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JP2022550608A - プリオン病の治療のためのジンクフィンガータンパク質転写因子 - Google Patents

プリオン病の治療のためのジンクフィンガータンパク質転写因子 Download PDF

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JP2022550608A JP2022520780A JP2022520780A JP2022550608A JP 2022550608 A JP2022550608 A JP 2022550608A JP 2022520780 A JP2022520780 A JP 2022520780A JP 2022520780 A JP2022520780 A JP 2022520780A JP 2022550608 A JP2022550608 A JP 2022550608A
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Abstract

本開示は、神経系におけるプリオン遺伝子の発現を阻害するジンクフィンガー融合タンパク質、およびプリオン病を治療するための前記タンパク質の使用方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年１０月２日に提出した米国仮出願６２／９０９，７２５、および２０２０年５月１１日に提出した米国仮出願６３／０２３，１９７に基づく優先権を主張する。前記仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。上記のＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年１０月２日に作成され、025297_WO012_SL.txtという名称であり、サイズは１９７，１２８バイトである。
発明の背景
プリオン病は、人間と動物の両方に影響を与える進行性の神経変性疾患の一群を意味する。これらの障害は、ニューロンの喪失と神経膠症を付随して脳を海綿状に変化させるプリオンタンパク質のミスフォールドされたアイソフォーム（ＰｒＰ Ｓｃｒａｐｉｅ；ＰｒＰＳｃ）の蓄積を特徴とする。プリオンという用語は、タンパク質性感染性粒子の略であり、これらの病原性アイソフォームのタンパク質のみの性質を意味する。異常な形状のタンパク質（ＰｒＰＳｃ）は、その後、豊富に発現される生理学的形態のプリオンタンパク質（細胞性ＰｒＰ；ＰｒＰＣ）に結合し、これを疾患の原因となるアイソフォームＰｒＰＳｃに変換することができる。この現象は、自己テンプレート化として知られている。タンパク質配列は同一であるが、ＰｒＰＳｃは、溶解性、構造、および安定性の点で生物物理学的にＰｒＰＣとは大幅に異なる（Riesner, Brit Med Bull. (2003) 66:21-33）。ＰｒＰＳｃアイソフォームの増殖に続いて凝集が起こり、中枢神経系で神経細胞死を引き起こす。ヒトプリオン病は、遺伝性（症例の１０～１５％を占める）、孤発性または獲得性であり、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトラウスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、およびクールー病が含まれうる。人間の場合、プリオン病は、脳機能を損ない、進行性の認知機能低下と異常な動きを引き起こす。プリオン病は、常に致命的であり、典型的には、発病から数か月～数年以内に死に至る。
ＰｒＰの正確な機能は、この分野ではまだ議論の余地があるが、多くの表現型の中において、ＰｒＰは、神経新生および神経保護、概日リズム、ミエリン維持、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、および長期増強（ＬＴＰ）において役割を果たすと仮定されている。家族性の形態に加えて、プリオン病はまた、孤発性または獲得性でありうる。孤発性プリオン病の人には、この病気の家族歴やＰＲＮＰ遺伝子の同定可能な変異がない。孤発性プリオン病は、ＰｒＰＣがＰｒＰＳｃに自然に変換されるときに発生する。孤発性のプリオン病には、孤発性ＣＪＤ（ｓＣＪＤ）、孤発性致死性不眠症（ｓＦＩ）、および可変プロテアーゼ感受性プリオン症（ＶＰＳＰｒ）が含まれる。獲得性プリオン病は、外部供給源からのＰｒＰＳｃへの曝露に起因する。例えば、異型ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）は、プリオン病の牛からのＰｒＰＳｃを含む牛肉製品の消費に起因する獲得性プリオン病の一種である。牛では、この形態の病気は、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）または「狂牛病」として知られている。獲得性ヒトプリオン病の別の例は、パプアニューギニアのサウスフォレ族で確認されたクールー病である。クールー病は、人食い葬儀の際に個人が罹患した人間の組織を食したときに伝染した。
ＰｒＰ発現の低下は、概念研究の多くの遺伝学的証拠、ならびにプリオン感染マウスの生存を延長することが示されているＰｒＰを低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のインビボ有効性によってサポートされる治療戦略である。例えば、Bueler et al., Cell (1993) 73(7):1339-47; Bueler et al., Mol Med Camb Mass. (1994) 1(1):19-30; Fischer et al., EMBO J. (1996) 15(6):1255-64; Mallucci et al., Science (2003) 302(5646):871-4; and Safar et al., J Gen Virol. (2005) 86(Pt 10):2913-23, Minikel et al., Nucleic Acids Res. (2020) 10.1093/nar/gkaa616を参照のこと。５０％のＰｒＰノックダウンを達成するＡＳＯは、マウスのプリオン病の発症を２倍以上まで遅らせることが示されているが、ＰｒＰノックダウンのレベルが高いほど、さらなる治療効果が得られうる。ＡＳＯで達成可能な範囲を超えたＰｒＰノックダウンの分布もまた、有効性にとって重要でありうる。よって、ＰｒＰ発現を標的とすることによるプリオン病の有効な治療の必要性が残っている。
本開示は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、またはマウス）ＰＲＮＰ遺伝子内またはその近くの部位を標的とするジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインを提供する。本開示のＺＦＰドメインは、哺乳動物のＰＲＮＰ遺伝子をＤＮＡレベルで特異的に阻害するために転写因子に融合されうる。これらの融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）とも呼ばれ、（ｉ）ＰＲＮＰ遺伝子の標的領域に特異的に結合するＺＦＰドメイン、および（ｉｉ）前記遺伝子の転写を低下させる転写リプレッサードメインを含む。これらのタンパク質は、プリオン病を治療するために用いることができる。
１の態様において、本開示は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写リプレッサードメインを含む融合タンパク質であって、前記ＺＦＰドメインが、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、またはマウス）プリオンタンパク質遺伝子（ＰＲＮＰ遺伝子）に結合する、融合タンパク質を提供する。ある実施態様において、前記ＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、ＰＲＮＰ遺伝子における転写開始部位（ＴＳＳ）の約１ｋｂまたは５００ｂｐ以内である。ある実施態様において、融合タンパク質は、１個またはそれ以上（例えば、２個、３個、４個、５個、または６個）のジンクフィンガーを含んでいてもよく、それは、適宜、ＰＲＮＰ遺伝子の発現を、検出可能なオフターゲット結合または活性がないか、または最小において、少なくとも約４０％、７５％、９０％、９５％、または９９％まで抑制する。ジンクフィンガードメインの非限定的な例を、図４および８Ａの表に示す。ある実施態様において、融合タンパク質は、図４および８Ａの表に示される１つまたはそれ以上の認識ヘリックス配列を含む。さらなる実施態様において、融合タンパク質は、示される骨格変異を有するか、または有さずに、図４および８Ａの表の一行からの認識ヘリックス配列のいくつかまたは全てを含む。特定の実施態様において、融合タンパク質は、図９Ａまたは９Ｂの表に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、融合タンパク質の転写リプレッサードメインは、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインアミノ酸配列を含みうる。融合タンパク質では、ＺＦＰドメインは、ペプチドリンカーを介して転写リプレッサードメインに結合していてもよい。
別の態様において、本開示は、本発明の融合タンパク質のコーディング配列を含む核酸構築物であって、前記コーディング配列が、転写調節エレメント、例えば、脳細胞において構成的に活性または誘導性である哺乳動物プロモーター（例えば、ヒトシナプシンＩプロモーター）などに作動可能に連結されている、核酸構築物を提供する。本開示はまた、核酸構築物を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、例えば、ヒト細胞、および／または脳細胞もしくは多能性幹細胞であって、前記幹細胞は、適宜、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。本開示はまた、核酸構築物を含む組換えウイルス（適宜、血清型６または９の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））を提供する。
さらに別の態様において、本開示は、哺乳動物の脳細胞におけるプリオンタンパク質（ＰｒＰ）の発現を阻害するための方法であって、本発明の融合タンパク質を、適宜、（例えば、組換えウイルスを介して）本明細書に記載される核酸構築物の導入により前記細胞に導入し、それにより前記細胞におけるＰｒＰの発現を阻害することを含む、方法を提供する。哺乳動物の脳細胞は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、またはマウスの細胞であってもよく、および／またはニューロン、グリア細胞、上衣細胞、または神経上皮細胞であってもよい。ある実施態様において、細胞は、プリオン病に罹患しているか、または発症するリスクのある患者の脳内にあり、前記プリオン病は、適宜、家族性、孤発性、または獲得性プリオン病、例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、孤発性ＣＪＤ、異型ＣＪＤ、ゲルストマン・シュトラウスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、孤発性致死性不眠症（ｓＦＩ）、クールー病、または可変プロテアーゼ感受性プリオン症（ＶＰＳＰｒ）である。
本開示はまた、患者における神経変性疾患を治療するための方法であって、本発明の融合タンパク質をコードする組換えＡＡＶを前記患者に投与することを含む、方法を提供する。神経変性疾患は、プリオン病であってもよく、前記プリオン病は、適宜、家族性、孤発性、または獲得性プリオン病、例えば、ＣＪＤ、孤発性ＣＪＤ、異型ＣＪＤ、ＧＳＳ、ＦＦＩ、ｓＦＩ、クールー病、またはＶＰＳＰｒなどである。ある実施態様において、前記疾患は、タウオパシー、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、または大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）などでありうる。他の実施態様において、前記疾患は、シヌクレイン病、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、またはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）などでありうる。
ある実施態様において、本融合タンパク質をコードするＡＡＶは、静脈内、髄腔内、脳室内、大槽内、または視床内注射、あるいはいずれかの脳領域への注射を介して患者に導入される。
本開示は、本明細書に記載の方法で使用するための本発明の融合タンパク質、核酸構築物、および組換えウイルス、ならびに本明細書に記載の方法において薬剤を製造するための融合タンパク質、核酸構築物、組換えウイルスの使用を提供する。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明で明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示すが、限定ではなく、例示としてのみ与えられていることを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。
図１は、マウスＰｒｎｐ遺伝子の上流ゲノム領域を示す図である。前記遺伝子の下のクラスター内の小さな三角形は、マウスＰｒｎｐ遺伝子を標的とするために調製された３８４個のＺＦＰ－ＴＦの標的ゲノム領域を示す。右向きの三角形は、ＺＦＰ－ＴＦが前記遺伝子のセンス鎖に結合することを示す。左向きの三角形は、ＺＦＰ－ＴＦが前記遺伝子のアンチセンス鎖に結合することを示す。前記ＺＦＰ－ＴＦの１９２個が、標準的な構造を有する親タンパク質であった。他の１９２個のタンパク質が変異体であり、各親に１つずつあり、ＺＦＰ－ＴＦの３個のジンクフィンガーのジンクフィンガーヘリックスの１番目のアミノ酸のＮ末端の４番目の位置に３個のＲからＱへの置換が組み込まれている。 図２は、ＺＦＰ－ＴＦのｍＲＮＡによるトランスフェクション２４時間後に採取されたＮｅｕｒｏ２ａ細胞におけるマウスＰｒｎｐのｍＲＮＡ発現の減少に関する親および変異体ＺＦＰ－ＴＦの各効果を示す図である。メッセンジャーＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した。正規化したＰｒｎｐ発現レベルは、勾配バー「ＰＲＮＰ ｍＲＮＡ」で示す。最も深い（赤）色は１００％の減少を示す。最も明るい（白い）色は０％の減少を示す。ＲＴ－ｑＰＣＲデータは、ＡＴＰ５ＢおよびＥＩＦ４Ａ２のｍＲＮＡレベルの平均に対して正規化した。 図３Ａ～Ｄは、用量設定時（左から右に３ｎｇ、１０ｎｇ、３０ｎｇ、１００ｎｇ、３００ｎｇ、１０００ｎｇのＺＦＰ－ＴＦ ｍＲＮＡ用量）のマウスＰｒｎｐ ｍＲＮＡ発現の減少に関する３８４個のＺＦＰ－ＴＦ（＃８１０７０～＃８１３９０）の各効果を示す棒グラフのの一群である。 図４は、３６個の選択し操作したＺＦＰによってマウスＰＲＮＰ遺伝子内またはその近くに結合した認識ヘリックス配列およびゲノム配列を示す表である。各ＺＦＰについて、ＺＦＰドメイン内の各ジンクフィンガーのゲノム標的配列（結合配列）およびＤＮＡ結合認識ヘリックス配列（すなわち、Ｆ１－Ｆ６）を一行に表示する。表中の「＾」は、示されたヘリックスの１番目のアミノ酸の上流の４番目の位置にあるアルギニン（Ｒ）残基がグルタミン（Ｑ）に変化していることを示す。各配列に割り当てた配列番号を、前記配列後の括弧内に示す。 図５は、図３Ｄについて上記に示すように評価した、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞における３６個の選択したＺＦＰ－ＴＦのＰｒｎｐ抑制活性を示す棒グラフの一群である。 図６Ａおよび６Ｂは、３６個の選択したＺＦＰ－ＴＦのうちの１個をコードする組換えＡＡＶによる感染７日後の一次マウス皮質ニューロンにおけるＰｒｎｐのｍＲＮＡレベルを示す。前記ニューロンは、ＡＡＶ感染多重度（ＭＯＩ）の増加とともに感染した（左から右へ：１Ｅ２、３Ｅ２、１Ｅ３、３Ｅ３、１Ｅ４、および３Ｅ４）。図６Ａは、正規化したＲＴ－ｑＰＣＲデータ（平均Ｐｒｎｐ ｍＲＮＡレベルおよび標準偏差）を示す表である。次に、前記データを、図６Ｂに示す棒グラフに図示する。ＲＴ－ｑＰＣＲデータを、ＡＴＰ５Ｂ、ＥＩＦ４Ａ２、およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルの平均に対して正規化した。 図７Ａは、マウス一次ニューロンにおける３６個の試験したマウスＰｒｎｐのＺＦＰ－ＴＦのオフターゲット活性を示すボルケーノプロットの一群である。前記ボルケーノプロットは、ＡＡＶ６形質導入７日後のマウス一次ニューロンのトランスクリプトームの変化を示すマイクロアレイデータをまとめたものである。前記ボルケーノプロットでは、緑色の円（各ボルケーノプロットの右側）が顕著に上方調節されたオフターゲット遺伝子を表し（ＦＤＲ Ｐ＜０．０５）、赤色の円が顕著に下方調節されたオフターゲット遺伝子を表す（ＦＤＲ Ｐ＜０．０５）。黄色の円は、マウスのＰｒｎｐおよびＰｒｎｄ（Ｐｒｎｐの下流に位置する）遺伝子座の両方をカバーするマイクロアレイプローブセットを示す。Ｐｒｎｄは、マウスの皮質ニューロンではほとんど発現しておらず、それゆえＰｒｎｐ発現の最小限の変化が検出された。 図７Ｂは、図７Ａにおけるボルケーノプロットに対応するマウス一次皮質ニューロンで試験したマウスＰｒｎｐのＺＦＰ－ＴＦについて調節不全のオフターゲット遺伝子の数を示す表である。 図８Ａは、１２個の選択し操作したＺＦＰによってヒトＰＲＮＰ遺伝子内またはその近くに結合した認識ヘリックス配列およびゲノム配列を示す表である。各ＺＦＰについて、ＺＦＰドメイン内の各ジンクフィンガーのゲノム標的配列（結合配列）およびＤＮＡ結合認識ヘリックス配列（すなわち、Ｆ１－Ｆ６）を一行に表示する。表中の「＾」は、示されたヘリックスの１番目のアミノ酸の上流の４番目の位置にあるアルギニン（Ｒ）残基がグルタミン（Ｑ）に変化していることを示す。各配列に割り当てた配列番号を、前記配列の下の括弧内に示す。 図８Ｂは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるヒトＰＲＮＰを標的とする図８Ａからの１２個のＺＦＰ－ＴＦを示す図の一群である。ｙ軸は、３個のハウスキーピング遺伝子（ＡＴＰ５Ｂ、ＥＩＦ４Ａ２、およびＧＡＰＤＨ）の幾何平均に対して正規化し、異なるＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶ６によるｉＰＳＣ由来ニューロンの形質導入３１日後に評価したＰＲＮＰのｍＲＮＡ発現である。使用したＡＡＶ６の量をｘ軸に示し、ＡＡＶ６の用量は、左から右に増加する（１Ｅ３、３Ｅ３、１Ｅ４、３Ｅ４、１Ｅ５、および３Ｅ５）。バーは、４回の技術的な反復の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を表す。用量設定スケールの拡大版を図の下部に示す。 図８Ｃは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるヒトＰＮＲＰの抑制を示す表である。 図８Ｄは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて試験した１２個のヒトＰＲＮＰのＺＦＰ－ＴＦのオフターゲット活性を示すボルケーノプロットの一群である。前記ボルケーノプロットは、ＡＡＶ６形質導入１９日後のヒトｉＰＳＣ由来ニューロンのトランスクリプトームの変化を示すマイクロアレイデータをまとめたものである。前記ボルケーノプロットでは、緑色の円（各ボルケーノプロットの右側）が顕著に上方調節されたオフターゲット遺伝子を表し（ＦＤＲ Ｐ＜０．０５）、赤色の円が顕著に下方調節されたオフターゲット遺伝子を表す（ＦＤＲ Ｐ＜０．０５）。黄色の円は、ヒトＰＲＮＰ遺伝子から発現した転写産物を検出するマイクロアレイプローブセットを示す。 図８Ｅは、図８Ｄのボルケーノプロットに対応する、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて試験したヒトＰＲＮＰのＺＦＰ－ＴＦの調節不全のオフターゲット遺伝子の数を示す表である。 図９Ａは、マウスＰｒｎｐのＺＦＰ－ＴＦの全長ＡＡ配列（ヘリックス、Ｒ（－５）Ｑ変異体、モジュール内およびモジュール間リンカー）を示す表である。図９Ｂは、ヒトＰＲＮＰのＺＦＰ－ＴＦの全長ＡＡ配列（ヘリックス、Ｒ（－５）Ｑ変異体、モジュール内およびモジュール間リンカー）を示す表である。各配列に割り当てた配列番号を、前記配列後の括弧内に示す。
発明の詳細な説明
本開示は、哺乳動物ＰＲＮＰ遺伝子内またはその近くの部位（すなわち、配列）を標的とするＺＦＰドメインを提供する。本明細書に記載のＺＦＰドメインは、別の機能的分子またはドメインに結合されるか、または融合されていてもよい。本開示のＺＦＰドメインは、哺乳動物ＰＲＮＰ遺伝子のＲＮＡへの転写を抑制するための転写因子に融合されていてもよい。前記融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）と呼ばれる。これらのＺＦＰ－ＴＦは、ＰＲＮＰ遺伝子内またはその近くの標的領域（すなわち、標的部位）に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび前記遺伝子の転写を低下させる転写リプレッサードメインを含む。前記ＺＦＰ－ＴＦを患者の脳に導入することによってニューロンのＰｒＰレベルを下げると、ＰｒＰＳｃの形成および拡散を抑制し（例えば、減少させ、または停止させ）、それによりプリオン病を治療する（例えば、症状を緩和し、症状の発症または悪化を予防し、および生存率を増加する）ことが期待される。
ＰＲＮＰ阻害に対する我々のＺＦＰ－ＴＦ方法には、現在他が試験しているアプローチと比較していくつかの利点がある。ＺＦＰ－ＴＦは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）について報告されているよりも高いレベルのＰｒＰ抑制を達成することができる。さらに、ＺＦＰ－ＴＦは、（ＺＦＰ－ＴＦ発現構築物、例えば、組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶなど）を患者に導入することによって）一度だけ投与する必要がありうるが、ＡＳＯは、反復投与を要する。さらに、ＺＦＰ－ＴＦ方法は、各細胞のゲノムにおけるＰＲＮＰ遺伝子の２個の対立遺伝子を関与させるだけで済む。対照的に、ＡＳＯは各細胞のＰＲＮＰｍＲＮＡの多数のコピーに関与する必要がある。さらに、組換えウイルス、例えば、組換えＡＡＶなどを用いると、ＺＦＰ－ＴＦを目的の脳領域に送達することができる。
プリオン病治療への我々のアプローチは、安全であることが期待される。約１８，０００人に１人の割合のヒトが、機能喪失型ＰＲＮＰ変異についてヘテロ接合であると推定されるが、これらの個体には認識できる有害な影響はない。
Ｉ．ＺＦＰドメインの標的
本発明の融合タンパク質のＺＦＰドメインは、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウス）ＰＲＮＰ遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合する。ＺＦＰ－ＴＦのＤＮＡ結合ＺＦＰドメインは、前記融合タンパク質をＰＲＮＰ遺伝子の標的領域に指示し、前記融合タンパク質の転写リプレッサードメインを標的領域に提示する。次に、前記リプレッサードメインは、ＲＮＡポリメラーゼによるＰＲＮＰ遺伝子の転写を抑制する。前記標的領域は、遺伝子発現の抑制を可能にするＰＲＮＰ遺伝子においていずれかの適切な部位でありうる。一例として、前記標的領域は、ＰＲＮＰ転写開始部位（ＴＳＳ）、またはＰＲＮＰ転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ＲＮＡポリメラーゼ休止部位など）を含むか、これらに隣接する。例えば、前記標的領域は、ＴＳＳの上流および／または下流約５００～１，０００ｂｐにありうる。
くる
ある実施態様において、ゲノム標的領域は、少なくとも８ｂｐの長さである。例えば、前記標的領域は、８ｂｐ～４０ｂｐの長さ、例えば、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ｂｐの長さでありうる。前記標的配列は、遺伝子のセンス鎖上または遺伝子のアンチセンス鎖上にあってもよい。標的の正確性を確保し、ＺＦＰ－ＴＦによるオフターゲット結合または活性を減少するために、選択されるＰＲＮＰ標的領域の配列は、好ましくは、他の遺伝子の配列に対して７５％未満の相同性（例えば、７０％未満、６５％未満、６０％未満、または５０％未満）を有する。特定の実施態様において、本発明のＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、１５～１８ｂｐの長さであり、ＴＳＳの約５００～１，０００ｂｐ内に存在する。マウスＰＲＮＰ遺伝子の標的領域の例を図１および図４に示す。ヒトＰＲＮＰ遺伝子の標的領域の例を図８Ａに示す。
ある実施態様において、本発明の操作されたＺＦＰは、好ましくは、検出可能なオフターゲット結合または活性がないか、またはほとんどなく、図４および図８Ａの表の一行に示される標的部位（すなわち、結合配列）に結合する。
標的部分をさらに評価するための他の基準には、このような部分または関連する部分に結合するＺＦＰの過去の利用可能性、特定の標的部分に結合する新しいＺＦＰの設計の容易性、およびオフターゲット結合評価が含まれる。
ＩＩ．ＺＦＰドメイン
「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、亜鉛によって安定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を意味する。ＺＦＰは、配列特異的な方法でＤＮＡに結合する。ＺＦＰの各ＤＮＡ結合ユニットは、ジンク「フィンガー」と呼ばれる。各フィンガーは、典型的に、７つのアミノ酸残基で構成され、ＤＮＡ結合の特異性を決定するＤＮＡ結合「認識ヘリックス」を含有する。ＺＦＰドメインは、少なくとも１つのフィンガーを有し、各フィンガーは、２～４塩基対のＤＮＡ、典型的には、３または４塩基対のＤＮＡに結合する。各ジンクフィンガーは、典型的には、約３０個のアミノ酸およびキレート亜鉛で構成される。操作されたＺＦＰは、天然に存在するＺＦＰと比較して、新規の結合特異性を有することができる。操作方法には、以下に限定されないが、合理的な設計および様々な種類の選択が含まれる。合理的な設計には、例えば、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および各ジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれ、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたはそれ以上のアミノ酸配列に関連するものである。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，１４０，０８１号；第６，２００，７５９号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第６，９７９，５３９号；および第８，５８６，５２６号；および国際特許公開ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０１６５３６；ＷＯ０２／０９９０８４；およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されるＺＦＰ設計方法を参照のこと。本明細書に記載されるＺＦＰドメインは、別の分子、例えば、タンパク質に結合され、または融合されていてもよい。このようなＺＦＰ融合物は、遺伝子活性化（例えば、活性化ドメイン）、遺伝子抑制（例えば、抑制ドメイン）、リガンド結合（例えば、リガンド結合ドメイン）、ハイスループットスクリーニング（例えば、リガンド結合ドメイン）、超変異の局所化（例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼドメイン）、クロマチン修飾（例えば、ヒストンデアセチラーゼドメイン）、組換え（例えば、リコンビナーゼドメイン）、標的化されたインテグレーション（例えば、インテグラーゼドメイン）、ＤＮＡ修飾（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン）、塩基エディッション（例、塩基エディタードメイン）、またはターゲットＤＮＡ切断（例えば、ヌクレアーゼドメイン）を可能にするドメインを含んでいてもよい。操作されたＺＦＰドメインの例を図４および８Ａの表に示す。
本発明の操作されたＺＦＰ融合タンパク質のＺＦＰドメインは、少なくとも１個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、またはそれ以上）のジンクフィンガーを含んでいてもよい。１個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的に、３個または４個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。２個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的に、６個または８個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。３個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的に、９個または１２個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。４個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的に、１２～１５個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。５個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的に、１５～１８個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。６個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、１８～２１個のヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。
ある実施態様において、本発明の操作されたＺＦＰは、図４および８Ａの表に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、図４および８Ａの表に示されるように、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、またはＦ６の配列を含みうる。
ある実施態様において、本発明の操作されたＺＦＰは、図４および８Ａの表の一行に示される２つの隣接するＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、図４および８Ａの表の一行に示されるＦ１－Ｆ２、Ｆ２－Ｆ３、Ｆ３－Ｆ４、Ｆ４－Ｆ５、またはＦ５－Ｆ６の配列を含みうる。
ある実施態様において、本発明の操作されたＺＦＰは、図４および８Ａの表の一行に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、図４および８Ａの表の一行に示されるＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、およびＦ６（例えば、Ｆ１～Ｆ６）の配列を含みうる。
ＺＦＰドメインの標的特異性は、例えば、米国特許第２０１８／００８７０７２号に記載されるＺＦＰ骨格配列に対する変異によって改善されうる。前記変異には、ＤＮＡ骨格上のリン酸と非特異的に相互作用することができるがヌクレオチド標的特異性には関連しないＺＦＰ骨格の残基に対してなされた変異が含まれる（例えば、Miller et al., Nat Biotechnil.(2019)37(8):945-52を参照のこと）。ある実施態様において、これらの変異には、カチオン性アミノ酸残基を中性またはアニオン性アミノ酸残基に変異させることが含まれる。ある実施態様において、これらの変異には、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基に変異させることが含まれる。さらなる実施態様において、変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して位置（－５）、（－９）および／または（－１４）で行われる。ある実施態様において、ジンクフィンガーは、位置（－５）、（－９）および／または（－１４）において１つまたはそれ以上の変異を含んでいてもよい。さらなる実施態様において、マルチフィンガーＺＦＰドメインにおける１つまたはそれ以上のジンクフィンガーは、位置（－５）、（－９）および／または（－１４）における変異を含みうる。ある実施態様において、位置（－５）、（－９）および／または（－１４）におけるアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、チロシン（Ｙ）、および／またはグルタミン（Ｑ）において変異を有する。１個、２個、または３個の骨格変異を有する操作されたＺＦＰの例を図４、８Ａ、９Ａおよび９Ｂの表に示す。図４および８Ａ中の記号「＾」は、示される認識ヘリックスの１番目のアミノ酸の４位上流のアルギニン（Ｒ）残基がグルタミン（Ｑ）に変化されていることを示し、図９Ａおよび９Ｂの表中に太字で示される。各認識ヘリックス配列では、７個のＤＮＡ結合アミノ酸の位置に－１、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、および＋６の番号が付けられている。よって、ＲからＱへの置換の位置は（－５）として番号付けされる。
ある実施態様において、本発明の操作されたＺＦＰは、図４および８Ａの表に示されるように、ＤＮＡ結合認識ヘリックス配列および関連する骨格変異を含む。ある実施態様において、本発明の操作されたＺＦＰは、図４および８Ａの表の一行に示されるように、ＤＮＡ結合認識ヘリックス配列および関連する骨格変異を含む。
ある実施態様において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰは、図９Ａおよび９Ｂの表の一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。ある実施態様において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰは、翻訳後修飾後に配列が現れるので、図９Ａおよび９Ｂの表の一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。例えば、翻訳後修飾は、図９Ａおよび９Ｂの表の一行に示されるように、配列から開始因子メチオニン残基を除去していてもよい。
ある実施態様において、本発明のＺＦＰ－ＴＦは、１個またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含む。前記ドメインは、例えば、１つのドメインが、１個またはそれ以上（例えば、４個、５個、または６個）のジンクフィンガーを含み、別のドメインが、さらに１個またはそれ以上（例えば、４個、５個、または６個）のジンクフィンガーを含むように、伸長可能な可撓性リンカーを介して一緒に連結されていてもよい。ある実施態様において、前記リンカーは、フィンガーアレイが、８個、９個、１０個、１１個または１２個またはそれ以上のフィンガーを含む１個のＤＮＡ結合ドメインを含むような、標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施態様において、前記リンカーは、可撓性リンカーなどの非定型リンカーである。例えば、２つのＺＦＰドメインは、構造（Ｎ末端からＣ末端まで）ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＦ－ＺＦＰ－ＺＦＰ、ＺＦＰ－ＴＦ－ＺＦＰ、またはＺＦＰ－ＴＦ－ＺＦＰ－ＴＦにおける転写リプレッサーＴＦに連結されていてもよい（２つのＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質はリンカーを介して融合される）。
ある実施態様において、ＺＦＰ－ＴＦは、「ツーハンド（two-handed）」、すなわち、それらは、介在するアミノ酸によって分離された２つのジンクフィンガークラスター（２つのＺＦＰドメイン）を含み、前記２つのＺＦＰドメインが２つの不連続な標的部位に結合している。ツーハンドタイプのジンクフィンガー結合タンパク質の例は、ＳＩＰ１であり、４個のジンクフィンガーのクラスターがタンパク質のアミノ末端に位置し、３個のフィンガーのクラスターがカルボキシル末端に位置している（Remacleetal., EMBO J.(1999)18(18):5073-84）。これらのタンパク質におけるジンクフィンガーの各クラスターは、固有の標的配列に結合することができ、２個の標的配列間の間隔は多くのヌクレオチドを含むことができる。
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来していてもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼ、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、およびＩ－ＴｅｖＩＩＩなどの認識配列が知られている。米国特許第５，４２０，０３２号および第６，８３３，２５２号；Belfort et al., NucleicAcidsRes.(1997)25:3379-88; Dujon et al., Gene(1989)82:115-8; Perler et al., NucleicAcidsRes.(1994)22:1125-7; Jasin, Trends Genet(1996)12:224-8; Gimble et al., JMolBiol.(1996)263:163-80; Argast et al., JMolBiol.(1998)280:345-53；ならびにニューイングランドバイオラボのカタログなども参照のこと。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Chevalier et al., Mol Cell(2002)10:895-905; Epinat et al., NucleicAcidsRes.(2003)31:2952-62; Ashworth et al., Nature(2006)441:656-59; Paques et al., Current Gene Therapy(2007)7:49-66;および米国特許公報第２００７／０１１７１２８号を参照のこと。
ＩＩＩ．ジンクフィンガータンパク質転写因子
本明細書に記載のＺＦＰドメインは、転写因子に融合されていてもよい。ある実施態様において、前記転写因子は、転写リプレッサードメインであって、前記ＺＦＰおよびリプレッサードメインは、直接ペプチジル結合またはペプチドリンカーによって、または二量体化によって（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質を介して）相互に結合していてもよい。本明細書で用いられるように、「融合タンパク質」は、共有結合したドメインを有するポリペプチド、ならびに非共有結合を介して相互に結合されたポリペプチドの複合体を意味する。転写リプレッサードメインは、ＺＦＰドメインのＣ末端またはＮ末端を含むいずれかの適切な位置でＺＦＰドメインと結合することができる。
ある実施態様において、本発明のＺＦＰ－ＴＦの２つまたはそれ以上が患者において同時に使用され、前記ＺＦＰ－ＴＦは、ＰＲＮＰ発現の最適な抑制を達成するために、ＰＲＮＰ遺伝子の異なる標的領域に結合する。
Ａ．転写リプレッサードメイン
本発明のＺＦＰ－ＴＦは、本明細書に記載される操作されたＺＦＰドメインおよびＰＲＮＰ遺伝子の転写活性を弱める１つまたはそれ以上の転写リプレッサードメインを含む。１つまたはそれ以上の操作されたＺＦＰドメインおよび１つまたはそれ以上の転写リプレッサードメインは、可撓性リンカーによって結合されていてもよい。転写リプレッサードメインの非限定的な例は、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメイン、ＫＡＰ－１、ＭＡＤ、ＦＫＨＲ、ＥＧＲ－１、ＥＲＤ、ＳＩＤ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ＥＲＢ－Ａ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＴＲａ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、核ホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体または甲状腺ホルモン受容体）、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２である。例えば、Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; and Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照のこと。さらに例示的な抑制ドメインには、以下に限定されないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが含まれる。例えば、Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; and Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27を参照すること。
ある実施態様において、転写リプレッサードメインは、ヒトジンクフィンガータンパク質１０／ＫＯＸ１（ＺＮＦ１０／ＫＯＸ１）のクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインからの配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿０１５３９４．４）を含む。例示的なＫＲＡＢドメイン配列は：
ＤＡＫＳＬＴＡＷＳＲ ＴＬＶＴＦＫＤＶＦＶ ＤＦＴＲＥＥＷＫＬＬ ＤＴＡＱＱＩＶＹＲＮ ＶＭＬＥＮＹＫＮＬＶ ＳＬＧＹＱＬＴＫＰＤ ＶＩＬＲＬＥＫＧＥＥ ＰＷＬＶＥＲＥＩＨＱ ＥＴＨＰＤＳＥＴＡＦ ＥＩＫＳＳＶ
（配列番号２６１）
である。
このＫＲＡＢ配列の変異体はもまた、同一または類似の転写抑制機能を有する限り用いられてもよい。
ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、好ましくは、検出可能なオフターゲット結合または活性がなく、またはほとんど伴わず、図４および８Ａの表の一行に示される標的部位に結合する。オフターゲット結合は、例えば、オフターゲット遺伝子におけるＺＦＰ－ＴＦの活性を測定することによって決定されてもよい。
ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、図４および８Ａの表に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、図４および８Ａの表の一行に示される２つの隣接するＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、図４および８Ａの表の一行に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、図９Ａおよび９Ｂの表の一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、図９Ａおよび９Ｂの表の一行に示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、翻訳後修飾後に配列が現れるため、図９Ａおよび９Ｂの表の一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される操作されたＺＦＰ－ＴＦは、配列が翻訳後修飾の後に現れるため、図９Ａおよび９Ｂの表の一行に示されるアミノ酸配列を含む。例えば、翻訳後修飾は、図９Ａおよび９Ｂの表に示される配列からの開始因子メチオニン残基を除去してもよい。
Ｂ．ペプチドリンカー
本発明のＺＦＰ－ＴＦのＺＦＰドメインおよび転写リプレッサードメイン、ならびに／あるいは前記ＺＦＰドメイン内のジンクフィンガーは、ペプチドリンカー、例えば、約５～２００個のアミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上のアミノ酸）の切断不可能なペプチドリンカーを介して連結されていてもよい。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。例えば、上記ならびに米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；第７，１５３，９４９号；第８，７７２，４５３号；および第９，１６３，２４５号；およびＷＯ２０１１／１３９３４９を参照のこと。本明細書に記載のタンパク質は、適切なリンカーのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。リンカーの非限定的な例は、ＤＧＧＧＳ（配列番号２５２）、ＴＧＥＫＰ（配列番号２５３）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号２５４）、ＧＧＲＲ（配列番号２５５）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号２５６）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号２５７）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号２５８）、ＬＲＱＫＤ（Ｇ３Ｓ）２ＥＲＰ（配列番号２５９）、およびＴＧＳＱＫＰ（配列番号２６０）である。ある実施態様において、ＴＧＥＫＰＦＡ（配列番号３４８）および／またはＴＧＳＱＫＰＦＱ（配列番号３４９）は、ＺＦＰドメイン内のジンクフィンガーを、ならびに／あるいはＬＲＱＫＤＡＡＲＧＳＧＧ（配列番号３５０）またはＬＲＧＳＧＧ（配列番号３５１）は、ＺＦＰドメインを、転写リプレッサードメインに結合する。
ある実施態様において、ペプチドリンカーは、３～２０個のアミノ酸残基の長さであり、Ｇおよび／またはＳが多い。このようなリンカーの非限定的な例は、Ｇ４Ｓ型リンカー（配列番号３４７）、すなわち、１個またはそれ以上（例えば、２個、３個、または４個）のＧＧＧＧＳ（配列番号２５１）モチーフ、または前記モチーフの変形（前記モチーフから１個、２個、または３個のアミノ酸の挿入、欠失、および置換を有するものなど）を含むリンカーである。
ＩＶ．ＺＦＰ－ＴＦの発現
本開示のＺＦＰ－ＴＦは、それをコードする核酸分子を介して患者に導入されてもよい。前記核酸分子は、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子でありうる。核酸分子は、脂質：核酸複合体（例えば、リポソーム）を含む組成物の注射を介して患者の脳に導入されてもよい。あるいは、ＺＦＰ－ＴＦは、ＺＦＰ－ＴＦをコードする配列を含む核酸発現ベクターを介して患者に導入されうる。前記発現ベクターは、神経系の細胞におけるＺＦＰ－ＴＦのコーディング配列の発現を可能にする発現調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列、および転写終結配列などを含みうる。ある実施態様において、前記発現ベクターは、安定なエピソームとして細胞内に存在したままである。他の実施態様において、前記発現ベクターは、細胞のゲノムに組み込まれる。
ある実施態様において、脳におけるＺＦＰ－ＴＦ発現を指示するためのベクター上のプロモーターは、構成的に活性なプロモーターまたは誘導性プロモーターである。適切なプロモーターには、以下に限定されないが、レトロウイルスＲＳＶ ＬＴＲプロモーター（適宜、ＲＳＶエンハンサーを有する）、ＣＭＶプロモーター（適宜、ＣＭＶエンハンサーを有する）、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＣＫ６プロモーター、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Niwa et al., Gene(1991)108 (2):193-9）、およびＲＵ－４８６応答性プロモーターが含まれる。ニューロン特異的プロモーター、例えば、シナプシンＩプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＣＡＭＫＩＩプロモーター、ＰｒＰプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、またはニューロンとグリア細胞への発現を制限する操作されたか、または天然のプロモーターなどもまた用いられうる。
エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リポソーム、核局在化シグナルと組み合わせたリポソーム、天然に存在するリポソーム（例えば、エキソソーム）、またはウイルス形質導入を含むが、これらに限定されない、細胞にヌクレオチド配列を導入するためのいずれかの方法が用いられてもよい。
発現ベクターのインビボ送達のために、ウイルス形質導入が用いられてもよい。当該技術分野で公知の様々なウイルスベクター、例えば、ワクチンベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポキシウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、およびハイブリッドウイルスベクターが、本開示における使用のために当業者によって用いられうる。ある実施態様において、本明細書で用いられるウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し、長期発現のための安定したエピソーム構造として存在し、免疫原性が非常に低いため、ＣＮＳ遺伝子送達に特に適する（Hadaczek et al., MolTher.(2010)18:1458-61; Zaiss, et al., GeneTher.(2008)15:808-16）。いずれかの適切なＡＡＶ血清型が用いられてもよい。例えば、前記ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０、あるいはＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、またはＡＡＶ２／９などのシュードタイプのもの（すなわち、複数の血清型に由来するＡＡＶ；例えば、ｒＡＡＶが、そのゲノムおよびＡＡＶ８、５、６、または９キャプシドにＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む）であってもよい。ある実施態様において、前記発現ベクターは、ＡＡＶウイルスベクターであり、昆虫細胞／バキュロウイルス産生系または哺乳動物細胞産生系などの産生系においてＡＡＶビリオンの生成を可能にするために、そのゲノムが、両端にＡＡＶ逆末端反復（ＩＴＲ）配列を有することを含む構築物を含む組換えＡＡＶビリオンによって標的ヒト細胞に導入される。前記ＡＡＶは、そのキャプシドタンパク質が、ヒトまたは非ヒト霊長類において免疫原性を低下させるか、または形質導入能を高めるように操作されていてもよい。ある実施態様において、ＡＡＶ９が用いられる。本明細書に記載のウイルスベクターは、当該技術分野で公知の方法を用いて生成されうる。いずれかの適切な許容細胞またはパッケージング細胞がウイルス粒子を生成するために用いられてもよい。例えば、哺乳動物または昆虫細胞がパッケージング細胞株として用いられうる。
Ｖ．医薬用途
本発明のＺＦＰ－ＴＦは、ＰｒＰ発現の下方調節を必要とする患者を治療するために用いることができる。前記患者はプリオン病に罹患しているか、または発症するリスクがある。治療されるプリオン病は、家族性、孤発性、または獲得性のプリオン病であってもよく、ＣＪＤ、ｓＣＪＤ、ｖＣＪＤ、ＧＳＳ、ＦＦＩ、ｓＦＩ、クールー病、ＶＰＳＰｒでありうる。リスクのある患者には、遺伝的素因のある患者、ならびに狂牛病に罹っている牛の肉またはその他の環境に起因するプリオンにさらされた患者が含まれる。本開示は、治療を必要とするヒト患者などの対象における神経変性疾患を治療するための方法であって、ＺＦＰ－ＴＦ（例えば、それを発現するｒＡＡＶベクター）の治療上有効量（例えば、ＰＲＮＰ発現の十分な抑制を可能にする量）を、前記対象の神経系にを導入することを含む方法を提供する。ある実施態様において、神経変性疾患は、プリオン病である。用語「治療する」は、症状の緩和、症状の発症の予防、疾患進行の遅延、生活の質の改善、および生存率の増加を包含する。脳脊髄液または血漿中のプリオンまたはニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）レベルを含むがこれらに限定されないバイオマーカーもまた、治療の進行をモニターするために測定されうる。
本開示は、ウイルスベクター、例えば、組換えゲノムがＺＦＰ－ＴＦのための発現カセットを含む組換えｒＡＡＶなどを含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、医薬的に許容される担体、例えば、水、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、デキストロース、グリセロール、ショ糖、乳糖、ゼラチン、デキストラン、アルブミン、またはペクチンなどをさらに含んでいてもよい。さらに、前記組成物は、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、または医薬組成物の有効性を高める他の試薬などを含みうる。前記医薬組成物は、送達ビヒクル、例えば、リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、および小胞などを含んでいてもよい。
本開示の治療法の標的となる細胞は、以下に限定されないが、神経細胞（例えば、運動ニューロン、感覚ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、またはセロトニン作動性ニューロン）；グリア細胞（例えば、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、周皮細胞、シュワン細胞、またはミクログリア細胞）；上衣細胞；または神経上皮細胞を含む。治療法の標的となる脳領域は、例えば、例えば、大脳皮質（古典型ＣＪＤ）、視床（ＦＦＩ）、脳幹（スクレイピー、ＢＳＥ、および慢性消耗病）、および小脳（クールー病）であってもよい。前記標的となる領域は、線条体内注射、視床内注射、脳内注射、大槽内（ＩＣＭ）注射、より一般的には、実質内注射、脳室内（ＩＣＶ）注射、髄腔内注射、または静脈内注射によって直接到達されうる。他の投与経路には、以下に限定されないが、脳内、心室内、鼻腔内、または眼内投与が含まれる。ある実施態様において、ウイルスベクターは、例えば、髄腔内および／または脳内注射、または大槽内注射を介して脳脊髄液（ＣＳＦ）に直接投与された後、ＣＮＳ組織全体に広がる。他の実施態様において、ウイルスベクターは、血液脳関門を通過し、静脈内投与後に対象のＣＮＳ組織全体に広範囲に分布することを達成する。他の実施態様において、ウイルスベクターは、実質内注射を介して標的領域に直接送達される。ある場合において、ウイルスベクターは、実質内送達後に、他の脳領域への逆行性または順行性輸送を受けうる。ある態様において、ウイルスベクターは、高い効率にて安定で無毒な遺伝子導入を達成する、異なるＣＮＳ組織標的化能力（例えば、ＣＮＳ組織向性）を有する。
一例として、医薬組成物は、脳室内投与により、患者の前脳の脳室領域、例えば、右側脳室、左側脳室、第三脳室、または第四脳室などに提供されうる。医薬組成物は、脳内投与、例えば、線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、嗅球、大脳、髄質、橋、小脳、青斑核橋、髄質、脳幹、淡蒼球、海馬、大脳皮質、大脳、頭蓋内腔、髄膜、硬膜、くも膜、または脳軟膜へまたはその近くへの組成物の注射によって患者に提供されうる。脳内投与には、ある場合において、脳周辺のくも膜下腔の脳脊髄液（ＣＳＦ）への薬剤の投与が含まれうる。
ある場合において、脳内投与は、定位固定法を用いた注射に関する。定位固定法は、当該技術分野で周知であり、典型的に、特定の脳内領域、例えば、心室領域に対して注射を誘導するために一緒に用いられるコンピュータおよび３次元走査装置の使用を伴う。マイクロインジェクションポンプ（例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）もまた用いられてもよい。ある場合において、マイクロインジェクションポンプは、ウイルスベクターを含む組成物を送達するために用いられる。ある場合において、組成物の注入速度は、０．１μｌ／分～１００μｌ／分の範囲である。当業者に理解されるように、注入速度は、例えば、対象の種、対象の年齢、対象の体重／サイズ、ＡＡＶの血清型、必要とされる投薬量、および対象とする脳内領域を含む様々な因子に依存する。よって、他の注入速度は、当業者が特定の状況において適切であると見なされるものであってもよい。
ｒＡＡＶの対象への送達は、例えば、静脈内投与によって行われてもよい。ある例において、ｒＡＡＶを、脳組織、脊髄、脳脊髄液（ＣＳＦ）、神経細胞、グリア細胞、髄膜、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、間質腔などに局所的に送達することが望まれうる。ある場合において、組換えＡＡＶは脳室領域に注入することによりＣＮＳに、ならびに実質、皮質、小脳葉、視床、海馬、または他の脳領域、あるいは脳領域の組み合わせに直接送達されてもよい。ＡＡＶは、当該技術分野で公知の神経外科技術を用いて、例えば、定位固定注射などによってニードル、カテーテル、または関連するデバイスで送達されうる（例えば、Stein et al., J Vir. (1999) 73:3424-9; Davidson et al., PNAS. (2000) 97:3428-32; Davidson et al., Nat Genet. (1993) 3:219-223; and Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. (2000) 11:2315-29を参照のこと）。
本明細書で別段の定義がない限り、本開示に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載される方法および材料と類似または同等のものもまた、本開示の実施または試験で用いることができる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。一般に、本明細書に記載の神経学、医学、医薬品化学、および細胞生物学に関連して使用される命名法、およびそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。酵素反応および精製技術は、当該技術分野で一般的に行われているか、または本明細書に記載されているように、製造業者の仕様に従って実施される。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。本明細書および実施態様を通して、単語「有する（have）」および「含む（comprise）」、あるいはこれらの変形「有する（has）」、「有する（having）」、「含む（comprises）」、または「含む（comprising）」などは、記載される整数または整数群を含むが、他の整数または整数群を除くことではないことを意味するものと理解される。本明細書に記載される全ての刊行物および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。多くの文献が本明細書で引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれもが当該技術分野の一般的な技術常識の一部を形成することを認めるものではない。本明細書で用いられるように、１つまたはそれ以上の目的の値に適用される用語「およそ」または「約」は、記載される参照値に類似する値を意味する。特定の実施態様において、前記用語は、特に明記されていないか、または文脈から明らかでない限り、記載され参照値の（より大きいか、または小さいかの）いずれかの方向において１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲内にある値の範囲を意味する。
本発明がより理解されるために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示のみを目的とするものであって、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：ＺＦＰ－ＴＦのスクリーニング
マウスＰＲＮＰ遺伝子の発現を抑制するＺＦＰ－ＴＦを同定するために、転写開始部位（ＴＳＳ）の上流約５００ｂｐからＴＳＳの下流約５００ｂｐまでに及ぶマウスＰＲＮＰ遺伝子の領域において１５から２２ｂｐまでの配列に結合すると予測される３８４個のＺＦＰ－ＴＦのライブラリーを設計し、スクリーニングした（図１および２）。ＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、前記２つの図中に矢印で示され、矢印の方向は、ＺＦＰ－ＴＦが結合するＤＮＡ鎖（５’から３’）を示す。前記ＺＦＰ－ＴＦのうちの１９２個は、親タンパク質であり、残りの半分は、３つのＲからＱへの変異を含む親タンパク質の変異体であった（Miller et al., NatBiotechnol.(2019)37(8):945-52）。この研究では、ＫＲＡＢドメイン配列（配列番号２６２）を転写リプレッサーとして使用し、ＺＦＰドメインのＣ末端に融合させた。
各ＺＦＰ－ＴＦをコードするメッセンジャーＲＮＡを調製し、６回希釈で９６ウェルプレートに分注した。マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞を、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）機器（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｈｅｒｌａｎｄ）を用いてｍＲＮＡでトランスフェクトした。２４時間後、トータルＲＮＡを前記細胞から抽出し、ＰＲＮＰおよび２つの参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４Ａ２）の発現をリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを用いてモニターした。このために、前記細胞を溶解し、逆転写を、Ｃ２ＣＴキットを製造業者の説明書に従って用いて行った。ＴａｑＭａｎ定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いてＰＲＮＰの発現レベルを測定した。ＰＲＮＰ発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子ＥＩＦ４Ａ２およびＡＴＰ５Ｂの発現レベルの幾何平均に対して正規化した。模擬トランスフェクションおよびＰＲＮＰを標的としないことが公知のＺＦＰ－ＴＦによるトランスフェクションを、ネガティブコントロールとして使用した。
図３Ａ～Ｄは、ｍＲＮＡ形態のＺＦＰ－ＴＦの示された量の投与２４時間後の正規化したＰＲＮＰ発現を示す（左から右に、３ｎｇ、１０ｎｇ、３０ｎｇ、１００、ｎｇ、３００ｎｇまたは１０００ｎｇの示されたＺＦＰ－ＴＦ ｍＲＮＡ用量）。ＰＲＮＰ発現を抑制するＺＦＰ－ＴＦの能力もまた、図２の色勾配によって示す（ＺＦＰ－ＴＦが強力であるほどその色は濃くなる）。
３８４個のＺＦＰ－ＴＦのうち、３６個をさらなる研究のために選択した。これらの３６個のＺＦＰ－ＴＦによって標的とされるマウスＰＲＮＰゲノム配列、ならびにＺＦＰ－ＴＦにおける６個のジンクフィンガーのＤＮＡ結合アミノ酸配列を図４に示す。対応するＺＦＰの全アミノ酸配列を図９Ａに示す。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞におけるこれらの３６個のＺＦＰ－ＴＦの各々の活性を図５に示す。図５のデータは、ＺＦＰ－ＴＦ＃＃８１１８５、８１１８７、８１１８９、８１１９３、８１１９９、８１２０１、８１２０８、８１２１０、８１２２８、８１２３０、８１２３４、８１２４０、８１２４４、８１２７８、８１２８２、８１２９５、８１３０３、８１３０９、および８１３１２が特に強力であることを示し、マウスＰＲＮＰ遺伝子の発現に対する用量依存的な抑制効果が示される。
実施例２：一次ニューロンにおける選択したＺＦＰ－ＴＦのＰＲＮＰ抑制活性
次に、マウスの一次皮質ニューロンにおいて選択した３６個のＺＦＰ－ＴＦの活性を試験した。一次マウス皮質ニューロン（ＭＣＮ；Ｇｉｂｃｏ）は、製造業者のプロトコルに従って培養した。ＺＦＰ－ＴＦのコーディング配列を、発現を促進するためのヒトＳＹＮ１プロモーターを用いて組換えＡＡＶ２／６ベクターにクローン化した。ウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ細胞で生成し、ＣｓＣｌ密度勾配を用いて精製し、当該技術分野で公知の方法に従ってリアルタイムｑＰＣＲによって用量設定した。精製したウイルスを用いて、ＤＩＶ２上の培養初代ＭＣＮを、１ｘ１０２ｖｇ／細胞、３ｘ１０２ｖｇ／細胞、１ｘ１０３ｖｇ／細胞、３ｘ１０３ｖｇ／細胞、１ｘ１０４ｖｇ／細胞、または３ｘ１０４ｖｇ／細胞で感染させた。７日後、トータルＲＮＡをニューロンから抽出し、ＰＲＮＰ ｍＲＮＡおよび３つの参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４Ａ２、ＧＡＰＤＨ）の発現をリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを使用してモニターした。
該データは、３６個の選択した全てのＺＦＰ－ＴＦが、マウスニューロンにおけるＰＲＮＰ発現に対して強力な用量依存的抑制活性を示したことを示す（図６Ａおよび６Ｂ）。
実施例３：マウスＰＲＮＰのＺＦＰ－ＴＦのオフターゲット活性
広範囲の遺伝子発現に対するマウスＰｒｎｐＺＦＰ－ＴＦのオフターゲットの影響を評価するために、代表的なプリオンＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶ６で処理した一次マウス皮質ニューロンから分離したトータルＲＮＡを用いてマイクロアレイ実験を行った。
一次マウス皮質ニューロンは、Ｇｉｂｃｏから購入した。細胞をポリ－Ｄ－リジンでコーティングした２４ウェルプレートに２００，０００細胞／ウェルでプレーティングし、Ｇｉｂｃｏ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）Ｉサプリメント、Ｂ２７サプリメント、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含む）を使用して製造業者の説明書に従って維持した。（ＤＩＶ２で）プレーティング４８時間後、該細胞を３Ｅ３ ＶＧ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でＡＡＶ６に感染させ、７日後に回収した（ＤＩＶ９；３～４日ごとに５０％の培地交換を行った）。その後、ＲＮＡ分離およびマイクロアレイ分析を行った。
オフターゲット分析は、ＧｅｎｅＴｉｔａｎ（登録商標）プラットフォーム（Ｃｌａｒｉｏｍ Ｓキット）を用いて製造業者の説明書に従って行った。該アッセイ結果を、ＴＡＣソフトウェアを用いて分析した。遺伝子は、ＦＤＲ補正したｐ値が０．０５以下の場合に差次的に調節されるものとした。最小のオフターゲットを有することが公知のＺＦＰ－ＴＦと模擬トランスフェクションをネガティブコントロールとして使用した。
図７Ａは、一次マウス皮質ニューロンにおいて試験した３６個の代表的なマウスＰＲＮＰ ＺＦＰ－ＴＦのマイクロアレイ結果を示す。広範囲のオフターゲット特異性が観察され、一部のＺＦＰ－ＴＦは、オフターゲット活性が非常に低いか、全く示さなかった。図７Ｂは、各ＺＦＰ－ＴＦについて調節不全の数を示す。
実施例４：ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるヒトＰＲＮＰ ＺＦＰ－ＴＦの活性
ヒトＰＲＮＰを標的とするように設計された１２個のＺＦＰ－ＴＦを、ヒトｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で試験した。これら１２個のＺＦＰ－ＴＦによって標的とされるヒトＰＲＮＰゲノム配列、ならびにＺＦＰ－ＴＦにおけるジンクフィンガーのＤＮＡ結合アミノ酸配列を図８Ａに示す。対応するＺＦＰの全アミノ酸配列を図９Ｂに示す。前記細胞をポリ－Ｌ－オルニチンおよびラミニンでコーティングした９６ウェルプレートに１ウェルあたり４０，０００細胞の密度でプレーティングし、製造業者の説明書に従って維持した。前記細胞を、プレーティング４８時間後に６個の異なるＭＯＩ（１Ｅ３、３Ｅ３、１Ｅ４、３Ｅ４、１Ｅ５、および３Ｅ５）で目的のＺＦＰ－ＴＦを発現するＡＡＶ６にてトランスフェクトした。形質導入された細胞を最大３３日間維持した（３～５日ごとに５０～７５％の培地交換を行った）。ＡＡＶ感染３１日後に細胞を回収した。
回収した細胞を溶解し、逆転写を、Ｃ２ＣＴキットを使用して製造業者の説明書に従って行った。ＴａｑＭａｎ定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いてＰＲＮＰの発現レベルを測定した。ＰＲＮＰ発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子ＥＩＦ４Ａ２、ＡＴＰ５Ｂ、およびＧＡＰＤＨの発現レベルの幾何平均に対して正規化した。模擬感染をネガティブコントロールとして使用した。
用量依存的な抑制は、ヒトＰＲＮＰを標的とするＺＦＰ－ＴＦを用いて示した。達成された最大の抑制は９９％以上であった一方で、プリオンの抑制の程度が低いＺＦＰ－ＴＦも同定された（例えば、最高用量で約９０％、約７５％、または約８０％）。
ヒトＰＲＮＰを標的とする１２個の例示的なＺＦＰ－ＴＦの用量依存的な活性を図８Ｂおよび８Ｃに示す。これらのデータは、前記ＺＦＰ－ＴＦが広範囲のプリオン抑制活性プロファイルを示し、試験した最高用量におけるプリオンｍＲＮＡ抑制が約７５％～９９％以上の範囲であることを示している。
実施例５：ヒトＰＲＮＰＺＦＰ－ＴＦのオフターゲット活性
広範囲の遺伝子発現に対するヒトＰＲＮＰＺＦＰ－ＴＦのオフターゲットの影響を評価するために、代表的なヒトＰＲＮＰＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶで処理したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンから単離したトータルＲＮＡを用いてマイクロアレイ実験を行った。
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを、実施例４に記載されているように処理した。マイクロアレイ分析のために、前記細胞をポリ－Ｌ－オルニチンおよびラミニンでコーティングした２４ウェルプレートに１ウェルあたり２６０，０００細胞の密度でプレーティングし、プレーティング４８時間後に１Ｅ５ ＶＧ／細胞で目的のＺＦＰ－ＴＦを発現するＡＡＶ６にてトランスフェクトし、ウイルストランスフェクション１９日後に回収した。トータルＲＮＡを回収した細胞から単離し、マイクロアレイ解析のために使用した。
オフターゲット分析は、ＧｅｎｅＴｉｔａｎ（登録商標）プラットフォーム（Ｃｌａｒｉｏｍ Ｓキット）を使用して製造業者の説明書に従って行った。アッセイ結果を、ＴＡＣソフトウェアを用いて分析した。遺伝子は、ＦＤＲ補正したｐ値が０．０５以下の場合に差次的に調節されるものとした。最小のオフターゲットを有することが公知のＺＦＰ－ＴＦと模擬トランスフェクションをネガティブコントロールとして使用した。
図８Ｄは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンで試験した１２個のヒトＰＲＮＰのＺＦＰ－ＴＦのマイクロアレイ結果を示す。広範囲のオフターゲット特異性が観察され、一部のＺＦＰ－ＴＦは、オフターゲット活性が非常に低いか、全く示さなかった。図８Ｅは、各ＺＦＰ－ＴＦについて調節不全の数を示す。広範囲のさまざまなオフターゲット特異性が観察され、一部のＺＦＰ－ＴＦは非常に低いオフターゲット活性を示した。

Claims (28)

  1. ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写リプレッサードメインを含む融合タンパク質であって、前記ＺＦＰドメインが、哺乳類のプリオンタンパク質遺伝子（ＰＲＮＰ遺伝子）における標的領域に結合する、融合タンパク質。
  2. 前記標的領域が、前記ＰＲＮＰ遺伝子における転写開始部位（ＴＳＳ）の約１ｋｂまたは５００ｂｐ以内である、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記ＰＲＮＰ遺伝子が、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、またはマウスのＰＲＮＰ遺伝子である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記ＺＦＰドメインが、６個のジンクフィンガーを含み、適宜、前記ＰＲＮＰ遺伝子の発現を、検出可能なオフターゲット結合または活性がないか、最小において、少なくとも約４０％、７５％、９０％、９５％、または９９％まで抑制する、請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  5. 前記転写リプレッサードメインが、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  6. 前記ＺＦＰドメインが、ペプチドリンカーを介して前記転写リプレッサードメインに結合している、請求項１～５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記ＺＦＰドメインが、図４および８Ａの表に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  8. 前記ＺＦＰドメインが、図４および８Ａの表における一行に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  9. 前記コーディング配列が、転写調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質のコーディング配列を含む、核酸構築物。
  10. 前記転写調節エレメントが、脳細胞において構成的に活性または誘導性である哺乳動物プロモーターであり、前記プロモーターが、適宜、ヒトシナプシンＩプロモーターである、請求項９に記載の核酸構築物。
  11. 請求項９または１０に記載の核酸構築物を含む、宿主細胞。
  12. 前記宿主細胞が、ヒト細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
  13. 前記宿主細胞が、脳細胞または多能性幹細胞であって、前記幹細胞が、適宜、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１１に記載の宿主細胞。
  14. 請求項９または１０に記載の核酸構築物を含む、組換えウイルス。
  15. 前記組換えウイルスが、適宜、血清型６または９の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１４に記載の組換えウイルス。
  16. 請求項９または１０に記載の核酸構築物、あるいは請求項１４または１５に記載の組換えウイルス、および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  17. 哺乳動物の脳細胞におけるプリオンタンパク質（ＰｒＰ）の発現を阻害するための方法であって、適宜、請求項７または８に記載の核酸構築物あるいは請求項１４または１５に記載の組換えウイルスを導入することにより、請求項１～６のいずれか１項に記載の融合タンパク質を前記細胞に導入し、それにより前記細胞におけるＰｒＰの発現を阻害することを含む、方法。
  18. 前記哺乳動物の脳細胞が、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、またはマウスの細胞である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記哺乳動物の脳細胞が、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞、または神経上皮細胞である、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 前記細胞が、プリオン病に罹患しているか、または発症するリスクのある患者の脳内にあり、前記プリオン病が、適宜、家族性、孤発性、または獲得性プリオン病である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、孤発性ＣＪＤ、変異型ＣＪＤ、ゲルストマン・ストロスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、孤発性致死性不眠症（ｓＦＩ）、クールー病、または可変プロテアーゼ感受性プリオン症（ＶＰＳＰｒ）である、請求項２０に記載の方法。
  22. 請求項１４または１５に記載の組換えウイルスを前記細胞に導入することを含む、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 請求項１５に記載の組換えＡＡＶを前記患者に投与することを含む、患者の神経変性疾患を治療し、または予防するための方法。
  24. 前記神経変性疾患が、プリオン病であって、適宜、前記プリオン病が、家族性、孤発性、または獲得性プリオン病である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ＡＡＶが、静脈内、髄腔内、脳室内、大槽内、または視床内注射、あるいはいずれかの脳領域への注射を介して患者に導入される、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、孤発性ＣＪＤ、変異型ＣＪＤ、ゲルストマン・ストロスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、孤発性致死性不眠症（ｓＦＩ）、クールー病、または可変プロテアーゼ感受性プリオン症（ＶＰＳＰｒ）である、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 請求項１７～２６のいずれか１項に記載の方法で使用するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項９または１０に記載の核酸構築物、あるいは請求項１４または１５に記載の組換えウイルス。
  28. 請求項１８～２５のいずれか１項に記載の方法における患者を治療するための薬剤の製造のための、請求項１～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項９または１０に記載の核酸構築物、あるいは請求項１４または１５に記載の組換えウイルスの使用。
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