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JP7117311B2 - Ｃｄ４７抗原結合単位およびその使用 - Google Patents

Ｃｄ４７抗原結合単位およびその使用 Download PDF

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JP7117311B2 JP2019541279A JP2019541279A JP7117311B2 JP 7117311 B2 JP7117311 B2 JP 7117311B2 JP 2019541279 A JP2019541279 A JP 2019541279A JP 2019541279 A JP2019541279 A JP 2019541279A JP 7117311 B2 JP7117311 B2 JP 7117311B2
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Description

関連出願
本願は、２０１７年１月２６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０７２７３８の優先権を主張し、この出願の内容全体が、参照によって本明細書に援用される。
本開示の背景
ＣＤ４７は、マクロファージおよび他の骨髄細胞において発現する膜貫通受容体であるＳＩＲＰαを介して阻害シグナルを送ることによって作用する、マクロファージの貪食作用に影響を与える重要な分子である。ＣＤ４７は、遍在的に発現し、マクロファージの貪食作用を妨げる「自己のマーカー」としての機能を果たす。同じ機構は、免疫学的根絶を回避するがん細胞によって利用される。実際に、ＣＤ４７の発現は、乳癌、結腸癌、肝臓癌、膀胱癌、脳癌、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、メラノーマなどの固形腫瘍、ならびにＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＣＭＬ、ＤＬＢＬ、ＦＬ、ＭＣＬ、ＭＭおよびその他などの血液がんを含む、いくつかのヒトのがんにおいて上昇している。ＣＤ４７は、マクロファージなどの骨髄細胞における阻害性膜貫通受容体であるＳＩＲＰαと相互作用する。ＣＤ４７／ＳＩＲＰαの相互作用は、双方向シグナル伝達をもたらし、マクロファージによる貪食作用の阻害を含む、異なる細胞間の応答が生じる。したがって、この相互作用の破壊は、この阻害を取り除くことができ、それによって、貪食作用が誘導される。このような相互作用を破壊する既存の薬剤は、多くの欠点を抱えている。中でも、ＣＤ４７に対する比較的低い親和性および／または選択性、ならびに望ましくない赤血球凝集を誘導する高い傾向がある。
参照による組み込み
本明細書において言及するすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願のそれぞれが、具体的かつ個々に参照により組み込まれることが示されるように、同程度で本明細書に参照により組み込まれる。
本開示の要旨
代替のＣＤ４７結合薬剤についての大きな必要性が存在している。本発明は、この必要性に取り組み、関連する利点を提供する。
本明細書において、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位であって、（ａ）ＣＤ４７と特異的に結合し；（ｂ）ＣＤ４７と結合する際にＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導し；（ｃ）１．５ｎｇ／ｍｌ～３０μｇ／ｍｌの前記抗原結合単位の濃度範囲で赤血球と混合された場合に、実質的に赤血球凝集を誘導する能力が欠如している抗原結合単位を開示する。一部の態様では、ＣＤ４７への抗原結合単位の結合は、マクロファージ細胞において発現するＳＩＲＰαへのＣＤ４７の結合を妨げる。一部の態様では、抗原結合単位は、配列番号２４０～２４１のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する。一部の態様では、抗原結合単位は、配列番号２４２～２４３のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する。一部の態様では、抗原結合単位は、配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する。一部の態様では、抗原結合単位は、ＣＤ４７を発現する細胞を利用するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいてアッセイした場合に、配列番号２４０～２４１のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較して、ＣＤ４７に対するより高い結合親和性を示す。一部の態様では、抗原結合単位は、ＣＤ４７を発現する細胞を利用するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいてアッセイした場合に、配列番号２４２～２４３のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較して、ＣＤ４７に対するより高い結合親和性を示す。一部の態様では、抗原結合単位は、ＣＤ４７を発現する細胞を利用するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいてアッセイした場合に、配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較して、ＣＤ４７に対するより高い結合親和性を示す。一部の態様では、赤血球が抗原結合単位と接触する際に誘導される赤血球凝集は、配列番号２４０～２４１のアミノ酸配列を有する抗原結合単位によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１分の１である。一部の態様では、赤血球が抗原結合単位と接触する際に誘導される赤血球凝集は、配列番号２４２～２４３のアミノ酸配列を有する抗原結合単位によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１分の１である。一部の態様では、赤血球が抗原結合単位と接触する際に誘導される赤血球凝集は、配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１分の１である。一部の態様では、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含み；重鎖ＣＤＲは、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含み；前記ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１～２２および１６２～１９０からなる群から選択される配列を有し；前記ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２３～４４および１９１～２３７からなる群から選択される配列を有する。一部の態様では、前記軽鎖ＣＤＲは、ＬＣ－ＣＤＲ配列の以下の組合せ：ａ）配列番号４、配列番号８および配列番号２１；ｂ）配列番号５、配列番号１０および配列番号１６；ｃ）配列番号６、配列番号９および配列番号１７；ｄ）配列番号２、配列番号１２および配列番号２０；ｅ）配列番号７、配列番号１１および配列番号１５；ｆ）配列番号１、配列番号１３および配列番号２２；ｇ）配列番号３、配列番号１４および配列番号１９；ｈ）配列番号１６９、配列番号１７３および配列番号１８０；ｉ）配列番号１６８、配列番号１７３および配列番号１８１；ｋ）配列番号１６５、配列番号１７７および配列番号１８２；ｌ）配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８３；ｍ）配列番号１６３、配列番号１７２および配列番号１８４；ｎ）配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８５；ｏ）配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８６；ｐ）配列番号１６３、配列番号１７０および配列番号１８７；ｑ）配列番号１６３、配列番号１７４および配列番号１８７；ｒ）配列番号１６４、配列番号１７５および配列番号１８７；ｓ）配列番号１６２、配列番号１７８および配列番号１８７；ｔ）配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８７；ｕ）配列番号１６４、配列番号１７８および配列番号１８７；ｖ）配列番号１６３、配列番号１７９および配列番号１８７；ｗ）配列番号１６６、配列番号１７６および配列番号１８８；ｘ）配列番号１６７、配列番号１７１および配列番号１８９；ならびにｙ）配列番号１６７、配列番号１７１および配列番号１９０の中から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、前記重鎖ＣＤＲは、ＨＣ－ＣＤＲ配列の以下の組合せ：ａ）配列番号２５、配列番号３２および配列番号３８；ｂ）配列番号２８、配列番号３５および配列番号３９；ｃ）配列番号２４、配列番号３４および配列番号４０；ｄ）配列番号２９、配列番号３３および配列番号４３；ｅ）配列番号２７、配列番号３０および配列番号４２；ｆ）配列番号２３、配列番号３６および配列番号４１；ｇ）配列番号２６、配列番号３１および配列番号４４；ｈ）配列番号１９１、配列番号２０７および配列番号２２６；ｉ）配列番号１９２、配列番号２２２および配列番号２３７；ｊ）配列番号１９３、配列番号２１９および配列番号２３３；ｋ）配列番号１９４、配列番号２２０および配列番号２２８；ｌ）配列番号１９５、配列番号２２１および配列番号２２９；ｍ）配列番号１９６、配列番号２１４および配列番号２２５；ｎ）配列番号１９７、配列番号２１２および配列番号２３２；ｏ）配列番号１９７、配列番号２１３および配列番号２３２；ｐ）配列番号１９８、配列番号２１０および配列番号２２４；ｑ）配列番号１９８、配列番号２０８および配列番号２３４；ｒ）配列番号１９８、配列番号２１０および配列番号２３４；ｓ）配列番号１９９、配列番号２１０および配列番号２２４；ｔ）配列番号２００、配列番号２２２および配列番号２３０；ｕ）配列番号２０１、配列番号２１０および配列番号２２４；ｖ）配列番号２０１、配列番号２１６および配列番号２２４；ｗ）配列番号２０２、配列番号２１０および配列番号２３４；ｘ）配列番号２０３、配列番号２１８および配列番号２２７；ｙ）配列番号２０４、配列番号２１１および配列番号２２４；ｚ）配列番号２０４、配列番号２１７および配列番号２２４；ａａ）配列番号２０４、配列番号２１４および配列番号２２５；ｂｂ）配列番号２０４、配列番号２１５および配列番号２３５；ｃｃ）配列番号２０４、配列番号２１４および配列番号２３６；ｄｄ）配列番号２０５、配列番号２０９および配列番号２２４；ｅｅ）配列番号２０５、配列番号２１０および配列番号２２４；ｆｆ）配列番号２０５、配列番号２２３および配列番号２３１；ならびにｇｇ）配列番号２０６、配列番号２１０および配列番号２２４の中から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、抗原結合単位は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。一部の態様では、抗原結合単位は、ｓＦｃ、Ｆｖ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２である。一部の態様では、特許請求項に記載の抗原結合単位は、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位によって認識されるエピトープへの結合について競合する。
本明細書において、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位であって、抗原結合単位が、（ａ）参照抗原結合単位の結合親和性より高い結合親和性でＣＤ４７と特異的に結合し、ＳＩＲＰαへのＣＤ４７の結合を妨げ；（ｂ）１．５ｎｇ／ｍｌ～３０μｇ／ｍｌの抗原結合単位の濃度範囲で赤血球と混合された場合に、実質的に赤血球凝集を誘導する能力が欠如しており、参照抗原の結合が、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する、抗原結合単位を開示する。一部の態様では、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含み；重鎖ＣＤＲは、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含み；前記ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１～２２および１６２～１９０からなる群から選択される配列を有し；前記ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２３～４４および１９１～２３７からなる群から選択される配列を有する。一部の態様では、前記軽鎖ＣＤＲは、ＬＣ－ＣＤＲ配列の以下の組合せ：ａ）配列番号４、配列番号８および配列番号２１；ｂ）配列番号５、配列番号１０および配列番号１６；ｃ）配列番号６、配列番号９および配列番号１７；ｄ）配列番号２、配列番号１２および配列番号２０；ｅ）配列番号７、配列番号１１および配列番号１５；ｆ）配列番号１、配列番号１３および配列番号２２；ｇ）配列番号３、配列番号１４および配列番号１９；ｈ）配列番号１６９、配列番号１７３および配列番号１８０；ｉ）配列番号１６８、配列番号１７３および配列番号１８１；ｋ）配列番号１６５、配列番号１７７および配列番号１８２；ｌ）配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８３；ｍ）配列番号１６３、配列番号１７２および配列番号１８４；ｎ）配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８５；ｏ）配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８６；ｐ）配列番号１６３、配列番号１７０および配列番号１８７；ｑ）配列番号１６３、配列番号１７４および配列番号１８７；ｒ）配列番号１６４、配列番号１７５および配列番号１８７；ｓ）配列番号１６２、配列番号１７８および配列番号１８７；ｔ）配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８７；ｕ）配列番号１６４、配列番号１７８および配列番号１８７；ｖ）配列番号１６３、配列番号１７９および配列番号１８７；ｗ）配列番号１６６、配列番号１７６および配列番号１８８；ｘ）配列番号１６７、配列番号１７１および配列番号１８９；ならびにｙ）配列番号１６７、配列番号１７１および配列番号１９０の中から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、前記重鎖ＣＤＲは、ＨＣ－ＣＤＲ配列の以下の組合せ：ａ）配列番号２５、配列番号３２および配列番号３８；ｂ）配列番号２８、配列番号３５および配列番号３９；ｃ）配列番号２４、配列番号３４および配列番号４０；ｄ）配列番号２９、配列番号３３および配列番号４３；ｅ）配列番号２７、配列番号３０および配列番号４２；ｆ）配列番号２３、配列番号３６および配列番号４１；ｇ）配列番号２６、配列番号３１および配列番号４４；ｈ）配列番号１９１、配列番号２０７および配列番号２２６；ｉ）配列番号１９２、配列番号２２２および配列番号２３７；ｊ）配列番号１９３、配列番号２１９および配列番号２３３；ｋ）配列番号１９４、配列番号２２０および配列番号２２８；ｌ）配列番号１９５、配列番号２２１および配列番号２２９；ｍ）配列番号１９６、配列番号２１４および配列番号２２５；ｎ）配列番号１９７、配列番号２１２および配列番号２３２；ｏ）配列番号１９７、配列番号２１３および配列番号２３２；ｐ）配列番号１９８、配列番号２１０および配列番号２２４；ｑ）配列番号１９８、配列番号２０８および配列番号２３４；ｒ）配列番号１９８、配列番号２１０および配列番号２３４；ｓ）配列番号１９９、配列番号２１０および配列番号２２４；ｔ）配列番号２００、配列番号２２２および配列番号２３０；ｕ）配列番号２０１、配列番号２１０および配列番号２２４；ｖ）配列番号２０１、配列番号２１６および配列番号２２４；ｗ）配列番号２０２、配列番号２１０および配列番号２３４；ｘ）配列番号２０３、配列番号２１８および配列番号２２７；ｙ）配列番号２０４、配列番号２１１および配列番号２２４；ｚ）配列番号２０４、配列番号２１７および配列番号２２４；ａａ）配列番号２０４、配列番号２１４および配列番号２２５；ｂｂ）配列番号２０４、配列番号２１５および配列番号２３５；ｃｃ）配列番号２０４、配列番号２１４および配列番号２３６；ｄｄ）配列番号２０５、配列番号２０９および配列番号２２４；ｅｅ）配列番号２０５、配列番号２１０および配列番号２２４；ｆｆ）配列番号２０５、配列番号２２３および配列番号２３１；ならびにｇｇ）配列番号２０６、配列番号２１０および配列番号２２４の中から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、抗原結合単位は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または二重特異性抗体である。一部の態様では、抗原結合単位は、ｓＦｃ、Ｆｖ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２である。
本明細書において、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位であって、抗原結合単位が、（ａ）ＣＤ４７と特異的に結合し；（ｂ）参照抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７と結合する際にＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導し、参照抗原結合単位が、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する、抗原結合単位を開示する。一部の態様では、抗原結合単位は、配列番号２４０～２４１のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する。一部の態様では、抗原結合単位は、配列番号２４２～２４３のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する。一部の態様では、抗原結合単位は、配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する。一部の態様では、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含み；重鎖ＣＤＲは、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３の重鎖を含み；前記ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１～２２および１６２～１９０からなる群から選択される配列を有し；前記ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２３～４４および１９１～２３７からなる群から選択される配列を有する。一部の態様では、前記軽鎖ＣＤＲは、ＬＣ－ＣＤＲ配列の以下の組合せ：ａ）配列番号４、配列番号８および配列番号２１；ｂ）配列番号５、配列番号１０および配列番号１６；ｃ）配列番号６、配列番号９および配列番号１７；ｄ）配列番号２、配列番号１２および配列番号２０；ｅ）配列番号７、配列番号１１および配列番号１５；ｆ）配列番号１、配列番号１３および配列番号２２；ｇ）配列番号３、配列番号１４および配列番号１９；ｈ）配列番号１６９、配列番号１７３および配列番号１８０；ｉ）配列番号１６８、配列番号１７３および配列番号１８１；ｋ）配列番号１６５、配列番号１７７および配列番号１８２；ｌ）配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８３；ｍ）配列番号１６３、配列番号１７２および配列番号１８４；ｎ）配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８５；ｏ）配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８６；ｐ）配列番号１６３、配列番号１７０および配列番号１８７；ｑ）配列番号１６３、配列番号１７４および配列番号１８７；ｒ）配列番号１６４、配列番号１７５および配列番号１８７；ｓ）配列番号１６２、配列番号１７８および配列番号１８７；ｔ）配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８７；ｕ）配列番号１６４、配列番号１７８および配列番号１８７；ｖ）配列番号１６３、配列番号１７９および配列番号１８７；ｗ）配列番号１６６、配列番号１７６および配列番号１８８；ｘ）配列番号１６７、配列番号１７１および配列番号１８９；ならびにｙ）配列番号１６７、配列番号１７１および配列番号１９０の中から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、前記重鎖ＣＤＲは、ＨＣ－ＣＤＲ配列の以下の組合せ：ａ）配列番号２５、配列番号３２および配列番号３８；ｂ）配列番号２８、配列番号３５および配列番号３９；ｃ）配列番号２４、配列番号３４および配列番号４０；ｄ）配列番号２９、配列番号３３および配列番号４３；ｅ）配列番号２７、配列番号３０および配列番号４２；ｆ）配列番号２３、配列番号３６および配列番号４１；ｇ）配列番号２６、配列番号３１および配列番号４４；ｈ）配列番号１９１、配列番号２０７および配列番号２２６；ｉ）配列番号１９２、配列番号２２２および配列番号２３７；ｊ）配列番号１９３、配列番号２１９および配列番号２３３；ｋ）配列番号１９４、配列番号２２０および配列番号２２８；ｌ）配列番号１９５、配列番号２２１および配列番号２２９；ｍ）配列番号１９６、配列番号２１４および配列番号２２５；ｎ）配列番号１９７、配列番号２１２および配列番号２３２；ｏ）配列番号１９７、配列番号２１３および配列番号２３２；ｐ）配列番号１９８、配列番号２１０および配列番号２２４；ｑ）配列番号１９８、配列番号２０８および配列番号２３４；ｒ）配列番号１９８、配列番号２１０および配列番号２３４；ｓ）配列番号１９９、配列番号２１０および配列番号２２４；ｔ）配列番号２００、配列番号２２２および配列番号２３０；ｕ）配列番号２０１、配列番号２１０および配列番号２２４；ｖ）配列番号２０１、配列番号２１６および配列番号２２４；ｗ）配列番号２０２、配列番号２１０および配列番号２３４；ｘ）配列番号２０３、配列番号２１８および配列番号２２７；ｙ）配列番号２０４、配列番号２１１および配列番号２２４；ｚ）配列番号２０４、配列番号２１７および配列番号２２４；ａａ）配列番号２０４、配列番号２１４および配列番号２２５；ｂｂ）配列番号２０４、配列番号２１５および配列番号２３５；ｃｃ）配列番号２０４、配列番号２１４および配列番号２３６；ｄｄ）配列番号２０５、配列番号２０９および配列番号２２４；ｅｅ）配列番号２０５、配列番号２１０および配列番号２２４；ｆｆ）配列番号２０５、配列番号２２３および配列番号２３１；ならびにｇｇ）配列番号２０６、配列番号２１０および配列番号２２４の中から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、抗原結合単位は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または二重特異性抗体である。一部の態様では、抗原結合単位は、ｓＦｃ、Ｆｖ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２である。
本明細書において、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位であって、軽鎖ＣＤＲが、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含み；重鎖ＣＤＲが、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含み、前記ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１～２２および１６２～１９０からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列相同性を共有する配列を含み、前記ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２３～４４および１９１～２３７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含む、抗原結合単位を開示する。一部の態様では、前記軽鎖ＣＤＲおよび前記重鎖ＣＤＲは、それぞれ、ａ）配列番号５４および配列番号５５；ｂ）配列番号６５および配列番号６３；ｃ）配列番号５８および配列番号６４；ｄ）配列番号６８および配列番号６０；ｅ）配列番号６６および配列番号６１；ｆ）配列番号５７および配列番号６２；ｇ）配列番号５６および配列番号５９；ｈ）配列番号８５および配列番号８６；ｉ）配列番号８７および配列番号８８；ｊ）配列番号８９および配列番号９０；ｋ）配列番号９１および配列番号９２；ｌ）配列番号９３および配列番号９４；ｍ）配列番号９５および配列番号９６；ｎ）配列番号９７および配列番号９８；ｏ）配列番号９９および配列番号１００；ｐ）配列番号１０１および配列番号１０２；ｑ）配列番号１０３および配列番号１０４；ｒ）配列番号１０５および配列番号１０６；ｓ）配列番号１０７および配列番号１０８；ｔ）配列番号１０９および配列番号１１０；ｕ）配列番号１１１および配列番号１１２；ｖ）配列番号１１３および配列番号１１４；ｗ）配列番号１１５および配列番号１１６；ｘ）配列番号１１７および配列番号１１８；ｙ）配列番号１１９および配列番号１２０；ｚ）配列番号１２１および配列番号１２２；ａａ）配列番号１２３および配列番号１２４；ｂｂ）配列番号１２５および配列番号１２６；ｃｃ）配列番号１２７および配列番号１２８；ｄｄ）配列番号１２９および配列番号１３０；ｅｅ）配列番号１３１および配列番号１３２；ｆｆ）配列番号１３３および配列番号１３４；ｇｇ）配列番号１３５および配列番号１３６；ｈｈ）配列番号１３７および配列番号１３８；ｉｉ）配列番号１３９および配列番号１４０；ｊｊ）配列番号１４１および配列番号１４２；ｋｋ）配列番号１４３および配列番号１４４；ｌｌ）配列番号１４５および配列番号１４６；ｍｍ）配列番号１４７および配列番号１４８；ｎｎ）配列番号２３８および配列番号２３９；ｏｏ）配列番号４７および配列番号７０；ｐｐ）配列番号４９および配列番号７３；ｑｑ）配列番号７１および配列番号５１；ｒｒ）配列番号５０および配列番号７４；ｓｓ）配列番号４５および配列番号５３；ｔｔ）配列番号６７および配列番号７２；ｕｕ）配列番号６９および配列番号５２；ｖｖ）配列番号４６および配列番号７７；ｗｗ）配列番号４６および配列番号７８；ｘｘ）配列番号４６および配列番号７９；ｙｙ）配列番号４８および配列番号７５；ｚｚ）配列番号４８および配列番号７６；ａａａ）配列番号４８および配列番号８０；ならびにｂｂｂ）表１に記載される任意の配列のペアからなる群から選択されるＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲを含む。一部の態様では、抗原結合単位は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または二重特異性抗体である。一部の態様では、抗原結合単位は、ｓＦｃ、ＦｖまたはＦａｂである。
本明細書において、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれか１つおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を開示する。
本明細書において、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれか１つをコードする単離された核酸を開示する。
本明細書において、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれか１つをコードする核酸配列を含むベクターを開示する。
本明細書において、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれか１つを発現する宿主細胞を開示する。
本明細書において、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれか１つをコードする核酸を含む宿主細胞を開示する。
本明細書において、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれか１つを製造する方法であって、抗原結合単位を発現させるために適切な条件下、本明細書に開示される宿主細胞のいずれかを培養すること；および宿主細胞によって発現される前記抗原結合単位を単離することを含む、方法を開示する。
本明細書において、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する方法であって、細胞を本明細書に開示される抗原結合単位のいずれか１つと接触させることを含む、方法を開示する。一部の態様では、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用は、少なくとも５％の効率で生じる。一部の態様では、抗原結合単位は、著しい赤血球凝集を引き起こさない。一部の態様では、細胞はがん細胞である。一部の態様では、細胞は、非リンパ腫および非白血病のがん細胞である。
本明細書において、ヒト対象においてＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する方法であって、ヒト対象に本明細書に開示される医薬組成物のいずれか１つを投与することを含む、方法を開示する。一部の態様では、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用は、少なくとも５％の効率で生じる。一部の態様では、抗原結合単位は、著しい赤血球凝集を引き起こさない。一部の態様では、細胞はがん細胞である。一部の態様では、細胞は、非リンパ腫および非白血病のがん細胞である。一部の態様では、細胞は、血液がん細胞または固形腫瘍細胞である。
本明細書において、がんを処置することを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれか１つの有効量を対象に投与することを含む、方法を開示する。一部の態様では、この方法は、治療用抗体を投与することをさらに含む。一部の態様では、治療用抗体は抗ＣＤ２０抗体である。一部の態様では、がんを処置することは、腫瘍体積を減少させることを含む。一部の態様では、腫瘍体積は、配列番号２４０および２４１、または配列番号２４２および２４３、または配列番号２４４および２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで減少する。
本明細書において、がんを処置することを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、本明細書に開示される医薬組成物のいずれか１つの有効量を対象に投与することを含む、方法を開示する。一部の態様では、がんは、血液がんまたは固形腫瘍である。一部の態様では、この方法は、治療用抗体を投与することをさらに含む。一部の態様では、治療用抗体は抗ＣＤ２０抗体である。一部の態様では、がんを処置することは、腫瘍体積を減少させることを含む。一部の態様では、腫瘍体積は、配列番号２４０および２４１、または配列番号２４２および２４３、または配列番号２４４および２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで減少する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位であって、（ａ）ＣＤ４７と特異的に結合し；（ｂ）ＣＤ４７と結合する際にＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導し；（ｃ）１．５ｎｇ／ｍｌ～３０μｇ／ｍｌの前記抗原結合単位の濃度範囲で赤血球と混合された場合に、実質的に赤血球凝集を誘導する能力が欠如している抗原結合単位。
（項目２）
ＣＤ４７への前記抗原結合単位の結合が、マクロファージ細胞において発現するＳＩＲＰαへのＣＤ４７の結合を妨げる、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目３）
配列番号２４０～２４１のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目４）
配列番号２４２～２４３のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目５）
配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目６）
ＣＤ４７を発現する細胞を利用するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいてアッセイした場合に、配列番号２４０～２４１のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較して、ＣＤ４７に対するより高い結合親和性を示す、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目７）
ＣＤ４７を発現する細胞を利用するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいてアッセイした場合に、配列番号２４２～２４３のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較して、ＣＤ４７に対するより高い結合親和性を示す、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目８）
ＣＤ４７を発現する細胞を利用するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいてアッセイした場合に、配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較して、ＣＤ４７に対するより高い結合親和性を示す、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目９）
赤血球が前記抗原結合単位と接触する際に誘導される赤血球凝集が、配列番号２４０～２４１のアミノ酸配列を有する抗原結合単位によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１分の１である、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目１０）
赤血球が前記抗原結合単位と接触する際に誘導される赤血球凝集が、配列番号２４２～２４３のアミノ酸配列を有する抗原結合単位によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１分の１である、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目１１）
赤血球が前記抗原結合単位と接触する際に誘導される赤血球凝集が、配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１分の１である、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目１２）
前記軽鎖ＣＤＲが、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含み；前記重鎖ＣＤＲが、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含み；
前記ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１～２２および１６２～１９０からなる群から選択される配列を有し；
前記ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２３～４４および１９１～２３７からなる群から選択される配列を有する、
項目１に記載の抗原結合単位。
（項目１３）
前記軽鎖ＣＤＲが、ＬＣ－ＣＤＲ配列の以下の組合せ：
ｉ．配列番号４、配列番号８および配列番号２１；
ｉｉ．配列番号５、配列番号１０および配列番号１６；
ｉｉｉ．配列番号６、配列番号９および配列番号１７；
ｉｖ．配列番号２、配列番号１２および配列番号２０；
ｖ．配列番号７、配列番号１１および配列番号１５；
ｖｉ．配列番号１、配列番号１３および配列番号２２；
ｖｉｉ．配列番号３、配列番号１４および配列番号１９；
ｖｉｉｉ．配列番号１６９、配列番号１７３および配列番号１８０；
ｉｘ．配列番号１６８、配列番号１７３および配列番号１８１；
ｘ．配列番号１６５、配列番号１７７および配列番号１８２；
ｘｉ．配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８３；
ｘｉｉ．配列番号１６３、配列番号１７２および配列番号１８４；
ｘｉｉｉ．配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８５；
ｘｉｖ．配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８６；
ｘｖ．配列番号１６３、配列番号１７０および配列番号１８７；
ｘｖｉ．配列番号１６３、配列番号１７４および配列番号１８７；
ｘｖｉｉ．配列番号１６４、配列番号１７５および配列番号１８７；
ｘｖｉｉｉ．配列番号１６２、配列番号１７８および配列番号１８７；
ｘｉｘ．配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８７；
ｘｘ．配列番号１６４、配列番号１７８および配列番号１８７；
ｘｘｉ．配列番号１６３、配列番号１７９および配列番号１８７；
ｘｘｉｉ．配列番号１６６、配列番号１７６および配列番号１８８；
ｘｘｉｉｉ．配列番号１６７、配列番号１７１および配列番号１８９；ならびに
ｘｘｉｖ．配列番号１６７、配列番号１７１および配列番号１９０
の中から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１２に記載の抗原結合単位。
（項目１４）
前記重鎖ＣＤＲが、ＨＣ－ＣＤＲ配列の以下の組合せ：
ｉ．配列番号２５、配列番号３２および配列番号３８；
ｉｉ．配列番号２８、配列番号３５および配列番号３９；
ｉｉｉ．配列番号２４、配列番号３４および配列番号４０；
ｉｖ．配列番号２９、配列番号３３および配列番号４３；
ｖ．配列番号２７、配列番号３０および配列番号４２；
ｖｉ．配列番号２３、配列番号３６および配列番号４１；
ｖｉｉ．配列番号２６、配列番号３１および配列番号４４；
ｖｉｉｉ．配列番号１９１、配列番号２０７および配列番号２２６；
ｉｘ．配列番号１９２、配列番号２２２および配列番号２３７；
ｘ．配列番号１９３、配列番号２１９および配列番号２３３；
ｘｉ．配列番号１９４、配列番号２２０および配列番号２２８；
ｘｉｉ．配列番号１９５、配列番号２２１および配列番号２２９；
ｘｉｉｉ．配列番号１９６、配列番号２１４および配列番号２２５；
ｘｉｖ．配列番号１９７、配列番号２１２および配列番号２３２；
ｘｖ．配列番号１９７、配列番号２１３および配列番号２３２；
ｘｖｉ．配列番号１９８、配列番号２１０および配列番号２２４；
ｘｖｉｉ．配列番号１９８、配列番号２０８および配列番号２３４；
ｘｖｉｉｉ．配列番号１９８、配列番号２１０および配列番号２３４；
ｘｉｘ．配列番号１９９、配列番号２１０および配列番号２２４；
ｘｘ．配列番号２００、配列番号２２２および配列番号２３０；
ｘｘｉ．配列番号２０１、配列番号２１０および配列番号２２４；
ｘｘｉｉ．配列番号２０１、配列番号２１６および配列番号２２４；
ｘｘｉｉｉ．配列番号２０２、配列番号２１０および配列番号２３４；
ｘｘｉｖ．配列番号２０３、配列番号２１８および配列番号２２７；
ｘｘｖ．配列番号２０４、配列番号２１１および配列番号２２４；
ｘｘｖｉ．配列番号２０４、配列番号２１７および配列番号２２４；
ｘｘｖｉｉ．配列番号２０４、配列番号２１４および配列番号２２５；
ｘｘｖｉｉｉ．配列番号２０４、配列番号２１５および配列番号２３５；
ｘｘｉｘ．配列番号２０４、配列番号２１４および配列番号２３６；
ｘｘｘ．配列番号２０５、配列番号２０９および配列番号２２４；
ｘｘｘｉ．配列番号２０５、配列番号２１０および配列番号２２４；
ｘｘｘｉｉ．配列番号２０５、配列番号２２３および配列番号２３１；ならびに
ｘｘｘｉｉｉ．配列番号２０６、配列番号２１０および配列番号２２４
の中から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１２に記載の抗原結合単位。
（項目１５）
モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目１６）
ｓＦｃ、Ｆｖ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２である、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目１７）
１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位によって認識されるエピトープへの結合について競合する、項目１に記載の抗原結合単位。
（項目１８）
軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位であって、前記抗原結合単位が、（ａ）参照抗原結合単位の結合親和性より高い結合親和性でＣＤ４７と特異的に結合し、ＳＩＲＰαへのＣＤ４７の結合を妨げ；（ｂ）１．５ｎｇ／ｍｌ～３０μｇ／ｍｌの抗原結合単位の濃度範囲で赤血球と混合された場合に、実質的に赤血球凝集を誘導する能力が欠如しており、前記参照抗原結合が、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する、抗原結合単位。
（項目１９）
前記軽鎖ＣＤＲが、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含み；前記重鎖ＣＤＲが、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含み；
前記ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１～２２および１６２～１９０からなる群から選択される配列を有し；
前記ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２３～４４および１９１～２３７からなる群から選択される配列を有する、
項目１８に記載の抗原結合単位。
（項目２０）
前記軽鎖ＣＤＲが、ＬＣ－ＣＤＲ配列の以下の組合せ：
ｉ．配列番号４、配列番号８および配列番号２１；
ｉｉ．配列番号５、配列番号１０および配列番号１６；
ｉｉｉ．配列番号６、配列番号９および配列番号１７；
ｉｖ．配列番号２、配列番号１２および配列番号２０；
ｖ．配列番号７、配列番号１１および配列番号１５；
ｖｉ．配列番号１、配列番号１３および配列番号２２；
ｖｉｉ．配列番号３、配列番号１４および配列番号１９；
ｖｉｉｉ．配列番号１６９、配列番号１７３および配列番号１８０；
ｉｘ．配列番号１６８、配列番号１７３および配列番号１８１；
ｘ．配列番号１６５、配列番号１７７および配列番号１８２；
ｘｉ．配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８３；
ｘｉｉ．配列番号１６３、配列番号１７２および配列番号１８４；
ｘｉｉｉ．配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８５；
ｘｉｖ．配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８６；
ｘｖ．配列番号１６３、配列番号１７０および配列番号１８７；
ｘｖｉ．配列番号１６３、配列番号１７４および配列番号１８７；
ｘｖｉｉ．配列番号１６４、配列番号１７５および配列番号１８７；
ｘｖｉｉｉ．配列番号１６２、配列番号１７８および配列番号１８７；
ｘｉｘ．配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８７；
ｘｘ．配列番号１６４、配列番号１７８および配列番号１８７；
ｘｘｉ．配列番号１６３、配列番号１７９および配列番号１８７；
ｘｘｉｉ．配列番号１６６、配列番号１７６および配列番号１８８；
ｘｘｉｉｉ．配列番号１６７、配列番号１７１および配列番号１８９；ならびに
ｘｘｉｖ．配列番号１６７、配列番号１７１および配列番号１９０
の中から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１９に記載の抗原結合単位。
（項目２１）
前記重鎖ＣＤＲが、ＨＣ－ＣＤＲ配列の以下の組合せ：
ｉ．配列番号２５、配列番号３２および配列番号３８；
ｉｉ．配列番号２８、配列番号３５および配列番号３９；
ｉｉｉ．配列番号２４、配列番号３４および配列番号４０；
ｉｖ．配列番号２９、配列番号３３および配列番号４３；
ｖ．配列番号２７、配列番号３０および配列番号４２；
ｖｉ．配列番号２３、配列番号３６および配列番号４１；
ｖｉｉ．配列番号２６、配列番号３１および配列番号４４；
ｖｉｉｉ．配列番号１９１、配列番号２０７および配列番号２２６；
ｉｘ．配列番号１９２、配列番号２２２および配列番号２３７；
ｘ．配列番号１９３、配列番号２１９および配列番号２３３；
ｘｉ．配列番号１９４、配列番号２２０および配列番号２２８；
ｘｉｉ．配列番号１９５、配列番号２２１および配列番号２２９；
ｘｉｉｉ．配列番号１９６、配列番号２１４および配列番号２２５；
ｘｉｖ．配列番号１９７、配列番号２１２および配列番号２３２；
ｘｖ．配列番号１９７、配列番号２１３および配列番号２３２；
ｘｖｉ．配列番号１９８、配列番号２１０および配列番号２２４；
ｘｖｉｉ．配列番号１９８、配列番号２０８および配列番号２３４；
ｘｖｉｉｉ．配列番号１９８、配列番号２１０および配列番号２３４；
ｘｉｘ．配列番号１９９、配列番号２１０および配列番号２２４；
ｘｘ．配列番号２００、配列番号２２２および配列番号２３０；
ｘｘｉ．配列番号２０１、配列番号２１０および配列番号２２４；
ｘｘｉｉ．配列番号２０１、配列番号２１６および配列番号２２４；
ｘｘｉｉｉ．配列番号２０２、配列番号２１０および配列番号２３４；
ｘｘｉｖ．配列番号２０３、配列番号２１８および配列番号２２７；
ｘｘｖ．配列番号２０４、配列番号２１１および配列番号２２４；
ｘｘｖｉ．配列番号２０４、配列番号２１７および配列番号２２４；
ｘｘｖｉｉ．配列番号２０４、配列番号２１４および配列番号２２５；
ｘｘｖｉｉｉ．配列番号２０４、配列番号２１５および配列番号２３５；
ｘｘｉｘ．配列番号２０４、配列番号２１４および配列番号２３６；
ｘｘｘ．配列番号２０５、配列番号２０９および配列番号２２４；
ｘｘｘｉ．配列番号２０５、配列番号２１０および配列番号２２４；
ｘｘｘｉｉ．配列番号２０５、配列番号２２３および配列番号２３１；ならびに
ｘｘｘｉｉｉ．配列番号２０６、配列番号２１０および配列番号２２４
の中から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１９に記載の抗原結合単位。
（項目２２）
モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または二重特異性抗体である、項目１８に記載の抗原結合単位。
（項目２３）
ｓＦｃ、Ｆｖ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２である、項目１８に記載の抗原結合単位。
（項目２４）
軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位であって、前記抗原結合単位が、（ａ）ＣＤ４７と特異的に結合し；（ｂ）参照抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７と結合する際にＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導し、前記参照抗原結合単位が、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する、抗原結合単位。
（項目２５）
配列番号２４０～２４１のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する、項目２４に記載の抗原結合単位。
（項目２６）
配列番号２４２～２４３のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する、項目２４に記載の抗原結合単位。
（項目２７）
配列番号２４４～２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する、項目２４に記載の抗原結合単位。
（項目２８）
前記軽鎖ＣＤＲが、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含み；前記重鎖ＣＤＲが、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３の重鎖を含み；前記ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１～２２および１６２～１９０からなる群から選択される配列を有し；
前記ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２３～４４および１９１～２３７からなる群から選択される配列を有する、
項目２４に記載の抗原結合単位。
（項目２９）
前記軽鎖ＣＤＲが、ＬＣ－ＣＤＲ配列の以下の組合せ：
ｉ．配列番号４、配列番号８および配列番号２１；
ｉｉ．配列番号５、配列番号１０および配列番号１６；
ｉｉｉ．配列番号６、配列番号９および配列番号１７；
ｉｖ．配列番号２、配列番号１２および配列番号２０；
ｖ．配列番号７、配列番号１１および配列番号１５；
ｖｉ．配列番号１、配列番号１３および配列番号２２；
ｖｉｉ．配列番号３、配列番号１４および配列番号１９；
ｖｉｉｉ．配列番号１６９、配列番号１７３および配列番号１８０；
ｉｘ．配列番号１６８、配列番号１７３および配列番号１８１；
ｘ．配列番号１６５、配列番号１７７および配列番号１８２；
ｘｉ．配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８３；
ｘｉｉ．配列番号１６３、配列番号１７２および配列番号１８４；
ｘｉｉｉ．配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８５；
ｘｉｖ．配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８６；
ｘｖ．配列番号１６３、配列番号１７０および配列番号１８７；
ｘｖｉ．配列番号１６３、配列番号１７４および配列番号１８７；
ｘｖｉｉ．配列番号１６４、配列番号１７５および配列番号１８７；
ｘｖｉｉｉ．配列番号１６２、配列番号１７８および配列番号１８７；
ｘｉｘ．配列番号１６３、配列番号１７８および配列番号１８７；
ｘｘ．配列番号１６４、配列番号１７８および配列番号１８７；
ｘｘｉ．配列番号１６３、配列番号１７９および配列番号１８７；
ｘｘｉｉ．配列番号１６６、配列番号１７６および配列番号１８８；
ｘｘｉｉｉ．配列番号１６７、配列番号１７１および配列番号１８９；ならびに
ｘｘｉｖ．配列番号１６７、配列番号１７１および配列番号１９０
の中から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２８に記載の抗原結合単位。
（項目３０）
前記重鎖ＣＤＲが、ＨＣ－ＣＤＲ配列の以下の組合せ：
ｉ．配列番号２５、配列番号３２および配列番号３８；
ｉｉ．配列番号２８、配列番号３５および配列番号３９；
ｉｉｉ．配列番号２４、配列番号３４および配列番号４０；
ｉｖ．配列番号２９、配列番号３３および配列番号４３；
ｖ．配列番号２７、配列番号３０および配列番号４２；
ｖｉ．配列番号２３、配列番号３６および配列番号４１；
ｖｉｉ．配列番号２６、配列番号３１および配列番号４４；
ｖｉｉｉ．配列番号１９１、配列番号２０７および配列番号２２６；
ｉｘ．配列番号１９２、配列番号２２２および配列番号２３７；
ｘ．配列番号１９３、配列番号２１９および配列番号２３３；
ｘｉ．配列番号１９４、配列番号２２０および配列番号２２８；
ｘｉｉ．配列番号１９５、配列番号２２１および配列番号２２９；
ｘｉｉｉ．配列番号１９６、配列番号２１４および配列番号２２５；
ｘｉｖ．配列番号１９７、配列番号２１２および配列番号２３２；
ｘｖ．配列番号１９７、配列番号２１３および配列番号２３２；
ｘｖｉ．配列番号１９８、配列番号２１０および配列番号２２４；
ｘｖｉｉ．配列番号１９８、配列番号２０８および配列番号２３４；
ｘｖｉｉｉ．配列番号１９８、配列番号２１０および配列番号２３４；
ｘｉｘ．配列番号１９９、配列番号２１０および配列番号２２４；
ｘｘ．配列番号２００、配列番号２２２および配列番号２３０；
ｘｘｉ．配列番号２０１、配列番号２１０および配列番号２２４；
ｘｘｉｉ．配列番号２０１、配列番号２１６および配列番号２２４；
ｘｘｉｉｉ．配列番号２０２、配列番号２１０および配列番号２３４；
ｘｘｉｖ．配列番号２０３、配列番号２１８および配列番号２２７；
ｘｘｖ．配列番号２０４、配列番号２１１および配列番号２２４；
ｘｘｖｉ．配列番号２０４、配列番号２１７および配列番号２２４；
ｘｘｖｉｉ．配列番号２０４、配列番号２１４および配列番号２２５；
ｘｘｖｉｉｉ．配列番号２０４、配列番号２１５および配列番号２３５；
ｘｘｉｘ．配列番号２０４、配列番号２１４および配列番号２３６；
ｘｘｘ．配列番号２０５、配列番号２０９および配列番号２２４；
ｘｘｘｉ．配列番号２０５、配列番号２１０および配列番号２２４；
ｘｘｘｉｉ．配列番号２０５、配列番号２２３および配列番号２３１；ならびに
ｘｘｘｉｉｉ．配列番号２０６、配列番号２１０および配列番号２２４
の中から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２８に記載の抗原結合単位。
（項目３１）
モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または二重特異性抗体である、項目２４に記載の抗原結合単位。
（項目３２）
ｓＦｃ、Ｆｖ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２である、項目２４に記載の抗原結合単位。
（項目３３）
軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位であって、前記軽鎖ＣＤＲが、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含み；前記重鎖ＣＤＲが、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含み、前記ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１～２２および１６２～１９０からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列相同性を共有する配列を含み、前記ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２３～４４および１９１～２３７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含む、抗原結合単位。
（項目３４）
前記軽鎖ＣＤＲおよび前記重鎖ＣＤＲが、それぞれ、
ａ．配列番号５４および配列番号５５；
ｂ．配列番号６５および配列番号６３；
ｃ．配列番号５８および配列番号６４；
ｄ．配列番号６８および配列番号６０；
ｅ．配列番号６６および配列番号６１；
ｆ．配列番号５７および配列番号６２；
ｇ．配列番号５６および配列番号５９；
ｈ．配列番号８５および配列番号８６；
ｉ．配列番号８７および配列番号８８；
ｊ．配列番号８９および配列番号９０；
ｋ．配列番号９１および配列番号９２；
ｌ．配列番号９３および配列番号９４；
ｍ．配列番号９５および配列番号９６；
ｎ．配列番号９７および配列番号９８；
ｏ．配列番号９９および配列番号１００；
ｐ．配列番号１０１および配列番号１０２；
ｑ．配列番号１０３および配列番号１０４；
ｒ．配列番号１０５および配列番号１０６；
ｓ．配列番号１０７および配列番号１０８；
ｔ．配列番号１０９および配列番号１１０；
ｕ．配列番号１１１および配列番号１１２；
ｖ．配列番号１１３および配列番号１１４；
ｗ．配列番号１１５および配列番号１１６；
ｘ．配列番号１１７および配列番号１１８；
ｙ．配列番号１１９および配列番号１２０；
ｚ．配列番号１２１および配列番号１２２；
ａａ．配列番号１２３および配列番号１２４；
ｂｂ．配列番号１２５および配列番号１２６；
ｃｃ．配列番号１２７および配列番号１２８；
ｄｄ．配列番号１２９および配列番号１３０；
ｅｅ．配列番号１３１および配列番号１３２；
ｆｆ．配列番号１３３および配列番号１３４；
ｇｇ．配列番号１３５および配列番号１３６；
ｈｈ．配列番号１３７および配列番号１３８；
ｉｉ．配列番号１３９および配列番号１４０；
ｊｊ．配列番号１４１および配列番号１４２；
ｋｋ．配列番号１４３および配列番号１４４；
ｌｌ．配列番号１４５および配列番号１４６；
ｍｍ．配列番号１４７および配列番号１４８；
ｎｎ．配列番号２３８および配列番号２３９
ｏｏ．配列番号４７および配列番号７０；
ｐｐ．配列番号４９および配列番号７３；
ｑｑ．配列番号７１および配列番号５１；
ｒｒ．配列番号５０および配列番号７４；
ｓｓ．配列番号４５および配列番号５３；
ｔｔ．配列番号６７および配列番号７２；
ｕｕ．配列番号６９および配列番号５２；
ｖｖ．配列番号４６および配列番号７７；
ｗｗ．配列番号４６および配列番号７８；
ｘｘ．配列番号４６および配列番号７９；
ｙｙ．配列番号４８および配列番号７５；
ｚｚ．配列番号４８および配列番号７６；
ａａａ．配列番号４８および配列番号８０；ならびに
ｂｂｂ．表１に記載される任意の配列のペア
からなる群から選択されるＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲを含む、項目３３に記載の抗原結合単位。
（項目３５）
モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または二重特異性抗体である、項目３３に記載の抗原結合単位。
（項目３６）
ｓＦｃ、ＦｖまたはＦａｂである、項目３３に記載の抗原結合単位。
（項目３７）
項目１～３６のいずれか一項に記載の抗原結合単位および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
（項目３８）
項目１～３６のいずれか一項に記載の抗原結合単位をコードする単離された核酸。
（項目３９）
項目１～３６のいずれか一項に記載の抗原結合単位をコードする核酸配列を含むベクター。
（項目４０）
項目１～３６のいずれか一項に記載の抗原結合単位を発現する宿主細胞。
（項目４１）
項目１～３６のいずれか一項に記載の抗原結合単位をコードする核酸を含む宿主細胞。
（項目４２）
項目１～３６のいずれか一項に記載の抗原結合単位を製造する方法であって、前記抗原結合単位を発現させるために適切な条件下、項目４０または４１に記載の宿主細胞を培養すること；および前記宿主細胞によって発現される前記抗原結合単位を単離することを含む、方法。
（項目４３）
ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する方法であって、前記細胞を項目１～３６のいずれか一項に記載の抗原結合単位と接触させることを含む、方法。
（項目４４）
ヒト対象においてＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する方法であって、前記ヒト対象に項目３７に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
（項目４５）
ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用が５％の効率で生じる、項目４３または４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記抗原結合単位が、著しい赤血球凝集を引き起こさない、項目４３または４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記細胞ががん細胞である、項目４３または４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記細胞が非リンパ腫および非白血病のがん細胞である、項目４３または４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記細胞が血液がん細胞または固形腫瘍細胞である、項目４３または４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
がんを処置することを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、項目１～３６のいずれか一項に記載の抗原結合単位の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目５１）
がんを処置することを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、項目３７に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目５２）
前記がんが血液がんまたは固形腫瘍である、項目５０～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記がんを処置することが、腫瘍体積を減少させることを含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
治療用抗体を投与することをさらに含む、項目５２または５３に記載の方法。
（項目５５）
前記治療用抗体が抗ＣＤ２０抗体である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記腫瘍体積が、配列番号２４０および２４１、または配列番号２４２および２４３、または配列番号２４４および２４５のアミノ酸配列を有する抗原結合単位と比較してより高い程度まで減少する、項目５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
図１は、実施例の貪食作用実験からのデータを表す。
図２Ａ～２Ｂは、実施例の貪食作用実験からのデータを表す。
図３Ａ～３Ｂは、実施例の抗体結合実験からのデータを表す。
図４は、実施例の貪食作用実験からのデータを表す。
図５は、実施例の貪食作用実験からのデータを表す。
図６は、実施例の赤血球結合実験からのデータを表す。
図７Ａ～７Ｂは、実施例の赤血球凝集実験からのデータを表す。
図８は、実施例の赤血球凝集実験からのデータを表す。
図９は、実施例の抗体結合実験からのデータを表す。
図１０は、実施例の抗体中和実験からのデータを表す。
図１１は、実施例の貪食作用実験からのデータを表す。
図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、実施例の抗体結合実験からのデータを表す。 図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、実施例の抗体結合実験からのデータを表す。
図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは、実施例の抗体結合実験からのデータを表す。 図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは、実施例の抗体結合実験からのデータを表す。
図１４Ａ～１４Ｂは、実施例の抗体結合実験からのデータを表す。
図１５Ａは、実施例の抗体結合実験からのデータを表す。図１５Ｂおよび１５Ｃは、実施例のブロッキング実験からのデータを表す。
図１５Ｂおよび１５Ｃは、実施例のブロッキング実験からのデータを表す。
図１６Ａは、実施例の結合アッセイからのデータを表す。
図１６Ｂは、実施例のブロッキングアッセイからのデータを表す。
図１７は、実施例の赤血球凝集アッセイからのデータを表す。
図１８は、実施例の結合アッセイからのデータを表す。
図１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃは、実施例の貪食作用アッセイからのデータを表す。
図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃおよび２０Ｄは、実施例の赤血球および血小板結合アッセイからのデータを表す。 図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃおよび２０Ｄは、実施例の赤血球および血小板結合アッセイからのデータを表す。
図２１は、実施例の異種移植実験からのデータを表す。
図２２Ａは、実施例のブロッキングアッセイからのデータを表す。
図２２Ｂは、実施例のＲＢＣ結合アッセイからのデータを表す。図２２Ｃは、実施例の血小板結合アッセイからのデータを表す。
図２２Ｄは、実施例の赤血球凝集アッセイからのデータを表す。
図２３は、実施例の異種移植実験からのデータを表す。
図２４は、実施例の異種移植実験からのデータを表す。
本開示の詳細な説明
本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、かつ説明するが、このような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。ここで、多数の変形、変更および置換は、本発明から逸脱することなく当業者には想起されるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する各種の代替が、本発明の実施において利用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義すること、ならびにこれらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにこれらの均等物が特許請求の範囲によって包含されることを意図している。
値の範囲が提供される場合、それぞれの、間の値には、文脈が明確に他を指示しない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限および下限の間、ならびに所定の範囲内にあるその他の所定の値または間の値が、本発明内に包含されることが理解される。これらのより少ない範囲の上限および下限は、独立して、より少ない範囲に含まれていてもよく、また、所定の範囲内で任意の特定の除外の限度の支配下にある、本発明内に包含される。所定の範囲が１つまたは両方の限度を含む場合、これらの含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状、環状または分枝状であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、例えば、硫酸化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ヨウ素化、メチル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡが媒介する付加、ユビキチン化、または標識化成分とのコンジュゲーションなどの任意のその他の操作を介して修飾された、アミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方を含む、天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれか、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣体を指す。指定のタンパク質に「由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。好ましくは、ポリペプチドは、配列においてコードされるポリペプチドのアミノ酸配列、または少なくとも１０～２０アミノ酸、もしくは少なくとも２０～３０アミノ酸、もしくは少なくとも３０～５０アミノ酸からなるそれらの部分と実質的に同一の、あるいは配列においてコードされるポリペプチドと免疫学的に同定され得るアミノ酸配列を有する。この専門用語は、指定の核酸配列から発現するポリペプチドも含む。
本明細書で使用される場合、「抗原結合単位」という用語は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（「免疫学的に反応する」）抗原結合部位を含有する分子を指す。「抗原結合単位」という用語には、無脊椎動物および脊椎動物を含むさまざまな種起源の免疫グロブリン分子も包含する。構造的に、最も単純な天然に存在する抗体（例えば、ＩｇＧ）は、ジスルフィド結合によって相互に接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖を含む。免疫グロブリンは、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥなどのいくつかの種類の分子を含む、大きなファミリーの分子を表す。「免疫グロブリン分子」という用語は、例えば、ハイブリッド抗体または改変抗体、およびこれらの断片を含む。抗体の抗原結合機能は、天然に存在する抗体の断片によって行うことができることも示されている。これらの断片は、まとめて「抗原結合単位」と呼ばれる。「抗原結合単位」という用語には、１つまたは複数の非共有結合相互作用が分子構造およびエピトープの間の複合体を安定化させる場合、エピトープにフィットして認識する特定の形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造も包含する。
抗原結合単位は、それがポリペプチドを含む他の参照抗原または他の物質と結合するよりも高い親和性またはアビディティーで結合する場合、抗原「と特異的に結合する」か「免疫反応性である」。
本明細書で使用される「抗原」は、抗原結合単位によって認識され、特異的に結合する物質を意味する。抗原としては、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖類および脂質、これらの部分ならびにこれらの組合せを挙げることができる。非限定的な例の抗原としては、ヒト、マウスからのＣＤ４７およびこれらの他のホモログが挙げられる。別の抗原の例は、ヒト、マウスからのＳＩＲＰαおよびこれらの他のホモログである。
「キメラ」タンパク質は、天然に存在するものと配列中の異なる位置に領域を含む、少なくとも１つの融合ポリペプチドを含有する。この領域は、別々のタンパク質中に通常は存在していてもよく、融合ポリペプチド中で一緒になり、または、これらは、同じタンパク質中に通常は存在し得るが、融合ポリペプチド中の新たな配置に置かれる。キメラタンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作出および翻訳することによって、作出され得る。
「ドメイン」は、タンパク質またはペプチドの他の部分と物理的または機能的に区別されるタンパク質の部分を指す。物理的に定義されたドメインとしては、膜結合または細胞質結合型の配列などの例外的に疎水性または親水性であるこれらのアミノ酸配列が挙げられる。ドメインはまた、例えば、遺伝子重複から生じる内部の相同性によって定義されてもよい。機能的に定義されたドメインは、区別できる生物学的機能を有する。例えば、受容体のリガンド結合ドメインは、リガンドと結合するドメインである。抗原結合ドメインは、抗原結合単位または抗原と結合する抗体の一部を指す。機能的に定義されたドメインは、連続するアミノ酸配列によってコードされる必要はない。機能的に定義されたドメインは、１つまたは複数の物理的に定義されたドメインを含有していてもよい。例えば、受容体は、一般に、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内エフェクタードメインに分けられる。
「宿主細胞」は、本発明のベクターのためのレシピエントであり得るか、またはレシピエントであった、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含む。後代は、天然、偶発的または計画的な変異に起因して、（全ＤＮＡ補体の形態またはゲノムにおいて）元の親細胞と完全に同一である必要はなくてもよい。宿主細胞は、本発明のベクターをｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を含む。「宿主細胞」は、原核細胞、真核細胞、または組換えベクターもしくは他の導入ポリヌクレオチドのためのレシピエントであり得るか、レシピエントであったか、もしくはレシピエントとして使用される単細胞体として培養される細胞株を指すことができ、トランスフェクトされた元の細胞の後代を含む。単細胞の後代は、天然、偶発的または計画的な変異に起因して、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体において、元の親と完全に同一である必要はなくてもよいことが理解される。
「細胞株」または「細胞培養物」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長または維持される、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または高等真核細胞を意味する。細胞の子孫は、親細胞と（形態、遺伝子型または表現型のいずれかで）完全に同一でなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはこれらの断片が、通常、天然では付随している構成成分、細胞およびその他のものから分離されていることを意味する。当業者に明らかであるように、天然に存在しない、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはこれらの断片は、その天然に存在する対応物からそれを区別するために「単離」の必要はない。加えて、「濃縮された」、「分離された」または「希釈された」、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはこれらの断片は、濃度または体積あたりの分子の数が、その天然に存在する対応物のそれよりも、「濃縮された」ものより大きいか、または「分離された」ものより少ないという点において、その天然に存在する対応物から区別可能である。富化は、溶液の体積あたりの重量などの絶対的基準で測定することができ、または、供給混合物中に存在する第２の潜在的な妨害物質との関係で測定することができる。本発明の実施形態の富化が高まると、益々好ましい。したがって、例えば、２倍の富化が好ましく、１０倍の富化がより好ましく、１００倍の富化がより好ましく、１０００倍の富化がさらにより好ましい。物質はまた、化学合成または組換え発現によるなどの人工的な組み立てのプロセスによって、単離された状態で提供され得る。
「連結された」および「融合された」または「融合」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換えの手段を含むどんな手段によっても、２つより多くの化学的エレメントまたは成分が一緒に連結されることを指す。「インフレーム融合」は、元のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の正しいリーディングフレームを維持する方法で、連続的なより長いＯＲＦを形成するための２つまたはそれよりも多くのＯＲＦの連結を指す。したがって、生じる組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つまたはそれよりも多くのセグメントを含有する単一タンパク質である（このセグメントは、天然では、通常そのように連結していない）。このように、リーディングフレームは、融合されたセグメント全体にわたって連続的に作られるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列（例えば、「フレクソン」）によって、物理的または空間的に分離されていてもよい。
ポリペプチドの文脈では、「配列」は、配列中で互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造中で連続する、アミノ末端からカルボキシル末端の方向でのポリペプチド中のアミノ酸の順序である。配列はまた、１つまたは両方の方向に追加の残基を含むことが公知のポリペプチドの一部の直鎖状の配列であり得る。
「異種」は、比較される実体の残部と遺伝子型で区別できる実体に由来することを意味する。例えば、その天然コード配列から取り出され、天然配列以外のコード配列に作動可能に連結したプロモーターは、異種プロモーターである。ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される「異種」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較される実体の残部のものと遺伝子型で区別できる実体に由来することを意味する。例えば、異種ポリヌクレオチドまたは抗原は、異なる種起源、異なる細胞型、および区別できる個体の同じ種類の細胞に由来していてもよい。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用される。これらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有していてもよく、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子もしくは遺伝子断片のコードもしくは非コード領域、連鎖分析から定義される遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離されたＤＮＡ、任意配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、プライマー、オリゴヌクレオチドまたは合成ＤＮＡ。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識化成分とのコンジュゲーションによって、さらに修飾されてもよい。
ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限および／またはライゲーションのステップ、ならびに天然に見出されるポリヌクレオチドから区別できる構築物をもたらす他の手順の各種の組合せの産物であることを意味する。
「遺伝子」または「遺伝子断片」という用語は、本明細書において互換的に使用される。これらは、転写および翻訳された後に、特定のタンパク質をコードする能力がある、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子断片は、ポリヌクレオチドが少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有する限り、ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成されたものであってもよく、これは、コード領域全体またはそのセグメントを包含し得る。
「作動可能に連結した」または「作動するように連結した」は、そのように記載の成分が、それらの意図した方法でそれらが機能することを可能にする関係にある、並置を指す。例えば、プロモーター配列は、プロモーター配列がコード配列の転写を促進する場合、コード配列に作動可能に連結している。
「融合遺伝子」は、一緒に連結された、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドで構成される遺伝子である。
遺伝子「データベース」は、ヌクレオチドおよびペプチド配列を含む配列の収集を表す、保存されたデータのセットを意味し、これは、同様に、生物学的参照材料の収集を表す。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡ（「転写物」とも称される）がその後ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは遺伝子産物と総称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞中のｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
「ベクター」は、挿入される核酸分子を宿主細胞内におよび／または宿主細胞の間で移行させる、好ましくは、自己複製性の核酸分子である。この用語は、細胞内へのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入のために主として機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために主として機能する複製ベクター、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。２つ以上の上記の機能を提供するベクターも含む。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入された場合に、ポリペプチドに転写および翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、所望の発現産物を得るために機能し得る発現ベクターで構成される適切な宿主細胞を含意する。
「生体試料」という用語は、生命体から得られるさまざまな試料の種類を包含し、診断または監視アッセイにおいて使用することができる。この用語は、生体起源の血液および他の液体試料、生検標本もしくは組織培養物またはそれらに由来する細胞などの固体組織試料、ならびにそれらの後代を包含する。この用語は、例えば、試薬での処理、可溶化またはある特定の成分についての富化によって、それらの入手後に任意の方法で操作された試料を包含する。この用語は、臨床試料を包含し、細胞培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液および組織試料も含む。
「処置」、「処置すること」、「処置する」などの用語は、本明細書において、一般に、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指すために使用される。効果は、疾患もしくはその症状の完全もしくは部分的な予防という点で予防的であってもよく、ならびに／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害な効果のための部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒という点で治療的であってもよい。本明細書において使用される「処置」は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒトおよび他の類人猿を含む霊長類、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患もしくは症状の素因を有し得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において、疾患もしくは症状を発生から予防すること；（ｂ）疾患の症状を阻害すること；（ｃ）疾患の発症を抑止すること；（ｄ）疾患の症状を軽減すること；（ｅ）疾患もしくは症状の退縮を引き起こすこと；またはこれらの任意の組合せを含む。
「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用することができ、診断、処置または治療が望まれる、任意の哺乳動物の対象、特に、ヒトを指す。
「がん」、「新生物」、「腫瘍」および「癌腫」という用語は、細胞が細胞増殖の制御の著しい欠如によって特徴付けられる異常な成長表現型を示すような、相対的に自律的な成長を示す細胞を指すために、本明細書において互換的に使用される。一般に、本出願における検出または処置のための目的の細胞は、前がん状態（例えば、良性）、悪性腫瘍、転移前、転移性および非転移性細胞を含む。「正常細胞」の文脈で使用される「正常」という用語は、形質転換されていない表現型の細胞を指すか、または調べられている組織型の形質転換されていない細胞の形態を示すことを意味する。「がん表現型」は、一般に、がん性細胞の特徴である任意のさまざまな生物学的現象を指し、この現象は、がんの種類によって異なり得る。がん表現型は、一般に、例えば、細胞成長もしくは増殖（例えば、制御されない成長または増殖）、細胞周期の調節、細胞移動性、細胞間相互作用、または転移などにおける異常な状態によって特定される。
貪食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｃｅｌｌ）または食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）は互換的な用語であり、貪食作用の能力がある細胞を指す。食細胞の非限定的なカテゴリーとしては、マクロファージ、単核細胞（例えば、組織球および単球）、多形核白血球（例えば、好中球）および樹状細胞が挙げられる。
組成物
一実施形態では、本開示は、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位であって、（ａ）ＣＤ４７と特異的に結合し；（ｂ）ＣＤ４７と結合する際にＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導し；（ｃ）約１．５ｎｇ／ｍｌ～約３０μｇ／ｍｌの本明細書に開示される抗原結合単位の濃度範囲で赤血球と混合された場合に、実質的に赤血球凝集を誘導する能力が欠如している抗原結合単位を提供する。
別の実施形態では、本開示は、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位であって、抗原結合単位が、（ａ）参照抗原結合単位の結合親和性より高い結合親和性でＣＤ４７と特異的に結合し、ＳＩＲＰαへのＣＤ４７の結合を妨げ；（ｂ）約１．５ｎｇ／ｍｌ～約３０μｇ／ｍｌの前記抗原結合単位の濃度範囲で赤血球と混合された場合に、実質的に赤血球凝集を誘導する能力が欠如しており、参照抗原結合単位が、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列を有する、抗原結合単位を提供する。
さらに別の実施形態では、本開示は、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位であって、抗原結合単位が、（ａ）ＣＤ４７と特異的に結合し；（ｂ）参照抗原結合単位と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７と結合する際にＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導し、参照抗原結合単位が、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列を有する、抗原結合単位を提供する。
またさらに別の実施形態では、本開示は、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位であって、軽鎖ＣＤＲが、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含み；重鎖ＣＤＲが、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含み、前記ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１～２２および１６２～１９０からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列相同性を共有する配列を含み、前記ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２３～４４および１９１～２３７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含む、抗原結合単位を提供する。
一部の態様では、抗原結合単位は、参照抗原結合単位によって認識されるエピトープへの結合について競合し得る。例えば、抗原結合単位は、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列を有する参照抗原の結合によって認識されるエピトープへの結合について競合し得る。選択抗体のエピトープ結合は、商品化された抗ＣＤ４７ブロッキング抗体を用いて、ＣＤ４７発現ＣＨＯ細胞を使用して実施した。簡潔には、７つの中和ＣＤ４７抗体および２つの参照抗体（陽性１および陽性２）を分析し、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４７を発現するＣＨＯ細胞へのそれらの競合的結合に従って群分けした。ビオチン化抗体を最初に使用して、９０％結合のための濃度を計算し、次いで、９つのＣＤ４７抗体を連続希釈して、あらかじめ決定した９０％結合濃度でビオチン化抗体の１つと混合した。ＳＡ－ＡＰＣを使用して、ビオチン化抗体結合の結合を検出した。すべての抗体を、互いおよび対照に対して比較した。結合において変化を示さなかった抗体を同じ群として分類した。細胞表面の結合において変化を示した抗体を別々の群に分類した。ＣＤ４７を発現するＣＨＯにおける３つの結合プロファイルを特定し、６つのヒットを下記のように３つの群とした。第１の群は、ＡＢＵ１、ＡＢＵ６および陽性１からなっていた。第２の群は、ＡＢＵ４、ＡＢＵ５および陽性１からなっていた。第３の群は、ＡＢＵ２、ＡＢＵ３、陽性１および陽性２からなっていた。
本明細書に開示されるいずれかの実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は軽鎖ＣＤＲを含む。軽鎖ＣＤＲは、抗原結合単位の軽鎖の相補性決定領域であり得る。軽鎖ＣＤＲは、アミノ酸残基の連続配列、または、フレームワーク領域などの非相補性決定領域によって、分離され、必要に応じて隣接するアミノ酸残基の２つもしくはそれよりも多くの連続する配列を含むことができる。一部の例では、軽鎖ＣＤＲは２つまたはそれよりも多くの軽鎖ＣＤＲを含み、これは、軽鎖ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２などと称することができる。有利な例では、軽鎖ＣＤＲは３つの軽鎖ＣＤＲを含み、これは、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ－１、軽鎖ＣＤＲ－２および軽鎖ＣＤＲ－３と称することができる。一部の例では、通常の軽鎖に存在するＣＤＲの群は、軽鎖ＣＤＲと総称することができる。
本明細書に開示されるいずれかの実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は重鎖ＣＤＲを含む。重鎖ＣＤＲは、抗原結合単位の重鎖の相補性決定領域であり得る。重鎖ＣＤＲは、アミノ酸残基の連続配列、または、フレームワーク領域などの非相補性決定領域によって、分離され、必要に応じて隣接するアミノ酸残基の２つもしくはそれよりも多くの連続する配列を含むことができる。一部の例では、重鎖ＣＤＲは２つまたはそれよりも多くの重鎖ＣＤＲを含み、これは、重鎖ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２などと称することができる。有利な例では、重鎖ＣＤＲは３つの重鎖ＣＤＲを含み、これは、それぞれ、重鎖ＣＤＲ－１、重鎖ＣＤＲ－２および重鎖ＣＤＲ－３と称することができる。一部の例では、通常の重鎖に存在するＣＤＲの群は、重鎖ＣＤＲと総称することができる。
本明細書に開示されるいずれかの実施形態の一部の態様では、本発明の抗原結合単位は、ＣＤ４７と特異的に結合する。本明細書で使用されるＣＤ４７は、公知のＣＤ４７配列の、オルソログ、ホモログ、コドン最適化形態、切断形態、断片化形態、変異形態、または任意のその他の公知の誘導体の形態を指すこともできる。例えば、ＣＤ４７は、ヒトＣＤ４７であり得、これは、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号ＣＥＪ９５６４０によって代表され、配列番号８１の配列を含む。ＣＤ４７は、マウスＣＤ４７であり得、これは、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号ＢＡＡ２５４０１．１によって代表され、配列番号８２の配列を含む。一部の文脈では、ＣＤ４７は、インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）と称される。ヒトＩＡＰは、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号ＣＡＡ８０９７７．１によって代表され、配列番号８３の配列を含む。マウスＩＡＰは、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号ＡＤＱ１２９１９．１によって代表され、配列番号８４の配列を含む。加えて、ＣＤ４７は、配列番号８１～８４のいずれか１つと少なくとも５０％の同一性を共有する配列を含むことができる。ＣＤ４７は、配列番号８１～８４のいずれか１つと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９％より高い同一性を共有する配列を含むことができる。
結合特異性は、相補性決定領域、または軽鎖ＣＤＲもしくは重鎖ＣＤＲなどのＣＤＲによって決定することができる。多くの場合では、結合特異性は、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲによって決定される。重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲの所与の組合せは、他の参照抗原と比較して、ＣＤ４７に対するより高い親和性および／または特異性を付与する所与の結合ポケットを提供する。
本明細書に開示される実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は、参照抗原結合単位の結合親和性より高い結合親和性でＣＤ４７と特異的に結合する。このような参照抗原結合単位としては、限定されるものではないが、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列を有する抗原結合単位が挙げられる。
ＣＤ４７への抗原結合単位の結合は、本技術分野において公知の任意の方法によって、特徴付けまたは発現することができる。例えば、結合は、結合親和性によって特徴付けることができ、これは、抗原結合単位および抗原の間の相互作用の強さであり得る。結合親和性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイなどの本技術分野において公知の任意の方法によって決定することができる。例えば、本明細書に開示される抗原結合単位の結合親和性は、ＣＤ４７を発現する細胞を利用するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいてアッセイした場合に、決定することができる。本発明の抗原結合単位の結合親和性は、Ｋｄという用語で表すことができ、これは、抗体およびそのそれぞれの抗原の間の平衡解離定数である。一部の場合では、本明細書に開示される抗原結合単位は、約１０μＭ～約１ｆＭの範囲内のＫｄでＣＤ４７と特異的に結合する。例えば、抗原結合単位は、約１０μＭ、１μＭ、０．１μＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、０．１ｐＭ、１０ｆＭ、１ｆＭ、０．１ｆＭ未満、または０．１ｆＭ未満のＫｄでＣＤ４７と特異的に結合することができる。一部の例では、本発明の抗原結合単位は、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列を有する参照抗原結合単位と比較して、ＣＤ４７に対するより高い結合親和性を示す。
本明細書に開示される実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は、ＳＩＲＰαへのＣＤ４７の結合を減少させるか、またはさらに妨げ、それによって、ＳＩＲＰαを発現するマクロファージ細胞による貪食作用を誘導する。典型的には、このような貪食作用は、ＣＤ４７への抗原結合単位の結合の際に誘導される。
一部の態様では、本発明の抗原結合単位は、参照抗原結合単位のものより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する。このような参照抗原結合単位は、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列を有することができる。貪食作用は、本技術分野において公知の任意の方法によって定性的に利用することができる。一部の場合では、貪食作用の程度は、マクロファージの集団の中で貪食作用を行ったマクロファージ（食細胞と称する）の数によって決定される。例えば、１００マクロファージあたりの食細胞の数を決定することができ、その結果、貪食作用の程度を百分率または食細胞指数として表すことができる。
ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用の誘導は、本明細書に開示される抗原結合単位の存在下で、これらの細胞の貪食作用のレベルの増加によって証拠付けることができる。一部の例では、このような細胞の貪食作用のレベルは、本組成物の非存在下で観察される貪食作用のレベルと比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、５００％、１０００％、または１０００％よりも大きく増加する。
本明細書に開示されるいずれかの実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は、実質的に赤血球凝集を誘導する能力が欠如している。一部の場合では、抗原結合単位は、約１．５ｎｇ／ｍｌ～約３０μｇ／ｍｌの間の前記抗原結合単位の濃度範囲で赤血球と混合された場合に、実質的に赤血球凝集を誘導する能力が欠如している。例えば、本発明の抗原結合単位は、抗原結合単位が、約０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、５５ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、６５ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、５５０ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、８５０ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ、９５０ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌまたはそれより高い前記抗原結合単位の濃度である場合、赤血球と混合された場合に、実質的に赤血球凝集を誘導する能力が欠如し得る。他の例では、抗原結合単位の濃度は、１．５ｎｇ／ｍＬ未満であり得る。他の例では、抗原結合単位の濃度は、３０μｇ／ｍｌより高くあり得る。
一部の場合では、赤血球が本発明の抗原結合単位と接触する際に誘導される赤血球凝集は、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列を有する参照抗原結合単位によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１分の１である。一部の場合では、赤血球が本発明の抗原結合単位と接触する際に誘導される赤血球凝集は、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列を有する参照抗原結合単位によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１分の１、多くとも２分の１、多くとも３分の１、多くとも４分の１、多くとも５分の１、多くとも６分の１、多くとも７分の１、多くとも８分の１、多くとも９分の１、または多くとも１０分の１である。一部の場合では、赤血球が本発明の抗原結合単位と接触する際に誘導される赤血球凝集は、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列を有する参照抗原結合単位によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１０分の１である。
一部の場合では、赤血球凝集の証拠は、ＲＢＣの非沈降の存在によって実証される。濁りの代わりに点状の赤い点が現れる場合、実質的な赤血球凝集の欠如を示す。
一部の態様では、赤血球凝集は、定量化することができ、赤血球凝集指数として表すことができる。赤血球凝集指数は、本発明の抗原結合単位の存在下または非存在下での赤血球のペレットの面積によって定量することができる。例えば、赤血球のペレットの直径は、手作業、またはＩｍａｇｅ Ｊなどのコンピューターソフトウェアを使用してのいずれかで決定することができる。コンピューターソフトウェアを使用する場合、赤血球のペレットの面積は、ペレットを構成するピクセルの数を数えることによって決定することができる。次いで、面積は、手作業、またはＥｘｃｅｌなどのソフトウェアを使用することによって計算することができる。一部の場合では、面積は、次いで、対照のデータセットに対して正規化され、最大赤血球凝集指数のパーセントとして表すことができる。このような例では、本発明の抗原結合単位は、最大赤血球凝集指数の約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％またはそれより高いパーセントを誘導することができる。一部の例では、本発明の抗原結合単位は、最大赤血球凝集指数の１００％未満を誘導する。例えば、本発明の抗原結合単位は、最大赤血球凝集指数の約１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％未満、またはそれより少ないパーセントを誘導することができる。
一部の態様では、本発明の抗原結合単位は、抗原結合単位が赤血球（ＲＢＣ）の溶液に添加される場合、実質的に赤血球凝集を誘導する能力が欠如し、ここで、ＲＢＣは、ＰＢＳなどの適切な緩衝液中で、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％より高いＲＢＣで構成される。一部の例では、溶液は、ＰＢＳなどの適切な緩衝液中で、２０％より高いＲＢＣである。
一部の態様では、本発明の抗原結合単位は、抗原結合単位が約１００μｇ／ｍＬ～約１ｐｇ／ｍＬの濃度で存在する場合、ＲＢＣを含有する溶液中で実質的にＲＢＣの赤血球凝集を誘導する能力が欠如している。例えば、実質的な赤血球凝集の欠如は、抗原結合単位の濃度が、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．６μｇ／ｍＬ、０．７μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、０．９μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ、７μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、９μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、またはそれよりも高い場合に、観察される。
本明細書に開示されるいずれかの実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は、抗原結合単位が赤血球に添加されて、約１０分から約１０時間インキュベートされた後に、実質的に赤血球凝集を誘導する能力が欠如している。例えば、実質的な赤血球凝集は、約１０分、１５分、３０分、４５分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、６．５時間、７時間、７．５時間、８時間、８．５時間、９時間、９．５時間、１０時間、または１０時間より長いインキュベーション時間の後に観察されない。
本明細書に開示されるいずれかの実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む。本発明の抗原結合単位は、表１に記載されるいずれかのＬＣ－ＣＤＲまたはＨＣ－ＣＤＲを含むことができる。加えて、またはその代わりに、本発明の抗原結合単位は、表１に記載されるいずれかのＬＣ－ＣＤＲまたはＨＣ－ＣＤＲと少なくとも６０％の同一性を有するＬＣ－ＣＤＲまたはＨＣ－ＣＤＲを含むことができる。一部の態様では、本発明のＬＣ－ＣＤＲまたはＨＣ－ＣＤＲは、表１に記載されるいずれかの配列番号と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を示すことができる。
Figure 0007117311000001
Figure 0007117311000002
Figure 0007117311000003
Figure 0007117311000004
一部の場合では、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲは、軽ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含み；重鎖（ＨＣ）ＣＤＲは、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含む。一部の例では、前記ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１～２２および１６２～１９０からなる群から選択される配列を有する。一部の例では、前記ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２３～４４および１９１～２３７からなる群から選択される配列を有する。一部の例では、前記ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１～２２および１６２～１９０からなる群から選択される配列を有し、前記ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２３～４４および１９１～２３７からなる群から選択される配列を有する。
本明細書に開示されるいずれかの実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は、軽鎖ＣＤＲを含み、前記軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲが、３つのＬＣ－ＣＤＲ、すなわち、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３の組合せを含む。３つのＬＣ－ＣＤＲの組合せは、表２に記載されるいずれかの組合せを含むことができる。
Figure 0007117311000005
本明細書に開示されるいずれかの実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は、重鎖ＣＤＲを含み、前記重鎖（ＨＣ）ＣＤＲが、３つのＨＣ－ＣＤＲ、すなわち、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３の組合せを含む。３つのＨＣ－ＣＤＲの組合せは、表３に記載されるいずれかの組合せを含むことができる。
Figure 0007117311000006
Figure 0007117311000007
本明細書に開示されるいずれかの実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含み、前記軽鎖ＣＤＲおよび前記重鎖ＣＤＲは、それぞれ、表２に記載されるＬＣ－ＣＤＲのいずれかの組合せおよび表３に記載されるＨＣ－ＣＤＲのいずれかの組合せからなる群から選択されるＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲを含む。
一部の態様では、本発明の抗原結合単位は、モノクローナル抗原結合単位、ポリクローナル抗原結合単位、ヒト化抗原結合単位、キメラ抗原結合単位、一価抗原結合単位、多価抗原結合単位、二重特異性抗原結合単位、またはこれらのいずれかの組合せである。抗原結合単位は、限定されるものではないが、ｓＦＣ、Ｆｖ、ｃｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｄを含む、さまざまな形式に適合し得る。このような抗体結合単位は、リシン、ペプシン、パパインまたは他のプロテアーゼ切断によって全免疫グロブリンから作製することができる。
加えて、抗原結合単位は、組換え免疫グロブリン技術を利用して設計することができる。例えば、本発明における使用のための「Ｆｖ」免疫グロブリンは、可変軽鎖領域を、ペプチドリンカーを介して可変重鎖領域と連結させることによって製造してもよい。例えば、ペプチドリンカーは、ポリグリシン、またはアルファヘリックスもベータシートモチーフも形成しない別の配列であり得る。参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第６，１４７，２０３号に記載のようにして、ＶＨおよびＶＬ領域の間の安定化されたジスルフィド結合を含むＦｖも作ることができる。これらの抗原結合単位のいずれかを本発明において利用することができる。一部の態様では、抗原結合単位は、２つの重鎖と対になった２つの軽鎖を有する全免疫グロブリンであり得る。
抗原結合単位は、軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドを含むヘテロ多量体であり得る。抗原結合単位の例としては、限定されるものではないが、（ｉ）その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，８３３，４４１号に開示されたヘテロ二量化配列によって安定化されたｃｃＦｖ断片；（ｉｉ）本明細書に記載の少なくとも１つのｃｃＦｖ断片を含む任意のその他の一価および多価分子；（ｉｉｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；ならびに（ｖｉｉ）ダイアボディが挙げられる。
ポリクローナル抗体は、抗原性組成物を産生動物に注射することによる標準的なプロトコールによって産生させることができる。例えば、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、１９８８年を参照のこと。タンパク質全体またはタンパク質の大きな区画を利用する場合、抗体は、タンパク質および適切なアジュバント（例えば、フロイント、フロイント完全、水中油型エマルジョンなど）で産生動物を免疫することによって産生させてもよい。より小さなペプチドを利用する場合、免疫賦活性コンジュゲートを作るために、ペプチドをより大きな分子とコンジュゲートさせることが有利である。このような使用のために市販されている通常利用されるコンジュゲートタンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が挙げられる。特定のエピトープに対する抗体を産生させるために、全配列に由来するペプチドを利用してもよい。その代わりに、タンパク質標的の比較的短いペプチド部分に対する抗体を作製するために、ポリペプチドがオボアルブミン、ＢＳＡまたはＫＬＨなどの担体タンパク質と連結される場合、優れた免疫応答を誘発させることができる。
ポリクローナルまたはモノクローナルの抗原結合単位または抗体は、ヒト免疫グロブリンを産生させるために遺伝子改変された動物から産生させることができる。トランスジェニック動物は、その動物の天然の抗体を産生しない「ノックアウト」動物を最初に作製し、ヒト抗体遺伝子座で動物を安定的に形質転換することによって（例えば、ヒト人工染色体の使用によって）、作製することができる。このような場合では、その後、ヒト抗体のみが動物によって作られる。このような動物を作製するためおよびそれらから抗体を誘導するための技術は、参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第６，１６２，９６３号および第６，１５０，５８４号に記載されている。このような抗体は、ヒト異種抗体と称することができる。
その代わりに、抗原結合単位は、ヒト可変領域を含有するファージライブラリーから作製することができる。参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第６，１７４，７０８号を参照のこと。
本明細書に開示されるいずれかの実施形態の一部の態様では、抗原結合単位はハイブリドーマによって産生される。例えば、本明細書に開示される抗原結合単位は、表１に記載される抗原結合単位の１つを発現するハイブリドーマからなる群から選択されるハイブリドーマによって産生され得る。例えば、ハイブリドーマは、参照番号［参照番号を挿入］で［日付］に寄託された任意のハイブリドーマであり得る。
モノクローナル抗原結合単位またはモノクローナル抗体のために、ハイブリドーマは、接種された動物の脾臓からの免疫細胞などの刺激を受けた免疫細胞を単離することによって形成され得る。次いで、これらの細胞は、細胞培養において無制限に複製する能力があるミエローマ細胞または形質転換細胞などの不死化細胞と融合することができ、それによって、不死の免疫グロブリン分泌細胞株が作製される。利用される不死細胞株は、ある特定の栄養を利用するために必要な酵素が不足するように選択することができる。多くのこのような細胞株（例えば、ミエローマ）は当業者に公知であり、例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはヒポキサンチン－グアニンホスホリボシル（phosphoriboxyl）トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）が挙げられる。これらの不足は、例えば、ヒポキサンチンアミノプテリンチミジン培地（ＨＡＴ）において成長するそれらの能力に従って融合細胞の選択を可能にする。
加えて、抗原結合単位は、遺伝子工学によって作製され得る。ヒトに投与した場合に免疫応答が少なくなる、ヒト化、キメラまたは異種ヒト抗原結合単位は、本発明において有用である。
本明細書に開示される抗原結合単位は、ヒトにおける望ましくない免疫応答、例えば、アナフィラキシーショックを誘導する傾向を低下させることができ、抗体治療または造影剤による繰り返し投薬を妨げる免疫応答（例えば、ヒト－抗マウス抗体「ＨＡＭＡ」応答）をプライミングするための傾向の低下も示し得る。このような抗原結合単位としては、限定されるものではないが、ヒト化、キメラまたは異種ヒト抗原結合単位が挙げられる。
キメラ抗原結合単位またはキメラ抗体は、主にヒトドメインを有する抗体を産生させるために、例えば、マウス（または他の動物由来）ハイブリドーマクローンから得られるマウス可変軽鎖および重鎖領域（ＶＫおよびＶＨ）をヒト定常軽鎖および重鎖領域と組み合わせることによる組換え手段によって、作ることができる。このようなキメラ抗体の産生は本技術分野において周知であり、（例えば、参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第５，６２４，６５９号に記載されるような）標準的な手段によって達成され得る。
非ヒト（例えば、げっ歯類または霊長類）抗体に適用される「ヒト化」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、ハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはこれらの断片である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または移入ＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれにおいても見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、ヒト身体に導入された場合に、抗体の性能をさらに精緻化および最適化するため、ならびに免疫原性を最小化するために行われる。一部の例では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的にすべて含み、ここで、すべてまたは実質的にすべての非ヒト免疫グロブリンのものに対応するＣＤＲ領域、およびすべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものを含んでいてもよい。
ヒト化抗体は、ヒト様免疫グロブリンドメインを含有し、動物由来抗体の相補性決定領域のみが組み込まれるように操作することができる。これは、モノクローナル抗原結合単位またはモノクローナル抗体の可変領域の超可変ループの配列を注意深く検討すること、およびこれらをヒト抗原結合単位またはヒト抗体鎖の構造にフィットさせることによって達成することができる。例えば、参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第６，１８７，２８７号を参照のこと。
非ヒト抗体をヒト化させるための方法は本技術分野において周知である。「ヒト化」抗体は、配列の少なくとも一部が、その初期の形態から改変されて、ヒト免疫グロブリンのようになるようにされた抗体である。一部のバージョンでは、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖定常（Ｃ）領域がヒト配列と置き換えられる。これは、可変（Ｖ）領域および異種免疫グロブリンＣ領域を含む融合ポリペプチドであり得る。一部のバージョンでは、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、非ヒト抗体配列を含む一方で、Ｖフレームワーク領域もヒト配列に変換されている。例えば、ＥＰ０３２９４００を参照のこと。一部のバージョンでは、Ｖ領域は、ヒトおよびマウスＶ領域の共通配列を設計し、共通配列の間で相違するＣＤＲ以外の残基を変換することによってヒト化される。
原則として、ヒト化抗体からのフレームワーク配列は、ＣＤＲグラフト化のための鋳型として働くことができ、しかしながら、これは、このようなフレームワークへの直鎖状のＣＤＲの置き換えが、抗原に対する結合親和性の著しい喪失をもたらし得ることを実証している。Glaserら（１９９２年）、J. Immunol.、１４９巻、２６０６頁；Tempestら（１９９２年）、Biotechnology、９巻、２６６頁；およびShalabyら（１９９２年）、J. Exp. Med.、１７巻、２１７頁。ヒト抗体（ＨｕＡｂ）が起源のマウス抗体（ｍｕＡｂ）とより相同であると、ヒトフレームワークが、親和性を減少させ得るひずみをマウスＣＤＲに導入する可能性が低くなる。抗体配列データベースに対する配列相同性サーチに基づいて、ＨｕＡｂ ＩＣ４は、ｍｕＭ４ＴＳ．２２に対して良好なフレームワーク相同性を提供するが、他の高度に相同のＨｕＡｂは、特に、ヒトサブグループＩのカッパＬ鎖またはヒトサブグループＩＩＩのＨ鎖と同様に適切である。Kabatら（１９８７年）。ＥＮＣＡＤ（Levittら（１９８３年）、J. Mol. Biol.、１６８巻、５９５頁）などの各種のコンピュータープログラムは、Ｖ領域について理想的な配列を予測するために利用可能である。したがって、本発明は、異なる可変（Ｖ）領域を有するＨｕＡｂを包含する。適切なＶ領域配列を決定すること、およびこれらの配列を最適化することは、当業者の範囲内である。免疫原性を減少させた抗体を得るための方法は、米国特許第５，２７０，２０２号およびＥＰ６９９，７５５にも記載されている。
ヒト化抗体は、親配列の解析のプロセス、ならびに親およびヒト化配列の三次元モデルを使用する各種概念のヒト化製品によって調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは当業者には知られている。選択した候補の免疫グロブリン配列の可能性が高い三次元立体配座構造を図示および表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の検討は、候補の免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の解析、すなわち、その抗原に結合する候補の免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の解析を可能にする。この方法において、ＦＲ残基は、標的抗原に対する向上した親和性のなどの所望の抗体の特徴を達成するように、共通配列および移入配列から選択および組み合わせることができる。
本発明の抗原結合単位のヒト化のためのプロセスは以下の通りであり得る。最適の生殖細胞系列のアクセプターの重鎖および軽鎖可変領域を、グラフト化のためのヒト抗体生殖細胞系列の相同性、正準構造および物理的性質に基づいて選択する。ｍＶＨ／ＶＬ対グラフト化ｈＶＨ／ＶＬのコンピューターモデリングを行い、プロトタイプのヒト化抗体配列を作製する。モデリングがフレームワークの復帰変異についての必要性を示したら、指示されたＦＷの変更を伴う第２のバリアントを作製する。選択した生殖細胞系列のフレームワークおよびマウスＣＤＲをコードするＤＮＡ断片を合成する。合成したＤＮＡ断片をＩｇＧ発現ベクターにサブクローニングし、配列をＤＮＡ配列決定によって確認する。ヒト化抗体を、２９３Ｆなどの細胞で発現させ、タンパク質を、例えば、ＭＤＭ貪食作用アッセイおよび抗原結合アッセイにおいて試験する。ヒト化抗原結合単位を、例えば、標的抗原を発現する細胞におけるＦＡＣＳによって、抗原結合親和性において、親の抗原結合単位と比較する。親和性が親の抗原結合単位の２分の１未満である場合、ヒト化バリアントの第２ラウンドを、上記に記載のようにして、作製および試験することができる。
上記で述べたように、抗原結合単位は、「一価」または「多価」のいずれかであり得る。前者は、抗原結合単位１つあたり１つの結合部位を有するが、後者は、同じまたは異なる種類の２つ以上の抗原と結合する能力がある複数の結合部位を含有する。結合部位の数に応じて、抗原結合単位は、二価（２つの抗原結合部位を有する）、三価（３つの抗原結合部位を有する）、四価（４つの抗原結合部位を有する）などであり得る。
多価抗原結合単位は、それらの結合特異性に基づいてさらに分類することができる。「単一特異性」抗原結合単位は、同じ種類の１つまたは複数の抗原と結合する能力がある分子である。「多重特異性」抗原結合単位は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する分子である。このような分子は、通常、２つの区別できる抗原のみと結合するが（すなわち、二重特異性抗原結合単位）、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体は、本明細書で使用される場合、この語句によって包含される。本開示は多重特異性抗原結合単位をさらに提供する。多重特異性抗原結合単位は、少なくとも２つの区別できる抗原と結合する能力がある多価分子である。好ましい多重特異性抗原結合単位は、それぞれ、２つおよび３つの区別できる抗原との結合特異性を示す二重特異性および三重特異性分子である。
本明細書に開示される実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は、二重特異性抗原結合単位であり、抗原結合単位は、ＣＤ４７および第２の抗原に特異的に結合する。一部の例では、第２の抗原はＣＤ４７ではない。一部の例では、第２の抗原はＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１である。一部の例では、第２の抗原は、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２、ＣＤ１１２Ｒ、ＣＤ２２６、ＣＤ９６、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ４８、ＣＤ２４４、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２００、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、ＢＴＮＬ２、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＫＩＲ２ＤＬ－１、ＫＩＲ２ＤＬ－２、ＫＩＲ２ＤＬ－３およびＫＩＲ３ＤＬ２を含む、他の免疫チェックポイント分子である。一部の例では、第２の抗原はＥＧＦＲである。一部の例では、第２の抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５５、ＣＤ１７１、ＰＴＨＲ２、ＨＡＶＣＲ２または他の公知のがん細胞マーカーである。適切な第２の抗原の追加の例としては、限定されるものではないが、ＦｃγＲＩ、ＣＤ １５、ｐ１８５ ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＣＤ３、悪性腫瘍Ｂ細胞（１Ｄ１０）、ｐ９７、クローディン１８．２、ＯＶＣＡＲ－３、グリピカン－３、メソテリン、Ｌ－Ｄ１（結腸癌）、Ｔｒｏｐ２、メラニン細胞刺激ホルモンアナログ、ＥｒｂＢ２、ＣＡＭＡ１、ＭｏＶ１８、ＣＡＩＸ（カルボキシ－アンヒドラーゼ－ＩＸ）、ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＭＥＴ、ＴｒｋＣ、ＴｒｋＡ、ＲＥＴ、ＡＬＫ、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＰ－４０、ＶＥＧＦＲ２、ＭＵＣ－１、ＭＵＣ－１６、ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原）、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＧＰＣ－３、ＬＭＰ－１、ＤＮＡＭ－１（ＤＮＡＸアクセサリー分子－１）、汎癌腫関連抗原（ＡＭＯＣ－３１）、サポリン、Ｉｄ－１、ＣＤ７、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＥＡ、リシンＡ鎖、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、ハイブリドーマイディオタイプ、ビンカアルカロイド、アルカリホスファターゼ、フィブリン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｔ細胞受容体、インフルエンザ、ＦｃγＲ、ＨＩＶ、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ハプテン、ウサギＩｇＧ、フェリチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ホルモン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、ＦＩＴＣおよびベータ－ガラクトシダーゼが挙げられる。他の適切な第２の抗原としては、限定されるものではないが、腫瘍細胞抗原、細胞毒性トリガー分子、毒素、血栓溶解剤、細胞表面受容体、感染性疾患の標的、ワクチンアジュバント、診断剤、検出分子およびレポーター分子が挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドおよびベクター
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれかをコードする単離された核酸を提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれかをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される抗原結合単位の軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲをコードする単離された核酸を提供する。
本発明の抗原結合単位は、組換えＤＭＡ技術、合成化学技術またはこれらの組合せによって調製することができる。例えば、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む抗原結合単位の所望の成分をコードする配列を、典型的には、組み立てて、本技術分野において公知の標準的な分子技術を使用して、発現ベクターにクローニングする。これらの配列は、所望のタンパク質配列をコードする他のベクターから、個別の鋳型核酸を使用するＰＣＲ作製断片から、または所望の配列をコードする合成オリゴヌクレオチドの組み立てによって、組み立てられてもよい。発現系は、目的の抗原結合単位を含む発現ベクターを適切な細胞にトランスフェクトすることによって作出することができる。
既存抗体の軽鎖または重鎖の各種領域に対応するヌクレオチド配列は、限定されるものではないが、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定を含む慣用の技術を使用して、容易に得ることができ、配列を決定することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、抗体のヌクレオチド配列の好ましい供給源としての役割を果たす。モノクローナル抗体のアレイを産生する多数のハイブリドーマ細胞は、公共または民間のリポジトリから入手してもよい。最大の受託機関は、よく特徴付けられたハイブリドーマ細胞株の多様なコレクションを提供する、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ａｔｃｃ．ｏｒｇ）である。その代わりに、抗体のヌクレオチドは、免疫されたか、または免疫されていないげっ歯類またはヒトから、ならびに脾臓および末梢血リンパ球などの器官から得ることができる。抗体のヌクレオチドを抽出および合成するために適用可能な具体的な技術は、Orlandiら（１９８９年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A、８６巻、３８３３～３８３７頁；Larrickら（１９８９年）、Biochem. Biophys. Res. Commun.、１６０巻、１２５０～１２５５頁；Sastryら（１９８９年）、Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.、８６巻、５７２８～５７３２頁；および米国特許第５，９６９，１０８号に記載されている。
抗原結合単位をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、相同非ヒト配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常領域のためのコード配列を置換することによって、修飾することができる。この方法では、元の抗原結合単位の結合特異性を維持したキメラ抗体が調製される。
本発明において具体化されるポリヌクレオチドには、例証されたポリペプチドの機能的等価物およびそれらの断片をコードするものを含むことも理解される。機能的等価物のポリペプチドとしては、それによってコードされるポリペプチドの性質を、増強するもの、減少するもの、または著しい影響を及ぼさないものが挙げられる。機能的等価物は、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチド、融合を含むアナログ、および変異体であってもよい。
遺伝コードの縮重に起因して、抗原結合単位のコード配列、ならびに本発明のポリヌクレオチドおよびベクターの構築のために適切な配列のヌクレオチドにおいて、多数の変形が存在し得る。配列のバリアントは、修飾されたＤＮＡまたはアミノ酸配列、１つもしくは複数の置換、欠失もしくは付加を有していてもよく、その正味の効果は、所望の抗原結合活性を維持することである。例えば、各種の置換を、コードされるアミノ酸を変えないか、または保存的な変更をもたらすかのいずれかのコード領域において行うことができる。これらの置換は、本発明に包含される。保存的アミノ酸置換としては、以下の群の中での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。保存的置換は、作製されるポリペプチドに含有される１つまたは複数のアミノ酸残基を効果的に変更するが、置換は、作製される生じる抗原結合単位の抗原結合活性を妨げることは予期されない。コードされるアミノ酸残基を変えないヌクレオチド置換は、異なる系での遺伝子発現を最適化するために有用である。適切な置換は、当業者に公知であり、例えば、発現系における好ましいコドン使用を反映させるために行われる。
所望の場合、組換えポリヌクレオチドは、発現の検出および遺伝子産物の精製を容易にする異種配列を含んでいてもよい。このような配列の例は、本技術分野において公知であり、β－ガラクトシダーゼ、β－ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびこれらの誘導体などのレポータータンパク質をコードするものが挙げられる。精製を容易にする他の異種配列は、Ｍｙｃ、ＨＡ（インフルエンザウイルス赤血球凝集素由来）、Ｈｉｓ－６、ＦＬＡＧ、または免疫グロブリンのＦｃ部分、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などのエピトープをコードし得る。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、上記に記載のさまざまな化学的な機能的部分とコンジュゲートすることができる。通常利用される部分としては、検出可能なシグナルを引き起こす能力がある標識、シグナルペプチド、免疫学的反応性を増強する薬剤、固体支持体へのカップリングを容易にする薬剤、ワクチン担体、生物応答修飾物質、常磁性の標識および薬物が挙げられる。この部分は、組換え、または本技術分野において公知の他の手段によって、ポリヌクレオチドと共有的に連結され得る。
本発明のポリヌクレオチドは、同じ転写単位内の追加のコード配列、プロモーター、リボソーム結合部位およびポリアデニル化部位などの制御エレメント、同じまたは異なるプロモーターの制御下にある追加の転写単位、宿主細胞のクローニング、発現および形質転換を可能にする配列、ならびに本発明の実施形態を提供するために望ましくあり得る任意のこのような構築物などの追加配列を含むことができる。
本発明において具体化されるポリヌクレオチドは、化学合成、組換えクローニング方法、ＰＣＲまたはこれらの任意の組合せを使用して、得ることができる。化学ポリヌクレオチド合成の方法は、本技術分野において周知であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書に提供される配列データを使用して、ＤＮＡ合成装置を利用することによって、または商業サービスに注文することによって、所望のポリヌクレオチドを得ることができる。
所望の配列を含むポリヌクレオチドは、適切なベクターに挿入することができ、次に、これを、複製および増幅のための適切な宿主細胞に導入することができる。したがって、本発明は、１つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドを含むさまざまなベクターを包含する。本明細書に開示される抗原結合単位をコードする少なくとも１つのベクターを含む発現ベクターの選択可能なライブラリーも提供する。
本発明のベクターは、一般に、抗原結合単位を発現するために必要な、転写または翻訳制御配列を含む。適切な転写または翻訳制御配列としては、限定されるものではないが、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー結合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、ならびに転写および翻訳の終結部位が挙げられる。
プロモーターの選択は、ベクターが導入される宿主細胞に主に依存する。このような制御配列が、宿主細胞系と適合するならば、所望の軽鎖または重鎖遺伝子に通常付随するプロモーターを利用することも可能である。細胞特異的または組織特異的プロモーターも使用し得る。非常に多様な組織特異的プロモーターが、本分野における熟練技術者によって記載および利用されている。選択的動物細胞において作動可能なプロモーターの例としては、肝細胞特異的プロモーターおよび心筋特異的プロモーターが挙げられる。レシピエントの細胞型の選択に応じて、当業者には、本発明の発現ベクターの構築のために適用可能な他の適切な細胞特異的または組織特異的プロモーターについて公知である。
公知の分子クローニングまたは遺伝子工学技術を使用して、適切な転写制御配列、エンハンサー、ターミネーター、または本技術分野において公知の任意のその他の遺伝エレメントを、必要に応じて、本発明に従って発現されるインタクトな選択可能な融合遺伝子を追加して、作動可能な関係で組み込むことができる。上記に記載のエレメントに加えて、ベクターは、選択可能マーカー（例えば、ベクターで形質転換される宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子）を含有していてもよいが、このようなマーカー遺伝子は、宿主細胞に共導入される別のポリヌクレオチド配列に続けることができる。
本発明のポリヌクレオチドおよびベクターはいくつかの特定の使用を有する。これらは、例えば、抗原結合単位の産生のための発現系において有用である。このようなポリヌクレオチドは、所望のポリヌクレオチドの増幅をもたらすプライマーとして有用である。さらにまた、本発明のポリヌクレオチドはまた、ワクチン、診断薬および薬物を含む医薬組成物において有用である。
本発明の宿主細胞は、とりわけ、本発明のポリヌクレオチド、ベクターのリポジトリとして、またはこれらの抗原結合特異性に基づく所望の抗原結合単位の産生およびスクリーニングのための媒体として、使用することができる。
したがって、本発明は、所望の抗原と免疫反応性である抗原結合単位を特定する方法を提供する。このような方法は、（ａ）抗原結合単位の遺伝学的に多様なライブラリーを準備するステップであって、ライブラリーは少なくとも１つの本発明の抗原結合単位を含む、ステップ；（ｂ）抗原結合単位のライブラリーを所望の抗原と接触させるステップ；（ｃ）抗原結合単位および抗原の間の特異的結合を検出し、それによって、所望の抗原と免疫反応性である抗原結合単位を特定するステップを含むことができる。
抗原結合単位が所望の抗原と特異的に結合する能力は、本技術分野において十分に確立されているさまざまな手順によって試験することができる。HarlowおよびLane（１９８８年）、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York；Gherardiら（１９９０年）、J. Immunol. Meth.、１２６巻、６１～６８頁を参照のこと。典型的には、所望の結合特異性を示す抗原結合単位は、イムノアッセイによって、例えば、標識された抗原結合単位を、固体支持体または基材上に固定化した抗原と反応させることによって、直接検出することができる。一般に、抗原が接着されている基材は、イムノアッセイの間に、低レベルの非特異的結合を示す材料で製造される。固体支持体の例は、１つまたは複数の以下の種類の材料から作られている：プラスチックポリマー、ガラス、セルロース、ニトロセルロース、半導体材料および金属。一部の例では、基材は、ペトリ皿、クロマトグラフィービーズ、磁気ビーズなどである。
このような固相アッセイのためには、未反応の抗原結合単位は洗浄によって除去される。しかしながら、液相アッセイでは、未反応の抗原結合単位は、濾過またはクロマトグラフィーなどのいくつかの他の分離技術によって除去される。抗原が標識された抗原結合単位と結合した後、結合した標識の量が決定される。この技術の変形は、抗原が元の結合分子と飽和状態で結合している、競合アッセイである。本発明の抗原結合単位の集団を複合体に導入すると、より高い結合親和性を示すもののみが競合することが可能であり、このようにして、抗原と結合したままになる。
その代わりに、所与の抗原に対する特異的結合を、細胞選別によって評価することができ、これは、選別される細胞に対して所望の抗原を提供すること、次いで、標的細胞を検出可能な薬剤とカップリングさせた抗原結合単位で標識すること、続いて、細胞選別機で標識されていない細胞から標識された細胞を分離することを含む。精巧な細胞分離方法は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）である。微細流中において一列で移動する細胞にレーザービームを通過させ、次いで、蛍光標識された抗原結合単位によって結合したそれぞれの細胞の蛍光が測定される。
溶出した抗原結合単位のその後の分析は、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を規定するためのタンパク質配列決定を含んでいてもよい。推定されたアミノ酸配列に基づき、次いで、抗体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲ、ライブラリースクリーニング、既存の核酸データベースでの相同性サーチ、またはこれらの任意の組合せを含む組換えクローニング方法によって、得ることができる。通常利用されるデータベースとしては、限定されるものではないが、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳおよびＨＴＧＳが挙げられる。
抗原結合単位のライブラリーがファージまたは細菌粒子を表示する場合、選択は、好ましくは、アフィニティークロマトグラフィーを使用して行われる。この方法は、典型的には、抗原でコーティングされたプレート、カラムマトリックス、細胞または溶液中のビオチン化抗原とのライブラリーのファージ抗原結合単位の結合、続いて、捕捉により進められる。固相と結合したファージまたは細菌は、洗浄され、次いで、可溶性ハプテン、酸またはアルカリによって溶出される。その代わりに、抗原の濃度の増加を使用して、アフィニティーマトリックスから抗原結合単位を解離させることができる。抗原との極めて高い親和性またはアビディティーを有するある特定の抗原結合単位のためには、効率的な溶出は、ＷＯ９２／０１０４７に記載の高ｐＨまたは穏和な還元溶液を必要とし得る。
選択の効率は、洗浄の間の解離の動力学、および単一ファージまたは細菌上の複数の抗原結合単位が固体支持体上の抗原と同時に結合することができるか否かを含む、いくつかの要因の組合せに依存する可能性がある。例えば、速い解離速度（および弱い結合親和性）を有する抗体は、短い洗浄、多価ディスプレイおよび固体支持体での抗原の高コーティング密度の使用によって、維持することができる。反対に、遅い解離速度（および良好な結合親和性）を有する抗原結合単位の選択は、長い洗浄、一価ファージおよび抗原の低コーティング密度の使用によることが好ましくあり得る。
所望の場合、抗原結合単位のライブラリーは、望ましくない抗原結合単位を対抗選択する無関連抗原に対して、事前に選択することができる。ライブラリーはまた、例えば、抗イディオタイプ抗原結合単位を単離するために、関連抗原に対して、事前に選択されてもよい。
本発明の宿主細胞
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれか１つを発現する宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞は、典型的には、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれか１つをコードする核酸を含む。
本発明は、上記に記載の、ポリヌクレオチド、ベクターまたはベクターのライブラリーをトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。ベクターは、エレクトロポレーション、微粒子銃；リポフェクション、感染（ベクターが感染病原体にカップリングされている場合）、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランまたは他の物質を利用するトランスフェクションを含む、多くの適切な手段のいずれかによって、適切な原核細胞または真核細胞に導入することができる。ベクターを導入するための手段の選択は、宿主細胞の特色に依存する場合が多い。
ほとんどの動物細胞については、上述の方法のいずれかがベクター送達のために適切である。好ましい動物細胞は、外因的に導入された遺伝子産物を大量に、例えば、ミリグラムレベルで発現する能力がある、脊椎動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞である。好ましい細胞の非限定的な例は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞である。
適切な宿主細胞に導入されたらすぐに、抗原結合単位の発現を、本技術分野において公知の任意の核酸またはタンパク質アッセイを使用して決定することができる。例えば、軽鎖ＣＤＲもしくは重鎖ＣＤＲ、または抗原結合単位の転写されたｍＲＮＡの存在は、従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット分析）、増幅手順（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ（米国特許第５，６９５，９３７号）およびアレイ系技術（例えば、米国特許第５，４０５，７８３号、第５，４１２，０８７号および第５，４４５，９３４号を参照のこと）によって、抗原結合単位のポリヌクレオチドのいずれかの領域と相補的なプローブを使用して、検出および／または定量化することができる。
ベクターの発現は、発現した抗原結合単位を調べることによって決定することもできる。さまざまな技術がタンパク質分析のために本技術分野において利用可能である。これらとしては、限定されるものではないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫放射定量アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を使用する）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥが挙げられる。
抗原結合単位の調製
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれかを製造する方法であって、抗原結合単位を発現させるために適切な条件下、抗原結合単位を発現する宿主細胞を培養すること、および宿主細胞によって発現される抗原結合単位を単離することを含む、方法を提供する。
発現した抗原結合単位は、本技術分野において公知のさまざまなタンパク質精製技術を使用して単離することができる。一般に、抗原結合単位は、分泌されたポリペプチドとして培地から単離されるが、これらは、シグナルペプチドなしで直接産生される場合、宿主細胞溶解物または細菌ペリプラズムから回収することができる。抗原結合単位が膜結合している場合、これらは、本分野における熟練技術者によって通常利用される適切な界面活性剤溶液によって可溶化することができる。回収された抗原結合単位は、塩析（例えば、硫酸アンモニウムを用いて）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、中性ｐＨで流されるカチオンまたはアニオン交換カラムにおいて、イオン強度が増加するステップ勾配で溶出させる）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル濾過ＨＰＬＣを含む）、ならびにタグアフィニティカラムまたはプロテインＡ、プロテインＧ、ヒドロキシアパタイトおよび抗免疫グロブリンなどのアフィニティ樹脂上でのクロマトグラフィーによって、さらに精製されてもよい。
加えて、付加された化学リンカー、蛍光色素などの検出可能部分、酵素、基質、化学発光部分、ストレプトアビジン、アビジンもしくはビオチンなどの特異的結合部分、または薬物コンジュゲートで誘導体化された免疫グロブリンは、本発明の方法および組成物において利用することができる。
本明細書において、化学的な機能的部分とコンジュゲートされた抗原結合単位をさらに開示する。典型的には、この部分は、検出可能なシグナルを発生させる能力がある標識である。これらのコンジュゲートされた抗原結合単位は、例えば、腫瘍量の定量化、ならびに転移病巣の画像化および腫瘍画像化などの検出システムにおいて有用である。このような標識は、本技術分野において公知であり、限定されるものではないが、放射性同位元素、酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、基質補助因子および阻害剤が挙げられる。例えば、このような標識の使用を教示する特許である米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号を参照されたい。この部分は、抗原結合単位と共有的に連結することができ、組換えで連結することができ、または二次抗体、プロテインＡもしくはビオチン－アビジン複合体などの二次試薬によって抗原結合単位とコンジュゲートすることができる。
他の機能的部分としては、シグナルペプチド、免疫学的反応性を増強する薬剤、固体支持体へのカップリングを容易にする薬剤、ワクチン担体、生物応答修飾物質、常磁性の標識および薬物が挙げられる。シグナルペプチドは、細胞膜、通常は、真核細胞における小胞体、ならびに細菌の内膜もしくは内膜および外膜の両方のいずれかを通り抜けるように、新たに合成されるタンパク質を方向付ける短いアミノ酸配列である。シグナルペプチドは、ポリペプチドのＮ末端部分またはポリペプチドのＣ末端部分に存在することができ、ポリペプチドの生合成および分泌の間に細胞から酵素的に除去することができる。このようなペプチドは、抗原結合単位に組み込まれて、合成分子の分泌を可能にし得る。
免疫学的反応性を増強する薬剤としては、限定されるものではないが、細菌のスーパー抗原が挙げられる。固体支持体へのカップリングを容易にする薬剤としては、限定されるものではないが、ビオチンまたはアビジンが挙げられる。免疫原の担体としては、限定されるものではないが、任意の生理学的に許容される緩衝液が挙げられる。生物応答修飾物質としては、サイトカイン、特に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン－２、インターロイキン－４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびγ－インターフェロンが挙げられる。
適切な薬物部分としては、抗新生物剤が挙げられる。非限定的な例としては、放射性同位元素、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよび硫酸ビンデシンなどのビンカアルカロイド、アドリアマイシン、ブレオマイシン硫酸塩、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、エトポシド、フルオロウラシル、ロムスチン、メクロレタミン（mechlororethamine）塩酸塩、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ペントスタチン、ピポブロマン、プロカルバジン（procarbaze）塩酸塩、ストレプトゾトシン、タキソール、チオグアニンおよびウラシルマスタードが挙げられる。
抗原結合単位を含む免疫毒素は、組換え手段によって産生させることができる。各種の免疫毒素の産生は本技術分野において周知であり、方法は、例えば、「Monoclonal Antibody-toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet」、Thorpeら（１９８２年）、Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine、Academic Press、１６８～１９０頁；Vitatta（１９８７年）、Science、２３８巻、１０９８～１１０４頁；ならびにWinterおよびMilstein（１９９１年）、Nature、３４９巻、２９３～２９９頁に見ることができる。適切な毒素としては、限定されるものではないが、リシン、放射性核種、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、レストリクトシンなどの真菌毒素およびホスホリパーゼ酵素が挙げられる。一般に、「Chimeric Toxins」、OlsnesおよびPihl、Pharmac. Ther、１５巻、３５５～３８１頁（１９８１年）；ならびに「Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy」、BaldwinおよびByers編、１５９～１７９頁、２２４～２６６頁、Academic Press（１９８５年）を参照のこと。
化学的な機能的部分は、例えば、抗原結合単位および機能的部分をコードする融合遺伝子を作出することによって、組換え的に作ることができる。その代わりに、抗原結合単位は、さまざまな十分に確立された化学的手順のいずれかによって、この部分に化学的に結合させることができる。例えば、この部分がタンパク質である場合、連結は、ヘテロ二官能性架橋剤、例えば、ＳＰＤＰ、カルボジイミドグルタルアルデヒドなどの方法によってであり得る。この部分は、共有的に連結することができ、または二次抗体、プロテインＡもしくはビオチン－アビジン複合体などの二次試薬によってコンジュゲートすることができる。常磁性の部分および抗体とのそれらのコンジュゲーションは本技術分野において周知である。例えば、Miltenyiら（１９９０年）Cytometry、１１巻、２３１～２３８頁を参照のこと。
使用および処置の方法
ＣＤ４７特異的抗原結合単位およびそれを含む医薬組成物は、限定されるものではないが、処置および診断を含む、幅広い範囲の適用を見出すことができる。
一実施形態では、本開示は、薬学的に許容される賦形剤、および本明細書に開示される抗原結合単位のいずれかを含む医薬組成物を提供する。
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する方法であって、ＣＤ４７を発現する細胞を本明細書に開示されるいずれかの抗原結合単位と接触させることを含む、方法を提供する。一部の態様では、細胞はがん細胞である。一部の態様では、細胞は、非リンパ腫のがん細胞である。一部の態様では、細胞は、非白血病のがん細胞である。一部の態様では、細胞は、非リンパ腫および非白血病のがん細胞である。一部の態様では、細胞は、血液がん細胞である。血液がんとしては、限定されるものではないが、白血病、リンパ腫および骨髄腫が挙げられる。白血病のある特定の形態としては、非限定的な例として、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄白血病（ＡＭＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）；および骨髄異形成症候群が挙げられる。リンパ腫のある特定の形態としては、非限定的な例として、ホジキンリンパ腫、低悪性度および高悪性度の両方の非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）が挙げられる。骨髄腫のある特定の形態としては、非限定的な例として、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、および軽鎖またはベンスジョーンズ骨髄腫が挙げられる。固形腫瘍としては、例えば、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、メラノーマ腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、膀胱腫瘍、平滑筋肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、脳腫瘍、食道腫瘍、胃腫瘍、肝臓腫瘍および腎臓腫瘍が挙げられる。
さらに別の実施形態では、本開示は、ヒト対象においてＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する方法であって、ヒト対象に薬学的に許容される賦形剤および本明細書に開示されるいずれかの抗原結合単位を含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。一部の態様では、細胞はがん細胞である。一部の態様では、細胞は、非リンパ腫のがん細胞である。一部の態様では、細胞は、非白血病のがん細胞である。一部の態様では、細胞は、非リンパ腫および非白血病のがん細胞である。一部の態様では、細胞は、血液がん細胞である。血液がんとしては、限定されるものではないが、白血病、リンパ腫および骨髄腫が挙げられる。白血病のある特定の形態としては、非限定的な例として、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄白血病（ＡＭＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）；および骨髄異形成症候群が挙げられる。リンパ腫のある特定の形態としては、非限定的な例として、ホジキンリンパ腫、低悪性度および高悪性度の両方の非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）が挙げられる。骨髄腫のある特定の形態としては、非限定的な例として、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、および軽鎖またはベンスジョーンズ骨髄腫が挙げられる。固形腫瘍としては、例えば、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、メラノーマ腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、膀胱腫瘍、平滑筋肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、脳腫瘍、食道腫瘍、胃腫瘍、肝臓腫瘍および腎臓腫瘍が挙げられる。
本明細書に開示される貪食作用を誘導する方法の一部の態様では、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用は、１％～１００％の範囲内の効率で生じる。一部の例では、貪食作用は、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の効率で生じる。一部の例では、貪食作用は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の効率で生じる。本明細書に開示されるいずれかの実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は、参照抗原結合単位のものより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する。このような参照抗原結合単位は、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、もしくは３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列、または任意のその他の公知の抗ＣＤ４７抗原結合単位を有することができる。貪食作用の程度は本技術分野において公知の任意の方法によって決定することができる。一部の場合では、貪食作用の程度は、マクロファージの集団の中で貪食作用を行ったマクロファージ（食細胞と称する）の数で決定される。例えば、１００マクロファージあたりの食細胞の数を決定することができ、それによって、貪食作用の程度を百分率または食細胞指数として表すことができる。
本明細書に開示される貪食作用を誘導する方法の一部の態様では、前記方法で使用される抗原結合単位は、著しい赤血球凝集を引き起こさない。一部の場合では、本明細書に開示される抗原結合単位のいずれかを使用する前記方法において誘導される赤血球凝集は、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列を有する参照抗原結合単位によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１分の１である。一部の場合では、赤血球が本発明の抗原結合単位と接触する際に誘導される赤血球凝集は、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列を有する参照抗原結合単位によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１分の１、多くとも２分の１、多くとも３分の１、多くとも４分の１、多くとも５分の１、多くとも６分の１、多くとも７分の１、多くとも８分の１、多くとも９分の１、または多くとも１０分の１である。一部の場合では、赤血球が本発明の抗原結合単位と接触する際に誘導される赤血球凝集は、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、または３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列を有する参照抗原結合単位によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１０分の１である。
一部の実施形態では、本開示は、がんを処置することを必要とする対象においてがんを処置する方法を提供する。一部の態様では、この方法は、がんを処置することを必要とする対象に本明細書に開示されるいずれかの抗原結合単位の有効量を投与することを含む。一部の態様では、がんは、非リンパ腫のがんである。一部の態様では、がんは、非白血病のがんである。一部の態様では、がんは、非リンパ腫および非白血病のがんである。一部の態様では、細胞は、血液がん細胞である。血液がんとしては、限定されるものではないが、白血病、リンパ腫および骨髄腫が挙げられる。白血病のある特定の形態としては、非限定的な例として、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄白血病（ＡＭＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）；および骨髄異形成症候群が挙げられる。リンパ腫のある特定の形態としては、非限定的な例として、ホジキンリンパ腫、低悪性度および高悪性度の両方の非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）が挙げられる。骨髄腫のある特定の形態としては、非限定的な例として、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、および軽鎖またはベンスジョーンズ骨髄腫が挙げられる。固形腫瘍としては、例えば、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、メラノーマ腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、膀胱腫瘍、平滑筋肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、脳腫瘍、食道腫瘍、胃腫瘍、肝臓腫瘍および腎臓腫瘍が挙げられる。ほとんどの場合で、有効量は、本技術分野において周知の方法で試験することによって経験的に決定される。
一部の実施形態では、本開示は、がんを処置することを必要とする対象においてがんを処置する方法を提供する。一部の態様では、この方法は、がんを処置することを必要とする対象に薬学的に許容される賦形剤および本明細書に開示される抗原結合単位のいずれかを含む医薬品の有効量を投与することを含む。一部の態様では、がんは、非リンパ腫のがんである。一部の態様では、がんは、非白血病のがんである。一部の態様では、がんは、非リンパ腫および非白血病のがんである。一部の態様では、細胞は、血液がん細胞である。血液がんとしては、限定されるものではないが、白血病、リンパ腫および骨髄腫が挙げられる。白血病のある特定の形態としては、非限定的な例として、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄白血病（ＡＭＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）；および骨髄異形成症候群が挙げられる。リンパ腫のある特定の形態としては、非限定的な例として、ホジキンリンパ腫、低悪性度および高悪性度の両方の非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）が挙げられる。骨髄腫のある特定の形態としては、非限定的な例として、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、および軽鎖またはベンスジョーンズ骨髄腫が挙げられる。固形腫瘍としては、例えば、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、メラノーマ腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、膀胱腫瘍、平滑筋肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、脳腫瘍、食道腫瘍、胃腫瘍、肝臓腫瘍および腎臓腫瘍が挙げられる。ほとんどの場合で、有効量は、本技術分野において周知の方法で試験することによって経験的に決定される。
本発明の方法による処置のための目的のがんとしては、限定されるものではないが、白血病；Ｔ-ＡＬＬ、Ｂ－ＡＬＬ、ＡＭＬなどの急性白血病；リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）；肉腫；メラノーマ；腺腫；卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、扁平上皮癌、移行上皮癌などを含む固形組織の癌腫、低酸素腫瘍、口、喉、喉頭および肺の扁平上皮癌、子宮頸がんおよび膀胱がんなどの泌尿生殖器がん、造血がん、頭頸部がん、ならびに神経膠腫、星状細胞腫、髄膜腫などの神経系がん、乳頭腫などの良性病変などが挙げられる。
がんの処置は、限定されるものではないが、がん細胞の増殖の減少、および非がん性細胞ががん性細胞になる発生率の減少を含む、がん細胞の成長の減少によって証拠付けることができる。がん細胞の成長における減少が達成されたか否かは、限定されるものではないが、［３Ｈ］－チミジン取り込み；所定の期間にわたる細胞の数のカウント；ＡＭＬと関連するマーカーの検出および／または測定などを含む、任意の公知のアッセイを使用して容易に決定することができる。物質または特定の量の物質ががんの処置において有効であるか否かは、限定されるものではないが、組織診、造影剤によるＸ線検査、ＣＡＴスキャンおよび個体の血液中のがんと関連する腫瘍マーカーの検出を含む、がんのためのさまざまな公知の診断アッセイのいずれかを使用して評価することができる。物質は、全身的または局所的に、通常は、全身的に投与することができる。
一部の態様では、がんの処置は腫瘍体積の減少によって証拠付けることができる。腫瘍体積は本分野において公知の任意の方法を使用して決定することができる。例えば、腫瘍体積はキャリパーを使用して腫瘍を測定することによって決定することができる。このような場合では、腫瘍の二次元を測定することができ、腫瘍体積は、式Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａおよびｂは、第１および第２の直径である）を使用して決定することができる。一部の場合では、第１の直径は、長径または２つの直径のより長い方である。一部の場合では、第２の直径は、短径または２つの直径のより短い方である。
一部の態様では、がんの処置は腫瘍体積の減少によって証拠付けることができる。一部の場合では、腫瘍体積は１％～１００％の範囲内の百分率だけ減少する。一部の例では、腫瘍体積は、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％減少する。一部の例では、腫瘍体積は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％減少する。本明細書に開示されるいずれかの実施形態の一部の態様では、抗原結合単位は、参照抗原結合単位のものより高い程度まで腫瘍体積を減少させることができる。このような参照抗原結合単位は、１）配列番号２４０～２４１、２）配列番号２４２～２４３、もしくは３）配列番号２４４～２４５で示されるアミノ酸配列、または任意のその他の公知の抗ＣＤ４７抗原結合単位を有することができる。
一部の態様では、参照抗原結合単位と比較される本発明の抗原結合単位の効果の比較は、抗腫瘍有効性を計算することによって決定することができる。このような場合では、腫瘍体積を上記で記載したようにして測定することができる。その代わりに、腫瘍のサイズまたは腫瘍の他の適切な特徴の異なるパラメーターを決定または測定することができる。腫瘍体積などの定量化できる特徴で作業する場合、抗腫瘍有効性は、式：Ｔ／Ｃ（式中、Ｔは処置群について選択された測定値（例えば、腫瘍体積）であり、Ｃは、対照群について選択された測定値（例えば、腫瘍体積）である）を使用することによって決定することができる。抗腫瘍有効性は、任意の所望の期間にわたって決定することができ、任意の所望の試料の数からの平均値を使用して決定することができる。抗腫瘍有効性は、数またはパーセントとして表すことができる。一部の例では、抗腫瘍有効性は、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％であり得る。一部の例では、抗腫瘍有効性は、最大で１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％であり得る。一部の例では、抗腫瘍有効性は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％であり得る。
本明細書に開示される組成物、例えば、抗原結合単位および医薬組成物は、任意の医学的に適切な手順、例えば、血管内（静脈内、動脈内、毛細血管内）投与、リンパ節への注射などを使用して投与することができる。血管内注射は、静脈注射または動脈注射によってであってもよい。特定の患者に投与される組成物の有効量は、さまざまな要因に依存し、そのいくつかは、患者間で異なり、経験的に決定することができる。組成物の投薬量は、決定された処置計画、投与経路、薬物療法の性質、薬物療法に対する腫瘍の感受性などに依存する。本明細書に開示される抗原結合単位について利用可能なＬＤ５０動物データおよび他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じて、個体のための最大安全用量を決定することができる。例えば、静脈内投与される用量は、治療組成物が投与されるより多くの体液を考えると、局所投与される用量よりも高くてもよい。同様に、身体から迅速に除去される組成物は、治療濃度を維持するために、より高い用量で、または反復用量で投与されてもよい。通常のスキルを利用して、能力がある臨床医は、特定の組成物の投薬量を最適化することが可能であろう。
一部の態様では、がんの処置のための方法を提供し、この方法は、本発明の抗原結合単位を含む先述の医薬組成物のいずれかの有効量を、がんの処置を必要とする対象に投与することを含む。一部の実施形態では、がんは、白血病、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、非小細胞肺がんもしくは癌を含む肺がん、肝臓がん、卵巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、皮膚がん、脳腫瘍または肝細胞癌（ＨＣＣ）である。ある特定の態様では、がんは、白血病である。がんは固形腫瘍であり得る。がんは、混合系統白血病（ＭＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病、および／または他の白血病；骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、軽鎖またはベンスジョーンズ骨髄腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫であり得る。がんは、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫のすべてのサブタイプなどのリンパ腫であり得る。
本開示は、他の経路を調節することが公知の薬剤、もしくは同じ経路の他の成分、またはさらに標的酵素が重複するセットを、本発明の抗原結合単位または本発明の抗原結合単位を含む医薬組成物と組み合わせて使用する、組合せ治療のための方法も提供する。一態様では、このような治療としては、限定されるものではないが、相乗的または相加的な治療効果を提供するための、本開示の１つまたは複数の抗原結合単位と、化学療法剤、治療用抗体および放射線処置の組合せが挙げられる。
所望の場合、本発明の抗原結合単位は、Ｎｏｔｃｈ阻害剤および／またはｃ－Ｍｙｂ阻害剤と組み合わせて使用することができる。所望の場合、本開示の抗原結合単位または医薬組成物は、ＭＬＬ－ＷＤＲ５阻害剤および／またはＤｏｔ１１阻害剤と組み合わせて使用することができる。
多くの化学療法剤が、現在、本技術分野において公知であり、本発明の抗原結合単位と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、化学療法剤は、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、インターカレート抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生体応答修飾物質、抗ホルモン剤、血管新生阻害剤および抗アンドロゲン剤からなる群から選択される。
非限定的な例は、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（イマチニブメシル酸塩）、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ボルテゾミブ）、カソデックス（ビカルタミド）、Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ）およびアドリアマイシン、ならびに化学療法剤の宿主などの、化学療法剤、細胞毒性剤および非ペプチド低分子である。化学療法剤の非限定的な例としては、チオテパおよびシクロホスファミド（cyclosphosphamide）（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパおよびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスルアミドおよびトリメチロロメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチラメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア（nitrosurea）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、Ｃａｓｏｄｅｘ（商標）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジンアナログ、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン剤；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォミチン；エリプチニウム酢酸塩；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。また、適切な化学療法細胞調整剤としては、例えば、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（商標））、ラロキシフェン、アロマターゼを阻害する４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ １１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン剤などの腫瘍におけるホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；カンプトテシン－１１（ＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤のＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）が挙げられる。所望の場合、本開示の抗原結合単位または医薬組成物は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｔａｘｏｌ（登録商標）、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、ＡＢＶＤ、ＡＶＩＣＩＮＥ、アバゴボマブ、アクリジンカルボキサミド、アデカツムマブ、１７－Ｎ－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、アルファラジン、アルボシジブ、３－アミノピリジン－２－カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン、アモナフィド、アントラセンジオン、抗ＣＤ２２免疫毒素、抗新生物剤、抗腫瘍性ハーブ、アパジコン、アチプリモド、アザチオプリン、ベロテカン、ベンダムスチン、ＢＩＢＷ ２９９２、ビリコダル、ブロスタリシン、ブリオスタチン、ブチオニンスルホキシミン、ＣＢＶ（化学療法）、カリクリン、細胞周期非特異的抗新生物剤、ジクロロ酢酸、ディスコデルモリド、エルサミトルシン、エノシタビン、エポチロン、エリブリン、エベロリムス、エキサテカン、エクシスリンド、フェルギノール、フォロデシン、ホスフェストロール、ＩＣＥ化学療法レジメン、ＩＴ－１０１、イメキソン、イミキモド、インドロカルバゾール、イロフルベン、ラニキダール、ラロタキセル、レナリドミド、ルカントン、ルルトテカン、マホスファミド、ミトゾロミド、ナホキシジン、ネダプラチン、オラパリブ、オルタタキセル、ＰＡＣ－１、ポーポー、ピクサントロン、プロテアソーム阻害剤、レベッカマイシン、レシキモド、ルビテカン、ＳＮ－３８、サリノスポラミドＡ、サパシタビン、スタンフォードＶ、スワインソニン、タラポルフィン、タリキダル、テガフール－ウラシル、テモダール、テセタキセル、四硝酸トリプラチン、トリス（２－クロロエチル）アミン、トロキサシタビン、ウラムスチン、バジメザン、ビンフルニン、ＺＤ６１２６またはゾスキダルなどの通常処方される抗がん薬と組み合わせて使用することができる。
本開示は、本明細書で提供される本発明の抗原結合単位または医薬組成物を、哺乳動物において異常細胞の成長を阻害するため、または過剰増殖性障害を処置するための放射線治療と組み合わせて使用するための方法にさらに関する。放射線治療を投与するための技術は本技術分野において公知であり、これらの技術を本明細書に記載の組合せ治療において使用することができる。
放射線治療は、限定されないが、対外照射治療、内部放射線治療、インプラント放射線、定位放射線手術、全身放射線治療、放射線治療および永久的または一時的な組織内小線源治療を含む、いくつかの方法の１つまたは方法の組合せによって投与することができる。本明細書で使用される「小線源治療」という用語は、腫瘍もしくは他の増殖性組織の疾患部位で、またはその近傍で、身体内に挿入された空間的に密封された放射性物質によって送達される放射線治療を指す。この用語は、限定されないが、放射性同位元素（例えば、Ａｔ－２１１、Ｉ－１３１、Ｉ－１２５、Ｙ－９０、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｂｉ－２１２、Ｐ－３２、およびＬｕの放射性同位元素）への曝露を含むことを意図する。本開示の細胞調整剤としての使用のための適切な放射線源は、固体および液体の両方を含む。非限定的な例として、放射線源は、固体源としてＩ－１２５、Ｉ－１３１、Ｙｂ－１６９、Ｉｒ－１９２、固体源としてＩ－１２５などの放射性核種、または光子、ベータ粒子、ガンマ線もしくは他の治療用放射線を発する他の放射性核種であり得る。放射性物質はまた、放射性核種の任意の溶液、例えば、Ｉ－１２５もしくはＩ－１３１の溶液から作られる流体であり得るか、または放射性流体は、Ａｕ－１９８、Ｙ－９０などの固体放射性核種の小粒子を含有する適切な流体のスラリーを使用して作製することができる。また、放射性核種は、ゲルまたは放射性マイクロスフェアで具体化することができる。
本開示の抗原結合単位または医薬組成物は、抗血管新生剤、シグナル伝達阻害剤、抗増殖剤、解糖阻害剤またはオートファジー阻害剤から選択される１つまたは複数の物質の量と組み合わせて使用することができる。
ＭＭＰ－２（マトリックスメタロプロテイナーゼ２）阻害剤、ＭＭＰ－９（マトリックスメタロプロテイナーゼ（matrix-metalloprotienase）９）阻害剤およびＣＯＸ－ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）（COX-11 (cyclooxygenase 11)）阻害剤などの抗血管新生剤は、本開示の抗原結合単位および本明細書に記載の医薬組成物と併せて使用することができる。抗血管新生剤としては、例えば、ラパマイシン、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ソラフェニブ、スニチニブおよびベバシズマブが挙げられる。有用なＣＯＸ－ＩＩ阻害剤の例としては、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標）（アレコキシブ）、バルデコキシブおよびロフェコキシブが挙げられる。有用なマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の例は、ＷＯ９６／３３１７２（１９９６年１０月２４日公開）、ＷＯ９６／２７５８３（１９９６年３月７日公開）、欧州特許出願第９７３０４９７１．１号（１９９７年７月８日出願）、欧州特許出願第９９３０８６１７．２号（１９９９年１０月２９日出願）、ＷＯ９８／０７６９７（１９９８年２月２６日公開）、ＷＯ９８／０３５１６（１９９８年１月２９日公開）、ＷＯ９８／３４９１８（１９９８年８月１３日公開）、ＷＯ９８／３４９１５（１９９８年８月１３日公開）、ＷＯ９８／３３７６８（１９９８年８月６日公開）、ＷＯ９８／３０５６６（１９９８年７月１６日公開）、欧州特許公開第６０６，０４６号（１９９４年７月１３日公開）、欧州特許公開第９３１，７８８号（１９９９年７月２８日公開）、ＷＯ９０／０５７１９（１９９０年５月３１日公開）、ＷＯ９９／５２９１０（１９９９年１０月２１日公開）、ＷＯ９９／５２８８９（１９９９年１０月２１日公開）、ＷＯ９９／２９６６７（１９９９年６月１７日公開）、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１１１３号（１９９８年７月２１日出願）、欧州特許出願第９９３０２２３２．１号（１９９９年３月２５日出願）、英国特許出願第９９１２９６１．１号（１９９９年６月３日出願）、米国仮出願第６０／１４８，４６４号（１９９９年８月１２日出願）、米国特許第５，８６３，９４９号（１９９９年１月２６日発行）、米国特許第５，８６１，５１０号（１９９９年１月１９日発行）および欧州特許公開第７８０，３８６号（１９９７年６月２５日公開）に記載されており、これらのすべては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。好ましいＭＭＰ－２およびＭＭＰ－９阻害剤は、ＭＭＰ－１を阻害する活性をほとんどまたはまったく有さないものである。より好ましくは、他のマトリックスメタロプロテイナーゼ（例えば、ＭＡＰ－１、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－４、ＭＭＰ－５、ＭＭＰ－６、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１１（MMP-ll）、ＭＭＰ－１２およびＭＭＰ－１３）に対して、ＭＭＰ－２および／またはＡＭＰ－９を選択的に阻害するものである。本開示において有用ないくつかのＭＭＰ阻害剤の特定の例は、ＡＧ－３３４０、ＲＯ ３２－３５５５およびＲＳ １３－０８３０である。
オートファジー阻害剤としては、限定されるものではないが、クロロキン、３－メチルアデニン、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ（商標））、バフィロマイシンＡ１、５－アミノ－４－イミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、オカダ酸、タンパク質ホスファターゼタイプ２Ａまたはタイプ１を阻害するオートファジー抑制藻類毒素、ｃＡＭＰのアナログ、ならびにアデノシン、ＬＹ２０４００２、Ｎ６－メルカプトプリンリボシドおよびビンブラスチンなどのｃＡＭＰレベルを上昇させる薬物が挙げられる。加えて、限定されるものではないが、ＡＴＧ５（オートファジーにおいて関与する）を含むタンパク質の発現を阻害するアンチセンスまたはｓｉＲＮＡも使用され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合単位および医薬組成物は、潤滑剤としても公知の液体または固体組織バリアと製剤化されるか、またはこれらと併せて投与される。組織バリアの例としては、限定されるものではないが、多糖類、ポリグリカン、セプラフィルム、インターシードおよびヒアルロン酸が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合単位と併せて投与される医薬は、吸入によって有用に送達される任意の適切な薬物、例えば、鎮痛剤、例えば、コデイン、ジヒドロモルヒネ、エルゴタミン、フェンタニルまたはモルヒネ；狭心症調製物、例えば、ジルチアゼム；抗アレルギー剤、例えば、クロモグリケート、ケトチフェンまたはネドクロミル；抗感染剤、例えば、セファロスポリン、ペニシリン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリンまたはペンタミジン；抗ヒスタミン剤、例えば、メタピリレン；抗炎症剤、例えば、ベクロメタゾン、フルニソリド、ブデソニド、チプレダン、トリアムシノロンアセトニドまたはフルチカゾン；鎮咳剤、例えば、ノスカピン；気管支拡張剤、例えば、エフェドリン、アドレナリン、フェノテロール、ホルモテロール、イソプレナリン、メタプロテレノール、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、ピルブテロール、レプロテロール、リミテロール、サルブタモール、サルメテロール、テルブタリン、イソエタリン、ツロブテロール、オルシプレナリンまたは（－）－４－アミノ－３，５－ジクロロ－α－［［［６－［２－（２－ピリジニル）エトキシ］ヘキシル］－アミノ］メチル］ベンゼンメタノール；利尿剤、例えば、アミロリド；抗コリン作用剤、例えば、イプラトロピウム、アトロピンまたはオキシトロピウム；ホルモン剤、例えば、コルチゾン、ヒドロコルチゾンまたはプレドニゾロン；キサンチン、例えば、アミノフィリン、コリンテオフィリネート、リジンテオフィリネートまたはテオフィリン；ならびに治療用タンパク質およびペプチド、例えば、インスリンまたはグルカゴンを含む。適切である場合、医薬は、医薬の活性および／または安定性を最適化するために、塩の形態で（例えば、アルカリ金属塩もしくはアミン塩として、または酸付加塩として）、またはエステル（例えば、低級アルキルエステル）として、または溶媒和物（例えば、水和物）として使用されることは当業者には明らかであろう。
組合せ治療のために有用な他の治療剤の例としては、限定されるものではないが、上記に記載の薬剤、放射線治療、ホルモンアンタゴニスト、ホルモンおよびそれらの放出因子、甲状腺および抗甲状腺薬、エストロゲンおよびプロゲスチン、アンドロゲン、副腎皮質刺激ホルモン；副腎皮質ステロイドおよびそれらの合成アナログ；副腎皮質ホルモンの合成および作用の阻害剤、インスリン、経口血糖降下剤、ならびに膵内分泌部の薬理学、石灰化および骨代謝回転に影響を及ぼす薬剤：リン酸カルシウム、副甲状腺ホルモン、ビタミンＤ、カルシトニン、水溶性ビタミン、ビタミンＢ複合体、アスコルビン酸、脂溶性ビタミン、ビタミンＡ、ＫおよびＥなどのビタミン、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、ムスカリン受容体アゴニストおよびアンタゴニスト；抗コリンエステラーゼ剤；神経筋接合部および／または自律神経節で作用する薬剤；カテコールアミン、交感神経刺激薬およびアドレナリン受容体アゴニストまたはアンタゴニスト；ならびに５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ、セロトニン）受容体アゴニストおよびアンタゴニストが挙げられる。
治療剤としては、ヒスタミンおよびヒスタミンアンタゴニスト、ブラジキニンおよびブラジキニンアンタゴニスト、５－ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）、膜リン脂質の選択的加水分解の産物の生体内変化によって生じる脂質物質、エイコサノイド、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、アスピリン、非ステロイド性抗炎症剤、解熱鎮痛剤、プロスタグランジンおよびトロンボキサンの合成を阻害する薬剤、誘導型シクロオキシゲナーゼの選択的阻害剤、誘導型シクロオキシゲナーゼ－２の選択的阻害剤、オータコイド、パラクリンホルモン、ソマトスタチン、ガストリン、体液性および細胞性免疫応答に関与する相互作用を媒介するサイトカイン、脂質由来オータコイド、エイコサノイド、β－アドレナリンアゴニスト、イプラトロピウム、グルココルチコイド、メチルキサンチン、ナトリウムチャネルブロッカー、オピオイド受容体アゴニスト、カルシウムチャネルブロッカー、膜安定化剤ならびにロイコトリエン阻害剤などの疼痛および炎症に対する薬剤も挙げることができる。
本明細書において考慮される追加の治療剤としては、利尿剤、バソプレシン、腎臓の水保存に影響を及ぼす薬剤、レンニン、アンジオテンシン、心筋虚血の処置において有用な薬剤、抗高血圧剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、β－アドレナリン受容体アンタゴニスト、高コレステロール血症の処置のための薬剤および脂質異常症の処置のための薬剤が挙げられる。
考慮される他の治療剤としては、胃の酸性度の制御のために使用される薬物、消化性潰瘍の処置のための薬剤、胃食道逆流症の処置のための薬剤、消化管運動改善剤、制吐剤、過敏性腸症候群において使用される薬剤、下痢のために使用される薬剤、便秘のために使用される薬剤、炎症性腸疾患のために使用される薬剤、胆道疾患のために使用される薬剤、膵臓疾患のために使用される薬剤、原虫感染症を処置するために使用される治療剤、マラリア、アメーバ症、ジアルジア症、トリコモナス症、トリパノソーマ症および／もしくはリーシュマニア症を処置するために使用される薬物、ならびに／または蠕虫症の化学療法において使用される薬物が挙げられる。他の治療剤としては、抗菌剤、スルホンアミド、トリメトプリム－スルファメトキサゾールキノロン、および尿路感染症のための薬剤、ペニシリン、セファロスポリンなど、β－ラクタム抗生物質、アミノグリコシドを含む薬剤、タンパク質合成阻害剤、結核、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍコンプレックス症、およびハンセン病の化学療法において使用される薬物、抗真菌剤、非レトロウイルス剤および抗レトロウイルス剤を含む抗ウイルス剤が挙げられる。
本開示の抗原結合単位と組み合わせることができる治療用抗体の例としては、限定されるものではないが、抗受容体チロシンキナーゼ抗体（セツキシマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ）、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ、トシツモマブ）ならびにアレムツズマブ、ベバシズマブおよびゲムツズマブなどの他の抗体が挙げられる。
また、免疫調節剤、免疫抑制剤、寛容原および免疫刺激剤などの免疫調節のために使用される治療剤は、本明細書における方法によって考慮される。加えて、血液および造血器官において作用する治療剤、造血剤、増殖因子、ミネラル、およびビタミン、抗凝固剤、血栓溶解剤ならびに抗血小板薬がある。
腎臓癌を処置するために、本開示の抗原結合単位を、ソラフェニブおよび／またはアバスチンと組み合わせてもよい。子宮内膜障害を処置するために、本開示の抗原結合単位を、ドキソルビシン（doxorubincin）、タキソテール（タキソール）および／またはシスプラチン（カルボプラチン）と組み合わせてもよい。卵巣がんを処置するために、本開示の抗原結合単位を、シスプラチン（カルボプラチン）、タキソテール、ドキソルビシン、トポテカンおよび／またはタモキシフェンと組み合わせてもよい。乳がんを処置するために、本開示の抗原結合単位を、タキソテール（タキソール）、ゲムシタビン（カペシタビン）、タモキシフェン、レトロゾール、タルセバ、ラパチニブ、ＰＤ０３２５９０１、アバスチン、ハーセプチン、ＯＳＩ－９０６および／またはＯＳＩ－９３０と組み合わせてもよい。肺がんを処置するために、本開示の抗原結合単位を、タキソテール（タキソール）、ゲムシタビン、シスプラチン、ペメトレキセド、タルセバ、ＰＤ０３２５９０１および／またはアバスチンと組み合わせてもよい。
本開示の抗原結合単位と組み合わせることができるさらなる治療剤は、GoodmanおよびGilmanの「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、第１０版、Hardman、LimbirdおよびGilman編、またはPhysician's Desk Referenceに見られ、それらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の抗原結合単位は、処置される状態に応じて、本明細書に開示される薬剤または他の適切な薬剤と組み合わせて使用することができる。そのため、一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数の抗原結合単位が、上記に記載の他の薬剤と共投与される。組合せ治療で使用される場合、本明細書に記載の抗原結合単位は、第２の薬剤と、同時または別々に投与される。組合せでのこの投与は、同じ剤形の２つの薬剤の同時投与、別々の剤形での同時投与、および別々の投与を含むことができる。すなわち、本明細書に記載の抗原結合単位および上記に記載の任意の薬剤は、同じ剤形中に一緒に製剤化し、同時投与することができる。その代わりに、本開示の抗原結合単位および上記に記載の任意の薬剤は、同時投与することができ、ここで、両方の薬剤は別々の製剤中に存在する。別の代替では、本開示の抗原結合単位が、投与された後すぐに、上記に記載の任意の薬剤を投与することができ、逆もまた同様である。別々の投与プロトコールの一部の実施形態では、本開示の抗原結合単位および上記に記載の任意の薬剤は、数分あけて、または数時間あけて、または数日あけて、投与される。
本発明による抗原結合単位、ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞の開発および使用のさらなる説明を、下記の実施例項において提供する。実施例は、当業者へのガイドとして提供され、決して限定することを意味するものではない。
以下の実施例は、本発明の各種の実施形態を説明する目的のために示し、いかなる形式でも本発明を限定することを意味するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に、現在の代表的な好ましい実施形態であり、例示であり、本発明の範囲を限定するものとして意図していない。特許請求の範囲によって定義される本発明の精神内で包含される、これらにおける変更および他の使用は、当業者が想起するであろう。
（実施例１）
抗原結合単位の作製およびスクリーニング
２つの異なるマウス系統（Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ６）を免疫のために使用して、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を作製した。配列番号１６１のＣＤ４７の組換え断片を２９３Ｆ細胞で発現させ、免疫のために使用した。一連または最後の血液試料からの血清を特異的抗体の存在のために分析した。血清の力価データを使用して、ハイブリドーマ融合のためのマウスを選択した。
単一の細胞懸濁液を最も良く応答した動物の脾臓から調製し、ミエローマ細胞と電気融合させた後、９６ウェルプレートに播種および培養した。次いで、ハイブリドーマを、上清のスクリーニングの前に、選択培地で７日間培養した。
産生した抗原結合単位を、ＥＬＩＳＡによるＣＤ４７タンパク質へのハイブリドーマ上清の結合、フローサイトメトリーを使用するヒトＣＤ４７を発現するＲａｊｉ細胞、および中和ＥＬＩＳＡの組合せによって特徴付けた。抗原結合単位を、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用アッセイにおけるそれらのブロッキングの有効性によってさらに特徴付けた。「陽性１」と称する商品化された抗ＣＤ４７ ｍＡｂを陽性対照として使用し、希釈した免疫前の血清を陰性参照として使用した。
モノクローナルハイブリドーマ細胞株を得るためのサブクローニングを行った。
（実施例２）
マクロファージ貪食作用アッセイ
選択抗体のヒットをマクロファージ貪食作用アッセイで評価して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能活性を確認した。ヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を、蛍光色素のＣＳＦＥで標識した標的の腫瘍細胞ＨＬ－６０と共培養した。貪食作用を、２時間のインキュベーション後に、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓによって分析した。腫瘍細胞を含有するマクロファージの百分率を計算し、貪食作用指数として表した。１つの代表的な実験からの結果を図１に示す。図１において、抗体は、１ｍＬあたり３マイクログラムの濃度で存在し；白色矢印は食菌されたＡＭＬ細胞の例を指し；ヒト前骨髄球性白血病ＨＬ－６０細胞は緑色で標識され；ヒトマクロファージは赤色で標識される。
このアッセイのために、ヒト単球を、ＣＤ１４ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ細胞単離ビーズを用いてヒトＰＢＭＣから精製した。精製されたＣＤ１４＋単球を、Ｍ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、Ｔ７５フラスコで７～１０日間培養した。単球由来マクロファージを、解離緩衝液中で５分間インキュベーションし、続いて、優しくスクレープすることによって収集した。次いで、Ｍ２細胞をＰＫＨ２６（赤色）で標識し、１×１０４のマクロファージを、１０％のＦＢＳを含有するＩＭＤＭ中、平底の９６ウェル組織培養プレートに２４時間蒔き、さらに２時間のインキュベーションのために、培地を無血清培地で置き換えた。５×１０４のＣＦＳＥ標識ＨＬ－６０細胞を、指示された抗体の存在下、ウェルに添加し２時間置いた。ウェルをＩＭＤＭで３回洗浄し、細胞を２％のＰＦＡで固定した。次いで、蛍光標識した細胞をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ装置で分析した。
貪食作用指数を１００マクロファージあたりの食細胞の数を計算することによって決定し、データを、図２Ａ～２Ｂに示すように、Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌで計算し、Ｐｒｉｓｍ５でグラフ化した。ＥＣ５０を、表４に示すように、最大貪食作用指数のパーセントに基づいて計算した。
Figure 0007117311000008
（実施例３）
ＣＤ４７結合アッセイ
選択抗体（ＡＢＵ番号）およびキメラ抗体（Ｃ－ＡＢＵ番号）についての抗体の結合親和性を、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーのいずれかを使用して、ＣＤ４７発現ＣＨＯ細胞およびジャーカット細胞の両方を使用することによって測定した。抗原結合単位のタンパク質の結合反応速度を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＳＰＲによって研究した。市販の参照抗体を対照として使用した。
ＥＬＩＳＡ系結合分析のために、１μｇ／ｍＬの濃度のヒトＳＩＲＰＡ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号Ｃ３８５）で、９６ハーフウェルプレートの底部を４℃で終夜コーティングした。ブロッキングをＰＢＳ（ＤＯＵＢＬＥ ＨＥＬＩＸ、カタログ番号Ｐ１００３３）中３％のスキムミルクを用いて室温で１時間行う前に、ＰＢＳＴ（０．０５％のｔｗｅｅｎ－２０（Ｓａｎｇｏｎ、カタログ番号９００５－６４－５）を有するＰＢＳ）によって３回洗浄した。連続希釈したヒトＣＤ４７タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号ＣＧ１８）をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし；３回のＰＢＳＴ洗浄の後、結合したＣＤ４７タンパク質をヒトＩｇＧ－Ｆｃ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９８６２４）に対するＨＲＰコンジュゲートヤギポリクローナル二次抗体によって検出し、次いで、３回のＰＢＳＴ洗浄後、ＴＭＢ基質（Ｂｉｏｐａｎｄａ、カタログ番号ＴＭＢ－Ｓ－００３）によって展開し、続いて、ＯＤ４５０の測定を行った。結合曲線（ＯＤ４５０対ＣＤ４７の濃度）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって解析し、ＥＣ９０をＣＤ４７中和研究のために計算した。結合の結果を下記の表５に表す。
Figure 0007117311000009
抗体の交差反応性を、異なる種からのＣＤ４７を発現する細胞を使用して、フローサイトメトリーによって研究した。カニクイザルの赤血球を、サルの交差反応性のために使用した。マウスＣＤ４７を発現するＣＨＯ細胞を、マウスの交差反応性の研究のために使用した。フローサイトメトリーに基づく結合分析のために、ヒトＳＩＲＰａ発現ＣＨＯ細胞株を作製し、ＳＩＲＰａ発現を、ＣＤ４７－Ｆｃタンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号ＣＧ１８）またはビオチンで標識したポリヒスチジンタグ化ＣＤ４７タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号３２１）の結合によって評価した。簡潔には、ヒトＳＩＲＰα発現ＣＨＯ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ解離緩衝液によって解離させ、ＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳを有するＰＢＳ緩衝液）で３回洗浄した。細胞を９６ウェルプレートに蒔き、細胞のスピンを行った。連続希釈したＣＤ４７タンパク質（マウス抗体のためにＦｃタグ化タンパク質、およびキメラ／ヒト化抗体のためにビオチンで標識したポリヒスチジン（polyhistindine）タグ化ＣＤ４７タンパク質）を使用して、細胞を再懸濁させ、４℃で１時間インキュベートし、次いで、それらの未結合タンパク質を洗い流した後、ＡＰＣで標識した抗ヒトＦＣ抗体で染色した。４度で１時間インキュベーションおよび３回洗浄後、細胞をＧｕａｖａ ＨＬ６Ｔ装置で分析し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。１μｇ／ｍＬの濃度で、９６ハーフウェルプレートの底部を４℃で終夜コーティングした。結合曲線（平均蛍光強度対ＣＤ４７の濃度）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって解析し、ＥＣ９０をＣＤ４７中和研究のために計算した。実施例の実験からのデータを図３Ａおよび３Ｂに表す。
（実施例４）
中和ＥＬＩＳＡ
選択抗体の中和効果を、ＳＩＲＰαでコーティングしたプレートを使用して、ＥＬＩＳＡによって分析した。簡潔には、ＳＩＲＰαタンパク質をマイクロタイタープレート上にコーティングし、ＣＤ４７－ｈＦｃタンパク質を連続希釈で添加して、対応するＥＣ９０を確立した。選択抗体を、連続希釈し、そのＥＣ９０濃度でｈＣＤ４７－ｈＦｃ融合タンパク質と混合し、それらの用量依存性ブロッキング効果を、ＣＤ４７－ｈＦｃに対して、ＨＲＰで標識した抗ｈＩｇＧ抗体を用いて検出した。
簡潔には、１μｇ／ｍＬの濃度のヒトＳＩＲＰＡ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号Ｃ３８５）で、９６ハーフウェルプレートの底部を４℃で終夜コーティングした。ブロッキングをＰＢＳ（ＤＯＵＢＬＥ ＨＥＬＩＸ、カタログ番号Ｐ１００３３）中３％のスキムミルクを用いて、室温で１時間行った。同時に、２．５μｇ／ｍＬで１２．５μＬのヒトＣＤ４７（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号ＣＧ１８）を、ハイブリドーマ上清または抗ＣＤ４７抗体の勾配（陽性対照として「陽性１」（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４－０４７９）および陰性対照として「陰性１」（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４－０４７８））と共に室温で１時間プレインキュベートし、次いで、これをそれぞれブロッキングされたウェルに室温で１時間適用した。ブロッキング効果を、ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９８６２４）に対するＨＲＰコンジュゲートヤギポリクローナル二次抗体によって検出し、次いで、３回のＰＢＳＴ洗浄後、ＴＭＢ基質（Ｂｉｏｐａｎｄａ、カタログ番号ＴＭＢ－Ｓ－００３）によって展開し、続いて、ＯＤ４５０の測定を行った。中和活性（ＯＤ４５０対抗体の濃度）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって解析し、ＩＣ５０を評価のために計算した。
選択抗体の中和効果をフローサイトメトリーによっても分析した。ヒトＳＩＲＰａ発現ＣＨＯ細胞株を作製し、ＳＩＲＰａ発現をＣＤ４７タンパク質結合によって評価した。簡潔には、ヒトＳＩＲＰａ発現ＣＨＯ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ解離緩衝液によって解離させ、ＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳを有するＰＢＳ緩衝液）で３回洗浄した。細胞を９６ウェルプレートに蒔き、細胞のスピンを行った。２５μＬの２．５μｇ／ｍＬのヒトＣＤ４７－Ｆｃまたはビオチン化ＣＤ４７タンパク質を、ハイブリドーマ上清または抗ＣＤ４７抗体の勾配（陽性対照としてＢ６Ｈ１２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４－０４７９）および陰性対照として２Ｄ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４－０４７８））と共に室温で１時間プレインキュベートし、次いで、細胞ペレットを再懸濁させ、４度で１時間インキュベートし、次いで、それらの未結合タンパク質を洗い流した後、ＡＰＣで標識した抗ヒトＦｃ抗体またはＡＰＣ－ストレプトアビジンで染色した。４度で１時間インキュベーションおよび３回洗浄後、細胞をＧｕａｖａ ＨＬ６Ｔ装置で分析し、データを、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して解析した。中和活性（平均蛍光強度対抗体の濃度）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって解析し、ＩＣ５０を評価のために計算した。実施例の中和ＥＬＩＳＡ実験からの結果を表６にまとめる。
Figure 0007117311000010
（実施例５）
抗ＣＤ４７抗体依存性貪食作用
ｉｎ ｖｉｔｒｏ貪食作用における選択抗体の用量依存性効果を行い、ＥＣ５０を得た。
ヒト単球を、ＣＤ１４ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ細胞単離ビーズを用いてヒトＰＢＭＣから精製した。精製されたＣＤ１４＋単球を、Ｍ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、Ｔ７５フラスコで７～１０日間培養した。単球由来マクロファージを、解離緩衝液中で５分間インキュベーションし、続いて、優しくスクレープすることによって収集した。次いで、Ｍ２細胞をＰＫＨ２６（赤色）で標識し、１×１０４のマクロファージを、１０％のＦＢＳを含有するＩＭＤＭ中、平底の９６ウェル組織培養プレートに２４時間蒔き、さらに２時間のインキュベーションために、培地を無血清培地で置き換えた。５×１０４のＣＦＳＥ標識ＨＬ－６０細胞を、指示された抗体の存在下、ウェルに添加し２時間置いた。ウェルをＩＭＤＭで３回洗浄し、細胞を２％のＰＦＡで固定した。次いで、蛍光標識した細胞をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ装置で分析した。
貪食作用指数を１００マクロファージあたりの食細胞の数を計算することによって決定し、データを、Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌで計算し、Ｐｒｉｓｍ５でグラフ化した。ＥＣ５０を、最大貪食作用指数のパーセントに基づいて計算した。
ＨＬ６０細胞株の細胞を使用する実施例の貪食作用実験からのデータを図４に表す。ＥＣ５０を計算し、表７にまとめた。ＤＬＤ－１ヒト結腸がん細胞株を使用する実施例の貪食作用実験からのデータを図５に表す。
Figure 0007117311000011
（実施例６）
ＣＤ４７ヒット抗体のエピトープ結合
これらのヒットのエピトープ結合を、ＣＤ４７発現ＣＨＯ細胞を、配列番号２４０および配列番号２４１を含む市販の抗ＣＤ４７ブロッキング抗体の陽性１、配列番号２４２および配列番号２４３を含むベンチマークのアナログ抗体の陽性２、ならびに配列番号２４４および配列番号２４５を含むアナログ抗体の陽性３と共に使用して、実施した。陽性１は配列番号１４９～１５４も含んでいた。陽性２は配列番号１５５～１６０も含んでいた。簡潔には、７つの中和ＣＤ４７抗体および３つの参照抗体を、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４７を発現するＣＨＯ細胞へのそれらの競合的結合に従って、分析および群分けした。ビオチン化抗体を最初に使用して、９０％結合のための濃度を計算し、次いで、ＣＤ４７抗体を連続希釈して、あらかじめ決定した９０％結合濃度でビオチン化抗体の１つと混合した。ＳＡ－ＡＰＣを使用して、ビオチン化抗体結合の結合を検出した。実験の設計として、標識抗体の結合は、同じ瓶のＡｂによって影響を受け、１群として分類されるはずである。標識抗体の結合が影響を受けない場合、次いで、これらの試験した抗体は、同じ瓶ではないものとし、別々の群として特徴付ける。ＣＤ４７を発現するＣＨＯにおける３つの結合プロファイルを特定し、６つのヒットを下記の表８に示す２つの群とした。ＡＢＵ４およびＡＢＵ５は、１つのエピトープ結合群に属するが、陽性３を含む他のものは、異なる群に属する。陽性１は、２つの群の細胞に対する結合を妨げた。
Figure 0007117311000012
（実施例７）
赤血球結合および赤血球凝集アッセイ
ＣＤ４７を、赤血球において特に高発現で、遍在的に発現させる。ヒト赤血球における結合親和性を評価するために、ＲＢＣ結合アッセイを、幾人かのドナーのＲＢＣを使用して行った。実施例の実験からの結合曲線およびＥＣ５０を図６に表す。
選択抗体を赤血球凝集アッセイにおいても試験を行い、強い赤血球凝集効果を示す抗体を特定した。試験する抗体をＰＢＳ中に指示された濃度で希釈し、連続希釈した９０μｌの抗体を、３７℃で１時間のインキュベーションのためにＶ底培養プレートに添加した。次いで、１０μＬのヒト赤血球（ＲＢＣ）を、ＰＢＳ中１０％の最終濃度で添加した。ＲＢＣを抗体と共に３７℃でインキュベートし、赤血球凝集素を２～４時間観察する。赤血球凝集素の証拠は、非赤血球凝集ＲＢＣの点状の赤い点と比較して濁りとして現れる、非沈降ＲＢＣの存在によって実証される。
赤血球凝集指数を、ｍＡｂの存在下または非存在下でのＲＢＣペレットの面積によって定量化し、ＲＢＣペレットの直径を、ピクセルでＩｍａｇｅＪソフトウェアによって決定し、次いで、面積をｅｘｃｅｌで計算した。計算したデータをアイソタイプのＩｇＧに対して正規化した。ｌｏｇ濃度対指数をＰｒｉｓｍ５でプロットし、図７Ａ～７Ｂに表す。
実施例の実験からの画像を図８に表す。ヒト赤血球の著しい赤血球凝集の誘導は、ウェル中での濁りの出現によって証拠付けられる。図８において、アイソタイプのｍｕＩｇＧ１は、陰性対照としての役割を果たし；点線はブランク対照を示し；赤血球凝集の陽性対象は青色の円であり；赤血球凝集の陰性対照は黄色の円である。
（実施例８）
キメラ抗ＣＤ４７抗体の特徴付け
キメラ抗体を作製するために、選択した抗原結合単位を取り、伸長させ、Ｖ領域配列を回復させた。Ｖ領域を合成し、ベクター中でサブクローニングして、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）キメラを得た。Ｓ２２８Ｐは、ＩｇＧ４がAalberse RCおよびSchuurman J（２００２年）、IgG4 breaking the rules.、Immunology、１０５巻、９～１９頁（その全体が本明細書に組み込まれる）に記載のようにして分割されるアミノ酸の位置を指す。ヒトＩｇＧ４配列を、選択した抗体の軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列のＣ末端でクローニングした。キメラｈＩｇＧ４抗体を２９３Ｆ細胞で発現させ、機能的検証のために、ヒトＩｇＧ４フォーマットとして精製した。キメラ抗体はまた、ＩｇＧ４領域に代えてＩｇＧ１定常領域を用いて作製した。
キメラ抗体の結合親和性を、ＣＤ４７発現細胞株を用いるフローサイトメトリーによって測定した。実施例の実験からの結果を図９に表す。
選択キメラ抗体の中和効果を、ＣＤ４７を発現する細胞を使用して分析した。簡潔には、ヒトキメラＩｇＧ４抗体を希釈し、ビオチン化ヒトＣＤ４７タンパク質と混合した。次いで、用量依存性のＳＩＲＰα結合ブロッキング効果を、Ｃ－ＡＢＵ１、Ｃ－ＡＢＵ２およびＣ－ＡＢＵ４について検出した。実施例の実験からの結果を図１０に表す。
選択キメラ抗体を、上記に記載のようにして行ったＤＬＤ－１細胞食作用アッセイにおいてさらに特徴付けた。実施例の実験からの結果を図１１に表し、アスタリスクは、ダネット検定後の一方向ＡＮＯＶＡによって計算したｐ値に基づく統計学的有意性を表す。
（実施例９）
追加の抗ＣＤ４７ Ｆａｂのファージ選択
抗ＣＤ４７ Ｆａｂを以下のファージに基づく方法を使用して作製した。免疫されたマウスの脾臓からの全ＲＮＡを調製した。オリゴ（ｄＴ）プライミングした逆転写後、抗体の可変領域ＶＬおよびＶＨをＰＣＲによって増幅した。次いで、マウスＶＬおよびＶＨ領域をヒト定常領域ＣＬおよびＣＨ１の軽鎖および重鎖とそれぞれ融合した。キメラ軽鎖および重鎖断片の組合せをファージミドベクターのｐＣｏｍｂ３Ｘにクローニングし、ファージにディスプレイされたマウス／ヒトＦａｂライブラリーをもたらした。
次いで、作製したファージライブラリーを抗ＣＤ４７特異的Ｆａｂについてスクリーニングした。ストレプトアビジンとコンジュゲートしたＤｙｎａｂｅａｄｓを、最初に、３％のＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて室温で１時間インキュベートすることによって、ブロッキングした。およそ１μＬのブロッキングされたＤｙｎａｂｅａｄｓを、抗原を捕捉するために、減少させた量のビオチン化ＣＤ４７－Ｆｃ（ラウンド１、２および３について、それぞれ、１００ｎＭ、５０ｎＭおよび２５ｎＭ）と共に３０分間インキュベートした。ファージライブラリーを、３％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中、別のおよそ１μＬのブロッキングされたＤｙｎａｂｅａｄｓに３０分間あらかじめ吸着させ、続いて、およそ１μｇ／ｍＬの３％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中のヒトＦｃ断片で枯渇させた。次いで、枯渇したファージライブラリーを、抗原でコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓと、頭上からの穏やかな縦の回転により、室温で１時間混合した。次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、磁気分離器を使用して、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有する１ｍＬのＰＢＳで洗浄した（ラウンド１、２および３について、それぞれ、５、１０および１５回）。結合したファージを５００μＬの溶出緩衝液と共に室温で１０分間のインキュベーションによって溶出させ、続いて、５０μＬの中和緩衝液で中和した。溶出したファージをＥ．ｃｏｌｉのＴＧ１細胞の感染によってレスキューし、ファージライブラリーを次ラウンドのスクリーニングのために調製した。
選択Ｆａｂを各種のＥＬＩＳＡアッセイによって特徴付けた。可溶性Ｆａｂ断片を誘導し、ペリプラズム画分を以下の方法によって調製した。第３のラウンドのスクリーニングからの個々のクローンを寒天プレートから取り、２ＹＴを含有するマイクロタイタープレートで終夜培養した。それぞれの５μＬの終夜培養物を、１５０μＬの２ＹＴ、２％のグルコース、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するマイクロタイタープレートに移し、３７℃で３時間成長させた。イソプロピルチオガラクトシド（Isoproplythiogalactoside）（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度まで各ウェルに添加した。振とうしながら２５℃で終夜成長させた後、プレートを遠沈し、上清を結合ＥＬＩＳＡにおいて直接使用した。ペリプラズム画分の調製のために、細胞ペレットを再懸濁させ、氷上で２０分間インキュベートした。次いで、これらのペリプラズム画分をフローサイトメトリーおよびブロッキングＥＬＩＳＡアッセイによる特異性の試験のために使用した。
個々のクローンからの可溶性Ｆａｂ断片の大スケールでの誘導を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２％のグルコースを含有する２ＹＴ中で、５０ｍｌのスケールで行った。ＯＤ６００が０．９まで３７℃で成長させた後、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加した。２５℃で終夜成長させた後、細胞ペレットを収集し、ペリプラズム画分を上記に記載のようにして調製した。
上記に記載のプールした大スケールのペリプラズム画分を、製造者の指示書に従って１ｍＬのＮｉ－樹脂を通過させた。カラムを緩衝液で洗浄し、タンパク質を、緩衝液を適用することによって溶出させた。溶出したタンパク質を濾過して、緩衝液をＰＢＳに交換した。次いで、精製されたＦａｂを、非還元および還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、濃度を分光光度法で決定した。
選択ＦａｂをＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度のヒトＣＤ４７－Ｆｃを用いて、４℃で終夜コーティングし、ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、ＰＢＳ／３％のスキムミルクで室温で１時間ブロッキングし、次いで、個々のクローンからの５０μＬの上清と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０で３回洗浄後、５０μＬの１：５０００希釈の特異的なＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ）２を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０で３回洗浄後、５０μＬのＴＭＢ基質を発色現像のために添加した。反応を５０μＬのＨＣｌの添加によって停止し、ＯＤ４５０をマイクロタイタープレートリーダーで測定した。
それぞれのクローンのＳＩＲＰａとのブロッキングＣＤ４７の相互作用の活性を阻害ＥＬＩＳＡによって行った。マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度のヒトＳＩＲＰａを用いて、４℃で終夜コーティングし、ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、ＰＢＳ／３％のスキムミルクで室温で１時間ブロッキングした。それぞれのクローンの５０μＬのペリプラズム画分を、およそ１μＬのヒトＣＤ４７と混合し、室温で１時間インキュベートし、続いて、５０μＬの混合物をマイクロタイタープレートのブロッキングされたウェルに添加した。室温で１時間インキュベートし、続くステップは上記と正確に同じであった。
ヒトＳＩＲＰａを安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、細胞解離緩衝液を使用して剥離させた。１０５の細胞を含有する２００μＬのアリコートをＵ底の９６ウェルプレートのウェルに分配した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％のＦＢＳ）で３回洗浄後、０．０７μｇ／ｍＬのビオチン化ＣＤ４７を、ＦＡＣＳ緩衝液中の連続希釈した濃度のＦａｂの存在下、再懸濁させた細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、続いて、１：１０００で希釈したＡＰＣ標識ＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。３回洗浄後、結合をＧｕａｖａ ＨＬ６Ｔ装置で測定した。実施例の実験からのデータを図１２Ａおよび表９に示す。
ヒトＳＩＲＰａを安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、細胞解離緩衝液を使用して剥離させた。１０４の細胞を含有する２００μＬのアリコートをＵ底の９６ウェルプレートのウェルに分配した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％のＦＢＳ）で３回洗浄後、０．０７μｇ／ｍＬのＨｉｓタグ化ＣＤ４７を、ＦＡＣＳ緩衝液中の連続希釈した濃度のＦａｂの存在下、再懸濁させた細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、続いて、１：１０００で希釈した抗Ｈｉｓ－ＡＰＣ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、番号Ａ０１８０２）と共に４℃で３０分間インキュベートした。３回洗浄後、結合をＧｕａｖａ ＨＬ６Ｔ装置で測定した。実施例の実験からのデータを図１２Ｂ～１２Ｃおよび表１０に示す。
Figure 0007117311000013
Figure 0007117311000014
選択Ｆａｂも細胞結合アッセイによって特徴付けた。１０５のＨＬ６０細胞またはＤＬＤ１細胞を含有する２００μＬのアリコートをＵ底の９６ウェルプレートのウェルに分配した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％のＦＢＳ）で３回洗浄後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中の連続希釈した濃度のＦａｂまたはＩｇＧに再懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、続いて、およそ３倍に希釈したＡＰＣ標識抗ヒト（Ｆａｂ）２特異的抗体またはＡＰＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧのそれぞれと共に４℃で３０分間インキュベートした。３回洗浄後、結合をＧｕａｖａ ＨＬ６Ｔ装置で測定した。ＨＬ６０細胞およびＦａｂを使用する実施例の実験からのデータを図１３Ａおよび表１１に示す。ＤＬＤ１細胞およびＦａｂを使用する実施例の実験からのデータを図１３Ｂおよび表１２に示す。ＤＬＤ１細胞およびＩｇＧを使用する追加の実験を図１３Ｃおよび１３Ｄならびに表１３に示す。
Figure 0007117311000015
Figure 0007117311000016
Figure 0007117311000017
選択Ｆａｂのキメラバージョンを作製し、ＥＬＩＳＡアッセイに付した。ＦｃＲｎでブロッキングされたＣＤ４７を発現するＤＬＤ１細胞を等分し、およそ１０４の細胞をＵ底９６ウェルプレートのウェルに分配した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％のＦＢＳ）で３回洗浄後、１００ｎＭのビオチン化ＳＩＲＰα－Ｆｃを、ＦＡＣＳ緩衝液中の連続希釈した濃度のＦａｂの存在下、再懸濁させた細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、続いて、希釈したＡＰＣ標識ＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。３回洗浄後、結合をＧｕａｖａ ＨＬ６Ｔ装置で測定した。実施例の実験からのデータを図１４Ａおよび１４Ｂならびに表１４に示す。
Figure 0007117311000018
（実施例１０）
抗ＣＤ４７抗体のヒト化
抗体配列を、構造モデリングを使用するプロファイリングに付し、最もマッチした生殖細胞系列および復帰変異部位を特定した。最適化された変異体を合成し、組換え抗体をＥＬＩＳＡによって決定された結合親和性のために産生させた。グラフト化および復帰変異の後、ヒト化抗体の親和性を維持または改善し（図１５Ａ）、Ｈ－ＡＢＵ２を、変異原性ライブラリーのＦＡＣＳスクリーニングによってさらに親和性を成熟させて、対応するキメラ親抗体と比較して、場合により最大で１０倍良く抗原に結合できるクローンを選択した。
選択親和性成熟ヒト化抗体を、先に記載したブロッキング実験でさらに特徴付けた。Ｒａｊｉ細胞を使用する実施例の実験からのデータを図１５Ｂ～１５Ｃおよび表１５に表す。
Figure 0007117311000019
ヒト化抗体の別のセットを先に記載した結合アッセイで分析した。行った結合アッセイは、ＣＤ４７でコーティングされたプレートを使用して、実施例３に記載されたものと同様のＥＬＩＳＡ結合ＥＣ５０研究であった。実施例の実験からのデータを図１６Ａおよび表１６に表す。これらの抗体の群を、先に記載したＲａｊｉ細胞を使用するＳＩＲＰ－アルファブロッキング実験でさらに特徴付けた。ブロッキングアッセイを実施例４に記載されたものと同様に行った。実施例の実験からのデータを図１６Ｂおよび表１７に表す。
Figure 0007117311000020
Figure 0007117311000021
選択マウス、キメラおよびヒト化抗体を先に記載した赤血球凝集アッセイに付した。簡潔には、モノクローナル抗体を連続希釈し、１時間インキュベートした後、全血を１０％の最終血液濃度で添加した。２～４時間のインキュベーション後、赤血球凝集効果をスキャナーによって調べた。
選択マウス、キメラおよびヒト化抗体も赤血球および血小板結合アッセイに付した。ヒト化抗体の中には、ヒトＩｇＧ１定常領域を含むＨ－ＡＢＵ ２－Ｇ１があり、ヒトＩｇＧ４定常領域を含むＨ－ＡＢＵ ２－Ｇ４があった。血液をＤＰＢＳで１：１００に希釈した。１０μｇ／ｍＬで開始してモノクローナル抗体を連続希釈し、１：２の体積割当（２０μｌの抗体および４０μｌの希釈した血液）で希釈した血液に添加した。混合物を４０℃で３０分間インキュベートし、次いで、ＤＰＢＳで２回洗浄した。次いで、血小板結合のために、二次抗体、すなわち、ＡＰＣ－抗ヒトまたはＡＰＢ－抗マウスモノクローナル抗体（それぞれ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１５－６０６－０４６または１０９－６０５－０８８）およびＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ６１（ＢＤ、５５５７５３）を添加した。二次抗体を添加した後、混合物を４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、結合親和性を、フローサイトメーターを使用して評価した。
選択ヒト化抗体を先に記載した赤血球凝集アッセイを使用して分析した。２人の異なるドナーからの試料および指示された抗体または対照を記載された濃度で使用する実施例の実験からのデータを図１７に表す。赤血球凝集アッセイを実施例７に記載されたものと同様に行った。上記に記載したように、濁ったハローの出現が欠如する血液細胞の区別できる点は、著しい赤血球凝集が生じなかったことを示す。多くのヒト化抗体が著しい赤血球凝集効果を示さなかった。
サル交差反応性について試験するために、次に、選択抗体を、カニクイザルのＣＤ４７を発現する赤血球を使用する結合アッセイを使用して試験した。アッセイは実施例３に記載したものと同様に行った。実施例の実験からのデータを図１８に表す。この実施例において、ＩｇＧの２つの変形を有する抗体を試験した。すなわち、使用したＩｇＧ４は、２つの異なるＦｃガンマ受容体バリアント：Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４（配列番号３７）またはＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ変異の両方を有するＩｇＧ（配列番号１８）のいずれかの１つであった。陽性３－ＩｇＧ４－ＰＥ抗体は、配列番号３０５および配列番号３０６を含む。陽性３－ＩｇＧ４－Ｐ抗体は、配列番号３０７および配列番号３０８を含む。
選択抗体を先に記載した貪食作用アッセイを使用して試験した。これらのアッセイを実施例５に記載されたものと同様に行った。ＤＬＤ－１細胞、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞またはＲａｊｉ細胞のいずれかをこれらの実験で使用した。実施例の実験からのデータを図１９Ａ～１９Ｃに表す。
選択抗体を先に記載した結合アッセイを使用してさらに試験した。抗体をＲＢＣ（図２０Ａおよび２０Ｂ）または血小板（図２０Ｃまたは２０Ｄ）のいずれかへのそれらの結合レベルについて試験した。この実施例において、ＩｇＧの２つの変形を有する抗体を試験した。すなわち、使用したＩｇＧ４は、２つの異なるＦｃガンマ受容体バリアント：Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４（配列番号３７）またはＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ変異の両方を有するＩｇＧ（配列番号１８）のいずれかの１つであった。
（実施例１１）
ｉｎ ｖｉｖｏのＣＤＸモデルおよびヒト化抗体のｉｎ ｖｉｖｏの抗腫瘍活性
Ｒａｊｉ細胞を、１０％の熱失活ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地中の培養物としてｉｎ ｖｉｔｒｏで、３７℃で、５％の空気中のＣＯ２雰囲気中で維持した。腫瘍細胞を、週に２回、定期的に継代培養した。指数増殖期で成長した細胞を収集し、腫瘍接種のためにカウントした。それぞれのマウスは、腫瘍の発達のために、０．１ｍｌのＰＢＳ中のＲａｊｉ腫瘍細胞（３×１０６）を右脇腹に皮下接種した。処置を、平均腫瘍サイズがおよそ１１３ｍｍ３に達した、腫瘍接種後の８日目に開始した。それぞれの群は、７または８頭の腫瘍を有するマウスからなっていた。
定期的な監視の時点で、動物は、移動度、食物および水の摂取（目視のみによる）、体重の増加／減少（体重を週に２回測定した）、目／毛の艶の消失、ならびにプロトコールに記載されている任意のその他の異常な影響などの通常の挙動に対する腫瘍の成長および処置の任意の効果を毎日チェックされた。死亡および観察された臨床徴候をそれぞれの小集団内の動物の数に基づいて記録した。
腫瘍のサイズを、キャリパーを使用して二次元で週に２回測定し、体積を、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長径および短径である）を使用して、ｍｍ３で表した。次いで、腫瘍サイズをＴ／Ｃ値の計算のために使用した。Ｔ／Ｃ値（パーセント）は、抗腫瘍有効性の指標であり；ＴおよびＣは、所与の日数での処置群および対照群それぞれの平均体積である。
一方向ＡＮＯＶＡを行って、群の中で腫瘍体積を比較し、有意なＦ統計量（処置の分散の誤差の分散に対する比）が得られた場合に、群間の比較をゲイムス－ハウエル検定で行った。すべてのデータを、Ｇｒａｐｈｐａｄ５．０を使用して解析した。Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であるとみなした。
選択ヒト化抗体を、上記に記載のようにしてｉｎ ｖｉｖｏで試験して、腫瘍サイズに対するそれらの効果を決定した。簡潔には、およそ３００万のＲａｊｉ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。抗ＣＤ４７抗体の投与量は、１０ｍｐｋ、ｉ．ｐ．、週に３回であった。抗体の投薬は、腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したときに開始した。実施例の実験についてのデータを図２１に表す。
（実施例１２）
ＩｇＧ４ＰおよびＩｇＧ４ＰＥ形態の比較
選択ヒト化抗体を、ＩｇＧの２つの変形のいずれかを含むバリアントを試験することによってさらに特徴付けた。すなわち、使用したＩｇＧ４は、２つの異なるＦｃガンマ受容体バリアント：Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４（配列番号３７、Ｐバリアント）またはＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ変異の両方を有するＩｇＧ（配列番号１８、ＰＥバリアント）のいずれかの１つであった。図２２Ａは、先に記載のようにして、一般的に行ったＲａｊｉ細胞を使用するブロッキングアッセイの実施例からのデータを表す。図２２Ｂおよび２３Ｃは、ＲＢＣおよび血小板結合アッセイのそれぞれの実施例からのデータを表し、これは、先に記載のようにして、一般的に行った。図２２Ｄは、赤血球凝集アッセイの実施例からのデータを表し、これは、先に記載のようにして、一般的に行った。上記に記載したように、濁ったハローの出現が欠如する血液細胞の区別できる点は、著しい赤血球凝集が生じなかったことを示す。
（実施例１３）
ヒト化抗体の特徴付けおよび抗腫瘍活性ならびに組合せ治療
選択ヒト化抗体を、上記に記載のようにしてｉｎ ｖｉｖｏで試験して、腫瘍サイズに対するそれらの影響を決定した。実施例の実験からのデータを図２３に表す。異種移植実験を、実施例１０に記載のようにして、一般的に行った。簡潔には、およそ３００万のＲａｊｉ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。抗ＣＤ４７抗体の投薬量は、１０ｍｐｋ、ｉ．ｐ．、週に３回であった。アッセイは、腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したときに開始した。この実施例において、異なるＩｇＧを有する抗ＣＤ４７抗体の２つの変形を有する抗体を試験した。すなわち、使用したＩｇＧ４は、２つの異なるＦｃガンマ受容体バリアント：Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４（配列番号３７）またはＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ変異の両方を有するＩｇＧ（配列番号１８）のいずれかの１つであった。
選択抗体を抗ＣＤ２０抗体と組み合わせる異種移植実験において使用して、上記で先に記載したようにして腫瘍サイズに対するそれらの効果を決定した。３００万のＲａｊｉ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したときに、Ｃ－ＡＢＵ １抗体、抗ＣＤ２０または両方の組合せを、１０ｍｇ／ｋｇで、１日おきに腹腔内に注射し、腫瘍サイズを記録した。Ｃ－ＡＢＵ １および抗ＣＤ２０の組合せは、腫瘍の進行を著しく防止した。実施例の実験からのデータを図２４にまとめる。それぞれの抗体または対照を表１８にまとめるようにして投与した。抗ＣＤ２０抗体および抗ＣＤ４７抗体の投薬量は、１０ｍｐｋ、ｉ．ｐ．、週に３回であった。アッセイは、腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したときに開始した。この実施例において、異なるＩｇＧを有する抗ＣＤ４７抗体の２つの変形を有する抗体を試験した。すなわち、使用したＩｇＧ４は、２つの異なるＦｃガンマ受容体バリアント：Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４（配列番号３７）またはＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ変異の両方を有するＩｇＧ（配列番号１８）のいずれかの１つであった。このアッセイで使用した抗ＣＤ－２０は、ヒトＩｇＧ１フォーマットであった。
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本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、かつ説明するが、このような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。ここで、多数の変形、変更および置換は、本発明から逸脱することなく当業者には想起されるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する各種の代替が、本発明の実施において利用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義すること、ならびにこれらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにこれらの均等物が特許請求の範囲によって包含されることを意図している。
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Claims (15)

  1. 可変軽鎖領域および可変重鎖領域を含む抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片はＣＤ４７と特異的に結合し、
    前記可変軽鎖領域が、軽鎖相補性決定領域ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含み、前記可変重鎖領域が、相補性決定領域ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含み；
    前記ＬＣ－ＣＤＲ１が配列番号２の配列を有し、前記ＬＣ－ＣＤＲ２が配列番号１２の配列を有し、前記ＬＣ－ＣＤＲ３が配列番号２０の配列を有し；かつ
    前記ＨＣ－ＣＤＲ１が配列番号２９の配列を有し、前記ＨＣ－ＣＤＲ２が配列番号３３の配列を有し、前記ＨＣ－ＣＤＲ３が配列番号４３の配列を有する、
    抗体またはその断片。
  2. ＣＤ４７への前記抗体またはその断片の結合が、マクロファージ細胞において発現するＳＩＲＰαへのＣＤ４７の結合を妨げる、請求項１に記載の抗体またはその断片。
  3. （ｉ）配列番号２４０および２４１、または配列番号２４２および２４３、または配列番号２４４および２４５のアミノ酸配列を有する抗体またはその断片と比較してより高い程度まで、ＣＤ４７を発現する細胞の貪食作用を誘導する；
    （ｉｉ）ＣＤ４７を発現する細胞を利用するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいてアッセイした場合に、配列番号２４０および２４１、または配列番号２４２および２４３、または配列番号２４４および２４５のアミノ酸配列を有する抗体またはその断片と比較して、ＣＤ４７に対するより高い結合親和性を示す；かつ／または
    （ｉｉｉ）赤血球が前記抗体またはその断片と接触する際に誘導される赤血球凝集が、配列番号２４０および２４１、または配列番号２４２および２４３、または配列番号２４４および２４５のアミノ酸配列を有する抗体またはその断片によって誘導される赤血球凝集と比較して、多くとも１分の１である
    請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
  4. モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
  5. ｓＦｃ、Ｆｖ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
  6. （ｉ）配列番号２４０および２４１、（ｉｉ）配列番号２４２および２４３、または（ｉｉｉ）配列番号２４４および２４５のアミノ酸配列を有する抗体またはその断片によって認識されるＣＤ４７のエピトープへの結合について競合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはその断片をコードする単離された核酸。
  8. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはその断片をコードする核酸配列を含むベクター。
  9. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を発現する宿主細胞。
  10. 対象においてがんを処置する方法において使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を含む組成物であって、前記方法が、前記組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、組成物。
  11. 前記がんが血液がんまたは固形腫瘍である、請求項１０に記載の使用のための組成物。
  12. 前記がんを処置することが、腫瘍体積を減少させることを含む、請求項１０または１１に記載の使用のための組成物。
  13. 前記方法が治療用抗体を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  14. 前記治療用抗体が抗ＣＤ２０抗体である、請求項１３に記載の使用のための組成物。
  15. 前記腫瘍体積が、配列番号２４０および２４１、または配列番号２４２および２４３、または配列番号２４４および２４５のアミノ酸配列を有する抗体またはその断片と比較してより高い程度まで減少する、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
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