JP4456715B2 - レムナント様リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査において動脈硬化症等の危険因子とされるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法と測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査において、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として負の因子、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として正の因子とされており、臨床検査の分野で頻繁に測定されている。近年、脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質中のコレステロールが動脈硬化症の危険因子としてＬＤＬ中のコレステロールより密接な指標となることが示されてきている。該リポ蛋白質としては、例えばレムナント様リポ蛋白質があげられており、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定に対しては厚生省により保険点数がつけられている。
【０００３】
レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法としては、抗アポＢ−１００抗体と抗アポＡ１抗体を用いて試料からレムナント様リポ蛋白質を分離し、分離したレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを測定する方法が知られている［動脈硬化，25(9,10), 371（1998）］。しかしながら本方法は抗体を使用したアフィニティークロマトグラフィー方法を使用するもので、試料の分離操作を必要とする等操作が煩雑で時間がかかる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、試料の分離操作が不要なレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを簡便に感度良く測定する方法および測定試薬を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決する手段】
本発明者らは、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、ＣＭレムナント、ＶＬＤＬレムナント、中密度リポ蛋白質（ＩＤＬ）レムナント等のリポ蛋白質を含有する生体試料中のコレステロールをコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼを使用して測定するに際し、リン脂質を加水分解する酵素を作用させることにより、ＣＭレムナント、ＶＬＤＬレムナントおよびＩＤＬレムナント等のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを特異的に測定することができることを見いだし本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち本発明は、下記（１）〜（１８）に関する。
【０００７】
（１） 生体試料にコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させ、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを測定することを特徴とする、生体試料中のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法。
【０００８】
（２） コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させるに際し、界面活性剤を添加する（１）記載の測定方法。
【０００９】
（３） 生体試料が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させる前に界面活性剤が添加されたものである（１）記載の方法。
【００１０】
（４） 界面活性剤が、レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤である（２）または（３）記載の方法。
【００１１】
（５） 界面活性剤が、ポリオキシアルキレン誘導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体である（２）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【００１２】
（６） 生体試料が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させる前にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体が添加されたものであり、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させるに際しポリオキシアルキレン誘導体を添加する（１）記載の方法。
【００１３】
（７） ポリオキシアルキレン誘導体が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチレン長鎖分岐アルキルエーテルである（５）または（６）記載の方法。
【００１４】
（８） ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体が一般式（Ｉ）
【００１５】
【化３】
【００１６】
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のアルキルを表す。]
で表される化合物である（５）または（６）記載の方法。
【００１７】
（９） リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２である（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００１８】
（１０） コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素からなるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定試薬。
【００１９】
（１１） 界面活性剤を含有する（１０）記載の測定試薬。
【００２０】
（１２） 界面活性剤を含有する第１試薬およびコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を含有する第２試薬からなる（１０）記載の測定試薬。
【００２１】
（１３） 界面活性剤が、レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤である（１１）または（１２）記載の測定試薬。
【００２２】
（１４） 界面活性剤が、ポリオキシアルキレン誘導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体である（１１）または（１２）記載の測定試薬。
【００２３】
（１５） 第１試薬の界面活性剤が、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体であり、第２試薬にポリオキシアルキレン誘導体を含有する（１２）記載の測定試薬。
【００２４】
（１６） ポリオキシアルキレン誘導体が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチレン長鎖分岐アルキルエーテルである（１４）または（１５）記載の測定試薬。
【００２５】
（１７） ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体が一般式（Ｉ）
【００２６】
【化４】
【００２７】
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のアルキルを表す。]
で表される化合物である（１４）または（１５）記載の測定試薬。
【００２８】
（１８） リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２である（１０）〜（１７）のいずれかに記載の測定試薬。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本発明のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを定量するための反応は水性媒体中、好ましくは緩衝液中で行われる。
【００３０】
緩衝液に使用する緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤およびグッドの緩衝剤等があげられる。グッドの緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセタミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下、ＭＯＰＳという）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）等があげられる。
【００３１】
緩衝液のｐＨは４〜１０、好ましくは５〜９である。緩衝液の使用濃度は、５〜５００ｍＭが好ましく、１０〜２００ｍＭがより好ましく、２０〜１００ｍＭが特に好ましい。
【００３２】
本発明に用いるコレステロールエステラーゼとしては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物または動物由来のコレステロールエステラーゼやリポプロテインリパーゼ等があげられる。
【００３３】
コレステロールオキシダーゼとしては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物または動物由来のコレステロールオキシダーゼがあげられる。
【００３４】
コレステロールデヒドロゲナーゼとしては、コレステロールを酸化して酸化型補酵素を還元する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物または動物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼがあげられる。
【００３５】
これら酵素の特異性、安定性をさらに向上させるためにポリエチレングリコールを主成分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで該酵素を化学的に修飾したものも用いられる。また、遺伝子操作により得られる酵素も用いられる。
【００３６】
本発明におけるコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼの使用量は、反応液中、それぞれ０．０１〜２００Ｕ／ｍｌが好ましく０．１〜１００Ｕ／ｍｌがより好ましい。
【００３７】
本発明のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを定量する反応には、反応の特異性に影響を及ぼさない範囲でコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼを活性化するためによく使用される界面活性剤あるいはコール酸類も使用することができる。また、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化するための種々の塩類を使用することもできる。
【００３８】
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼを活性化するための界面活性剤としては、例えばアニオン界面活性剤があげられる。アニオン界面活性剤としては１−ペンタスルホン酸塩、１−ヘキサスルホン酸塩、１−ヘプタスルホン酸塩、１−オクタスルホン酸塩などのアルキルスルホン酸塩があげられ０〜５％の範囲で使用される。コール酸類としては、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸などが０〜５％の範囲で使用される。
【００３９】
塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化リチウム、硫酸リチウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムなどが０〜１００ｍＭの範囲で使用される。
【００４０】
リン脂質を分解する酵素としては、リン脂質を分解する能力を有する酵素であれば特に制限されない。例えば動物、植物および微生物由来のリン脂質を分解する酵素があげられる。具体的なリン脂質を分解する酵素としては、例えばホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２、リゾホスホリパーゼ等があげられる。
【００４１】
リン脂質を分解する酵素の使用濃度としては、反応液中、それぞれ０．０１〜２００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｍｌがより好ましい。
【００４２】
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼとしてコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを用いるときは、コレステロールの反応により酸素から過酸化水素が発生する。発生した過酸化水素は、例えばパーオキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンとフェノール類、４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬または高感度の色素源を用いて定量することができる。
【００４３】
フェノール類としては、例えばフェノール、４−クロロフェノール、ｍ−クレゾール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。
【００４４】
トリンダー試薬（同仁化学研究所第１９版総合カタログ、１９９４年）としては、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジスルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン等のアニリン類あるいはＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等があげられる。
【００４５】
高感度の色素源としては、特公昭６０−３３４７９号で示される１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、特公平４−２７８３９で示されるビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、特開昭６２−２９６号で示される化合物等があげられる。
【００４６】
これら色素源の濃度としては、０．０１〜10ｍｇ／ｍｌが好ましい。
【００４７】
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼとしてコレステロールエステラーゼとコレステロールデヒドロゲナーゼとを用いるときは、コレステロールの反応により酸化型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）から還元型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈが発生する。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、特に好ましくは約３４０ｎｍでの反応液の吸光度を測定することにより定量することができる。なお、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量は、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩を添加してホルマザン色素を生成させ、ホルマザン色素を比色して行うこともできる。
【００４８】
反応は、１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃、通常３７℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間行う。
【００４９】
本発明を適用する生体試料は、特に限定されず、具体的には血液自体または血漿、血清等の血液画分を使用することができる。
【００５０】
本発明では、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定の精度を高めるために前述のコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの活性を高める界面活性剤と共にまたは単独で、レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤を添加することが好ましい。該界面活性剤は、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させるに際して該酵素と同時に添加することができるが、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させる前の生体試料に添加することが好ましい。
【００５１】
レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤としては、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼのレムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対する作用を低減させる界面活性剤であれば特に制限がないが、例えばポリオキシアルキレン誘導体およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体等があげられる。
【００５２】
ポリオキシアルキレン誘導体としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチレン長鎖分岐アルキルエーテル等があげられ、該アルキルとしては、炭素数８以上の、例えばオクチル、ノニル等があげられ、該アリールとしては、フェニル等があげられる。
【００５３】
具体的なポリオキシアルキレン誘導体としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして例えばノニオンＨＳ−２１０、ノニオンＨＳ−２１５、ノニオンＮＳ−２０８．５、ノニオンＨＳ−２０８（以上、日本油脂社製）、エマルゲンＬ−４０、エマルゲン９１１、エマルゲン８１０（以上、花王社製）、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルとして例えばブラウノン（ＢＬＡＵＮＯＮ）ＴＳＰ−５０（青木油脂社製）等の市販品があげられる。
【００５４】
ポリオキシアルキレン誘導体の親水性・親油性バランス（以下、ＨＬＢという）は、９〜２０が好ましい。
【００５５】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体としては、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのランダム共重合体でもブロック共重合体でもよく、例えば一般式（Ｉ）
【００５６】
【化５】
【００５７】
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のアルキルを表す。]で表される化合物があげられる。
【００５８】
直鎖または分岐のアルキルとしては、好ましくは炭素数１〜３０のアルキル、より好ましくは炭素数２〜２４のアルキルがあげられる。
【００５９】
一般式（Ｉ）で表される化合物としては、例えば、プロニックＬ−１２１、プルロニックＬ−１２２、プルロニックＬ−１０１、プルロニックＰ−１０３、プルロニックＦ−１０８等の市販品（いずれも旭電化社製）、ポリオキシアルキレン長鎖分岐アルキルエーテルとして例えばユニルーブＭＴ０６２０Ｂ（日本油脂社製）があげられる。また、一般式（Ｉ）で表される化合物中のポリプロピレングリコール基の分子量としては、２，０５０以上が好ましく、２，７５０以上がより好ましく、３，２５０以上が特に好ましい。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体のＨＬＢは、１〜６が好ましい。
【００６０】
レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤の使用濃度は特に限定されないが、０．００１〜１０％が好ましく、０．０１〜５％がより好ましく、０．０５〜１％が特に好ましい。
【００６１】
反応液には、必要によりリポ蛋白質凝集剤、他の酵素等を含有させることができる。
【００６２】
リポ蛋白質凝集剤としてはリンタングステン酸塩、デキストラン硫酸塩、ヘパリンなどのポリアニオンが、マグネシウム、カルシウム、コバルト等の２価の金属塩があげられる。他の酵素としてはアルコルビン酸オキシダーゼ等があげられる。
以下に本発明の実施例を示す。
【００６３】
【実施例】
実施例１
下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を作製した。
試薬１
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ
プルロニックＦ−１０８（旭電化社製） １ｇ／Ｌ
パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００６４】
試薬２
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ
ホスホリパーゼ Ｄ（旭化成社製） ５単位／ｍｌ
【００６５】
実施例２
下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を作製した。
試薬１
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（青木油脂社製） ２ｇ／Ｌ
パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００６６】
試薬２
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ
ホスホリパーゼ Ｄ（旭化成社製） ５単位／ｍｌ
【００６７】
実施例３
下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を作製した。
試薬１
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ
ユニルーブＭＴ−０６２０Ｂ（日本油脂社製） ０．５ｇ／Ｌ
パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００６８】
試薬２
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ
ホスホリパーゼ Ｄ（旭化成社製） ５単位／ｍｌ
【００６９】
実施例４
下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を作製した。
試薬１
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（青木油脂社製） ２ｇ／Ｌ
パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００７０】
試薬２
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（東洋紡社社製） １０単位／ｍｌ
コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ
ホスホリパーゼ Ｃ（旭化成社製） ２０単位／ｍｌ
【００７１】
実施例５
下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を作製した。
試薬１
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（青木油脂社製） ２ｇ／Ｌ
パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００７２】
試薬２
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ
ホスホリパーゼ Ａ２（旭化成社製） ５０単位／ｍｌ
【００７３】
実施例６
新鮮な血清検体７０検体を下記の操作により測定した。
【００７４】
実施例１の試薬１を２．２５ｍｌ分光光度計のセルに入れ、血清３０μｌを添加して攪拌し、３７℃で５分間加温した。ついで３７℃に予備加温された実施例１の試薬２を０．７５ｍｌ添加して攪拌し、５分間加温した後、５５５ｎｍにて吸光度の変化を測定した。日本抗体研究所社製ＲＬＰ−Ｃ測定キットでレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値が４９．６ｍｇ／ｄＬである血清標準液を用いて同様に操作し検量線を作成し、上記吸光度の変化から検体中のコレステロール値を求めた。
【００７５】
一方、前述の新鮮な血液検体７０検体を、日本抗体研究所社製のＲＬＰ−Ｃ測定キットを用いてレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を測定し、得られるコレステロール値との相関性を調べた。
【００７６】
結果を図１に示す。実施例１の試薬を用いて得られるコレステロール値とレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬である日本抗体研究所社製ＲＬＰ−Ｃ測定キットで得られるコレステロール値とには良好な相関が認められ、相関係数は０．９４５であった。このことから、実施例１の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を簡便に測定できることが示される。
【００７７】
実施例７
実施例２の試薬を用いて実施例６と同様に測定した結果、相関係数は０．８４であった。このことから、実施例２の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を簡便に測定できることが示される。
【００７８】
実施例８
実施例３の試薬を用いて実施例６と同様に試験した結果、相関係数は０．９３であった。このことから、実施例３の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を簡便に測定できることが示される。
【００７９】
実施例９
実施例４の試薬を用いて実施例６と同様に試験した結果、相関係数は０．８７であった。このことから、実施例４の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を簡便に測定できることが示される。
【００８０】
実施例１０
実施例５の試薬を用いて実施例６と同様に試験した結果、相関係数は０．８５であった。このことから、実施例５の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を簡便に測定できることが示される。
【００８１】
【発明の効果】
本発明により、試料の分離操作が不要なレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを簡便に感度良く測定する方法および測定試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の試薬を用いて得られるコレステロール値（縦軸）と日本抗体研究所社製ＲＬＰ−Ｃ測定キットを用いて得られるコレステロール値（横軸）との相関図を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査において動脈硬化症等の危険因子とされるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法と測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査において、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として負の因子、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として正の因子とされており、臨床検査の分野で頻繁に測定されている。近年、脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質中のコレステロールが動脈硬化症の危険因子としてＬＤＬ中のコレステロールより密接な指標となることが示されてきている。該リポ蛋白質としては、例えばレムナント様リポ蛋白質があげられており、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定に対しては厚生省により保険点数がつけられている。
【０００３】
レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法としては、抗アポＢ−１００抗体と抗アポＡ１抗体を用いて試料からレムナント様リポ蛋白質を分離し、分離したレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを測定する方法が知られている［動脈硬化，25(9,10), 371（1998）］。しかしながら本方法は抗体を使用したアフィニティークロマトグラフィー方法を使用するもので、試料の分離操作を必要とする等操作が煩雑で時間がかかる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、試料の分離操作が不要なレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを簡便に感度良く測定する方法および測定試薬を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決する手段】
本発明者らは、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、ＣＭレムナント、ＶＬＤＬレムナント、中密度リポ蛋白質（ＩＤＬ）レムナント等のリポ蛋白質を含有する生体試料中のコレステロールをコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼを使用して測定するに際し、リン脂質を加水分解する酵素を作用させることにより、ＣＭレムナント、ＶＬＤＬレムナントおよびＩＤＬレムナント等のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを特異的に測定することができることを見いだし本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち本発明は、下記（１）〜（１８）に関する。
【０００７】
（１） 生体試料にコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させ、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを測定することを特徴とする、生体試料中のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法。
【０００８】
（２） コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させるに際し、界面活性剤を添加する（１）記載の測定方法。
【０００９】
（３） 生体試料が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させる前に界面活性剤が添加されたものである（１）記載の方法。
【００１０】
（４） 界面活性剤が、レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤である（２）または（３）記載の方法。
【００１１】
（５） 界面活性剤が、ポリオキシアルキレン誘導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体である（２）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【００１２】
（６） 生体試料が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させる前にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体が添加されたものであり、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させるに際しポリオキシアルキレン誘導体を添加する（１）記載の方法。
【００１３】
（７） ポリオキシアルキレン誘導体が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチレン長鎖分岐アルキルエーテルである（５）または（６）記載の方法。
【００１４】
（８） ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体が一般式（Ｉ）
【００１５】
【化３】
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のアルキルを表す。]
で表される化合物である（５）または（６）記載の方法。
【００１７】
（９） リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２である（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００１８】
（１０） コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素からなるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定試薬。
【００１９】
（１１） 界面活性剤を含有する（１０）記載の測定試薬。
【００２０】
（１２） 界面活性剤を含有する第１試薬およびコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を含有する第２試薬からなる（１０）記載の測定試薬。
【００２１】
（１３） 界面活性剤が、レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤である（１１）または（１２）記載の測定試薬。
【００２２】
（１４） 界面活性剤が、ポリオキシアルキレン誘導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体である（１１）または（１２）記載の測定試薬。
【００２３】
（１５） 第１試薬の界面活性剤が、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体であり、第２試薬にポリオキシアルキレン誘導体を含有する（１２）記載の測定試薬。
【００２４】
（１６） ポリオキシアルキレン誘導体が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチレン長鎖分岐アルキルエーテルである（１４）または（１５）記載の測定試薬。
【００２５】
（１７） ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体が一般式（Ｉ）
【００２６】
【化４】
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のアルキルを表す。]
で表される化合物である（１４）または（１５）記載の測定試薬。
【００２８】
（１８） リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２である（１０）〜（１７）のいずれかに記載の測定試薬。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本発明のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを定量するための反応は水性媒体中、好ましくは緩衝液中で行われる。
【００３０】
緩衝液に使用する緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤およびグッドの緩衝剤等があげられる。グッドの緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセタミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下、ＭＯＰＳという）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）等があげられる。
【００３１】
緩衝液のｐＨは４〜１０、好ましくは５〜９である。緩衝液の使用濃度は、５〜５００ｍＭが好ましく、１０〜２００ｍＭがより好ましく、２０〜１００ｍＭが特に好ましい。
【００３２】
本発明に用いるコレステロールエステラーゼとしては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物または動物由来のコレステロールエステラーゼやリポプロテインリパーゼ等があげられる。
【００３３】
コレステロールオキシダーゼとしては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物または動物由来のコレステロールオキシダーゼがあげられる。
【００３４】
コレステロールデヒドロゲナーゼとしては、コレステロールを酸化して酸化型補酵素を還元する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物または動物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼがあげられる。
【００３５】
これら酵素の特異性、安定性をさらに向上させるためにポリエチレングリコールを主成分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで該酵素を化学的に修飾したものも用いられる。また、遺伝子操作により得られる酵素も用いられる。
【００３６】
本発明におけるコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼの使用量は、反応液中、それぞれ０．０１〜２００Ｕ／ｍｌが好ましく０．１〜１００Ｕ／ｍｌがより好ましい。
【００３７】
本発明のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを定量する反応には、反応の特異性に影響を及ぼさない範囲でコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼを活性化するためによく使用される界面活性剤あるいはコール酸類も使用することができる。また、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化するための種々の塩類を使用することもできる。
【００３８】
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼを活性化するための界面活性剤としては、例えばアニオン界面活性剤があげられる。アニオン界面活性剤としては１−ペンタスルホン酸塩、１−ヘキサスルホン酸塩、１−ヘプタスルホン酸塩、１−オクタスルホン酸塩などのアルキルスルホン酸塩があげられ０〜５％の範囲で使用される。コール酸類としては、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸などが０〜５％の範囲で使用される。
【００３９】
塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化リチウム、硫酸リチウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムなどが０〜１００ｍＭの範囲で使用される。
【００４０】
リン脂質を分解する酵素としては、リン脂質を分解する能力を有する酵素であれば特に制限されない。例えば動物、植物および微生物由来のリン脂質を分解する酵素があげられる。具体的なリン脂質を分解する酵素としては、例えばホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２、リゾホスホリパーゼ等があげられる。
【００４１】
リン脂質を分解する酵素の使用濃度としては、反応液中、それぞれ０．０１〜２００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｍｌがより好ましい。
【００４２】
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼとしてコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを用いるときは、コレステロールの反応により酸素から過酸化水素が発生する。発生した過酸化水素は、例えばパーオキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンとフェノール類、４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬または高感度の色素源を用いて定量することができる。
【００４３】
フェノール類としては、例えばフェノール、４−クロロフェノール、ｍ−クレゾール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。
【００４４】
トリンダー試薬（同仁化学研究所第１９版総合カタログ、１９９４年）としては、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジスルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン等のアニリン類あるいはＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等があげられる。
【００４５】
高感度の色素源としては、特公昭６０−３３４７９号で示される１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、特公平４−２７８３９で示されるビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、特開昭６２−２９６号で示される化合物等があげられる。
【００４６】
これら色素源の濃度としては、０．０１〜10ｍｇ／ｍｌが好ましい。
【００４７】
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼとしてコレステロールエステラーゼとコレステロールデヒドロゲナーゼとを用いるときは、コレステロールの反応により酸化型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）から還元型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈが発生する。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、特に好ましくは約３４０ｎｍでの反応液の吸光度を測定することにより定量することができる。なお、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量は、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩を添加してホルマザン色素を生成させ、ホルマザン色素を比色して行うこともできる。
【００４８】
反応は、１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃、通常３７℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間行う。
【００４９】
本発明を適用する生体試料は、特に限定されず、具体的には血液自体または血漿、血清等の血液画分を使用することができる。
【００５０】
本発明では、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定の精度を高めるために前述のコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの活性を高める界面活性剤と共にまたは単独で、レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤を添加することが好ましい。該界面活性剤は、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させるに際して該酵素と同時に添加することができるが、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させる前の生体試料に添加することが好ましい。
【００５１】
レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤としては、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼのレムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対する作用を低減させる界面活性剤であれば特に制限がないが、例えばポリオキシアルキレン誘導体およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体等があげられる。
【００５２】
ポリオキシアルキレン誘導体としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチレン長鎖分岐アルキルエーテル等があげられ、該アルキルとしては、炭素数８以上の、例えばオクチル、ノニル等があげられ、該アリールとしては、フェニル等があげられる。
【００５３】
具体的なポリオキシアルキレン誘導体としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして例えばノニオンＨＳ−２１０、ノニオンＨＳ−２１５、ノニオンＮＳ−２０８．５、ノニオンＨＳ−２０８（以上、日本油脂社製）、エマルゲンＬ−４０、エマルゲン９１１、エマルゲン８１０（以上、花王社製）、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルとして例えばブラウノン（ＢＬＡＵＮＯＮ）ＴＳＰ−５０（青木油脂社製）等の市販品があげられる。
【００５４】
ポリオキシアルキレン誘導体の親水性・親油性バランス（以下、ＨＬＢという）は、９〜２０が好ましい。
【００５５】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体としては、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのランダム共重合体でもブロック共重合体でもよく、例えば一般式（Ｉ）
【００５６】
【化５】
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のアルキルを表す。]で表される化合物があげられる。
【００５８】
直鎖または分岐のアルキルとしては、好ましくは炭素数１〜３０のアルキル、より好ましくは炭素数２〜２４のアルキルがあげられる。
【００５９】
一般式（Ｉ）で表される化合物としては、例えば、プロニックＬ−１２１、プルロニックＬ−１２２、プルロニックＬ−１０１、プルロニックＰ−１０３、プルロニックＦ−１０８等の市販品（いずれも旭電化社製）、ポリオキシアルキレン長鎖分岐アルキルエーテルとして例えばユニルーブＭＴ０６２０Ｂ（日本油脂社製）があげられる。また、一般式（Ｉ）で表される化合物中のポリプロピレングリコール基の分子量としては、２，０５０以上が好ましく、２，７５０以上がより好ましく、３，２５０以上が特に好ましい。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体のＨＬＢは、１〜６が好ましい。
【００６０】
レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤の使用濃度は特に限定されないが、０．００１〜１０％が好ましく、０．０１〜５％がより好ましく、０．０５〜１％が特に好ましい。
【００６１】
反応液には、必要によりリポ蛋白質凝集剤、他の酵素等を含有させることができる。
【００６２】
リポ蛋白質凝集剤としてはリンタングステン酸塩、デキストラン硫酸塩、ヘパリンなどのポリアニオンが、マグネシウム、カルシウム、コバルト等の２価の金属塩があげられる。他の酵素としてはアルコルビン酸オキシダーゼ等があげられる。
以下に本発明の実施例を示す。
【００６３】
【実施例】
実施例１
下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を作製した。
試薬１
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ
プルロニックＦ−１０８（旭電化社製） １ｇ／Ｌ
パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００６４】
試薬２
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ
ホスホリパーゼ Ｄ（旭化成社製） ５単位／ｍｌ
【００６５】
実施例２
下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を作製した。
試薬１
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（青木油脂社製） ２ｇ／Ｌ
パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００６６】
試薬２
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ
ホスホリパーゼ Ｄ（旭化成社製） ５単位／ｍｌ
【００６７】
実施例３
下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を作製した。
試薬１
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ
ユニルーブＭＴ−０６２０Ｂ（日本油脂社製） ０．５ｇ／Ｌ
パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００６８】
試薬２
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ
ホスホリパーゼ Ｄ（旭化成社製） ５単位／ｍｌ
【００６９】
実施例４
下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を作製した。
試薬１
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（青木油脂社製） ２ｇ／Ｌ
パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００７０】
試薬２
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（東洋紡社社製） １０単位／ｍｌ
コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ
ホスホリパーゼ Ｃ（旭化成社製） ２０単位／ｍｌ
【００７１】
実施例５
下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を作製した。
試薬１
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（青木油脂社製） ２ｇ／Ｌ
パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００７２】
試薬２
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製） １０単位／ｍｌ
コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ
ホスホリパーゼ Ａ２（旭化成社製） ５０単位／ｍｌ
【００７３】
実施例６
新鮮な血清検体７０検体を下記の操作により測定した。
【００７４】
実施例１の試薬１を２．２５ｍｌ分光光度計のセルに入れ、血清３０μｌを添加して攪拌し、３７℃で５分間加温した。ついで３７℃に予備加温された実施例１の試薬２を０．７５ｍｌ添加して攪拌し、５分間加温した後、５５５ｎｍにて吸光度の変化を測定した。日本抗体研究所社製ＲＬＰ−Ｃ測定キットでレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値が４９．６ｍｇ／ｄＬである血清標準液を用いて同様に操作し検量線を作成し、上記吸光度の変化から検体中のコレステロール値を求めた。
【００７５】
一方、前述の新鮮な血液検体７０検体を、日本抗体研究所社製のＲＬＰ−Ｃ測定キットを用いてレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を測定し、得られるコレステロール値との相関性を調べた。
【００７６】
結果を図１に示す。実施例１の試薬を用いて得られるコレステロール値とレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬である日本抗体研究所社製ＲＬＰ−Ｃ測定キットで得られるコレステロール値とには良好な相関が認められ、相関係数は０．９４５であった。このことから、実施例１の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を簡便に測定できることが示される。
【００７７】
実施例７
実施例２の試薬を用いて実施例６と同様に測定した結果、相関係数は０．８４であった。このことから、実施例２の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を簡便に測定できることが示される。
【００７８】
実施例８
実施例３の試薬を用いて実施例６と同様に試験した結果、相関係数は０．９３であった。このことから、実施例３の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を簡便に測定できることが示される。
【００７９】
実施例９
実施例４の試薬を用いて実施例６と同様に試験した結果、相関係数は０．８７であった。このことから、実施例４の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を簡便に測定できることが示される。
【００８０】
実施例１０
実施例５の試薬を用いて実施例６と同様に試験した結果、相関係数は０．８５であった。このことから、実施例５の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を簡便に測定できることが示される。
【００８１】
【発明の効果】
本発明により、試料の分離操作が不要なレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを簡便に感度良く測定する方法および測定試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の試薬を用いて得られるコレステロール値（縦軸）と日本抗体研究所社製ＲＬＰ−Ｃ測定キットを用いて得られるコレステロール値（横軸）との相関図を示す。
Claims (18)
- 生体試料に、(1)コレステロールエステラーゼ、(2)コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ、および、(3)ホスホリパーゼを作用させ、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを測定することを特徴とする、生体試料中のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法。
- (1)コレステロールエステラーゼ、(2)コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ、および、(3)ホスホリパーゼを作用させるに際し、界面活性剤を添加する請求項１記載の測定方法。
- 生体試料が、(1)コレステロールエステラーゼ、(2)コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ、および、(3)ホスホリパーゼを作用させる前に界面活性剤が添加されたものである請求項１記載の方法。
- 界面活性剤が、レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対する(1)コレステロールエステラーゼ、および、(2)コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤である請求項２または３記載の方法。
- 界面活性剤が、ポリオキシアルキレン誘導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体である請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
- 生体試料が、(1)コレステロールエステラーゼ、(2)コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ、および、(3)ホスホリパーゼを作用させる前にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体が添加されたものであり、(1)コレステロールエステラーゼ、(2)コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ、および、(3)ホスホリパーゼを作用させるに際しポリオキシアルキレン誘導体を添加する請求項１記載の方法。
- ポリオキシアルキレン誘導体が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチレン長鎖分岐アルキルエーテルである請求項５または６記載の方法。
- ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体が一般式（Ｉ）
- ホスホリパーゼが、ホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣおよびホスホリパーゼＡ２からなる群より選ばれるホスホリパーゼである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
- (1)コレステロールエステラーゼ、(2)コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ、および、(3)ホスホリパーゼからなるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定試薬。
- 界面活性剤を含有する請求項１０記載の測定試薬。
- 界面活性剤を含有する第１試薬、および、(1)コレステロールエステラーゼ、(2)コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ、および、(3)ホスホリパーゼを含有する第２試薬からなる請求項１０記載の測定試薬。
- 界面活性剤が、レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対する(1)コレステロールエステラーゼ、および、(2)コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤である請求項１１または１２記載の測定試薬。
- 界面活性剤が、ポリオキシアルキレン誘導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体である請求項１１または１２記載の測定試薬。
- 第１試薬の界面活性剤が、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体であり、第２試薬にポリオキシアルキレン誘導体を含有する請求項１２記載の測定試薬。
- ポリオキシアルキレン誘導体が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチレン長鎖分岐アルキルエーテルである請求項１４または１５記載の測定試薬。
- ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体が一般式（Ｉ）
- ホスホリパーゼが、ホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣおよびホスホリパーゼＡ２からなる群より選ばれるホスホリパーゼである請求項１０〜１７のいずれかに記載の測定試薬。
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