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JP6719463B2 - ケトン化合物およびアミン化合物の還元的アミノ化のための操作されたイミンレダクターゼおよび方法 - Google Patents

ケトン化合物およびアミン化合物の還元的アミノ化のための操作されたイミンレダクターゼおよび方法 Download PDF

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Description

本出願は、その全体がすべての目的のために参考として本明細書に援用される、２０１４年１１月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／０８４０３７号に対する優先権を主張する。
技術分野
本発明は、種々のケトン基質およびアミン基質の第二級アミン生成物および第三級アミン生成物への変換に有用なイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドに関する。
配列表、表、またはコンピュータプログラムに関する言及
配列表の写しを、ファイル名「ＣＸ２−１４５ＷＯ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１５年１１月２０日、およびサイズ２３０キロバイトのＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂから明細書と同時に提出している。ＥＦＳ−Ｗｅｂから提出した配列表は、本明細書の一部を構成し、その全体が本明細書中で参照によって組み込まれる。
背景
キラルな第二級アミンおよび第三級アミンは、医薬品産業において重要な構成物質である。このキラルアミン化合物クラスを生成するための効率的な生体触媒経路は知られていない。既存の化学的方法は、キラルホウ素試薬または多工程合成を使用する。
第二級アミンの生体触媒合成についての文献にいくつかの報告がある。嫌気性菌Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉのホールセルのイミンレダクターゼ活性は、ベンジリジンイミンおよびブチリジンイミンを還元することが報告されている（Ｃｈａｄｈａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍ．，１９：９３−９６［２００８］）。別の報告は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉのホールセルを使用した水性媒質中でベンズアルデヒドまたはブチルアルデヒドおよびブチルアミンまたはアニリンを使用している（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ６０：７５３−７５８［２００４］）。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＦ３５８７およびＧＦ３５４６は、２−メチル−１−ピロリンを立体選択的に還元することが報告されている（Ｍｉｔｓｕｋａｒａら，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：４５３３−４５３５［２０１０］）。
この反応型のための生体触媒経路を開発する上での困難の１つは、産業的に適用可能な条件下でかかる反応を効率的に実行するように操作することができる酵素クラスを同定することである。オピンデヒドロゲナーゼは、補因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用してＣＨ−ＮＨ結合に対して作用するオキシドレダクターゼクラスである。オピンデヒドロゲナーゼの天然の反応は、アミノ酸でのα−ケト酸の還元的アミノ化である。オピンデヒドロゲナーゼクラスの特徴的な活性を有する酵素をコードするいくらかの相同性を有する少なくとも５つの天然に存在する遺伝子が同定されている。これら５つの酵素には、以下が含まれる：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ．１Ｃ株由来のオピンデヒドロゲナーゼ（ＣＥＮＤＨ）；Ｐｅｃｔｅｎ ｍａｘｉｍｕｓ（オオホタテガイ（ｇｒｅａｔ ｓｃａｌｌｏｐ））由来のオクトピンデヒドロゲナーゼ（ＯｐＤＨ）；Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ Ｋ１由来のオルニチンシンターゼ（ＣＥＯＳ）；Ｃｅｌｌａｎａ ｇｒａｔａ由来のβ−アラニンオピンデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）；およびＳｕｂｅｒｉｔｅｓ ｄｏｍｕｎｃｕｌａ由来のタウロピンデヒドロゲナーゼ（ＴａｕＤＨ）。オピンデヒドロゲナーゼＣＥＮＤＨの結晶構造が決定されている（例えば、Ｂｒｉｔｔｏｎら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：５９３−６０１［１９９８］を参照のこと）。別の酵素であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のＮ−メチルＬ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＭＤＨ）は、α−ケト酸およびアルキルアミンと反応するオピンデヒドロゲナーゼに類似の活性を有することが公知であるが、オピンデヒドロゲナーゼおよびアミノ酸デヒドロゲナーゼに対する配列相同性はほとんど無いか全く無いようである。ＮＭＤＨは、ＮＡＤ（Ｐ）依存性オキシドレダクターゼの新規のスーパーファミリーに属することが特徴として挙げられている（例えば、７，４５２，７０４Ｂ２号；およびＥｓａｋｉら，ＦＥＢＳ Ｊ．，２７２，１１１７−１１２３［２００５］を参照のこと）。
産業的に適用可能な条件下でのキラルな第二級アミンおよび第三級アミンの合成のための生体触媒およびその使用プロセスが当該分野で必要とされている。
Ｃｈａｄｈａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍ．，１９：９３−９６［２００８］ Ｓｔｅｐｈｅｎｓら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ６０：７５３−７５８［２００４］ Ｍｉｔｓｕｋａｒａら，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：４５３３−４５３５［２０１０］ Ｂｒｉｔｔｏｎら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：５９３−６０１［１９９８］ Ｅｓａｋｉら，ＦＥＢＳ Ｊ．，２７２，１１１７−１１２３［２００５］
概要
本発明は、基質として非活性化ケトンおよび非活性化アミンを使用した直接還元的アミノ化によるキラルな第二級アミンおよび第三級アミンの合成のための新規の生体触媒およびこの生体触媒の関連する使用方法を提供する。本発明の生体触媒は、配列番号２のアミノ酸配列を有するオピンデヒドロゲナーゼをコードするＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．１Ｃ株由来の初期野生型遺伝子の指向進化によって生成された、配列番号４、６および８の操作された酵素の指向進化によって誘導された操作されたポリペプチドバリアントである。これらの操作されたポリペプチドは、第二級アミン生成物化合物（ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）または第三級アミン生成物化合物を形成するためのケトン基質（シクロヘキサノンおよび２−ペンタノンなどの非活性化ケトン基質が含まれる）またはアルデヒド基質および第一級アミン基質または第二級アミン基質（ブチルアミン、アニリン、メチルアミン、およびジメチルアミンなどの非活性化アミン基質が含まれる）の変換を触媒することができる。オピンデヒドロゲナーゼから誘導されたこれらの操作されたポリペプチドの酵素活性を「イミンレダクターゼ活性」といい、本明細書中に開示の操作された酵素を「イミンレダクターゼ」または「ＩＲＥＤ」ともいう。一般的なＩＲＥＤのイミンレダクターゼ活性を、以下のスキーム１に示す。
本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、広範な基質を受け入れることができる。したがって、スキーム１の生体触媒反応では、式（Ｉ）の基質のＲ１基およびＲ２基は、水素原子、または任意選択的に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから独立して選択され；式（ＩＩ）の基質のＲ３基およびＲ４基は、水素原子、ならびに任意選択的に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから独立して選択され、但し、Ｒ３およびＲ４の両方が水素であり得ないことを条件とする。任意選択的に、式（Ｉ）の基質のＲ１基およびＲ２基ならびに式（ＩＩ）の基質のＲ３基およびＲ４基のいずれかまたは両方が連結して、３員環から１０員環を形成することができる。さらに、スキーム１の生体触媒反応は、分子内反応（式（Ｉ）の化合物のＲ１基およびＲ２基のうちの少なくとも１つが式（ＩＩ）の化合物のＲ３基およびＲ４基のうちの少なくとも１つに連結する）であり得る。また、式（ＩＩＩ）の生成物化合物中に＊で示した炭素原子および／または窒素のいずれかまたは両方はキラルであり得る。本明細書中にさらに記載するように、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは立体選択性を示し、したがって、スキーム１のイミンレダクターゼ反応を使用して、単一の生体触媒反応において式（ＩＩＩ）の生成物化合物の１つ、２つ、またはそれを超えるキラル中心を樹立することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２、４、または６のアミノ酸参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照アミノ配列と比較した場合に１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の相違をさらに含むアミノ酸配列を含み、イミンレダクターゼ活性を有する、操作されたポリペプチドを提供する。操作されたポリペプチドのいくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性は、スキーム１、任意選択的に、表２に示す反応の活性である。
さらに、上記のように、オピンデヒドロゲナーゼＣＥＮＤＨの結晶構造が決定されている（例えば、Ｂｒｉｔｔｏｎら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：５９３−６０１［１９９８］を参照のこと）。したがって、本明細書中に開示の種々のアミノ酸の相違と機能活性とのこの相関関係は、野生型酵素ＣＥＮＤＨの公知の三次元構造と共に、本明細書中に提供したポリペプチド（および相同オピンデヒドロゲナーゼ酵素（ＯｐＤＨ、ＢＡＤＨ、ＣＥＯＳ、およびＴａｕＤＨが含まれる））のアミノ酸残基をさらに変化させるように合理的に操作し、イミンレダクターゼ活性または安定性を維持するか改良するのに十分な情報を当業者に提供することができる。いくつかの実施形態では、かかる改良には、一定範囲の基質に対してイミンレダクターゼ活性を有し、スキーム１に記載の一定範囲の生成物を提供するように本発明の操作されたポリペプチドを操作する工程を含み得ることが意図される。
いくつかの実施形態では、本発明は、操作されたポリペプチドであって、ポリペプチドは、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ３１、Ｘ３７、Ｘ４４、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ６５、Ｘ８２、Ｘ９３、Ｘ９８、Ｘ１０８、Ｘ１３７、Ｘ１３８、Ｘ１４１、Ｘ１４２、Ｘ１４３、Ｘ１５３、Ｘ１５４、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５９、Ｘ１６６、Ｘ１６７、Ｘ１６８、Ｘ１７３、Ｘ１７７、Ｘ１７８、Ｘ１８４、Ｘ１８５、Ｘ１９５、Ｘ１９７、Ｘ１９８、Ｘ１９９、Ｘ２００、Ｘ２０１、Ｘ２０３、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１３、Ｘ２１５、Ｘ２１６、Ｘ２１８、Ｘ２２０、Ｘ２２１、Ｘ２２３、Ｘ２２４、Ｘ２２６、Ｘ２３４、Ｘ２３９、Ｘ２４２、Ｘ２４５、Ｘ２５１、Ｘ２５３、Ｘ２５６、Ｘ２５７、Ｘ２５９、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ２６２、Ｘ２６３、Ｘ２６５、Ｘ２６６、Ｘ２６７、Ｘ２６８、Ｘ２６９、Ｘ２７２、Ｘ２７３、Ｘ２７４、Ｘ２７６、Ｘ２７７、Ｘ２７８、Ｘ２７９、Ｘ２８０、Ｘ２８１、Ｘ２８２、Ｘ２８３、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ２８９、Ｘ２９０、Ｘ２９１、Ｘ２９２、Ｘ２９３、Ｘ２９４、Ｘ３３０およびＸ３４９から選択される位置に少なくとも１つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドは、配列番号２と比較した場合にイミンレダクターゼ活性を有する、操作されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号４の参照配列と比較した場合に、Ｘ１９８、Ｘ１５３、Ｘ１６７、Ｘ２６５、Ｘ２６２、Ｘ１０８、Ｘ２３４、Ｘ２８４、Ｘ２８２、Ｘ２２０、Ｘ２７２、Ｘ２５６、Ｘ２６７、Ｘ２４２、Ｘ２８１、Ｘ１９７、Ｘ２７７、Ｘ２２４およびＸ１４３から選択される少なくとも２つの残基の相違を含む。いくつかの追加的な実施形態では、操作されたポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６の参照配列と比較した場合に、Ｘ２８３、Ｘ２６２、Ｘ９、Ｘ２５９、Ｘ２２０、Ｘ２６７、Ｘ１５３、Ｘ２７９、Ｘ２００、Ｘ２２４、Ｘ２５６、Ｘ１３７、Ｘ１４３、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ１５４、Ｘ２７６およびＸ１８５から選択される少なくとも１つの残基の相違を含む。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号８の参照配列と比較した場合に、Ｘ１２、Ｘ３１、Ｘ３７、Ｘ４４、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ６５、Ｘ８２、Ｘ９３、Ｘ９８、Ｘ１０８、Ｘ１３７、Ｘ１３８、Ｘ１４１、Ｘ１４２、Ｘ１４３、Ｘ１５３、Ｘ１５４、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５９、Ｘ１６６、Ｘ１６８、Ｘ１７３、Ｘ１７７、Ｘ１７８、Ｘ１８４、Ｘ１８５、Ｘ１９５、Ｘ１９７、Ｘ１９９、Ｘ２００、Ｘ２０１、Ｘ２０３、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１３、Ｘ２１５、Ｘ２１６、Ｘ２１８、Ｘ２２０、Ｘ２２１、Ｘ２２３、Ｘ２２６、Ｘ２３４、Ｘ２３９、Ｘ２４２、Ｘ２４５、Ｘ２５１、Ｘ２５３、Ｘ２５６、Ｘ２５７、Ｘ２５９、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ２６２、Ｘ２６３、Ｘ２６５、Ｘ２６６、Ｘ２６７、Ｘ２６８、Ｘ２６９、Ｘ２７３、Ｘ２７４、Ｘ２７７、Ｘ２７８、Ｘ２７９、Ｘ２８０、Ｘ２８１、Ｘ２８２、Ｘ２８３、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ２８９、Ｘ２９０、Ｘ２９１、Ｘ２９２、Ｘ２９３、Ｘ２９４、Ｘ３３０およびＸ３４９から選択される少なくとも１つの残基の相違を含む。
本発明は、イミンレダクターゼ活性が、適切な反応条件下で、以下のケトン基質化合物およびアミン基質化合物の対から、列挙したアミン生成物化合物：（ａ）ケトン基質化合物（１ａ）およびアミン基質化合物（２ａ）から化合物（３ａ）を生成すること；（ｂ）ケトン基質化合物（１ｂ）およびアミン基質化合物（２ｂ）から化合物（３ｂ）を生成すること；（ｃ）ケトン基質化合物（１ｃ）およびアミン基質化合物（２ｃ）から化合物（３ｃ）を生成すること；（ｄ）ケトン基質化合物（１ｄ）およびアミン基質化合物（２ｄ）から化合物（３ｄ）を生成すること；（ｅ）ケトン基質化合物（１ｄ）およびアミン基質化合物（２ｃ）から化合物（３ｅ）を生成すること；（ｆ）ケトン基質化合物（１ｄ）およびアミン基質化合物（２ｃ）から化合物（３ｆ）を生成すること；ならびにケトン基質化合物（１ｄ）およびアミン基質化合物（２ｃ）から化合物（３ｇ）を生成することのうちの少なくとも１つを変換することを含む、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをさらに提供する。いくつかの追加的な実施形態では、適切な反応条件下での前記ケトン基質化合物および前記アミン基質化合物の対の前記列挙したアミン生成物化合物への変換に係る前記イミンレダクターゼ活性が、配列番号４、６、１２、３０、１２６、１７３、３６０および／または５５０の参照ポリペプチドの対応する活性と比較した場合に少なくとも２倍増加している。
本発明は、アミノ酸配列が、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子からなる群から選択される配列を含む操作されたポリペプチドもまた提供する。
本発明は、本明細書において提供される操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号５〜１２９９のうち奇数番号の配列識別子からなる群から選択される核酸配列を含む。
本発明は、本明細書において提供されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターもまた提供する。本発明は、本明細書において提供される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞もまた提供する。本発明は、本明細書において提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞もまた提供する。
本発明は、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを調製する方法であって、本明細書において提供される宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適切な条件下で培養する工程を含み、任意選択的に、前記操作されたポリペプチドを単離する工程をさらに含む、方法もまた提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
操作されたポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつＸ９、Ｘ３１、Ｘ３３、Ｘ３９、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４８、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ９８、Ｘ１６６、Ｘ１６７、Ｘ１６８、Ｘ１７３、Ｘ１９８、Ｘ１９９、Ｘ２０３、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１３、Ｘ２１５、Ｘ２１６、Ｘ２１８、Ｘ２２４、Ｘ２３９、Ｘ２４５、Ｘ２５１、Ｘ２６８、Ｘ２６９、Ｘ２８０、Ｘ２８５、Ｘ２８９、Ｘ２９０、Ｘ２９３、Ｘ３３０、Ｘ３４１およびＸ３４９から選択される位置に少なくとも１つの置換を有するアミノ酸配列を含み、
前記ポリペプチドは、配列番号２と比較した場合にイミンレダクターゼ活性を有する、操作されたポリペプチド。
（項目２）
操作されたポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつＸ９、Ｘ１２、Ｘ３１、Ｘ３３、Ｘ３７、Ｘ３９、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ６５、Ｘ８２、Ｘ９３、Ｘ９８、Ｘ１０８、Ｘ１３７、Ｘ１３８、Ｘ１４１、Ｘ１４２、Ｘ１４３、Ｘ１５３、Ｘ１５４、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５９、Ｘ１６６、Ｘ１６７、Ｘ１６８、Ｘ１７３、Ｘ１７７、Ｘ１７８、Ｘ１８４、Ｘ１８５、Ｘ１９５、Ｘ１９７、Ｘ１９８、Ｘ１９９、Ｘ２００、Ｘ２０１、Ｘ２０３、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１３、Ｘ２１５、Ｘ２１６、Ｘ２１８、Ｘ２２０、Ｘ２２１、Ｘ２２３、Ｘ２２４、Ｘ２２６、Ｘ２３４、Ｘ２３９、Ｘ２４２、Ｘ２４５、Ｘ２５１、Ｘ２５３、Ｘ２５６、Ｘ２５７、Ｘ２５９、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ２６２、Ｘ２６３、Ｘ２６５、Ｘ２６６、Ｘ２６７、Ｘ２６８、Ｘ２６９、Ｘ２７２、Ｘ２７３、Ｘ２７４、Ｘ２７６、Ｘ２７７、Ｘ２７８、Ｘ２７９、Ｘ２８０、Ｘ２８１、Ｘ２８２、Ｘ２８３、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ２８９、Ｘ２９０、Ｘ２９１、Ｘ２９２、Ｘ２９３、Ｘ２９４、Ｘ３３０、Ｘ３４１およびＸ３４９から選択される位置に少なくとも２つの置換を有するアミノ酸配列を含み、
前記ポリペプチドは、配列番号２と比較した場合にイミンレダクターゼ活性を有する、操作されたポリペプチド。
（項目３）
前記アミノ酸配列が、配列番号４の参照配列と比較した場合に、Ｘ１９８、Ｘ１５３、Ｘ１６７、Ｘ２６５、Ｘ２６２、Ｘ１０８、Ｘ２３４、Ｘ２８４、Ｘ２８２、Ｘ２２０、Ｘ２７２、Ｘ２５６、Ｘ２６７、Ｘ２４２、Ｘ２８１、Ｘ１９７、Ｘ２７７、Ｘ２２４およびＸ１４３から選択される少なくとも１つの残基の相違を含む、項目２に記載の操作されたポリペプチド。
（項目４）
前記アミノ酸配列が、配列番号６の参照配列と比較した場合に、Ｘ２８３、Ｘ２６２、Ｘ９、Ｘ２５９、Ｘ２２０、Ｘ２６７、Ｘ１５３、Ｘ２７９、Ｘ２００、Ｘ２２４、Ｘ２５６、Ｘ１３７、Ｘ１４３、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ１５４、Ｘ２７６およびＸ１８５から選択される少なくとも１つの残基の相違を含む、項目２に記載の操作されたポリペプチド。
（項目５）
前記アミノ酸配列が、配列番号８の参照配列と比較した場合に、Ｘ１２、Ｘ３１、Ｘ３７、Ｘ４４、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ６５、Ｘ８２、Ｘ９３、Ｘ９８、Ｘ１０８、Ｘ１３７、Ｘ１３８、Ｘ１４１、Ｘ１４２、Ｘ１４３、Ｘ１５３、Ｘ１５４、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５９、Ｘ１６６、Ｘ１６８、Ｘ１７３、Ｘ１７７、Ｘ１７８、Ｘ１８４、Ｘ１８５、Ｘ１９５、Ｘ１９７、Ｘ１９９、Ｘ２００、Ｘ２０１、Ｘ２０３、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１３、Ｘ２１５、Ｘ２１６、Ｘ２１８、Ｘ２２０、Ｘ２２１、Ｘ２２３、Ｘ２２６、Ｘ２３４、Ｘ２３９、Ｘ２４２、Ｘ２４５、Ｘ２５１、Ｘ２５３、Ｘ２５６、Ｘ２５７、Ｘ２５９、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ２６２、Ｘ２６３、Ｘ２６５、Ｘ２６６、Ｘ２６７、Ｘ２６８、Ｘ２６９、Ｘ２７３、Ｘ２７４、Ｘ２７７、Ｘ２７８、Ｘ２７９、Ｘ２８０、Ｘ２８１、Ｘ２８２、Ｘ２８３、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ２８９、Ｘ２９０、Ｘ２９１、Ｘ２９２、Ｘ２９３、Ｘ２９４、Ｘ３３０およびＸ３４９から選択される少なくとも１つの残基の相違を含む、項目２に記載の操作されたポリペプチド。
（項目６）
前記イミンレダクターゼ活性が、適切な反応条件下で、以下のケトン基質化合物およびアミン基質化合物の対から、列挙したアミン生成物化合物：
（ａ）ケトン基質化合物（１ａ）およびアミン基質化合物（２ａ）から化合物（３ａ）を生成すること；
（ｂ）ケトン基質化合物（１ｂ）およびアミン基質化合物（２ｂ）から化合物（３ｂ）を生成すること；
（ｃ）ケトン基質化合物（１ｃ）およびアミン基質化合物（２ｃ）から化合物（３ｃ）を生成すること；
（ｄ）ケトン基質化合物（１ｄ）およびアミン基質化合物（２ｄ）から化合物（３ｄ）を生成すること；
（ｅ）ケトン基質化合物（１ｄ）およびアミン基質化合物（２ｃ）から化合物（３ｅ）を生成すること；
（ｆ）ケトン基質化合物（１ｄ）およびアミン基質化合物（２ｃ）から化合物（３ｆ）を生成すること；ならびに
ケトン基質化合物（１ｄ）およびアミン基質化合物（２ｃ）から化合物（３ｇ）を生成すること
のうちの少なくとも１つを変換することを含む、項目２に記載の操作されたポリペプチド。
（項目７）
適切な反応条件下での前記ケトン基質化合物および前記アミン基質化合物の対の前記列挙したアミン生成物化合物への変換における前記イミンレダクターゼ活性が、配列番号４、６、１２、３０、１２６、１７３、３６０および／または５５０の参照ポリペプチドの対応する活性と比較した場合に少なくとも２倍増加している、項目６に記載の操作されたポリペプチド。
（項目８）
前記アミノ酸配列が、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子からなる群より選択される配列を含む、項目１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目９）
項目１〜８のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目１０）
前記ポリヌクレオチドが、配列番号５〜１２９９のうち奇数番号の配列識別子からなる群より選択される核酸配列を含む、項目９に記載のポリヌクレオチド。
（項目１１）
項目９または１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目１２）
項目９または１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、あるいは項目１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目１３）
イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを調製する方法であって、項目１２に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現に適切な条件下で培養する工程を含み、任意選択的に、前記操作されたポリペプチドを単離する工程をさらに含む、方法。
発明の詳細な説明
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」という表記には１つを超えるポリペプチドが含まれる。同様に、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は、相互に交換可能であり、本発明を制限することを意図しない。種々の実施形態の説明で用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例では、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」という用語を使用して実施形態を代わりに説明することができると理解すべきである。種々の実施形態の説明で用語「任意選択的な」または「任意選択的に」を使用する場合、その後に記載する事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、この記載には事象または状況が起こる場合および起こらない例が含まれるとさらに理解すべきである。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は例示および説明のみを目的とし、本発明を制限しないと理解すべきである。本明細書中で使用した節の表題は、まとめのみを目的とし、記載の主題を制限すると解釈されない。
略語：
遺伝的にコードされたアミノ酸のために使用した略語は慣習的な略語であり、これらを以下に示す。
三文字略語を使用する場合、「Ｌ」または「Ｄ」が明確に前置されないか、略語を使用した文脈から明確で無い限り、アミノ酸は、α−炭素（Ｃα）についてＬ型またはＤ型の立体配置のいずれかであり得る。例えば、「Ａｌａ」がα−炭素についての立体配置を特定しないでアラニンを示すのに対して、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニンをそれぞれ示す。一文字略語を使用する場合、大文字はα−炭素についてＬ−立体配置のアミノ酸を示し、小文字はα−炭素についてＤ−立体配置のアミノ酸を示す。例えば、「Ａ」はＬ−アラニンを示し、「ａ」はＤ−アラニンを示す。ポリペプチド配列を一連の一文字略語または三文字略語（またはその混合）として示す場合、配列を、慣習にしたがってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）への方向で示す。
遺伝的にコードするヌクレオシドのために使用される略語は慣習的な略語であり、以下に示す：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。特に記載しないかぎり、省略したヌクレオチドは、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドを、個別または凝集体に基づいてリボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであると特定することができる。核酸配列を一連の一文字略語として示す場合、配列を、慣習にしたがって５’から３’への方向で示し、リン酸塩は示さない。
定義：
本発明に関して、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、他で具体的に定義しないかぎり、当業者によって一般的に理解される意味を有するであろう。したがって、以下の用語は以下の意味を有することを意図する。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」を、長さや翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、ユビキチン化など）と無関係にアミド結合によって共有結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために本明細書中で互換的に使用する。Ｄ型およびＬ型アミノ酸ならびにＤ型およびＬ型アミノ酸の混合物が本定義の範囲内に含まれる。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、相互に共有結合した２つまたはそれを超えるヌクレオシドをいう。ポリヌクレオチドを、リボヌクレオシド（すなわち、ＲＮＡ）から完全に構成することができ、２’デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）またはリボヌクレオシドおよび２’デオキシリボヌクレオシドの混合物から完全に構成することができる。典型的にはヌクレオシドが標準的なホスホジエステル結合を介して相互に連結する一方で、ポリヌクレオチドは、１つまたはそれを超える非標準的な連結を含み得る。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であり得るか、一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含み得る。さらに、ポリヌクレオチドは典型的には天然に存在するコードヌクレオベース（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）から構成される一方で、ポリヌクレオチドは１つまたはそれを超える改変および／または合成ヌクレオベース（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど）を含み得る。好ましくは、かかる改変または合成ヌクレオベースは、コードヌクレオベースであろう。
「オピンデヒドロゲナーゼ活性」は、本明細書中で使用する場合、２−ケト酸（例えば、ピルバート）のカルボニル基および天然Ｌ−アミノ酸（例えば、Ｌ−ノルバリン）のアミノ基が第二級アミンジカルボキシラート化合物（例えば、Ｎ−［１−（Ｒ）−（カルボキシ）エチル］−（Ｓ）−ノルバリンなど）に変換される酵素活性をいう。
「オピンデヒドロゲナーゼ」は、本明細書中で使用する場合、オピンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をいう。オピンデヒドロゲナーゼには、以下の天然に存在する酵素が含まれるが、これらに限定されない：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．１Ｃ株由来のオピンデヒドロゲナーゼ（ＣＥＮＤＨ）（配列番号２）。
「イミンレダクターゼ活性」は、本明細書中で使用する場合、スキーム１に示すように、ケトンまたはアルデヒドのカルボニル基および第一級アミンまたは第二級アミンのアミノ基（ここで、カルボニル基およびアミノ基は個別の化合物上または同一化合物上に存在し得る）を補因子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下で第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物に変換する酵素活性をいう。
「イミンレダクターゼ」または「ＩＲＥＤ」は、本明細書中で使用する場合、イミンレダクターゼ活性を有する酵素をいう。イミンレダクターゼは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．１Ｃ株由来の野生型オピンデヒドロゲナーゼから誘導された操作されたポリペプチドに制限されないが、イミンレダクターゼ活性を有する他の酵素（Ｐｅｃｔｅｎ ｍａｘｉｍｕｓ由来のオクトピンデヒドロゲナーゼ（ＯｐＤＨ）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ Ｋ１由来のオルニチンシンターゼ（ＣＥＯＳ）、Ｃｅｌｌａｎａ ｇｒａｔａ由来のβ−アラノピンデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）、Ｓｕｂｅｒｉｔｅｓ ｄｏｍｕｎｃｕｌａ由来のタウロピンデヒドロゲナーゼ（ＴａｕＤＨ）；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のＮ−メチルＬ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＭＤＨ）などの他のオピンデヒドロゲナーゼ酵素から誘導された操作されたポリペプチドが含まれる）；またはイミンレダクターゼ活性を有する野生型酵素から誘導された操作された酵素が含まれ得ると理解すべきである。本明細書中で使用されるイミンレダクターゼには、天然に存在する（野生型）イミンレダクターゼおよび人為的に生成された天然に存在しない操作されたポリペプチドが含まれる。
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の一部をいう。
「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見出される形態をいう。例えば、天然に存在するか野生型のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然供給源から単離することができ、且つ人為的に意図的に改変されていない生物中に存在する配列である。
「組換え」または「操作された」または「天然に存在しない」は、例えば、細胞、核酸、またはポリペプチドに関して使用する場合、材料、すなわち、他の点では天然に存在しないと考えられる様式で改変された材料の天然または未変性の形態に対応する材料、または天然または未変性の形態に同一であるが、合成材料および／または組換え技術を使用した操作によって産生または誘導された材料をいう。非限定的な例には、とりわけ、細胞の未変性（非組換え）形態内に見出されない遺伝子を発現するか、他の方法で異なるレベルで発現される未変性遺伝子を発現する組換え細胞が含まれる。
「配列同一率」および「相同率」を、ポリヌクレオチド間およびポリペプチド間の比較をいうために本明細書中で互換的に使用し、比較ウィンドウにわたる２つの最適にアラインメントした配列の比較によって決定し、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列部分またはポリペプチド配列部分は、２配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較した場合に付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一率を得ることによって百分率を計算することができる。あるいは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に生じるか、核酸塩基またはアミノ酸残基をギャップを用いてアラインメントした位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一率を得ることによって百分率を計算することができる。当業者は、２つの配列をアラインメントするために利用可能な確立されたアルゴリズムが多数存在すると認識する。比較のための配列の最適アラインメントを、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，（１９８８）の類似性検索法、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実行（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照のこと）によって行うことができる。配列同一率および配列類似率の決定に適切なアルゴリズムの例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３８９−３４０２，（１９７７）に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターウェブサイトから公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードとアラインメントした場合にいくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか満たすクエリー配列中の長さＷのショートワードの同定による高スコア配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）の第１の同定を含む。Ｔを、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）という（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、これらのワードヒットを含むより長いＨＳＰを見出すための検索開始のためのシードとして働く。次いで、ワードヒットを、累積アラインメントスコアを増加させることができるかぎり、各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアを、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（一致する残基対のための報酬スコア；常に０超）およびＮ（ミスマッチ残基のためのペナルティスコア；常に０未満）を使用して計算する。アミノ酸配列について、スコア行列を使用して、累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたはそれを超える負スコアの残基アラインメントの蓄積によって累積スコアが０またはそれ未満に進行した場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワードレングス（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワードレングス（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５［１９８９］を参照のこと）を使用する。例示的な配列アラインメントおよび配列同一率の決定には、提供されたデフォルトパラメーターを使用したＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴプログラムまたはＧＡＰプログラムを使用することができる。
「参照配列」は、配列比較の基本として使用される定義された配列をいう。参照配列は、より大きな配列のサブセット（例えば、全長の遺伝子配列またはポリペプチド配列のセグメント）であり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長またはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それぞれ、（１）２配列間で類似する配列（すなわち、完全配列の一部）を含むことができ、（２）２配列間で異なる配列をさらに含むことができるので、２つ（またはそれを超える）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較を、典型的には、配列が類似する局所領域を同定および比較するための「比較ウィンドウ」にわたる２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の比較によって行う。いくつかの実施形態では、「参照配列」は一次アミノ酸配列に基づくことができ、ここで、参照配列は一次配列中に１つまたはそれを超える変化を有し得る配列である。例えば、「Ｘ１４に対応する残基にバリンを有する配列番号４に基づく参照配列」またはＸ１４Ｖは、配列番号４中のＸ１４の対応する残基（チロシンである）がバリンに変更された参照配列をいう。
「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の連続するヌクレオチドの位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントをいい、ここで、ある配列を少なくとも２０個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウ中の配列の一部が２配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加や欠失を含まない）と比較した場合に２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウは、２０個の連続残基よりも長いことが可能であり、任意選択的に、３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウィンドウが含まれる。
「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基の位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁には、少なくとも３０〜５０残基のウィンドウにわたって参照配列と比較した場合に、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％同一性、および８９〜９５％配列同一性、より通常には少なくとも９９％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列をいい、ここで、配列同一率を、比較ウィンドウにわたって合計で２０％またはそれ未満の参照配列が付加または欠失した配列との参照配列の比較によって計算する。ポリペプチドに適用した特定の実施形態では、用語「実質的な同一性」は、２つのポリペプチド配列が、デフォルトギャップウェイトを使用したプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントした場合、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも８９％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性、またはそれを超える配列同一性（例えば、９９％配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
「〜に相当する」、「〜に関する」、または「〜に関連する」は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の付番の文脈で使用する場合、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合に指定した参照配列の残基の付番をいう。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基の位置を、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の番号の位置によるよりもむしろ参照配列に関して命名する。例えば、所与のアミノ酸配列（操作されたイミンレダクターゼのアミノ酸配列など）を、２配列間の残基マッチを最適にするためのギャップの導入によって参照配列とアラインメントすることができる。これらの場合、ギャップが存在するにもかかわらず、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列中の残基を、アラインメントした参照配列に関して付番する。
「アミノ酸の相違」または「残基の相違」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基と比較したポリペプチド配列の位置のアミノ酸残基の変化をいう。アミノ酸の相違の位置を、一般に、本明細書中で「Ｘｎ」といい、ここで、ｎは残基の相違に基づいた参照配列中の対応する位置をいう。例えば、「配列番号２と比較した場合のＸ２５位の残基の相違」は、配列番号２の２５位に対応するポリペプチドの位置でのアミノ酸残基の変化をいう。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが２５位にバリンを有する場合、「配列番号２と比較した場合のＸ２５位の残基の相違」は、配列番号２の２５位に対応するポリペプチドの位置でのバリン以外の任意の残基のアミノ酸置換をいう。本明細書中のほとんどの例では、ある位置での特異的なアミノ酸残基の相違を「ＸｎＹ」として示し、ここで、「Ｘｎ」は上記の対応する位置を指定し、「Ｙ」は操作されたポリペプチド中に見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中の残基と異なる残基）の一文字識別子である。いくつかの実施形態では、１つを超えるアミノ酸が指定した残基の位置に存在することができ、別のアミノ酸をＸｎＹ／Ｚ（式中、ＹおよびＺは代わりとなるアミノ酸残基を示す）の形態で列挙することができる。いくつかの場合（例えば、表３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、および３Ｅ中）、本発明はまた、従来の表示法「ＡｎＢ」で示す特異的なアミノ酸の相違を提供し、ここで、Ａは参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は参照配列中の残基の位置の番号であり、Ｂは操作されたポリペプチド配列中の残基置換の一文字識別子である。さらに、いくつかの例では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比較した１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の相違を含むことができ、この相違は、参照配列と比較した場合に変化した特定の位置のリストによって示される。本発明は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換のいずれか／または両方を含む１つまたはそれを超えるアミノ酸の相違を含む操作されたポリペプチド配列を含む。
「保存的アミノ酸置換」は、ある残基の類似の側鎖を有する異なる残基との置換をいい、したがって、典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸の同一または類似と定義されたアミノ酸クラス内のアミノ酸との置換を含む。制限されない例として、それぞれ、脂肪族側鎖を有するあるアミノ酸を、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）と置換することができ；ヒドロキシル側鎖を有するあるアミノ酸を、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）と置換し；芳香族側鎖を有するあるアミノ酸を、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）と置換し；塩基性側鎖を有するあるアミノ酸を、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）と置換し；酸性側鎖を有するあるアミノ酸を、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）と置換し；ある疎水性または親水性のアミノ酸を、別の疎水性または親水性のアミノ酸と置換する。例示的な保存性置換を以下の表１に示す。
「非保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸の有意に性質が異なる側鎖を有するアミノ酸との置換をいう。非保存的置換は、定義した群内よりもむしろ群間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換領域中のペプチド骨格の構造（例えば、グリシンのプロリンへの置換）、（ｂ）電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さに影響を及ぼす。制限されない例として、例示的な非保存的置換は、塩基性アミノ酸または脂肪族アミノ酸に置換された酸性アミノ酸；小アミノ酸に置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸に置換された親水性アミノ酸であり得る。
「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つまたはそれを超えるアミノ酸の除去によるポリペプチドの改変をいう。欠失は、操作されたイミンレダクターゼ酵素の酵素活性を保持し、そして／またはその改良された性質を保持しながら、参照酵素を構成する１またはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、または２０またはそれを超えるアミノ酸、全アミノ酸数の１０％まで、または全アミノ酸数の２０％までを除去することができる。欠失は、ポリペプチドの内部および／または末端部が対象であり得る。種々の実施形態では、欠失は、連続的なセグメントを含むことができるか、不連続であり得る。
「挿入」は、参照ポリペプチドに対する１つまたはそれを超えるアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変をいう。いくつかの実施形態では、改良された操作されたイミンレダクターゼ酵素は、イミンレダクターゼ活性を有する天然に存在するポリペプチドへの１つまたはそれを超えるアミノ酸の挿入および他の改良されたイミンレダクターゼポリペプチドへの１つまたはそれを超えるアミノ酸の挿入を含む。ポリペプチドの内部またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に挿入することができる。本明細書中で使用される挿入には、当該分野で公知の融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続セグメントであり得るか、天然に存在するポリペプチド中で１つまたはそれを超えるアミノ酸によって分離され得る。
本明細書中で使用する場合の「フラグメント」は、アミノ末端の欠失および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残存するアミノ酸配列が配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドをいう。フラグメントは、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長、またはそれを超えるアミノ酸長、ならびに全長イミンレダクターゼポリペプチド（例えば、配列番号４〜１３００のいずれかのポリペプチド）の７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、および９９％までであり得る。
「単離されたポリペプチド」は、ポリペプチドに天然に付随している他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドをいう。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されているポリペプチドを含む。操作されたイミンレダクターゼ酵素は、細胞内に存在することができるか、細胞培地中に存在することができるか、種々の形態（溶解物または単離された調製物など）で調製することができる。そのようなものとして、いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼ酵素は、単離されたポリペプチドであり得る。
「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が主に存在する種である（すなわち、モルベースまたは重量ベースで、組成物中の任意の他の個別の高分子種よりも豊富に存在する）組成物をいい、一般に、モルまたは重量％で存在する高分子種の少なくとも約５０％を対象種が占める場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なイミンレダクターゼ組成物は、モルまたは重量％で組成物に存在する全高分子種の約６０％またはそれを超えて、約７０％またはそれを超えて、約８０％またはそれを超えて、約９０％またはそれを超えて、約９５％またはそれを超えて、および約９８％またはそれを超えて含まれるであろう。いくつかの実施形態では、対象種を、本質的に均一（すなわち、従来の検出方法によって組成物中の夾雑種を検出できない）まで精製し、ここで、組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。溶媒種、小分子（５００ダルトン未満）、および元素イオン種は、高分子種と見なさない。いくつかの実施形態では、単離された操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
「立体選択的な」は、化学反応または酵素反応における一方の立体異性体の他方の立体異性体を超える形成の優先度をいう。立体選択性は、一方の立体異性体の形成が他方よりも好まれる場合は部分的であり得、一方の立体異性体のみが形成される場合は完全であり得る。立体異性体が鏡像異性体である場合、立体選択性は、エナンチオ選択性（両方の合計中の１つの鏡像異性体の分率（典型的には、百分率として報告される））をいう。エナンチオ選択性は、代わりとして、式［主な鏡像異性体−少数の鏡像異性体］／［主な鏡像異性体＋少数の鏡像異性体］にしたがって鏡像異性体から計算した鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）（典型的には百分率として）として当該分野で一般的に報告されている。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性をジアステレオ選択性（２つのジアステレオマーの混合物のうちの一方のジアステレオマーの分率（典型的には、百分率として報告される））といい、一般に、代わりとして、ジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として報告される。鏡像体過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ）の一形態である。
「高度に立体選択的な」は、１つの基質または複数の基質（例えば、基質化合物（１ｅ）および（２ｂ））を対応するアミン生成物（例えば、化合物（３ｉ））に少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で変換することができる化学反応または酵素反応をいう。
「改良された酵素の性質」は、参照イミンレダクターゼと比較した場合に任意の酵素の性質が改良されたイミンレダクターゼポリペプチドをいう。本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドについて、一般にイミンレダクターゼが由来する野生型酵素と比較するが、いくつかの実施形態では、参照酵素が別の改良された操作されたイミンレダクターゼであり得る。改良が望まれる酵素の性質には、酵素活性（基質変換率で示すことができる）、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性プロフィール、補因子要件、インヒビター抵抗性（例えば、基質または生成物の阻害）、立体特異性、および立体選択性（エナンチオ選択性が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
「酵素活性の増加」は、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの性質の改良をいい、この酵素活性の増加を、参照イミンレダクターゼ酵素と比較した場合の比活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質重量）の増加または基質の生成物への変換率（例えば、特定の量のイミンレダクターゼを使用した特定の時間における出発量の基質の生成物への変換率）の増加によって示すことができる。例示的な酵素活性の決定方法を、実施例に示す。酵素活性に関する任意の性質（その変化によって酵素活性が増加し得るＫｍ、Ｖｍａｘ、またはｋｃａｔの古典的な酵素の性質が含まれる）が影響を受け得る。酵素活性の改良は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．２倍から、イミンレダクターゼポリペプチドが由来する天然に存在するか別の操作されたイミンレダクターゼよりも酵素活性が２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、またはそれを超えるまでであり得る。イミンレダクターゼ活性を、標準的なアッセイのうちのいずれか１つ（基質、補因子、または生成物の性質の変化のモニタリングなど）によって測定することができる。いくつかの実施形態では、生成物の生成量を、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって測定することができる。本明細書中にさらに詳述するように、酵素活性を、定義された酵素の調製、設定された条件下での定義されたアッセイ、および１つまたはそれを超える定義された基質を使用して比較する。一般に、溶解物を比較する場合、宿主細胞による酵素の生成量および溶解物中の酵素の存在量の変動を最小にするために同一の発現系および同一の宿主細胞も使用して細胞数およびタンパク質のアッセイ量を決定する。
「変換」は、基質の対応する生成物への酵素変化をいう。「変換率」は、特定の条件下での時間内の生成物に変換した基質の百分率をいう。したがって、イミンレダクターゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」を、基質の生成物への「変換率」として示すことができる。
「熱安定性」は、野生型酵素と比較して一定期間（例えば、０．５〜２４時間）高温（例えば、４０〜８０℃）に暴露後に類似の活性（例えば、６０％〜８０％を超える）を維持するイミンレダクターゼポリペプチドをいう。
「溶媒安定性」は、野生型酵素と比較して一定期間（例えば、０．５〜２４時間）種々の濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）に曝露後に類似の活性（例えば、６０％〜８０％を超える）を維持するイミンレダクターゼポリペプチドをいう。
「熱および溶媒安定性」は、熱安定性および溶媒安定性の両方を示すイミンレダクターゼポリペプチドをいう。
「ストリンジェントなハイブリッド形成」を、本明細書中で、核酸ハイブリッドが安定な条件をいう。当業者に公知のように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値を、公知の融点の予測方法を使用して計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６８：７６１−７７７；Ｂｏｌｔｏｎら，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：１３９０；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：８８９３−８８９７；Ｆｒｅｉｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｋｉｅｒｚｅｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：７８４０−７８４６；Ｒｙｃｈｌｉｋら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：６４０９−６４１２（ｅｒｒａｔｕｍ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：６９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ｓｕｐｒａ）；Ｓｕｇｇｓら，１９８１，Ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら，ｅｄｓ．），ｐｐ．６８３−６９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６：２２７−２５９（全ての刊行物が本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示のポリペプチドをコードし、定義した条件下で（中程度にストリンジェントな条件または高ストリンジェントな条件など）、本発明の操作されたイミンレダクターゼ酵素をコードする配列の相補物とハイブリッド形成する。
「ハイブリッド形成ストリンジェンシー」は、核酸のハイブリッド形成における洗浄条件などのハイブリッド形成条件をいう。一般に、ハイブリッド形成反応を、低い方のストリンジェンシーの条件下で実施後、多様であるが高い方のストリンジェンシーで洗浄する。用語「中程度のストリンジェントなハイブリッド形成」は、標的−ＤＮＡが標的ＤＮＡに対して約６０％同一、好ましくは約７５％同一、約８５％同一、標的−ポリヌクレオチドに対して約９０％を超える同一性で相補核酸に結合可能な条件をいう。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、４２℃での５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでのハイブリッド形成後、４２℃での０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでの洗浄に等価な条件である。「高ストリンジェンシーハイブリッド形成」は、一般に、定義されたポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で決定した熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満低い温度の条件をいう。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．０１８Ｍ ＮａＣｌにて安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみがハイブリッド形成することが可能な条件をいう（すなわち、ハイブリッドが６５℃の０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定ではない場合、本明細書中で意図するように、高ストリンジェンシー条件下で安定でないであろう）。高ストリンジェンシー条件を、例えば、４２℃の５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ後、６５℃で０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳでの洗浄に等価な条件でのハイブリッド形成によって提供することができる。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃の０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含む５×ＳＳＣでのハイブリッド形成および６５℃の０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣの洗浄に等価な条件でのハイブリッド形成である。他の高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件および中程度にストリンジェントな条件は、上記で引用した文献に記載されている。
「異種」ポリヌクレオチドは、実験技術によって宿主細胞に導入された任意のポリヌクレオチドをいい、宿主細胞から取り出され、実験操作に供され、次いで、宿主細胞に再導入されたポリヌクレオチドが含まれる。
「コドン最適化」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、コードされたタンパク質が目的の生物中で効率的に発現されるように特定の生物中で優先的に使用されるコドンへの変化をいう。ほとんどのアミノ酸がいくつかのコドンによって示されるという点で遺伝暗号が縮重している（「同義語」または「同義」コドンと呼ばれる）にもかかわらず、特定の生物によるコドン使用頻度が非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または起源となる祖先の遺伝子、低コピー数タンパク質に対する高発現タンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関して高い可能性がある。いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化することができる。
「好ましいコドン、最適なコドン、高コドン使用頻度バイアスコドン」は、同一アミノ酸をコードする他のコドンよりもタンパク質コード領域中でより高い頻度で使用されるコドンを互換的にいう。好ましいコドンを、単一の遺伝子、共通の機能または起源の遺伝子組、高発現遺伝子におけるコドン使用頻度、全生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはその組み合わせに関して決定することができる。遺伝子発現レベルに伴って頻度が増加するコドンは、典型的には、発現に最適なコドンである。特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的な同義語コドン使用頻度）およびコドン優先度（例えば、クラスター分析またはコレスポンデンス分析を使用した多変量解析が含まれる）ならびに遺伝子中で使用された有効コドン数を決定するための種々の方法が公知である（ＧＣＧ ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｊｏｈｎ Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ １４：３７２−７３［１９９８］；Ｓｔｅｎｉｃｏら，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２２４３７−４６［１９９４］；およびＷｒｉｇｈｔ，Ｇｅｎｅ ８７：２３−２９［１９９０］を参照のこと）。コドン使用頻度表は、増大する生物のリストに利用可能である（例えば、Ｗａｄａら，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８［１９９２］；Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２ ［２０００］；Ｄｕｒｅｔら，ｓｕｐｒａ；およびＨｅｎａｕｔ ａｎｄ Ｄａｎｃｈｉｎ，“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，”Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら，（Ｅｄｓ．），ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，［１９９６］，ｐ．２０４７−２０６６を参照のこと）。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依存し得る。これらのデータ・セットは、発現したタンパク質をコードすることが実際に公知の核酸配列（例えば、完全タンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の推定コード領域）を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，［２００１］；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２５９−２８１［１９９６］；およびＴｉｗａｒｉら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：２６３−２７０［１９９７］を参照のこと）。
「調節配列」は、本明細書中で、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要であるか有利な全ての成分を含むと定義する。各調節配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して未変性または外来であり得る。かかる調節配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。最小限でも、調節配列は、プロモーター、転写停止シグナル、および翻訳停止シグナルを含む。調節配列に、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域内の調節配列のライゲーションを容易にする特異的な制限部位を導入するためのリンカーを提供することができる。
「作動可能に連結された」は、本明細書中で、調節配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または制御するように目的のポリヌクレオチドに関連する位置に調節配列が適切に（すなわち、機能的関係において）配置された構成と定義する。
「プロモーター配列」は、目的のポリヌクレオチド（コード配列など）の発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列をいう。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、最適な宿主細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であってよく（変異プロモーター、短縮プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが含まれる）、宿主細胞と同種または異種のいずれかの細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
「適切な反応条件」は、本発明のイミンレダクターゼポリペプチドが基質化合物を生成物化合物に変換することができる（例えば、化合物（２）の化合物（１）への変換）生体触媒反応溶液中の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒の範囲など）をいう。例示的な「適切な反応条件」を、本発明中に示し、実施例で例示する。
「補因子再生系」または「補因子リサイクル系」は、補因子の酸化型を還元する（例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨ）反応に関与する反応物組をいう。ケトン基質のイミンレダクターゼ触媒還元的アミノ化によって酸化された補因子は、補因子再生系によって還元型で再生される。補因子再生系は、還元性水素等価物の供給源であり、補因子の酸化型を還元することができる化学量論的還元剤を含む。補因子再生系は、触媒（例えば、還元剤による補因子の酸化型の還元を触媒する酵素触媒）をさらに含むことができる。それぞれＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子再生系は、当該分野で公知であり、本明細書中に記載の方法で使用することができる。
「ギ酸デヒドロゲナーゼ」および「ＦＤＨ」を、それぞれホルマートおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の二酸化炭素およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへの変換を触媒するＮＡＤ＋依存性酵素またはＮＡＤＰ＋依存性酵素をいうために本明細書中で互換的に使用する。
「化合物負荷」、「酵素負荷」、または「補因子負荷」などにおける「負荷」は、反応開始時の反応混合物中の成分の濃度または量をいう。
生体触媒媒介プロセスの文脈における「基質」は、生体触媒が作用する化合物または分子をいう。例えば、本明細書中に開示の還元的アミノ化プロセスで使用されるイミンレダクターゼ生体触媒の基質は、式（Ｉ）のケトン（またはアルデヒド）基質（シクロヘキサノンなど）および式（ＩＩ）のアミン基質（ブチルアミンなど）である。
生体触媒媒介プロセスの文脈中の「生成物」は、生体触媒の作用に起因する化合物または分子をいう。例えば、本明細書中に開示のプロセスで使用されるイミンレダクターゼ生体触媒の例示的な生成物は、第二級アミン化合物または第三級アミン化合物（式（ＩＩＩ）の化合物など）である。
「アルキル」は、１〜１８個の炭素原子（両端の数を含む）、直鎖または分岐鎖のいずれかであり、より好ましくは１〜８個の炭素原子（両端の数を含む）、最も好ましくは１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）の飽和炭化水素基をいう。特定の数の炭素原子を有するアルキルを丸括弧内に示し、例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルは１〜６個の炭素原子のアルキルをいう。
「アルキレン」は、１〜１８個の炭素原子（両端の数を含む）、より好ましくは１〜８個の炭素原子（両端の数を含む）、最も好ましくは１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有する直鎖または分岐鎖の２価の炭化水素ラジカルをいう。
「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含むが、任意選択的に１つを超える二重結合を含む直鎖または分岐鎖のいずれかの２〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）の基をいう。
「アルケニレン」は、２〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）および１つまたはそれを超える炭素――炭素二重結合、より好ましくは２〜８個の炭素原子（両端の数を含む）、最も好ましくは２〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有する直鎖または分枝鎖の２価の炭化水素ラジカルをいう。
「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含むが、任意選択的に１つを超える三重結合を含み、さらに、任意選択的に１つまたはそれを超える二重結合部分を含む直鎖または分岐鎖の２〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）の基をいう。
「シクロアルキル」は、１〜３個のアルキル基に任意選択的に置換することができる単一の環または複数の縮合した環を有する３〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）の環状アルキル基をいう。例示的なシクロアルキル基には、単環構造（シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル、１−メチルシクロプロピル、２−メチルシクロペンチル、および２−メチルシクロオクチルなど）または多環構造（アダマンチルなどの架橋環系が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
「シクロアルキルアルキル」は、好ましくは、アルキル部分中に１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、シクロアルキル部分中に３〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）を有する、シクロアルキルに置換されたアルキル（すなわち、シクロアルキル−アルキル基）をいう。かかるシクロアルキルアルキル基の例は、シクロプロピルメチルおよびシクロヘキシルエチルなどである。
「アリール」は、単一の環（例えば、フェニル）または複数の縮合した環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する、６〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）の不飽和芳香族炭素環基をいう。例示的なアリールには、フェニル、ピリジル、およびナフチルなどが含まれる。
「アリールアルキル」は、好ましくはアルキル部分中に１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、アリール部分中に６〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）を有する、アリールに置換されたアルキル（すなわち、アリール−アルキル基）をいう。かかるアリールアルキル基の例は、ベンジルおよびフェネチルなどである。
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、およびヘテロアルキニル」は、１つまたはそれを超える炭素原子が同一または異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基にそれぞれ独立して置き換えられた本明細書中に定義のアルキル、アルケニル、およびアルキニルをいう。炭素原子と置き換えることができるヘテロ原子および／またはヘテロ原子基には、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｏ−、−ＮＲγ−、−ＰＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）ＮＲγ−、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲγ−など（その組み合わせが含まれる）（式中、各Ｒγは、水素、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される）が含まれるが、これらに限定されない。
「ヘテロアリール」は、環内に１〜１０個の炭素原子（両端の数を含む）および１〜４個の酸素、窒素、および硫黄から選択されるヘテロ原子（両端の数を含む）を含む芳香族複素環基をいう。かかるヘテロアリール基は、単一の環（例えば、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有することができる。
「ヘテロアリールアルキル」は、好ましくは、アルキル部分中に１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、ヘテロアリール部分中に５〜１２個の環原子（両端の数を含む）を有する、ヘテロアリールに置換されたアルキル（すなわち、ヘテロアリール−アルキル基）をいう。かかるヘテロアリールアルキル基の例は、ピリジルメチルなどである。
「ヘテロ環」、「複素環」、および、互換的に「ヘテロシクロアルキル」は、単環または複数の縮合環、環内に２〜１０個の炭素環原子（両端の数を含む）および１〜４個の窒素、硫黄、または酸素から選択されるヘテロ環原子（両端の数を含む）を有する飽和または不飽和の基をいう。かかる複素環基は、単一の環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または複数の縮合した環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフラン、またはキヌクリジニル）を有することができる。ヘテロ環の例には、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、およびインドリンなどが含まれるが、これらに限定されない。
「ヘテロシクロアルキルアルキル」は、好ましくは、アルキル部分中に１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、ヘテロシクロアルキル部分中に３〜１２個の環原子（両端の数を含む）を有する、ヘテロシクロアルキルに置換されたアルキル（すなわち、ヘテロシクロアルキル−アルキル基）をいう。
「オキシ」は、異なるオキシ基（エステルまたはエーテルが含まれる）を形成するための種々の置換基を有することができる２価の−Ｏ−基をいう。
「アルコキシ」または「アルキルオキシ」を、−ＯＲζ基（式中、Ｒζはアルキル基（任意選択的に置換されたアルキル基が含まれる）である）をいうために本明細書中で互換的に使用する。
本明細書中で使用される場合の「アリールオキシ」は、−ＯＲ基（式中、Ｒは上記定義のアリール基（本明細書中でも定義された任意選択的に置換されたアリール基が含まれる）である）をいう。
「カルボキシ」は−ＣＯＯＨをいう。
「カルボキシアルキル」は、カルボキシ基に置換されたアルキルをいう。
「カルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）−基をいう。置換カルボニルは、Ｒη−Ｃ（Ｏ）−Ｒη基（式中、各Ｒηは、任意選択的に置換されたアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、カルボキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、およびスルホニルなどから独立して選択される）をいう。典型的な置換カルボニル基には、酸、ケトン、アルデヒド、アミド、エステル、アシルハライド、およびチオエステルなどが含まれる。
「アミノ」は、−ＮＨ２基をいう。置換アミノは、−ＮＨＲη基、ＮＲηＲη基、およびＮＲηＲηＲη基（式中、各Ｒηは、任意選択的に置換されたアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、カルボキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、およびスルホニルなどから独立して選択される）をいう。典型的なアミノ基には、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチル（ｍｅｔｈｙｌｙ）スルホニルアミノ、およびフラニル−オキシ−スルファミノなどが含まれるが、これらに限定されない。
「アミノアルキル」は、１つまたはそれを超える水素原子がアミノ基（置換アミノ基が含まれる）に置き換えられたアルキル基をいう。
「アミノカルボニル」は、本明細書中に定義のアミノ基（置換アミノ基が含まれる）に置換されたカルボニル基をいい、アミドを含む。
「アミノカルボニルアルキル」は、本明細書中に定義のアミノカルボニル基に置換されたアルキルをいう。
「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードをいう。
「ハロアルキル」は、１つまたはそれを超える水素原子をハロゲンと置き換えたアルキル基をいう。したがって、用語「ハロアルキル」は、モノハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキルなどからペルハロアルキルまでが含まれることを意味する。例えば、語句「（Ｃ１ Ｃ２）ハロアルキル」には、１−フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、１−フルオロエチル、１，１−ジフルオロエチル、１，２−ジフルオロエチル、１，１，１トリフルオロエチル、ペルフルオロエチルなどが含まれる。
「ヒドロキシ」は−ＯＨをいう。
「ヒドロキシアルキル」は、１つまたはそれを超えるヒドロキシ基に置換されたアルキルをいう。
「チオ」または「スルファニル」は、−ＳＨをいう。置換されたチオまたはスルファニルは、−Ｓ−Ｒη（式中、Ｒηは、アルキル、アリール、または他の適切な置換基である）をいう。
「アルキルチオ」は、−ＳＲζ（式中、Ｒζは、任意選択的に置換することができるアルキルである）をいう。典型的なアルキルチオ基には、メチルチオ、エチルチオ、およびｎ−プロピルチオなどが含まれるが、これらに限定されない。
「アルキルチオアルキル」は、アルキルチオ基（−ＳＲζ（式中、Ｒζは、任意選択的に置換することができるアルキルである））に置換されたアルキルをいう。
「スルホニル」は、−ＳＯ２−をいう。置換スルホニルは、−ＳＯ２−Ｒη（式中、Ｒηはアルキル、アリール、または他の適切な置換基である）をいう。
「アルキルスルホニル」は、−ＳＯ２−Ｒζ（式中、Ｒζは、任意選択的に置換することができるアルキルである）をいう。典型的なアルキルスルホニル基には、メチルスルホニル、エチルスルホニル、およびｎ−プロピルスルホニルが含まれるが、これらに限定されない。
「アルキルスルホニルアルキル」は、アルキルスルホニル基−ＳＯ２−Ｒζ（式中、Ｒζは、任意選択的に置換することができるアルキルである）に置換されたアルキルをいう。
「員環」は、任意の環状構造を含むことを意味する。用語「員」の前の数字は、環を構成する骨格原子の数を示す。したがって、例えば、シクロヘキシル、ピリジン、ピラン、およびチオピランは６員環であり、シクロペンチル、ピロール、フラン、およびチオフェンは５員環である。
「縮合二環」は、各環内に５または８個の原子を有し、環は２個の共通の原子を有する、非置換または置換の炭素環および／または複素環部分の両方をいう。
前述の化学基に関して本明細書中で使用される場合の「任意選択的に置換された」は、水素によって占められる化学基の位置を、炭素、酸素、窒素、または硫黄などの別の原子、またはヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ（ａｍｉｄｏｘｉｍｏ）、ヒドロキサモイル、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、ヘテロ環、（ヘテロ環）オキシ、および（ヘテロ環）アルキルによって例示されるが、これらに限定されない化学基に置換することができ；ここで、好ましいヘテロ原子が酸素、窒素、および硫黄であることを意味する。さらに、開殻価電子（ｏｐｅｎ ｖａｌｅｎｃｅ）がこれらの置換化学基上に存在する場合、開殻価電子をアルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、および／またはヘテロ環基にさらに置換することができ、これらの開殻価電子が炭素上に存在する場合、開殻価電子を、ハロゲンならびに酸素、窒素、または硫黄に結合した置換基にさらに置換することができ、複数のかかる開殻価電子が存在する場合、結合の直接形成または新規のヘテロ原子、好ましくは酸素、窒素、または硫黄への結合の形成のいずれかによってこれらの基を接合させて環を形成することができる。水素の置換基への置き換えによって本発明の分子が許容できない不安定性を生じず、かつ他の点で化学的に妥当であるという条件で、上記置換を実施することができることがさらに意図される。当業者は、任意選択的に置換されたと記載の任意の化学基に関して、立体的に実用的および／または合成的に実行可能な化学基のみが含まれることを意味すると理解するであろう。最後に、本明細書中で使用される場合の「任意選択的に置換された」は、その後に来る１つの用語または一連の化学基の全てを修飾することをいう。例えば、用語「任意選択的に置換されたアリールアルキル」では、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分を置換しても置換しなくてもよく、一連の用語「任意選択的に置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール」について、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、およびヘテロアリール基を、他の基から独立して、置換しても置換しなくてもよい。
６．３ 操作されたイミンレダクターゼ（ＩＲＥＤ）ポリペプチド
本発明は、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ポリペプチドの調製方法、およびポリペプチドの使用方法を提供する。記述がポリペプチドに関する場合、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記載していると理解すべきである。
上述の通り、イミンレダクターゼは、スキーム１に例示するように、ケトン基質および第一級アミン基質または第二級アミン基質の第二級アミン生成物または第三級アミン生成物への還元的アミノ化を触媒する酵素クラスに属する（式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の化合物のスキームおよび基の構造については上記を参照のこと）。
配列番号２のアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．１Ｃ株由来のオピンデヒドロゲナーゼ（本明細書中で「ＣＥＮＤＨ」とも呼ばれる）は、天然には、ケトン基質、ピルバートおよびアミノ酸基質、Ｌ−２−アミノペンタン酸（または「Ｌ−ノルバリン」）の生成物（２Ｓ）−２−（（１−カルボキシエチル）アミノ）ペンタン酸への変換を触媒する。ＣＥＮＤＨはまた、ビルバートの、アミノ酸基質、Ｌ−オルニチン、およびβ−アラニン、ならびに構造的に類似するアミノスルホン酸基質であるタウリンとの反応を触媒する。さらに、ＣＥＮＤＨは、非活性化ケトン基質であるシクロヘキサノン（ピルバートよりもむしろ）およびその天然アミン基質であるＬ−ノルバリンの第二級アミン生成物（（Ｓ）−２−（シクロヘキシルアミノ）ペンタン酸）への変換を触媒することが見出された。ＣＥＮＤＨはまた、第一級アミンであるブチルアミン、エチルアミン、およびイソプロピルアミンを使用したその天然のケトン基質であるピルバートのそのそれぞれの２−（アルキルアミノ）プロパン酸（第二級アミン生成物）への変換を触媒することが見出された。しかし、ＣＥＮＤＨは、第二級アミン（ジメチルアミンなど）を使用したピルバートの変換にいかなる活性も示さなかった。さらに、ＣＥＮＤＨは、非活性化第一級アミン基質であるブチルアミンと共に使用した場合、非活性化ケトン基質であるシクロヘキサノンを使用していかなるイミンレダクターゼ活性も示さなかった。
本発明は、野生型オピンデヒドロゲナーゼＣＥＮＤＨの欠点を克服する操作されたイミンレダクターゼを提供する。以下の表２に列挙した変換反応（ａ）〜（ｇ）によって示されるように、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．１Ｃ株の野生型酵素から誘導された操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、ピルバートおよびＬ−ノルバリンを生成物（２Ｓ）−２−（（１−カルボキシエチル）アミノ）ペンタン酸に効率的に変換することができるだけでなく、一定範囲の式（Ｉ）のケトン基質化合物および式（ＩＩ）のアミン基質化合物を式（ＩＩＩ）の第二級アミン生成物化合物および第三級アミン生成物化合物に効率的に変換することもできる。
有意には、本発明は、酵素の性質（とりわけ、イミンレダクターゼ活性、基質特異性、および選択性が含まれる）が改良された、（以前に配列番号２の天然に存在するＣＥＮＤＨポリペプチドから進化した）配列番号４、６または８のイミンレダクターゼ活性を有する参照の操作されたポリペプチドの配列におけるアミノ酸残基の位置および対応する変異を提供する。特に、本発明は、表２などに記載の還元的アミノ化反応（すなわち、式（ＩＩＩ）の第二級アミン化合物または第三級アミン化合物が生成される式（ＩＩ）の第一級アミン基質化合物および第二級アミン基質化合物を使用した式（Ｉ）のケトン基質化合物の還元的アミノ化）を触媒することができる操作されたＩＲＥＤポリペプチドを提供する。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、野生型酵素ＣＥＮＤＨと比較した場合に同量の酵素を使用した定義の時間における式（Ｉ）のケトン基質および式（ＩＩ）のアミン基質の式（ＩＩＩ）のアミン生成物への変換において活性の増加が認められる。いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、適切な反応条件下で配列番号４、６または８の参照の操作されたポリペプチドと比較した場合に、少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍、またはそれを超える活性を有する。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、式（Ｉ）のケトン基質および式（ＩＩ）のアミン基質の式（ＩＩＩ）のアミン生成物への変換においてイミンレダクターゼ活性を示し、配列番号２の野生型ポリペプチドＣＥＮＤＨは検出可能な活性を持たない。
操作されたイミンレダクターゼポリペプチドによって生成された式（ＩＩＩ）の生成物化合物は、１つまたはそれを超えるキラル中心を有する第二級アミン化合物または第三級アミン化合物であり得る。いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、９９．５％超、またはそれを超える鏡像体過剰率またはジアステレオマー過剰率で、式（Ｉ）および式（ＩＩ）のケトン基質化合物およびアミン基質化合物を式（ＩＩＩ）のキラルなアミン生成物化合物に変換することができる。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、式（Ｉ）および式（ＩＩ）のケトン基質化合物およびアミン基質化合物を、適切な反応条件下での配列番号４、６または配列番号８の参照ポリペプチドの耐性と比較してこれらの基質化合物の一方または両方が存在するための耐性が増加した変換が可能である。したがって、いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、適切な反応条件下での約１２０時間またはそれ未満、７２時間またはそれ未満、約４８時間またはそれ未満、約３６時間またはそれ未満、または約２４時間またはそれ未満の反応時間にて、少なくとも約．００１％、少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約１０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の変換率で、少なくとも約１ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１２５ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ、約１７５ｇ／Ｌ、または約２００ｇ／Ｌ、またはそれを超える基質負荷濃度の式（Ｉ）および式（ＩＩ）のケトン基質化合物およびアミン基質化合物を変換することができる。
上記の操作されたポリペプチドの改良された性質によって変換が行われる適切な反応条件を、以下および実施例にさらに記載するように、以下の濃度または量に関して決定することができる：ポリペプチド、基質、補因子（例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）、補酵素（例えば、ＦＤＨ［ギ酸デヒドロゲナーゼ］またはＧＤＨ［グルコースデヒドロゲナーゼ］）、緩衝液、共溶媒、ｐＨ、温度、反応時間、および／または固体支持体上に固定したポリペプチドを使用した条件。
本発明は、イミンレダクターゼ活性を有する多数の例示的な操作されたポリペプチドを提供する。これらの例示的なポリペプチドを、配列番号４、６または８の以前に操作されたポリペプチド（配列番号２の野生型ＣＥＮＤＨから指向進化によって得られた）から進化させ、性質の改良、特に、種々のケトン基質およびアミン基質の変換（化合物（１ａ）および（２ａ）のアミン生成物化合物（３ａ）への変換、化合物（１ｂ）および（２ｂ）のアミン生成物化合物（３ｂ）への変換、化合物（１ｃ）および（２ｃ）のアミン生成物化合物（３ｃ）への変換、化合物（１ｄ）および（２ｄ）のアミン生成物化合物（３ｄ）への変換、化合物（１ｄ）および（２ｃ）のアミン生成物化合物（３ｅ）への変換、化合物（１ｄ）および（２ｃ）のアミン生成物化合物（３ｆ）および化合物（１ｄ）および（２ｃ）のアミン生成物化合物（３ｇ）への変換が含まれる）における活性および安定性の増加を示す。これらの例示的なイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４、６または８と比較した場合に以下の残基の位置：Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ３１、Ｘ３７、Ｘ４４、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ６５、Ｘ８２、Ｘ９３、Ｘ９８、Ｘ１０８、Ｘ１３７、Ｘ１３８、Ｘ１４１、Ｘ１４２、Ｘ１４３、 Ｘ１５３、Ｘ１５４、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５９、Ｘ１６６、Ｘ１６７、Ｘ１６８、Ｘ１７３、Ｘ１７７、Ｘ１７８、Ｘ１８４、Ｘ１８５、Ｘ１９５、Ｘ１９７、Ｘ１９８、Ｘ１９９、Ｘ２００、Ｘ２０１、Ｘ２０３、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１３、Ｘ２１５、Ｘ２１６、Ｘ２１８、Ｘ２２０、Ｘ２２１、Ｘ２２３、Ｘ２２４、Ｘ２２６、Ｘ２３４、Ｘ２３９、Ｘ２４２、Ｘ２４５、Ｘ２５１、Ｘ２５３、Ｘ２５６、Ｘ２５７、Ｘ２５９、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ２６２、Ｘ２６３、Ｘ２６５、Ｘ２６６、Ｘ２６７、Ｘ２６８、Ｘ２６９、Ｘ２７２、Ｘ２７３、Ｘ２７４、Ｘ２７６、Ｘ２７７、Ｘ２７８、Ｘ２７９、Ｘ２８０、Ｘ２８１、Ｘ２８２、Ｘ２８３、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ２８９、Ｘ２９０、Ｘ２９１、Ｘ２９２、Ｘ２９３、Ｘ２９４、Ｘ３３０およびＸ３４９に１つまたはそれを超える残基の相違を含むアミノ酸配列（添付の配列表中に配列番号１０〜１３００のうち偶数番号の配列識別子として提供）を有する。表３Ａ〜３Ｍの結果は、一定範囲のケトン基質およびアミン基質にわたるイミンレダクターゼの活性および／または安定性の増加を伴うバリアントを提供する。
本発明の例示的な天然に存在しない（または操作された）イミンレダクターゼポリペプチドの構造および機能の情報は、これらの酵素の指向進化で使用した以下の７つの異なる高処理（ＨＴＰ）スクリーニングアッセイに基づく：化合物（１ａ）および（２ａ）のアミン生成物化合物（３ａ）への変換、化合物（１ｂ）および（２ｂ）のアミン生成物化合物（３ｂ）への変換、化合物（１ｃ）および（２ｃ）のアミン生成物化合物（３ｃ）への変換、化合物（１ｄ）および（２ｄ）のアミン生成物化合物（３ｄ）への変換、化合物（１ｄ）および（２ｃ）のアミン生成物化合物（３ｅ）への変換、化合物（１ｄ）および（２ｃ）のアミン生成物化合物（３ｆ），および化合物（１ｄ）および（２ｃ）のアミン生成物化合物（３ｇ）への変換。これらのＨＴＰスクリーニングアッセイの結果を以下の表３Ａ〜３Ｍに示す。奇数番号の配列識別子（すなわち、配列番号）は、偶数番号の配列番号によって提供されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をいい、その配列を本発明に添付の配列表の電子ファイル中に提供し、この電子ファイルは本明細書中で参照によって組み込まれる。
表３Ａ〜３Ｍに示す例示的なポリペプチドの分析から、酵素の性質の改良は、配列番号４、６および／または８の操作されたポリペプチドの参照配列と比較した場合に、これらの表に示される残基の位置での残基の相違に関連する。
さらに、上で述べたように、オピンデヒドロゲナーゼＣＥＮＤＨの結晶構造が決定されている（例えば、Ｂｒｉｔｔｏｎら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５：５９３−６０１［１９９８］を参照のこと）。したがって、野生型酵素ＣＥＮＤＨの公知の三次元構造と共に、この本明細書中に開示の種々のアミノ酸の相違と機能活性との相関により、当業者は本明細書中に提供したポリペプチド（および相同オピンデヒドロゲナーゼ酵素（ＯｐＤＨ、ＢＡＤＨ、ＣＥＯＳ、およびＴａｕＤＨが含まれる））のアミノ酸残基がさらに変化するように合理的に操作し、イミンレダクターゼ活性または安定性を保持または改良するための十分な情報を得ることができる。いくつかの実施形態では、かかる改良には、本発明の操作されたポリペプチドを、スキーム１に記載するように、一定の範囲の基質とのイミンレダクターゼ活性を有し、一定範囲の生成物が得られるように操作する工程を含むことができることを意図する。
本明細書中に提供したガイダンスを考慮すると、例えば、表３Ａ〜３Ｍ中の他のポリペプチド由来の種々のアミノ酸の相違と本明細書中に記載の他の残基の位置との新規の組み合わせの添加によるその後の一連の進化によって、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子の任意の例示的な操作されたポリペプチド配列を、他の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの合成のための出発アミノ酸配列として使用することができることをさらに意図する。より初期の一連の進化を通して不変なままの残基の位置にアミノ酸の相違を含めることによってさらに改良することができる。したがって、いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性および表３Ａ〜３Ｍに提供される通りの少なくとも１つの置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、の参照配列と比較した場合に、少なくとも２つの残基の相違を含むアミノ酸配列を含む。
当業者が認識するように、いくつかの実施形態では、選択された上記の残基の相違の１つまたは組み合わせを、コア配列として操作されたイミンレダクターゼ中に一定に維持し、他の残基の位置のさらなる残基の相違をコア配列に組み込むことにより性質が改良されたさらなる操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを生成することができる。したがって、上記の残基の相違の１つまたはサブセットを含む任意の操作されたイミンレダクターゼについて、本発明が、残基の相違の１つまたはサブセット、さらに、本明細書中に開示の他の残基の位置に１つまたはそれを超える残基の相違を含む他の操作されたイミンレダクターゼを意図すると理解すべきである。制限されない例として、残基の位置Ｘ９に残基の相違を含む操作されたイミンレダクターゼは、他の残基の位置（例えば、Ｘ１９８など）に１つまたはそれを超える残基の相違をさらに組み込むことができる。
一般に、本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、（スキーム１に例示のように）式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）の化合物を、配列番号２のＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｃ１株野生型オピンデヒドロゲナーゼ参照ポリペプチドと比較するか、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子の操作されたポリペプチドから選択されるイミンレダクターゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較した場合に、活性および／または立体選択性が改良された式（ＩＩＩ）のアミン生成物化合物に変換することができる。いくつかの実施形態では、活性の改良および／または立体選択性の改良は、表２に示す式（Ｉ）の化合物と式（ＩＩ）の化合物との特定の組み合わせの表２に示す式（ＩＩＩ）の対応するアミン生成物化合物への変換に関連する。
したがって、いくつかの実施形態では、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子から選択される参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性、ならびに配列番号２と比較した場合に、本明細書に提供されるものから選択される残基の位置に１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を有する本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で１つまたはそれを超える以下の変換反応が可能であり、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子の参照ポリペプチドと比較した場合に活性および／または立体選択性が改良される：
（ａ）基質化合物（１ａ）および（２ａ）の生成物化合物（３ａ）への変換；
（ｂ）基質化合物（１ｂ）および（２ｂ）の生成物化合物（３ｂ）への変換；
（ｃ）基質化合物（１ｃ）および（２ｃ）の生成物化合物（３ｃ）への変換；
（ｄ）基質化合物（１ｄ）および（２ｄ）の生成物化合物（３ｄ）への変換；
（ｅ）基質化合物（１ｄ）および（２ｃ）の生成物化合物（３ｅ）への変換；
（ｆ）基質化合物（１ｄ）および（２ｃ）の生成物化合物（３ｆ）への変換；および
（ｇ）基質化合物（１ｄ）および（２ｃ）の生成物化合物（３ｇ）への変換。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有し、適切な反応条件下で１つまたはそれを超える上記変換反応（ａ）〜（ｇ）を触媒することができ、活性および／または立体選択性が改良された操作されたポリペプチドは、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子のうちの１つと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、配列番号２と比較した場合に、表３Ａ〜３Ｍに提供する配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子のうちのいずれか１つに存在するアミノ酸残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有し、適切な反応条件下で１つまたはそれを超える上記変換反応（ａ）〜（ｇ）を触媒することができ、活性および／または立体選択性が改良された操作されたポリペプチドは、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子から選択される配列を含むアミノ酸配列を有する。本発明の操作されたポリペプチドが由来する配列番号２のＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｃ１株（ＣＥＮＤＨ）由来の野生型オピンデヒドロゲナーゼは、化合物（１）のケトン基質および化合物（２）のアミン基質の第二級アミン生成物化合物（３）への変換において検出可能な活性を持たない。しかし、いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、本明細書に提供されるケトン基質およびアミン基質を本明細書に記載される通りの第二級アミン生成物化合物に変換することができる。
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に開示のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、化合物（１ａ）のケトン基質および化合物（２ａ）のアミン基質を配列番号４の参照ポリペプチドの活性と比較した場合に少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれを超える活性でアミン生成物化合物（３ａ）に変換することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、化合物（１ｂ）のケトン基質および化合物（２ｂ）のアミン基質を配列番号６の参照ポリペプチドの活性と比較した場合に少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれを超える活性でアミン生成物化合物（３ｂ）に変換することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、化合物（１ｃ）のケトン基質および化合物（２ｃ）のアミン基質を配列番号８の参照ポリペプチドの活性と比較した場合に少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれを超える活性でアミン生成物化合物（３ｃ）に変換することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、化合物（１ｄ）のケトン基質および化合物（２ｄ）のアミン基質を配列番号８の参照ポリペプチドの活性と比較した場合に少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれを超える活性でアミン生成物化合物（３ｄ）に変換することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、化合物（１ｄ）のケトン基質および化合物（２ｃ）のアミン基質を配列番号８の参照ポリペプチドの活性と比較した場合に少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれを超える活性でアミン生成物化合物（３ｅ）に変換することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、化合物（１ｄ）のケトン基質および化合物（２ｃ）のアミン基質を配列番号８の参照ポリペプチドの活性と比較した場合に少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれを超える活性でアミン生成物化合物（３ｆ）に変換することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、化合物（１ｄ）のケトン基質および化合物（２ｃ）のアミン基質を配列番号８の参照ポリペプチドの活性と比較した場合に少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれを超える活性でアミン生成物化合物（３ｇ）に変換することができる。
上で特定した残基の相違の位置に加えて，本明細書中に開示の任意の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、表３Ａ〜３Ｍに開示のアミノ酸相違の位置以外の残基の位置に、他の残基の相違をさらに含むことができる。これらの他の残基の位置での残基の相違により、ポリペプチドが表２由来の１つまたはそれを超える上記の変換反応（ａ）〜（ｇ）を触媒する能力に悪影響を与えずにアミノ酸配列をさらに変動させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、配列番号４〜１３００から選択される操作されたイミンレダクターゼポリペプチドのうちのいずれか１つに存在するアミノ酸残基の相違に加えて、配列は、配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に他のアミノ酸残基の位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個の残基の相違をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基の相違の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個の残基の位置にあり得る。いくつかの実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基の相違の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の残基の位置にあり得る。これらの他の位置での残基の相違は、保存的変化または非保存的変化であり得る。いくつかの実施形態では、残基の相違は、配列番号２の天然に存在するイミンレダクターゼポリペプチドまたは配列番号４、６および／または８の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドと比較した場合に保存的置換および非保存的置換を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、操作されたイミンレダクターゼの機能活性および／または改良された性質を保持する本明細書中に記載の任意の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドのフラグメントを含む操作されたポリペプチドを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、適切な反応条件下で１つまたはそれを超える上記の表２の変換反応（ａ）〜（ｇ）を触媒することができるポリペプチドフラグメントであって、このフラグメントが、本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチド（配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子から選択される例示的な操作されたイミンレダクターゼポリペプチドなど）の全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む、ポリペプチドフラグメントを提供する。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼポリペプチド（配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子の例示的な操作されたポリペプチドなど）のうちのいずれか１つの欠失を含むアミノ酸配列を有することができる。したがって、本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの各実施形態およびあらゆる実施形態のために、アミノ酸配列は、イミンレダクターゼポリペプチドの１つまたはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、３またはそれを超えるアミノ酸、４またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、６またはそれを超えるアミノ酸、８またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、または２０またはそれを超えるアミノ酸、総アミノ酸数の１０％まで、総アミノ酸数の１０％まで、総アミノ酸数の２０％まで、または総アミノ酸数の３０％までの欠失を含むことができ、本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼの関連する機能活性および／または改良された性質が維持される。いくつかの実施形態では、欠失は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個のアミノ酸残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、欠失数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基数であり得る。いくつかの実施形態では、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼポリペプチド（配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子の例示的な操作されたポリペプチドなど）のうちのいずれか１つと比較した場合に挿入を含むアミノ酸配列を有することができる。したがって、本発明のイミンレダクターゼポリペプチドの各実施形態およびあらゆる実施形態のために、挿入は、１つまたはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、３またはそれを超えるアミノ酸、４またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、６またはそれを超えるアミノ酸、８またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、２０またはそれを超えるアミノ酸、３０またはそれを超えるアミノ酸、４０またはそれを超えるアミノ酸、または５０またはそれを超えるアミノ酸を含むことができ、本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼの関連する機能活性および／または改良された性質が維持される。挿入は、イミンレダクターゼポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端または内部に存在し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書中の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドは、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子から選択される配列を含むアミノ酸配列、ならびに任意選択的に１つまたは数個の（例えば、３、４、５まで、または１０までの）アミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列数は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
上記の実施形態では、操作されたポリペプチドの適切な反応条件は、表３Ａ〜３Ｍおよび実施例に記載のＨＴＰアッセイ条件であり得る。これらの前述のＨＴＰ反応条件およびＳＦＰ反応条件ならびにイミンレダクターゼポリペプチドの使用のガイダンスを、とりわけ、表３Ａ〜３Ｍおよび実施例に示す。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが他のポリペプチド（制限されない例として、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、金属への結合のためのＨｉｓタグ）、および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル）など）に融合した融合ポリペプチドの形態であり得る。したがって、本明細書中に記載の操作されたポリペプチドを、他のポリペプチドに融合するか融合せずに使用することができる。
本明細書中に記載のポリペプチドが遺伝的にコードされたアミノ酸に制限されないと理解すべきである。遺伝的にコードされたアミノ酸に加えて、本明細書中に記載のポリペプチドは、その全体または一部が、天然に存在し、そして／または合成によるコードされないアミノ酸から構成され得る。本明細書中に記載のポリペプチドを構成することができる一定の一般的に認められる非コードアミノ酸には、以下が含まれるが、これらに限定されない：遺伝的にコードされたアミノ酸のＤ−ステレオマー；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓｔｙｒｙｌｋａｌａｎｉｎｅ）（ｓＡｌａ）；アントリルアラニン（ａｕｔｈｒｙｌａｌａｎｉｎｅ）（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（３−ａｍｉｎｏ−５−ｐｈｅｎｙｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリジン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈｏｍｏｇｌｕｔａｎｉｃ ａｃｉｄ）（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペント−（２または３）−エン−４ カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）。本明細書中に記載のポリペプチドを構成することができるさらなるコードされないアミノ酸は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ａｔ ｐｐ．３−７０、および引用文献（その全てが本明細書中で参照によって組み込まれる）に記載の種々のアミノ酸を参照のこと）。これらのアミノ酸は、Ｌ立体配置またはＤ立体配置のいずれかであり得る。
当業者は、側鎖保護基を保有するアミノ酸または残基が本明細書中に記載のポリペプチドを構成することもできると認識するであろう。この場合に芳香族カテゴリーに属するかかる保護されたアミノ酸の非限定的な例には、以下が含まれるが、これらに限定されない（カッコ内に保護基を列挙する）：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）、およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）。
本明細書中に記載のポリペプチドを構成することができるコンフォメーションが拘束された非コードアミノ酸には、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ−立体配置）；１−アミノシクロペント−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、例えば、実質的に精製された酵素としての単離された調製物、酵素をコードする遺伝子を使用して形質転換されたホールセル、ならびに／またはかかる細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解物などの種々の形態であり得る。酵素は、以下でさらに考察するように、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、沈殿形態、または粗ペースト形態であり得る。
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドを、固体支持体（膜、樹脂、固体キャリア、または他の固相材料など）上に提供することができる。固体支持体は、有機ポリマー（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドなど）、ならびにそのコポリマーおよびグラフトから構成され得る。固体支持体は、ガラス、シリカ、孔制御ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金属（金または白金など）などの無機固体支持体でもあり得る。固体支持体の構成は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜、または面の形態であり得る。面は、平面、実質的平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であってよく、膨潤性または非膨潤性であり得る。固体支持体を、ウェル、窪み、または他の容器、管の形態、特徴、または位置で構成することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを、このポリペプチドが配列番号４、６および／または８の参照の操作されたポリペプチドと比較した場合に改良された活性、立体選択性、および／または他の改良された性質を保持するように固体支持体上に固定することができる。かかる実施形態では、固定されたポリペプチドは、式（Ｉ）および式（ＩＩ）のケトン基質化合物およびアミン基質化合物の式（ＩＩＩ）のアミン生成物化合物への生体触媒変換（例えば、表２の変換反応（ａ）〜（ｇ）など）を容易にすることができ、反応完了後に容易に保持され（例えば、ポリペプチドが固定されたビーズの保持による）、次いで、その後の反応で再利用またはリサイクルされる。かかる酵素の固定化プロセスによりさらに効率が上がり、経費が抑えられる。したがって、本発明のイミンレダクターゼポリペプチドの任意の使用方法を、固体支持体に結合または固定された同一のイミンレダクターゼポリペプチドを使用して実施することができることがさらに意図される。
酵素の固定方法は、当該分野で周知である。操作されたポリペプチドを、非共有結合または共有結合することができる。固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）への酵素の種々のコンジュゲーションおよび固定方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｙｉら，Ｐｒｏｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４２：８９５−８９８［２００７］；Ｍａｒｔｉｎら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７６：８４３−８５１［２００７］；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔ．Ｂ：Ｅｎｚｙ．，６３：３９−４４［２０１０］；Ｔｒｕｐｐｏら，Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ［２００８］；Ｍａｔｅｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｒｏｇ．，１８：６２９−３４［２００２］；およびＣ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ［ｅｄ．］，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ［２００４］（それぞれ、本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。本発明の操作されたイミンレダクターゼの固定に有用な固体支持体には、エポキシド官能基を有するポリメタクリラート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリラート、スチレン／ＤＶＢコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリラートを含むビーズまたは樹脂が含まれるが、これらに限定されない。本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの固定に有用な固体支持体の例には、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ、およびＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）（以下の異なるタイプのＳＥＰＡＢＥＡＤが含まれる：ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９、およびＥＸＥ１２０）が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のポリペプチドを、キットの形態で提供することができる。キット中の酵素は、個別に存在し得るか、複数の酵素として存在し得る。キットは、酵素反応を行うための試薬、酵素活性を評価するための基質、および生成物を検出するための試薬をさらに含むことができる。キットはまた、試薬用ディスペンサーおよびキットの使用説明書を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、異なるアドレス可能位置に複数の異なるイミンレダクターゼポリペプチドを含むアレイを含み、異なるポリペプチドが、それぞれが少なくとも１つの異なる改良された酵素の性質を有する参照配列の異なるバリアントである。いくつかの実施形態では、固体支持体上に固定した複数のポリペプチドを、ロボットによる試薬送達のためにアドレス可能であるか、検出方法および／または検出装置によってアレイの種々の位置に構成することができる。アレイを使用して、ポリペプチドによる変換について種々の基質化合物を試験することができる。複数の操作されたポリペプチドを含むかかるアレイおよびその使用方法は当該分野で公知である（例えば、ＷＯ２００９／００８９０８Ａ２号を参照のこと）。
６．４ 操作されたイミンレダクターゼをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を調節する１つまたはそれを超える異種制御配列に作動可能に連結してポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製することができる。操作されたイミンレダクターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するイミンレダクターゼポリペプチドを発現させることができる。
当業者に明らかなように、タンパク質配列の利用可能性および種々のアミノ酸に対応するコドンの知識により、対象ポリペプチドをコードすることができる全てのポリヌクレオチドが説明される。同一のアミノ酸が代替コドンまたは同義語コドンによってコードされる遺伝暗号の縮重により、非常に多数の核酸を作製することが可能であり、その核酸の全てが改良されたイミンレダクターゼ酵素をコードする。したがって、特定のアミノ酸配列の知識を有することにより、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変えない方法で１つまたはそれを超えるコドンの配列を改変するだけでいくつもの異なる核酸を作製することができる。これに関して、本発明は、可能なコドンの選択に基づいた組み合わせの選択による本明細書中に記載のポリペプチドをコードする作製可能なポリヌクレオチドのそれぞれおよびあらゆる可能なバリエーションを具体的に意図し、全てのかかるバリエーションは、本明細書中に記載の任意のポリペプチド（本明細書中で参照によって組み込まれた表３Ａ〜３Ｍに示し、配列表に配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子として開示したアミノ酸配列が含まれる）について具体的に開示されると見なされるものとする。
種々の実施形態では、タンパク質が生成される宿主細胞に適合するようにコドンを選択することが好ましい。例えば、細菌中で遺伝子を発現するために細菌中で使用される好ましいコドンを使用し；酵母中での発現のために酵母中で使用される好ましいコドンを使用し；哺乳動物細胞中での発現のために哺乳動物中で使用される好ましいコドンを使用する。いくつかの実施形態では、天然の配列が好ましいコドンを含み、好ましいコドンの使用が全てのアミノ酸残基に必要でないかもしれないので、全てのコドンがイミンレダクターゼのコドン使用頻度を最適化するために置換される必要はない。したがって、イミンレダクターゼ酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える位置で好ましいコドンを含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２の天然に存在するイミンレダクターゼポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１のコドン最適化核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性を含む核酸配列を有する。配列番号１のコドン最適化配列は、コードされた天然に存在するイミンレダクターゼの発現を増強する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１の参照配列またはその相補物とハイブリッド形成することができ、イミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、上記のように、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に改良された性質を有するイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子から選択される参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、上記のように、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に改良された性質を有するイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子から選択される参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、基質化合物（１ａ）および（２ａ）を生成物化合物（３ａ）に変換することができ、配列番号４、１２および／または３０と比較した場合に性質が改良されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、参照配列である配列番号４と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性、および配列番号４と比較した場合に、以下：Ｘ１９８、Ｘ１５３、Ｘ１６７、Ｘ２６５、Ｘ２６２、Ｘ１０８、Ｘ２３４、Ｘ２８４、Ｘ２８２、Ｘ２２０、Ｘ２７２、Ｘ２５６、Ｘ２６７、Ｘ２４２、Ｘ２８１、Ｘ１９７、Ｘ２７７、Ｘ２２４およびＸ１４３から選択される残基の位置に１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、基質化合物（１ｂ）および（２ｂ）を生成物化合物（３ｂ）に変換することができ、配列番号６、１２６および／または１７３と比較した場合に性質が改良されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、参照配列である配列番号６と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性、および配列番号６と比較した場合に、以下： Ｘ２８３、Ｘ２６２、Ｘ９、Ｘ２５９、Ｘ２２０、Ｘ２６７、Ｘ１５３、Ｘ２７９、Ｘ２００、Ｘ２２４、Ｘ２５６、Ｘ１３７、Ｘ１４３、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ１５４、Ｘ２７６およびＸ１８５から選択される残基の相違の少なくともある組み合わせを有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、基質化合物（１ｃ）および（２ｃ）を生成物化合物（３ｃ）に変換することができ、配列番号８と比較した場合に性質が改良されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、参照配列である配列番号８と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性、および配列番号８と比較した場合に、表３Ｇに示される残基の相違の組み合わせを有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、基質化合物（１ｄ）および（２ｄ）を生成物化合物（３ｄ）に変換することができ、配列番号８と比較した場合に性質が改良されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、参照配列である配列番号８と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性、および配列番号８と比較した場合に、表３Ｇに示される残基の相違の組み合わせを有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、基質化合物（１ｄ）および（２ｃ）を生成物化合物（３ｅ）に変換することができ、配列番号８と比較した場合に性質が改良されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、参照配列である配列番号８と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性、および配列番号８と比較した場合に、表３Ｇに示される残基の相違の組み合わせを有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、基質化合物（１ｄ）および（２ｃ）を生成物化合物（３ｆ）に変換することができ、配列番号３６０および／または５５０と比較した場合に性質が改良されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、参照配列である配列番号８と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性、および配列番号８と比較した場合に、表３Ｈおよび３Ｉに示される残基の相違の組み合わせを有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、基質化合物（１ｄ）および（２ｃ）を生成物化合物（３ｇ）に変換することができ、配列番号３６０および／または５５０と比較した場合に性質が改良されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、参照配列である配列番号８と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性、および配列番号８と比較した場合に、Ｘ１２、Ｘ３１、Ｘ３７、Ｘ４４、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ６５、Ｘ８２、Ｘ９３、Ｘ９８、Ｘ１０８、Ｘ１３７、Ｘ１３８、Ｘ１４１、Ｘ１４２、Ｘ１４３、Ｘ１５３、Ｘ１５４、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５９、Ｘ１６６、Ｘ１６８、Ｘ１７３、Ｘ１７７、Ｘ１７８、Ｘ１８４、Ｘ１８５、Ｘ１９５、Ｘ１９７、Ｘ１９９、Ｘ２００、Ｘ２０１、Ｘ２０３、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１３、Ｘ２１５、Ｘ２１６、Ｘ２１８、Ｘ２２０、Ｘ２２１、Ｘ２２３、Ｘ２２６、Ｘ２３４、Ｘ２３９、Ｘ２４２、Ｘ２４５、Ｘ２５１、Ｘ２５３、Ｘ２５６、Ｘ２５７、Ｘ２５９、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ２６２、Ｘ２６３、Ｘ２６５、Ｘ２６６、Ｘ２６７、Ｘ２６８、Ｘ２６９、Ｘ２７３、Ｘ２７４、Ｘ２７７、Ｘ２７８、Ｘ２７９、Ｘ２８０、Ｘ２８１、Ｘ２８２、Ｘ２８３、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ２８９、Ｘ２９０、Ｘ２９１、Ｘ２９２、Ｘ２９３、Ｘ２９４、Ｘ３３０およびＸ３４９から選択される残基の相違の少なくともある組み合わせを有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、基質化合物（１）および（２）を生成物化合物（３）に変換することができ、配列番号２、４、６、８、１２、３０、１２６、１７３、３６０および／または５５０の参照ポリペプチドと比較した場合に酵素の性質が改良された操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子のうちのいずれか１つから選択される参照ポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、但し、アミノ酸配列が、配列番号２と比較した場合に、表３Ａ〜３Ｍに列挙する配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子のポリペプチド配列のうちのいずれか１つに含まれる残基の相違の組のうちのいずれか１つを含むことを条件とする。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４〜１３００のうち奇数番号の配列識別子から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号３〜１２９９うち奇数番号の配列識別子から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補物にハイブリッド形成することができ、本明細書中に記載の１つまたはそれを超える改良された性質を有するイミンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に、以下：Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ３１、Ｘ３７、Ｘ４４、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ６５、Ｘ８２、Ｘ９３、Ｘ９８、Ｘ１０８、Ｘ１３７、Ｘ１３８、Ｘ１４１、Ｘ１４２、Ｘ１４３、Ｘ１５３、Ｘ１５４、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５９、Ｘ１６６、Ｘ１６７、Ｘ１６８、Ｘ１７３、Ｘ１７７、Ｘ１７８、Ｘ１８４、Ｘ１８５、Ｘ１９５、Ｘ１９７、Ｘ１９８、Ｘ１９９、Ｘ２００、Ｘ２０１、Ｘ２０３、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１３、Ｘ２１５、Ｘ２１６、Ｘ２１８，Ｘ２２０、Ｘ２２１、Ｘ２２３、Ｘ２２４、Ｘ２２６、Ｘ２３４、Ｘ２３９、Ｘ２４２、Ｘ２４５、Ｘ２５１、Ｘ２５３、Ｘ２５６、Ｘ２５９、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ２６２、Ｘ２６３、Ｘ２６５、Ｘ２６６、Ｘ２６７、Ｘ２６８、Ｘ２６９、Ｘ２７２、Ｘ２７３、Ｘ２７４、Ｘ２７６、Ｘ２７７、Ｘ２７８、Ｘ２７９、Ｘ２８０、Ｘ２８１、Ｘ２８２、Ｘ２８３、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ２８９、Ｘ２９０、Ｘ２９１、Ｘ２９２、Ｘ２９３、Ｘ２９４、Ｘ３３０およびＸ３４９から選択される残基の位置に１つまたはそれを超える残基の相違を含むアミノ酸配列を有するイミンレダクターゼポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、これらの残基の位置における具体的な残基の相違は、以下：配列番号４に対してＳ２８４Ｑ／Ｌ／Ｈ／Ｃ、Ｌ２７７Ａ、Ｅ２７２Ｄ、Ｓ２６２Ｖ、Ｅ２５６Ｖ／Ｓ／Ａ、Ｉ２４２Ｃ、Ａ２３４Ｃ、Ｈ２２０Ｑ、Ｅ１９８Ｄ、Ｙ１５３Ｇ／Ｑ／Ｎ／Ｒ／Ｅ、Ａ１６７Ｔ、Ｑ２６５Ｔ、Ｎ１０８Ｃ、Ｇ２８２Ｌ、Ｐ２６７Ａ、Ｉ１９７Ｍ、Ｑ２６５Ｖ、Ｒ２８１Ｎ／Ｐ／Ｌ、Ｅ２２４ＤおよびＲ１４３Ｋ；または配列番号６に対してＶ９Ｇ、Ｎ１３７Ｄ、Ｒ１４３Ｋ、Ｙ１５３Ｌ／Ｍ、Ｆ１５４Ｖ、Ａ１８５Ｔ、Ｖ２００Ｓ、Ｈ２２０Ｅ、Ｅ２２４Ｈ、Ｅ２５６Ｃ／Ｗ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ２５９Ｍ、Ｋ２６０Ｒ、Ｉ２６１Ｒ、Ｓ２６２Ｆ／Ｎ、Ｐ２６７Ｉ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、Ｇ２７６Ｓ、Ｖ２７９Ａ／Ｈ／Ｌ／Ｎ／ＹおよびＶ２８３Ｅ／Ｔ／Ｗ；または配列番号８に対してＭ１２Ｌ、Ｌ３１Ｍ、Ａ３７Ｐ、Ｑ４４Ｎ、Ｒ４６Ｓ／Ｎ、Ａ４８Ｇ、Ｇ５５Ｙ／Ｃ、Ｌ５６Ｍ、Ｖ６５Ｌ／Ｆ、Ｔ８２Ｖ、Ａ９３Ｇ、Ｙ９８Ｗ／Ｃ、Ｎ１０８Ｓ、Ｎ１３７Ｄ、Ｍ１３８Ｌ、Ｗ１４１Ｖ／Ｔ／Ｓ、Ｃ１４２Ａ、Ｒ１４３Ｗ／Ｌ、Ｙ１５３Ｆ／Ｅ／Ｇ／Ａ、Ｆ１５４Ｖ／Ｍ／Ｌ、Ｉ１５５Ｍ／Ｓ、Ｔ１５６Ｍ／Ｑ／Ｇ／Ｅ／Ａ、Ｑ１５９Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｅ、Ａ１６６Ｉ、Ｋ１６８Ｍ、Ｌ１７３Ｍ、Ｇ１７７Ｔ／Ａ、Ｓ１７８Ｅ、Ｑ１８４Ｌ、Ａ１８５Ｌ／Ｇ、Ｔ１９５Ｓ／Ｒ、Ｉ１９７Ｔ／Ｌ、Ａ１９９Ｖ、Ｖ２００Ｙ、Ｉ２０１Ｍ／Ｌ／Ｆ／Ｃ／Ａ、Ｐ２０３Ｇ、Ｐ２０５Ｔ／Ｓ／Ｎ／Ｌ／Ｇ／Ｄ／Ａ、Ｔ２０６Ｖ／Ｑ／Ｎ／Ｍ／Ｌ／Ｉ／Ｈ／Ｄ、Ａ２１０Ｆ、Ｃ２１３Ｙ／Ｖ／Ｍ／Ｌ／Ｆ、Ｓ２１５Ｅ、Ｇ２１６Ｖ／Ｓ／Ｒ、Ｐ２１８Ｑ、Ｈ２２０Ｄ、Ｙ２２１Ｗ／Ｍ／Ｌ／Ｉ、Ｔ２２３Ｓ、Ｉ２２６Ｙ、Ｃ２３４Ｍ／Ａ、Ａ２３９Ｑ、Ｉ２４２Ｃ／Ｖ、Ａ２４５Ｇ、Ｎ２５１Ｅ、Ｐ２５３Ｄ、Ａ２５６Ｓ／Ｌ／Ｅ／Ｎ／Ｋ／Ｇ、Ｅ２５７Ｓ、Ｖ２５９Ｍ／Ｌ、Ｎ２６０Ｄ／Ｋ、Ｈ２６１Ｉ／Ｅ／Ｄ、Ｖ２６２Ｓ、Ｃ２６３Ｑ／Ｅ／Ｔ、Ｑ２６５Ｎ、Ｔ２６６Ｐ／Ｎ、Ｐ２６７Ｖ／Ｑ／Ｋ、Ａ２６８Ｎ／Ｄ、Ｔ２６９Ｈ、Ａ２７３Ｖ／Ｔ／Ｉ、Ｍ２７４Ｖ、Ｌ２７７Ｍ、Ｐ２７８Ｖ、Ｖ２７９Ｆ／Ｒ／Ｅ、Ｌ２８０Ｐ／Ｅ、Ｒ２８１Ａ／Ｓ、Ｇ２８２Ｔ、Ｖ２８３Ｙ／Ｗ／Ｔ、Ｓ２８４Ｐ／Ｍ／Ｈ／Ｉ、Ｇ２８５Ｗ、Ｌ２８９Ｗ／Ｒ、Ｎ２９０Ｙ／Ｓ／Ｒ、Ｔ２９１Ａ、Ｅ２９２Ｖ、Ｈ２９３Ｙ／Ｑ／Ｍ／Ｌ／Ｆ、Ｆ２９４Ａ、Ｉ３３０ＶおよびＬ３４９Ｐから選択される。
いくつかの実施形態では、残基の相違は、以下：配列番号４に対してＥ１９８Ｄ、Ｙ１５３Ｇ／Ｑ／Ｎ／Ｒ、Ａ１６７Ｔ、Ｑ２６５Ｔ／Ｖ、Ｎ１０８Ｃ、Ｇ２８２Ｌ、Ｐ２６７Ａ、Ｉ１９７Ｍ、Ｒ２８１Ｎ／Ｐ／Ｌ、Ｅ２２４ＤおよびＲ１４３Ｋ；または配列番号６に対してＶ９Ｇ、Ｎ１３７Ｄ、Ｒ１４３Ｋ、Ｙ１５３Ｌ／Ｍ、Ａ１８５Ｔ、Ｈ２２０Ｅ、Ｅ２２４Ｈ、Ｅ２５６Ｗ／Ｃ、Ｖ２５９Ｍ／Ｉ、Ｋ２６０Ｒ、Ｓ２６２Ｎ、Ｐ２６７Ｙ／Ｔ、Ｇ２７６Ｓ、Ｖ２７９Ａ／Ｈ／Ｎ、Ｖ２８３Ｔ／Ｗ／Ｅ；または配列番号８に対してＭ１２Ｌ、Ｌ３１Ｍ、Ｑ４４Ｎ、Ｒ４６Ｓ／Ｎ、Ａ４８Ｇ、Ｇ５５Ｙ／Ｃ、Ｌ５６Ｍ、Ｖ６５Ｌ／Ｆ、Ｔ８２Ｖ、Ｙ９８Ｗ／Ｃ、Ｎ１３７Ｄ、Ｗ１４１Ｖ／Ｔ／Ｓ、Ｙ１５３Ｇ／Ａ、Ｉ１５５Ｓ、Ｔ１５６Ｑ／Ｇ／Ｅ／Ａ、Ｑ１５９Ｍ／Ｉ／Ｅ、Ａ１６６Ｉ、Ｋ１６８Ｍ、Ｌ１７３Ｍ、Ｇ１７７Ｔ／Ａ、Ｑ１８４Ｌ、Ａ１８５Ｌ／Ｇ、Ｔ１９５Ｒ、Ｉ１９７Ｔ／Ｌ、Ａ１９９Ｖ、Ｖ２００Ｙ、Ｉ２０１Ｍ／Ｌ／Ｆ／Ｃ／Ａ、Ｐ２０３Ｇ、Ｐ２０５Ｔ／Ｓ／Ｎ／Ｌ／Ｇ／Ｄ／Ａ、Ｔ２０６Ｖ／Ｑ／Ｎ／Ｍ／Ｌ／Ｉ／Ｈ／Ｄ、Ａ２１０Ｆ、Ｃ２１３Ｙ／Ｖ／Ｍ／Ｌ／Ｆ、Ｓ２１５Ｅ、Ｇ２１６Ｖ／Ｓ／Ｒ、Ｐ２１８Ｑ、Ｙ２２１Ｗ／Ｍ／Ｌ／Ｉ、Ｉ２２６Ｙ、Ｃ２３４Ｍ／Ａ、Ａ２３９Ｑ、Ｉ２４２Ｖ、Ａ２４５Ｇ、Ｎ２５１Ｅ、Ｐ２５３Ｄ、Ａ２５６Ｎ／Ｋ／Ｇ、Ｅ２５７Ｓ、Ｖ２５９Ｍ／Ｌ、Ｎ２６０Ｋ、Ｈ２６１Ｄ、Ｖ２６２Ｓ、Ｃ２６３Ｔ、Ｑ２６５Ｎ、Ｔ２６６Ｐ／Ｎ、Ｐ２６７Ｖ／Ｑ／Ｋ、Ａ２６８Ｎ／Ｄ、Ｔ２６９Ｈ、Ａ２７３Ｖ／Ｔ／Ｉ、Ｍ２７４Ｖ、Ｌ２７７Ｍ、Ｐ２７８Ｖ、Ｖ２７９Ｒ／Ｅ、Ｌ２８０Ｐ／Ｅ、Ｒ２８１Ｓ、Ｇ２８２Ｔ、Ｖ２８３Ｙ／Ｗ／Ｔ、Ｓ２８４Ｉ、Ｇ２８５Ｗ、Ｌ２８９Ｗ／Ｒ、Ｎ２９０Ｙ／Ｓ／Ｒ、Ｔ２９１Ａ、Ｅ２９２Ｖ、Ｈ２９３Ｙ／Ｑ／Ｍ／Ｌ／Ｆ、Ｉ３３０ＶおよびＬ３４９Ｐから選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のポリペプチドをコードするが、操作されたイミンレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで約８０％、またはそれを超える配列同一性、約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号３〜１２９９のうち奇数番号の配列識別子から選択される。
改良されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現させる種々の方法で操作することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を制御するための１つまたはそれを超える調節配列が存在する発現ベクターとして提供することができる。発現ベクターに応じて単離されたポリヌクレオチドをベクターへの挿入前に操作することが望ましいか必要かもしれない。組換えＤＮＡ法を利用したポリヌクレオチドおよび核酸配列の改変技術は、当該分野で周知である。
いくつかの実施形態では、調節配列には、とりわけ、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれる。適切なプロモーターを、使用する宿主細胞に基づいて選択することができる。細菌宿主細胞のために、本発明の核酸構築物の転写の指示に適切なプロモーターには、大腸菌ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１［１９７８］）から得たプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５［１９８３］）が含まれる。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターには、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、ＷＯ９６／００７８７号を参照のこと）の遺伝子から得たプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、その変異プロモーター、短縮プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが含まれる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８［１９９２］を参照のこと）。
調節配列はまた、適切な転写終結配列（転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列）であり得る。終結配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞で機能する任意のターミネーターを、本発明で使用することができる。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのα−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロム Ｃ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターはまた、当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら，前出を参照のこと）。
調節配列はまた、適切なリーダー配列（宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）であり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞で機能する任意のリーダー配列を使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得る。酵母宿主細胞に適切なリーダーを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得る。
調節配列はまた、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写時に転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）であり得る。最適な宿主細胞で機能する任意のポリアデニル化配列を、本発明で使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ α−グルコシダーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、当該分野で公知である（例えば、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５：５９８３−５９９０［１９９５］を参照のこと）。
調節配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向づけるシグナルペプチドコード領域であり得る。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと共に翻訳読み枠中に天然に連結したシグナルペプチドコード領域を固有に含むことができる。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード領域を含むことができる。発現されたポリペプチドを最適な宿主細胞の分泌経路に方向づける任意のシグナルペプチドコード領域を、本発明で使用することができる。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得たシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、当該分野で公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５７：１０９−１３７［１９９３］を参照のこと）。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得たシグナルペプチドコード領域であり得る。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子に由来し得る。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら，前出を参照のこと）。
調節配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られたポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合、酵素原）として公知である。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断によって活性な成熟ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子から得ることができる（例えば、ＷＯ９５／３３８３６号を参照のこと）。シグナルペプチド領域およびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端に隣接し、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端に隣接する。
宿主細胞の成長に関連するポリペプチドの発現を制御可能な制御配列を付加することも望ましいかもしれない。制御系の例は、化学的刺激または物理的刺激（制御化合物の存在が含まれる）に応答して遺伝子発現をオンまたはオフにする制御系である。原核生物宿主細胞では、適切な制御配列には、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐのオペレーター系が含まれる。酵母宿主細胞では、適切な制御系には、例として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が含まれる。糸状菌では、適切な制御配列には、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが含まれる。
制御配列の他の例は、遺伝子増幅が可能な制御配列である。真核生物系では、これらの配列には、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および重金属と共に増幅されるメタロチオネイン遺伝子が含まれる。これらの場合、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、制御配列に作動可能に連結されるであろう。
別の態様では、本発明はまた、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および導入される宿主のタイプに応じて１つまたはそれを超える発現制御領域（プロモーターおよびターミネーターなど）、複製起点などを含む組換え発現ベクターに関する。上記の種々の核酸および調節配列を共に接合して組換え発現ベクターを産生することができ、この組換え発現ベクターは、１つまたはそれを超える都合の良い制限部位を含むことができ、この制限部位は、かかる部位でのポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換が可能である。あるいは、本発明の核酸配列を、核酸配列または該配列を含む核酸構築物を発現に適切なベクター内に挿入することによって発現することができる。発現ベクターの作製では、コード配列が発現に適切な調節配列と作動可能に連結されるようにコード配列をベクター中に配置する。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に都合よく供することができ、且つポリヌクレオチド配列を発現することができる任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとベクターを導入すべき宿主細胞との適合性に依存するであろう。ベクターは、線状プラスミドまたは閉じた環状プラスミドであり得る。
発現ベクターは、その複製が染色体複製から独立している自己複製ベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクター）（例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）であり得る。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含むことができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された場合にゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。さらに、単一のベクターまたはプラスミドまたは宿主細胞のゲノムに導入されるべきＤＮＡの全てを共に含む２つまたはそれを超えるベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンを使用することができる。
本発明の発現ベクターは、形質転換した細胞を容易に選択することができる１つまたはそれを超える選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属耐性、および栄養素要求体に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌選択マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、あるいは、抗生物質耐性（アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール（実施例１）、またはテトラサイクリンへの耐性など）を付与するマーカーである。酵母宿主細胞に適切なマーカーには、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が含まれるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞で用いる選択マーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにその等価物が含まれるが、これらに限定されない。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞で用いる実施形態には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が含まれる。
別の態様では、本発明は、本発明の改良されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、このポリヌクレオチドが宿主細胞中でイミンレダクターゼ酵素の発現のための１つまたはそれを超える調節配列に作動可能に連結されている、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされたポリペプチドの発現で用いる宿主細胞は、当該分野で周知であり、細菌細胞（大腸菌細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞など）；真菌細胞（酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））など）；昆虫細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞など）；動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞など）；および植物細胞が含まれるが、これらに限定されない。例示的な宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１である。
上記宿主細胞の適切な培養培地および成長条件は当該分野で周知である。イミンレダクターゼ発現のためのポリヌクレオチドを、当該分野で公知の種々の方法によって細胞に導入することができる。技術には、とりわけ、エレクトロポレーション、遺伝子銃粒子衝突、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が含まれる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、無細胞発現系中で発現することができる（例えば、Ｋｕｄｌｉｃｋｉら，Ｃｅｌｌ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，１ｓｔ Ｅｄ．，Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ［２００７］；およびＳｐｉｒｉｎら，（ｅｄｓ．），Ｃｅｌｌ Ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１ｓｔ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ［２００７］（その全てが本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。
本明細書中の実施形態では、改良されたポリペプチドおよび対応するポリヌクレオチドを、当業者によって使用される方法を使用して得ることができる。本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼを、野生型オピンデヒドロゲナーゼＣＥＮＤＨ（配列番号２）または別の操作されたイミンレダクターゼをコードする天然に存在する遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、上記で考察した変異誘発および／または指向進化法に供することによって得ることができる。
例えば、変異誘発法および指向進化法を、発現、スクリーニング、およびアッセイが可能なバリアントライブラリーを生成するために、ポリヌクレオチドに容易に適用することができる。変異誘発法および指向進化法は当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，７１６，６３１号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２８８，３７５号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第８，３８３，３４６号、同第８，５０４，４９８号、同第８，８４９，５７５号、同第８，８７６，０６６号、同第８，７６８，８７１号、ならびに全ての関連する非米国対応物；Ｌｉｎｇら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４（２）：１５７−７８［１９９７］；Ｄａｌｅら，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５７：３６９−７４［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：４２３−４６２［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１１９３−１２０１［１９８５］；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３７：１−７［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒら，Ｃｅｌｌ，３８：８７９−８８７［１９８４］；Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ，３４：３１５−３２３［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３：２８４−２９０［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：２５９−２６４［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８−２９１［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：４３６−４３８［１９９７］；Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：４５０４−４５０９［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３１５−３１９［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１［１９９４］；米国特許出願公開第２００８／０２２０９９０号、米国特許出願公開第２００９／０３１２１９６号、米国特許出願公開第２０１４／０００５０５７号、米国特許出願公開第２０１４／０２１４３９１号、米国特許出願公開第２０１４／０２２１２１６号、米国特許出願公開第２０１５／００５０６５８号、米国特許出願公開第２０１５／０１３３３０７号、米国特許出願公開第２０１５／０１３４３１５号および全ての関連非米国対応出願；ＷＯ９５／２２６２５号、ＷＯ９７／００７８号、ＷＯ９７／３５９６６号、ＷＯ９８／２７２３０号、ＷＯ００／４２６５１号、ＷＯ０１／７５７６７号、およびＷＯ２００９／１５２３３６号（その全てが本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。利用される他の指向進化手順には、とりわけ、付着伸長プロセス（ＳｔＥＰ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Ｚｈａｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：２５８−２６１［１９９８］を参照のこと）、変異誘発ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．，３：Ｓ１３６−Ｓ１４０［１９９４］を参照のこと）、およびカセット変異誘発（例えば、Ｂｌａｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：３５２５−３５２９［１９９６］を参照のこと）（その全てが、本明細書中で参照によって組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
変異誘発処置後に得られるクローンを、１つまたはそれを超える所望の改良された酵素の性質を有する操作されたイミンレダクターゼについてスクリーニングすることができる。例えば、望ましい改良された酵素の性質が化合物（１ｂ）のケトンおよび化合物（２ｂ）のアミンの化合物（３ｂ）の第二級アミンへの変換における活性を増加させる場合、酵素活性を、化合物（３ｂ）の生成について測定することができる。次いで、所望の特徴（例えば、化合物（３ｂ）生成の増加）を有するイミンレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含むクローンを単離し、配列決定してヌクレオチド配列の変化（存在する場合）を同定し、これを使用して宿主細胞中で酵素を発現させる。発現ライブラリー由来の酵素活性の測定を、標準的な生化学技術（ＨＰＬＣ分析および／または生成物の誘導体化（分離前または分離後）（例えば、ダンシルクロリドまたはＯＰＡを使用）など）を使用して行うことができる。
操作されたポリペプチドの配列が既知の場合、酵素をコードするポリヌクレオチドを、公知の合成方法にしたがった標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、約１００塩基までのフラグメントを、個別に合成し、次いで、接合して（例えば、酵素的もしくは化学的なライゲーション（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）法、またはポリメラーゼ媒介法による）、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、イミンレダクターゼの一部をコードするポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを、自動化合成法で典型的に実施される古典的なホスホルアミダイト法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−６９［１９８１］を参照のこと）または代替法（例えば、Ｍａｔｔｈｅｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．，３：８０１−０５［１９８４］を参照のこと）を使用した化学合成によって調製することができる。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡ合成機で合成し、精製し、アニーリングし、適切なベクター中にライゲーションし、クローニングする。さらに、本質的に任意の核酸を、種々の販売者のうちのいずれかから得ることができる。いくつかの実施形態では、さらなるバリエーションを、欠失、挿入、および／または置換を含むオリゴヌクレオチドを合成し、種々の順序でオリゴヌクレオチドを組み合わせて性質が改良された操作されたイミンレダクターゼを作製することによって作製することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製する方法であって、（ａ）配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号４と比較した場合に、以下：Ｘ１９８、Ｘ１５３、Ｘ１６７、Ｘ２６５、Ｘ２６２、Ｘ１０８、Ｘ２３４、Ｘ２８４、Ｘ２８２、Ｘ２２０、Ｘ２７２、Ｘ２５６、Ｘ２６７、Ｘ２４２、Ｘ２８１、Ｘ１９７、Ｘ２７７、Ｘ２２４およびＸ１４３から選択される残基の位置に１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされるイミンレダクターゼポリペプチドを発現する工程を含む方法を提供する。方法のいくつかの実施形態において、残基の相違は、配列番号４に対してＥ１９８、Ｙ１５３、Ａ１６７、Ｑ２６５、Ｓ２６２、Ｎ１０８、Ａ２３４、Ｓ２８４、Ｇ２８２、Ｈ２２０、Ｅ２７２、Ｅ２５６、Ｐ２６７、Ｉ２４２、Ｒ２８１、Ｉ１９７、Ｌ２７７、Ｅ２２４およびＲ１４３から選択される。方法のいくつかの実施形態において、残基の相違は、配列番号４に対してＳ２８４Ｑ／Ｌ／Ｈ／Ｃ、Ｌ２７７Ａ、Ｅ２７２Ｄ、Ｓ２６２Ｖ、Ｅ２５６Ｖ／Ｓ／Ａ、Ｉ２４２Ｃ、Ａ２３４Ｃ、Ｈ２２０Ｑ、Ｅ１９８Ｄ、Ｙ１５３Ｇ／Ｑ／Ｎ／Ｒ／Ｅ、Ａ１６７Ｔ、Ｑ２６５Ｔ、Ｎ１０８Ｃ、Ｇ２８２Ｌ、Ｐ２６７Ａ、Ｉ１９７Ｍ、Ｑ２６５Ｖ、Ｒ２８１Ｎ／Ｐ／Ｌ、Ｅ２２４ＤおよびＲ１４３Ｋから選択される。いくつかの追加的な実施形態において、残基の相違は、配列番号４に対してＸ１９８、Ｘ１６７およびＸ２２４から選択される。いくつかのさらなる実施形態において、残基の相違は、配列番号４に対してＥ１９８、Ａ１６７およびＥ２２４から選択される。いくつかの追加的な実施形態において、残基の相違は、配列番号４に対してＥ１９８Ｄ、Ｙ１５３Ｇ／Ｑ／Ｎ／Ｒ、Ａ１６７Ｔ、Ｑ２６５Ｔ／Ｖ、Ｎ１０８Ｃ、Ｇ２８２Ｌ、Ｐ２６７Ａ、Ｉ１９７Ｍ、Ｒ２８１Ｎ／Ｐ／Ｌ、Ｅ２２４ＤおよびＲ１４３Ｋから選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製する方法であって、（ａ）配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号６と比較した場合に、以下：Ｘ２８３、Ｘ２６２、Ｘ９、Ｘ２５９、Ｘ２２０、Ｘ２６７、Ｘ１５３、Ｘ２７９、Ｘ２００、Ｘ２２４、Ｘ２５６、Ｘ１３７、Ｘ１４３、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ１５４、Ｘ２７６およびＸ１８５から選択される残基の位置に１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされるイミンレダクターゼポリペプチドを発現する工程を含む方法を提供する。方法のいくつかの実施形態において、残基の相違は、配列番号６に対してＶ２８３、Ｓ２６２、Ｖ９、Ｖ２５９、Ｈ２２０、Ｐ２６７、Ｙ１５３、Ｖ２７９、Ｖ２００、Ｅ２２４、Ｅ２５６、Ｎ１３７、Ｒ１４３、Ｋ２６０、Ｉ２６１、Ｆ１５４、Ｇ２７６およびＡ１８５から選択される。方法のいくつかの実施形態において、残基の相違は、配列番号６に対してＶ９Ｇ、Ｎ１３７Ｄ、Ｒ１４３Ｋ、Ｙ１５３Ｌ／Ｍ、Ｆ１５４Ｖ、Ａ１８５Ｔ、Ｖ２００Ｓ、Ｈ２２０Ｅ、Ｅ２２４Ｈ、Ｅ２５６Ｃ／Ｗ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ２５９Ｍ、Ｋ２６０Ｒ、Ｉ２６１Ｒ、Ｓ２６２Ｆ／Ｎ、Ｐ２６７Ｉ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、Ｇ２７６Ｓ、Ｖ２７９Ａ／Ｈ／Ｌ／Ｎ／ＹおよびＶ２８３Ｅ／Ｔ／Ｗから選択される。いくつかの追加的な実施形態において、残基の相違は、配列番号６に対してＸ９およびＸ２２４から選択される。いくつかのさらなる実施形態において、残基の相違は、配列番号６に対してＶ９およびＥ２２４から選択される。いくつかの追加的な実施形態において、残基の相違は、配列番号６に対してＶ９Ｇ、Ｎ１３７Ｄ、Ｒ１４３Ｋ、Ｙ１５３Ｌ／Ｍ、Ａ１８５Ｔ、Ｈ２２０Ｅ、Ｅ２２４Ｈ、Ｅ２５６Ｗ／Ｃ、Ｖ２５９Ｍ／Ｉ、Ｋ２６０Ｒ、Ｓ２６２Ｎ、Ｐ２６７Ｙ／Ｔ、Ｇ２７６Ｓ、Ｖ２７９Ａ／Ｈ／Ｎ、およびＶ２８３Ｔ／Ｗ／Ｅから選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製する方法であって、（ａ）配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号８と比較した場合に、以下：Ｘ１２、Ｘ３１、Ｘ３７、Ｘ４４、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ６５、Ｘ８２、Ｘ９３、Ｘ９８、Ｘ１０８、Ｘ１３７、Ｘ１３８、Ｘ１４１、Ｘ１４２、Ｘ１４３、Ｘ１５３、Ｘ１５４、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５９、Ｘ１６６、Ｘ１６８、Ｘ１７３、Ｘ１７７、Ｘ１７８、Ｘ１８４、Ｘ１８５、Ｘ１９５、Ｘ１９７、Ｘ１９９、Ｘ２００、Ｘ２０１、Ｘ２０３、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１３、Ｘ２１５、Ｘ２１６、Ｘ２１８、Ｘ２２０、Ｘ２２１、Ｘ２２３、Ｘ２２６、Ｘ２３４、Ｘ２３９、Ｘ２４２、Ｘ２４５、Ｘ２５１、Ｘ２５３、Ｘ２５６、Ｘ２５７、Ｘ２５９、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ２６２、Ｘ２６３、Ｘ２６５、Ｘ２６６、Ｘ２６７、Ｘ２６８、Ｘ２６９、Ｘ２７３、Ｘ２７４、Ｘ２７７、Ｘ２７８、Ｘ２７９、Ｘ２８０、Ｘ２８１、Ｘ２８２、Ｘ２８３、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ２８９、Ｘ２９０、Ｘ２９１、Ｘ２９２、Ｘ２９３、Ｘ２９４、Ｘ３３０、およびＸ３４９から選択される残基の位置に１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされるイミンレダクターゼポリペプチドを発現する工程を含む方法を提供する。方法のいくつかの実施形態において、残基の相違は、配列番号８に対してＭ１２、Ｌ３１、Ａ３７、Ｑ４４、Ｒ４６、Ａ４８、Ｇ５５、Ｌ５６、Ｖ６５、Ｔ８２、Ａ９３、Ｙ９８、Ｎ１０８、Ｎ１３７、Ｍ１３８、Ｗ１４１、Ｃ１４２、Ｒ１４３、Ｙ１５３、Ｆ１５４、Ｉ１５５、Ｔ１５６、Ｑ１５９、Ａ１６６、Ｋ１６８、Ｌ１７３、Ｇ１７７、Ｓ１７８、Ｑ１８４、Ａ１８５、Ｔ１９５、Ｉ１９７、Ａ１９９、Ｖ２００、Ｉ２０１、Ｐ２０３、Ｐ２０５、Ｔ２０６、Ａ２１０、Ｃ２１３、Ｓ２１５、Ｇ２１６、Ｐ２１８、Ｈ２２０、Ｙ２２１、Ｔ２２３、Ｉ２２６、Ｃ２３４、Ａ２３９、Ｉ２４２、Ａ２４５、Ｎ２５１、Ｐ２５３、Ａ２５６、Ｅ２５７、Ｖ２５９、Ｎ２６０、Ｈ２６１、Ｖ２６２、Ｃ２６３、Ｑ２６５、Ｔ２６６、Ｐ２６７、Ａ２６８、Ｔ２６９、Ａ２７３、Ｍ２７４、Ｌ２７７、Ｐ２７８、Ｖ２７９、Ｌ２８０、Ｒ２８１、Ｇ２８２、Ｖ２８３、Ｓ２８４、Ｇ２８５、Ｌ２８９、Ｎ２９０、Ｔ２９１、Ｅ２９２、Ｈ２９３、Ｆ２９４、Ｉ３３０、およびＬ３４９から選択される。方法のいくつかの実施形態において、残基の相違は、配列番号８に対してＭ１２Ｌ、Ｌ３１Ｍ、Ａ３７Ｐ、Ｑ４４Ｎ、Ｒ４６Ｓ／Ｎ、Ａ４８Ｇ、Ｇ５５Ｙ／Ｃ、Ｌ５６Ｍ、Ｖ６５Ｌ／Ｆ、Ｔ８２Ｖ、Ａ９３Ｇ、Ｙ９８Ｗ／Ｃ、Ｎ１０８Ｓ、Ｎ１３７Ｄ、Ｍ１３８Ｌ、Ｗ１４１Ｖ／Ｔ／Ｓ、Ｃ１４２Ａ、Ｒ１４３Ｗ／Ｌ、Ｙ１５３Ｆ／Ｅ／Ｇ／Ａ、Ｆ１５４Ｖ／Ｍ／Ｌ、Ｉ１５５Ｍ／Ｓ、Ｔ１５６Ｍ／Ｑ／Ｇ／Ｅ／Ａ、Ｑ１５９Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｅ、Ａ１６６Ｉ、Ｋ１６８Ｍ、Ｌ１７３Ｍ、Ｇ１７７Ｔ／Ａ、Ｓ１７８Ｅ、Ｑ１８４Ｌ、Ａ１８５Ｌ／Ｇ、Ｔ１９５Ｓ／Ｒ、Ｉ１９７Ｔ／Ｌ、Ａ１９９Ｖ、Ｖ２００Ｙ、Ｉ２０１Ｍ／Ｌ／Ｆ／Ｃ／Ａ、Ｐ２０３Ｇ、Ｐ２０５Ｔ／Ｓ／Ｎ／Ｌ／Ｇ／Ｄ／Ａ、Ｔ２０６Ｖ／Ｑ／Ｎ／Ｍ／Ｌ／Ｉ／Ｈ／Ｄ、Ａ２１０Ｆ、Ｃ２１３Ｙ／Ｖ／Ｍ／Ｌ／Ｆ、Ｓ２１５Ｅ、Ｇ２１６Ｖ／Ｓ／Ｒ、Ｐ２１８Ｑ、Ｈ２２０Ｄ、Ｙ２２１Ｗ／Ｍ／Ｌ／Ｉ、Ｔ２２３Ｓ、Ｉ２２６Ｙ、Ｃ２３４Ｍ／Ａ、Ａ２３９Ｑ、Ｉ２４２Ｃ／Ｖ、Ａ２４５Ｇ、Ｎ２５１Ｅ、Ｐ２５３Ｄ、Ａ２５６Ｓ／Ｌ／Ｅ／Ｎ／Ｋ／Ｇ、Ｅ２５７Ｓ、Ｖ２５９Ｍ／Ｌ、Ｎ２６０Ｄ／Ｋ、Ｈ２６１Ｉ／Ｅ／Ｄ、Ｖ２６２Ｓ、Ｃ２６３Ｑ／Ｅ／Ｔ、Ｑ２６５Ｎ、Ｔ２６６Ｐ／Ｎ、Ｐ２６７Ｖ／Ｑ／Ｋ、Ａ２６８Ｎ／Ｄ、Ｔ２６９Ｈ、Ａ２７３Ｖ／Ｔ／Ｉ、Ｍ２７４Ｖ、Ｌ２７７Ｍ、Ｐ２７８Ｖ、Ｖ２７９Ｆ／Ｒ／Ｅ、Ｌ２８０Ｐ／Ｅ、Ｒ２８１Ａ／Ｓ、Ｇ２８２Ｔ、Ｖ２８３Ｙ／Ｗ／Ｔ、Ｓ２８４Ｐ／Ｍ／Ｈ／Ｉ、Ｇ２８５Ｗ、Ｌ２８９Ｗ／Ｒ、Ｎ２９０Ｙ／Ｓ／Ｒ、Ｔ２９１Ａ、Ｅ２９２Ｖ、Ｈ２９３Ｙ／Ｑ／Ｍ／Ｌ／Ｆ、Ｆ２９４Ａ、Ｉ３３０Ｖ、およびＬ３４９Ｐから選択される。いくつかの追加的な実施形態において、残基の相違は、配列番号８に対してＸ３１、Ｘ４４、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ９８、Ｘ１６６、Ｘ１６８、Ｘ１７３、Ｘ１９９、Ｘ２０３、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１３、Ｘ２１５、Ｘ２１６、Ｘ２１８、Ｘ２３９、Ｘ２４５、Ｘ２５１、Ｘ２６８、Ｘ２６９、Ｘ２８０、Ｘ２８５、Ｘ２８９、Ｘ２９０、Ｘ２９３、Ｘ３３０、およびＸ３４９から選択される。いくつかのさらなる実施形態において、残基の相違は、配列番号８に対してＬ３１、Ｑ４４、Ｒ４６、Ａ４８、Ｇ５５、Ｌ５６、Ｙ９８、Ａ１６６、Ｋ１６８、Ｌ１７３、Ａ１９９、Ｐ２０３、Ｐ２０５、Ｔ２０６、Ａ２１０、Ｃ２１３、Ｓ２１５、Ｇ２１６、Ｐ２１８、Ａ２３９、Ａ２４５、Ｎ２５１、Ａ２６８、Ｔ２６９、Ｌ２８０、Ｇ２８５、Ｌ２８９、Ｎ２９０、Ｈ２９３、Ｉ３３０、およびＬ３４９から選択される。いくつかの追加的な実施形態において、残基の相違は、配列番号８に対してＭ１２Ｌ、Ｌ３１Ｍ、Ｑ４４Ｎ、Ｒ４６Ｓ／Ｎ、Ａ４８Ｇ、Ｇ５５Ｙ／Ｃ、Ｌ５６Ｍ、Ｖ６５Ｌ／Ｆ、Ｔ８２Ｖ、Ｙ９８Ｗ／Ｃ、Ｎ１３７Ｄ、Ｗ１４１Ｖ／Ｔ／Ｓ、Ｙ１５３Ｇ／Ａ、Ｉ１５５Ｓ、Ｔ１５６Ｑ／Ｇ／Ｅ／Ａ、Ｑ１５９Ｍ／Ｉ／Ｅ、Ａ１６６Ｉ、Ｋ１６８Ｍ、Ｌ１７３Ｍ、Ｇ１７７Ｔ／Ａ、Ｑ１８４Ｌ、Ａ１８５Ｌ／Ｇ、Ｔ１９５Ｒ、Ｉ１９７Ｔ／Ｌ、Ａ１９９Ｖ、Ｖ２００Ｙ、Ｉ２０１Ｍ／Ｌ／Ｆ／Ｃ／Ａ、Ｐ２０３Ｇ、Ｐ２０５Ｔ／Ｓ／Ｎ／Ｌ／Ｇ／Ｄ／Ａ、Ｔ２０６Ｖ／Ｑ／Ｎ／Ｍ／Ｌ／Ｉ／Ｈ／Ｄ、Ａ２１０Ｆ、Ｃ２１３Ｙ／Ｖ／Ｍ／Ｌ／Ｆ、Ｓ２１５Ｅ、Ｇ２１６Ｖ／Ｓ／Ｒ、Ｐ２１８Ｑ、Ｙ２２１Ｗ／Ｍ／Ｌ／Ｉ、Ｉ２２６Ｙ、Ｃ２３４Ｍ／Ａ、Ａ２３９Ｑ、Ｉ２４２Ｖ、Ａ２４５Ｇ、Ｎ２５１Ｅ、Ｐ２５３Ｄ、Ａ２５６Ｎ／Ｋ／Ｇ、Ｅ２５７Ｓ、Ｖ２５９Ｍ／Ｌ、Ｎ２６０Ｋ、Ｈ２６１Ｄ、Ｖ２６２Ｓ、Ｃ２６３Ｔ、Ｑ２６５Ｎ、Ｔ２６６Ｐ／Ｎ、Ｐ２６７Ｖ／Ｑ／Ｋ、Ａ２６８Ｎ／Ｄ、Ｔ２６９Ｈ、Ａ２７３Ｖ／Ｔ／Ｉ、Ｍ２７４Ｖ、Ｌ２７７Ｍ、Ｐ２７８Ｖ、Ｖ２７９Ｒ／Ｅ、Ｌ２８０Ｐ／Ｅ、Ｒ２８１Ｓ、Ｇ２８２Ｔ、Ｖ２８３Ｙ／Ｗ／Ｔ、Ｓ２８４Ｉ、Ｇ２８５Ｗ、Ｌ２８９Ｗ／Ｒ、Ｎ２９０Ｙ／Ｓ／Ｒ、Ｔ２９１Ａ、Ｅ２９２Ｖ、Ｈ２９３Ｙ／Ｑ／Ｍ／Ｌ／Ｆ、Ｉ３３０Ｖ、およびＬ３４９Ｐから選択される。
方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、任意選択的に１つまたは数個の（例えば、３、４、５まで、または１０までの）アミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する操作されたイミンレダクターゼをコードする。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列数は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
別の態様では、本発明は、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを製造する方法であって、ポリペプチドの発現に適切な条件下でイミンレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養する工程を含むことができる、方法を提供する。本方法は、本明細書中に記載のように、発現されたイミンレダクターゼポリペプチドを単離または精製する工程をさらに含むことができる。
いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを調製または製造する方法は、ポリペプチドを単離する工程をさらに含む。操作されたポリペプチドを適切な細胞中で発現させ、上記のように、タンパク質精製のために使用される周知の技術（とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心、およびクロマトグラフィが含まれる）のうちの任意の１つまたは複数を使用して宿主細胞、培養培地、および／または発現培地から単離（または回収）することができる。大腸菌などの細菌の溶解および高効率のタンパク質抽出に適切な溶液は、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｍ）Ｏなど市販されている。イミンレダクターゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィ技術には、とりわけ、逆相クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、およびアフィニティクロマトグラフィが含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の天然に存在しないポリペプチドを調製し、種々の形態（以下の実施例でさらに例示する粗抽出物（例えば、無細胞溶解物）、粉末（例えば、フラスコ振盪培養粉末（ｓｈａｋｅ−ｆｌａｓｋ ｐｏｗｄｅｒ））、凍結乾燥物、および実質的に純粋な調製物（例えば、ＤＳＰ粉末）が含まれるが、これらに限定されない）で使用することができる。
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドを調製し、精製形態（例えば、実質的に精製された形態）で使用することができる。一般に、特定のポリペプチドの精製条件は、その一部が、正味荷電、疎水性、親水性、分子量、分子の形状などの要因に依存し、その条件は当業者に明らかであろう。精製を容易にするために、いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドを、精製タグ（金属に親和性を有するＨｉｓタグなど）または抗体への結合のための抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープタグ）との融合タンパク質として発現することができることが意図される。
いくつかの実施形態では、親和性技術を使用して、改良されたイミンレダクターゼ酵素を単離することができる。アフィニティクロマトグラフィ精製のために、イミンレダクターゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体生成のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどが含まれるが、これらに限定されない）を、イミンレダクターゼポリペプチドまたはそのフラグメントを使用した注射によって免疫化することができる。イミンレダクターゼポリペプチドまたはフラグメントを、側鎖官能基または側鎖官能基に取り付けたリンカーによって適切なキャリア（ＢＳＡなど）に取り付けることができる。いくつかの実施形態では、親和性精製は、イミンレダクターゼによって結合した特異的リガンド（ポリ（Ｌ−プロリン）など）または色素アフィニティカラム（例えば、欧州特許第０６４１８６２号；およびＳｔｅｌｌｗａｇｅｎ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ ９．２−９．２．１６［２００１］を参照のこと）を使用することができる。
６．５ 操作されたイミンレダクターゼ酵素の使用方法
別の態様では、本明細書中に記載のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを、上記およびスキーム１に例示のように、式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）の第二級アミン化合物または第三級アミン化合物に変換するプロセスで使用することができる。一般に、スキーム１の還元的アミノ化反応を実施するためのかかる生体触媒プロセスは、式（ＩＩＩ）のアミン生成物化合物の形成に適切な反応条件下にて補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなど）の存在下でケトン基質化合物およびアミン基質化合物を本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドと接触させるかインキュベートする工程を含む。
いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼを、式（ＩＩＩ）：

（式中、Ｒ１基およびＲ２基は、任意選択的に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから独立して選択され；任意選択的にＲ１およびＲ２が連結して３員環から１０員環を形成し；Ｒ３基およびＲ４基は、水素原子、ならびに任意選択的に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから独立して選択され、但し、Ｒ３およびＲ４の両方が水素であり得ないことを条件とし；任意選択的に、Ｒ３およびＲ４が連結して３員環から１０員環を形成し；任意選択的に、＊で示した炭素原子および／または窒素はキラルである）の第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物を調製するためのプロセスで使用することができる。このプロセスは、式（Ｉ）：

（式中、Ｒ１およびＲ２は上記定義の通りである）のケトン化合物；および式（ＩＩ）：

（式中、Ｒ３およびＲ４は上記定義の通りである）のアミン化合物を、適切な反応条件下にて補因子の存在下でイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドと接触させる工程を含む。
表２および表３Ａ〜３Ｍ中の反応によって例示されるように、本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、式（ＩＩＩ）の化合物の調製プロセスで広範な式（ＩＩ）のアミン基質化合物との活性を有するか、活性を有するようにさらに操作することができる。したがって、式（ＩＩＩ）の第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物を調製するための上記生体触媒プロセスのいくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも１つが水素であり、それにより、式（ＩＩＩ）の生成物が第二級アミン化合物である第一級アミンであり得る。プロセスのいくつかの実施形態では、Ｒ３およびＲ４のいずれも水素ではなく、式（ＩＩ）の化合物は第二級アミンであり、それにより、式（ＩＩＩ）の化合物は第三級アミンである。プロセスのいくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は第二級アミンであり、Ｒ３またはＲ４は異なり、それにより、式（ＩＩＩ）のアミン化合物の＊で示した窒素原子はキラルである。さらに、いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のキラルアミン化合物の１つの立体異性体を、立体選択性に形成し、任意選択的に、高い立体選択性で（例えば、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で）形成する。
式（ＩＩＩ）の第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物を調製するための生体触媒プロセスのいくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物のＲ３基およびＲ４基を連結して３員環から１０員環を形成する。いくつかの実施形態では、環は、５員環〜８員環であり、任意選択的に置換されたシクロアルキル環、アリール環、アリールアルキル環、ヘテロシクロアルキル環、ヘテロアリール環、またはヘテロアリールアルキル環である。
式（ＩＩＩ）のアミン生成物化合物を調製するための生体触媒プロセスのいくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は第一級アミンであり、ここで、Ｒ３基は水素であり、Ｒ４は、任意選択的に置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ６）カルボキシアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アミノアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）ハロアルキル、および（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルチオアルキルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ４基は、任意選択的に置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）カルボキシアルキル、および（Ｃ１〜Ｃ６）アミノアルキルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ４基は、任意選択的に置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、または（Ｃ１〜Ｃ６）カルボキシアルキルである。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、メチルアミン、ジメチルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、およびイソブチルアミンから選択される。いくつかの実施形態では、アミン基質化合物のＲ３基は水素であり、Ｒ４は、任意選択的に置換された（Ｃ４〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ４〜Ｃ８）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ４〜Ｃ８）アリール、（Ｃ４〜Ｃ８）アリールアルキル、（Ｃ４〜Ｃ８）ヘテロアリール、および（Ｃ４〜Ｃ８）ヘテロアリールアルキルから選択される。いくつかの実施形態では、アミン基質化合物のＲ３基は水素であり、Ｒ４は、任意選択的に置換された（Ｃ４〜Ｃ８）アリール、（Ｃ４〜Ｃ８）アリールアルキル、（Ｃ４〜Ｃ８）ヘテロアリール、および（Ｃ４〜Ｃ８）ヘテロアリールアルキルから選択される。いくつかの実施形態では、アミン基質化合物のＲ３基は水素であり、Ｒ４は任意選択的に置換された（Ｃ４〜Ｃ８）アリールである。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は任意選択的に置換されたアニリンである。
表２および表３Ａ〜３Ｍ中の反応によって例示されるように、本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、式（ＩＩＩ）の化合物の調製プロセスで広範な式（Ｉ）のケトン基質化合物との活性を有するか、活性を有するようにさらに操作することができる。いくつかの実施形態では、化合物（Ｉ）のケトン基質のＲ１基およびＲ２基は異なり、それにより、式（ＩＩＩ）のアミン化合物の＊で示した炭素原子はキラルである。さらに、プロセスのいくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のキラルアミン化合物の１つの立体異性体を、立体選択性に形成し、任意選択的に、高い立体選択性で（例えば、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で）形成する。
式（ＩＩＩ）の第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物を調製するための生体触媒プロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のＲ１基およびＲ２基を連結して３員環から１０員環を形成する。いくつかの実施形態では、環は、任意選択的に置換されたシクロアルキル環、アリール環、アリールアルキル環、ヘテロシクロアルキル環、ヘテロアリール環、またはヘテロアリールアルキル環である。プロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、任意選択的に置換されたシクロブタノン、シクロペンタノン、シクロヘキサノン、およびシクロヘプタノンから選択される。
式（ＩＩＩ）の第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物を調製するための生体触媒プロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のＲ１基およびＲ２基は、任意選択的に置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ６）カルボキシアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アミノアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）ハロアルキル、および（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルチオアルキルから独立して選択される。
式（ＩＩＩ）の第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物を調製するための生体触媒プロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のＲ１基は、任意選択的に置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ６）カルボキシアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アミノアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）ハロアルキル、および（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルチオアルキルから選択され；式（Ｉ）の化合物のＲ２基は、任意選択的に置換された（Ｃ４〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ４〜Ｃ８）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ４〜Ｃ８）アリールアルキル、（Ｃ４〜Ｃ８）ヘテロアリール、および（Ｃ４〜Ｃ８）ヘテロアリールアルキルから選択される。
式（ＩＩＩ）の第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物を調製するための生体触媒プロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のＲ１基はカルボキシである。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、ピルビン酸、２−オキソ−プロパン酸、２−オキソ−ブタン酸、２−オキソ−ペンタン酸、２−オキソ−ヘキサン酸から選択される２−ケト酸である。
式（ＩＩＩ）の第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物を調製するための生体触媒プロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のＲ１基は水素原子であり、式（Ｉ）の化合物はアルデヒドである。かかる実施形態では、式（Ｉ）の化合物のＲ１基は、任意選択的に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから選択される。
表２中の反応について列挙した式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の化合物によって例示されるように、式（ＩＩＩ）の第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物を調製するための上記の生体触媒プロセスのいくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の生成物化合物は、化合物（３ａ）、化合物（３ｂ）、化合物（３ｃ）、化合物（３ｄ）、化合物（３ｅ）、化合物（３ｆ）および化合物（３ｇ）からなる群から選択される化合物を含む。プロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、以下：化合物（１ａ）、化合物（１ｂ）、化合物（１ｃ）および化合物（１ｄ）からなる群から選択される化合物を含む。プロセスのいくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、以下：化合物（２ａ）、化合物（２ｂ）および化合物（２ｃ）からなる群から選択される化合物を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドによって触媒される式（ＩＩＩ）のアミン生成物化合物を調製するためのプロセスが分子内反応を含み、式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）の化合物が同一の単一の分子上の基であることも意図される。したがって、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のケトン化合物のＲ１およびＲ２のうちの少なくとも１つが式（ＩＩ）のアミン化合物のＲ３およびＲ４のうちの少なくとも１つに連結し、方法が、適切な反応条件下で式（ＩＩ）のアミン基に連結した式（Ｉ）のケトン基を有する単一の化合物を本発明の操作されたポリペプチドと接触させる工程を含む。例示的な分子内反応には、以下の表４に示すスキーム２〜５の反応が含まれるが、これらに限定されず、ここで、Ｒ１基およびＲ３基がＲ１基およびＲ３基について上記の定義の通りであり、Ｒ５基は、水素原子、ならびに任意選択的に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから選択される。
理論に拘束されないが、ほとんどの場合、スキーム１の生体触媒反応は中間体イミン化合物（例えば、イミニウム中間体）の形成に関与し、次いで、酵素によって式（ＩＩＩ）の最終的な第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物にさらに還元されると考えられる。いくつかの実施形態では、本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドによって触媒される式（ＩＩＩ）のアミン生成物化合物を調製するためのプロセスが、本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを式（Ｉ）のケトン化合物および式（ＩＩ）の第一級アミン化合物と接触させる工程を含み、それによりイミン中間体が形成され、次いで、分子内不斉環化反応を経て環状の第二級または第三級のヒドロキシアミン中間体が得られ、ヒドロキシル脱離を経て第２のイミン（またはエナミン）中間体が得られることも意図される。この第２のイミン（またはエナミン）を、その後に本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドによってｉｎ ｓｉｔｕで還元して最終的な環状アミン生成物を得る。ヒドロキシアミン中間体を経由した不斉環化に関与する反応例には、以下の表５中に示すスキーム６〜９の反応が含まれるが、これらに限定されず、ここで、Ｒ１基およびＲ３基がＲ１基およびＲ３基について上記の定義の通りであり、Ｒ５基、Ｒ６基、およびＲ７基は、水素原子、ならびに任意選択的に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルから独立して選択される。
理論に拘束されないが、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチド（ＩＲＥＤ）が、スキーム２〜９の反応中に示すイミンおよび／またはヒドロキシアミン中間体の形成だけでなく、イミン中間体の第２の反応の矢印によって示した式（ＩＩＩ）の最終アミン生成物化合物への変換も媒介すると考えられる。
一般に、イミン化合物はアミン化合物より安定性が低く、望ましくない酸化反応の影響を受けやすい。しかし、本発明のプロセスのいくつかの実施形態では、酵素の非存在下で式（Ｉ）のケトンおよび式（ＩＩ）のアミン化合物からイミン化合物またはエナミン化合物（互変異性体化してイミンを形成することができる）を形成することができ、次いで、本発明の操作されたポリペプチドと接触させて最終物の式（ＩＩＩ）の第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物への変換を触媒することができることを意図する。例えば、イミン中間体化合物またはエナミン中間体化合物を、スキーム６〜９に示すが、ＩＲＥＤ（すなわち、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチド）の非存在下で式（Ｉ）のケトンと式（ＩＩ）のアミン化合物とを組み合わせることによって最初に形成することができる。次いで、直接またはエナミン化合物の互変異性体化から形成されたイミン化合物を、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドと接触させて、式（ＩＩＩ）の最終アミン生成物化合物への変換を触媒することができる。いくつかの実施形態では、イミン中間体化合物またはエナミン中間体化合物を、適切に安定である場合、単離後にイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドと接触させる工程を実施することができることを意図する。したがって、プロセスのいくつかの実施形態では、イミン化合物またはエナミン化合物を、式（Ｉ）および式（ＩＩ）の化合物から、またはアミン基に連結したケトン基を有する化合物の分子内反応によって最初に形成し、次いで、このイミン化合物またはエナミン化合物を、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドと接触させて式（ＩＩＩ）のアミン生成物化合物を形成することを意図する。
いくつかの実施形態では、安定なイミン化合物またはエナミン化合物を得ることができ（すなわち、式（Ｉ）のケトン化合物および式（ＩＩ）のアミン化合物の第１の反応なし）、この化合物をＩＲＥＤと共に基質として直接使用する。かかる実施形態では、安定なイミン化合物またはエナミン化合物である単一の基質のみが存在する生体触媒プロセスを行い、この化合物を、安定なイミン化合物の還元を触媒する本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドと接触させて式（ＩＩＩ）の第２の化合物を形成することを意図する。かかる反応では、操作されたポリペプチドの立体選択性により、式（ＩＩＩ）の化合物のアミン基に隣接するキラル中心の形成を媒介することができる。表６（以下）は、医薬品ソリフェナシンおよびタダラフィルの合成ならびに薬学的化合物デクスメチルフェニデートの合成のための中間体化合物を生成するために本発明の操作されたポリペプチドを使用した生体触媒プロセスにおいてキラル還元を受けることができる安定なイミン化合物の３つの例を列挙している。
あるいは、単離されたイミン基質化合物またはエナミン基質化合物（表６に示す）のＩＲＥＤ触媒反応を介して生成された式（ＩＩＩ）の任意の生成物化合物を、イミン基質化合物またはエナミン基質化合物の開鎖バージョンを基質として使用したＩＲＥＤ触媒分子内反応（表４に例示の反応など）を介して生成することもできることも意図する。したがって、表６の各生成物化合物を、本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドと共に表７に示す分子内基質を使用して作製することもできる。
本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドおよび／または本発明の操作されたポリペプチドのさらなる指向進化によって生成された操作されたポリペプチドを使用した生体触媒還元的アミノ化によって生成することができる第二級アミン基または第三級アミン基を含む活性薬剤成分化合物が多数存在する。例えば、表８は、公知の活性薬剤成分化合物または本発明のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）の対応する基質化合物と共に使用して生成することができる活性薬剤成分化合物の合成に有用な中間体化合物である式（ＩＩＩ）の種々の生成物化合物を列挙する。
式（ＩＩＩ）の第二級アミン生成物化合物または第三級アミン生成物化合物の調製のための上記生体触媒プロセスのいくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、天然に存在するオピンデヒドロゲナーゼから誘導される。いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、本明細書中に開示の配列番号２のＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．１Ｃ株由来のオピンデヒドロゲナーゼから誘導された操作されたポリペプチドであり、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドによって例示される。
本明細書中に記載の任意の操作されたイミンレダクターゼを、式（ＩＩＩ）の第二級アミン化合物または第三級アミン化合物の調製のための上記生体触媒プロセスで使用することができる。例として制限されないが、いくつかの実施形態では、このプロセスは、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子から選択される参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを使用することができ、配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に、以下：Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ３１、Ｘ３７、Ｘ４４、Ｘ４６、Ｘ４８、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ６５、Ｘ８２、Ｘ９３、Ｘ９８、Ｘ１０８、Ｘ１３７、Ｘ１３８、Ｘ１４１、Ｘ１４２、Ｘ１４３、Ｘ１５３、Ｘ１５４、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５９、Ｘ１６６、Ｘ１６７、Ｘ１６８、Ｘ１７３、Ｘ１７７、Ｘ１７８、Ｘ１８４、Ｘ１８５、Ｘ１９５、Ｘ１９７、Ｘ１９８、Ｘ１９９、Ｘ２００、Ｘ２０１、Ｘ２０３、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１３、Ｘ２１５、Ｘ２１６、Ｘ２１８，Ｘ２２０、Ｘ２２１、Ｘ２２３、Ｘ２２４、Ｘ２２６、Ｘ２３４、Ｘ２３９、Ｘ２４２、Ｘ２４５、Ｘ２５１、Ｘ２５３、Ｘ２５６、Ｘ２５９、Ｘ２６０、Ｘ２６１、Ｘ２６２、Ｘ２６３、Ｘ２６５、Ｘ２６６、Ｘ２６７、Ｘ２６８、Ｘ２６９、Ｘ２７２、Ｘ２７３、Ｘ２７４、Ｘ２７６、Ｘ２７７、Ｘ２７８、Ｘ２７９、Ｘ２８０、Ｘ２８１、Ｘ２８２、Ｘ２８３、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ２８９、Ｘ２９０、Ｘ２９１、Ｘ２９２、Ｘ２９３、Ｘ２９４、Ｘ３３０およびＸ３４９から選択される残基の位置における１つまたはそれを超える（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３等）残基の相違を含むアミノ酸配列を有するイミンレダクターゼポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、これらの残基の位置における具体的な残基の相違は、以下：配列番号４に対してＳ２８４Ｑ／Ｌ／Ｈ／Ｃ、Ｌ２７７Ａ、Ｅ２７２Ｄ、Ｓ２６２Ｖ、Ｅ２５６Ｖ／Ｓ／Ａ、Ｉ２４２Ｃ、Ａ２３４Ｃ、Ｈ２２０Ｑ、Ｅ１９８Ｄ、Ｙ１５３Ｇ／Ｑ／Ｎ／Ｒ／Ｅ、Ａ１６７Ｔ、Ｑ２６５Ｔ、Ｎ１０８Ｃ、Ｇ２８２Ｌ、Ｐ２６７Ａ、Ｉ１９７Ｍ、Ｑ２６５Ｖ、Ｒ２８１Ｎ／Ｐ／Ｌ、Ｅ２２４ＤおよびＲ１４３Ｋ；または配列番号６に対してＶ９Ｇ、Ｎ１３７Ｄ、Ｒ１４３Ｋ、Ｙ１５３Ｌ／Ｍ、Ｆ１５４Ｖ、Ａ１８５Ｔ、Ｖ２００Ｓ、Ｈ２２０Ｅ、Ｅ２２４Ｈ、Ｅ２５６Ｃ／Ｗ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ２５９Ｍ、Ｋ２６０Ｒ、Ｉ２６１Ｒ、Ｓ２６２Ｆ／Ｎ、Ｐ２６７Ｉ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、Ｇ２７６Ｓ、Ｖ２７９Ａ／Ｈ／Ｌ／Ｎ／ＹおよびＶ２８３Ｅ／Ｔ／Ｗ；または配列番号８に対してＭ１２Ｌ、Ｌ３１Ｍ、Ａ３７Ｐ、Ｑ４４Ｎ、Ｒ４６Ｓ／Ｎ、Ａ４８Ｇ、Ｇ５５Ｙ／Ｃ、Ｌ５６Ｍ、Ｖ６５Ｌ／Ｆ、Ｔ８２Ｖ、Ａ９３Ｇ、Ｙ９８Ｗ／Ｃ、Ｎ１０８Ｓ、Ｎ１３７Ｄ、Ｍ１３８Ｌ、Ｗ１４１Ｖ／Ｔ／Ｓ、Ｃ１４２Ａ、Ｒ１４３Ｗ／Ｌ、Ｙ１５３Ｆ／Ｅ／Ｇ／Ａ、Ｆ１５４Ｖ／Ｍ／Ｌ、Ｉ１５５Ｍ／Ｓ、Ｔ１５６Ｍ／Ｑ／Ｇ／Ｅ／Ａ、Ｑ１５９Ｌ／Ｍ／Ｉ／Ｅ、Ａ１６６Ｉ、Ｋ１６８Ｍ、Ｌ１７３Ｍ、Ｇ１７７Ｔ／Ａ、Ｓ１７８Ｅ、Ｑ１８４Ｌ、Ａ１８５Ｌ／Ｇ、Ｔ１９５Ｓ／Ｒ、Ｉ１９７Ｔ／Ｌ、Ａ１９９Ｖ、Ｖ２００Ｙ、Ｉ２０１Ｍ／Ｌ／Ｆ／Ｃ／Ａ、Ｐ２０３Ｇ、Ｐ２０５Ｔ／Ｓ／Ｎ／Ｌ／Ｇ／Ｄ／Ａ、Ｔ２０６Ｖ／Ｑ／Ｎ／Ｍ／Ｌ／Ｉ／Ｈ／Ｄ、Ａ２１０Ｆ、Ｃ２１３Ｙ／Ｖ／Ｍ／Ｌ／Ｆ、Ｓ２１５Ｅ、Ｇ２１６Ｖ／Ｓ／Ｒ、Ｐ２１８Ｑ、Ｈ２２０Ｄ、Ｙ２２１Ｗ／Ｍ／Ｌ／Ｉ、Ｔ２２３Ｓ、Ｉ２２６Ｙ、Ｃ２３４Ｍ／Ａ、Ａ２３９Ｑ、Ｉ２４２Ｃ／Ｖ、Ａ２４５Ｇ、Ｎ２５１Ｅ、Ｐ２５３Ｄ、Ａ２５６Ｓ／Ｌ／Ｅ／Ｎ／Ｋ／Ｇ、Ｅ２５７Ｓ、Ｖ２５９Ｍ／Ｌ、Ｎ２６０Ｄ／Ｋ、Ｈ２６１Ｉ／Ｅ／Ｄ、Ｖ２６２Ｓ、Ｃ２６３Ｑ／Ｅ／Ｔ、Ｑ２６５Ｎ、Ｔ２６６Ｐ／Ｎ、Ｐ２６７Ｖ／Ｑ／Ｋ、Ａ２６８Ｎ／Ｄ、Ｔ２６９Ｈ、Ａ２７３Ｖ／Ｔ／Ｉ、Ｍ２７４Ｖ、Ｌ２７７Ｍ、Ｐ２７８Ｖ、Ｖ２７９Ｆ／Ｒ／Ｅ、Ｌ２８０Ｐ／Ｅ、Ｒ２８１Ａ／Ｓ、Ｇ２８２Ｔ、Ｖ２８３Ｙ／Ｗ／Ｔ、Ｓ２８４Ｐ／Ｍ／Ｈ／Ｉ、Ｇ２８５Ｗ、Ｌ２８９Ｗ／Ｒ、Ｎ２９０Ｙ／Ｓ／Ｒ、Ｔ２９１Ａ、Ｅ２９２Ｖ、Ｈ２９３Ｙ／Ｑ／Ｍ／Ｌ／Ｆ、Ｆ２９４Ａ、Ｉ３３０ＶおよびＬ３４９Ｐから選択される。
いくつかの実施形態では、残基の相違は、以下：配列番号４に対してＥ１９８Ｄ、Ｙ１５３Ｇ／Ｑ／Ｎ／Ｒ、Ａ１６７Ｔ、Ｑ２６５Ｔ／Ｖ、Ｎ１０８Ｃ、Ｇ２８２Ｌ、Ｐ２６７Ａ、Ｉ１９７Ｍ、Ｒ２８１Ｎ／Ｐ／Ｌ、Ｅ２２４ＤおよびＲ１４３Ｋ；または配列番号６に対してＶ９Ｇ、Ｎ１３７Ｄ、Ｒ１４３Ｋ、Ｙ１５３Ｌ／Ｍ、Ａ１８５Ｔ、Ｈ２２０Ｅ、Ｅ２２４Ｈ、Ｅ２５６Ｗ／Ｃ、Ｖ２５９Ｍ／Ｉ、Ｋ２６０Ｒ、Ｓ２６２Ｎ、Ｐ２６７Ｙ／Ｔ、Ｇ２７６Ｓ、Ｖ２７９Ａ／Ｈ／Ｎ、Ｖ２８３Ｔ／Ｗ／Ｅ；または配列番号８に対してＭ１２Ｌ、Ｌ３１Ｍ、Ｑ４４Ｎ、Ｒ４６Ｓ／Ｎ、Ａ４８Ｇ、Ｇ５５Ｙ／Ｃ、Ｌ５６Ｍ、Ｖ６５Ｌ／Ｆ、Ｔ８２Ｖ、Ｙ９８Ｗ／Ｃ、Ｎ１３７Ｄ、Ｗ１４１Ｖ／Ｔ／Ｓ、Ｙ１５３Ｇ／Ａ、Ｉ１５５Ｓ、Ｔ１５６Ｑ／Ｇ／Ｅ／Ａ、Ｑ１５９Ｍ／Ｉ／Ｅ、Ａ１６６Ｉ、Ｋ１６８Ｍ、Ｌ１７３Ｍ、Ｇ１７７Ｔ／Ａ、Ｑ１８４Ｌ、Ａ１８５Ｌ／Ｇ、Ｔ１９５Ｒ、Ｉ１９７Ｔ／Ｌ、Ａ１９９Ｖ、Ｖ２００Ｙ、Ｉ２０１Ｍ／Ｌ／Ｆ／Ｃ／Ａ、Ｐ２０３Ｇ、Ｐ２０５Ｔ／Ｓ／Ｎ／Ｌ／Ｇ／Ｄ／Ａ、Ｔ２０６Ｖ／Ｑ／Ｎ／Ｍ／Ｌ／Ｉ／Ｈ／Ｄ、Ａ２１０Ｆ、Ｃ２１３Ｙ／Ｖ／Ｍ／Ｌ／Ｆ、Ｓ２１５Ｅ、Ｇ２１６Ｖ／Ｓ／Ｒ、Ｐ２１８Ｑ、Ｙ２２１Ｗ／Ｍ／Ｌ／Ｉ、Ｉ２２６Ｙ、Ｃ２３４Ｍ／Ａ、Ａ２３９Ｑ、Ｉ２４２Ｖ、Ａ２４５Ｇ、Ｎ２５１Ｅ、Ｐ２５３Ｄ、Ａ２５６Ｎ／Ｋ／Ｇ、Ｅ２５７Ｓ、Ｖ２５９Ｍ／Ｌ、Ｎ２６０Ｋ、Ｈ２６１Ｄ、Ｖ２６２Ｓ、Ｃ２６３Ｔ、Ｑ２６５Ｎ、Ｔ２６６Ｐ／Ｎ、Ｐ２６７Ｖ／Ｑ／Ｋ、Ａ２６８Ｎ／Ｄ、Ｔ２６９Ｈ、Ａ２７３Ｖ／Ｔ／Ｉ、Ｍ２７４Ｖ、Ｌ２７７Ｍ、Ｐ２７８Ｖ、Ｖ２７９Ｒ／Ｅ、Ｌ２８０Ｐ／Ｅ、Ｒ２８１Ｓ、Ｇ２８２Ｔ、Ｖ２８３Ｙ／Ｗ／Ｔ、Ｓ２８４Ｉ、Ｇ２８５Ｗ、Ｌ２８９Ｗ／Ｒ、Ｎ２９０Ｙ／Ｓ／Ｒ、Ｔ２９１Ａ、Ｅ２９２Ｖ、Ｈ２９３Ｙ／Ｑ／Ｍ／Ｌ／Ｆ、Ｉ３３０ＶおよびＬ３４９Ｐから選択される。
上記プロセスのいくつかの実施形態では、本明細書中に開示の表２の変換反応（ａ）〜（ｇ）を実施することができる例示的なイミンレダクターゼが使用される。これは、配列番号４〜１３００のうち偶数番号の配列識別子から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書中に開示の操作されたポリペプチドを含む。操作されたイミンレダクターゼの選択および使用についてのガイダンスを、本明細書中の説明（例えば、表３Ａ〜３Ｍ）および実施例に提供する。
本明細書中および実施例に例示の実施形態では、プロセスで使用することができる種々の範囲の適切な反応条件には、基質負荷、補因子負荷、ポリペプチド負荷、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、反応時間、および／または固体支持体上に固定されたポリペプチドに伴う条件が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に記載の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを使用した基質化合物の生成物化合物への生体触媒変換プロセスの実施のためのさらに適切な反応条件を、本明細書中に提供したガイダンスを考慮して、日常的な実験（濃度、ｐＨ、温度、および溶媒条件の実験反応条件下での目的の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドとケトン基質化合物およびアミン基質化合物との接触、ならびに生成物化合物の検出が含まれるが、これらに限定されない）によって容易に最適化することができる。
一般に、本発明のプロセスでは、適切な反応条件は、イミンレダクターゼによって実施される還元反応において電子供与体として作用することができる補因子分子の存在を含む。いくつかの実施形態では、補因子は、ＮＡＤＰ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ＋の還元型）、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、およびＮＡＤＨ（ＮＡＤ＋の還元型）から選択される（しかし制限されない）。一般に、補因子の還元型を酵素反応混合物に添加する。したがって、いくつかの実施形態では、プロセスを、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨ（これら２つの補因子を本明細書中で集合的に「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」ともいう）から選択される補因子の存在下で行う。いくつかの実施形態では、電子供与体はＮＡＤＰＨ補因子である。いくつかの実施形態では、反応条件が約０．０３〜約１ｇ／Ｌ、０．０３〜約０．８ｇ／Ｌ、約０．０３〜約０．５ｇ／Ｌ、約０．０５〜約０．３ｇ／Ｌ、約０．０５〜約０．２ｇ／Ｌ、または約０．１〜約０．２ｇ／Ｌの濃度のＮＡＤＨ補因子またはＮＡＤＰＨ補因子を含むプロセスを行うことができる。いくつかの実施形態では、約１ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ、または約０．０３ｇ／Ｌの濃度のＮＡＤＨの補因子またはＮＡＤＰＨ補因子下で本プロセスを行う。
プロセスのいくつかの実施形態では、任意選択的な補因子リサイクル系（補因子再生系ともいう）を使用して、酵素反応で生成されたＮＡＤＰ＋／ＮＡＤ＋から補因子ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨを再生することができる。補因子再生系は、補因子の酸化型を還元する（例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨへの還元）反応に関与する一連の反応物をいう。ケト基質のポリペプチド還元によって酸化される補因子を、補因子再生系によって還元型に再生する。補因子再生系は、還元性水素等価物の供給源であり、且つ酸化型補因子を還元することができる化学量論的還元剤を含む。補因子再生系は、触媒（例えば、還元剤による酸化型補因子の還元を触媒する酵素触媒）をさらに含むことができる。それぞれＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子再生系は、当該分野で公知であり、本明細書中に記載の方法で使用することができる。
本発明のイミンレダクターゼプロセスで使用することができる適切な補因子再生系の例には、ホルマートおよびギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、第二級アルコールおよびアルコールデヒドロゲナーゼ、ホスファイトおよび亜リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびに分子水素およびヒドロゲナーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。これらの系を、補因子としてのＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ＋／ＮＡＤＨのいずれかと組み合わせて使用することができる。ヒドロゲナーゼを使用した電気化学的再生も、補因子再生系として使用することができる（例えば、米国特許第５，５３８，８６７号および同第６，４９５，０２３号（その両方が本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。金属触媒および還元薬（例えば、分子水素またはホルマート）を含む化学的補因子再生系も適切であり得る（例えば、ＷＯ２０００／０５３７３１号（本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、補因子再生系は、ホルマートおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を二酸化炭素およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへのそれぞれの変換を触媒するＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性の酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼを含む。本明細書中に記載のイミンレダクターゼプロセスでの補因子再生系としての使用に適切なギ酸デヒドロゲナーゼには、天然に存在するおよび天然に存在しないギ酸デヒドロゲナーゼが含まれる。適切なギ酸デヒドロゲナーゼには、当該分野で現在公知のギ酸デヒドロゲナーゼが含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＷＯ２００５／０１８５７９号（本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、プロセスで使用されるギ酸デヒドロゲナーゼは、ＦＤＨ−１０１であり、市販されている（Ｃｏｄｅｘｉｓ，Ｉｎｃ．Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）。ホルマートを、塩の形態（典型的にはアルカリ塩またはアンモニウム塩（例えば、ＨＣＯ２ＮａおよびＫＨＣＯ２ＮＨ４など））、ギ酸の形態（典型的にはギ酸水溶液）、またはその混合物で提供することができる。塩基または緩衝液を使用して、所望のｐＨにすることができる。
いくつかの実施形態では、補因子リサイクル系は、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含み、これは、Ｄ−グルコースおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のグルコン酸およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへのそれぞれの変換を触媒するＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性の酵素である。本明細書中に記載のイミンレダクターゼプロセスの実施での使用に適切なグルコースデヒドロゲナーゼには、天然に存在するグルコースデヒドロゲナーゼおよび天然に存在しないグルコースデヒドロゲナーゼが含まれる。天然に存在するグルコースデヒドロゲナーゼのコード遺伝子が文献中に報告されている（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ６１２９７ ＧＤＨ遺伝子、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９、およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）。天然に存在しないグルコースデヒドロゲナーゼは、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して再生されている（例えば、変異誘発および指向進化など；例えば、ＷＯ２００５／０１８５７９号ならびに米国特許出願公開第２００５／００９５６１９号および同第２００５／０１５３４１７号（それぞれ本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本プロセスで使用されるグルコースデヒドロゲナーゼはＣＤＸ−９０１またはＧＤＨ−１０５であり、それぞれ市販されている（Ｃｏｄｅｘｉｓ，Ｉｎｃ．Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）。
いくつかの実施形態では、補因子再生系は、アルコールデヒドロゲナーゼまたはケトレダクターゼを含み、これは、第二級アルコールおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のケトンおよびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへのそれぞれの変換を触媒するＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性の酵素である。補因子再生系で有用な適切な第二級アルコールには、低級第二級アルカノールおよびアリール−アルキルカルビノール（イソプロパノール、２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、および３，３−ジメチル−２−ブタノールが含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。本明細書中に記載のプロセスで補因子再生系としての使用に適切なアルコールデヒドロゲナーゼには、天然に存在するケトレダクターゼおよび天然に存在しないケトレダクターゼが含まれる。天然に存在するアルコールデヒドロゲナーゼ／ケトレダクターゼには、制限されない例として、Ｔｈｅｒｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ由来の公知の酵素が含まれ、天然に存在しないアルコールデヒドロゲナーゼには、上記由来の操作されたアルコールデヒドロゲナーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、熱安定性および溶媒安定性のために操作された天然に存在しないケトレダクターゼを使用することができる。かかるケトレダクターゼには、本明細書中に記載のケトレダクターゼ、および当該分野で公知の他のケトレダクターゼが含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００８０３１８２９５Ａ１号、同第２００９００９３０３１Ａ１号、同第２００９０１５５８６３Ａ１号、同第２００９０１６２９０９Ａ１号、同第２００９０１９１６０５Ａ１号、同第２０１０００５５７５１Ａ１号、ＷＯ／２０１０／０２５２３８Ａ２号、ＷＯ／２０１０／０２５２８７Ａ２号、および米国特許出願公開第２０１０００６２４９９Ａ１号（それぞれ本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。
反応混合物中のケトン基質化合物およびアミン基質化合物の濃度を、例えば、生成物化合物の望ましい量、酵素活性に及ぼす基質濃度の影響、反応条件下での酵素の安定性、および生成物に対する基質の変換率を考慮して変更することができる。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５〜約２００ｇ／Ｌ、１〜約２００ｇ／Ｌ、５〜約１５０ｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｇ／Ｌ、２０〜約１００ｇ／Ｌ、または約５０〜約１００ｇ／Ｌの基質化合物負荷を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌ、または少なくとも約２００ｇ／Ｌ、またはさらに超えるそれぞれのケトン基質化合物およびアミン基質化合物の負荷を含む。本明細書中に提供した基質負荷値は化合物（１ｄ）の分子量に基づくが、他のケトン基質およびアミン基質（ケトン基質化合物（１ａ）〜（１ｄ）およびアミン基質化合物（２ａ）〜（２ｄ）など）のモル当量を使用することができ、等モル量のこれらの化合物のいずれかの水和物または塩も本プロセスで使用することができることも意図する。いくつかの実施形態では、適切な反応条件が、化合物（１ｄ）についての上記ｇ／Ｌ濃度に対するモル濃度当量に関する各ケトン基質化合物およびアミン基質化合物の負荷を含むことも意図する。したがって、反応条件は、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約７５ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、またはさらにそれを超える基質負荷の各ケトン基質化合物およびアミン基質化合物を含むことができる。さらに、式（Ｉ）および（ＩＩ）によって網羅される基質化合物を、化合物（１ｄ）のために使用した量と同一範囲の量で使用することができることを意図する。
本明細書中に記載のイミンレダクターゼ媒介プロセスの実施では、操作されたポリペプチドを、精製酵素、部分精製酵素、酵素をコードする遺伝子で形質転換したホールセルの形態で、かかる細胞の細胞抽出物および／または溶解物として、および／または固体支持体上に固定した酵素として反応混合物に添加することができる。操作されたイミンレダクターゼ酵素をコードする遺伝子で形質転換したホールセルまたはその細胞抽出物、溶解物、および単離された酵素を、種々の異なる形態（固体（例えば、凍結乾燥形態、および噴霧乾燥形態など）または半固体（例えば、粗ペースト）が含まれる）で使用することができる。細胞抽出物または細胞溶解物を、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、または熱処理など、およびその後の凍結乾燥前の脱塩手順（例えば、限外濾過および透析など）によって部分精製することができる。任意の酵素調製物（ホールセル調製物が含まれる）を、公知の架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドなど）を使用した架橋または固相（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃなど）への固定によって安定化することができる。
操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子を、宿主細胞に個別に形質転換するか、同一宿主細胞に共に形質転換することができる。例えば、いくつかの実施形態では、一方の宿主細胞組を、一方の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換することができ、他方の組を他方の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換することができる。両方の形質転換された細胞の組を、ホールセルの形態またはホールセル由来の溶解物もしくは抽出物の形態にて反応混合物中で共に利用することができる。他の実施形態では、宿主細胞を、複数の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換することができる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドを、分泌されたポリペプチドの形態で発現することができ、分泌されたポリペプチドを含む培養培地を、イミンレダクターゼ反応のために使用することができる。
本明細書中に開示の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドの改良された活性および／または立体選択性により、より低い濃度の操作されたポリペプチドを使用してより高い変換率を得ることができるプロセスが得られる。プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、７５％（ｗ／ｗ）、１００％（ｗ／ｗ）、またはそれを超える量の基質化合物負荷の操作されたポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、約０．０１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ；約０．０５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；約１ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；約２ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；約５ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；約５ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ；約０．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ；約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ；約０．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ；または約０．１ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌで存在する。いくつかの実施形態では、イミンレダクターゼポリペプチドは、約０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、または５０ｇ／Ｌで存在する。
一連の反応中、反応混合物のｐＨは変化し得る。反応混合物のｐＨを、所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲内に維持することができる。一連の反応前および／または反応中の酸または塩基の添加によってこれを行うことができる。あるいは、緩衝液の使用によってｐＨを調節することができる。したがって、いくつかの実施形態では、反応条件には、緩衝液が含まれる。所望のｐＨ範囲を維持するための適切な緩衝液が当該分野で公知であり、制限されない例として、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、酢酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、および２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）緩衝液などが含まれる。いくつかの実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液である。プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約０．０１〜約０．４Ｍ、０．０５〜約０．４Ｍ、０．１〜約０．３Ｍ、または約０．１〜約０．２Ｍの濃度の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）を含む。いくつかの実施形態では、反応条件は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．３、または０．４Ｍの濃度の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）を含む。いくつかの実施形態では、反応条件は、適切な溶媒として緩衝液が存在しない水を含む。
プロセスの実施形態では、反応条件は、適切なｐＨを含むことができる。望ましいｐＨまたは望ましいｐＨ範囲を、酸または塩基、適切な緩衝液の使用、または緩衝化と酸もしくは塩基の添加との組み合わせによって維持することができる。反応混合物のｐＨを、一連の反応前および／または反応中に調節することができる。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、ｐＨが約４〜約１０、約５〜約１０、約７〜約１１、約８〜約１０、約６〜約８の溶液を含む。いくつかの実施形態では、反応条件は、ｐＨが約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０の溶液を含む。
本明細書中のプロセスの実施形態では、例えば、より高い温度での反応速度の増加および反応期間中の酵素活性を考慮して、反応条件に適切な温度を使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃〜約８０℃、約１０℃〜約７０℃、約１５℃〜約６５℃、約２０℃〜約６０℃、約２０℃〜約５５℃、約２５℃〜約５５℃、または約３０℃〜約５０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、または８０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度を、一連の反応を通して特定の温度に維持することができる。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度を、一連の反応中の温度プロフィールに対して調整することができる。
本発明のプロセスを、一般に溶媒中で行う。適切な溶媒には、水、水性緩衝液、有機溶媒、ポリマー溶媒、および／または共溶媒系（一般に、水性溶媒、有機溶媒、および／またはポリマー溶媒を含む）が含まれる。水性溶媒（水または水性共溶媒系）を、ｐＨ緩衝化しても緩衝化しなくてもよい。いくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを使用するプロセスを、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチル−ピロリドン（ＮＭＰ）、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、およびトルエンなど）、イオン性溶媒または極性溶媒（例えば、１−エチル−４−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボラート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボラート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスファート、グリセロール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）を含む水性共溶媒系中で行うことができる。いくつかの実施形態では、共溶媒は、極性溶媒（ポリオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または低級アルコールなど）であり得る。水性共溶媒系の非水性共溶媒成分は、水性成分と混和性を示して単一の液相を得ることができるか、水性成分と部分的混和性または不混和性を示して２種の液相を得ることができる。例示的な水性共溶媒系は、水ならびに有機溶媒、極性溶媒、およびポリオール溶媒から選択される１つまたはそれを超える共溶媒を含むことができる。一般に、水性共溶媒系の共溶媒成分を、反応条件下でイミンレダクターゼ酵素を不利に不活化しないように選択する。適切な共溶媒系を、酵素活性アッセイ（本明細書中に記載のアッセイなど）を利用した候補溶媒系における目的の定義した基質を使用した指定の操作されたイミンレダクターゼ酵素の酵素活性の測定によって容易に同定することができる。
プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、水性共溶媒を含み、この共溶媒は、約１％〜約５０％（ｖ／ｖ）、約１〜約４０％（ｖ／ｖ）、約２％〜約４０％（ｖ／ｖ）、約５％〜約３０％（ｖ／ｖ）、約１０％〜約３０％（ｖ／ｖ）、または約１０％〜約２０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含む。プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）、約２０％（ｖ／ｖ）、約２５％（ｖ／ｖ）、約３０％（ｖ／ｖ）、約３５％（ｖ／ｖ）、約４０％（ｖ／ｖ）、約４５％（ｖ／ｖ）、または約５０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含む水性共溶媒を含むことができる。
いくつかの実施形態では、反応条件は、反応の安定化または増強のための界面活性剤を含むことができる。界面活性剤は、非イオン性、陽イオン性、陰イオン性、および両親媒性の界面活性剤を含むことができる。例示的な界面活性剤には、制限されない例として、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ポリオキシエチレン−ステアリルアミン、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、オレイルアミド硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｌｅｙｌａｍｉｄｏｓｕｌｆａｔｅ）、ポリオキシエチレン−ソルビタンモノステアラート、ヘキサデシルジメチルアミンなどが含まれる。反応を安定化または増強することができる任意の界面活性剤を使用することができる。反応における界面活性剤の使用濃度は、一般に、０．１〜５０ｍｇ／ｍｌ、特に１〜２０ｍｇ／ｍｌであり得る。
いくつかの実施形態では、反応条件には、反応溶液を混合またはスパージングする場合などに反応溶液中の起泡を軽減または防止するのを補助する消泡剤を含めることができる。消泡剤には、非極性油（例えば、鉱物、シリコーンなど）、極性油（例えば、脂肪酸、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルファートなど）、および疎水性消泡剤（例えば、処理済みシリカ、ポリプロピレンなど）が含まれ、これらのうちのいくつかは界面活性剤としても機能する。例示的な消泡剤には、Ｙ−３０（登録商標）（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ポリ−グリコールコポリマー、オキシ／エトキシル化アルコール、およびポリジメチルシロキサンが含まれる。いくつかの実施形態では、消泡剤は、約０．００１％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）、または約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２％（ｖ／ｖ）で存在し得る。いくつかの実施形態では、消泡剤は、反応を促進することが望ましい場合、約０．００１％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、または約５％（ｖ／ｖ）、またはそれを超えて存在し得る。
イミンレダクターゼ反応で使用される反応物の量は、一般に、望ましい生成物の量、同時にイミンレダクターゼ基質の使用量に応じて変化するであろう。当業者は、所望の生成レベルおよび生成規模に合わせてこれらの量を変化させる方法を容易に理解するであろう。
いくつかの実施形態では、反応物の添加順序は重要ではない。反応物を、溶媒（例えば、単相溶媒および二相水性共溶媒系など）と同時に共に添加することができ、あるいは、いくつかの反応物を、個別に添加することができ、いくつかの反応物を異なる時点で一緒に添加することができる。例えば、補因子、補助基質、イミンレダクターゼ、および基質を、最初に溶媒に添加することができる。
固体反応物（例えば、酵素、塩など）を、種々の異なる形態（粉末（例えば、凍結乾燥粉末および噴霧乾燥粉末など）、溶液、乳濁液、および懸濁液などが含まれる）で反応物に提供することができる。反応物を、当業者に公知の方法および装置を使用して容易に凍結乾燥または噴霧乾燥させることができる。例えば、タンパク質溶液を、少量ずつ等分して−８０℃で凍結し、次いで、予め冷却した凍結乾燥室に添加し、その後に真空を適用することができる
水性共溶媒系を使用する場合の混合効率を改良するために、イミンレダクターゼおよび補因子を水相に最初に添加し、混合することができる。次いで、有機相を添加し、混合し、その後にイミンレダクターゼ基質および補助基質を添加することができる。あるいは、イミンレダクターゼ基質を、有機相に予め混合後、水相に添加することができる。
イミンレダクターゼ反応は、一般に、基質の生成物へのさらなる変換が反応時間とともに有意に変化しなくなるまで（例えば、１０％未満の基質が変換されるか、５％未満の基質が変換されるまで）進行させる。いくつかの実施形態では、基質が生成物に完全またはほぼ完全に変換されるまで、反応を進行させる。基質の生成物への成分変換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を、公知の方法を使用して、誘導体化するか誘導体化しない基質および／または生成物の検出によってモニタリングすることができる。適切な分析方法には、ガスクロマトグラフィおよびＨＰＬＣなどが含まれる。
プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、またはそれを超える基質の負荷を含み、本方法により、約４８時間またはそれ未満、約３６時間またはそれ未満、または約２４時間またはそれ未満で少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれを超えて基質化合物が生成物化合物に変換される。
適切な反応条件下にてプロセスで使用した場合、本発明の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドにより、所望の第二級アミン生成物または第三級アミン生成物のジアステレオマー過剰率は少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える。いくつかの実施形態では、検出可能な量の望ましくないジアステレオマーの第二級アミン生成物または第三級アミン生成物は形成されない。
操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを使用した基質化合物のアミン生成物化合物への変換のためのプロセスのさらなる実施形態では、適切な反応条件は、反応溶液への最初の基質負荷を含み得、これは、その後、ポリペプチドによって接触される。この反応溶液に、少なくとも約１ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約２ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約６ｇ／Ｌ／ｈ、またはそれを超える速度での長時間にわたる連続的添加またはバッチ式添加としてさらなる基質化合物をさらに補足する。したがって、これらの適切な反応条件によれば、ポリペプチドを、それぞれ少なくとも約２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、または４０ｇ／Ｌの最初のケトン基質およびアミン基質を負荷した溶液に添加する。このポリペプチドの添加後、それぞれ少なくとも約３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、またはそれを超える遥かに高い最終基質負荷に到達するまで約２ｇ／Ｌ／ｈ、４ｇ／Ｌ／ｈ、または６ｇ／Ｌ／ｈの速度で溶液にさらなるケトン基質およびアミン基質を連続的に添加する。したがって、プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、それぞれ少なくとも約２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、または４０ｇ／Ｌの基質を最初に負荷した溶液へのポリペプチドの添加、その後の少なくとも約３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌまたはそれを超える最終基質負荷に到達するまでの約２ｇ／Ｌ／ｈ、４ｇ／Ｌ／ｈ、または６ｇ／Ｌ／ｈの速度での溶液へのさらなるケトン基質およびアミン基質の添加を含む。これらの基質補足反応条件により、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超える基質のアミン生成物への高変換率を維持しながらより高い基質負荷を達成可能である。
プロセスのいくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを使用した反応は、以下の適切な反応条件を含むことができる：（ａ）約５ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約１９ｇ／Ｌ（０．１３Ｍ）〜５７ｇ／Ｌ（０．３９Ｍ）のα−ケトグルタラート；（ｄ）約１４ｇ／Ｌ（０．０８Ｍ）〜６３ｇ／Ｌ（０．３６Ｍ）アスコルビン酸；（ｅ）約１．５ｇ／Ｌ（３．８ｍＭ）〜４．５ｇ／Ｌ（１１．５ｍＭ）のＦｅＳＯ４；（ｆ）約６〜９のｐＨ；（ｇ）約２０℃〜５０℃の温度；および（ｈ）２〜２４時間の反応時間。
プロセスのいくつかの実施形態では、操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを使用した反応は、以下の適切な反応条件を含むことができる：（ａ）約１０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約０．１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／ＬのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの負荷；（ｄ）約６〜１０のｐＨ；（ｇ）約２０℃〜５０℃の温度；および（ｈ）６〜１２０時間の反応時間。
いくつかの実施形態では、反応条件を補足するために、さらなる反応成分またはさらなる技術を実施した。これらは、酵素の安定化またはその不活化の阻害、生成物の阻害の軽減、アミン生成物形成への反応平衡のシフトのための手段を講じることを含むことができる。
さらなる実施形態では、基質化合物の生成物化合物への変換のための上記の任意のプロセスは、以下：生成物化合物の抽出；単離；精製；および結晶化から選択される１つまたはそれを超える工程をさらに含むことができる。上で開示の方法によって生成された生体触媒反応混合物からのアミン生成物の抽出、単離、精製、および／または結晶化のための方法、技術、およびプロトコールは、当業者に公知であり、そして／または日常的な実験によって評価される。さらに、例示的な方法を、以下の実施例に示す。
本発明の種々の特徴および実施形態を、以下の代表例で例示しており、これは、例示を意図し、本発明の制限を意図しない。
実験
以下の実施例（達成された実験および結果が含まれる）を、例示のみを目的として提供し、この実施例は、本発明を制限すると解釈されない。
以下に開示の実験では、以下の略語を適用する：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（ユニット）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド／平方インチ）；℃（摂氏）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＣＡＭおよびｃａｍ（クロラムフェニコール）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）；ＧＤＨ（グルコースデヒドロゲナーゼ）；ＦＤＨ（ギ酸デヒドロゲナーゼ）；ＬＢ（Ｌｕｒｉａブロス）；ＴＢ（ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス）；ＳＦＰ（フラスコ振盪培養粉末）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；大腸菌Ｗ３１１０（一般的に使用される研究用大腸菌株，ｔｈｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴから利用可能）；ＨＴＰ（高処理）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）；ＦＩＯＰＣ（ポジティブコントロールに対する改良の倍数）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）；およびＧｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ（Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。
実施例１
イミンレダクターゼ活性を有するＣＥＮＤＨから誘導された操作されたポリペプチドの生成
配列番号４〜１３００のうちの偶数番号の配列の操作されたイミンレダクターゼポリペプチドを、ｌａｃプロモーターの調節下にて大腸菌Ｗ３１１０中で生成した。操作されたポリペプチドの指向進化で使用したＨＴＰアッセイのための酵素調製物を、以下のように作製した。
高処理（ＨＴＰ）成長、発現、および溶解物調製。細胞を選別し、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬ ＣＡＭを含むＬＢ培地中にて、３０℃、２００ｒｐｍ、湿度８５％で一晩成長させた。次に、２０μＬの一晩成長物を、３０μｇ／ｍＬ ＣＡＭを含む３８０μＬのＴＢ成長培地を含むディープウェルプレートに移し、３０℃、２５０ｒｐｍ、湿度８５％で増殖させた。イミンレダクターゼ遺伝子の発現を、培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８であるときにＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加することで誘導した。次に、インキュベーションを一晩（約１８時間）継続した。細胞培養物を、４０００ｒｐｍにて、４℃で１０分間遠心分離し、培地を破棄した。細胞ペレットを−８０℃で保存し、以下のようにＨＴＰ反応のための溶解物調製のために使用した。１ｇ／Ｌリゾチームおよび１ｇ／Ｌ ＰＭＢＳを含む溶解緩衝液を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で調製した。９６ウェルプレート中の細胞ペレットを、タイタープレートシェーカーにて室温で２時間中速振盪しながら２５０μＬ溶解緩衝液中で溶解した。次いで、プレートを、４０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離し、透明な上清を、ＨＴＰアッセイ反応における透明溶解物として使用した。
フラスコ振盪培養粉末（ＳＦＰ）の生成：フラスコ振盪手順を使用して、二次スクリーニングアッセイに有用である、および／または本明細書中に開示の生体触媒プロセスにおいて使用する操作されたイミンレダクターゼポリペプチドのフラスコ振盪培養粉末（ＳＦＰ）を生成することができる。酵素のフラスコ振盪培養粉末（ＳＦＰ）調製により、ＨＴＰアッセイで使用した細胞溶解物と比較した場合に、より精製された操作された酵素の調製物（例えば、総タンパク質の３０％まで）が得られ、とりわけ、より濃縮した酵素溶液の使用が可能である。目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含む大腸菌の単一コロニーを、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含む５０ｍＬ Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉブロスに播種する。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪したインキュベーター中にて３０℃で一晩（少なくとも１６時間）成長させる。培養物を、１Ｌフラスコ中にて３０μｇ／ｍｌ ＣＡＭを含む２５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（１２ｇ／Ｌバクト−トリプトン、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌグリセロール、６５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＭｇＳＯ４）で６００ｎｍ（ＯＤ６００）の光学密度０．２に希釈し、３０℃で成長させる。培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８である場合に最終濃度１ｍＭまでのＩＰＴＧの添加によってイミンレダクターゼ遺伝子の発現を誘導する。次いで、インキュベーションを一晩（少なくとも１６時間）継続する。細胞を、遠心分離（４０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）によって回収し、上清を破棄する。細胞ペレットを、等体積の冷却（４℃）５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）での再懸濁により洗浄し、上記のように遠心分離によって回収する。洗浄した細胞を、秤量し、細胞ペレット１ｇ当たり６ｍｌの冷却５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で再懸濁する。再懸濁した細胞を、１１０Ｌ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ， Ｎｅｗｔｏｎ， ＭＡ）を使用して溶解する。細胞デブリを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、６０分間、４℃）によって除去する。透明な溶解物上清を回収し、−２０℃で保存する。凍結透明溶解物の凍結乾燥により、粗製の操作されたポリペプチドの乾燥フラスコ振盪培養粉末が得られる。あるいは、細胞ペレット（洗浄前または洗浄後）を、４℃または−８０℃で保存することができる。
実施例２
化合物３ａおよび３ｂの調製における改良された安定性およびイミンレダクターゼ活性についての配列番号４から誘導された操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
配列番号４のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを使用して、表３Ａ〜３Ｃのさらに操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、配列番号４と比較して、改良されたイミンレダクターゼ活性（例えば、ケトン基質化合物（１ａ）の生成物への変換率）を有する。次に、配列番号６のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを使用して、表３Ｄ〜３Ｆのさらに操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、配列番号６と比較して、改良されたイミンレダクターゼ活性（例えば、ケトン基質化合物（１ｂ）の生成物への変換率）を有する。
配列番号１０〜３５８のうち偶数番号の配列識別子のアミノ酸配列を有するこれらの操作されたポリペプチドを、ＨＴＰアッセイおよび表４Ａに記述し、且つ以下にさらに記載した分析方法と共に上記の指向進化法を使用して配列番号４または６の「骨格」アミノ酸配列から生成した。
指向進化を、出発「骨格」遺伝子配列として、それぞれ、配列番号４および６の操作されたポリペプチドをコードする配列番号３および５のポリヌクレオチドから開始した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技術（例えば、飽和変異誘発、予め同定した有益なアミノ酸の相違の組換え）を使用して生成し、ＨＴＰアッセイおよび操作されたポリペプチドが１つまたはそれを超える表２に示す触媒反応（ＡまたはＢ）を実施する能力を測定する分析方法を使用してスクリーニングした。スクリーニング後、出発骨格配列（すなわち「コントロール」配列）を超える最高の改良を示す操作されたポリペプチドを、さらなるライブラリーの構築のための骨格配列として使用し、スクリーニングプロセスを繰り返して、所望の活性を得るためにポリペプチドをさらに進化させた。
酵素アッセイ反応を、９６ウェルプレート形式で１００μＬの総体積中で実施した。アッセイ反応を、５５μＬの溶解物を含む各ウェルに以下のものを添加することで開始した：（ｉ）１０μＬのＧＤＨ補因子リサイクリングプレミックス（プレミックスは、１０ｇ／Ｌグルコース、３０ｇ／Ｌ ＮＡＤ＋、１０ｇ／Ｌ ＧＤＨ−１０５を含む）；（ｉｉ）２０μＬのアミン基質ストック溶液（５００ｍＭ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液中、ｐＨは８．０に調整）；および１５μＬのケトンレダクターゼストック溶液（３３３ｍＭ、ＤＭＳＯ中）。結果的に生じたアッセイ反応物は、５０ｍＭケトンレダクターゼ基質化合物（１ａまたは１ｂ）、１００ｍＭアミン基質（２ａまたは２ｂ）、５５．５ｍＭグルコース、３ｇ／Ｌ ＮＡＤ＋、１ｇ／Ｌ ＧＤＨ−１０５、８５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０、１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含んでいた。反応プレートを、熱封止し、４４℃において４００ｒｐｍで一晩（１６〜２４時間）振盪した。各反応混合物を、０．１％ギ酸を含む１００μＬのＣＨ３ＣＮを添加することでクエンチし、振盪し、１０分間、４０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。１０μＬのクエンチした混合物を、混合しながら０．０５％ギ酸を含むＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（５０／５０）中で２０倍に希釈した。次に、１０μＬの希釈した混合物を、０．０５％ギ酸を含む１９０μＬのＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（５０／５０）にさらに希釈して、合計８００倍希釈の混合物とした。次に、これらの混合物を、以下の表に記載する通りのＭＲＭモードのＬＣ−ＭＳにより生成物化合物（３ａまたは３ｂ）形成について解析した。
アミン生成物化合物３ａについてのＬＣ−ＭＳ分析（表４Ａ）：上記の実施例２に記述のように調製したＨＴＰアッセイ混合物を、ＭＲＭトランジション：３４７／２３２を使用したＭＲＭモードでのＬＣ−ＭＳによって生成物化合物（３ａ）の形成について分析した。さらなる関連するＬＣ−ＭＳ装置のパラメーターおよび条件を、以下に示す通りであった。
アミン生成物化合物３ｂについてのＬＣ−ＭＳ分析（表４ｂ）：上記の実施例２に記述のように調製したＨＴＰアッセイ混合物を、ＭＲＭトランジション：２４２／１６８を使用したＭＲＭモードでのＬＣ−ＭＳによって生成物化合物（３ｂ）の形成について分析した。さらなる関連するＬＣ−ＭＳ装置のパラメーターおよび条件を、以下に示す通りであった。
実施例３
化合物３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆおよび３ｇの調製における改良された安定性およびイミンレダクターゼ活性についての配列番号８から誘導された操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
配列番号８のイミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを使用して、表３Ｇ〜３Ｍのさらに操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、これらの表に示されるようにさらに改良されたイミンレダクターゼ活性（例えば、ケトン基質化合物（１ｃまたは１ｄ）の生成物への変換率）を有する。配列番号３５８〜１３００のうち偶数番号の配列識別子のアミノ酸配列を有するこれらの操作されたポリペプチドを、上記の指向進化法ならびにＨＴＰアッセイおよび表４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅに示し、且つ以下にさらに記載した分析方法を使用して配列番号８の「骨格」アミノ酸配列から生成した。
指向進化を、出発「骨格」遺伝子配列として、配列番号８の操作されたポリペプチドをコードする配列番号７のポリヌクレオチドから開始した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技術（例えば、飽和変異誘発、予め同定した有益なアミノ酸の相違の組換え）を使用して生成し、ＨＴＰアッセイおよび操作されたポリペプチドが１つまたはそれを超える表２に示す触媒反応（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆおよび／またはＧ）を実施する能力を測定する分析方法を使用してスクリーニングした。スクリーニング後、出発骨格配列（すなわち「コントロール」配列）を超える最高の改良を示す操作されたポリペプチドを、さらなるライブラリーの構築のための骨格配列として使用し、スクリーニングプロセスを繰り返して、所望の活性を得るためにポリペプチドを進化させた。
酵素アッセイ反応を、９６ウェルプレート形式で１００μＬの総体積中で実施した。アッセイ反応を、５５μＬの溶解物を含む各ウェルに以下のものを添加することで開始した：（ｉ）１０μＬのＧＤＨ補因子リサイクリングプレミックス（プレミックスは、１００ｇ／Ｌグルコース、３０ｇ／Ｌ ＮＡＤ＋、１０ｇ／Ｌ ＧＤＨ−１０５を含む）；（ｉｉ）２０μＬのアミン基質ストック溶液（２５０ｍＭ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液中、ｐＨは８．０に調整）；および１５μＬのケトンレダクターゼストック溶液（３３３ｍＭ化合物、ＤＭＳＯ中）。結果的に生じたアッセイ反応物は、５０ｍＭケトンレダクターゼ基質化合物（１ｃまたは１ｄ）、１００ｍＭまたは５０ｍＭアミン基質（２ｃまたは２ｄ）、５５．５ｍＭグルコース、３ｇ／Ｌ ＮＡＤ＋、１ｇ／Ｌ ＧＤＨ−１０５、８５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０、１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含んでいた。反応プレートを、熱封止し、４４℃において４００ｒｐｍで一晩（１６〜２４時間）振盪した。各反応混合物を、０．１％ギ酸を含む１００μＬのＣＨ３ＣＮを添加することでクエンチし、振盪し、１０分間、４０００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離した。１０μＬのクエンチした混合物を、混合しながら０．０５％ギ酸を含むＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（５０／５０）中で１０倍に希釈して、合計１００倍希釈の混合物とした。次に、これらの混合物を、以下の表に記載する通りのＭＲＭモードのＬＣ−ＭＳにより生成物化合物（３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆおよび／または３ｇ）形成について解析した。
アミン生成物化合物（３ｃ）についてのＬＣ−ＭＳ分析（表４ｃ）：上記の実施例３に記述のように調製したＨＴＰアッセイ混合物を、ＭＲＭトランジション：３００．３／１９０．２を使用したＭＲＭモードでのＬＣ−ＭＳによって生成物化合物（３ｃ）の形成について分析した。さらなる関連するＬＣ−ＭＳ装置のパラメーターおよび条件を、以下に示す通りに使用した。
アミン生成物化合物３ｄについてのＬＣ−ＭＳ分析（表４Ｄ）：上記の実施例３に記述のように調製したＨＴＰアッセイ混合物を、ＭＲＭトランジション：３８５．３／３２９．４を使用したＭＲＭモードでのＬＣ−ＭＳによって生成物化合物（３ｄ）の形成について分析した。さらなる関連するＬＣ−ＭＳ装置のパラメーターおよび条件を、以下に示した通りに使用した。
アミン生成物化合物（３ｅ、３ｆおよび３ｇについてのＬＣ−ＭＳ分析（表４Ｅ）：実施例３に上記のように調製したＨＴＰアッセイ混合物を、４９９．２質量単位の検出を使用したＭＳ２モードでのＬＣ−ＭＳによって生成物化合物（３ｆ、３ｇおよび３ｅ）（３ｆおよび３ｇの合計）の形成について分析した。さらなる関連するＬＣ−ＭＳ装置のパラメーターおよび条件を、以下に示す通りに使用した。

Claims (6)

  1. 操作されたポリペプチドであって、
    前記ポリペプチドは、配列番号３７２、３７４、３７６、３８８、４０２、４０４、４０６、４０８、４１６、４１８、４２２、４２６、４２８、４３２、４３６、４４２、４４４、４５８、４６８、４７０、４７４、４７８、４８２、４８４、４８６、４９０、４９２、４９４、５００、５０２、５０４、５０８、５１８、５２０、５２２、５２４、５３０、５３６および５４４の配列識別子からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
    前記ポリペプチドは、配列番号８と比較した場合に増大したイミンレダクターゼ活性を有する、操作されたポリペプチド。
  2. 前記イミンレダクターゼ活性が、適切な反応条件下で、以下のケトン基質化合物およびアミン基質化合物の対から、列挙したアミン生成物化合物：

    のうちの少なくとも１つを変換することを含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  3. 請求項１に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  4. 請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  5. 請求項３に記載のポリヌクレオチド、あるいは請求項４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  6. イミンレダクターゼ活性を有する操作されたポリペプチドを調製する方法であって、請求項５に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現に適切な条件下で培養する工程を含み、任意選択的に、前記操作されたポリペプチドを単離する工程をさらに含む、方法。

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