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CN114761041A - Hiv疫苗及其制备和使用方法 - Google Patents

Hiv疫苗及其制备和使用方法 Download PDF

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CN114761041A
CN114761041A CN202080064560.7A CN202080064560A CN114761041A CN 114761041 A CN114761041 A CN 114761041A CN 202080064560 A CN202080064560 A CN 202080064560A CN 114761041 A CN114761041 A CN 114761041A
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hiv
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CN202080064560.7A
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刘心岸
A·T·玛卡德赞格
S·R·马丁
H·希哈塔
E·斯瓦罗夫斯凯亚
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Gilead Sciences Inc
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Abstract

本发明提供了用于引发对HIV‑1的免疫应答的HIV‑1融合多肽、编码此类融合多肽的多核苷酸、表达此类融合多肽的载体；包含此类融合多肽、多核苷酸或载体的药物和免疫原性组合物和试剂盒，以及用于治疗和/或预防HIV‑1的方法。本发明还提供了用于设计抗病毒疫苗包括引发对HIV‑1的免疫应答的疫苗的方法。

Description

HIV疫苗及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请按照35U.S.C.§119(e)的规定要求2019年7月16日提交的美国临时专利申请号62/874,712的权益，该临时专利申请据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。
序列表
本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式以电子方式提交并据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2020年6月30日，名称为1314_PF_SL.txt，大小为449,156字节。
背景技术
人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染是一种严重的威胁生命的疾病，并且仍然是全世界发病率和死亡率的主要原因之一，在全球有大约3690万人被感染，在美国(US)有110万人被感染(National Center for HIV/AIDS Viral Hepatitis STD&TB Prevention:Division of HIV/AIDS Prevent ion,HIV in the United States and DependentAreas.2019年1月；UNAIDS,2017Global HIV Statistics.Fact Sheet-7月.2018)。HIV-1感染的联合抗逆转录病毒疗法(cART)通过抑制病毒复制、保持免疫功能和避免发展成AIDS显著改善了发病率和死亡率。然而，尽管有cART，HIV-1感染会导致慢性免疫激活和非AIDS相关的发病率和死亡率的风险增加。
在感染早期，HIV-1整合到记忆簇决定簇4(CD4)T细胞的基因组中，该基因组的一部分形成HIV-1感染细胞的长期存在的储库，尽管用抗逆转录病毒疗法(ART)治疗，该储库仍持续存在(Siliciano等人，Nature Medicine(2003)9(6):727-728)。病毒储库的消除是任何HIV治愈策略的组成部分。基于免疫的疗法可以是HIV治愈或无ART病毒缓解的联合方法的另一组成部分，并且可以包括基于T细胞和抗体的疫苗、抗体和免疫调节剂的被动施用。
HIV T细胞特异性疫苗的开发主要集中在设计免疫原，其通过解决全球HIV病毒多样性来提供普遍覆盖。HIV-1由4个组(组M、N、O和P)定义。组M内的亚型或进化枝(标记为A-K)和几种交叉进化枝重组形式导致大多数人类疾病。设计解决庞大全球病毒序列多样性的疫苗的策略包括计算机设计的多价镶嵌免疫原，其可捕获潜在T细胞表位内的常见表位变体(Fischer等人，Nat Med,(2007)13(1):100-6)。这些免疫原可表达为全长人工蛋白质或来自具有高度序列保守性的区域的人工重组蛋白质(Ondondo等人，Mol Ther,(2016)24(4):832-42；Barouch等人，Cell,(2013)155(3):531-9)。计算机设计算法的后续迭代开发了一种计算速度更快的基于图形的方法，称为epigraph(Theiler等人，Sci Rep,(2016)6:33987)。这些设计方法可以用于开发单一的全球疫苗，或针对在特定人群和地理区域内循环的进化枝进行调整。然而，这些方法只关注病毒多样性，而没有考虑驱动抗原呈递和T细胞识别的宿主遗传多样性，以及随后出现的免疫驱动的逃逸变体。
抗原特异性CD4+和CD8+T细胞与急性感染期间病毒血症的控制有关，并且与在没有ART(精英控制者)的情况下保持低病毒载量的个体中疾病进展缓慢和病毒血症控制有关。抗原特异性T细胞识别在MHC I类和II类分子上呈递的病毒表位。在全基因组关联研究(GWAS)中，人类白细胞抗原(HLA)I类等位基因与HIV控制有关(Fellay等人，Science,2007.317(5840):944-7；International,H.I.V.C.S.等人，Science,(2010)330(6010):1551-7)。这些蛋白质呈递来自序列的抗原肽以诱导效应和记忆T细胞。目前产生HIV-1候选疫苗的方法集中在病毒序列多样性上，而没有充分模拟一系列宿主HLA等位基因的表位生成过程。这种抗原呈递和T细胞引发的复杂过程包括蛋白酶体切割、TAP转运、交叉呈递、MHC结合和肽-MHC复合物稳定以及最终的TCR识别(Yewdell等人，Nat Rev Immunol,(2003)3(12):952-61)。因此，产生T细胞疫苗的现有方法取得的成功有限，例如在一些情况下，每位患者平均仅诱导4次反应(参见例如Priddy等人，Clin Infect Dis(2008)46(11):1769-81；Sekaly等人，J Exp Med.(2008)205(1):7–12；以及Iaccino等人，Retrovirology.(2008)5:56)。
另外，高度变异的病毒诸如HIV-1由于高水平的序列多样性和驱动一些该序列多样性的宿主免疫应答而提供了独特的挑战。适应性免疫反应在驱动HIV-1多样性中的作用已经被充分描述，并且导致病毒序列随着时间变化(Goulder等人，Nature,(2001)412(6844):334-8；Kelleher等人，J Exp Med,(2001)193(3):375-86；Schneidewind等人，JVirol,(2007)81(22):12382-93；Kawashima等人，Nature,(2009)458(7238):641-5；Leslie等人，Nat Med,(2004)10(3):282-9；Phillips等人，Nature,(1991)354(6353):453-9)。大部分该多样性由识别在MHC I类等位基因上呈递的肽表位的细胞毒性T淋巴细胞驱动。在慢性感染期间由这些T细胞应答施加的选择压力导致HIV序列适应。该序列演变驱动个体内和群体中HIV-1的多样性(Kawashima等人，同上；Phillips等人，同上)。另外，病毒序列正在经历突变，使它们能够躲避宿主防御。这些序列可能类似于诱导中枢或外周耐受的自身肽或肽序列。标准疫苗设计方法可能无法解释病毒序列变异，并且可能由于包括可诱导可与自身抗原交叉反应的应答的序列而导致疫苗能力的低效使用。
疫苗对人类健康的影响怎么强调都不为过。然而，其中大多数是预防性疫苗，在诱导针对感染性疾病靶标的中和抗体方面通常是有效的。治疗性疫苗的开发在癌症免疫治疗方面取得了很大进展，其中重点是开发产生抗原特异性T细胞的疫苗。许多肿瘤相关或肿瘤特异性抗原是自身抗原，需要设计出能够克服免疫耐受的疫苗。最近在鉴定和预测由癌症特异性突变产生的新抗原方面的创新提供了可能不受中枢或外周耐受机制影响的潜在靶标。已经建立了各种信息学策略来支持新抗原的鉴定并预测它们引发强烈T细胞应答的能力(参见例如Bulik-Sullivan等人，Nature Biotech(2019)37:55-63)。在开发针对HIV的治疗性疫苗时，抗原靶标由病毒定义。预测这些病毒序列有效呈递和刺激免疫应答的能力的工具不太明确。这在HIV的背景下是相关的，其中高突变率加上宿主免疫介导的选择压力导致高度可变的准物种的建立。因此，我们开发了信息学工具，其允许在基于群体的共有序列中或通过对分离群进行单独深度测序来鉴定保守病毒序列，并且可以预测在设计HIV疫苗免疫原中有用的T细胞和HLA驱动的逃逸途径的呈递、引发。
发明内容
本文提供了至少以下实施方案。在本文的详细实施方案和实施例中描述了另外的实施方案。
融合多肽
实施方案1：一种融合多肽，其包含由选自Gag、Nef、Env、Pol、Rev、Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu的一种或多种HIV基因编码的一种或多种人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)蛋白的多个多肽片段。
实施方案2：根据实施方案1所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含由HIV-1基因Env、Gag、Nef和Pol编码的多肽片段或者仅由所述多肽片段组成，例如不包含由HIV-1Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。
实施方案3：根据实施方案1所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含由HIV-1基因Gag、Nef和Pol编码的多肽片段或者仅由所述多肽片段组成，例如不包含由HIV-1Env、Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。
实施方案4：根据实施方案1所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含由HIV-1基因Gag和Nef编码的多肽片段或者仅由所述多肽片段组成，例如不包含由HIV-1Env、Pol、Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。
实施方案5：根据实施方案1所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含由HIV-1基因Pol和Nef编码的多肽片段或者仅由所述多肽片段组成，例如不包含由HIV-1Env、Gag、Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。
实施方案6：根据实施方案1所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含由HIV-1基因Pol和Env编码的多肽片段或者仅由所述多肽片段组成，例如不包含由HIV-1Gag、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。
实施方案7：根据实施方案1所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含由HIV-1Pol基因编码的多肽片段或者仅由所述多肽片段组成，例如不包含由HIV-1Env、Gag、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。
实施方案8：根据实施方案1至7中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段不含由HIV Tat、Rev、Vif、Vpr和Vpu基因中的一个、两个、三个或四个编码的片段。
实施方案9：根据实施方案1至8中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽片段衍生自病毒蛋白质组序列群中的保守区。
实施方案10：根据实施方案9所述的融合多肽，其中所述保守区在患者间群体中在HIV-1种类之间具有大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的保守性。
实施方案11：根据实施方案9至10中任一项所述的融合多肽，其中所述保守区在HIV-1进化枝A-K中的一个或多个例如进化枝A、B、C、D和G中的一个或多个或HIV-1进化枝A-K中的一个或多个的重组形式以及它们的组合之间是保守的。
实施方案12：根据实施方案1至11中任一项所述的融合多肽，其包含至少5个并且至多40个多肽片段，例如5个多肽片段并且至多6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个多肽片段。
实施方案13：根据实施方案1至12中任一项所述的融合多肽，其中每个多肽片段的长度为至少8个氨基酸，并且长度为至多约30个例如至多约50个例如至多约100个例如至多约250个氨基酸，例如长度为至少8个氨基酸并且长度为至多9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个氨基酸。
实施方案14：根据实施方案1至13中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽的全长包含至少约350个氨基酸并且至多约1000个氨基酸，例如至少约350个氨基酸并且至多约360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个氨基酸。
实施方案15：根据实施方案1至13中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽的全长包含至少约500个氨基酸并且至多约1000个氨基酸，例如至少约500个氨基酸并且至多约550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个氨基酸。
实施方案16：根据实施方案1至13中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽的全长包含由HIV-1基因Gag、Nef和Pol编码的多肽片段或者仅由所述多肽片段组成，并且长度为至少约700个氨基酸并且至多约800个氨基酸，例如至少约700个氨基酸并且至多约710、720、730、740、750、760、770、780、790或800个氨基酸(例如，SEQ ID NO:345-350、422-423是例示性融合多肽)。
实施方案17：根据实施方案1至13中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽的全长包含由HIV-1基因Gag和Nef编码的多肽片段或者仅由所述多肽片段组成，并且长度为至少约340个氨基酸并且至多约500个氨基酸，例如至少约340个氨基酸并且至多约350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500个氨基酸，包括任选的N末端信号肽在内(例如，SEQ ID NO:351-356、430是例示性融合多肽)。
实施方案18：根据实施方案1至13中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽的全长包含由HIV-1基因Pol和Env编码的多肽片段或者仅由所述多肽片段组成，并且长度为至少约335个氨基酸并且至多约970个氨基酸，例如至少约335个氨基酸并且至多约340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960或970个氨基酸，包括任选的N末端信号肽在内(例如，SEQ ID NO:357-366是例示性融合多肽)。
实施方案19：根据实施方案1至13中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽的全长包含由HIV-1基因Pol编码的多肽片段或者仅由所述多肽片段组成，并且长度为至少约645个氨基酸并且至多约675个氨基酸，例如至少约645个氨基酸并且至多约650、655、660、670、675或680个氨基酸(例如，SEQ ID NO:407-410是例示性融合多肽)。
实施方案20：根据实施方案1至13中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽的全长包含由HIV-1基因Env、Gag、Nef和Pol编码的多肽片段或者仅由所述多肽片段组成，并且长度为至少约360个氨基酸并且至多约510个氨基酸，例如至少约360个氨基酸并且至多约370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或510个氨基酸，包括任选的N末端信号肽在内(例如，SEQ ID NO:367-371、424、431-435是例示性融合多肽)。
实施方案21：根据实施方案1至13中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽的全长包含由HIV-1基因Env、Gag、Nef和Pol编码的多肽片段或者仅由所述多肽片段组成，并且长度为至少约760个氨基酸并且至多约955个氨基酸，例如至少约760个氨基酸并且至多约770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、955个氨基酸，包括任选的N末端信号肽在内(例如，SEQ ID NO:373-377、411是例示性融合多肽)。
实施方案22：根据实施方案1至14中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽的全长不长于800个氨基酸，例如不长于795、790、785、780、775、770、765、760、755、750、745、740、735、730、725、720、715、710、705或700个氨基酸。
实施方案23：根据实施方案1至22中任一项所述的融合多肽，其中每个多肽片段包含一个或多个预测的T细胞表位或者由所述表位组成。
实施方案24：根据实施方案1至23中任一项所述的融合多肽，其包含一个或多个多肽片段，所述多肽片段与例如单个受试者内或多名患者之间的一个或多个人HLA I类等位基因(例如，1、2、3、4、5或6个等位基因)结合或由所述等位基因呈递。
实施方案25：根据实施方案1至24中任一项所述的融合多肽，其包含一个或多个多肽片段，所述多肽片段与至少一个人HLA I类分子例如人A*0201HLA I类分子结合或由所述分子呈递。
实施方案26：根据实施方案1至25中任一项所述的融合多肽，其包含一个或多个8聚体、9聚体和/或10聚体多肽片段，所述多肽片段由例如单个受试者内的一个或多个人HLAI类等位基因(例如，1、2、3、4、5或6个等位基因)呈递。
实施方案27：根据实施方案1至25中任一项所述的融合多肽，其包含一个或多个25聚体多肽片段，每个25聚体多肽片段包含一个或多个8聚体、9聚体和/或10聚体多肽片段，所述多肽片段由例如单个受试者内的一个或多个人HLA I类等位基因(例如，1、2、3、4、5或6个等位基因)呈递。
实施方案28：根据实施方案1至27中任一项所述的融合多肽，其包含一个或多个多肽片段，所述多肽片段在细胞内加工并由例如单个受试者内的一个或多个人HLA II类等位基因(例如，1、2、3、4、5或6个等位基因)呈递。
实施方案29：根据实施方案1至28中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽片段中的一个或多个邻接或融合到相邻片段。
实施方案30：根据实施方案1至28中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽片段中的一个或多个通过一个或多个肽接头结合到相邻片段。
实施方案31：根据实施方案30所述的融合多肽，其中所述一个或多个肽接头选自聚丙氨酸接头、聚甘氨酸接头、可切割接头、柔性接头、刚性接头、Nef连接序列以及它们的组合中的一种或多种。
实施方案32：根据实施方案31所述的融合多肽，其中所述聚丙氨酸接头包含2或3个连续丙氨酸残基例如AA、AAA(SEQ ID NO:378)、AAY(SEQ ID NO:379)或AAX(SEQ ID NO:380)或者由所述连续丙氨酸残基组成，其中X是任何氨基酸(例如，A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y)。
实施方案33：根据实施方案31所述的融合多肽，其中所述柔性接头或聚甘氨酸接头包含GG、GGS(SEQ ID NO:419)、GSG(SEQ ID NO:420)或GGGS(SEQ ID NO:421)或者由所述项组成。
实施方案34：根据实施方案31所述的融合多肽，其中所述可切割接头选自2A可切割肽(例如，口蹄疫病毒(F2A)、马鼻炎A病毒(E2A)、猪捷申病毒-1(P2A)和明脉扁刺蛾病毒(T2A))、弗林蛋白酶识别/切割序列(例如，REKR(SEQ ID NO:382)、RRKR(SEQ ID NO:383)、RAKR(SEQ ID NO:381))、Nef连接序列以及它们的组合、衍生物或变体。
实施方案35：根据实施方案34所述的融合多肽，其中所述可切割接头包含选自由以下项组成的组的弗林蛋白酶识别/切割位点或者由所述弗林蛋白酶识别/切割位点组成：RAKR(SEQ ID NO:381)、REKR(SEQ ID NO:382)和RRKR(SEQ ID NO:383)。
实施方案36：根据实施方案34至35中任一项所述的融合多肽，其中所述可切割接头包含与ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:384)、APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ IDNO:385)、RAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:386)、QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQID NO:387)或EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:388)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，或者包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:384)、APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:385)、RAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:386)、QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:387)或EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:388)的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成。
实施方案37：根据实施方案31所述的融合多肽，其中所述Nef连接序列包含与VHAGPIA(SEQ ID NO:389)、VHAGPVA(SEQ ID NO:390)或GALDI(SEQ ID NO:391)至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，或者包含选自VHAGPIA(SEQ ID NO:389)、VHAGPVA(SEQ ID NO:390)或GALDI(SEQ ID NO:391)的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成。
实施方案38：根据实施方案1至37中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个选自SEQ IDNO:1-344的片段。
实施方案39：根据实施方案1至38中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括由所述HIV-1Gag基因编码的一种或多种病毒蛋白或其片段或子序列的一个或多个片段。
实施方案40：根据实施方案39所述的融合多肽，其中由所述HIV-1Gag基因编码的所述一种或多种病毒蛋白选自p7、p17和p24，并且其中所述融合多肽不包含任何p6蛋白。
实施方案41：根据实施方案39至40中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：
·SEQ ID NO:68-146和339-342；
·SEQ ID NO:68、69、72、73、74、75、76、77、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、92、93、101、102、103、104、109、110、115、116、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、139、140、141、142、143、144、145和146；
·SEQ ID NO:76、77、86、87和92-124；
·SEQ ID NO:76、77、86、87、94和95；
·SEQ ID NO:76、86和94；
·SEQ ID NO:77、87和95；
·SEQ ID NO:68-79和92-124；
·SEQ ID NO:70-71、76-77和94-95；
·SEQ ID NO:78、79、96、99、100、107、108、113、114、121、122、123、124、137和138；
·SEQ ID NO:78、99、107、113、121、123和137；
·SEQ ID NO:78、79、90、91、97、98、99、100、105、106、107、108、111、112、113、114、117、118、119、120、121、122、123、124、137和138；
·SEQ ID NO:78、90、97、105、111、117、119和137；以及
·SEQ ID NO:78和137。
实施方案42：根据实施方案39至41中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个以下片段：其包含与选自31-53、37-51、142-166、175-199、183-191、257-282、257-290、265-282、288-313、288-321、296-313、333-357、337-361、341-349、345-353和429-444的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Gag氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:404而言的。
实施方案43：根据实施方案39至42中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段不包括1、2、3、4、5个或更多个以下多肽片段：其包含与选自1-30、54-127、138-146、370-428和445-500的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Gag氨基酸序列或其子序列或者由所述氨基酸序列或其子序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:404而言的。
实施方案44：根据实施方案39至43中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段不包括1、2、3、4、5个或更多个以下多肽片段：其包含SEQ ID NO:444-448中的任一者的HIV-1Gag氨基酸序列或与SEQ ID NO:444-448中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或它们的子序列或者由所述氨基酸序列或所述序列或它们的子序列组成。
实施方案45：根据实施方案1至44中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括由所述HIV-1Nef基因编码的所述病毒蛋白的一个或多个片段。
实施方案46：根据实施方案45所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少一个多肽片段，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：
·SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171和172；
·SEQ ID NO:147、148、149、150、155、156、157、158、159、160、166、167、168、169、170和171；
·SEQ ID NO:149-152；
·SEQ ID NO:151和152；
·SEQ ID NO:149、150、151、152、159、160、161、162、163、164、166、167、168、169、170、171、172、173和174；
·SEQ ID NO:151、152、161和162；
·SEQ ID NO:151和152；
·SEQ ID NO:153、154、172和173；
·SEQ ID NO:153和172；
·SEQ ID NO:153、154、155、156、157、158、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172和173；
·SEQ ID NO:153和165；以及
·SEQ ID NO:153。
实施方案47：根据实施方案45至46中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个以下片段：其包含与选自64-102、81-102、88-97、91-99、130-148、130-154、134-142、134-148、136-148、137-145、137-145和117-154的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Nef氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:405而言的。
实施方案48：根据实施方案45至47中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段不包括1、2、3个或更多个以下多肽片段：其包含与选自1-63、103-116和155-206的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Nef氨基酸序列或其子序列或者由所述氨基酸序列或其子序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:405而言的。
实施方案49：根据实施方案45至48中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段不包括1、2、3个或更多个以下多肽片段：其包含SEQ ID NO:449-451中的任一者的HIV-1Nef氨基酸序列或与SEQ ID NO:449-451中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或它们的子序列或者由所述氨基酸序列或所述序列或它们的子序列组成。
实施方案50：根据实施方案1至49中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含由所述HIV-1Gag和Nef基因编码的病毒蛋白的一个或多个片段或者由所述一个或多个片段组成。
实施方案51：根据实施方案50所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：
·SEQ ID NO:68-79和92-124、149、150、151、152、159、160、161、162、163、164、166、167、168、169、170、171、172、173和174；
·SEQ ID NO:70、71、76、77、94、95、151、152、161和162；
·SEQ ID NO:70、76、94、151和161；以及
·SEQ ID NO:71、77、95、152和162。
实施方案52：根据实施方案1至4和8至51中任一项所述的融合多肽，其从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：
·SEQ ID NO:70、76、94、151和161；或者
·SEQ ID NO:71、77、95、152和162。
实施方案53：根据实施方案1至52中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含SEQ ID NO:351-356和430中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:351-356和430中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
实施方案54：根据实施方案1、2、6和9至53中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括由所述HIV-1Env基因编码的一种或多种病毒蛋白的一个或多个片段。
实施方案55：根据实施方案54所述的融合多肽，其中由所述HIV-1Env基因编码的所述一种或多种病毒蛋白选自gp120和gp41。
实施方案56：根据实施方案54至55中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：
·SEQ ID NO:1-67和338；
·SEQ ID NO:2、3、8、9、13、14、17、18、23、24、25、26、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、58、59、62、63、64、65、66和67；
·SEQ ID NO:4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、28、29、30、37、38、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61和338；
·SEQ ID NO:4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、28、29、30、37、38、41和42；
·SEQ ID NO:28、29、30和41-56；
·SEQ ID NO:28、29、41和42；
·SEQ ID NO:4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、37和38；
·SEQ ID NO:4、5、11、12、37和38；
·SEQ ID NO:6、7、15、16、21、22、30、60和61；
·SEQ ID NO:6、15、21、30和60；
·SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、19、20、27、55、56、57、58、59、60、61和338；
·SEQ ID NO:1、10、19、27、55、56和57；以及
·SEQ ID NO:6、15和60。
实施方案57：根据实施方案54至56中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或更多个以下片段：其包含与选自28-52、34-48、34-47、36-44、59-83、64-83、66-83、67-75、113-137、235-259、586-594、586-610、589-606和594-602的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Env氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:403而言的。
实施方案58：根据实施方案54至57中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段不包括1、2、3、4、5、6个或更多个以下多肽片段：其包含与选自1-27、53-58、84-112、138-234、269-474、490-501、611-856的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Env氨基酸序列或其子序列或者由所述氨基酸序列或其子序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:403而言的。
实施方案59：根据实施方案54至57中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段不包括1、2、3、4、5个或更多个以下多肽片段：其包含SEQ ID NO:437-443中的任一者的HIV-1Env氨基酸序列或与SEQ ID NO:437-443中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或它们的子序列或者由所述氨基酸序列或所述序列或它们的子序列组成。
实施方案60：根据实施方案1至58中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括由所述HIV-1Pol基因编码的一种或多种病毒蛋白的一个或多个片段或者由所述一个或多个片段组成。
实施方案61：根据实施方案60所述的融合多肽，其中由所述HIV-1Pol基因编码的所述一种或多种病毒蛋白选自蛋白酶(PR)、逆转录酶(RT)和整合酶(INT)中的一种或多种。
实施方案62：根据实施方案60至61中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：
·SEQ ID NO:174-337和343-344；
·SEQ ID NO:174、175、178、179、180、181、182、183、184、185、193、194、195、196、197、198、199、200、203、204、205、206、207、208、213、214、221、222、236、237、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、263、264、266、267、268、269、270、271、272、273、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、305、306、307、308、309、310、313、314、315、316、317、318、321和322；
·SEQ ID NO:180、181、182、183、184、185、186、187、190、191、192、193、194、195、196、221、222、294、295、296、297、298、299、300、301、305、306、307、308、311、312、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336和337；
·SEQ ID NO:180、181、186、187、221、222、294、295、307、308、321和322；
·SEQ ID NO:176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、282、283、294、295、296、297、298、299、300、301、302、305、306、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336和337；
·SEQ ID NO:176、177、188、189、213、214、223、224、259、260、282、283、294、295、305、306、319和320；
·SEQ ID NO:180、181、186、187、221、222、294、295、321和322；
·SEQ ID NO:182-202、292-302、305和306；
·SEQ ID NO:188、189、294、295、305和306；
·SEQ ID NO:176、177、178、179、180、181、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、282、283、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336和337；
·SEQ ID NO:176、177、213、214、223、224、259、260、282、283、319和320；
·SEQ ID NO:192、201、202、215、216、217、218、219、220、229、230、231、240、241、242、243、244、265、276、277、298、299、302、311、312、327、328、331、332、333、336和337；
·SEQ ID NO:192、201、215、217、219、229、230、240、241、243、265、276、298、302、311、327、331、333和336；
·SEQ ID NO:190、191、192、197、198、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、238、239、261、262、274、275、276、277、296、297、298、299、300、301、302、303、304、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、343、344、375和376；
·SEQ ID NO:190、197、209、210、211、225、227、234、238、261、296、300、303、323、325、329和334；以及
·SEQ ID NO:192、215、217、219、229、230、276、298、302、327、331、333和336。
实施方案63：根据实施方案54至62中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：
·SEQ ID NO:4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、28、29、30、37、38、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、282、283、294、295、296、297、298、299、300、301、302、305、306、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337和338；
·SEQ ID NO:4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、28、29、30、37、38、41、42、176、177、188、189、213、214、223、224、259、260、282、283、294、295、305、306、319和320；
·SEQ ID NO:28、29、30、41-56、182-202、292-302、305和306；
·SEQ ID NO:28、29、41、42、188、189、294、295、305和306；
·SEQ ID NO:4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、37、38、176、177、178、179、180、181、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、282、283、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336和337；以及
·SEQ ID NO:4、5、11、12、37、38、176、177、213、214、223、224、259、260、282、283、319和320。
实施方案64：根据实施方案1、6、9至38和54至63中任一项所述的融合多肽，其从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：
·SEQ ID NO:188、305、28、41、294、4、176、11、319、259、282、223、213和37；
·SEQ ID NO:188、305、28、41和294；
·SEQ ID NO:4、176、11、319、259、282、223、213和37；
·SEQ ID NO:189、306、29、42、295、5、177、12、320、260、283、224、214和38；
·SEQ ID NO:189、306、29、42和295；
·SEQ ID NO:5、177、12、320、260、283、224、214和38；
·SEQ ID NO:305、319、259、282、223、213、294、176和188；
·SEQ ID NO:306、320、260、283、224、214、295、177和189；
·SEQ ID NO:305、294、223、213、176、259、319、188和282；
·SEQ ID NO:306、295、224、214、177、260、320、189和283；
·SEQ ID NO:305、294、319、259、282、223、176和188；
·SEQ ID NO:306、295、320、260、283、224、177和189；
·SEQ ID NO:305、223、294、176、259、319、188和282；或者
·SEQ ID NO:306、224、295、177、260、320、189和283。
实施方案65：根据实施方案60至64中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、39、30个或更多个以下片段：其包含与选自144-168、152-160、291-315、326-350、328-352、330-354、333-354、334-342、336-344、338-346、374-398、380-404、382-390、388-396、399-423、400-424、406-430、553-577、642-666、650-658、759-783、767-775、768-792、776-784、834-858、940-964、947-971、948-956、948-972、955-963、956-964、980-1003和988-996的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Pol氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:406而言的。
实施方案66：根据实施方案60至65中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段不包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个以下多肽片段：其包含与选自1-55、118-128、321-325、355-366、432-541、607-641、667-682、709-746、828-833、921-930的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Pol氨基酸序列或其子序列或者由所述氨基酸序列或其子序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:406而言的。
实施方案67：根据实施方案60至66中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段不包括1、2、3、4、5个或更多个以下多肽片段：其包含SEQ ID NO:452-461中的任一者的HIV-1Pol氨基酸序列或与SEQ ID NO:452-461中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或它们的子序列或者由所述氨基酸序列或所述序列或它们的子序列组成。
实施方案68：根据实施方案1、6至38和54至67中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者的氨基酸序列或与SEQ IDNO:357-366和407-410中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
实施方案69：根据实施方案1、3和8至68中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含由Gag、Nef和Pol基因编码的病毒蛋白的片段或者由所述片段组成。
实施方案70：根据实施方案69所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：
·SEQ ID NO:76、77、86、87、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、149、150、151、152、180、181、182、183、184、185、186、187、190、191、192、193、194、195、196、221、222、294、295、296、297、298、299、300、301、305、306、307、308、311、312、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、339、340、341和342；以及
·SEQ ID NO:76、77、86、87、94、95、151、152、181、182、186、187、221、222、294、195、307、308、321、322。
实施方案71：根据实施方案69至70中任一项所述的融合多肽，其从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：
·SEQ ID NO:76、86、94、180、186、221、294、307、321和151；或者
·SEQ ID NO:77、87、95、181、187、222、295、308、322和152。
实施方案72：根据实施方案69至71中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含SEQ ID NO:345-350、表1中的序列和SEQ ID NO:422-424中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:345-350、表1中的序列和SEQ ID NO:422-424中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
实施方案73：根据实施方案1至72中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含由Gag、Pol、Env和Nef基因编码的病毒蛋白的片段或者由所述片段组成，其中所述多个多肽片段中的每一个可以与人HLA等位基因A*0201结合或由所述等位基因呈递。
实施方案74：根据实施方案73所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段中的每一个的长度为8-35个氨基酸，例如长度为9-34个氨基酸，例如长度为9-25个氨基酸。
实施方案75：根据实施方案73至74中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成
·SEQ ID NO:6、7、15、16、21、22、30、60、61、78、79、96、99、100、107、108、113、114、121、122、123、124、137、138、153、154、172、173、192、201、202、215、216、217、218、219、220、229、230、231、240、241、242、243、244、265、276、277、298、299、302、311、312、327、328、331、332、333、336和337；
·SEQ ID NO:6、15、21、30、60、78、99、107、113、121、123、137、153、172、192、201、215、217、219、229、230、240、241、243、265、276、298、302、311、327、331、333和336；
·SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、19、20、27、55、56、57、58、59、60、61、78、79、90、91、97、98、99、100、105、106、107、108、111、112、113、114、117、118、119、120、121、122、123、124、137、138、153、154、155、156、157、158、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、190、191、192、197、198、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、238、239、261、262、274、275、276、277、296、297、298、299、300、301、302、303、304、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、343和344；
·SEQ ID NO:1、10、19、27、55、56、57、78、90、97、105、111、117、119、137、153、165、190、197、209、210、211、225、227、234、238、261、296、300、303、323、325、329和334。
实施方案76：根据实施方案73至75中任一项所述的融合多肽，其从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：
·SEQ ID NO:201、78、107、96、229、172、327、6、333、243、331、192、265、311、137、15、123、30、336、302、153、219、298、121、230、240、60、241、276、113、99、21、217和215；
·SEQ ID NO:78、296、1、339、197、329、232、323、303、234、90、261、274、238、211、325、137、227、209、190、341、57、225、27、210、119、19、165、334、117、153、10、97和300；或者
·SEQ ID NO:296、1、78、197、339、227、261、274、238、325、137、329、303、234、90、232、27、57、225、323、190、341、119、19、165、334、117、153、10、97和300。
实施方案77：根据实施方案73至76中任一项所述的融合多肽，其中所述多个多肽片段包含SEQ ID NO:367-377、411、431-435中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:367-377、411、431-435中的任一者80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
实施方案78：根据实施方案1至77中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽不包含氨基酸序列YMDD(SEQ ID NO:462)或YVDD(SEQ ID NO:463)。
实施方案79：根据实施方案78所述的融合多肽，其中所述融合多肽不包含选自SEQID NO:215、216、217、218、219和220的一个或多个氨基酸序列。
实施方案80：根据实施方案78至79中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽不包含选自SEQ ID NO:209、210、211、212、213、214、343和344的一个或多个氨基酸序列。
实施方案81：一种融合多肽，其包含SEQ ID NO:345-352、357-362、367、373、407-411或422-424的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:345-352、357-362、367、373、407-411、422-424和431-435中的任一者至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
实施方案82：根据实施方案1至81中任一项所述的融合多肽，其包含N末端信号肽或前导序列。
实施方案83：根据实施方案82所述的融合多肽，其中所述信号肽或前导序列来自选自以下项的源蛋白：血清蛋白、细胞因子、趋化因子、伴侣蛋白、不变蛋白和将蛋白质引导到溶酶体室的蛋白质。
实施方案84：根据实施方案82至83中任一项所述的融合多肽，其中所述信号肽或前导序列来自选自由以下项组成的组的源蛋白：集落刺激因子2(CSF2、GM-CSF)、组织型纤溶酶原活化剂(PLAT、t-PA)、C-C基序趋化因子配体7(CCL7、MCP-3)、C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10、IP-10)、连环蛋白β1(CTNNB1)、CD74(p33；DHLAG；HLADG；Ia-GAMMA、不变链)、血清白蛋白(ALB)、聚泛素B/C(UBB/UBC)、钙网蛋白(CALR)、水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)、溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)和溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)。
实施方案85：根据实施方案82至84中任一项所述的融合多肽，其中所述信号肽或前导序列选自SEQ ID NO:393-402和412-413中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:393-402和412-413中的任一者至少95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
实施方案86：根据实施方案1至85中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽是重组产生的或化学合成的。
实施方案87：根据实施方案1至86中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够诱导、促进或刺激人类的免疫应答。
实施方案88：根据实施方案1至87中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够诱导、促进或刺激人类对HIV-1的免疫应答。
实施方案89：根据实施方案1至88中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够诱导、促进或刺激选自单核细胞来源的树突状细胞(DC)、CD8+T细胞和CD4+T细胞的一种或多种细胞类型的增殖和/或活化。
多核苷酸、脂复合物、表达盒、载体、宿主细胞
实施方案90：一种多核苷酸，其编码根据实施方案1至89中任一项所述的一种或多种融合多肽。
实施方案91：根据实施方案90所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括cDNA、mRNA、自扩增RNA(SAM)、自复制RNA或自扩增复制子RNA(RepRNA)或者为这些核酸的形式。
实施方案92：根据实施方案91所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括一个或多个自复制或自扩增甲病毒复制子。
实施方案93：根据实施方案90至92中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:414-418中的任一者的核酸序列或与SEQ ID NO:414-418中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
实施方案94：一种脂复合物，例如脂质纳米颗粒(LNP)，其包含根据实施方案90至93中任一项所述的多核苷酸。
实施方案95：一种表达盒，其包含根据实施方案90至93中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到一个或多个调控序列。
实施方案96：根据实施方案95所述的表达盒，其中所述多核苷酸可操作地连接到组成型启动子并且受组成型启动子的控制。
实施方案97：根据实施方案95至96中任一项所述的表达盒，其中所述启动子选自CMV启动子、CAG启动子和EF1a启动子。
实施方案98：一种载体，其包含根据实施方案90至93中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据实施方案95至97中任一项所述的表达盒。
实施方案99：根据实施方案98所述的载体，其中所述载体是质粒载体、细菌载体或病毒载体。
实施方案100：根据实施方案98至99中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体或病毒表达载体。
实施方案101：根据实施方案98至100中任一项所述的载体，其中所述病毒载体或病毒表达载体来自DNA病毒或RNA病毒。
实施方案102：根据实施方案98至101中任一项所述的载体，其中所述病毒载体或病毒表达载体来自选自由以下项组成的组的病毒：腺病毒、腺相关病毒、沙粒病毒、甲病毒、痘病毒、巨细胞病毒、弹状病毒、水疱性口炎病毒、黄病毒、马拉巴病毒和牛痘病毒。
实施方案103：根据实施方案98至102中任一项所述的载体，其中所述病毒载体或所述病毒表达载体来自选自以下项的分类学家族的病毒：腺病毒科(Adenoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如巨细胞病毒)、痘病毒科(Poxviridae)(例如牛痘病毒，例如修饰的牛痘安卡拉(MVA))、副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如麻疹病毒)、黄病毒科(Flaviviridae)(例如黄热病病毒)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如水疱性病毒，例如马拉巴水疱性病毒)、披膜病毒科(Togaviridae)(例如甲病毒)。
实施方案104：根据实施方案98至103中任一项所述的载体，其中所述病毒载体或病毒表达载体是选自以下项的沙粒病毒载体：淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)、卡利(Cali)哺乳动物沙粒病毒(又名皮秦德(Pichinde)哺乳动物沙粒病毒或皮秦德沙粒病毒)、瓜纳里托(Guanarito)病毒(GTOV)、胡宁(Junin)病毒(JUNV)、拉沙(Lassa)病毒(LASV)、卢约(Lujo)病毒(LUJV)、马丘波(Machupo)病毒(MACV)、萨比亚(Sabia)病毒(SABV)和白水阿罗约(Whitewater Arroyo)病毒(WWAV)。
实施方案105：根据实施方案104所述的载体，其中所述病毒载体或病毒表达载体是选自以下项的沙粒病毒载体：淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)或卡利哺乳动物沙粒病毒(又名皮秦德哺乳动物沙粒病毒或皮秦德沙粒病毒)。
实施方案106：根据实施方案98至103中任一项所述的载体，其中所述病毒载体或病毒表达载体是人腺病毒或猿腺病毒(例如，黑猩猩腺病毒、大猩猩腺病毒或恒河猴腺病毒)。
实施方案107：根据实施方案106所述的载体，其中所述病毒载体或病毒表达载体是选自以下项的腺病毒载体：血清型5腺病毒(Ad5)、血清型26腺病毒(Ad26)、血清型34腺病毒(Ad34)、血清型35腺病毒(Ad35)、血清型48腺病毒(Ad48)、黑猩猩腺病毒(例如，ChAd3(AdC3)、ChAd5(AdC5)、ChAd6(AdC6)、ChAd7(AdC7)、ChAd8(AdC8)、ChAd9(AdC9)、ChAd10(AdC10)、ChAd11(AdC11)、ChAd17(AdC17)、ChAd16(AdC16)、ChAd19(AdC19)、ChAd20(AdC20)、ChAd22(AdC22)、ChAd24(AdC24)、ChAdY25、ChAd26(AdC26)、ChAd28(AdC28)、ChAd30(AdC30)、ChAd31(AdC31)、ChAd37(AdC37)、ChAd38(AdC38)、ChAd43(AdC43)、ChAd44(AdC44)、ChAd55(AdC55)、ChAd63(AdC63)、ChAdV63、ChAd68(AdC68)、ChAd73(AdC73)、ChAd82(AdC82)、ChAd83(AdC83)、ChAd143(AdC143)、ChAd144(AdC144)、ChAd145(AdC145)、ChAd147(AdC147))、大猩猩腺病毒(例如，GC44、GC45、GC46)和恒河猴腺病毒(例如，RhAd51、RhAd52、RhAd53、RhAd54、RhAd55、RhAd56、RhAd57、RhAd58、RhAd59、RhAd60、RhAd61、RhAd62、RhAd63、RhAd64、RhAd65、RhAd66)。
实施方案108：根据实施方案98至107中任一项所述的载体，其中所述病毒载体或病毒表达载体是复制缺陷型的、复制不足型的、复制减弱型的或复制能力型的。
实施方案109：根据实施方案98至108中任一项所述的载体，其中所述病毒载体或病毒表达载体是腺病毒载体，所述腺病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
实施方案110：根据实施方案98至109中任一项所述的载体，其中所述载体包含两种或更多种多核苷酸，所述多核苷酸编码两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白与以下氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或100％相同：SEQ ID NO:345和346；SEQ IDNO:347和348；SEQ ID NO:349和350；SEQ ID NO:351和352；SEQ ID NO:430和352；SEQ IDNO:357和358；SEQ ID NO:360和362；SEQ ID NO:359和361；SEQ ID NO:351和357；SEQ IDNO:351和358；SEQ ID NO:351和359；SEQ ID NO:351和360；SEQ ID NO:351和361；SEQ IDNO:351和362；SEQ ID NO:351和407；SEQ ID NO:351和408；SEQ ID NO:351和409；SEQ IDNO:351和410；SEQ ID NO:352和357；SEQ ID NO:352和358；SEQ ID NO:352和359；SEQ IDNO:352和360；SEQ ID NO:352和361；SEQ ID NO:352和362；SEQ ID NO:352和407；SEQ IDNO:352和408；SEQ ID NO:352和409；SEQ ID NO:352和410；SEQ ID NO:430和357；SEQ IDNO:430和358；SEQ ID NO:430和359；SEQ ID NO:430和360；SEQ ID NO:430和361；SEQ IDNO:430和362；SEQ ID NO:407和409；SEQ ID NO:407和408；SEQ ID NO:408和410；或者SEQID NO:409和410。
实施方案111：一种宿主细胞，其包含根据实施方案90至93中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据实施方案98至110中任一项所述的一种或多种载体。
实施方案112：根据实施方案111所述的宿主细胞，其中所述一种或多种多核苷酸不整合到所述宿主细胞基因组中，例如是游离型的。
实施方案113：根据实施方案111所述的宿主细胞，其中所述一种或多种多核苷酸整合到所述宿主细胞基因组中。
实施方案114：根据实施方案111至113中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如人类细胞，例如选自BHK-21、A549、Vero、HEK293(例如，HEK293E、HEK293F、HEK293H、HEK293T、Expi293TM)细胞、MDCK、Caco-2和Calu-3的细胞系。
实施方案115：根据实施方案111至114中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是体外的。
实施方案116：根据实施方案111至114中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是体内的。
组合物
实施方案117：一种免疫原性组合物，其包含根据实施方案1至89中任一项所述的一种或多种融合多肽或者根据实施方案90至93中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据实施方案98至110中任一项所述的一种或多种载体以及药学上可接受的载剂。
实施方案118：根据实施方案117所述的免疫原性组合物，其包含根据实施方案1至89中任一项所述的两种或更多种融合多肽或者根据实施方案90至93中任一项所述的两种或更多种多核苷酸或者根据实施方案98至110中任一项所述的两种或更多种载体。
实施方案119：根据实施方案117至118中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种多核苷酸包含DNA、cDNA、mRNA或自复制RNA或者为这些核酸的形式。
实施方案120：根据实施方案117至118中任一项所述的免疫原性组合物，其包含：
1)一种或多种融合多肽，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：
·SEQ ID NO:70、76、94、151和161；或者
·SEQ ID NO:71、77、95、152和162；以及
2)一种或多种融合多肽，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：
·SEQ ID NO:188、305、28、41、294、4、176、11、319、259、282、223、213和37；
·SEQ ID NO:188、305、28、41和294；
·SEQ ID NO:4、176、11、319、259、282、223、213和37；
·SEQ ID NO:189、306、29、42、295、5、177、12、320、260、283、224、214和38；
·SEQ ID NO:189、306、29、42和295；
·SEQ ID NO:5、177、12、320、260、283、224、214和38；
·SEQ ID NO:305、319、259、282、223、213、294、176和188；
·SEQ ID NO:306、320、260、283、224、214、295、177和189；
·SEQ ID NO:305、294、223、213、176、259、319、188和282；
·SEQ ID NO:306、295、224、214、177、260、320、189和283；
·SEQ ID NO:305、294、319、259、282、223、176和188；
·SEQ ID NO:306、295、320、260、283、224、177和189；
·SEQ ID NO:305、223、294、176、259、319、188和282；或者
·SEQ ID NO:306、224、295、177、260、320、189和283。
实施方案121：根据实施方案117至120中任一项所述的免疫原性组合物，其包含一种或多种腺病毒载体，每种腺病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
实施方案122：根据实施方案117至121中任一项所述的免疫原性组合物，其包含一种或多种病毒载体，每种病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白与以下氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或100％相同：SEQ ID NO:345和346；SEQ ID NO:347和348；SEQ ID NO:349和350；SEQ ID NO:351和352；SEQ ID NO:430和352；SEQ ID NO:357和358；SEQ ID NO:360和362；SEQ ID NO:359和361；SEQ ID NO:351和357；SEQ ID NO:351和358；SEQ ID NO:351和359；SEQ ID NO:351和360；SEQ ID NO:351和361；SEQ ID NO:351和362；SEQ ID NO:351和407；SEQ ID NO:351和408；SEQ ID NO:351和409；SEQ ID NO:351和410；SEQ ID NO:352和357；SEQ ID NO:352和358；SEQ ID NO:352和359；SEQ ID NO:352和360；SEQ ID NO:352和361；SEQ ID NO:352和362；SEQ ID NO:352和407；SEQ ID NO:352和408；SEQ ID NO:352和409；SEQ ID NO:352和410；SEQ ID NO:430和357；SEQ ID NO:430和358；SEQ ID NO:430和359；SEQ ID NO:430和360；SEQ ID NO:430和361；SEQ ID NO:430和362；SEQ ID NO:407和409；SEQ ID NO:407和408；SEQ ID NO:408和410；或者SEQ ID NO:409和410。
实施方案123：根据实施方案117至122中任一项所述的免疫原性组合物，其包含：
1)一种或多种融合多肽，其包含SEQ ID NO:351-356和430中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:351-356和430中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列；以及
2)一种或多种融合多肽，其包含SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
实施方案124：一种药物组合物，其包含根据实施方案1至89中任一项所述的一种或多种融合多肽或者根据实施方案90至93中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据实施方案98至110中任一项所述的一种或多种载体以及药学上可接受的载剂。
实施方案125：根据实施方案124所述的药物组合物，其包含两种或更多种融合多肽、两种或更多种多核苷酸或者两种或更多种载体。
实施方案126：根据实施方案124至125中任一项所述的药物组合物，其还包含佐剂、免疫刺激剂、洗涤剂、胶束形成剂和油中的一种或多种。
实施方案127：根据实施方案126所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂选自toll样受体(TLR)激动剂、细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、FLT3LG以及它们的组合和功能变体)、非编码免疫刺激性多核苷酸(例如，病原体活化的分子模式(PAMP)、胞嘧啶-磷酸-鸟苷(CpG)寡聚脱氧核苷酸和免疫刺激性RNA(isRNA，例如CV8102))、抑制性免疫检查点蛋白的抑制剂或刺激性免疫检查点蛋白的刺激剂。
实施方案128：根据实施方案124至127中任一项所述的药物组合物，其被配制用于经由选自由以下项组成的组的途径施用：静脉内、肌内、皮内、皮下和粘膜(例如，颊部、鼻内、直肠内、阴道内)。
实施方案129：根据实施方案124至128中任一项所述的药物组合物，其被配制为液体。
实施方案130：根据实施方案124至128中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被冻干。
试剂盒
实施方案131：一种试剂盒，其包含一个或多个整体剂量的根据实施方案1至89中任一项所述的一种或多种融合多肽或者根据实施方案90至93中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据实施方案98至110中任一项所述的一种或多种载体或者根据实施方案117至121中任一项所述的一种或多种免疫原性组合物或者根据实施方案124至130中任一项所述的一种或多种药物组合物。
实施方案132：根据实施方案131所述的试剂盒，其中所述一个或多个整体剂量在单个容器中。
实施方案133：根据实施方案131所述的试剂盒，其中所述一个或多个整体剂量在两个或更多个单独的容器中。
实施方案134：根据实施方案131至133中任一项所述的试剂盒，其包含一个或多个选自由以下项组成的组的容器：小瓶、安瓿和预装注射器。
实施方案135：根据实施方案131至134中任一项所述的试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器包含所述一种或多种融合多肽、一种或多种多核苷酸或一种或多种载体的水性溶液。
实施方案136：根据实施方案131至135中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个整体剂量是相同的。
实施方案137：根据实施方案131至135中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个整体剂量是不同的。
实施方案138：根据实施方案131至137中任一项所述的试剂盒，其包含一个或多个整体剂量的根据实施方案98至110中任一项所述的一种或多种病毒载体，其中所述整体剂量在约103至约1015个病毒病灶形成单位(FFU)或噬菌斑形成单位(PFU)或感染单位(IU)或病毒颗粒(vp)的范围内，例如为约104至约107个病毒FFU或PFU或IU或vp，例如约103至约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个病毒FFU或PFU或IU或vp。
实施方案139：根据实施方案131至138中任一项所述的试剂盒，其包含根据实施方案1至89中任一项所述的两种或更多种融合多肽或者根据实施方案90至93中任一项所述的两种或更多种多核苷酸或者根据实施方案98至110中任一项所述的两种或更多种载体。
实施方案140：根据实施方案139所述的试剂盒，其包含两种或更多种编码所述融合多肽的多核苷酸或者两种或更多种表达所述融合多肽的载体，所述融合多肽包含：
1)一种或多种融合多肽，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：
·SEQ ID NO:70、76、94、151和161；或者
·SEQ ID NO:71、77、95、152和162；以及
2)一种或多种融合多肽，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：
·SEQ ID NO:188、305、28、41、294、4、176、11、319、259、282、223、213和37；
·SEQ ID NO:188、305、28、41和294；
·SEQ ID NO:4、176、11、319、259、282、223、213和37；
·SEQ ID NO:189、306、29、42、295、5、177、12、320、260、283、224、214和38；
·SEQ ID NO:189、306、29、42和295；
·SEQ ID NO:5、177、12、320、260、283、224、214和38；
·SEQ ID NO:305、319、259、282、223、213、294、176和188；
·SEQ ID NO:306、320、260、283、224、214、295、177和189；
·SEQ ID NO:305、294、223、213、176、259、319、188和282；
·SEQ ID NO:306、295、224、214、177、260、320、189和283；
·SEQ ID NO:305、294、319、259、282、223、176和188；
·SEQ ID NO:306、295、320、260、283、224、177和189；
·SEQ ID NO:305、223、294、176、259、319、188和282；或者
·SEQ ID NO:306、224、295、177、260、320、189和283。
实施方案141：根据实施方案139所述的试剂盒，其包含两种或更多种编码所述融合多肽的多核苷酸或者两种或更多种表达所述融合多肽的载体，所述融合多肽包含：
1)一种或多种融合多肽，其包含一种或多种编码以下项的多核苷酸或者一种或多种能够表达以下项的载体：SEQ ID NO:351-356和430中的任一者的氨基酸序列或与SEQ IDNO:351-356和430中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列；以及
2)一种或多种融合多肽，其包含一种或多种编码以下项的多核苷酸或者一种或多种能够表达以下项的载体：SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
实施方案142：根据实施方案131至141中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种编码所述融合多肽的多核苷酸或者一种或多种表达所述融合多肽的载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：
·SEQ ID NO:201、78、107、96、229、172、327、6、333、243、331、192、265、311、137、15、123、30、336、302、153、219、298、121、230、240、60、241、276、113、99、21、217和215；
·SEQ ID NO:78、296、1、339、197、329、232、323、303、234、90、261、274、238、211、325、137、227、209、190、341、57、225、27、210、119、19、165、334、117、153、10、97和300；或者
·SEQ ID NO:296、1、78、197、339、227、261、274、238、325、137、329、303、234、90、232、27、57、225、323、190、341、119、19、165、334、117、153、10、97和300。
实施方案143：根据实施方案131至142中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种编码所述融合多肽的多核苷酸或者一种或多种表达所述融合多肽的载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:345-377、411、422-424和430-435中的任一者的氨基酸序列或与345-377、411、422-424和430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
实施方案144：根据实施方案131至143中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种腺病毒载体，每种腺病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
实施方案145：根据实施方案131至144中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种病毒载体，其中每种病毒载体包含两种或更多种多核苷酸，所述多核苷酸编码两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白与以下氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或100％相同：SEQ ID NO:345和346；SEQ ID NO:347和348；SEQ ID NO:349和350；SEQ ID NO:351和352；SEQ ID NO:430和352；SEQ ID NO:357和358；SEQ ID NO:360和362；SEQ ID NO:359和361；SEQ ID NO:351和357；SEQ ID NO:351和358；SEQ ID NO:351和359；SEQ ID NO:351和360；SEQ ID NO:351和361；SEQ ID NO:351和362；SEQ ID NO:351和407；SEQ ID NO:351和408；SEQ ID NO:351和409；SEQ ID NO:351和410；SEQ ID NO:352和357；SEQ ID NO:352和358；SEQ ID NO:352和359；SEQ ID NO:352和360；SEQ ID NO:352和361；SEQ ID NO:352和362；SEQ ID NO:352和407；SEQ ID NO:352和408；SEQ ID NO:352和409；SEQ ID NO:352和410；SEQ ID NO:430和357；SEQ ID NO:430和358；SEQ ID NO:430和359；SEQ ID NO:430和360；SEQ ID NO:430和361；SEQ ID NO:430和362；SEQ ID NO:407和409；SEQ ID NO:407和408；SEQ ID NO:408和410；或者SEQ ID NO:409和410。
实施方案146：根据实施方案131至145中任一项所述的试剂盒，其还包含一个或多个整体剂量的一种或多种附加治疗剂。
实施方案147：根据实施方案146所述的试剂盒，其包含一种或多种活化潜伏性HIV的药剂，例如一种或多种潜伏期逆转剂(LRA)。
实施方案148：根据实施方案146至147中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种选自由以下项组成的组的LRA：一种或多种toll样受体(TLR)的激动剂或活化剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、蛋白激酶C(PKC)活化剂、Smyd2抑制剂、BET-溴结构域4(BRD4)抑制剂、离子霉素、凋亡蛋白抑制剂(IAP)拮抗剂以及胱天蛋白酶(SMAC)第二线粒体衍生的活化剂模拟物。
实施方案149：根据实施方案146至148中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种toll样受体(TLR)的一种或多种激动剂或活化剂。
实施方案150：根据实施方案149所述的试剂盒，其中所述TLR激动剂或活化剂选自由以下项组成的组：TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂。
实施方案151：根据实施方案149至150中任一项所述的试剂盒，其中所述TLR7激动剂选自由以下项组成的组：GS 9620(维沙莫特)、R848(瑞喹莫特)、DS-0509、LHC-165和TMX-101(咪喹莫特)，并且/或者其中所述TLR8激动剂选自由以下项组成的组：GS-9688、R848(瑞喹莫特)、CV8102(双TLR7/TLR8激动剂)和NKTR-262(双TLR7/TLR8激动剂)。
实施方案152：根据实施方案149至151中任一项所述的试剂盒，其中所述TLR9激动剂选自由以下项组成的组：AST-008、可比托莫特、CMP-001、IMO-2055、IMO-2125、利尼莫特、MGN-1601、BB-001、BB-006、IMO-3100、IMO-8400、IR-103、IMO-9200、阿格托莫特、DIMS-9054、DV-1079、DV-1179、AZD-1419、来菲莫特(MGN-1703)、CYT-003、CYT-003-QbG10、替索托利莫特和PUL-042。
实施方案153：根据实施方案146至152中任一项所述的试剂盒，其包含选自以下项的白介素的一种或多种白介素受体激动剂：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF和FLT3LG。
实施方案154：根据实施方案153所述的试剂盒，其包含选自由以下项组成的组的一种或多种细胞因子：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、FLT3LG以及它们的组合和功能变体。
实施方案155：根据实施方案146至154中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种先天性免疫活化剂。
实施方案156：根据实施方案155所述的试剂盒，其中所述一种或多种先天性免疫活化剂包括非编码免疫刺激性多核苷酸(例如，病原体活化的分子模式(PAMP)、胞嘧啶-磷酸-鸟苷(CpG)寡聚脱氧核苷酸和免疫刺激性RNA(isRNA，例如CV8102))、选自由以下项组成的组的受体的激动剂：fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)、干扰素基因刺激剂(STING)受体、DExD/H-盒解旋酶58(DDX58；又名RIG-I)、含核苷酸结合寡聚结构域2(NOD2)。
实施方案157：根据实施方案146至156中任一项所述的试剂盒，其包含抑制性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种阻断剂、拮抗剂或抑制剂和/或刺激性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种活化剂或激动剂。
实施方案158：根据实施方案157所述的试剂盒，其中所述一种或多种免疫检查点蛋白或受体选自由以下项组成的组：CD27、CD70；CD40、CD40LG；CD47、CD48(SLAMF2)、含跨膜和免疫球蛋白结构域2(TMIGD2、CD28H)、CD84(LY9B、SLAMF5)、CD96、CD160、MS4A1(CD20)、CD244(SLAMF4)；CD276(B7H3)；含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1、B7H4)；V-set免疫调节受体(VSIR、B7H5、VISTA)；免疫球蛋白超家族成员11(IGSF11、VSIG3)；自然杀伤细胞细胞毒性受体3配体1(NCR3LG1、B7H6)；HERV-H LTR相关2(HHLA2、B7H7)；诱导型T细胞共刺激因子(ICOS、CD278)；诱导型T细胞共刺激因子配体(ICOSLG、B7H2)；TNF受体超家族成员4(TNFRSF4、OX40)；TNF超家族成员4(TNFSF4、OX40L)；TNFRSF8(CD30)、TNFSF8(CD30L)；TNFRSF10A(CD261、DR4、TRAILR1)、TNFRSF9(CD137)、TNFSF9(CD137L)；TNFRSF10B(CD262、DR5、TRAILR2)、TNFRSF10(TRAIL)；TNFRSF14(HVEM、CD270)、TNFSF14(HVEML)；CD272(B和T淋巴细胞相关(BTLA))；TNFRSF17(BCMA、CD269)、TNFSF13B(BAFF)；TNFRSF18(GITR)、TNFSF18(GITRL)；MHC I类多肽相关序列A(MICA)；MHC I类多肽相关序列B(MICB)；CD274(CD274、PDL1、PD-L1)；程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4、CD152)；CD80(B7-1)、CD28；nectin细胞粘附分子2(NECTIN2、CD112)；CD226(DNAM-1)；脊髓灰质炎病毒受体(PVR)细胞粘附分子(PVR、CD155)；含PVR相关免疫球蛋白结构域(PVRIG、CD112R)；具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域4(TIMD4；TIM4)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2、TIMD3、TIM3)；半乳凝素9(LGALS9)；淋巴细胞活化3(LAG3、CD223)；信号转导淋巴细胞活化分子家族成员1(SLAMF1、SLAM、CD150)；淋巴细胞抗原9(LY9、CD229、SLAMF3)；SLAM家族成员6(SLAMF6、CD352)；SLAM家族成员7(SLAMF7、CD319)；UL16结合蛋白1(ULBP1)；UL16结合蛋白2(ULBP2)；UL16结合蛋白3(ULBP3)；视黄酸早期转录物1E(RAET1E；ULBP4)；视黄酸早期转录物1G(RAET1G；ULBP5)；视黄酸早期转录物1L(RAET1L；ULBP6)；淋巴细胞活化3(CD223)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞凝集素样受体C1(KLRC1、NKG2A、CD159A)；杀伤细胞凝集素样受体K1(KLRK1、NKG2D、CD314)；杀伤细胞凝集素样受体C2(KLRC2、CD159c、NKG2C)；杀伤细胞凝集素样受体C3(KLRC3、NKG2E)；杀伤细胞凝集素样受体C4(KLRC4、NKG2F)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)；杀伤细胞凝集素样受体D1(KLRD1)；以及SLAM家族成员7(SLAMF7)。
实施方案159：根据实施方案157至158中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种T细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种阻断剂、拮抗剂或抑制剂。
实施方案160：根据实施方案159所述的试剂盒，其中所述T细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体选自由以下项组成的组：CD274(CD274、PDL1、PD-L1)；程序性细胞死亡1配体2(PDCD1LG2、PD-L2、CD273)；程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4、CD152)；CD276(B7H3)；含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1、B7H4)；V-set免疫调节受体(VSIR、B7H5、VISTA)；免疫球蛋白超家族成员11(IGSF11、VSIG3)；TNFRSF14(HVEM、CD270)、TNFSF14(HVEML)；CD272(B和T淋巴细胞相关(BTLA))；含PVR相关免疫球蛋白结构域(PVRIG、CD112R)；具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；淋巴细胞活化3(LAG3、CD223)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2、TIMD3、TIM3)；半乳凝素9(LGALS9)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；以及杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)。
实施方案161：根据实施方案157至160中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种T细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种激动剂或活化剂。
实施方案162：根据实施方案161所述的试剂盒，其中所述T细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体选自由以下项组成的组：CD27、CD70；CD40、CD40LG；诱导型T细胞共刺激因子(ICOS、CD278)；诱导型T细胞共刺激因子配体(ICOSLG、B7H2)；TNF受体超家族成员4(TNFRSF4、OX40)；TNF超家族成员4(TNFSF4、OX40L)；TNFRSF9(CD137)、TNFSF9(CD137L)；TNFRSF18(GITR)、TNFSF18(GITRL)；CD80(B7-1)、CD28；nectin细胞粘附分子2(NECTIN2、CD112)；CD226(DNAM-1)；脊髓灰质炎病毒受体(PVR)细胞粘附分子(PVR、CD155)。
实施方案163：根据实施方案157至162中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种NK细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种阻断剂、拮抗剂或抑制剂。
实施方案164：根据实施方案163所述的试剂盒，其中所述NK细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体选自由以下项组成的组：杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)；杀伤细胞凝集素样受体C1(KLRC1、NKG2A、CD159A)；以及杀伤细胞凝集素样受体D1(KLRD1、CD94)。
实施方案165：根据实施方案157至164中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种NK细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种激动剂或活化剂。
实施方案166：根据实施方案165所述的试剂盒，其中所述NK细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体选自CD16、CD226(DNAM-1)；杀伤细胞凝集素样受体K1(KLRK1、NKG2D、CD314)；以及SLAM家族成员7(SLAMF7)。
实施方案167：根据实施方案157至166中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂包含PD-L1(CD274)、PD-1(PDCD1)或CTLA4的蛋白质抑制剂。
实施方案168：根据实施方案167所述的试剂盒，其中所述CTLA4的蛋白质抑制剂选自由以下项组成的组：伊匹单抗、曲美木单抗、BMS-986218、AGEN1181、AGEN1884(泽弗利单抗)、BMS-986249、MK-1308、REGN-4659、ADU-1604、CS-1002、BCD-145、APL-509、JS-007、BA-3071、ONC-392、AGEN-2041、JHL-1155、KN-044、CG-0161、ATOR-1144、PBI-5D3H5、FPT-155(CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308(PD-1/CTLA4)、MGD-019(PD-1/CTLA4)、KN-046(PD-1/CTLA4)、MEDI-5752(CTLA4/PD-1)、XmAb-20717(PD-1/CTLA4)和AK-104(CTLA4/PD-1)。
实施方案169：根据实施方案167所述的试剂盒，其中所述PD-L1(CD274)或PD-1(PDCD1)的蛋白质抑制剂选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、西米单抗、匹地利珠单抗、AB122(赛帕利单抗)、AMP-224、MEDI0680(AMP-514)、斯巴达珠单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、BMS-936559、CK-301、PF-06801591、BGB-A317(替雷利珠单抗)、GLS-010(WBP-3055)、AK-103(HX-008)、AK-105、CS-1003、HLX-10、MGA-012、BI-754091、AGEN-2034(巴替利单抗)、JS-001(特瑞普利单抗)、JNJ-63723283、杰诺单抗(CBT-501)、LZM-009、BCD-100、LY-3300054、SHR-1201、SHR-1210(卡瑞利珠单抗)、Sym-021、ABBV-181、PD1-PIK、BAT-1306(MSB0010718C)、CX-072、CBT-502、TSR-042(多塔利单抗)、MSB-2311、JTX-4014、BGB-A333、SHR-1316、CS-1001(WBP-3155、KN-035、IBI-308(信迪利单抗)、HLX-20、KL-A167、STI-A1014、STI-A1015(IMC-001)、BCD-135、FAZ-053、TQB-2450、MDX1105-01、FPT-155(CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308(PD-1/CTLA4)、MGD-013(PD-1/LAG-3)、FS-118(LAG-3/PD-L1)MGD-019(PD-1/CTLA4)、KN-046(PD-1/CTLA4)、MEDI-5752(CTLA4/PD-1)、RO-7121661(PD-1/TIM-3)、XmAb-20717(PD-1/CTLA4)、AK-104(CTLA4/PD-1)、M7824(PD-L1/TGFβ-EC结构域)、CA-170(PD-L1/VISTA)、CDX-527(CD27/PD-L1)、LY-3415244(TIM3/PDL1)和INBRX-105(4-1BB/PDL1)。
实施方案170：根据实施方案157至169中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂包含CD274(PDL1、PD-L1)、程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1)或CTLA4的小分子抑制剂。
实施方案171：根据实施方案170所述的试剂盒，其中所述CD274或PDCD1的小分子抑制剂选自由以下项组成的组：GS-4224、GS-4416、INCB086550和MAX10181。
实施方案172：根据实施方案170所述的试剂盒，其中所述CTLA4的小分子抑制剂包含BPI-002。
实施方案173：根据实施方案146至172中任一项所述的试剂盒，其还包含一种或多种抗病毒剂。
实施方案174：根据实施方案173所述的试剂盒，其中所述一种或多种抗病毒剂选自由以下项组成的组：HIV蛋白酶抑制剂、HIV逆转录酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV非催化位点(或变构)整合酶抑制剂、HIV进入(融合)抑制剂、HIV成熟抑制剂和衣壳抑制剂。
治疗或预防HIV的方法
实施方案175：一种用于引发有需要的受试者对人类免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用根据实施方案124至130中任一项所述的药物组合物或者根据实施方案117至121中任一项所述的免疫原性组合物。
实施方案176：一种治疗或预防有需要的受试者的人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法，其包括向所述受试者施用根据实施方案124至130中任一项所述的药物组合物、根据实施方案117至121中任一项所述的免疫原性组合物。
实施方案177：根据实施方案175至176中任一项所述的方法，其包括施用单一融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或病毒表达载体，其中所述融合多肽包含两个或更多个多价多肽片段，例如二价多肽片段。
实施方案178：根据实施方案175至176中任一项所述的方法，其中同时或并发向所述受试者施用两种或更多种融合多肽或编码所述融合多肽的两种或更多种病毒表达载体。
实施方案179：根据实施方案175至178中任一项所述的方法，其中两种或更多种融合多肽或编码所述融合多肽的两种或更多种多核苷酸或两种或更多种病毒表达载体为二价抗原组合物的形式。
实施方案180：根据实施方案175至179中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用：
1)一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：
·SEQ ID NO:70、76、94、151和161；或者
·SEQ ID NO:71、77、95、152和162；以及
2)一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：
·SEQ ID NO:188、305、28、41、294、4、176、11、319、259、282、223、213和37；
·SEQ ID NO:188、305、28、41和294；
·SEQ ID NO:4、176、11、319、259、282、223、213和37；
·SEQ ID NO:189、306、29、42、295、5、177、12、320、260、283、224、214和38；
·SEQ ID NO:189、306、29、42和295；
·SEQ ID NO:5、177、12、320、260、283、224、214和38；
·SEQ ID NO:305、319、259、282、223、213、294、176和188；
·SEQ ID NO:306、320、260、283、224、214、295、177和189；
·SEQ ID NO:305、294、223、213、176、259、319、188和282；
·SEQ ID NO:306、295、224、214、177、260、320、189和283；
·SEQ ID NO:305、294、319、259、282、223、176和188；
·SEQ ID NO:306、295、320、260、283、224、177和189；
·SEQ ID NO:305、223、294、176、259、319、188和282；或者
·SEQ ID NO:306、224、295、177、260、320、189和283。
实施方案181：根据实施方案175至180中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用：
1)一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:351-356和430中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:351-356和430中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列序列组成；以及
2)一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
实施方案182：根据实施方案175至178中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：
·SEQ ID NO:201、78、107、96、229、172、327、6、333、243、331、192、265、311、137、15、123、30、336、302、153、219、298、121、230、240、60、241、276、113、99、21、217和215；
·SEQ ID NO:78、296、1、339、197、329、232、323、303、234、90、261、274、238、211、325、137、227、209、190、341、57、225、27、210、119、19、165、334、117、153、10、97和300；或者
·SEQ ID NO:296、1、78、197、339、227、261、274、238、325、137、329、303、234、90、232、27、57、225、323、190、341、119、19、165、334、117、153、10、97和300。
实施方案183：根据实施方案175至182中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者的氨基酸序列或与345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
实施方案184：根据实施方案175至183中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用一种或多种腺病毒载体，每种腺病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
实施方案185：根据实施方案175至183中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用一种或多种病毒载体，其中每种病毒载体包含两种或更多种多核苷酸，所述多核苷酸编码两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白与以下氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或100％相同：SEQ ID NO:345和346；SEQ ID NO:347和348；SEQ ID NO:349和350；SEQ ID NO:351和352；SEQ ID NO:430和352；SEQ ID NO:357和358；SEQ ID NO:360和362；SEQ ID NO:359和361；SEQ ID NO:351和357；SEQ ID NO:351和358；SEQ ID NO:351和359；SEQ ID NO:351和360；SEQ ID NO:351和361；SEQ ID NO:351和362；SEQ ID NO:351和407；SEQ ID NO:351和408；SEQ ID NO:351和409；SEQ ID NO:351和410；SEQ ID NO:352和357；SEQ ID NO:352和358；SEQ ID NO:352和359；SEQ ID NO:352和360；SEQ ID NO:352和361；SEQ ID NO:352和362；SEQ ID NO:352和407；SEQ ID NO:352和408；SEQ ID NO:352和409；SEQ ID NO:352和410；SEQ ID NO:430和357；SEQ ID NO:430和358；SEQ ID NO:430和359；SEQ ID NO:430和360；SEQ ID NO:430和361；SEQ ID NO:430和362；SEQ ID NO:407和409；SEQ ID NO:407和408；SEQ ID NO:408和410；或者SEQ ID NO:409和410。
实施方案186：根据实施方案175至185中任一项所述的方法，其中所述受试者被HIV-1感染、疑似被HIV-1感染或者处于被HIV-1感染的风险中。
实施方案187：根据实施方案175至186中任一项所述的方法，其中所述受试者被HIV-1慢性感染。
实施方案188：根据实施方案175至187中任一项所述的方法，其中所述受试者被HIV-1急性感染。
实施方案189：根据实施方案175至188中任一项所述的方法，其中所述受试者具有Fiebig IV期或更早例如Fiebig III期、Fiebig II期或Fiebig I期的HIV-1感染。
实施方案190：根据实施方案175至189中任一项所述的方法，其中所述组合物经由选自以下项的途径施用：静脉内、肌内、皮内、皮下和粘膜(例如，颊部、鼻内、直肠内、阴道内)。
实施方案191：根据实施方案175至190中任一项所述的方法，其包括每次施用施用约103至约1015个病毒病灶形成单位(FFU)或噬菌斑形成单位(PFU)或感染单位(IU)或病毒颗粒(vp)，例如约104至约107个病毒FFU或PFU或IU或vp，例如约103至约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个病毒FFU或PFU或IU或vp。
实施方案192：根据实施方案175至191中任一项所述的方法，其包括初免-加强方案，所述初免-加强方案包括：
(i)在第一时间点施用初免组合物并在一个或多个后续时间点施用一种或多种加强组合物(例如，初免-加强-加强-加强等)；或者
(ii)一次或多次迭代在第一时间点施用初免组合物并在第二时间点施用加强组合物(例如，初免-加强-初免-加强等)。
实施方案193：根据实施方案192所述的方法，其中所述初免组合物和所述一种或多种加强组合物的施用间隔至少1周、2周、3周或1个月，例如至少2、3、4、5或6个月。
实施方案194：根据实施方案192至193中任一项所述的方法，其中所述初免组合物和所述加强组合物包含相同的免疫原性组合物。
实施方案195：根据实施方案192至193中任一项所述的方法，其中所述初免组合物和所述加强组合物包含不同的免疫原性组合物。
实施方案196：根据实施方案192至193中任一项所述的方法，其中所述初免组合物和所述加强组合物包含相同的一种或多种融合多肽和相同的多核苷酸或病毒表达载体。
实施方案197：根据实施方案192至193中任一项所述的方法，其中所述初免组合物和所述加强组合物包含不同的融合多肽和/或不同的多核苷酸或病毒表达载体。
实施方案198：根据实施方案197所述的方法，其包括用第一多核苷酸或病毒表达载体初免，并用第二多核苷酸或病毒表达载体加强。
实施方案199：根据实施方案192至198中任一项所述的方法，其中所述初免-加强方案包括：
a)用病毒表达载体初免并用多核苷酸加强，其中所述多核苷酸是DNA、cDNA、mRNA或自复制RNA；
b)用多核苷酸初免，其中所述多核苷酸是DNA、cDNA、mRNA或自复制RNA，并用病毒表达载体加强；
c)用第一病毒表达载体初免并用第二病毒表达载体加强，其中所述第一病毒表达载体和所述第二病毒表达载体来自相同、相关或不相关的分类学家族；
d)用第一复制不足型病毒表达载体初免并用第二复制不足型病毒表达载体加强，其中所述第一复制不足型病毒表达载体和所述第二复制不足型病毒表达载体来自相同、相关或不相关的分类学家族；
e)用第一减弱不足型病毒表达载体初免并用第二复制减弱型病毒表达载体加强，其中所述第一复制减弱型病毒表达载体和所述第二复制减弱型病毒表达载体来自相同、相关或不相关的分类学家族；
f)用复制不足型病毒表达载体初免并用复制减弱型病毒表达载体加强；
g)用复制减弱型病毒表达载体初免并用复制不足型病毒表达载体加强；
h)用淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)病毒表达载体初免并用皮秦德哺乳动物沙粒病毒病毒表达载体加强；
i)用皮秦德哺乳动物沙粒病毒病毒表达载体初免并用淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)病毒表达载体加强；
j)用沙粒病毒病毒表达载体初免并用腺病毒病毒表达载体加强；或者
k)用腺病毒病毒表达载体初免并用沙粒病毒病毒表达载体加强。
实施方案200：根据实施方案175至199中任一项所述的方法，其中所述受试者未接受抗逆转录病毒治疗(ART)，或者在施用所述一种或多种组合物之前中断ART。
实施方案201：根据实施方案175至200中任一项所述的方法，其中在一次或多次施用所述组合物之后中断ART。
实施方案202：根据实施方案175至201中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用一种或多种附加治疗剂，例如两种、三种、四种或更多种附加治疗剂。
实施方案203：根据实施方案202所述的方法，其包括共同施用一种或多种活化潜伏性HIV的药剂，例如一种或多种潜伏期逆转剂(LRA)。
实施方案204：根据实施方案202至203中任一项所述的方法，其中所述一种或多种LRA选自由以下项组成的组：一种或多种toll样受体(TLR)的激动剂或活化剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、蛋白激酶C(PKC)活化剂、Smyd2抑制剂、BET-溴结构域4(BRD4)抑制剂、离子霉素、凋亡蛋白抑制剂(IAP)拮抗剂以及胱天蛋白酶(SMAC)第二线粒体衍生的活化剂模拟物。
实施方案205：根据实施方案202至204中任一项所述的方法，其包括共同施用一种或多种toll样受体(TLR)的一种或多种激动剂或活化剂。
实施方案206：根据实施方案205所述的方法，其中所述TLR激动剂或活化剂选自由以下项组成的组：TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂。
实施方案207：根据实施方案205至206中任一项所述的方法，其中所述TLR7激动剂选自由以下项组成的组：GS 9620(维沙莫特)、R848(瑞喹莫特)、DS-0509、LHC-165和TMX-101(咪喹莫特)，并且/或者其中所述TLR8激动剂选自由以下项组成的组：GS-9688、R848(瑞喹莫特)、CV8102(双TLR7/TLR8激动剂)和NKTR-262(双TLR7/TLR8激动剂)。
实施方案208：根据实施方案202至207中任一项所述的方法，其包括共同施用选自以下项的白介素的一种或多种白介素受体激动剂：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF和FLT3LG。
实施方案209：根据实施方案208所述的方法，其包括共同施用选自由以下项组成的组的一种或多种细胞因子：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、FLT3LG以及它们的组合和功能变体。
实施方案210：根据实施方案202至209中任一项所述的方法，其包括共同施用一种或多种先天性免疫活化剂。
实施方案211：根据实施方案210所述的方法，其中所述一种或多种先天性免疫活化剂包括非编码免疫刺激性多核苷酸(例如，病原体活化的分子模式(PAMP)、胞嘧啶-磷酸-鸟苷(CpG)寡聚脱氧核苷酸和免疫刺激性RNA(isRNA，例如CV8102))、选自由以下项组成的组的受体的激动剂：fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)、干扰素基因刺激剂(STING)受体、DExD/H-盒解旋酶58(DDX58；又名RIG-I)、含核苷酸结合寡聚结构域2(NOD2)。
实施方案212：根据实施方案202至211中任一项所述的方法，其包括共同施用抑制性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种拮抗剂或抑制剂和/或刺激性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种活化剂或激动剂。
实施方案213：根据实施方案212所述的方法，其中所述一种或多种免疫检查点蛋白或受体选自由以下项组成的组：CD27、CD70；CD40、CD40LG；CD47、CD48(SLAMF2)、含跨膜和免疫球蛋白结构域2(TMIGD2、CD28H)、CD84(LY9B、SLAMF5)、CD96、CD160、MS4A1(CD20)、CD244(SLAMF4)；CD276(B7H3)；含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1、B7H4)；V-set免疫调节受体(VSIR、B7H5、VISTA)；免疫球蛋白超家族成员11(IGSF11、VSIG3)；自然杀伤细胞细胞毒性受体3配体1(NCR3LG1、B7H6)；HERV-H LTR相关2(HHLA2、B7H7)；诱导型T细胞共刺激因子(ICOS、CD278)；诱导型T细胞共刺激因子配体(ICOSLG、B7H2)；TNF受体超家族成员4(TNFRSF4、OX40)；TNF超家族成员4(TNFSF4、OX40L)；TNFRSF8(CD30)、TNFSF8(CD30L)；TNFRSF10A(CD261、DR4、TRAILR1)、TNFRSF9(CD137)、TNFSF9(CD137L)；TNFRSF10B(CD262、DR5、TRAILR2)、TNFRSF10(TRAIL)；TNFRSF14(HVEM、CD270)、TNFSF14(HVEML)；CD272(B和T淋巴细胞相关(BTLA))；TNFRSF17(BCMA、CD269)、TNFSF13B(BAFF)；TNFRSF18(GITR)、TNFSF18(GITRL)；MHC I类多肽相关序列A(MICA)；MHC I类多肽相关序列B(MICB)；CD274(CD274、PDL1、PD-L1)；程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4、CD152)；CD80(B7-1)、CD28；nectin细胞粘附分子2(NECTIN2、CD112)；CD226(DNAM-1)；脊髓灰质炎病毒受体(PVR)细胞粘附分子(PVR、CD155)；含PVR相关免疫球蛋白结构域(PVRIG、CD112R)；具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域4(TIMD4；TIM4)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2、TIMD3、TIM3)；半乳凝素9(LGALS9)；淋巴细胞活化3(LAG3、CD223)；信号转导淋巴细胞活化分子家族成员1(SLAMF1、SLAM、CD150)；淋巴细胞抗原9(LY9、CD229、SLAMF3)；SLAM家族成员6(SLAMF6、CD352)；SLAM家族成员7(SLAMF7、CD319)；UL16结合蛋白1(ULBP1)；UL16结合蛋白2(ULBP2)；UL16结合蛋白3(ULBP3)；视黄酸早期转录物1E(RAET1E；ULBP4)；视黄酸早期转录物1G(RAET1G；ULBP5)；视黄酸早期转录物1L(RAET1L；ULBP6)；淋巴细胞活化3(CD223)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞凝集素样受体C1(KLRC1、NKG2A、CD159A)；杀伤细胞凝集素样受体K1(KLRK1、NKG2D、CD314)；杀伤细胞凝集素样受体C2(KLRC2、CD159c、NKG2C)；杀伤细胞凝集素样受体C3(KLRC3、NKG2E)；杀伤细胞凝集素样受体C4(KLRC4、NKG2F)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)；杀伤细胞凝集素样受体D1(KLRD1)；以及SLAM家族成员7(SLAMF7)。
实施方案214：根据实施方案212至213中任一项所述的方法，其包括共同施用一种或多种T细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种阻断剂、拮抗剂或抑制剂。
实施方案215：根据实施方案214所述的方法，其中所述T细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体选自由以下项组成的组：CD274(CD274、PDL1、PD-L1)；程序性细胞死亡1配体2(PDCD1LG2、PD-L2、CD273)；程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4、CD152)；CD276(B7H3)；含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1、B7H4)；V-set免疫调节受体(VSIR、B7H5、VISTA)；免疫球蛋白超家族成员11(IGSF11、VSIG3)；TNFRSF14(HVEM、CD270)、TNFSF14(HVEML)；CD272(B和T淋巴细胞相关(BTLA))；含PVR相关免疫球蛋白结构域(PVRIG、CD112R)；具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；淋巴细胞活化3(LAG3、CD223)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2、TIMD3、TIM3)；半乳凝素9(LGALS9)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；以及杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)。
实施方案216：根据实施方案212至213中任一项所述的方法，其包括共同施用一种或多种T细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种激动剂或活化剂。
实施方案217：根据实施方案216所述的方法，其中所述T细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体选自由以下项组成的组：CD27、CD70；CD40、CD40LG；诱导型T细胞共刺激因子(ICOS、CD278)；诱导型T细胞共刺激因子配体(ICOSLG、B7H2)；TNF受体超家族成员4(TNFRSF4、OX40)；TNF超家族成员4(TNFSF4、OX40L)；TNFRSF9(CD137)、TNFSF9(CD137L)；TNFRSF18(GITR)、TNFSF18(GITRL)；CD80(B7-1)、CD28；nectin细胞粘附分子2(NECTIN2、CD112)；CD226(DNAM-1)；脊髓灰质炎病毒受体(PVR)细胞粘附分子(PVR、CD155)。
实施方案218：根据实施方案212至213中任一项所述的方法，其包括共同施用一种或多种NK细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种阻断剂、拮抗剂或抑制剂。
实施方案219：根据实施方案218所述的方法，其中所述NK细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体选自由以下项组成的组：杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)；杀伤细胞凝集素样受体C1(KLRC1、NKG2A、CD159A)；以及杀伤细胞凝集素样受体D1(KLRD1、CD94)。
实施方案220：根据实施方案212至213中任一项所述的方法，其包括共同施用一种或多种NK细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种激动剂或活化剂。
实施方案221：根据实施方案220所述的方法，其中所述NK细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体选自CD16、CD226(DNAM-1)；杀伤细胞凝集素样受体K1(KLRK1、NKG2D、CD314)；以及SLAM家族成员7(SLAMF7)。
实施方案222：根据实施方案212至215中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂包含PD-L1(CD274)、PD-1(PDCD1)或CTLA4的蛋白质抑制剂。
实施方案223：根据实施方案222所述的方法，其中所述CTLA4的蛋白质抑制剂选自由以下项组成的组：伊匹单抗、曲美木单抗、BMS-986218、AGEN1181、AGEN1884(泽弗利单抗)、BMS-986249、MK-1308、REGN-4659、ADU-1604、CS-1002、BCD-145、APL-509、JS-007、BA-3071、ONC-392、AGEN-2041、JHL-1155、KN-044、CG-0161、ATOR-1144、PBI-5D3H5、FPT-155(CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308(PD-1/CTLA4)、MGD-019(PD-1/CTLA4)、KN-046(PD-1/CTLA4)、MEDI-5752(CTLA4/PD-1)、XmAb-20717(PD-1/CTLA4)和AK-104(CTLA4/PD-1)。
实施方案224：根据实施方案222所述的方法，其中所述PD-L1(CD274)或PD-1(PDCD1)的蛋白质抑制剂选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、西米单抗、匹地利珠单抗、AB122(赛帕利单抗)、AMP-224、MEDI0680(AMP-514)、斯巴达珠单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、BMS-936559、CK-301、PF-06801591、BGB-A317(替雷利珠单抗)、GLS-010(WBP-3055)、AK-103(HX-008)、AK-105、CS-1003、HLX-10、MGA-012、BI-754091、AGEN-2034(巴替利单抗)、JS-001(特瑞普利单抗)、JNJ-63723283、杰诺单抗(CBT-501)、LZM-009、BCD-100、LY-3300054、SHR-1201、SHR-1210(卡瑞利珠单抗)、Sym-021、ABBV-181、PD1-PIK、BAT-1306(MSB0010718C)、CX-072、CBT-502、TSR-042(多塔利单抗)、MSB-2311、JTX-4014、BGB-A333、SHR-1316、CS-1001(WBP-3155、KN-035、IBI-308(信迪利单抗)、HLX-20、KL-A167、STI-A1014、STI-A1015(IMC-001)、BCD-135、FAZ-053、TQB-2450、MDX1105-01、FPT-155(CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308(PD-1/CTLA4)、MGD-013(PD-1/LAG-3)、FS-118(LAG-3/PD-L1)MGD-019(PD-1/CTLA4)、KN-046(PD-1/CTLA4)、MEDI-5752(CTLA4/PD-1)、RO-7121661(PD-1/TIM-3)、XmAb-20717(PD-1/CTLA4)、AK-104(CTLA4/PD-1)、M7824(PD-L1/TGFβ-EC结构域)、CA-170(PD-L1/VISTA)、CDX-527(CD27/PD-L1)、LY-3415244(TIM3/PDL1)和INBRX-105(4-1BB/PDL1)。
实施方案225：根据实施方案212至215中任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂包含CD274(PDL1、PD-L1)、程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1)或CTLA4的小分子抑制剂。
实施方案226：根据实施方案225所述的方法，其中所述CD274或PDCD1的小分子抑制剂选自由以下项组成的组：GS-4224、GS-4416、INCB086550和MAX10181。
实施方案227：根据实施方案225所述的方法，其中所述CTLA4的小分子抑制剂包含BPI-002。
实施方案228：根据实施方案202至227中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用一种或多种抗病毒剂。
实施方案229：根据实施方案228所述的方法，其中所述一种或多种抗病毒剂选自由以下项组成的组：HIV蛋白酶抑制剂、HIV逆转录酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV非催化位点(或变构)整合酶抑制剂、HIV进入(融合)抑制剂、HIV成熟抑制剂和衣壳抑制剂。
实施方案230：根据实施方案202至229中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用一种或多种抗HIV抗体或其抗原结合片段。
实施方案231：根据实施方案230所述的方法，其中所述一种或多种抗HIV抗体或其抗原结合片段与HIV gp120结合。
实施方案232：根据实施方案230至231中任一项所述的方法，其中所述抗HIV抗体或其抗原结合片段包含广谱中和抗体。
实施方案233：根据实施方案230至232中任一项所述的方法，其中结合、抑制和/或中和HIV的一种或多种抗HIV抗体或其抗原结合片段与抗HIV的广谱中和抗体(bNAb)的VH和VL可变结构域竞争或者包含这些可变结构域。
实施方案234：根据实施方案230至233中任一项所述的方法，其中结合、抑制和/或中和HIV的一种或多种抗HIV抗体或其抗原结合片段与选自由以下项组成的组的gp120的表位或区域结合：
i.第三可变环(V3)和/或包含N332寡甘露糖聚糖的高甘露糖补丁；
ii.CD4结合位点(CD4bs)；
iii.第二可变环(V2)和/或Env三聚体顶点；
iv.gp120/gp41交界面；或者
v.gp120的沉默面。
实施方案235：根据实施方案230至234中任一项所述的方法，其中结合、抑制和/或中和HIV的所述抗体或其抗原结合片段与所述第三可变环(V3)和/或包含N332寡甘露糖聚糖的高甘露糖补丁中的gp120的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：GS-9722、PGT-121、PGT-122、PGT-123、PGT-124、PGT-125、PGT-126、PGT-128、PGT-130、PGT-133、PGT-134、PGT-135、PGT-136、PGT-137、PGT-138、PGT-139、10-1074、VRC24、2G12、BG18、354BG8、354BG18、354BG42、354BG33、354BG129、354BG188、354BG411、354BG426、DH270.1、DH270.6、PGDM12、VRC41.01、PGDM21、PCDN-33A、BF520.1和VRC29.03。
实施方案236：根据实施方案230至235中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与所述CD4结合位点(CD4bs)中的gp120的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：b12、F105、VRC01、VRC07、VRC07-523、VRC03、VRC06、VRC06b01、VRC08、VRC0801、NIH45-46、GS-9723、3BNC117、3BNC60、VRC-PG04、PGV04；CH103、44-VRC13.01、1NC9、12A12、N6、N49-P7、NC-Cow1、IOMA、CH235和CH235.12、N49P6、N49P7、N49P11、N49P9和N60P25。
实施方案237：根据实施方案230至236中任一项所述的方法，其中结合、抑制和/或中和HIV的所述抗体或其抗原结合片段与所述第二可变环(V2)和/或Env三聚体顶点中的gp120的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：PG9、PG16、PGC14、PGG14、PGT-142、PGT-143、PGT-144、PGT-145、CH01、CH59、PGDM1400、CAP256、CAP256-VRC26.08、CAP256-VRC26.09、CAP256-VRC26.25、PCT64-24E和VRC38.01。
实施方案238：根据实施方案230至237中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段与所述gp120/gp41交界面中的gp120的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：PGT-151、CAP248-2B、35O22、8ANC195、ACS202、VRC34和VRC34.01。
实施方案239：根据实施方案230至238中任一项所述的方法，其中结合、抑制和/或中和HIV的所述抗体或其抗原结合片段与所述gp120沉默面的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：VRC-PG05和SF12。
实施方案240：根据实施方案230至239中任一项所述的方法，其中结合、抑制和/或中和HIV的所述抗体或其抗原结合片段与所述膜近侧区域(MPER)中的gp41的表位或区域结合。
实施方案241：根据实施方案230至240中任一项所述的方法，其中结合、抑制和/或中和HIV的所述抗体或其抗原结合片段与所述膜近侧区域(MPER)中的gp41的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：10E8、10E8v4、10E8-5R-100cF、4E10、DH511.11P、2F5、7b2和LN01。
实施方案242：根据实施方案230至241中任一项所述的方法，其中结合、抑制和/或中和HIV的所述抗体或其抗原结合片段与所述gp41融合肽的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：VRC34和ACS202。
实施方案243：根据实施方案175至242中任一项所述的方法，其中在任选地与一种或多种附加治疗剂组合一次或多次施用所述组合物中的一种或多种之后，所述受试者在没有抗逆转录病毒治疗(ART)的情况下至少6个月、至少1年、至少2年、至少3年或更长时间未表现出HIV或AIDS的症状。
实施方案244：根据实施方案175至243中任一项所述的方法，其中在任选地与一种或多种附加治疗剂组合一次或多次施用所述组合物中的一种或多种之后，所述受试者在没有抗逆转录病毒治疗(ART)的情况下至少6个月、至少1年、至少2年、至少3年或更长时间具有小于500例如小于400、小于300、小于200、小于100、小于50的病毒载量拷贝/ml血液。
免疫原设计的方法
实施方案245：一种设计能够引发对一种或多种病毒靶抗原的免疫应答的融合多肽的方法，所述方法包括：
a)计算机鉴定由病毒基因编码的多肽序列群体中的一个或多个序列保守区，所述群体来自患者间病毒群体；以及
b)计算机鉴定来自在步骤a)中鉴定的所述一个或多个保守区的两个最普遍的多肽序列，并由所述保守区产生多价多肽片段。
实施方案246：根据实施方案245所述的方法，其中所述多价多肽片段是二价多肽片段。
实施方案247：根据实施方案245至246中任一项所述的方法，其还包括步骤c)：将所述多肽片段排列成一个或多个连续融合多肽，使得连接所述多肽片段的连接部减少或避免产生能够例如以小于约1000nM的预测结合亲和力IC50值结合人MHC I类或人MHC II类分子或百分位等级在多肽片段群体中的前5％内的表位。
实施方案248：根据实施方案245至247中任一项所述的方法，其还包括在预测产生能够结合人MHC I类或人MHC II类分子的表位的多肽片段连接部之间插入接头的步骤。
实施方案249：根据实施方案245至248中任一项所述的方法，其包括在步骤b)之后和在步骤c)之前的以下步骤：
d)在步骤a)中鉴定的所述一个或多个序列保守区内，计算机鉴定预测以小于约1000nM的IC50值与人MHC I类分子结合或百分位等级在多肽片段群体中的前5％内的多肽片段；以及
e)生成包含在步骤a)中鉴定的所述一个或多个序列保守区的多肽片段，并且预测所述多肽片段以小于约1000nM的IC50值与人MHC I类分子结合或百分位等级在多肽片段群体中的前5％内。
实施方案250：根据实施方案245至249中任一项所述的方法，其还包括在步骤b)之后且在步骤c)之前减少或消除与人类蛋白具有至少55％(9个氨基酸残基中的5个)、例如至少65％(9个氨基酸残基中的6个)、例如至少75％(9个氨基酸残基中的7个)、例如至少85％(9个氨基酸残基中的8个)氨基酸序列同一性的病毒多肽9聚体的步骤。
实施方案251：根据实施方案245至250中任一项所述的方法，其还包括在步骤b)之后且在步骤c)之前提供已知或预测例如以小于约1000nM的预测结合亲和力IC50值结合人MHC II类分子或百分位等级在多肽片段群体中的前5％内的一种或多种多肽片段的步骤。
实施方案252：根据实施方案245至251中任一项所述的方法，其还包括在步骤b)之后且在步骤c)之前在步骤a)中鉴定的所述一个或多个序列保守区内鉴定由所述病毒基因编码的多肽序列的第二群体中的序列方差的步骤，所述第二群体来自患者内病毒群体。
实施方案253：根据实施方案252所述的方法，其中来自所述患者内病毒群体的所述序列方差通过深度测序或下一代测序来确定。
实施方案254：一种设计能够引发对一种或多种病毒靶抗原的免疫应答的融合多肽的方法，所述方法包括：
a)计算机鉴定由病毒基因编码的第一多肽序列群体中的一个或多个序列保守区，所述第一群体来自患者间病毒群体；
b)计算机鉴定来自在步骤a)中鉴定的所述一个或多个保守区的两个最普遍的多肽序列；
c)在步骤a)中鉴定的所述一个或多个序列保守区内，计算机鉴定预测以小于约1000nM的IC50值与人MHC I类分子结合或百分位等级在多肽片段群体中的前5％内的多肽片段；
d)生成包含在步骤a)中鉴定的一个或多个序列保守区的多肽片段，并且预测所述多肽片段以小于约1000nM的IC50值与人MHC I类分子结合或百分位等级在多肽片段群中的前5％内；
e)去除在步骤d)中生成的被确定为与人类蛋白具有至少55％(9个氨基酸残基中的5个)、例如至少65％(9个氨基酸残基中的6个)、例如至少75％(9个氨基酸残基中的7个)、例如至少85％(9个氨基酸残基中的8个)氨基酸序列同一性的病毒多肽9聚体，从而产生保留的病毒多肽片段；以及
f)将所述保留的多肽片段排列成一个或多个连续融合多肽，使得连接所述多肽片段的连接部避免或减少产生能够例如以小于约1000nM的预测结合亲和力IC50值结合人MHCI类或人MHC II类分子或百分位等级在多肽片段群体中的前5％内的表位。
实施方案255：一种设计能够引发对一种或多种病毒靶抗原的免疫应答的融合多肽的方法，所述方法包括：
a)计算机鉴定由病毒基因编码的第一多肽序列群体中的一个或多个序列保守区，所述第一群体来自患者间病毒群体；
b)任选地，计算机鉴定来自在步骤a)中鉴定的所述一个或多个保守区的两个最普遍的多肽序列；
c)在步骤a)中鉴定的所述一个或多个序列保守区内，鉴定由所述病毒基因编码的多肽序列的第二群体的序列方差，所述第二群体来自所述患者内病毒群体；
d)在步骤a)中鉴定的所述一个或多个序列保守区内，计算机鉴定预测以小于约1000nM的IC50值与人MHC I类分子结合或百分位等级在多肽片段群体中的前5％内的多肽片段；
e)生成包含在步骤a)中鉴定的所述一个或多个序列保守区的多肽片段，并且预测所述多肽片段以小于约1000nM的IC50值与人MHC I类分子结合或百分位等级在多肽片段群体中的前5％内；
f)去除在步骤e)中生成的被确定为与人类蛋白具有至少55％(9个氨基酸残基中的5个)、例如至少65％(9个氨基酸残基中的6个)、例如至少75％(9个氨基酸残基中的7个)、例如至少85％(9个氨基酸残基中的8个)氨基酸序列同一性的病毒多肽9聚体，从而产生保留的病毒多肽片段；
g)将所述保留的多肽片段排列成一个或多个连续融合多肽，使得连接所述多肽片段的连接部避免或减少产生能够例如以小于约1000nM的预测结合亲和力IC50值结合人MHCI类或人MHC II类分子或百分位等级在多肽片段群体中的前5％内的表位。
实施方案256：根据实施方案255所述的方法，其中来自所述患者内病毒群体的所述序列方差通过深度测序或下一代测序来确定。
实施方案257：根据实施方案254至256中任一项所述的方法，其还包括并入已知或预测例如以小于约1000nM的预测结合亲和力IC50值结合人MHC II类分子或百分位等级在多肽片段群体中的前5％内的一种或多种多肽片段的步骤。
实施方案258：根据实施方案254至257中任一项所述的方法，其还包括在多肽片段之间在预测产生能够结合人MHC I类或人MHC II类分子的表位的连接部处插入接头的步骤。
实施方案259：一种用于产生多价抗原的方法，所述方法包括通过包括以下步骤的方法计算机构建病毒蛋白质组序列群体的结构保守区内的一组多价氨基酸序列：
(a)比对所述病毒蛋白质组序列群体；
(b)对于所述比对中的每个序列，产生一组从N末端氨基酸开始的9个氨基酸子序列(“9聚体”)，每个子序列与前面的子序列重叠八个氨基酸，使得所述比对中每个长度为l的序列含有(l-8)个9聚体；
(c)计算在所述比对的每个序列中从位置i开始的每个独特9聚体的频率，并鉴定每个位置处的所述两个或更多个最常见的独特9聚体；(c)(1)其中频率计算为所述独特9聚体在所述比对中在位置i出现的次数除以所述比对中的序列总数；
(d)通过将所述比对中含有所述两个或更多个最常见的独特9聚体中任一个的序列的比例相加来计算每个位置的二价保守性；
(e)通过提取所述比对中具有大于80％或大于90％的多价保守性的序列来产生保守区的比对；
(f)确定所述保守区的比对中每个位置处每对独特9聚体的频率；
(g)将9聚体对连接在所述保守区的比对的相邻位置，这些位置共享八个氨基酸的重叠；
(h)产生有向无环图，其中每个9聚体对是一个节点，相邻节点之间的边由所述相邻位置中连接的所述9聚体对形成，每条边的权重等于下游9聚体对的频率，
·添加源节点并将其与第一个位置的所有节点连接，
·添加宿节点并将其与最后一个位置的所有节点连接，并且
·将所有权重取反；
(i)在所述有向无环图中找到从所述源节点到所述宿节点的最佳路径，其中所述最佳路径是根据所述有向无环图中所有9聚体对的频率之和来定义的；
(j)如果所述最佳二价9聚体路径内相邻位置的两个或更多个9聚体共享八个氨基酸的重叠，则通过连接它们来构建多价抗原，从而产生连接的9聚体的两个或更多个序列，它们一起形成所述多价抗原；以及
(k)任选地，重新排列所述多肽片段以减少或避免在多肽片段之间的连接部处产生有害表位。
实施方案260：根据实施方案259所述的方法，其中所述多价保守性是二价保守性，并且其中所述多价抗原是二价抗原。
实施方案261：根据实施方案259至260中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，通过执行以下步骤中的一个或多个进一步限定所述保守区：
(i)去除长度少于35个氨基酸(例如，长度为9个氨基酸至10、15、20、25、30或35个氨基酸)的片段；
(ii)去除被确定为具有小于90％多价(例如，二价)保守性的片段；
(iii)去除被确定为弱免疫原性或非免疫原性(例如，如体外或体内所证明)的片段；以及/或者
(iv)包括被确定为免疫原性(例如，如体外或体内所证明)的另外的片段。
实施方案262：根据实施方案259至261中任一项所述的方法，其中重新排列所述肽片段以减少或避免产生有害表位的步骤是通过包括计算机HLA结合分析和人类蛋白质组交叉识别分析中的一种或多种的方法进行的。
实施方案263：根据实施方案259至262中任一项所述的方法，其还包括在一个或多个相邻片段之间插入接头序列。
实施方案264：根据实施方案259至263中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过去除以小于约1000nM的预测IC50值与特定HLA等位基因结合或百分位等级在多肽片段群体中的前5％内的连接9聚体来改进在步骤(h)中产生的所述多价(例如二价)抗原。
实施方案265：根据实施方案259至264中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过去除与人类肽具有至少55％(9个氨基酸残基中的5个)、例如至少65％(9个氨基酸残基中的6个)、例如至少75％(9个氨基酸残基中的7个)、例如至少85％(9个氨基酸残基中的8个)氨基酸序列同一性或与人类蛋白具有相同的面向T细胞受体(TCR)的残基的9聚体来改进在步骤(h)中产生的所述多价(例如二价)抗原。
实施方案266：根据实施方案259至265中任一项所述的方法，其还包括改进在步骤(h)中产生的所述多价(例如二价)抗原以产生足够的T细胞表位来覆盖患者内病毒多样性，所述方法还包括以下步骤：
a)鉴定从受试者获得的生物样品内的病毒准物种变体；以及
b)通过包括以下步骤的方法从在步骤(h)中产生的所述多价(例如二价)抗原的序列中确定患者内氨基酸变体：
(i)在所述多价(例如二价)抗原中的每个9聚体位置处，从完全覆盖所述位置的所述多个测序读段中确定对应的9聚体子序列；
(ii)提取9聚体子序列；以及
(iii)将所提取的9聚体子序列与所述多价(例如二价)抗原的所述序列进行比对并确定任何错配的存在。
实施方案267：根据实施方案266所述的方法，其中所述病毒准物种通过包括以下步骤的方法来鉴定：对所述病毒DNA进行测序，组装多个测序读数以产生受试者共有序列；将所述多个读段中的每个读段与所述受试者共有序列进行比对；将所述受试者的所述比对读段映射到参考序列以获得序列坐标。
实施方案268：根据实施方案266至267中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自血液、外周血单核细胞(PBMC)、血清、血浆、精子或淋巴结。
实施方案269：根据实施方案266至268中任一项所述的方法，其中所述受试者被HIV-1急性感染。
实施方案270：根据实施方案266至269中任一项所述的方法，其中所述受试者具有Fiebig IV期或更早例如Fiebig III期、Fiebig II期或Fiebig I期的HIV-1感染。
实施方案271：根据实施方案266至268中任一项所述的方法，其中所述受试者被HIV-1慢性感染。
实施方案272：根据实施方案266至271中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受抗逆转录病毒疗法(ART)。
实施方案273：根据实施方案266至271中任一项所述的方法，其中所述受试者尚未接受抗逆转录病毒疗法(ART)。
实施方案274：根据实施方案266至273中任一项所述的方法，其还包括排除具有预先存在的逃逸变体的序列。
实施方案275：根据实施方案259至274中任一项所述的方法，其还包括重新排列所述多肽片段以减少或避免在多肽片段之间的连接部处产生有害表位。
实施方案276：根据实施方案275所述的方法，其中重新排列所述肽片段以减少或避免产生有害表位的步骤是通过包括计算机HLA结合分析和人类蛋白质组交叉识别分析中的一种或多种的方法进行的。
实施方案277：根据实施方案245至276中任一项所述的方法，其中所述一种或多种病毒靶抗原来自哺乳动物病毒，例如人类病毒。
实施方案278：根据实施方案245至277中任一项所述的方法，其中所述一种或多种病毒靶抗原来自选自由以下项组成的组的病毒：人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)、埃博拉病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病病毒。
实施方案279：根据实施方案245至278中任一项所述的方法，其中所述患者间病毒群体来自未接受抗逆转录病毒疗法(ART)的患者群体。
实施方案280：根据实施方案245至278中任一项所述的方法，其中所述患者间病毒群体来自已接受抗逆转录病毒疗法(ART)的患者群体。
实施方案281：根据实施方案252至280中任一项所述的方法，其中所述患者间病毒群体来自尚未接受抗逆转录病毒疗法(ART)的患者。
实施方案282：根据实施方案252至280中任一项所述的方法，其中所述患者内病毒群体来自已接受抗逆转录病毒疗法(ART)的患者。
实施方案283：一种根据实施方案245至282中任一项所述的方法制备的融合多肽，其中所述融合多肽引发哺乳动物例如人对病毒的免疫应答。
附图说明
图1示出了用于设计融合多肽以引发抗病毒应答的8步工作流程。
图2示出了基于群体的疫苗构建方法的代表性方法。
图3示出了如本文所述的保守步行分析(CWA)算法的步骤。
图4A-4B：图4A示出了可以如何基于群体中所有考虑的病毒序列中两个最常见的9聚体的流行率来确定“二价保守性”。图4A按出现的顺序分别在上图中公开了SEQ ID NO475-476、476-477、476、476、478-479和479-480。图4A还在下图中公开了“QNLQGQMVH”为SEQID NO:481、“QNIQGQMVH”为SEQ ID NO:482和“PNIQGQMVH”为SEQ ID NO:483。图4B示出了如何基于9聚体位置中的“二价保守性”分布来鉴定保守区。HIV-1Gag p24用作代表性蛋白质。
图5A-5C：图5A示出了从比对的天然序列中提取的独特9聚体。图5B示出了基于9聚体对节点以及它们连接部构建的有向无环图。图5C示出了如何连接连接的9聚体对中的9聚体。当连接有两种选择时，最终连接由每个连接在天然存在的序列中的流行率决定。图5A-5C公开了“IIIIIIIIR”为SEQ ID NO:467、“GIIIIIIIIH”为SEQ ID NO:473、“AIIIIIIIIK”为SEQ ID NO:474、“GIIIIIIIIR”为SEQ ID NO:484、“GIIIIIIII”为SEQ ID NO:485、“AIIIIIIII”为SEQ ID NO:486、“IIIIIIIIK”为SEQ ID NO:487和“IIIIIIIIH”为SEQ IDNO:488。
图6示出了患者间和患者内多样性病毒序列分析。图6按出现的顺序分别在第一列公开了SEQ ID NO:475-476、476-477、476、476、478-479、479-480和489，在第二列中公开了SEQ ID NO:475、490、490、490、490、475、475、475、475、475、475、489和491。
图7示出了HIV-1蛋白的患者内多样性分析。二价疫苗序列在高度保守区中21-48％的位置处与准物种错配。
图8示出了人类蛋白质组交叉识别分析的结果。图8按出现的顺序分别公开了“HIV肽”序列为SEQ ID NO:492和“人类蛋白9聚体”序列为SEQ ID NO:493-498和493。
图9示出了多肽片段排列分析可以如何减少或消除连接区中有害或不希望的表位的可能呈现。
图10A-10B示出了一组HLA限制性9聚体选自二价构建体并组合形成HLA限制性疫苗构建体的方法。图10A示出了实施例3中所述的“短肽”方法的基本方法。图10B示出了实施例3中所述的“长肽”方法的基本方法。
图11示出了将鉴定的保守病毒蛋白区与MHC I类分子(包括泛等位基因(例如，HLA超型：A01、A02、A03、A24、B07、B08、B27、B44、B58、B62)和特定等位基因(例如，作为代表性人类MHC一类等位基因的A*0201))结合的考虑因素分析。
图12A-12B：图12A示出了将保守区位置分类为四类的方法。可以通过结合深度测序分析和MHC I类结合数据来改进抗病毒疫苗设计方法。图12A按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO:499-501、121、502-505、499-501、121和502-510。图12B示出了通过将深度测序分析和MHC I类结合数据结合到患者内序列分析中来改进当前抗病毒疫苗设计方法的方法。
图13示出了包括深度测序数据和患者HLA数据分析以形成个体化疫苗构建体的方法。
图14示出了包括深度测序数据分析以进一步改进实施例3中所述的HLA限制性疫苗构建体的方法。
图15示出了考虑患者间和患者内病毒序列多样性和宿主MHC I类和II类分子结合和T细胞识别的合理抗病毒免疫原设计方法。该方法和所得免疫原在本文中通过引发对HIV-1的人免疫应答的免疫原例示。
图16示出了在本文所述的融合多肽构建体中使用的由HIV-1Env基因编码的多肽片段。Env HIV-1HXB2参考多肽(SEQ ID NO:403)序列用下划线标记。图16还按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO:1、10、4、15、6、19、21、27-28、30、37、511、512和60。
图17示出了在本文所述的融合多肽构建体中使用的由HIV-1Gag基因编码的多肽片段。Gag HIV-1HXB2参考多肽(SEQ ID NO:404)序列用下划线标记。图17还按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO:70、76、78、87、94、96-97、99、339、107、341、117、113、119、121、123和137。
图18示出了在本文所述的融合多肽构建体中使用的由HIV-1Nef基因编码的多肽片段。在位置124处具有色氨酸(W)的Nef HIV-1HXB2参考多肽(SEQ ID NO:405)序列用下划线标记。图18还按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO:151、513、153、514、165、515和172。
图19A-19C示出了在本文所述的融合多肽构建体中使用的由HIV-1Pol基因编码的多肽片段。Pol HIV-1HXB2参考多肽(SEQ ID NO:406)序列用下划线标记。图19A-19C还按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO:176、188、181、190、192、516、209、517、197、210、201、211、213、518、217、219、223、222、225、227、229-230、232、234、236、238、240-241、243、259、261、265、274、282、276、294、296、300、298、302-303、305、519、311、319、322-323、334、325、336、329、327、331和333。
图20示出了用于在该示例中在CMV启动子的控制下在腺病毒表达载体中表达融合多肽的修饰的疫苗表达盒。为了确定组合保守区的方法，构建候选病毒载体疫苗以表达计算定义的保守区的多肽片段，并且将这些区组合为(A)融合多肽构建体(SEQ ID NO:345/346)；(B)含F2A蛋白水解切割位点的加工间隔子(SEQ ID NO:349/350)；(C)柔性接头(例如，AAA(SEQ ID NO:378)(SEQ ID NO:347/348)；(D)仅具有p17和p24保守区的融合多肽；(E)仅具有蛋白酶、RT、整合酶保守区的融合多肽；以及(F)仅Nef构建体(SEQ ID NO:151/152)。
图21A-21C：(A)将含有各自表示不同连接策略(融合物、F2A切割位点、AAA接头(SEQ ID NO:378))的疫苗免疫原或融合片段(例如，Pol PR-RT)的质粒DNA转染到Expi293TM细胞中。通过流式细胞术评估转染的Expi293F细胞的％GFP表达来确定转染效率。所示结果代表若干独立实验。(B)所有质粒DNA在表达盒中都含有p24。通过疫苗转基因构建体的p24ELISA(C)翻译产物来评估表达效率。通过用抗Nef抗体(2μg/mL，0.5秒暴露)进行蛋白质印迹免疫沉淀来确认翻译多肽的身份。最上面的条带对应于融合物中预期的全长翻译产物(88kDa)和含有AAA接头(SEQ ID NO:378)的构建体。抗Nef抗体未检测到含有F2A的翻译产物，表明Nef产物因缺乏全长构建体而被切割。为了控制等量加样，用抗α微管蛋白的抗体探测膜。
图22示出了未成熟树突细胞和成熟单核细胞来源的树突细胞(mMoDC)的分化表型的比较。单核细胞来源的DC(MoDC)在存在细胞因子的情况下成熟8天，并通过流式细胞术分析CD11c、HLA-DR、CD14、CD430、DCSIGN、CD83、CD86和OX40L的表达。
图23示出了在转染后第3天在八个人类供体中以1000PFU的感染复数(MOI)使用表达GFP的Ad5/35病毒载体的代表性moDC转导效率。通过流式细胞术得到的表达GFP的细胞比例在y轴上示出。x轴表示仅由p17-p24中的保守区(SEQ ID NO:428)组成以及由用3种融合方法(F2A(SEQ ID NO:347)、融合物(SEQ ID NO:349)和AAA接头(SEQ ID NO:345)(“AAA”被公开为SEQ ID NO:378))中的每一种设计的全长Gag-Nef免疫原组成的疫苗免疫原构建体。氨基酸序列在表1中提供。
图24A-24B示出了通过表达通过融合物、F2A蛋白水解切割序列或AAA接头(SEQ IDNO:378)串联或连接的HIV-1保守区的疫苗构建体对抗原特异性T细胞的初免。(A)在PBMC与疫苗载体转导的自体moDC共培养后第10天，通过IFN-γELISpot测定评估的初免反应的大小。PBMC来源于在基线处具有预先存在的HIV特异性响应的HIV感染供体(B)响应的广度被定义为新生识别的肽池的数量(不包括预先存在的基线响应)。在该分析中，在不同组之间没有观察到统计显著性。
图25A-25B示出了来自HIV感染供体的抗原特异性T细胞的体外初免。代表性流式细胞术图示出了在PBMC与疫苗载体转导的自体moDC共培养后第10天通过细胞内细胞因子染色(ICS)显示的IFN-γ产生。x轴表示用于体外初免的疫苗构建体。每个条形分别代表来自Gag p17、gag p24、整合酶、Pol(蛋白酶/RT)和Nef的肽池的刺激。表示了(A)CD8+T细胞响应(B)CD4+T细胞的IFN-γ+T细胞的百分比。(●)Gag p17；(■)Gag p24；(▲)INT；(▼)Pol；(◆)Nef。在该分析中，在不同组之间没有观察到统计显著性。图25A-25B公开了“AAA”为SEQID NO:378。
图26A-26B示出了来自无病毒血症和病毒血症HIV-1感染供体的抗原特异性T细胞的体外初免。代表性图示出了在无病毒血症(A)和病毒血症(B)供体中PBMC与用包含根据三种融合方法(F2A(SEQ ID NO:347)、融合物(SEQ ID NO:349)和AAA接头(SEQ ID NO:345；“AAA”公开为SEQ ID NO:378)中的一种设计的Gag-Nef免疫原的腺病毒载体转导的自体modc共培养后第7天(第一轮)和第14天(第二轮)通过细胞内细胞因子染色(ICS)显示的IFN-γ产生。x轴表示用于体外初免的疫苗构建体。每个条形分别代表来自Gag p17、Gagp24、整合酶、Pol(蛋白酶/RT)和Nef的肽池的刺激。表示了(A)CD8+T细胞响应(B)CD4+T细胞的IFN-γ+T细胞的百分比。(●)Gag p17；(■)Gag p24；(▲)INT；(▼)Pol；(◆)Nef。
图27示出了使用moDC初免的抗原特异性CD8+和CD4+T细胞的抗原功能特征谱，该moDC用含有免疫原表达盒的载体转导，这些免疫原表达盒具有通过融合物、F2A蛋白水解切割序列或AAA接头(SEQ ID NO:378)串联的保守区。这些饼图描绘了初免的CD8+或CD4+T细胞的调整后的多功能性(减去背景响应)特征(一种至四种功能—CD107a、IFN-γ、TNF-α和IL-2)。
图28A-28C示出了表达HIV-1抗原的病毒载体在免疫后引发高幅度CD8+T细胞应答。(A)免疫和采样方案。用表达通过融合物、F2A蛋白水解切割序列或柔性AAA接头(SEQ IDNO:378)串联的HIV-1保守区序列的Ad5/35载体免疫Balb/c小鼠组。在第1天和第29天以同源初免-加强方案免疫小鼠，在第16天(初免)或第36天(初免-加强)分析每组。通过使用IFN-γELISPOT测定检测产生IFN-γ的细胞来评估离体肽特异性脾细胞的频率，从而确定免疫后(B)第16天(C)第36天的免疫原性。合成了一组重叠11个与疫苗构建体中的序列以及F2A肽相匹配的氨基酸的15聚体肽，并将这些肽用于在ELISpot和ICS测定中刺激脾细胞。
图29A-29B示出了在Balb/c(A)和C57 BL/6动物(B)中疫苗诱导的CD8+T细胞应答的功能特征。分析了能够介导脱粒(CD107a)、IFN-γ、IL-2和TNF-α产生的CD8+T细胞的流式细胞术特征，并显示了每个疫苗接种组中动物响应的功能组成。将脾细胞用相关肽池(此处显示的p24)刺激6小时，并如方法中所述进行染色。饼图汇总了数据，饼图的每个切片对应于总CD8+T细胞群中具有给定数量功能的CD8+T细胞的分数。所有可能的响应组合在x轴上显示，总群体中功能不同的CD8+T细胞的百分比在y轴上显示。显示平均值和SD。图29A-29B公开了“AAA”为SEQ ID NO:378。
图30A-30B示出了产生IFN-γ的细胞的记忆表型。(A)流式细胞术图示出了在用2μg/ml Gag p24肽池再刺激后基于IFN-γ+CD8+T上的CCR7、CD45RA、CD27、PD-1和CTLA-4表达定义记忆子集和耗尽表型的门控策略。(B)在用2μg/ml Gag p24肽池再刺激后IFN-γ+CD8+和IFN-γ+CD4+T细胞中稚细胞(CCR7+CD45RA+)、效应记忆细胞(CCR7-CD45RA-)和中央记忆细胞(CCR7+CD45RA-)的比例。
图31A-31B：图31A示出了信号序列不同地增强疫苗免疫原(SEQ ID NO:369、370、371、368、367)的免疫原性。图31B示出了具有GM-CSF信号序列(SEQ ID NO:353、363)的HIV-1保守区的序列具有免疫原性。
图32A-32E：图32A示出了免疫和采样时间表。图32B示出了用于免疫Balb/c小鼠组的表达来自Gag-Nef融合蛋白序列的HIV-1保守区序列的LCMV载体，这些保守区序列不具有信号序列(SEQ ID NO:357、430)和具有来自GM-CSF(SEQ ID NO:353、363)、t-PA(SEQ IDNO:354)、MCP-3(SEQ ID NO:355)、β-连环蛋白(SEQ ID NO:356)的信号序列。图32C-32D示出了在存在或不存在MCP-3、tPA、β-连环蛋白和GM-CSF信号序列的情况下用表达保守Gag-Nef的LCMV复制无能型载体进行初免免疫后第7天(图32C)和加强免疫后第27天(图32D)后通过IFN-γELISpot得到的具有不同信号序列的疫苗免疫原对Gag p24的免疫原性。图32E表示在免疫后第7天雌性Balb/c中表达具有或不具有GMCSF信号序列的保守Pol的Ad5/35载体的免疫原性。每个点代表一只单独的小鼠。显示平均值和SD。在该分析中，在不同组之间没有观察到统计显著性。
图33A-33D：图32A示出了免疫和采样时间表。用图33B免疫Balb/c小鼠组，该图示出了用于免疫Balb/c小鼠组的表达来自Gag-Nef和Pol融合蛋白序列的HIV-1保守区序列的Ad5/35载体，这些保守区序列不具有信号序列(SEQ ID NO:357、430)和具有来自GM-CSF(SEQ ID NO:353、363)、t-PA(SEQ ID NO:354)、MCP-3(SEQ ID NO:355)、β-连环蛋白(SEQID NO:356)的信号序列。融合蛋白序列在表J中提供。图33C-33D示出了在初免免疫后第16天通过IFN-γELISpot得到的具有不同信号序列的疫苗免疫原的免疫原性(图33C)以及通过流式细胞仪分析得到的细胞内IFN-γ+CD8+T(图33D)细胞。每个点代表一只单独的小鼠。显示平均值和SD。使用非参数Mann-Whitney测试来确定组之间的统计显著性。*P≤0.05，**P≤0.001。
图34A-34D示出了在A*0201-C57/BL6转基因小鼠中含有具有和不具有前导序列的保守HIV序列的LCMV载体的免疫原性。图34A表示免疫和取样方案，其描述了初免和加强接种的时间点以及通过IFN-γELISpot评估响应的时间点。图34B表示在不存在(SEQ ID NO:367、431)或存在(SEQ ID NO:368、432)GM-CSF信号序列的情况下用于用表达A*0201序列的LCMV载体接种的免疫原构建体。还在不存在(SEQ ID NO:430+SEQ ID NO:357)或存在(SEQID NO:353+SEQ ID NO:363)GM-CSF信号序列的情况下用表达Gag-Nef和Pol融合蛋白序列的LCMV载体免疫小鼠。融合蛋白序列在表J中提供。A*0201序列包含来自保守HIV序列的对A*0201等位基因特异的表位序列，并以串珠排列形式放置在载体中。图34C表示来自初免和初免/加强接种动物的对A*0201肽池的IFN-γ响应的幅度。图34D表示来自初免和初免/加强接种动物的对Gag肽池的IFN-γ响应的幅度。在图34C-34D中：Y轴表示对特定肽池刺激的IFN-γ响应的幅度，表示为每106个脾细胞的斑点形成单位(SFU)的数量。通过减去无肽刺激的对照以排除非特异性响应来获得肽特异性值。X轴表示用于研究其肽特异性响应的体内初免和加强的单个疫苗构建体。在该分析中，在不同组之间没有观察到统计显著性。
图35A-35D示出了在A*0201-C57/BL6转基因小鼠中含有具有和不具有前导序列的保守HIV序列的Ad5/35载体的免疫原性。图35A表示免疫和取样方案，其描述了初免接种的时间点以及通过IFN-γELISpot评估响应的时间点。图35B表示用于疫苗接种的免疫原构建体，其中不具有信号序列的A*0201序列是(SEQ ID NO:367、431)，具有GM-CSF信号序列的所述序列是(SEQ ID NO:368、432)，具有tPA信号序列的所述序列是(SEQ ID NO:369、433)，具有MCP-3信号序列的所述序列是(SEQ ID NO:370、434)，具有β-连环蛋白信号序列的所述序列是(SEQ ID NO:371、435)，具有LAMP-1N末端和C末端信号序列的所述序列是(SEQ ID NO:372)，并且各自表达GM-CSF Gag-Nef和GM-CSF Pol融合蛋白序列的载体分别是(SEQ IDNO:353+SEQ ID NO:363)。融合蛋白序列在表J中提供。载体中的A*0201序列包含来自保守HIV序列的对A*0201等位基因特异的表位序列，并以串珠排列形式克隆在Ad5/35载体中。图35C表示来自初免接种动物的对A*0201肽池的IFN-γ响应的幅度。Y轴表示对A*0201肽池刺激的IFN-γ响应的幅度，表示为每106个脾细胞的斑点形成细胞(SFC)的数量。通过减去无肽刺激的对照以排除非特异性响应来获得肽特异性值。X轴表示用于体内初免的单个疫苗构建体。图35D表示GM-CSF-Gag/Nef+GM-CSF-Pol接种动物中对Gag、Nef、Pol-1和Pol-2肽池的IFN-γ响应的幅度。载体序列含有作为整体的保守序列；不仅是A*0201表位特异性序列。Y轴表示GM-CSF-Gag/Nef+GM-CSCF-Pol疫苗初免动物中IFN-γ响应的幅度，并且X轴表示用于刺激的特定肽池。每个条形分别代表来自Gag p24、Gag p17、Nef、Pol-1(蛋白酶/RT)和Pol-2(整合酶)的肽池的刺激。响应表示为每106个脾细胞的斑点形成单位(SFU)。通过减去无肽刺激的对照以排除非特异性响应来获得肽特异性值。使用非参数Mann-Whitney测试来确定组之间的统计显著性。*P≤0.05，**P≤0.001。
图36A-36E示出了使用沙粒病毒LCMV和皮秦德(PICV)沙粒病毒载体的各种初免和初免-加强方案。(A)用三段复制减弱型LCMV(TT1)、三段复制减弱型PICV(TT2)、复制缺陷型PICV(VV2)和表达SIVsme543 gp140的腺病毒载体进行单次初免来免疫C57Bl/6小鼠。(B)用表达Gag、Pol-1/Pol-2和Env(gp140)的三段复制减弱型LCMV(TT1)或三段复制减弱型PICV(TT2)载体进行的同源和异源初免加强方案。(C)异源初免-加强的比较，首先用三段复制减弱型PICV(TT2)或复制缺陷型PICV(VV2)初免，然后用表达SIV抗原的复制缺陷型LCMV(VV1)和三段复制减弱型LCMV(TT1)载体加强。小鼠在每个时间点接受单次免疫，包括以1:1:1:1的比例混合的三种(三段复制减弱型)或四种(复制缺陷型)沙粒病毒载体。(D)用表达SIVsme543 Gag的复制减弱型沙粒病毒载体作为同源LCMV或PICV和异源PICV初免和LCMV加强免疫恒河猴。在第1天、第29天、第85天和第113天施用四次静脉内免疫。(E)用表达SIVsme543 Gag的复制减弱型沙粒病毒载体作为同源LCMV或PICV和异源PICV初免和LCMV加强免疫的恒河猴中通过IFN-γELISpot得到的纵向随访免疫响应的汇总。在(E)中观察到的响应是在(D)中观察到的响应的延伸。
图37A-37F：(A)示出了针对moDC-T细胞初免测定随后是使用384孔ELISPOT测定的单个表位建立的方案。(B)表示在该分析中完成的10名无病毒血症HIV-1患者供体当前可获得的性别、病毒载量和HLA多样性特征。(C)表示不存在信号序列的情况下的病毒载体序列，以评估疫苗接种是否增强(D)中评估的响应的广度。(D)用表达Gag-Nef和Pol-Env内的保守区的Ad5/35载体转导的moDC进行初免后诱导的响应的广度(独立表位的数量)的比较。(E)用空载体(疫苗前)和具有不同信号序列(SEQ ID NO.353、363、354、355、356、429和357)的保守区疫苗表征对不同HIV-1抗原的免疫响应的广度。(F)被定义为新生识别的肽池的数量的响应的广度(不包括预先存在的基线响应)以及在PBMC与表达具有不同信号序列的保守区构建体的疫苗载体转导的自体moDC共培养后第10天通过IFN-γELISpot测定评估的响应的幅度。每个点代表一个供体。显示平均值和SD。
具体实施方式
1.简介
本文提供了包含多个多肽或肽片段的融合多肽和相关组合物(包括免疫原性组合物和药物组合物)，以及用于制备融合多肽的方法和使用它们来引发有需要的受试者对人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的免疫原性应答的方法。如本文所用，“免疫原”是引发免疫应答或能够引发免疫应答的物质，诸如抗原。还提供了编码本文所述的融合多肽的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的载体。
本文提供了被设计成诱导抗病毒免疫应答的融合多肽。本文所述的疫苗构建体被设计成使用病毒蛋白质组序列源集内最高度保守的预测表位来提供预测T细胞表位(“PTE”)的数学确定的提高覆盖率。作为设计抗病毒免疫原方法的范例，使用由HIV-1Gag、Pol、Env和Nef基因中的一种、两种、三种或四种编码的融合多肽。本文所述的方法既保留了PTE在序列源集中的位置信息，又构建了二价序列集以提高保守PTE的覆盖率。结果得到一种初始二价疫苗构建体，其有利地改进或增加了高度保守的PTE，这些PTE最有可能与患者群体中和个体患者内病毒物种表达的蛋白质中天然存在的序列中的保守表位高度相似，因为这两者都保留了位置信息。另外，在患者间和患者内群体的HIV-1物种中仅使用高度保守的PTE序列降低了逃逸突变体的可能性，因为高度保守的序列更有可能有助于病毒结构和功能。
还提供了用于为高度可变的病毒(诸如HIV-1)设计抗病毒疫苗免疫原的计算方法。抗病毒疫苗免疫原设计方法结合了来自具有可变序列的个体患者样品的深度测序数据，并在宿主HLA多样性的背景下分析了序列多样性以开发用于治疗和预防用途的抗病毒疫苗。抗病毒免疫原可以被设计成在个体水平上为具有一组定义的HLA等位基因的一组个体或为广泛的群体覆盖提供覆盖。在本文所述的疫苗免疫原设计方法中，我们定义了一种使用大量群体序列(例如，来自公共数据库和内部开发的数据库)靶向疫苗序列内的保守区的计算方法。此外，使用个体患者深度序列数据，我们定义了保守区内每个潜在T细胞表位的序列变异性。此外，我们基于个体宿主的一组HLA等位基因呈现的可能性鉴定了可用作实际表位的区域。将与由可公开获得和内部开发的数据库定义的宿主HLA结合的可能性用于开发模拟每个等位基因的肽结合的深度学习模型。这可以与可以定义抗原变体在调节TCR识别中的潜在影响或将肽鉴定为逃逸变体的计算机内、已发表和/或实验性体外T细胞引发数据相结合。将这些数据用于设计一组含有表位和相关表位变体的肽免疫原。将表位序列串联或串行连接(直接融合或经由接头序列连结)成单个融合多肽。肽片段从N末端到C末端按计算确定的顺序结合，这减少或消除了可能模拟人类自身抗原并且具有不良影响(例如，引发自身免疫反应或耐受原反应)的连接表位的产生。
与类似的基于图形的疫苗设计方法不同，本文所述的方法仅使用在自然序列中也相邻的相邻PTE来构建连接的PTE片段。另外，本发明方法首先构建由两个匹配的多肽组成的二价构建体，以改进或增加病毒蛋白质组中每个PTE位置的覆盖率。二价构建体本身可用作疫苗，如下文实施例1和2中所述的构建体，或者它可作为进一步的构建体(诸如实施例3中所述的HLA限制性构建体或下文实施例4和5中所述的个体化构建体)的基础。通过分析基于群体的序列(例如患者间多样性)设计的二价构建体鉴定可能有助于病毒结构和功能的基于群体的保守序列，并且可以作为用于定义患者内序列内保守性的模板，这些信息可以应用于构建个体化疫苗构建体。
本文所述的方法可以从使用本文称为“保守分析”或“保守算法”的过程鉴定保守区二价序列开始。这些方法还可以包括使用本文称为“保守步行算法”或“CWA”的过程构建具有最大表位覆盖率同时保留来自天然序列的PTE的位置信息的二价疫苗构建体的步骤。
基于诱导T细胞反应的治疗性疫苗正在接受评估，并在癌症疫苗的背景下显示出功效。这些疫苗通常是基于表位的，并且可以针对个体的HLA等位基因及其特定的肿瘤抗原进行定制(参见例如Tran等人，Science,(2014)344(6184):641-5)。我们已经开发了疫苗序列，这些疫苗序列可基于某些HLA等位基因的群体流行率来靶向亚群体，或者可针对个体的HLA等位基因范围进行专门定制。
2.可用于促进对人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的免疫应答的融合多肽
本文提供了包含由一种或多种HIV-1基因编码的多个多肽或肽片段的融合多肽。本文所述的融合多肽的“片段”是相对于参考序列(例如，Env、Gag、Nef和Pol多肽的HIV-1HXB2参考序列，在本文分别提供为SEQ ID NO:403-406)而言至少8个氨基酸的连续序列。本文所述的多肽是“融合”多肽，因为它们由两个或多个HIV-1蛋白的连接或串联多肽或肽片段组装而成。关于HIV-1蛋白参考序列，多肽或肽片段可对应于相同HIV-1蛋白或不同HIV-1蛋白的不连续序列。通常，融合多肽是非天然存在的，并且可以是合成的或重组产生的。
a.多肽片段
关于编码用于组装本文所述的融合多肽的多肽片段的HIV-1基因，在各种实施方案中，融合多肽包含由选自Gag、Nef、Env、Pol、Vpu、Vpr和Vif的一种或多种(例如，两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种)HIV-1基因(例如，选自Gag、Nef、Env、Pol和Vif的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种HIV-1基因)编码的一种或多种人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)蛋白的多个多肽片段。在一些实施方案中，多个多肽片段仅由HIV-1基因Env、Gag、Nef和Pol编码的多肽片段构成，例如不包含由HIV-1Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。在一些实施方案中，多个多肽片段仅由HIV-1基因Gag、Nef和Pol编码的多肽片段构成，例如不包含由HIV-1Env、Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。在一些实施方案中，多个多肽片段仅由HIV-1基因Gag和Nef编码的多肽片段构成，例如不包含由HIV-1Env、Pol、Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。在一些实施方案中，多个多肽片段仅由HIV-1基因Pol和Nef编码的多肽片段构成，例如不包含由HIV-1Env、Gag、Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。在一些实施方案中，多个多肽片段仅由HIV-1基因Pol和Env编码的多肽片段构成，例如不包含由HIV-1Gag、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。在一些实施方案中，多个多肽片段仅由HIV-1Pol基因编码的多肽片段构成，例如不包含由HIV-1Env、Gag、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。在各种实施方案中，多个多肽片段不含由HIV Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因中的一个、两个、三个或四个编码的片段。
关于组装、连接、连结或串联成单个融合多肽的多肽片段的数量，在各种实施方案中，融合多肽由至少5个并且至多40个多肽片段(例如，5个多肽片段并且至多6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个多肽片段)构成。视情况而定，多肽片段可以以与天然存在的蛋白质相同或不同的顺序排列。
关于被选择为包含在融合多肽中的多肽片段的由HIV-1基因编码的多肽区，在各种实施方案中，多肽片段来源于病毒蛋白质组序列群体中的保守区。在一些实施方案中，保守区在HIV-1种类之间具有大于80％(例如，大于81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的保守性，例如如在患者间和/或患者内群体中所确定。如本文所用，由HIV-1基因编码的多肽中的保守区是指含有与预定氨基酸片段或子序列位置中最普遍的一个氨基酸片段或子序列相同的氨基酸片段或子序列(例如，长度为9个氨基酸的片段或9聚体)的序列群体中序列的百分比，其中氨基酸片段或子序列位置是相对于参考序列(例如HIV-1HXB2多肽序列，例如SEQ ID NO:403-406)确定的。在各种实施方案中，保守区在组M内HIV-1进化枝中的一个或多个(例如HIV-1进化枝A-K中的一个或多个，例如进化枝A、B、C、D和G中的一个或多个)之间(例如在HIV-1组M进化枝B及其重组形式(例如CRF01_AE)之间)是保守的。在一些实施方案中，多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如选自SEQ ID NO:1-344的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个多肽片段，例如，在表B中鉴定的多肽片段。在一些实施方案中，多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如选自SEQ ID NO:2、3、8、9、13、14、17、18、23、24、25、26、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、58、59、62、63、64、65、66、67、68、69、72、73、74、75、76、77、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、92、93、101、102、103、104、109、110、115、116、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、155、156、157、158、159、160、166、167、168、169、170、171、174、175、178、179、180、181、182、183、184、185、193、194、195、196、197、198、199、200、203、204、205、206、207、208、213、214、221、222、236、237、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、263、264、266、267、268、269、270、271、272、273、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、305、306、307、308、309、310、313、314、315、316、317、318、321和322的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个多肽片段，例如在表C中鉴定的多肽片段。开始和结束位置是相对于HIV-1HXB2参考多肽(GenBank登录号K03455，ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/K03455，本文提供为SEQ ID NO:403-406并在表A中鉴定)而言的。
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关于单个多肽或肽片段的长度范围，在各种实施方案中，每个多肽片段的长度为至少8个氨基酸，并且长度为至多约约250个氨基酸，例如长度为至少8个氨基酸并且长度为至多9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个氨基酸。在各种实施方案中，每个多肽片段的长度为至少8个氨基酸，并且长度为至多约35个氨基酸，例如长度为至少8个氨基酸并且长度为至多9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34或35个氨基酸。在各种实施方案中，每个多肽片段的长度为至少15个氨基酸，并且长度为至多约30个氨基酸，例如长度为至少15个氨基酸并且长度为至多16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。
关于全长融合多肽的长度，在各种实施方案中，在一些实施方案中，融合多肽的全长包含至少约350个氨基酸并且至多约1000个氨基酸，例如至少约350个氨基酸并且至多约360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个氨基酸。关于全长融合多肽的长度，在各种实施方案中，在一些实施方案中，融合多肽的全长包含至少约350个氨基酸并且至多约800个氨基酸，例如至少约350个氨基酸并且至多约360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790或800个氨基酸。在一些实施方案中，融合多肽的全长不长于800个氨基酸，例如不长于795、790、785、780、775、770、765、760、755、750、745、740、735、730、725、720、715、710、705或700个氨基酸。
通常，融合多肽是免疫原性的，因为它们能够在人体内引发例如对HIV-1的免疫应答。在一些实施方案中，例如如本文所述的融合多肽任选地与一种或多种附加治疗剂组合能够在人体内引发对HIV-1的保护或治疗有效的免疫应答，例如能够在未感染个体中或在治疗环境中预防HIV-1感染，能够引发足以诱导免疫介导的对HIV-1的控制或根除被感染个体中的HIV-1的免疫应答。融合多肽的免疫原性可以如本文所述在体外和体内测定中评估和证明。例如，融合多肽的免疫原性可以通过体外测定(包括CD4+和/或CD8+T细胞活化(例如，包括细胞因子表达和靶标杀伤测定)或增殖测定)来证明。T细胞可以通过暴露于已经用编码融合多肽的多核苷酸转染的抗原呈递细胞(APC)(例如树突细胞，例如单核细胞来源的树突细胞)来活化。此类测定是本领域已知的并在本文中描述。融合多肽的免疫原性还可以在体内动物模型中证明，例如通过向小鼠或非人灵长类动物施用例如一种或多种人HLA分子的转基因物(可从Jackson Laboratories或Taconic获得)，并评估CD4+和/或CD8+T细胞活化(例如，包括血清细胞因子水平)或增殖。在各种实施方案中，每个多肽片段中的一个、两个、三个或更多个包含一个或多个预测的T细胞表位或由所述表位组成，例如如计算或实验确定的。在一些实施方案中，融合多肽包含一个或多个多肽片段，所述多肽片段与例如单个受试者内或多名受试者之间的一个或多个人HLA I类和/或II类等位基因(例如，1、2、3、4、5或6个等位基因)结合或由所述等位基因呈递。在一些实施方案中，融合多肽包含一个或多个多肽片段，所述多肽片段至少与人A*0201HLA I类分子结合或由所述分子呈递。在一些实施方案中，融合多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个8聚体、9聚体和/或10聚体多肽片段，所述多肽片段与例如单个受试者内的一个或多个人HLA I类和/或II类等位基因(例如，1、2、3、4、5或6个等位基因)结合或由所述等位基因呈递。在一些实施方案中，融合多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个多肽片段，每个多肽片段的长度为15-30个氨基酸，所述多肽片段在细胞内加工并由例如单个受试者内的一个或多个人HLA I类和/或II类等位基因(例如，1、2、3、4、5或6个等位基因)呈递。
串联多肽片段
视情况而定，一个或多个多肽片段可以直接与相邻片段邻接或融合，或者可以通过一个或多个肽接头结合、连接或连结到相邻片段。在各种实施方案中，一个或多个肽接头选自以下项中的一种或多种：例如接头内或全长融合多肽内的聚丙氨酸接头、聚甘氨酸接头、可切割接头、柔性接头、刚性接头、Nef连接序列以及它们的组合。可以在本发明融合多肽中用于连接一个或多个多肽片段的例示性融合蛋白接头例如在Chen等人，Adv DrugDeliv Rev.(2013)65(10):1357–1369中描述。在一些实施方案中，聚丙氨酸接头包含2或3个连续丙氨酸残基例如AA、AAA(SEQ ID NO:378)、AAY(SEQ ID NO:379)或AAX或者由所述连续丙氨酸残基组成，其中X是任何氨基酸(例如，A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y)(SEQ ID NO:380)。在一些实施方案中，使用聚甘氨酸接头，例如GGS(SEQ ID NO:419)、GSG(SEQ ID NO:420)或GGGS(SEQ ID NO:421)。
在一些实施方案中，可切割接头选自2A可切割肽。可以在本发明融合多肽中用于连接一个或多个多肽片段的例示性2A可切割肽例如在Donnelly等人，J.Gen.Virol(2001),82,1027–1041以及Chng等人，mAbs(2015)7:2,403-412中描述。可以用于连接一个或多个多肽片段的例示性可切割肽包括但不限于2A可切割序列(例如，口蹄疫病毒(F2A)、马鼻炎A病毒(E2A)、猪捷申病毒-1(P2A)和明脉扁刺蛾病毒(T2A))和弗林蛋白酶识别/切割序列(例如，REKR(SEQ ID NO:382)、RRKR(SEQ ID NO:383)、RAKR(SEQ ID NO:381))。在某些实施方案中，将弗林蛋白酶识别/切割序列(例如，REKR(SEQ ID NO:382)、RRKR(SEQ ID NO:383)、RAKR(SEQ ID NO:381))与2A可切割肽(例如，口蹄疫病毒(F2A)、马鼻炎A病毒(E2A)、猪捷申病毒-1(P2A)和明脉扁刺蛾病毒(T2A))组合或融合在单个接头中。参见例如Chng等人，mAbs(2015)7:2,403-412。在各种实施方案中，2A可切割接头包含与ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQID NO:384)、APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:385)、RAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:386)、QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:387)或EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:388)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，或者包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:384)、APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:385)、RAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:386)、QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:387)或EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:388)的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成。视情况而定，在某些实施方案中，弗林蛋白酶识别/切割序列可以位于2A接头的N末端或C末端。在一些实施方案中，可切割接头包含选自由以下项组成的组的弗林蛋白酶识别/切割位点或者由所述弗林蛋白酶识别/切割位点组成：RAKR(SEQ ID NO:381)、REKR(SEQ ID NO:382)和RRKR(SEQ ID NO:383)。REKR(SEQ ID NO:382)是HIV和SIV包膜糖蛋白前体中的天然存在的可切割接头(Bahbouhi等人，Biochem.J.(2002)366,863-872)。在一些实施方案中，融合多肽包含一个或多个Nef连接序列，所述连接序列包含与VHAGPIA(SEQ ID NO:389)、VHAGPVA(SEQ ID NO:390)或GALDI(SEQ ID NO:391)至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，或者包含选自VHAGPIA(SEQ ID NO:389)、VHAGPVA(SEQ ID NO:390)或GALDI(SEQ ID NO:391)的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成。可以用于连结或连接融合多肽中的一个或多个多肽片段的例示性接头在表D中提供。
Figure BDA0003546306850001041
Figure BDA0003546306850001051
由HIV-1Gag基因编码的多肽片段
在各种实施方案中，融合多肽包含由HIV-1Gag基因编码的一种或多种病毒蛋白或其片段或子序列的一个或多个片段。在一些实施方案中，由HIV-1Gag基因编码的一种或多种病毒蛋白选自p17(N末端基质)、p24(衣壳)、p7(核衣壳)和p6(C末端)。在一些实施方案中，由HIV-1Gag基因编码的一种或多种病毒蛋白不包含任何p6组分。在一些实施方案中，多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO:68-146和339-342；SEQ ID NO:68、69、72、73、74、75、76、77、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、92、93、101、102、103、104、109、110、115、116、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、139、140、141、142、143、144、145和146；SEQ ID NO:76、77、86、87和92-124；SEQ IDNO:76、77、86、87、94和95；SEQ ID NO:76、86和94；SEQ ID NO:77、87和95；SEQ ID NO:68-79和92-124；SEQ ID NO:70-71、76-77和94-95；SEQ ID NO:78、79、96、99、100、107、108、113、114、121、122、123、124、137和138；SEQ ID NO:78、99、107、113、121、123和137；SEQ ID NO:78、79、90、91、97、98、99、100、105、106、107、108、111、112、113、114、117、118、119、120、121、122、123、124、137和138；SEQ ID NO:78、90、97、105、111、117、119和137；以及SEQ ID NO:78和137。
在一些实施方案中，融合多肽包含至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个以下片段：其包含与选自31-53、37-51、142-166、175-199、183-191、257-282、257-290、265-282、288-313、288-321、296-313、333-357、337-361、341-349、345-353和429-444的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Gag氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:404而言的。在某些实施方案中，融合多肽不包括1、2、3、4、5个或更多个以下多肽片段：其包含与选自1-30、54-127、138-146、370-428和445-500的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Gag氨基酸序列或其子序列或者由所述氨基酸序列或其子序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:404而言的。在一些实施方案中，多个多肽片段不包括或本文所述的融合蛋白不包含1、2、3、4、5个或更多个以下多肽片段：其包含SEQ ID NO:444-448中的任一者的HIV-1Gag氨基酸序列或与SEQ ID NO:444-448中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或它们的子序列(表K)或者由所述氨基酸序列或所述序列或它们的子序列组成。由HIV-1Gag基因编码且并入本文所述的融合多肽中的例示性多肽片段(例如，被确定为来自保守区，预测与人HLA A*0201结合和/或已知为免疫原性的)被描绘为与图18中的HIV-1HXB2 Gag参考多肽进行比对。如本文所用，当任何给定聚合物组分(例如，氨基酸、核苷酸，也统称为“残基”)的位置通过参考所选氨基酸或核酸聚合物中的相同或等同位置(例如，基于最佳比对或共有序列)，而不是通过给定聚合物中组分的实际数字位置来指定时，给定氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号“对应于”、“与…相对应”或“相对于”所选或参考氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号。
由HIV-1Nef基因编码的多肽片段
在一些实施方案中，融合多肽包含由HIV-1Nef基因编码的病毒蛋白的一个或多个片段。在一些实施方案中，多个多肽片段包括至少一个多肽片段，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171和172；SEQ ID NO:147、148、149、150、155、156、157、158、159、160、166、167、168、169、170和171；SEQ ID NO:149-152；SEQ ID NO:151-152；SEQ ID NO:149、150、151、152、159、160、161、162、163、164、166、167、168、169、170、171、172、173和174；SEQ ID NO:151、152、161和162；SEQ ID NO:151和152；SEQ ID NO:153、154、172和173；SEQ ID NO:153和172；SEQID NO:153、154、155、156、157、158、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172和173；SEQ ID NO:153和165；以及SEQ ID NO:153。
在一些实施方案中，融合多肽包含至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个以下片段：其包含与选自64-102、81-102、88-97、91-99、130-148、130-154、134-142、134-148、136-148、137-145、137-145和117-154的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Nef氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:405而言的。在某些实施方案中，融合多肽不包括1、2、3个或更多个以下多肽片段：其包含与选自1-63、103-116和155-206的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Nef氨基酸序列或其子序列或者由所述氨基酸序列或其子序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ IDNO:405而言的。在一些实施方案中，多个多肽片段不包括或本文所述的融合蛋白不包含1、2、3个或更多个以下多肽片段：其包含SEQ ID NO:449-451中的任一者的HIV-1Nef氨基酸序列或与SEQ ID NO:449-451中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或它们的子序列(表K)或者由所述氨基酸序列或所述序列或它们的子序列组成。由HIV-1Nef基因编码且并入本文所述的融合多肽中的例示性多肽片段(例如，被确定为来自保守区，预测与人HLA A*0201结合和/或已知为免疫原性的)被描绘为与图19中的HIV-1HXB2 Nef参考多肽进行比对。
具有由HIV-1Gag和Nef基因编码的多肽片段的融合多肽
在一些实施方案中，融合多肽包含由HIV-1Gag和Nef基因编码的病毒蛋白的一个或多个片段或者由所述片段组成，例如不包含由HIV-1Env、Pol、Tat、Rev、Vif、Vpr或Vpu基因编码的一个或多个多肽片段。在一些实施方案中，融合多肽包含至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO:68-79和92-124、149、150、151、152、159、160、161、162、163、164、166、167、168、169、170、171、172、173和174；SEQ ID NO:70、71、76、77、94、95、151、152、161和162；SEQ ID NO:70、76、94、151和161；以及SEQ ID NO:71、77、95、152和162。包含在具有由HIV-1Gag和Nef基因编码的多肽片段的融合多肽中的多肽片段在表E中列出。
Figure BDA0003546306850001091
Figure BDA0003546306850001101
Figure BDA0003546306850001111
在一些实施方案中，融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQ ID NO:70、76、94、151和161；或者SEQ ID NO:71、77、95、152和162。
在一些实施方案中，融合多肽包含SEQ ID NO:351-356和430中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:351-356和430中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
可在本文所述的融合多肽和编码此类融合多肽的多核苷酸的结构中进行修饰，并且这些修饰仍然获得编码具有期望(例如免疫原性)特征的变体或衍生多肽的功能分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以产生本文所述的融合多肽的等同或甚至改善的变体或部分时，本领域技术人员通常将改变编码DNA序列的密码子中的一个或多个。
例如，某些氨基酸可取代蛋白质结构中的其他氨基酸，而不会明显丧失其结合其他多肽(例如抗原)或细胞的能力。由于正是蛋白质的结合能力和性质限定该蛋白质的生物功能活性，因此可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸序列取代，当然可以在其基础DNA编码序列中进行某些氨基酸序列取代，但获得具有类似性质的蛋白质。因此可以设想，可在所公开的融合多肽的多肽序列或编码此类融合多肽的对应DNA序列中进行各种改变，而不会明显丧失它们的生物效用或活性。
在许多情况下，多肽变体将含有一个或多个保守取代。“保守取代”是其中氨基酸取代具有相似特性的另一个氨基酸，使得肽化学领域技术人员将期望多肽的二级结构和亲水性基本上不变的取代。
当比较多核苷酸和多肽序列时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸的序列在如下所述进行最大对应比对时相同，则认为这两个序列是“相同的”。通常通过在比较窗口上比较序列来进行两个序列之间的比较，以鉴别和比较序列相似性的局部区。如本文所用，“比较窗口”是指至少约20个连续位置(通常为30至约75个、40至约50个)的片段，其中在将两个序列进行最佳比对后，可将该序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。
用于比较的序列的最佳比对可使用Lasergene生物信息学软件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的Megalign程序使用默认参数进行。该程序体现了以下参考文献中描述的若干比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.Dayhoff,M.O.(编辑)Atlas ofProtein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC第5卷，增刊3，第345-358页；Hein J.(1990)Unified Approach toAlignment and Phylogenes pp.626-645Methods in Enzymology vol.183,AcademicPress,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.(1989)CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.and Muller W.(1988)CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor 77:105；Santou,N.Nes,M.(1987)Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 80:726-730。
另选地，用于比较的序列的最佳比对可通过以下算法进行：局部同一性算法(Smith and Waterman(1981)Add.APL.Math 2:482)、同一性比对算法(Needleman andWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443)、相似性搜索方法(Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444)、这些算法的计算机化实施(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575ScienceDr.,Madison,WI)或检查。
适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个示例是BLAST和BLAST2.0法，它们分别在Altschul等人(1977)Nucl.Acids Res.25:3389-3402以及Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中描述。BLAST和BLAST 2.0可以例如与本文所述的参数一起用于确定本文所述的多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)公开获得。
在一个例示性示例中，对于核苷酸序列，可以使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的惩罚分数；总是<0)来计算累积分数。字词命中在每个方向上的延伸在以下情况下停止：累积比对分数从其最大实现值下降数量X；累积分数由于一个或多个负分数残基比对的累积而变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11和期望值(E)10作为默认值，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对，(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。
对于氨基酸序列，可以使用评分矩阵来计算累积得分。字词命中在每个方向上的延伸在以下情况下停止：累积比对分数从其最大实现值下降数量X；累积分数由于一个或多个负分数残基比对的累积而变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。
在一种方法中，通过在至少20个位置的比较窗口内比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中与用于两个序列的最佳比对的参考序列(不包含添加或缺失)相比，多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分可包含20％或更少(通常为5％至15％，或10％至12％)的添加或缺失(即空位)。通过确定两个序列中相同核酸碱基或氨基酸残基出现的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以参考序列中的总位置数(即窗口大小)并将结果乘以100以产生序列同一性百分比来计算百分比。
如本文所用，术语多肽“变体”是通常与本文具体公开的多肽在一个或多个取代、缺失、添加和/或插入方面不同的多肽。此类变体可以是天然存在的或可例如通过修饰本文所述的上述多肽序列中的一个或多个并评估如本文所述的多肽的一种或多种生物活性和/或使用本领域熟知的多种技术中的任一种来合成生成。术语“变体”还可指包含一个或多个核苷酸或氨基酸突变的任何天然存在的或工程化的分子。
由HIV-1Env基因编码的多肽片段
在一些实施方案中，融合多肽包含由HIV-1Env基因编码的一种或多种病毒蛋白的一个或多个片段。在某些实施方案中，由HIV-1Env基因编码的一种或多种病毒蛋白选自gp120和gp41。
在某些实施方案中，融合多肽包含至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO:1-67和338；SEQ ID NO:2、3、8、9、13、14、17、18、23、24、25、26、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、58、59、62、63、64、65、66和67；SEQ ID NO:4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、28、29、30、37、38、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61和338；SEQ ID NO:4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、28、29、30、37、38、41和42；SEQ ID NO:28、29、30和41-56；SEQID NO:28、29、41和42；SEQ ID NO:4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、37和38；SEQ ID NO:4、5、11、12、37和38；SEQ ID NO:6、7、15、16、21、22、30、60和61；SEQ ID NO:6、15、21、30和60；SEQID NO:1、2、3、4、5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、19、20、27、55、56、57、58、59、60、61和338；SEQ ID NO:1、10、19、27、55、56和57；以及SEQ ID NO:6、15和60。
在各种实施方案中，融合多肽包含至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或更多个以下片段：其包含与选自28-52、34-48、34-47、36-44、59-83、64-83、66-83、67-75、113-137、235-259、586-594、586-610、589-606和594-602的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Env氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:403而言的。在某些实施方案中，融合多肽不包括1、2、3、4、5、6个或更多个以下多肽片段：其包含与选自1-27、53-58、84-112、138-234、269-474、490-501、611-856的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Env氨基酸序列或其子序列或者由所述氨基酸序列或其子序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:403而言的。在一些实施方案中，多个多肽片段不包括或本文所述的融合蛋白不包含1、2、3、4、5个或更多个以下多肽片段：其包含SEQID NO:437-443中的任一者的HIV-1Env氨基酸序列或与SEQ ID NO:437-443中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或它们的子序列(表K)或者由所述氨基酸序列或所述序列或它们的子序列组成。由HIV-1Env基因编码且并入本文所述的融合多肽中的例示性多肽片段(例如，被确定为来自保守区，预测与人HLA A*0201结合和/或已知为免疫原性的)被描绘为与图17中的HIV-1HXB2 Env参考多肽进行比对。
由HIV-1Pol基因编码的多肽片段
在一些实施方案中，融合多肽包含由HIV-1Pol基因编码的一种或多种病毒蛋白的一个或多个片段。在各种实施方案中，由HIV-1Pol基因编码的一种或多种病毒蛋白选自蛋白酶(PR)、逆转录酶(RT)和整合酶(INT)中的一种或多种。
在一些实施方案中，多个多肽片段包括至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO:174-337和343-344；SEQ ID NO:174、175、178、179、180、181、182、183、184、185、193、194、195、196、197、198、199、200、203、204、205、206、207、208、213、214、221、222、236、237、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、263、264、266、267、268、269、270、271、272、273、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、305、306、307、308、309、310、313、314、315、316、317、318、321和322；SEQ ID NO:180、181、182、183、184、185、186、187、190、191、192、193、194、195、196、221、222、294、295、296、297、298、299、300、301、305、306、307、308、311、312、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336和337；SEQ ID NO:180、181、186、187、221、222、294、295、307、308、321和322；SEQ ID NO:176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、282、283、294、295、296、297、298、299、300、301、302、305、306、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336和337；SEQ ID NO:176、177、188、189、213、214、223、224、259、260、282、283、294、295、305、306、319和320；SEQ ID NO:180、181、186、187、221、222、294、295、321和322；SEQID NO:182-202、292-302、305、306；SEQ ID NO:188、189、294、295、305和306；SEQ ID NO:176、177、178、179、180、181、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、282、283、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336和337；SEQ ID NO:176、177、213、214、223、224、259、260、282、283、319和320；SEQ ID NO:192、201、202、215、216、217、218、219、220、229、230、231、240、241、242、243、244、265、276、277、298、299、302、311、312、327、328、331、332、333、336和337；SEQ ID NO:192、201、215、217、219、229、230、240、241、243、265、276、298、302、311、327、331、333和336；SEQ ID NO:190、191、192、197、198、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、238、239、261、262、274、275、276、277、296、297、298、299、300、301、302、303、304、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、343、344、375和376；SEQ ID NO:190、197、209、210、211、225、227、234、238、261、296、300、303、323、325、329、334；以及SEQ ID NO:192、215、217、219、229、230、276、298、302、327、331、333和336。
在一些实施方案中，融合多肽包含至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、39、30个或更多个以下片段：其包含与选自144-168、152-160、291-315、326-350、328-352、330-354、333-354、334-342、336-344、338-346、374-398、380-404、382-390、388-396、399-423、400-424、406-430、553-577、642-666、650-658、759-783、767-775、768-792、776-784、834-858、940-964、947-971、948-956、948-972、955-963、956-964、980-1003和988-996的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Pol氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:406而言的。在某些实施方案中，融合多肽不包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个以下多肽片段：其包含与选自1-55、118-128、321-325、355-366、432-541、607-641、667-682、709-746、828-833、921-930的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Pol氨基酸序列或其子序列或者由所述氨基酸序列或其子序列组成，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:406而言的。在一些实施方案中，多个多肽片段不包括或本文所述的融合蛋白不包含1、2、3、4、5个或更多个以下多肽片段：其包含SEQ ID NO:452-461中的任一者的HIV-1Pol氨基酸序列或与SEQ IDNO:452-461中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或它们的子序列(表K)或者由所述氨基酸序列或所述序列或它们的子序列组成。由HIV-1Pol基因编码且并入本文所述的融合多肽中的例示性多肽片段(例如，被确定为来自保守区，预测与人HLA A*0201结合和/或已知为免疫原性的)被描绘为与图20A-C中的HIV-1HXB2 Pol参考多肽进行比对。
在一些实施方案中，包含由HIV-1Pol基因编码的多肽片段的融合多肽不包含氨基酸序列或基序YMDD(SEQ ID NO:462)或YVDD(SEQ ID NO:463)。在一些实施方案中，融合多肽不包含选自SEQ ID NO:215、216、217、218、219和220的一个或多个氨基酸序列。在一些实施方案中，融合多肽不包含选自SEQ ID NO:209、210、211、212、213、214、343和344的一个或多个氨基酸序列。
具有由HIV-1Env和Pol基因编码的多肽片段的融合多肽
在一些实施方案中，融合多肽包含由HIV-1Env和Pol基因编码的病毒蛋白的一个或多个片段或者由所述片段组成，例如不包含由HIV-1Gag、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr或Vpu基因编码的一个或多个多肽片段。
在一些实施方案中，融合多肽包含至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO:4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、28、29、30、37、38、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、282、283、294、295、296、297、298、299、300、301、302、305、306、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337和338；SEQ ID NO:4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、28、29、30、37、38、41、42、176、177、188、189、213、214、223、224、259、260、282、283、294、295、305、306、319和320；SEQ ID NO:28、29、30、41-56、182-202、292-302、305和306；SEQ ID NO:28、29、41、42、188、189、294、295、305和306；SEQ ID NO:4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、37、38、176、177、178、179、180、181、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、282、283、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336和337；以及SEQ ID NO:4、5、11、12、37、38、176、177、213、214、223、224、259、260、282、283、319和320。包含在具有由HIV-1Env和Pol基因编码的多肽片段的融合多肽中的多肽片段在表F中列出。
在一些实施方案中，融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段：SEQ ID NO:188、305、28、41、294、4、176、11、319、259、282、223、213和37；SEQ ID NO:188、305、28、41和294；SEQ ID NO:4、176、11、319、259、282、223、213和37；SEQ ID NO:189、306、29、42、295、5、177、12、320、260、283、224、214和38；SEQID NO:189、306、29、42和295；SEQ ID NO:5、177、12、320、260、283、224、214和38；SEQ IDNO:305、319、259、282、223、213、294、176和188；SEQ ID NO:306、320、260、283、224、214、295、177和189；SEQ ID NO:305、294、223、213、176、259、319、188和282；SEQ ID NO:306、295、224、214、177、260、320、189和283；SEQ ID NO:305、294、319、259、282、223、176和188；SEQ ID NO:306、295、320、260、283、224、177和189；SEQ ID NO:305、223、294、176、259、319、188和282；或者SEQ ID NO:306、224、295、177、260、320、189和283。
在一些实施方案中，融合多肽包含SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
具有由HIV-1Gag、Nef和Pol基因编码的多肽片段的融合多肽
在一些实施方案中，融合多肽包含由HIV-1Gag、Nef和Pol基因编码的病毒蛋白的一个或多个片段或者由所述片段组成，例如不包含由HIV-1Env、Tat、Rev、Vif、Vpr或Vpu基因编码的一个或多个多肽片段。
在一些实施方案中，融合多肽包含至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO:76、77、86、87、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、149、150、151、152、180、181、182、183、184、185、186、187、190、191、192、193、194、195、196、221、222、294、295、296、297、298、299、300、301、305、306、307、308、311、312、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、339、340、341和342；以及SEQ ID NO:76、77、86、87、94、95、151、152、181、182、186、187、221、222、294、195、307、308、321、322。包含在具有由HIV-1Gag、Nef和Pol基因编码的多肽片段的融合多肽中的多肽片段在表G中列出。
在一些实施方案中，融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段：SEQ ID NO:76、86、94、180、186、221、294、307、321和151；或者SEQ ID NO:77、87、95、181、187、222、295、308、322和152。
在一些实施方案中，融合多肽包含SEQ ID NO:345-350、表1中的序列和SEQ IDNO:422-424中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:345-350、表1中的序列和SEQ ID NO:422-424中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
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具有由HIV-1 Env、Gag、Nef和Pol编码并且预测与人HLA A*0201分子结合或由该 分子呈递的多肽片段的融合多肽
如本文所述，我们设计了具有多个多肽片段的融合多肽，计算预测这些多肽片段与人HLA A*0201分子结合或由该分子呈递。通常，此类融合多肽中选择或包含的多肽片段包含由HIV-1Env、Gag、Nef和Pol基因编码的多肽片段(例如，不包含由HIV-1Tat、Rev、Vif、Vpr或Vpu基因编码的一个或多个多肽片段)，并且预计这些多肽片段与以小于约1,000nM的IC50值与人HLA A*0201分子结合。在某些实施方案中，此类融合多肽中选择或包含的多肽片段包含由HIV-1Env、Gag、Nef和Pol基因编码的多肽片段(例如，不包含由HIV-1Tat、Rev、Vif、Vpr或Vpu基因编码的一个或多个多肽片段)，并且预计这些多肽片段与以在多肽片段群体中的前5％内的百分位等级与人HLA A*0201分子结合。在一些实施方案中，融合多肽包含由Gag、Pol、Env和Nef基因编码的病毒蛋白的片段或者由所述片段组成，其中多个多肽片段中的每一个可以与人HLA等位基因A*0201结合或由该等位基因呈递。
在一些实施方案中，多个多肽片段中的每一个的长度为8-35个氨基酸，例如长度为9-34个氨基酸，例如长度为9-25个氨基酸。
在一些实施方案中，融合多肽包含至少2个多肽片段，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40个或更多个以下片段：其包含选自以下项的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO:6、7、15、16、21、22、30、60、61、78、79、96、99、100、107、108、113、114、121、122、123、124、137、138、153、154、172、173、192、201、202、215、216、217、218、219、220、229、230、231、240、241、242、243、244、265、276、277、298、299、302、311、312、327、328、331、332、333、336和337；SEQ ID NO:6、15、21、30、60、78、99、107、113、121、123、137、153、172、192、201、215、217、219、229、230、240、241、243、265、276、298、302、311、327、331、333和336；SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、19、20、27、55、56、57、58、59、60、61、78、79、90、91、97、98、99、100、105、106、107、108、111、112、113、114、117、118、119、120、121、122、123、124、137、138、153、154、155、156、157、158、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、190、191、192、197、198、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、238、239、261、262、274、275、276、277、296、297、298、299、300、301、302、303、304、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、343和344；SEQ ID NO:1、10、19、27、55、56、57、78、90、97、105、111、117、119、137、153、165、190、197、209、210、211、225、227、234、238、261、296、300、303、323、325、329和334。包含在具有由HIV-1Env、Gag、Nef和Pol基因编码并且预测与人HLAA*0201分子结合或由该分子呈递的多肽片段的融合多肽中的多肽片段在表H中列出。
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在一些实施方案中，融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段：SEQ ID NO:201、78、107、96、229、172、327、6、333、243、331、192、265、311、137、15、123、30、336、302、153、219、298、121、230、240、60、241、276、113、99、21、217和215；SEQ ID NO:78、296、1、339、197、329、232、323、303、234、90、261、274、238、211、325、137、227、209、190、341、57、225、27、210、119、19、165、334、117、153、10、97和300；或者SEQ ID NO:296、1、78、197、339、227、261、274、238、325、137、329、303、234、90、232、27、57、225、323、190、341、119、19、165、334、117、153、10、97和300。
在一些实施方案中，融合多肽包含SEQ ID NO:367-377和411中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:367-377和411中的任一者80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
信号或前导序列
在各种实施方案中，融合多肽包括信号序列或信号肽，例如以引导融合多肽在细胞内运输至蛋白酶体或溶酶体室。在各种实施方案中，融合多肽包括N末端和/或C末端处的信号序列。在一些实施方案中，融合多肽包括N末端信号肽或前导序列。在各种实施方案中，信号肽或前导序列来自选自以下项的源蛋白：血清蛋白、细胞因子、趋化因子、伴侣蛋白、不变蛋白和将蛋白质引导到溶酶体室的蛋白质。在一些实施方案中，信号肽或前导序列来自选自由以下项组成的组的源蛋白：集落刺激因子2(CSF2、GM-CSF)、组织型纤溶酶原活化剂(PLAT、t-PA)、C-C基序趋化因子配体7(CCL7、MCP-3)、C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10、IP-10)、连环蛋白β1(CTNNB1)、CD74(p33；DHLAG；HLADG；Ia-GAMMA、不变链)、血清白蛋白(ALB)、聚泛素B/C(UBB/UBC)、钙网蛋白(CALR)、水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)、溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)和溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)。在某些实施方案中，融合多肽包括来自LAMP-1的N末端和C末端信号序列，例如分别为SEQ ID NO:399和412。在各种实施方案中，信号肽或前导序列选自SEQ ID NO:393-402和412-413中的任一者的氨基酸序列或与SEQ IDNO:393-402和412-413中的任一者至少95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。可以用于本发明融合多肽中的例示性信号序列在表I中提供。
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具有和不具有根据本文所述的方法设计和组装的信号序列的例示性融合多肽在表J中提供。
在各种实施方案中，本文所述的融合多肽不包括1、2、3、4、5个或更多个或任何或全部以下多肽片段：其包含SEQ ID NO:437-461的HIV-1氨基酸序列或与SEQ ID NO:437-461的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或它们的子序列或者由所述氨基酸序列或所述序列或它们的子序列组成。在某些实施方案中可以从本文所述的融合多肽中排除(即，不包括在其中)的氨基酸序列在表K中提供。
还提供了用于制备融合多肽、药物组合物、免疫原性组合物或包含它们的疫苗组合物的方法。在一些具体实施中，这些方法包括使用肽合成构建融合多肽。在一些具体实施中，这些方法包括使用合成或重组DNA技术构建编码二价抗原的多肽中的每一种并从表达载体表达多肽的多核苷酸。在一些具体实施中，这些方法还可包括将多核苷酸插入一种或多种载体中并在细胞中表达编码的多肽。
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3.编码融合多肽的多核苷酸
提供了编码本文所述的融合多肽的多核苷酸、包含此类多核苷酸的载体以及包含此类多核苷酸或表达载体的宿主细胞(例如，人类细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、细菌细胞，例如大肠杆菌)。本文提供了包含编码本文所提供的融合多肽中任一种的核苷酸序列的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸序列的表达盒和载体，例如用于在宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)中有效表达的表达载体。在各种实施方案中，多核苷酸是DNA、cDNA、mRNA、自扩增RNA(SAM)、自复制RNA或自扩增复制子RNA(RepRNA)。在一些实施方案中，多核苷酸包括甲病毒自复制或自扩增复制子RNA(RepRNA)。自复制RNA和自扩增复制子RNA作为疫苗递送模式在以下文献中描述：例如Tews等人，Methods Mol Biol.(2017)1499:15-35；Démoulins等人，Methods Mol Biol.(2017)1499:37-75；Englezou等人，MolTher Nucleic Acids.(2018)12:118-134；McCollough等人，Vaccines(Basel).(2014)2(4):735-54；以及McCollough等人，Mol Ther Nucleic Acids.(2014)3:e173。
术语“多核苷酸”和“核酸分子”可互换地指核苷酸的聚合形式，并且包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义链和反义链，以及上述的合成形式和混合聚合物。如本文所用，术语“核酸分子”可与术语“多核苷酸”互换。在一些实施方案中，核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式以及它们的组合。该术语还包括但不限于单链和双链形式的DNA。另外，多核苷酸例如cDNA或mRNA，可包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸中的一者或两者。如本领域技术人员将容易理解的，核酸分子可以是化学修饰或生物化学修饰的，或者可含有非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代天然存在的核苷酸中的一者或多者、核苷酸间修饰诸如不带电的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧链部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化物和修饰的键(例如，α异头核酸等)。上述术语还旨在包括任何拓扑构象，包括单链构象、双链构象、部分双链构象、三链构象、发夹构象、环状构象和挂锁构象。除非另外指明，否则对核酸序列的提及涵盖其互补序列。因此，对具有特定序列的核酸分子的提及应理解为涵盖其互补链及其互补序列。该术语还包括用于在所需病毒表达载体或宿主细胞中改善表达的密码子偏好性多核苷酸。
如本文所用，“取代”表示一个或多个氨基酸或核苷酸分别被不同的氨基酸或核苷酸替换。
“分离的”核酸是指已与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常包含核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。“分离的编码多肽片段或编码融合多肽的核酸”是指一种或多种编码此类多肽片段或融合多肽的核酸分子，包括单个载体或单独载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中一个或多个位置处的此类核酸分子。
如本文所用，术语多核苷酸“变体”是通常与本文具体公开的多核苷酸在一个或多个取代、缺失、添加和/或插入方面不同的多核苷酸。此类变体可以是天然存在的或可例如通过修饰本文所述的多核苷酸序列中的一者或多者并评估如本文所述的所编码的多肽的一种或多种生物活性和/或使用本领域熟知的多种技术中的任一种来合成生成。
在一些实施方案中，核酸分子具有密码子偏好性以增强在所需宿主细胞(例如，人细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或细菌细胞，例如大肠杆菌细胞)中的表达。因此，提供了编码本文所述的融合多肽的多核苷酸，其中多核苷酸具有密码子偏好性，包含替换异源信号序列，并且/或者消除了mRNA不稳定性元件。产生密码子偏好性核酸的方法可以通过调整在以下文献中描述的方法进行：例如美国专利号5,965,726、6,174,666、6,291,664、6,414,132和6,794,498。用于从所需病毒表达载体和/或在所需宿主细胞中表达包含HIV-1多肽片段的融合多肽的优选密码子使用例如在kazusa.or.jp/codon/和genscript.com/tools/codon-frequency-table中提供。
在一些实施方案中，编码如本文所述的融合多肽的多核苷酸具有与选自由如表L中提供的SEQ ID NO:414-418组成的组的核酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸序列。
视情况而定，在某些实施方案中，编码本文所述的融合多肽的多核苷酸的3’端包含一个或或多个串联终止密码子，例如两个或更多个串联TAG(“琥珀(amber)”)、TAA(“赭石(ochre)”)或TGA(“乳白(opal)”或“棕土(umber)”)终止密码子。多个串联终止密码子可以相同或不同。
还提供了表达盒，其包含编码如本文所述的融合多肽的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到一个或多个调控序列。在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接到组成型启动子并且受组成型启动子的控制。在一些实施方案中，启动子选自巨细胞病毒主要即刻早期启动子(CMV)、与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)融合的增强子CMV、人延长因子-1α(HEF-1α)、小鼠巨细胞病毒(小鼠CMV)、中国仓鼠延长因子-1α(CHEF-1α)和磷酸甘油酸激酶(PGK)。
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4.载体和宿主细胞
还提供了包含编码本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸的载体，或者或包含此类多核苷酸的表达盒。载体可以是任何类型，例如重组载体，诸如表达载体。载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)以及衍生自噬菌体或植物或动物(包括人)病毒的载体。载体可以包括被所提出的宿主细胞识别的复制起点，并且就表达载体而言，包括启动子和被宿主细胞识别的其他调控区。在另外的实施方案中，载体包含编码本公开的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到启动子和任选地另外的调节元件。某些载体能够在它们所引入的宿主中自主复制(例如，具有细菌复制起点的载体可以在细菌中复制)。其他载体可以在引入宿主时整合到宿主的基因组中，由此与宿主基因组一起复制。载体包括但不限于适用于重组产生本文所公开的融合多肽的那些。
如本文所用，术语“载体”是指能够使与其连接的另一个核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自复制核酸结构的载体以及整合到已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体适用于递送本申请的核酸分子或多核苷酸。某些载体能够引导与它们有效连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为表达载体。
术语“可操作地连接”是指通常物理连接并且彼此具有功能关系的两个或更多个核酸序列元件。例如，如果启动子能够引发或调控编码序列的转录或表达，则该启动子可操作地连接至编码序列，在这种情况下，该编码序列应理解为“处于该启动子的控制下”。
载体的选择取决于随后的重组程序和使用的宿主。将载体引入宿主细胞中可以尤其通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、电穿孔、病毒感染或经由如本文所述向受试者施用来实现。载体可自主复制或可与它们所整合的染色体一起复制。在某些实施方案中，载体含有一种或多种选择标志物。标志物的选择可取决于选择的宿主细胞。这些包括但不限于，卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、zeocin、来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)和来自小鼠的二氢叶酸还原酶基因(dhfr)。本公开还涵盖包含编码本文所述的融合多肽的一种或多种核酸分子的载体，所述核酸分子可操作地连接到编码可以用于分离融合多肽的蛋白质或肽(“纯化标签”)的一种或多种核酸分子。这些蛋白质或肽包括但不限于FLAG标签(DYKDDDDKL；SEQ ID NO:436)、谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、金属结合多组氨酸、绿色荧光蛋白、荧光素酶和β-半乳糖苷酶。
在其他实施方案中，使用的载体是pcDNATM3.1+(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher,MA)。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。视情况而定，病毒载体可以是DNA病毒或RNA病毒，包括自复制RNA病毒。自复制RNA病毒包括甲病毒，并且在例如以下文献中描述：Lundstrom,Molecules.(2018)23(12).pii:E3310(PMID:30551668)；以及Ljungberg等人，Expert Rev Vaccines.(2015)14(2):177-94)。在各种实施方案中，病毒载体来自选自由以下项组成的组的病毒：腺病毒、腺相关病毒、沙粒病毒、甲病毒、自复制甲病毒、痘病毒、巨细胞病毒、弹状病毒、水疱性口炎病毒、黄病毒、马拉巴病毒和牛痘病毒。在一些实施方案中，病毒载体来自选自由以下项组成的组的病毒家族：腺病毒科(例如腺病毒、腺相关病毒)、沙粒病毒科(例如淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒、卡利哺乳动物沙粒病毒(又名皮秦德哺乳动物沙粒病毒))、疱疹病毒科(例如巨细胞病毒、疱疹病毒，例如HSV-1)、细小病毒科(例如细小病毒H1)、痘病毒科(例如牛痘病毒，例如修饰的牛痘安卡拉(MVA))、副粘病毒科(例如麻疹病毒)、黄病毒科(例如黄热病病毒)、呼肠病毒科(例如呼肠病毒)、微小核糖核酸病毒科(例如柯萨基病毒、塞内卡谷病毒、脊髓灰质炎病毒)、副粘病毒科(例如麻疹病毒、新城疫病毒(NDV))、弹状病毒科(例如水疱性病毒，包括马拉巴水疱性病毒和水疱性口炎病毒(VSV))、披膜病毒科(例如甲病毒，例如自复制甲病毒；辛德毕斯病毒)、肠道病毒科(例如艾柯病毒)。用于表达本发明融合多肽的例示性修饰的牛痘病毒载体例如在WO 2019/134049中描述。
在一些实施方案中，病毒表达载体是选自以下项的沙粒病毒载体：淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)(NCBI：txid11623)、卡利哺乳动物沙粒病毒(又名皮秦德哺乳动物沙粒病毒或皮秦德沙粒病毒)(NCBI：txid2169993)、瓜纳里托病毒(GTOV)(NCBI：txid45219)、阿根廷哺乳动物沙粒病毒(又名胡宁病毒(JUNV))(NCBI：txid2169991)、拉沙病毒(LASV)(NCBI：txid11620)、卢约病毒(LUJV)(NCBI：txid649188)、马丘波病毒(MACV)(NCBI：txid11628)、巴西哺乳动物沙粒病毒(又名萨比亚病毒(SABV))(NCBI：txid2169992)和白水阿罗约病毒(WWAV)(NCBI：txid46919)。在一些实施方案中，病毒表达载体是选自以下项的沙粒病毒载体：淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)或卡利哺乳动物沙粒病毒(又名皮秦德哺乳动物沙粒病毒或皮秦德沙粒病毒)。可以用作本文描述的融合多肽的递送和表达媒介的例示性沙粒病毒载体例如在以下文献中描述：WO 2009/083210；WO 2015/183895；WO 2016/075250；WO 2017/198726；以及美国专利号9,943,585。
在一些实施方案中，病毒表达载体是例如来自人腺病毒或猿腺病毒(例如，黑猩猩腺病毒、大猩猩腺病毒或恒河猴腺病毒)的腺病毒载体。在一些实施方案中，腺病毒载体选自血清型5腺病毒(Ad5)、血清型26腺病毒(Ad26)、血清型34腺病毒(Ad34)、血清型35腺病毒(Ad35)、血清型48腺病毒(Ad48)、黑猩猩腺病毒(例如，ChAd3(AdC3)、ChAd5(AdC5)、ChAd6(AdC6)、ChAd7(AdC7)、ChAd8(AdC8)、ChAd9(AdC9)、ChAd10(AdC10)、ChAd11(AdC11)、ChAd17(AdC17)、ChAd16(AdC16)、ChAd19(AdC19)、ChAd20(AdC20)、ChAd22(AdC22)、ChAd24(AdC24)、ChAdY25、ChAd26(AdC26)、ChAd28(AdC28)、ChAd30(AdC30)、ChAd31(AdC31)、ChAd37(AdC37)、ChAd38(AdC38)、ChAd43(AdC43)、ChAd44(AdC44)、ChAd55(AdC55)、ChAd63(AdC63)、ChAdV63、ChAd68(AdC68)、ChAd73(AdC73)、ChAd82(AdC82)、ChAd83(AdC83)、ChAd143(AdC143)、ChAd144(AdC144)、ChAd145(AdC145)、ChAd147(AdC147))、大猩猩腺病毒(例如，GC44、GC45、GC46)和恒河猴腺病毒(例如，RhAd51、RhAd52、RhAd53、RhAd54、RhAd55、RhAd56、RhAd57、RhAd58、RhAd59、RhAd60、RhAd61、RhAd62、RhAd63、RhAd64、RhAd65、RhAd66)。可以用作本文描述的融合多肽的递送和表达媒介的例示性黑猩猩、大猩猩或恒河猴腺病毒载体例如在以下文献中描述：WO 2019/076880；WO 2019/076877；Andrabi等人，(2019)Cell Reports27:2426–2441；Guo等人，Hum Vaccin Immunother.(2018)14(7):1679-1685；Abbink等人，J Virol.(2015)89(3):1512-22；以及Abbink等人，J Virol.(2018)92(6).pii:e01924-17。
在各种实施方案中，病毒表达载体不能复制(即复制缺陷型或复制不足型)，例如与野生型病毒载体相比具有降低或减弱的复制能力(即，复制减弱型)，或者是复制能力型的。
在各种实施方案中，病毒载体或病毒表达载体是腺病毒载体，所述腺病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在各种实施方案中，病毒载体或病毒表达载体两种或更多种多核苷酸，所述多核苷酸编码两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白与以下氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或100％相同：SEQ ID NO:345和346；SEQ ID NO:347和348；SEQ ID NO:349和350；SEQ ID NO:351和352；SEQ ID NO:430和352；SEQ ID NO:357和358；SEQ ID NO:360和362；SEQ ID NO:359和361；SEQ ID NO:351和357；SEQ ID NO:351和358；SEQ ID NO:351和359；SEQ ID NO:351和360；SEQ ID NO:351和361；SEQ ID NO:351和362；SEQ ID NO:351和407；SEQ ID NO:351和408；SEQ ID NO:351和409；SEQ ID NO:351和410；SEQ ID NO:352和357；SEQ ID NO:352和358；SEQ ID NO:352和359；SEQ ID NO:352和360；SEQ ID NO:352和361；SEQ ID NO:352和362；SEQ ID NO:352和407；SEQ ID NO:352和408；SEQ ID NO:352和409；SEQ ID NO:352和410；SEQ ID NO:430和357；SEQ ID NO:430和358；SEQ ID NO:430和359；SEQ ID NO:430和360；SEQ ID NO:430和361；SEQ ID NO:430和362；SEQ ID NO:407和409；SEQ ID NO:407和408；SEQ ID NO:408和410；或者SEQ ID NO:409和410。
在一些实施方案中，载体还包含编码细胞因子或其功能变体的多核苷酸或者非编码免疫刺激性多核苷酸。在一些实施方案中，载体还包含编码选自由以下项组成的组的细胞因子的多核苷酸：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、集落刺激因子2(CSF2；又名GM-CSF)、fms相关受体酪氨酸激酶3配体(FLT3LG)以及它们的组合和功能变体。细胞因子与疫苗的共表达和/或共同施用例如在以下文献中描述：Elizaga等人，(2018)PLoS One 13(9):e0202753(IL-12)；Buchbinder等人，(2017)PLoS One 12(7):e0179597(GM-CSF)；Abaitua等人，Virus Res(2006)116(1-2):11-20(IL12+IFN-γ)；Oudard等人，Cancer Immunol Immunother(2011)2月；60(2):261-71(IL-2+IFN-α)。在一些实施方案中，载体还包含选自病原体活化的分子模式(PAMP)、胞嘧啶-磷酸-鸟苷(CpG)寡聚脱氧核苷酸和免疫刺激性RNA(isRNA)的非编码免疫刺激性多核苷酸。例示性isRNA包括CV8102(CureVac)和例如WO2016170176中所述的其他。
还提供了宿主细胞，其包含编码本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或者表达所述融合多肽的一种或多种载体。可以使用各种宿主细胞中的任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞，诸如基于中国仓鼠卵巢(CHO)或CHO来源的细胞系(例如，CHO-S、CHO DG44、ExpiCHOTM、
Figure BDA0003546306850001711
ZFN修饰的GS-/-CHO细胞系、CHO-K1、CHO-K1a)、COS细胞、BHK细胞、NSO细胞或Bowes黑素瘤细胞。人宿主细胞的示例尤其是HeLa、911、AT1080、A549和HEK293(例如，HEK293E、HEK293F、HEK293H、HEK293T、Expi293TM)。另外，融合多肽可以在酵母细胞(诸如毕赤酵母(参见例如Powers等人，J Immunol Methods.251:123-35(2001))、汉逊酵母或酿酒酵母)中表达。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已经引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，包括原代转化细胞和由其衍生的后代，不考虑传代数。后代在核酸含量方面可能与亲本细胞不完全相同，而是可含有突变。本文包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变后代。
视情况而定，宿主细胞可以用编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸稳定或瞬时转染。视情况而定，宿主细胞可以用表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体感染。在一些实施方案中，宿主细胞能够表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种复制减弱型或复制能力型载体被感染或者能够繁殖所述载体。适用于被病毒载体感染和/或繁殖病毒载体的例示性细胞包括但不限于BHK-21、A549、Vero和HEK293(例如，HEK293E、HEK293F、HEK293H、HEK293T、Expi293TM)细胞。在某些实施方案中，宿主细胞表达柯萨基病毒和腺病毒受体(CAR)，例如MDCK、Caco-2或Calu-3宿主细胞。在某些实施方案中，多核苷酸整合到宿主细胞的基因组中。
5.药物组合物/免疫原性组合物
提供了药物组合物或免疫原性组合物，其包含如本文所述的一种或多种融合多肽，或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的多核苷酸，或包含一种或多种此类多核苷酸的病毒表达载体，以及药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。通常，本文所述的药物组合物是免疫原性的。在某些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的一种或多种融合多肽，或编码一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸，或含有编码一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸的一种或多种病毒表达载体。
根据本公开，各种药学上可接受的稀释剂、载剂和赋形剂以及用于制备和使用药物组合物的技术将是本领域技术人员已知的。例示性药物组合物和药学上可接受的稀释剂、载剂和赋形剂也在例如以下文献中描述：Loyd V.Allen Jr(编辑),“Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,”第22版，2012,Pharmaceutical Press；Brunton,Knollman and Hilal-Dandan,“Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics,”第13版，2017,McGraw-Hill Education/Medical；McNally and Hastedt(编辑),“Protein Formulation and Delivery，第2版，2007,CRC Press；Banga,“Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and DeliverySystems,”第3版，2015,CRC Press；Lars Hovgaard,Frokjaer and van de Weert(编辑),“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins,”第2版，2012,CRC Press；Carpenter and Manning(编辑),“Rational Design of Stable ProteinFormulations:Theory and Practice,”2002,Springer(Pharmaceutical Biotechnology(Book13))；Meyer(编辑),“Therapeutic Protein Drug Products:Practical Approachesto Formulation in the Laboratory,Manufacturing,and the Clinic,2012,WoodheadPublishing。
在某些实施方案中，多核苷酸或载体被配制成脂质纳米颗粒。例如，在融合多肽从自复制或自扩增RNA分子表达的一些实施方案中，自复制或自扩增RNA可以被配制成脂复合物，诸如脂质纳米颗粒(LNP)。如本文所用，“脂复合物”是指作为DNA的非病毒(合成)脂质载剂的阳离子脂质体。如本文所用，术语“脂质纳米颗粒”是指平均直径介于约10纳米至约1000纳米之间并且包括可以溶解亲脂性分子的固体脂质核基质的一个或多个球形纳米颗粒。在某些实施方案中，脂质核由表面活性剂(例如，乳化剂)稳定，并且可以包含以下项中的一种或多种：甘油三酯(例如，三硬脂精)、甘油二酯(例如，甘油山嵛酸酯)、甘油单酯(例如，单硬脂酸甘油酯)、脂肪酸(例如，硬脂酸)、类固醇(例如，胆固醇)和蜡(例如，鲸蜡醇棕榈酸酯)，包括它们的组合。脂质纳米颗粒例如在以下文献中描述：Petrilli等人，CurrPharm Biotechnol.15:847-55,2014；以及美国专利号6,217,912；6,881,421；7,402,573；7,404,969；7,550,441；7,727,969；8,003,621；8,691,750；8,871,509；9,017,726；9,173,853；9,220,779；9,227,917；和9,278,130，这些文献中的每一篇全文以引用方式并入。在一个实施方案中，编码本文所述的一种或多种融合多肽的自复制或自扩增RNA分子被配制或缩合到聚乙烯亚胺(PEI)-复合物递送媒介中，例如如以下文献中所述：Démoulins等人，Nanomedicine.(2016)4月；12(3):711-722以及Démoulins等人，J Control Release.(2017)11月28日；266:256-271，该媒介可以是纳米颗粒。
在融合多肽从病毒表达载体表达的实施方案中，病毒表达载体可以被配制用于所需的施用途径，例如作为等渗药学上可接受的水溶液用于静脉内、肌内、皮下或皮内施用。在一些实施方案中，病毒表达载体可以被配制用于粘膜(例如，颊部、鼻内或直肠内)递送。可以用于本文所述的药物组合物和方法中的病毒表达载体的例示性制剂例如在以下文献中描述：Manfredsson and Benskey编辑，“Viral Vectors for Gene Therapy:Methodsand Protocols(Methods in Molecular Biology),”2019,Book 1937in Methods inMolecular Biology Series,Humana Press；WO 2017/013169(在存在无定形糖和低盐浓度的情况下，水性混合物或冷冻干燥组合物形式的腺病毒载体制剂)；以及Kumru等人，JPharm Sci.(2018)11月；107(11):2764-2774(在Tris中缓冲并含有脯氨酸、乳糖和甘露醇作为稳定添加剂的水性制剂)。沙粒病毒载体的制剂例如在以下文献中描述：WO 2009/083210、WO2016/075250和WO 2017/198726。在某些实施方案中，病毒表达载体经由微针介导的递送进行递送，例如如Zaric等人，Expert Opin Drug Deliv.(2017)10月；14(10):1177-1187中所述。通过向鼻孔施用病毒颗粒的鼻内病毒疫苗接种例如在Dorta-Estremera等人，PLoS One.2017年12月8日；12(12):e0188807中描述。通过向直肠施用病毒颗粒的直肠内病毒疫苗接种例如在Patterson等人，Clin Vaccine Immunol.(2012)5月；19(5):629-37中描述。
在一些实施方案中，每种载剂、稀释剂或赋形剂在与药物组合物的其他成分相容并且对受试者没有伤害的意义上是“可接受的”。通常，药学上可接受的载剂是水性pH缓冲液。可以用作药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的材料的一些示例包括：水；缓冲液，例如pKa在约6.0至约8.0范围内的缓冲液，例如生理学上可接受的缓冲液，例如选自磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、柠檬酸盐、马来酸盐、甘氨酸-甘氨酸、HEPES、HEPPSO、HEPPS、咪唑、BICINE、TRICINE、Tris和BIS-Tris；糖，诸如乳糖、海藻糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可油和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；汉克溶液；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；氨基酸(例如，带电氨基酸，包括但不限于天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸)；以及用于药物制剂中的其他无毒相容物质。润湿剂、乳化剂和润滑剂(诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、释放剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。可以用于病毒表达载体、病毒体或病毒样颗粒(VLP)的阴道内或直肠内(例如，以锭剂、子宫托或栓剂的形式)递送的固体和半固体制剂例如在以下文献中描述：Brown等人，PLoS One.2017年8月17日；12(8):e0183510；Brown等人，PLoS One.2016年3月10日；11(3):e0151184；以及Amacker等人，npj Vaccines 5,41(2020)。
在一种特定制剂中，本文所述的沙粒病毒载体(例如，LCMV或皮秦德哺乳动物沙粒病毒载体)以如下等渗水溶液形式配制：其包含pH为中性或接近中性、pKa在约6.0至约8.0范围内的生物相容性缓冲液(例如，HEPES和NaCl)以及非离子表面活性剂(例如，
Figure BDA0003546306850001751
F68(又名泊洛沙姆188))。在一种特定制剂中，本文所述的沙粒病毒载体(例如，LCMV或皮秦德哺乳动物沙粒病毒载体)以如下等渗水溶液形式配制：其包含pH为7.4的HEPES缓冲液、NaCl和
Figure BDA0003546306850001752
F68(又名泊洛沙姆188)。Schleiss等人(Clin Vaccine Immunol.2017年1月5日；24(1):e00300-16)描述了以稀释剂(25mM HEPES、150mM NaCl、0.01％
Figure BDA0003546306850001753
F68；pH 7.4)形式配制LCMV载体，其可以用于配制本文所描述的沙粒病毒载体。添加最终浓度为10％的山梨糖醇，然后在低于-60℃下冷冻。
药物组合物的制剂和递送方法通常将根据待治疗的部位和疾病进行调整。示例性制剂包括但不限于适合肠胃外施用(例如，静脉内、动脉内、肌内或皮下施用)的那些，包括封装在胶束、脂质体或药物释放胶囊中的制剂(掺在被设计用于缓慢释放的生物相容性涂层内的活性剂)；可摄取制剂；用于局部使用的制剂，诸如乳膏、软膏和凝胶；以及其他制剂，诸如吸入剂、气雾剂和喷雾剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于肠胃外(例如，静脉内、皮下或口服)施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于粘膜(例如，颊部、鼻内、直肠内和/或阴道内)施用。
在某些实施方案中，药物组合物是无菌的。在某些实施方案中，药物组合物具有4.5至8.5、4.5至6.5、6.5至8.5范围内的pH，或者约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0或约8.5的pH。在一个实施方案中，药物组合物具有240-260或250-330mOsmol/L范围内的同渗浓摩。在某些实施方案中，药物组合物是等渗或接近等渗的。
在一些实施方案中，药物组合物是液体或固体。在一些实施方案中，药物组合物包含水溶液。在一些实施方案中，药物组合物是冻干的或是冷冻液体。
在一些实施方案中，药物组合物还包含一种或多种附加治疗剂，例如第二治疗剂或第二治疗剂和第三治疗剂，用于如本文所述的联合疗法。
在某些实施方案中，药物组合物还包含佐剂。可以与本文所述的融合多肽、编码此类融合多肽的多核苷酸和表达此类融合多肽的载体共同配制或共同施用的例示性佐剂包括但不限于细胞因子、趋化因子、免疫共刺激分子、免疫抑制途径的toll样受体激动剂或抑制剂，如本文和Li等人，Curr Issues Mol Biol.(2017)22:17-40中所述。可以与本文所述的融合多肽、编码此类融合多肽的多核苷酸和表达此类融合多肽的载体共同配制或共同施用的其他佐剂包括但不限于矿物盐(例如铝盐(例如矾)、磷酸钙、不完全弗罗因德佐剂)、脂质颗粒(例如MF59、脂质卷(cochleate)、病毒样颗粒)、微粒(例如病毒体、聚乳酸(PLA)、聚[丙交酯-共乙交酯](PLG))、免疫增效剂(例如dsRNA:Poly(I:C)、Poly-IC:LC、单磷酰基脂质A(MPL)、LPS、鞭毛蛋白、咪唑啉喹啉:咪喹莫特(R837)、瑞喹莫德(848)、CpG寡聚脱氧核苷酸(ODN)、胞壁酰二肽(MDP)、皂苷(QS-21)和粘膜佐剂(例如，霍乱毒素(CT)、不耐热肠毒素(LTK3和LTR72)、壳聚糖)。可以与本文所述的融合多肽、编码此类融合多肽的多核苷酸和表达此类融合多肽的载体共同配制或共同施用的佐剂在Apostólico等人，J Immunol Res.(2016)2016:1459394中汇总。
在某些实施方案中，药物组合物还包含免疫调节剂。可以与本文所述的融合多肽、编码此类融合多肽的多核苷酸和表达此类融合多肽的载体共同配制或共同施用的例示性免疫调节剂包括但不限于toll样受体激动剂和小分子免疫检查点抑制剂。可以共同配制或共同施用的示例TLR7激动剂包括但不限于AL-034、DSP-0509、GS-9620(维沙莫特)、LHC-165、TMX-101(咪喹莫特)、GSK-2245035、瑞喹莫德、DSR-6434、DSP-3025、IMO-4200、MCT-465、MEDI-9197、3M-051、SB-9922、3M-052、Limtop、TMX-30X、TMX-202、RG-7863、RG-7854和RG-7795。可以共同配制或共同施用的例示性TLR7/TLR8激动剂包括CV8102、NKTR-262、特拉莫德(telratolimod)和BDB-001。可以共同配制或共同施用的示例TLR8激动剂包括但不限于E-6887、IMO-4200、IMO-8400、IMO-9200、MCT-465、MEDI-9197、莫托莫德(motolimod)、瑞喹莫德、GS-9688、VTX-1463、VTX-763、3M-051、3M-052。可以共同配制或共同施用的示例TLR9激动剂包括但不限于AST-008、可比托莫特(cobitolimod)、CMP-001、IMO-2055、IMO-2125、利尼莫特(litenimod)、MGN-1601、BB-001、BB-006、IMO-3100、IMO-8400、IR-103、IMO-9200、阿格托莫特(agatolimod)、DIMS-9054、DV-1079、DV-1179、AZD-1419、来非莫特(lefitolimod)(MGN-1703)、CYT-003、CYT-003-QbG10、替索托利莫特(tilsotolimod)和PUL-042。可以共同配制或共同施用的CD274或PDCD1的小分子抑制剂的示例包括但不限于GS-4224、GS-4416、INCB086550和MAX10181。可以共同配制或共同施用的CTLA4的示例小分子抑制剂包括BPI-002。
在一些实施方案中，药物组合物或免疫原性组合物包含两种或更多种融合多肽、编码此类融合多肽的两种或更多种多核苷酸或表达此类融合多肽的两种或更多种载体的混合物。例如，在某些实施方案中，混合物包含如本文所述的融合多肽的二价对。在一些实施方案中，药物组合物包含两种或更多种融合多肽、编码此类融合多肽的两种或更多种多核苷酸或表达此类融合多肽的两种或更多种载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQID NO:70、76、94、151和161；以及SEQ ID NO:71、77、95、152和162。在一些实施方案中，药物组合物包含两种或更多种融合多肽、编码此类融合多肽的两种或更多种多核苷酸或表达此类融合多肽的两种或更多种载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQ ID NO:188、305、28、41、294、4、176、11、319、259、282、223、213和37；SEQ ID NO:188、305、28、41和294；SEQID NO:4、176、11、319、259、282、223、213和37；SEQ ID NO:189、306、29、42、295、5、177、12、320、260、283、224、214和38；SEQ ID NO:189、306、29、42和295；SEQ ID NO:5、177、12、320、260、283、224、214和38；SEQ ID NO:305、319、259、282、223、213、294、176和188；SEQ ID NO:306、320、260、283、224、214、295、177和189；SEQ ID NO:305、294、223、213、176、259、319、188和282；SEQ ID NO:306、295、224、214、177、260、320、189和283；SEQ ID NO:305、294、319、259、282、223、176和188；SEQ ID NO:306、295、320、260、283、224、177和189；SEQ IDNO:305、223、294、176、259、319、188和282；以及SEQ ID NO:306、224、295、177、260、320、189和283。在一些实施方案中，药物组合物包含两种或更多种融合多肽、编码此类融合多肽的两种或更多种多核苷酸或表达此类融合多肽的两种或更多种载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQ ID NO:76、86、94、180、186、221、294、307、321和151；以及SEQ ID NO:77、87、95、181、187、222、295、308、322和152。
在一些实施方案中，药物组合物或免疫原性组合物包含两种或更多种融合多肽、编码此类融合多肽的两种或更多种多核苷酸或表达此类融合多肽的两种或更多种载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:351-356和430中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:351-356和430中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列序列组成。在一些实施方案中，药物组合物或免疫原性组合物包含两种或更多种融合多肽、编码此类融合多肽的两种或更多种多核苷酸或表达此类融合多肽的两种或更多种载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物或免疫原性组合物包含两种或更多种融合多肽、编码此类融合多肽的两种或更多种多核苷酸或表达此类融合多肽的两种或更多种载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:345-350、表1中的序列和SEQ ID NO:422-424中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:345-350、表1中的序列和SEQ ID NO:422-424中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
在一些实施方案中，药物组合物或免疫原性组合物包含第一融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体，所述融合多肽包含由HIV-1Gag和Nef基因编码的一个或多个多肽片段；以及第二融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽包含由HIV-1Pol或Pol和Env基因编码的一个或多个多肽片段。在一些实施方案中，药物组合物或免疫原性组合物包含(1)一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达此类融合多肽的一种或多种载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQ ID NO:70、76、94、151和161；或者SEQ ID NO:71、77、95、152和162；以及(2)一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达此类融合多肽的一种或多种载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQ IDNO:188、305、28、41、294、4、176、11、319、259、282、223、213和37；SEQ ID NO:188、305、28、41和294；SEQ ID NO:4、176、11、319、259、282、223、213和37；SEQ ID NO:189、306、29、42、295、5、177、12、320、260、283、224、214和38；SEQ ID NO:189、306、29、42和295；SEQ ID NO:5、177、12、320、260、283、224、214和38；SEQ ID NO:305、319、259、282、223、213、294、176和188；SEQ ID NO:306、320、260、283、224、214、295、177和189；SEQ ID NO:305、294、223、213、176、259、319、188和282；SEQ ID NO:306、295、224、214、177、260、320、189和283；SEQ IDNO:305、294、319、259、282、223、176和188；SEQ ID NO:306、295、320、260、283、224、177和189；SEQ ID NO:305、223、294、176、259、319、188和282；或者SEQ ID NO:306、224、295、177、260、320、189和283。在一些实施方案中，药物组合物或免疫原性组合物包含(1)一种或多种融合多肽、编码此类融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达此类融合多肽的一种或多种载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:351-356和430中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:351-356和430中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列；以及(2)一种或多种融合多肽、编码此类融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达此类融合多肽的一种或多种载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者的氨基酸序列或与SEQID NO:357-366和407-410中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
在一些实施方案中，药物组合物或免疫原性组合物包含一种或多种病毒载体，每种病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白与以下氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或100％相同：SEQ ID NO:345和346；SEQ ID NO:347和348；SEQ ID NO:349和350；SEQ ID NO:351和352；SEQ ID NO:430和352；SEQ ID NO:357和358；SEQ ID NO:360和362；SEQ ID NO:359和361；SEQ ID NO:351和357；SEQ ID NO:351和358；SEQ ID NO:351和359；SEQ ID NO:351和360；SEQ ID NO:351和361；SEQ ID NO:351和362；SEQ ID NO:351和407；SEQ ID NO:351和408；SEQ ID NO:351和409；SEQ ID NO:351和410；SEQ ID NO:352和357；SEQ ID NO:352和358；SEQ ID NO:352和359；SEQ ID NO:352和360；SEQ ID NO:352和361；SEQ ID NO:352和362；SEQ ID NO:352和407；SEQ ID NO:352和408；SEQ ID NO:352和409；SEQ ID NO:352和410；SEQ ID NO:430和357；SEQ ID NO:430和358；SEQ ID NO:430和359；SEQ ID NO:430和360；SEQ ID NO:430和361；SEQ ID NO:430和362；SEQ ID NO:407和409；SEQ ID NO:407和408；SEQ ID NO:408和410；或者SEQ ID NO:409和410。
在一些实施方案中，药物组合物或免疫原性组合物包含融合多肽、编码此类多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体，该融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQ ID NO:201、78、107、96、229、172、327、6、333、243、331、192、265、311、137、15、123、30、336、302、153、219、298、121、230、240、60、241、276、113、99、21、217和215；SEQ ID NO:78、296、1、339、197、329、232、323、303、234、90、261、274、238、211、325、137、227、209、190、341、57、225、27、210、119、19、165、334、117、153、10、97和300；或者SEQ ID NO:296、1、78、197、339、227、261、274、238、325、137、329、303、234、90、232、27、57、225、323、190、341、119、19、165、334、117、153、10、97和300。在一些实施方案中，药物组合物或免疫原性组合物包含融合多肽、编码此类多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体，该融合多肽包含SEQ ID NO:367-377、411、422-424和431-435中的任一者的氨基酸序列或与367-377、411、422-424和431-435中的任一者80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
6.治疗方法
还提供了用于治疗或预防有需要的受试者(例如，人类受试者)的HIV感染或相关疾病或障碍的方法，其包括向有需要的受试者提供有效量的如本文所述的一种或多种融合多肽或者编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或者表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体。如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物。哺乳动物可以是任何哺乳动物，例如人、非人灵长类动物(例如猕猴)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠)、狗、猫或家养动物(诸如奶牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪)。术语“患者”是指人类受试者。如本文所用，术语“有效量”在向受试者施用疗法的上下文中是指达到所需预防或治疗效果的疗法的量。多核苷酸可存在于载体(例如，如本文所述的病毒载体)中。在一些实施方案中，相关疾病或障碍是由HIV感染引起的。在其他实施方案中，其是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。在某些实施方案中，受试者是病毒学抑制的HIV感染的哺乳动物，而在其他实施方案中，受试者是治疗初治型的HIV感染的哺乳动物或未经病毒学抑制的经历过治疗的HIV感染的受试者。在某些实施方案中，治疗初治型受试者具有介于<50个拷贝/mL与108个拷贝/ml之间的病毒载量。在某些实施方案中，病毒学抑制的受试者具有<50个拷贝/ml的病毒载量。在另一个实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，受试者已被诊断患有HIV(例如HIV-1或HIV-2)感染或相关疾病或障碍(例如AIDS)，或被认为处于发生HIV(例如HIV-1或HIV-2)感染或相关疾病或障碍(例如AIDS)的风险中。处于HIV相关疾病或障碍的风险中的受试者包括已经与被感染的人接触或已经以某种其他方式暴露于HIV的患者。预防剂的施用可以在HIV相关疾病或障碍的特征性症状表现之前发生，使得预防疾病或障碍或者另选地延迟其进展。
在一些实施方案中，受试者被HIV-1慢性感染。在一些实施方案中，受试者被HIV-1急性感染，例如具有Fiebig IV期或更早例如Fiebig III期、Fiebig II期或Fiebig I期的HIV-1感染。在一些实施方案中，受试者未接受抗逆转录病毒疗法(ART)，或者在施用一种或多种组合物之前中断ART。在一些实施方案中，在一次或多次施用组合物之后中断ART。在一些实施方案中，与施用如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体同时施用ART。
还提供了用于预防或抑制受试者(例如，人类受试者)中HIV病毒滴度、病毒复制、病毒增殖或HIV病毒DNA、HIV前病毒DNA或HIV病毒蛋白的量增加的方法。在一个实施方案中，该方法包括向有需要的受试者提供一定量的如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体以有效防止HIV滴度增加、病毒复制，或者一定量的受试者体内的一种或多种HIV毒株或分离株的HIV蛋白。在某些实施方案中，该方法还包括在一个或多个时间点(例如，在向受试者提供如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体之前或之后)测量HIV病毒或前病毒DNA或蛋白质的量。用于确定受试者中HIV病毒或前病毒DNA或蛋白质的量的方法和生物标志物在本领域中是已知的和可获得的，并且例如在Siliciano,J.D.等人，Curr Opin.HIV AIDS,5(6):491-7(2010)以及Rouzioux,C.等人，Curr Opin HIV AIDS,8(3):170-5(2013)中所述。
在一些实施方案中，如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体可用于例如抑制某些病毒(诸如本文所述的HIV分离株)、预防性抑制或防止某些病毒(诸如本文所述的HIV分离株)的感染、检测样品中的某些病毒(诸如本文所述的HIV分离株)、抑制某些病毒(诸如本文所述的HIV分离株)或诊断某些病毒(诸如本文所述的HIV分离株)的方法中。
对于哺乳动物受试者(例如人)的体内治疗，可向受试者施用或提供药物组合物，该药物组合物包含如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体。当用于体内疗法中时，如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体通常以治疗有效量(即，消除或减少患者的病毒负荷和/或病毒储库的量)施用或提供给患者。如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体根据已知的方法施用或提供给哺乳动物受试者(例如人)，诸如但不限于静脉内施用(例如推注)或通过在一段时间内连续输注、通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体可在靶细胞位点肠胃外施用(在可能的情况下)或静脉内施用。在一个实施方案中，向受试者施用如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体经由静脉内途径进行。在另一个实施方案中，向受试者施用如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体经由皮下途径进行。在另外的实施方案中，本公开的药物组合物全身、肠胃外或局部(例如经粘膜，包括颊部、直肠内和/或阴道内途径)施用给受试者。
在某些实施方案中，本公开提供了一种用于治疗HIV感染的方法，其包括向有需要的人类受试者施用治疗有效量的如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于预防HIV感染的方法，其包括向有需要的人类受试者施用治疗有效量的如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体。
在各种实施方案中，这些方法包括施用单一融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或病毒表达载体，其中所述融合多肽包含两个或更多个多价多肽片段，例如二价多肽片段。在一些实施方案中，同时或并发向受试者施用两种或更多种融合多肽或编码所述融合多肽的两种或更多种病毒表达载体。在一些实施方案中，两种或更多种融合多肽或编码所述融合多肽的两种或更多种多核苷酸或两种或更多种病毒表达载体为二价抗原组合物的形式。
在一些实施方案中，这些方法需要向受试者施用：(1)一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQ ID NO:70、76、94、151和161；或者SEQ ID NO:71、77、95、152和162；以及(2)一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQ ID NO:188、305、28、41、294、4、176、11、319、259、282、223、213和37；SEQ ID NO:188、305、28、41和294；SEQ ID NO:4、176、11、319、259、282、223、213和37；SEQ ID NO:189、306、29、42、295、5、177、12、320、260、283、224、214和38；SEQ ID NO:189、306、29、42和295；SEQ ID NO:5、177、12、320、260、283、224、214和38；SEQID NO:305、319、259、282、223、213、294、176和188；SEQ ID NO:306、320、260、283、224、214、295、177和189；SEQ ID NO:305、294、223、213、176、259、319、188和282；SEQ ID NO:306、295、224、214、177、260、320、189和283；SEQ ID NO:305、294、319、259、282、223、176和188；SEQ ID NO:306、295、320、260、283、224、177和189；SEQ ID NO:305、223、294、176、259、319、188和282；或者SEQ ID NO:306、224、295、177、260、320、189和283。
在一些实施方案中，这些方法需要向受试者施用：(1)一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽包含SEQ IDNO:351-356和430中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:351-356和430中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列序列组成；以及(2)一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用一种或多种病毒载体，其中每种病毒载体包含两种或更多种多核苷酸，所述多核苷酸编码两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白与以下氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或100％相同：SEQ ID NO:345和346；SEQ ID NO:347和348；SEQ ID NO:349和350；SEQ ID NO:351和352；SEQ ID NO:430和352；SEQ ID NO:357和358；SEQ ID NO:360和362；SEQ ID NO:359和361；SEQ ID NO:351和357；SEQ ID NO:351和358；SEQ ID NO:351和359；SEQ ID NO:351和360；SEQ ID NO:351和361；SEQ ID NO:351和362；SEQ ID NO:351和407；SEQ ID NO:351和408；SEQ ID NO:351和409；SEQ ID NO:351和410；SEQ ID NO:352和357；SEQ ID NO:352和358；SEQ ID NO:352和359；SEQ ID NO:352和360；SEQ ID NO:352和361；SEQ ID NO:352和362；SEQ ID NO:352和407；SEQ ID NO:352和408；SEQ ID NO:352和409；SEQ ID NO:352和410；SEQ ID NO:430和357；SEQ ID NO:430和358；SEQ ID NO:430和359；SEQ ID NO:430和360；SEQ ID NO:430和361；SEQ ID NO:430和362；SEQ ID NO:407和409；SEQ ID NO:407和408；SEQ ID NO:408和410；或者SEQ ID NO:409和410。
在一些实施方案中，这些方法需要向受试者施用一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQ ID NO:201、78、107、96、229、172、327、6、333、243、331、192、265、311、137、15、123、30、336、302、153、219、298、121、230、240、60、241、276、113、99、21、217和215；SEQ IDNO:78、296、1、339、197、329、232、323、303、234、90、261、274、238、211、325、137、227、209、190、341、57、225、27、210、119、19、165、334、117、153、10、97和300；或者SEQ ID NO:296、1、78、197、339、227、261、274、238、325、137、329、303、234、90、232、27、57、225、323、190、341、119、19、165、334、117、153、10、97和300。
在一些实施方案中，这些方法需要向受试者施用一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:367-377、411、422-424和431-435中的任一者的氨基酸序列或与367-377、411、422-424和431-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
在一些实施方案中，这些方法需要施用表达一种或多种融合多肽的一种或多种病毒表达载体。在各种实施方案中，这些方法需要每次施用施用约103至约1012个病毒病灶形成单位(FFU)或噬菌斑形成单位(PFU)或感染单位(IU)或病毒颗粒(vp)，例如约104至约107个病毒FFU或PFU或IU或vp，例如约103至约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个病毒FFU或PFU或IU或vp。
在各种实施方案中，所述方法实施初免-加强方案。在各种实施方案中，初免-加强方案包括在第一时间点施用初免组合物并在一个或多个后续时间点施用一种或多种加强组合物(例如，初免-加强-加强-加强等)。在各种实施方案中，初免-加强方案包括一次或多次迭代在第一时间点施用初免组合物并在第二时间点施用加强组合物(例如，初免-加强-初免-加强等)。实施初免-加强方案包括一次或多次迭代在第一时间点施用初免组合物并在第二时间点施用加强组合物(例如，初免-加强-初免-加强等)，这可以促进主要在融合多肽上集中或训练的免疫应答，并减少或避免诱导在载体主链和/或载体特异性蛋白质上集中或训练的免疫应答。在一些实施方案中，初免组合物和一种或多种加强组合物的施用间隔至少1周、2周、3周或1个月，例如至少2、3、4、5或6个月。在一些实施方案中，初免组合物和加强组合物包含相同的免疫原性组合物。在一些实施方案中，初免组合物和加强组合物包含不同的免疫原性组合物。在一些实施方案中，初免组合物和加强组合物包含相同的一种或多种融合多肽和相同的多核苷酸或病毒表达载体。在一些实施方案中，初免组合物和加强组合物包含不同的融合多肽和相同的多核苷酸或病毒表达载体。在一些实施方案中，初免组合物和加强组合物包含相同的融合多肽和不同的多核苷酸或病毒表达载体。在一些实施方案中，这些方法需要用第一多核苷酸或病毒表达载体初免，并用第二多核苷酸或病毒表达载体加强。
在各种实施方案中，初免-加强方案包括：
a)用病毒表达载体初免并用多核苷酸加强，其中所述多核苷酸是DNA、cDNA、mRNA或自复制RNA；
b)用多核苷酸初免，其中所述多核苷酸是DNA、cDNA、mRNA或自复制RNA，并用病毒表达载体加强；
c)用第一病毒表达载体初免并用第二病毒表达载体加强，其中所述第一病毒表达载体和所述第二病毒表达载体来自相同、相关或不相关的分类学家族；
d)用第一复制不足型病毒表达载体初免并用第二复制不足型病毒表达载体加强，其中所述第一复制不足型病毒表达载体和所述第二复制不足型病毒表达载体来自相同、相关或不相关的分类学家族；
e)用第一减弱不足型病毒表达载体初免并用第二复制减弱型病毒表达载体加强，其中所述第一复制减弱型病毒表达载体和所述第二复制减弱型病毒表达载体来自相同、相关或不相关的分类学家族；
f)用复制不足型病毒表达载体初免并用复制减弱型病毒表达载体加强；
g)用复制减弱型病毒表达载体初免并用复制不足型病毒表达载体加强；
h)用淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)病毒表达载体初免并用皮秦德哺乳动物沙粒病毒病毒表达载体加强；
i)用皮秦德哺乳动物沙粒病毒病毒表达载体初免并用淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)病毒表达载体加强；
j)用沙粒病毒病毒表达载体初免并用腺病毒病毒表达载体加强；或者
k)用腺病毒病毒表达载体初免并用沙粒病毒病毒表达载体加强。
在一些实施方案中，在任选地与本文所述的一种或多种附加治疗剂一起一次或多次施用如本文所述的一种或多种融合多肽或编码如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达如本文所述的一种或多种融合多肽的一种或多种载体之后，受试者在没有抗逆转录病毒治疗(ART)的情况下至少6个月、至少1年、至少2年、至少3年或更长时间未表现出HIV或AIDS的症状。在一些实施方案中，在一次或多次施用结合分子之后，受试者在没有抗逆转录病毒治疗(ART)的情况下至少6个月、至少1年、至少2年、至少3年或更长时间具有小于500例如小于400、小于300、小于200、小于100、小于50的病毒载量拷贝/ml血液。
7.联合疗法
在某些实施方案中，提供了用于治疗或预防患有HIV感染或具有该感染风险的人中的该感染的方法，其包括与治疗有效量的一种或多种(例如，一种、两种、三种、一种或两种或者一种至三种)附加治疗剂组合向该人施用治疗有效量的如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体。在一个实施方案中，提供了用于治疗患有HIV感染或具有该感染风险的人中的该感染的方法，其包括与治疗有效量的一种或多种(例如，一种、两种、三种、一种或两种或一种至三种)附加治疗剂组合向该人施用治疗有效量的本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐。
在各种实施方案中，与一种或多种(例如，一种、两种、三种、一种或两种或者一种至三种)附加治疗剂组合施用如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体。
在某些实施方案中，提供了用于治疗HIV感染的方法，其包括与治疗有效量的适于治疗HIV感染的一种或多种(例如，一种、两种、三种、一种或两种或者一种至三种)附加治疗剂组合，向有需要的患者施用治疗有效量的本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与一种、两种、三种、四种或更多种附加治疗剂和药学上可接受的载剂一起共同配制。在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体或其药学上可接受的盐与两种附加治疗剂组合。视情况而定，一种、两种、三种、四种或更多种附加治疗剂可以是选自相同类别的治疗剂的不同治疗剂，并且/或者它们可选自不同类别的治疗剂。
HIV组合疗法的施用
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与一种或多种附加治疗剂一起施用。本文所公开的化合物与一种或多种附加治疗剂的共同施用通常是指同时或并行或顺序施用本文所公开的化合物和一种或多种附加治疗剂，使得治疗有效量的本文所公开的化合物和一种或多种附加治疗剂均存在于患者体内。当顺序施用时，该组合可以两次或更多次施用的方式施用。
共同施用包括在施用单位剂量的一种或多种附加治疗剂之前或之后施用单位剂量的本文所公开的化合物。例如，可在施用一种或多种附加治疗剂后数秒、数分钟或数小时内施用如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体。在一些实施方案中，首先施用单位剂量的如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体，然后在数秒或数分钟内施用单位剂量的一种或多种附加治疗剂。另选地，首先施用单位剂量的一种或多种附加治疗剂，然后在数秒或数分钟内施用单位剂量的如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体。在其他实施方案中，首先施用单位剂量的如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体，然后在数小时(例如，1-12小时)后施用单位剂量的一种或多种附加治疗剂。在其他实施方案中，首先施用单位剂量的一种或多种附加治疗剂，然后在数小时(例如，1-12小时)后施用单位剂量的如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体。
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与一种或多种附加治疗剂在单一剂型中组合用于向患者同时或并行施用，例如作为用于静脉内、肌内、皮内或皮下施用的水性制剂。在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与一种或多种附加治疗剂在单一剂型中组合用于向患者同时或并行施用，例如作为直肠内栓剂。
在某些实施方案中，可以将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与一种或多种用于治疗HIV的其他化合物共同配制或共同施用。在某些实施方案中，共同配制或共同施用可以包含用于治疗HIV的另一种活性剂，诸如抗HIV抗体、toll样受体(TLR)激动剂、免疫检查点抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶的HIV非核苷或非核苷酸抑制剂、逆转录酶的HIV核苷或核苷酸抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV非催化位点(或别构)整合酶抑制剂、药代动力学增强剂以及它们的组合。
在某些实施方案中，视情况而定，一种或多种活性剂适于每日一次给药、每周一次给药、每月一次给药、每3个月一次给药、每四个月一次给药、两年一次给药或每年一次给药。
在一些实施方案中，如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体以及一种或多种附加治疗剂可以是抗HIV剂。在一些情况下，附加治疗剂可以是HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶的HIV非核苷或非核苷酸抑制剂、逆转录酶的HIV核苷或核苷酸抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV非催化位点(或别构)整合酶抑制剂、HIV进入抑制剂、HIV成熟抑制剂、HIV衣壳抑制剂、HIV Tat或Rev抑制剂、免疫调节剂、免疫治疗剂、抗体-药物缀合物、基因修饰剂、基因编辑器(诸如CRISPR/Cas9、锌指核酸酶、归巢核酸酶、合成核酸酶、TALEN)、细胞疗法(诸如嵌合抗原受体T细胞CAR-T和工程化T细胞受体TCR-T、自体T细胞疗法、工程化B细胞)、潜伏期逆转剂、基于免疫的疗法、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、HIV抗体、双特异性抗体和“抗体样”治疗蛋白、HIV p17基质蛋白抑制剂、IL-13拮抗剂、肽基脯氨酰顺反异构酶A调节剂、蛋白质二硫键异构酶抑制剂、补体C5a受体拮抗剂、DNA甲基转移酶抑制剂、HIV vif基因调节剂、Vif二聚化拮抗剂、HIV-1病毒感染因子抑制剂、HIV-1Nef调节剂、Hck酪氨酸激酶调节剂、混合谱系激酶-3(MLK-3)抑制剂、HIV-1剪接抑制剂、整合素拮抗剂、核蛋白抑制剂、剪接因子调节剂、含COMM结构域蛋白1调节剂、HIV核糖核酸酶H抑制剂、防御素调节剂、CDK-9抑制剂、树突状ICAM-3抓取非整合素1抑制剂、HIV GAG蛋白抑制剂、HIV POL蛋白抑制剂、补体因子H调节剂、泛素连接酶抑制剂、脱氧胞苷激酶抑制剂、细胞周期素依赖性激酶抑制剂、前蛋白转化酶PC9刺激剂、ATP依赖性RNA解旋酶DDX3X抑制剂、逆转录酶引发复合物抑制剂、G6PD和NADH氧化酶抑制剂、药代动力学增强剂、HIV基因疗法、HIV疫苗以及它们的组合。
在一些实施方案中，附加治疗剂选自由以下项组成的组：用于HIV的组合药物、用于治疗HIV的其他药物、HIV蛋白酶抑制剂、HIV逆转录酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV非催化位点(或别构)整合酶抑制剂、HIV进入(融合)抑制剂、HIV成熟抑制剂、潜伏期逆转剂、衣壳抑制剂、基于免疫的疗法、PI3K抑制剂、HIV抗体和双特异性抗体和“抗体样”治疗蛋白以及它们的组合。
组合药物
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与HIV组合药物组合或共同施用。可以与本公开的药剂一起使用的组合药物的示例包括
Figure BDA0003546306850001911
(依法韦仑、富马酸替诺福韦二吡呋酯和恩曲他滨)；
Figure BDA0003546306850001921
(
Figure BDA0003546306850001922
利匹韦林、富马酸替诺福韦二吡呋酯和恩曲他滨)；
Figure BDA0003546306850001923
(埃替拉韦、可比司他、富马酸替诺福韦二吡呋酯和恩曲他滨)；
Figure BDA0003546306850001924
(富马酸替诺福韦二吡呋酯和恩曲他滨；TDF+FTC)；
Figure BDA0003546306850001925
(替诺福韦艾拉酚胺和恩曲他滨)；
Figure BDA0003546306850001926
(替诺福韦艾拉酚胺、恩曲他滨和利匹韦林)；
Figure BDA0003546306850001927
(替诺福韦艾拉酚胺、恩曲他滨、可比司他和埃替拉韦)；地瑞拉韦、半富马酸替诺福韦艾拉酚胺、恩曲他滨和可比司他；依法韦仑、拉米夫定和富马酸替诺福韦二吡呋酯；拉米夫定和富马酸替诺福韦二吡呋酯；替诺福韦和拉米夫定；替诺福韦艾拉酚胺和恩曲他滨；半富马酸替诺福韦艾拉酚胺和恩曲他滨；半富马酸替诺福韦艾拉酚胺、恩曲他滨和利匹韦林；半富马酸替诺福韦艾拉酚胺、恩曲他滨、可比司他和艾维雷韦；
Figure BDA0003546306850001928
(齐多夫定和拉米夫定；AZT+3TC)；
Figure BDA0003546306850001929
(
Figure BDA00035463068500019210
硫酸阿巴卡韦和拉米夫定；ABC+3TC)；
Figure BDA00035463068500019211
(
Figure BDA00035463068500019212
洛匹那韦和利托那韦)；
Figure BDA00035463068500019213
(度鲁特韦、阿巴卡韦和拉米夫定)；BIKTARVY(比卡格韦+恩曲他滨+替诺福韦艾拉酚胺)、DOVATO、
Figure BDA00035463068500019214
(硫酸阿巴卡韦、齐多夫定和拉米夫定；ABC+AZT+3TC)；阿扎那韦和可比司他；硫酸阿扎那韦和可比司他；硫酸阿扎那韦和利托那韦；地瑞拉韦和可比司他；度鲁特韦和利匹韦林；度鲁特韦和盐酸利匹韦林；度鲁特韦、硫酸阿巴卡韦和拉米夫定；拉米夫定、奈韦拉平和齐多夫定；雷特格韦和拉米夫定；多拉韦林、拉米夫定和富马酸替诺福韦二吡呋酯；多拉韦林、拉米夫定和替诺福韦二吡呋酯；度鲁特韦+拉米夫定、拉米夫定+阿巴卡韦+齐多夫定、拉米夫定+阿巴卡韦、拉米夫定+富马酸替诺福韦二吡呋酯、拉米夫定+齐多夫定+奈韦拉平、洛匹那韦+利托那韦、洛匹那韦+利托那韦+阿巴卡韦+拉米夫定、洛匹那韦+利托那韦+齐多夫定+拉米夫定、替诺福韦+拉米夫定和富马酸替诺福韦二吡呋酯+恩曲他滨+盐酸利匹韦林、洛匹那韦、利托那韦、齐多夫定和拉米夫定；卡博特韦+利匹韦林；尔必达(依斯沙韦林；VM-1500；VM-1500A)。
可以与如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体组合的用于治疗HIV的其他药物的示例包括乙酰吗喃、阿拉泊韦、BanLec、去铁酮、Gamimune、米特法林、纳曲酮、Prolastin、REP 9、RPI-MN、VSSP、H1病毒、SB-728-T、1,5-二咖啡酰奎尼酸、rHIV7-shl-TAR-CCR5RZ、AAV-eCD4-Ig基因疗法、MazF基因疗法、BlockAide、ABX-464、AG-1105、APH-0812、BIT-225、CYT-107、HGTV-43、HPH-116、HS-10234、IMO-3100、IND-02、MK-1376、MK-2048、MK-4250、MK-8507、MK-8591、NOV-205、PA-1050040(PA-040)、PGN-007、SCY-635、SB-9200、SCB-719、TR-452、TEV-90110、TEV-90112、TEV-90111、TEV-90113、RN-18、Immuglo和VIR-576。
HIV蛋白酶抑制剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与HIV蛋白酶抑制剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的HIV蛋白酶抑制剂的示例包括安普那韦、阿扎那韦、贝卡那韦、地瑞拉韦、膦沙那韦、膦沙那韦钙、茚地那韦、硫酸茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、甲磺酸奈非那韦、利托那韦、沙奎那韦、甲磺酸沙奎那韦、替拉那韦、DG-17、TMB-657(PPL-100)、T-169、BL-008、MK-8122、TMB-607和TMC-310911。
HIV逆转录酶抑制剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与非核苷或非核苷酸抑制剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的逆转录酶的HIV非核苷或非核苷酸抑制剂的示例包括达匹韦林、地拉韦定、甲磺酸地拉韦定、多拉韦林、依法韦仑、依曲韦林、香菇多糖(lentinan)、奈韦拉平、利匹韦林、ACC-007、AIC-292、KM-023、PC-1005和依斯沙韦林(VM-1500)。
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与HIV核苷或核苷酸抑制剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的逆转录酶的HIV核苷或核苷酸抑制剂的示例包括阿德福韦、阿德福韦双特戊酯、阿兹夫定、恩曲他滨、替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺、富马酸替诺福韦艾拉酚胺、半富马酸替诺福韦艾拉酚胺、替诺福韦二吡呋酯、富马酸替诺福韦二吡呋酯、半富马酸替诺福韦二吡呋酯、
Figure BDA0003546306850001931
和VIDEX
Figure BDA0003546306850001932
(地达诺新，ddl)、阿巴卡韦、硫酸阿巴卡韦、阿洛夫定、阿立他滨、西那夫定、地达诺新、艾夫他滨、非替那韦、磷夫定替酯、CMX-157、达匹韦林、多拉韦林、依曲韦林、OCR-5753、乳清酸替诺福韦二吡呋酯、福齐夫定替酯、拉米夫定、叠氮膦、司他夫定、扎西他滨、齐多夫定、罗瓦福韦-依他拉芬酰胺(GS-9131)、GS-9148、MK-8504、MK-8591、MK-858、VM-2500和KP-1461。
HIV整合酶抑制剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与HIV整合酶抑制剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的HIV整合酶抑制剂的示例包括艾维雷韦、姜黄素、姜黄素的衍生物、菊苣酸、菊苣酸的衍生物、3,5-二咖啡酰奎尼酸、3,5-二咖啡酰奎尼酸的衍生物、金精三羧酸、金精三羧酸的衍生物、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸苯乙酯的衍生物、酪氨酸激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂的衍生物、槲皮素、槲皮素的衍生物、雷特格韦、度鲁特韦、JTK-351、比克替拉韦、AVX-15567、卡博特韦(长效注射型)、二酮喹啉-4-1衍生物、整合酶-LEDGF抑制剂、莱金(ledgins)、M-522、M-532、NSC-310217、NSC-371056、NSC-48240、NSC-642710、NSC-699171、NSC-699172、NSC-699173、NSC-699174、二苯乙烯二磺酸、T169、VM-3500和卡博特韦。
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与HIV非催化位点或别构整合酶抑制剂(NCINI)组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的HIV非催化位点或别构整合酶抑制剂(NCINI)的示例包括CX-05045、CX-05168和CX-14442。
HIV进入抑制剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与HIV进入抑制剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的HIV进入(融合)抑制剂的示例包括赛尼克韦罗、CCR5抑制剂、gp41抑制剂、CD4附着抑制剂、gp120抑制剂和CXCR4抑制剂。
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与CCR5抑制剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的CCR5抑制剂的示例包括阿普拉韦罗、维克韦罗、马拉韦罗、赛尼克韦罗、勒罗利单抗(leronlimab)(PRO-140)、阿达他韦(RAP-101)、尼非韦罗(TD-0232)、抗GP120/CD4或CCR5双特异性抗体、B-07、MB-66、多肽C25P、TD-0680和vMIP(Haimipu)。
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与gp41抑制剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的gp41抑制剂的示例包括艾博卫泰、恩夫韦肽、BMS-986197、恩夫韦肽生物改良药、恩夫韦肽生物仿制药、HIV-1融合抑制剂(P26-Bapc)、ITV-1、ITV-2、ITV-3、ITV-4、PIE-12三聚物和西夫韦肽。
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与CD4附接抑制剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的CD4附接抑制剂的示例包括依巴利珠单抗(ibalizumab)和CADA类似物。
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与gp120抑制剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的gp120抑制剂的示例包括Radha-108(受体醇)3B3-PE38、BanLec、基于膨润土的纳米医学、福斯特沙韦氨丁三醇、IQP-0831和BMS-663068。
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与CXCR4抑制剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的CXCR4抑制剂的示例包括普乐沙福、ALT-1188、N15肽和vMIP(Haimipu)。
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与HIV成熟抑制剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的HIV成熟抑制剂的示例包括BMS-955176、GSK-3640254和GSK-2838232。
潜伏期逆转剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与潜伏期逆转剂(LRA)组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的潜伏期逆转剂的示例包括toll样受体(TLR)激动剂(包括TLR7激动剂，例如GS-9620)、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂(诸如万珂、蛋白激酶C(PKC)活化剂、Smyd2抑制剂、BET-溴结构域4(BRD4)抑制剂、离子霉素、IAP拮抗剂(凋亡蛋白抑制剂，诸如APG-1387、LBW-242)、胱天蛋白酶第二线粒体衍生的活化剂(SMAC；NCBI基因ID：56616)模拟物(包括恰帕韦(ciapavir)、BI-891065、TL32711、LCL161、GDC-0917、HGS1029、AT-406)、PMA、SAHA(辛二酸胺异羟肟酸或辛二酰、苯胺和异羟肟酸)、NIZ-985、IL-15调节抗体(包括IL-15、IL-15融合蛋白和IL-15受体激动剂)、JQ1、双硫仑、两性霉素B和泛素抑制剂(诸如拉格唑拉(largazole)类似物、APH-0812和GSK-343)。PKC活化剂的示例包括吲哚内酰胺、prostratin、巨大戟醇B和DAG-内酯。
组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与组蛋白脱乙酰酶(例如，组蛋白脱乙酰酶9(HDAC9、HD7、HD7b、HD9、HDAC、HDAC7、HDAC7B、HDAC9B、HDAC9FL、HDRP、MITR；基因ID：9734))的抑制剂组合或共同施用。HDAC抑制剂的示例包括但不限于艾贝司他(abexinostat)、ACY-241、AR-42、BEBT-908、贝利司他(belinostat)、CKD-581、CS-055(HBI-8000)、CUDC-907(非美诺司他(fimepinostat))、恩替司他(entinostat)、吉维司他(givinostat)、莫西司他(mocetinostat)、帕比司他(panobinostat)、普瑞司他(pracinostat)、奎西诺司他(quisinostat)(JNJ-26481585)、瑞米司他、利可林司他(ricolinostat)、罗米地辛、SHP-141、丙戊酸(VAL-001)、伏立诺他、替莫司汀(tinostamustine)、瑞美司他(remetinostat)、恩替司他(entinostat)。
衣壳抑制剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与衣壳抑制剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的衣壳抑制剂的示例包括衣壳聚合抑制剂或衣壳破坏化合物、HIV核衣壳p7(NCp7)抑制剂(诸如偶氮二甲酰胺)、HIV p24衣壳蛋白抑制剂、GS-6207(来那卡帕韦(lenacapavir))、GS-CA1、AVI-621、AVI-101、AVI-201、AVI-301和AVI-CAN1-15系列以及本专利(GSK WO2019/087016)中所述的化合物。
免疫检查点调节剂
在各种实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与抑制性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种阻断剂、拮抗剂或抑制剂和/或与一种或多种刺激性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种刺激剂、活化剂或激动剂组合或共同施用。抑制性免疫检查点的阻断或抑制可正向调节T细胞或NK细胞活化并防止感染细胞的免疫逃逸。刺激免疫检查点的活化或刺激可以增强免疫检查点抑制剂在感染性治疗中的效果。在各种实施方案中，免疫检查点蛋白或受体调节T细胞应答(例如，在Xu等人，J Exp Clin Cancer Res.(2018)37:110中综述)。在各种实施方案中，免疫检查点蛋白或受体调节NK细胞应答(例如，在Davis等人，Semin Immunol.(2017)31:64–75以及Chiossone等人，Nat Rev Immunol.(2018)18(11):671-688中综述)。
免疫检查点蛋白或受体的示例包括但不限于CD27(NCBI基因ID：939)、CD70(NCBI基因ID：970)、CD40(NCBI基因ID：958)、CD40LG(NCBI基因ID：959)、CD47(NCBI基因ID：961)、CD48(SLAMF2；NCBI基因ID：962)、含跨膜和免疫球蛋白结构域2(TMIGD2、CD28H；NCBI基因ID：126259)、CD84(LY9B、SLAMF5；NCBI基因ID：8832)、CD96(NCBI基因ID：10225)、CD160(NCBI基因ID：11126)、MS4A1(CD20；NCBI基因ID：931)、CD244(SLAMF4；NCBI基因ID：51744)；CD276(B7H3；NCBI基因ID：80381)；含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1、B7H4；NCBI基因ID：79679)；V-set免疫调节受体(VSIR、B7H5、VISTA；NCBI基因ID：64115)；免疫球蛋白超家族成员11(IGSF11、VSIG3；NCBI基因ID：152404)；自然杀伤细胞细胞毒性受体3配体1(NCR3LG1、B7H6；NCBI基因ID：374383)；HERV-H LTR相关2(HHLA2、B7H7；NCBI基因ID：11148)；诱导型T细胞共刺激因子(ICOS、CD278；NCBI基因ID：29851)；诱导型T细胞共刺激因子配体(ICOSLG、B7H2；NCBI基因ID：23308)；TNF受体超家族成员4(TNFRSF4、OX40；NCBI基因ID：7293)；TNF超家族成员4(TNFSF4、OX40L；NCBI基因ID：7292)；TNFRSF8(CD30；NCBI基因ID：943)、TNFSF8(CD30L；NCBI基因ID：944)；TNFRSF10A(CD261、DR4、TRAILR1；NCBI基因ID：8797)、TNFRSF9(CD137；NCBI基因ID：3604)、TNFSF9(CD137L；NCBI基因ID：8744)；TNFRSF10B(CD262、DR5、TRAILR2；NCBI基因ID：8795)、TNFRSF10(TRAIL；NCBI基因ID：8743)；TNFRSF14(HVEM、CD270；NCBI基因ID：8764)、TNFSF14(HVEML；NCBI基因ID：8740)；CD272(B和T淋巴细胞相关((BTLA)；NCBI基因ID：151888)；TNFRSF17(BCMA、CD269；NCBI基因ID：608)、TNFSF13B(BAFF；NCBI基因ID：10673)；TNFRSF18(GITR；NCBI基因ID：8784)、TNFSF18(GITRL；NCBI基因ID：8995)；MHC I类多肽相关序列A(MICA；NCBI基因ID：100507436)；MHC I类多肽相关序列B(MICB；NCBI基因ID：4277)；CD274(CD274、PDL1、PD-L1；NCBI基因ID：29126)；程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1；CD279；NCBI基因ID：5133)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4、CD152；NCBI基因ID：1493)；CD80(B7-1；NCBI基因ID：941)、CD28(NCBI基因ID：940)；nectin细胞粘附分子2(NECTIN2、CD112；NCBI基因ID：5819)；CD226(DNAM-1；NCBI基因ID：10666)；脊髓灰质炎病毒受体(PVR)细胞粘附分子(PVR、CD155；NCBI基因ID：5817)；含PVR相关免疫球蛋白结构域(PVRIG、CD112R；NCBI基因ID：79037)；具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT；NCBI基因ID：201633)；含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域4(TIMD4；TIM4；NCBI基因ID：91937)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2、TIMD3、TIM3；NCBI基因ID：84868)；半乳凝素9(LGALS9；NCBI基因ID：3965)；淋巴细胞活化3(LAG3、CD223；NCBI基因ID：3902)；信号转导淋巴细胞活化分子家族成员1(SLAMF1、SLAM、CD150；NCBI基因ID：6504)；淋巴细胞抗原9(LY9、CD229、SLAMF3；NCBI基因ID：4063)；SLAM家族成员6(SLAMF6、CD352；NCBI基因ID：114836)；SLAM家族成员7(SLAMF7、CD319；NCBI基因ID：57823)；UL16结合蛋白1(ULBP1；NCBI基因ID：80329)；UL16结合蛋白2(ULBP2；NCBI基因ID：80328)；UL16结合蛋白3(ULBP3；NCBI基因ID：79465)；视黄酸早期转录物1E(RAET1E；ULBP4；NCBI基因ID：135250)；视黄酸早期转录物1G(RAET1G；ULBP5；NCBI基因ID：353091)；视黄酸早期转录物1L(RAET1L；ULBP6；NCBI基因ID：154064)；杀伤细胞凝集素样受体C1(KLRC1、NKG2A、CD159A；NCBI基因ID：3821)；杀伤细胞凝集素样受体K1(KLRK1、NKG2D、CD314；NCBI基因ID：22914)；杀伤细胞凝集素样受体C2(KLRC2、CD159c、NKG2C；NCBI基因ID：3822)；杀伤细胞凝集素样受体C3(KLRC3、NKG2E；NCBI基因ID：3823)；杀伤细胞凝集素样受体C4(KLRC4、NKG2F；NCBI基因ID：8302)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1；NCBI基因ID：3802)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2；NCBI基因ID：3803)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3；NCBI基因ID：3804)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1、KIR、CD158E1；NCBI基因ID：3811)(例如利瑞鲁单抗(IPH2102/BMS-986015)、IPH-4102)；以及杀伤细胞凝集素样受体D1(KLRD1；NCBI基因ID：3824)。
在各种实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与一种或多种T细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种阻断剂、拮抗剂或抑制剂组合或共同施用。例示性T细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体包括但不限于CD274(CD274、PDL1、PD-L1)；程序性细胞死亡1配体2(PDCD1LG2、PD-L2、CD273)；程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4、CD152)；CD276(B7H3)；含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1、B7H4)；V-set免疫调节受体(VSIR、B7H5、VISTA)；免疫球蛋白超家族成员11(IGSF11、VSIG3)；TNFRSF14(HVEM、CD270)、TNFSF14(HVEML)；CD272(B和T淋巴细胞相关(BTLA))；含PVR相关免疫球蛋白结构域(PVRIG、CD112R)；具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；淋巴细胞活化3(LAG3、CD223)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2、TIMD3、TIM3)；半乳凝素9(LGALS9)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；以及杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)。利瑞鲁单抗是结合并阻断KIR2DL1/2L3受体的例示性抗体。在各种实施方案中，将如本文所述的融合多肽、多核苷酸、载体、LNP、免疫原性组合物和/或药物组合物与一种或多种T细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种激动剂或活化剂组合。例示性T细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体包括但不限于CD27、CD70；CD40、CD40LG；诱导型T细胞共刺激因子(ICOS、CD278)；诱导型T细胞共刺激因子配体(ICOSLG、B7H2)；TNF受体超家族成员4(TNFRSF4、OX40)；TNF超家族成员4(TNFSF4、OX40L)；TNFRSF9(CD137)、TNFSF9(CD137L)；TNFRSF18(GITR)、TNFSF18(GITRL)；CD80(B7-1)、CD28；nectin细胞粘附分子2(NECTIN2、CD112)；CD226(DNAM-1)；CD244(2B4、SLAMF4)、脊髓灰质炎病毒受体(PVR)细胞粘附分子(PVR、CD155)。参见例如Xu等人，J Exp Clin Cancer Res.(2018)37:110。
在各种实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与一种或多种NK细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种阻断剂、拮抗剂或抑制剂组合或共同施用。例示性NK细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体包括但不限于杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾区1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)；杀伤细胞凝集素样受体C1(KLRC1、NKG2A、CD159A)(例如莫纳利珠单抗(monalizumab)(IPH2201))；以及杀伤细胞凝集素样受体D1(KLRD1、CD94)。在各种实施方案中，将如本文所述的药剂与一种或多种NK细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种激动剂或活化剂组合。例示性NK细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体包括但不限于CD16、CD226(DNAM-1)；CD244(2B4、SLAMF4)；杀伤细胞凝集素样受体K1(KLRK1、NKG2D、CD314)；SLAM家族成员7(SLAMF7)。参见例如Davis等人，Semin Immunol.(2017)31:64–75；Fang等人，Semin Immunol.(2017)31:37-54；以及Chiossone等人，Nat Rev Immunol.(2018)18(11):671-688。
在一些实施方案中，一种或多种免疫检查点抑制剂包括PD-L1(CD274)、PD-1(PDCD1)或CTLA4的蛋白质(例如，抗体或其片段或抗体模拟物)抑制剂。在一些实施方案中，一种或多种免疫检查点抑制剂包括PD-L1(CD274)、PD-1(PDCD1)或CTLA4的有机小分子抑制剂。在一些实施方案中，CD274或PDCD1的小分子抑制剂选自由GS-4224、GS-4416、INCB086550和MAX10181组成的组。在一些实施方案中，CTLA4的小分子抑制剂包括BPI-002。
可以共同施用的CTLA4的抑制剂的示例包括但不限于伊匹单抗、曲美木单抗、BMS-986218、AGEN1181、AGEN1884(泽弗利单抗)、BMS-986249、MK-1308、REGN-4659、ADU-1604、CS-1002、BCD-145、APL-509、JS-007、BA-3071、ONC-392、AGEN-2041、JHL-1155、KN-044、CG-0161、ATOR-1144、PBI-5D3H5、BPI-002，以及多特异性抑制剂FPT-155(CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308(PD-1/CTLA4)、MGD-019(PD-1/CTLA4)、KN-046(PD-1/CTLA4)、MEDI-5752(CTLA4/PD-1)、XmAb-20717(PD-1/CTLA4)和AK-104(CTLA4/PD-1)。
可以共同施用的PD-L1(CD274)或PD-1(PDCD1)的抑制剂的示例包括但不限于派姆单抗、纳武单抗、西米单抗、匹地利珠单抗、AB122(赛帕利单抗)、AMP-224、MEDI0680(AMP-514)、斯巴达珠单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、BMS-936559、CK-301、PF-06801591、BGB-A317(替雷利珠单抗)、GLS-010(WBP-3055)、AK-103(HX-008)、AK-105、CS-1003、HLX-10、MGA-012、BI-754091、AGEN-2034(巴替利单抗)、JS-001(特瑞普利单抗)、JNJ-63723283、杰诺单抗(CBT-501)、LZM-009、BCD-100、LY-3300054、SHR-1201、SHR-1210(卡瑞利珠单抗)、Sym-021、ABBV-181、PD1-PIK、BAT-1306(MSB0010718C)、CX-072、CBT-502、TSR-042(多塔利单抗)、MSB-2311、JTX-4014、BGB-A333、SHR-1316、CS-1001(WBP-3155、KN-035、IBI-308(信迪利单抗)、HLX-20、KL-A167、STI-A1014、STI-A1015(IMC-001)、BCD-135、FAZ-053、TQB-2450、MDX1105-01、GS-4224、GS-4416、INCB086550、MAX10181，以及双特异性抑制剂FPT-155(CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308(PD-1/CTLA4)、MGD-013(PD-1/LAG-3)、FS-118(LAG-3/PD-L1)MGD-019(PD-1/CTLA4)、KN-046(PD-1/CTLA4)、MEDI-5752(CTLA4/PD-1)、RO-7121661(PD-1/TIM-3)、XmAb-20717(PD-1/CTLA4)、AK-104(CTLA4/PD-1)、M7824(PD-L1/TGFβ-EC结构域)、CA-170(PD-L1/VISTA)、CDX-527(CD27/PD-L1)、LY-3415244(TIM3/PDL1)和INBRX-105(4-1BB/PDL1)。
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与抗TIGIT抗体(诸如艾替利单抗(etigilimab)、BMS-986207、替拉格鲁单抗(tiragolumab)(又名MTIG-7192A；RG-6058；RO 7092284)、AGEN1307、AGEN1327、AGEN1777、COM-902、IBI-939、AB154、MG1131和EOS884448(EOS-448))组合或共同施用。
TNF受体超家族(TNFRSF)成员激动剂或激活剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与一种或多种TNF受体超家族(TNFRSF)成员的一种或多种激动剂组合或共同施用，例如以下项中的一种或多种的激动剂：TNFRSF1A(NCBI基因ID：7132)、TNFRSF1B(NCBI基因ID：7133)、TNFRSF4(OX40、CD134；NCBI基因ID：7293)、TNFRSF5(CD40；NCBI基因ID：958)、TNFRSF6(FAS，NCBI基因ID：355)、TNFRSF7(CD27，NCBI基因ID：939)、TNFRSF8(CD30，NCBI基因ID：943)、TNFRSF9(4-1BB、CD137，NCBI基因ID：3604)、TNFRSF10A(CD261、DR4、TRAILR1，NCBI基因ID：8797)、TNFRSF10B(CD262、DR5、TRAILR2，NCBI基因ID：8795)、TNFRSF10C(CD263、TRAILR3，NCBI基因ID：8794)、TNFRSF10D(CD264、TRAILR4，NCBI基因ID：8793)、TNFRSF11A(CD265、RANK，NCBI基因ID：8792)、TNFRSF11B(NCBI基因ID：4982)、TNFRSF12A(CD266，NCBI基因ID：51330)、TNFRSF13B(CD267，NCBI基因ID：23495)、TNFRSF13C(CD268，NCBI基因ID：115650)、TNFRSF16(NGFR、CD271，NCBI基因ID：4804)、TNFRSF17(BCMA、CD269，NCBI基因ID：608)、TNFRSF18(GITR、CD357，NCBI基因ID：8784)、TNFRSF19(NCBI基因ID：55504)、TNFRSF21(CD358、DR6，NCBI基因ID：27242)和TNFRSF25(DR3，NCBI基因ID：8718)。
可以共同施用的示例抗TNFRSF4(OX40)抗体包括但不限于MEDI6469、MEDI6383、MEDI0562(他沃立珠单抗)、MOXR0916、PF-04518600、RG-7888、GSK-3174998、INCAGN1949、BMS-986178、GBR-8383、ABBV-368，以及WO2016179517、WO2017096179、WO2017096182、WO2017096281和WO2018089628中所述的那些。
可以共同施用的示例抗TNFRSF5(CD40)抗体包括但不限于RG7876、SEA-CD40、APX-005M和ABBV-428。
在一些实施方案中，共同施用抗TNFRSF7(CD27)抗体伐立鲁单抗(CDX-1127)。
可以共同施用的示例抗TNFRSF9(4-1BB、CD137)抗体包括但不限于乌瑞鲁单抗、乌托鲁单抗(PF-05082566)、AGEN2373和ADG-106。
可以共同施用的示例抗TNFRSF18(GITR)抗体包括但不限于MEDI1873、FPA-154、INCAGN-1876、TRX-518、BMS-986156、MK-1248、GWN-323，以及WO2017096179、WO2017096276、WO2017096189和WO2018089628中所述的那些。在一些实施方案中，共同施用共同靶向TNFRSF4(OX40)和TNFRSF18(GITR)的抗体或其片段。此类抗体例如在WO2017096179和WO2018089628中描述。
双特异性和三特异性自然杀伤(NK)细胞衔接物
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与双特异性NK细胞衔接物(BiKE)或三特异性NK细胞衔接物(TriKE)(例如，不具有Fc)或者抗以下项的双特异性抗体(例如，具有Fc)组合或共同施用：NK细胞活化受体，例如CD16A、C型凝集素受体(CD94/NKG2C、NKG2D、NKG2E/H和NKG2F)、天然细胞毒性受体(NKp30、NKp44和NKp46)、杀伤细胞C型凝集素样受体(NKp65、NKp80)、Fc受体FcγR(其介导抗体依赖性细胞毒性)、SLAM家族受体(例如，2B4、SLAM6和SLAM7)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)(KIR-2DS和KIR-3DS)、DNAM-1和CD137(41BB)。视情况而定，抗CD16结合双特异性分子可具有或可不具有Fc。可以共同施用的例示性双特异性NK细胞衔接物靶向CD16和如本文所述的一种或多种HIV相关抗原。BiKE和TriKE例如在以下文献中描述：Felices等人，Methods Mol Biol.(2016)1441:333–346；Fang等人，SeminImmunol.(2017)31:37-54。三特异性NK细胞衔接物(TRiKE)的示例包括OXS-3550和CD16-IL-15-B7H3 TriKe。
吲哚胺-吡咯-2,3-双加氧酶(IDO1)抑制剂
在各种实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1；NCBI基因ID：3620)的抑制剂组合。IDO1抑制剂的示例包括但不限于BLV-0801、艾卡哚司他、F-001287、GBV-1012、GBV-1028、GDC-0919、吲哚莫德、NKTR-218、基于NLG-919的疫苗、PF-06840003、吡喃萘醌衍生物(SN-35837)、瑞米司他、SBLK-200802、BMS-986205和shIDO-ST、EOS-200271、KHK-2455、LY-3381916。
Toll样受体(TLR)激动剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与toll样受体(TLR)的激动剂组合或共同施用，例如TLR1(NCBI基因ID：7096)、TLR2(NCBI基因ID：7097)、TLR3(NCBI基因ID：7098)、TLR4(NCBI基因ID：7099)、TLR5(NCBI基因ID：7100)、TLR6(NCBI基因ID：10333)、TLR7(NCBI基因ID：51284)、TLR8(NCBI基因ID：51311)、TLR9(NCBI基因ID：54106)和/或TLR10(NCBI基因ID：81793)的激动剂。可以共同施用的示例TLR7激动剂包括但不限于AL-034、DSP-0509、GS-9620(维沙莫特)、LHC-165、TMX-101(咪喹莫特)、GSK-2245035、瑞喹莫德、DSR-6434、DSP-3025、IMO-4200、MCT-465、MEDI-9197、3M-051、SB-9922、3M-052、Limtop、TMX-30X、TMX-202、RG-7863、RG-7854、RG-7795，以及US20100143301(Gilead Sciences)、US20110098248(Gilead Sciences)、and US20090047249(Gilead Sciences)、US20140045849(Janssen)、US20140073642(Janssen)、WO2014/056953(Janssen)、WO2014/076221(Janssen)、WO2014/128189(Janssen)、US20140350031(Janssen)、WO2014/023813(Janssen)、US20080234251(Array Biopharma)、US20080306050(Array Biopharma)、US20100029585(VentirxPharma)、US20110092485(Ventirx Pharma)、US20110118235(Ventirx Pharma)、US20120082658(Ventirx Pharma)、US20120219615(Ventirx Pharma)、US20140066432(Ventirx Pharma)、US20140088085(Ventirx Pharma)、US20140275167(NoviraTherapeutics)和US20130251673(Novira Therapeutics)中所公开的化合物。可以共同施用的例示性双TLR7/TLR8激动剂包括CV8102、NKTR-262、特拉莫德(telratolimod)和BDB-001。可以共同施用的示例TLR8激动剂包括但不限于E-6887、IMO-4200、IMO-8400、IMO-9200、MCT-465、MEDI-9197、莫托莫(motolimod)、瑞喹莫德、GS-9688、VTX-1463、VTX-763、3M-051、3M-052，以及US20140045849(Janssen)、US20140073642(Janssen)、WO2014/056953(Janssen)、WO2014/076221(Janssen)、WO2014/128189(Janssen)、US20140350031(Janssen)、WO2014/023813(Janssen)、US20080234251(Array Biopharma)、US20080306050(Array Biopharma)、US20100029585(Ventirx Pharma)、US20110092485(VentirxPharma)、US20110118235(Ventirx Pharma)、US20120082658(Ventirx Pharma)、US20120219615(Ventirx Pharma)、US20140066432(Ventirx Pharma)、US20140088085(Ventirx Pharma)、US20140275167(Novira Therapeutics)和US20130251673(NoviraTherapeutics)中所公开的化合物。可以共同施用的示例TLR9激动剂包括但不限于AST-008、可比托莫特(cobitolimod)、CMP-001、IMO-2055、IMO-2125、利尼莫特(litenimod)、MGN-1601、BB-001、BB-006、IMO-3100、IMO-8400、IR-103、IMO-9200、阿格托莫特(agatolimod)、DIMS-9054、DV-1079、DV-1179、AZD-1419、来非莫特(lefitolimod)(MGN-1703)、CYT-003、CYT-003-QbG10、替索托利莫特(tilsotolimod)和PUL-042。TLR3激动剂的示例包括雷他莫德、聚ICLC、
Figure BDA0003546306850002051
Apoxxim、
Figure BDA0003546306850002052
IPH-33、MCT-465、MCT-475和ND-1.1。TLR4激动剂的示例包括G-100和GSK-1795091。在一些实施方案中，TLR激动剂是选自病原体活化的分子模式(PAMP)、胞嘧啶-磷酸-鸟苷(CpG)寡聚脱氧核苷酸和免疫刺激性RNA(isRNA，例如CV8102)的非编码免疫刺激性多核苷酸。
STING激动剂、RIG-I和NOD2调节剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与干扰素基因刺激物(STING)受体(又名干扰素反应刺激物cGAMP相互作用物1(STING1)；跨膜蛋白173(TMEM173)；NCBI基因ID：340061)激动剂组合或共同施用。在一些实施方案中，STING受体激动剂或活化剂选自由ADU-S100(MIW-815)、SB-11285、MK-1454、SR-8291、AdVCA0848、GSK-532、SYN-STING、MSA-1、SR-8291、5,6-二甲基呫吨酮-4-醋酸(DMXAA)、环状GAMP(cGAMP)和环状di-AMP组成的组。
在一些实施方案中，附加治疗剂是DExD/H-盒解旋酶58(DDX58；又名RIG-I、RIG1、RIGI、RLR-1、SGMRT2；NCBI基因ID：23586)的激动剂。例示性RIG-I激动剂包括索那吉韦(inarigivir soproxil)(SB-9200；GS-9992)；SB-40、SB-44、CV8102、ORI-7246、ORI-9350、ORI-7537、ORI-9020、ORI-9198、ORI-7170、RGT-100和KIN1148，如Hemann等人，J ImmunolMay 1,2016,196(1Supplement)76.1所述。另外的RIG-I激动剂在以下文献中描述：例如Elion等人，Cancer Res.(2018)78(21):6183-6195；以及Liu等人，J Virol.(2016)90(20):9406-19。RIG-I激动剂可例如从Invivogen(invivogen.com)商购获得。在一些实施方案中，将本文所述的药剂与含核苷酸结合寡聚结构域2(NOD2；NCBI基因ID：64127)激动剂(诸如索那吉韦(SB-9200；GS-9992)和IR-103)组合。
LAG-3和TIM-3抑制剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与抗TIM-3(甲型肝炎病毒细胞受体2；HAVCR2；CD366、HAVcr-2、KIM-3、SPTCL、TIM3、TIMD-3、TIMD3、Tim-3；NCBI基因ID：84868)抗体(诸如TSR-022、LY-3321367、MBG-453、INCAGN-2390)组合或共同施用。
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与抗LAG-3(淋巴细胞活化3；LAG3；CD223；NCBI基因ID：3902)抗体(诸如瑞拉利单抗(relatlimab)(ONO-4482)、LAG-525、MK-4280、REGN-3767、INCAGN2385)组合或共同施用。
白介素或细胞因子受体激动剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与细胞因子(例如白介素)受体激动剂(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、fms相关受体酪氨酸激酶3(FLT3)受体激动剂以及它们的组合)组合或共同施用。可以共同施用的IL-2受体激动剂的示例包括普留净(阿白介素、IL-2)；聚乙二醇化IL-2(例如，NKTR-214)；IL-2的修饰变体(例如，THOR-707)、贝培阿地白介素、AIC-284、ALKS-4230、CUI-101、Neo-2/15。可以共同施用的IL-15受体激动剂的示例包括ALT-803(nogapendekinα)、NKTR-255和hetIL-15、白介素-15/Fc融合蛋白、AM-0015、NIZ-985、SO-C101、IL-15Synthorin(聚乙二醇化Il-15)、P-22339和IL-15-PD-1融合蛋白N-809。可以共同施用的IL-7受体激动剂的示例包括CYT-107。
可以与本公开的药剂组合的另外的基于免疫的疗法的示例包括干扰素α；干扰素α-2b；干扰素α-n3；聚乙二醇化干扰素α；干扰素γ；fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)激动剂(例如，GS-3583、CDX-301)；gepon；诺姆福隆、聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b、RPI-MN。
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂
在一些实施方案中，将如本文所述的免疫原性多肽、编码此类多肽的多核苷酸、载体、LNP和包含此类多肽或多核苷酸的免疫原性组合物与以下项的抑制剂组合或共同施用：磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基，例如磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α(PIK3CA、CLAPO、CLOVE、CWS5、MCAP、MCM、MCMTC、PI3K、PI3K-α、p110-α；NCBI基因ID：5290)；磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基β(PIK3CB、P110BETA、PI3K、PI3KBETA、PIK3C1；NCBI基因ID：5291)；磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基γ(PIK3CG、PI3CG、PI3K、PI3Kγ、PIK3、p110γ、p120-PI3K；基因ID：5494)；以及/或者磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基δ(PIK3CD、APDS、IMD14、P110DELTA、PI3K、p110D，NCBI基因ID：5293)。在一些实施方案中，PI3K抑制剂是泛PI3K抑制剂。PI3K抑制剂的示例包括但不限于ACP-319、AEZA-129、AMG-319、AS252424、AZD8186、BAY1082439、BEZ235、比拉利西布(bimiralisib)(PQR309)、布帕利西布(buparlisib)(BKM120)、BYL719(阿博利西布(alpelisib))、乳清酸羧基氨基咪唑(CTO)、CH5132799、CLR-457、CLR-1401、科潘利西布(copanlisib)(BAY 80-6946)、DS-7423、杜韦利西布(duvelisib)(IPI-145)、非美诺司他(fimepinostat)(CUDC-907)、格达利西布(gedatolisib)(PF-05212384)、GDC-0032、GDC-0084(RG7666)、GDC-0077、吡替西布(pictilisib)(GDC-0941)、GDC-0980、GSK2636771、GSK2269577、艾德利西布(idelalisib)
Figure BDA0003546306850002081
INCB040093、INCB50465、IPI-443、IPI-549、KAR4141、LY294002、LY3023414、
Figure BDA0003546306850002082
(来那替尼(neratinib))、奈米拉西布(nemiralisib)(GSK2269557)、奥米帕西布(omipalisib)(GSK2126458、GSK458)、OXY111A、帕奴利(panulisib)(P7170、AK151761)、PA799、哌立福辛(KRX-0401)、皮拉西布(Pilaralisib)(SAR245408；XL147)、甲磺酸普喹替尼(puquitinib)(XC-302)、SAR260301、塞来西布(seletalisib)(UCB-5857)、塞拉贝西布(serabelisib)(INK-1117、MLN-1117、TAK-117)、SF1126、索诺西布(sonolisib)(PX-866)、RG7604、利戈替布(rigosertib)钠(ON-01910钠)、RP5090、特纳利西布(tenalisib)(RP6530)、RV-1729、SRX3177、塔塞利西布(taselisib)、TG100115、恩布拉西布(umbralisib)(TGR-1202)、TGX221、沃塔西布(voxtalisib)(SAR245409)、VS-5584、WX-037、X-339、X-414、XL499、XL756、渥曼青霉素、ZSTK474，以及WO 2005/113556(ICOS)、WO2013/052699(GileadCalistoga)、WO 2013/116562(Gilead Calistoga)、WO 2014/100765(Gilead Calistoga)、WO2014/100767(Gilead Calistoga)和WO 2014/201409(Gilead Sciences)中所述的化合物。
α-4/β-7拮抗剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与α-4/β-7拮抗剂组合或共同施用。可以与本公开的药剂组合的整联蛋白α-4/β-7拮抗剂的示例包括PTG-100、TRK-170、阿利鲁单抗(abrilumab)、依曲利珠单抗(etrolizumab)、甲基卡罗格拉斯(carotegrast methyl)和维多珠单抗(vedolizumab)。
CD47的抑制剂
在各种实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与CD47((IAP、MER6、OA3；NCBI基因ID：961；UniProtQ08722)的抑制剂或破坏CD47与SIRPα结合的药剂组合或共同施用。CD47抑制剂的示例包括但不限于抗CD47 mAb(Vx-1004)、抗人CD47 mAb(CNTO-7108)、CC-90002、CC-90002-ST-001、人源化抗CD47抗体(Hu5F9-G4；莫洛利单抗(magrolimab))、NI-1701、NI-1801、RCT-1938、ALX-148、TTI-621、RRx-001、DSP-107、VT-1021、TTI-621、TTI-622、IMM-02和SGN-CD47M，以及以下国际专利公开号中所述的CD47靶向剂：WO199727873、WO199940940、WO2002092784、WO2005044857、WO2009046541、WO2010070047、WO2011143624、WO2012170250、WO2013109752、WO2013119714、WO2014087248、WO2015191861、WO2016022971、WO2016023040、WO2016024021、WO2016081423、WO2016109415、WO2016141328、WO2016188449、WO2017027422、WO2017049251、WO2017053423、WO2017121771、WO2017194634、WO2017196793、WO2017215585、WO2018075857、WO2018075960、WO2018089508、WO2018095428、WO2018137705、WO2018233575、WO2019027903、WO2019034895、WO2019042119、WO2019042285、WO2019042470、WO2019086573、WO2019108733、WO2019138367、WO2019144895、WO2019157843、WO2019179366、WO2019184912、WO2019185717、WO2019201236、WO2019238012、WO2019241732、WO2020019135、WO2020036977、WO2020043188和WO2020009725。
可以组合或共同施用的靶向CD47的双特异性抗体的示例包括但不限于IBI-322(CD47/PD-L1)、IMM-0306(CD47/CD20)、TJ-L1C4(CD47/PD-L1)、HX-009(CD47/PD-1)、PMC-122(CD47/PD-L1)、PT-217、(CD47/DLL3)、IMM-26011(CD47/FLT3)、IMM-0207(CD47/VEGF)、IMM-2902(CD47/HER2)、BH29xx(CD47/PD-L1)、IMM-03(CD47/CD20)、IMM-2502(CD47/PD-L1)、HMBD-004B(CD47/BCMA)、HMBD-004A(CD47/CD33)。抗CD47抗体的示例包括诸如IBI-188、TJC-4、SHR-1603、HLX-24、LQ-001、IMC-002、ZL-1201、IMM-01、B6H12、GenSci-059、TAY-018、PT-240、1F8-GMCSF、SY-102、KD-015。
HIV靶向抗体
可以与本公开的药剂组合的HIV抗体、双特异性抗体和“抗体样”治疗蛋白的示例包括
Figure BDA0003546306850002101
Figure BDA0003546306850002102
Fab衍生物、bNAb(广谱中和HIV-1抗体)、TMB-360以及靶向HIV gp120或gp41的那些抗体、靶向HIV的抗体募集分子、抗CD63单克隆抗体、抗GB病毒C抗体、抗GP120/CD4、CCR5双特异性抗体、抗Nef单结构域抗体、抗Rev抗体、骆驼科来源的抗CD18抗体、骆驼科来源的抗ICAM-1抗体、DCVax-001、gp140靶向抗体、基于gp41的HIV治疗抗体、人重组mAb(PGT-121)、依巴利珠单抗、Immuglo、MB-66。
在某些实施方案中，共同施用的抗体或其抗原结合片段或者抗原结合分子是或来源于靶向HIV-1的人中和抗体(例如，单克隆抗体)。“中和抗体”是可中和HIV在体外引发和/或维持宿主和/或靶细胞中的感染的能力的抗体。本公开提供了中和单克隆人抗体，其中该抗体识别来自HIV的抗原，例如gp120多肽。在某些实施方案中，“中和抗体”可抑制HIV-1病毒(例如，SF162和/或JR-CSF)的进入，中和指数>1.5或>2.0(Kostrikis LG等人，J.Virol.,70(1):445-458(1996))。
在一些实施方案中，共同施用的抗体或其抗原结合片段或者抗原结合分子是或来源于靶向HIV-1的人广谱中和抗体(例如，单克隆抗体)。所谓“广谱中和抗体”意指在中和测定中中和多于一种HIV-1病毒种类(来自不同的进化枝和进化枝内的不同毒株)的抗体。广谱中和抗体可中和HIV-1的至少2、3、4、5、6、7、8、9种或更多种不同的毒株，这些毒株属于相同或不同的进化枝。可以在联合疗法中作为附加治疗剂共同施用的例示性广谱中和抗体(bNAb)在以下文献中描述：例如8,673,307、9,493,549、9,783,594，以及WO 2012/154312、WO2012/158948、WO2013/086533、WO 2013/142324、WO2014/063059、WO 2014/089152、WO2015/048462、WO 2015/103549、WO 2015/117008、WO2016/014484、WO2016/154003、WO2016/196975、WO 2016/149710、WO2017/096221、WO2017/133639、WO 2017/133640，这些文献据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。可以共同施用的例示性bNAb包括但不限于12A12、12A21、NIH45-46、bANC131、8ANC134、IB2530、INC9、8ANC195。8ANC196、10-259、10-303、10-410、10-847、10-996、10-1074、10-1121、10-1130、10-1146、10-1341、10-1369和10-1074GM。另外的示例包括在以下文献中描述的那些：Sajadi等人，Cell.(2018)173(7):1783-1795；Sajadi等人，J Infect Dis.(2016)213(1):156-64；Klein等人，Nature,492(7427):118-22(2012)；Horwitz等人，Proc Natl Acad Sci U S A,110(41):16538-43(2013)；Scheid等人，Science,333:1633-1637(2011)；Scheid等人，Nature,458:636-640(2009)；Eroshkin等人，Nucleic Acids Res.,42(Database issue):Dl 133-9(2014)；Mascola等人，Immunol Rev.,254(l):225-44(2013)，诸如2F5、4E10、M66.6、CAP206-CH12、10E81(它们所有都结合gp41的MPER)；PG9、PG16、CH01-04(它们所有都结合V1V2-聚糖)、2G12(其与外部结构域聚糖结合)；b12、HJ16、CH103-106、VRC01-03、VRC-PG04、04b、VRC-CH30-34、3BNC62、3BNC89、3BNC91、3BNC95、3BNC104、3BNC176和8ANC131(它们所有都与CD4结合位点结合)，这些文献据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与广谱中和抗体(bNAb)组合或共同施用，所述广谱中和抗体与选自由以下项组成的组的gp120的表位或区域结合：(i)第三可变环(V3)和/或包含N332寡甘露糖聚糖的高甘露糖补丁；(ii)第二可变环(V2)和/或Env三聚体顶点；(iii)CD4结合位点(CD4bs)；(iv)gp120/gp41交界面；或者(v)gp120的沉默面。广谱中和抗体结合的gp120的前述表位或区域例如在以下文献中描述：McCoy,Retrovirology(2018)15:70；Sok and Burton,Nat Immunol.201819(11):1179-1188；Possas等人，Expert Opin TherPat.2018年7月；28(7):551-560；以及Stephenson and Barouch,Curr HIV/AIDS Rep(2016)13:31–37，这些文献据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与广谱中和抗体(bNAb)组合或共同施用，所述广谱中和抗体与第三可变环(V3)和/或包含N332寡甘露糖聚糖的高甘露糖补丁中的gp120的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：GS-9722、PGT-121.60、PGT-121.66、PGT-121、PGT-122、PGT-123、PGT-124、PGT-125、PGT-126、PGT-128、PGT-130、PGT-133、PGT-134、PGT-135、PGT-136、PGT-137、PGT-138、PGT-139、10-1074、VRC24、2G12、BG18、354BG8、354BG18、354BG42、354BG33、354BG129、354BG188、354BG411、354BG426、DH270.1、DH270.6、PGDM12、VRC41.01、PGDM21、PCDN-33A、BF520.1和VRC29.03。与第三可变环(V3)和/或包含N332寡甘露糖聚糖的高甘露糖补丁中的gp120结合并且可以用作第二抗体或其抗原结合片段的另外的广谱中和抗体例如在以下文献中描述：WO 2012/030904、WO 2014/063059、WO2016/149698、WO 2017/106346、WO 2018/075564、WO2018/125813和WO 2018/237148，这些文献据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与广谱中和抗体(bNAb)组合或共同施用，所述广谱中和抗体与CD4结合位点(CD4bs)中的gp120的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的CDR和/或VH和VL区域竞争或者包含这些区域：b12、F105、VRC01、VRC07、VRC07-523、VRC03、VRC06、VRC06b01、VRC08、VRC0801、NIH45-46、GS-9723、3BNC117、3BNC60、VRC-PG04、PGV04；CH103、44-VRC13.01、1NC9、12A12、N6、N49-P7、NC-Cow1、IOMA、CH235和CH235.12、N49P6、N49P7、N49P11、N49P9和N60P25。
在一些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与广谱中和抗体(bNAb)组合或共同施用，所述广谱中和抗体与第二可变环(V2)和/或Env三聚体顶点中的gp120的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：PG9、PG16、PGC14、PGG14、PGT-142、PGT-143、PGT-144、PGT-145、CH01、CH59、PGDM1400、CAP256、CAP256-VRC26.08、CAP256-VRC26.09、CAP256-VRC26.25、PCT64-24E和VRC38.01。与第二可变环(V2)和/或Env三聚体顶点中的gp120结合并且可以用作第二抗体或其抗原结合片段的另外的广谱中和抗体例如在以下文献中描述：WO 2010/107939、WO2012/030904、WO 2018/075564和WO 2018/125813，这些文献据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与广谱中和抗体(bNAb)组合或共同施用，所述广谱中和抗体与gp120/gp41交界面中的gp120的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：PGT-151、CAP248-2B、35O22、8ANC195、ACS202、VRC34和VRC34.01。与gp120/gp41交界面中的gp120结合并且可以用作第二抗体或其抗原结合片段的另外的广谱中和抗体例如在以下文献中描述：WO 2011/038290、WO2012/030904和WO2017/079479，这些文献据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与广谱中和抗体(bNAb)组合或共同施用，所述广谱中和抗体与gp120沉默面的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：VRC-PG05和SF12。参见例如Schoofs等人，“Broad andPotent Neutralizing Antibodies Recognize the Silent Face of the HIVEnvelope,”Immunity(2019)5月14日.pii:S1074-7613(19)30194-3(PMID31126879)。
在一些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与广谱中和抗体(bNAb)组合或共同施用，所述广谱中和抗体与膜近侧区域(MPER)中的gp41的表位或区域结合。与MPER中的gp41结合并且可以用作第二抗体或其抗原结合片段的另外的广谱中和抗体例如在以下文献中描述：WO2011/034582、WO 2011/038290、WO 2011/046623和WO 2013/070776，这些文献据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。
在一些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与广谱中和抗体(bNAb)组合或共同施用，所述广谱中和抗体与膜近侧区域(MPER)中的gp41的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：10E8、10E8v4、10E8-5R-100cF、4E10、DH511.11P、2F5、7b2和LN01。
在一些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与广谱中和抗体(bNAb)组合或共同施用，所述广谱中和抗体与gp41融合肽的表位或区域结合，并且与选自由以下项组成的组的抗体的VH和VL区域竞争或者包含这些区域：VRC34和ACS202。
可以共同施用的另外的抗体的示例包括巴威单抗(bavituximab)、UB-421、BF520.1、CH01、CH59、C2F5、C4E10、C2F5+C2G12+C4E10、3BNC117、3BNC117-LS、3BNC60、DH270.1、DH270.6、D1D2、10-1074-LS、GS-9722、DH411-2、BG18、PGT145、PGT121、PGT-121.60、PGT-121.66、PGT122、PGT-123、PGT-124、PGT-125、PGT-126、PGT-151、PGT-130、PGT-133、PGT-134、PGT-135、PGT-128、PGT-136、PGT-137、PGT-138、PGT-139、MDX010(伊匹单抗)、DH511、DH511-2、N6、N6LS、N49P6、N49P7、N49P7.1、N49P9、N49P11、N60P1.1、N60P25.1、N60P2.1、N60P31.1、N60P22、NIH 45-46、PGC14、PGG14、PGT-142、PGT-143、PGT-144、PGDM1400、PGDM12、PGDM21、PCDN-33A、2Dm2m、4Dm2m、6Dm2m、PGDM1400、MDX010(伊匹单抗)、VRC01、VRC-01-LS、A32、7B2、10E8、VRC-07-523、VRC07-523LS、VRC24、VRC41.01、10E8VLS、3810109、10E8v4、IMC-HIV、iMabm36、eCD4-Ig、IOMA、CAP256-VRC26.25、DRVIA7,VRC-HIVMAB080-00-AB、VRC-HIVMAB060-00-AB、P2G12、VRC07、354BG8、354BG18、354BG42、354BG33、354BG129、354BG188、354BG411、354BG426、VRC29.03、CAP256、CAP256-VRC26.08、CAP256-VRC26.09、CAP256-VRC26.25、PCT64-24E和VRC38.01、PGT-151、CAP248-2B、35O22、ACS202、VRC34和VRC34.01、10E8、10E8v4、10E8-5R-100cF、4E10、DH511.11P、2F5、7b2和LN01。
HIV双特异性和三特异性抗体的示例包括MGD014、B12BiTe、TMB-双特异性、SAR-441236、VRC-01/PGDM-1400/10E8v4、10E8.4/iMab、10E8v4/PGT121-VRC01。
在一些实施方案中，bNAb可以在患者体内表达。体内递送的bNAb的示例包括AAV8-VRC07；编码抗HIV抗体VRC01的mRNA；以及编码3BNC117的工程化B细胞(Hartweger等人，J.Exp.Med.2019,1301)。
药代动力学增强剂
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与药代动力学增强剂组合。可以与本公开的药剂组合的药代动力学增强剂的示例包括可比司他和利托那韦。
附加治疗剂
可以与如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体组合的附加治疗剂的示例包括WO2004/096286(GileadSciences)、WO 2006/015261(Gilead Sciences)、WO 2006/110157(Gilead Sciences)、WO2012/003497(Gilead Sciences)、WO 2012/003498(Gilead Sciences)、WO 2012/145728(Gilead Sciences)、WO 2013/006738(Gilead Sciences)、WO2013/159064(GileadSciences)、WO 2014/100323(Gilead Sciences)、US2013/0165489(University ofPennsylvania)、US 2014/0221378(Japan Tobacco)、US 2014/0221380(Japan Tobacco)、WO 2009/062285(Boehringer Ingelheim)、WO 2010/130034(Boehringer Ingelheim)、WO2013/006792(Pharma Resources)、US 20140221356(Gilead Sciences)、US 20100143301(Gilead Sciences)和WO 2013/091096(Boehringer Ingelheim)中公开的化合物。
HIV疫苗
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与HIV疫苗组合。可以与本公开的药剂组合的HIV疫苗的示例包括肽疫苗、重组亚基蛋白疫苗、活载体疫苗、DNA疫苗、CD4来源的肽疫苗、疫苗组合、腺病毒载体疫苗(腺病毒载体，诸如Ad5、Ad26或Ad35)、猴腺病毒(黑猩猩、大猩猩、恒河猴，即rhAd)、腺相关病毒载体疫苗、黑猩猩腺病毒疫苗(例如ChAdOX1、ChAd68、ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、Pan5、Pan6、Pan7、Pan9)、基于柯萨奇病毒的疫苗、基于肠病毒的疫苗、大猩猩腺病毒疫苗、基于慢病毒载体的疫苗、沙粒病毒疫苗(诸如LCMV、皮秦德)、基于双分段或三分段的沙粒病毒的疫苗、基于麻疹病毒的疫苗、基于黄病毒载体的疫苗、基于烟草花叶病毒载体的疫苗、基于水痘带状疱疹病毒的疫苗、基于人副流感病毒3(PIV3)的疫苗、基于痘病毒的疫苗(修饰的牛痘病毒安卡拉(Ankara)(MVA)、正痘病毒来源的NYVAC和禽痘病毒来源的ALVAC(金丝雀痘病毒)毒株)；基于鸡痘病毒的疫苗、基于弹状病毒的疫苗，诸如VSV和马拉巴病毒；基于重组人CMV(rhCMV)的疫苗、基于甲病毒的疫苗，诸如西门利克森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和辛德毕斯病毒；(参见Lauer,Clinical andVaccine Immunology,2017,DOI:10.1128/CVI.00298-16)；LNP配制的基于mRNA的治疗疫苗；LNP配制的自复制RNA/自扩增RNA疫苗。
可以共同施用的HIV疫苗的示例包括：rgp120(AIDSVAX)、ALVAC HIV(vCP1521)/AIDSVAX B/E(gp120)(RV144)、单体gp120 HIV-1C亚型疫苗、Remune、ITV-1、Contre Vir、Ad5-ENVA-48、DCVax-001(CDX-2401)、Vacc-4x、Vacc-C5、VAC-3S、多级DNA重组腺病毒-5(rAd5)、rAd5 gag-pol env A/B/C疫苗、Pennvax-G、Pennvax-GP、Pennvax-G/MVA-CMDR、HIV-TriMix-mRNA疫苗、HIV-LAMP-vax、Ad35、Ad35-GRIN、NAcGM3/VSSP ISA-51、poly-ICLC佐剂疫苗s、TatImmune、GTU-multiHIV(FIT-06)、gp140[delta]V2.TV1+MF-59、rVSVIN HIV-1gag疫苗、SeV-Gag疫苗、AT-20、DNK-4、ad35-Grin/ENV、TBC-M4、HIVAX、HIVAX-2、NYVAC-HIV-PT1、NYVAC-HIV-PT4、DNA-HIV-PT123、rAAV1-PG9DP、GOVX-B11、GOVX-B21、TVI-HIV-1、Ad-4(Ad4-env Clade C+Ad4-mGag)、Paxvax、EN41-UGR7C、EN41-FPA2、PreVaxTat、AE-H、MYM-V101、CombiHIVvac、ADVAX、MYM-V201、MVA-CMDR、DNA-Ad5 gag/pol/nef/nev(HVTN505)、MVATG-17401、ETV-01、CDX-1401、rcAD26.MOS1.HIV-Env、Ad26.Mod.HIV疫苗、Ad26.Mod.HIV+MVA镶嵌疫苗+gp140、AGS-004、AVX-101、AVX-201、PEP-6409、SAV-001、ThV-01、TL-01、TUTI-16、VGX-3300、IHV-001和病毒氧颗粒疫苗(诸如假病毒疫苗)、CombiVICHvac、LFn-p24 B/C融合疫苗、基于GTU的DNA疫苗、HIV gag/pol/nef/env DNA疫苗、抗TAT HIV疫苗、缀合多肽疫苗、树突细胞疫苗(诸如DermaVir)、基于gag的DNA疫苗、GI-2010、gp41 HIV-1疫苗、HIV疫苗(PIKA佐剂)、i-key/MHC II类抗原杂合肽疫苗、ITV-2、ITV-3、ITV-4、LIPO-5、多级Env疫苗、MVA疫苗、Pennvax-GP、pp71缺陷型HCMV载体HIV gag疫苗、rgp160 HIV疫苗、RNActive HIV疫苗、SCB-703、Tat Oyi疫苗、TBC-M4、UBI HIV gp120、Vacc-4x+罗米地辛、变体gp120多肽疫苗、rAd5 gag-pol env A/B/C疫苗、DNA.HTI和MVA.HTI、VRC-HIVDNA016-00-VP+VRC-HIVADV014-00-VP、INO-6145、JNJ-9220、gp145C.6980；基于eOD-GT8 60mer的疫苗、PD-201401、env(A、B、C、A/E)/gag(C)DNA疫苗、gp120(A、B、C、A/E)蛋白质疫苗、PDPHV-201401、Ad4-EnvCN54、EnvSeq-1 Envs HIV-1疫苗(GLA-SE佐剂)、HIV p24gag初免-加强质粒DNA疫苗、基于沙粒病毒载体的疫苗(例如，WO 2009/083210；WO 2015/183895；WO2016/075250；WO 2017/198726；和美国专利号9,943,585中所述)、MVA-BN HIV-1疫苗方案、UBI HIV gp120、基于mRNA的预防性疫苗和TBL-1203HI。
节育(避孕)联合疗法
在某些实施方案中，将本文所述的药剂与节育或避孕方案组合。可以与本公开的药剂组合的用于节育(避孕)的治疗剂包括醋酸环丙孕酮、去氧孕烯、地诺孕素、屈螺酮、戊酸雌二醇、乙炔雌二醇、炔诺醇、依托孕烯、左旋甲基四氢叶酸、左炔诺孕酮、利奈孕酮、醋酸甲羟孕酮、炔雌醇甲醚、米非司酮、米索前列醇、醋酸诺美孕酮、去甲孕酮、异炔诺酮、诺孕酯、奥美昔芬、醋酸西格索尼、醋酸乌利司他以及它们的任何组合。
在一个实施方案中，将本文所公开的药剂或其药学上可接受的盐与选自以下项的一种、两种、三种、四种或更多种附加治疗剂组合：
Figure BDA0003546306850002171
(依法韦仑、富马酸替诺福韦二吡呋酯和恩曲他滨)；
Figure BDA0003546306850002172
(
Figure BDA0003546306850002173
利匹韦林、富马酸替诺福韦二吡呋酯和恩曲他滨)；
Figure BDA0003546306850002181
(埃替拉韦、可比司他、富马酸替诺福韦二吡呋酯和恩曲他滨)；
Figure BDA0003546306850002182
(富马酸替诺福韦二吡呋酯和恩曲他滨；TDF+FTC)；
Figure BDA0003546306850002183
(替诺福韦艾拉酚胺和恩曲他滨)；
Figure BDA0003546306850002184
(替诺福韦艾拉酚胺、恩曲他滨和利匹韦林)；
Figure BDA0003546306850002185
(替诺福韦艾拉酚胺、恩曲他滨、可比司他和埃替拉韦)；BIKTARVY(比卡格韦+恩曲他滨+替诺福韦艾拉酚胺)，阿德福韦；阿德福韦双特戊酯；可比司他；恩曲他滨；替诺福韦；替诺福韦二吡呋酯；富马酸替诺福韦二吡呋酯；替诺福韦艾拉酚胺；半富马酸替诺福韦艾拉酚胺；
Figure BDA0003546306850002186
(度鲁特韦、阿巴卡韦和拉米夫定)；度鲁特韦、硫酸阿巴卡韦和拉米夫定；雷特格韦；雷特格韦和拉米夫定；马拉韦罗；恩夫韦肽；
Figure BDA0003546306850002187
(
Figure BDA0003546306850002188
洛匹那韦和利托那韦)；
Figure BDA0003546306850002189
(齐多夫定和拉米夫定；AZT+3TC)；
Figure BDA00035463068500021810
(
Figure BDA00035463068500021811
硫酸阿巴卡韦和拉米夫定；ABC+3TC)；
Figure BDA00035463068500021812
(硫酸阿巴卡韦、齐多夫定和拉米夫定；ABC+AZT+3TC)；利匹韦林；盐酸利匹韦林；硫酸阿扎那韦和可比司他；阿扎那韦和可比司他；地瑞拉韦和可比司他；阿扎那韦；硫酸阿扎那韦；度鲁特韦；埃替拉韦；利托那韦；硫酸阿扎那韦和利托那韦；地瑞拉韦；拉米夫定；普拉汀；福沙那韦；福沙那韦钙依法韦仑；依曲韦林；奈非那韦；甲磺酸奈非那韦；干扰素；地达诺新；司他夫定；茚地那韦；硫酸茚地那韦；替诺福韦和拉米夫定；齐多夫定；奈韦拉平；沙喹那韦；甲磺酸沙喹那韦；阿地白介素；扎西他滨；替拉那韦；安普那韦；地拉夫定；甲磺酸地拉夫定；Radha-108(受体醇)；拉米夫定和富马酸替诺福韦二吡呋酯；依法韦仑、拉米夫定和富马酸替诺福韦二吡呋酯；叠氮膦；拉米夫定、奈韦拉平和齐多夫定；阿巴卡韦；和硫酸阿巴卡韦。
在一些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与逆转录酶的HIV核苷或核苷酸抑制剂和逆转录酶的HIV非核苷抑制剂组合。在另一个具体实施方案中，将本文所公开的药剂或其药物组合物与逆转录酶的HIV核苷或核苷酸抑制剂和HIV蛋白酶抑制化合物组合。在另外的实施方案中，将本文所公开的药剂或其药物组合物与逆转录酶的HIV核苷或核苷酸抑制剂、逆转录酶的HIV非核苷抑制剂和药代动力学增强剂组合。在某些实施方案中，将本文所公开的药剂或其药物组合物与逆转录酶的至少一种HIV核苷抑制剂、整合酶抑制剂和药代动力学增强剂组合。在另一个实施方案中，将本文所公开的药剂或其药物组合物与逆转录酶的两种HIV核苷或核苷酸抑制剂组合。
在一个实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与硫酸阿巴卡韦、替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯、富马酸替诺福韦二吡呋酯、半富马酸替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦艾拉酚胺或半富马酸替诺福韦艾拉酚胺组合。
在另一个实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯、富马酸替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦艾拉酚胺或半富马酸替诺福韦艾拉酚胺组合。
在另一个实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与第一附加治疗剂和第二附加治疗剂组合，该第一附加治疗剂选自由硫酸阿巴卡韦、替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯、富马酸替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦艾拉酚胺和半富马酸替诺福韦艾拉酚胺组成的组，该第二附加治疗剂选自由恩曲他滨和拉米夫定组成的组。
在另一个实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与第一附加治疗剂和第二附加治疗剂组合，该第一附加治疗剂选自由替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯、富马酸替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦艾拉酚胺和半富马酸替诺福韦艾拉酚胺组成的组，其中该第二附加治疗剂是恩曲他滨。
将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与第一附加治疗剂(避孕剂)组合，该第一附加治疗剂选自由以下项组成的组：醋酸环丙孕酮、去氧孕烯、地诺孕素、屈螺酮、戊酸雌二醇、乙炔雌二醇、炔诺醇、依托孕烯、左旋甲基四氢叶酸、左炔诺孕酮、利奈孕酮、醋酸甲羟孕酮、炔雌醇甲醚、米非司酮、米索前列醇、醋酸诺美孕酮、去甲孕酮、异炔诺酮、诺孕酯、奥美昔芬、醋酸西格索尼、醋酸乌利司他以及它们的任何组合。
基因疗法和细胞疗法
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与基因或细胞疗法方案组合。基因疗法和细胞疗法包括但不限于使基因沉默的基因修饰；直接杀伤感染细胞的基因方法；免疫细胞的输注，所述免疫细胞被设计成替换大部分患者自身的免疫系统以增强对被感染细胞的免疫应答，或激活患者自身的免疫系统以杀死被感染细胞，或找到并杀死被感染细胞；修饰细胞活性的基因方法，以进一步改变针对感染的内源性免疫应答。树突状细胞疗法的示例包括AGS-004。CCR5基因编辑剂包括SB-728T。CCR5基因抑制剂包括Cal-1。在一些实施方案中，将表达C34-CCR5/C34-CXCR4的CD4阳性T细胞与一种或多种融合多肽共同施用。在一些实施方案中，将本文所述的药剂与AGT-103转导的自体T细胞疗法或AAV-eCD4-Ig基因疗法共同施用。
基因编辑物
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与基因编辑物(例如，HIV靶向基因编辑物)组合。在各种实施方案中，基因组编辑系统可以选自由以下项组成的组：CRISPR/Cas9复合物、锌指核酸酶复合物、TALEN复合物、归巢内切核酸酶复合物和大范围核酸酶复合物。例示性HIV靶向CRISPR/Cas9系统包括但不限于EBT-101。
CAR-T细胞疗法
在一些实施方案中，可以将本文所述的药剂与经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体共同施用，其中CAR包含HIV抗原结合结构域。HIV抗原包括HIV包膜蛋白或其部分、gp120或其部分、gp120上的CD4结合位点、gp120上的CD4诱导的结合位点、gp120上的N聚糖、gp120的V2、gp41上的膜近侧区域。免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞或它们的组合。细胞可以是自体同源的或同种异体的。HIV CAR-T的示例包括VC-CAR-T、CMV-N6-CART、抗CD4 CART细胞疗法、CD4 CAR+C34-CXCR4+CCR5 ZFN T细胞、经遗传工程化以表达CD4 CAR和C46肽的自体造血干细胞。
TCR-T细胞疗法
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与TCR-T细胞群体组合。TCR-T细胞被工程化以靶向病毒感染细胞表面上存在的HIV来源的肽，例如ImmTAV。
B细胞疗法
在某些实施方案中，将如本文所公开的一种或多种融合多肽或编码此类融合多肽的多核苷酸或表达此类融合多肽的载体与经基因修饰以表达广谱中和的抗体(诸如3BNC117(Hartweger等人，J.Exp.Med.2019,1301；Moffett等人，Sci.Immunol.4,eaax0644(2019),2019年5月17日))的B细胞群体组合。
8.试剂盒
还提供了试剂盒，其包括一个或多个整体剂量的如本文所述的一种或多种融合多肽或如本文所述的编码此类融合多肽的一种或多种多核苷酸或如本文所述的表达此类融合多肽的一种或多种载体。在一些实施方案中，试剂盒包括两个或更多个整体剂量的如本文所述的一种或多种融合多肽或如本文所述的编码此类融合多肽的两种或更多种多核苷酸或如本文所述的表达此类融合多肽的两种或更多种载体。在一些实施方案中，一个或多个整体剂量在单个容器中。在一些实施方案中，一个或多个整体剂量在两个或更多个单独的容器中。在某些实施方案中，整体剂量可以相同或不同，例如可以包含相同或不同的整体剂量，例如可以包含多肽、多核苷酸、载体或它们的组合。
在各种实施方案中，试剂盒包括一个或多个药物包或一个或多个容器(例如，小瓶、安瓿、预装注射器)，所述药物包或容器含有本文所述的药物组合物的一种或多种成分，诸如如本文所述的一种或多种融合多肽或如本文所述的编码此类融合多肽的一种或多种多核苷酸或如本文所述的表达此类融合多肽的一种或多种载体。在各种实施方案中，试剂盒包括一个或多个容器，所述容器包含水性溶液形式的如本文所述的一种或多种融合多肽或如本文所述的编码此类融合多肽的一种或多种多核苷酸或如本文所述的表达此类融合多肽的一种或多种载体。在各种实施方案中，试剂盒包括一个或多个容器，所述容器包含冻干形式的如本文所述的一种或多种融合多肽或如本文所述的编码此类融合多肽的一种或多种多核苷酸或如本文所述的表达此类融合多肽的一种或多种载体。
在一些实施方案中，试剂盒包括一个或多个整体剂量的能够表达融合多肽的一种或多种病毒载体。在一些实施方案中，整体剂量的一种或多种病毒载体在约103至约1012个病毒病灶形成单位(FFU)或噬菌斑形成单位(PFU)或感染单位(IU)或病毒颗粒(vp)的范围内，例如为约104至约107个病毒FFU或PFU或IU或vp，例如约103至约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个病毒FFU或PFU或IU或vp。
在一些实施方案中，试剂盒包括编码融合多肽的两种或更多种多核苷酸或表达融合多肽的两种或更多种病毒载体，所述融合多肽包括：(1)一种或多种以下融合多肽：其从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQ ID NO:70、76、94、151和161；或者SEQ ID NO:71、77、95、152和162；以及(2)一种或多种以下融合多肽：其从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQ ID NO:188、305、28、41、294、4、176、11、319、259、282、223、213和37；SEQ ID NO:188、305、28、41和294；SEQ ID NO:4、176、11、319、259、282、223、213和37；SEQ ID NO:189、306、29、42、295、5、177、12、320、260、283、224、214和38；SEQ ID NO:189、306、29、42和295；SEQ ID NO:5、177、12、320、260、283、224、214和38；SEQ ID NO:305、319、259、282、223、213、294、176和188；SEQ ID NO:306、320、260、283、224、214、295、177和189；SEQ ID NO:305、294、223、213、176、259、319、188和282；SEQ ID NO:306、295、224、214、177、260、320、189和283；SEQ ID NO:305、294、319、259、282、223、176和188；SEQ ID NO:306、295、320、260、283、224、177和189；SEQ ID NO:305、223、294、176、259、319、188和282；或者SEQ ID NO:306、224、295、177、260、320、189和283。
在一些实施方案中，试剂盒包括编码融合多肽的两种或更多种多核苷酸或表达融合多肽的两种或更多种病毒载体，所述融合多肽包括：(1)一种或多种以下融合多肽：其包含SEQ ID NO:351-356和430中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:351-356和430中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列；以及(2)一种或多种以下融合多肽：其包含SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种病毒载体，其中每种病毒载体包含两种或更多种多核苷酸，所述多核苷酸编码两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白与以下氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或100％相同：SEQ ID NO:345和346；SEQ IDNO:347和348；SEQ ID NO:349和350；SEQ ID NO:351和352；SEQ ID NO:430和352；SEQ IDNO:357和358；SEQ ID NO:360和362；SEQ ID NO:359和361；SEQ ID NO:351和357；SEQ IDNO:351和358；SEQ ID NO:351和359；SEQ ID NO:351和360；SEQ ID NO:351和361；SEQ IDNO:351和362；SEQ ID NO:351和407；SEQ ID NO:351和408；SEQ ID NO:351和409；SEQ IDNO:351和410；SEQ ID NO:352和357；SEQ ID NO:352和358；SEQ ID NO:352和359；SEQ IDNO:352和360；SEQ ID NO:352和361；SEQ ID NO:352和362；SEQ ID NO:352和407；SEQ IDNO:352和408；SEQ ID NO:352和409；SEQ ID NO:352和410；SEQ ID NO:430和357；SEQ IDNO:430和358；SEQ ID NO:430和359；SEQ ID NO:430和360；SEQ ID NO:430和361；SEQ IDNO:430和362；SEQ ID NO:407和409；SEQ ID NO:407和408；SEQ ID NO:408和410；或者SEQID NO:409和410。
在一些实施方案中，试剂盒包括编码融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达融合多肽的一种或多种病毒载体，所述融合多肽从N末端到C末端按顺序包含任选地通过一个或多个接头结合或连接的以下多肽片段或者由以下多肽片段组成：SEQ ID NO:201、78、107、96、229、172、327、6、333、243、331、192、265、311、137、15、123、30、336、302、153、219、298、121、230、240、60、241、276、113、99、21、217和215；SEQ ID NO:78、296、1、339、197、329、232、323、303、234、90、261、274、238、211、325、137、227、209、190、341、57、225、27、210、119、19、165、334、117、153、10、97和300；或者SEQ ID NO:296、1、78、197、339、227、261、274、238、325、137、329、303、234、90、232、27、57、225、323、190、341、119、19、165、334、117、153、10、97和300。
在一些实施方案中，试剂盒包括编码融合多肽的一种或多种多核苷酸或表达融合多肽的一种或多种病毒载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:367-377、411、422-424和431-435中的任一者的氨基酸序列或与367-377、411、422-424和431-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
在一些实施方案中，试剂盒还包括一个或多个整体剂量的一种或多种附加治疗剂。例如，在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种toll样受体(TLR)的一种或多种激动剂或活化剂。在一些实施方案中，TLR激动剂或活化剂选自由TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂组成的组。在一些实施方案中，TLR7激动剂选自由以下项组成的组：GS 9620(维沙莫特)、R848(瑞喹莫特)、DS-0509、LHC-165和TMX-101(咪喹莫特)，并且/或者其中所述TLR8激动剂选自由以下项组成的组：GS-9688、R848(瑞喹莫特)、CV8102(双TLR7/TLR8激动剂)和NKTR-262(双TLR7/TLR8激动剂)。在一些实施方案中，TLR9激动剂选自由以下项组成的组：AST-008、可比托莫特、CMP-001、IMO-2055、IMO-2125、利尼莫特、MGN-1601、BB-001、BB-006、IMO-3100、IMO-8400、IR-103、IMO-9200、阿格托莫特、DIMS-9054、DV-1079、DV-1179、AZD-1419、来菲莫特(MGN-1703)、CYT-003、CYT-003-QbG10、替索托利莫特和PUL-042。在一些实施方案中，TLR激动剂是选自病原体活化的分子模式(PAMP)、胞嘧啶-磷酸-鸟苷(CpG)寡聚脱氧核苷酸和免疫刺激性RNA(isRNA，例如CV8102)的非编码免疫刺激性多核苷酸。
在一些实施方案中，试剂盒包括选自以下项的白介素的一种或多种白介素受体激动剂：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFNγ、集落刺激因子2(CSF2；又名GM-CSF)和FLT3LG，例如选自由以下项组成的组的一种或多种细胞因子：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、FLT3LG以及它们的组合和功能变体。
在一些实施方案中，试剂盒包括抑制性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种拮抗剂或抑制剂和/或刺激性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种活化剂或激动剂。在一些实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白或受体选自由以下项组成的组：CD27、CD70；CD40、CD40LG；CD47、CD48(SLAMF2)、含跨膜和免疫球蛋白结构域2(TMIGD2、CD28H)、CD84(LY9B、SLAMF5)、CD96、CD160、MS4A1(CD20)、CD244(SLAMF4)；CD276(B7H3)；含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1、B7H4)；V-set免疫调节受体(VSIR、B7H5、VISTA)；免疫球蛋白超家族成员11(IGSF11、VSIG3)；自然杀伤细胞细胞毒性受体3配体1(NCR3LG1、B7H6)；HERV-H LTR相关2(HHLA2、B7H7)；诱导型T细胞共刺激因子(ICOS、CD278)；诱导型T细胞共刺激因子配体(ICOSLG、B7H2)；TNF受体超家族成员4(TNFRSF4、OX40)；TNF超家族成员4(TNFSF4、OX40L)；TNFRSF8(CD30)、TNFSF8(CD30L)；TNFRSF10A(CD261、DR4、TRAILR1)、TNFRSF9(CD137)、TNFSF9(CD137L)；TNFRSF10B(CD262、DR5、TRAILR2)、TNFRSF10(TRAIL)；TNFRSF14(HVEM、CD270)、TNFSF14(HVEML)；CD272(B和T淋巴细胞相关(BTLA))；TNFRSF17(BCMA、CD269)、TNFSF13B(BAFF)；TNFRSF18(GITR)、TNFSF18(GITRL)；MHC I类多肽相关序列A(MICA)；MHC I类多肽相关序列B(MICB)；CD274(CD274、PDL1、PD-L1)；程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4、CD152)；CD80(B7-1)、CD28；nectin细胞粘附分子2(NECTIN2、CD112)；CD226(DNAM-1)；脊髓灰质炎病毒受体(PVR)细胞粘附分子(PVR、CD155)；含PVR相关免疫球蛋白结构域(PVRIG、CD112R)；具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域4(TIMD4；TIM4)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2、TIMD3、TIM3)；半乳凝素9(LGALS9)；淋巴细胞活化3(LAG3、CD223)；信号转导淋巴细胞活化分子家族成员1(SLAMF1、SLAM、CD150)；淋巴细胞抗原9(LY9、CD229、SLAMF3)；SLAM家族成员6(SLAMF6、CD352)；SLAM家族成员7(SLAMF7、CD319)；UL16结合蛋白1(ULBP1)；UL16结合蛋白2(ULBP2)；UL16结合蛋白3(ULBP3)；视黄酸早期转录物1E(RAET1E；ULBP4)；视黄酸早期转录物1G(RAET1G；ULBP5)；视黄酸早期转录物1L(RAET1L；ULBP6)；淋巴细胞活化3(CD223)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞凝集素样受体C1(KLRC1、NKG2A、CD159A)；杀伤细胞凝集素样受体K1(KLRK1、NKG2D、CD314)；杀伤细胞凝集素样受体C2(KLRC2、CD159c、NKG2C)；杀伤细胞凝集素样受体C3(KLRC3、NKG2E)；杀伤细胞凝集素样受体C4(KLRC4、NKG2F)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)；杀伤细胞凝集素样受体D1(KLRD1)；以及SLAM家族成员7(SLAMF7)。在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种T细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种阻断剂、拮抗剂或抑制剂。在一些实施方案中，T细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体选自由以下项组成的组：CD274(CD274、PDL1、PD-L1)；程序性细胞死亡1配体2(PDCD1LG2、PD-L2、CD273)；程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4、CD152)；CD276(B7H3)；含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1、B7H4)；V-set免疫调节受体(VSIR、B7H5、VISTA)；免疫球蛋白超家族成员11(IGSF11、VSIG3)；TNFRSF14(HVEM、CD270)、TNFSF14(HVEML)；CD272(B和T淋巴细胞相关(BTLA))；含PVR相关免疫球蛋白结构域(PVRIG、CD112R)；具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；淋巴细胞活化3(LAG3、CD223)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2、TIMD3、TIM3)；半乳凝素9(LGALS9)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；以及杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)。利瑞鲁单抗是结合并阻断KIR2DL1/2L3受体的例示性抗体。在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种T细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种激动剂或活化剂。在一些实施方案中，T细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体选自由以下项组成的组：CD27、CD70；CD40、CD40LG；诱导型T细胞共刺激因子(ICOS、CD278)；诱导型T细胞共刺激因子配体(ICOSLG、B7H2)；TNF受体超家族成员4(TNFRSF4、OX40)；TNF超家族成员4(TNFSF4、OX40L)；TNFRSF9(CD137)、TNFSF9(CD137L)；TNFRSF18(GITR)、TNFSF18(GITRL)；CD80(B7-1)、CD28；nectin细胞粘附分子2(NECTIN2、CD112)；CD226(DNAM-1)；脊髓灰质炎病毒受体(PVR)细胞粘附分子(PVR、CD155)。在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种NK细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种阻断剂、拮抗剂或抑制剂。在一些实施方案中，NK细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体选自由以下项组成的组：杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)；杀伤细胞凝集素样受体C1(KLRC1、NKG2A、CD159A)(例如莫纳利珠单抗(monalizumab)(IPH2201))；以及杀伤细胞凝集素样受体D1(KLRD1、CD94)。在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种NK细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体的一种或多种激动剂或活化剂。在一些实施方案中，NK细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体选自CD16、CD226(DNAM-1)；杀伤细胞凝集素样受体K1(KLRK1、NKG2D、CD314)；以及SLAM家族成员7(SLAMF7)。在一些实施方案中，一种或多种免疫检查点抑制剂包括PD-L1(CD274)、PD-1(PDCD1)或CTLA4的蛋白质抑制剂。在一些实施方案中，CTLA4的蛋白质抑制剂选自由以下项组成的组：伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、BMS-986218、AGEN1181、AGEN1884(泽弗利单抗)、BMS-986249、MK-1308、REGN-4659、ADU-1604、CS-1002、BCD-145、APL-509、JS-007、BA-3071、ONC-392、AGEN-2041、JHL-1155、KN-044、CG-0161、ATOR-1144、PBI-5D3H5、FPT-155(CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308(PD-1/CTLA4)、MGD-019(PD-1/CTLA4)、KN-046(PD-1/CTLA4)、MEDI-5752(CTLA4/PD-1)、XmAb-20717(PD-1/CTLA4)和AK-104(CTLA4/PD-1)。在一些实施方案中，PD-L1(CD274)或PD-1(PDCD1)的蛋白质抑制剂选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、西米单抗、匹地利珠单抗、AB122(赛帕利单抗)、AMP-224、MEDI0680(AMP-514)、斯巴达珠单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、BMS-936559、CK-301、PF-06801591、BGB-A317(替雷利珠单抗)、GLS-010(WBP-3055)、AK-103(HX-008)、AK-105、CS-1003、HLX-10、MGA-012、BI-754091、AGEN-2034(巴替利单抗)、JS-001(特瑞普利单抗)、JNJ-63723283、杰诺单抗(CBT-501)、LZM-009、BCD-100、LY-3300054、SHR-1201、SHR-1210(卡瑞利珠单抗)、Sym-021、ABBV-181、PD1-PIK、BAT-1306(MSB0010718C)、CX-072、CBT-502、TSR-042(多塔利单抗)、MSB-2311、JTX-4014、BGB-A333、SHR-1316、CS-1001(WBP-3155、KN-035、IBI-308(信迪利单抗)、HLX-20、KL-A167、STI-A1014、STI-A1015(IMC-001)、BCD-135、FAZ-053、TQB-2450、MDX1105-01、FPT-155(CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308(PD-1/CTLA4)、MGD-013(PD-1/LAG-3)、FS-118(LAG-3/PD-L1)MGD-019(PD-1/CTLA4)、KN-046(PD-1/CTLA4)、MEDI-5752(CTLA4/PD-1)、RO-7121661(PD-1/TIM-3)、XmAb-20717(PD-1/CTLA4)、AK-104(CTLA4/PD-1)、M7824(PD-L1/TGFβ-EC结构域)、CA-170(PD-L1/VISTA)、CDX-527(CD27/PD-L1)、LY-3415244(TIM3/PDL1)和INBRX-105(4-1BB/PDL1)。在一些实施方案中，一种或多种免疫检查点抑制剂包含CD274(PDL1、PD-L1)、程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1)或CTLA4的小分子抑制剂。在一些实施方案中，CD274或PDCD1的小分子抑制剂选自由GS-4224、GS-4416、INCB086550和MAX10181组成的组。在一些实施方案中，CTLA4的小分子抑制剂包括BPI-002。
在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种抗病毒剂。在一些实施方案中，一种或多种抗病毒剂选自由以下项组成的组：HIV蛋白酶抑制剂、HIV逆转录酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV非催化位点(或变构)整合酶抑制剂、HIV进入(融合)抑制剂、HIV成熟抑制剂、潜伏期逆转剂和衣壳抑制剂。
任选地与此类容器相关联的可以是管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的通知，该通知反映了该机构批准用于人施用的制造、使用或销售。
9.设计可用于促进抗病毒免疫应答的融合多肽的方法
提供了用于设计能够在人体内引发对一种或多种病毒抗原的免疫应答的疫苗构建体或免疫原的方法。免疫原性融合多肽采用计算、经验和手动步骤的组合来设计，可以用于引发对高度可变病毒的免疫应答。这些设计方法可以用于产生能够在人体中诱导对所需靶病毒(包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)、埃博拉病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病病毒)的一种或多种病毒抗原的免疫应答的免疫原。在不同的具体实施中，这些方法提供了针对以下项设计的疫苗构建体：(1)基于广泛的群体的最大表位覆盖率，在本文中称为“群体”构建体或抗原；(2)共享一组限定的HLA等位基因的一组个体的最大表位覆盖率，在本文中称为“HLA限制性”构建体或抗原；或者(3)通过考虑病毒中患者内可变性(包括个体的病毒‘准物种’的独特补体)的感染个体病毒的最大表位覆盖率，在本文中称为“个性化”构建体或抗原。优选地，包含每个构建体的片段代表一个或多个MHC I类和/或MHC II类T细胞表位。因此，这些片段在本文中可被称为群体、HLA限制性或个性化表位，可以将这些表位组合和组装成免疫原性融合多肽。
大部分步骤可以在计算机中执行，但一些步骤可以手动执行(例如，包含和/或排除对某些多肽序列的选择；对一个或多个接头的选择)，并且可基于实验数据(例如，实验确定的MHC II类表位)并入信息。输入信息是病毒序列数据集(例如，对于HIV而言，是内部和公开获得的HIV群体数据集)。如图1和表M的流程图所汇总，疫苗设计方法涉及以下步骤中的至少2个，例如至少3、4、5、6、7或8个：1.鉴定保守区。在天然存在的病毒序列中，所有9个氨基酸片段(9聚体)都被认为是潜在的T细胞表位。患者间病毒群体中具有至少80％保守性的9聚体位置被鉴定为保守区并包括在内以供进一步分析。2.从保守区构建二价序列。这可以通过采用基于图形的算法来完成。由保守区组装9聚体，以包括最大数量的天然存在的9聚体。3.鉴定保守区内的患者内多样性。这可以使用深度测序数据来完成。4.预测已鉴定的多肽片段与人MHC等位基因的结合。5.产生更长的肽片段(例如，长度为15至26个氨基酸)，包括预测与人MHC I类分子结合的多肽片段。6.包括预测或显示与MHC II类结合的多肽片段。7.评估和消除与宿主(例如，人、狗、猫、马)蛋白质具有高序列同一性(例如，交叉识别)的多肽片段。8.排列多肽片段以减少或避免在连接部处产生人类可识别的新表位。这可以通过评估连接部周围的9聚体与宿主(例如，人、狗、猫、马)蛋白质的MHC I类结合和交叉识别来完成。
Figure BDA0003546306850002311
除了提高表位覆盖率之外，本文所述的方法还提供了从群体、HLA限制性或个性化表位中选择最具免疫原性的表位，这些表位被鉴定用于并入最终疫苗构建体中。在一个方面，这些方法包括筛选群体、HLA限制性或个性化构建体的一组候选多肽片段的MHC肽结合亲和力。可以使用一种或多种算法来预测MHC结合亲和力。示例性预测算法包括NetMHC(Vita等人，Nucleic Acids Res 2015 43:D405-D412)、NetMHCpan(Andreatta andNielsen Bioinformatics 2016 32:511-517)和MHCflurry(O’Donnell等人，Cell Syst2018 7:12-132)。其他T细胞表位预测工具是可公开获得的并且例如在Sanchez-Trincado等人，J.Immunology Res.2017，文章编号2680160中描述。用于鉴定MHC结合肽的另外的方法包括例如如US 10,055,540、WO 2019/104203中所述的采用机器学习工具的那些方法，以及Bulik-Sullivan等人，Nature Biotechnology 2019 37:55中所述的“EDGE”工具。
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生二价群体或HLA限制性构建体的方法，这些构建体被设计成通过提供数学确定和提高的所有潜在T细胞表位的覆盖率来捕获病毒蛋白质组(例如，HIV蛋白质组)的独特多样性，并例如通过保留与天然存在的病毒蛋白质组中发现的相同顺序的多肽片段来确保该对构建的多肽中的每个多肽中的表位保留原始输入病毒序列的位置信息。因此，所得的该对多肽的表位将更类似于天然存在的病毒序列的表位，从而增加了它们引发相关T细胞反应的可能性。
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生二价HLA限制性构建体的方法，该构建体被设计成通过在一系列宿主HLA等位基因中对表位产生建模来捕获驱动抗原加工和T细胞识别的宿主遗传多样性。
通常，此处描述的方法包括使用基于图形的方法就所有潜在T细胞表位(“PTE”)在病毒蛋白质组序列群体中的覆盖率最初提供了一组数学确定和提高的PTE。与类似的基于图形的疫苗设计方法不同，此处描述的方法仅使用在自然序列中也相邻的相邻PTE来构建连接的PTE片段。这提供了保留PTE在序列源集中的位置信息的构建体。同样与其他基于图形的方法不同，此处描述的方法同时构建了二价构建体，以提供对群体中最高度保守的PTE的最大覆盖。结果得到初始二价疫苗构建体，其有利地最大化高度保守的PTE，这些PTE最有可能与天然序列中的保守表位高度相似。更有利地，仅使用最高度保守的PTE降低了逃逸突变体的可能性，因为高度保守的序列更有可能对病毒功能至关重要。
通过这些方法产生的初始二价构建体本身可用作疫苗，或者它可作为进一步的构建体(诸如HLA限制性构建体或个性化构建体，如下文更详细描述)的基础。
本文所述的方法通常从使用本文称为“保守分析”或“保守算法”的过程鉴定保守区二价序列开始。这些方法通常还包括使用本文称为“保守步行算法”或“CWA”的过程构建具有最大表位覆盖率同时保留来自天然序列的PTE的位置信息的二价疫苗构建体的步骤。因此，在一些具体实施中，该方法中的初始步骤是针对选定的一组病毒基因鉴定病毒蛋白质组中的一组所有保守区。在用于设计融合多肽以引发对HIV-1的免疫应答的具体实施中，该组HIV-1病毒基因选自Gag、Pol、Env和Nef中的两个或更多个。在一些具体实施中，该组病毒基因由Gag、Pol、Env和Nef组成。在一些具体实施中，该组病毒基因由Gag、Pol和Nef组成。在一些具体实施中，该组病毒基因由Gag和Nef或Pol和Env或仅Pol组成。
根据此处描述的方法，首先将病毒蛋白质组序列群体与参考序列(例如，由GenBank登录号K03455鉴定的HIV参考序列HXB2)进行比对。由Env、Gag、Nef和Pol基因编码的多肽的参考序列在本文中分别提供为SEQ ID NO:403-406。病毒蛋白质组序列的初始输入或‘源’群体由从天然存在的病毒获得的序列组成。此类序列可例如从洛斯阿拉莫斯国家实验室、美国卫生与公众服务部和美国国立卫生研究院维护的HIV数据库中公开获得。在本文所述方法的一些具体实施中，源病毒序列可由对应于特定病毒组和/或进化枝的序列组成。在一些具体实施中，为了改进保守区和序列的鉴定，输入病毒序列可限于单个病毒进化枝和/或组。在一些具体实施中，输入病毒序列限于组M进化枝B序列。
源病毒序列与参考序列的比对可使用多种比对算法来实现，例如快速傅里叶变换算法MAFFT。Katoh等人，2002Nucleic Acids Res.30(14):3059-66。基础MAFFT软件是可公开获得和例如在伯克利软件套件(BSD)许可下分发的。
接下来，将保守算法应用于比对后的序列。对于比对中的每个序列，从第一个氨基酸位置开始，该方法一次移动一个氨基酸位置并产生长度为9个氨基酸的所有可能的氨基酸片段，在本文中称为“9聚体”。因此，对于比对中的每个序列，该算法产生一组从N末端氨基酸开始的9个氨基酸子序列(“9聚体”)，每个子序列与前面的子序列重叠八个氨基酸，使得比对中每个长度为l的序列含有(l-8)个9聚体。
接下来，对于每个9聚体位置，该方法鉴定两个最常见的独特9聚体以及它们在比对的源病毒蛋白质组序列集中的流行率。换句话说，从位置i开始，每个位置的两个最常见的独特9聚体是基于它们的频率来鉴定的，计算为独特9聚体在比对中在位置i出现的次数除以比对中的序列总数。
计算上，每个长度为l的序列含有l-8个9聚体。我们将所有从位置i开始的9聚体定义为sij，将频率定义为fij,j＝1、2、3…m。在位置i总共有m个独特9聚体。每两个独特9聚体(siu,siv)可以构成一个9聚体对，其频率为fiu+fiv。并且每个9聚体本身可以构成一个9聚体对，如(siu,siu)，其频率为fiu。因此，在每个位置总共有m+(m–1)+(m–2)+…+2+1＝m*(m+1)/2个9聚体对。
然后，该方法通过将含有两个最常见的9聚体中任一个的比对的源病毒蛋白质组序列集的比例相加来计算每个9聚体位置的二价保守性。为此，通过将比对中含有两个最常见的独特9聚体中任一个的序列的比例相加来计算每个位置的“二价保守性”。如本文所用，“二价保守性”是指在9聚体位置含有与两个最普遍的氨基酸片段中的任一个完全相同的9个氨基酸片段(9聚体)的序列的百分比。
接下来，通过提取比对中具有所需二价保守性(例如，大于80％或大于90％的二价保守性，这意味着位置i处两个最常见的9聚体在保守区的新比对中占该位置处9聚体的80％以上或90％以上)的序列来产生保守区的新比对。换句话说，该方法将新比对中的保守区鉴定为其中每个位置处两个最常见的9聚体的频率之和大于某个截止值(例如，大于80％或大于90％)的那些。因此，该方法还计算了保守区的新比对中每个位置处每对独特9聚体的频率。
在一些具体实施中，可将进一步的选择标准应用于保守区，诸如限于具有大于90％的保守性的区域并去除少于35个氨基酸的短片段。
使用这组修改的保守区，该方法的某些具体实施应用CWA来构建二价序列构建体。CWA将9聚体对连接在保守区的比对的相邻位置，这些位置共享八个氨基酸的重叠。
计算上，每个9聚体s含有9个氨基酸，我们写为s[x:y]表示从位置x到y的氨基酸子序列，总共y-x+1个氨基酸：
siu[2:9]＝＝si+1p[1:8]且siv[2:9]＝＝si+1q[1:8]
或者
siu[2:9]＝＝si+1q[1:8]且siv[2:9]＝＝si+1p[1:8]。
接下来，该算法构建了有向无环图，其中每个9聚体对是一个节点，相邻节点之间的边由相邻位置中连接的9聚体对形成，每条边的权重等于下游9聚体对的频率。这种有向无环图是位置De Brujin图。此类图已结合下一代测序数据的组装进行了描述，例如如Ronen等人，Bioinformatics2012 28:188-196中所述。该方法还添加了源节点，将其与第一个位置的所有节点连接；以及宿节点，将其与最后一个位置的所有节点连接。然后将权重取反，找到从源节点到宿节点的最佳路径，其中最佳路径被定义为从源节点到宿节点的所有路径中所有9聚体对的频率之和最大的路径。例如，使用Bellman–Ford算法执行找到最佳路径的任务。通常，Bellman-Ford算法计算加权有向图中从单个源顶点到所有其他顶点的最短路径，该加权有向图由一组由边连接的顶点组成，其中边具有与它们相关的方向。
计算步骤可以汇总如下：
·(4-1)将每个9聚体对作为节点处理，并在步骤3中的相邻节点之间构建边缘；
·(4-2)添加源节点并将其与第1个位置的所有节点连接；
·(4-3)添加宿节点并将其与最后一个位置的所有节点连接；
·(4-4)每个边缘的权重等于下游9聚体对的频率；
·(4-5)使用Bellman–Ford算法将所有权重取反并找到最佳路径。
该方法的另外的步骤是基于最佳二价9聚体对路径构建二价疫苗序列，并且如果最佳二价9聚体对路径内相邻位置的两个9聚体共享8个氨基酸的重叠，则连接它们。如果最佳二价9聚体路径内相邻位置的两个9聚体共享八个氨基酸的重叠，则通过连接它们来构建二价构建体，从而产生连接的9聚体的两个序列，它们一起形成二价构建体。连接的相邻9聚体对均具有8个氨基酸重叠，因此它们将被组装成两个序列。例如，可以将一个9聚体对(AIIIIIIIS(SEQ ID NO:464)、MIIIIIIII(SEQ ID NO:465))与另一个9聚体对(IIIIIIISK(SEQ ID NO:466)、IIIIIIIIR(SEQ ID NO:467))连接，并且形成两个序列(二价序列)：AIIIIIIISK(SEQ ID NO:468)和MIIIIIIIIR(SEQ ID NO:469)。
计算上，可以将该方法描述为基于位置De Brujin图形的二价疫苗序列设计算法，其包括以下5个基本步骤：
步骤1：对所有群体序列进行比对。
步骤2：对于每个9聚体位置，找出所有独特9聚体及其频率，并构建具有频率的9聚体对集。每个长度为l的序列含有l-8个9聚体。我们将所有从位置i开始的9聚体定义为sij，将频率定义为fij,j＝1、2、3…m。在位置i总共有m个独特9聚体。每两个独特9聚体(siu,siv)可以构成一个9聚体对，其频率为fiu+fiv。并且每个9聚体本身可以构成一个9聚体对，如(siu,siu)，其频率为fiu。因此，在每个位置总共有m+(m–1)+(m–2)+…+2+1＝m*(m+1)/2个9聚体对。
步骤3：如果相邻位置中的9聚体对不具有任何冲突的氨基酸，则连接它们。如本文所用，“冲突的氨基酸残基”是指两个9聚体之间的重叠位置处的不同氨基酸残基。每个9聚体s含有9个氨基酸，我们写为s[x:y]表示从位置x到y的氨基酸子序列，总共y-x+1个氨基酸：
siu[2:9]＝＝si+1p[1:8]且siv[2:9]＝＝si+1q[1:8]
或者
siu[2:9]＝＝si+1q[1:8]且siv[2:9]＝＝si+1p[1:8]
步骤4：根据路径内所有9聚体的频率之和找到从第1个9聚体位置到最后一个位置的最佳路径。基本思路是将最大覆盖率二价疫苗构建问题建模为经典图论问题，其中解决方案是在有向无环图中找到最小路径。
步骤5：基于最佳二价9聚体对路径构建二价疫苗序列，并且如果最佳二价9聚体对路径内相邻位置的两个9聚体共享8个氨基酸的重叠，则连接它们。以例如以下情况为例：
情况1：如果siu[2:9]＝si+1p[1:8]且siv[2:9]＝si+1q[1:8]，则连接siu与si+1p以及siv与si+1q；
情况2：如果siu[2:9]＝si+1q[1:8]且siv[2:9]＝si+1p[1:8]，则连接siu与si+1q以及siv与si+1p；
情况3：如果siu[2:9]＝si+1p[1:8]且siv[2:9]＝si+1q[1:8]且siu[2:9]＝si+1q[1:8]且siv[2:9]＝si+1p[1:8]，则连接的选择基于自然序列中的两个连接的流行率：
将输入序列中six和si+1y共存的流行率表示为Cixy；
如果Ciup+Civq>Ciuq+Civp，则连接siu与si+1p以及siv与si+1q；
如果Ciuq+Civp>Ciup+Civq，则连接siu与si+1q以及siv与si+1p；
如果Ciup+Civq＝Ciuq+Civp，则回溯并组合位置i-1和i中9聚体对共存的流行率，直到第1个位置。如果两个不同的连接之间没有区别，则随机选择一个。
HLA限制性构建体
在一些具体实施中，疫苗构建体(例如，单价、二价或多价)可被设计成增加与特定HLA等位基因或一组HLA等位基因结合或者由所述等位基因呈递的可能性。根据该具体实施，可以使用诸如NetMHC或MHCflurry的工具预测多价(例如，二价)多肽中每个9聚体的MHC结合亲和力，并且可以排除不以高亲和力结合感兴趣的特定HLA等位基因的9聚体。这些工具是可公开获得的并且例如在Lundegarrd等人，Nucleic Acids Res.2008年7月1日；36(Web Server issue):W509-12以及O’Donnell等人，Cell Systems 2018 7:129-132中描述。另外的可公开获得的T细胞表位预测工具可以用于本文所述的病毒疫苗设计方法中，并且在例如Sanchez-Trincado等人，J Immunol Res(2017)2017:2680160(PMID:29445754)中描述。用于鉴定MHC I类结合表位的预测工具包括例如MAPPP、PEPVAC、EPISOPT、BIMAS、Propred-1、EpiJen、IEDB-MHCI、Net MHC、NetMHCpan、nHLApred、NetCTL和WAPP。用于鉴定MHC II类结合表位的预测工具包括例如EpiDOCK、PREDIVAC、EpiTOP、TEPITOPE、Propred、IEDB-MHCII、IL4pred、MHC2PRED、NetMHCII和NetMHCIIpan。用于鉴定MHC I类和/或MHC II类结合表位的预测工具包括例如MotifScan、Rankpep、SYFPEITHI、Vaxign、MHCPred、MULTIPRED2、SVMHC和SVRMHC。
在一些具体实施中，通过进行人类蛋白质组交叉识别分析进一步改进构建体，例如通过包括在人类蛋白质组数据库诸如UniProt中搜索构建体中的所有9聚体以鉴定与人类肽具有一定氨基酸序列同一性(例如，至少5个残基)或与人类蛋白质共享面向T细胞受体(TCR)的残基的任何9聚体的方法。然后可以从构建体中排除任何此类9聚体。然后例如使用“串珠”方法将所有剩余的9聚体组合，从而将多个表位连接在单个连续融合多肽中。参见例如Negahdaripour等人，Infect Genet Evol.(2018)58:96-109；Schubert等人，GenomeMed.2016年1月26日；8(1):9；Bounds等人，Hum Vaccin Immunother.2017年12月2日；13(12):2824-2836；Toes等人，Proc Natl Acad Sci U S A.(1997)94(26):14660-5；以及Whitton等人，J Virol.1993年1月；67(1):348-52。在另选具体实施中，剩余的9聚体中的每一个在上游和下游都侧接有最保守的8个氨基酸片段，以产生25个氨基酸长的肽，并且例如使用“串珠”方法将所有25聚体组合。
在一些具体实施中，可例如通过对连接片段进行HLA结合分析、人类蛋白质组交叉识别分析或这两种分析任选地重新排列多肽片段，以减少或避免有害连接反应。在设计抗癌疫苗的背景下用于减少新抗原的连接表位呈递的例示性方法在WO 2019/104203中描述。
在一些具体实施中，通过计算机执行以下步骤中的一个或多个来进一步限定保守区：(i)去除短多肽片段，例如长度为35个或更少氨基酸(例如长度为9-35个氨基酸)的多肽片段；(ii)去除在人类中为弱免疫原性或非免疫原性的片段；(iii)去除在预定序列群体中保守性小于90％(在某些情况下，保守性小于80％)的片段；(iv)包括来自HIV-1蛋白的已知在人类中为免疫原性的另外的片段(例如Env、Gag、Nef和Pol)(参见例如hiv.lanl.gov/content/immunology/maps/maps.html中的表位图；Fischer等人，Nat Med.(2007)13(1):100-6；以及Addo等人，J Virol,(2003)77(3):2081-92)。
在一些具体实施中，相邻的多肽片段可任选地被接头序列分开，如上文所述。在一些实施方案中，一个或多个接头序列包括可切割接头，任选地还包括位于可切割接头附近的附加接头序列。另外的接头可以是另一种可切割接头、聚丙氨酸接头、聚甘氨酸接头、柔性接头或刚性接头，如上文和本文所述。在一些实施方案中，弗林蛋白酶识别位点在2A可切割接头的N末端前或位于该处。在特定具体实施中，在接头序列包含口蹄疫病毒(FMDV)可切割肽、FMDV 2A或其衍生物的情况下，另外的接头序列可以是REKR序列(SEQ ID NO:382)或其衍生物。在一些具体实施中，接头选自短聚丙氨酸肽，例如由2至4个丙氨酸残基(SEQ IDNO:470)组成或者具有序列AAY(SEQ ID NO:379)或AAX(SEQ ID NO:380)的肽，其中X是任何氨基酸残基。
在一些具体实施中，在二价多肽的每个相邻保守区之间插入接头。在一些具体实施中，例如，当没有产生有害连接表位时，在多肽中相同蛋白质的相邻片段之间没有接头插入。可以在不同蛋白质的相邻片段之间插入接头。
个性化构建体
在一些具体实施中，本公开还提供了用于产生个性化构建体的方法。通常，个性化构建体从基于群体的疫苗构建体开始，该构建体定义了保守区并考虑了受试者自身病毒分离株(DNA或RNA)的序列多样性，以便修改参考群体的片段以产生足够的T细胞表位来覆盖患者内病毒多样性。因此，这些方法提供了最终的疫苗构建体，其多肽序列解释了感染特定患者的病毒的病毒多样性。为此，这些方法包括分析个体患者深度测序数据，以定义使用上述方法获得的二价疫苗构建体所覆盖的保守区的每个位置内的患者内病毒序列变异性。本质上，该方法包括鉴定受试者体内存在的病毒准物种变体，并修改初始二价疫苗构建体以反映这种多样性，并进一步降低逃逸突变体的风险，同时改善个体HLA等位基因的呈现。
在初始步骤中，组装深度测序读段以产生特定于受试者的共有序列，将该共有序列映射到参考序列，诸如HXB2。在参考构建体(即根据上述方法制备的群体构建体)中相应序列所覆盖的保守区内的每个9聚体位置，从完全覆盖该位置的多个测序读段中提取相应子序列，并将其转化为9个氨基酸序列(9聚体)。接下来，提取被足够多的测序读段(例如，至少约1000个读段)覆盖的那些位置中的9聚体，条件是它们以覆盖的测序读段的至少阈值比例(例如，至少约1％)存在。将提取的9聚体子序列与参考二价构建体的序列进行比对，并确定错配。
在一些具体实施中，该方法还包括基于个体宿主的一组HLA等位基因呈现的可能性来鉴定可用作实际表位的区域。可使用预测算法来确定与宿主HLA结合的可能性。例如，已经使用可公开获得的数据库来开发模拟每个等位基因的肽结合的深度学习模型设计了此类算法。这可与可以定义抗原变体在调节T细胞受体(TCR)识别中的潜在影响或将肽鉴定为逃逸变体的计算机内、已发表和/或实验性体外T细胞引发数据相结合。
在一些具体实施中，该方法还包括排除具有预先存在的逃逸变体的序列。例如，在还预测已知或已被实验定义为逃避变体的患者内9聚体变体结合的MHC(如使用诸如NetMHC、NetMHCpan、MHCflurry的工具或如上所述的其他类似工具确定)情况下，可将其排除。另外，鉴定了未包含在二价疫苗构建体中但映射到该构建体覆盖的位置的任何9聚体变体，并且如果预测该9聚体变体对受试者的HLA等位基因具有低结合亲和力，则可能需要从二价疫苗构建体中去除该9聚体位置才能避免逃逸。还可以例如使用逃逸变体的现有知识、肽预测模型、免疫肽组分析和体外T细胞识别数据来确定要排除的可能逃逸变体。
如上所述，该方法包括分析从感染的受试者获得的病毒蛋白质组序列。在一些具体实施中，该方法可任选地还包括从受试者获得病毒RNA或DNA的样品的步骤。样品可以是血浆样品或血液样品，例如含有或富集外周血单核细胞(PBMC)或淋巴组织的样品。可在抗逆转录病毒疗法之前(“preART”)或在ART之后从受试者获得样品。样品可包括血浆病毒RNA、前病毒DNA、完整前病毒DNA和储库长出病毒中的一种或多种。在一些具体实施中，样品是从感染HIV的治疗初治型受试者获得的。在一些具体实施中，样品是从ART后的受试者获得的。
在一些实施方案中，这些方法还可包括从获自受试者的生物样品(例如血清样品)中分离病毒RNA或DNA，以及对病毒DNA进行测序。
测序步骤还可包括组装多个测序读段以产生受试者共有序列；将所述多个读段中的每个读段与所述受试者共有序列进行比对；以及将所述受试者的所述比对读段映射到参考序列以获得序列坐标。参考序列可以是例如由GenBank登录号K03455鉴定的HIV参考序列HXB2。HXB2参考蛋白Env、Gag、Nef和Pol的多肽序列在本文中提供为SEQ ID NO:403-406。
实施例
提供以下实施例以说明而非限制受权利要求书保护的本发明。
实施例1
产生二价疫苗构建体的保守分析和保守步行分析(CWA)的图解具体实施
该实施例通过保守分析和CWA的具体实施以产生基于由HIV-1Env、Gag、Nef和/或Pol基因编码的保守蛋白质区域的二价疫苗构建体描述了基于群体的二价多肽构建体的设计。
首先，该方法针对选定的一组病毒基因鉴定病毒蛋白质组中的一组所有保守区。在该实施例中，该组病毒基因由HIV-1Gag、Pol和Nef组成。
计算上，可以将保守算法和CWA的组合描述为基于位置De Brujin图的二价疫苗序列设计算法，其包括以下5个基本步骤，如图3所示：
步骤1：将一组源病毒蛋白质组序列与参考序列进行比对。
在步骤1中，将病毒蛋白质组序列的源群体与参考序列进行比对。在该实施例中，所使用的参考序列是由GenBank登录号K03455鉴定的HIV-1HXB2。HXB2参考多肽Env、Gag、Nef和Pol的氨基酸序列在本文中分别提供为SEQ ID NO:403、404、405和406。病毒蛋白质组序列的源群体由从天然存在的病毒获得的序列组成。此类序列可例如从洛斯阿拉莫斯国家实验室、美国卫生与公众服务部和美国国立卫生研究院(hiv.lanl.gov)维护的HIV数据库中公开获得，该数据库是用于该实施例中的序列源群体的数据库。出于说明的目的，我们将分析集中在病毒序列的一个子集，此处为组M进化枝B的序列。使用多重比对算法、特别是快速傅里叶变换算法MAFFT进行比对。Katoh等人，(2002)Nucleic Acids Res.30(14):3059-66。基础MAFFT软件是可公开获得和例如在伯克利软件套件(BSD)许可下分发的。
步骤2：对于每个9聚体位置，找出所有独特9聚体及其频率，并构建具有频率的9聚 体对集。
在步骤2中，我们将保守算法应用于该组比对的序列。对于比对中的每个序列，从N末端的第一个氨基酸开始，该算法一次移动一个氨基酸位置以产生长度为9个氨基酸的一组所有可能的氨基酸片段，称为“9聚体”。因此，对于比对中的每个序列，该算法产生一组从N末端氨基酸开始的9个氨基酸子序列(“9聚体”)，每个子序列与前面的子序列重叠八个氨基酸，使得比对中每个长度为l的序列含有(l-8)个9聚体。
接下来，对于每个9聚体位置，该方法鉴定两个最常见的独特9聚体以及它们在比对的源病毒蛋白质组序列集中的流行率。换句话说，从位置i开始，每个位置的两个最常见的独特9聚体是基于它们的频率来鉴定的，计算为独特9聚体在比对中在位置i出现的次数除以比对中的序列总数。
计算上，每个长度为l的序列含有l-8个9聚体。我们将所有从位置i开始的9聚体定义为sij，将频率定义为fij,j＝1、2、3…m。在位置i总共有m个独特9聚体。每两个独特9聚体(siu,siv)可以构成一个9聚体对，其频率为fiu+fiv。并且每个9聚体本身可以构成一个9聚体对，如(siu,siu)，其频率为fiu。因此，在每个位置总共有m*(m+1)/2个9聚体对。
然后，该方法通过将含有两个最常见的9聚体中任一个的比对的源病毒蛋白质组序列集的比例相加来计算每个9聚体位置的二价保守性。为此，通过将比对中含有两个最常见的独特9聚体中任一个的序列的比例相加来计算每个位置的“二价保守性”。
接下来，通过提取比对中具有所需二价保守性的序列来产生保守区的新比对。在该实施例中，我们使用大于80％或大于90％的二价保守性，这意味着位置i处两个最常见的9聚体在保守区的新比对中占该位置处9聚体的80％以上或90％以上。换句话说，该方法将新比对中的保守区鉴定为其中每个位置处两个最常见的9聚体的频率之和大于某个截止值(例如，大于80％或大于90％)的那些。因此，该方法还计算了保守区的新比对中每个位置处每对独特9聚体的频率。
这在图4A中以图形方式说明。图4A示出了一组假设的10个输入自然序列，每个序列在第一个9聚体内具有单个氨基酸变异。在该组10个序列中，在第三个氨基酸位置处具有“L”的9聚体出现6次，在该位置处具有“I”的9聚体出现3次，并且在该位置处具有“I”但在第一个位置具有不同氨基酸的9聚体出现一次。因此，保守算法选择两个最普遍的9聚体，它们一起占比对序列群体中该位置处可能的9聚体的90％。
使用该分析，可以确定群体中所有蛋白质序列中每个位置的高度保守的9聚体的分布。这在图4B中以图形方式说明。该图示出了从洛斯阿拉莫斯HIV序列数据库获得的9,846个组M进化枝B输入序列中由Gag基因p24蛋白编码的蛋白质的保守分布。y轴显示二价保守性，x轴显示9聚体相对于参考序列(来自HXB2的Gag p24)的位置。在图的顶部，水平条将保守区描绘为每个位置处使用两个最普遍的9聚体的具有至少80％二价保守性的区域。带正方形的深灰色线绘制了每个位置处使用两个最普遍的9聚体的二价保守性，而带菱形的浅灰色线示出了每个位置处仅使用最普遍的9聚体的保守性。该分析表明，使用两个最普遍的9聚体改进了对输入群体的结构保守序列的鉴定。
我们接下来应用进一步的选择标准来定义保守区，包括限于具有大于90％二价保守性的区域并去除少于35个氨基酸的短片段，例如长度为9-35个氨基酸的片段。
我们还包括来自某些区域的一些附加片段，这些区域具有至少80％的二价保守性并且已知具有高度免疫原性，特别是与参考序列HXB2_K03455的氨基酸64-99对应的Nef区域(参见例如hiv.lanl.gov/content/immunology/maps/maps.html的表位图；Fischer等人，Nat Med.(2007)13(1):100-6；以及Addo等人，J Virol,(2003)77(3):2081-92)。
步骤3：如果相邻位置中的9聚体对不具有任何冲突的氨基酸，则连接它们。
使用这组修改的保守区，我们应用CWA来构建二价序列构建体。CWA将9聚体对连接在保守区的比对的相邻位置，这些位置共享八个氨基酸的重叠。
计算上，每个9聚体s含有9个氨基酸，我们写为s[x:y]表示从位置x到y的氨基酸子序列，总共y-x+1个氨基酸：
siu[2:9]＝＝si+1p[1:8]且siv[2:9]＝＝si+1q[1:8]
或者
siu[2:9]＝＝si+1q[1:8]且siv[2:9]＝＝si+1p[1:8]。
步骤4：根据路径内所有9聚体的频率之和找到从第一个9聚体位置到最后一个位 置的最佳路径。
在步骤4中，该算法构建了有向无环图，其中每个9聚体对是一个节点，相邻节点之间的边由相邻位置中连接的9聚体对形成，每条边的权重等于下游9聚体对的频率。这种有向无环图是位置De Brujin图。此类图已结合下一代测序数据的组装进行了描述，例如如Ronen等人，Bioinformatics(2012)28:188-196所述。
在本实施例中，我们添加源节点并将其与第一个位置的所有节点连接；并且我们添加宿节点并将其与最后一个位置的所有节点连接。在有向图中，源节点是仅具有流出的节点，并且宿节点是仅具有流入的节点。此处，源节点是与第一个位置的所有9聚体对节点连接的虚设节点，并且宿节点是与最后一个位置的所有9聚体对节点连接的虚设节点。
然后我们将所有权重取反并找到从源节点到宿节点的最佳路径，其中最佳路径是根据所有9聚体对的频率之和来定义的。例如，使用Bellman–Ford算法执行找到最佳路径的任务。通常，Bellman-Ford算法计算加权有向图中从单个源顶点到所有其他顶点的最短路径。有向图由一组由边连接的顶点组成，其中边具有与它们相关的方向。
计算上，基本思路是将最大覆盖率二价疫苗构建问题建模为经典图论问题，其中解决方案是在有向无环图中找到最小路径。计算步骤可以汇总如下：
·(4-1)将每个9聚体对作为节点处理，并在步骤3中的相邻节点之间构建边缘；
·(4-2)添加源节点并将其与第1个位置的所有节点连接；
·(4-3)添加宿节点并将其与最后一个位置的所有节点连接；
·(4-4)每个边缘的权重等于下游9聚体对的频率；以及
·(4-5)使用Bellman–Ford算法将所有权重取反并找到最佳路径。
步骤5：基于最佳二价9聚体对路径构建二价疫苗序列，并且如果最佳二价9聚体对 路径内相邻位置的两个9聚体共享8个氨基酸的重叠，则连接它们。
在步骤5中，如果最佳二价9聚体路径内相邻位置的两个9聚体共享八个氨基酸的重叠，则通过连接它们来构建二价构建体，从而产生连接的9聚体的两个序列，它们一起形成二价构建体。连接的相邻9聚体对均具有8个氨基酸重叠，因此它们将被组装成两个序列。例如，可以将一个9聚体对(AIIIIIIIS(SEQ ID NO:464)、MIIIIIIII(SEQ ID NO:465))与另一个9聚体对(IIIIIIISK(SEQ ID NO:466)、IIIIIIIIR(SEQ ID NO:467))连接，并且形成两个序列(二价序列)：AIIIIIIISK(SEQ ID NO:468)和MIIIIIIIIR(SEQ ID NO:469)。
该方法在图5A-5C中以图形方式说明。图5A示出了一组假设的9个源病毒序列，这些序列在第一个位置具有2个独特9聚体，并且在第二个相邻位置具有3个独特9聚体。每个序列的频率在序列的右侧表示为“次”，例如“x5”表示序列在源集中出现5次。图5B描绘了位置De Brujin图的构建，其中每个节点是一个二价9聚体对。当相邻位置的两个二价9聚体对共享八个氨基酸的重叠时，将它们连接起来形成一条边。以这种方式产生有向无环图。图5C示出了最佳路径的发现。如上所述，最佳路径是根据所有9聚体对的频率之和来定义的。这是通过找到相邻9聚体之间提供关于输入序列的最高保守性的连接来实现的。因此，在图5C中，如四对中的顶部组所示连接两个9聚体对提供了以下二价序列：
GIIIIIIIIK(SEQ ID NO:471)x0
AIIIIIIIIH(SEQ ID NO:472)x0。
这些序列都不存在于图5A所示的源序列中。
相比之下，在图5C中如四对中的底部组所示连接两个9聚体对提供了以下二价序列：
GIIIIIIIIH(SEQ ID NO:473)x3
AIIIIIIIIK(SEQ ID NO:474)x4。
这些中的每一个在图5A所示的源序列中分别存在3次或4次。因此，算法选择的是这些第二对二价序列，因为它相对于源序列最大化保守性。
计算上，这可以通过以下示例性情况来说明：
情况1：如果siu[2:9]＝si+1p[1:8]且siv[2:9]＝si+1q[1:8]，则连接siu与si+1p以及siv与si+1q；
情况2：如果siu[2:9]＝si+1q[1:8]且siv[2:9]＝si+1p[1:8]，则连接siu与si+1q以及siv与si+1p；
情况3：如果siu[2:9]＝si+1p[1:8]且siv[2:9]＝si+1q[1:8]且siu[2:9]＝si+1q[1:8]且siv[2:9]＝si+1p[1:8]，则连接的选择基于自然序列中的两个连接的流行率：
将输入序列中six和si+1y共存的流行率表示为Cixy；
如果Ciup+Civq>Ciuq+Civp，则连接siu与si+1p以及siv与si+1q；
如果Ciuq+Civp>Ciup+Civq，则连接siu与si+1q以及siv与si+1p；
如果Ciup+Civq＝Ciuq+Civp，则回溯并组合位置i-1和i中9聚体对共存的流行率，直到第一个位置。如果两个不同的连接之间没有区别，则随机选择一个。
这种回溯和共存流行率方法考虑了长于9个氨基酸的肽的流行率，并进一步将本算法与其他基于图形的方法区分开来。
接下来，使用以下三种不同接头策略中的一种来组合来自天然序列中彼此不相邻的区域(即，由于它们缺乏8个氨基酸重叠而不能根据上述CWA结合的区域)的构建序列：1.无需任何接头直接融合；2.在每两个保守区之间插入‘AAA’接头(SEQ ID NO:378)；3.同一蛋白质内的片段无需任何接头直接融合，并在不同蛋白质的片段之间插入F2A接头。
保守步行分析(CWA)方法的概述在图1和图2中示出。SEQ ID NO:345-350的融合多肽和表1中的序列(具有由HIV-1Gag、Nef和Pol基因编码的多肽片段)是根据该方法设计的示例性免疫原性融合多肽序列。
实施例2
应用于由HIV-1基因编码的蛋白质的保守分析和保守步行分析(CWA)的图解具体 实施
该实施例描述了基于(i)Gag和Nef(“GagNef”)、(ii)Pol或(iii)Pol和Env(“PolEnv”)的保守HIV-1区域的类似具体实施。
在以上实施例1中，应用保守算法来鉴定靶基因Gag、Nef、Env和Pol的蛋白质编码区中的一组所有候选保守区。在该实施例中，我们分别利用(1)Gag和Nef、(2)Pol或(3)Pol和Env的蛋白质编码区产生三种不同的二价构建体“GagNef”、“Pol”和“PolEnv”。如在以上实施例1的步骤1-2中，我们首先比对源序列，然后应用保守算法来鉴定靶基因(其为Gag和Nef、Pol或Pol和Env)的蛋白编码区中的一组所有候选保守区。如上所述，然后我们基于保守性和已知的免疫原性应用进一步的选择标准(参见例如hiv.lanl.gov/content/immunology/maps/maps.html的表位图，以及Fischer等人，Nat Med.(2007)13(1):100-6)。在包括由Pol基因编码的多肽片段的某些序列中，我们排除了包括逆转录酶中的“YMDD”基序(SEQ ID NO:462)和蛋白酶中的“DTG”基序中的一者或两者的序列片段，因为它们可能影响酶活性维持的表达。
使用这组修改的保守区，我们应用CWA来构建二价序列构建体，如在实施例1的步骤3-5中。
一些多肽片段通过聚丙氨酸接头(例如，AA、AAA(SEQ ID NO:378)或AAY(SEQ IDNO:379))连接，该接头被选择用于证实目的，因为它是较小的柔性接头，不太可能对蛋白质结构有重要影响。如果我们确定可以融合多肽片段而不产生有害或不希望的连接表位(例如，可能刺激可与自身抗原交叉反应的T细胞的连接表位)，则使用融合方法。如果我们确定可能会产生有害或不希望的连接表位，则在多肽片段之间插入柔性接头。
对于该实施例，我们对可能存在有害表位的连接区域进行了进一步分析，并排列了片段以减少或避免此类连接表位的产生。
肽片段的不同排列产生不同的连接9聚体，可以诱导不同的连接反应。我们开发了一种多肽片段排列工具来检查MHC结合亲和力和与人类肽的交叉识别，用于每种排列中的所有连接9聚体。我们内部开发的多肽片段排列工具搜索肽的不同排列，并基于在9聚体的连接部上应用以下描述的两种分析的计算机预测结果来确定连接反应最小的最佳排列：(1)计算机HLA结合分析以及(2)人类蛋白质组分析以鉴定可能引发可识别自身抗原的T细胞的表位)。每两个相邻片段之间的连接反应分数由预测与靶HLA等位基因具有高结合亲和力的连接9聚体的数量与预测具有带任何连接9聚体的肽或T细胞识别基序的人类蛋白质的数量之和确定。每种片段排列的分数由每种片段排列中所有连接区域的连接反应分数之和确定。
1)当有少于15个肽片段时，我们内部开发的多肽片段排列工具搜索所有可能的排列，并确定连接反应最小(片段排列分数最低)的最佳排列
2)当有至少15个肽片段时，我们内部开发的多肽片段排列工具使用“贪婪”策略。它首先创建所有连接部，然后根据预测的连接反应从最佳连接部开始。接下来，它迭代地搜索下一个兼容的最佳连接部并组装所有肽片段。
计算机MHC I类(人HLA)结合分析：抗原加工、呈递和T细胞受体识别是很复杂的过程，尚未完全了解。细胞内和细胞外抗原在内体区室内被加工，并且细胞质被蛋白酶体加工并被运输到内体区室，诸如ER，在那里它们的肽片段与MHC分子相互作用。稳定的肽-MHC复合物被运输到细胞表面，在那里它们可以被表达TCR的T细胞以适当的特异性识别。抗原加工和呈递中最具选择性的步骤之一是HLA结合。HLA结合亲和力可以使用各种工具(诸如NetMHC或MHCflurry)或源自免疫肽组分析的大型内部数据集来预测，并通过实验结合数据以及从患者样品中定义的表位来确认。这些工具是可公开获得的并且例如在Lundegarrd等人，Nucleic Acids Res.2008年7月1日；36(Web Server issue):W509-12以及O’Donnell等人，Cell Systems 2018 7:129–132中所述。在该实施例中，我们使用了NetMHC。默认设置用于NetMHC中的所有参数，以及肽序列和HLA等位基因的输入信息。IC50值小于1,000nM的预测结合亲和力被认为是低结合亲和力。
人类蛋白质组交叉识别分析：类似于人类肽的表位可诱导可能与自身抗原交叉反应的一种或多种耐受原反应。我们在公共人类蛋白质数据库(例如Uniprot、NCBI)中搜索了我们的疫苗中的所有9聚体。如果HIV肽9聚体与人类肽9聚体具有至少5个残基的氨基酸序列同一性，并且预计两者对相同等位基因都具有高结合亲和力，则它们被认为是交叉保守的9聚体。我们从UniProt数据库下载了所有人类蛋白质序列，并构建了一种工具来支持在具有多达4个错配(至少5个匹配)的所有人类蛋白质9聚体中高效搜索给定的9聚体。
图8示出了人类蛋白质组交叉识别分析的结果。在该实施例中，我们在人类蛋白质数据库中搜索了HIV-1肽9聚体，并鉴定了共享一定数量的氨基酸(暂定至少5个)并基于本文所述的计算机MHC I类分析预测对相同等位基因具有高结合亲和力(例如，IC50小于约1000nM或百分位等级在多肽片段群体中的前5％内)的所有人类蛋白质9聚体。排除了这种既与人类蛋白质的肽片段具有高序列同一性(例如，具有至少55％(9个氨基酸残基中的5个)、例如至少65％(9个氨基酸残基中的6个)、例如至少75％(9个氨基酸残基中的7个)、例如至少85％(9个氨基酸残基中的8个))又具有高预测MHC I类结合亲和力的HIV 9聚体，因为它们可能诱导可能与人类自身抗原(本文定义为“有害表位”)交叉反应的一种或多种耐受原反应。
图9示出了多肽片段排列分析可以如何减少或消除连接区中有害或不希望的表位的可能呈现。在例示的默认排列中，预测Seg 2与Seg3之间以及Seg 3与Seg 4之间的连接9聚体会产生可能在人体中诱导耐受原或自身反应性反应的连接序列(例如，基于计算机HLA结合分析具有高MHC结合亲和力或基于人类蛋白质组交叉识别分析与人类蛋白质发生交叉识别)。我们应用了一种算法，该算法搜索不同的排列并确定产生减少或消除的可能在人体中诱导耐受原或自身反应性反应的预测连接序列的排列。
SEQ ID NO:351-366和407-410的融合多肽是根据该方法设计的示例性免疫原性融合多肽序列。
实施例3
MHC I类限制融合多肽
改进T细胞疫苗抗原设计的一个组成部分是定义一组理想的抗原，这些抗原可以很容易地被宿主的T细胞呈递并引发T细胞反应。来源于病毒抗原的短氨基酸片段(8-30aa长)经过加工并在主要组织相容性复合物(MHC)中定义的宿主人类白细胞抗原(HLA)等位基因上呈递。如果这些等位基因呈递被CD8+T细胞上的T细胞受体(TCR)识别的肽，则它们被定义为MHC I类，并且如果肽和MHC复合物被CD4+T细胞上的TCR识别，则它们被定义为MHC II类。
该实施例描述了一组MHC I类限制性9聚体选自二价构建体并组合形成MHC I类限制性疫苗构建体的方法。该方法通过设计具有预测与人HLA-A*0201等位基因结合的多个表位的免疫原性融合多肽来说明。我们选择人HLA-A*0201等位基因来演示该方法，因为它是美国很常见的等位基因。
使用两种方法来产生HLA-A*0201限制性序列，即“短肽”方法和“长肽”方法。对于短肽方法，我们应用了实施例2中所述的计算机MHC I类结合分析来鉴定二价序列中预测对HLA-A*0201具有低结合亲和力的任何9聚体。从构建体中去除低亲和力9聚体(例如，预测的MHC I类结合IC50值小于1,000nM的9聚体)。
接下来，如实施例2中所述，我们对二价构建体中的所有9聚体进行了人类蛋白质组交叉识别分析。我们鉴定了与人类肽序列共享至少5个残基的任何9聚体，并将它们从构建体中去除。
我们随后应用了实施例2中所述的我们内部开发的多肽片段排列工具，并将两个二价序列中的所有剩余9聚体组合成单个序列，以减少或避免不希望的连接的顺序排列。我们将此称为“串珠”方法。在基于单种或多种MHC I类等位基因结合特异性的疫苗构建体中，辅助CD4+T细胞应答的诱导可以通过包括MHC II类表位来实现。这些可以是文献中定义的II类表位，并且已知被大部分群体靶向，或者可针对个体自己的MHC II类等位基因进行定制(Ranasinghe,J Virol,(2012)86(1):277-83；以及Kaufmann等人，J Virol.(2004)78(9):4463-77)。
对于“长肽”方法，我们进行了与上述相同的步骤以得到“短肽”序列，不同的是在去除低亲和力MHC I类(此处为人HLA-A*0201)结合9聚体后，剩余9聚体中的每一个在上游和下游都侧接有最保守的8个氨基酸片段，以产生25个氨基酸长的肽。然后，与短肽方法一样，使用“串珠”方法将所有25聚体组合成单个序列，以减少或避免不希望的连接的顺序排列。
图10A-B提供了分别示出“短肽”和“长肽”方法的基本方法的流程图。SEQ ID NO:367-377和411的融合多肽是根据该方法设计的示例性免疫原性融合多肽序列。
实施例4
并入深度测序数据分析的个体化构建体
该实施例描述了一种包括深度测序数据分析以形成个体化疫苗构建体的方法。在该实施例中，如在以上实施例1的步骤1-2中，我们首先比对源序列，然后应用保守算法来鉴定靶基因的蛋白编码区中的一组所有候选保守区。在该实施例中，靶基因是Gag、Nef和Pol。我们应用CWA在这些区中构建二价序列，如实施例1的步骤3-5中所示。
除了从下载的群体序列中获得的9聚体之外，我们还分析了目标个体的深度测序数据，以鉴定这些保守区内的患者内多样性。为了使用深度测序数据来鉴定患者内9聚体变体，组装深度测序读段以产生特定于受试者的共有序列。将深度测序读段与受试者特定的共有序列进行比对，然后基于受试者特定的共有序列与HXB2参考序列的比对，将比对映射到HXB2位置坐标。在保守区内的每个9聚体位置，从完全覆盖该位置的所有测序读段中提取相应子序列，并将其转化为9个氨基酸序列。仅包括流行率超过测定背景的9聚体变体。
对于保守区内的所有9聚体位置，我们进行了计算机HLA预测分析，然后将所有位置分类为四类(图6)。如果所有患者内9聚体与二价序列匹配并且其中至少一个具有高预测结合亲和力，则将这些位置分类为I类(在图12A中表示为
Figure BDA0003546306850002511
)。如果所有患者内9聚体与二价序列匹配并且它们都具有低预测结合亲和力，则将这些位置分类为II类(在图12A中表示为
Figure BDA0003546306850002512
)。如果所有患者内9聚体中的至少一个确实与二价序列匹配并且它们都具有高预测结合亲和力，则将这些位置分类为III类(在图12A中表示为
Figure BDA0003546306850002513
)。如果所有患者内9聚体中的至少一个确实与二价序列匹配并且其中至少一个具有低预测结合亲和力，则将这些位置分类为IV类(在图12A中表示为
Figure BDA0003546306850002514
)。
接下来，基于保守区位置分类结果，去除IV类位置中的所有9聚体变体，仅保留其他位置中对患者HLA等位基因具有高结合亲和力的9聚体(例如，预测的MHC I类结合IC50值大于1,000nM的9聚体)。去除基于外部公共HIV数据库(hiv.lanl.gov)或内部实验数据已知是逃逸变体(即，逃避T细胞识别的序列变体)的任何表位。如实施例2中所述，我们对所有剩余的9聚体进行了人类蛋白质组交叉识别分析，并且去除了与人类肽序列共享至少5个残基的任何9聚体。然后如实施例3中的“长肽”方法中所述，剩余的9聚体中的每一个在上游和下游都侧接有最保守的8个氨基酸片段，以产生25个氨基酸长肽(25聚体)。在最终步骤中，我们应用了实施例2中所述的内部开发的多肽片段排列工具，并将所有的25聚体组合成单个序列(“串珠”方法)。
图13提供了示出个体化构建体方法的基本方法的流程图。SEQ ID NO:422提供了根据该方法设计的示例性免疫原性融合多肽序列。它是设计并入深度测序数据分析的例示性个体化构建体；使用来自具有以下HLA等位基因的患者的深度测序数据产生：A*02:01、A*23:01、B*07:02、B*44:03、C*04:01和C*07:02。
实施例5
通过深度测序数据分析改进的HLA限制性构建体
该实施例描述了一种包括深度测序数据和患者HLA数据分析以进一步改进实施例3中所述的HLA限制性疫苗构建体的方法。在该实施例中，如在以上实施例1的步骤1-2中，我们首先比对源序列，然后应用保守算法来鉴定靶基因的蛋白编码区中的一组所有候选保守区。在该实施例中，靶基因是Gag、Pol和Nef。我们应用CWA在这些区中构建二价序列，如实施例1的步骤3-5中所示。
除了从下载的群体序列中获得的9聚体之外，我们还分析了四个具有相同HLA等位基因(HLA-A*0201)的个体的深度测序数据，以鉴定这些保守区内的患者内多样性。
如以上实施例4中所述，我们分析了深度测序数据，并将每个个体的所有保守区位置分为四类。
对于保守区中的每个位置，如果对于至少一名患者而言它属于IV类，则去除所有9聚体变体，因为这表明该等位基因的逃逸途径已被定义。而在所有其他位置，仅保留对靶HLA等位基因(在该实施例中为HLA-A*0201)具有高结合亲和力的9聚体。如实施例2中所述，我们对所有剩余的9聚体进行了人类蛋白质组交叉识别分析，并且去除了与人类肽序列共享至少5个残基的任何9聚体。然后如实施例3中的“长肽”方法中所述，剩余的9聚体中的每一个在上游和下游都侧接有最保守的8个氨基酸片段，以产生25个氨基酸长肽(25聚体)(参见Assadipour等人，Clin Cancer Res.(2017)23(15):4347-4353；Zhang等人，J BiolChem,(2009)284(14):9184-91)。在最终步骤中，我们应用了实施例2中所述的内部开发的多肽片段排列工具，并将所有的25聚体组合成单个序列(“串珠”方法)。
图14提供了示出并入深度测序数据分析的HLA限制性构建体(例如，HLA-A*0201序列)方法的基本方法的流程图。SEQ ID NO:423提供了根据该方法设计的示例性免疫原性融合多肽序列。它是通过深度测序数据分析改进的例示性HLA限制性构建体；使用来自四名HLA-A*02:01患者的深度测序数据产生。
实施例6
含有免疫原性融合多肽的病毒表达载体
在该实施例中，我们产生了编码计算定义的多肽片段(所述多肽片段含有由Gag、Nef和Pol基因编码的HIV-1的保守区作为转基因)的病毒表达载体，并证实了转基因在哺乳动物细胞中的表达。含有保守区的多肽片段通过多种方法串联或连接，包括直接融合、通过添加蛋白水解切割位点序列或在各区之间添加柔性接头来连接各区。出于证实的目的，我们使用了聚丙氨酸(AAA)柔性接头(SEQ ID NO:378)以及来源于口蹄疫病毒(FMDV)多蛋白(F2A)的2A区的蛋白水解切割位点(Ryan等人，J Gen Virol,(1991)72(11):2727-32)。
方法
含有编码融合多肽变体的转基因的病毒表达载体的构建。使用标准方法(VectorBiolabs)通过体外重组产生了表达HIV-1计算定义的疫苗免疫原的Ad5/35载体，该载体采用各种方法连接保守的HIV-1序列。使用经密码子偏好以改进人类表达的合成寡核苷酸(GeneArt,ThermoFisher Scientific)通过PCR产生表达盒，并且使用标准基因克隆技术将其置于CMV启动子的控制下。针对该评估开发的构建体在表1中列出，并在图20中示意性描绘。
Figure BDA0003546306850002541
Figure BDA0003546306850002551
靶基因表达和F2A切割的体外评估。为了改进编码疫苗表达盒的病毒载体的组装，将基因克隆到含有用于克隆靶基因的限制性位点和GFP标记的载体质粒(ThermoFisherScientific)中。按照制造商的方案将DNA转化到One ShotTM TOP10感受态细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并接种到补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上。将板在37℃下孵育过夜。从板中挑出单个菌落并接种到10ml液体LB+氨苄青霉素培养物中，并在Eppendorf台式摇床中以250rpm在37℃下摇动过夜。按照制造商的方案使用QIAprep Spinminiprep试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)处理细菌沉淀，以获得质粒DNA。通过使用NanoDropTM2000(Thermo Scientific)读取280nm处的吸光度来确定核酸浓度。为了评估体外表达，使用ExpiFectamineTM(Invitrogen,Carlsbad,CA)根据制造商的方案将表达载体转染到Expi293TM细胞中。在转染后第2天，当细胞存活率仍>80％时，通过流式细胞术评估它们的GFP表达或将它们制成球粒。通过ELISA评估细胞裂解物的HIV-1gag p24表达，或通过用抗Nef抗体免疫沉淀的蛋白质印迹测定蛋白质表达，从而能够检测在C末端含有Nef序列的全长翻译产物。
结果
图21A-21C中描绘的数据证明，将保守区多肽片段串联或连接成融合多肽的所有三种方法都使得转基因编码的多肽有效转染和表达。翻译产物的评估表明，包含F2A蛋白水解切割序列使得多肽被适当切割(图21C)。然后，我们在各种病毒载体系统中测试了这些构建体在体外和体内引发T细胞反应的效率。
实施例7
表明融合多肽诱导的人T细胞活化的体外测定
在该实施例中，我们建立了一种用于测试表达载体中的疫苗构建体在人体中引发T细胞的功效的体外方法。类似的方法在例如WO 2015/110397中描述。该方法在疫苗学中的应用允许评估转基因盒在人体中的抗原加工、呈递和T细胞引发，以及研究免疫参数，包括可能改变引发功效的佐剂和免疫调节剂。
方法
单核细胞纯化和单核细胞来源的树突细胞(moDC)的成熟。将新鲜分离或冷冻保存的PBMC用于基于moDC的T细胞刺激测定中。使用EasySep人抗CD14阳性选择抗体试剂盒(StemCell Technologies)从感染或未感染HIV、ART初治型或接受ART的个体的PBMCS中纯化CD14+单核细胞。在建立培养之前使用流式细胞术来确认分离的CD14+单核细胞的纯度>90％。为了产生未成熟的moDC，将2×106个纯化的CD14+单核细胞在6孔培养板中的3mLmoDC分化培养基(即含有10％热灭活胎牛血清、1％青霉素链霉素/mL、0.5mM HEPES、800U/mL GM-CSF(Miltenyi Biotec)和1000U IL-4(Miltenyi Biotec)的完整RPMI 1640)中培养。将板在37℃和5％CO2下孵育6天，每天监测以确保单核细胞的粘附。为了产生成熟的moDC，向粘附的未成熟moDC培养物中补充重组可溶性CD40L(0.5μg/ml)、IFN-γ(1,000U/ml)、PGE2(5μM)、TNF-α(10ng/ml)、IL-6(100ng/ml)和IL-1β(10ng/ml)，在第6天再添加3mlmoDC分化培养基，并在37℃和5％CO2下再孵育48小时。
在第8天，使用冰冷的PBS和细胞刮刀分离粘附的成熟moDC，以手动分离moDC。在该程序之后，使用moDC分化培养基洗涤未附着的细胞并将其转移到50ml Falcon管中。将所得细胞混合物在室温下以1500rpm离心5分钟。接下来，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于5mlmoDC分化培养基中。分离成熟的moDC级分并对其进行染色，以用抗CD11c+、抗HLA-DR+、抗CD14-、抗CD40+、抗DCSIGN+、抗CD83、抗CD86和抗OX40L抗体表征moDC的分化表型。结果在图22中示出。
用病毒载体(例如腺病毒(Ad)5/35载体)转导moDC。收获纯化的moDC，在无血清培养基中洗涤两次，然后以107/ml重悬于X-Vivo 15(BioWhittaker,Walkersville,MD)中。在转导之前，将细胞在37℃水浴中平衡20-30分钟。将Ad5/35原液在冰上解冻并以指定的感染复数(MOI)添加到moDC悬浮液中。轻轻混合细胞并立即置于37℃培养箱中。2小时后，添加含有GM-CSF和IL-4的温moDC分化培养基，将moDC稀释至终浓度为105/ml。将0.5ml转导的moDC转移到48孔板中并在37℃和5％CO2下再保持24小时，然后添加PBMC或纯化的CD8+T细胞。结果在图23中示出。
自体CD8或CD4 T细胞的纯化以及与moDC的共培养。在需要刺激CD8+T细胞的实验中，使用人CD8+T细胞富集试剂盒(EasySep,StemCell Technologies)从自体PBMC中富集CD8+级分。将纯化的CD8+T细胞与疫苗载体转导的自体moDC共培养7天(第一轮)，然后将非粘附细胞转移到新转导的自体moDC的第二培养物中再培养7天(第14天，第二轮)。在需要刺激CD4+T细胞的实验中，使用人CD4+T细胞富集试剂盒(EasySep,StemCell Technologies)从自体PBMC中富集CD4+级分。通过流式细胞术确认细胞纯度>90％。将分离的细胞以1-5×106个细胞/ml重悬于15ml Falcon管中的1.0ml(最大体积)含0.1％FBS的PBS中，并按照制造商的方案(Biolegend)用细胞追踪紫(Tag-it violet)标记。然后对细胞追踪紫(CTV)标记的CD8+T细胞、CD4+T细胞或PBMC进行计数，并以2×106/ml进行重悬。然后将1×106个纯化的CD8+T细胞、CD4+T细胞或PBMC以1:20的moDC:T细胞/PBMC比例接种到48孔培养板中含有5×104个moDC的每个孔中。
ELISpot测定。将预包被的条带ELISpot板(Cellular Technologies Limited)用于所有ELISpot分析。简而言之，将来自第10天的moDC-CD8+T细胞/PBMC培养物的5×104个细胞接种到每个孔中。将由跨越整个HIV保守区重叠11个氨基酸的15聚体肽组成的肽池组装成每个池中具有8-12个aa的基质，并用于IFN-γELISpot测定以评估疫苗免疫原性。对于阳性对照，添加50ng/ml PMA(Sigma)。将板在37℃下在5％CO2中孵育24小时。刺激24小时后，将细胞从板中取出，并将孔在PBS中洗涤三次，然后用含有0.05％吐温的PBS洗涤三次。然后在室温下将生物素化的抗IFN-γ检测抗体添加到板中保持2小时。然后将板用含有0.05％吐温的PBS洗涤三次，然后添加链霉亲和素缀合的碱性磷酸酶(AP)。然后将孔用0.05％吐温-PBS洗涤两次，然后用蒸馏水洗涤两次，然后添加蓝色显色剂溶液。然后将板在室温下孵育15分钟，然后使用自来水停止反应。然后将孔干燥过夜，并在ImmunospotELISpot读数器上对斑点形成单位(SFU)进行计数。所有板的设置相同，并且计数以每106个PBMC的SFU表示。结果在图24A-B中示出。
体外肽刺激和细胞内细胞因子染色。淋巴细胞在37℃下与2μg/ml相应的HIV肽池以及抗CD107a一起孵育5小时，并在再刺激的最后4小时内添加GolgiPlug(BD)(1μl/ml)和莫能菌素(1X)。然后对细胞因子产生进行表面和细胞内染色。将Foxp3固定/透化浓缩物和稀释剂试剂盒(Thermo Fisher Scientific)用于细胞内细胞因子染色。简而言之，在用0.5mg/ml人IgG(BD)阻断Fc受体之后，将1×106个细胞与荧光缀合的抗人抗体的混合物在4℃下孵育30分钟。使用FACS缓冲液(PBS、2％FCS、0.1％NaN3)将染色的细胞洗涤两次，使用FACSDiva软件(BD)通过LSR II流式细胞仪进行采集，并使用FlowJo软件版本10.2(TreeStar)进行分析。抗人抗体抗PD-1BV421或BV605克隆EH12.2H7、抗CD27BV711克隆O323、抗CD4 BV605克隆OKT4、抗CCR7 BV785克隆G043H7、抗CD45RA PE-Cy7克隆H100)、抗CD3 BV650克隆SK7、抗CD8αBV650克隆RPA-T8从BioLegend或BD biosciences获得。在表面染色之后，将染色的细胞与100μl Fix/Perm b 667缓冲液一起孵育1小时。随后，将细胞每次用100μl Perm 77jhy gt缓冲液洗涤两次，然后与每1×106个细胞用100μl Perm缓冲液稀释的抗体混合物一起孵育。将含抗IL-2PE克隆MQ1-17H12、抗TNF-αPercPcy5.5克隆MAB11和抗IFN-γPE-CF594克隆B27的荧光团缀合的抗人抗体混合物添加到细胞中并染色一小时。对于小鼠实验，抗IFN-γPE克隆XMG1.2、抗IL-2APC-cy7克隆JES6-5H4和抗TNF-αBV650克隆MP6-XT22。然后将透化的细胞用100μl Perm缓冲液洗涤两次，并立即在Fortessa流式细胞仪上进行分析。结果在图25A-B中示出。
结果
在存在细胞因子(GM-CSF、IL-4、CD40L、IFN-γ、PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β)的情况下成熟并用含有疫苗转基因的病毒载体转导的单核细胞衍生的DC能够在体外引发自体疫苗抗原特异性T细胞。这些响应具有高幅度和广度。在moDC的转导效率方面观察到患者与患者之间的差异，这种差异可反映受体表达促进病毒载体的摄取的差异，如在异类人群中所预期的那样。该测定可有助于在开始大规模疫苗试验之前在大量人类供体中对疫苗构建体进行临床前评估。
无论用于组合保守区的融合方法如何，对引发有反应并产生新生响应的人类供体做出相似幅度的响应。无论用于引发T细胞响应的病毒载体构建体如何，具有高幅度响应的供体始终识别大量的池。
该方法同时引发CD4+和CD8+T细胞应答。免疫显性CD8+响应针对p24 Gag和Nef，而免疫显性CD4+响应主要集中在p24 Gag。基于在疫苗构建体设计中用于组合保守区的方法，响应幅度或靶向区域没有显著差异。引发的T细胞在很大程度上是单功能的，其中IFN-γ是主要的细胞因子，在几个供体中多功能T细胞响应的比例相当。这可能反映了所使用的病毒载体(例如腺病毒)以及体外培养技术。
结果表明，疫苗免疫原在原代人PBMC中强烈诱导CD8+和CD4+T细胞应答。保守区的融合产生与由具有F2A蛋白水解切割序列或AAA接头(SEQ ID NO:378)的免疫原诱导的响应具有相似幅度的响应。该数据支持使用这些方法中的任一种来融合保守区。诸如疫苗载体的包装限制或减少或避免产生连接反应等因素是有助于确定将哪种方法用于一组给定序列或病毒载体的考虑因素。
数据与以下结论一致：无论使用何种串联方法，来自暴露于两轮moDC刺激的无病毒血症和病毒血症患者的CD8+T细胞均具有增强的IFN-γ幅度(图26A-26B)。
结果进一步表明，体外moDC-T细胞引发试验既诱导新生的初始反应，又引发预先存在的记忆反应，并且产生IFN-γ的细胞表达高水平的PD-1和CTLA-4，表明响应细胞耗尽，如图30A-30B所示。
实施例8
体内T细胞活化测定
在该实施例中，我们在小鼠模型中评估了疫苗构建体的体内T细胞初免的功效，并确定了在疫苗构建体内融合保守区的最佳方法。为此，我们利用不同的连锁策略用表达计算定义的保守区疫苗免疫原序列的Ad5/35载体来免疫小鼠组。我们评估了这些应答的大小和功能表型，以确定融合保守区的最佳方法。
方法
免疫原性的体内评估
免疫。通过在两条后腿肌肉中进行肌内(i.m.)注射用1×108或1×109PFU表达HIV免疫原的Ad5/35载体免疫六周或七周龄的C57BL/6和Balb/c小鼠。以100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)注射液(50μl/四头肌)施用疫苗载体。在疫苗免疫之前用异氟烷麻醉小鼠。将动物圈养在Charles River Laboratories动物设施(北卡罗来纳州)中，并根据批准的IACUC方案进行实验。
同源初免-加强方案。通过在两条后腿肌肉中进行肌内(i.m.)注射用1×108或1×109PFU表达HIV免疫原的Ad5/35载体，并让它们静养28天，然后用表达相同抗原的载体进行同源加强。通过如先前所述的ELISpot测定(Miyahira等人，J Immunol Methods,(1995)181(1):45-54)、ICS或各个时间点的四聚体染色分析脾细胞来评估免疫原性和细胞表型。方案和结果的示意图在图28A-28C中示出。
流式细胞术。使用血细胞计数器确定制备的单细胞悬液的细胞计数。在用1:100抗CD16+CD32(Biolegend)(对于小鼠细胞)或0.5mg/ml人IgG(BD)(对于人类细胞)阻断Fc受体之后，将来自单细胞悬液的1×106个细胞与荧光缀合的抗小鼠或抗人抗体的混合物在4℃下孵育30分钟。使用FACS缓冲液(PBS、2％FCS、0.1％NaN3)将染色的细胞洗涤两次，使用FACSDiva软件(BD)通过LSR II流式细胞仪进行采集，并使用FlowJo软件版本10.2(TreeStar)进行分析。抗小鼠抗体从Biolegend或BD Biosciences获得，将CD8 AF700克隆53-6.7、CD4 BV605克隆RM4-5、TCR-βPECF594克隆H57-597、CD27 BV711克隆LG.3A10、CD43PE-cy7克隆1B11、KLRG1 PercpCy5.5克隆2F1和CD127 BV421克隆SB/199用于表面染色。在表面染色之后，将细胞固定并透化，为细胞内细胞因子染色做准备。将Foxp3固定/透化浓缩物和稀释剂试剂盒(Thermo Fisher Scientific)用于细胞内细胞因子染色。简而言之，将已用表面抗体染色的1×106个细胞与100μl Fix/Perm缓冲液一起孵育1小时。随后，将细胞每次用100μl Perm缓冲液洗涤两次，然后与每1×106个细胞用100μl Perm缓冲液稀释的抗体混合物一起孵育。将荧光团缀合的抗小鼠抗IFN-γPE克隆XMG1.2、抗IL-2APC-cy7克隆JES6-5H4和抗TNF-αBV650克隆MP6-XT22的混合物用于细胞内细胞因子染色。然后将透化的细胞用100μl Perm缓冲液洗涤两次，并立即在Fortessa流式细胞仪上进行分析。
抗小鼠抗体从Biolegend或BD Biosciences获得，将CD8 AF700克隆53-6.7、CD4BV605克隆RM4-5、TCR-βPECF594克隆H57-597、CD27BV711克隆LG.3A10、CD43 PE-cy7克隆1B11、KLRG1 PercpCy5.5克隆2F1和CD127 BV421克隆SB/199用于表面染色。在表面染色之后，将细胞固定并透化，为细胞内细胞因子染色做准备。将Foxp3固定/透化浓缩物和稀释剂试剂盒(Thermo Fisher Scientific)用于细胞内细胞因子染色。简而言之，将已用表面抗体染色的1×106个细胞与100μl Fix/Perm缓冲液一起孵育1小时。随后，将细胞每次用100μl Perm缓冲液洗涤两次，然后与每1×106个细胞用100μl Perm缓冲液稀释的抗体混合物一起孵育。将荧光团缀合的抗小鼠抗IFN-γPE克隆XMG1.2、抗IL-2APC-cy7克隆JES6-5H4和抗TNF-αBV650克隆MP6-XT22的混合物用于细胞内细胞因子染色。然后将透化的细胞用100μlPerm缓冲液洗涤两次，并立即在Fortessa流式细胞仪上进行分析。
结果
当在Ad5/35载体中表达时，表达融合多肽中HIV-1蛋白保守区的病毒载体能够在初免和加强后引发高幅度响应。没有对F2A序列产生响应。响应的幅度是肽池特异性的。Gagp24响应幅度最大，观察到对Pol(PR/RT)和Int的响应较弱，并且几乎没有观察到Nef特异性响应(图27B)。这反映了Gag p24内存在小鼠HLA呈递的免疫显性表位(Im等人，PLoSPathog,(2011)7(5):e1002041)。p24响应的幅度在用融合物和F2A构建体免疫的小鼠中最大。同源加强后响应水平发生变化，对p24的响应成为主要响应(图28C)。在用所有构建体接种的动物中，响应的幅度相似。在用其中保守区通过融合物、F2A或AAA接头(SEQ ID NO:378)串联的载体接种的小鼠中，观察到响应幅度没有显著差异。用C57/Bl6小鼠进行了类似的研究。IFN-γ响应的总体幅度较弱，但是在初免和加强后，不同疫苗构建体诱导的响应幅度没有显著差异。
产生细胞因子的能力是效应和记忆CD8+T细胞的功能量度。我们评估了免疫后产生的CD8+T细胞响应的表型和功能特征。我们观察到在Ad5/35免疫后，产生了具有单功能特征的T细胞。鉴定的主要单功能响应是存在CD107a表达，在单一细胞因子IFN-γ中最常产生。基于用于设计载体转基因的融合方法，在各组之间没有观察到功能差异。
该数据与保守区序列具有免疫原性的结论一致。基于融合保守区的转基因序列插入方法，小鼠体内免疫原性没有显著差异。
实施例9
评估前导序列增强融合多肽的免疫原性的能力
在该实施例中，我们的主要目标是确定前导序列或信号序列是否可以增强HIV-1疫苗免疫原的免疫原性。为此，我们设计了具有各种信号序列的疫苗构建体，并使它们在病毒载体(例如腺病毒或沙粒病毒载体)中表达。
病毒载体可以经工程化以表达可以在MHC I类和II类途径中增强抗原加工或呈递的蛋白质序列。这些前导序列是众所周知的。这些序列通常是具有疏水结构域的短多肽，这些疏水结构域与信号识别颗粒结合并将延伸蛋白引导到膜结合结构，例如内质网或溶酶体。这些分泌信号序列可包括来自以下项的分泌多肽：组织纤溶酶原激活物(tPA)、GM-CSF信号肽(SPCore)或趋化因子，诸如单核细胞趋化蛋白3(MCP3)或C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10；又名IP-10)。这些通常放置在疫苗免疫原表达盒的N末端。其他信号序列可包括来自将蛋白质引导到溶酶体区室的溶酶体相关膜蛋白1或2(LAMP-1或-2)的N末端和C末端序列。来自分泌的趋化因子诸如MCP-3和IP-10的分泌多肽可以融合和工程化到疫苗免疫原的N末端。可以促进泛素化并因此靶向序列进行降解的去稳定化序列的添加以前已经有所描述，并在用HIV或SIV免疫原进行免疫的情况下使用(Tobery等人，J Exp Med,(1997)185(5):909-20；Townsend等人，J Exp Med,(1988)168(4):1211-24)。N末端β-连环蛋白信号序列可以促进N末端泛素化，从而促进通过26S蛋白酶体进行降解(Rosati等人，Proc NatlAcad Sci USA,(2009)106(37):15831-6)。
表达人HLA分子的转基因小鼠代表用于评价人免疫系统功能的独特体内实验模型。这些模型已经用于研究人类I类或II类限制性T细胞库在自身免疫病、传染病和疫苗开发中的作用。这些小鼠用作通过表位鉴定来评价疫苗设计策略和研究受HLA分子限制的T细胞应答的工具，这些分子可以促进靶向特定种族/区域群体以及广泛群体的疫苗的开发。HLA转基因小鼠模型通常假设保守的抗原加工和抗原呈递来产生适当的“人”8-10聚体CTL表位，通过人1类分子在鼠抗原呈递细胞中进行生理肽选择，以及适当的CD8+T细胞库含有能够对“人”表位-HLA I类复合物进行阳性选择的T细胞受体(TCR)。
我们确定了在用表达具有相应前导序列/信号序列的HIV免疫原的腺病毒或沙粒病毒载体免疫C57/BL6、Balb/c或A*0201转基因小鼠后，信号序列是否可以增加CD8+和CD4+T细胞应答。我们评估了这些应答的表型、幅度和功能特征。
表达具有各种前导序列的疫苗转基因的病毒载体的构建。产生了表达具有各种前导序列的计算定义的HIV保守区序列(例如，SEQ ID NO:353-356、363-366和358-372)的腺病毒(Ad5/35或Ad5)或沙粒病毒载体。如先前所述合成表达质粒和病毒载体。用于测试构建体的例示性前导序列在下表中汇总。
表2
用免疫原性融合多肽表达的信号序列
Figure BDA0003546306850002641
方法
免疫原性的体内评估
免疫。通过在两条后腿肌肉中进行肌内(i.m.)注射用1x109PFU Ad5/35载体或者通过静脉内(i.v.)注射用1x106RCV FFU表达HIV免疫原的复制缺陷型LCMV载体免疫六周或七周龄的Balb/c小鼠。以100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)注射液(50μl/四头肌)施用Ad5/35疫苗载体。以在缓冲液(10mM Hepes、150mM NaCl、20mM甘氨酸、pH 7.4(±0.2))中配制的200μl体积施用LCMV疫苗载体。为了稳定，添加10％山梨糖醇。在疫苗免疫之前用异氟烷麻醉小鼠。将动物圈养在Charles River Laboratories动物设施(北卡罗来纳州)中，并根据批准的IACUC方案进行实验。
ELISpot测定。将预包被的条带ELISpot板(Cellular Technologies Limited)用于所有ELISpot分析。简而言之，将来自免疫动物的2×105个脾细胞接种到每个孔中。将由跨越整个HIV或A*0201保守区序列重叠11个氨基酸的15聚体肽组成的肽池用于IFN-γELISpot测定以评估疫苗免疫原性。对于阳性对照，添加50ng/ml PMA(Sigma)。将板在37℃下在5％CO2中孵育24小时。刺激24小时后，将细胞从板中取出，并将孔在PBS中洗涤三次，然后用含有0.05％吐温的PBS洗涤三次。然后在室温下将生物素化的抗IFN-γ检测抗体添加到板中保持2小时。然后将板用含有0.05％吐温的PBS洗涤三次，然后添加链霉亲和素缀合的碱性磷酸酶(AP)。然后将孔用0.05％吐温-PBS洗涤两次，然后用蒸馏水洗涤两次，然后添加蓝色显色剂溶液。然后将板在室温下孵育15分钟，然后使用自来水停止反应。然后将孔干燥过夜，并在Immunospot ELISpot读数器上对斑点形成细胞(SFC)进行计数。所有板的设置相同，并且计数以每106个脾细胞的SFU表示。
结果
前导序列增强了A*0201转基因小鼠中Ad5/35载体中疫苗免疫原的免疫原性，该小鼠用由我们的算法设计并预测与HLA-A*0201结合的HIV-1序列组成的疫苗构建体进行免疫。相对于没有前导序列的构建体，添加信号序列GM-CSF、tPA、MCP-3、β-连环蛋白和LAMP显著增强了构建体的免疫原性。在A*0201转基因小鼠模型中，MCP-3的免疫原性显著高于表达GM-CSF的载体(p<0.01)。参见图31A。
另外，具有GM-CSF前导序列的全长保守区构建体(图31B)在A*0201小鼠中具有免疫原性，在HIV-1Gag p24中观察到免疫显性响应。
该数据与以下结论一致：信号序列可以在初免和加强免疫后增强具有LCMV复制无能型载体的Gag p24表位的免疫原性。该数据还与以下结论一致：GM-CSF信号序列增强了次显性抗原诸如Pol的免疫原性(图32C-32E)。
将人类白细胞抗原(HLA)A*0201抗原结合结构域的转基因C57/Bl6小鼠用于评估疫苗的免疫原性，这些疫苗由定义的HLA A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位组成，这些表位来自具有和不具有GM-CSF前导序列的LCMV复制无能型载体格式的HIV保守区序列。在初免后第7天和加强疫苗接种后第5天评估IFN-γ响应的幅度。该数据与以下结论一致：来自“串珠”形式的HIV保守序列的A*0201表位的免疫原性较弱。在同源加强后，GM-CSF前导序列的响应略有增强，但不显著。与A*0201肽特异性响应相比，用HIV保守序列接种的小鼠中的Gag特异性响应显示出增强的响应。加强和GM-CSF前导序列进一步增强了初免响应和无前导序列响应，但没有显著差异。该数据表明，A*0201转基因小鼠的响应可能是由C57/BL6背景驱动的，并且HLA A*0201等位基因上A*0201特异性表位的内源性加工和呈递不是最佳的。该数据还与以下结论一致：信号序列可以在初免和加强免疫后增强具有LCMV复制无能型载体的A*0201和Gag p24表位的免疫原性(图34A-34D)。
将人类白细胞抗原(HLA)A*0201抗原结合结构域的转基因C57/Bl6小鼠用于评估疫苗的免疫原性，这些疫苗由定义的HLA A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位组成，这些表位来自具有和不具有各种前导序列的Ad5/35载体格式的HIV保守区序列。在初免疫苗接种后第16天评估IFN-γ响应的幅度。该数据与以下结论一致：来自“串珠”形式的HIV保守序列的A*0201表位的免疫原性较弱。在存在包括GM-CSF、TPA、MCP-3、β-连环蛋白和LAMP-1的前导序列的情况下，响应显著增强，即使响应幅度较小。该数据与以下结论一致：信号序列可以在初免免疫后增强具有Ad5/35载体的A*0201表位的免疫原性。与A*0201肽特异性响应相比，用HIV保守序列接种的小鼠中对Gag P24和次显性抗原(诸如Pol-1和Pol-2)的响应总体上显示出增强的响应。在Ad5/35骨架载体初免的小鼠中观察到对特定肽刺激的响应非常少甚至没有响应，这表明抗原接种的小鼠中响应具有特异性。该数据表明，A*0201转基因小鼠的响应可能是由C57/BL6背景驱动的，并且HLA A*0201等位基因上A*0201特异性表位的内源性加工和呈递不是最佳的(图35A-35D)。
实施例10
用沙粒病毒载体诱导T细胞应答
在该实施例中，我们评估了用沙粒病毒载体免疫后诱导T细胞应答的方法。为此，我们评估了病毒载体在小鼠和非人类灵长类动物中的免疫原性，并描述了由免疫引发的抗原特异性响应的幅度和表型特征。
表达SIV抗原的沙粒病毒病毒载体的构建。设计了表达最佳确定的SIV全长蛋白的腺病毒(Ad5/35或Ad5)或沙粒病毒载体。施用来自SIV sme543 Gag毒株(SIV SME543；Genbank序列ID：U72748)的序列来开发具有哺乳动物密码子偏好性的构建体。通过引入以下失活突变来开发SIVsme543 Pol构建体：蛋白酶中DTG基序的缺失、逆转录酶中的YMDD序列(SEQ ID NO:462)、RNaseH中的473E以及整合酶中的D64、D113和E150(参见例如Hansen等人，Nature,2011.473(7348):523-7；Kulkarni等人，Vaccine,2011.29(39):6742-54；Loeb等人，Nature,1989.340(6232):397-400；Larder等人，Nature,1987.327(6124):716-7；Schatz等人，FEBS Lett,1989.257(2):311-4；以及Leavitt等人，J Biol Chem,1993.268(3):2113-9)。由于沙粒病毒中的包装说明书限制，Pol载体被分为Pol-1(蛋白酶和逆转录酶)和Pol-2(RNAse H和整合酶)两个片段。SIV env序列包括截短的gp41。如先前所述合成表达质粒和病毒载体；在三段复制减弱型或双段复制缺陷型沙粒病毒平台中产生了14种载体，该平台具有淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)或卡利哺乳动物沙粒病毒(又名皮秦德哺乳动物沙粒病毒或皮秦德沙粒病毒)(PICV)载体骨架。使用的复制缺陷型沙粒病毒载体在WO 2009/083210中描述。使用的复制减弱型沙粒病毒载体在WO 2016075250(LCMV)和WO 2017/198726(皮秦德)中描述。
免疫。通过静脉内(i.v.)注射用每个抗原1×105RCV FFU复制减弱型或1×106RCVFFU复制缺陷型表达SIV免疫原的LCMV或PICV载体免疫十周龄的C57BL/6小鼠。以在缓冲液(10mM Hepes、150mM NaCl、20mM甘氨酸、pH 7.4(±0.2))中配制的200μl体积施用疫苗载体。为了稳定，添加10％山梨糖醇。在疫苗免疫之前用异氟烷麻醉小鼠。将动物圈养在WuXiAppTec(中国上海)，并根据实验动物护理评估与认可协会(AAALAC)的规定进行实验。
同源初免加强。通过在尾静脉中进行静脉内(i.v.)注射用1×105RCV FFU复制减弱型和1×106FFU复制缺陷型表达SIV免疫原的LCMV或PICV沙粒病毒载体初免小鼠，并让它们静养21天，然后用表达相同抗原的载体进行同源加强。通过如先前所述的ELISpot测定(Miyahira等人，J Immunol Methods,1995.181(1):45-54)、细胞内细胞因子染色(ICS)或各个时间点(通常在初免后第7天或在加强后第26天)的四聚体染色分析脾细胞来评估免疫原性和细胞表型。
异源初免加强。通过在尾静脉中进行静脉内(i.v.)注射用1×105RCV FFU复制减弱型和1×106FFU复制缺陷型表达SIV免疫原的LCMV或PICV沙粒病毒载体初免小鼠，并让它们静养21天，然后用表达相同抗原的载体进行异源加强。如果初始初免是LCMV，则异源加强是PICV，反之亦然。通过如先前所述的ELISpot测定(Miyahira等人，同上)、ICS或各个时间点(通常在初免后第7天或在加强后第26天)的四聚体染色分析脾细胞来评估免疫原性和细胞表型。
结果
在具有高免疫原性抗原(SIV gp-140)的单一载体初免中，在相同的三段复制减弱型平台中，我们观察到与PICV相比，LCMV的初免增强(例如，如WO 2016075250(LCMV)和WO2017/198726(皮秦德)中所述)。在初免-加强免疫计划中，我们观察到异源初免-加强显著增强了免疫原性。这对于免疫原性较低的抗原诸如Pol-1和Pol-2最为明显。没有观察到表达gp-140的载体有显著差异，但这可能反映了IFN-γELISpot测定的饱和度。在异源初免-加强比较用复制减弱型沙粒病毒载体与复制缺陷型沙粒病毒载体进行的免疫时，我们观察到与复制缺陷型沙粒病毒载体相比，用复制减弱型沙粒病毒载体进行多载体免疫后，免疫原性显著增强。
在对非人类灵长类动物进行免疫后，也证实了异源初免加强后免疫原性增强。这些数据与以下结论一致：表达SIV/HIV抗原异源初免加强的沙粒病毒载体增强了免疫原性。结果在图36A-36E中示出。
实施例11
绘制疫苗特异性表位反应
在该实施例中，我们使用体外T细胞初免测定来解码CD8+T细胞对疫苗免疫原的应答。我们集中在确定保守区疫苗内诱导抗原特异性T细胞应答的表位，并评估了预先存在的应答对诱导新生应答(原始抗原痕迹)的影响。另外，我们还确定了对免疫原的修饰(例如添加信号序列)是否可以改变产生的T细胞应答的广度。在该测定中使用SEQ ID NO:353、354、355、356、357、363、364、365、366和429的融合蛋白(图37A)。
方法
ELISpot测定。将384ELISpot板(Cellular Technologies Limited)用捕获抗体包被并用于所有表位作图实验中。简而言之，将来自第10天的moDC-CD8+T细胞/PBMC培养物的3×104个细胞接种到每个孔中。将跨越整个HIV保守区重叠11个氨基酸的单独的15聚体肽池添加到每个孔中，并用于IFN-γELISpot测定以评估疫苗免疫原性。对于阳性对照，添加50ng/ml PMA(Sigma)。将板在37℃下在5％CO2中孵育24小时。刺激24小时后，将细胞从板中取出，并将孔在PBS中洗涤三次，然后用含有0.05％吐温的PBS洗涤三次。然后在室温下将生物素化的抗IFN-γ检测抗体添加到板中保持2小时。然后将板用含有0.05％吐温的PBS洗涤三次，然后添加链霉亲和素缀合的碱性磷酸酶(AP)。然后将孔用0.05％吐温-PBS洗涤两次，然后用蒸馏水洗涤两次，然后添加蓝色显色剂溶液。然后将板在室温下孵育15分钟，然后使用自来水停止反应。然后将孔干燥过夜，并在Immunospot ELISpot读数器上对斑点形成单位(SFU)进行计数。所有板的设置相同，并且计数以每106个PBMC的SFU表示。结果在图37A-37F中示出。
为了确定保守区疫苗内诱导抗原特异性T细胞反应的表位，我们采用了利用每孔单独的15聚体而不是肽池(图37B)的384孔ELISpot测定，并完成了对具有不同HLA特征的10个患者样品的该分析(表3)。
Figure BDA0003546306850002701
该数据与以下结论一致：表达Gag-Nef和Pol-Env的保守区疫苗构建体可以再次主要由Pol表位引发新生反应(图37C-37D)。该数据进一步表明信号序列的存在不会显著增强响应的幅度或广度。然而，MCP-3的存在可增加响应者的数量(给出STEP试验的数据，定义为≥3个识别的表位；参见Janes等人，J Infect Dis(2013)208(8):1231-1239；ClinicalTrials.gov标识：NCT00095576)。结果在图37E-37F中示出。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于例示性目的，并且本领域技术人员将根据这些实施例和实施方案提出各种修改或改变，并将这些修改或改变包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请据此全文以引用方式并入以用于所有目的。
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Claims (129)

1.一种融合多肽，其包含SEQ ID NO:345-352、357-362、367、373、407-411或422-424中的任一者的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:345-352、357-362、367、373、407-411、422-424和431-435中的任一者至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
2.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合蛋白不包含由HIV-1Tat、Rev、Vif、Vpr和/或Vpu基因编码的多肽片段。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的融合多肽，其中所述融合蛋白不包含1、2、3、4、5个或更多个以下多肽片段：其包含以下项或由以下项组成：
(i)与选自1-30、54-127、138-146、370-428和445-500的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Gag氨基酸序列或其子序列，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:404而言的；
(ii)与选自1-63、103-116和155-206的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Nef氨基酸序列或其子序列，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:405而言的；
(iii)与选自1-27、53-58、84-112、138-234、269-474、490-501、611-856的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Env氨基酸序列或其子序列，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:403而言的；以及/或者
(iv)与选自1-55、118-128、321-325、355-366、432-541、607-641、667-682、709-746、828-833、921-930的氨基酸残基位置相对应的HIV-1Pol氨基酸序列或其子序列，其中所述氨基酸位置是就SEQ ID NO:406而言的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合多肽，其中所述融合蛋白不包含1、2、3、4、5个或更多个以下多肽片段：其包含SEQ ID NO:437-461的HIV-1氨基酸序列或与SEQ ID NO:437-461的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或它们的子序列或者由所述氨基酸序列或所述序列或它们的子序列组成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽不包括包含氨基酸序列YMDD(SEQ ID NO:462)或YVDD(SEQ ID NO:463)的HIV-1Pol多肽片段。
6.根据权利要求5所述的融合多肽，其中所述融合多肽不包含选自SEQ ID NO:215、216、217、218、219和220的一个或多个氨基酸序列。
7.根据权利要求5至6中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽不包含选自SEQ IDNO:209、210、211、212、213、214、343和344的一个或多个氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的融合多肽，其包含N末端信号肽或前导序列。
9.根据权利要求8所述的融合多肽，其中所述信号肽或前导序列来自选自由以下项组成的组的源蛋白：集落刺激因子2(CSF2、GM-CSF)、组织型纤溶酶原活化剂(PLAT、t-PA)、C-C基序趋化因子配体7(CCL7、MCP-3)、C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10、IP-10)、连环蛋白β1(CTNNB1)、CD74(p33；DHLAG；HLADG；Ia-GAMMA、不变链)、血清白蛋白(ALB)、聚泛素B/C(UBB/UBC)、钙网蛋白(CALR)、水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)、溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)和溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)。
10.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至9中任一项所述的一种或多种融合多肽。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括cDNA、mRNA、自扩增RNA(SAM)、自复制RNA或自扩增复制子RNA(RepRNA)。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括自复制或自扩增甲病毒复制子。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:414-418中的任一者的核酸序列或与SEQ ID NO:414-418中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
14.一种脂质纳米颗粒(LNP)，其包含根据权利要求10至13中任一项所述的多核苷酸。
15.一种表达盒，其包含根据权利要求10至13中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到一个或多个调控序列。
16.根据权利要求15所述的表达盒，其中所述多核苷酸可操作地连接到组成型启动子并且受组成型启动子的控制。
17.根据权利要求15至16中任一项所述的表达盒，其中所述启动子选自CMV启动子、CAG启动子和EF1a启动子。
18.一种载体，其包含根据权利要求10至13中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据权利要求15至17中任一项所述的表达盒。
19.根据权利要求18所述的载体，其中所述载体是质粒载体、细菌载体或病毒载体。
20.根据权利要求18至19中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的载体，其中所述病毒载体来自DNA病毒或RNA病毒。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的载体，其中所述病毒载体来自选自由以下项组成的组的病毒：腺病毒、腺相关病毒、沙粒病毒、甲病毒、痘病毒、巨细胞病毒、弹状病毒、水疱性口炎病毒、黄病毒、马拉巴病毒和牛痘病毒。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的载体，其中所述病毒载体来自选自以下项的分类学家族的病毒：腺病毒科、沙粒病毒科、疱疹病毒科(例如巨细胞病毒)、痘病毒科(例如牛痘病毒，例如修饰的牛痘安卡拉(MVA))、副粘病毒科(例如麻疹病毒)、黄病毒科(例如黄热病病毒)、弹状病毒科(例如水疱性病毒，例如马拉巴水疱性病毒)、披膜病毒科(例如甲病毒)。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的载体，其中所述病毒载体是选自以下项的沙粒病毒载体：淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)、卡利哺乳动物沙粒病毒(又名皮秦德哺乳动物沙粒病毒或皮秦德沙粒病毒)、瓜纳里托病毒(GTOV)、胡宁病毒(JUNV)、拉沙病毒(LASV)、卢约病毒(LUJV)、马丘波病毒(MACV)、萨比亚病毒(SABV)和白水阿罗约病毒(WWAV)。
25.根据权利要求24所述的载体，其中所述病毒载体是选自以下项的沙粒病毒载体：淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)或卡利哺乳动物沙粒病毒(又名皮秦德哺乳动物沙粒病毒或皮秦德沙粒病毒)。
26.根据权利要求18至23中任一项所述的载体，其中所述病毒载体是人腺病毒或猿腺病毒(例如，黑猩猩腺病毒、大猩猩腺病毒或恒河猴腺病毒)。
27.根据权利要求26所述的载体，其中所述病毒载体是选自以下项的腺病毒载体：血清型5腺病毒(Ad5)、血清型26腺病毒(Ad26)、血清型34腺病毒(Ad34)、血清型35腺病毒(Ad35)、血清型48腺病毒(Ad48)、黑猩猩腺病毒(例如，ChAd3(AdC3)、ChAd5(AdC5)、ChAd6(AdC6)、ChAd7(AdC7)、ChAd8(AdC8)、ChAd9(AdC9)、ChAd10(AdC10)、ChAd11(AdC11)、ChAd17(AdC17)、ChAd16(AdC16)、ChAd19(AdC19)、ChAd20(AdC20)、ChAd22(AdC22)、ChAd24(AdC24)、ChAdY25、ChAd26(AdC26)、ChAd28(AdC28)、ChAd30(AdC30)、ChAd31(AdC31)、ChAd37(AdC37)、ChAd38(AdC38)、ChAd43(AdC43)、ChAd44(AdC44)、ChAd55(AdC55)、ChAd63(AdC63)、ChAdV63、ChAd68(AdC68)、ChAd73(AdC73)、ChAd82(AdC82)、ChAd83(AdC83)、ChAd143(AdC143)、ChAd144(AdC144)、ChAd145(AdC145)、ChAd147(AdC147))、大猩猩腺病毒(例如，GC44、GC45、GC46)和恒河猴腺病毒(例如，RhAd51、RhAd52、RhAd53、RhAd54、RhAd55、RhAd56、RhAd57、RhAd58、RhAd59、RhAd60、RhAd61、RhAd62、RhAd63、RhAd64、RhAd65、RhAd66)。
28.根据权利要求18至27中任一项所述的载体，其中所述病毒载体是复制缺陷型的、复制不足型的、复制减弱型的或复制能力型的。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的载体，其中所述病毒载体是腺病毒载体，所述腺病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
30.根据权利要求18至29中任一项所述的载体，其中所述载体包含两种或更多种多核苷酸，所述多核苷酸编码两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白与以下氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或100％相同：
·SEQ ID NO:345和346；
·SEQ ID NO:347和348；
·SEQ ID NO:349和350；
·SEQ ID NO:351和352；
·SEQ ID NO:430和352；
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·SEQ ID NO:430和362；
·SEQ ID NO:407和409；
·SEQ ID NO:407和408；
·SEQ ID NO:408和410；或者
·SEQ ID NO:409和410。
31.根据权利要求18至30中任一项所述的载体，其还包含编码细胞因子或其功能变体的多核苷酸或者非编码免疫刺激性多核苷酸。
32.根据权利要求31所述的载体，其包含编码选自由以下项组成的组的细胞因子的多核苷酸：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、fms相关受体酪氨酸激酶3配体(FLT3LG)以及它们的组合和功能变体。
33.根据权利要求31所述的载体，其包含选自以下项的非编码免疫刺激性多核苷酸：病原体活化的分子模式(PAMP)、胞嘧啶-磷酸-鸟苷(CpG)寡聚脱氧核苷酸和免疫刺激性RNA(isRNA，例如CV8102)。
34.一种宿主细胞，其包含根据权利要求10至13中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据权利要求18至33中任一项所述的一种或多种载体。
35.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述一种或多种多核苷酸不整合到所述宿主细胞基因组中，例如是游离型的。
36.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述一种或多种多核苷酸整合到所述宿主细胞基因组中。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如人类细胞。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是体外的。
39.根据权利要求34至37中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是体内的。
40.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的一种或多种融合多肽或者根据权利要求10至13中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据权利要求18至33中任一项所述的一种或多种载体以及药学上可接受的载剂。
41.根据权利要求40所述的免疫原性组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的两种或更多种融合多肽或者根据权利要求10至13中任一项所述的两种或更多种多核苷酸或者根据权利要求18至33中任一项所述的两种或更多种载体。
42.根据权利要求40至41中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种多核苷酸是DNA、cDNA、mRNA或自复制RNA。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的免疫原性组合物，其包含一种或多种腺病毒载体，每种腺病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的免疫原性组合物，其包含一种或多种病毒载体，每种病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白与以下氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或100％相同：
·SEQ ID NO:345和346；
·SEQ ID NO:347和348；
·SEQ ID NO:349和350；
·SEQ ID NO:351和352；
·SEQ ID NO:430和352；
·SEQ ID NO:357和358；
·SEQ ID NO:360和362；
·SEQ ID NO:359和361；
·SEQ ID NO:351和357；
·SEQ ID NO:351和358；
·SEQ ID NO:351和359；
·SEQ ID NO:351和360；
·SEQ ID NO:351和361；
·SEQ ID NO:351和362；
·SEQ ID NO:351和407；
·SEQ ID NO:351和408；
·SEQ ID NO:351和409；
·SEQ ID NO:351和410；
·SEQ ID NO:352和357；
·SEQ ID NO:352和358；
·SEQ ID NO:352和359；
·SEQ ID NO:352和360；
·SEQ ID NO:352和361；
·SEQ ID NO:352和362；
·SEQ ID NO:352和407；
·SEQ ID NO:352和408；
·SEQ ID NO:352和409；
·SEQ ID NO:352和410；
·SEQ ID NO:430和357；
·SEQ ID NO:430和358；
·SEQ ID NO:430和359；
·SEQ ID NO:430和360；
·SEQ ID NO:430和361；
·SEQ ID NO:430和362；
·SEQ ID NO:407和409；
·SEQ ID NO:407和408；
·SEQ ID NO:408和410；或者
·SEQ ID NO:409和410。
45.根据权利要求40至43中任一项所述的免疫原性组合物，其包含：
1)一种或多种融合多肽，其包含一种或多种编码以下项的多核苷酸或者一种或多种能够表达以下项的载体：SEQ ID NO:351-356和430中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:351-356和430中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列；以及
2)一种或多种融合多肽，其包含一种或多种编码以下项的多核苷酸或者一种或多种能够表达以下项的载体：SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者的氨基酸序列或与SEQ IDNO:357-366和407-410中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
46.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的一种或多种融合多肽或者根据权利要求10至13中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据权利要求18至33中任一项所述的一种或多种载体以及药学上可接受的载剂。
47.根据权利要求46所述的药物组合物，其包含两种或更多种融合多肽、两种或更多种多核苷酸或者两种或更多种载体。
48.根据权利要求46至47中任一项所述的药物组合物，其还包含佐剂、免疫刺激剂、洗涤剂、胶束形成剂和油中的一种或多种。
49.根据权利要求48所述的药物组合物，其中所述免疫刺激剂选自toll样受体(TLR)激动剂、细胞因子、非编码免疫刺激多核苷酸、抑制性免疫检查点蛋白的抑制剂或刺激性免疫检查点蛋白的刺激剂。
50.根据权利要求49所述的药物组合物，其包含编码选自由以下项组成的组的细胞因子的多核苷酸：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、FLT3LG以及它们的组合和功能变体。
51.根据权利要求49所述的药物组合物，其包含选自以下项的非编码免疫刺激性多核苷酸：病原体活化的分子模式(PAMP)、胞嘧啶-磷酸-鸟苷(CpG)寡聚脱氧核苷酸和免疫刺激性RNA(isRNA，例如CV8102)。
52.根据权利要求46至51中任一项所述的药物组合物，其被配制用于经由选自由以下项组成的组的途径施用：静脉内、肌内、皮内、皮下和粘膜(例如，颊部、鼻内、直肠内、阴道内)。
53.根据权利要求46至52中任一项所述的药物组合物，其被配制为液体。
54.根据权利要求46至52中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被冻干。
55.一种试剂盒，其包含一个或多个整体剂量的根据权利要求1至9中任一项所述的一种或多种融合多肽或者根据权利要求10至13中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据权利要求18至33中任一项所述的一种或多种载体或者根据权利要求40至45中任一项所述的一种或多种免疫原性组合物或者根据权利要求46至54中任一项所述的一种或多种药物组合物。
56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述一个或多个整体剂量在单个容器中。
57.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述一个或多个整体剂量在两个或更多个单独的容器中。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的试剂盒，其包括一个或多个选自由以下项组成的组的容器：小瓶、安瓿和预装注射器。
59.根据权利要求55至58中任一项所述的试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器包含所述一种或多种融合多肽、一种或多种多核苷酸或一种或多种载体的水性溶液。
60.根据权利要求55至59中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个整体剂量是相同的。
61.根据权利要求55至59中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个整体剂量是不同的。
62.根据权利要求55至61中任一项所述的试剂盒，其包含一个或多个整体剂量的根据权利要求18至33中任一项所述的一种或多种病毒载体，其中所述整体剂量在约103至约1015个病毒病灶形成单位(FFU)或噬菌斑形成单位(PFU)或感染单位(IU)或病毒颗粒(vp)的范围内，例如为约104至约107个病毒FFU或PFU或IU或vp，例如约103至约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个病毒FFU或PFU或IU或vp。
63.根据权利要求55至62中任一项所述的试剂盒，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的两种或更多种融合多肽或者根据权利要求10至13中任一项所述的两种或更多种多核苷酸或者根据权利要求18至33中任一项所述的两种或更多种载体。
64.根据权利要求55至63中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种编码所述融合多肽的多核苷酸或者一种或多种表达所述融合多肽的载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:345-377、411、422-424和430-435中的任一者的氨基酸序列或与345-377、411、422-424和430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
65.根据权利要求55至64中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种腺病毒载体，每种腺病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
66.根据权利要求55至65中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种病毒载体，其中每种病毒载体包含两种或更多种多核苷酸，所述多核苷酸编码两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白与以下氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或100％相同：
·SEQ ID NO:345和346；
·SEQ ID NO:347和348；
·SEQ ID NO:349和350；
·SEQ ID NO:351和352；
·SEQ ID NO:430和352；
·SEQ ID NO:357和358；
·SEQ ID NO:360和362；
·SEQ ID NO:359和361；
·SEQ ID NO:351和357；
·SEQ ID NO:351和358；
·SEQ ID NO:351和359；
·SEQ ID NO:351和360；
·SEQ ID NO:351和361；
·SEQ ID NO:351和362；
·SEQ ID NO:351和407；
·SEQ ID NO:351和408；
·SEQ ID NO:351和409；
·SEQ ID NO:351和410；
·SEQ ID NO:352和357；
·SEQ ID NO:352和358；
·SEQ ID NO:352和359；
·SEQ ID NO:352和360；
·SEQ ID NO:352和361；
·SEQ ID NO:352和362；
·SEQ ID NO:352和407；
·SEQ ID NO:352和408；
·SEQ ID NO:352和409；
·SEQ ID NO:352和410；
·SEQ ID NO:430和357；
·SEQ ID NO:430和358；
·SEQ ID NO:430和359；
·SEQ ID NO:430和360；
·SEQ ID NO:430和361；
·SEQ ID NO:430和362；
·SEQ ID NO:407和409；
·SEQ ID NO:407和408；
·SEQ ID NO:408和410；或者
·SEQ ID NO:409和410。
67.根据权利要求63所述的试剂盒，其包含两种或更多种编码所述融合多肽的多核苷酸或者两种或更多种表达所述融合多肽的载体，所述融合多肽包含：
1)SEQ ID NO:351-356和430中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:351-356和430中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列；以及
2)SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
68.根据权利要求55至66中任一项所述的试剂盒，其还包含一个或多个整体剂量的一种或多种附加治疗剂。
69.根据权利要求68所述的试剂盒，其包含一种或多种活化潜伏性HIV的药剂，例如一种或多种潜伏期逆转剂(LRA)。
70.根据权利要求68至69中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种选自由以下项组成的组的LRA：一种或多种toll样受体(TLR)的激动剂或活化剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、蛋白激酶C(PKC)活化剂、Smyd2抑制剂、BET-溴结构域4(BRD4)抑制剂、离子霉素、凋亡蛋白抑制剂(IAP)拮抗剂以及胱天蛋白酶(SMAC)第二线粒体衍生的活化剂模拟物。
71.根据权利要求68至70中任一项所述的试剂盒，其包含一种或多种toll样受体(TLR)的一种或多种激动剂或活化剂。
72.根据权利要求71所述的试剂盒，其中所述TLR激动剂或活化剂选自由TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂组成的组。
73.根据权利要求71至72中任一项所述的试剂盒，其中所述TLR7激动剂选自由以下项组成的组：GS 9620(维沙莫特)、R848(瑞喹莫特)、DS-0509、LHC-165和TMX-101(咪喹莫特)，并且/或者其中所述TLR8激动剂选自由以下项组成的组：GS-9688、R848(瑞喹莫特)、CV8102(双TLR7/TLR8激动剂)和NKTR-262(双TLR7/TLR8激动剂)。
74.根据权利要求71至73中任一项所述的试剂盒，其中所述TLR9激动剂选自由以下项组成的组：AST-008、可比托莫特、CMP-001、IMO-2055、IMO-2125、利尼莫特、MGN-1601、BB-001、BB-006、IMO-3100、IMO-8400、IR-103、IMO-9200、阿格托莫特、DIMS-9054、DV-1079、DV-1179、AZD-1419、来菲莫特(MGN-1703)、CYT-003、CYT-003-QbG10、替索托利莫特和PUL-042。
75.根据权利要求68至74中任一项所述的试剂盒，其包含选自以下项的白介素的一种或多种白介素受体激动剂：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、FLT3LG。
76.根据权利要求75所述的试剂盒，其包含选自由以下项组成的组的一种或多种细胞因子：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、FLT3LG以及它们的组合和功能变体。
77.根据权利要求68至76中任一项所述的试剂盒，其包含选自由以下项组成的组的受体的激动剂：fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)、干扰素基因刺激剂(STING)受体、DExD/H-盒解旋酶58(DDX58；又名RIG-I)、含核苷酸结合寡聚结构域2(NOD2)。
78.根据权利要求68至77中任一项所述的试剂盒，其包含选自由以下项组成的组的T细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体的抑制剂：CD274(CD274、PDL1、PD-L1)；程序性细胞死亡1配体2(PDCD1LG2、PD-L2、CD273)；程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4、CD152)；CD276(B7H3)；含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1、B7H4)；V-set免疫调节受体(VSIR、B7H5、VISTA)；免疫球蛋白超家族成员11(IGSF11、VSIG3)；TNFRSF14(HVEM、CD270)、TNFSF14(HVEML)；CD272(B和T淋巴细胞相关(BTLA))；含PVR相关免疫球蛋白结构域(PVRIG、CD112R)；具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；淋巴细胞活化3(LAG3、CD223)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2、TIMD3、TIM3)；半乳凝素9(LGALS9)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；以及杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)。
79.根据权利要求68至78中任一项所述的试剂盒，其包含选自由以下项组成的组的T细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体的激动剂、活化剂或刺激剂：CD27、CD70；CD40、CD40LG；诱导型T细胞共刺激因子(ICOS、CD278)；诱导型T细胞共刺激因子配体(ICOSLG、B7H2)；TNF受体超家族成员4(TNFRSF4、OX40)；TNF超家族成员4(TNFSF4、OX40L)；TNFRSF9(CD137)、TNFSF9(CD137L)；TNFRSF18(GITR)、TNFSF18(GITRL)；CD80(B7-1)、CD28；nectin细胞粘附分子2(NECTIN2、CD112)；CD226(DNAM-1)；脊髓灰质炎病毒受体(PVR)细胞粘附分子(PVR、CD155)。
80.根据权利要求78所述的试剂盒，其中所述CTLA4的抑制剂选自由以下项组成的组：伊匹单抗、曲美木单抗、BMS-986218、AGEN1181、AGEN1884(泽弗利单抗)、BMS-986249、MK-1308、REGN-4659、ADU-1604、CS-1002、BCD-145、APL-509、JS-007、BA-3071、ONC-392、AGEN-2041、JHL-1155、KN-044、CG-0161、ATOR-1144、PBI-5D3H5、FPT-155(CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308(PD-1/CTLA4)、MGD-019(PD-1/CTLA4)、KN-046(PD-1/CTLA4)、MEDI-5752(CTLA4/PD-1)、XmAb-20717(PD-1/CTLA4)、AK-104(CTLA4/PD-1)和BPI-002。
81.根据权利要求78所述的试剂盒，其中所述PD-L1(CD274)或PD-1(PDCD1)的抑制剂选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、西米单抗、匹地利珠单抗、AB122(赛帕利单抗)、AMP-224、MEDI0680(AMP-514)、斯巴达珠单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、BMS-936559、CK-301、PF-06801591、BGB-A317(替雷利珠单抗)、GLS-010(WBP-3055)、AK-103(HX-008)、AK-105、CS-1003、HLX-10、MGA-012、BI-754091、AGEN-2034()、JS-001(特瑞普利单抗)、JNJ-63723283、杰诺单抗(CBT-501)、LZM-009、BCD-100、LY-3300054、SHR-1201、SHR-1210(卡瑞利珠单抗)、Sym-021、ABBV-181、PD1-PIK、BAT-1306(MSB0010718C)、CX-072、CBT-502、TSR-042(多塔利单抗)、MSB-2311、JTX-4014、BGB-A333、SHR-1316、CS-1001(WBP-3155、KN-035、IBI-308(信迪利单抗)、HLX-20、KL-A167、STI-A1014、STI-A1015(IMC-001)、BCD-135、FAZ-053、TQB-2450、MDX1105-01、FPT-155(CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308(PD-1/CTLA4)、MGD-013(PD-1/LAG-3)、FS-118(LAG-3/PD-L1)MGD-019(PD-1/CTLA4)、KN-046(PD-1/CTLA4)、MEDI-5752(CTLA4/PD-1)、RO-7121661(PD-1/TIM-3)、XmAb-20717(PD-1/CTLA4)、AK-104(CTLA4/PD-1)、M7824(PD-L1/TGFβ-EC结构域)、CA-170(PD-L1/VISTA)、CDX-527(CD27/PD-L1)、LY-3415244(TIM3/PDL1)、INBRX-105(4-1BB/PDL1)、GS-4224、GS-4416、INCB086550和MAX10181。
82.根据权利要求68至81中任一项所述的试剂盒，其还包括向所述受试者施用CD47的抑制剂。
83.根据权利要求68至82中任一项所述的试剂盒，其还包括一种或多种抗病毒剂。
84.根据权利要求83所述的试剂盒，其中所述一种或多种抗病毒剂选自由以下项组成的组：HIV蛋白酶抑制剂、HIV逆转录酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV非催化位点(或变构)整合酶抑制剂、HIV进入(融合)抑制剂、HIV成熟抑制剂和衣壳抑制剂。
85.一种用于引发有需要的受试者对人类免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1至9中任一项所述的一种或多种融合多肽或者根据权利要求10至13中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据权利要求18至33中任一项所述的一种或多种载体或者根据权利要求40至45中任一项所述的一种或多种免疫原性组合物或者根据权利要求46至54中任一项所述的一种或多种药物组合物。
86.一种治疗或预防有需要的受试者的人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1至9中任一项所述的一种或多种融合多肽或者根据权利要求10至13中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据权利要求18至33中任一项所述的一种或多种载体或者根据权利要求40至45中任一项所述的一种或多种免疫原性组合物或者根据权利要求46至54中任一项所述的一种或多种药物组合物。
87.根据权利要求85至86中任一项所述的方法，其包括施用单一融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或病毒表达载体，其中所述融合多肽包含两个或更多个多价多肽片段，例如二价多肽片段。
88.根据权利要求85至86中任一项所述的方法，其中同时或并发向所述受试者施用两种或更多种融合多肽或编码所述融合多肽的两种或更多种病毒表达载体。
89.根据权利要求85至88中任一项所述的方法，其中两种或更多种融合多肽或编码所述融合多肽的两种或更多种多核苷酸或两种或更多种病毒表达载体为二价抗原组合物的形式。
90.根据权利要求85至89中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者的氨基酸序列或与345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
91.根据权利要求85至90中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用一种或多种腺病毒载体，每种腺病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:345-377、407-411、422-424、430-435中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
92.根据权利要求85至91中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用一种或多种病毒载体，其中每种病毒载体包含两种或更多种多核苷酸，所述多核苷酸编码两种或更多种融合蛋白，所述融合蛋白与以下氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或100％相同：
·SEQ ID NO:345和346；
·SEQ ID NO:347和348；
·SEQ ID NO:349和350；
·SEQ ID NO:351和352；
·SEQ ID NO:430和352；
·SEQ ID NO:357和358；
·SEQ ID NO:360和362；
·SEQ ID NO:359和361；
·SEQ ID NO:351和357；
·SEQ ID NO:351和358；
·SEQ ID NO:351和359；
·SEQ ID NO:351和360；
·SEQ ID NO:351和361；
·SEQ ID NO:351和362；
·SEQ ID NO:351和407；
·SEQ ID NO:351和408；
·SEQ ID NO:351和409；
·SEQ ID NO:351和410；
·SEQ ID NO:352和357；
·SEQ ID NO:352和358；
·SEQ ID NO:352和359；
·SEQ ID NO:352和360；
·SEQ ID NO:352和361；
·SEQ ID NO:352和362；
·SEQ ID NO:352和407；
·SEQ ID NO:352和408；
·SEQ ID NO:352和409；
·SEQ ID NO:352和410；
·SEQ ID NO:430和357；
·SEQ ID NO:430和358；
·SEQ ID NO:430和359；
·SEQ ID NO:430和360；
·SEQ ID NO:430和361；
·SEQ ID NO:430和362；
·SEQ ID NO:407和409；
·SEQ ID NO:407和408；
·SEQ ID NO:408和410；或者
·SEQ ID NO:409和410。
93.根据权利要求85至91中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用：
1)一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:351-356和430中的任一者的氨基酸序列或与SEQID NO:351-356和430中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列序列组成；以及
2)一种或多种融合多肽或编码所述融合多肽的多核苷酸或表达所述融合多肽的病毒表达载体，所述融合多肽包含SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:357-366和407-410中的任一者至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或者由所述氨基酸序列或所述序列组成。
94.根据权利要求85至92中任一项所述的方法，其中所述受试者被HIV-1感染、疑似被HIV-1感染或者处于被HIV-1感染的风险中。
95.根据权利要求85至94中任一项所述的方法，其中所述受试者被HIV-1慢性感染。
96.根据权利要求85至95中任一项所述的方法，其中所述受试者被HIV-1急性感染。
97.根据权利要求85至96中任一项所述的方法，其中所述受试者具有Fiebig IV期或更早例如Fiebig III期、Fiebig II期或Fiebig I期的HIV-1感染。
98.根据权利要求85至97中任一项所述的方法，其中所述组合物经由选自以下项的途径施用：静脉内、肌内、皮内、皮下和粘膜(例如，颊部、鼻内、直肠内、阴道内)。
99.根据权利要求85至98中任一项所述的方法，其包括每次施用施用约103至约1015个病毒病灶形成单位(FFU)或噬菌斑形成单位(PFU)或感染单位(IU)或病毒颗粒(vp)，例如约104至约107个病毒FFU或PFU或IU或vp，例如约103至约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个病毒FFU或PFU或IU或vp。
100.根据权利要求85至99中任一项所述的方法，其包括初免-加强方案，所述初免-加强方案包括：
(i)在第一时间点施用初免组合物并在一个或多个后续时间点施用一种或多种加强组合物(例如，初免-加强-加强-加强等)；或者
(ii)一次或多次迭代在第一时间点施用初免组合物并在第二时间点施用加强组合物(例如，初免-加强-初免-加强等)。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述初免组合物和所述一种或多种加强组合物的施用间隔至少1周、2周、3周或1个月，例如至少2、3、4、5或6个月。
102.根据权利要求100至101中任一项所述的方法，其中所述初免组合物和所述加强组合物包含相同的免疫原性组合物。
103.根据权利要求100至101中任一项所述的方法，其中所述初免组合物和所述加强组合物包含不同的免疫原性组合物。
104.根据权利要求100至101中任一项所述的方法，其中所述初免组合物和所述加强组合物包含相同的一种或多种融合多肽和相同的多核苷酸或病毒表达载体。
105.根据权利要求100至101中任一项所述的方法，其中所述初免组合物和所述加强组合物包含不同的融合多肽和/或不同的多核苷酸或病毒表达载体。
106.根据权利要求105所述的方法，其包括用第一多核苷酸或病毒表达载体初免，并用第二多核苷酸或病毒表达载体加强。
107.根据权利要求100至106中任一项所述的方法，其中所述初免-加强方案包括：
a)用病毒表达载体初免并用多核苷酸加强，其中所述多核苷酸是DNA、cDNA、mRNA或自复制RNA；
b)用多核苷酸初免，其中所述多核苷酸是DNA、cDNA、mRNA或自复制RNA，并用病毒表达载体加强；
c)用第一病毒表达载体初免并用第二病毒表达载体加强，其中所述第一病毒表达载体和所述第二病毒表达载体来自相同、相关或不相关的分类学家族；
d)用第一复制不足型病毒表达载体初免并用第二复制不足型病毒表达载体加强，其中所述第一复制不足型病毒表达载体和所述第二复制不足型病毒表达载体来自相同、相关或不相关的分类学家族；
e)用第一减弱不足型病毒表达载体初免并用第二复制减弱型病毒表达载体加强，其中所述第一复制减弱型病毒表达载体和所述第二复制减弱型病毒表达载体来自相同、相关或不相关的分类学家族；
f)用复制不足型病毒表达载体初免并用复制减弱型病毒表达载体加强；
g)用复制减弱型病毒表达载体初免并用复制不足型病毒表达载体加强；
h)用淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)病毒表达载体初免并用皮秦德哺乳动物沙粒病毒病毒表达载体加强；
i)用皮秦德哺乳动物沙粒病毒病毒表达载体初免并用淋巴细胞脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒(LCMV)病毒表达载体加强；
j)用沙粒病毒病毒表达载体初免并用腺病毒病毒表达载体加强；或者
k)用腺病毒病毒表达载体初免并用沙粒病毒病毒表达载体加强。
108.根据权利要求85至107中任一项所述的方法，其中所述受试者未接受抗逆转录病毒治疗(ART)，或者在施用所述一种或多种组合物之前中断ART。
109.根据权利要求85至108中任一项所述的方法，其中在一次或多次施用所述组合物之后中断ART。
110.根据权利要求85至109中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用一种或多种附加治疗剂，例如两种、三种、四种或更多种附加治疗剂。
111.根据权利要求110所述的方法，其包括共同施用一种或多种活化潜伏性HIV的药剂，例如一种或多种潜伏期逆转剂(LRA)。
112.根据权利要求110至111中任一项所述的方法，其中所述一种或多种LRA选自由以下项组成的组：一种或多种toll样受体(TLR)的激动剂或活化剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、蛋白激酶C(PKC)活化剂、Smyd2抑制剂、BET-溴结构域4(BRD4)抑制剂、离子霉素、凋亡蛋白抑制剂(IAP)拮抗剂以及胱天蛋白酶(SMAC)第二线粒体衍生的活化剂模拟物。
113.根据权利要求110至112中任一项所述的方法，其包括共同施用一种或多种toll样受体(TLR)的一种或多种激动剂或活化剂。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述TLR激动剂或活化剂选自由TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂组成的组。
115.根据权利要求113至114中任一项所述的方法，其中所述TLR7激动剂选自由以下项组成的组：GS 9620(维沙莫特)、R848(瑞喹莫特)、DS-0509、LHC-165和TMX-101(咪喹莫特)，并且/或者其中所述TLR8激动剂选自由以下项组成的组：GS-9688、R848(瑞喹莫特)、CV8102(双TLR7/TLR8激动剂)和NKTR-262(双TLR7/TLR8激动剂)。
116.根据权利要求110至115中任一项所述的方法，其包括共同施用选自以下项的白介素的一种或多种白介素受体激动剂：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF和FLT3LG。
117.根据权利要求116所述的方法，其包括共同施用选自由以下项组成的组的一种或多种细胞因子：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、FLT3LG以及它们的组合和功能变体。
118.根据权利要求110至117中任一项所述的方法，其包括共同施用选自由以下项组成的组的受体的激动剂：fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)、干扰素基因刺激剂(STING)受体、DExD/H-盒解旋酶58(DDX58；又名RIG-I)、含核苷酸结合寡聚结构域2(NOD2)。
119.根据权利要求110至118中任一项所述的方法，其包括共同施用选自由以下项组成的组的T细胞抑制性免疫检查点蛋白或受体的抑制剂：CD274(CD274、PDL1、PD-L1)；程序性细胞死亡1配体2(PDCD1LG2、PD-L2、CD273)；程序性细胞死亡1(PDCD1、PD1、PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4、CD152)；CD276(B7H3)；含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1、B7H4)；V-set免疫调节受体(VSIR、B7H5、VISTA)；免疫球蛋白超家族成员11(IGSF11、VSIG3)；TNFRSF14(HVEM、CD270)、TNFSF14(HVEML)；CD272(B和T淋巴细胞相关(BTLA))；含PVR相关免疫球蛋白结构域(PVRIG、CD112R)；具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；淋巴细胞活化3(LAG3、CD223)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2、TIMD3、TIM3)；半乳凝素9(LGALS9)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR、CD158E1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾1(KIR2DL1)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾2(KIR2DL2)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个Ig结构域和长胞质尾3(KIR2DL3)；以及杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个Ig结构域和长胞质尾1(KIR3DL1)。
120.根据权利要求110至119中任一项所述的方法，其包括共同施用选自由以下项组成的组的T细胞刺激性免疫检查点蛋白或受体的激动剂、活化剂或刺激剂：CD27、CD70；CD40、CD40LG；诱导型T细胞共刺激因子(ICOS、CD278)；诱导型T细胞共刺激因子配体(ICOSLG、B7H2)；TNF受体超家族成员4(TNFRSF4、OX40)；TNF超家族成员4(TNFSF4、OX40L)；TNFRSF9(CD137)、TNFSF9(CD137L)；TNFRSF18(GITR)、TNFSF18(GITRL)；CD80(B7-1)、CD28；nectin细胞粘附分子2(NECTIN2、CD112)；CD226(DNAM-1)；脊髓灰质炎病毒受体(PVR)细胞粘附分子(PVR、CD155)。
121.根据权利要求119所述的方法，其中所述CTLA4的抑制剂选自由以下项组成的组：伊匹单抗、曲美木单抗、BMS-986218、AGEN1181、AGEN1884(泽弗利单抗)、BMS-986249、MK-1308、REGN-4659、ADU-1604、CS-1002、BCD-145、APL-509、JS-007、BA-3071、ONC-392、AGEN-2041、JHL-1155、KN-044、CG-0161、ATOR-1144、PBI-5D3H5、FPT-155(CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308(PD-1/CTLA4)、MGD-019(PD-1/CTLA4)、KN-046(PD-1/CTLA4)、MEDI-5752(CTLA4/PD-1)、XmAb-20717(PD-1/CTLA4)、AK-104(CTLA4/PD-1)和BPI-002。
122.根据权利要求119所述的方法，其中所述PD-L1(CD274)或PD-1(PDCD1)的抑制剂选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、西米单抗、匹地利珠单抗、AB122(赛帕利单抗)、AMP-224、MEDI0680(AMP-514)、斯巴达珠单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、BMS-936559、CK-301、PF-06801591、BGB-A317(替雷利珠单抗)、GLS-010(WBP-3055)、AK-103(HX-008)、AK-105、CS-1003、HLX-10、MGA-012、BI-754091、AGEN-2034(巴替利单抗)、JS-001(特瑞普利单抗)、JNJ-63723283、杰诺单抗(CBT-501)、LZM-009、BCD-100、LY-3300054、SHR-1201、SHR-1210(卡瑞利珠单抗)、Sym-021、ABBV-181、PD1-PIK、BAT-1306(MSB0010718C)、CX-072、CBT-502、TSR-042(多塔利单抗)、MSB-2311、JTX-4014、BGB-A333、SHR-1316、CS-1001(WBP-3155、KN-035、IBI-308(信迪利单抗)、HLX-20、KL-A167、STI-A1014、STI-A1015(IMC-001)、BCD-135、FAZ-053、TQB-2450、MDX1105-01、FPT-155(CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308(PD-1/CTLA4)、MGD-013(PD-1/LAG-3)、FS-118(LAG-3/PD-L1)MGD-019(PD-1/CTLA4)、KN-046(PD-1/CTLA4)、MEDI-5752(CTLA4/PD-1)、RO-7121661(PD-1/TIM-3)、XmAb-20717(PD-1/CTLA4)、AK-104(CTLA4/PD-1)、M7824(PD-L1/TGFβ-EC结构域)、CA-170(PD-L1/VISTA)、CDX-527(CD27/PD-L1)、LY-3415244(TIM3/PDL1)、INBRX-105(4-1BB/PDL1)、GS-4224、GS-4416、INCB086550和MAX10181。
123.根据权利要求110至122中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用CD47的抑制剂。
124.根据权利要求110至123中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用一种或多种抗病毒剂。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述一种或多种抗病毒剂选自由以下项组成的组：HIV蛋白酶抑制剂、HIV逆转录酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV非催化位点(或变构)整合酶抑制剂、HIV进入(融合)抑制剂、HIV成熟抑制剂和衣壳抑制剂。
126.根据权利要求85至125中任一项所述的方法，其中在任选地与一种或多种附加治疗剂组合一次或多次施用所述组合物中的一种或多种之后，所述受试者在没有抗逆转录病毒治疗(ART)的情况下至少6个月、至少1年、至少2年、至少3年或更长时间未表现出HIV或AIDS的症状。
127.根据权利要求85至126中任一项所述的方法，其中在任选地与一种或多种附加治疗剂组合一次或多次施用所述组合物中的一种或多种之后，所述受试者在没有抗逆转录病毒治疗(ART)的情况下至少6个月、至少1年、至少2年、至少3年或更长时间具有小于500例如小于400、小于300、小于200、小于100、小于50的病毒载量拷贝/ml血液。
128.根据权利要求1至9中任一项所述的一种或多种融合多肽或者根据权利要求10至13中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据权利要求18至33中任一项所述的一种或多种载体或者根据权利要求40至45中任一项所述的一种或多种免疫原性组合物或者根据权利要求46至54中任一项所述的一种或多种药物组合物，其用于引发有需要的受试者对人类免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答。
129.根据权利要求1至9中任一项所述的一种或多种融合多肽或者根据权利要求10至13中任一项所述的一种或多种多核苷酸或者根据权利要求18至33中任一项所述的一种或多种载体或者根据权利要求40至45中任一项所述的一种或多种免疫原性组合物或者根据权利要求46至54中任一项所述的一种或多种药物组合物，其用于治疗或预防有需要的受试者的人类免疫缺陷病毒(HIV)。
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