JP7096456B2

JP7096456B2 - 血液サンプルのアッセイ法

Info

Publication number: JP7096456B2
Application number: JP2019144662A
Authority: JP
Inventors: アーネ，ルドヴィクファーレン，; フランクフランツェン，; アーネ，クリスチャンノルトハイ，; アーリングサンドレハーゲン，; ラーシュオーニング，
Original assignee: Axis Shield PoC AS
Current assignee: Axis Shield PoC AS
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2019-08-06
Publication date: 2022-07-06
Anticipated expiration: 2032-11-09
Also published as: JP2019205469A; EP3435089A1; CN110042146A; US20170349933A1; CN103946711A; EP2751575A2; US20140302540A1; KR102381248B1; KR20140096280A; WO2013068572A2; KR20200013074A; US9695464B2; US11085066B2; KR102072251B1; US20200131560A1; JP2017099399A; JP6507423B2; US11814669B2; KR102606189B1; KR20220062310A

Description

本発明は、全血サンプルなどの細胞含有血液サンプル中の脂質成分などの成分の測定に関する。具体的には、本発明は、特定の種類のリポタンパク質と関連したコレステロールおよびトリグリセリドなどの血漿脂質成分の、特に酵素アッセイによる測定に関する。より詳細には本発明は、「ポイント・オブ・ケア（ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ」装置で実行される自動化法において使用するための、診断、予後およびリスク決定アッセイなどのアッセイに関する。

身体サンプル中の成分の測定は、臨床評価の一般的な特徴である。身体サンプル中の特定の分析物の濃度から、またはいくつかの成分の濃度プロファイルから、多数の診断を行うまたは確認することができ、解明された疾患の状態もしくは進行、または多くの症状のリスクを評価することができる。病状と、１つまたは複数の分析物の濃度との既知の相関関係の数が増大すると、単一の分析物および多数の分析物の両方についてのサンプル分析はますます価値のある手段になる。従って、それに応じて、これまでよりも多数のサンプルをますます迅速に分析するように臨床検査室へのプレッシャーが増大している。これを満足させるために、より迅速、より高処理量、より簡単、かつ／またはより完全に自動化されたアッセイが必要とされている。

「ポイント・オブ・ケア」で実行されるアッセイに対する要求が高まっている。現在行われている慢性疾患のプライマリケアへの移行と共に要求は増大している。これは患者にとって有益であり、患者は即座に助言を受け、疑念を持ち続けることが少ない。また、「患者の近く（ｎｅａｒｐａｔｉｅｎｔ）」での検査は、患者のコンプライアンス、処置および治療管理の厳守を改善することも示されている（Ｐｒｉｃｅ．（２００１）ＢＭＪ３３２：１２８５－８）。また医師にとっても有益であり、医師は複数の予約の必要性を潜在的に回避することができ、自身の判断をより確信することができる。

ポイント・オブ・ケアアッセイは、簡単な操作および迅速な結果に対する必要性の観点から、非常に要求が厳しい。アッセイが数分以上かかると、ポイント・オブ・ケアでアッセイを行う利点の多くが失われる。さらに、このようなアッセイを行う職員は医療従事者である可能性は高いが、分析の専門家ではなく、多数の機器を利用することはできないであろう。従って、このようなアッセイは最小限のサンプル処理に依存するように設計されることが必要である。このため、そして時間、人材およびコストの理由で、単一の分析機器および単一の検査装置において単一のサンプルを用いて単一の動作で複数の異なる分析物のレベルが決定されることは、多くの場合に非常に有利である。これにより、広範なサンプル操作、多数の検査装置または多数の分析機器に対する高価で時間のかかる必要性が回避される。

ポイント・オブ・ケア方法の１つの特定の問題は、キャリブレーションにほとんど適応できないことである。酵素は貯蔵中の不活性化に対して本質的に敏感なので、これは、酵素ベースのアッセイ法において特に懸念される。

未知の酵素活性の問題を回避するための一般的な方法は、酵素反応の終点を決定することである。全ての分析物を生成物に転換するのに十分な試薬が存在し、完全な転換のために十分な時間が提供されれば、形成される最終生成物の量は反応の開始時に存在する分析物の量だけに依存し得る。反応を触媒するのに十分に活性な酵素が存在する限り、その酵素の活性は反応の速度を決定するだけであり、終点を決定しないであろう。しかしながら、このアプローチは、非常に過剰の酵素を必要としてコストを増大させる、かつ／または、十分に長いアッセイ時間を必要として総アッセイ時間を増大させる。これは、通常５～１０分以内に完了されなければならないポイント・オブ・ケアアッセイにとって特に懸念される。

特に懸念されるのは、測定可能な終点を生じない酵素反応である。このような状況には、前の反応が終点に到達する前に次の反応が始まるか、または併発反応が起こる逐次反応が含まれる。同様に、１つの成分がブロック化された第２の成分（「ブロック」が存在しないと反応し得る）の存在下で反応する場合には、ブロック化が共有結合反応などにより「永久的」である場合にだけ終点に到達することができる。しかしながら、多くのブロッキング試薬は一時的な効果を有するだけであり、従って、その終点に到達するために必要な期間の間に第２の成分がある程度「脱ブロック化」されると、第１の成分の反応の終点に到達することはできない。典型的な例は、特定のリポタンパク質、例えば高密度リポタンパク質と関連したコレステロールの脂質成分の測定である。リポタンパク質成分のブロック化は、通常、一時的で動力学的なタイプのブロックある。このことによって、典型的な終点アッセイは困難または不可能になり、定点測定に基づくアッセイなどの他の方法が使用されなければならない。これらの場合は速度依存性であり、従って、長期間の試薬の減衰を補償できるように、完全に安定した試薬（通常、乾燥試薬）を必要とするか、またはキャリブレータの包含を必要とする。乾燥試薬は、再構成時に誤差を生じやすく、非常に長い再構成時間を必要とすることが多く、乾燥過程で活性損失を受け、特にインデバイス乾燥試薬の場合には、製造コストを増大させるという不都合を有する。キャリブレータは、高頻度でポイント・オブ・ケアアッセイに適合しない。

リポタンパク質の構造は、通常、タンパク質成分と強固に結合されて近づくことのできない塊になった脂質成分を有する。従って、酵素反応は一般に、リポタンパク質内に強固に結合された脂質に影響を与えないか、または非常に遅い速度で影響を与えるであろう。従って、リポタンパク質内からの脂質の酵素反応のための試薬混合物は、通常、リポタンパク質を「アンロック」して脂質成分を酵素の作用に暴露するのに役立つ界面活性剤などの試薬も含有する。従って、リポタンパク質成分の「ブロック化」は、多くの場合、「ブロック化」された成分が酵素反応に利用できなくされるように、このような界面活性剤の作用に対してその成分を安定化することである。しかしながら、時間が経つと、反応混合物中の酵素および／または界面活性剤は、通常、ブロック化されたリポタンパク質成分についてもいくらかの分解を引き起こし始めるであろう。これは次に壊滅的な効果を引き起こし、この場合、試薬の作用がリポタンパク質構造を開放し始め、そしてより反応性になり、従ってさらに開放し、そして以下同様である。それに応じて、「ブロック化」脂質成分は、急速および次第にその「ブロック」を失い、著しい妨害を引き起こす前の特定の長さの時間（例えば、数百秒）は、反応において測定可能な関与をしないことが信頼され得る。このような一時的なブロックは、終点に到達し得る前にブロックが破壊され、従って結果が所望の成分を表さないので、終点反応において使用することができない。

また、測定することが望ましい成分が、特定のタイプの脂質の総量の比較的少量部分（例えば、典型的な健康な患者では総量の３０％未満）を含有する場合、残りの部分が「ブロック化」されるときに、このブロック化が大きく除去され得る前にアッセイが実行されることが特に重要であることも注目すべきである。これは、大きい成分の比較的少量の脱ブロック化は、より小さい成分が分析される場合の結果に著しい影響を与え得るからである。

上記のことを考慮して、現在のポイント・オブ・ケア機器は、キャリブレータを含むことができないので液体試薬を使用することができず、そして終点が到達不能または測定不能であるために終点分析を使用することができない。従って、このような機器の製造業者に利用可能である唯一の解決法は、通常乾燥形態である安定化された試薬の使用であった。しかしながら、これにはその独自の不都合がある。乾燥試薬はより高価であるだけでなく、その再構成は時間がかかると共に潜在的に信頼できない。従って、このような乾燥試薬を用いる機械は、恐らく酵素試薬の完全な再構成が時折失敗するために、予想されるよりも高い割合の異常な結果を生じる傾向がある。従って、キャリブレータを存在させずに溶液試薬を用いて、測定可能な終点を持たない反応が確実に使用されることを可能にする方法はかなり価値があるであろう。

アッセイが行われる最も一般的な臨床サンプルは、採取および操作が比較的容易であるために流体、特に血液および尿である。血液において、分析されるのは、通常、流体血漿の内容物である。血液由来のサンプルにおいて行われる最も一般的および臨床的に重要な測定のいくつかは血漿脂質含量に関する。血漿中に存在する主要な脂質は、リン脂質（ＰＬ）、トリグリセリド（ＴＧ）、およびコレステロール（ＣＨ）である。これらのうち、ＴＧおよびＣＨは心血管疾患と関連しているために特に診断上重要であり、そして心血管疾患は先進国において最もよく見られる疾患の１つである。

脂質はまさにその本質から非水溶性であり、血液中では、資質を可溶化するアポリポタンパク質との複合体において輸送される。これらの複合体であるリポタンパク質はその大きさおよび脂質対タンパク質比に基づいて５つの群に分類される：カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）。カイロミクロンは基本的に脂肪の液滴であり、約９０％までがＴＧからなる。カイロミクロンは回腸から脂肪組織および肝臓まで食物脂質を輸送するための媒体としての機能を果たし、食後の短時間だけ全身循環中に存在する。

残りの４つの種類のリポタンパク質は肝臓で産生される。ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、およびＬＤＬは肝臓から組織への脂質の輸送を担うが、５番目の種類のＨＤＬは、さらなる肝胆道分泌のために、末梢組織から肝臓へ戻る過剰な脂質の逆輸送に関与する。ＶＬＤＬおよびＩＤＬは半減期が短く、主にＴＧを組織に送達する。ＬＤＬおよびＨＤＬは半減期がより長く、血中コレステロールの恒常性に主として関係する。平均して、ＬＤＬおよびＨＤＬは合わせて、血液中に存在するコレステロールの約９５％を運び、ＬＤＬが約７０％、そしてＨＤＬが約２５％を運ぶ。

リポタンパク質中には５つの異なるタイプのタンパク質：アポリポタンパク質（Ａｐｏ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが存在しており、各タイプはさらに細分することができる。アポリポタンパク質は、リポタンパク質の形成、分泌、および輸送、ならびに末梢組織中のリポタンパク質に作用する酵素活性のために重要である。アポリポタンパク質Ｂ（アポＢ）はＶＬＤＬ、ＩＤＬ、およびＬＤＬ中の主要なタンパク質であり、ＬＤＬでは唯一のタンパク質である。ＨＤＬにはアポＢがなく、主要なタンパク質はアポ－Ａ１である。

高濃度のＴＧは、糖尿病、心血管疾患、高脂血症、高トリグリセリド血症Ｉ型およびＩＶ型、ならびに腎炎症候群などの様々な病態生理学的な障害と関連している。肝感染症および栄養障害では低濃度が見出される。

多数の疫学的研究から、カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、およびＬＤＬと関連したＣＨが心血管疾患（ＣＶＤ）の主要な危険因子であり、濃度の増大がＣＶＤのリスクの増大と相関することは、十分に立証された事実である。ＬＤＬ粒子と関連したＣＨは主な危険因子であると考えられ、これらの成分の中で群を抜いて最大である。一方、ＨＤＬと関連したＣＨは心血管疾患のリスクと逆相関する。ＨＤＬの濃度が低いほど、心血管疾患のリスクが高くなる。従って、潜在的に他の因子と組み合わせて、心血管疾患を診断および予測するために、そしてＣＶＤのリスクの公式化において、通常は総ＣＨと共にＬＤＬおよび／またはＨＤＬと関連したＣＨを決定することが一般的に行われている。

ＣＨの定量化のために現在２つの方法が日常的に使用されている。いずれの方法も酵素的な方法である。第１の方法では、過酸化水素の発生により着色または蛍光シグナルを生じるために、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼで始まる酵素鎖が用いられる。もう一方の方法はコレステロールオキシダーゼの代わりにコレステロールデヒドロゲナーゼを使用し、生成したＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量に基づいて、サンプル中のＣＨの量を決定する。これらの方法は、反応が効果的に進行できる前は、そのリポタンパク質キャリアからのコレステロールの少なくとも部分的な放出に依存する。界面活性剤は一般にこの機能のために使用され、当該技術分野において周知である。

ＨＤＬ関連ＣＨは、この種類のリポタンパク質を非ＨＤＬリポタンパク質から物理的またはブロック化のいずれかで分離することによって決定され得る。非ＨＤＬを利用不能にした後、総ＣＨの酵素的方法を用いてＨＤＬ関連ＣＨが測定される。しかしながら、既知のブロック化方法は一時的であり、終点に到達する前に除去され得るので、この反応はその終点まで実行することができない。これに対する例外は、非ＨＤＬを物理的に分離することができる場合であるが、これには、ポイント・オア・ケア（ｐｏｉｎｔ－ｏｒ－ｃａｒｅ）機器で利用できない遠心分離などの技術が必要とされる。

最初は、そして今でもまだよく使用されるのは、以下のうちの１つを用いることによる非ＨＤＬの沈殿であった：
（ｉ）ヘパリン／Ｍｇ２＋（ＨａｉｎｌｉｎｅＡｅｔａｌ（１９８２）Ｍａｎｕａｌｏｆｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ，ｌｉｐｉｄａｎｄｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓ，第２版Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：ＵＳｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９８２：１５１頁）、
（ｉｉ）リンタングステン酸－Ｍｇ２＋（Ｌｏｐｅｓ－ＶｉｒｅｌｌａＭＦｅｔａｌ（１９７７）ＣｌｉｎＣｈｅｍ２３：８８２－４）、
（ｉｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ＶｉｉｋａｒｉＪ，（１９７６）ＳｃａｎＪＣｌｉｎＬａｂＩｎｖｅｓｔ３５：２６５－８）、および
（ｉｖ）デキストラン硫酸－Ｍｇ２＋（Ｆｉｎｌｅｙｅｔａｌ（１９７８）ＣｌｉｎＣｈｅｍ２４：９３１－３）。

沈殿した非ＨＤＬは、次に、遠心分離により除去される。後者の方法は、ＨＤＬ関連ＣＨの測定のための基準方法として、ＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＮｅｔｗｏｒｋによって今も推奨されている（Ｋｉｍｂｅｒｌｙｅｔａｌ（１９９９）ＣｌｉｎＣｈｅｍ４５：１８０３－１２）。

その他の方法では、電気泳動法（ＣｏｎｌｉｎＤｅｔａｌ（１９７９）２５：１９６５－９）またはクロマトグラフィ（Ｕｓｕｉｅｔａｌ（２０００）ＣｌｉｎＣｈｅｍ４６：６３－７２）による分離が使用された。

上記の方法は効果的であるが、冗長な分離ステップおよび多数の実験室用機器を必要とする。骨の折れるサンプル前処理を除去するために、２つの異なる経路が取られている。カセットまたは試薬含侵ストリップであり得る検査装置内にＨＤＬの分離および定量化を一体化させたポイント・オブ・ケア機器、例えばＣｈｏｌｅｓｔｅｃｈのＨＤＬアッセイ装置および方法（米国特許第５２１３９６５号明細書）などが開発されている。

自動医療機器に関して、ＨＤＬ関連ＣＨ画分を測定するために非ＨＤＬリポタンパク質の物理的な分離を必要としない均一法（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓｍｅｔｈｏｄ）が開発された。非ＨＤＬ粒子は種々の方法によってブロック化され、ＣＨ代謝酵素へ近づきにくくされた。最新の開発は、ＨＤＬを選択的に溶解する非常に特異的な界面活性剤である。このような状況では、非ＨＤＬ脂質をリポタンパク質形態で残し、従って酵素の作用に非常に近づきにくくする界面活性剤だけを含むことにより、非ＨＤＬを効率的に「ブロックする」、ＨＤＬのための反応混合物である。

ＬＤＬ関連コレステロールは、一般に、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄの式（ＦｒｉｅｄｅｗａｌｄＷＴｅｔａｌ（１９７２）ＣｌｉｎＣｈｅｍ１８：４９９－５０１）：
ＬＤＬ＝総ＣＨ－（ＨＤＬ＋ＴＧ／２）
を用いてコンピュータで決定される。

便利であり、そしてほとんどの場合に十分正確であるが、この方法は周知の制限を受け、特に、患者は採血の前に患者は絶食する（絶食は血液からカイロミクロンを枯渇させる）必要があり、ＴＧレベルを４ｇ／Ｌ未満にすることが要求される。従って、ＮＩＨ支援によるナショナルコレステロール教育プログラム成人治療委員会（ＮａｔｉｏｎａｌＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＥｄｕｃａｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ））成人治療委員会（ＡｄｕｌｔＴｒｅａｔｍｅｎｔＰａｎｅｌ）ＩＩＩ（ＡＴＰＩＩＩ）ガイドラインは、総ＣＨ、ＨＤＬ関連ＣＨ、およびＴＧからＬＤＬ関連ＣＨを計算するのではなく、ＬＤＬ関連ＣＨの直接測定を使用することを推奨している。しかしながら、最近の報告では、直接測定したＬＤＬレベルの計算値に対する臨床的優位性に疑問が投げ掛けられている（Ｍｏｒａｅｔａｌ（２００９）ＣｌｉｎＣｈｅｍ５５：８８８－９４）。

最初は、ＬＤＬ関連ＣＨは超遠心分離法を用いて測定された（ＨａｖｅｌＲＪｅｔａｌ，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１９５５；３４：１３４５－５３）。これは、今でも最もよく使用されている基準方法であるが、明らかにサンプルの前処を必要とする。ＬＤＬＣＨ画分を測定するために非ＬＤＬリポタンパク質の物理的な分離を必要としない均一法が後で開発された（米国特許第５８８８８２７号明細書、米国特許第５９２５５３４号明細書）。

ＶＬＤＬ関連ＣＨは、最初は超遠心分離法を用いて測定された。これは、今でも好ましい基準方法のままであるが、ここ数年の間に、ＶＬＤＬ関連ＣＨを決定するための均一法が開発されている。これらには、米国特許第６９８６９９８号明細書および米国特許第７２０８２８７号明細書からの方法が含まれる。

ＩＤＬと関連したＣＨ（「ＶＬＤＬレムナント」または「レムナント様粒子」とも呼ばれる）は、一般に、超遠心分離法、高速液体クロマトグラフィまたは電気泳動法を用いて決定される。ＩＤＬ関連コレステロールの選択的酵素分解を促進するために特定の界面活性剤を使用する２つの均一法が最近開発された（米国特許第７２７２０４７号明細書および米国特許出願公開第２００７／０１６１０６８号明細書）。

近年、いくつかの報告により、非ＨＤＬの測定は、ＬＤＬの測定よりも多くの心臓事象を防止することが提言されている（ｖａｎＤｅｖｅｎｔｅｒｅｔａｌＣｌｉｎＣｈｅｍ（２０１１）５７：４９０－５０１、Ｓｎｉｄｅｒｍａｎｅｔａｌ（２０１１）ＣｉｒｃＣａｒｄｉｏｖａｓｃＯｕｔｃｏｍｅｓ４：３３７－４５）。特に、非ＨＤＬは、ＴＧレべルが高い場合に優秀であり得る（Ｓｎｉｄｅｒｍａｎｅｔａｌ（２０１０）ＪＣｌｉｎＬｉｐｉｄｏｌ４：１５２－５）。非ＨＤＬは現在任意の既知の従来のアッセイ法により直接測定されていないが、総ＣＨおよびＨＤＬと関連したコレステロールの差として計算される（非ＨＤＬ＝総ＣＨ－ＨＤＬ）」。しかしながら、本発明は、非ＨＤＬ成分の直接または間接的な（計算された）測定を可能にする。本発明の１つの態様では、分析物の少なくとも１つは非ＨＤリポタンパク質群に結合されている。特に、非ＨＤＬコレステロールは非常に好ましい分析物である。非ＨＤＬコレステロールは、例えば脂質パネルアッセイにおいて、総ＴＧおよび総ＣＨと共に測定され得る。

スクリーニングの目的で、非ＨＤＬのための直接アッセイは、総ＣＨおよびＨＤＬの２つのアッセイを実行して、非ＨＤＬを差異として計算する場合（実施例１０）と比較して、アッセイ時間およびコストを低減するという利点を有するであろう。従って、本発明のさらなる態様では、１つの分析物は非ＨＤリポタンパク質に結合され（例えば、非ＨＤＬコレステロールなど）、直接（すなわち、２つの他の測定値の差を取るのではなく）測定されるであろう。この分析物は任意の他の分析物と共に測定されてもよいし、そうでなくてもよい。さらに、非ＨＤＬ（例えば、非ＨＤＬＣＨ）を直接測定することの利点は、終点の推定（すなわち、本明細書において記載されるような架空の終点の計算）を使用するアッセイにまで及び、そして従来の技術を使用するアッセイにも及ぶ。従って、さらなる態様では、本発明は、非ＨＤコレステロールなどの非ＨＤリポタンパク質に結合した脂質成分の直接測定ためのアッセイを提供する。ＣＶＤのリスクまたは傾向を指定するための対応する方法は、このような値と、健常者および／またはＣＶＤの高いリスクもしくは傾向のある者の集団から誘導されるしきい値などの適切なしきい値とを比較することによって提供される。

ＴＧは４段階の酵素反応において日常的に決定されており、リポタンパク質リパーゼによりＴＧは非エステル化グリセロールおよび遊離脂肪酸に加水分解される。次に、グリセロールはリン酸化され（グリセロキナーゼ）、そして酸化されて（グリセロール－３－リン酸オキシダーゼ）、ジヒドロキシ－アセトン－リン酸および過酸化水素になり、過酸化水素は着色、蛍光または化学発光シグナルを発生させるために使用される。

様々なリポタンパク質類のＣＨの測定と同様に、特定のリポタンパク質類のＴＧの測定は、様々なリポタンパク質類の様々な化学特性および物理特性を利用するいくつかの方法によって実施され得る。

上記のように、特定のリポタンパク質類の脂質成分の測定、例えば、ＨＤＬ中のコレステロールの測定は、ポイント・オブ・ケアアッセイに対する特定の問題を構成する。現在の方法は、特定のリポタンパク質類以外のリポタンパク質中に存在する特定の脂質成分を一時的にブロックし、次に特定のリポタンパク質類と関連した特定の脂質成分測定することに依存している。このような方法は、合成ポリマーおよびポリアニオン（米国特許第５７７３３０４号明細書、米国特許第６８１１９９４号明細書）または抗体（米国特許第４８２８９８６号明細書、米国特許第６１６２６０７号明細書）またはポリエチレングリコール修飾酵素と結合したシクロデキストリン（米国特許第５６９１１５９号明細書）による望ましくないリポタンパク質のブロック化に依存するか、または特定の界面活性剤（米国特許第７２０８２８７号明細書、米国特許第７２７２０４７号明細書）を使用する。

ブロック化は一時的なので、これらの反応の真の終点は測定することができず、唯一の真の終点は、４つの種類のリポタンパク質のすべてに存在する特定の脂質成分の終点である。従って、特定のリポタンパク質の特定の脂質成分は、特定のリポタンパク質以外のリポタンパク質中に存在する特定の脂質成分が実質的に妨害しないように選択された定点において測定される（通常５分間）か、または反応の最初の数分間に動力学的に測定される。いずれの場合も、長期間の試薬の減衰を補償するように、完全に安定した試薬、すなわち乾燥試薬か、またはキャリブレータの包含の何れかが必要とされる。

異なるアプローチは、検出可能な生成物を与えない酵素反応において、分析中の特定のリポタンパク質類以外のリポタンパク質と関連した特定の脂質成分を選択的に除去することである。特定のタンパク質類の特定の脂質成分は次に検出可能な生成物に転換される。いくつかのこのような方法は、特定のリポタンパク質類と選択的に反応する界面活性剤を使用すると記載されている（欧州特許第１１６４３７６号明細書、米国特許第５９２５５３４号明細書、米国特許第６１９４１６４号明細書、米国特許第６８１８４１４号明細書、米国特許第６８９３８３２号明細書）。

しかしながら、完全な除去を達成するために、反応は終点まで到達されなければならず、時間がかかる。このために必要とされる時間は、ポイント・オブ・ケアアッセイ、特に、複数の分析物を測定するポイント・オブ・ケアアッセイ（「パネル」アッセイとして知られている）のためには長すぎる時間であろう。さらに、これらのアプローチには、分析中の特定のリポタンパク質以外のリポタンパク質中の特定の脂質成分の不完全な除去によって、または特定のリポタンパク質中の特定の脂質成分の非特異的な除去によって引き起こされる不正確さに関する問題がある。実際には、次に、これらのタイプのアッセイは定点測定も必要とし、従って、長期間の試薬の減衰を補償するために、完全に安定した試薬、すなわち乾燥試薬か、またはキャリブレータの包含の何れかに依存する。

上記のことを考慮して、１つまたは複数の血漿成分（脂質成分など）を測定するための改善されたポイント・オブ・ケアアッセイ、特に、特定のリポタンパク質類の脂質成分を含むアッセイが明らかに必要とされている。このようなアッセイが液体試薬を可能にでき、キャリブレータを必要とせず、かつ／または短い総アッセイ時間を有することができれば有利であろう。

本発明者らはここで、血液細胞含有サンプル（例えば、全血など）を使用し、液体試薬を使用し、短い総アッセイ時間を有し、キャリブレータを必要としないポイント・オブ・ケア装置のために適切なアッセイ法を構築することが可能であることを立証した。

本発明者らは、驚くことに、その終点が理論的に到達不可能であり、かつ／または実際に測定不能である酵素反応の終点を決定することが可能であることを見出した。これにより、終点分析の利点の多くを、終点がこれまで考慮されていなかった状況に適用することが可能になる。例えば、いくつかの酵素を含むシーケンスでは、生成物が消費され、従って終点に到達することができない。また、終点を直接測定できない場合、例えば、前の反応が終点に到達する前に次のステップが始まる逐次酵素反応、または反応の初期進行に十分な違いがある併発酵素反応である。

終点が測定できないまたは測定されない状況では、直接測定で達成されるのと同様の精度およびＣＶで、直接測定するのではなく適切なアルゴリズムを用いて計算され得る。必要とされるのは、反応が十分な長さの時間モニターされ、そして終点を正確に予測するための適切なアルゴリズムを用いることである。適切なアルゴリズムおよび方程式は、曲線適合を目的として当該技術分野で定期的に使用されており、従って周知であるが、これまでは、測定不能な終点を予測するためにこのような方法で適用されたことはなかった。通常、反応は、標的分析物の少なくとも５０％が転換されるまでモニターされなければならないが、これは、進行曲線のほんのわずかな部分を構成し得る。標的分析物の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、そして場合により少なくとも６０％が消費されるまでモニターすることは、種々の実施形態において適切である。

一実施形態では、任意の併発反応（例えば、ブロック化された成分のいずれかの脱ブロック化および反応など）が著しくないように測定区間が選択されることが好ましい。

代替の実施形態では、ブロック化された成分のいずれかの脱ブロック化および反応などの併発反応は測定可能な程度まで起こり得るが、このような併発反応の影響は、サンプルから２つ以上の分析物が測定される測定後の分析によってある程度まで補正され得る。例えば、脂質パネルアッセイなどにおいて複数の脂質分析物が測定される場合、ＨＤＬ測定に対する非ＨＤＬの妨害（非ＨＤＬ成分の部分的な脱ブロック化および反応などによる）は、
総コレステロール＝ＨＤＬ＋非ＨＤＬ
に従うＨＤＬおよび総コレステロールの読取り、ならびにＨＤＬアッセイに対する非ＨＤＬの効果についての所定の標準曲線（実施例６）を伴う反復プロセスにおいて部分的に補正され得る。

また本発明者らは、測定可能な終点を生じる反応と共に終点の推定を用いると、液体試薬を用いるポイント・オブ・ケアアッセイにかなりの利点を提供し得ることも見出した。終点の測定は、貯蔵時間と共に試薬活性の損失がアッセイ時間に与える効果を考慮に入れなければならず、推定される終点の使用はこれを回避し、その結果より短い測定時間の使用が可能になる。

第１の態様では、本発明は従って、血液細胞含有サンプルの血漿部分において少なくとも１つの分析物の濃度を測定するための酵素的方法を提供しており、サンプルは第１の成分および第２の成分を含有し、前記第２の成分が存在しかつブロック化されていない場合に、前記第２の成分は前記第１の成分の測定を妨害する。前記方法は、
ｉ）前記血液細胞含有サンプルを、サンプルを希釈する試薬混合物と接触させるステップと、
ｉｉ）血液細胞を実質的に除去して、実質的に無細胞のサンプルを提供するステップと、
ｉｉｉ）前記サンプルを、前記第２の成分の反応を一時的および／または競合的に防止する役割を果たす少なくとも１つの試薬と接触させ、それにより、ブロック化された第２の成分を生成するステップと、
ｉｖ）前記サンプルを、前記少なくとも１つの分析物の各分析物の少なくとも１つの構成物のための少なくとも１つの転換酵素を含む少なくとも１つの試薬混合物と接触させ、それにより、その分析物または各分析物の選択的反応によって、検出可能な反応生成物を直接または間接的に生成させるステップであって、前記分析物または前記分析物の１つが前記第１の成分であるステップと、
ｖ）１つまたは複数の前記検出可能な反応生成物をモニターするステップと、
ｖｉ）１つまたは複数の前記検出可能な生成物の量および／または１つまたは複数の前記検出可能な生成物の形成速度と、前記血液サンプル中の前記少なくとも１つの分析物またはそのそれぞれの濃度とを関連付けるステップであって、測定不能な（架空の）終点を推定することによって、少なくとも前記第１の成分の濃度が対応する検出可能な反応生成物と関連付けられるステップと
を含み、ステップｉｉｉ）は、ステップｉｖ）に至るまで（ステップｉｖ）を含む）の任意の段階で、ただしステップｖ）～ｖｉ）よりも前に実行されることが可能であり、ステップｉｉｉ）の試薬はサンプルに別箇に適用されてもよいし、またはステップｉ）もしくはｉｖ）の試薬混合物中に含まれていてもよい。

好ましい態様では、本方法は、前記細胞含有サンプル中の２つ、３つまたはそれ以上の分析物などの複数の分析物の付随（例えば、同時）測定のためのものである。

検出可能な「生成物」の検出が示される本発明の全ての態様において、状況が許す場合には、これは明らかに、検出可能な反応物または出発材料の検出も可能にするであろう。ほとんどの場合に行う必要があり得る唯一の変更は、反応物または出発材料が消費され、従って濃度が低下し得ることである。生成物および出発材料は通常既知の化学量論により関連されるので、反応物の減少は、生成物を検出するための間接的な方法である。従って、適切な生成物の検出は全て、１つまたは複数の反応物の消費を観察することによって実行され得る。

さらなる態様では、本発明はさらに、血液細胞含有サンプルの血漿部分において少なくとも３つの異なる分析物の濃度を決定する際に使用するためのキットを提供しており、サンプルは第１の成分および第２の成分を含有し、前記第２の成分が存在しかつブロック化されていない場合に、前記第２の成分は前記第１の成分の測定を妨害する。前記キットは、
ａ）前記サンプルを希釈するように配合された第１の試薬混合物と、
ｂ）細胞分離ユニットと、
ｃ）（ブロック）前記第２の成分の反応を一時的および／または競合的に防止する役割を果たす第２の試薬であって、それにより、ブロック化された第２の成分を生成する第２の試薬と、
ｄ）前記少なくとも３つの異なる分析物の選択的転換を引き起こし、それにより、各分析物に対応する検出可能な間接的生成物を生成するように配合された少なくとも３つのさらなる試薬混合物と
を含む。

本発明は、血液細胞含有サンプル中の少なくとも１つの分析物の濃度が測定されるアッセイ法を提供する。

本明細書で使用される場合、「分析物」という用語は、その測定が所望される成分または成分の群を示すために使用される。従って、分析物は、ＨＤＬコレステロールなどの単一の成分であってもよいし、または成分のセットであってもよい。通常、例えば全てのコレステロール含有リポタンパク質のセットなど、このようなセットは共通の特徴を有するであろう。

本発明で使用するために最も好ましい分析物は脂質成分であり、すなわち、サンプルの血漿部分中の特定のタイプの脂質（例えば、ＴＧまたはＣＨ）の総量、または特定のタイプの脂質の特定のリポタンパク質として存在する部分（例えば、ＨＤＬＣＨ）または特定のリポタンパク質セット（例えば、非ＨＤＬＣＨ）である。

終点推定の使用は、単一の成分のためのアッセイにおいて有用であり、その成分の特定の構成物の転換（例えば、ＨＤＬの脂質成分の転換）の終点は、本明細書で示される方法によって推定されるであろう。しかしながら、この技術は、多数の分析物のためのパラレルアッセイ（「パネルアッセイ」と呼ばれることが多い）においても非常に価値がある。これは特にポイント・オブ・ケアにおいて適用される。このような場合、アッセイにおいて２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の分析物が測定され得る。さらに、機器は、測定データから他の分析物のレベルを計算できることもあり、従って、直接測定されるよりも多い成分について報告できることもある（例えば、本明細中の議論を参照）。本発明のパネルアッセイ実施形態において、少なくとも３つの分析物が測定されることが好ましい。

少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ）の分析物が測定される場合、終点推定法はこのような分析物の１つまたは複数の分析のために使用されるであろう。少なくとも１つの分析物が、別の成分をブロックすることなく便利／確実に測定することができない第１の成分である場合、この第１の成分は、測定不能な（架空の）終点の推定によって分析されるであろう。しかしながら、この方法と組み合わせて、終点法によって測定され得る他の成分が、全アッセイのために必要とされる時間を低減するために終点推定によって測定されることもある。従って、一実施形態では、全ての分析物が終点推定法によって測定され、少なくとも１つの分析物が測定不能な（架空の）終点の推定によって測定される。

上記のように、好ましい分析物は血液サンプルの脂質成分である。従って、典型的な分析物は、コレステロール、トリグリセリドまたはリン脂質（完全に、および／またはＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬからなる群からの特定のリポタンパク質と関連して）であろう。リポタンパク質群と関連したコレステロール、トリグリセリドおよび／またはリン脂質（例えば、非ＨＤＬＣＨ）も測定することができ、さらなる好ましい分析物が形成される。

本明細書において言及される「第１の成分」は、通常、ＨＤＬ＿ＣＨまたは非ＨＤＬ－ＣＨなどの、特定のリポタンパク質（またはリポタンパク質群）と関連した特定の脂質であろう。従って、通常、前記第１の成分は、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬから選択される少なくとも１つのリポタンパク質成分と関連した、コレステロール、トリグリセリドまたはリン脂質から選択される脂質成分、例えば、ＨＤＬと関連したコレステロールなどを有する１つの分析物である。

「第２の成分」と、本明細書において示される「第１の成分」の測定との間で起こる妨害は、一般に、第１の成分の脂質成分の反応と、第２の成分の脂質成分の反応とを区別する必要性に起因するであろう。従って、通常、第１および第２の成分は、同じ脂質成分を含むであろう。典型的な例では、非ＨＤＬ－ＣＨ（第２の成分）の存在下でＨＤＬ－ＣＨ（第１の成分および分析物）を測定することが所望され得る。これは、脂質成分がいずれもＣＨであり、従って両方とも反応することができればこれらを区別することは不可能なので、第２の成分の「ブロック化」がなければ容易に実行することができない。このような状況では、第１の成分が唯一または主として反応に利用できるように第２の成分は「ブロック化」される。

成分（特に、本明細書中で記載される「第２の成分」）を「ブロック化」し得る方法は多数ある。これらの方法の多くは本明細書において議論されており、その他の方法は当業者に知られている。このようなブロック化を永久的に行うまたは行うことができれば（例えば、ブロック化部分のいくらかの共有結合によって）、終点推定は必要がない（しかし、アッセイ法を促進するために依然として利点であり得る）。しかしながら、現在知られておりかつ／または広く使用されている技術は「一時的な」ブロック化方法であり、すなわち、第２の成分は完全にまたはほとんど非反応性にされるが、本明細書において記載されるプロセスのステップｉｖ）で使用される酵素転換試薬および／または界面活性剤とは独立して、またはその存在下で、この反応性を取り戻す。本明細書で使用される場合、成分の反応を「一時的に」防止する役割を果たす試薬は、適切な条件（例えば、ステップｉｖ）の条件）下で少なくとも６０秒間、好ましくは少なくとも２４０秒間、最も好ましくは少なくとも３６０秒間その成分の有意な反応を防止するであろう。有意な反応とは、その成分の任意の構成物（例えば、脂質部分）の１０％を超える反応、好ましくは５％を超える反応、最も好ましくは３％を超える反応を示す。

それに応じて、「ブロック化」された成分は、本明細書中の任意の実施形態で記載されるステップｉｖ）の条件などの反応条件にさらされたときに、少なくとも６０秒間、好ましくは少なくとも２４０秒間、より好ましくは少なくとも３６０秒間にわたって１０％を超える、好ましくは５％を超える、より好ましくは３％を超える程度のその脂質成分の反応を受けないであろう。

好ましい実施形態では、ステップｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）の条件は、血液サンプルの細胞が無傷または実質的に無傷なままである（例えば、細胞の１０％未満、好ましくは細胞の５％未満、最も好ましくは３％未満（例えば、０．１～３％）がステップｉ）～ｉｉｉ）の間に溶解を受ける）ように選択される。この点において、イオン強度および界面活性剤のタイプ／濃度を含む因子が特に重要である。

場合により、反応速度を増大し、従ってアッセイ時間を短くするために、特にステップｉｖ）において、米国特許第６８１８４１４号明細書において開示されるものなどの反応促進剤が試薬溶液中に包含されてもよい。

本発明において、方法および他の態様は、少なくとも１つの分析物の測定に関する。このような分析物は通常脂質分析物であり、それぞれ独立して、トリグリセリド、コレステロールなどの特定の脂質成分の総量であってもよいし、または特定のリポタンパク質もしくは特定のリポタンパク質群と関連した脂質成分であってもよい。これらの非包括的な例としては、脂質成分のコレステロール、トリグリセリドまたはリン脂質と、リポタンパク質のＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬのいずれかとの全ての組み合わせ、ならびにこのようなリポタンパク質と関連しない各総脂質成分の対応する部分が挙げられる。従って、例えば、分析物には、ＨＤＬコレステロールおよび非ＨＤＬコレステロールが含まれ、後者は総コレステロールのＨＤＬリポタンパク質に結合していない部分である。特に好ましい分析物には、総ＴＧ、総ＣＨ、非ＨＤＬ、ＬＤＬ、低密度ＬＤＬおよびＨＤＬコレステロールが含まれる。

リポタンパク質と関連した特定の脂質成分の部分を測定するために、その成分もしくは同じ脂質成分を有する全ての他のリポタンパク質のいずれかを「ブロック」する、または非反応性にすることが必要である。これにより、普通には妨害を起こし得る別の成分の存在下で１つの成分を測定できるようになる。

このブロック化はそれ自体知られており、本明細書において以下に多数の例が記載されているが、これを達成するための既知の方法は永久的なブロック化をもたらさない、または脂質成分を永久的に保持しない。むしろ、特定の期間の後、および／またはサンプル中の他の場所の脂質成分の濃度が低くなり過ぎると、ブロック化がなくなり始め、脂質成分が反応性になるであろう。従って、このような状況では、ブロック化成分における構成要素であるものと同じ脂質成分を消費する反応は、その終点に到達する前にブロック化が無効になり得るので、その点まで進むことができない。このような終点は、本明細書では、実際に決して到達することができないという事実を反映するために、「到達不能」、「測定不能」または「架空」と記載される。

上記のことを考慮して、終点型のアッセイは、終点が「測定不能」なので、このタイプのブロック化された脂質成分と共に使用できないことは、当該技術分野において前提とされてきた。この結果、それらに関連する不都合の全て（当該技術分野において知られており、本明細書において記載される）を有するアッセイにおいて、キャリブレーションまたはより一般的には乾燥試薬を使用することが必要とされてきた。

しかしながら、本発明者らはここで、終点推定技術はこのような測定不能な終点においても効果的に使用可能であり、従って、たとえ実際には決して到達することができなくても、到達不能または測定不能（「架空」）の終点はそれでも計算可能であることを立証した。

特定の種類の脂質または特定の種類のリポタンパク質の選択的反応、およびリポタンパク質の脂質成分から検出可能な二次的分析物への転換に関しては、当該技術分野において周知の方法がいくつかあり、これらはどれも本発明における使用に適している。上記の均一法は全て適しており、本発明の範囲内に含まれる。さらなる詳細は以下において、そして参照される引用において提供される。

ＣＨの定量化のために現在２つの方法が日常的に使用されている。いずれの方法も酵素的であり、本発明の方法における使用に適している。第１の方法では、コレステロールエステラーゼがコレステロールエステルをＣＨに転換する。次に、コレステロールオキシダーゼがＣＨをコレスト－４－エン－３－オンおよび過酸化水素に転換する。最後に、水素ペルオキシダーゼが形成された過酸化水素を用いて、フェノールの存在下で４－アミノアンチピリンを転換し、着色キノンイミン化合物を生成する。キノンイミンは、５００～６００ｎｍの波長で測光法によりモニターされる。４－アミノアンチピリン／フェノールの代わりに、その他の周知の発色基質（例えば、ＴＭＢ、これは生成物が青色であり、６５０ｎｍでモニターされる）または蛍光もしくは化学発光基質が使用されてもよい。

もう一方の方法はコレステロールオキシダーゼの代わりにコレステロールデヒドロゲナーゼを用い、生成したＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量に基づいて、サンプル中のＣＨの量を決定する。

ＴＧの検出に関して、これは４段階の酵素反応で日常的に決定されており、リポタンパク質リパーゼがＴＧを非エステル化グリセロールおよび遊離脂肪酸に加水分解する。グリセロールは次にグリセロキナーゼによってリン酸化され、グリセロール－３－リン酸オキシダーゼによって酸化されて、ジヒドロキシ－アセトン－リン酸および過酸化水素になる。最後の発色ステップにおいて、形成された過酸化水素を水素ペルオキシダーゼが使用し、フェノールの存在下で４－アミノアンチピリンを着色キノンイミンに転換する。キノンイミンは５００ｎｍの波長で分光光度的にモニターされる。適切な基質およびフェノールを選択することによって、形成される着色生成物は４５０～８５０ｎｍの波長でモニターされ得る。同様に、４－アミノアンチピリンの代わりに蛍光または化学発光基質が使用されてもよい。明らかに、両方の過酸化物ベースの方法における最終ステップは等価であり、交換可能である。

従って、特定の血漿脂質成分を検出可能な化学生成物に転換する酵素反応は、好ましくは、上記の酵素系を用いて実施され得る。
ＣＨの場合：
（ｉ）コレステロールエステラーゼ＋コレステロールオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、または
（ｉｉ）コレステロールエステラーゼ＋コレステロールデヒドロゲナーゼ。
ＴＧの場合：
（ｉｉｉ）リパーゼ＋グリセロールキナーゼ＋グリセロール－３－リン酸オキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ。

酵素としては、動物、微生物または植物に由来する市販の酵素を使用することができる。リポタンパク質類ＶＬＤＬと優先的に反応するクロモバクテリウム・ビスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｓｃｏｓｕｍ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からのリポタンパク質リパーゼおよびコレステロールエステラーゼなど、特定のソースからの酵素は特定のリポタンパク質類に対する選択性を示し得る。このような酵素は特定の成分をアッセイするために、単独で、または本明細書に記載される他の選択方法と組み合わせて使用することができる。酵素はその特異性および安定性を変化させるように化学的に修飾されていてもよく、例えば、酵素のＬＤＬ関連ＣＨとの反応性を低くするためのコレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼと、ＰＥＧとの結合などである（米国特許第５８０７６９６号明細書）。酵素は、通常、１００～１００，０００Ｕ／Ｌの濃度で使用される。

特定のリポタンパク質類の脂質成分の測定は、様々なリポタンパク質類の様々な化学特性および物理特性を利用するいくつかの方法によって実施することができる。一般に、これらの方法は酵素の特異性に依存し、かつ／またはその他の妨害し得る成分を分離、転換または不活性化した後に所望の成分の反応を可能にする。

非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性イオン性の界面活性剤は、酵素反応の選択性を増大させるため、または反応速度を増大させるために包含され得る。反応の過程において細胞の無傷な状態の保持を可能にする任意の適切な界面活性剤が使用され得る。細胞の状態にとって特に重要である非イオン性界面活性剤の１つの特性は、親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）である。ＨＬＢ値が１０未満および１３を超える界面活性剤は、無傷の細胞の存在下で使用するのに特に適している。しかしながら、ＨＬＢ値が１０～１３の間である界面活性剤も、使用濃度に応じて、そして反応時間および使用温度、イオン強度、アッセイ混合物中で使用される塩のｐＨおよびタイプ、ならびに安定化物質（例えば、血清アルブミンなど）の存在などのアッセイの構成および配合に応じて、無傷の細胞と適合し得る。適切な界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ３５および７８）、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ４５およびＸ３０５、Ｉｇｅｐａｌ２１０および２７２）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン－コオキシプロピレンブロックコポリマー（ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８およびＬ６４）、ポリエチレングリコールを有するテロメアＢモノエーテル（ＺｏｎｙｌＦＳＮ１００）、エチレンジアミンアルコキサラート（ａｌｋｏｘａｌａｔｅ）ブロックコポリマー（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ１３０７）、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールエトキシレート（Ｓｕｒｆｏｎｙｌ４６５および４８５）、ポリジメチルシロキサンメチルエトキシレート（ＳｉｌｗｅｔＬ７６００）、ポリエトキシル化オレイルアルコール（ＲｈｏｄａｓｕｒｆＯＮ－８７０）、ポリエトキシル化ヒマシ油（ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ）、ｐ－イソノニルフェノキシ－ポリ（グリシドール）（界面活性剤１０Ｇ）、およびポリエーテルスルホネート（ＴｒｉｔｏｎＸ２００）が挙げられる。界面活性剤は通常、この目的のために０．００１～１０％、好ましくは０．０１～１％の濃度で使用される。

以下の方法は、記載される特定のリポタンパク質成分を選択的に反応させるのに適したものに含まれる。全ての場合において、参照される公開材料は参照によって本明細書中に援用される。

ＨＤＬ関連ＣＨ画分を測定するための均一法において、様々な方法により非ＨＤＬ粒子は反応からブロック化されており、ＣＨ代謝酵素が利用できないようにされている。つい最近の開発は、ＨＤＬを選択的に溶解する特定の界面活性剤である。これらには、以下のものが含まれる：
（ｉ）ＰＥＧ／シクロデキストリン法（米国特許第５６９１１５９号明細書）では、硫酸化アルファ－シクロデキストリンはＭｇ^２＋の存在下で非ＨＤＬとの可溶性複合体を形成し、これにより、ＰＥＧ修飾酵素による分解に対して抵抗性になる。
（ｉｉ）ポリアニオン法（米国特許第５７７３３０４号明細書）はポリアニオンまたは界面活性剤（米国特許第７８５１１７４号明細書）と共に合成ポリマーを使用し、非ＨＤＬをブロック化して、特定の洗剤による可溶化および酵素測定に対して抵抗性にする。
（ｉｉｉ）免疫学的方法（米国特許第６１６２６０７号明細書）は、全ての非ＨＤＬ中のアポリポタンパク質Ｂの存在と、ＨＤＬ中のその非存在とを利用する。アポＢに対する抗体は、コレステロール酵素との反応に対して非ＨＤＬをブロックする。
（ｉｖ）クリアランス法（米国特許第６４７９２４９号明細書）では、非ＨＤＬは発色しない反応において最初に消費される。次に特定の洗剤が添加され、発色反応において酵素とＨＤＬとの反応が可能になる。
（ｖ）促進剤／洗剤法（米国特許第６８１８４１４号明細書）は、促進剤を用いてＨＤＬの非エステル化コレステロールを分解して反応を促進し、発色しないプロセスで、形成したＨ２Ｏ２を除去する。第２のステップでは、ＨＤＬコレステロールは、発色プロセスにおいてＨＤＬ特異的な洗剤を用いて分解される。

これらの方法はどれも、個々にまたは組み合わせの何れかで、本発明の方法においてＨＤＬ関連ＣＨの測定に適用され得る。

ＬＤＬ関連ＣＨは、ＬＤＬＣＨ画分を測定するために非ＬＤＬリポタンパク質の物理的分離を必要としない均一法により測定されている。このような方法には、以下のものが含まれる：
（ｉ）米国特許第５８８８８２７号明細には、Ｍｇ^２＋の存在下で界面活性剤およびシクロデキストリンにより非ＬＤＬをマスクし、ＰＥＧ修飾酵素による分解に対して抵抗性にする方法が記載されている。
（ｉｉ）米国特許第５９２５５３４号明細書には、ポリアニオンおよび界面活性剤を用いてサンプル中のＬＤＬを保護し、非ＬＤＬを酵素的に除去できるようにし、そこで脱保護薬の添加によりＬＤＬ関連ＣＨの酵素的な決定を可能にする方法が記載されている。
（ｉｉｉ）米国特許第６０５７１１８号明細書および米国特許第６１９４１６４号明細書には、ＬＤＬ関連ＣＨを決定する前に非ＬＤＬ関連ＣＨを酵素反応において選択的に除去するために特定の界面活性剤を用いる２つの異なる方法が記載されている。

近年、ＶＬＤＬ関連ＣＨを決定するための均一法が開発されている。これらには、以下のものが含まれる：
（ｉ）米国特許第６９８６９９８号明細には、ＨＤＬおよびＬＤＬをブロックするためにそれぞれアルブミンおよびカリックスアレーンを用いる方法が記載されており、クロモバクテリウム・ビスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｓｃｏｓｕｍ）からのＶＬＤＬ選択的酵素を用いる酵素反応においてＶＬＤＬの選択的な分解が可能になる。
（ｉｉ）米国特許第７２０８２８７号明細書には、酵素反応においてＶＬＤＬを選択的に分解するために特定の界面活性剤を用いる方法が記載されている。

ＩＤＬと関連したコレステロール（「ＶＬＤＬレムナント」または「レムナント様粒子」とも呼ばれる）は、一般に、超遠心分離法、高速液体クロマトグラフィまたは電気泳動法を用いて決定される。ＩＤＬ関連コレステロールの選択的酵素分解を促進するために特定の界面活性剤を使用する２つの均一法が最近開発された（米国特許第７２７２０４７号明細書および米国特許出願公開第２００７／０１６１０６８号明細書）。これらの方法はどれも、個々にまたは組み合わせの何れかで、本発明の方法においてＬＤＬ関連ＣＨの測定に適用され得る。

特定のリポタンパク質類のＴＧの測定は、様々なリポタンパク質類の様々な化学特性および物理特性を利用する方法によって実施することができる。これらの方法は、従って、コレステロールについて上記に記載した方法と類似しているが、本明細書において上記で記載された方法などによるＴＧの酵素検出を用いる。このような方法には、以下のものが含まれる：
（ｉ）米国特許第６８１１９９４号明細書には、選択的な界面活性剤およびポリエチレングリコール修飾酵素を用いて、特定のリポタンパク質以外のリポタンパク質をブロックすることが記載されている。
（ｉｉ）国際公開第２００４／０８７９４５号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００９／０２２６９４４号明細書には、選択的な界面活性剤を用いて、検出可能な生成物を生成しない反応において非ＬＤＬからＴＧを除去し、次にＬＤＬと関連したＴＧを検出可能な生成物に転換することが記載されている。
（ｉｉｉ）国際公開第２０００／０６１１２号パンフレットには、選択的な界面活性剤を用いて、検出可能な生成物を生成しない反応においてＶＬＤＬおよび／またはＩＤＬ以外のリポタンパク質からＴＧを除去し、次にＶＬＤＬおよび／またはＩＤＬと関連したＴＧを検出可能な生成物に転換することが記載されている。

これらの方法はどれも個々にまたは組み合わせの何れかで、本発明の方法において特定のリポタンパク質と関連したＴＧの測定に適用され得る。

本発明のアッセイ法において使用される検出方法は通常測光法によるものであり、間接的な生成物は一般に、測光法で検出可能であるように選択される（例えば、１つまたは複数の予め特定された波長におけるその吸光度、蛍光または化学発光による）。

シグナル発生のための非常に好ましい方法は過酸化水素によるものであり、過酸化水素は、発色物質の酵素的酸化のための基質としての役割を果たす。形成した過酸化水素と反応して検出可能な化学生成物を生じる１つまたは複数の酸化可能な発色試薬は当該技術分野において既知の任意の分子でよく、その酸化生成物は、紫外、可視、もしくは赤外分光法によって、または蛍光または発光によって測定することができる。

適切な発色性試薬の例はＴｒｉｎｄｅｒ試薬であり、これは、Ｈ_２Ｏ_２の存在下でカプラーと反応して着色された生成物を形成する。カプラーの好ましい例は、４－アミノアンチピリン（４ＡＡ）、３－メチル－２－ベンゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニル－４－アミノアニリン（ＮＣＰ－０４）、Ｎ－メチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－４－アミノアニリン（ＮＣＰ－０５）、Ｎ－メチル－Ｎ－（３－メトキシフェニル）－４－アミノアニリン（ＮＣＰ－０６）、Ｎ－メチル－Ｎ－（３－メトキシフェニル）－３－メトキシ－４－アミノアニリン（ＮＣＰ－０７）である。Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬の好ましい例は、６００ｎｍ以上の波長において比色測定で決定することができる生成物を形成するものである：Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルオキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシ－４－フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（４－スルホブチル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＤＢ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）。Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬ではない好ましい例は、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ－ＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）トリジン（ＳＡＴＢｌｕｅ）、Ｎ－（カルボキシメチル－アミノカルボニル）－４，４－ビス（ジメチルアミノ）－ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６７）である。色素原の濃度は、好ましくは０．０１～１０ｇ／Ｌであり、溶解度により制限される。

適切な蛍光基質の例は、ジヒドロカルセイン、ジヒドロエチジウム、ジヒドロフルオレセイン、ジヒドロフェノキサジン（Ａｍｐｌｅｘｒｅｄ、１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン）、およびジヒドロローダミンである。

適切な化学発光基質の例は、ルミノール（３－アミノトリフェニレン複合体）、ＬｕｍｉｇｅｎＰＳ－２およびＬｕｍｉｇｅｎＰＳ－ａｔｔｏである。

非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性イオン性界面活性剤は、着色した間接分析物を測定する前に細胞溶解の目的で使用され得る。測定に影響を与えない任意の適切な界面活性剤は、通常は０．０１～１０％の間であるが、好ましくは０．１～２％の間の濃度で使用され得る。

適切な界面活性剤の例は、アニオン性界面活性剤のアルキルベンゼン（ａｋｌｙｌｂｅｎｚｅｎｅ）スルホン酸アミン（Ｎｉｎａｔｅ４１１）、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム（ＡｅｒｏｓｏｌＯＴ）、Ｎ－オレイル－Ｎ－メチルタウリンナトリウム（ＧｅｒｏｐｏｎＴ－７７）、オレフィンスルホン酸ナトリウム（ＢｉｏｔｅｒｇｅＡＳ－４０）、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム（ＳｔａｎｄａｐｏｌＥＳ－１）、ならびに非イオン性界面活性剤のポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ１００およびＸ１１４）およびポリオキシエチレンラウリルアルコール（ＣｈｅｍａｌＬＡ－９）である。

細胞溶解が生じたところでは、明らかに、それに応じてヘモグロビンおよび他の細胞生成物が反応媒体中に放出されるであろう。従って、溶解から最大の利益を得るため、そしてバックグラウンドシグナルをできるだけ低減するために、このような場合には、これらの放出生成物によって検出が阻害されない生成物（二次分析物）を選択することが好ましい。従って、細胞溶解が使用される場合には、４５０ｎｍを超える、好ましくは５００ｎｍを超える、最も好ましくは６００ｎｍ以上（例えば、５００～１４００ｎｍまたは６００～１２００ｎｍ）の波長で検出可能な二次分析物が好ましい。

サンプル中の血液細胞の物理的分離は、全細胞のための特定の結合剤を通過させることを含む任意の適切な方法によって実施することができるが、最も一般的にはろ過によるであろう。反応ステップ（ｉ）の後に細胞を除去するためにろ過することは、元の血液サンプルのろ過よりもかなりの利点を有することに注目すべきである。特に、反応ステップは、指先穿刺からの少量の血液サンプルにより実行することができる。１つまたは複数の試薬が添加された後、反応混合物の容積ははるかに大きくなり、細胞の分離はデッドボリュームを大きくせずに行うことができる。また細胞はより低濃度であり、これにより、ろ過の際に細胞はフィルタ表面により均一に広がることができ、ろ過はより効果的になる。

本明細書に記載されるろ過は、従って、本発明の方法のステップｉｉ）において使用するために好ましい技術であり、対応するフィルタなどは本発明のキットと共に供給するために適切である。このようなろ過のいくつかの好ましい実施形態は以下に提供されており、そのうちのいずれかが個々にまたは任意の組み合わせで本発明の方法およびキットに適用され得る。

ろ過において、サンプルは細孔サイズが小さい多孔質界面（フィルタ、膜、またはふるい）を通過され、そこで細胞が捕捉される。多孔質界面は、固体（例えば、焼結ガラス）であっても、繊維状（例えば、セルロースまたはガラス製）であってもよく、流れは横方向に通り抜けても側方であってもよい。サンプルは、重力、遠心分離、毛管力、圧力または吸引によってフィルタを通過され得る。ろ過材料はさらに、血液細胞を捕獲する試薬（例えば、レクチン、抗体）を含有していてもよい。他の方法は静電引力を使用する。

横方向（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ）ろ過に適した材料は表２で与えられる。側方流動（ｌａｔｅｒａｌｆｌｏｗ）ろ過に適した材料は、Ｈｅｍａｓｅｐ（登録商標）Ｌ（ＰａｌｌＣｏｒｐ）ならびにＬＦ１およびＭＦ１（Ｗｈａｔｍａｎ）である。

酵素活性を計算するために、吸光度の読取りに基づいた酵素進行曲線の数学的処理はよく知られている。このような数学的手順であるアルゴリズムは、統合されたミカエリス－メンテン式に基づいている（ＬｏｎｄｏｎＪＷ（１９７７）ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ４８：１７１６－９）。しかしながら、このようなアルゴリズムの目的は、速度をゼロ時間まで外挿することによって酵素活性を決定することであり、これらは、生成物の終点の決定に適用することができない。

近年、１つのグループにより、固定時間および動的な測定の組み合わせを用いると、最後まで追跡するのではなく予測終点の９０～９５％に到達したときに、進行曲線の読取りを終了できることが報告された。これは、実質的に短縮されたアッセイ時間を可能にする（Ｋｖａｍ（２００９）ＰｏｉｎｔｏｆＣａｒｅ８：１６－２０）。

驚くことに本発明者らがここで見出したことは、測定可能な終点を持たない反応において、真の測定不能な終点の直接的な表示である架空の終点を推定することがまだ可能であるということである（図１）。これにより、定点測定ならびにキャリブレータおよび／または乾燥試薬に対するその要求に関する問題を回避することができるであろう。必要とされるのは、適切なアルゴリズムと、進行曲線の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％または少なくとも７０％）とである。

本発明の種々の態様において測定不能または架空の終点を予測するために使用されるアルゴリズムは反応の進行を適切に記述する任意の数学的な方程式でよく、このような進行がプロットされたときに形成される曲線を記述するために使用され得る。多数のこのような方程式は当業者に知られているであろう。通常、アルゴリズムは、一次速度式（例えば、Ｙ＝Ｙ_０ ^＊ｅ＾（－ｋＸ））またはロジスティック関数（例えば、Ｙ＝１／（１＋ｅ＾（－Ｘ）））に基づくものであろう（表３）。特定の状況に対してどのアルゴリズムが最も好ましいかは、測定が実施された方法（透過または吸光度）、反応条件（例えば、反応温度）、ならびに測定区間および他の因子などの多数の因子に依存するであろう。しかしながら、それぞれの適切な方程式から曲線を実験データに適合させることは日常的な事柄であり、従って、それぞれの場合に最も近い適合を決定するであろう。従って、異なる機器プラットフォームは異なる曲線適合アルゴリズムを選択し得るが、それぞれの場合の適切なアルゴリズムが迅速に確立されるであろう。多くの場合、２つ以上のアルゴリズムが容認できる結果を与えるであろう。

測定不能な終点を推定する場合、測定区間は、好ましくは最低限の併発反応が生じるように選択されなければならない。しかしながら、併発反応が存在できないことは、厳密な必要条件ではない。このような併発反応の影響は、測定後の分析において補正され得る。これは、サンプル中で少なくとも２つの分析物が測定され、前記分析物の少なくとも２つの間に既知の（絶対的または近似的な）関係が存在する場合に特に真実である。

例えば、ＨＤＬアッセイにおいて、推定される測定不能な終点は、（ｉ）測定区間、（ｉｉ）反応温度、（ｉｉｉ）ＨＤＬ／非ＨＤＬ比などの様々な因子に依存して、非ＨＤＬがブロッキング試薬によって一時的に非反応性にされた場合でも、付随する非ＨＤＬの転換によって影響され得る。脂質パネルアッセイでは、これは、ＨＤＬ、同時に測定される総コレステロール、およびＨＤＬキャリブレーション曲線と同じ方法で予め決定されて、試薬に供給される情報（例えば、バーコード）に含まれる非ＨＤＬのキャリブレーション曲線を伴う反復プロセスにおいて補正され得る。分析後の補正が実行され得る方法の一例は実施例６に記載される。

また、測定不能な終点を推定するために使用されるアルゴリズムにおいて発生する併発反応を考慮することも可能であり得る。例えば、反応条件は測定区間の間は併発反応が本質的に線形であるように策定され、線形項によってアルゴリズムで表現され得る（表３）。

本発明のアッセイ法の多数の利点の１つは、結果として得られるアッセイ時間の減少である。従って、ステップｉ）で試薬を添加してからステップｖ）における検出可能な反応生成物のモニタリングの最後までの時間は、１０分以下、より好ましくは８分以下、最も好ましくは５～７分の範囲であることが好ましい。

本発明のさらなる利点は、最小容量の血液で実行され得ることである。アッセイ法のステップｉ）の全血サンプルの容量はそのために４０μＬ以下、より好ましくは２０μＬ以下、最も好ましくは１０～１５μＬの範囲であることが好ましい。

本発明者らは、さらに、サンプルと「ブロッキング試薬」（前記第２の成分の反応を一時的に防止する役割を果たす試薬）との早期の接触によってさらなる反応時間が節約され得ることを立証した。このブロッキング試薬（その多くは本明細書に記載される）は通常、第２の成分と反応するまでにいくらかの時間（数分）がかかる。従って、方法のステップｉｖ）でまたはその前後にこのブロッキング試薬が添加される典型的なポイント・オブ・ケアアッセイは、このブロッキング試薬の反応を可能にするために数分間遅延し得る。

本発明者らはここで、細胞を著しく溶解させることなく、適切なブロッキング試薬を細胞含有血液サンプル（例えば、全血サンプル）に添加する（この試薬が細胞分離ステップの間にサンプルの第２の成分と反応していることができるように）ことが可能であることを立証した。明らかに、これは、ブロック化反応を待つ必要性を低減し、アッセイ時間を約３０秒、好ましくは約１分だけ減少させることができる。この実施形態では、ブロッキング試薬は、通常、ステップｉ）で添加される希釈混合物に含まれるであろう。あるいは、希釈後であって細胞分離の前かまたはその細胞分離プロセスの後のいずれかの時点で添加されてもよい。いずれの場合も、ブロッキング試薬をこれまでよりも早期に添加できれば、アッセイ時間を節約することができる。

多数分析物（パネル）アッセイでは、特定の反応のためにサンプルがいくつかの部分に分割される前にブロッキング試薬が添加される場合、ブロッキング試薬は種々の分析物の検出を妨害してはならないことが重要である。そして例えば分析物がＨＤＬ－ＣＨ、総ＣＨおよび総ＴＧである場合、試薬が非ＨＤＬ－ＣＨ（第２の成分）のブロック化を起こし、従ってＨＤＬ－ＣＨの特定の反応を可能にするので、ブロッキング試薬は妨害を起こさずにステップｉ）～ｉｉｉ）のいずれかで添加され得る。総ＣＨおよび総ＴＧに関しては、ブロッキング試薬が存在し得るが、これらの特定の反応のための試薬混合物は、総ＣＨまたは総ＴＧをブロックにもかかわらず放出するために適切な界面活性剤を含有することしか必要としない。このような界面活性剤は当業者により識別され、容易に選択されるであろう。従って、総ＣＨまたは総ＴＧの必要性の妨害は起こらない。

本発明のキットでは、第１の試薬混合物は好ましくはＨＤＬ反応の第１の試薬混合物と一緒に、単一の試薬混合物として配合される。これによりステップ数が減少し、従って、アッセイ時間が減少し、さらにアッセイ装置における試薬の貯蔵および取扱い要求が減少し、あまり高性能でない自動分析器と共に本方法を実施することが可能になる。

キットはさらに、ヘマトクリットの決定を可能にする細胞溶解を引き起こす溶解剤を含有していてもよい。

本発明は、以下の非限定的な実施例および添付図面によってこれからさらに説明されるであろう。

非ＨＤＬと関連したコレステロールの存在下で推定されるＨＤＬ関連コレステロールの測定不能な終点が、非ＨＤＬと関連したコレステロールが存在しない同じ量のＨＤＬ関連コレステロールの測定可能な終点と一致することを実証する。ＲｏｃｈｅのＴＧアッセイにおける終点、定点および推定終点測定を比較し、定点測定は試薬貯蔵時間に強く依存するが、終点および推定終点測定は依存しないことを示す。市販のＨＤＬ試薬を用いるＨＤＬの測定において終点の推定の有用性を実証する。推定される終点は、決定されたＨＤＬレベルと非常によく相関した。Ａｆｉｎｉｏｎポイント・オブ・ケア機器において推定終点法で得られるＨＤＬレベルと、臨床検査室の方法で得られるものとを比較する。図は、「一次」および「ロジスティック」適合アルゴリズムのそれぞれを用いて、Ａｆｉｎｉｏｎ方法および検査室方法で決定されたＨＤＬレベルの比較を与える。Ａｆｉｎｉｏｎポイント・オブ・ケア機器において推定終点法により得られたＨＤＬレベルを、商業的ポイント・オブ・ケア方法より得られたレベルと比較する。図は、Ａｆｉｎｉｏｎ方法および同等の商業的ポイント・オブ・ケア方法によって決定されるＨＤＬレベルの比較を示す。適合は、本発明の実施形態の場合（図４）よりも著しく悪い。ＨＤＬアッセイにおいて必要とされる非ＨＤＬブロッキング緩衝液が、全般的な希釈緩衝液として使用され得ることを実証する。希釈緩衝液としてブロッキング緩衝液を用いてＡｆｉｎｉｏｎポイント・オブ・ケア機器において得られるＴＧレベルは、臨床検査室方法によって得られるレベルと比較される。Ａｆｉｎｉｏｎポイント・オブ・ケア機器において推定終点法によって得られた非ＨＤＬレベルを、ＣＲＭＬＮ認定検査室によって得られたレベルと比較する。Ａｆｉｎｉｏｎポイント・オブ・ケア分析器において決定された全血および血漿脂質プロファイルを比較する。

実施例１
非ＨＤＬと関連したコレステロールの存在下におけるＨＤＬ関連コレステロールの架空の最終測定値の推定
ＣｏｂａｓＭｉｒａｐｌｕｓ機器（ＡＢＸＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）において、ＷａｋｏＨＤＬ－ＣＬタイプの試薬およびプロトコル（表４）を使用して、６６ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、２５５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬおよび３００ｍｇ／ｄＬのＴＧを含有するサンプルを分析した。吸光度を６００ｎｍでモニターした（図１、黒丸）。６４ｍｇ／ｄＬのＨＤＬを含有するが、有意な量のＬＤＬを含有しないキャリブレータも同じ方法で分析した（図１、白丸）。サンプルの進行曲線は最初の２００～３００秒間はほぼ同一であったが、その後、サンプル中の非ＨＤＬのコレステロールが脱ブロック化されて転換されるにつれて発散した。他の非ＨＤＬと関連したコレステロールの存在下におけるＨＤＬ関連コレステロールの転換は、従って、測定可能な終点を持たない。唯一の測定可能な終点は、ＨＤＬ＋非ＨＤＬ中に存在するコレステロール（すなわち、総コレステロール）のものであろう。しかしながら、サンプルの進行曲線の最初の２００秒間（太線）から、一次アルゴリズム
Ｙ＝Ｙｍａｘ（１－ｅ^{（－Ｋ（Ｘ－Ｘ０））}）
を用いてＨＤＬ関連コレステロールの架空の終点が計算され得る（点線）。これは、ほとんど同じ濃度（６６ｍｇ／ｄＬに対して６４ｍｇ／ｄＬ）のＨＤＬのみを含有するキャリブレータの真の終点と一致する。酵素反応の動態学に従うためのその他の周知のアルゴリズムも同様にして使用され得る。

実施例２
ＴＧアッセイにおける終点、定点および推定終点測定の比較
ＲｏｃｈｅＴＧ試薬（表５）を２５℃で貯蔵し、様々な時点でサンプルを取り出し、１８６ｍｇ／ｄＬのトリグリセリドを含有する血漿サンプルを測定するために使用した。血漿サンプルを一定分量に分けて－４０℃で凍結して貯蔵し、測定の前に解凍した。ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓＭｕｌｔｉｓｃａｎＲＣプレートリーダーにおいて、測定を周囲温度（２０～２２℃）で実施した。反応が完了するまで進行曲線を追跡し、終点を決定した。さらに、４パラメータのロジスティック関数を用いて、進行曲線の最初の３００秒に基づいて終点を推定した。得られた推定終点を、真の終点、推定のために使用される時間３００秒間の最後の吸光度と比較した。図２に示されるように、推定終点は真の終点に従ったが、定点測定は、わずか５か月の貯蔵後に、真の終点との比較においてすでに著しく低下した。従って、終点推定および定点法はいずれもわずか３００秒間の試験区間を可能にするが、定点測定は、試薬の任意の合理的な寿命を通してサンプルに正確な値を提供するためにキャリブレータの包含を必要とするであろう。対照的に、推定終点の計算は、キャリブレータを包含することなく精度を保持し得る。

実施例３
ＲｏｃｈｅＨＤＬアッセイの終点推定
ＡＢＸｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの「ＣｏｂａｓＭｉｒａｐｌｕｓ」機器において、ＲｏｃｈｅからのＨＤＬＣ３試薬（表６）を用いて、８つの異なる血清サンプルのＨＤＬレベルを決定した。進行曲線の最初の１００秒を使用し、４パラメータのロジスティック関数を用いて架空の終点を推定した。図３に示されるように、推定終点（吸光度単位）は、決定されたＨＤＬレベルと非常によく相関した。

実施例４
ＡｆｉｎｉｏｎＨＤＬアッセイ（ポイント・オブ・ケア）－大型臨床機器アッセイ法との比較
ＳｉｅｍｅｎｓからのＡｄｖｉａ機器および試薬、基準方法において４９の血清サンプルのＨＤＬレベルを決定した。Ａｆｉｎｉｏｎポイント・オブ・ケア装置において、ＷａｋｏＨＤＬ－ＣＬ－タイプの試薬（表４）を用いる推定終点法によってもサンプルを測定した。進行曲線を１６０秒間モニターし、２つの異なるアルゴリズム：一次方程式（表３、１型）およびロジスティック方程式（表３、ｌｏｇ変換型）を用いて終点を推定した。ＡＢＸＰｅｎｔｒａからのＨＤＬダイレクトＣＰ試薬（表７）を用いてＣｏｂａｓＭｉｒａｐｌｕｓにおいてそのＨＤＬレベルが決定されたＴｒｉｎａＢｉｏｎｏｓｔｉｃｓからのキャリブレータを用いる別の実験でＡｆｉｎｉｏｎにおいて確立されたキャリブレーション曲線を用いて、推定終点を濃度に変換した。図４は、４４の血清サンプルについて、Ａｆｉｎｉｏｎ方法と基準方法（一次予測－黒丸、ロジスティック適合－白丸）との相関関係を示す。Ａｆｉｎｉｏｎ方法により測定される平均ＨＤＬレベルは、一次曲線およびロジスティック曲線の適合をそれぞれ用いて、基準方法と比べて０．４％（０．４ｍｇ／ｄＬ）および１．１％（０．６ｍｇ／ｄＬ）低く、傾斜因子は０．９６および１．０６であった。

実施例５
ＡｆｉｎｉｏｎＨＤＬアッセイ－ポイント・オブ・ケアアッセイ法との比較
Ｃｈｏｌｅｓｔｅｃｈからのポイント・オブ・ケアアッセイシステム、ＬＤＸシステム脂質プロファイルＧｌｕにおいて、４２の血清サンプルのＨＤＬレベルを決定した。また、実施例４に本質的に記載されるようにＡｆｉｎｉｏｎＨＤＬ方法によってもサンプルを測定し、ＨＤＬ値を計算した。図５は、４２の血清サンプルについて、ＡｆｉｎｉｏｎおよびＬＤＸ方法の相関関係を示す。ＬＤＸ方法では、１５ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ値は＜１５ｍｇ／ｄＬで報告され、１００ｍｇ／ｄＬを超える値は＞１００ｍｇ／ｄＬで報告されるので、直線回帰（ｎ＝１０）においてこれらの値（白丸）を省いた。Ａｆｉｎｉｏｎによって測定される平均ＨＤＬレベルは、ＬＤＸ法と比べて１％（０．５ｍｇ／ｄＬ）高く、傾斜因子は１．０３であった。

実施例６
非ＨＤＬの平行転換の影響に対する多成分アッセイ法におけるＨＤＬの推定終点の補正
サンプル中の総ＣＨの同時測定に基づいた分析後の計算によって、同時に転換された非ＨＤＬの影響に対してＨＤＬアッセイを補正する可能性を例示するために、以下の実験を実施した：
（ｉ）ＣｏｂａｓＭｉｒａｐｌｕｓ機器およびＷａｋｏＨＤＬ－ＣＬタイプの試薬およびプロトコル（表４）を用いて、純粋なＨＤＬ（ＷａｋｏＨｉｇｈＵｎｉｔＨＤＬ－Ｃ）の調製物からＨＤＬのキャリブレーション曲線を作成した。キャリブレーション曲線の作成において、進行曲線の最初の３００秒からの推定終点の吸光度、および一次関数を用いる曲線の適合を使用した：
ＨＤＬ＝１．２＋１３６．３ＡＢＳ（１）
（ｉｉ）２つの異なる濃度のＨＤＬおよび４つの異なる濃度のＬＤＬの純粋なＨＤＬおよび純粋なＬＤＬの混合物（ＷａｋｏＨｉｇｈＵｎｉｔＬＤＬ－Ｃ）から、非ＨＤＬの平行転換によるＨＤＬ測定値への影響に対するキャリブレーション曲線を作成した。測定されるＨＤＬの増大を非ＨＤＬ濃度の関数としてプロットした。増大は非ＨＤＬ濃度と指数関数的に相関した。
ＨＤＬの増大＝２．４３３ｅｘｐ＾０．００８４９９非ＨＤＬ（２）

非ＨＤＬの濃度は、ＣＨ（測定された総コレステロール）とＨＤＬの差から計算した：
非ＨＤＬ＝ＣＨ－ＨＤＬ（３）

１１１ｍｇ／ｄＬのＨＤＬを含有する血清サンプルを、２つの異なる濃度で２つの異なる量の純粋なＬＤＬと混合した。ＣｏｂａｓＭｉｒａｐｌｕｓ機器において、ＡＢＸＰｅｎｔｒａコレステロールＣＰおよびＷａｋｏＨＤＬ－ＣＬタイプの試薬およびプロトコルをそれぞれ用いてＣＨおよびＨＤＬレベルを測定した。

測定値は平均して４８％過大に推定された。上記の方程式（１）～（３）を用いて反復して補正をした後、平均の過大推定は５％に低減された（表８）。

実施例７－ブロッキング試薬による細胞溶解の除去：
０、６０、９０または１２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌが添加された４００μＬのＨＤＬ－ＣＬタイプのＲ１（Ｗａｋｏ）に、２μＬの全血を添加した。混合した後、サンプルの吸光度を６６０ｎｍで測定した。この波長において、ヘモグロビンからの吸収は存在しないが、無傷の細胞からの強い妨害（光の散乱による）があった。ＮａＣｌが添加されないＲ１はほとんど完全な溶解を引き起こしたが、１２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌが添加されたＲ１はほんのわずかな細胞溶解を生じた。

添加したＮａＣｌ６６０ｎｍにおける吸収溶血
（ｍｍｏｌ／Ｌ）（ＡＵ）（％）
００．０６２１００
６０１．３０６２３
９０１．５６９７
１２０１．６１５４

理解できるように、細胞溶解の５％未満までの低下は、試薬Ｒ１におけるイオン強度の適切な選択によって達成可能である。

実施例８－非溶解性希釈緩衝液内に含まれるブロッキング試薬の使用：
ＨＤＬ試薬Ｒ１を全般的な希釈緩衝液として使用することのトリグリセリドの測定に対する効果
Ａｆｉｎｉｏｎポイント・オブ・ケア機器において、全般的な希釈緩衝液としてのＨＤＬ試薬Ｒ１（表）およびＲｏｃｈｅＴＧ試薬（表５）を用いて４６の血清サンプのＴＧレベルを決定した。

１５μＬのサンプルを２８０μＬのＨＤＬ試薬Ｒ１中に希釈し、５８μＬを１００μＬのＴＧ試薬に移した。反応の終点を決定し、ＣＲＭＬＮ検査室（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＵＳＡ）において前もって定量化されたキャリブレータを用いて別の実験でＡｆｉｎｉｏｎにおいて確立されたキャリブレーション曲線を用いて、濃度に変換した。平行実験において、Ａｄｖｉａ機器およびＳｉｅｍｅｎｓ試薬を用いて、同じサンプルを別の検査室（ＦｕｅｒｓｔＭｅｄｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）で決定した。サンプルを２つの方法の間で極めて十分に比較し、ＡｆｉｎｉｏｎＴＧの結果に対して、ＨＤＬＲ１希釈緩衝液からの有意な妨害の表れはなかった（図６）。

表希釈緩衝液
希釈緩衝液Ｇｏｏｄの緩衝液、ｐＨ７．０
ＮａＣｌ１７５ｍｍｏｌ／Ｌ
４－アミノアンチピリン０．９ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ２４００Ｕ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ２７００Ｕ／Ｌ
抗ヒトアポ－β－リポタンパク質抗体

実施例９－等張性ＨＤＬＲ１中での全血の希釈および本質的に無細胞のろ液を得るためのろ過
ウェル番号２の底にフィルタパッドを置くことによってろ過能力が備えられたＡｆｉｎｉｏｎ機器において、全血のための全般的な希釈およびろ過緩衝液としてのＨＤＬＲ１（非ＨＤＬブロッキング）試薬の適用性を調査した。希釈／ろ過緩衝液は、ＮａＣｌを１７５ｍＭまで添加することによって非溶解性にされたＨＤＬ－ＣＬタイプの試薬１（Ｒ１）（表４）であった。

全血を毛管力により１５μＬのサンプルデバイス内に吸い込み、機器内に置いたマルチウェルカートリッジに挿入した。サンプルを空にし、２５０μＬの修飾ＨＤＬＲ１中に混合し、全容積を、フィルタパッドを含有するウェルに移した。次に、マルチウェルカートリッジのメンブレンチューブをフィルタパッド上にしっかりと配置した。メンブレンチューブの開放端部に周囲圧力よりも低い圧力をかけると希釈全血はフィルタパッド内に流れ込み、血液細胞がフィルタ内に捕獲される一方、希釈血漿はフィルタを通過して、メンブレンチューブに流れ込む。圧力が上昇し始めたら（空気の吸引）、メンブレンチューブをフィルタから取り出し、空のウェル内に下ろし、上記の周囲圧力をかけることによりろ過された血漿を放出させた。血液の汚染を測定した。ＮａＮＯ_２を用いて汚染ヘモグロビンをメトヘモグロビンに転換し、４１０ｎｍの波長で吸光度を測定した。既知の濃度のメトヘモグロビンから作成したキャリブレーション曲線からの内挿によって吸光度を％Ｈｂに変換した。表９で与えられる結果は、Ｒ１試薬に希釈することにより生じる溶血、ろ過により生じる溶血、およびフィルタパッドの捕獲されなかった血液細胞による汚染の計算結果である。

実施例１０
ＨＤＬと関連したコレステロールの存在下における非ＨＤＬ関連コレステロールの架空の最終測定値の推定。認定検査室の方法との比較。
ＨＤＬを保護し、全ての他のリポタンパク質（非ＨＤＬ）と関連したコレステロールが検出可能な生成物に転換されるＨＤＬ特異性ブロックポリマー（ＨＤＬ－Ｘ、Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）を使用することにより、非ＨＤＬを直接決定するための方法を構築した。ＨＤＬ特異性ブロックポリマーの原料として、ＷａｋｏＨＤＬ－ＣＬ－Ｍ／２－ＰＭ試薬（Ｗａｋｏ，日本）からの試薬１を使用した。試薬１の正確な組成は入手できないが、Ｇｏｏｄの緩衝液ｐＨ７．０、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ＨＭＭＰＳ、カタラーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼおよびＨＤＬブロックポリマーを含有することが開示されている。試薬１にペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄｉｓｅ）（６０００Ｕ／Ｌ）、４－アミノアンチピリン（ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｕｒｉｎ）（０．８ｍｍｏｌ／Ｌ）およびアジ化ナトリウム（０．０２５％）を補充することによって、ＨＤＬを一時的に保護しながら非ＨＤＬを検出可能な生成物に転換する試薬を配合した。

２μＬのキャリブレータまたは血漿サンプルを１５０μＬの補充された試薬１と混合した。反応を３７Ｃで実施し、ＣｏｂａｓＭｉｒａｐｌｕｓ機器を用いて６００ｎｍでモニターした。４パラメータのロジスティック関数（表３）を用いて進行曲線の最初の３００秒から終点の吸光度を推定した。

キャリブレータおよびサンプルは、ＣＲＭＬＮ検査室（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＵＳＡ）において、ＣＨ、ＨＤＬおよびＴＧに関して前もって定量化した。これらの値から、
非ＨＤＬ＝ＣＨ－ＨＤＬ
に従って非ＨＤＬ値を計算した。

本発明の方法によって決定された９つの血清サンプルの非ＨＤＬ値は、ＣＲＭＬＮ値から計算された非ＨＤＬ値と非常によく相関した（図７）。

実施例１１
Ａｆｉｎｉｏｎポイント・オブ・ケア分析器において決定された全血および血漿の脂質プロファイル
６０人の健康なボランティアから入手した１５μＬの新しい全血において、Ａｆｉｎｉｏｎ分析器を用いてＣＨ、ＴＧおよびＨＤＬの血漿レベルを決定した。これらのデータから、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄの式、ＬＤＬ＝ＣＨ－（ＨＤＬ＋ＴＧ／５）を用いて、ＬＤＬレベルをｍｇ／ｄＬ単位で計算した。同じサンプルの血漿画分も入手し（１０００ｇで１０分間の遠心分離による）、同じ分析物についてＡｆｉｎｉｏｎにおいて測定した。使用した試薬は、表４（ＨＤＬ）、表５（ＴＧ）および表１０（ＣＨ）に記載されるものであった。ＴＧおよびＣＨについて反応の終点を決定した。ＨＤＬ反応の測定不能な終点は、進行曲線の最初の１００秒および一次方程式を用いる曲線適合（表３）を用いて推定した。実施例９に記載されるように全血ヘマトクリットを決定し、各特定の全血サンプルについて得られたヘマトクリット値を用いて各結果を（１－ヘマトクリット）で除することによって、全血結果を血漿結果に変換した。図８は、６０のサンプルについて、全血および血漿において得られた血漿レベル間の相関関係を示す。

さらなる実施形態は以下のとおりである。
１．血液細胞含有サンプルの血漿部分において少なくとも１つの分析物の濃度を測定するための酵素的方法であって、前記サンプルが第１の成分および第２の成分を含有し、前記第２の成分が存在しかつブロック化されていない場合に、前記第２の成分が前記第１の成分の測定を妨害し、
ｉ）前記血液細胞含有サンプルを、前記サンプルを希釈する試薬混合物と接触させるステップと、
ｉｉ）前記血液細胞を実質的に除去して、実質的に無細胞のサンプルを提供するステップと、
ｉｉｉ）前記サンプルを、前記第２の成分の反応を一時的に防止する役割を果たす少なくとも１つの試薬と接触させ、それにより、ブロック化された第２の成分を生成するステップと、
ｉｖ）前記サンプルを、前記少なくとも１つの分析物の各分析物の少なくとも１つの構成物のための少なくとも１つの転換酵素を含む少なくとも１つの試薬混合物と接触させ、それにより、前記分析物または各分析物の構成物の選択的反応により、検出可能な反応生成物を直接または間接的に生成させるステップであって、前記分析物または前記分析物の１つが前記第１の成分であるステップと、
ｖ）１つまたは複数の前記検出可能な反応生成物をモニターするステップと、
ｖｉ）１つまたは複数の前記検出可能な生成物の量および／または１つまたは複数の前記検出可能な生成物の形成速度と、前記血液サンプル中の前記少なくとも１つの分析物またはそのそれぞれの濃度とを関連付けるステップであって、測定不能な（架空の）終点を推定することによって、少なくとも前記第１の成分の濃度が対応する検出可能な反応生成物と関連付けられるステップと
を含み、ステップｉｉｉ）が、ステップｉｖ）に至るまで（ステップｉｖ）を含む）の任意の段階で、ただしステップｖ）もしくはｖｉ）よりも前に実行されることが可能であり、ステップｉｉｉ）の前記試薬が前記サンプルに別箇に適用されてもよいし、またはステップｉ）もしくはｉｖ）の少なくとも１つの試薬混合物中に含まれていてもよい、酵素的方法。
２．前記第１の成分および前記第２の成分が、共通の脂質構成物を有するが異なるタンパク質構成物を有するリポタンパク質成分である、実施形態１に記載の方法。
３．前記少なくとも１つの構成物のための転換酵素が、コレステロール、トリグリセリドまたはリン脂質のための転換酵素などの、前記少なくとも１つの分析物の脂質構成物のための転換酵素である、実施形態１または２に記載の方法。
４．前記少なくとも１つの分析物が、完全に、および／またはＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよび非ＨＤＬからなる群からの特定のリポタンパク質と関連して、コレステロール、トリグリセリドまたはリン脂質の群からのものである、実施形態１～３のいずれか一つに記載の方法。
５．前記第１の成分が、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよび非ＨＤＬから選択される少なくとも１つのリポタンパク質構成物と関連した、コレステロール、トリグリセリドまたはリン脂質から選択される脂質構成物（例えば、ＨＤＬと関連したコレステロールなど）を有する１つの分析物である、実施形態４に記載の方法。
６．前記第１の成分が非ＨＤＬコレステロールである、実施形態４に記載の方法。
７．前記血液細胞含有サンプルが全血サンプルである、実施形態１～６のいずれか一つに記載の方法。
８．ステップｉ）およびｉｉｉ）がステップｉｉ）の前に実行される、実施形態１～７のいずれか一つに記載の方法。
９．ステップｉ）およびｉｉｉ）が同時に実行される、実施形態８に記載の方法。
１０．ステップｉ）において前記サンプルを希釈する前記試薬混合物が、ステップｉｉｉ）において前記第２の成分の反応を一時的に防止する役割を果たす前記少なくとも１つの試薬を含む、実施形態９に記載の方法。
１１．血液細胞含有サンプルの血漿部分において少なくとも３つの異なる分析物の濃度を測定するための酵素的方法であって、前記サンプルが第１の成分および第２の成分を含有し、前記第２の成分が存在しかつブロック化されていない場合に、前記第２の成分が前記第１の成分の測定を妨害し、
ｉ）前記血液細胞含有サンプルを、前記サンプルを希釈する試薬混合物と接触させるステップと、
ｉｉ）前記血液細胞を実質的に除去して、実質的に無細胞のサンプルを提供するステップと、
ｉｉｉ）前記サンプルを、前記第２の成分の反応を一時的に防止する役割を果たす少なくとも１つの試薬と接触させ、それにより、ブロック化された第２の成分を生成するステップと、
ｉｖ）前記無細胞サンプルを少なくとも３つの部分に分割し、各部分を、脂質転換酵素を含む少なくとも３つの試薬混合物の少なくとも１つと接触させ、それにより、少なくとも３つの異なる分析物のそれぞれの選択的反応により、それぞれの検出可能な反応生成物を（直接または間接的に）生成させるステップであって、前記分析物の１つが前記第１の成分であるステップと、
ｖ）前記検出可能な反応生成物をモニターするステップと、
ｖｉ）前記検出可能な生成物の量および／または前記検出可能な生成物の形成（または消費）速度と、前記血液サンプル中の前記少なくとも３つの異なる分析物の濃度とを関連付けるステップであって、測定不能な（架空の）終点を推定することによって、少なくとも前記第１の成分の濃度が対応する検出可能な反応生成物と関連付けられるステップと
を含み、ステップｉｉｉ）が、ステップｉｖ）に至るまで（ステップｉｖ）を含む）の任意の段階で、ただしステップｖ）もしくはｖｉ）よりも前に実行されることが可能であり、ステップｉｉｉ）の前記試薬が前記サンプルに別箇に適用されてもよいし、またはステップｉ）もしくはｉｖ）の少なくとも１つの試薬混合物中に含まれていてもよい、酵素的方法を含む、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．前記方法が、前記血液細胞含有サンプルの血漿部分において、前記第１の成分および第１の分析物としての少なくとも１つの特定のリポタンパク質と関連したコレステロールの濃度と、第２の分析物としての総コレステロールの濃度と、第３の分析物としての総トリグリセリドの濃度とを含む脂質プロファイルを決定するステップを含む、実施形態１～１１のいずれか一つに記載の方法。
１３．ステップｉｖ）が、
ｉｖ）前記無細胞サンプルまたはその一部を、脂質転換酵素を含む少なくとも１つの試薬混合物と接触させるステップであって、前記少なくとも１つの試薬混合物が前記ブロック化された第２の成分の存在下で反応して、特定のリポタンパク質または特定のリポタンパク質群（例えば、ＨＤＬまたは非ＨＤＬ）と関連したコレステロールの少なくとも部分的に選択的な反応を引き起こすステップ
を含む、実施形態１２に記載の方法。
１４．ステップｉｖ）が、
ｉｖ）前記無細胞サンプルの第１の部分を、脂質転換酵素を含む少なくとも１つの試薬混合物と接触させるステップであって、前記少なくとも１つの反応混合物が前記ブロック化された第２の成分の存在下で反応して、特定のリポタンパク質または特定のリポタンパク質群（例えば、ＨＤＬまたは非ＨＤＬ）と関連したコレステロールの少なくとも部分的に選択的な反応を引き起こすステップと、
前記無細胞サンプルの第２の部分を、脂質転換酵素を含む少なくとも１つの試薬混合物と接触させるステップであって、前記少なくとも１つの反応混合物が前記第２の部分内の総コレステロールと反応するステップと、
前記無細胞サンプルの第３の部分を、脂質転換酵素を含む少なくとも１つの試薬混合物と接触させるステップであって、前記少なくとも１つの反応混合物が前記第３の部分内の総トリグリセリドと反応するステップと、
前記第１の成分（例えば、ＨＤＬコレステロールなど）、総コレステロールおよび総トリグリセリドのそれぞれに対応する検出可能な反応生成物を付随して生成するステップと
を含む、実施形態１２または１３に記載の方法。
１５．前記第１の成分が、脂質構成物（例えば、コレステロール）およびタンパク質構成物を有するリポタンパク質であり、かつ前記第２の成分が、前記第１の成分の前記タンパク質構成物以外のタンパク質と関連した同じ脂質構成物を含む、実施形態１～１４のいずれか一つに記載の方法。
１６．ステップｉｉｉ）における前記ブロック化された第２の成分の存在または生成が、ステップｉｖ）における前記分析物または分析物の構成物のいずれかの反応を妨害しない、実施形態１～１５のいずれか一つに記載の方法。
１７．前記検出可能な生成物が測光法で検出可能である、実施形態１～１６のいずれか一つに記載の方法。
１８．前記血液サンプルの希釈が少なくとも１０倍である、実施形態１～１７のいずれか一つに記載の方法。
１９．前記実質的に無細胞のサンプルが５％未満の血液細胞を含有する、実施形態１～１８のいずれか一つに記載の方法。
２０．ステップｉｉ）がろ過によって実行される、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の方法。
２１．ステップｉｉ）が、５％以下の血液細胞の溶解を引き起こすことなどによって、細胞溶解を実質的に引き起こさずに実行される、実施形態１～２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．ステップｉｉ）が、前記成分のいずれかを５％以下だけ低減することなどによって、血漿脂質成分に実質的に影響を与えることなく実行される、実施形態１～２１のいずれか一つに記載の方法。
２３．前記第２の成分の反応を一時的に防止する役割を果たす前記少なくとも１つの試薬が、前記第１の成分よりも前記第２の成分に特異的な少なくとも１つの抗体を含む、実施形態１～２２のいずれか一つに記載の方法。
２４．前記第２の成分の反応を一時的に防止する役割を果たす前記少なくとも１つの試薬が、前記第２の成分のリポタンパク質構成物に特異的な少なくとも１つの抗体などの少なくとも１つの特定の結合剤を含む、実施形態１～２３のいずれか一つに記載の方法。
２５．２０μＬ以下の血液を必要とする、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の方法。
２６．適切なアルゴリズムを使用して、少なくとも前記第１の成分の測定不能な終点が決定される、実施形態１～２５のいずれか一つに記載の方法。
２７．前記アルゴリズムが一次速度式またはロジスティック関数である、実施形態２６に記載の方法。
２８．前記ブロック化された第２の成分の実際のまたは潜在的な脱ブロック化のために、前記測定不能な終点を測定することができない、実施形態１～２７のいずれか一つに記載の方法。
２９．複数の分析物を測定するための、実施形態１～２８のいずれか一つに記載の方法。
３０．終点を推定することによって、前記各分析物の濃度が対応する検出可能な生成物の形成または消費と関連付けられ、前記終点の少なくとも１つが測定不能な（架空の）終点である、実施形態２９に記載の方法。
３１．血液細胞含有サンプルの血漿部分において少なくとも３つの異なる分析物の濃度を決定する際に使用するためのキットであって、前記サンプルが第１の成分および第２の成分を含有し、前記第２の成分が存在しかつブロック化されていない場合に、前記第２の成分が前記第１の成分の測定を妨害し、
ａ）前記サンプルを希釈するように配合された第１の試薬混合物と、
ｂ）細胞分離ユニットと、
ｃ）（ブロック）前記第２の成分の反応を一時的および／または競合的に防止する役割を果たす第２の試薬であって、それにより、ブロック化された第２の成分を生成する第２の試薬と、
ｄ）前記少なくとも３つの異なる分析物の選択的転換を引き起こし、それにより、各分析物に対応する検出可能な間接的生成物を生成するように配合された少なくとも３つのさらなる試薬混合物と
を含むキット。
３２．前記試薬ｃ）が、前記試薬混合物ａ）中に含まれる、実施形態３１に記載のキット。
３３．前記少なくとも３つの分析物が、総コレステロール、総トリグリセリド、およびＨＤＬ関連コレステロールを含む、実施形態３１または３２に記載のキット。

Claims

非ＨＤＬ脂質およびＨＤＬ脂質を含有するサンプルにおいて少なくとも３つの異なる分析物の濃度を決定する際に使用するためのキットであって、
前記少なくとも３つの異なる分析物が、総コレステロール、総トリグリセリドおよび非ＨＤＬコレステロールを含み、
前記ＨＤＬ脂質が存在しかつブロック化されていない場合に、前記ＨＤＬ脂質が前記非ＨＤＬ脂質の測定を妨害し、
ａ）前記サンプルを希釈するように配合された第１の試薬混合物であって、ｐＨ７．０の希釈緩衝液を含む第１の試薬混合物と、
ｂ）細胞分離ユニットと、
ｃ）前記ＨＤＬ脂質の反応を一時的および／または競合的に防止する役割を果たす第２の試薬であって、それにより、ブロック化されたＨＤＬ脂質を生成するＨＤＬ特異性ブロックポリマーである第２の試薬と、
ｄ）前記少なくとも３つの異なる分析物の選択的転換を引き起こし、それにより、各分析物に対応する検出可能な生成物を生成するように配合された少なくとも３つのさらなる試薬混合物と
を含み、
前記少なくとも３つのさらなる試薬混合物が、脂質転換酵素を含む、キット。
前記第１の試薬混合物が、前記第２の試薬を含む、請求項１に記載のキット。
前記サンプルが全血である、請求項１または２に記載のキット。
前記サンプルが、血液細胞含有サンプルの血漿部分である、請求項１または２に記載のキット。
前記第２の試薬が、前記ＨＤＬ脂質を少なくとも６０秒間ブロック化する、請求項１～４のいずれか一項に記載のキット。
前記少なくとも３つの異なる分析物のうちの１つが、非ＨＤＬトリグリセリドである、請求項１～５のいずれか一項に記載のキット。
前記少なくとも３つの異なる分析物のうちの１つが、非ＨＤＬリン脂質である、請求項１～６のいずれか一項に記載のキット。
前記少なくとも３つの異なる分析物のうちの１つが、非ＨＤＬコレステロールである、請求項１～７のいずれか一項に記載のキット。
前記検出可能な生成物が、測光法で検出可能である、請求項１～８のいずれか一項に記載のキット。
溶解剤を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のキット。