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KR102489471B1 - 항-cd47 항체 및 그 용도 - Google Patents

항-cd47 항체 및 그 용도 Download PDF

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KR102489471B1
KR102489471B1 KR1020177021330A KR20177021330A KR102489471B1 KR 102489471 B1 KR102489471 B1 KR 102489471B1 KR 1020177021330 A KR1020177021330 A KR 1020177021330A KR 20177021330 A KR20177021330 A KR 20177021330A KR 102489471 B1 KR102489471 B1 KR 102489471B1
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셀진 코포레이션
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Abstract

본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 항체에 관련된 조성물, 방법 및 용도를 제공한다. 또한, 치료 방법, 진단 방법 및 그러한 항체의 제조 방법을 제공한다.

Description

항-CD47 항체 및 그 용도
본 출원은 2014년 12월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 62/098,291호의 이익을 주장하며, 상기 출원의 내용은 그 전체가 참고로 본원에 통합된다.
전자적으로 제출된 서열 목록의 참고
본 출원은 2015년 12월 27일에 생성되고 크기가 87,612 바이트이며 "Sequence_Listing_12827-563-228.txt" 라는 명칭의 텍스트 파일로서 본 출원과 함께 제출된 서열 목록을 참고로 통합한다.
본 발명은 CD47에 특이적으로 결합하는 항체(항-CD47 항체) 및 그러한 항체를 포함하는, 약학 조성물, 진단 조성물 및 키트를 비롯한 조성물을 제공한다. 또한 치료 및 진단 목적을 위하여 항-CD47 항체를 이용하는 방법 및 예를 들어, 무세포(CF) 시스템을 이용하여, 그러한 항-CD47 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
인테그린-연합 단백질(IAP), 난소암 항원 OA3, Rh-관련 항원 및 MER6으로도 알려진 CD47은 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 멀티-스패닝(multi-spanning) 경막 수용체이다. 대식세포 상에 발현된 SIRPα(시그널-조절-단백질α)는 CD47과 상호작용하며, 이 상호작용은 숙주 세포 식세포작용과 같은 천연 면역 세포의 이펙터 기능을 부정적으로 조절한다. CD47 발현 및/또는 활성은 많은 질병과 질환에 관련되었다. 따라서, CD47을 표적화하는 치료법 및 그러한 치료법을 만들기 위한 더 나은 방법이 필요하다.
일 양태에서, 본 발명은 CD47의 세포외 도메인(ECD)와 같은 CD47(예를 들어, 인간 CD47)에 특이적으로 결합하는, 항원-결합 단편을 비롯한 항체(예를 들어, 단클론 항체)를 제공한다. 구체적인 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 SIRPα에의 CD47 결합을 차단하고, 식세포작용을 촉진하며, Fc 이펙터 기능(예를 들어, FcγR, ADCC, 또는 CDC에의 결합)이 감소되거나 없으며 및/또는 응집(예를 들어, 적혈구응집) 활성이 거의 또는 전혀 없다.
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 단클론 항-CD47 항체를 제공하며, 이때 항-CD47 항체는 모(parental) 항체의 변이체이며, 무세포(Cell-free: CF) 발현 시스템을 이용하여 생산될 경우 항-CD47 항체는 CF 발현 시스템에서 생산된 모 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 갖는다. 구체적 양태에서, CF 시스템에서 발현되는 본 발명의 항-CD47 항체는 비글리코실화(aglycosylated)된다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 CD47(예를 들어, 서열 번호 38 또는 39)에 특이적으로 결합하는 단클론 항-CD47 항체를 제공하며, 이때 항-CD47 항체는 무세포 시스템을 이용하여 생산될 경우, 무세포 시스템을 이용하여 생산된 모 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 갖는다. 구체적 양태에서, 항-CD47 항체 발현 역가 또는 수율은 모 항체에 비하여 적어도 1배, 적어도 2배 또는 적어도 3배 더 높다. 구체적 양태에서, 항-CD47 항체 발현 역가 또는 수율은 모 항체에 비하여 적어도 25%, 50%, 75%, 또는 100% 더 높다. 구체적 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 인간화 항체이다. 특정 양태에서, 무세포 시스템은 S30 무세포 추출물을 이용하는 것을 포함한다. 구체적 양태에서, 그러한 무세포 시스템은 원핵 이황화 결합 아이소머라제(isomerase) DsbC를 포함한다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG4 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 EU 넘버링 인덱스(EU numbering index)에 따라 S228P 아미노산 치환을 포함하는 IgG4 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 EU 넘버링 인덱스에 따라 S228P 및 L235E 아미노산 치환을 포함하는 IgG4 항체이다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체의 그러한 모 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 그러한 모 항체는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 구체적 양태에서, 그러한 모 항체는 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 (i) 항체 2A1의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2, 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 항체 2A1의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 (i) 각각 아미노산 서열 GFNIKDYYLH (서열 번호 14), WIDPDQGDTE(서열 번호 15), 및 NAAYGSSSYPMDY(서열 번호 16)을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2, 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 각각 아미노산 서열 KASQDIHRYLS(서열 번호 17), RANRLVS(서열 번호 18), 및 LQYDEFPYT(서열 번호 19)를 각각 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 모 항체에 대하여 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 아미노산 치환)을 포함하는 항-CD47 항체를 제공한다. 구체적 양태에서, 그러한 하나 이상의 아미노산 치환은 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 골격 영역(framework region) 내에 있다. 특정 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 중쇄 가변 영역의 골격 영역에서 13 또는 14 아미노산 변형(예를 들어, 아미노산 치환)을 포함한다. 구체적 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 중쇄 가변 영역의 골격 영역에서 1 내지 15 아미노산 변형(예를 들어, 아미노산 치환)을 포함한다. 구체적 양태에서, 그러한 아미노산 변형은 보존적 아미노산 치환이다.
구체적 양태에서, 본 발명은 CD47 (예를 들어, 서열 번호 38 또는 39와 같은 인간 CD47)에 특이적으로 결합하며 아미노산 서열 : X 1 QX 2 QLVQSGAEVKKX 3 GX 4 SVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQX 5 LEWMGWIDPDQGDTEYAQKX 6 QX 7 RVTX 8 TX 9 DX 10 SX 11 STAYMELX 12 SLRSX 13 DTAX 14 YYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV(서열 번호 20)을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 단클론 항-CD47 항체를 제공하며, 이때 위치 X1의 아미노산은 임의의 아미노산이거나 위치 X1에서 아미노산이 없으며, 위치 X2-X14의 각각에서의 아미노산은 임의의 아미노산이다. 일부 양태에서, X1은 M이거나 위치 X1에서 아미노산이 없으며, X2는 M 또는 V와 같은 소수성 측쇄를 가진 아미노산이며, X3은 T 또는 P이며, X4는 S 또는 A이며, X5는 A 또는 G와 같은 지방족 측쇄를 가진 아미노산이며, X6은 F 또는 L이며, X7은 D 또는 G이며, X8은 I 또는 M과 같은 소수성 측쇄를 가진 아미노산이며 X9는 R 또는 T이며, X10은 R 또는 T이며, X11은 M 또는 T이며, X12는 S 또는 R이며, X13은 E 또는 D와 같은 음전하를 가진 아미노산이며, X14는 M 또는 V와 같은 소수성 측쇄를 가진 아미노산이다. 구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체의 VH는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체의 VH는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 서열 번호 13 또는 N-말단에서 아미노산 M이 없는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 CD47(예를 들어, 서열 번호 38 또는 39와 같은 인간 CD47)에 특이적으로 결합하는 단클론 항-CD47 항체를 제공하며, 이때 항-CD47 항체는 투여 후 실질적인 적혈구 고갈, 빈혈 또는 적혈구 고갈과 빈혈 둘 모두를 야기하거나 촉진하지 않는다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 투여 후 실질적인 혈소판 고갈을 야기하거나 촉진하지 않는다. 구체적 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 투여 후 세포의 실질적인 응집을 야기하거나 촉진하지 않는다. 구체적 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 투여 후 적혈구의 실질적인 응집을 야기하거나 촉진하지 않는다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 CD47이 시그널-조절-단백질α(SIRPα)와 상호작용하는 것을 억제한다(예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 억제한다). 구체적 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 CD47-발현 세포의 대식세포-매개 식세포작용과 같은, 식세포작용을 촉진한다. 일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 그러한 항-CD47 항체는 유의한 수준의 이펙터 기능을 야기하거나 촉진하지 않는다. 일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 무세포 시스템을 이용하여 발현될 경우, CHO 세포를 이용하여 발현된 경우에 비하여, FcγR에 대하여 낮은(예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 만큼 낮은) 결합 친화성을 나타내거나, FcγR에 결합하지 않는다. 구체적 양태에서, 그러한 낮은 결합 친화성은 적어도 1 로그 낮거나 적어도 2 로그 낮다. 일부 양태에서, FcγR은 FcγRI, FcγRIIA R131, FcγRIIA H131, FcγRIIB, 또는 FcγRIIIA V158이다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 CHO 세포에서 발현되는 경우에 비하여 무세포 시스템을 이용하여 발현될 경우 비글리코실화되거나 글리코실화가 적다(예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 적다).
구체적 양태에서, 본 발명은 CD47(예를 들어, 서열 번호 38 또는 39와 같은 인간 CD47)에 특이적으로 결합하는 단클론 항-CD47 항체를 제공하며, 이때 항-CD47 항체는 (i) CD47-발현 세포의 대식세포-매개 식세포작용과 같은 식세포작용을 촉진하며; (ii) 투여 후 유의한 수준의 적혈구 응집을 야기하거나 촉진하지 않으며; (iii) 유의한 수준의 ADCC 또는 CDC를 야기하거나 촉진하지 않으며; 및/또는 (iv) CHO 세포를 이용하여 발현된 경우나 모 항체에 비하여 FcγR에 대한 낮은(예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 만큼 낮은) 결합 친화성을 나타내거나 FcγR에 결합하지 않는다.
일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 이특이적(bispecific) 항체이다. 구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 제제(agent)에 접합(conjugate)된다. 일부 양태에서, 제제는 라벨이거나 독소이다.
구체적 양태에서, 본 발명은 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 약학 조성물은 추가로 약학적 허용 담체를 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 VH 쇄 영역, VL 쇄 영역, 또는 VL 쇄 영역과 VH 쇄 영역 둘 모두를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 구체적 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 중쇄, 경쇄 또는 중쇄와 경쇄 둘 모두를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 구체적 양태에서, 그러한 폴리뉴클레오티드는 중쇄를 코딩하는 서열 번호 26-32 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적 양태에서, 그러한 폴리뉴클레오티드는 경쇄를 코딩하는 서열 번호 33의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 (i) 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 VH 또는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 VL 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 집단을 제공한다. 일부 양태에서, 그러한 제1 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터에 작동가능하게 연결(operably linked)되며, 그러한 제2 폴리뉴클레오티드는 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
구체적 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 (i) 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 VH 또는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터 및 (ii) 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 VL 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 집단을 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 무세포 추출물 및 본 명세서에 개시된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 무세포 단백질 발현용 조성물을 제공한다. 구체적 양태에서, 조성물은 추가로 S30 무세포 추출물을 포함한다. 구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 조성물은 추가로 원핵 이황화 결합 아이소머라제 DsbC를 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체를 대상체에서 암을 치료하기에 충분한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체를 대상체에서 암의 하나 이상의 증상을 완화시키기에 충분한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 증상을 완화시키는 방법을 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 그러한 방법은 추가로 방사선 또는 화학요법의 투여를 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 그러한 방법은 추가로 다른 항암제를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에서 제공되는 방법의 구체적 양태에서, 암은 혈액암이다. 구체적 양태에서, 암은 고형암이다. 일부 양태에서, 암은 다발성 골수종, 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 급성 골수성 백혈병(AML), 유방암, 방광암, 비소세포 폐암/암종, 간세포 암종(HCC), 육종 또는 두경부암이다.
구체적 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 분리된 세포를 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 집단을 포함하는 분리된 세포를 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 분리된 세포를 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 (i) 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 VH 또는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 숙주 세포 및 (ii) 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 VL 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포 집단을 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체를 본 명세서에 개시된 무세포 단백질 발현용 조성물로 발현시키는 것을 포함하는 항-CD47 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 그러한 방법은 추가로 항-CD47 항체의 정제를 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 세포를 이용하여 항-CD47 항체를 발현시키는 것을 포함하는 항-CD47 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 그러한 방법은 추가로 항-CD47 항체의 정제를 포함한다.
도 1a는 무세포(CF) 시스템으로 발현된 항-CD47 항체의 오토라디오그램(autoradiagram)을 도시한다. 시료 1-10은 각각 CF-발현된 항-CD47 IgG1(1), IgG1-5m(2), IgG1-13m(3), IgG1-13mZ(4), IgG4P(5), IgG4P-5m(6), IgG4P-13m(7), IgG4PE(8), IgG4PE-5m(9), 및 IgG4PE-13m(10) 항체에 대응한다.
도 1b는 CF 발현 시스템으로부터 수득한 항-CD47 항체 역가(mg/L)를 보여주는 그래프를 도시한다. 시료 1-10은 각각 CF-발현된 항-CD47 IgG1(1), IgG1-5m(2), IgG1-13m(3), IgG1-13mZ(4), IgG4P(5), IgG4P-5m(6), IgG4P-13m(7), IgG4PE(8), IgG4PE-5m(9), 및 IgG4PE-13m(10) 항체에 대응한다.
도 2a-2f는 항-CD47 IgG1-5m(2a), IgG1-13m(2b), IgG1-13mZ(2c), IgG4P-5m(2d), IgG4PE-5m(2e), 및 대조군 항체(2f)의 비아코어(Biacore) 분석으로부터의 개별 센서그램(sensorgrams)을 도시한다.
도 3a-3c는 항-CD47 IgG1-13mZ(3a), IgG1-13m(3b), 및 IgG1-5m(3c) 항체를 위한 시차주사열량측정법(DSC)를 이용한 열안정성 분석으로부터의 비열 용량(kcal/mol/℃) 대 온도(℃)를 도시한 그래프이다.
도 4는 CHO 세포로 생산된 항-CD47 IgG4-PE 항체 및 CF 발현 시스템에 의해 생산된 항-CD47 IgG1 및 IgG1-5m 항체를 이용한 약동학 연구로부터의 항-CD47 항체 혈장 농도(㎍/mL) 대 시간(hrs)를 도시한 그래프이다.
도 5는 1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 및 0.1 mg/kg (qwx3)의 투여량의 CF 발현 시스템에 의해 생산된 항-CD47 IgG1-5m 항체를 이용한 생체 내(in vivo) 마우스 종양 이종이식편 연구로부터 RPMI8226 종양 세포 접종 후 종양 부피(mm3) 대 일 수를 도시한 그래프이다.
일 양태에서, 본 발명은 CD47(예를 들어, 인간 CD47)에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, 단클론 항체) 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 구체적 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 SIRPα에의 CD47 결합을 차단하고, 식세포작용을 촉진하며, Fc 이펙터 기능(예를 들어, FcγR, ADCC, 또는 CDC에의 결합)이 감소되거나 없으며 및/또는 응집(예를 들어, 적혈구응집) 활성이 거의 또는 전혀 없다.
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 단클론 항-CD47 항체를 제공하며, 이때 항-CD47 항체는 모 항체의 변이체이며, 무세포(CF) 발현 시스템을 이용하여 생산될 경우 항-CD47 항체는 CF 시스템에서 생산된 모 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 갖는다. 구체적 양태에서, CF 시스템에서 발현되는 본 발명의 항-CD47 항체는 비글리코실화된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CD47" 또는 "인테그린-연합 단백질" 또는 "IAP" 또는 "난소암 항원" 또는 "OA3" 또는 "Rh-관련 항원" 또는 "MER6"는 상호교환되어 사용될 수 있으며 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 멀티-스패닝 경막 수용체를 말한다. 예시적인 인간 CD47의 아미노산 서열은 하기에 제공된다(젠뱅크 기탁 번호(GenBank Accession No.) Q08722.1 (GI:1171879), 참고로 본원에 통합됨). 시그널 서열(아미노산 1-18)은 밑줄이 그어진다.
Figure 112017073071594-pct00001
Figure 112017073071594-pct00002
명확히 하기 위하여, 시그널 서열을 제외한 예시적인 인간 CD47의 아미노산 서열이 하기에 제공된다.
Figure 112017073071594-pct00003
용어 적혈구(들)(red blood cell(s))과 적혈구(들)(erythrocyte(s))는 동의어이며 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 응집은 세포 응집을 말하며, 용어 적혈구응집은 특정 세포 서브세트, 즉, 적혈구의 응집을 말한다. 따라서, 적혈구응집은 응집의 일 유형이다.
5. 1 항체
구체적 양태에서, 본 발명은 CD47 (예를 들어, 인간 CD47)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 구체적 양태에서, 본 발명은 변형없는 모 항체 보다 무세포(CF) 발현 시스템에서의 더 우수한 생산을 놀랍게도 허용하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 변형(예를 들어, 중쇄 가변 영역의 골격 영역에서의 5-13 아미노산 치환)을 포함하는 항-CD47 항체를 제공한다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 CD47과의 SIRPα 상호작용을 억제하고, 비글리코실화되며, 생체 내 또는 시험관 내(in vitro) 또는 둘 모두에서 식세포작용을 촉진하며, (예를 들어, 적혈구응집과 같은 응집을 촉진하지 않고)항종양 활성을 가지며, 및/또는 Fc 이펙터 기능(예를 들어, FcγR, ADCC, 또는 CDC에의 결합)이 낮거나 없다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 생체 내에서 동물 또는 포유류(예를 들어, 인간)의 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않는 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 그리고 달리 특정되지 않으면, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 플러스 또는 마이너스 10% 이내를 의미한다. 정수가 요구되는 경우에는, 이 용어는 주어진 값 또는 범위의 플러스 또는 마이너스 10% 이내를 의미하며, 가장 가까운 정수로 올림되거나 내림된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 및 "면역글로불린" 및 "Ig"는 본 기술분야의 용어이며 본 명세서에서 상호교환되어 사용될 수 있으며 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 가진 분자를 말한다.
항체는 예를 들어, 단클론 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 일특이적 항체, 다중특이적 항체(이특이적 항체 포함), 인간 항체, 인간화 항체, 쥐 항체(예를 들어, 마우스 또는 래트 항체), 키메라 항체, 합성 항체, 및 두 중쇄와 두 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체를 포함할 수 있다. 구체적 실시형태에서, 항체는 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 인트라바디(intrabodies), 이종접합체 항체, 단일 도메인 항체 및 1가 항체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 구체적 실시형태에서, 항체는 단일쇄 항체 또는 단일-쇄 Fv(scFv)(예를 들어, 일특이적, 이특이적, 등을 포함), 낙타화 항체, 아피바디(affybodies), Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편 및 이황화-결합 Fv(sdFv)와 같은 그러나 이에 제한되지 않는 항원-결합 단편 또는 에피토프 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 다클론 항체 집단을 말한다.
항체는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY), 임의의 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2), 또는 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG2a 또는 IgG2b)의 면역글로불린 분자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 IgG 항체, 또는 그의 클래스(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 서브클래스이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 IgG1 항체(예를 들어, 인간 IgG1) 또는 그의 서브클래스이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 IgG1 항체는 불변 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 IgG4 항체(예를 들어, 인간 IgG4) 또는 그의 서브클래스이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 IgG4 항체는 불변 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항원"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프를 함유하는 모이어티 또는 분자이다. 따라서, 항원은 또한 항체에 의해 특이적으로 결합된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 본 기술분야의 용어이며 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소 영역을 말한다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 형태를 가진, 비선형 또는 불연속적, 에피토프일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 항원의 경우, 에피토프는 폴리펩티드의 인접 아미노산들("선형" 에피토프)일 수 있거나 에피토프는 폴리펩티드의 둘 이상의 비-인접 영역으로부터의 아미노산을 포함할 수 있다("형태를 가진", "비-선형" 또는 "불연속적" 에피토프). 당업자는 일반적으로 선형 에피토프가 2차, 3차 또는 4차 구조에 의존하거나 의존하지 않을 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역특이적으로 결합", "면역특이적으로 인식", "특이적으로 결합" 및 "특이적으로 인식"은 항체의 맥락에서 유사한 용어이며, 항원/에피토프에 결합하는 분자를 말하며 그러한 결합은 당업자가 이해한다. 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 분자(예를 들어, 항체)는 예를 들어, 면역분석, 표면 플라스몬 공명 분석, 예를 들어, 비아코어(Biacore)™, 킨엑스에이(KinExA) 플랫폼(사피딘 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments), 아이다호주의 보이스), 또는 본 기술분야에 알려진 다른 분석에 의해 결정할 때 일반적으로 더 낮은 친화성으로, 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 구체적 실시형태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 그 분자가 다른 항원에 결합할 때의 Ka보다 적어도 2 로그, 2.5 로그, 3 로그, 4 로그 또는 그보다 더 큰 Ka로 항원에 결합한다. 다른 구체적 실시형태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 다른 단백질과 교차반응하지 않는다. 다른 구체적 실시형태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 다른 비-CD47 단백질과 교차반응하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단클론 항체"는 균질하거나 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 말하는, 본 기술분야에서 잘 알려진 용어이다. 용어 "단클론"은 항체를 제조하는 임의의 구체적 방법에 한정되지 않는다. 일반적으로, 단클론 항체 집단은 세포, 세포 집단 또는 세포주에 의해 생성될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단클론 항체"는 단일 세포 또는 세포주에 의해 생산된 항체이며 항체는 예를 들어, ELISA 또는 다른 항원-결합 또는 본 기술분야에 알려진 경쟁적 결합 분석에 의해 또는 본 명세서에서 제공된 실시예에서 결정할 때 CD47 에피토프에 면역특이적으로 결합한다. 구체적 실시형태에서, 단클론 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 단클론 항체는 1가 항체 또는 다가(예를 들어, 2가) 항체이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비-천연 아미노산"은 단백질형성 아미노산 또는 그의 번역후 변형 변이체가 아닌 아미노산을 말한다. 구체적으로, 이 용어는 20개의 일반적 아미노산 또는 피로라이신 또는 셀레노시스테인 또는 그의 번역후 변형 변이체 중 하나가 아닌 아미노산을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "다클론 항체"는 항원 또는 항원들 내의 동일 및/또는 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 다양한 상이한 항체를 포함하는 항체 집단을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 일부, 일반적으로, 항체 경쇄 또는 중쇄의 일부, 전형적으로 성숙 중쇄에서 아미노-말단 약 110 내지 120 아미노산 및 성숙 경쇄에서 아미노-말단 약 90 내지 100 아미노산을 말한다. 가변 영역은 골격 영역(FR)이 측면에 배치된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일반적으로, CDR 및 FR의 공간 배향은 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음과 같다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 어떤 특정 기전 또는 이론에 구애되지 않고, 경쇄 및 중쇄의 CDR은 주로 항원과 항체의 상호작용 및 에피토프에 대한 항체의 특이성을 책임지는 것으로 생각된다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체의 아미노산 위치의 넘버링은 Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242에서처럼, EU 인덱스에 따른다. 일부 실시형태에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 일부 실시형태에서, 가변 영역은 쥐 (예를 들어, 마우스 또는 래트) CDR 및 인간 골격 영역(FR)을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 가변 영역은 영장류(예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류) 가변 영역이다. 일부 실시형태에서, 가변 영역은 쥐(예를 들어, 마우스 또는 래트) CDR 및 영장류(예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류) 골격 영역(FR)을 포함한다. 비제한적인 예로서, 본 명세서에 개시된 가변 영역은 인간 서열의 둘 이상의 단편을 복합 인간 서열로 조립함으로써 수득된다.
일부 양태에서, 항체의 CDR은 (i) 카밧(Kabat) 넘버링 시스템(Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad . Sci . 190:382-391 및, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242); 또는 (ii) 본 명세서에서 "초티아(Chothia) CDR"로 불리는, 초티아 넘버링 도식(예를 들어, Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917; Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948; Chothia et al., 1992, J. Mol. Biol., 227:799-817; Tramontano A et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(1):175-82; 및 미국 특허 7,709,226호 참고); 또는 (iii) 예를 들어, Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7:132-136 및 Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212 ("IMGT CDRs")에 개시된, 이뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics)(IMGT) 넘버링 시스템; 또는 (iv) MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, Martin, A., "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)를 참고한다.
카밧 넘버링 시스템에 관하여, 항체 중쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 31 내지 35에 존재하며, 선택적으로 35 (카밧 넘버링 도식에서 35A 및 35B로 불림)(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65(CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102(CDR3) 후에 하나 또는 둘의 추가 아미노산을 포함할 수 있다. 카밧 넘버링 시스템을 이용하여, 항체 경쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56(CDR2), 및 아미노산 위치 89 내지 97(CDR3)에 존재한다. 당업자에게 잘 알려진 대로, 카밧 넘버링 시스템을 이용하여, 항체 가변 도메인의 실제 선형 아미노산 서열은 FR 및/또는 CDR의 단축 또는 연장으로 인해 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있으며, 따라서, 아미노산의 카밧 번호는 반드시 그의 선형 아미노산 번호와 동일하지는 않다.
본 발명에서 제공되는 항체는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY), 임의의 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2), 또는 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG2a 또는 IgG2b 또는 그 혼합물)의 면역글로불린 분자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 IgG 항체(예를 들어, 인간 IgG), 또는 그의 클래스(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 서브클래스이다.
구체적 양태에서, 본 발명은 항체 경쇄 및 중쇄, 예를 들어, 별도의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체를 제공한다. 경쇄와 관련하여, 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체의 경쇄는 카파(κ) 경쇄이다. 다른 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체의 경쇄는 람다(λ) 경쇄이다. 다른 실시형태에서, 경쇄는 혼합된 서열이며, 예를 들어, 경쇄의 가변 부분은 카파 경쇄 서열을 포함하고 경쇄의 불변 영역은 람다 경쇄 서열을 포함하거나, 그 역이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체의 경쇄는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄이다. 인간 불변 영역 서열의 비제한적인 예는 본 기술분야에서 개시되었으며, 예를 들어, 미국 특허 5,693,780호 및 Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242를 참고한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 단클론 항체를 제공하며, 그러한 항-CD47 항체는 모 항-CD47 항체의 변이체이며, 항-CD47 항체는 무세포(CF) 발현 시스템을 이용하여 생산할 경우, CF 시스템에서 발현된 모 항-CD47 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 가지며, 항-CD47 항체는 모 항-CD47 항체에 대하여, 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어, 1-15 아미노산 변형을 포함한다. 구체적 양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어, 1-15 아미노산 변형은 중쇄 또는 VH(예를 들어, 서열 번호 1) 내에 있다. 구체적 양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어, 1-15 아미노산 변형은 VH(예를 들어, 서열 번호 1)의 골격 영역 내에 있다. 일부 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-CD47 항체는 모 항-CD47 항체의 CDR(예를 들어, 카밧 CDR)을 포함하는 모 항-CD47 항체의 변이체이다.
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 단클론 항체를 제공하며, 그러한 항-CD47 항체는 모 항-CD47 항체의 변이체이며, 항-CD47 항체는 무세포(CF) 발현 시스템을 이용하여 생산할 경우, CF 시스템에서 발현된 모 항-CD47 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 가지며, 항-CD47 항체는 모 항-CD47 항체에 대하여, 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어, 1-15 아미노산 변형을 포함한다. 구체적 양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어, 5 또는 14 아미노산 변형은 중쇄 또는 VH(예를 들어, 서열 번호 1) 내에 있다. 구체적 양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어, 5, 10, 13 또는 14 아미노산 변형은 VH(예를 들어, 서열 번호 1)의 골격 영역 내에 있다. 구체적 양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어, 5, 13 또는 14 아미노산 변형은 VH(예를 들어, 서열 번호 1)의 골격 영역 내에 있다. 일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 모 항-CD47 항체의 CDR(예를 들어, 카밧 CDR)을 포함하는 모 항-CD47 항체의 변이체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아이소타입 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1 아이소타입 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1 Z 알로타입(allotype) 아이소타입 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG4, 예를 들어, IgG4P 또는 IgG4PE, 아이소타입 항체이다.
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 단클론 항체를 제공하며, 그러한 항-CD47 항체는 모 항-CD47 항체의 변이체이며, 항-CD47 항체는 무세포(CF) 발현 시스템을 이용하여 생산할 경우, CF 시스템에서 발현된 모 항-CD47 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 가진다. 구체적 실시형태에서, 모 항-CD47 항체는 항체 AB6.12이다(예를 들어, 미국 특허출원 공개 US 2014/0140989 A1호를 참고하며 그 전체가 참고로 본원에 통합된다). 항체 AB6.12의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열이 하기에 제공되며, 카밧 CDR에 밑줄 그어진다. 일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 모 항체 AB6.12의 변이체이며, 모 항체 AB6.12의 CDR(예를 들어, 카밧 CDR), 예를 들어, 서열 번호 14-19를 포함한다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아이소타입 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1 아이소타입 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1 Z 알로타입 아이소타입 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG4, 예를 들어, IgG4P 또는 IgG4PE, 아이소타입 항체이다.
항-CD47 항체 AB6.12 중쇄 가변 영역(VH)(카밧 CDR 1-3은 밑줄이 그어짐, 서열 번호 14-16):
Figure 112017073071594-pct00004
항-CD47 항체 AB6.12 경쇄 가변 영역(VL)(카밧 CDR 1-3은 밑줄이 그어짐, 서열 번호 17-19):
Figure 112017073071594-pct00005
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47은 모 항체, 예를 들어, 참고로 그 전체가 본원에 통합되는 미국 특허출원 공개 2014/0140989 A1호에 개시된 항-CD47 항체, 예를 들어, 미국 특허출원 공개 US 2014/0140989 A1호의 표 1에 개시된 항-CD47 항체(예를 들어, 항-CD47 항체 2A1, AB2.03, AB2.04, AB2.05, AB2.06, AB2.07, AB2.08, AB2.09, AB2.13, AB3.09, AB6.12, AB6.13, AB6.14, AB6.17, AB10.13, AB10.14, AB11.05, AB12.05, AB15.05, AB16.05, AB17.05, AB22.05, AB23.05, AB24.05, 및 AB25.05)로부터 선택된 모 항체의, 예를 들어, VH 골격 영역 내에서 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 1-15 아미노산 변형)을 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 단클론 항체를 제공하며, 그러한 항-CD47 항체는 모 항-CD47 항체의 변이체이며, 항-CD47 항체는 무세포(CF) 발현 시스템을 이용하여 생산할 경우, CF 시스템에서 발현된 모 항-CD47 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 가지며, 항-CD47 항체는 하기의 N-말단에서 C-말단으로의 서열을 포함하는 VH를 포함하며:
Figure 112017073071594-pct00006
,X 1 - X 14 를 위한 밑줄 친 아미노산 잔기는 N-말단으로부터 C-말단으로의 순서이며, X1은 M이거나 위치 X1에 아미노산이 없으며, X2는 M 또는 V와 같은 소수성 측쇄를 가진 아미노산이며, X3은 T 또는 P이며, X4는 S 또는 A이며, X5는 A 또는 G와 같은 지방족 측쇄를 가진 산이며, X6은 F 또는 L이며, X7은 D 또는 G이며, X8은 I 또는 M과 같은 소수성 측쇄를 가진 아미노산이며, X9는 R 또는 T이며, X10은 R 또는 T이며, X11은 M 또는 T이며, X12는 S 또는 R이며, X13은 E 또는 D와 같은 음전하를 가진 아미노산이며, X14는 M 또는 V와 같은 소수성 측쇄를 가진 아미노산이다.
구체적 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 서열 번호 20의 서열을 포함하는 VH를 포함하며, 위치 X1의 아미노산은 M과 같은 임의의 아미노산이며, X2는 M이 아니며, X3는 T가 아니며, X4는 S가 아니며, X5는 A가 아니며, X6은 F가 아니며, X7은 D가 아니며, X8은 I가 아니며, X9는 R이 아니며, X10은 R이 아니며, X11은 M이 아니며, X12는 S가 아니며, X13은 E가 아니며 및/또는 X14는 M이 아니다. 구체적 양태에서, X1 내지 X14 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개는 이들 아미노산이 아니다. 구체적 양태에서, VH 아미노산 서열은 항체 AB6.12의 VH 아미노산 서열이 아니며, 예를 들어, VH 아미노산 서열은 서열 번호 1이 아니다.
구체적 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 서열 번호 20의 서열을 포함하는 VH를 포함하며, 이때 위치 X7의 아미노산은 G가 아니며, X9는 A가 아니며 및/또는 X11은 S가 아니다. 구체적 양태에서, X7, X9 및 X11 중 임의의 1, 2, 또는 3개는 이들 아미노산이 아니다. 구체적 양태에서, 위치 X7의 아미노산이 G이면, X8은 M이고 및/또는 X10은 T이고, X9는 A가 아니며 및/또는 X11은 S가 아니다.
구체적 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 서열 번호 20의 서열을 포함하는 VH를 포함하며, 이때 위치 X7의 아미노산은 G가 아니며, X8은 M이 아니며, X9는 E가 아니며, X10은 T가 아니며, 및/또는 X11은 T가 아니다. 구체적 양태에서, X7 내지 X11 중 임의의 1, 2, 3 또는 4개는 이들 아미노산이 아니다. 구체적 양태에서, 위치 X7의 아미노산이 G이면, X8은 M이고 X10은 T이고, X9는 E가 아니며 및/또는 X11은 T이다.
구체적 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 서열 번호 20의 서열을 포함하는 VH를 포함하며, 이때 VH는 그 전체가 참고로 본원에 통합되는 미국 특허출원 공개 US2014/0140989 A1호의 서열 번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 구체적 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 서열 번호 20의 컨센서스 서열을 포함하는 VH를 포함하며, 이때 VH는 그 전체가 참고로 본원에 통합되는 미국 특허출원 공개 US2014/0140989 A1호의 서열 번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30의 아미노산 서열의 골격 영역을 포함하지 않는다.
구체적 양태에서, X1은 M이고, X2는 V이며, X3는 P이고, X4는 A이며, X5는 G이고, X6은 L이며, X7은 G이고, X8은 M이며, X9는 T이고, X10은 T이며, X11은 T이고, X12는 R이며, X13은 D이고, 및/또는 X14는 V이다. 구체적 실시형태에서, X1 내지 X14 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개가 이들 아미노산이다.
구체적 양태에서, X1은 M이고, X2는 M이며, X3은 P이고, X4는 S이며, X5는 A이고 X6은 F이며, X7은 G이고, X8은 I이며, X9는 R이고, X10은 R이며, X11은 T이고, X12는 R이고, X13은 E이며, 및/또는 X14는 V이다. 구체적 실시형태에서, X1 내지 X14 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개는 이들 아미노산이다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 항체 AB6.12가 아니다. 구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 항체 AB6.12의 VH(예를 들어, 서열 번호 1) 및/또는 VL(예를 들어, 서열 번호 12)을 포함하지 않는다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 표 1에 제시된 하기의 VH 아미노산 서열 중 하나를 포함한다.
[표 1] VH 아미노산 서열
Figure 112017073071594-pct00007
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 단클론 항체를 제공하며, 그러한 항-CD47 항체는 모 항-CD47 항체의 변이체이며, 항-CD47 항체는 무세포(CF) 발현 시스템을 이용하여 생산할 경우, CF 시스템에서 발현된 모 항-CD47 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 가지며,항-CD47 항체는 서열 번호 21을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아이소타입 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1 아이소타입 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1 Z 알로타입 아이소타입 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG4, 예를 들어, IgG4P 또는 IgG4PE, 아이소타입 항체이다.
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 단클론 항체를 제공하며, 그러한 항-CD47 항체는 모 항-CD47 항체의 변이체이며, 항-CD47 항체는 무세포(CF) 발현 시스템을 이용하여 생산할 경우, CF 시스템에서 발현된 모 항-CD47 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 가지며,항-CD47 항체는 서열 번호 22를 포함하는 VH를 포함한다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아이소타입 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1 아이소타입 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG1 Z 알로타입 아이소타입 항체이다. 일부 양태에서, 그러한 항-CD47 항체는 IgG4, 예를 들어, IgG4P 또는 IgG4PE, 아이소타입 항체이다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체(IgG1-13m)는 하기에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 중쇄를 포함한다:
Figure 112017073071594-pct00008
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체(IgG1-13mZ)는 하기에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 IgG1-Z 알로타입 중쇄를 포함한다:
Figure 112017073071594-pct00009
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체(IgG1-5m)는 하기에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 중쇄를 포함한다:
Figure 112017073071594-pct00010
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체(IgG4P-13m)는 하기에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 IgG4P 항체를 포함한다:
Figure 112017073071594-pct00011
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체(IgG4P-5m)는 하기에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 IgG4P 중쇄를 포함한다:
Figure 112017073071594-pct00012
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체(IgG4PE-13m)는 하기에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 IgG4PE 중쇄를 포함한다:
Figure 112017073071594-pct00013
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체(IgG4PE-5m)는 하기에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 IgG4PE 중쇄를 포함한다:
Figure 112017073071594-pct00014
Figure 112017073071594-pct00015
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 단클론 항체를 제공하며, 그러한 항-CD47 항체는 모 항-CD47 항체의 변이체이며, 항-CD47 항체는 무세포(CF) 발현 시스템을 이용하여 생산할 경우, CF 시스템에서 발현된 모 항-CD47 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 가지며,항-CD47 항체는 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역(예를 들어, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역), 예를 들어, 서열 번호 13을 포함하는 경쇄를 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 단클론 항체를 제공하며, 그러한 항-CD47 항체는 모 항-CD47 항체의 변이체이며, 항-CD47 항체는 무세포(CF) 발현 시스템을 이용하여 생산할 경우, CF 시스템에서 발현된 모 항-CD47 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 가지며, 항-CD47 항체는 (i) 본 명세서에 개시된 VH(예를 들어, 서열 번호 20, 21, 또는 22) 또는 본 명세서에 개시된 중쇄(예를 들어, 서열 번호 5-11 중 어느 하나), 및 (ii) 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역(예를 들어, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역)을 포함하는 경쇄, 예를 들어, 서열 번호 13, 예를 들어, 하기에 개시된 것(항-CD47 항체 경쇄(Igκ)), 또는 N-말단에서 아미노산 M이 없는 서열 번호 13을 포함한다:
Figure 112017073071594-pct00016
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47은 참고로 그 전체가 본원에 통합되는 미국 특허출원 공개 2014/0140989 A1호에 개시된 항-CD47 항체, 예를 들어, 상기 공보의 표 1에 개시된 항-CD47 항체(예를 들어, 항-CD47 항체 2A1, AB2.03, AB2.04, AB2.05, AB2.06, AB2.07, AB2.08, AB2.09, AB2.13, AB3.09, AB6.12, AB6.13, AB6.14, AB6.17, AB10.13, AB10.14, AB11.05, AB12.05, AB15.05, AB16.05, AB17.05, AB22.05, AB23.05, AB24.05, 및 AB25.05) 중 어느 하나, 또는 상기 공보의 서열 번호 5-30 중 어느 것을 포함하는 임의의 항체가 아니다.
일부 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG 아이소타입이다. 일부 실시형태에서, 항체의 불변 영역은 하기 아미노산 서열을 가진 인간 IgG1 아이소타입이다:
Figure 112017073071594-pct00017
일부 실시형태에서, 인간 IgG1 불변 영역은 항체의 글리코실화를 방지하기 위하여 아미노산 Asn297(상자로 표시됨, 카밧 넘버링)에서 변형되며, 예를 들어, Asn297Ala(N297A)이다. 일부 실시형태에서, 항체의 불변 영역은 Fc 수용체 상호작용을 변화시키기 위하여 아미노산 Leu235(카밧 넘버링)에서 변형되며, 예를 들어, Leu235Glu(L235E) 또는 Leu235Ala(L235A)이다. 일부 실시형태에서, 항체의 불변 영역은 Fc 수용체 상호작용을 변화시키기 위하여 아미노산 Leu234 (카밧 넘버링)에서 변형되며, 예를 들어, Leu234Ala(L234A)이다. 일부 실시형태에서, 항체의 불변 영역은 아미노산 234 및 235 둘 모두에서 변형되며, 예를 들어, Leu234Ala 및 Leu235Ala(L234A/L235A)(Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest의 EU 인덱스)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체의 불변 영역은 하기 아미노산 서열을 가진 인간 IgG2 아이소타입이다:
Figure 112017073071594-pct00018
일부 실시형태에서, 인간 IgG2 불변 영역은 항체의 글리코실화를 방지하기 위하여 아미노산 Asn297(상자 표시됨, 카밧 넘버링)에서 변형되며, 예를 들어, Asn297Ala (N297A)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체의 불변 영역은 하기 아미노산 서열을 가지는 인간 IgG3 아이소타입이다:
Figure 112017073071594-pct00019
일부 실시형태에서, 인간 IgG3 불변 영역은 항체의 글리코실화를 방지하기 위하여 아미노산 Asn297(상자 표시됨, 카밧 넘버링)에서 변형되며, 예를 들어, Asn297Ala (N297A)이다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG3 불변 영역은 반감기를 연장하기 위하여 아미노산 435에서 변형되며, 예를 들어, Arg435His(R435H)(Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest의 EU 인덱스)이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체의 불변 영역은 하기 아미노산 서열을 가진 인간 IgG4 아이소타입이다:
Figure 112017073071594-pct00020
일부 실시형태에서, 인간 IgG4 불변 영역은 쇄 교환을 방지하거나 감소시키기 위하여 힌지 영역 내에서 변형되며, 예를 들어, Ser228Pro(S228P)이다. 다른 실시형태에서, 인간 IgG4 불변 영역은 Fc 수용체 상호작용을 변화시키기 위하여 아미노산 235에서 변형되며, 예를 들어, Leu235Glu(L235E)이다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG4 불변 영역은 힌지내에서 및 아미노산 235에서 변형되며, 예를 들어, Ser228Pro 및 Leu235Glu(S228P/L235E)이다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG4 불변 영역은 항체의 글리코실화를 방지하기 위하여 아미노산 Asn297(카밧 넘버링)에서 변형되며, 예를 들어, Asn297Ala(N297A)이다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 인간 IgG4 불변 영역은 아미노산 위치 Ser228, Leu235, 및 Asn297에서 변형된다(예를 들어, S228P/L235E/N297A). (Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest의 EU 인덱스). 본 발명의 다른 실시형태에서, 항체는 인간 IgG4 서브클래스이며 글리코실화가 결핍된다. 이들 실시형태에서, 글리코실화는 위치 297 (카밧 넘버링)에서의 돌연변이, 예를 들어, N297A에 의해 제거될 수 있다. 다른 실시형태에서, 글리코실화는 번역후 글리코실화 능력이 없는 숙주 세포, 예를 들어, 박테리아 또는 효모 유래 시스템 또는 변형된 포유류 세포 발현 시스템에서 항체를 생산함으로써 제거될 수 있다.
일부 실시형태에서, 인간 IgG 불변 영역은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체-의존성 세포독성(CDC)을 변화시키기 위하여 변형되며, 예를 들어, Natsume et al., 2008 Cancer Res, 68(10): 3863-72; Idusogie et al., 2001 J Immunol, 166(4): 2571-5; Moore et al., 2010 mAbs, 2(2): 181-189; Lazar et al., 2006 PNAS, 103(11): 4005-4010, Shields et al., 2001 JBC, 276( 9): 6591-6604; Stavenhagen et al., 2007 Cancer Res, 67(18): 8882-8890; Stavenhagen et al., 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164; Alegre et al, 1992 J Immunol, 148: 3461-3468에 개시되고; Kaneko and Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1):1-11에서 검토된 아미노산 변형이 있다.
일부 실시형태에서, 인간 IgG 불변 영역은 이종이량체화를 유도하기 위하여 변형된다. 예를 들어, 보다 부피가 큰 아미노산, 예를 들어, Tyr(T366W)로 치환될 경우, 위치 Thr366, Leu368, 및 Tyr407에서 덜 부피가 큰 아미노산, 예를 들어, Ser, Ala 및 Val로 각각 아미노산 변형(T366S/L368A/Y407V)을 가진 두번째 CH3 도메인과 우선적으로 쌍을 이룰 수 있는, Thr366에서 CH3 도메인 내의 아미노산 변형을 갖는 것이 있다. CH3 변형을 통한 이종이량체화는 예를 들어, 반대측 CH3 도메인 상에서 Ser354를 Cys(S354C)로 그리고 Y349를 Cys(Y349C)로 변화시킴으로써, 이황화 결합을 도입함으로써 추가로 안정화될 수 있다(Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15에서 검토됨).
다른 양태에서, 항체는 글리코실화가 결핍되지만, 아미노산 Asn297(카밧 넘버링)에서 변형되지 않는다. 이들 실시형태에서, 글리코실화는 예를 들어, 번역후 글리코실화 능력이 없는 숙주 세포, 예를 들어, 박테리아 또는 효모 유래 시스템 또는 변형된 포유류 세포 발현 시스템에서 항체를 생산함으로써 제거될 수 있다. 일부 양태에서, 그러한 시스템은 CF 발현 시스템일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 모 항체에 대하여 소정의 퍼센트 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
두 서열(예를 들어, 아미노산 서열 또는 핵산 서열) 간의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 이루어질 수 있다. 두 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 비제한적인 예는 Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877에서처럼 변형된 Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘은 Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램내로 통합된다. BLAST 뉴클레오티드 조사는 본 명세서에 개시된 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위하여 NBLAST 뉴클레오티드 프로그램 파라미터 세트, 예를 들어, 점수=100, 단어길이=12를 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 조사는 본 명세서에 개시된 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위하여 XBLAST 프로그램 파라미터 세트, 예를 들어, 점수 50, 단어길이=3을 이용하여 수행될 수 있다. 비교 목적을 위하여 갭을 가진 배열을 수득하기 위하여, Gapped BLAST를 Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402에 개시된 대로 이용할 수 있다. 대안적으로, PSI BLAST는 분자 간의 거리 관계(Id)를 검출하는 반복된 조사를 수행하기 위하여 이용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI Blast 프로그램을 이용할 경우, 각 프로그램의(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST의) 디폴트 파라미터를 이용할 수 있다(예를 들어, 월드와이드 웹 ncbi.nlm.nih.gov의 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 참고). 서열 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직한 비제한적인 예는 Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘은 GCG 서열 배열 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)에 통합된다. 아미노산 서열 비교를 위하여 ALIGN 프로그램을 이용할 경우, PAM120 가중 잔기 표(weight residue table), 갭 길이 패널티 12, 및 갭 패널티 4가 이용될 수 있다.
두 서열 간의 퍼센트 동일성은 갭을 허용하거나 허용하지 않고, 상술한 것과 유사한 기술을 이용하여 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성 계산에서, 전형적으로 정확한 매치만이 계수된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 12의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하며, 항체는 CD47에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 12의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하며, 항체는 CD47에 특이적으로 결합하며, 항체는 서열 번호 12의 CDR(예를 들어, VL CDR 1-3)(예를 들어, 서열 번호 17-19)에 동일한 CDR(예를 들어, VL CDR 1-3)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 13의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하며, 항체는 CD47에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 13의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 도메인을 포함하며, 항체는 CD47에 특이적으로 결합하며, 항체는 서열 번호 13의 CDR(예를 들어, VL CDR 1-3)(예를 들어, 서열 번호 17-19)에 동일한 CDR(예를 들어, VL CDR 1-3)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하며, 항체는 CD47에 특이적으로 결합하며, 항-CD47 항체는 무세포 발현 시스템을 이용하여 생산될 경우 CF 발현 시스템에서 생산된 모 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하며, 항체는 CD47에 특이적으로 결합하며, 항체는 서열 번호 1의 CDR(예를 들어, VL CDR 1-3)(예를 들어, 서열 번호 14-16)에 동일한 CDR(예를 들어, VL CDR 1-3)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 2의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하며, 항체는 CD47에 특이적으로 결합하며, 항-CD47 항체는 무세포 발현 시스템을 이용하여 생산될 경우 CF 발현 시스템에서 생산된 모 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 2의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 도메인을 포함하며, 항체는 CD47에 특이적으로 결합하며, 항체는 서열 번호 2의 CDR(예를 들어, VL CDR 1-3)(예를 들어, 서열 번호 17-19)에 동일한 CDR(예를 들어, VL CDR 1-3)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 3의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하며, 항체는 CD47에 특이적으로 결합하며, 항-CD47 항체는 무세포 발현 시스템을 이용하여 생산될 경우 CF 발현 시스템에서 생산된 모 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 3의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 도메인을 포함하며, 항체는 CD47에 특이적으로 결합하며, 항체는 서열 번호 3의 CDR(예를 들어, VL CDR 1-3)(예를 들어, 서열 번호 17-19)에 동일한 CDR(예를 들어, VL CDR 1-3)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 4의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하며, 항체는 CD47에 특이적으로 결합하며, 항-CD47 항체는 무세포 발현 시스템을 이용하여 생산될 경우 CF 발현 시스템에서 생산된 모 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 4의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 도메인을 포함하며, 항체는 CD47에 특이적으로 결합하며, 항체는 서열 번호 4의 CDR(예를 들어, VL CDR 1-3)(예를 들어, 서열 번호 17-19)에 동일한 CDR(예를 들어, VL CDR 1-3)을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 비제한적인 예로서, CD47과 그의 리간드 SIRPα 사이의 상호작용의 차단 및/또는 적혈구의 응집을 촉진(예를 들어, 유도 또는 증가)하지 않고 식세포작용의 촉진(예를 들어, 유도 또는 증가) 및 항종양 활성과 같은 하나 이상의 바람직한 특징을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 부재하에서 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용 수준에 비하여 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용의 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%를 차단한다.
구체적 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 세포, 예를 들어, CD47-발현 세포(예를 들어, CCRF-CEM 세포)의 예를 들어, 대식세포에 의한 식세포작용을 촉진한다(예를 들어, 유도하거나 증가시킨다). 일 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 존재하에서의 식세포작용의 수준은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 존재하에서의 식세포작용의 수준에 비하여, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99%, 적어도 150%, 적어도 200% 증가된다.
구체적 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 세포의 유의한 수준의 응집을 촉진(예를 들어, 유도 또는 증가)하거나 야기하지 않으며, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 적혈구의 유의한 수준의 응집을 촉진(예를 들어, 유도 또는 증가)하거나 야기하지 않는다. 일 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 존재하에서 응집 수준은 MCA911 마우스 항-인간 CD47 항체(BRIC126)와 같은, 응집을 유도하는 것으로 알려진 항-CD47 항체의 존재하에서의 응집 수준에 비하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99% 감소된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 존재하에서의 응집 수준이 MCA911 마우스 항-인간 CD47 항체(BRIC126)와 같은, 응집을 유도하는 것으로 알려진 기존의 항-CD47 항체의 존재하에서의 응집 수준에 비하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99% 감소되면, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 유의한 수준의 응집을 촉진(예를 들어, 유도 또는 증가) 또는 야기하지 않는다.
본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 또한 CD47에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하며, 항체는 유의한 수준의 응집, 예를 들어, 적혈구 응집("RBC 응집")을 촉진(예를 들어, 유도 또는 증가)하거나 야기하지 않는다.
일부 양태에서, RBC 고갈 수준은 치료제, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 투여 후 대상체에서 RBC 카운트를 측정하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 투여 후 대상체에서 RBC 카운트가 정상의 건강한 대상체의 범위 이내이면, 유의한 수준의 RBC 고갈을 촉진(예를 들어, 유도 또는 증가)하거나 야기하지 않는다. 예를 들어, 정상의 건강한 남성의 RBC 카운트는 약 470만 내지 약 610만 세포/혈액 시료 마이크로리터이다. 예를 들어, 정상의 건강한 여성의 RBC 카운트는 약 420만 내지 약 540만 세포/혈액 시료 마이크로리터이다. 일부 양태에서, 만일 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 투여 후(예를 들어, 5 분, 10 분, 30 분, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 12 h, 24 h, 2 일, 4 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 이상) 대상체에서 RBC 카운트가 투여 전 RBC 카운트의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%이면, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 유의한 수준의 RBC 고갈을 촉진(예를 들어, 유도 또는 증가)하거나 야기하지 않는다. 구체적 양태에서, 만일 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 투여 후(예를 들어, 5 분, 10 분, 30 분, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 12 h, 24 h, 2 일, 4 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 이상) 대상체에서 RBC 카운트가 위약 치료제(예를 들어, 비히클)의 투여 후 대상체에서 RBC 카운트의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%이면, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 유의한 수준의 RBC 고갈을 촉진(예를 들어, 유도 또는 증가)하거나 야기하지 않는다. RBC 카운트는 본 기술 분야의 표준 방법에 의해 결정된다.
구체적 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 유의한 수준의 혈소판 고갈을 촉진(예를 들어, 유도 또는 증가)하거나 야기하지 않는다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 투여는 남아 있는 혈소판 백분율이 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 이도록 한다.
또한, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 Fcγ 수용체(FcγR)에 결합하지 않거나 이에 낮은 결합 친화성을 갖는 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 항-CD47 항체의 불변 영역은, 예를 들어, CF 발현 시스템을 이용하여 생산할 경우, 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포) 발현 시스템을 이용하여 생산된 항-CD47 항체의 불변 영역보다 FcγR에 대한 결합 친화성이 더 낮다.
당업자는 과도한 실험없이, 응집 수준, 예를 들어, RBC의 응집 수준을 정량하는 것이 가능함을 인식할 것이다. 예를 들어, 당업자는 적혈구응집 수준이 하기 실시예에 개시된 대로 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 존재하에서 적혈구응집 분석을 수행한 후 RBC 도트(dot)의 면적을 측정함으로써 확인됨을 인식할 것이다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 존재하에서의 RBC 도트의 면적은 항-CD47 항체의 부재하에서, 예를 들어, 적혈구응집이 없는 상태에서, RBC 도트의 면적에 비교된다. 이러한 방식으로, 적혈구응집은 기준선 대조군에 대하여 정량된다. 더 큰 RBC 도트 면적은 더 높은 수준의 적혈구응집에 해당한다. 대안적으로, RBC 도트의 밀도가 또한 적혈구응집을 정량하기 위하여 이용될 수 있다.
당업자는 과도한 실험없이, RBC 고갈 수준을 정량하는 것이 가능함을 인식할 것이다. 예를 들어, 당업자는 예를 들어, 세포 계수기 또는 혈구계를 이용하여, 예를 들어, RBC 카운트(즉, 혈액 시료 내의 RBC의 총 수)를 측정함으로써, RBC 고갈 수준이 확인됨을 인식할 것이다. 당업자는 혈액 시료 내의 RBC가 계수 전에, 예를 들어, 원심분리를 이용하여 전혈을 분획화함으로써 선택적으로 분리될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 존재하에서 RBC 카운트는 CD47 항체의 부재하에서의, 예를 들어, RBC 고갈이 없는 상태에서의 RBC 카운트에 비교된다. 이러한 방식으로, RBC 고갈 수준은 기준선 대조군에 대하여 정규화된다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 예를 들어, CD47 발현(예를 들어, CD47의 세포 표면 발현 억제), 활성 및/또는 시그널링의 억제에 의해, 또는 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 방해함으로써, 억제 활성을 나타낸다. 일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 CD47, 예를 들어, 인간 CD47에 결합하거나 또는 다르게는 상호작용할 때, CD47 발현 또는 활성을 완전히 또는 부분적으로 감소시키거나 다르게는 조절한다. CD47의 생물학적 기능의 감소 또는 조절은 항체와 인간 CD47 폴리펩티드 및/또는 펩티드 사이의 상호작용시에 완전하거나, 유의하거나 부분적이다. 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는, 항체의 존재하에서 CD47 발현 또는 활성의 수준이 본 명세서에 개시된 항체와의 상호작용, 예를 들어, 결합의 부재시의 CD47 발현 또는 활성의 수준에 비하여 적어도 95%, 예를 들어, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 감소될 경우, CD47 발현 또는 활성을 완전히 억제하는 것으로 간주된다. 구체적 양태에서, 항-CD47 항체는, CD47 항체의 존재하에서 CD47 발현 또는 활성의 수준이 본 명세서에 개시된 CD47 항체와의 결합 부재시에 CD47 발현 또는 활성의 수준에 비하여 적어도 50%, 예를 들어, 55%, 60%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 감소될 경우, CD47 발현 또는 활성을 유의하게 억제하는 것으로 간주된다. 일부 양태에서, 항-CD47 항체는, 항체의 존재하에서 CD47 발현 또는 활성의 수준이 본 명세서에 개시된 항체와의 상호작용, 예를 들어, 결합의 부재시에 CD47 발현 또는 활성의 수준에 비하여 95% 미만, 예를 들어, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 감소되면, CD47 발현 또는 활성을 부분적으로 억제하는 것으로 간주된다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 부위-특이적 위치에서 하나 이상의 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어, 그 전체가 참고로 본원에 통합되는 미국 특허출원 공개 2014/0046030 A1호를 참고한다. 구체적 양태에서, 부위-특이적 위치에서 비천연 아미노산 잔기는 항체 생산 수율, 가용성, 결합 친화성 및/또는 활성을 위해 이점을 갖는다. 비천연 아미노산의 비제한적인 예는 예를 들어, 미국 특허출원 공개 2014/0066598 A1호에 개시되었다.
구체적 양태에서, 본 발명은 라벨 또는 독소와 같은 접합 모이어티(conjugation moiety) 또는 제제(agent)에 접합된 항-CD47 항체를 제공한다. 접합 모이어티는 당업자에게 유용한 것으로 간주되는 임의의 접합 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 접합 모이어티는 시험관 내 또는 생체 내에서 항체의 안정성을 개선할 수 있는, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체일 수 있다. 접합 모이어티는 치료 활성을 가져서, 항체-약물 접합체를 생성할 수 있다. 접합 모이어티는 표적 세포에 해로운 분자 탑재물(molecular payload)일 수 있다. 접합 모이어티는 검출 또는 진단에 유용한 라벨일 수 있다. 일부 양태에서, 접합 모이어티는 직접 공유 결합을 통해 항체에 연결된다. 일부 양태에서, 접합 모이어티는 링커를 통해 항체에 연결된다. 구체적 양태에서, 접합 모이어티 또는 링커는 항-CD47 항체의 비천연 아미노산 중 하나를 통해 부착된다. 예시적인 접합 모이어티 및 링커는 예를 들어, 미국 특허출원 공개 2014/0046030A1호에 개시되었으며, 그 전체가 참고로 본원에 통합된다.
5.2 항체 생산
CD47 (예를 들어, 인간 CD47의 ECD)에 면역특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 화학적 합성에 의해 또는 재조합 발현 기술(예를 들어, CF 발현 시스템)에 의해 생산될 수 있다.
그러한 방법은 분자 생물학, 미생물학, 유전자 분석, 재조합 DNA, 유기화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오티드 합성 및 변형, 핵산 하이브리드화 및 본 기술분야 내의 관련 분야에서의 통상적인 기술을 이용할 수 있다. 이들 기술은 예를 들어, 본 명세서에서 인용된 문헌에서 개시되며 완전히 설명된다. 예를 들어, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 및 연례 개정판); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 및 연례 개정판) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참고한다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 CF 발현 시스템, 예를 들어, 본 기술분야에 알려진 CF 발현 시스템을 이용하여 그리고 예를 들어, 하기의 실시예에 개시된대로, 생산될 수 있다. 예를 들어, CF 발현 시스템은 DsbC를 가진 무세포 추출물, 예를 들어, S30 무세포 추출물, 및 20 아미노산(예를 들어, 천연 또는 비천연), 및 선택적으로, 이오도아세트아미드, 마그네슘 글루타메이트, 암모늄 글루타메이트, mM 포타슘 글루타메이트, 소듐 피루베이트, AMP, GMP, UMP, 및 CMP, 소듐 옥살레이트, 푸트레신, 스펄미딘, 포타슘 포스페이트, T7 RNAP 및 산화된 (GSSG) 글루타치온 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 중쇄 플라스미드 및 경쇄 플라스미드는 따라서 폴리펩티드 생산 및 정제를 위해 CF 추출물 조성물에 추가된다.
일부 양태에서, CF 발현 시스템은 그 전체가 참고로 본원에 통합되는 Yin et al., mAbs, 2012, 4:217-225에 개시된 시험관 내 전사 및 번역 시스템이다. 일부 양태에서, 무세포 시스템은 진핵 세포로부터 또는 원핵 세포로부터의 무세포 추출물을 이용한다. 일부 양태에서, 원핵 세포는 이. 콜라이(E.coli)이다.
구체적 실시형태에서, CF 발현 시스템은 그 전체가 참고로 본원에 통합되는 미국 특허출원 공개 2014/0315245호에 개시된 시스템을 이용할 수 있다. 예를 들어, CF 발현 시스템은 산화성 인산화 시스템 및 무세포 단백질 합성에 필요한 성분들을 가진 박테리아 추출물을 포함할 수 있으며, 일부 실시형태에서, 외인성 단백질 샤페론(chaperone), 예를 들어, 단백질 이황화 아이소머라제(PDI), 또는 펩티드-프롤릴 시스-트랜스 아이소머라제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적 실시형태에서, PDI는 이. 콜라이의 Dsb(이황화 결합 형성) 패밀리의 구성원, 예를 들어, DsbA 또는 DsbC이다. 일부 실시형태에서, CF 발현 시스템은 예를 들어, Zawada et al., Biotechnology and Bioengineering (2011) vol. 108, No. 7에 따라 제조될 수 있는, 미국 특허출원 공개 2014/0315245호에 개시된, 이. 콜라이 균주 SBDG028, SBDG031, 또는 SBDG044의 세포 추출물을 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 CF 발현 시스템을 이용하여 모 항체보다 더 우수하게 항체 생산이 가능하도록 하는 아미노산 변형을 포함한다. 구체적 양태에서, CF 발현 시스템을 이용하여 생산되는 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 비글리코실화된다.
단클론 항체는 예를 들어, 하이브리도마, 재조합 및 파아지 디스플레이 기술 또는 그 조합의 사용을 비롯하여 본 기술분야에서 알려진 광범위한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 단클론 항체는 본 기술분야에 알려지고 예를 들어, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981)에서 교시된 것들을 비롯한 하이브리도마 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "단클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체로 제한되지 않는다. 예를 들어, 단클론 항체는 본 명세서에 개시된 항체(예를 들어, 항체 Ab235-Ab255 중 어느 하나의 CDR을 포함하는 항-CD47 항체) 또는 그 단편, 예를 들어, 그러한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현하도록 조작된 숙주 세포로부터 재조합적으로 생산될 수 있다.
또한, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한 본 기술분야에 알려진 다양한 파아지 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에서는, 기능성 항체 도메인이 그들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유한 파아지 입자의 표면 상에 디스플레이된다. 본 명세서에 개시된 항체를 제조하기 위하여 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예는 Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; PCT 출원 PCT/GB91/O1134호; 국제 공개 WO 90/02809호, WO 91/10737호, WO 92/01047호, WO 92/18619호, WO 93/11236호, WO 95/15982호, WO 95/20401호, 및 WO97/13844호; 및 미국 특허 5,698,426호, 5,223,409호, 5,403,484호, 5,580,717호, 5,427,908호, 5,750,753호, 5,821,047호, 5,571,698호, 5,427,908호, 5,516,637호, 5,780,225호, 5,658,727호, 5,733,743호 및 5,969,108호에 개시된 것들을 포함한다.
본 명세서에 개시된 항체는 예를 들어, 키메라 항체를 포함할 수 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분들이 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래되는 분자이다. 예를 들어, 키메라 항체는 인간 항체의 불변 영역에 융합된 마우스 또는 래트 단클론 항체의 가변 영역을 함유할 수 있다. 키메라 항체의 생산 방법은 본 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; 및 미국 특허 5,807,715호, 4,816,567호, 4,816,397호, 및 6,331,415호를 참고한다.
본 명세서에 개시된 것과 같은 기술을 이용하여 생산된 항체 또는 항원-결합 단편은 잘 알려진 표준 기술을 이용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들어, 단백질 A-세파로즈, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 종래의 면역글로불린 정제 절차에 의해 예를 들어, 배양 배지, 복수액, 혈청, 세포용해물, 합성 반응 물질 등으로부터 적절하게 분리될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "분리된" 또는 "정제된" 항체는 항체가 유래되는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 다른 단백질이 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성될 경우 화학 전구체 또는 다른 화학물질 또는 항체를 생산하기 위해 사용되는 CF 발현 시스템의 성분들이 실질적으로 없다.
본 명세서에 개시된 항체는 특정 CD47 항원을 인식하고 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 생성될 수 있는 항체 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 Fab 및 F(ab')2 단편은 (Fab 단편을 생산하기 위해)파파인 또는 (F(ab')2 단편을 생산하기 위해)펩신과 같은 효소를 이용하여, 면역글로불린 분자의 단백질분해성 절단에 의해 생산될 수 있다. Fab 단편은 항체 분자의 두 동일한 암(arm) 중 하나에 해당하며 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이룬 완전한 경쇄를 함유한다. F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 항체 분자의 두 항원-결합 암을 함유한다. 대안적으로, 본 명세서에 개시된 항체 단편은 잘 알려진 재조합 발현 기술을 통해 일상적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 92/22324호; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; 및 Better et al., 1988, Science 240:1041-1043를 참고한다.
본 명세서에 개시된 항체는 예를 들어, 인간화 항체, 예를 들어, 탈면역화 또는 복합 인간 항체를 포함할 수 있다. 인간화 항체는 인간 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 임의의 아이소타입을 비롯한 임의의 면역글로불린 클래스로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체는 카파 또는 람다 경쇄 불변 서열을 포함할 수 있다.
인간화 항체는 CDR-그래프팅(유럽 특허 EP 239,400호; 국제 공개 WO 91/09967호; 및 미국 특허 5,225,539호, 5,530,101호, 및 5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing)(유럽 특허 EP 592,106호 및 EP 519,596호; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; 및 Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973), 쇄 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 5,565,332호), 및 예를 들어, 미국 특허 6,407,213호, 미국 특허 5,766,886호, WO 9317105호, Tan et al., J. Immunol. 169:1119 25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267 79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895 904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s- 5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994), 및 Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994)에 개시된 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본 기술분야에 알려진 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 또한, 미국 특허 공개 US 2005/0042664 A1호 (2005년 2월 24일)을 참고하며, 그 각각은 그 전체가 참고로 본원에 통합된다.
본 명세서에 개시된 항체는 예를 들어, 다중특이적, 예를 들어, 이특이적, 항체일 수 있다. 다중특이적(예를 들어, 이특이적 항체)의 제조 방법은 개시되었으며 예를 들어, 미국 특허 7,951,917호, 7,183,076호, 8,227,577호, 5,837,242호, 5,989,830호, 5,869,620호, 6,132,992호, 및 8,586,713호를 참고한다.
단일 도메인 항체, 예를 들어, 경쇄가 결핍된 항체는 본 기술분야에 잘 알려진 방법에 의해 생산될 수 있다. Riechmann et al., 1999, J. Immunol. 231:25-38; Nuttall et al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3):253-263; Muylderman, 2001, J. Biotechnol. 74(4):277302; 미국 특허 6,005,079호; 및 국제 공개 WO 94/04678호, WO 94/25591호, 및 WO 01/44301호를 참고한다.
인간 항체는 본 기술분야에 알려진 임의의 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 기능적인 내인성 쥐 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 잘 알려진 트랜스제닉 마우스를 이용할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 상술한 파아지 디스플레이 기술이 이용될 수 있다. 더욱이, 일부 실시형태에서, 인간 항체는 예를 들어, 마우스-인간 하이브리도마를 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV)로 형질전환된 인간 말초 혈액 림프구는 마우스 골수종 세포와 융합되어 인간 단클론 항체를 분비하는 마우스-인간 하이브리도마를 생산할 수 있으며, 이들 마우스-인간 하이브리도마는 표적 항원(예를 들어, 인간 CD47의 ECD)에 면역특이적으로 결합하는 인간 단클론 항체를 분비하는 것들을 결정하기 위하여 스크리닝될 수 있다. 그러한 방법은 알려져 있으며 본 기술분야에서 개시되며, 예를 들어, Shinmoto et al., Cytotechnology, 2004, 46:19-23; Naganawa et al., Human Antibodies, 2005, 14:27-31을 참고한다.
원하는 결합 특이성을 가진 항체 가변 도메인(항체-항원 배합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 융합체 중 적어도 하나에서 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유한 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 원한다면, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 별도의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적절한 숙주 유기체 내로 동시-형질감염된다. 이특이적 항체 생성을 위한 추가의 상세사항은 예를 들어, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)를 참고한다.
WO 96/27011호에 개시된 다른 방법에 따라, 항체 분자 쌍 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하기 위하여 조작될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)으로 치환된다. 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보충 "캐비티(cavities)"는 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환함으로써 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이것은 동종이량체와 같은 다른 원치않는 최종산물에 비하여 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.
이특이적 항체는 전길이 항체 또는 항체 단편(예를 들어 F(ab')2 이특이적 항체)으로서 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에 개시되었다. 예를 들어, 이특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조될 수 있다. Brennan et al., Science 229:81 (1985)는 그대로의 항체가 단백질분해로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 개시한다. 이들 단편은 비시날(vicinal) 디티올을 안정화시키고 분자간 이황화물 형성을 방지하기 위하여 디티올 착화제 소듐 알세나이트의 존재하에서 환원된다. 생성된 Fab' 단편은 이어서 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 이어서 머캡토에틸아민을 이용한 환원에 의해 Fab'-티올로 다시 전환되고 동몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이특이적 항체를 형성한다. 생산된 이특이적 항체는 효소의 선택적 고정을 위한 제제로서 사용될 수 있다.
5.2.1 폴리뉴클레오티드, 세포 및 벡터
일부 양태에서, 본 발명은 CD47 항원에 면역특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항체 또는 그 단편(예를 들어, 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터, 예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, 이. 콜라이 및 포유류 세포)에서의 재조합 발현을 위해 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 세포(예를 들어, 숙주 세포)를 제공한다. 또한 본 발명은 본 명세서에 개시된 항체 및 항원-결합 단편의 제조 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 항체의 VL FR 및 CDR을 포함하는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 항체의 VH FR 및 CDR을 포함하는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 13 또는 N-말단에서 아미노산 M이 없는 서열 번호 13의 VL 쇄 영역을 코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5-11 및 20-22 중 어느 하나의 VH 쇄 영역을 코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5-11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 코딩한다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드는 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는, 표 2에 제공된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
[표 2] 항-CD47 항체 VH 및 VL 뉴클레오티드 서열
Figure 112017073071594-pct00021
Figure 112017073071594-pct00022
Figure 112017073071594-pct00023
Figure 112017073071594-pct00024
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일부 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 그러한 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 포유류 세포의 게놈으로부터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터) 유래된다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
구체적 양태에서, 본 발명은 경쇄 및 중쇄, 예를 들어, 별도의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 경쇄와 관련하여, 구체적 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 카파 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구체적 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 람다 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄를 포함하는 본 명세서에 개시된 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 인간 불변 영역 서열은 미국 특허 5,693,780호에 개시된 것들일 수 있다.
구체적 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 CD47 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는, 본 명세서에 개시된 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 항체는 중쇄를 포함하며, 중쇄의 불변 영역은 인간 감마(γ) 중쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 감마(γ) 1 중쇄 불변 영역, 인간 감마(γ) 2 중쇄 불변 영역, 인간 감마(γ) 3 중쇄 불변 영역, 또는 인간 감마(γ) 4 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다.
5.2. 2 세포 및 벡터
일부 양태에서, 본 발명은 CD47에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항체(또는 그의 항원-결합 단편)을 (예를 들어, 재조합적으로) 발현하는 세포(예를 들어, 숙주 세포) 및 관련된 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터, 예를 들어, CF 발현 시스템에 사용하기에 적합한 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 CF 발현 시스템에서의 재조합 발현을 위해 항-CD47 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)를 제공한다. 구체적 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 예를 들어, 개선된 항체 발현 역가 또는 수율을 야기하는 조건하에서, CF 발현 시스템을 이용하여 그러한 항체를 발현하는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 숙주 세포, 예를 들어, 포유류 세포에서 재조합 발현을 위해 항-CD47 항체 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)를 제공한다. 또한 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체(예를 들어, 인간 또는 인간화 항체)를 재조합적으로 발현하기 위한 그러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 구체적 양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 이용하여 항체를 발현하는 것을 포함하는, 본 명세서에 개시된 항체의 생산 방법을 제공한다.
CD47에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항체(예를 들어, 전길이 항체, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 본 명세서에 개시된 단일쇄 항체)의 재조합 발현은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유한 발현 벡터의 제작에 관련된다. 본 명세서에 개시된 항체 분자, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 그 단편(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 항체 분자의 생산을 위한 벡터는 본 기술분야에 잘 알려진 기술을 이용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄) 코딩 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄) 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 시그널을 함유한 발현 벡터를 제작할 수 있다. 이들 방법은 예를 들어, 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 또한 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 명세서에 개시된 항체 분자, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체 또는 그 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터가 제공된다. 그러한 벡터는 예를 들어, 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 국제 공개 WO 86/05807호 및 WO 89/01036호; 및 미국 특허 5,122,464호 참고)을 포함하며 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄, 전체 경쇄 또는 전체 중쇄와 경쇄 둘 모두의 발현을 위해 그러한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
발현 벡터는 종래 기술에 의해 세포(예를 들어, 숙주 세포)로 전달될 수 있으며 생성된 세포는 이어서 종래 기술에 의해 배양되어 본 명세서에 개시된 항체 또는 그 단편을 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 숙주 세포에서 그러한 서열의 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그 단편, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄 또는 그 단편, 또는 본 명세서에 개시된 단일쇄 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 이중쇄 항체의 발현을 위해, 개별적으로 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 코딩하는 벡터는 후술하는 바처럼, 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주세포에서 동시발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 본 명세서에 개시된 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 모두 또는 그 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 함유한다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포는 두 개의 상이한 벡터를 함유하며, 제1 벡터는 본 명세서에 개시된 항체의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역 또는 그 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 제2 벡터는 본 명세서에 개시된 항체의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 그 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 제1 숙주 세포는 본 명세서에 개시된 항체의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역 또는 그 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터를 포함하며, 제2 숙주 세포는 본 명세서에 개시된 항체의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 제1 세포에 의해 발현된 중쇄/중쇄 가변 영역은 제2 세포의 경쇄/경쇄 가변 영역과 연합되어 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 그 항원-결합 단편을 형성한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 그러한 제1 숙주 세포와 그러한 제2 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포 집단을 제공한다.
구체적 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 경쇄/경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 중쇄/중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 집단을 제공한다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 명세서에 개시된 항체 분자를 발현하기 위하여 이용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 5,807,715호 참고). 그러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생산되고 이어서 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염될 경우 인 시 추에서 본 명세서에 개시된 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 항체 코딩 서열을 함유한 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예를 들어, 이. 콜라이 및 비. 서브틸리스(B. subtilis))와 같은 미생물; 항체 코딩 서열을 함유한 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 피치아(Saccharomyces Pichia)); 항체 코딩 서열을 함유한 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 항체 코딩 서열을 함유한 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템(예를 들어, 클라미도 모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii)와 같은 녹조류); 또는 포유류 세포 게놈으로부터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터) 유래된 프로모터를 함유한 재조합 발현 구조체를 보유한 포유류 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa, 및 NIH 3T3 세포)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하기 위한 세포는 CHO 세포, 예를 들어 CHO GS System™(론자(Lonza))로부터의 CHO 세포이다. 구체적 실시형태에서, 포유류 발현 벡터는 pOptiVEC™ 또는 pcDNA3.3이다. 구체적 실시형태에서, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 박테리아 세포, 또는 진핵 세포(예를 들어, 포유류 세포)는 재조합 항체 분자의 발현을 위해 사용된다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유류 세포는 항체를 위한 효과적인 발현 시스템이다(Foecking et al., 1986, Gene 45:101; 및 Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 CHO 세포 또는 NS0 세포에 의해 생산된다. 구체적 실시형태에서, CD47에 면역특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
박테리아 시스템에서, 발현되는 항체 분자의 의도된 용도에 따라 많은 발현 벡터가 유익하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 대량의 그러한 항체가 생산되어야 하는 경우, 항체 분자의 약학 조성물의 생성을 위하여, 쉽게 정제되는 융합 단백질 생성물의 고 농도의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 그러한 벡터는 항체 코딩 서열이 개별적으로 lacZ 코딩 영역과 인 프레임(in frame)으로 벡터 내로 결찰되어 융합 단백질이 생성되는, 이. 콜라이 발현 벡터pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791); pIN 벡터(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, pGEX 벡터 또한 외래 폴리펩티드를 글루타치온 5-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 발현하기 위하여 이용될 수 있다. 일반적으로, 그러한 융합 단백질은 가용성이며 매트릭스 글루타치온 아가로즈 비드에의 흡착 및 결합과 이어서 유리 글루타치온 존재하에서의 용리에 의해 용해 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 캘리포니카 (Autographa californica) 핵 다면체 바이러스(nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV)는, 예를 들어, 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로 이용될수 있다. 바이러스는 스포도프테라 프루지페르 다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열은 개별적으로 바이러스의 비-필수 영역(예를 들어, 폴리헤드린(polyhedrin) 유전자) 내로 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예를 들어 폴리헤드린 프로모터)의 조절하에 위치될 수 있다.
포유류 숙주 세포에서, 많은 바이러스계 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 이용되는 경우, 관심 항체 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 삼자(tripartite) 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이 키메라 유전자는 이어서 시험관 내 또는 생체 내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈 내에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에서의 삽입은 감염된 숙주에서 생존가능하며 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 생성할 것이다(예를 들어, Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359 참고). 삽입된 항체 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특이적 개시 시그널이 또한 요구될 수 있다. 이들 시그널은 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 더욱이, 개시 코돈은 전체 삽입체의 번역을 보장하기 위하여 원하는 코딩 서열의 해독 프레임과 맞아야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시 코돈은 기원이 다양할 수 있으며, 천연 및 합성일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함시켜 향상될 수 있다(예를 들어, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544 참고).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형하고 가공하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 그러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 프로세싱(예를 들어, 절단)은 단백질의 기능을 위해 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역후 프로세싱 및 변형을 위해 특징적이고 특이적인 기전을 가진다. 발현되는 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하기 위하여 적절한 세포주 또는 숙주 세포가 선택될 수 있다. 이를 위하여, 일차 전사물의 적절한 프로세싱, 유전자 생성물의 글리코실화 및 인산화를 위한 세포 기계를 보유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 그러한 포유류 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, Hela, COS, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0(어떤 면역글로불린 쇄도 내인성으로 생산하지 않는 쥐 골수종 세포주), CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체(예를 들어, 항체 Ab235-Ab255 중 어느 하나의 CDR을 포함하는 항체)는 CHO 세포와 같은 포유류 세포에서 생산된다.
재조합 단백질의 장기적이고 고수율의 생산을 위해, 안정한 발현 세포가 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 안정하게 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 세포는 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 형성하기 위하여 연합하는 경쇄/경쇄 가변 도메인 및 중쇄/중쇄 가변 도메인을 안정하게 발현한다.
일부 양태에서, 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 이용하기 보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 조절되는 DNA 및 선택성 마커로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA/폴리뉴클레오티드의 도입 후, 조작된 세포는 농축 배지에서 1-2일 동안 성장될 수 있으며, 그 후 선택성 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드 내의 선택성 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하여 세포가 플라스미드를 그들의 염색체 내로 안정하게 통합하고 성장하여 포커스를 형성하고 이는 다시 클로닝되어 세포주로 증식될 수 있다. 이 방법은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 그 단편을 발현하는 세포주를 조작하기 위해 유익하게 사용될 수 있다. 그러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에서 특히 유용할 수 있다.
헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 티미딘 키나제(Wigler et al., 1977, Cell 11:223), 하이포잔틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17) 유전자를 비롯한 그러나 이에 제한되지 않는 많은 선택 시스템이 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 이용될 수 있다. 또한, 항대사물 저항성이 하기 유전자들을 위한 선택 기초로서 이용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); 미코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo(Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; 및 Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):l55-2 15); 및 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro(Santerre et al., 1984, Gene 30:147). 재조합 DNA 기술 분야에서 일반적으로 알려진 방법은 원하는 재조합 클론을 선택하기 위해 일상적으로 적용될 수 있으며, 그러한 방법은 예를 들어, Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1에 개시되며, 그 전체가 참고로 본원에 통합된다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(검토를 위해, Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)를 참고). 항체 발현 벡터 시스템 내의 마커가 증폭가능할 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 연합되므로, 항체의 생산 또한 증가할 것이다(Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
숙주 세포는 본 명세서에 개시된 둘 이상의 발현 벡터인, 중쇄 유래 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터로 동시-형질감염될 수 있다. 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동일한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택성 마커를 함유할 수 있다. 숙주 세포는 상이한 양의 둘 이상의 발현 벡터로 동시-형질감염될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 하기 비율 중 어느 하나의 제1 발현 벡터와 제2 발현 벡터로 형질감염될 수 있다: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 또는 1:50.
대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두를 코딩하며 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 그러한 상황에서는, 경쇄는 과량의 독성 자유 중쇄를 피하기 위하여 중쇄 앞에 위치되어야 한다(Proudfoot, 1986, Nature 322:52; 및 Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197-2199). 중쇄 및 경쇄를 위한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 단일시스트론(monocistronic) 또는 다중시스트론일 수 있다. 다중시스트론 핵산 구조체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상, 또는 2-5, 5-10 또는 10-20 유전자/뉴클레오티드 서열 범위를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 이중시스트론 핵산 구조체는 하기의 순서로 프로모터, 제1 유전자(예를 들어, 본 명세서에 개시된 항체의 중쇄), 및 제2 유전자(예를 들어, 본 명세서에 개시된 항체의 경쇄)를 포함할 수 있다. 그러한 발현 벡터에서, 두 유전자의 전사는 프로모터에 의해 구동될 수 있는 반면, 제1 유전자로부터의 mRNA의 번역은 cap-의존성 스캐닝 기전에 의할 수 있고 제2 유전자로부터의 mRNA의 번역은 cap-독립적 기전, 예를 들어, IRES에 의할 수 있다.
일단 본 명세서에 개시된 항체 분자가 재조합 발현에 의해 생산되면, 이는 면역글로불린 분자의 정제를 위해 본 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화성에 의해, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등적 용해도에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 추가로, 본 명세서에 개시된 항체는 본 명세서에 개시되거나 다르게는 본 기술분야에 알려진 이종성 폴리펩티드 서열에 융합되어 정제를 촉진할 수 있다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 분리되거나 정제된다. 일반적으로, 분리된 항체는 분리된 항체와 상이한 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 것이다. 예를 들어, 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체의 제제는 세포 물질 및/또는 화학 전구체가 실질적으로 없다. 용어 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 항체가 분리되거나 재조합적으로 생산된 세포의 세포 성분으로부터 항체가 분리된 항체 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 항체는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1%(건조 중량 기준) 미만의 이종성 단백질(본 명세서에서 "오염 단백질"로도 불림) 및/또는 항체의 변이체, 예를 들어, 항체의 상이한 번역후 변형 형태 또는 항체의 다른 상이한 버젼(예를 들어, 항체 단편)을 가진 항체의 제제를 포함한다. 항체가 재조합에 의해 생산될 경우, 항체는 또한 일반적으로 배양 배지가 실질적으로 없으며, 즉, 배양 배지는 단백질 제제의 부피의 약 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만을 나타낸다. 항체가 화학적 합성에 의해 생산되는 경우, 항체는 일반적으로 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없으며, 즉, 단백질의 합성에서 관련되는 화학 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 그러한 항체 제제는 관심 항체 외의 다른 화학 전구체 또는 화합물이 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% (건조 중량 기준) 미만이다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 분리되거나 정제된다.
5.3 약학 조성물 및 키트
본 발명은 본 명세서에 개시된 항체(예를 들어, 항-CD47 항체), 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 접합체 하나 이상을 포함하는 조성물, 약학 조성물 및 키트를 제공한다. 구체적 양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물(예를 들어, 약학 조성물)은 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외(ex vivo) 용도를 위한 것일 수 있다. 용도의 비제한적인 예는 CD47 활성 조절(예를 들어, 억제 또는 유도/향상) 용도 및 질환, 예를 들어, 암의 관리 또는 치료 용도를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항체(예를 들어, 인간화 항체) (또는 그의 항원-결합 단편) 및 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적 허용"은 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나, 또는 미국 약전, 유럽 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 동물 및 더욱 구체적으로 인간에서의 사용을 위한 약전에서 열거됨을 의미한다.
본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 하나 이상을 함유한 제형은 원하는 순도를 가진 항체를 선택적인 생리학적 허용 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장을 위해 제조될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2006) Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD). 그러한 제형은 예를 들어, 동결건조 제형 또는 수용액 형태일 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항체의 투여에 적합한 약학적 담체는 당업자에게 특정 투여 양식에 적합한 것으로 알려진 임의의 그러한 담체를 포함한다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용되는 투여량과 농도에서 수용체에게 비독성이며, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 버퍼; 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
생체 내 투여를 위해 사용될 제형은 멸균될 수 있다. 이것은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 이루어질 수 있다.
구체적 양태에서, 본 발명에서 제공되는 약학 조성물은 본 발명에서 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편 하나 이상의 치료적 유효량을 약학적 허용 담체 내에 함유한다. 그러한 약학 조성물은 본 명세서에 개시된 병태 또는 질환 또는 하나 이상의 그의 증상의 예방, 치료, 관리 또는 완화에서 유용하다.
본 발명에서 제공되는 조성물은 본 발명에서 제공되는 하나 이상의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편이 용액, 현탁액, 분말, 서방성 제형 또는 비경구 투여를 위한 멸균 용액 또는 현탁액 내의 엘릭시르 또는 경피 패치 제제 및 건조 분말 흡입제와 같은 적합한 약학 제제로 제형화된다.
일 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 조성물은 단일 투여량 투여를 위해 제형화된다. 조성물을 제형화하기 위하여, 화합물의 중량 분획을 치료되는 병태가 완화되거나, 예방되거나 또는 하나 이상의 증상이 완화되도록 하는 유효 농도로 선택된 담체에서 용해, 현탁, 분산 또는 다르게는 혼합한다.
일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항체는 치료되는 환자에게 바람직하지 못한 부작용이 없거나 최소 또는 무시할만한 부작용으로 치료적으로 유용한 효과를 나타내기에 충분한 유효량으로 약학적 허용 담체 내에 포함된다.
본 발명에서 제공되는 약학 조성물 내의 항-CD47 항체의 농도는 예를 들어, 항체의 생리화학적 특징, 투약 스케쥴, 및 투여되는 양 및 다른 인자들에 의존할 것이다.
본 명세서에 개시된 약학 조성물은 적합한 양의 화합물 또는 그의 약학적 허용 유도체를 함유한 멸균 비경구(예를 들어, 정맥내) 용액 또는 현탁액과 같은, 단위 투여 형태로 인간 또는 동물(예를 들어, 포유류)에게 투여하기 위해 제공된다. 약학 조성물은 또한 적합한 양의 항-CD47 항체 또는 그의 약학적 허용 유도체를 함유한 정제, 캡슐, 알약, 분말, 과립, 및 경구 또는 비강 용액 또는 현탁액, 및 오일-물 에멀젼과 같은 단위 투여 형태로 인간 및 동물에게 투여하기 위해 제공된다. 항체는 일 실시형태에서, 단위-투여 형태 또는 다중-투여 형태로 제형화되고 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 단위-투여 형태는 인간 또는 동물(예를 들어, 포유류) 대상체에게 적합하며 개별적으로 포장된, 물리적으로 구별되는 단위를 말한다. 각 단위-투여량은 필요한 약학적 담체, 비히클 또는 희석제와 함께, 원하는 치료 효과를 생산하기에 충분한 소정의 양의 항-CD47 항체를 함유한다. 단위-투여량 형태의 예는 앰퓰 및 시린지 및 개별 포장된 정제 또는 캡슐을 포함한다. 단위-투여량 형태는 그의 분획 또는 다수로 투여될 수 있다. 다중-투여량 형태는 분리된 단위-투여량 형태로 투여될, 단일 용기내에 포장된 동일한 단위-투여량 형태 복수개이다. 다중-투여량 형태의 예는 바이알, 정제 또는 캡슐의 병 또는 병을 포함한다. 따라서, 구체적 양태에서, 다중 투여량 형태는 포장 내에서 분리되지 않은 단위-투여량 다수이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 액체 약학 제형 내에 있다. 액체 약학적 투여 조성물은 예를 들어, 물, 염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜 등과 같은 담체에서, 항체 및 선택적 약학 아쥬반트를 용해, 분산 또는 다르게는 혼합하여 용액 또는 현탁액을 형성하여 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여될 본 발명에서 제공되는 약학 조성물은 또한 습윤제, 유화제, 가용화제 및 pH 완충제 등과 같은 비독성 보조 물질 소량을 함유할 수 있다.
그러한 투여 형태의 제조 방법은 당업자에게 알려져 있거나 명백할 것이다; 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2006) Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD를 참고한다.
일 실시형태에서, 비경구 투여는 피하 또는 근육내 주사를 특징으로 하며, 또는 정맥내 주사 또한 본 발명에서 고려된다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체 중의 용액 또는 현탁액을 위해 적합한 고형 형태로서, 또는 에멀젼으로서, 종래 형태로 제조될 수 있다. 주사제, 용액 및 에멀젼은 또한 하나 이상의 부형제를 함유한다. 적합한 부형제는 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올이다. 다른 투여 경로는 장 투여, 뇌내 투여, 비강 투여, 동맥내 투여, 심장내 투여, 골내 주입, 척추강내 투여 및 복강내 투여를 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제는 주사용으로 준비된 멸균 용액, 피하주사용 정제를 비롯하여 사용 직전에 용매와 배합될 준비가 된 멸균 건조 가용성 제품, 예를 들어, 동결건조 분말, 주사용으로 준비된 멸균 현탁액, 사용 직전에 비히클과 배합될 준비가 된 멸균 건조 불용성 제품, 및 멸균 에멀젼을 포함한다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.
정맥내로 투여되면, 적합한 담체는 생리학적 염수 또는 포스페이트 완충 염수(PBS), 및 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜 및 그 혼합물과 같은 증점제 및 가용화제를 함유한 용액을 포함한다.
비경구 제제에 사용되는 약학적 허용 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항균제, 등장제, 버퍼, 항산화제, 국소 마취제, 현탁 및 분산 제제, 유화제, 격리 또는 킬레이팅 제제 및 기타 약학적 허용 물질을 포함한다.
약학적 담체는 또한 수 혼화성 비히클을 위한 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜; 및 pH 조정을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 단편을 함유한 멸균 수용액의 정맥내 또는 동맥내 주입은 효과적인 투여 양식이다. 다른 구체예는 원하는 약리학적 효과를 생산하기 위하여 필요에 따라 주사되는 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체를 함유한 멸균 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액이다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 미세화 또는 다른 적합한 형태로 현탁될 수 있다. 생성된 혼합물의 형태는 의도하는 투여 양식 및 선택된 담체 또는 비히클에서 화합물의 용해도를 비롯한 많은 인자들에 의존한다.
다른 실시형태에서, 약학 제형은 투여를 위해 용액, 에멀젼 및 다른 혼합물로서 재구성될 수 있는, 동결건조 분말이다. 그들은 또한 고체 또는 젤로서 재구성되고 제형화될 수 있다.
동결건조 분말은 예를 들어, 적합한 용매에서 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체를 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 동결건조 분말은 멸균성이다. 적합한 용매는 분말 또는 분말로부터 제조된 재구성된 용액의 안정성 또는 다른 약리학 성분을 개선하는 부형제를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 덱스트로스, 솔비탈, 프럭토스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스 또는 다른 적합한 제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 용매는 또한 시트레이트, 소듐 또는 포타슘 포스페이트 또는 일 실시형태에서는 약 중성 pH의 당업자에게 알려진 다른 그러한 버퍼와 같은 버퍼를 함유할 수 있다. 후속하여 용액을 멸균 여과한 후 당업자에게 알려진 표준 조건하에서 동결건조하는 것이 제형화의 예를 제공한다. 일 실시형태에서, 생성된 용액은 동결건조를 위해 바이알 내로 배분될 것이다. 동결건조 분말은 약 4℃ 내지 실온과 같은, 적절한 조건하에서 저장될 수 있다.
주사용 물을 이용하여 이 동결건조된 분말을 재구성하면 비경구 투여에 사용하기 위한 제형을 제공한다. 재구성을 위하여, 동결건조 분말은 멸균수 또는 다른 적합한 담체에 추가된다.
일부 양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체는 국소 투여 또는 국소 적용, 예를 들어, 피부 및 점막, 예를 들어, 눈에 국소 적용하기 위해, 젤, 크림 및 로션의 형태로, 그리고 눈에의 적용을 위해 또는 낭내 또는 척수내 적용을 위해 제형화될 수 있다. 국소 투여는 경피 전달을 위해 고려되며 또한 눈 또는 점막에의 투여를 위해 또는 흡입 치료법을 위해 고려된다. 활성 화합물 단독 또는 다른 약학적 허용 부형제와 조합된 활성 화합물의 비강 용액이 또한 투여될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체 및 다른 조성물은 또한 치료될 대상체의 신체의 특정 조직, 기관 또는 다른 영역에 표적화되도록 제형화될 수 있다. 많은 그러한 표적화 방법이 당업자에게 잘 알려져 있다. 모든 그러한 표적화 방법은 본 조성물에서 사용하기 위해 본 명세서에서 고려된다. 표적화 방법의 비제한적인 예를 위해서는, 예를 들어, 미국 특허 6,316,652호, 6,274,552호, 6,271,359호, 6,253,872호, 6,139,865호, 6,131,570호, 6,120,751호, 6,071,495호, 6,060,082호, 6,048,736호, 6,039,975호, 6,004,534호, 5,985,307호, 5,972,366호, 5,900,252호, 5,840,674호, 5,759,542호 및 5,709,874호를 참고한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 시각 기관, 골수, 위장관, 폐, 뇌 또는 연골에 표적화(또는 다르게는 투여)된다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체는 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있다.
본 발명은 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체 하나 이상과 같은, 본 명세서에 개시된 약학 조성물의 성분 중 하나 이상으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로, 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인을 반영하는, 의약 또는 생물 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 공고문이 그러한 용기(들)와 연합될 수 있다.
또한 본 발명은 본 명세서에 개시된 항체 또는 항체 단편 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 일 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 용기에 본 명세서에 개시된 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키트는 대조군으로서 실질적으로 정제된 CD47 항원을 함유한다. 다른 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키트는 추가로 CD47 항원과 반응하지 않는 대조군 항체를 포함한다. 다른 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키트는 CD47 항원에의 변형된 항체의 결합을 검출하기 위한 하나 이상의 요소를 함유한다(예를 들어, 항체는 형광 화합물, 효소 기질, 방사성 화합물 또는 발광 화합물과 같은 검출가능한 기질에 접합될 수 있거나, 제1 항체를 인식하는 제2 항체가 검출가능한 기질에 접합될 수 있다). 구체적 실시형태에서, 본 발명에서 제공되는 키트는 재조합적으로 생산되거나 화학적으로 합성된 CD47 항원을 포함할 수 있다. 키트에 제공되는 CD47 항원은 또한 고형 지지체에 부착될 수 있다. 보다 구체적 실시형태에서, 상술한 키트의 검출 수단은 CD47 항원이 부착되는 고형 지지체를 포함한다. 그러한 키트는 또한 비부착 리포터-라벨링 항-인간 항체 또는 항-마우스/래트 항체를 포함할 수 있다. 이 실시형태에서, CD47 항원에의 항체의 결합은 상기 리포터-라벨링된 항체의 결합에 의해 검출될 수 있다.
5.4 용도 및 방법
구체적 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 CD47 활성을 조절하는 방법을 제공한다.
구체적 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체로 CD47 활성을 억제하는(예를 들어, 부분적으로 억제하는) 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체를 이용하여, 암과 같은 병태 또는 질환을 관리 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체를 이용하여, 암과 같은 병태 또는 질환으로부터 보호하는 방법을 제공한다.
구체적 실시형태에서, 본 발명은 CD47 (예를 들어, 인간 CD47)에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 관리, 치료, 예방 또는 암으로부터 보호하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 암과 연합된 하나 이상의 증상의 진행 또는 심각성을 완화, 억제 또는 감소시키는 방법을 제제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "투여하다" 또는 "투여"는 점막, 국소, 피내, 비경구, 정맥내, 피하, 근육내 전달 및/또는 본 명세서에 개시되거나 본 기술분야에 알려진 임의의 다른 물리적 전달 방법에 의해서와 같이, 대상체 또는 환자(예를 들어, 인간)에게 물질(예를 들어, 본 발명에서 제공되는 인간화된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편)을 주사하거나 다르게는 물리적으로 전달하는 행위를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 주어진 병태, 질환 또는 질병(예를 들어, 암, 전이, 또는 혈관신생) 및/또는 거기에 관련된 증상의 심각성 및/또는 지속성을 감소 및/또는 완화시키기에 충분한 치료제(예를 들어, 본 발명에서 제공되는 항체 또는 약학 조성물)의 양을 말한다. 이들 용어는 또한 주어진 질병의 악화 또는 진행의 감소, 지연 또는 완화, 주어진 질병의 재발, 발생 또는 개시의 감소, 지연 또는 완화를 위해, 및/또는 다른 치료법(예를 들어, 본 발명에서 제공되는 항-CD47 항체 외의 다른 치료법)의 예방 또는 치료 효과(들)를 개선하거나 향상시키기 위하여 필요한 양을 포괄한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "유효량"은 또한 특정 결과를 이루기 위하여 본 명세서에 개시된 항체의 양을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 다른 치료법의 투여 맥락에서 용어 "조합된"은 하나보다 많은 치료법의 사용을 말한다. 용어 "조합된"의 사용은 치료법이 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 치료법은 예를 들어, 연속적으로, 순차적으로, 동시에, 또는 부수적으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "관리하다", "관리하는" 및 "관리"는 대상체가 치료법(예를 들어, 예방 또는 치료 제제)으로부터 얻는 유익한 효과를 말하며, 이 효과는 CD47과 연합된 병태의 치료를 야기하지는 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 병태 또는 질환의 진행 또는 악화를 방지하기 위하여, 본 명세서에 개시된 병태 또는 질환 또는 그의 하나 이상의 증상을 "관리"하기 위하여 하나 이상의 치료법(예를 들어, 본 명세서에 개시된 항체와 같은 예방 또는 치료 제제)가 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 발명에서 제공되는 병태 또는 질환(예를 들어, 자가면역 질환, 면역 질환, 암 또는 염증)의 맥락에서 용어 "방해하다" 또는 "방해하는"은 본 발명에서 제공되는 치료법 또는 치료법의 조합(예를 들어, 본 명세서에 개시된 항체와 같은, 예방 또는 치료 제제의 조합)의 투여로부터 야기되는, 본 발명에서 제공되는 병태 또는 질환(예를 들어, 암, 전이 또는 혈관신생) 및/또는 그에 관련된 증상의 발생, 재발, 개시 또는 확산의 전체적 또는 부분적 억제(예를 들어, 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만) 또는 차단을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 대상체는 비-영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 염소, 토끼, 래트, 마우스 등), 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간), 예를 들어 인간과 같은 포유류이다. 일 실시형태에서, 대상체는 본 발명에서 제공되는 병태 또는 질환(예를 들어, 암, 전이 또는 혈관신생)을 가진 것으로 진단된 포유류, 예를 들어, 인간이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 본 발명에서 제공되는 병태 또는 질환(예를 들어, 암, 전이 또는 혈관신생)을 일으킬 위험이 있는 포유류, 예를 들어, 인간이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시형태에서, CD47은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체의 세포에서 증폭된다. 대상체로부터의 시료에서 cd47 증폭의 확인은 예를 들어, 정량적 역전사 PCR, 면역블롯 분석, DNA 핑거프린팅, (예를 들어, 다색 형광 인시추 하이브리드화(multicolor fluorescence in situ hybridization)(mFISH)에 의한)염색체 분석, 비교 게놈 하이브리드화 및 유전자 발현 프로파일링과 같은 당업자에게 알려진 분석에 의해 수행될 수 있다. 비제한적인 예로서, 종양 시료의 단백질 발현은 시료에 존재하는 CD47 단백질의 양을 측정하기 위하여 면역조직화학적 분석을 이용하여 규명할 수 있다.
대상체로부터의 시료에서 돌연변이 또는 결실의 확인은 예를 들어, DNA 추출, 상보성 DNA의 생성, 및 cDNA 시퀀싱과 같은 당업자에게 알려진 분석에 의해 수행될 수 있다. cDNA 서열은, 예를 들어, 당업자에게 알려진 방법에 의해 번역 생성물을 수득하기 위해 이용될 수 있다. 유전자 결실 및 아미노산 치환은 예를 들어, 대상체로부터의 시료로부터의 서열을 야생형 및/또는 컨센서스 서열에 비교함으로써 확인될 수 있다.
일부 실시형태에서, CD47은 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에서 증폭된다. 대상체로부터의 시료에서 CD47 증폭의 확인은 정량적 역전사 PCR 또는 면역블롯 분석과 같은 당업자에게 알려진 분석에 의해 수행된다. 대상체로부터의 시료에서 돌연변이 또는 결실의 확인은 예를 들어, DNA 추출, 상보성 DNA의 생성, 및 cDNA 시퀀싱과 같은 당업자에게 알려진 분석에 의해 수행될 수 있다. cDNA 서열은, 예를 들어, 당업자에게 알려진 방법에 의해 번역 생성물을 수득하기 위해 이용된다. 유전자 결실 및 아미노산 치환은 예를 들어, 대상체로부터의 시료로부터의 서열을 야생형 및/또는 컨센서스 서열에 비교함으로써 확인된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료법들" 및 "치료법"은 병태 또는 질환 또는 그 증상(예를 들어, 본 발명에서 제공되는 병태 또는 질환(예를 들어, 암) 또는 그와 관련된 하나 이상의 증상 또는 병태)의 예방, 치료, 관리 또는 완화에 사용될 수 있는 임의의 프로토콜(들), 방법(들), 조성물, 제형, 및/또는 제제(들)를 말할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용어 "치료법들" 및 "치료법"은 병태 또는 질환 또는 하나 이상의 그 증상 (예를 들어, 암 또는 그와 관련된 하나 이상의 증상 또는 병태)의 치료, 관리, 예방 또는 완화에 유용한 약물 치료법, 아쥬반트 치료법, 방사선, 수술, 생물학적 치료법, 지지 치료법, 및/또는 다른 치료법을 말한다. 일부 실시형태에서, 용어 "치료법"은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 그의 약학 조성물 외의 다른 치료법을 말한다. 구체적 실시형태에서, "추가 치료법" 및 "추가 치료법들"은 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 그의 약학 조성물을 이용하는 치료 외의 다른 치료법을 말한다. 구체적 실시형태에서, 치료법은 아쥬반트 치료법으로서 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 사용을 포함한다. 예를 들어, 약물 치료법, 생물 치료법, 수술 및/또는 지지 치료법과 함께 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체를 이용하는 것이 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "혈액암"은 혈액의 암을 말하며, 다른 것 중에서도 백혈병, 림프종 및 골수종을 포함한다. "백혈병"은 감염과 싸우는데 있어서 비효과적인 너무 많은 백혈구가 만들어져서 혈소판 및 적혈구와 같은 혈액을 구성하는 다른 부분들이 배제되는 혈액의 암을 말한다. 백혈병의 케이스는 급성 또는 만성으로 분류된다. 소정의 백혈병 형태는 비제한적인 예로서, 다른 것들 중에서도 급성 림프구성 백혈병(ALL); 급성 골수성 백혈병(AML); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 만성 골수성 백혈병(CML); 골수증식성 질환/종양(MPDS); 및 골수형성이상 증후군을 포함한다. "림프종"은 다른 것들중에서도 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 저급 및 공격적 비호지킨 림프종(indolent and aggressive non-Hodgkin's lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 및 소포성 림프종(소세포 및 대세포)를 포함한다. 골수종은 다발성 골수종(MM), 거대 세포 골수종, 중쇄 골수종 및 경쇄 또는 벤스-존스( Bence-Jones) 골수종을 말할 수 있다.
본 명세서에 개시된 항-CD47 항체로 치료되거나 관리될 수 있는 병태의 비제한적인 예는 혈액암 및/또는 고형 종양을 포함한다.
비정상적인 CD47 발현, 활성 및/또는 시그널링에 관련된 질병 또는 질환은 비제한적인 예로서, 혈액암 및/또는 고형 종양을 포함한다. 혈액암은 예를 들어, 백혈병, 림프종 및 골수종을 포함한다. 소정의 형태의 백혈병은 비제한적인 예로서, 급성 림프구성 백혈병(ALL); 급성 골수성 백혈병(AML); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 만성 골수성 백혈병(CML); 골수증식성 질환/종양(MPDS); 및 골수형성이상 증후군을 포함한다. 소정의 형태의 림프종은 비제한적인 예로서 호지킨 림프종, 저급 및 공격적 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, 및 소포성 림프종(소세포 및 대세포)를 포함한다. 소정의 형태의 골수종은 비제한적인 예로서, 다발성 골수종(MM), 거대 세포 골수종, 중쇄 골수종 및 경쇄 또는 벤스-존스 골수종을 포함한다. 고형 종양은 예를 들어, 유방 종양, 난소 종양, 폐 종양, 췌장 종양, 전립선 종양, 흑색종 종양, 대장 종양, 폐 종양, 두경부 종양, 방광 종양, 식도 종양, 간 종양 및 신장 종양을 포함한다.
암 및 다른 종양 질환과 연합된 증상은 예를 들어, 염증, 열, 전신권태, 열, 종종 염증 부위에 국한된 통증, 식욕부진, 체중 감소, 부종, 두통, 피로, 발진, 빈혈, 근육 약화, 근육 피로 및 복부 증상, 예를 들어, 복부 통증, 설사 또는 변비를 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 암(예를 들어, MM, NHL, AML, 유방암, 방광암, 비소세포 폐암/암종, 간세포 암종(HCC), 육종 및 두경부 암)의 증상의 진행을 치료, 지연하거나 재발을 방해, 방지하거나 증상을 완화하는 데 유용한 항-CD47 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 CD47 항체는 혈액 악성종양 및/또는 종양, 예를 들어, 혈액 악성 종양 및/또는 종양 치료에서 유용하다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 CD47 항체는 CD47+ 종양의 치료에 유용하다. 비제한적인 예로서, 본 명세서에 개시된 CD47 항체는 비호지킨 림프종(NHL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 다발성 골수종(MM), 유방암, 난소암, 두경부암, 방광암, 흑색종, 대장암, 췌장암, 폐암, 평활근종, 평활근육종, 신경교종, 교모세포종 등의 치료에 유용하다. 고형 종양은 예를 들어, 유방 종양, 난소 종양, 폐 종양(예를 들어, NSCLC), 췌장 종양, 전립선 종양, 흑색종 종양, 대장 종양, 폐 종양, 두경부 종양, 방광 종양, 식도 종양, 간 종양(예를 들어, 간세포 암종), 육종 및 신장 종양을 포함한다.
구체적 실시형태에서, 본 발명은 (i) 인간 CD47과 같은 CD47에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 그 항원-결합 단편, 및 (ii) 다른 항암제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여(예를 들어, 동시에 또는 순차적으로 투여)하는 것을 포함하는, 대상체에서 암(예를 들어, 혈액 질환/암 또는 고형 암)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 항암제는 화학치료제(예를 들어, 미세소관 분해 차단제, 항대사물, 토포아이소머라제 억제제 및 DNA 가교제 또는 손상제)이다. 일부 실시형태에서, 항암제는 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 글리벡(GLEEVEC)®(이마티닙 메실레이트) 또는 수텐트(SUTENT)®(SU11248 또는 수니티닙)이다. 티로신 키나제 억제제의 다른 비제한적인 예는 706 및 AMNI07 (니로티닙).RAD00I, PKC412, 제피티닙(이레사(IRESSA)™), 엘로티닙(타르세바(TARCEVA)®), 소라페닙(넥사바르(NEXAVAR)®), 파조파닙(보트리엔트(VOTRIENT)™), 악시티닙, 보수티닙, 세디라닙(레센틴(RECENTIN)®), 스프리셀(SPRYCEL)®(다사티닙), 라파티닙(티케르브(TYKERB)®), 레스타우르티닙, 네라티닙, 니로티닙(타시그나(TASIGNA)®), 세막사닙, 토세라닙(팔라디아(PALLADIA)™), 반데타닙(작티마(ZACTIMA)™), 및 바타라닙을 포함한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47과 같은 CD47에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 그 항원-결합 단편, 및 (ii) 방사선 치료법을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여(예를 들어, 동시에 또는 순차적으로 투여)하는 것을 포함하는, 대상체에서 암(예를 들어, 혈액 질환/암 또는 고형 암)을 치료하는 방법을 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 유효량을 종양 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 식세포작용, 예를 들어, 종양 세포의 대식세포 매개 식세포 사멸을 촉진(예를 들어, 유도 또는 증가)하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, CD47을 발현하는 종양 세포와 같은 종양 세포를 가진 대상체)에서 식세포작용, 예를 들어, 종양 세포의 대식세포 매개 식세포 사멸을 촉진(예를 들어, 유도 또는 증가)하는 방법을 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 유효량을 종양과 접촉시키는 것을 포함하는, 종양 부피를 감소시키는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, CD47을 발현하는 종양 세포와 같은 종양 세포를 가진 대상체)에서 종양 부피를 감소시키는 방법을 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 유효량을 암세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 암세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, CD47을 발현하는 암 세포와 같은 암 세포를 가진 대상체)에서 암세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
5.4.1 진단 용도
일 양태에서, 인간 CD47의 ECD에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 및 그의 항원-결합 단편은 암(예를 들어, 대장암, 위암, 폐암, 또는 흑색종)과 같은 본 명세서에 개시된 병태(예를 들어, CD47 및/또는 비정상 CD47 시그널링 및/또는 비정상 CD47 발현에 관련된 병태)를 검출, 진단 또는 모니터하기 위해 진단 목적으로 사용될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 진단 목적에서 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 라벨링된다. 본 명세서에 개시된 병태를 검출, 진단 또는 모니터하기 위한 진단 목적을 위한 본 발명에서 제공되는 방법은 시험관 내 방법, 인 시추(in situ) 방법 또는 생체 외 방법일 수 있다. 본 명세서에 개시된 병태를 검출, 진단 또는 모니터하기 위한 진단 목적을 위한 본 발명에서 제공되는 방법은 생체 내 방법일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 이용하여 대상체의 시료에서 CD47의 발현을 분석하고; (b) CD47 발현 수준을 대조군 수준, 예를 들어, 정상 조직 시료(예를 들어, 본 명세서에 개시된 병태를 갖지 않은 환자로부터 또는 병태의 개시 전 동일 환자로부터의)에서의 수준과 비교하여, CD47 발현의 대조군 수준에 비하여 CD47 발현의 분석된 수준에서의 증가 또는 감소가 본 명세서에서 개시된 병태를 나타내는 것을 포함하는, 암과 같은 본 명세서에 개시된 병태의 검출 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 본 명세서에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 이용하여 대상체의 시료에서 CD47의 발현을 분석하고; (b) CD47 발현 수준을 대조군 수준, 예를 들어, 정상 시료(예를 들어, 암에 걸리지 않은 환자, CD47을 과발현하지 않는 암에 걸린 환자, 또는 병태의 개시 전 동일 환자로부터의)에서의 수준과 비교하는 것을 포함하는, CD47을 발현하는(예를 들어, CD47을 과발현하는) 암의 검출 방법을 제공한다. 구체적 양태에서, 대조군 CD47 발현수준에 비교하여 분석된 CD47 발현 수준에서의 증가 또는 감소는 CD47을 발현하는 암을 나타낸다.
구체적 실시형태에서, 본 발명은 환자에서 CD47-발현 암의 진단 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 환자로부터의 생물학적 시료를 본 명세서에 개시된 하나 이상의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계;
(b) 환자로부터의 생물학적 시료 내의 CD47 단백질 수준을 결정하기 위하여 항체 또는 항원-결합 단편의 CD47에의 결합을 검출하는 단계; 및
(c) CD47 단백질 수준을 표준 CD47 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함한다.
구체적 실시형태에서, 본 발명은 환자에서 CD47-발현 암을 치료하는 동안 CD47 단백질 수준을 모니터하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 환자로부터의 생물학적 시료를 본 명세서에 개시된 하나 이상의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계;
(b) 환자로부터의 생물학적 시료 내의 CD47 단백질 수준을 결정하기 위하여 항체 또는 항원-결합 단편의 CD47에의 결합을 검출하는 단계; 및
(c) CD47 단백질 수준을 표준 CD47 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함한다.
대상체로부터의 임의의 시료(예를 들어, 체액 또는 조직 시료)가 본 발명에서 제공되는 진단 방법에서 이용될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 진단 방법에서 이용될 수 있는 시료의 비제한적인 예는 혈청 시료, 혈장 시료, 조직 시료, 소변 시료, 종양 시료 및 대변 시료를 포함한다.
본 명세서에 개시된 항체는 본 명세서에 개시되거나 당업자에게 알려진 전통적인 면역조직학적 방법을 이용하여 생물 시료에서 CD47 수준을 분석하기 위하여 사용될 수 있다(예를 들어, Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; 및 Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096 참고). 단백질 유전자 발현을 검출하기 위해 유용한 다른 항체-기반 방법은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 및 방사성면역분석(RIA)와 같은 면역분석을 포함한다. 적합한 항체 분석 라벨은 본 기술분야에 알려져 있으며 글루코스 옥시다제와 같은 효소 라벨; 요오드(125I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(121In), 및 테크네튬(99Tc)과 같은 방사성동위원소; 루미놀과 같은 발광 라벨; 및 플루오르세인 및 로다민, 및 비오틴과 같은 형광 라벨을 포함한다.
일 실시형태에서, 암과 같은, 본 명세서에 개시된 병태(예를 들어, CD47 및/또는 비정상적 CD47 시그널링 및/또는 비정상적 CD47 발현에 관련된 병태)의 모니터링은 초기 진단 후 일정 기간 동안 진단 방법을 반복함으로써 수행된다.
라벨링된 분자의 존재는 생체 내 스캐닝을 위해 본 기술분야에 알려진 방법을 이용하여 대상체에서 검출될 수 있다. 당업자는 특정 라벨을 검출하기 위한 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 진단 방법에서 사용될 수 있는 방법과 장치는 컴퓨터 단층촬영(CT), 양전자방출 단층촬영(PET)와 같은 전신 스캔, 자기 공명 영상화(MRI), 및 초음파검사을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
6. 실시예
이 섹션의 실시예는 예시로서 제공되며 제한하는 것이 아니다.
6.1 실시예 1: 무세포 (CF) 항체 생산
무세포(CF) 시스템에서 동시-발현될 경우 항-CD47 항체 AB6.12의 중쇄 및 경쇄의 비효율적인 조립이 관찰되었다. 이 과정을 개선하기 위한 한 가지 방법은 중쇄 반응내에 접힌 경쇄를 사전-첨가하는 것을 포함한다. 다른 방법에서는, 중쇄 골격 서열 변형이 놀랍게도 CF 시스템에서 항-CD47 항체의 중쇄 및 경쇄의 보다 효율적인 조립 및 동시발현을 야기하였다. 중쇄 골격 서열 변형을 가진 이들 항-CD47 항체의 특성규명이 하기에서 보다 상세히 개시된다.
소규모 생산
DsbC 과발현(2X DsbC)을 가진 무세포 추출물을 실온으로 해동시키고 30분 동안 50 uM 이오도아세트아미드와 항온처리하였다. 8 mM 마그네슘 글루타메이트, 10 mM 암모늄 글루타메이트, 130 mM 포타슘 글루타메이트, 35 mM 소듐 피루베이트, 1.2 mM AMP, 각각 0.86 mM의 GMP, UMP, 및 CMP, 0.5 mM로 첨가된 티로신을 제외하고 모든 19 아미노산을 위해 2 mM 아미노산, 4 mM 소듐 옥살레이트, 1 mM 푸트레신, 1.5 mM 스퍼미딘, 15 mM 포타슘 포스페이트, 100 nM T7 RNAP, 및 2 mM 산화된 (GSSG) 글루타치온을 가진 30%(v/v) 이오도아세트아미드-처리된 추출물을 함유한 무세포 반응물을 최대 10시간 동안 30 ℃에서 러닝하였다. 반응물 내에서 중쇄 플라스미드와 경쇄 플라스미드의 농도는 각각 7.5 ug/mL 및 2.5 ug/mL이었다. 합성된 단백질을 14C로 라벨링하기 위하여, 3.33%(v/v) l-[U-14C]-루이신(300 mCi/mmole; 지이 라이프 사이언시즈(GE Life Sciences), 뉴저지주 피스카타웨이)를 또한 반응물에 첨가하였다. 이 실험에서는, 동일한 경쇄 (LC), 서열 번호 13과 쌍을 이룬 하기의 중쇄(HC)가 발현되었다.
Figure 112017073071594-pct00026
상기 중쇄 서열을 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 23, 26, 27, 24, 28, 29, 25, 32 및 31에서 제공된다.
비-환원성 SDS-PAGE를 위해, 젤에 로딩하기 전에 4 uL의 시료, 8 uL의 탈이온수(DI H2O) 및 4 uL의 4X LDS 버퍼(인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스바드)를 혼합하였다. 환원성 젤을 위해, 4 uL의 시료, 1 uL의 1 M DTT, 7 uL 의 DI H2O 및 4 uL의 4X LDS 버퍼(인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드)를 혼합하고 5분 동안 70℃에서 고온 블롯(blot)에서 가열하였다. 시료를 제조사의 권장사항에 따라 4~12% Bis-Tris SDS-PAGE 젤(인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드)에 의해 분석하였다. 젤을 건조시키고 약 16시간 노출 후 스톰(Storm) 840 포스포이미저(PhosphoImager)를 이용하여 방사능사진촬영에 의해 분석하였다. 방사능사진은 도 1a에 나타난다.
데이터는 IgG1, IgG4P 및 IgG4PE의 CF 발현 역가가 각각 그들의 HC 서열에서의 5 돌연변이 및 13 돌연변이 조작에 의해 극적으로 개선되었음을 나타낸다. 역가는 도 1b에 보고된다.
규모 확대 생산 - IgG1 변이체
IgG1-5m 및 IgG1-13mZ와 같은 IgG1 변이체 항체의 규모 확대 CF 생산 및 정제를 수행하였다. 규모 확대 조건은 하기 표(예를 들어, 표 3-6)에서 보다 상세히 개시된다. 두 변이체를 본질적으로 동일한 방법으로 제조하였다: 가장 큰 차이는 반응 온도였다. IgG1-5m은 25℃에서 발현시키고 IgG1-13mZ는 30℃에서 수행하였다. IgG1-13mZ는 25℃와 30℃에서 유사한 결과를 나타냈으나, IgG1-5m은 30℃에 비하여 25℃에서 더 높은 역가를 나타냈다. 두 변이체 간의 반응 시간에서의 약간의 차이는 단지 일정의 편의성의 결과이며 과정에 어떤 유의한 영향도 미치지 않는다. 구체적인 추출물 요건이 아니라 추출물 이용가능성에 기초하여 변이체들을 위해 상이한 추출물을 이용하였다. DsbC의 과발현을 가진 임의의 추출물은 이들 생성물을 위해 유사하게 작용할 것으로 예상되었다.
IgG1-13mZ(IgG1, VH1-18 골격, 13+2 돌연변이) 규모 확대 발현:
S30 무세포 추출물을 실온에서 30분 동안 50 uM 이오도아세트아미드(IAM)로 처리하였다. 이 처리 후, 추출물을 표 3의 시약과 배합하고 생물반응기(디시-바이오라피테 에보 바이오리액터(Dci-BioLafitte Evo Bioreactor), 10L 최대 작업 부피)로 옮겼다. 생물반응기 대조군은 표 4에 열거된 대로 구성하였다. 6시간의 반응 후, 추가의 5 mM(최종 농도) 산화 글루타치온을 반응에 첨가하였다. 산화 글루타치온은 반응기에 첨가하기 전에 7 내지 8로 조정된 pH를 가진 250 mM 스톡 용액으로서 제조되었다. 반응은 다운스트림 프로세싱으로 옮기기 전에 총 15 시간동안 수행하였다.
무세포 반응 성분
시약 CF 반응에서 최종 농도
AMP 1.2 mM
GMP 0.86 mM
UMP 0.86 mM
CMP 0.86 mM
소듐 포스페이트 15 mM
19 아미노산(티로신 제외) 각각 2 mM
옥살산 4 mM
퓨트레신 1 mM
스퍼미딘 1.5 mM
암모늄 글루타메이트 10 mM
포타슘 글루타메이트 130 mM
마그네슘 글루타메이트 8 mM
티로신 1 mM
피루베이트 35 mM
산화 글루타치온 2 mM
박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 0.02 g/L
경쇄 단백질을 코딩하는 플라스미드 2.5 mg/L
중쇄 단백질을 코딩하는 플라스미드 7.5 mg/L
시프로(Cipro) 1 mg/L
플루로닉(Pluronic)-R 31R1 0.005% (v/v)
이. 콜라이 균주SBDG028로부터의 IAM 처리된 추출물 30% (v/v)
생물반응기 대조군 세팅(5L 반응 부피)
파라미터 설정값
온도 30°C
pH 대조군 없음
기류 (스파저) 1.5 SLPM
DO 100% 공기 포화
교반 DO 대조군을 위해 필요한 대로 200-400 RPM (일차 DO 캐스캐이드)
산소 유동(스파저) DO 대조군을 위해 필요한 대로 0-2 SLPM(이차 DO 캐스캐이드)
항-CD47 항체 IgG1-5m(IgG1, VH1-18 골격, 5 돌연변이) 규모 확대 발현:
S30 무세포 추출물을 실온에서 30분 동안 50 uM 이오도아세트아미드(IAM)로 처리하였다. 이 처리 후, 추출물을 표 5의 시약과 배합하고 생물반응기(사르토리우스 바이오스타트 큐 바이오리액터(Sartorius Biostat Q Bioreactor), 500 mL 최대 작업 부피)로 옮겼다. 생물반응기 대조군은 표 6에 열거된 대로 구성하였다. 5.5시간의 반응 후, 추가의 5 mM(최종 농도) 산화 글루타치온을 반응에 첨가하였다. 산화 글루타치온은 반응기에 첨가하기 전에 7 내지 8로 조정된 pH를 가진 250 mM 스톡 용액으로서 제조되었다. 반응은 다운스트림 프로세싱으로 옮기기 전에 총 15.7 시간동안 수행하였다.
무세포 반응 성분
시약 CF 반응에서 최종 농도
AMP 1.2 mM
GMP 0.86 mM
UMP 0.86 mM
CMP 0.86 mM
소듐 포스페이트 15 mM
19 아미노산(티로신 제외) 각각 2 mM
옥살산 4 mM
퓨트레신 1 mM
스퍼미딘 1.5 mM
암모늄 글루타메이트 10 mM
포타슘 글루타메이트 130 mM
마그네슘 글루타메이트 8 mM
티로신 1 mM
피루베이트 35 mM
산화 글루타치온 2 mM
박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 0.02 g/L
경쇄 단백질을 코딩하는 플라스미드 2.5 mg/L
중쇄 단백질을 코딩하는 플라스미드 7.5 mg/L
시프로 1 mg/L
플루로닉-R 31R1 0.005% (v/v)
이. 콜라이 균주SBDG031로부터의 IAM 처리된 추출물 30% (v/v)
생물반응기 대조군 세팅(0.5L 반응 부피)
파라미터 설정값
온도 25°C
pH 대조군 없음
기류(스파저) 0.25 SLPM
DO 80% 공기 포화
교반 DO 대조군을 위해 필요한 대로 200-400 RPM (일차 DO 캐스캐이드)
산소 유동(스파저) DO 대조군을 위해 필요한 대로 0-1 SLPM(이차 DO 캐스캐이드)
6.2 실시예 2: CD47 결합의 비아코어 분석
재료 및 방법:
고정: 단클론 마우스 항-인간 Fc IgG (비아코어 인간 항체 포획 키트내에 포함됨, 지이 라이프 사이언시즈 Cat # BR-1008-39)를 비아코어 CM5 센서 칩 표면에 아민-커플링시켜 항-인간 Fc(AHC) 표면을 제조하였다. 고정 절차를 위한 러닝 버퍼는 HBS-EP+(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 계면활성제로서 0.05% v/v P-20)이었다. 표면 아민-커플링된 항-인간 Fc IgG를 제조하기 위하여 모두 4개의 유동 세포에서 하기를 수행하였다. 400 mM EDC와 100 mM NHS의 1:1 (v/v) 혼합물을 7분 동안 10 μL/min으로 주입하여 CM5 칩 표면을 활성화하였다. 이 처리 후, 항-인간 IgG를 10 mM 소듐 아세테이트 버퍼 pH 5.0에서 25 ㎍/mL로 희석시키고, 7분 동안 10 μL/min으로 모든 유동 세포에 주입하였다. 그 후, 에탄올아민을 7분 동안 10 μL/min으로 주입하여 모든 표면을 차단하였다. 이 절차는 센서 칩상에서 ~10,000 - 11,000 RU의 고정화 수준을 야기하였다.
운동역학 분석: 운동역학 분석을 위하여, 항-CD47 항체를 항-인간 Fc 표면(상기에 개시된 표면 제조) 상에 포획시켰다. 인간 Fc를 이용하여 항체를 포획하기 위하여, 항체를 HBS-EP+ 러닝 버퍼에서 10 ㎍/mL로 희석시켰다. 항체 변이체는 12초 동안 10 uL/min의 유속으로 유동 세포 2, 3 또는 4에 유동시킴으로써 고정시켰다. 분석물(인간 CD47 항원)을 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50 nM 농도를 제공하기 위하여 러닝 버퍼내에서 희석하여 2배 희석배수로 생성된 연속 희석 시리즈를 제조하였다. 항-CD47 항체 포획 후, CD47 분석물을 180초(3분) 동안 50 μL/min으로 유동 세포에 주입하고, 복합체 해리를 900초(15분) 동안 모니터하였다. 버퍼 블랭크(blank) 또한 러닝하였으며, 피팅(fitting) 전에 분석물 결합 데이터의 기준으로 이용하였다. 항-인간 Fc 표면은 각 분석물 결합 주기 사이에 30 uL/min으로 3M MgCl2를 두번 30-초 주입하여 재생시켰다.
운동학적 데이터 분석: 주어진 항체-항원 상호작용을 위한 실험 데이터를 글로벌(global) Rmax, 글로벌 ka(결합), 글로벌 kd(해리) 파라미터 및 상수 RI(벌크 굴절률) 파라미터를 이용하여, 1:1 결합 모델을 이용하여 피팅시켰다. 분획 활성(% 리간드 활성)은 이론 Rmax(Rmax Theo) 및 실험 Rmax (Rmax exp) 사이의 관계를 계산하기 위하여 하기 식을 이용하여 결정하였다. 식에서, 화학양론은 항체와 항원 사이의 상호작용의 경우, 예를 들어, 항체가 리간드인 경우를 나타내며, 각 항체 암은 항원과 상호작용할 수 있어서 화학양론은 2이다.
Figure 112017073071594-pct00027
Figure 112017073071594-pct00028
결과: 비아코어 분석은 5 돌연변이를 가진 모든 세 개의 항-CD47 항체 변이체(아이소타입에 무관)가 유사한 오프-레잇(off-rate) 및 친화성을 나타냄을 보여주며, 분획 활성(% 리간드 활성)은 약 38%이다. 또한, 5 돌연변이를 가진 항체 변이체의 친화성은 모 항체와 잘 일치한다. 데이터는 하기 표(표 7)에 요약된다.
비아코어 결과 요약
　# 돌연변이 항원 리간드 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU) Chi2 (RU2) % 리간드 활성
PGRTV
5 돌연변이		 CD47 IgG1 - 5m 6.36E+05 2.60E-03 4.09E-09 123.4 1.83 37.4
CD47 IgG4P - 5m 7.04E+05 2.54E-03 3.60E-09 106.5 1.86 38.2
CD47 IgG4PE - 5m 5.94E+05 2.54E-03 4.27E-09 115.4 2.5 39.2
대조군 항체 CD47 항-CD47 CF 대조군 7.32E+05 2.31E-03 3.16E-09 99.68 1.36 39.4
항-CD47 항체 변이체 13m(13 돌연변이를 가짐) 및 13mZ(13 돌연변이를 가지며 IgG1 Z 알로타입임)를 위한 데이터는 매우 빠른 오프-레잇을 나타냈으며, 운동학적 파라미터의 분석은 1:1 결합 모델에 기반하여 신뢰할만한 피트(fit)를 생성하지 않았다.
도 2a-2e는 항체 변이체 IgG1-5m(도 2a), IgG1-13m(도 2b), IgG1-13mZ(도 2c), IgG4P-5m(도 2d), 및 IgG4PE-5m(도 2e)를 위한 개별 센서그램(sensorgram)을 도시하며; 도 2f는 항-CD47 대조군 항체를 위한 센서그램을 도시한다.
6.3 실시예 3: 직접 CD47 세포 결합 분석
결합 곡선을 얻기 위하여, 시료 변이체를 각 시료를 위해 ~66 nM의 고농도로부터 시작하여 FACS 버퍼(PBS 2% FCS)에서 1:2로 적정하였다. 0.1 x 106 CCRF-EM 세포를 96웰 플레이트에 도말하고 얼음에서 1시간 동안 표시된 농도의 시료 변이체를 함유한 50 ㎕ FACS 버퍼에서 항온처리하였다. 그 후 세포를 150 ㎕ FACS 버퍼로 세척하고 1:100으로 희석된 2차 항체(항-인간-IgG-PE, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))를 함유한 50㎕ FACS 버퍼에서 얼음에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 후 세포를 FACS 버퍼로 세척하고 LSR II, DB 유세포분석기(비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 캘리포니아주 샌호세)에서의 획득을 위해 2% PFA에 고정시켰다. 유세포분석은 플로조(FloJo) 소프트웨어 버젼 9.6.4를 이용하여 수행하였다. 적정 곡선 및 Kd를 얻기 위하여, 평균 형광 강도(MFI) 값을 농도(nM)에 대해 e도시하였다. Kd 값은 프리즘(Prism) 6, 비선형 회귀 곡선 피트 분석(Non linear regression curve fit analysis), 힐 슬로프를 가진 일 부위 특이적 결합(One Site Specific Binding with Hill Slope)을 이용하여 계산하였다.
결과: 모든 CHO 및 CF 항-CD47 단클론 항체는 인간 T 림프아구 세포(ATCC® CCL-119™)인 CCRF-CEM 세포의 표면 상에서 동등한 결합 Kd를 나타냈다. 계산된 Kd (nM) 값은 하기 표(표 8)에 제시된다.
항-CD47 Mabs Kd (nM)
IgG1-모-CHO 0.18
IgG1-모-CF 0.14
IgG1-13m-CF 0.15
IgG1-13mZ -CF 0.21
IgG1-5m-CF 0.12
IgG4P-모-CHO 0.18
IgG4P-5m-CF 0.14
IgG4PE-모-CHO 0.21
IgG4PE-5m-CF 0.14
B6H12, mu 항-hu CD47 ~16.0
6.4 실시예 4: 식세포작용 분석
인간 대식세포의 생성: 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 스탠포드 혈액 센터(Stanford Blood Center)(미국 캘리포니아주 팔로 알토)로부터 구매한 버피 코트(buffy coat)(혈액을 원심분리기에서 침전시킨 후 전혈 단위에서 적혈구와 혈장 사이의 백색 층)로부터 분리하였다. 버피 코트를 PBS로 2배 희석하고 50 ml 류코셉(Leucosep) 튜브(그레이네르 바이오 원(Greiner Bio One), 미국 노스캐롤라이나주 먼로)에서 15 ml 니코프렙(NycoPrep) 1.077(액시스-쉴드(Axis-Shield), 스코틀랜드 던디) 상에 적층하고, 20분 동안 1,000 x g에서 원심분리시켰다. PBMC를 계면으로부터 수집하고, 35 ml PBS로 세척하고 5분 동안 250 x g에서 원심분리하였다. 오염성 적혈구를 10 ml ACK 용해 비퍼(론자(Lonza), 미국 뉴저지주 알렌데일)로 2분 동안 용해시키고 세포를 40 ml PBS로 희석하고 40 um 세포 스트레이너(strainer)(비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산 호세)를 통과시켰다. 세포를 5분 동안 250 x g에서 원심분리하고 10% FBS, 2 mM 글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 30 ml RPMI 배지에 재현탁시켰다. PBMC를 계수하고 밤새 RPMI 배지에서 5x106 세포/ml로 배양하였다. 다음날, CD14-양성 단핵구를 오토맥스 프로(AutoMacs Pro)를 이용하여 CD14 마이크로비드(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotech), 미국 캘리포니아주 오번)로 분리하고 50 ng/ml M-CSF(페프로텍(Peprotech), 미국 뉴저지주 록키 힐)를 함유한 RPMI 배지에서 5-7일 동안 배양하여 분화된 대식세포를 수득하였다. 세포를 회수 세포 배양 동결 배지(Recovery Cell Culture Freezing Medium)(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)에서 동결시켰다.
식세포작용 활성의 측정: 동결되거나 신선한 인간 대식세포를 밤새 96-웰에서 배양하였다(50 ng/ml M-CSF로 보충된 0.1 ml RPMI 배지에 20,000 세포). 다음날, 한번 세척 후 배지를 M-CSF가 없는 50 ㎕ RPMI 배지로 교환하였다. 1.5x106 세포/ml 밀도로 계대된 CD47-양성 CCRF-CEM 세포(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스)를 30분 동안 10 μM 셀트레이스 오레곤 그린(CellTrace Oregon Green) 488(라이프 테크놀로지스, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로 라벨링하고 RPMI 배지로 3회 세척하였다. 50 ㎕ RPMI 배지 내의 라벨링된 CCRF-CEM 세포(50 ㎕ 내에 80,000 세포) 및 항-CD47 항체를 대식세포에 첨가하였다. 항-CD47 항체를 4 ng/ml 내지 10 ㎍/ml의 최종 농도로 시험하였다. 플레이트를 간단히 원심분리하고 3시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 대식세포를 PBS로 3회 세척하여 CCRF-CEM 세포를 제거하고 10분 동안 37℃에서 50㎕ 아큐타제(비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산 호세)로 탈착시켰다. 대식세포를 수집하고, FACS 세척 버퍼(0.2% FBS를 함유한 PBS)로 한번 세척하고, 15분 동안 항-CD14-APC로 염색하였다. 세포를 두번 세척하고 10분 동안 4% 포름알데히드에서 고정시켰다. 세포를 유세포분석에 의해 분석하여 식세포작용 지수를 결정하였다(오레곤 그린 라벨링된 CD14-양성 세포의 %). 가변 기울기(4 파라미터) 비선형 회귀 분석을 이용하여 용량-반응 곡선 및 최대 유효 농도 절반(EC50) 값을 얻기 위하여 그래프패드 프리즘을 이용하여 데이터를 분석하였다.
결과: 모든 IgG1 변이체(CF 및 CHO)에 대해 그리고 CHO만으로부터의 IgG4P 및 IgG4PE에 대해 식세포작용 활성이 관찰되었다. EC50 값이 하기 표(표 9)에 나타난다.
항-CD47 변이체 EC50 (nM)
IgG1 IgG1-모-CHO 0.3
IgG1-모-CF 0.5
IgG1-5m-CF (R&D) 0.6
IgG1-5m-CF (PD) 0.3
IgG4P IgG4P―모-CHO 0.5
IgG4P-모-CF nd
IgG4P-5m-CF nd
IgG4PE IgG4PE-모-CHO 0.7
IgG4PE-모-CF nd
IgG4PE-5m-CF nd
6.5 실시예 5: 적혈구응집 분석
공개된 연구들은 일부 항-CD47 항체가 인간 적혈구(RBC)의 응집을 야기할 수 있음을 제안한다. 따라서, 적혈구응집 분석을 수행하여 항-CD47 항체가 RBC의 응집을 촉진하는 능력을 규명하였다.
인간 RBC는 이노베이티브 리서치(Innovative Research)(Cat# IPLA-WB3)로부터 공급받았다. 인간 RBC(2 mL)를 10 mL의 1x dPBS(pH 7.4)로 세척하고 10분 동안 500g(1500rpm)에서 원심분리하였다. 상등액을 흡입하고, 인간 RBC를 두 번 세척하고, RBC의 20% 용액을 위해 8 mL 1 x dPBS에 재현탁시켰다. 양성 대조군인 항-인간 RBC(토끼) 항체(락랜드 이뮤노케미컬스 인크.(Rockland Immunochemicals Inc.), Catalog #109-4139, Lot 27233)를 위한 희석은 1:3 연속 희석(10X)을 이용하여 1:64였다. 시료를 위한 출발 농도는 1:3 연속 희석된(10X) 1000 nM이었다. 각 항체 적정액을 U-바닥 96웰 플레이트의 모든 웰에 피펫팅하였다(50 μL). RBC 용액(50μL의 20% RBC 용액)을 플레이트의 모든 웰에 첨가하고, 플레이트를 적어도 1.5시간 내지 12시간동안 37 ℃에서 항온처리하였다(참고: 1.5 시간과 밤새 처리 사이에 결과에 있어서 시각적인 차이는 없음). 항-인간 RBC(토끼) 항체 및 MCA911(마우스 항-인간 CD47(클론 BRIC 126, 앱노바(Abnova)))이 양성 대조군으로 작용하였다. 분석물을 플레이트의 상부로부터 가시화하였다. 음성(비-적혈구응집) 결과는 그대로 적색 점으로 나타나는 반면, 양성(적혈구응집) 결과는 분산된 적색 매트로 나타난다.
결과: 양성 대조군(토끼 항-인간 RBC 항체 및 MCA911 (마우스 항-인간 CD47 항체)만이 적혈구응집을 나타냈다. IgG1-모, IgG4P-모, IgG4PE-모, IgG1-13mZ-CF, IgG1-13m-CF, IgG1-5m-CF, IgG4P-5m-CF, IgG4PE-5m-CF를 비롯한, CHO 및 무세포(CF)-발현된 항-CD47 단클론 항체는 어느 것도 적혈구응집의 증거를 나타내지 않는다.
6.6 실시예 6: C1Q 결합 ELISA
방법: 96-웰 고 단백질 결합 ELISA 플레이트(맥스솔프 눈크(MaxSorp Nunc))를 밤새 4℃에서 0.05 M 소듐 바이카보네이트 버퍼(pH 9)에서 희석된 시료 항-CD47 항체 변이체로 코팅하였다. 시료를 133.4 nM (20㎍/ml)의 고농도로 희석하고 11-점 희석 곡선으로 1:2로 적정하였다. 플레이트를 PBS, 0.05% Tween 20에서 세 번 세척하고 1시간 동안 실온에서 ELISA 희석제(0.1 M NAPO4, 0.1 M NaCl, 0.1% 젤라틴, 0.05% Tween 20, 0.05% ProClin300)로 차단시켰다. 그 후 플레이트를 다시 세 번 세척하고 실온에서 두 시간 동안 ELISA 희석제에서 희석된 2 ㎍/mL 인간 C1q(에이비디 세로텍(AbD Serotec) 2221-5504, 1mg/mL 스톡)과 항온처리하였다. 그 후 플레이트를 세 번 세척하고 ELISA 희석제에서 1:200 희석된 양 항-인간 C1q HRP(에이비디 세로텍 2221-5004P)와 실온에서 1시간 동안 항온처리하여 결합된 C1q를 검출하였다. 그 후 플레이트를 세 번 세척하고, 이어서 100 μL의 TMB 용액을 첨가하였다. 반응을 100 ㎕의 1M 인산을 첨가하여 급냉시키고 플레이트를 450 nM에서 판독하였다. 프리즘 6을 이용하여 데이터를 log(억제제) 대 반응-가변 기울기(4 파라미터)를 가진 비선형 회귀로서 도시한다.
결과: IgG1-QN1-CHO는 C1Q ELISA 분석에서 활성을 나타내는 한편, IgG4P, IgG4PE, 및 scFv 항-CD47 단클론 항체는 C1Q ELISA 분석에서 활성을 나타내지 않는다("NA"). EC50 값은 하기 표(표 10)에 제시된다.
시료 EC50 (nM)
IgG1-모-CHO 3.6
IgG1-모-CF NA
IgG1-13mZ-CF NA
IgG1-13m-CF NA
IgG1-5m-CF NA
IgG4P-모-CHO NA
IgG4P-모-CF NA
IgG4P-5m-CF NA
항-CD47 B6H12 scFv NA
IgG4PE-모-CHO NA
IgG4PE-모-CF NA
IgG4PE-5m-CF NA
6.7 실시예 7: 보체 -의존성 세포독성( CDC ) 분석
방법: CD47-발현 세포주(Raji 및/또는 CCRF)를 수집하고 0.3 x 106 세포/mL로 CDC 버퍼(RPMI 1640, L-글루타민(100x 스톡), 및 1% BSA)에서 재현탁시켰다. 그 후 세포를 96웰 백색 조직 배양 플레이트(팰콘(Falcon))에서 10,000 세포/웰로 도말하고 CDC 버퍼에서 10 ㎍/mL의 최종 농도의 시료 항-CD47 항체 변이체와 1시간동안 37℃에서 항온처리하였다. 스핀 필터(코스타 스핀엑스(Costar SpinX) 미세원심분리 튜브)를 이용하여 잔류 오염물을 제거하였다. 토끼(7.5%) 또는 인간(30%) 혈청을 그 후 각각 2.5% 및 10%의 최종 농도로 첨가하고, 2시간 동안 37 ℃에서 항온처리하였다. 혈청을 CDC 분석 버퍼에서 희석하였다. 그 후 세포 사멸을 셀 톡스 글로(Cell Tox Glo) 키트(프로메가(Promega) G292)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다. 플레이트를 인비젼(Envision) 발광 플레이트 판독기(발광 96웰 전체 면적 프로그램)에서 판독하고 퍼센트 CDC 활성을 (처리 세포-자발적 세포)/(총 용해-자발적 용해)*100으로서 처리하였다.
결과: CDC 활성이 Bric 126 항체, 항-CD20 IgG1 항체 및 항-CD20 IgG4 항체에서 관찰되었으나, CDC 활성은 시험된 어떤 다른 항체에세도 관찰되지 않았다("NA"). EC50 값은 하기 표(표 11)에 제시된다.
명칭 EC50 (nM)
CD20 IgG1 0.21
BRIC 126 (항-CD47 항체) 0.0014
B6H12 (항-CD47 항체) NA
IgG1-모-CHO NA
IgG4P-모-CHO NA
IgG4PE-모-CHO NA
IgG1-모-CF NA
IgG1-5m-CF NA
IgG1-13m-CF NA
IgG1-13mZ-CF NA
IgG4P-모-CF NA
IgG4P-5m-CF NA
대조군 IgG1 아이소타입 NA
대조군 IgG4 아이소타입 NA
IgG4PE-모-CF NA
IgG4PE-5m-CF NA
6.8 실시예 8: 항체-의존성 세포독성( ADCC ) 분석
방법: PBC를 버피 코트로부터 제조하였다. 버피 코트를 PBS로 2배 희석하고 50 ml 류코셉 튜브(그레이네르 바이오 원, 미국 노스캐롤라이나주 먼로)에서 15 ml 니코프렙 1.077(액시스-쉴드, 스코틀랜드 던디) 상에 적층하고, 20분 동안 1,000 x g에서 원심분리시켰다. PBMC를 계면으로부터 수집하고, 35 ml PBS로 세척하고 5분 동안 250 x g에서 원심분리하였다. 오염성 적혈구를 10 ml ACK 용해 비퍼(론자, 미국 뉴저지주 알렌데일)로 2분 동안 용해시키고 세포를 40 ml PBS로 희석하고 40 ㎛ 세포 스트레이너(비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산 호세)를 통과시켰다. 세포를 5분 동안 250 x g에서 원심분리하고 10% FBS, 2 mM 글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 30 ml RPMI 배지에 재현탁시켰다. 10,000 CCRF-CEM 또는 SKBR3 세포를 96 웰 U 바닥 폴리프로필렌 플레이트에서 각 웰 당 300,000 PBMC와 동시배양시켰다. PBMC는 스탠포드 혈액 센터로부터 받은 인간 버피 코트로부터 제조하였다. 22.2 nM의 최고농도로부터 시작하여, 시료 변이체의 세배 희석액을 두 벌로 각 웰에 첨가하고 3시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 세포를 이어서 제조사의 설명서에 따라 글로 시약 50 μL에서 용해시켰다. 플레이트를 인비젼 발광 플레이트 판독기(발광 96웰 전체 면적 프로그램)에서 판독하였다. 퍼센트 ADCC 활성을 (처리 세포-자발적 세포)/(총 용해-자발적 용해)*100으로서 계산하였다.
결과: ADCC 활성은 트라스투주맙(CHO) 및 IgG1 모-CHO에서 관찰되었으며 둘 모두 CHO 세포에서 발현되었으나; 시험된 어떤 다른 항-CD47 항체(CHO 세포 발현 또는 CF 발현)에서도 ADCC 활성이 관찰되지 않았다("NA"). EC50 값은 하기 표(표 12)에 제시된다:
항체 명칭 IC50 (nM)
IgG1-모-CHO 0.06
트라스투주맙 (CHO) 0.001
트라스투주맙 (CF) NA
대조군 IgG1 아이소타입 NA
IgG4P-모-CHO NA
IgG4PE-모-CHO NA
대조군 IgG4 아이소타입 NA
IgG1-모-CF NA
IgG1-5m-CF NA
IgG1-13m-CF NA
IgG1-13mZ-CF NA
IgG4P-모-CF NA
IgG4P-5m-CF NA
IgG4PE-모-CF NA
IgG4PE-5m-CF NA
6.9 실시예 9: 시차 주사 열량측정법( DSC )( 열안정성 ) 분석
방법: 시차 주사 열량측정법(DSC)을 지이 브이피 캐필러리(GE VP Capillary) DSC 장비에서 수행하였다. 분석은 60℃/hr 가열 램프로 20-100℃에서 수행하였다. 피드백 모드를 금지시켰으며, 10s의 필터링 기간을 이용하였다. 스캔-전 온도조절은 5분으로 설정하였다. 모든 시료를 하기 버퍼에서 1mg/mL의 농도로 시험하였다: 50mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 2% 트레할로스, pH 6.0.
결과: 세 가지 상이한 항-CD47 IgG1 항체 구조체를 DSC에 의해 분석하였다:
1) IgG1-13mZ
2) IgG1-13m
3) IgG1-5m
구체적으로, 세 가지 항체가 Fab 도메인에 위치된 잔기에서만 상이했음을 고려할 때, Fab 도메인(TM2)의 용융 전이(melting transition)가 흥미로웠다. 데이터가 도 3a에서 보여주듯이, 모든 세 구조체에 대해 Fab 전이를 위해 우수한 협동적 풀림(unfolding)이 관찰되며, IgG1-5m이 최고의 TM2를 나타낸다.
하기 표(표 13)는 모든 세 가지 항-CD47 IgG1 구조체를 위한 세 가지 상이한 전이의 전이 온도를 요약한다. 관찰될 수 있는 것처럼, 단지 적은(<1.0 ℃) TM 차이만이 CH2 (TM1) 및 CH3 (TM3) 전이에 대해 관찰될 수 있다. 하지만, IgG1-5m의 TM2는 다른 변이체에 비하여 1.5℃ 안정화를 보여준다.
변이체 TM1[℃] TM2[℃] TM3[℃]
IgG1-13mZ 62.0 75.3 81.8
IgG1-13m 62.5 75.3 82.5
IgG1-5m 62.2 76.6 82.8
구체적으로, IgG1-5m은 CHO 세포-배양 유래 IgG4PE(CHO IgG4PE) 참고 표준에 비교할 때 놀랍게 개선된 열 안정성을 보여준다(도 3b). 관찰될 수 있는 것처럼, CHO IgG4PE 물질을 위한 모든 열 전이는 75℃ 미만에 놓이는 한편, IgG1-5m은 고온에서 상당히 안정화되고 변성되며, 62.2℃의 CH2 도메인은 예외이다.
IgG1 맥락에서 관찰된 열 안정화가 또한 IgG4 스캐폴드에 해당할지 보기 위하여, 하기의 세 가지 항-CD47 IgG4 변이체를 DSC를 통해 비교하였다:
1) IgG4PE-5m
2) IgG4P-5m
3) IgG4PE CHO
도 3c에 제시된 온도기록도에서 볼 수 있는 것처럼, IgG4P 및 IgG4PE 맥락에서 Fab 영역 용융은 IgG4PE CHO 참고 물질에 비교할 때, 5-돌연변이의 도입에 의해, 9℃ 만큼 개선된다.
다함께, 이들 결과는 선택된 돌연변이의 도입에 의해 Fab 도메인의 상당한 열 안정화가 이루어질 수 있음을 보여준다. Fab 영역이 IgG1과 IgG4 스캐폴드 간에 변화되지 않고 남아 있으므로, 열 안정성 이득은 하나의 스캐폴드로부터 다른 것으로 적용되는 것으로 보여서, 이것은 또한 다른 IgG1 아이소타입에 대해서도 사실일 것임을 나타낸다.
6.10 실시예 10: 항-CD47 항체의 약동학적 특성
방법: 항-CD47 항체 IgG4-PE CHO, IgG1-CF 및 IgG1-5m-CF를 각각 3.0, 3.0 및 2.5 mg/kg의 투여량 수준으로 마우스에게 볼루스 정맥내 주사에 의해 투여하였다. 투약 후 28일(672시간)까지 선택된 시간에 혈장 시료를 수집하고, 각 단백질의 농도를 면역분석에 의해 결정하였다. 약동학 파라미터를 이어서 윈논린(WinNonlin) 'v' 5.3, 피닉스(Phoenix) 64(캘리포니아주 세르타라)로 비구획 접근법을 이용하여 계산하였다. 곡선의 상향 부분을 위해서는 선형 사다리꼴 공식을 그리고 하강 부분을 위해서는 로그 사다리꼴 공식을 이용하여 AUC를 계산하였다. 최종 반감기는 혈장 농도의 로그 대 시간의 회귀로부터 결정하였다. 회귀를 위해 사용된 지점의 수는 최소 3개의 최종 시점을 이용하여 데이터의 시각적 검사에 의해 결정하였다. 분포의 초기 부피는 0 시간으로 외삽된 투여량/혈장 농도로부터 계산하였다. 모든 다른 파라미터는 표준 방법을 이용하여 윈논린 내에서 계산하였다.
결과: IgG4-PE CHO, IgG1-CF 및 IgG1-5m-CF의 약동학은 서로 유사하였다. 이들 유형의 화합물에 대해 전형적인 낮은 분포 부피에도 불구하고 소거율은 낮아서 상대적으로 긴 반감기를 야기한다. 분포의 초기 부피는 대략 혈액 부피인 반면, 면적 및 정상-상태에 기초한 분포의 부피는 대략 세포외 물의 부피의 절반이었다.
Figure 112017073071594-pct00029
6.11 실시예 11: 생체 내 항-종양 활성
무세포 시스템에 의해 생산된 항-CD47 항체의 항-종양 활성을 인간 골수종 세포주 RPMI8226을 가진 이종이식편 종양 모델을 이용하여 생체 내에서 시험하였다.
방법: NOD/SCID 마우스에 RPMI 8226 세포를 피하주사하였다. 후속하여, 마우스에 비히클 대조군, hIgG4, 또는 CF 항-CD47 항체, 예를 들어, 항-CD47 IgG1-5m을 1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg의 투여량으로 투여하여(qwx3) 처리하였다. 종양 부피를 모니터하였다.
결과: 도 5는 종양 세포 접종 후 종양 부피 대 일수의 그래프를 도시한다. CF 항-CD47 IgG1-5m 항체는 1 mg/kg의 투여량에서는 83%의 종양 부피 감소(TVR)을 이루었고 0.3 mg/kg의 투여량에서는 50%의 TVR을 이루었다. 종결시에 종양이 없는 마우스의 백분율은 1 mg/kg 투여량의 CF 항-CD47 IgG1-5m 항체를 위해 25%(2/8)이다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌(예를 들어, 간행물 또는 특허 또는 특허 출원)은 각 개별 문헌(예를 들어, 간행물 또는 특허 또는 특허 출원)이 구체적으로 그리고 개별적으로 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 통합되는 것으로 나타내진 것처럼, 그 전체가 모든 목적을 위해 참고로 본원에 통합된다.
다른 실시형태는 하기 청구범위 이내이다.
SEQUENCE LISTING <110> Celgene Corporation <120> ANTI-CD47 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 12827-563-228 <140> <141> <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD47 antibody AB6.12 heavy chain variable region <400> 1 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Asn Ala Ala Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val 115 <210> 2 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD47 antibody IgG1 heavy chain <400> 2 Met Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp 20 25 30 Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys 50 55 60 Phe Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95 Cys Asn Ala Ala Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Pro Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp 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Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60 Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80 Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95 Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110 Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125 Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140 Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160 Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175 Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190 Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205 Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220 Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240 Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255 Ser Leu Cys Ile Ala Ala 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120 125 Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe Gly Ile 130 135 140 Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr Ile Ala 145 150 155 160 Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val Gly Ala 165 170 175 Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr Gly Leu 180 185 190 Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His Tyr Tyr 195 200 205 Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala Ile Leu 210 215 220 Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu Ser Leu 225 230 235 240 Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly 245 250 255 Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys 260 265 270 Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys Ala Val 275 280 285 Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met Asn Asp 290 295 300 Glu 305

Claims (75)

  1. 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 단클론성 항-CD47 항체:
    X1 QX2 QLVQSGAEVKKX3 GX4 SVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQX5 LEWMGWIDPDQGDTEYAQKX6 QX7 RVTX8 TX9 DX10 SX11 STAYMELX12 SLRSX13 DTAX14 YYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV(서열 번호: 20)
    상기 서열에서, X1은 M이거나 위치 X1에서 아미노산이 없고, X2는 M 또는 V이고, X3는 P이고, X4는 S 또는 A이고, X5는 A 또는 G이고, X6은 F 또는 L이고, X7은 G이고, X8은 I 또는 M이고, X9는 R 또는 T이고, X10은 R 또는 T이고, X11은 T이고, X12는 R이고, X13은 E 또는 D이고, X14는 V이고;
    상기 항-CD47 항체는, 각각 아미노산 서열 KASQDIHRYLS(서열 번호 17), RANRLVS(서열 번호 18), 및 LQYDEFPYT(서열 번호 19)을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항-CD47 항체는 무세포 시스템을 이용하여 생산될 경우 무세포 시스템을 이용하여 생산된 모 항-CD47 항체에 비하여 더 높은 항체 발현 역가 또는 수율을 갖고, 상기 모 항-CD47 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 서열 번호 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 단클론성 항-CD47 항체.
  7. 제6항에 있어서,
    항체 발현 역가 또는 수율이 모 항체에 비하여 적어도 1배, 적어도 2배, 또는 적어도 3배 더 높은, 항-CD47 항체.
  8. 제1항에 있어서,
    인간화 항체인, 항-CD47 항체.
  9. 제1항에 있어서,
    IgG1 항체인, 항-CD47 항체.
  10. 제1항에 있어서,
    IgG4 항체인, 항-CD47 항체.
  11. 제10항에 있어서,
    EU 넘버링 인덱스에 따라 S228P 아미노산 치환을 포함하는 IgG4 항체인, 항-CD47 항체.
  12. 제10항에 있어서,
    EU 넘버링 인덱스에 따라 S228P 및 L235E 아미노산 치환을 포함하는 IgG4 항체인, 항-CD47 항체.
  13. 제6항에 있어서,
    상기 모 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항-CD47 항체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 모 항체는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-CD47 항체.
  15. 제6항에 있어서,
    상기 모 항체는 서열 번호 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-CD47 항체.
  16. 제1항에 있어서,
    서열 번호 1의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역의 골격 영역에서 13 아미노산 변형을 포함하는, 항-CD47 항체.
  17. 제1항에 있어서,
    서열 번호 1의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역의 골격 영역에서 10 아미노산 변형을 포함하는, 항-CD47 항체.
  18. 제1항에 있어서,
    서열 번호 1의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역의 골격 영역에서 14 아미노산 변형을 포함하는, 항-CD47 항체.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 VH는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항-CD47 항체.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 VH는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는, 항-CD47 항체.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 VH는 서열 번호 7의 중쇄 아미노산 서열의 VH 아미노산 서열을 포함하는, 항-CD47 항체.
  22. 제1항에 있어서,
    서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-CD47 항체.
  23. 제1항에 있어서,
    서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-CD47 항체.
  24. 제1항에 있어서,
    서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-CD47 항체.
  25. 제1항에 있어서,
    서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-CD47 항체.
  26. 제1항에 있어서,
    서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-CD47 항체.
  27. 제1항에 있어서,
    서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-CD47 항체.
  28. 제1항에 있어서,
    서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항-CD47 항체.
  29. 제1항에 있어서,
    서열 번호 13 또는 N-말단에 아미노산 M이 없는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항-CD47 항체.
  30. 제1항에 있어서,
    투여 후 적혈구 고갈, 빈혈, 또는 적혈구 고갈 및 빈혈 둘 모두를 야기하지 않는, 항-CD47 항체.
  31. 제30항에 있어서,
    투여 후 혈소판 고갈을 야기하지 않는, 항-CD47 항체.
  32. 제30항에 있어서,
    투여 후 세포 응집을 야기하지 않는, 항-CD47 항체.
  33. 제30항에 있어서,
    투여 후 적혈구 응집을 야기하지 않는, 항-CD47 항체.
  34. 제1항에 있어서,
    CD47이 시그널-조절-단백질 α(SIRPα)와 상호작용하는 것을 억제하는, 항-CD47 항체.
  35. 제1항에 있어서,
    CD47-발현 세포의 대식세포-매개 식세포작용을 촉진하는, 항-CD47 항체.
  36. 제1항에 있어서,
    유의한 수준의 이펙터 기능을 야기하지 않는, 항-CD47 항체.
  37. 제1항에 있어서,
    무세포 시스템을 이용하여 발현될 경우, CHO 세포를 이용하여 발현된 경우보다, FcγR에 대해 더 낮은 결합 친화성을 나타내거나, 결합하지 않는, 항-CD47 항체.
  38. 제37항에 있어서,
    더 낮은 결합 친화성은 적어도 1로그 더 낮거나 적어도 2로그 더 낮은 것인, 항-CD47 항체.
  39. 제37항에 있어서,
    FcγR은 FcγRI, FcγRIIA R131, FcγRIIA H131, FcγRIIB, 또는 FcγRIIIA V158인, 항-CD47 항체.
  40. 제1항에 있어서,
    CHO 세포에서 발현되는 경우에 비하여 무세포 시스템을 이용하여 발현될 경우 비글리코실화되거나 덜 글리코실화되는, 항-CD47 항체.
  41. 제1항에 있어서,
    유의한 수준의 ADCC 또는 CDC를 야기하거나 촉진하지 않는, 항-CD47 항체
  42. 제1항에 있어서,
    무세포 시스템을 이용하여 생산하며, 이 때 무세포 시스템은 S30 무세포 추출물을 이용하는 것을 포함하는, 항-CD47 항체.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 S30 무세포 추출물은 원핵 이황화 결합 아이소머라제 DsbC를 포함하는, 항-CD47 항체.
  44. 제1항에 있어서,
    이특이적 항체인, 항-CD47 항체
  45. 제1항에 있어서,
    제제에 접합되는, 항-CD47 항체.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 제제는 라벨 또는 독소인, 항-CD47 항체.
  47. 제1항에 따른 항-CD47 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학 조성물.
  48. 제47항에 있어서,
    약학적 허용 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  49. 제1항의 항-CD47 항체의 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH) 둘 모두를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 VH는 서열 번호 26 내지 32 중 어느 하나의 VH 영역으로 코딩되고, 상기 VL은 서열번호 33의 VL 영역으로 코딩되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  51. 제50항에 있어서,
    서열번호 26 내지 32 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열은 중쇄를 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
  52. 제51항에 있어서,
    서열 번호 33의 뉴클레오티드 서열은 경쇄를 코딩하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  53. (i) 제1항의 항-CD47 항체의 VH 또는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 (ii) 제1항의 항-CD47 항체의 VL 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 집단.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 제2 폴리뉴클레오티드는 제2 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드 집단.
  55. 제49항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  56. (i) 제1항의 항-CD47 항체의 VH 또는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터, 및 (ii) 제1항의 항-CD47 항체의 VL 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 집단.
  57. S30 무세포 추출물, 원핵 이황화 결합 아이소머라제 DsbC 및 제55항의 벡터 하나 이상을 포함하는 무세포 단백질 발현용 조성물.
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 제1항에 있어서,
    암을 치료하기 위한 의약품의 제조를 위해 사용되는, 항-CD47 항체.
  61. 제1항에 있어서,
    암의 증상을 완화하기 위한 의약품의 제조를 위해 사용되는, 항-CD47 항체.
  62. 제60항에 있어서,
    상기 의약품은 제조되어 방사선 또는 항암화학요법과 병용하여 추가로 투여되는, 항-CD47 항체.
  63. 제60항에 있어서,
    상기 의약품은 제조되어 다른 항암제와 병용하여 추가로 투여되는, 항-CD47 항체.
  64. 제60항에 있어서,
    상기 암은 혈액암인, 항-CD47 항체.
  65. 제60항에 있어서,
    상기 암은 고형암인, 항-CD47 항체.
  66. 제60항에 있어서,
    상기 암은 다발성 골수종, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 유방암, 방광암, 비소세포 폐암/암종, 간세포 암종(HCC), 육종 또는 두경부암인, 항-CD47 항체.
  67. 제49항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 세포.
  68. 제53항의 폴리뉴클레오티드 집단을 포함하는 분리된 세포.
  69. 제55항의 벡터를 포함하는 분리된 세포.
  70. 제56항의 벡터 집단을 포함하는 분리된 세포.
  71. 제1항의 항-CD47 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 분리된 세포.
  72. (i) 제1항의 항-CD47 항체의 VH 또는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 숙주 세포, 및 (ii) 제1항의 항-CD47 항체의 VL 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포 집단.
  73. 제57항의 무세포 단백질 발현용 조성물을 이용하여 항-CD47 항체를 발현하는 것을 포함하는 항-CD47 항체의 제조 방법.
  74. 제67항의 세포를 이용하여 항-CD47 항체를 발현하는 것을 포함하는 항-CD47 항체의 제조 방법.
  75. 제73항에 있어서,
    항-CD47 항체를 정제하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
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