JP6525473B2 - 複製物配列決定リードを同定するための組成物および方法 - Google Patents

Description

（関連出願への相互参照）
この出願は、２０１３年１１月１３日に出願された米国仮出願第６１／９０３，８２６号（これは、その全体が参考して援用される）の利益を主張する。

電子的に提出されたテキストファイルについての説明
ここに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参考として本明細書に援用される：配列表のコンピュータ読み取り可能なフォーマットのコピー（ファイル名称：ＮＵＧＮ＿００１＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１４年１１月１２日、ファイルサイズ ３キロバイト）。

（発明の分野）
本発明は、一般に、ハイスループット配列決定反応の分野および配列複製物を通じて生じる人工産物を、固有の分子であるヌクレオチド分子から識別する能力に関する。

（発明の背景）
ＲＮＡ配列決定適用において、正確な遺伝子発現測定は、ライブラリー増幅の間に起こるＰＣＲ複製人工産物によって妨害され得る。ＲＮＡ配列決定データを分析する場合、２以上の同一の配列が見出される場合、これらが異なるＲＮＡ分子に独立して由来する固有のｃＤＮＡ分子を表すか否か、またはそれらが単一のＲＮＡ分子に由来するＰＣＲ複製物であるか否かを知ることは、困難であり得る。配列決定によって遺伝子型決定するにあたって、複製物リードは、無情報（ｎｏｎ−ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ）であるとみなされ得、単一リードへと帰結（ｃｏｌｌａｐｓｅｄ ｄｏｗｎ）され得るので、最終分析で使用される配列決定リードの数を低減させ得る。一般には、配列決定リードは、２つの独立して生成された分子が偶然に同一の出発位置を有し得るとしても、正方向リードおよび逆方向リードの両方が同一の出発位置を有する場合に、複製物であると決定され得る。単一のプライマー伸長ベースの標的化された再配列決定は、配列決定リードの一方の末端のみが無作為に生成されると同時に、他方の（逆方向リード）末端が特定のプローブによって生成されるという点で問題がある。このことは、２つのリードが複製物であるか否かを決定することを困難にし得る。なぜならそれらは、ＰＣＲによって複製されたか、または同じ位置で偶然出発したからである。

発現分析研究において、ペアエンド配列決定（ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行うことにおける価値は限られている可能性がある。なぜなら実験の目的が、エキソン使用法を研究することとは対照的に、存在する転写物の量を決定することであるからである。これら研究において、ペアエンド配列決定はコストを付加する一方で、唯一の価値は、ＰＣＲ複製物を区別する一助にある。２つのリードが一方の末端のみにある同じ位置で出発する確率は、２つのリードが２つの末端（正方向リードおよび逆方向リード）にある同じ出発位置を有する確率より高い。使用できないもしくは望ましくないデータリードの生成に起因する配列決定コストを押し上げる内在する機器の非効率性をともなわずに、目的の領域の低コストのハイスループット配列決定、ＲＮＡ転写物の遺伝子型決定もしくは単純な検出を可能にする改善された方法が必要である。本明細書で記載される発明は、この必要性を満たす。ここで、本発明者らは、真のＰＣＲ複製物の同定およびそれらの除去を可能にするアダプターアプローチを記載する。

本発明の方法は、配列決定の間に真の複製物リードを同定するため（例えば、配列決定データのデータ分析を改善するため）の新規な方法および他の関連する利点を提供する。

（発明の要旨）
本発明は、複製物配列決定リードを配列決定リードの集団から識別するための組成物および方法に一部基づく。本明細書で示される複製物配列決定リードの検出および／もしくは除去は、ハイスループット配列決定反応（複雑な多重シークエンス反応を含む）から生成されたデータを評価する有効性を増大させる新規なアプローチである。

よって、本発明は、複製物配列決定リードをサンプル配列決定リードの集団から検出する方法を提供し、上記方法は、アダプターを、１以上のサンプルに由来する複数の核酸フラグメントの各核酸フラグメントの５’末端にライゲーションする工程を包含し、ここで上記アダプターは、インデックス付加プライマー結合部位、インデックス付加部位、識別子部位、および標的配列プライマー結合部位を含む。上記ライゲーションされたアダプター−核酸フラグメント生成物は、増幅され得、従って、配列決定リードの集団を、上記増幅されたアダプター−核酸ライゲーション生成物から生成し得る。次いで、複製物識別子部位および標的配列を有する上記配列決定リードは、上記配列決定リードの集団から検出され得る。上記方法は、上記複製物識別子部位および標的配列を有する配列決定リードを、配列リードの集団から除去することをさらに含み得る。

いくつかの実施形態において、上記識別子部位は、上記インデックス付加部位もしくは上記標的配列とともに配列決定される。さらなる実施形態において、上記識別子部位は、上記インデックス付加部位もしくは上記標的配列とは別個に配列決定される。

いくつかの実施形態において、上記アダプターは、５’から３’へと、上記インデックス付加プライマー結合部位；上記インデックス付加部位；上記識別子部位；および上記標的配列プライマー結合部位を含む。さらなる実施形態において、上記アダプターは、５’から３’へと、上記インデックス付加プライマー結合部位；上記インデックス付加部位；上記標的配列プライマー結合部位；および上記識別子部位を含む。

いくつかの実施形態において、上記複数の核酸フラグメントは、１より多くのサンプルから生成される。いくつかの実施形態において、各サンプルに由来する上記核酸フラグメントは、同じインデックス付加部位を有する。いくつかの実施形態において、上記配列決定リードは、上記インデックス付加部位に基づいて分離される。なお他の実施形態において、上記配列決定リードの分離は、複製物識別子部位および標的配列を有する配列リードを検出する前に行われる。

いくつかの実施形態において、上記核酸フラグメントは、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、もしくはＤＮＡ／ＲＮＡフラグメントである。さらなる実施形態において、上記核酸フラグメントは、ゲノムＤＮＡフラグメントもしくはｃＤＮＡフラグメントである。

いくつかの実施形態において、上記インデックス付加部位は、２ヌクレオチド〜８ヌクレオチドの間の長さである。さらなる実施形態において、上記インデックス付加部位は、約６ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、上記識別子部位は、１ヌクレオチド〜８ヌクレオチドの間の長さである。さらなる実施形態において、上記識別子部位は、約８ヌクレオチドの長さである。

いくつかの実施形態において、上記インデックス付加プライマー結合部位は、ユニバーサルインデックス付加プライマー結合部位であり；いくつかの実施形態において、上記標的配列プライマー結合部位は、ユニバーサル標的配列プライマー結合部位である。

本発明はまた、複数のアダプターを含むキットであって、ここで各アダプターは、インデックス付加プライマー結合部位；インデックス付加部位、および識別子部位、ならびに標的配列決定プライマー結合部位を含むキットを含む実施形態を包含する。

本発明の新規な特徴および本発明の利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態およびその添付の図面を記載する以下の説明を参照することによって得られる。

図１は、インデックス付加プライマーおよび標的配列プライマーがアニールする場所を含むライブラリーの配列決定リードを生成する模式図を示す。 図２Ａは、単一プライマー富化技術（ＳＰＥＴ）の機構、ならびに識別子部位が最終ライブラリーへとどのようにして持ち越されるか、および上記インデックス付加部位を通じて上記識別子部位への配列決定が、核酸分子が同定されるデータをどのようにして提供するかを示す。 図２Ｂは、図２Ａの続きである。 図３は、多くの想定される実施形態の中でも例示のアダプターの配列の詳細な図、および上記インデックス付加部位および識別子部位の位置（配列番号１）を提供する。「Ｎ」とは、任意の核酸をいう。 図４は、上記インデックス付加プライマーおよび上記標的プライマーが、識別子部位を使用するライブラリーと比較して古典的ライブラリーにおいてアニールする場合を示す、２つの別個の配列ライブラリーの模式図を示す。 図５は、上記アダプターにおいて識別子部位を使用する見かけ上のもしくは認められた複製物に対して、真の複製物を分離するという精度を示すデータテーブルを示す。

（発明の詳細な説明）
本発明は、複製物配列決定リードを配列決定リードの集団から識別するための組成物および方法に一部基づく。本発明は、配列決定適用において複製される配列を検出する方法、および上記複製される配列リードのさらなる除去を包含する。本発明は、ハイスループット配列決定反応における複製される配列リードを検出および除去するための方法のカスタマイズされた適用を可能にする成分を含むキットをさらに包含する。上記組成物および方法は、遺伝的サンプル分析（例えば、ＲＮＡ配列分析、コピー数変動分析、メチル化配列決定分析、遺伝子型決定および全ゲノム適用）のための種々の適用で使用され得る。

ここで本発明の例示的実施形態が詳細に参照される。開示される方法および組成物は、上記例示的実施形態とともに記載されるが、これら例示的実施形態が本発明を限定するとは意図されないことが理解される。逆に、本開示は、本発明の趣旨および範囲に包含され得る代替手段、改変および均等物を包含すると意図される。

別段特定されなければ、遺伝学、分子生物学、生化学および本明細書で使用される核酸の用語および記号は、当該分野における標準的取り決めおよびテキストのものに従う：例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７５）；Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｇａｉｔ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）；など。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、配列決定リードの集団から、１つの配列決定リード（例えば、複製物識別子部位および標的配列を有する複製物配列決定リード）を検出するためのものである。複製物配列決定リードは、上記配列決定リードの集団中の別の配列決定リードと同じ識別子部位および標的配列を有する配列決定リードであり得る。

（アダプター）
本発明は、アダプターの組成物およびアダプターの使用を含む方法を提供する。アダプターとは、オリゴヌクレオチド配列であって、目的の標的ポリヌクレオチドもしくは標的ポリヌクレオチド鎖へのそのライゲーションが、上記目的の標的ポリヌクレオチドもしくは標的ポリヌクレオチド鎖の増幅準備ができた生成物の生成を可能にするものをいう。上記標的ポリヌクレオチド分子は、アダプターの付加の前にフラグメント化されてもよいし、フラグメント化されなくてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、アダプターを、１以上のサンプルに由来する複数の核酸フラグメントの各核酸フラグメントの５’末端にライゲーションする工程を包含する。

種々のアダプター設計が想定され、これらは、目的の標的配列領域／鎖の増幅準備のできた生成物の生成に適している。例えば、上記アダプターの２本の鎖は、自己相補的であっても、非相補的であっても、部分的に相補的であってもよい。いくつかの実施形態において、上記アダプターは、インデックス付加プライマー結合部位、インデックス付加部位、識別子部位、および標的配列プライマー結合部位を含み得る。

インデックス付加プライマー結合部位は、インデックス付加部位に関するプライマーを結合するためのヌクレオチド配列である。インデックス付加部位は、複数のポリヌクレオチドサンプルに関するインデックスとして作用し、従って、上記サンプルが単一配列決定連続作業単位へと一緒にプールされる（これは多重化として公知である）ことを可能にする核酸配列である。いくつかの実施形態において、上記インデックス付加部位は、少なくとも２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、もしくは１０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、上記インデックス付加部位は、２ヌクレオチド〜８ヌクレオチドの間の長さである。いくつかの実施形態において、上記インデックス付加部位は、約６ヌクレオチドの長さである。

識別子部位は、ランダム塩基を含み、複製物配列決定リードを同定するために使用される核酸配列である。いくつかの実施形態において、上記識別子部位は、少なくとも２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、もしくは１０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、上記識別子部位は、１ヌクレオチド〜８ヌクレオチドの間の長さである。いくつかの実施形態において、上記識別子部位は、約８ヌクレオチドの長さである。この識別子部位は、配列のセットとして設計され得るか、または半ランダムであり得るか、または完全にランダムであり得る。さらに、この識別子部位は、固定された長さであり得るか、または可変性の長さであり得る。いくつかの実施形態において、複数のアダプターの中の上記識別子部位は、固定された長さのものである。例えば、上記識別子部位は、全て８個のランダム塩基であり得る。別の実施形態において、複数のアダプターの中の上記識別子部位は、可変性の長さのものである。例えば、上記識別子部位は、１〜８塩基のサイズ範囲のものであり得る。さらに別の実施形態において、上記識別子部位は、規定された配列の規定されたセットのものであり得る。例えば、複数のアダプターの上記識別子部位は、９６の規定された６塩基ヌクレオチド配列のうちの１つであり得る。

標的配列プライマー結合部位ヌクレオチド配列は、標的配列に関するプライマーを結合するためのものである。上記プライマーは、上記標的配列（例えば、サンプル由来の核酸フラグメント）を増幅するために使用され得る。よって、いくつかの実施形態において、上記アダプターは、インデックス付加プライマー結合部位および標的配列プライマー結合部位を含む。

プライマーは、ポリヌクレオチド鎖、代表的には、２００残基未満の長さ、最も代表的には、１５〜１００ヌクレオチドの間の長さであるが、より長いポリヌクレオチド鎖を包含し得る。上記プライマー結合部位を標的化するプライマーは、代表的には、１本鎖核酸鎖へとハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態において、上記プライマー結合部位を標的化するプライマーは、１本鎖ＤＮＡ標的にハイブリダイズするように設計される。上記サンプルがゲノムＤＮＡもしくは他の２本鎖ＤＮＡを含む場合に、上記サンプルは、まず変性されて、上記標的１本鎖にされ、上記プライマーが上記目的の所望の配列領域にハイブリダイズさせられ得る。これら実施形態において、本明細書で記載される方法および組成物は、領域特異的富化および目的の配列領域の増幅を可能にし得る。いくつかの実施形態において、上記他の２本鎖ＤＮＡは、１種以上の標的ＲＮＡの第１鎖および第２鎖合成によって生成される２本鎖ｃＤＮＡであり得る。

他の実施形態において、上記プライマー結合部位を標的化するプライマーは、２本鎖核酸の変性なしに、上記２本鎖核酸標的にハイブリダイズするように設計される。他の実施形態において、上記プライマー結合部位を標的化するプライマーは、ｄｓＤＮＡの変性なしに、２本鎖ＤＮＡ標的にハイブリダイズするように設計される。これら実施形態において、上記目的の選択された配列領域を標的化するプライマーは、上記目的の選択された配列領域において三重らせん（三重鎖）を形成するように設計される。上記目的の２本鎖ＤＮＡ配列領域への上記プライマーのハイブリダイゼーションは、上記２本鎖核酸サンプルを事前に変性させずに行われ得る。このような実施形態において、本明細書で記載される方法および組成物は、領域特異的富化および鎖特異的富化、ならびに目的の配列領域の増幅を可能にし得る。この方法は、上記ｄｓＤＮＡ投入ＤＮＡを変性させる必要性なしに複雑な核酸から目的の鎖特異的配列領域のコピーを生成し、天然の複雑な核酸サンプルの中の目的の配列領域の多重度の富化および分析を可能にするために有用であり得る。上記方法は、インサイチュで行われる研究および分析の用途が見出され、単一細胞もしくは非常に小さな十分に規定された細胞集団の集まりの中の複雑なゲノムＤＮＡの研究および分析を可能にし、同様にクロマチン構造の破壊なしに複雑なゲノムＤＮＡの分析を可能にする。

本発明のプライマーは、一般には、ポリヌクレオチドテンプレート（例えば、標的配列の増幅のための）に沿って、ポリメラーゼによる伸長反応において（例えば、ＰＣＲにおいて）使用されるオリゴヌクレオチドである。上記オリゴヌクレオチドプライマーは、１本鎖である合成ポリヌクレオチド（その３’末端において、上記標的ポリヌクレオチドの配列とハイブリダイズし得る配列を含む）であり得る。いくつかの実施形態において、上記標的核酸とハイブリダイズする上記プライマーの３’領域は、プライマー結合部位に少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の相補性を有する。

いくつかの実施形態において、上記プライマー結合部位は、ユニバーサルプライマーに関する結合部位である。ユニバーサルプライマーは、多くの異なる配列を増幅するために使用され得るプライマーである。いくつかの実施形態において、ユニバーサルプライマーは、異なるライブラリーを増幅するために使用される。いくつかの実施形態において、インデックス付加プライマー結合部位は、ユニバーサルインデックス付加プライマーに関する結合部位である（すなわち、上記インデックス付加プライマー結合部位は、ユニバーサルインデックス付加プライマー結合部位である）。いくつかの実施形態において、複数の核酸フラグメントをライゲーションするために使用される上記アダプターは、ユニバーサルインデックス付加プライマー結合部位を有する。いくつかの実施形態において、上記ユニバーサルインデックス付加プライマーは、多くの異なるインデックス付加部位を増幅および／もしくは配列決定するために使用され得る。

いくつかの実施形態において、標的配列プライマー結合部位は、ユニバーサル標的配列プライマーに関する結合部位である（すなわち、上記標的配列プライマー結合部位は、ユニバーサル標的配列プライマー結合部位である）。いくつかの実施形態において、複数の核酸フラグメントをライゲーションするために使用される上記アダプターは、ユニバーサル標的配列プライマー結合部位を有する。いくつかの実施形態において、上記ユニバーサル標的配列プライマーは、多くの異なる標的配列を増幅および／もしくは配列決定するために使用され得る。

いくつかの実施形態において、上記アダプターは、インデックス付加部位に対して３’側に識別子部位を含む。いくつかの実施形態において、上記アダプターは、インデックス付加部位に対して５’側に識別子部位を含む。いくつかの実施形態において、上記アダプターは、５’から３’へと、インデックス付加プライマー結合部位、インデックス付加部位、識別子部位、および標的配列プライマー結合部位を含む。他の実施形態において、上記アダプターは、５’から３’へと、インデックス付加プライマー結合部位、インデックス付加部位、識別子部位、および標的配列プライマー結合部位を含む。なお他の実施形態において、上記アダプターは、５’から３’へと、インデックス付加プライマー結合部位、識別子部位、インデックス付加部位、および標的配列プライマー結合部位を含む。

（サンプル）
いくつかの実施形態において、アダプターは、核酸フラグメント（例えば、上記核酸フラグメントの５’末端）にライゲーションされる。上記核酸フラグメントは、１以上のサンプルに由来する複数の核酸フラグメントに由来し得る。上記核酸フラグメントは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくは複雑なＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡおよびＰＮＡであり得、その場合、改変された核酸が使用され得る。上記核酸フラグメントはまた、ｃＤＮＡであり得る。上記ｃＤＮＡは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡから生成され得る。

上記サンプルは、生物学的サンプルであり得る。例えば、上記サンプルは、動物、植物、細菌、藻類、もしくはウイルスのサンプルであり得る。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、ヒト、ラット、もしくはマウスのサンプルである。上記サンプルは、種々の種（例えば、宿主病原体、細菌集団など）のゲノムの混合物に由来し得る。上記サンプルは、種々の種のゲノムの混合物から作製されたｃＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、合成供給源に由来し得る。上記サンプルは、ミトコンドリアＤＮＡであり得る。上記サンプルは、無細胞ＤＮＡであり得る。上記無細胞ＤＮＡは、血清もしくは血漿サンプルのような供給源から得られ得る。上記サンプルは、１以上の染色体を含み得る。例えば、上記サンプルがヒトに由来する場合、上記サンプルは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２染色体、Ｘ染色体もしくはＹ染色体のうちの１以上を含み得る。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、直線状もしくは環状のゲノムを含む。上記サンプルは、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、もしくは酵母人工染色体（ＹＡＣ）であり得る。上記サンプルは、１より多くの個体もしくは生物に由来し得る。上記サンプルは、２本鎖もしくは１本鎖であり得る。上記サンプルは、クロマチンの一部であり得る。上記サンプルは、ヒストンと関連し得る。

いくつかの実施形態において、アダプターは、１より多くのサンプル（例えば、２、３、４、５、もしくはより多くのサンプル）に由来する複数の核酸フラグメントにライゲーションされる。いくつかの実施形態において、各サンプルに由来する上記核酸フラグメントは、同じインデックス付加部位を有する。いくつかの実施形態において、複数の核酸フラグメントは、第１のサンプルおよび第２のサンプルから生成され、アダプターは、各核酸フラグメントにライゲーションされ、ここで上記第１のサンプルに由来する各核酸フラグメントにライゲーションされたアダプターは、同じ第１のインデックス付加部位を有し、上記第２のサンプルに由来する核酸フラグメントにライゲーションされたアダプターは、同じ第２のインデックス付加部位を有する。いくつかの実施形態において、上記核酸フラグメントもしくは上記核酸フラグメントと関連するデータ（例えば、配列決定リード）は、上記インデックス付加部位に基づいて分離される。

いくつかの実施形態において、サンプルから生成された核酸フラグメントの集団は、１以上の特定のサイズ範囲のものである。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、約１０ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチドの平均長を有する。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、約５０ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチドの平均長を有する。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、約１００ヌクレオチド〜２，５００ヌクレオチド、１０ヌクレオチド〜１，０００ヌクレオチド、１０ヌクレオチド〜８００ヌクレオチド、１０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチド、５０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチド、５０ヌクレオチド〜２５０ヌクレオチド、もしくは５０ヌクレオチド〜１５０ヌクレオチドの平均長を有する。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、１０，０００ヌクレオチド未満、例えば、５，０００ヌクレオチド未満、２，５００ヌクレオチド未満、２，５００ヌクレオチド未満、１，０００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、例えば、４００ヌクレオチド未満、３００ヌクレオチド未満、２００ヌクレオチド未満、もしくは１５０ヌクレオチド未満の、平均長を有する。

いくつかの実施形態において、上記核酸のフラグメント化は、当該分野で公知の方法によって達成され得る。フラグメント化は、物理的なフラグメント化法および／もしくは酵素によるフラグメント化法によって達成され得る。物理的なフラグメント化法としては、噴霧化、超音波処理、および／もしくは水力学的剪断が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、上記フラグメント化は、上記投入サンプル中の核酸を超音波処理に供する工程を含めて、機械的に達成され得る。いくつかの実施形態において、上記フラグメント化は、上記投入サンプル中の核酸を１種以上の酵素で、上記１種以上の酵素が２本鎖核酸切断を生成するために適した条件下で処理する工程を包含する。核酸フラグメントもしくはポリヌクレオチドフラグメントの生成において有用な酵素の例としては、配列特異的および非配列特異的なヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼの非限定的例としては、ＤＮａｓｅ Ｉ、Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ、制限エンドヌクレアーゼ、その改変体、およびこれらの組み合わせが挙げられる。酵素によるフラグメント化反応を行うための試薬は、市販されている（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから）。例えば、ＤＮａｓｅ Ｉでの消化は、Ｍｇ^＋＋の非存在下でかつＭｎ^＋＋の存在下で、ＤＮＡにおけるランダム２本鎖切断を誘発し得る。いくつかの実施形態において、フラグメント化は、上記投入サンプル中の核酸を１種以上の制限エンドヌクレアーゼで処理する工程を包含する。フラグメント化は、５’突出末端、３’突出末端、平滑末端、もしくはこれらの組み合わせを有するフラグメントを生じ得る。いくつかの実施形態において、例えば、フラグメント化が１種以上の制限エンドヌクレアーゼの使用を包含する場合、サンプルポリヌクレオチドの切断は、予測可能な配列を有する突出を後に残す。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記フラグメントを、当該分野で公知の標準的な方法（例えば、カラム精製もしくはアガロースゲルからの単離）を介してサイズ選択する工程を包含する。

いくつかの実施形態において、上記核酸のフラグメント化に続いて、上記核酸フラグメントの末端修復が行われる。末端修復は、平滑末端、非平滑末端（すなわち、粘着末端もしくは付着末端）、または３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼによる単一塩基突出（例えば、上記核酸フラグメントの３’末端への単一のｄＡヌクレオチドの付加）の生成が挙げられ得る。末端修復は、当該分野で公知である任意の多くの酵素および／もしくは方法（市販のキット（例えば、Ｅｎｃｏｒｅ^ＴＭ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＮＧＳ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉ）が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して行われ得る。いくつかの実施形態において、末端修復は、平滑末端を生成するために２本鎖ＤＮＡフラグメントに対して行われ得、ここで上記２本鎖ＤＮＡフラグメントは、５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシルを含む。いくつかの実施形態において、上記２本鎖ＤＮＡフラグメントは、アダプターへと繋げられる前に、平滑末端を有するＤＮＡフラグメントを生成するために平滑末端化（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ ｐｏｌｉｓｈｅｄ）（もしくは「末端修復」）され得る。上記２本鎖フラグメントでの平滑末端の生成は、上記２本鎖生成物の突出している１本鎖末端を分解するために、１本鎖特異的ＤＮＡエキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ１、エキソヌクレアーゼ７もしくはこれらの組み合わせ）の使用によって生成され得る。あるいは、上記２本鎖ＤＮＡフラグメントは、１本鎖特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、緑豆エンドヌクレアーゼもしくはＳ１エンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない）の使用によって平滑末端化され得る。あるいは、上記２本鎖生成物は、上記２本鎖生成物の突出している１本鎖末端を分解するために、１本鎖エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ）、もしくは１本鎖エキソヌクレアーゼ活性を含む任意の他のポリメラーゼまたはこれらの組み合わせの使用によって平滑末端化され得る。いくつかの場合に、上記１本鎖エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼは、１以上のｄＮＴＰを含むかもしくは含まない反応混合物中でインキュベートされ得る。他の場合には、１本鎖核酸特異的エキソヌクレアーゼと１種以上のポリメラーゼとの組み合わせは、上記核酸を含むサンプルをフラグメント化することによって生成される２本鎖フラグメントを平滑末端化するために使用され得る。さらに他の場合には、上記核酸フラグメントは、上記２本鎖フラグメントの突出している１本鎖末端をフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ ｉｎ）することによって、平滑末端化され得る。例えば、上記フラグメントは、ポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼもしくはクレノウポリメラーゼまたはこれらの組み合わせ）とともに１以上のｄＮＴＰの存在下でインキュベートされて、上記２本鎖フラグメントの１本鎖部分をフィルインし得る。あるいは、上記２本鎖ＤＮＡフラグメントは、エキソヌクレアーゼおよび／もしくはポリメラーゼを使用する１本鎖突出分解反応と１以上のｄＮＴＰの存在下での１種以上のポリメラーゼを使用するフィルイン反応との組み合わせによって平滑にされ得る。

米国特許公開番号２０１３−０２３１２５３ Ａ１号および同第２０１４−０２７４７２９ Ａ１号は、核酸フラグメントを生成するための方法、上記フラグメントを改変するための方法および上記フラグメントの分析をさらに記載し、これは、それらの全体が本明細書で参考として援用される。

（アダプターのライゲーション）
目的の配列領域の所望の末端での（例えば、サンプルから生成された核酸フラグメントの５’末端もしくは３’末端での）アダプターのライゲーションは、本発明の方法を行うために適している。核酸の選択、核酸改変酵素および上記核酸の得られるライゲーション可能な末端に依存して、種々のライゲーション様式が想定される。例えば、上記目的の標的領域／配列を含む平滑末端生成物が生成される場合、平滑末端ライゲーションは適切であり得る。あるいは、既知の配列特異性の制限酵素を使用して切断を行って、既知の配列突出を有する切断部位の生成をもたらす場合、上記アダプターの適切な末端は、上記目的の配列領域の切断部位への上記アダプターのハイブリダイゼーションおよびその後のライゲーションを可能にするように設計され得る。ライゲーションとはまた、問題の核酸の配列を得るようにさらに改変され得る単一の核酸配列を生じる２つの核酸分子の任意の繋がりをいう。アダプターの効率的かつ迅速なライゲーションのための試薬および方法は、市販されており、当該分野で公知である。

いくつかの実施形態において、フラグメント化された核酸の５’および／もしくは３’末端ヌクレオチド配列は、本発明のアダプターオリゴヌクレオチドとのライゲーションの前に、改変されず、末端修復もされない。例えば、制限エンドヌクレアーゼによるフラグメント化は、予測可能な突出を後に残すために使用され得、次に、核酸フラグメント上の上記予測可能な突出に対して相補的な突出を含む１以上のアダプターオリゴヌクレオチドとのライゲーションが行われ得る。別の例では、予測可能な平滑末端を後に残す酵素による切断の次に、平滑末端化核酸フラグメントの、平滑末端を含むアダプターオリゴヌクレオチドへのライゲーションが行われ得る。いくつかの実施形態において、末端修復の次に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれより多いヌクレオチド（例えば、１個またはそれより多いアデニン、１個またはそれより多いチミン、１個またはそれより多いグアニン、もしくは１個またはそれより多いシトシン）が付加されて、突出を生成し得る。突出を有する核酸フラグメントは、相補的な突出を有する１以上のアダプターオリゴヌクレオチドに、例えば、ライゲーション反応において繋げられ得る。例えば、単一のアデニンは、テンプレート非依存性ポリメラーゼを使用して、末端修復されたＤＮＡフラグメントの３’末端へと付加され得、続いて、１以上のアダプター（各々３’末端にチミンを有する）へとライゲーションされ得る。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、１個またはそれより多いヌクレオチドでの３’末端の伸長、続いて、５’リン酸化によって改変された、平滑末端２本鎖核酸フラグメントに繋がれ得る。いくつかの場合には、３’末端の伸長は、ポリメラーゼ（例えば、クレノウポリメラーゼもしくは本明細書で提供される適切なポリメラーゼのうちのいずれか）で、または末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼの使用によって、マグネシウムを含む適切な緩衝液中での１以上のｄＮＴＰの存在下で行われ得る。いくつかの実施形態において、平滑末端を有する核酸フラグメントは、平滑末端を含む１以上のアダプターに繋がれ得る。核酸フラグメントの５’末端のリン酸化は、ＡＴＰおよびマグネシウムを含む適切な緩衝液中で、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで行われ得る。上記フラグメント化された核酸分子は、５’末端もしくは３’末端を、例えば、当該分野で公知の酵素（例えば、ホスファターゼ）を使用することによって脱リン酸化するために必要に応じて処理され得る。

いくつかの実施形態において、上記アダプターを本明細書で記載される方法によって生成された核酸フラグメントに付加することは、ライゲーション反応もしくはプライミング反応を使用して達成され得る。いくつかの実施形態において、上記核酸フラグメントへのアダプターの付加は、ライゲーションを含む。いくつかの実施形態において、上記核酸フラグメントへの上記アダプターのライゲーションは、上記核酸フラグメントの末端修復の後に続き得る。別の実施形態において、上記核酸フラグメントへの上記アダプターのライゲーションは、上記核酸フラグメントの末端修復なしで、上記核酸フラグメントの生成の後に続き得る。上記アダプターは、当該分野で公知のアダプター（上記アダプターが２本の相補的な鎖を含む従来の二重鎖もしくは２本鎖アダプターが挙げられるが、これらに限定されない）のうちのいずれかのタイプであり得る。いくつかの実施形態において、上記アダプターは、２本鎖ＤＮＡアダプターであり得る。いくつかの実施形態において、上記アダプターは、既知の配列のオリゴヌクレオチドであり得るので、任意のポリヌクレオチド（これに対して上記アダプターが付加もしくは結合される）の増幅および／または配列決定のために、配列特異的プライマーの生成および／または使用を可能にする。いくつかの実施形態において、上記アダプターは、従来の二重鎖アダプターであり得、ここで上記アダプターは、当該分野で周知の配列を含む。いくつかの実施形態において、上記アダプターは、複数の配向において本明細書で記載される方法によって生成された核酸フラグメントに付加され得る。いくつかの実施形態において、上記本明細書で記載される方法は、平滑末端化されている既知の配列の２本鎖ＤＮＡを含む二重鎖アダプターの使用を包含し得、２つの配向のうちの１つで、本明細書で記載される方法によって生成された２本鎖核酸フラグメントに結合し得る。いくつかの実施形態において、上記アダプターは、上記核酸フラグメントの各々にライゲーションされ得、その結果上記核酸フラグメントの各々が同じアダプターを含む。言い換えると、上記核酸フラグメントの各々は、共通するアダプターを含む。別の実施形態において、アダプターは、本明細書で記載される方法によって生成された核酸フラグメントのライブラリーに付加もしくはライゲーションされ得、その結果、核酸フラグメントのライブラリーの中の各核酸フラグメントは、一方の末端もしくは両方の末端にライゲーションされたアダプターを含む。別の実施形態において、１より多くのアダプターは、本明細書で記載される方法によって生成された核酸フラグメントのライブラリーに付加もしくはライゲーションされ得る。上記複数のアダプターは、互いに隣接して、断続的に間隔を空けて、もしくは上記核酸フラグメントの反対の末端に、存在し得る。いくつかの実施形態において、上記アダプターは、本明細書で記載される方法によって生成された核酸フラグメントの５’末端および／もしくは３’末端にライゲーションされ得るかもしくは付加され得る。上記アダプターは、２本の鎖であって、各鎖が遊離３’ヒドロキシル基を含むが、いずれの鎖も遊離５’ホスフェートを含まないものを含み得る。いくつかの実施形態において、上記アダプターの各鎖の遊離３’ヒドロキシル基は、本発明の核酸フラグメントのいずれかの末端に存在する遊離５’ホスフェートにライゲーションされ得る。この実施形態では、上記アダプターは、ライゲーション鎖および非ライゲーション鎖を含み、それによって上記ライゲーション鎖は、上記核酸フラグメントのいずれかの末端の５’ホスフェートにライゲーションされ得る一方で、ニックもしくはギャップが、上記アダプターの非ライゲーション鎖と上記核酸フラグメントのいずれかの末端の３’ヒドロキシルとの間に存在し得る。いくつかの実施形態において、上記ニックもしくはギャップは、ギャップ修復反応を行うことによってフィルインされ得る。いくつかの実施形態において、上記ギャップ修復は、鎖置換活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼで行われ得る。いくつかの実施形態において、上記ギャップ修復は、弱い鎖置換活性を有するかもしくは全く鎖置換活性を有しないＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われ得る。いくつかの実施形態において、上記アダプターのライゲーション鎖は、ギャップ修復反応もしくはフィルイン反応のためのテンプレートとして働き得る。上記ギャップ修復反応もしくはフィルイン反応は、伸長反応を含み得、この反応では上記アダプターのライゲーション鎖がテンプレートとして働き、相補的な端（ｔｅｒｍｉｎｉ）または末端を有する核酸フラグメントの生成をもたらす。いくつかの実施形態において、上記ギャップ修復は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われ得る。いくつかの実施形態において、第１のアダプターの、本明細書で記載される方法によって生成された核酸フラグメントへのライゲーションの次に、ギャップ修復が行われなくてもよい。上記核酸フラグメントは、各鎖の５’末端においてのみライゲーションされたアダプター配列を含み得る。

上記核酸フラグメントへの上記アダプターのライゲーション、および必要に応じてギャップ修復は、アダプター−核酸フラグメント複合体を生成する。いくつかの実施形態において、上記アダプター−核酸フラグメント複合体は、変性され得る。変性は、当該分野で公知の方法（物理的変性、熱変性、および／もしくは化学的変性が挙げられるが、これらに限定されない）のうちのいずれかを使用して達成され得る。いくつかの実施形態において、変性は、熱変性（ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）または加熱変性（ｈｅａｔ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）を使用して達成され得る。いくつかの実施形態において、上記アダプター−核酸フラグメント複合体の変性は、核酸フラグメントの５’末端においてのみ上記アダプター配列を含む１本鎖核酸フラグメントを生成する。別の実施形態において、第１のアダプター−核酸フラグメント複合体の変性は、核酸フラグメントの５’末端および３’末端の両方でアダプター配列を含む１本鎖核酸フラグメントを生成する。

（適用方法）
本明細書で記載される方法、組成物およびキットは、増幅準備ができた生成物を、次世代配列決定のような下流の適用、ならびに目的の配列領域の富化集団を有するライブラリーの生成のための核酸供給源から直接生成するために有用であり得る。いくつかの実施形態において、例えば、１以上のサンプルに由来する複数の核酸フラグメントの各核酸フラグメントの５’末端へのアダプターのライゲーションからの上記アダプター−核酸フラグメントのライゲーション生成物は、増幅される。

増幅方法は、当該分野で周知である。いくつかの実施形態において、上記増幅は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＤＮＡの特異的２本鎖配列の酵素による増幅において指数関数的である。他の実施形態において、上記増幅方法は、線形的である。他の実施形態において、上記増幅方法は、等温性である。いくつかの実施形態において、上記増幅は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡの特異的２本鎖配列の酵素による増幅において、指数関数的である。

適切な増幅反応は、指数関数的であり得るかもしくは等温性であり得、任意のＤＮＡ増幅反応（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、線形増幅、多重置換増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、単一プライマー等温性増幅（ＳＰＩＡ（例えば、米国特許第６，２５１，６３９号を参照のこと））、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ、もしくはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。いくつかの場合には、上記テンプレート核酸を提供するための増幅方法は、わずか数回の増幅（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、３０回など）が例えば、ｃＤＮＡ生成のために一般に行われるような制限条件下で、行われ得る。増幅の回数は、約１〜３０回、約１〜２０回、約１〜１５回、約１〜１０回、約５〜３０回、約１０〜３０回、約１５〜３０回、約２０〜３０回、約１０〜３０回、約１５〜３０回、約２０〜３０回、もしくは約２５〜３０回であり得る。

ＰＣＲは、変性、オリゴヌクレオチドプライマーアニーリング、および好熱性テンプレート依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼによるプライマー伸長の反復サイクルに基づくインビトロ増幅手順であり、上記プライマーが隣接した上記ポリヌクレオチド検体の所望の配列のコピーに指数関数的増大を生じる。２種の異なるＰＣＲプライマー（これらは、上記ＤＮＡの反対側の鎖にアニールする）は、１つのプライマーの上記ポリメラーゼが触媒した伸長生成物が、他方のテンプレート鎖として働き得、長さが上記オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端の間の距離によって規定される不連続の２本鎖フラグメントの蓄積をもたらすように位置決めされる。

ＬＣＲは、リガーゼ酵素を使用して、予め形成された核酸プローブの対を繋げる。上記プローブは、存在する場合、上記核酸検体の各相補的な鎖とハイブリダイズし、リガーゼは、上記特定の核酸配列を反復するために次のサイクルにおいて働き得る２つのテンプレートを一緒に生じるプローブの各対を結合するために使用される。

ＳＤＡ（Ｗｅｓｔｉｎ ｅｔ ａ ２０００，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，１９９−２０２；Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ １９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０，７，１６９１−１６９６）は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＨｉｎｃＩＩもしくはＢｓｏＢＩ）がその認識部位のヘミホスホロチオエート形態の非改変鎖にニックを入れる能力、およびエキソヌクレアーゼ欠損性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クレノウエキソマイナスポリメラーゼ）、もしくはＢｓｔポリメラーゼが上記ニックにおいて３’末端を伸長し、その下流のＤＮＡ鎖を置換する能力に基づく等温性の増幅技術である。指数関数的増幅は、センス反応とアンチセンス反応を対にすることから生じる（ここでセンス反応から置換された鎖が、アンチセンス反応のための標的として働く（そしてその逆もまた然り））。

本発明のいくつかの局面は、核酸もしくはポリヌクレオチドの線形増幅を利用する。線形増幅とは、一般には、核酸もしくはポリヌクレオチド分子（通常は、核酸検体もしくはポリヌクレオチド検体）の一方のみの鎖の相補体の１以上のコピーの形成を包含する方法をいう。従って、線形増幅と指数関数的増幅との間の主な差異は、後者のプロセスでは、その生成物がより多くの生成物の形成のための基質として働くのに対して、前者のプロセスでは、出発配列が生成物の形成のための基質であるが、反応の生成物、すなわち、上記出発テンプレートの複製物は、生成物の生成のための基質ではないという点である。線形増幅において、形成される生成物の量は、形成される生成物の量が時間の指数関数である指数関数的増幅とは対照的に、時間の線形関数として増大する。

（下流の適用）
本発明の一局面は、本明細書で開示される方法および組成物が、目的の生物学的材料の喪失を最小限にして、下流の分析のために、例えば、次世代配列決定もしくはハイブリダイゼーションプラットフォームにおいて効率的にかつ費用効果が高く利用されることである。本発明の方法はまた、目的の選択的ゲノム領域、ならびに上記目的の選択的領域と相互作用し得るゲノム領域の遺伝情報の分析（例えば、ＳＮＰもしくは他の疾患マーカーの分析）において使用され得る。本発明の方法はさらに、コピー数変動および差次的発現の分析において使用され得る。

（配列決定）
いくつかの実施形態において、配列決定リードの集団は、上記増幅されたアダプター−核酸フラグメントのライゲーション生成物から生成される。いくつかの実施形態において、配列決定リードは、インデックスリード（これは、インデックス付加部位の配列を含む）を含む。いくつかの実施形態において、インデックスリードは、インデックス付加部位の配列および識別子部位の配列を含む。例えば、上記インデックス付加部位は、上記識別子部位とともに配列決定される。いくつかの実施形態において、上記インデックスリードは、識別子部位の配列を含まない。例えば、上記インデックス付加部位は、上記識別子部位とともに配列決定されない。いくつかの実施形態において、配列決定リードは、上記標的配列を含む。いくつかの実施形態において、配列決定リードは、標的配列および識別子配列を含む。例えば、上記標的配列は、上記識別子部位とともに配列決定される。いくつかの実施形態において、上記標的配列は、上記識別子部位とともに配列決定されない。

本発明の方法は、米国特許第５，７５０，３４１号；同第６，３０６，５９７号；および同第５，９６９，１１９号に記載されるように、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって商品化された方法による配列決定のために有用である。

一般に、２本鎖フラグメントポリヌクレオチドは、一方の末端（例えば、（Ａ）／（Ａ’）もしくは両方の末端（例えば、（Ａ）／（Ａ’）および（Ｃ）／（Ｃ’））においてタグ付けされた増幅核酸配列を生成するために、本発明の方法によって調製され得る。いくつかの場合には、一方の末端もしくは両方の末端でタグ付けされた１本鎖核酸は、本発明の方法によって（例えば、ＳＰＩＡもしくは線形的ＰＣＲによって）増幅される。得られた核酸は、次いで、変性され、その１本鎖の増幅されたポリヌクレオチドは、フローセルチャネルの内部表面に無作為に結合される。非標識ヌクレオチドが、固相架橋増幅を開始して、２本鎖ＤＮＡの密なクラスターを生成するために添加される。第１の塩基配列決定サイクルを開始するために、４種の標識された可逆的ターミネーター、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを添加する。レーザー励起の後、上記フローセルの各クラスターの蛍光を、画像化する。次いで、各クラスターの第１の塩基の正体が記録される。一度に一塩基ずつ上記フラグメント配列を決定するために、配列決定のサイクルが行われる。

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって商品化されたライゲーション方法（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定）による配列決定のために、標的ポリヌクレオチドを調製するために有用である。他の実施形態において、上記方法は、４５４／Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって商品化された方法（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら、，Ｎａｔｕｒｅ（２００５）４３７：３７６−３８０ （２００５）；ならびに米国特許第７，２４４，５５９号；同第７，３３５，７６２号；同第７，２１１，３９０号；同第７，２４４，５６７号；同第７，２６４，９２９号；および同第７，３２３，３０５号に記載される方法および装置が挙げられるが、これらに限定されない）を使用する合成によって配列決定のために標的ポリヌクレオチドを調製するために有用である。他の実施形態において、上記方法は、米国特許出願第１１／１６７，０４６号、ならびに米国特許第７，５０１，２４５号；同第７，４９１，４９８号；同第７，２７６，７２０号；および米国特許出願公開番号ＵＳ２００９００６１４３９；ＵＳ２００８００８７８２６；ＵＳ２００６０２８６５６６；ＵＳ２００６００２４７１１；ＵＳ２００６００２４６７８；ＵＳ２００８０２１３７７０；およびＵＳ２００８０１０３０５８に記載されるとおり、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）によって商品化された方法によって配列決定するために標的ポリヌクレオチドを調製するために有用である。他の実施形態において、上記方法は、米国特許第７，４６２，４５２号；同第７，４７６，５０４号；同第７，４０５，２８１号；同第７，１７０，０５０号；同第７，４６２，４６８号；同第７，４７６，５０３号；同第７，３１５，０１９号；同第７，３０２，１４６号；同第７，３１３，３０８号；ならびに米国特許出願公開番号ＵＳ２００９００２９３８５；ＵＳ２００９００６８６５５；ＵＳ２００９００２４３３１；およびＵＳ２００８０２０６７６４に記載されるとおりにＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって商品化された方法によって配列決定のために標的ポリヌクレオチドを調製するために有用である。

提供される本発明の方法において使用され得る配列決定技術の例は、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔによって（例えば、Ｉｏｎ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）を使用して）提供される半導体配列決定である。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術は、複数層、例えば、微細機械加工されたウェルを有する層、イオン感受性相、およびイオンセンサ層を有する半導体チップを使用し得る。核酸は、上記ウェルへと導入され得る。例えば、単一核酸のクローン集団が、単一のヘッドに付着させられ得、そしてビーズがウェルの中に導入され得る。上記ビーズ上の核酸の配列決定を開始するために、デオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、もしくはｄＴＴＰ）のうちの１タイプが上記ウェルに導入され得る。１以上のヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれる場合、プロトン（水素イオン）は、上記ウェル中に放出され、これは、上記イオンセンサによって検出され得る。次いで、上記半導体チップは洗浄され得、上記プロセスは、種々のデオキシリボヌクレオチドで反復され得る。複数の核酸が半導体チップのウェルの中で配列決定され得る。上記半導体チップは、ＤＮＡ配列決定するために化学感応性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍｉｃａｌ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｉｅｌｄ ｅｆｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイを含み得る（例えば、米国特許出願公開番号２００９００２６０８２に記載されるとおり）。配列決定プライマーの３’末端において１種以上のトリホスフェートを新たな核酸鎖に組み込むことは、ｃｈｅｍＦＥＴによって電流の変化によって検出され得る。アレイは、複数のｃｈｅｍＦＥＴセンサを有し得る。

提供される本発明の方法において使用され得る配列決定技術の別の例は、ナノポア配列決定である（例えば、Ｓｏｎｉ Ｇ Ｖ ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ Ａ．（２００７）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５３：１９９６〜２００１を参照のこと）。ナノポアは、直径約１ナノメートルの小さな孔であり得る。導電性流体の中へのナノポアの浸漬および導電性流体を横切っての電位の印加は、上記ナノポアを通るイオンの伝導に起因して、僅かな電流を生じ得る。流れる電流の量は、上記ナノポアのサイズに敏感である。ＤＮＡ分子がナノポアを通過するにつれて、上記ＤＮＡ分子の各ヌクレオチドは、上記ナノポアを種々の程度にまで塞ぐ。従って、上記ＤＮＡ分子が上記ナノポアを通過するときの上記ナノポアを通過する電流の変化は、上記ＤＮＡ配列の読み取りを表し得る。

（データ分析）
いくつかの実施形態において、上記配列リードは、目的の選択的ゲノム領域ならびに上記目的の選択的領域と相互作用し得るゲノム領域の遺伝情報の分析において使用される。本明細書で開示されるとおりの増幅方法は、遺伝的分析のために、当該分野で公知のデバイス、キット、および方法において使用され得る（例えば、米国特許第６，４４９，５６２号、同第６，２８７，７６６号、同第７，３６１，４６８号、同第７，４１４，１１７号、同第６，２２５，１０９号、および同第６，１１０，７０９号で見出されるものが挙げられるが、これらに限定されない）。

いくつかの実施形態において、上記配列決定リードは、複製物配列決定リードを検出するために使用される。いくつかの実施形態において、配列決定リードは、これが配列決定リードの同じ集団に由来する別の配列決定リードと同じである識別子部位および標的配列を含む場合、複製物配列決定リードと同定される。

いくつかの実施形態において、複製物配列決定リードは、見かけ上のもしくは認められた複製物に対して真の複製物であるとして互いから区別される。見かけ上のもしくは認められた複製物は、配列決定ライブラリーから、および複製物リードの従来の測定値を使用して同定され得る（すなわち、リードを、ｂｏｗｔｉｅを使用してマッピングした）。ここで同じ出発核酸座標および終了核酸座標を有する全てのリードを、複製物とみなした。真の複製物は、ランダムに同じ出発マッピング座標および終了マッピング座標を有するＤＮＡのフラグメント間を区別するためにライゲーションを通じて導入された識別子部位を既に有している配列決定ライブラリーから同定され得る。

いくつかの実施形態において、任意のｄｓＤＮＡから生成された２つの核酸のインデックスリードに由来する上記識別子部位の配列は、上記生成された核酸フラグメントの標的配列の配列決定リードから決定されるように、同じ出発部位を有し得る。上記２つの核酸フラグメントのインデックスリードに由来する上記識別子部位が同一ではない場合、上記標的配列リードは、その同じ元のｄｓＤＮＡ分子から生成されなかったので、真の複製物リードではない。本発明の方法に付随する、ｄｓＤＮＡ分子へのランダム配列のライゲーションは、見かけ上のもしくは認められた複製物リードに対して真の複製物リードの同定を可能にする。

いくつかの実施形態において、２つの核酸フラグメント（これらは、上記核酸フラグメントの標的配列の配列決定リードから決定され得る、同じ出発部位を有するゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）分子から生成された）のインデックスリードに由来する上記識別子部位の配列が、決定される。上記２つの核酸フラグメントのインデックスリードに由来する上記識別子部位が同一でない場合、上記標的配列リードはその同じ元のｇＤＮＡ分子から生成されなかったので、真の複製物リードではない。別の実施形態において、識別子部位は、アダプター挿入接合部に挿入される。上記識別子部位の配列は、上記ライブラリー増幅工程を通じて遂行される。上記識別子部位は、正方向リードの間の第１の配列リードである。上記識別子配列は天然に存在する配列に隣接して論理上存在しないので、これは、上記ＤＮＡフラグメントを固有に同定する。従って、ランダム配列を元のｇＤＮＡにライゲーションすることによって、本発明の方法は、真の複製物リードを同定する。

いくつかの実施形態において、複製物配列決定リードは、検出および分析される。複製物リードは、「ｓａｍｔｏｏｌｓ ｒｍｄｕｐ」を使用してフィルタにかけられ得、ここで同一の外部座標を有するリードは除去され、最高のマッピング品質を有するただ１つのリードが保持される。フィルタにかけた後、脱複製した（ｄｅｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ）リードのフィルタにかけたセットは、任意の下流分析において使用され得る。逆に、このフィルタにかける工程は省かれ得、下流分析が、複製物を含めてフィルタにかけられていないリードを使用して行われ得る。

いくつかの実施形態において、配列決定リードは、多くのサンプルから生成される。いくつかの実施形態において、アダプターは、上記サンプルに由来する複数の核酸フラグメントにライゲーションされ、ここで各サンプルに由来する上記核酸フラグメントは、同じインデックス付加部位を有する。いくつかの実施形態において、複数の核酸フラグメントは、第１のサンプルおよび第２のサンプルから生成され、アダプターは、各核酸フラグメントにライゲーションされ、ここで上記第１のサンプルに由来する各核酸フラグメントにライゲーションされたアダプターは、同じ第１のインデックス付加部位を有し、上記第２のサンプルに由来する核酸フラグメントにライゲーションされたアダプターは、同じ第２のインデックス付加部位を有する。いくつかの実施形態において、上記核酸フラグメントと関連づけられたデータ（例えば、配列決定リード）は、上記標的配列および／もしくは識別子部位の配列決定リードが分析される前に、上記インデックス付加部位に基づいて分離される。いくつかの実施形態において、上記核酸フラグメントもしくは上記核酸フラグメントと関連づけられたデータ（例えば、配列決定リード）は、複製物配列決定リードが分析および／もしくは除去される前に、上記インデックス付加部位に基づいて分離される。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、他の方法と比較して増大した精度で、１以上の真の複製物を同定もしくは検出する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、他の方法と比較して増大した精度で、（見かけ上のもしくは認められた複製物を同定することとは対照的に）真の複製物を同定する。１以上の真の複製物を同定することにおける増大した分解能および／もしくは精度は、真の複製物をより正確に同定するにあたって、技術水準にかなり貢献し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、他の方法（例えば、ペアエンド配列決定）と比較して増大した効率で、真の複製物を同定もしくは検出する。複製物リード（例えば、真の複製物）を検出することにおける精度、分解能、および／もしくは効率の増大は、配列決定結果において、例えば、発現およびＣＮＶ分析のために、信頼度を増大させ得る。

（キット）
本明細書で記載される組成物のうちのいずれかは、キット中に含まれ得る。非限定的例において、上記キットは、適切な容器の中に以下を含む：アダプターもしくは数種のアダプター、増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび試薬のうちの１以上。

上記キットの容器は、一般には、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジもしくは他の容器を含み、その中に構成要素が配置され得、そして好ましくは、適切にアリコートに分けられ得る。１より多くの構成要素が上記キットの中に存在する場合、上記キットはまた、一般には、第２の、第３のもしくは他のさらなる容器を含み、その中にさらなる構成要素が別個に配置され得る。しかし、構成要素の種々の組み合わせが容器の中に含まれ得る。

上記キットの構成要素が１以上の液体溶液中に提供される場合、上記液体溶液は、水性溶液であり得る。しかし、上記キットの構成要素は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および／もしくは構成要素が乾燥粉末として提供される場合、上記粉末は、適切な溶媒を添加することによって再構成され得る。

キットは、上記キットの構成要素を使用するための、同様に上記キット中に含まれない任意の他の試薬も使用するための説明書を含み得る。説明書は、実行され得るバリエーションを含み得る。

いくつかの実施形態において、本発明は、上記の方法および組成物の中で開示される要素のうちの任意の１以上を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、１以上の容器の中に本発明の組成物を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で記載されるアダプター、プライマー、および／もしくは他のオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、上記キットは、（ａ）ＤＮＡリガーゼ、（ｂ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｄ）正方向アダプター、（ｅ）逆方向アダプター配列を含む１以上のオリゴヌクレオチド、および（ｆ）上記キット中に含まれる要素のうちの１以上に適切な１以上の緩衝液、のうちの１以上をさらに含む。上記アダプター、プライマー、他のオリゴヌクレオチド、および試薬は、上記で記載されるもののうちのいずれかであり得るが、限定されない。上記キットの要素は、上記で記載される量および／もしくは組み合わせ（例えば、同じキットもしくは同じ容器中で）のうちのいずれかにおいてさらに提供され得るが、限定されない。上記キットは、本発明の方法に従う使用のためのさらなる薬剤（例えば、上記で記載されるもの）をさらに含み得る。例えば、上記キットは、本明細書で記載されるとおりの部分二重鎖アダプターである第１の正方向アダプター、第２の正方向アダプター、および上記第１の正方向アダプターに存在する制限部位および／もしくは切断部位に特異的な核酸改変酵素を含み得る。上記キット要素は、任意の適切な容器（試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、アンプル、シリンジなどが挙げられるが、これらに限定されない）の中に提供され得る。上記薬剤は、本発明の方法において直接使用され得る形態で、または使用前の調製を要する形態（凍結乾燥した薬剤の再構成におけるように）で提供され得る。薬剤は、単回使用のためのアリコートで、または多くの反応におけるように複数回の使用が得られ得るストックとして提供され得る。

いくつかの実施形態において、上記キットは、複数のアダプターオリゴヌクレオチドおよびその使用のための説明書を含み、ここで上記アダプターオリゴヌクレオチドの各々は、複数の識別子部位配列のうちの少なくとも１つを含み、ここで上記複数の識別子部位配列の各識別子部位配列は、少なくとも３個のヌクレオチド位置において、上記複数の識別子部位配列の中のあらゆる他の識別子部位配列とは異なる。異なる識別子部位配列を含むアダプターは、個々に、または異なる識別子部位配列を有する１以上のさらなるアダプターと組み合わせて、供給され得る。いくつかの実施形態において、上記キットは、複数のアダプターオリゴヌクレオチドを含み得る。

実施例１：ＮｕＧＥＮ Ｏｖａｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｙｓｔｅｍでの複製物配列決定リードの同定
サンプル説明：ヒトＨａｐＭａｐサンプル（ＮＡ１９２３８）由来の１００ｎｇのＤＮＡを、Ｃｏｖａｒｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）で超音波処理することによって、約５００塩基対の長さへとフラグメント化した。得られたＤＮＡを、末端修復酵素ミックスＮｕＧＥＮ Ｒ０１２８０およびＲ０１４３９（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）で、供給元の推奨に従って処理して、平滑末端化ＤＮＡフラグメントを生成した。

ライブラリー生成、富化、および識別子部位組み込み：上の鎖の５’から３’へと以下のセグメント：１）Ｉｌｌｕｍｉｎａインデックス付加プライミング部位（例えば、ＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣ（配列番号２））、２）インデックス付加部位、３）ランダム６塩基配列を有する識別子部位、および４）Ｉｌｌｕｍｉｎａ正方向配列決定プライミング部位と適合性の配列（例えば、ＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号３））、を有するオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチドにアニールして、部分的２本鎖ＤＮＡアダプターを形成した。これらアダプターの５μＭを、ＮｕＧＥＮ’ｓ Ｏｖａｔｉｏｎ Ｕｌｔｒａｌｏｗ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）のリガーゼおよびリガーゼ反応緩衝液を使用して、供給元の推奨に従って上記末端修復したＤＮＡにライゲーションした。２５℃での３０分のインキュベーション後、上記反応混合物を水で希釈し、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ磁性ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の０．８×容積を添加し、上記溶液を激しく混合した。上記ビーズを集め、洗浄し、そのライゲーションしたＤＮＡフラグメントを、製造業者の推奨に従って溶離した。標的化プローブのプールを、上記溶液を９５℃へと最初に加熱し、次いで、上記混合物を８０℃から６０℃へと０．６℃／分ずつゆっくりと冷却することによって、上記溶離したＤＮＡフラグメントにアニールした。特異的にアニールした標的化プローブを、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で、製造業者のプロトコルに従って伸長した。伸長後、上記ＤＮＡフラグメントを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ磁性ビーズ上で集め、洗浄し、製造業者の推奨に従って溶離した。これらライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセル配列（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）も含むＮｕＧＥＮライブラリー富化プライマー（Ｏｖａｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を使用して３０サイクルのＰＣＲによって供給元の推奨に従って富化した。

得られたライブラリーを、ＫＡＰＡによって提供されるキットを使用してｑＰＣＲによって定量し、２ｎＭへと希釈し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ＤＮＡシークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に適用した。以下のシリーズを行った：３６塩基第１リード、１４塩基第２リード、および２４塩基第３リード。

データ分析：シークエンサー出力を、製造業者の推奨に従って加工処理した。上記データを分析するために、インデックス付加リードを、２つのファイルに分けた。第１のファイルは、上記インデックス付加リードの最初の８塩基を含んでおり、標準的ライブラリー解析（ｐａｒｓｉｎｇ）のためにライブラリーインデックスファイルとして利用される。他のファイルは、ランダム塩基のみを含み、さらなる配列解析のためにとっておかれる。

ｂｏｗｔｉｅアライナー（ｂｏｗｔｉｅ ａｌｉｇｎｅｒ）（Ｌａｎｇｍｅａｄ Ｂ．ら、，Ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２００９，１０：Ｒ２．）での配列アラインメントの本発明者らのデータ分析パイプラインにしたがって、複製物リードを、それらのゲノム出発位置によって同定した。この時点で、同じゲノム位置で出発した配列決定リードを、ランダム塩基ファイルに対してチェックして、上記リードがこれらにライゲーションしたランダム塩基の同じセットもしくは異なるセットを有するかどうかを調べた。同じ出発ゲノム座標を有する２つの配列が、ランダム塩基の同じセットを有した場合、上記２つの配列は、どのＯｖａｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ標的化プローブが問題の配列フラグメントを生成するために使用されたかに関わらず、同じ最初のＤＮＡライゲーション事象に由来したとみなした。これら配列は、従って、上記出発ゲノムＤＮＡについての固有の情報を提供せず、改変体分析の目的のために１つの配列決定リードとしてみなされる。異なるランダム塩基を有する同じ出発ゲノム座標を有する２つの配列リードは固有のライゲーション事象から由来し、改変体同定の目的のために、両方が有効な配列決定リードであるとみなした。図５は、複製物リードの同定を実証する分析結果を提供する。識別子部位の使用は、見かけ上のもしくは認められた複製物の数に対して真の複製物の数の決定を可能にした。

２つのライブラリーの配列が同一である場合、それらの複製状態は、これがいかなるライブラリーでも偶然に起こり得たことから未知である。識別子配列を、ライブラリーリードと併せて使用する場合、上記状態が決定され得る（同一であれば複製物、異なっていれば別個）。ＳＰＥＴシステムを用いると、一方の末端は、２つのライブラリーが同一の末端を有する確率が増大するので共通する。これらは、複製物配列であるようであり、それらの真の状態は、識別子配列を調べることによって決定され得る。

全てランダムに選択されたリードのサンプリングにわたり、識別子部位の使用は、真の複製物の存在に対して増大した分解能を提供した。２００万のランダムリードを評価する場合、その見かけの複製物は、全てのリードのうちの３９％を構成することが見出された。しかし、その真の複製物（識別子部位の使用を通じて同定された）は、全てのリードのうちの２６％を構成するに過ぎないことが見出された。識別子部位の使用を採用する方法は、リードのプール内における複製物の真の数についての分解能をかなり増大させることが見出された。

実施例２：８塩基識別子部位を有する複製物配列決定リードの除去
標準的ＲＮＡ配列決定ライブラリーにおいて、アダプターを、２本鎖ｃＤＮＡの末端にライゲーションする。これらアダプターは、ＰＣＲ増幅およびハイスループット配列決定機で配列決定することを可能にするユニバーサル配列を含む。上記アダプターは、ライゲーション末端においてさらなる配列（ここではさらなる配列の各々が識別子部位である）の大きな集団で合成される。上記識別子部位は、上記アダプターと上記ｃＤＮＡとの間の接合部に存在する。上記配列リードは、上記識別子部位で始まり、ｃＤＮＡ配列へと続く。

識別子部位のこのプールは、ＰＣＲ複製物の検出のために使用される。なぜなら、ＰＣＲ複製物は、同一の識別子部位を含むのに対して、２つの異なるｃＤＮＡ分子は、２つの異なる識別子部位を含む２つの異なるアダプターへライゲーションするからである。この識別子部位は、上記アダプターの末端に導入された８個のランダム塩基として設計される。このようなアダプターで作製したライブラリーからの配列リードは、上記識別子部位の上記８塩基、続いて上記ｃＤＮＡ配列を含む。標準的ＰＣＲ複製物除去ソフトウェア（例えば、ＰＩＣＡＲＤ、Ｍａｒｋｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ、および／もしくはＳＡＭｔｏｏｌｓ ｒｎｄｕｐ）は、あらゆる場合の、同じ配列を偶然有する複数のｃＤＮＡフラグメントを分析のために残して、ＰＣＲ複製物を同定および除去するために使用される。

実施例３：ランダムな１〜８個の塩基の識別子部位の混合物を有する複製物配列決定リードの除去
標準的ＲＮＡ配列決定ライブラリーにおいて、アダプターを、２本鎖ｃＤＮＡの末端にライゲーションする。これらアダプターは、ＰＣＲ増幅およびハイスループット配列決定機で配列決定することを可能にするユニバーサル配列を含む。上記アダプターは、ライゲーション末端においてさらなる配列（ここではさらなる配列の各々が識別子部位である）の大きな集団で合成される。上記識別子部位は、上記アダプターと上記ｃＤＮＡとの間の接合部に存在する。上記配列リードは、上記識別子部位で始まり、ｃＤＮＡ配列へと続く。

識別子部位のこのプールは、ＰＣＲ複製物の検出のために使用される。なぜなら、ＰＣＲ複製物は、同一の識別子部位を含むのに対して、２つの異なるｃＤＮＡ分子は、２つの異なる識別子部位を含む２つの異なるアダプターへライゲーションするからである。

１〜８個のランダム塩基を、上記アダプターの末端に導入する。このようなアダプターで作製したライブラリーからの配列リードは、上記識別子部位の１〜８個の間の塩基、続いてｃＤＮＡ配列を含む。標準的ＰＣＲ複製物除去ソフトウェア（例えば、ＰＩＣＡＲＤ、Ｍａｒｋｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ、および／もしくはＳＡＭｔｏｏｌｓ ｒｎｄｕｐ）は、あらゆる場合の、同じ配列を偶然有する複数のｃＤＮＡフラグメントを分析のために残して、ＰＣＲ複製物を同定および除去するために使用される。

実施例４：９６の規定された６塩基識別子部位の混合物を有する複製物配列決定リードの除去
標準的ＲＮＡ配列決定ライブラリーにおいて、アダプターを、２本鎖ｃＤＮＡの末端にライゲーションする。これらアダプターは、ＰＣＲ増幅およびハイスループット配列決定機で配列決定することを可能にするユニバーサル配列を含む。上記アダプターは、ライゲーション末端においてさらなる配列（ここではさらなる配列の各々が識別子部位である）の大きな集団で合成される。上記識別子部位は、上記アダプターと上記ｃＤＮＡとの間の接合部に存在する。上記配列リードは、上記識別子部位で始まり、ｃＤＮＡ配列へと続く。

識別子部位のこのプールは、ＰＣＲ複製物の検出のために使用される。なぜなら、ＰＣＲ複製物は、同一の識別子部位を含むのに対して、２つの異なるｃＤＮＡ分子は、２つの異なる識別子部位を含む２つの異なるアダプターへライゲーションするからである。

９６の規定された６塩基配列の混合物を、上記アダプターの末端に導入する。従って、各６塩基配列は、識別子部位である。このようなアダプターで作製したライブラリーからの配列リードは、上記９６の６塩基識別子部位のうちの１つ、続いて上記ｃＤＮＡ配列を含む。標準的ＰＣＲ複製物除去ソフトウェア（例えば、ＰＩＣＡＲＤ、Ｍａｒｋｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ、および／もしくはＳＡＭｔｏｏｌｓ ｒｎｄｕｐ）は、あらゆる場合の、同じ配列を偶然有する複数のｃＤＮＡフラグメントを分析のために残して、ＰＣＲ複製物を同定および除去するために使用される。

実施例５：ｍＲＮＡ発現レベルの決定における複製物配列決定リードの同定
サンプル説明：総ＲＮＡを、腫瘍および正常な隣接組織から、この２つのサンプルタイプの間で転写物の発現レベルに差異を見出す目的で抽出する。各サンプルのうちの１００ｎｇを、ＮｕＧＥＮ’ｓ Ｅｎｃｏｒｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）中で提供されるＵＳＰプライマー、反応緩衝液、および逆転写酵素を使用して供給元の推奨に従ってｃＤＮＡへと変換する。この次に、再び上記キット中に提供される材料を使用して、推奨に従って第２鎖合成を行う。２本鎖ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｄｏｕｐｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して製造業者の指示に従って調製した。ＤＮＡを、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓシリーズデバイス（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）で、上記機器と共に提供される２００ｂｐ超音波処理プロトコル（１０％ デューティーサイクル、２００サイクル／バースト、強度５、１８０秒）を使用して剪断した。ＤＮＡを、総容積１５μＬにおいて、１．５μＬ １０×平滑化緩衝液、０．５μＬ 平滑化酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ；ｐ／ｎ Ｅ１２０１）および１．２μＬの各ｄＮＴＰミックス２．５ｍＭで、３０秒間２５℃、続いて、１０分間７０℃において処理した。

ライブラリー生成：次いで、上記ＤＮＡフラグメントを、ＮｕＧＥＮ’ｓ Ｏｖａｔｉｏｎ Ｕｌｔｒａｌｏｗ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）中で提供される末端修復緩衝液および酵素を使用して、末端修復に供した。

を、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から全て注文した。上記逆方向アダプターは、これらアダプターで作製されたライブラリーを区別できるようにする固有の識別子（下線を付した）を各々含む。この場合、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの等モル混合物を表す。１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８中の５μＭ 正方向、５μＭ 逆方向、および１０μＭ 共通の混合物を、９５℃へと５分間加熱し、次いで、２０℃へと冷却した。アダプターライゲーションを、４．５μＬ 水、３μＬ アダプターミックス（上記で調製）、６μＬ ５×ＮＥＢＮｅｘｔ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒおよび１．５μＬ Ｑｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ；ｐ／ｎ Ｅ６０５６）を添加することによって行って、続いて、２５℃で３０分間、続いて７０℃で１０分間のインキュベーションを行った。ライゲーション生成物を、７０μＬ 水および８０μＬのＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を添加し、７０％エタノールで２回洗浄し、２０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０で溶離することによって精製した。ライブラリー生成物を、プライマー（５’ ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ（配列番号８）、および５’ ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ（配列番号９）の各々０．５ｕＭ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ 各ｄＮＴＰ、および１ユニットＴａｑ ポリメラーゼを含む５０μＬ ＰＣＲで増幅した。上記反応を９５℃で１５秒、６０℃で１分間の条件下で１５サイクル行った。ＰＣＲ生成物を、１容積のＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で上記のように精製した。そのライブラリーを、ＨＳ ＤＮＡ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によって分析し、ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ；ｐ／ｎ ＫＫ４８３５）で供給元の指示に従って定量した。その得られたライブラリーを合わせると、ＧＡＩＩｘ，ＭｉＳｅｑ、もしくはＨｉ Ｓｅｑ配列決定装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の標準的ＴｒｕＳｅｑ単一末端もしくは対形成Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プロトコルと適合性である。以下のシリーズを行う；５０塩基第１リード、６塩基第２リード。第３リードは、カウント目的にも複製物分析にも必要とされない。

データ分析：シークエンサー出力を、製造業者の推奨に従って加工処理した。上記インデックスリードの６塩基を、２つのサンプルタイプからデータファイルを分離して、標準的ライブラリー解析のために使用する。上記標的配列リードの第１の５０塩基を、互いに比較する。任意の他のリードと同一配列を有する任意のリードを複製物と同定し、集団から除去する。従って、単一コピーのみが上記ファイル内に保持される。上記複製物リードがいったん除去されたら、８塩基を各リードからトリミングする。上記トリミングしたリードを、参照ゲノムに対して整列させる。次いで、差次的な発現を、ｃｕｆｆｌｉｎｋｓもしくはｃｕｆｆｄｉｆｆ（Ｔｒａｐｎｅｌｌら、２０１０、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２８、５１１〜５１５；Ｔｒａｐｎｅｌｌら、２０１３、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１、４６〜５３）のようなスクリプトを利用して、ライブラリー間でＦＰＫＭ（フラグメント／キロベース／１００万リード）値を比較することによって決定する。

実施例６：ペアエンドリードにおいて標的配列を有する上記識別子部位の配列決定
Ｔｈｅ Ｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｌｏｗ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ Ｓａｍｐｌｅｓ（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、単一アンプリコンから各々４つのライブラリーを生成した。精製したライブラリーを混合し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で多重のもの（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）として配列決定して、１２５ｎｔ 正方向、８ｎｔ インデックス１、８ｎｔ インデックス２、および２５ｎｔ 逆方向リードを生成した。全てのアンプリコンリードは同じ配列座標で出発および終了するので、ライブラリーＰＣＲ複製物をマークする（複製物と同じゲノム座標で出発および終了するリードをマークする）古典的な方法は使用できない。代わりに、上記アンプリコンにライゲーションしたアダプター中に含まれる０〜８ｎｔのランダム配列を識別子配列として処理し、複製物をマークするために使用した。これらランダム塩基の同じ長さおよび配列を任意の他のペアエンドリードと共有した任意のペアエンドリードを、複製物と称した。以下の表は、この複製物マーキングの結果を示す。

表１は、複製物リードと真に独立した分子からのリードとの間を区別するために使用した方法の精度を実証する。独立した分子からのリードの集団（表１の最終列に示される）は、上記ライブラリーを生成するにあたって使用した独立したアンプリコン分子からの配列を表す。

実施例７：Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ（ＲＲＢＳ）ライブラリーにおける標的配列を有する識別子部位の配列決定
ヒトゲノムのＲｅｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ（ＲＲＢＳ）ライブラリーを、１００ｎｇ入力サンプルの完全制限酵素消化、続いて、短いフラグメントの選択を通じて生成する。得られたフラグメントプールを、インデックス付加部位および識別子部位を含むアダプター配列にライゲーションする。上記識別子部位は、６個もしくは８個いずれかのランダムヌクレオチドを含む。次いで、上記配列を配列決定して、上記識別子部位を同定すると、上記プールにおける複製物の真の数が明らかになる。識別子部位の非存在下では、見かけ上のもしくは認められた複製物の数は、真の複製物の数より大きい。識別子部位を含めることは、見かけ上のもしくは認められた複製物のより大きな数と比較して、真の複製物の数の同定を生じる。

別段定義されなければ、本明細書中の全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものに類似もしくは均等な任意の方法および材料が、本発明の実施もしくは試験において使用され得るものの、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。引用される全ての刊行物、特許、および特許公開は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書で参考として援用される。

本明細書で議論される刊行物は、本願の出願日より前にそれらの開示に関して提供されるに過ぎない。本発明が、先の発明によってこのような刊行物より日付が先である権利を与えられないという承認として解釈されるべきものは、本明細書中にはない。

本明細書で引用される全ての参考文献、学術論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、全ての目的のためにそれらの全体において参考として援用される。しかし、本明細書で引用される任意の参考文献、学術論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、それらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれかの国において技術常識の一部を形成するという示唆の承認もしくは何らかの形態として解釈されず、またそのように解釈されるべきではない。

本発明は、その具体的実施形態とともに記載されてきたが、それはさらなる改変が可能であり、本願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明が属する技術内の公知もしくは習慣的な実施内に入るとして、本開示からのこのような逸脱を含め、そして本明細書で先に示される本質的特徴に適用され得るとおりおよび添付の特許請求の範囲に従うとおり、本発明の任意のバリエーション、使用、もしくは適合を網羅することが意図されることは、理解される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
複製物配列決定リードをサンプル配列決定リードの集団から検出するための方法であって、前記方法は、以下：
ａ）アダプターを、１以上のサンプルに由来する複数の核酸フラグメントの各核酸フラグメントの５’末端にライゲーションする工程であって、ここで前記アダプターは、以下：
（ｉ）インデックス付加プライマー結合部位；
（ｉｉ）インデックス付加部位；
（ｉｉｉ）識別子部位；および
（ｉｖ）標的配列プライマー結合部位
を含む、工程；
ｂ）前記アダプター−核酸フラグメントのライゲーション生成物を増幅する工程；
ｃ）配列決定リードの集団を、増幅されたアダプター−核酸フラグメントのライゲーション生成物から生成する工程；ならびに
ｄ）複製物識別子部位および標的配列を有する配列決定リードを含む前記配列決定リードの集団を、検出する工程
を包含する、方法。
（項目２）
前記方法は、前記配列リードの集団から、複製物識別子部位および標的配列を有する配列決定リードを除去する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記識別子部位は、前記インデックス付加部位とともに配列決定される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記識別子部位は、前記インデックス付加部位とは別個に配列決定される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記識別子部位は、前記標的配列とともに配列決定される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記識別子部位は、前記標的配列とは別個に配列決定される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記アダプターは、５’から３’へと：
（ｉ）前記インデックス付加プライマー結合部位；
（ｉｉ）前記インデックス付加部位；
（ｉｉｉ）前記識別子部位；および
（ｉｖ）前記標的配列プライマー結合部位
を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記アダプターは、５’から３’へと：
（ｉ）前記インデックス付加プライマー結合部位；
（ｉｉ）前記インデックス付加部位；
（ｉｉｉ）前記標的配列プライマー結合部位；および
（ｉｖ）前記識別子部位
を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
複数の前記核酸フラグメントは、１より多くのサンプルから生成される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
各サンプルの前記核酸フラグメントは、同じインデックス付加部位を有する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記配列決定リードは、前記インデックス付加部位に基づいて分離される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記配列決定リードの分離は、工程ｄ）の前に行われる、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記核酸フラグメントは、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、もしくはＤＮＡ／ＲＮＡフラグメントである、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記核酸フラグメントは、ゲノムＤＮＡフラグメントもしくはｃＤＮＡフラグメントである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記インデックス付加部位は、２ヌクレオチド〜８ヌクレオチドの間の長さである、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記インデックス付加部位は、約６ヌクレオチドの長さである、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記識別子部位は、１ヌクレオチド〜８ヌクレオチドの間の長さである、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記識別子部位は、約８ヌクレオチドの長さである、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記インデックス付加プライマー結合部位は、ユニバーサルインデックス付加プライマー結合部位である、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記標的配列プライマー結合部位は、ユニバーサル標的配列プライマー結合部位である、項目１に記載の方法。
（項目２１）
複数のアダプターを含むキットであって、ここで各アダプターは、以下：
（ｉ）インデックス付加プライマー結合部位；
（ｉｉ）インデックス付加部位；
（ｉｉｉ）識別子部位；および
（ｉｖ）標的配列決定プライマー結合部位、
を含む、キット。

Claims (21)

1. 複製物配列決定リードをサンプル配列決定リードの集団から検出するための方法であって、前記方法は、以下：
   ａ）アダプターを、１以上のサンプルに由来する複数の核酸フラグメントの各核酸フラグメントの５’末端にライゲーションする工程であって、ここで前記アダプターは、以下：
   （ｉ）インデックス付加プライマー結合部位；
   （ｉｉ）複数のポリヌクレオチドに関するインデックスである、インデックス付加部位；
   （ｉｉｉ）ランダム塩基を含み、１〜８ヌクレオチドからなる識別子部位；および
   （ｉｖ）標的配列プライマー結合部位
   を含む、工程；
   ｂ）前記アダプター−核酸フラグメントのライゲーション生成物を増幅する工程；
   ｃ）配列決定リードの集団を、増幅されたアダプター−核酸フラグメントのライゲーション生成物から生成する工程；ならびに
   ｄ）前記配列決定リードの集団における他の配列決定リードと同一である識別子部位および核酸フラグメントを含む配列決定リードとして、複製物配列決定リードを同定する工程
   を包含する、方法。
2. 前記方法は、前記配列リードの集団から、複製物識別子部位および標的配列を有する配列決定リードを除去する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
3. 前記識別子部位は、前記インデックス付加部位とともに配列決定される、請求項１に記載の方法。
4. 前記識別子部位は、前記インデックス付加部位とは別個に配列決定される、請求項１に記載の方法。
5. 前記識別子部位は、前記標的配列とともに配列決定される、請求項１に記載の方法。
6. 前記識別子部位は、前記標的配列とは別個に配列決定される、請求項１に記載の方法。
7. 前記アダプターは、５’から３’へと：
   （ｉ）前記インデックス付加プライマー結合部位；
   （ｉｉ）前記インデックス付加部位；
   （ｉｉｉ）前記識別子部位；および
   （ｉｖ）前記標的配列プライマー結合部位
   を含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記アダプターは、５’から３’へと：
   （ｉ）前記インデックス付加プライマー結合部位；
   （ｉｉ）前記インデックス付加部位；
   （ｉｉｉ）前記標的配列プライマー結合部位；および
   （ｉｖ）前記識別子部位
   を含む、請求項１に記載の方法。
9. 複数の前記核酸フラグメントは、１より多くのサンプルから生成される、請求項１に記載の方法。
10. 各サンプルの前記核酸フラグメントは、同じインデックス付加部位を有し、異なるサンプルの前記核酸フラグメントは異なるインデックス付加部位を有する、請求項９に記載の方法。
11. 前記配列決定リードは、前記インデックス付加部位に基づいて分離される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記配列決定リードの分離は、工程ｄ）の前に行われる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記核酸フラグメントは、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、もしくはＤＮＡ／ＲＮＡフラグメントである、請求項１に記載の方法。
14. 前記核酸フラグメントは、ゲノムＤＮＡフラグメントもしくはｃＤＮＡフラグメントである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記インデックス付加部位は、２ヌクレオチド〜８ヌクレオチドの間の長さである、請求項１に記載の方法。
16. 前記インデックス付加部位は、約６ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
17. 前記識別子部位は、６ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
18. 前記識別子部位は、８ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
19. 前記インデックス付加プライマー結合部位は、ユニバーサルインデックス付加プライマー結合部位である、請求項１に記載の方法。
20. 前記標的配列プライマー結合部位は、ユニバーサル標的配列プライマー結合部位である、請求項１に記載の方法。
21. インデックス付加部位に基づいてフラグメントまたは配列決定リードを分離する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。