 대립유전자에 대한 ZFP-TF의 효과를 평가하기 위해 C9 세포 및 야생형 세포에서 총 C9를 결정하였다. 각각의 ZFP-TF에 대해, 1, 3, 10, 30, 100 및 300 ng mRNA의 농도가 좌측에서 우측으로 제시된다. 도 2b는 상부 그래프에서 ZFP-TF 74949, 74951, 74954, 74955 및 74964에 대한 결과 및 하부 그래프에서 74969, 74971, 74973, 74978 및 74979에 대한 결과를 보여준다. 도 2b는 출현 순서대로 각각 서열식별번호: 1, 1 및 3을 개시한다. 도 2c는 상부 그래프에서 ZFP-TF 74983, 74984, 74986, 74987 및 74988에 대한 결과 및 하부 그래프에서 74997, 74998, 75001 및 75003에 대한 결과를 보여준다. 도 2c는 출현 순서대로 각각 서열식별번호: 4 및 5를 개시한다. 도 2d는 상부 그래프에서 ZFP-TF 75023, 75027, 75031, 75032, 75055 및 75078에 대한 결과 및 하부 그래프에서 75090, 75105, 75109, 75114 및 75115에 대한 결과를 보여준다. 도 2d는 출현 순서대로 각각 서열식별번호: 8-11을 개시한다. 그래프 하단의 서열은 ZFP-TF에 대한 DNA 결합 모티프를 나타낸다. 각각의 ZFP-TF는 그러한 모티프를 함유하는 3개의 헥사뉴클레오티드 반복부에 결합한다. 전사체 수준을 ZFP-TF mRNA로 형질감염된 GFP mRNA로부터 발현된 녹색 형광 단백질 (GFP)의 수준에 대해 정규화하였다. 그래프에서 수평 점선은 나타낸 바와 같은 50% 또는 70% 억제를 보여준다. 예를 들어, ZFP-TF 75115의 경우, C9 세포주에서 총 이소형 전사체의 대략 50% 억제 및 반복부 함유 이소형 특이적 전사체의 약 70% 억제가 존재한 반면, WT 세포주에서는 총 이소형의 최소 억제가 존재하였다. 그래프는 30%의 전사체가 남아있음을 나타내고, 이는 70%가 억제되었음을 나타낸다.
도 3은 C9orf72 확장된 대립유전자의 센스 및 안티센스 전사체에 대한 프로모터 영역의 다이어그램을 보여준다. 센스, 총 및 안티센스 전사체의 특이적 검출을 위한 프라이머 쌍을 나타낸다. AS: 안티센스. ddPCR: 액적 디지털 PCR. 도면은 출현 순서대로 각각 서열식별번호: 1, 1 및 7을 개시한다.
도 4a 및 4b는 인트론 1b를 표적화하는 프라이머가 안티센스 프리-mRNA를 특이적으로 검출함을 보여준다. 가닥-특이적 PCR을 사용하여 건강한 대조군 (Con) 또는 C9 세포 (C9)로부터 센스 (S) 또는 안티센스 (AS) cDNA 주형을 생성하였다. 예를 들어, C9-AS는 C9 세포로부터 단리된 RNA로부터 생산된 안티센스 cDNA 주형으로 수득된 ddPCR 결과를 나타낸다. 도 4a는 cDNA 주형 C9-AS만이 PCR 생성물을 생산한다는 것을 보여주며, 이는 안티센스 프리-mRNA의 검출에 대한 프라이머의 특이성을 나타낸다. 도 4b는 도 4a의 실험을 상이한 G4C2 반복부 길이를 갖는 7개의 상이한 C9orf72 환자-유래 세포주 및 6개의 상이한 건강한 대조군 세포주로 확대한 것이다.
도 5a-c는 반복부-함유 이소형 특이적 검정을 사용한 C9 세포에서의 전사체의 억제를 보여주는 그래프이다. 도 5a는 ZFP-TF 74949, 74978, 75003, 75027, 75109, 75114, 75115, 74960, 및 74967을 3가지의 상이한 용량 (30, 100, 또는 300 ng)으로 제공한 다음, 질환 센스 전사체의 양을 측정한 3가지의 실험을 보여준다. 도 5b는 질환 안티센스 전사체를 측정하는 3가지의 실험을 보여준다. 도 5c는 총 C9orf72 전사체를 측정하는 3가지의 실행을 보여준다.
도 6은 각각 그의 확장된 대립유전자에 상이한 G4C2 반복부의 수 (각각 약 600, 800, 및 850개의 반복부)를 함유하는 상이한 ALS 환자로부터 수득된 3종의 상이한 섬유모세포주에서의 확장된 센스 및 안티센스 전사체 (질환 이소형)와 함께 총 C9 전사체의 억제를 보여준다. 세포를 100 ng의 ZFP-TF 75109, 75114, 및 75115에 노출시킨 후, 이소형 선택적 검정을 사용하여 억제 수준을 평가하였다. 모든 3종의 ZFP-TF는 모든 3종의 세포주에서 선택적 억제를 유지하였다.
도 7은 그의 대립유전자 상에 전형적인 G4C2 반복부 수보다 더 큰, 건강한 개체로부터의 2종의 세포주에서의 총 C9 전사체의 억제를 보여준다. 건강한 개체는 전형적으로 각각의 그의 C9orf72 대립유전자 상에 2-5개의 G4C2 반복부를 갖는다. 그러나, 일부 건강한 개체는 더 많은 반복부를 함유한다. ZFP-TF에 대한 충분한 결합 부위가 제공되도록 보장하기 위해, 전형적인 반복부 수 (5/8 및 5/20 반복부)를 초과하여 함유하는 세포주를 사용하였다. 총 C9 전사체는 이들 세포주에서 최소의 영향을 받는다.
도 8a-8c는 ALS 환자-유래 1차 섬유모세포 (C921, 또한 C9021로도 불림), 마우스 1차 뉴런, 및 표시된 리프레서 (75027, 75109, 75114, 및 75115)의 특이성을 보여주는 인간 1차 뉴런에서의 마이크로어레이 분석의 결과를 보여준다. ZFP-TF 75027은 반복되는 GCCCCG (서열식별번호: 8) 모티프를 표적화하고, ZFP-TF 75109, 75114, 및 75115는 C9orf72 유전자의 안티센스 가닥 내의 CCGGCC (서열식별번호: 11) 모티프를 표적화한다.
도 8a는 데이터베이스 내에 21,000개의 주석이 잘 달려있는 유전자를 함유하는 써모 피셔 클라리옴(Thermo Fisher Clariom)™ S 검정을 사용한, 환자-유래 1차 섬유모세포 (C9021)에서의 마이크로어레이 분석의 결과를 보여준다. 분석은 mRNA 형태의 리프레서를 300 ng으로 C9021 세포에 투여한지 24시간 후에 수행하였다. 그래프는 표시된 ZFP-TF에 반응하여 상향- 또는 하향-조절된 유전자를 예시한다.
도 8b는 데이터베이스 내에 140,000개의 주석이 달린 및 주석이 달리지 않은 코딩 및 비-코딩 전사체를 함유하는 써모 피셔 클라리옴™ D 검정을 사용한, 마우스 1차 뉴런에서의 마이크로어레이 분석의 결과를 보여준다. AAV 형질도입 7일 후에 분석을 수행하였다. 모든 세포를 MOI 3,000으로 형질도입하였다. 그래프는 표시된 ZFP-TF에 반응하여 상향- 또는 하향-조절된 유전자를 예시한다.
도 8c는 써모 피셔 클라리옴™ D 검정을 사용한 인간 1차 뉴런에서의 마이크로어레이 분석의 결과를 보여준다. 분석은 MOI 3,000으로의 세포의 AAV 형질도입 19일 후에 수행하였다. 그래프는 표시된 ZFP-TF에 반응하여 상향- 또는 하향-조절된 유전자를 예시한다.
도 9는 C9orf72 BAC 트랜스제닉 마우스에서의 ZFP의 생체내 표적 결속을 보여준다. 패널 a는 주사에 사용된 AAV 구축물을 보여준다. 구축물은 시냅신 프로모터, ZFP-KRAB 코딩 서열, 및 베누스(Venus) 태그를 함유한다. 패널 b 및 c는 신생 마우스에게 ZFP-KRAB 발현 구축물을 함유하는 AAV를 뇌실내로 (ICV) 주사하고, 하류 분석을 위해 주사 1개월 후에 해부하는 연구 설계를 보여준다. 패널 d는 ZFP-KRAB (75027) 주사된 동물의 해마 및 피질에서의 센스, 안티센스 및 총 C9 RNA의 수준을 보여준다. 패널 e는 ZFP-KRAB (75027) 주사된 동물에서 해마의 암몬각 (CA) 및 치상회 (DG) 영역으로부터의 센스 및 안티센스 RNA 병소 및 정량화의 대표적인 영상을 보여준다.
본 개시내용은 확장된 G4C2 반복부 영역을 갖는 인간 C9orf72 유전자 대립유전자를 우선적으로 표적화하고 이들 돌연변이체 대립유전자의 RNA로의 전사를 억제하는 아연 핑거 단백질-기반 전사 인자 (ZFP-TF)를 제공한다. 이러한 확장된 영역은 30개 초과의 G4C2 반복부를 가질 수 있다. 본 발명의 ZFP-TF는 (i) 돌연변이체 대립유전자의 센스 또는 안티센스 가닥 상의 반복부 내의 DNA 모티프에 특이적으로 결합하는 적어도 1개의 아연 핑거 단백질 (ZFP) 도메인, 및 (ii) 센스 및 안티센스 방향 중 하나 또는 둘 다로 대립유전자의 전사를 감소시키는 적어도 1개의 전사 리프레서 도메인을 함유하는 융합 단백질이다. ZFP-TF를 환자의 신경계 (예를 들어, 뇌 및 척수) 내로 도입함으로써 뉴런에서 돌연변이체 C9orf72 전사체의 수준을 감소시키는 것은 세포 내에서 질환-유발 세포독성 물질의 형성을 억제 (예를 들어, 감소 또는 정지)할 것으로 예상된다. 본 발명의 ZFP-TF는 C9orf72-관련 장애, 예컨대 ALS 및 C9FTD의 예방 및 완화를 포함한 치료를 위해 사용될 수 있다.
ALS 및 FTD를 진단, 예방 및/또는 치료하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 특히, 조작된 전사 인자 리프레서 및 뉴클레아제의 사용을 포함하여, 이들 질환을 치료하기 위해 특정 유전자를 변형시키는 (예를 들어, 그의 발현을 조정하는) 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 발현의 조정은 센스 및/또는 안티센스 발현 둘 다를 조정하는 것을 포함한다.
따라서, 세포 (예를 들어, 뉴런)에서 C9orf72 유전자의 반복부 확장된 돌연변이체 대립유전자의 센스 및/또는 안티센스 전사를 억제하는 방법 (생체내, 생체외 및/또는 시험관내)이 본원에 기재된다. 방법은 세포를 돌연변이체 C9orf72 유전자 대립유전자의 1종 이상의 리프레서로 처리하는 것을 포함하며, 1종 이상의 리프레서는 전사 억제 도메인 및 돌연변이체 C9orf72 유전자 대립유전자 내의 표적 부위에 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함한다. 리프레서(들)는 1개 이상의 아연 핑거 단백질 전사 인자 (ZFP DNA-결합 도메인을 포함하는 ZFP-TF), 1개 이상의 TAL-이펙터 도메인 전사 인자 (TAL-이펙터 도메인 DNA-결합 도메인을 포함하는 TALE-TF) 및/또는 1개 이상의 CRISPR/Cas 전사 인자 시스템 (단일 가이드 RNA DNA-결합 도메인을 포함함)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 상이한 리프레서 (예를 들어, 2종 이상의 상이한 리프레서를 포함하는 1종 이상의 제약 조성물)가 사용된다. 특정 실시양태에서, C9orf72 유전자는 1개 이상의 (G4C2) 반복부를 포함하는 돌연변이체 대립유전자를 포함하며, 임의로 여기서 리프레서의 DNA-결합 도메인에 의해 결합되는 표적 부위는 1개 이상의 (G4C2) 반복부 내에 있다. 따라서, 본 발명은 센스 및/또는 안티센스 전사의 리프레서에 대한 1개 이상의 (G4C2) 반복부를 포함하는 돌연변이체 C9orf72 확장된 대립유전자에 결합하는 1종 이상의 ZFP-TF, TALE-TF 또는 CRISPR/Cas TF 리프레서 (예를 들어, 1종 이상의 리프레서를 포함하는 1종 이상의 제약 조성물로 제제화된 것)의, 그를 필요로 하는 대상체 (예를 들어 ALS 및/또는 FTD를 갖는 대상체, 여기서 질환은 치료되고/거나 증상이 호전됨) (예를 들어, 비치료 세포/대상체와 비교하여 50%, 70% 또는 그 초과만큼)에서의 용도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 센스 및/또는 안티센스 전사는 정상 (대조군) 수준의 90% 초과로 억제되지 않는다. 특정 실시양태에서, 안티센스 및 센스 전사 둘 다는 동일하거나 상이한 수준으로 억제되고 (예를 들어, 안티센스 및 센스 전사는 유사하게 억제됨); 안티센스 전사는 센스 전사보다 더 억제되거나, 또는 센스 전사는 안티센스 전사보다 더 억제된다. 특정 실시양태에서, 특이적 센스 전사체는 억제되지만, 다른 것은 억제되지 않는다. 일부 실시양태에서, 1b 인트론 절편 내의 프로모터로부터의 전사는 억제되지 않지만, 1a 인트론 내의 프로모터로부터의 전사 및 안티센스 전사체는 억제된다. 특정 실시양태에서, 확장된 반복부를 포함하는 전사체는 선택적으로 억제된다 (예를 들어, 안티센스 전사는 억제되고/거나, 1a 프로모터로부터의 센스 전사는 억제되고/거나, 1b 프로모터로부터의 센스 전사는 억제되지 않음). 특정 실시양태에서, 표 1에 제시된 바와 같은 인식 헬릭스 영역을 포함하는 1종 이상의 ZFP-TF 리프레서는 임의로 1종 이상의 상이한 리프레서 (예를 들어, 추가의 상이한 ZFP-TF, 예를 들어, 표 1에 제시된 바와 같은 ZFP를 포함하는 1종 이상의 추가의 ZFP-TF)와 조합되어 본원에 기재된 방법 및 용도에서 사용된다. 특정 실시양태에서, 리프레서 중 1종 이상은 1종 이상의 비-바이러스 벡터 (예를 들어, mRNA로서) 및/또는 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV 예컨대 AAV2/9)를 사용하여 세포에 투여된다. 1종 이상의 조정제 (예를 들어, 리프레서)의 다중 카피는 동일하거나 상이한 양식 (예를 들어, mRNA 및/또는 AAV)을 사용하여 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 동일하거나 상이한 양식은 1종 이상의 상이한 조정제 (예를 들어, 리프레서)를 전달하는데 사용될 수 있다. 살아있는 대상체 (예를 들어, 인간)에서의 생체내 방법 및 용도는 뇌실내, 척수강내, 두개내, 안와후 (RO), 정맥내, 비강내 및/또는 수조내 정맥내를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 수단에 의한 (예를 들어, 리프레서 및/또는 리프레서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 제약 조성물의) 투여를 수반할 수 있다. 뇌 투여는 편측 또는 양측 (예를 들어, 해마에 대한 것)일 수 있다. 임의의 양 (투여량), 예를 들어 1E10 내지 1E13 (예를 들어, 6E11) vg/반구가 투여될 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 용도 중 임의의 것에서, 대상체에서 ALS 및/또는 FTD가 치료된다 (및/또는 이들 질환의 1종 이상의 증상이 치료됨).
C9orf72 유전자 내의 적어도 12개의 뉴클레오티드의 표적 부위에 결합하는 DNA-결합 도메인 (예를 들어, 아연 핑거 단백질 (ZFP), TAL-이펙터 도메인 단백질 (TALE) 또는 단일 가이드 RNA); 및 전사 조절 도메인 (예를 들어, 억제 도메인)을 포함하는, C9orf72 유전자의 유전자 조정제가 본원에 제공된다. 본원에 기재된 유전자 조정제 중 1종 이상을 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 바이러스 또는 비바이러스 유전자 전달 비히클, 예를 들어 AAV 벡터)가 또한 제공된다. 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 1종 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 1종 이상의 유전자 전달 비히클을 포함하는 제약 조성물이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 유전자 조정제는 조절인자 도메인을 포함하고, 유전자 조정제 (및 1종 이상의 유전자 조정제 또는 1종 이상의 유전자 조정제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물)는 C9orf72 유전자의 발현을 조정 (예를 들어, 억제 또는 활성화)한다. 유전자의 센스 및/또는 안티센스 가닥은 결합 및/또는 조정될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 유전자 조정제; 1종 이상의 폴리뉴클레오티드; 1종 이상의 유전자 전달 비히클; 및/또는 1종 이상의 제약 조성물을 포함하는 단리된 세포 (세포 집단 포함)가 본원에 제공된다. 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 유전자 조정제; 1종 이상의 폴리뉴클레오티드; 1종 이상의 유전자 전달 비히클; 및/또는 1종 이상의 제약 조성물을 세포에 (뇌실내, 척수강내, 두개내, 안와후 (RO), 정맥내 또는 수조내를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 방법을 통해) 투여하는 것을 포함하는, 세포에서 (시험관내, 생체내 또는 생체외) C9orf72 유전자의 발현을 조정 (예를 들어, 억제)하기 위한 방법 및 용도가 또한 제공된다. 방법은 대상체에서 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTD)의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 대상체에서 ALS 또는 FTD의 치료 및/또는 예방을 위한 1종 이상의 유전자 조정제; 1종 이상의 폴리뉴클레오티드; 1종 이상의 유전자 전달 비히클; 및/또는 1종 이상의 제약 조성물의 용도가 또한 제공된다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 유전자 조정제; 1종 이상의 폴리뉴클레오티드; 1종 이상의 유전자 전달 비히클; 및/또는 1종 이상의 제약 조성물, 및 임의로 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트가 제공된다.
따라서, 한 측면에서, 1종 이상의 유전자의 조작된 (비-자연 발생) 유전자 조정제 (예를 들어, 리프레서)가 제공된다. 이들 유전자 조정제는 대립유전자의 발현을 조정 (예를 들어, 억제)하는 시스템 (예를 들어, 아연 핑거 단백질, TAL이펙터 (TALE) 단백질 또는 CRISPR/dCas-TF)을 포함할 수 있다. 야생형 및/또는 돌연변이체 대립유전자의 발현은 함께 또는 개별적으로 조정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 대립유전자의 조정은 야생형 대립유전자보다 더 큰 수준으로 이루어진다 (예를 들어, 야생형 대립유전자는 정상의 50% 이하로 억제되지만, 돌연변이체 대립유전자는 비처리된 대조군과 비교하여 적어도 70%만큼 억제됨). 일부 실시양태에서, 발현의 조정은 C9orf72 유전자의 센스 및 안티센스 전사체 둘 다를 조정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현의 조정은 센스 전사체를 우세하게 조정할 수 있는 한편, 다른 실시양태에서 발현의 조정은 안티센스 전사체를 우세하게 조정할 수 있다.
C9orf72 대립유전자에서의 확장 돌연변이는 ALS 및 FTD와 연관된 센스 및 안티센스 RNA 생성물 둘 다의 발현으로 이어지고, 따라서 한 실시양태에서, ALS 또는 FTD의 치료를 위해 이들 돌연변이체 C9orf72 대립유전자의 발현을 억제하도록 설계된 조작된 전사 인자가 제공된다. 조작된 아연 핑거 단백질 또는 TALE는 DNA 결합 도메인 (예컨대 인식 헬릭스 또는 RVD)이 미리-선택된 표적 부위에 결합하도록 (예컨대 선택 및/또는 합리적 설계에 의해) 변경된 비-자연 발생 아연 핑거 또는 TALE 단백질이다. 본원에 기재된 아연 핑거 단백질 중 임의의 것은 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 아연 핑거를 포함할 수 있으며, 각각의 아연 핑거는 선택된 서열(들) (예를 들어, 유전자(들)) 내의 표적 하위부위에 결합하는 인식 헬릭스를 갖는다. 특정 실시양태에서, ZFP-TF는 표 1의 단일 행에 제시된 바와 같은 인식 헬릭스 영역을 갖는 ZFP를 포함한다. 유사하게, 본원에 기재된 TALE 단백질 중 임의의 것은 임의의 수의 TALE RVD를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 RVD는 비-특이적 DNA 결합을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 인식 헬릭스 (또는 RVD)은 비-자연 발생이다. 특정 실시양태에서, TALE-TF는 표 1에 제시된 바와 같은 표적 부위의 적어도 12개의 염기 쌍에 결합하는 TALE를 포함한다. CRISPR/Cas-TF는 표적 서열에 결합하는 단일 가이드 RNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조작된 전사 인자는 질환 연관 유전자 내의 적어도 9-12개의 염기 쌍 표적 부위, 예를 들어 이들 표적 부위 (예를 들어, 표 1에 제시된 바와 같은 표적 부위) 내의 인접 또는 비-인접 서열을 포함한, 적어도 9-20개의 염기 쌍 (예를 들어, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과)을 포함하는 표적 부위에 (예를 들어, ZFP, TALE 또는 sgRNA DNA 결합 도메인을 통해) 결합한다. 특정 실시양태에서, 유전자 조정제는 (유전자 리프레서를 형성하기 위해) 전사 억제 도메인에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 바와 같은 DNA-결합 분자 (ZFP, TALE, 단일 가이드 RNA)를 포함한다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같은 아연 핑거 단백질 (ZFP), CRISPR/Cas 시스템의 Cas 단백질 또는 TALE 단백질은 융합 분자의 일부로서 조절 도메인 (또는 기능적 도메인)과 작동적으로 연결되어 배치될 수 있다. 기능적 도메인은, 예를 들어 전사 활성화 도메인, 전사 억제 도메인 및/또는 뉴클레아제 (절단) 도메인일 수 있다. DNA-결합 분자와 함께 사용하기 위한 활성화 도메인 또는 억제 도메인을 선택함으로써, 이러한 분자는 유전자 발현을 활성화 또는 억제하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 기능적 또는 조절 도메인은 히스톤 번역후 변형에서 역할을 할 수 있다. 일부 예에서, 도메인은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT), 히스톤 데아세틸라제 (HDAC), 히스톤 메틸라제, 또는 히스톤을 SUMO화 또는 비오티닐화하는 효소, 또는 번역후 히스톤 변형 조절된 유전자 억제를 가능하게 하는 다른 효소 도메인이다 (Kousarides, (2007) Cell 128:693-705). 일부 실시양태에서, 유전자 발현을 하향-조절하는데 사용될 수 있는 전사 억제 도메인에 융합된 본원에 기재된 바와 같은 유전자 (예를 들어, C9orf72)에 표적화된 ZFP, dCas 또는 TALE를 포함하는 분자가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 진핵생물을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 조절 도메인의 활성은 세포의 전사 기구와의 상호작용이 외인성 리간드의 부재 하에 일어나지 않도록 외인성 소분자 또는 리간드에 의해 조절된다. 이러한 외부 리간드는 ZFP-TF, CRISPR/Cas-TF 또는 TALE-TF와 전사 기구의 상호작용 정도를 제어한다. 조절 도메인(들)은 1개 이상의 ZFP, dCas 또는 TALE 사이, 1개 이상의 ZFP, dCas 또는 TALE의 외부, 및 그의 임의의 조합을 포함하여, 1개 이상의 ZFP, dCas 또는 TALE의 임의의 부분(들)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조절 도메인은 표적화된 유전자 (예를 들어, C9orf72)의 유전자 발현의 억제를 발생시킨다. 본원에 기재된 융합 단백질 중 임의의 것은 제약 조성물로 제제화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 인공 조절인자는 유전자의 전사 개시 부위 (TSS)의 상류 (예를 들어, 5')의 프로모터 영역에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인공 조절인자는 TSS의 하류 영역에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 인공 조절인자는 C9orf72 유전자 내의 확장된 반복부 영역에 우선적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, C9orf72 유전자에 대한 인공 조절인자의 결합은 1a 인트론 내의 프로모터의 발현을 억제한다. 일부 실시양태에서, C9orf72 유전자에 대한 인공 조절인자의 결합은 1b 인트론 내의 프로모터의 발현을 억제한다. 일부 실시양태에서, 인공 조절인자의 결합은 1a 프로모터 및 안티센스 프로모터로부터의 발현을 억제하지만, 1b 프로모터는 억제하지 않는다. 또한 도 1b 및 1c를 참조한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 2종 이상의 융합 분자, 예를 들어 2종 이상의 C9orf72 조정제 (인공 전사 인자)의 사용을 포함한다. 2종 이상의 융합 분자는 상이한 표적 부위에 결합할 수 있고, 동일하거나 상이한 기능적 도메인을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 2종 이상의 융합 분자는 동일한 표적 부위에 결합할 수 있지만, 상이한 기능적 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 3종 이상의 융합 분자가 사용되고, 다른 경우에 4종 이상의 융합 분자가 사용되고, 다른 경우에 5종 이상의 융합 분자가 사용된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 또는 5종 이상의 융합 분자 (또는 그의 성분)는 핵산으로서 세포에 전달된다. 바람직한 실시양태에서, 융합 분자는 표적화된 유전자의 발현의 억제를 유발한다. 일부 실시양태에서, 2종의 융합 분자는 각각의 분자가 그 자체로 활성이지만 조합되어 억제 활성이 상가적이 되는 용량으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 2종의 융합 분자는 어느 것도 그 자체로는 활성이지 않지만, 조합되어 억제 활성이 상승작용적이 되는 용량으로 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 DNA 결합 도메인 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, DNA 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다. 일부 측면에서, mRNA는 화학적으로 변형될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kormann et al., (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-7]). 다른 측면에서, mRNA는 ARCA 캡을 포함할 수 있다 (미국 특허 번호 7,074,596 및 8,153,773 참조). 추가 실시양태에서, mRNA는 비변형 및 변형된 뉴클레오티드의 혼합물을 포함할 수 있다 (미국 특허 공개 번호 2012/0195936 참조).
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 리프레서) 중 임의의 것을 포함하는 유전자 전달 벡터가 제공된다. 특정 실시양태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터 (예를 들어, Ad5/F35 벡터), 통합 적격 또는 통합-결함 렌티바이러스 벡터를 포함한 렌티바이러스 벡터 (LV), 또는 아데노바이러스 연관 바이러스 벡터 (AAV)이다. 특정 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV2, AAV6, AAV8 또는 AAV9 벡터 또는 유사형화 AAV 벡터, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5, AAV2/9 및 AAV2/6이다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있는 AAV 벡터이다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2015/0079038). 다른 실시양태에서, AAV는 자기-상보적 AAV (sc-AAV) 또는 단일 가닥 (ss-AAV) 분자이다. 또한, 적어도 1개의 뉴클레아제 (ZFN 또는 TALEN)를 코딩하는 서열 및/또는 표적 유전자 내로의 표적화된 통합을 위한 공여자 서열을 포함하는 아데노바이러스 (Ad) 벡터, LV 또는 아데노바이러스 연관 바이러스 벡터 (AAV)가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, Ad 벡터는 키메라 Ad 벡터, 예를 들어 Ad5/F35 벡터이다. 특정 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 인테그라제-결함 렌티바이러스 벡터 (IDLV) 또는 통합 적격 렌티바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 벡터는 VSV-G 외피 또는 다른 외피에 의해 유사형화된다.
추가적으로, 핵산 및/또는 융합체, 예컨대 인공 전사 인자 (예를 들어, ZFP, Cas 또는 TALE, 또는 ZFP, Cas 또는 TALE를 포함하는 융합 분자)를 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다. 예를 들어, 특정 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합된, 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 ZFP, Cas 또는 TALE 중 1개를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하며, 여기서 조절 서열은 세포에서 핵산의 발현을 가능하게 한다. 특정 실시양태에서, 코딩된 ZFP, Cas, CRISPR/Cas 또는 TALE는 야생형 및/또는 돌연변이체 대립유전자를 조정한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 대립유전자는 야생형 대립유전자보다 우선적으로 조정되고, 예를 들어 억제된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 돌연변이체 대립유전자를 우선적으로 조정하는 ZFP, CRISPR/Cas 또는 TALE, 및 신경영양 인자를 조정하는 ZFP, CRISPR/Cas 또는 TALE를 포함한다. 단백질 기반 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 1개 이상의 ZFP, CRISPR/Cas 또는 TALE 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 단백질, 융합 분자, 폴리뉴클레오티드 및/또는 조성물 중 임의의 것을 포함하는 단리된 세포가 또한 제공된다. 단리된 세포는 비-치료 용도, 예컨대 진단 및/또는 스크리닝 방법을 위한 세포 또는 동물 모델의 제공을 위해 및/또는 치료 용도, 예컨대 생체외 세포 요법을 위해 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 유전자 조정제, 1종 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자 전달 비히클) 및/또는 1종 이상의 단리된 세포 (예를 들어, 집단)를 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 2종 이상의 유전자 조정제를 포함한다. 예를 들어, 특정 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 희귀 질환과 연관된 유전자 (예를 들어, C9orf72) 중 1종의 1종 이상의 유전자 조정제를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유전자 조정제(들) (예를 들어, 본원에 기재된 ZFP, Cas 또는 TALE 포함)는 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합되며, 여기서 조절 서열은 세포에서 핵산의 발현을 가능하게 한다. 특정 실시양태에서, 코딩된 ZFP, CRISPR/Cas 또는 TALE는 돌연변이체 또는 야생형 대립유전자 (예를 들어, C9orf72)에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 야생형 대립유전자와 비교하여 돌연변이체 대립유전자를 우선적으로 조정하는 (예를 들어, 보다 큰 수준으로 억제하는) TF를 포함한, 돌연변이체 및/또는 야생형 대립유전자 (예를 들어, C9orf72)를 조정하는 ZFP-TF, CRISPR/Cas-TF 또는 TALE-TF를 포함한다. 단백질-기반 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 1종 이상의 유전자 조정제 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 유전자 조정제 (동일하거나 상이한 유형의 벡터, 예를 들어 AAV 벡터 상에 보유됨)를 포함하는 조성물이 사용되며, 임의로 여기서 유전자 조정제 중 1종은 74949, 74978, 75027 또는 75109로 지정된 ZFP를 포함하는 ZFP-TF 리프레서를 포함한다.
본 발명은 또한 유전자 발현의 억제를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 희귀 질환을 갖는 대상체)에게 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 폴리뉴클레오티드, 1종 이상의 유전자 전달 비히클, 및/또는 제약 조성물을 제공하는 것을 포함하는, 유전자 발현의 억제를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 희귀 질환을 갖는 대상체)에서 유전자 발현을 억제하기 위한 방법 및 용도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 ALS 또는 FTD의 치료 및/또는 예방을 포함하여, 대상체에서 돌연변이체 C9orf72 발현을 억제하기 위해 사용된다. 본원에 기재된 조성물은 뇌 (예컨대 비제한적으로 전두 피질 엽 예컨대 비제한적으로 전전두 피질, 두정 피질 엽, 후두 피질 엽, 측두 피질 엽 예컨대 비제한적으로 내후각 피질, 해마, 뇌간, 선조체, 시상, 중뇌, 소뇌) 및 척수 (예컨대 비제한적으로 요추, 흉추 및 경추 영역)에서 지속적인 기간 (4주, 3개월, 6개월 내지 1년 또는 그 초과) 동안 유전자 발현을 억제한다. 본원에 기재된 조성물은 뇌실내, 척수강내, 두개내, 정맥내, 안화 (안와후 (RO)), 비강내 및/또는 수조내 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 투여 수단에 의해 대상체에게 제공될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 조성물 중 1종 이상 (예를 들어, 유전자 조정제, 폴리뉴클레오티드, 제약 조성물 및/또는 세포) 뿐만 아니라 이들 조성물의 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 CNS (예를 들어, ALS 및/또는 FTD)를 치료 및/또는 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터 (예를 들어, 플라스미드) 및/또는 그의 조합을 사용하여 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질이 전달될 수 있는 조성물을 수반한다. 일부 실시양태에서, 방법은 인공 전사 인자 (예를 들어, ZFP-TF, TALE-TF, 또는 dCas-TF)를 포함하는 줄기 세포 집단을 포함하는 조성물을 수반한다. 본원에 기재된 바와 같은 조성물 (단백질, 폴리뉴클레오티드, 세포 및/또는 이들 단백질, 폴리뉴클레오티드 및/또는 세포를 포함하는 제약 조성물)의 투여는 ALS 및/또는 FTD와 연관된 임의의 임상 증상의 개선 또는 제거, 뿐만 아니라 CNS 세포 (예를 들어, 뉴런, 성상세포, 미엘린 등)의 기능 및/또는 수의 증가를 포함하나 이에 제한되지는 않는 치료 (임상) 효과를 발생시킨다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은, 본원에 기재된 바와 같은 인공 리프레서를 제공받지 않은 대조군과 비교하여, 표적 유전자 (예를 들어, C9orf72)에 대한 센스 및/또는 안티센스 전사체의 발현을 적어도 30% 또는 40%, 예를 들어 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 95% 초과로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 적어도 50% 감소가 달성된다. 특정 실시양태에서, 인공 리프레서는 야생형 대립유전자와 비교하여 돌연변이체 대립유전자 (예를 들어, 확장된 대립유전자)를 우선적으로, 예를 들어 적어도 20% 억제한다 (예를 들어, 야생형 대립유전자는 50% 이하로 억제하고, 돌연변이체 대립유전자는 적어도 70% 억제함). 일부 실시양태에서, 리프레서는 돌연변이체 대립유전자의 센스 전사체를 우선적으로 억제하는 한편, 다른 실시양태에서 리프레서는 돌연변이체 대립유전자의 안티센스 전사체를 우선적으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 리프레서는 돌연변이체 대립유전자의 센스 및 안티센스 전사체를 억제한다.
또 다른 추가 측면에서, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 사용하여 대상체의 뇌에 유전자 리프레서를 전달하는 방법이 본원에 기재된다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV9 벡터이다. 전달은 캐뉼라의 사용을 통한 것을 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 임의의 뇌 영역, 예를 들어, 해마 또는 내후각 피질에 대해 이루어질 수 있다. 뇌 영역에 벡터를 직접 투여하지 않고 순행성 및 역행성 축삭 이동을 통하는 것을 포함하는, 대상체의 뇌에 유전자 조정제 (예를 들어, 리프레서)의 광범위한 전달을 제공하는 임의의 AAV 벡터 (예를 들어, 피각에의 전달은 다른 구조 예컨대 피질, 흑색질, 시상 등에의 전달을 발생시킴). 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이고, 다른 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 투여는 단일 용량으로, 또는 동시에 주어지는 일련의 용량으로, 또는 (투여 사이의 임의의 시기에의) 다중 투여로 이루어질 수 있다.
따라서, 다른 측면에서, AAV를 사용하여 대상체에게 유전자의 리프레서를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 (예를 들어, ALS 및/또는 FTD)을 예방 및/또는 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 특정 실시양태에서, 리프레서는 대상체의 CNS (예를 들어, 해마 및/또는 내후각 피질) 또는 PNS (예를 들어, 척수/액)에 투여된다. 다른 실시양태에서, 리프레서은 정맥내로 투여된다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 AAV 벡터를 사용하여 대상체에게 C9orf72 대립유전자 (야생형 및/또는 돌연변이체)의 리프레서를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 ALS 또는 FTD를 예방 및/또는 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 특정 실시양태에서, 유전자 조정제를 코딩하는 AAV는 뇌실내, 척수강내, 두개내, 정맥내, 비강내, 안와후 또는 수조내 전달을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 전달 방법을 통해 CNS (뇌 및/또는 CSF)에 투여된다. 다른 실시양태에서, 리프레서를 코딩하는 AAV는 대상체의 실질 (예를 들어, 해마 및/또는 내후각 피질) 내로 직접 투여된다. 다른 실시양태에서, 리프레서를 코딩하는 AAV는 정맥내로 (IV) 투여된다. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 투여는 1회 (단일 투여) 수행될 수 있거나, 또는 투여당 동일하거나 상이한 용량으로 다수회 (투여 사이에는 임의의 시간이 존재함) 수행될 수 있다. 다수회 투여되는 경우, 동일하거나 상이한 투여량 및/또는 투여 방식의 전달 비히클이 사용될 수 있다 (예를 들어, 상이한 AAV 벡터가 IV 및/또는 ICV로 투여됨). 방법은 상기 방법을 제공받지 않은 대상체와 비교해서도 또는 상기 방법을 제공받기 전의 대상체 자신과 비교해서도 모두, ALS 대상체에서 근육 기능의 손실, 신체적 협응의 손실, 근육 강직, 근육 연축, 언어 기능의 손실, 삼킴 곤란, 인지 장애를 감소시키는 방법, 운동 기능의 손실을 감소시키는 방법, 및/또는 1종 이상의 인지 기능의 손실을 감소시키는 방법을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 하기 중 1종 이상을 포함한, ALS 또는 FTD와 같은 희귀 질환의 바이오마커 및/또는 증상의 감소를 발생시킨다: 근육 기능의 손실, 신체적 협응의 손실, 근육 강직, 근육 연축, 언어 기능의 손실, 삼킴 곤란, 인지 장애, G-CSF, IL-2, IL-15, IL-17, MCP-1, MIP-1α, TNF-α, 및 VEGF 수준을 포함한 ALS와 연관된 혈액 및/또는 뇌 척수액 화학에서의 변화 (문헌 [Chen et al., Front Immunol. (2018) 9:2122] 참조) 및/또는 관련 기술분야에 공지된 다른 바이오마커. 특정 실시양태에서, 방법은, 예를 들어 FTD를 갖는 대상체에서, 타우의 1종 이상의 유전자 리프레서 (MAPT)를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2018/0153921을 참조한다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 표적화된 대립유전자의 리프레서는 예를 들어 대립유전자에 특이적으로 결합하는 ZFP 및 전사 억제 도메인 (예를 들어, KOX, KRAB 등)을 포함하는 융합 단백질인 ZFP-TF일 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적화된 대립유전자의 리프레서는 예를 들어 유전자 대립유전자에 특이적으로 결합하는 TALE 폴리펩티드 및 전사 억제 도메인 (예를 들어, KOX, KRAB 등)을 포함하는 융합 단백질인 TALE-TF일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화된 대립유전자 리프레서는 Cas 단백질 내의 뉴클레아제 도메인이 단백질이 더 이상 DNA를 절단하지 않도록 불활성화된 것인 CRISPR/Cas-TF이다. 생성된 Cas RNA-가이드 DNA 결합 도메인은 전사 리프레서 (예를 들어 KOX, KRAB 등)에 융합되어 표적화된 대립유전자를 억제한다. 일부 실시양태에서, 조작된 전사 인자는 돌연변이된 대립유전자의 발현을 억제할 수 있지만 야생형 대립유전자는 억제할 수 없다. 추가 실시양태에서, DNA 결합 분자는 육량체 GGGGCC (서열식별번호: 1) 확장을 우선적으로 인식한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 리프레서 (예를 들어, ZFP-TF, TALE-TF 또는 CRISPR/Cas-TF)를 코딩하는 서열은 게놈 내로 삽입 (통합) 되고, 한편 다른 실시양태에서, 리프레서를 코딩하는 서열은 에피솜에 유지된다. 일부 경우에, TF 융합체를 코딩하는 핵산은 내인성 프로모터가 발현을 구동하도록 프로모터를 포함하는 세이프 하버 부위에 (예를 들어, 뉴클레아제-매개 통합을 통해) 삽입된다. 다른 실시양태에서, 리프레서 (TF) 공여자 서열은 세이프 하버 부위 내로 (뉴클레아제-매개 통합을 통해) 삽입되고, 공여자 서열은 리프레서의 발현을 구동하는 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 광범위하게 발현되고, 한편 다른 실시양태에서, 프로모터는 조직 또는 세포/유형 특이적이다. 바람직한 실시양태에서, 프로모터 서열은 뉴런 세포에 대해 특이적이다. 다른 실시양태에서, 프로모터 서열은 근육 세포에 대해 특이적이다. 일부 실시양태에서, 선택된 프로모터는 낮은 발현을 갖는 것을 특징으로 한다. 유용한 프로모터의 비제한적 예는 신경 특이적 프로모터 NSE, 시냅신, CAMKiia 및 MECP를 포함한다. 편재성 프로모터의 비제한적 예는 CMV, CAG 및 Ubc를 포함한다. 추가 실시양태는 미국 특허 공보 번호 2015/0267205에 기재된 바와 같은 자기-조절 프로모터의 사용을 포함한다. 추가 실시양태는 미국 특허 공개 번호 2015/0267205에 기재된 바와 같은 자기-조절 프로모터의 사용을 포함한다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 방법은 대상체 (예를 들어, ALS를 갖는 대상체)의 1개 이상의 뉴런에서 표적 대립유전자 (예를 들어, 돌연변이체 또는 야생형 C9orf72)의 약 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 또는 약 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 억제를 발생시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 야생형 대립유전자의 발현은 (비치료 대상체와 비교하여) 대상체에서 50% 이하로 억제되는 한편, 돌연변이체 대립유전자는 (비치료 대상체와 비교하여) 대상체에서 적어도 70% (70% 또는 그 초과의 임의의 값) 억제된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 프로모터의 발현은 적어도 70% 억제된다. 특정 실시양태에서, C9orf72 인트론 1a, 1b 및/또는 1c의 영역에서 발견되는 안티센스 프로모터의 발현은 적어도 70% 억제되고, C9orf72 인트론 1b의 영역에서 센스 프로모터의 발현은 50% 이하로 억제된다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 조절인자 (예를 들어, 리프레서 또는 활성화제)는 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 및 폴리뉴클레오티드의 임의의 조합으로서 대상체에게 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 리프레서(들)는 AAV 벡터를 사용하여 전달된다. 다른 실시양태에서, 조절인자의 적어도 1종의 성분 (예를 들어, CRISPR/Cas 시스템의 sgRNA)은 RNA 형태로서 전달된다. 다른 실시양태에서, 조절인자(들)는 본원에 기재된 발현 구축물 중 임의의 것의 조합, 예를 들어 1종의 발현 구축물 (AAV9) 상의 1종의 리프레서 (또는 그의 부분) 및 별개의 발현 구축물 (AAV 또는 다른 바이러스 또는 비-바이러스 구축물) 상의 1종의 리프레서 (또는 그의 부분)를 사용하여 전달된다.
또한, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 조절인자 (예를 들어, 리프레서)는 목적하는 효과를 제공하는 임의의 농도 (용량)로 세포에 (생체외 또는 생체내) 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절인자는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 10,000 - 500,000개 벡터 게놈/세포 (또는 그 사이의 임의의 값)로 전달된다. 특정 실시양태에서, 조절인자는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 250 내지 1,000 (또는 그 사이의 임의의 값)의 MOI로 전달된다. 다른 실시양태에서, 조절인자는 플라스미드 벡터를 사용하여 0.01-1,000 ng/100,000개 세포 (또는 그 사이의 임의의 값)로 전달된다. 다른 실시양태에서, 리프레서는 mRNA로서 150-1,500 ng/100,000개 세포 (또는 그 사이의 임의의 값)로 전달된다. 또한, 생체내 사용의 경우, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 유전자 조정제(들) (예를 들어, 리프레서)는 그를 필요로 하는 대상체에서 목적하는 효과를 제공하는 임의의 농도 (용량)로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리프레서는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 10,000 - 500,000개 벡터 게놈/세포 (또는 그 사이의 임의의 값)로 전달된다. 특정 실시양태에서, 리프레서는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 250 내지 1,000 (또는 그 사이의 임의의 값)의 MOI로 전달된다. 다른 실시양태에서, 리프레서는 플라스미드 벡터를 사용하여 0.01-1,000 ng/100,000개 세포 (또는 그 사이의 임의의 값)로 전달된다. 다른 실시양태에서, 리프레서는 mRNA로서 0.01-3000 ng/세포의 개수 (예를 들어, 50,000-200,000 (예를 들어, 100,000)개 세포 (또는 그 사이의 임의의 값))로 전달된다. 다른 실시양태에서, 리프레서는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 뇌 실질에 1E11-1E14개 Vg/mL로, 1-300 μL의 고정 부피로 전달된다. 다른 실시양태에서, 리프레서는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 CSF에 1E11-1E14개 Vg/mL로, 0.5-10 mL의 고정 부피로 전달된다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 방법은 대상체의 1개 이상의 세포에서 표적화된 대립유전자(들)의 약 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 또는 약 95% 이상의 조정 (예를 들어, 억제)을 발생시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 야생형 및 돌연변이체 대립유전자는 상이하게 조정되고, 예를 들어 돌연변이체 대립유전자는 야생형 대립유전자와 비교하여 우선적으로 변형된다 (예를 들어, 돌연변이체 대립유전자는 적어도 70% 억제되고, 야생형 대립유전자는 50% 이하로 억제됨).
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 방법은 대상체의 1개 이상의 세포에서 표적화된 대립유전자(들)의 안티센스 발현의 약 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 또는 약 95% 이상의 조정 (예를 들어, 억제)을 발생시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 대립유전자에서의 센스 발현 및 안티센스 발현은 상이하게 조정되며, 예를 들어 안티센스 전사체의 발현은 돌연변이체 대립유전자에서의 센스 전사체의 발현과 비교하여 우선적으로 조정된다 (예를 들어, 안티센스 발현은 적어도 70% 억제되고, 센스 발현은 50% 이하로 억제됨).
추가 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 전사 인자, 예컨대 아연 핑거 단백질 (ZFP-TF), TALE (TALE-TF), 및 CRISPR/Cas-TF 중 1종 이상을 포함하는 전사 인자, 예를 들어 ZFP-TF, TALE-TF 또는 CRISPR/Cas-TF는 대상체의 뇌 (예를 들어, 뉴런)에서 돌연변이체 및/또는 야생형 대립유전자 (예를 들어, C9orf72)의 발현을 억제하는데 사용된다. 억제는 대상체의 비처리 (야생형) 세포와 비교하여 대상체의 1종 이상의 세포에서 표적화된 대립유전자의 약 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 약 75% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 또는 약 95% 이상의 억제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 야생형 대립유전자의 억제는 (비처리된 세포 또는 대상체와 비교하여) 50% 이하이고, 돌연변이체 (이환된 또는 이소형 변이체)의 억제는 (비처리된 세포 또는 대상체와 비교하여) 적어도 70%이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 전사는 완전히 (전부) 억제된다. 특정 실시양태에서, 센스 전사체의 억제는 (비처리 세포 또는 대상체와 비교하여) 50% 이하이고, 안티센스 전사체의 억제는 (비처리 세포 또는 대상체와 비교하여) 적어도 70%이다. 특정 실시양태에서, 표적화된-조정 전사 인자는 본원에 기재된 방법 중 1종 이상을 달성하는데 사용될 수 있다.
따라서, 외인성 서열 (예컨대 인공 TF)의 발현과 함께 또는 그의 발현 없이, 본원에 개시된 희귀 장애와 연관된 유전자의 발현을 조정 (억제 포함)하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 기재되어 있다. 조성물 및 방법은 시험관내 (예를 들어, 그의 조정을 통한 표적 유전자의 연구용 세포의 제공을 위해; 약물 발견을 위해; 및/또는 트랜스제닉 동물 및 동물 모델의 제조를 위해), 생체내 또는 생체외 사용을 위한 것일 수 있고, 임의로 뉴클레아제에 의한 절단 후 유전자 내로 통합되는 공여자를 갖는 뉴클레아제의 경우, 희귀 질환과 연관된 유전자에 대해 표적화된 DNA-결합 분자를 포함하는 인공 전사 인자 또는 뉴클레아제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공여자 유전자 (트랜스진)는 세포에서 염색체외로 유지된다. 특정 실시양태에서, 세포는 질환을 갖는 환자 내의 것이다. 다른 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 변형되고, 변형된 세포는 그를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 희귀 질환을 갖는 대상체)에게 투여된다. 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 세포를 포함한, 유전자 변형된 유전자 (예를 들어, 외인성 서열)를 포함하는 유전자 변형된 세포 (예를 들어, 줄기 세포, 전구체 세포, T 세포, 근육 세포 등)가 또한 제공된다. 이들 세포를 사용하여, 예를 들어 세포(들)를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 또는 대안적으로 세포에 의해 생산된 단백질을 단리하고, 단백질을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 (효소 대체 요법), 희귀 질환을 갖는 대상체에게 치료 단백질(들)을 제공할 수 있다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 조정제 (예를 들어, 리프레서) 및/또는 표적-조정제의 성분을 포함하고/거나 표적-조정제 (또는 그의 성분)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 세포 (예를 들어, 뉴런 또는 근육 세포), 시약 (예를 들어 CSF에서, 예를 들어 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 것) 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 방법을 포함한 사용에 대한 지침서를 추가로 포함할 수 있다.
본 방법 및 조성물은 하기에 추가로 상세하게 기재된다.
I. 아연-핑거 단백질 전사 인자
본 발명의 ZFP-TF는 DNA-결합 아연 핑거 단백질 (ZFP) 도메인 및 전사 리프레서 도메인을 함유하는 융합 단백질이고, 여기서 2개의 도메인은 직접 펩티딜 연결 또는 펩티드 링커에 의해, 또는 이량체화에 의해 (예를 들어, 류신 지퍼, STAT 단백질 N-말단 도메인, 또는 FK506 결합 단백질을 통해) 서로 회합될 수 있다. 본원에 사용된 "융합 단백질"은 공유 연결된 도메인을 갖는 폴리펩티드 뿐만 아니라 비-공유 결합을 통해 서로 회합된 폴리펩티드의 복합체를 지칭한다. 전사 리프레서 도메인은 ZFP 도메인의 C- 또는 N-말단을 포함한 임의의 적합한 위치에서 ZFP 도메인과 회합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ZFP-TF는 인간 돌연변이체 C9orf72 유전자의 전사를 45% 이상 (예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 또는 그 초과) 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 ZFP-TF 중 2개 이상은 환자에서 공동으로 사용되고, 여기서 ZFP-TF는 돌연변이체 C9orf72 전사의 최적 억제를 달성하기 위해 확장된 C9orf72 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥 내의 상이한 DNA 모티프에 결합한다.
A. ZFP 도메인의 표적
본 발명의 융합 단백질의 ZFP 도메인은 돌연변이체 인간 C9orf72 유전자 대립유전자 내의 확장된 영역에 우선적으로 결합한다. 인간 C9orf72 유전자는 염색체 9의 짧은 (p) 아암의 위치 21.2 (9p21.2)에 위치한다. 이는 염색체 상의 염기쌍 27,546,546 내지 27,573,866에 걸쳐있다. 인간 C9orf72의 게놈 구조를 도 1a에 제시한다. ZFP-TF의 DNA-결합 ZFP 도메인은 융합 단백질을 돌연변이체 C9orf72 유전자의 확장된 반복부 영역으로 지시하고, 융합 단백질의 전사 리프레서 도메인을 표적 영역으로 가져온다. 이어서, 리프레서 도메인은 RNA 폴리머라제에 의한 C9orf72 유전자 전사를 억제한다.
일부 실시양태에서, 확장된 영역 내의 표적 서열은 적어도 8 bp 길이이다. 예를 들어, 표적 서열은 8 bp 내지 40 bp 길이, 예컨대 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36 bp 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 ZFP-TF의 표적 서열은 12-20 (예를 들어, 12-18, 15-19, 15, 18, 또는 19) bp 길이이다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 인접하지 않은 하위서열을 포함한다.
G4C2 반복부는 유전자의 센스 및 안티센스 가닥에서 하기 헥사뉴클레오티드 DNA 모티프를 생성한다:
센스 C9orf72 가닥에서의 모티프:
(i) GGGGCC (서열식별번호: 1)
(ii) GGGCCG (서열식별번호: 2)
(iii) GGCCGG (서열식별번호: 3)
(iv) GCCGGG (서열식별번호: 4)
(v) CCGGGG (서열식별번호: 5)
(vi) CGGGGC (서열식별번호: 6)
안티센스 C9orf72 가닥에서의 모티프:
(vii) GGCCCC (서열식별번호: 7)
(viii) GCCCCG (서열식별번호: 8)
(ix) CCCCGG (서열식별번호: 9)
(x) CCCGGC (서열식별번호: 10)
(xi) CCGGCC (서열식별번호: 11)
(xii) CGGCCC (서열식별번호: 12)
일부 실시양태에서, 본 발명의 ZFP-TF의 표적 서열은 이들 DNA 모티프의 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4개)의 탠덤 반복부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 모티프 중 1개의 3개의 탠덤 반복부로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 모티프의 1개 이상 (예를 들어, 2 또는 3개)의 탠덤 반복부 플러스 상류 및/또는 하류 인접 서열로부터의 수개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)의 뉴클레오티드 (예를 들어, CC(G4C2)2GG) (서열식별번호: 75)를 포함한다.
표적 서열은 유전자의 센스 가닥 또는 유전자의 안티센스 가닥 상에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 환자에 사용되는 ZFP-TF는 돌연변이체 대립유전자의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다에 결합한다. 표적화 정확도를 보장하고 ZFP-TF에 의한 오프-타겟 결합을 감소시키기 위해, 선택된 C9orf72 표적 영역의 서열은 바람직하게는 게놈 내의 다른 유전자 내의 서열에 대해 75% 미만의 상동성 (예를 들어, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 또는 50% 미만의 상동성)을 갖는다.
표적 절편을 추가로 평가하기 위한 다른 기준은 이러한 절편 또는 관련 절편에 대한 ZFP 결합의 사전 이용가능성, 주어진 표적 절편에 결합하는 새로운 ZFP의 설계 용이성, 및 오프-타겟 결합 위험을 포함한다.
B. 아연 핑거 단백질 도메인
"아연 핑거 단백질" 또는 "ZFP"는 아연에 의해 안정화된 DNA-결합 도메인을 갖는 단백질을 지칭한다. ZFP는 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합한다. 개별 DNA-결합 도메인은 "핑거"로 지칭된다. ZFP는 적어도 1개의 핑거를 가지며, 각각의 핑거는 DNA의 2 내지 4개의 염기 쌍, 전형적으로 DNA의 3 또는 4개의 염기 쌍에 결합한다. 각각의 아연 핑거는 전형적으로 대략 30개의 아미노산을 포함하고, 아연을 킬레이트화한다. 조작된 ZFP는 자연-발생 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 트리플렛 (또는 쿼드루플렛) 뉴클레오티드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 트리플렛 또는 쿼드루플렛 뉴클레오티드 서열은 특정한 트리플렛 또는 쿼드루플렛 서열에 결합하는 아연 핑거의 1개 이상의 아미노산 서열과 회합된다. 예를 들어, 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,140,081; 6,200,759; 6,453,242; 6,534,261; 6,979,539; 8,586,526; 8,841,260; 8,956,828; 및 9,234,016; 및 국제 특허 공개 WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/016536; WO 02/099084; 및 WO 03/016496에 상세히 기재된 ZFP 설계 방법을 참조한다.
본 발명의 ZFP-TF의 ZFP 도메인은 적어도 3개 (예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13개, 또는 그 초과)의 아연 핑거를 포함할 수 있다. 3개의 핑거를 갖는 ZFP 도메인은 전형적으로 9 내지 12개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식한다. 4개의 핑거를 갖는 ZFP 도메인은 전형적으로 12 내지 15개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식한다. 5개의 핑거를 갖는 ZFP 도메인은 전형적으로 15 내지 18개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식한다. 6개의 핑거를 갖는 ZFP 도메인은 18 내지 21개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식할 수 있다.
ZFP 도메인의 표적 특이성은, 예를 들어 미국 특허 공개 2018/0087072에 기재된 바와 같이 ZFP 백본에 대한 돌연변이에 의해 개선될 수 있다. 돌연변이는 DNA 백본 상의 포스페이트와 비-특이적으로 상호작용할 수 있지만 뉴클레오티드 표적 특이성에 수반되지 않는 ZFP 백본 내의 잔기에 대해 이루어진 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 돌연변이는 양이온성 아미노산 잔기를 중성 또는 음이온성 아미노산 잔기로 돌연변이시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 돌연변이는 극성 아미노산 잔기를 중성 또는 비-극성 아미노산 잔기로 돌연변이시키는 것을 포함한다. 추가 실시양태에서, 돌연변이는 DNA-결합 헬릭스에 대해 위치 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 아연 핑거는 위치 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에 1개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, 다중-핑거 ZFP 도메인 내의 1개 이상의 아연 핑거는 위치 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 위치 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌 (R) 또는 리신 (K))은 알라닌 (A), 류신 (L), Ser (S), Asp (N), Glu (E), Tyr (Y), 및/또는 글루타민 (Q)으로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 위치 (-5)에서의 R 잔기는 Q로 돌연변이된다.
대안적으로, DNA-결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열이 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 5,420,032 및 6,833,252; 문헌 [Belfort et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3379-88; Dujon et al., Gene (1989) 82:115-8; Perler et al., Nucleic Acids Res. (1994) 22:1125-7; Jasin, Trends Genet. (1996) 12:224-8; Gimble et al., J Mol Biol. (1996) 263:163-80; Argast et al., J Mol Biol. (1998) 280:345-53]; 및 뉴 잉글랜드 랩스(New England Biolabs) 카탈로그를 참조한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ZFP-TF는 1개 이상의 아연 핑거 도메인을 포함한다. 도메인은, 예를 들어 하나의 도메인은 1개 이상 (예를 들어, 4, 5 또는 6개)의 아연 핑거를 포함하고 또 다른 도메인은 추가의 1개 이상 (예를 들어, 4, 5 또는 6개)의 아연 핑거를 포함하도록, 연장가능한 가요성 링커를 통해 함께 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 핑거 어레이가 8, 9, 10, 11 또는 12개 또는 그 초과의 핑거를 포함하는 1개의 DNA-결합 도메인을 포함하도록 하는 표준 핑거간 링커이다. 다른 실시양태에서, 링커는 비정형 링커, 예컨대 가요성 링커이다. 예를 들어, 2개의 ZFP 도메인은 전사 리프레서 TF에 (N 말단에서 C 말단으로) ZFP-ZFP-TF, TF-ZFP-ZFP, ZFP-TF-ZFP, 또는 ZFP-TF-ZFP-TF (2개의 ZFP-TF 융합 단백질은 링커를 통해 함께 융합됨) 입체형태로 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, ZFP-TF는 "2 핸드"이며, 즉 이는 2개의 ZFP 도메인이 2개의 불연속 표적 부위에 결합하도록 개재 아미노산에 의해 분리된 2개의 아연 핑거 클러스터 (2개의 ZFP 도메인)를 함유한다. 2 핸드 유형의 아연 핑거 결합 단백질의 예는 SIP1이고, 여기서 4개의 아연 핑거의 클러스터는 단백질의 아미노 말단에 위치하고, 3개의 핑거의 클러스터는 카르복실 말단에 위치한다 (문헌 [Remacle et al., EMBO J. (1999) 18(18):5073-84] 참조). 이들 단백질 내의 아연 핑거의 각각의 클러스터는 독특한 표적 서열에 결합할 수 있고, 2개의 표적 서열 사이의 간격은 많은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 기능상 ZFP-TF와 유사한 단백질이 ZFP-TF 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, ZFP 도메인 대신, 전사 리프레서 융합 단백질은 전사 활성화제 유사 이펙터 (TALE) DNA-결합 도메인으로부터 유래된 DNA-결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 8,586,526 및 9,458,205; 미국 특허 공개 2013/0196373 및 2013/0253040; WO 2010/079430; 문헌 [Schornack et al., J Plant Physiol (2006) 163(3):256-72); Kay et al., Science (2007) 318:648-51; Moscou and Bogdanove, Science (2009) 326:1501; 및 Boch et al., Science (2009) 326:1509-12]를 참조한다. 또 다른 예에서, 전사 리프레서 융합 단백질은 CRISPR/Cas 시스템의 단일-가이드 RNA인 DNA-결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 2015/0056705; 문헌 [Jinek et al., Science (2012) 337:816; Ramalingam et al., Genome Biol. (2013) 14:107; Hwang et al., (2013) Nature Biotechnology 31(3):227]를 참조한다.
C. 전사 리프레서 도메인
본 발명의 ZFP-TF는 돌연변이체 C9orf72 대립유전자의 전사 활성을 약화시키는 1개 이상의 전사 리프레서 도메인을 포함한다. 전사 리프레서 도메인의 비제한적 예는 KOX1, KAP-1, MAD, FKHR, EGR-1, ERD, SID, TGF-베타-유도성 초기 유전자 (TIEG), v-ERB-A, MBD2, MBD3, DNMT 패밀리의 구성원 (예를 들어, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb, 및 MeCP2의 KRAB 도메인이다. 예를 들어, 문헌 [Bird et al., Cell (1999) 99:451-54; Tyler et al., Cell (1999) 99:443-46; Knoepfler et al., Cell (1999) 99:447-50; 및 Robertson et al., Nature Genet. (2000) 25:338-42]를 참조한다. 추가의 예시적인 억제 도메인은 ROM2 및 AtHD2A를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Chem et al., Plant Cell (1996) 8:305-21; 및 Wu et al., Plant J. (2000) 22:19-27]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 전사 리프레서 도메인은 인간 아연 핑거 단백질 10/KOX1 (ZNF10/KOX1)의 크루펠-연관 박스 (KRAB) 도메인으로부터의 서열을 포함한다 (예를 들어, 진뱅크 번호 NM_015394.4). 예시적인 KRAB 도메인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00001
이러한 KRAB 서열의 변이체는 또한 이들이 동일하거나 유사한 전사 리프레서 기능을 갖는 한 사용될 수 있다.
D. 펩티드 링커
본 발명의 ZFP-TF의 ZFP 도메인 및 전사 리프레서 도메인 및/또는 ZFP 도메인 내의 아연 핑거는 펩티드 링커, 예를 들어 약 5 내지 200개 아미노산 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 아미노산)의 비절단가능한 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 일부 바람직한 링커는 재조합 융합 단백질로서 합성되는 가요성 아미노산 서열이다. 예를 들어, 상기 설명; 및 미국 특허 6,479,626; 6,903,185; 7,153,949; 8,772,453; 및 9,163,245; 및 WO 2011/139349를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 링커의 비제한적 예는 DGGGS (서열식별번호: 14), TGEKP (서열식별번호: 15), LRQKDGERP (서열식별번호: 16), GGRR (서열식별번호: 17), GGRRGGGS (서열식별번호: 18), LRQRDGERP (서열식별번호: 19), LRQKDGGGSERP (서열식별번호: 20), LRQKD(G3S)2ERP (서열식별번호: 21), TGSQKP (서열식별번호: 22), LRQKDAARGS (서열식별번호: 26), 및 LRQKDAARGSGG (서열식별번호: 76)이다.
일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 3 내지 20개의 아미노산 잔기 길이이고, G 및/또는 S가 풍부하다. 이러한 링커의 비제한적 예는 G4S-유형 링커 (서열식별번호: 23으로 개시된 "G4S"), 즉 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4개)의 GGGGS (서열식별번호: 23) 모티프 또는 모티프의 변이 (예컨대 모티프에 1, 2, 또는 3개의 아미노산 삽입, 결실, 및 치환을 갖는 것)를 함유하는 링커이다.
일부 실시양태에서, ZFP-TF는 핵 국재화 신호 (예를 들어, SV40 중간 T-항원으로부터의 것) 및/또는 에피토프 태그 (예를 들어, FLAG 및 헤마글루티닌)를 포함한다.
II. ZFP-TF의 발현
본 개시내용의 ZFP-TF는 이를 코딩하는 핵산 분자를 통해 환자에게 도입될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 RNA 분자이고, RNA 분자는 지질:핵산 복합체 (예를 들어, 리포솜)를 포함하는 조성물의 주사를 통해 환자의 뇌 내로 도입된다. 대안적으로, ZFP-TF는 ZFP-TF에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 발현 벡터를 통해 환자에게 도입될 수 있다. 발현 벡터는 신경계 (예를 들어, 중추 신경계)의 세포에서 ZFP-TF에 대한 코딩 서열의 발현을 가능하게 하는 발현 제어 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 전사 신호 서열, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 안정한 에피솜으로서 세포 내에 여전히 존재한다. 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 세포의 게놈 내로 통합된다.
일부 실시양태에서, 뇌에서 ZFP-TF 발현을 지시하기 위한 벡터 상의 프로모터는 구성적으로 활성인 프로모터 또는 유도성 프로모터이다. 적합한 프로모터는, 비제한적으로, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터 (임의로 RSV 인핸서를 가짐), 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의로 CMV 인핸서를 가짐), CMV 극초기 프로모터, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, EFlα 프로모터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMLV) LTR, 크레아틴 키나제-기반 (CK6) 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터 (TTR), 티미딘 키나제 (TK) 프로모터, 테트라시클린 반응성 프로모터 (TRE), B형 간염 바이러스 (HBV) 프로모터, 인간 α1-항트립신 (hAAT) 프로모터, 키메라 간-특이적 프로모터 (LSP), E2 인자 (E2F) 프로모터, 인간 텔로머라제 리버스 트랜스크립타제 (hTERT) 프로모터, CMV 인핸서/닭 β-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터 (CAG 프로모터; Niwa et al., Gene (1991) 108(2):193-9), 및 RU-486-반응성 프로모터를 포함한다. 뉴런-특이적 프로모터, 예컨대 시냅신 I 프로모터, 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II (CamKII) 프로모터, 메틸 CpG-결합 단백질 2 (MeCP2) 프로모터, 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT) 프로모터, 및 칼빈딘 (Calb) 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 성상세포-특이적 프로모터, 예컨대 신경교 원섬유성 산성 단백질 (GFAP) 프로모터 또는 알데히드 데히드로게나제 1 패밀리, 구성원 L1 (Aldh1L1) 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 핍지교세포-특이적 프로모터, 예컨대 Olig2 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 또한, 프로모터는 ZFP-TF가 결합하여 그 자신의 발현 수준을 미리 설정된 역치로 억제할 수 있는 1개 이상의 자기-조절 요소를 포함할 수 있다. 미국 특허 9,624,498을 참조한다.
전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주사, 양이온성 또는 음이온성 리포솜, 핵 국재화 신호와 조합된 리포솜, 자연 발생 리포솜 (예를 들어, 엑소솜), 또는 바이러스 형질도입을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 임의의 방법이 사용될 수 있다.
발현 벡터의 생체내 전달을 위해, 바이러스 형질도입이 사용될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 다양한 바이러스 벡터, 예를 들어 백시니아 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 폭시바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 하이브리드 바이러스 벡터가 본 개시내용에서 사용하기 위해 적합화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 바이러스 벡터는 재조합 AAV (rAAV) 벡터이다. AAV 벡터는 중추 신경계 (CNS) 유전자 전달에 특히 적합하며, 이는 AAV가 분열 및 비-분열 세포 둘 다를 감염시키고, 매우 낮은 면역원성을 갖고, 바이러스 게놈이 장기간 발현을 위한 안정한 에피솜 구조로서 존재하기 때문이다 (Hadaczek et al., Mol Ther. (2010) 18:1458-61; Zaiss, et al., Gene Ther. (2008) 15:808-16). 임의의 적합한 AAV 혈청형이 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV8.2, AAV9, 또는 AAVrh10, 또는 유사형의 것 (예를 들어, AAV2/8, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/9, 또는 AAV2/6/9)일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 7,198,951 및 9,585,971을 참조한다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 AAV 벡터이고, 이는 생산 시스템, 예컨대 곤충 세포/바큘로바이러스 생산 시스템 또는 포유동물 세포 생산 시스템에서의 AAV 비리온의 생산을 가능하게 하기 위해 그의 게놈이 양쪽 말단에 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 갖는 구축물을 포함하는 재조합 AAV 비리온에 의해 표적 인간 세포에 도입된다. AAV는 그의 캡시드 단백질이 인간에서 감소된 면역원성 또는 증진된 형질도입 능력을 갖도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV9가 사용된다. 본원에 기재된 바이러스 벡터는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 임의의 적합한 허용 또는 패키징 세포 유형이 바이러스 입자를 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 293) 또는 곤충 (예를 들어, Sf9) 세포가 패키징 세포주로서 사용될 수 있다.
또한, ZFP를 비롯한 치료 단백질을 그를 필요로 하는 환자의 신경계에서 발현시키는 방법에 대한 미국 특허 6,309,634; 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,953,575; 6,979,539; 7,013,219; 7,163,824; 7,182,944; 8,309,355; 8,337,458; 8,586,526; 9,050,299; 및 9,089,667을 참조한다.
III. 제약 용도
본 발명의 ZFP-TF는 C9orf72 발현의 하향조절, 특히 돌연변이체 C9orf72 대립유전자의 발현의 하향조절을 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 환자는 C9orf72-관련 신경변성 질환, 예컨대 ALS 및 C9FTD를 앓고 있거나, 또는 그의 발병 위험이 있다. 위험이 있는 환자는 유전적으로 소인이 있는 환자, 뇌진탕과 같은 반복된 뇌 손상을 겪은 환자, 및 환경적 신경독소에 노출된 환자를 포함한다. 본 개시내용은 C9orf72-관련 신경계 질환 (예를 들어, ALS 및 C9FTD)의 치료를 필요로 하는 대상체, 예컨대 인간 환자의 신경계 (예를 들어, CNS)에 치료 유효량 (예를 들어, 돌연변이체 C9orf72 대립유전자 발현의 충분한 억제를 가능하게 하는 양)의 ZFP-TF (예를 들어, 이를 발현하는 rAAV 벡터)를 도입하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 C9orf72-관련 신경계 질환 (예를 들어, ALS 및 C9FTD)을 치료하는 방법을 제공한다. 용어 "치료하는"은 증상의 완화, 증상의 발병의 예방, 질환 진행의 저속화, 삶의 질의 개선, 및 증가된 생존을 포괄한다.
본 개시내용은 재조합 게놈이 ZFP-TF에 대한 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터, 예컨대 rAAV를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체, 예컨대 물, 염수 (예를 들어, 포스페이트-완충 염수), 덱스트로스, 글리세롤, 수크로스, 락토스, 젤라틴, 덱스트란, 알부민, 또는 펙틴을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH-완충제, 안정화제, 또는 제약 조성물의 유효성을 증진시키는 다른 시약을 함유할 수 있다. 제약 조성물은 전달 비히클, 예컨대 리포솜, 나노캡슐, 마이크로입자, 마이크로구체, 지질 입자, 및 소포를 함유할 수 있다.
본 개시내용의 치료제에 의해 표적화되는 세포는 비제한적으로 뉴런 세포 (예를 들어, 운동 뉴런, 감각 뉴런, 도파민성 뉴런, 콜린성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, GABA성 뉴런, 또는 세로토닌성 뉴런); 신경교 세포 (예를 들어, 핍지교세포, 성상세포, 혈관주위세포, 슈반 세포, 또는 소교 세포); 상의 세포; 또는 신경상피 세포를 포함한, 뇌 및/또는 척수 내의 세포이다. 표적화되는 뇌 영역은 피질 영역, 전두측두 영역, 내후각 피질, 해마, 소뇌, 교뇌, 및 수질일 수 있다. 이들 영역은 해마내 주사, 뇌내 주사, 거대수조내 (ICM) 주사를 통해, 또는 보다 일반적으로 실질내 주사, 뇌실내 (ICV) 주사, 척수강내 주사, 또는 정맥내 주사를 통해 직접 도달될 수 있다. 다른 투여 경로는 비제한적으로 뇌내, 뇌실내, 비강내, 또는 안내 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는, 예를 들어 척수강내 및/또는 뇌내 주사, 또는 거대수조내 주사 또는 뇌실내 주사를 통한 뇌척수액 (CSF) 내로의 직접 투여 후에 CNS 조직 전반에 걸쳐 확산된다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 혈액-뇌 장벽을 가로지르고, 정맥내 투여 후에 대상체의 CNS 조직 전반에 걸쳐 광범위한 분포를 달성한다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 실질내 주사를 통해 표적 영역에 직접 전달된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 실질내 전달 후에 다른 뇌 영역으로 역행성 또는 순행성 수송을 거칠 수 있다. 일부 측면에서, 바이러스 벡터는 높은 효율로 안정하고 비독성인 유전자 전달을 달성하는 별개의 CNS 조직 표적화 능력 (예를 들어, CNS 조직 향성)을 갖는다.
예로서, 제약 조성물은 뇌실내 투여를 통해, 예를 들어 환자의 전뇌의 뇌실 영역, 예컨대 우측뇌실, 좌측뇌실, 제3 뇌실, 또는 제4 뇌실 내로 환자에게 제공될 수 있다. 제약 조성물은 뇌내 투여, 예를 들어 뇌의 대뇌, 수질, 교뇌, 소뇌, 두개내강, 수막, 경막, 거미막, 또는 연막으로의 또는 그 근처로의 조성물의 주사를 통해 환자에게 제공될 수 있다. 뇌내 투여는, 일부 경우에, 뇌 주위의 지주막하 공간의 뇌척수액 (CSF) 내로의 작용제의 투여를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 뇌내 투여는 정위 절차를 사용하는 주사를 수반한다. 정위 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 전형적으로 특정한 뇌내 영역, 예를 들어 뇌실 영역으로의 주사를 가이드하기 위해 함께 사용되는 컴퓨터 및 3차원 스캐닝 장치의 사용을 수반한다. 미세-주사 펌프 (예를 들어, 월드 프리시전 인스트루먼츠(World Precision Instruments)로부터의 것)가 또한 사용될 수 있다. 일부 경우에, 미세주사 펌프는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 전달하는데 사용된다. 일부 경우에, 조성물의 주입 속도는 1 μl/분 내지 100 μl/분의 범위이다. 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 주입 속도는, 예를 들어 대상체의 연령, 대상체의 체중/크기, AAV의 혈청형, 요구되는 투여량, 및 표적화된 뇌내 영역을 포함한 다양한 인자에 좌우될 것이다. 따라서, 다른 주입 속도가 특정 상황에서 통상의 기술자에 의해 적절한 것으로 간주될 수 있다.
대상체에게 rAAV를 전달하는 것은, 예를 들어 정맥내 투여에 의해 달성될 수 있다. 특정 경우에, rAAV를 뇌 조직, 척수, 뇌척수액 (CSF), 뉴런 세포, 신경교 세포, 수막, 성상세포, 핍지교세포, 간질 공간 등에 국부로 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에, 재조합 AAV (예를 들어, 107-1015 Vg/용량)는 뇌실 영역 내 및/또는 해마, 피질, 소뇌 소엽, 또는 다른 뇌 영역으로의 주사에 의해 CNS로 직접 전달될 수 있다. AAV는 바늘, 카테터 또는 관련 장치에 의해, 관련 기술분야에 공지된 신경외과 기술을 사용하여, 예컨대 정위 주사에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Stein et al., J Vir. (1999) 73:3424-9; Davidson et al., PNAS. (2000) 97:3428-32; Davidson et al., Nat Genet. (1993) 3:219-223; 및 Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. (2000) 11:2315-29]; 미국 특허 7,837,668 및 8,092,429를 참조한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기재되지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 또한 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 상충되는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 신경학, 의약, 의약 및 제약 화학, 및 세포 생물학과 관련하여 사용된 명명법 및 그의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 설명서에 따라, 관련 기술분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다. 본 명세서 및 실시양태 전반에 걸쳐, 단어 "갖는다" 및 "포함한다", 또는 변형어, 예컨대 "갖다", "갖는", "포함하다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수의 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 군을 배제하는 것은 아님을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 다수의 문헌이 본원에 인용되지만, 이러한 인용은 이들 문헌 중 임의의 것이 관련 기술분야의 통상의 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것은 아니다. 본원에 사용된 용어 "대략" 또는 "약"은 1개 이상의 관심 값에 적용되는 경우에 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상기 용어는 달리 언급되거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 언급된 참조 값의 어느 한 방향 (초과 또는 미만)으로 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
본 발명이 보다 잘 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 실시양태 및 실시예가 제시된다. 이들 실시양태 및 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
IV. 예시적 실시양태
본 개시내용의 비제한적인 예시적 실시양태가 하기 기재된다.
1. 세포를 전사 억제 도메인 및 C9orf72 유전자 내의 표적 부위에 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함하는 C9orf72 유전자의 1종 이상의 리프레서로 처리하는 것을 포함하며, 임의로 여기서 1종 이상의 리프레서는 1개 이상의 아연 핑거 단백질 전사 인자 (ZFP-TF), 1개 이상의 TAL-이펙터 도메인 전사 인자 (TALE-TF), 및/또는 1개 이상의 CRISPR/Cas 전사 인자를 포함하는 것인, 세포에서 C9orf72 유전자의 센스 및/또는 안티센스 전사를 억제하는 방법.
2. 제1항에 있어서, C9orf72 유전자가 1개 이상의 확장된 (G4C2) 반복부를 포함하는 돌연변이체 대립유전자를 포함하며, 임의로 여기서 표적 부위는 1개 이상의 (G4C2) 반복부 내에 있는 것인 방법.
3. 센스 및/또는 안티센스 전사의 억제를 필요로 하는 대상체에서 센스 및/또는 안티센스 전사의 억제를 위한, 1개 이상의 (G4C2) 반복부를 포함하는 돌연변이체 C9orf72 확장된 대립유전자에 결합하는 1종 이상의 ZFP-TF, TALE-TF 및/또는 CRISPR/Cas TF 리프레서의 용도.
4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 전사가 비처리 세포와 비교하여 적어도 50% 억제되는 것인 방법 또는 용도.
5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 전사가 비처리 세포와 비교하여 적어도 70% 억제되는 것인 방법 또는 용도.
6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 확장된 반복부를 포함하는 전사체가 선택적으로 억제되고, 임의로 여기서 안티센스 전사가 억제되고/거나, 1a 프로모터로부터의 센스 전사가 억제되고/거나, 1b 프로모터로부터의 센스 전사가 억제되지 않는 것인 방법 또는 용도.
7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 ZFP-TF 리프레서가 표 1에 제시된 순서로 인식 헬릭스 영역을 갖는 ZFP를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 ZFP-TF 리프레서가 mRNA로서 또는 바이러스 벡터를 사용하여 세포에 투여되는 것인 방법 또는 용도.
9. 실시양태 8에 있어서, 바이러스 벡터가 Ad 또는 AAV 벡터인 방법 또는 용도.
10. 실시양태 9에 있어서, AAV 벡터가 AAV2/9 벡터인 방법 또는 용도.
11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 세포가 살아있는 대상체 내에 있고, 1종 이상의 ZFP-TF 리프레서가 대상체에게 투여되는 것인 방법 또는 용도.
12. 실시양태 11에 있어서, 1종 이상의 ZFP-TF 리프레서가 대상체에게 뇌실내, 척수강내, 두개내, 안와후 (RO), 정맥내, 비강내 및/또는 수조내 정맥내로 투여되는 것인 방법 또는 용도.
13. 실시양태 12에 있어서, ZFP-TF 리프레서가 대상체의 해마에 편측으로 또는 양측으로, 임의로 AAV 벡터를 사용하여 1E10 내지 1E13 (예를 들어, 6E11) vg/반구의 용량으로 투여되는 것인 방법 또는 용도.
14. 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 세포가 뉴런인 방법 또는 용도.
15. 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 2종 이상의 ZFP-TF 리프레서가 투여되는 것인 방법 또는 용도.
16. 실시양태 15에 있어서, 2종 이상의 ZFP-TF 리프레서가 동일하거나 상이한 비-바이러스 또는 바이러스 벡터 상에 보유되는 것인 방법 또는 용도.
17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, ALS 및/또는 FTD가 대상체에서 치료되는 것인 방법 또는 용도.
18. 실시양태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, ALS 및/또는 FTD의 1종 이상의 증상이 대상체에서 호전되는 것인 방법 또는 용도.
19. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 78021인 ZFP-TF 융합 단백질.
20. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 75114인 ZFP-TF 융합 단백질.
21. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 75115인 ZFP-TF 융합 단백질.
22. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 74969인 ZFP-TF 융합 단백질.
23. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 79895인 ZFP-TF 융합 단백질.
24. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 79898인 ZFP-TF 융합 단백질.
25. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 74986인 ZFP-TF 융합 단백질.
26. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 79899인 ZFP-TF 융합 단백질.
27. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 79901인 ZFP-TF 융합 단백질.
28. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 79902인 ZFP-TF 융합 단백질.
29. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 79904인 ZFP-TF 융합 단백질.
30. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 79916인 ZFP-TF 융합 단백질.
31. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 75027인 ZFP-TF 융합 단백질.
32. 표적 서열에 결합하고, 표 1에 제시된 바와 같은 SBS ID에 상응하는 아연 핑거를 포함하며, 아연 핑거는 SBS ID에 대해 표 1의 단일 행에 제시된 DNA-결합 (인식) 헬릭스 서열을 포함하고, 여기서 SBS ID는 79921인 ZFP-TF 융합 단백질.
33. 실시양태 19 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 13을 포함하는 전사 리프레서 도메인을 포함하는 ZFP-TF 융합 단백질.
34. 실시양태 19 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 아연 핑거 도메인 및 전사 리프레서 도메인이 서열식별번호: 26을 포함하는 펩티드 링커에 의해 연결된 것인 ZFP-TF 융합 단백질.
실시예
실시예 1: 인공 전사 리프레서
확장된 인간 C9orf72 대립유전자를 표적화하도록 한 패널의 ZFP-TF를 생성하였다. 예시적인 ZFP-TF를 하기 표 1에 제시한다. 이들 ZFP-TF는 각각 6개의 핑거를 갖는 ZFP 도메인 및 상기 기재된 바와 같은 KRAB 도메인을 함유하였다 (서열식별번호: 13). 펩티드 링커를 사용하여 ZFP 도메인을 KRAB 도메인에 연결하였다. 링커는 하기 아미노산 서열을 가졌다: LRQKDAARGS (서열식별번호: 26).
표 1은 표적 부위의 DNA 서열 및 각각의 ZFP-TF 내의 각각의 아연 핑거 (F1 내지 F6)의 DNA-결합 헬릭스의 아미노산 서열을 보여준다. 서열식별번호는 괄호 안에 제시된다. 표적 부위에서 ZFP 도메인에 의해 결합되는 표적 서열은 대문자로 제시되고, 플랭킹 서열은 소문자로 제시된다. 서열식별번호: 24는 유전자 대립유전자의 센스 가닥 상의 표적 부위이고, 서열식별번호: 25는 유전자 대립유전자의 안티센스 상의 표적 부위이다.
DNA-결합 헬릭스는 아연 핑거의 가변 부분이고, 전형적으로 6 또는 7개의 아미노산 잔기를 함유한다. ZFP 도메인의 표적 특이성은, 예를 들어 미국 특허 공개 2018/0087072에 기재된 바와 같이 ZFP 백본에 대한 돌연변이에 의해 개선될 수 있다. 표에서의 기호 "^"는 표시된 헬릭스 내의 제1 아미노산의 상류의 제4 위치의 아르기닌 (R) 잔기가 글루타민 (Q)으로 변화된 것을 나타낸다. 각각의 아연 핑거 헬릭스 서열에서, 7개의 DNA-결합 아미노산의 위치는 -1, +1, +2, +3, +4, +5, 및 +6으로 넘버링된다. 따라서, R에서 Q로의 치환을 위한 위치는 (-5)로 넘버링된다.
표 1 예시적인 C9orf72 ZFP-TF
Figure pct00002
Figure pct00003
ZFP-TF를 표준 SELEX 분석에 의해 평가하였다 (예를 들어, 문헌 [Miller et al., Nat Biotech. (2010) doi:10.1038/nbt.1755; Wilen et al., PLoS (2011) 7(4):e1002020] 참조). 모두 그의 표적 부위에 결합하는 것으로 나타났다.
5가지 유형의 인간 세포주 및 1가지 마우스 세포주를 연구에 사용하였다. C9021 섬유모세포 세포주는 콜럼비아 대학교의 더 에이엘에스 인스티튜트(The ALS Institute)로부터 입수하였고, 이는 ALS-FTD 환자로부터 유래된 것이다. 이는 그의 정상 대립유전자 상에 5개의 G4C2 반복부 및 그의 확장된 대립유전자 상에 대략 850개의 반복부를 함유한다. 야생형 섬유모세포 세포주 (NDS00035), 353TRAD 및 204TDP 섬유모세포주를 국립 신경계 장애 및 졸중 연구소로부터 입수하였다. 야생형 세포주는 각각의 대립유전자 상에 2개의 G4C2 반복부를 함유한다. 353TRAD 세포주는 하나의 대립유전자 상에 5개의 반복부 및 다른 대립유전자 상에 8개의 반복부를 함유한다. 204TDP는 하나의 대립유전자 상에 2개의 반복부 및 다른 대립유전자 상에 20개의 반복부를 갖는다. 모든 섬유모세포 실험을 위해, 인간 뉴런을 셀 다이나믹스 인터내셔널(Cell Dynamics International) (아이셀 가바뉴런스 키트(iCell GABANeurons Kit), 01434; Cat# R1013; 셀 로트# 104901)로부터 입수하였다. 마우스 피질 뉴런은 깁코(GIBCO) (Cat# A15586)로부터 입수하였다. 그의 표적 영역에 결합하지만 관찰가능한 억제 효과를 갖지 않는 ZFP 74960을 음성 대조군으로서 사용하였다.
환자 유래 섬유모세포에서 수행된 모든 실험에 대해, 세포 내로의 ZFP-TF mRNA의 형질감염은 론자(Lonza)로부터의 96-웰 셔틀 뉴클레오펙터 시스템을 사용하여 수행하였다. 40,000개 세포당 1, 3, 10, 30, 100, 및 300 ng의 ZFP-TF mRNA를 아막사(Amaxa) P2 1차 세포 뉴클레오펙터 키트를 사용하여 CA-137 프로그램을 사용하여 형질감염시켰다. 밤새 인큐베이션한 후, 셀즈-투-Ct(Cells-to-Ct) 키트 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 사용하여 형질감염된 세포로부터 cDNA를 생성한 후, qRT-PCR을 사용하여 유전자 발현 분석을 수행하였다.
뉴런 형질도입을 위해, ZFP를 AAV6 플라스미드 내로 제조하였다. 뉴런을 AAV6-ZFP로 형질도입하였다. 모든 형질도입은 3,000 MOI로 수행하였다. 마우스 뉴런을 형질도입 7일 후에 수집하고, 인간 뉴런은 형질도입 19일 후에 수집하였다. 세포를 수집한 후, 이들을 마이크로어레이 분석을 위해 프로세싱하였다.
스크리닝 분석을 다중 라운드로 수행하였다. 각각의 라운드에서, ZFP를 다중 농도에서 시험하여 적합한 온 타겟 (선택적 억제) 패턴을 갖는 ZFP-TF를 확인하였다. 라운드 2 스크리닝을 C9 (C9021) 세포에서 수행하여 ZFP-TF 처리 후에 확장된 센스 전사체 (질환) C9orf72 대 총 C9orf72 ("총 C9") 성숙 mRNA의 수준을 평가하였다. RT-PCR 검정은 인트론 영역 1a를 표적화하는 프라이머/프로브 세트를 사용하였다.
확장된 센스 C9orf72 전사체:
정방향: 5' CCCTCTCTCCCCACTACTTG 3' (서열식별번호: 61)
역방향: 5' CTACAGGCTGCGGTTGTTTCC 3' (서열식별번호: 62)
프로브: 5' TCTCACAGTACTCGCTGAGGGTGA 3' (서열식별번호: 63)
G4C2 확장은 비효율적인 스플라이싱 및 확장-함유 프리-mRNA의 축적으로 이어진다 (도 2a). 대조적으로, 효율적으로 스플라이싱된 야생형 (WT) 프리-mRNA는 매우 낮은 수준으로 존재한다. C9021 세포에서 이러한 검정을 사용함으로써, 본 발명자들은 시험된 ZFP-TF가 확장된 센스 (질환) C9orf72 전사체의 넓은 범위의 억제를 나타냄을 보여주었다. (도 2b-d).
총 C9orf72 mRNA의 억제를 평가하기 위해, "총 C9" (도 2a)로 표시된 상이한 프라이머/프로브 세트를 사용하였다:
총 C9orf72 mRNA:
정방향: 5' CTATGTGTGTGGTGGGATATGG 3' (서열식별번호: 58)
역방향: 5' CTCCAGGTTATGTGAAGCAGAA 3' (서열식별번호: 59)
프로브: 5' AGGCCTGCTAAAGGATTCAACTGGAA 3' (서열식별번호: 60)
이러한 프라이머/프로브 세트는 엑손 8 및 9에 걸친 영역을 포함하는 mRNA를 검출할 수 있었다. 이러한 영역은 모든 C9orf72 mRNA 이소형에 존재한다. 도 2b에 제시된 바와 같이, 많은 ZFP-TF는 총 C9orf72 전사체의 보통의 억제를 보였다. 예를 들어, ZFP-TF 75114 및 75115는 총 C9orf72 mRNA의 발현을 50% 초과로 보존하면서 확장된 센스 (질환) 전사체를 70% 초과로 억제하였다 (도 2d, 라운드 2 데이터).
라운드 3에서, 총 C9orf72 mRNA 수준에 대한 시험된 ZFP-TF의 효과를 추가로 평가하기 위해 총 C9orf72 mRNA를 평가하고, C9021 세포와 야생형 (WT) 세포 사이에서 비교하였다. 데이터는 돌연변이체 세포에서의 총 C9orf72 mRNA 수준이 WT 세포에서의 수준보다 훨씬 더 현저하게 감소하였고 (도 2b-d), 동일한 ZFP-TF에 의해 처리된 야생형 세포에서 훨씬 덜 영향을 받았음을 보여준다. 전반적인 데이터는 일부 ZFP, 예컨대 75109, 75114, 및 75115의 경우, 총 C9 전사체 C9 환자 섬유모세포주의 약 50%를 유지시키면서 확장된 이소형은 유의하게 (약 70%) 억제시킨다는 것을 예시한다.
그의 확장된 대립유전자 상에 상이한 G4C2 확장 반복부 (600, 800, 및 850)를 함유하는 3가지의 상이한 환자 유래된 섬유모세포에서 ZFP-TF 75109, 75114, 및 75115의 이소형 선택적 억제를 평가하였다 (도 6). 모든 3종의 ZFP는 반복부 확장 길이와 독립적인 유사한 거동을 나타냈으며, 이는 ZFP-TF의 선택적 억제가 G4C2 반복부 길이와 독립적임을 예시한다.
그의 대립유전자 상에 정상보다 더 큰 G4C2 반복부의 수를 갖는 건강한 개체로부터의 2개의 세포주에서 총 C9 전사체의 억제를 평가하였다 (도 7). 총 C9 전사체는 건강한 세포주에서 최소의 영향을 받는다. 환자 유래 세포주 (C9021)에서의 총 C9 mRNA 전사체의 ZFP 매개된 억제는, 총 C9 mRNA 전사체를 검출하는데 사용되는 PCR 검정이 확장된 및 비-확장된 (WT) 이소형 둘 다에 존재하는 엑손 8 및 9를 표적화하기 때문에, WT 이소형 수준의 진정한 표현이 아니다 (도 2a). 이소형 선택적 ZFP-TF (75109, 75114, 및 75115)에 반응한 총 C9 mRNA 전사체의 억제를 그의 대립유전자 상에 상이한 G4C2 반복부 길이를 갖는 2가지의 상이한 건강한 세포주에서 평가하였다 (도 7). 세포주 353TREAD는 하나의 대립유전자 상에 5개의 반복부 및 다른 대립유전자 상에 8개의 반복부를 갖는 한편, 세포주 204TDP는 하나의 대립유전자 상에 2개의 반복부 및 다른 대립유전자 상에 20개의 반복부를 갖는다. 총 C9 mRNA 전사체가 C9 세포주 C921 (비-확장된 대립유전자 상에 5개의 반복부 및 확장된 대립유전자 상에 850개의 반복부)에서 용량 의존적 방식으로 억제되었지만, 확장된 대립유전자가 없는 2가지의 다른 세포주에서는 최소의 영향을 받았고, 이는 질환 세포주 (5/850)에서의 총 C9 이소형의 억제가 확장된 이소형의 억제의 결과이고, 비-확장된 이소형의 발현은 선택적 ZFP-TF에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다 (도 7).
이론에 얽매이지는 않지만, 본 발명의 ZFP-TF는 다수의 반복부를 갖는 대립유전자를 선택적으로 억제하기 위해 협동 방식으로 작용할 수 있는 것이 가능하다. 이는, 예를 들어 ZFP-연결된 KRAB 도메인과 회합하는 KAP1 공동-리프레서의 동원을 통한, 보다 고차의 복합체에 의해 매개될 수 있다. 이러한 가설 하에서, 다중 ZFP-TF에 걸친 KAP1/KRAB "스캐폴드"는 전사 억제 기구의 안정성을 증가시키고, 야생형 대립유전자보다 확장된 C9orf72 대립유전자의 우선적 억제를 가능하게 한다.
실시예 2: C9orf72 억제의 특이성
표 1에 제시된 ZFP-TF의 전반적 특이성을 3종의 세포주: C9021 섬유모세포, 1차 마우스 피질 뉴런 및 인간 뉴런에서 마이크로어레이 분석에 의해 평가하였다. C9021 세포의 경우, 간략하게, 100 ng의 ZFP-TF 코딩 mRNA를 150,000개의 C9021 세포 내로 사중으로 형질감염시켰다. 24시간 후, 총 RNA를 추출하고, 제조업체의 프로토콜 (아피메트릭스 진칩(Affymetrix Genechip) MTA1.0)을 통해 프로세싱하였다. 강건한 멀티-어레이 평균 (RMA)을 사용하여 각각의 프로브 세트로부터의 미가공 신호를 정규화하였다. 분석은 트랜스크립톰 분석 콘솔 3.0 (아피메트릭스)을 사용하여 "유전자 수준 차등 발현 분석" 옵션으로 수행하였다. ZFP-TF-형질감염된 샘플을 비관련 ZFP-TF (C9orf72 표적 부위에 결합하지 않는 것)로 처리된 샘플과 비교하였다. 대조군에 비해 평균 신호에서 >2배 차이 및 P-값 < 0.05 (일원 ANOVA 분석, 각각의 프로브 세트에 대한 독립표본 T-검정)를 갖는 전사체 (프로브 세트)에 대해 변화 콜을 보고하였다. 뉴런에 대해 유사한 절차를 또한 수행하되, 단 이는 AAV6으로 3000 MOI로 형질도입하고, 수거 전에 마우스 뉴런의 경우에는 7일 및 인간 뉴런의 경우에는 19일 동안 배양하였다.
예시적인 데이터를 도 8a-8c에 제시한다. 데이터는 ZFP-TF 75027이 C9orf72 (원형으로 제시됨)에 더하여 여러 오프-타겟을 나타낸 반면, ZFP-TF 75109, 75114, 및 75115는 인간 및 마우스 둘 다에서 섬유모세포 및 뉴런 둘 다에서 최소 오프-타겟으로 C9orf72만을 억제하였음을 보여준다. 이들 결과는 대표적인 ZFP-TF가 C9orf72에 대해 고도로 특이적임을 입증한다.
실시예 3: 안티센스-특이적 억제의 검출
센스 및 안티센스 전사체는 DNA의 중첩 영역에 의해 코딩되기 때문에, 본 발명자들은 전사체의 차등 프로세싱에 기초한 검출 전략을 개발하였다. 확장된 대립유전자로부터의 센스 mRNA의 경우, 확장된 영역을 함유하는 인트론 (인트론 1a)은 미스-스플라이싱되고 유지되지만, 인트론 1b를 포함한 모든 다른 인트론은 제거된다. 대조적으로, 인트론 1b 영역은 안티센스 mRNA 전사체에서의 예측되는 엑손이고, 유지되어야 한다. 따라서, 본 발명자들은 인트론 1b 내에 위치하는 프라이머를 설계하고 시험하였고, 하기에 추가로 기재된 바와 같이 안티센스 전사체의 특이적 검출을 입증하였다.
C9orf72 전사체를 검출하기 위해, 본 발명자들은 액적 디지털 PCR (ddPCR)을 사용하였다. 간략하게, 센스 또는 안티센스 cDNA 주형을 생성하기 위해, RNA를 C9orf72 환자 및 건강한 대조군 세포 (C9orf72 세포주: C9-3, C9-6, C9-7, C9-5, C9-10, C9-11, C9-2, C9-4; 대조군 세포주: KinALS6, Con3, Kin1ALS17, Con8, Con10, Con1; 문헌 [Lagier-Tourenne et al., PNAS (2013) 110(47):E4530-9] 참조)로부터 정제하고, 하기와 같이 슈퍼스크립트 III (써모 피셔 사이언티픽) 제1 가닥 합성 시스템을 사용하여 cDNA를 합성하는데 사용하였다:
1) 0.5 μg의 RNA, 0.5 μL의 10 mM 가닥 특이적 프라이머 및 dNTP 믹스를 혼합하고, 물로 10 μL로 만들었다. 센스 주형의 생성을 위해, 프라이머 5' CTCTAGCGACTGGTGGAATTG 3' (서열식별번호: 64)를 사용하였다. 안티센스 주형을 생성하기 위해, 프라이머 5' GTGCATGGCAACTGTTTGAATA 3' (서열식별번호: 65)를 사용하였다.
2) 이 반응물을 변성을 위해 65℃에서 5분 동안 인큐베이션하고, 적어도 1분 동안 얼음 상에 두었다.
3) cDNA 합성 믹스를 이들 시약: 10x RT 완충제 (2 μL); 25 mM MgCl2 (4 μL); 0.1 M DTT (2 μL); RNase OUT (1 μL); 슈퍼스크립트 III (1 μL)을 사용하여 제조하였다.
4) 10 μL의 이 반응물을 RNA 믹스에 첨가하고, 50℃에서 50분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 반응물을 85℃에서 5분 인큐베이션에 의해 불활성화시켰다.
이어서, 제조업체의 프로토콜에 따라 표지된 프로브를 사용하여 주형을 ddPCR에 적용하였다. 간략하게, 프로브용 dUTP-무함유 ddPCR 슈퍼믹스 (바이오-라드(Bio-Rad))를 사용하여 ABI PCR 96-웰 플레이트에서 PCR 반응을 수행하였다. PCR 마스터믹스를 제조업체의 지침에 따라 제조하였다. 인트론 1b 영역 상에 위치하는 안티센스 프라이머-프로브 세트 (도 3)를 하기 제시한다.
정방향: 5' CAAAGCCTGGTGGTGTTCAA 3' (서열식별번호: 66)
역방향: 5' GGACATGACCTGGTTGCTTC 3' (서열식별번호: 67)
프로브: 5' CGCGGCCAGATAGACCCAATGAGCA 3' (서열식별번호: 68).
반응을 하기와 같이 설정하였다:
1) 완전 마스터 믹스를 ABI PCR 플레이트의 8개의 웰 사이에 고르게 분포시켰다.
2) 10 μL 1:10-희석된 RT 반응물 또는 물을 샘플 웰에 첨가하였다.
3) 15 μL의 마스터 믹스를 RT-함유 웰로 옮겼다.
4) 플레이트를 밀봉하고, 볼텍싱하고, 간략히 회전시켰다.
액적을 제조하기 위해, 카트리지를 하기와 같이 사용하였다:
1) 70 μL의 프로브 오일을 카트리지 상의 오일로 표지된 웰에 두고, 20 μL의 ddPCR 반응물을 샘플로 표지된 웰에 두었다.
2) 고무 가스켓을 카트리지의 상부에 두었다.
3) 40 μL의 액적을 새로운 에펜도르프 96 웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 알루미늄 호일로 밀봉하고, PCR을 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.
데이터는 C9orf72 섬유모세포주에서, 이들 프라이머가 안티센스 확장된 프리-mRNA (C9-AS)에서 엑손을 증폭시켰고, 상보적 영역이 센스 영역 (C9-S)에 부재하였음을 보여준다 (도 4a). 따라서, 본원의 ddPCR 안티센스 프라이머는 6종의 상이한 대조군 섬유모세포와 비교하여 7종의 상이한 C9 환자-유래 섬유모세포에서 명백하게 상승된 안티센스 프리-mRNA를 특이적으로 검출하였다 (도 4b).
실시예 4: 확장된 대립유전자 센스 및 안티센스 프리-mRNA 억제
확장된 대립유전자에 대한 ZFP-TF 리프레서의 활성을 시험하기 위해, 세포를 상기 기재된 바와 같이 ZFP-TF 74949, 74978, 75003, 75027, 75109, 75114, 75115, 74967 (표 1), 또는 74960 (음성 대조군)으로 처리하였다. 2개의 별개의 PCR 검정을 사용하여 샘플 순서에 대해 맹검인 조사자가 ZFP-TF 매개된 억제를 평가하였다. 각각의 검정은 상이한 프라이머/프로브를 사용한다 (도 5a-5c).
실행 #1 및 #2에 대해, 센스 확장된, 안티센스 확장된, 및 총 C9를 측정하기 위한 검정을 상기 기재된 바와 같이 수행하였고, 단 증폭은 관련 기술분야의 표준 프로토콜에 따른 랜덤 육량체 및 하기 제시된 프라이머를 사용하여 수행하였다:
안티센스 확장된 C9orf72 프리-mRNA (도 5b): 상기 실시예 3에 제시된 바와 같음.
센스 확장된 C9orf72 프리-mRNA (도 5a): 이러한 프라이머/프로브 세트는 엑손 1a 및 인트론 1a에 걸친 영역을 포함하는 mRNA를 검출할 수 있었다.
정방향: 5' ACTACTTGCTCTCACAGTACTCG 3' (서열식별번호: 69)
역방향: 5' TAGCGCGCGACTCCTGAGTTCC 3' (서열식별번호: 70)
프로브: 5' AGGGAAACAACCGCAGCCTGTAGCAAGCTC 3' (서열식별번호: 71).
총 C9orf72 mRNA (도 5c): 이러한 프라이머/프로브 세트는 엑손 2 내의 영역을 포함하는 mRNA를 검출할 수 있었다.
정방향: 5' TGTGACAGTTGGAATGCAGTGA 3' (서열식별번호: 72)
역방향: 5' GCCACTTAAAGCAATCTCTGTCTTG 3' (서열식별번호: 73)
프로브: 5' TCGACTCTTTGCCCACCGCCA 3' (서열식별번호: 74).
실행 #3 (도 5a 및 5c)은 상기 실시예 1에 제시된 프라이머 (도 2b-2d)를 사용하였다. 안티센스 질환 전사체에 대해, 하기 프라이머/프로브를 사용하여 인트론 영역 1b를 검출하였다 (도 5b).
정방향: 5' CAGCTTCGGTCAGAGAAATGAG 3' (서열식별번호: 78)
역방향: 5' AAGAGGCGCGGGTAGAA 3' (서열식별번호: 79)
프로브: 5' CTCTCCTCAGAGCTCGACGCATTT 3' (서열식별번호: 80)
상이한 프라이머/프로브 세트 및 상이한 PCR 검정이 사용되었다는 사실에도 불구하고 (실행 #1 및 실행 #2는 유사한 검정에 의해 수행되었지만 실행 #3과 상이함), 데이터는 일관되었고, 억제 수준은 대등하였다.
종합하면, 모든 실행은 일부 ZFP-TF가 모든 3가지 전사체 (센스, 안티센스, 및 총)를 강하게 억제할 수 있는 반면에 (예를 들어, ZFP-TF 74978, 75003, 및 75027), 일부 ZFP-TF (예를 들어, ZFP-TF 75109, 75114, 및 75115)는 총 C9 전사체를 보존하면서 센스 및 안티센스 질환 전사체를 선택적으로 억제함을 (선택적 억제) 일관되게 입증하였다.
실시예 5: BAC C9orf72 트랜스제닉 마우스 뉴런에서 인간 C9orf72의 조정
BAC 마우스 C9orf72에 대해 표적화된 모든 리프레서를 발현의 구동을 위해 CMV 프로모터를 사용하여 rAAV6 벡터 내로 클로닝한다. 재조합 AAV를 HEK293T 세포에서 생산하고, CsCl 밀도-구배를 사용하여 정제하고, 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 실시간 qPCR에 의해 적정한다. 정제된 바이러스를 사용하여 배양된 1차 마우스 피질 뉴런을 3E5, 1E5, 3E4, 및 1E4 Vg/세포로 감염시킨다. 7일 후에, 총 RNA를 추출하고, C9orf72 센스 및 안티센스 전사체 뿐만 아니라 2종의 참조 유전자 (예를 들어 Atp5b 및 Eif4a2)의 발현을 RT-qPCR을 사용하여 모니터링한다.
모든 ZFP-TF-코딩 AAV 벡터는 광범위한 감염 용량에 걸쳐 마우스 세포에서 그의 표적을 효과적으로 억제할 것이고, 일부 ZFP는 다중 용량에서 표적을 95% 초과만큼 감소시킬 것이다. 대조적으로, 동등한 용량으로 시험된 CMV-GFP rAAV6 바이러스 또는 모의-처리된 뉴런에 대해서는 유전자 억제가 관찰되지 않는다.
실시예 6: AAV-전달된 ZFP-TF에 의해 구동된 생체내 유전자 억제
표적 결속 연구에 사용된 C9orf72 BAC 트랜스제닉 마우스는 실질적인 플랭킹 서열을 갖는 약 500개의 G4C2 반복부를 갖는 전장 C9orf72 유전자 대립유전자를 함유하는 98 kb의 인간 트랜스진을 함유한다 (Liu et al., Neuron (2016) 90(3):521-34). 상이한 효능을 갖는 2가지 ZFP-TF, 즉 ZFP-TF 75027 또는 ZFP-TF 75114 (ZFP-TF 75027이 보다 강력함; 도 2d)를 본 연구를 위해 선택하였다. 2가지 융합 단백질에 대한 발현 카세트를, 발현을 구동하는 시냅신 프로모터 및 자기-절단가능한 펩티드 (예를 들어, 2A 펩티드, 예컨대 T2A 또는 P2A)에 대한 코딩 서열에 이어서 생체분포를 측정하기 위한 베누스 태그를 함유하는 rAAV 벡터 내로 둘 다 클로닝하였다 (도 9, 패널 a). rAAV를 HEK293T 세포에서 생산하고, ITR 상의 프라이머를 사용하여 ddPCR에 의해 적정하였다.
생체내 확장-함유 센스 및 안티센스 전사체의 억제에 대한 ZFP-TF 발현의 효과를 평가하기 위해, ZFP-TF rAAV를 뇌실내 (ICV) 주사에 의해 P0 C9-BAC 또는 WT 마우스 내로 전달하였다. 간략하게, 비히클 (PBS) 또는 ZFP-TF 75027 rAAV 또는 ZFP-TF 75114 rAAV (뇌실당 2E10 Vg의 총 용량)를 신생 C9-BAC 마우스 (반복부 길이에 대해 매칭됨) 또는 WT 마우스 내로 양측으로 투여하였다 (뇌실당 2 μl) (도 9, 패널 c). 동물을 주사 4주 후에 희생시키고, 하나의 반구를 RNA 병소 분석을 위해 포매하고, 다른 반구를 추가 분석을 위해 피질, 해마 및 소뇌로 미세해부하였다 (도 9, 패널 b). 바이러스 게놈 및 베누스 mRNA 및 단백질의 정량화는 ZFP-TF 75027 및 ZFP-TF 75114 둘 다의 동등한 형질도입 및 발현과 함께 광범위한 생체분포를 보여주었다.
피질 및 해마 조직으로부터 총 RNA를 추출하고, 아이스크립트(iScript) cDNA 합성 키트 (바이오라드)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. ddPCR을 수행하여 센스 및 안티센스 확장-함유 전사체의 발현 및 마우스 TBP 수준에 대해 정규화된 총 C9 mRNA 수준을 측정하였다. 본 검정에 사용된 프라이머는 하기와 같았다:
총 C9 mRNA:
정방향: 5'TGTGACAGTTGGAATGCAGTGA3' (서열식별번호: 72)
역방향: 5'GCCACTTAAAGCAATCTCTGTCTTG3' (서열식별번호: 73)
프로브: 5'TCGACTCTTTGCCCACCGCCA3' (서열식별번호: 74)
센스 확장된 프리-mRNA:
정방향: 5' ACTACTTGCTCTCACAGTACTCG 3' (서열식별번호: 69)
역방향: 5' TAGCGCGCGACTCCTGAGTTCC 3' (서열식별번호: 70)
프로브: 5' AGGGAAACAACCGCAGCCTGTAGCAAGCTC 3' (서열식별번호: 71).
안티센스 확장된 프리-mRNA:
정방향: 5'AGTCGCTAGAGGCGAAAGC3' (서열식별번호: 81)
역방향: 5'CGAGTGGGTGAGTGAGGAG3' (서열식별번호: 82)
프로브: 5'AAGAGGCGCGGGTAGAAGCGGGGGC3' (서열식별번호: 83)
데이터는 ZFP-TF 75027이 PBS-주사된 대조군에 비해 C9-BAC 동물의 해마 및 피질에서 총 C9 mRNA, 센스 및 안티센스 확장-함유 전사체의 수준을 억제함을 보여준다 (도 9, 패널 d). (트랜스제닉 마우스는 WT 인간 C9orf72 대립유전자를 함유하지 않고 마우스 C9orf72 유전자는 G4C2 반복부를 함유하지 않기 때문에, 이 동물 모델에서는 선택적 억제를 관찰할 수 없었음). ZFP-TF 75114에 의해서는 억제가 관찰되지 않았다.
또한, 형광 계내 혼성화를 사용하여 ZFP-TF 주사 후 해마에서 발견되는 센스 및 안티센스 RNA 응집체 (병소)의 수준을 측정하였다 (도 9, 패널 e). 간략하게, 10 μm 절편을 형광단-표지된 프로브와 혼성화시키고: 5'GGCCCCGGCCCCGGCCCC-Cy3 (서열식별번호: 84)을 사용하여 센스 RNA 병소를 측정하고, 5'GGGGCCGGGGCCGGGGCC-Cy3 (서열식별번호: 85)을 사용하여 안티센스 RNA 병소를 측정하였다. 스택 영상을 공초점 현미경 (LSM880) 상에서 40x 줌으로 수득하였다. 세포의 총 수에 대해 정규화된 센스 및 안티센스 RNA 병소의 수를 해마의 암몬각 (CA) 영역으로부터 정량화하였다. 보다 낮은 백분율의 안티센스 RNA 병소가 ZFP-TF 75027 주사된 동물에서 관찰되었다.
이들 결과는 C9orf72를 표적화하는 ZFP-TF가 생체내에서 질환-유발 C9orf72 대립유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있고, ZFP-TF의 효력에서 차이가 관찰될 수 있음을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO THERAPEUTICS, INC. <120> MODULATORS OF CHROMOSOME 9 OPEN READING FRAME 72 GENE EXPRESSION AND USES THEREOF <130> 025297.WO017 <140> <141> <150> 62/964,844 <151> 2020-01-23 <150> 62/837,523 <151> 2019-04-23 <160> 85 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggggcc 6 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gggccg 6 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggccgg 6 <210> 4 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gccggg 6 <210> 5 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ccgggg 6 <210> 6 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cggggc 6 <210> 7 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggcccc 6 <210> 8 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gccccg 6 <210> 9 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ccccgg 6 <210> 10 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cccggc 6 <210> 11 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ccggcc 6 <210> 12 <211> 6 <212> DNA <213> Homo 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Claims (30)

  1. 아연 핑거 단백질 (ZFP) 도메인 및 전사 리프레서 도메인을 포함하며, 여기서 ZFP 도메인은 인간 C9orf72 유전자의 돌연변이체 대립유전자 상의 엑손 1a 및 1b 사이의 인트론 절편 내의 표적 영역에 결합하고, 여기서 표적 영역은 G4C2 (서열식별번호: 1)의 30개 초과의 탠덤 반복부를 포함하는 것인 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 돌연변이체 대립유전자로부터의 반복부-함유 mRNA의 전사를 억제하고, 유전자로부터의 야생형 mRNA의 전사는 억제하지 않는 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, ZFP 도메인이 표적 영역 내의 센스 서열에 결합하며, 여기서 센스 서열은 헥사뉴클레오티드 GGGGCC (서열식별번호: 1), GGGCCG (서열식별번호: 2), GGCCGG (서열식별번호: 3), GCCGGG (서열식별번호: 4), CCGGGG (서열식별번호: 5), 또는 CGGGGC (서열식별번호: 6)의 1 내지 3개의 탠덤 반복부를 포함하는 것인 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 세포에서 돌연변이체 C9orf72 대립유전자로부터의 센스 전사를 억제하는 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, C9orf72 1a 프로모터로부터의 센스 전사를 억제하고, C9orf72 1b 프로모터로부터의 센스 전사는 억제하지 않는 융합 단백질.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, ZFP 도메인이 표적 영역 내의 안티센스 서열에 결합하며, 여기서 안티센스 서열은 헥사뉴클레오티드 GGCCCC (서열식별번호: 7), GCCCCG (서열식별번호: 8), CCCCGG (서열식별번호: 9), CCCGGC (서열식별번호: 10), CCGGCC (서열식별번호: 11), 또는 CGGCCC (서열식별번호: 12)의 1 내지 3개의 탠덤 반복부를 포함하는 것인 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 세포에서 돌연변이체 C9orf72 대립유전자로부터의 안티센스 전사를 억제하는 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 세포에서 돌연변이체 C9orf72 대립유전자로부터의 센스 전사 및 안티센스 전사 둘 다를 억제하는 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 C9orf72 대립유전자로부터의 센스 및/또는 안티센스 전사를 적어도 약 30%, 40%, 75%, 90%, 또는 95% 억제하고, 임의로 C9orf72 1b 프로모터로부터의 센스 전사는 억제하지 않는 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, ZFP 도메인이
    6개의 아연 핑거를 포함하고/거나;
    표 1에 제시된 표적 서열에 결합하고/거나;
    임의로 표 1에 표시된 바와 같은 인식 헬릭스 영역 외부의 잔기에 대해 1개 이상의 돌연변이를 포함하는, 표 1에 제시된 ZFP 전사 인자의 6개의 아연 핑거 서열을 포함하는 것인
    융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 리프레서 도메인이 인간 KOX1로부터의 KRAB 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, ZFP 도메인이 펩티드 링커를 통해 전사 리프레서 도메인에 연결된 것인 융합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 융합 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하며, 여기서 코딩 서열은 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 구축물.
  14. 제13항에 있어서, 전사 조절 요소가 뇌 세포에서 구성적으로 활성 또는 유도성인 포유동물 프로모터이고, 임의로 여기서 프로모터는 인간 시냅신 I 프로모터인 핵산 구축물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 구축물이 바이러스 구축물이고, 임의적으로 여기서 바이러스 구축물은 재조합 아데노-연관 바이러스 구축물인 핵산 구축물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포.
  17. 제16항에 있어서, 인간 세포인 숙주 세포.
  18. 제17항에 있어서, 인간 세포가 뉴런 또는 만능 줄기 세포이고, 여기서 줄기 세포는 임의로 배아 줄기 세포 또는 유도성 만능 줄기 세포 (iPSC)인 숙주 세포.
  19. 제15항의 핵산 구축물을 포함하며, 임의로 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)인 재조합 바이러스.
  20. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 핵산 구축물 또는 제19항의 재조합 바이러스, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  21. 인간 세포에서 C9orf72 유전자의 돌연변이체 대립유전자의 전사를 억제하는 방법이며, 여기서 돌연변이체 대립유전자는 엑손 1a 및 1b 사이의 인트론 절편 내에 확장된 G4C2 (서열식별번호: 1) 반복부 영역을 포함하고, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 핵산 구축물, 제19항의 재조합 바이러스, 또는 제20항의 제약 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 인간 세포가 뉴런, 신경교 세포, 상의 세포, 또는 신경상피 세포인 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 세포가 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 C9 가족성 전두측두엽 치매 (C9FTD)로부터 임의로 선택된 C9orf72-관련 장애를 앓고 있는 환자의 뇌 또는 척수 내의 것인 방법.
  24. 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 C9 가족성 전두측두엽 치매 (C9FTD)로부터 임의로 선택된 C9orf72-관련 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 환자에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 핵산 구축물, 제19항의 재조합 바이러스, 또는 제20항의 제약 조성물을 도입하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 통해 도입되는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 재조합 바이러스가 임의로 혈청형 9 또는 유사형 AAV2/9 또는 AAV2/6/9의 아데노-연관 바이러스 (AAV)인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 재조합 바이러스가 뇌실내, 척수강내, 두개내, 안와후 (RO), 정맥내, 비강내 및/또는 수조내 경로를 통해 환자에게 투여되는 것인 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 2종 이상의 융합 단백질이 도입되며, 임의로 여기서 2종 이상의 융합 단백질에 대한 코딩 서열은 동일한 재조합 바이러스 벡터 상에 있는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제15항, 제19항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 융합 단백질, 핵산 구축물, 재조합 바이러스, 또는 제약 조성물.
  30. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 핵산 구축물 또는 제19항의 재조합 바이러스의 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에서 그를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 용도.
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