DE68926735T2

DE68926735T2 - Verwendung von spezifischen Eigenschaften der Tierallergene und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE68926735T2
Application number: DE68926735T
Authority: DE
Inventors: Lubertus Berrens
Original assignee: Laboratorios Leti SA
Current assignee: Cbf Leti Sa Tres Cantos Madrid Es
Priority date: 1989-01-05
Filing date: 1989-01-05
Publication date: 1997-02-27
Anticipated expiration: 2009-01-06
Also published as: DE68926735D1; EP0377229B1; ATE139802T1; ES2091192T3; EP0377229A1; US5667979A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von spezifischen Eigenschaften von Tierallergenen und Verfahren zu deren Isolierung.
Die Hypersensibiltät von Menschen gegenüber bestimmten Substanzen in ihrer Umgebung kann sich in Form von mehreren verschiedenen Krankheitssymptomen äußern. Von diesen sind die Erscheinungsbilder von allergischem Bronchialasthma, Neurodermitis, vasomotorischer Rhinits, Heuschnupfen (oder Pollinose) und Lebensmittelallergien unter den am weitesten bekannten. Trotz der Tatsache, daß in jeder menschlichen Population an einem geografischen Ort die Exponierung gegenüber den reizauslösenden Agentien (oder "Allergenen") für jedes Individuum etwa gleich ist, gibt es nichtsdestoweniger einen ziemlich gleichbleibenden Anteil von etwa 10 % jeder gegebenen Population, der tatsächlich deutliche Krankheitssymptome entwickelt. Diese Randgruppe der menschlichen Population wird als "atopisch" bezeichnet, was bedeutet, daß die betroffenen Individuen eine genetisch bestimmte Prädisposition besitzen, auf "Allergene" in der Umgebung mit Krankheitssymptomen zu antworten, im Gegensatz zu der nicht-atopischen Population, die nur bei sehr viel höheren Expositionsniveaus oder überhaupt nicht antwortet. Die derzeitige wissenschaftliche Theorie geht davon aus, daß bei atopischen Personen in Erscheinung tretende allergische Krankheiten durch die Wechselwirkung solcher Umgebungsallergene mit spezifischen Antikörpern, sogenannten Immunoglobulinen des IgE-Isotyps, die das Allergen als individuelle makromolekulare Einheit oder, in der derzeitigen Terminologie, als ein "Antigen" erkennen, verursacht wird. Da dieser Antikörper der IgE-Klasse tatsächlich vorwiegend im Blut und im Gewebe von atopischen Personen gefunden wird, wird angenommen, daß die innewohnende physiologische Konditionierung der "Atopie" in erster Linie eine angeborene Abnormalität des immunologischen Abwehrsystems ist, was verursacht, daß atopische Personen "starke IgE-Antworten geben".
Die medizinische Behandlung von menschlichen Krankheiten zielt normalerweise auf die Bekämpfung des letztendlichen physiologischen Effekts der durch die Allergen-IgE-Wechselwirkung ausgelösten Kettenreaktion ab und beruht daher auf Antihistaminen, cholinergenen Antagonisten oder adrenergenen Antagonisten, auf wiederholten Injektionen mit dem auslösenden Allergen, um eine Verschiebung der Antikörperantwort in Richtung der als "abwehrend" angenommenen IgG-Antikörper auszulösen, und, prophylaktisch, auf die Identifizierung und Eliminierung der jeweiligen Allergenquelle (n) in der Umgebung des Patienten. Wissenschaft und Technologie zur Identifizierung und Quantifizierung der ursächlichen Allergene in der direkten Umgebung eines Patienten, d.h. zu Hause oder am Arbeitsplatz, ist unterentwickelt geblieben. Weitere Technologien auf diesem Gebiet werden dringend gebraucht, um jeden einzelnen Patienten oder jede Gruppe von Patienten mit profundem Rat über die "Hygiene" in ihrer Umgebung und die Reduktion der allergenen Belastung versorgen zu können, bevor Arzneimittel genommen werden, um die Symptome zu lindern. Solche Maßnahmen hängen von den für den Nachweis von Allergenen zur Verfügung stehenden Techniken ab, und die Entwicklung von diesen entspringt der derzeitigen wissenschaftlichen Einsicht in ihre Eigenart und Wirkungsweise (n).
Die derzeitige Betrachtungsweise von menschlichen allergischen Krankheiten des sogenannten "Sofort-Typus" (Typ I nach immunologischer Klassifizierung) hängt ab von dem strukturellen Konzept, das die Allergene als molekulare Einheiten (oder als "Antigene") von spezifischen IgE-Antikörpern erkannt werden. Der klinische Nachweis und die Identifikation von Allergenen über ihrer Fähigkeit, starke (urticariale und erythemale) Quaddel- und Hautrötungsreaktionen zu verursachen, wenn sie in die Haut eines spezifisch sensibilisierten atopischen Patienten injiziert werden, ist aus offensichtlichen Gründen zu beschwerlich, um eine angemessene Überwachung des allergenen Potentials der Umgebung zu ermöglichen. Zu diesem Zweck entwickelte Labormethoden begründeten sich daher auf ausgeklügelte und kostspielige immunochemische Techniken zur Identifizie rung und Quantifizierung von Allergenen in Extrakten von aus der Umgebung entnommenen Substraten mit Hilfe von Untersuchungen zur Bindung an IgE-Antikörper in individuellen oder gesammelten menschlichen Blutserumproben von Allergikern.
Der Hauptteil allergener Substanzen für atopische Personen leitet sich von Bestandteilen im Staub ab, der sich in Häusern sammelt. Viele verschiedene Organismen tragen zu dieser allergenen Belastung bei, insbesondere Milben und andere Arthropoden, Insekten, Hefen und Schimmelpilze und, in den betreffenden Jahreszeiten, durch Wind verteilte Pollenkörner von Gräsern, Bäumen und Kräutern aus der Umgebung draußen. In einigen Behausungen können Allergene, die mit den Hautschuppen, trockenen Speichel- oder Urinkonstituenten von Haustieren wie Katzen, Hunden, Vögeln und anderen Tieren verteilt werden, wesentlich zu der allergenen Belastung in der persönlichen Umgebung eines Menschen beitragen. Um jedes einzelne dieser verschiedenen Allergene mit Techniken zu identifizieren, die auf der Bindung spezifischer IgE-Antikörper basieren, müßte eine sehr große Vielzahl von Blutserumproben von Allergikern verfügbar sein. Dieses besondere Erfordernis wird weiterhin die Entwicklung adäquater Kontrollmaßnahmen der allergischen Umgebung von Menschen verhindern.
In einem Versuch, den Beitrag der sogenannten Hausstaubmilben Dermatophagoides pteronyssinus und D. farinae, die im Hausstaub leben und hochpotente Atemallergene für den Menschen ausscheiden, zu quantifizieren, ist vorgeschlagen worden, das stickstoffhaltige Ausscheidungsprodukt Guanin in aus Staub entnommenen Proben zu quantifizieren. Ein auf diesem Prinzip basierendes technisches Verfahren ist zur Verfügung gestellt worden und beschrieben in der wissenschaftlichen und Patentliteratur EP 0 144 820, 0 152 068 und 0 174 448. (Bischoff E, Schirmacher W: Allergologie 1984; 7: 446-9; 1985; 8: 36-8; Bischoff E, Schirmacher W, Schober G: Allergologie 1985; 8: 97-9. Bronswijk JEMH van, Bischoff E, Schirmacher W, Berrens L, Schober G. J Med Entomol 1986; 23: 217-8). Die erhaltenen Ergebnisse liefern jedoch nicht wirklich relevante Daten für die gewünschte Abschätzung der allergenen Belastung in der Umgebung, die mit der Ausprägung allergischer Krankheiten verbunden ist. Das stickstoffhaltige Abfallprodukt Guanin, das von Arthropoden, Spinnen, Insekten, Vögeln und einigen Säugern produziert wird, hat sich als eine hochgradig unlösliche niedermolekulare organische Verbindung herausgestellt, die völlig bar jeder nachweisbaren allergischen Aktivität ist. Die Messung ihres Beitrags zum Trockengewicht von Hausstaubproben kann daher nicht mehr sein, als ein ungefährer Index für die Gesamtbiomasse an Organismen, die zu dem gesamten Vorrat an Bestandteilen im Hausstaub beitragen, ob allergen oder nicht. In dieser Weise erhaltene Ergebnisse können daher nicht extrapoliert oder umgewandelt werden zu einem realistischen Parameter für den in der Umwelt enthaltenen Gehalt an biologisch aktiven allergenen Makromolekülen, die sich von einer großen Vielzahl potentiell allergischer Substrate ableiten. In Übereinstimmung damit haben Untersuchungen über den Zusammenhang zwischen dem Guaningehalt von Hausstaubproben und immunologischen Parametern für den wahren Allergengehalt nur grobe statistische Nährungswerte für die angenommene vergangene und gegenwärtige Population an Milben in den Staubproben gezeigt (Bronswijk JEMH van. Exp Appl Acarology 1986; 2: 231 - 8.; Bronswijk JEMH van, Reumer JWF, Pickard R. Exp Appl Acarology 1987; 3: 271-8.; Pauli G, Hoyet C, Tenabene A, Le Mao J, Thierry R, Bessot JC. Clin Allergy 1988; 18: 383-92).
Die Verfügbarkeit eines Verfahrens zur Abschätzung des gesamten oder spezifischen Allergengehalts von der Umgebung entnommenen Staubproben, das auf der Messung biologisch wirklich relevanter allergenischer Eigenschaften und nicht auf biologisch inerten und zufälligen Nebenprodukten beruht, wäre wünschenswert.
Im Gegensatz zu der allgemein anerkannten Strukturtheone der Allergie, wonach allergene Makromoleküle von spezifischen (IgE-)Antikörpern als Antigene erkannt werden, ist bereits vorgeschlagen worden, daß Allergene selbst biologisch aktive Moleküle sein könnten, die ihre Wirkung in atopischen Personen durch eine intrinsische molekulare Eigenschaft ausüben, die sie von allen anderen Antigenen unterscheidet (Berrens L. Ann Allergy 1976; 36: 351-61). Für die Entwicklung dieser inhärenten biologischen Aktivität in Allergikern ist angenommen worden, daß keine Antikörper irgendeiner Klasse wesentlich wären. In diesem Zusammenhang wurde beispielsweise gezeigt, daß die Ansammlung von Allergenen im Hausstaub im Menschen die Funktion einer Aktivierung des sogenannten Komplementsystems von Zymogenen ausübt, ohne die nachweisbare Beteiligung von Antikörpern (Berrens L. Guikers CLH, Van Rijswijk-Verbeek J. Immunochemistry 1976; 13: 367-72).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß Allergene tierischer oder insektischer Herkunft enzymatische Eigenschaften von Serin-Proteinase und kallikreinartiger Proteinase aufweisen. Dies ist völlig unerwartet in Anbetracht der Tatsache, das die wissenschaftliche Literatur über mögliche Enzyme in Hausstaub- oder Staubmilbenextrakten in Bezug auf die Allergenizität sich als in hohem Maße entinutigend herausgestellt hat (Bousquet J., Hale R. Guerin B. Michel F-B. Ann Allergy 1980; 45: 316-21); es wurden keine Enzyme, die auch nur entfernt zuständig für die Auslösung von Enzymkaskaden wären, als mit der Allergenizität korreliert nachgewiesen. Stewart GA, Bucher A. Lees K, Ackland J. J. Allergy Clin. Immunol. 1986; 77: 14-24 haben Staubmilbenextrakte auf die Anwesenheit von Enzymen untersucht und haben einige der gefundenen enzymatischen Aktivitäten mit Antigenen korreliert in dem Bestreben, zu bestimmen, ob solche Enzyme allergen sind. Trypsin und Chymotrypsin wurden in keinem der Extrakte nachgewiesen. Ein Extrakt enthielt ein trypsinartiges Enzym. J. Bousquet et al. (1978), Ann. Allergy 41, 164-169 berichteten eine Beziehung zwischen der Leucin-Aminopeptid-Aktivität und der Allergenizität von Gartengraspollenextrakten. In einem geringeren Grade korrelierte die Aktivität der sauren Phosphatase mit der Allergenizität. Trypsin-Aktivität war in einigen der Pollenextrakte vorhanden, es wurde jedoch keine gute Korrelation mit der allergenen Wirkung gefunden. In beiden Artikeln wurde die enzymatische Aktivität mit dem Api-Zym-System bestimmt und die allergene Wirkung wurde mit RAST-Inhibierung, CIE und CRIE bestimmt.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines passend zu dem aktiven Zentrum einer Proteinase konstruierten Substrates mit Substratspezifität für diese Proteinase, wobei das Substrat ein Protein oder ein Peptidderivat ist, das eine zu dem aktiven Zentrum der Proteinase passend konstru ierte Aminosäure oder Aminosäuresequenz aufweist, wobei die Verwendung in der Feststellung des allergenen Potentials aus der Umgebung entnommener Staubproben und individueller allergener Präparate besteht, indem die Größe der proteolytischen Aktivität der aus der Umgebung entnommenen Staubprobe oder dem allergenen Präparat bestimmt wird, wobei die Proben und Präparate aus insektischen oder tierischen Quellen abgeleitet sind und die Proteinase eine Serinproteinase ist, weil ein Allergen identisch oder eng verwandt mit der Serinproteinase ist.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen
- die Verwendung basierend auf der intrinsischen enzymatischen Aktivität von Allergenen aus Säuger- und Nichtsäugerexkrementquellen von Tieren wie Arthropoden, Insekten, Vögeln und Säugern, Proteine zu hydrolysieren und Substrate spezifisch für das aktive Zentrum des Enzyms aufzuspalten;
- die Verwendung basierend auf der intrinsischen Eigenschaft von Säugetierallergenen, die vorhanden sind in Speichel, Schweiß, trockenen Hautschuppen und Urin, als glanduläre Kallikrein-Enzyme zu wirken, die in der Lage sind, niedermolekulare Substrate spezifisch für Gewebs- Kallikreine zu spalten.
Nach der vorliegenden Erfindung scheint es so, daß Hausstaub extrakte nicht nur starke proteolytische Enzyme enthalten, sondern daß die enzymatischen Aktivitäten, die durch Anwendung von auf das aktive Zentrum spezifischen Substraten gemessen werden, eng mit der IgE-Bindungskapazität solcher Extrakte korrelieren. Hauptallergene aus einzelnen Substraten wie Dermatophagoides-Milben, von Insekten wie Heuschrecken, Schaben, der gemeinen Hausfliege, dem Käfer Trogoderma angustum etc. und aus den trockenen staubigen Exkreten von Vögeln und anderen Tieren sind tatsächlich identisch - oder eng verwandt mit - proteolytischen Verdauungsenzymen (d.h. Serinproteinasen mit den Spezifitäten von Trypsin und Chymotrypsin), die in die Umgebung durch Ausstoß aus den Verdauungstrakten entlassen werden.
Mit den Sektreten in Schweiß (oder in Hornhautschuppen), Speichel und Urin von Tieren wie Katzen, Hunden, Mäusen, Ratten, Pferden und anderen Säugern verbundene Allergene sind tatsächlich identisch mit den jeweiligen Gewebs-Kallikreinenzymen, die mit diesen Körperflüssigkeiten sekretiert werden. Diese (glandulären) Kallikreinenzyme zeigen eine Substratspezifität, die leicht unterschiedlich ist von der von trypsinartigen Serinproteinasen, die mit den Exkreten abgesetzt werden.
Die intrinsische biologische Eigenschaft der enzymatischen Wirkung eröffnet eine ganze Palette von Techniken. Ein wichtiges Beispiel ist der schnelle, leicht zugängliche und preiswerte Test des gesamten und spezifischen allergenen Potentials aus der Umgebung bei den Menschen zuhause oder sonst. Die auf diese Weise gemessene Proteaseaktivität erlaubt die abgestufte Bewertung des Beitrags der Biomasse tierischer Herkunft zu dem allergenen Potential in Staubproben.
Eines der aggressivsten Allergene, das sich im Staub menschlicher Behausungen sammelt, stammt von Milben der Spezies Dermatophagoides. Es ist bereits erkannt worden, daß "die Interpretation der Beziehung zwischen allergischen Symptomen und der Exponierung mit Milbenallergenen die Messung der Milbenallergenspiegel in den einzelnen Häusern erfordern würde" (Platts-Mills THAE, Hayden ML, Chapman MD, Wilkins SR. J Allergy Clin Immunol 1987: 79:781-91). Zwei Hauptallergene aus dieser Quelle sind bekannt, nämlich: ein Allergen P1 (D per 1), das hauptsächlich mit den Milbenexkreten verbunden ist, und ein Allergen DPX (D per II), das hauptsächlich mit (sauberen) ganzen Milbenkörpern verknüpft ist. Während Untersuchungen zur Isolierung des Allergens P1 aus Milbenkulturen hat der Anmelder gefunden, daß dieses Allergen identisch mit der in dieser Erfindung beschriebenen Proteinase ist, so daß die Messung der proteolytischen oder amidolytischen, aber nicht der sauren Phosphataseaktivität von Milbenkultur-Extrakten einen akuraten Zugang zum P1-Gehalt liefert. Tests haben ergeben, daß hochallergene und IgE-bindende Allergene, die aus den sauberen Milbenkörpern isoliert wurden, keine detektierbare proteolytische oder esterolytische Aktivität besaßen, aber deutliche saure Phosphataseaktivität zeigten. Beispielsweise wird bei Allergenquellen aus Milben die Messung der Proteinaseaktivität einen Parameter für den P1-Gehalt liefern, der abhängig ist von dem Volumen von durch vergangene oder gegenwärtige Milbengenerationen in dem Herkunftsmaterial abgegebenen Fäkalien; während die Messung der sauren Proteinaseaktivität einen Parameter für die aktuelle Zahl von Milbenkörpern liefern wird, weil dieses Enzym sicherlich aus dem organischen Schimmel- oder Hefematerial stammt, das von den Milben als Futter verwendet wird und noch in ihren Verdauungstrakten vorhanden ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können allergene Makromoleküle in aus der Umgebung entnommenen Staubproben, die aus insektischen oder tierischen Quellen stammen, quantitativ nachgewiesen und beurteilt werden, indem die Proteinaseaktivität von wässrigen Extrakten gegenüber verschiedenen spezifischen, zu dem aktiven Zentrum einer Proteinase mit der Substratspezifität einer Serinproteinase oder einer kallikrein-artigen Proteinase passend konstruierten Substraten gemessen wird. Wegen dieser engen Korrelation zwischen den IgE-Bindungseigenschaften solcher Extrakte aus dem Serum von spezifisch allergischen Menschen auf der einen Seite und dem spezifischen und quantitativen Proteinasepotential der Extrakte auf der anderen Seite sind die vorgeschlagenen Techniken und quantitativen Testsysteme ebenfalls direkt anwendbar für die (pharmazeutische) Wirksamkeitsuntersuchung und Standardisierung von allergenen Extrakten, die für die Verwendung beim Menschen als diagnostische oder therapeutische Mittel vorgesehen sind.
Im Falle der Verwendung der proteolytischen, (oder amidolytischen oder esterolytischen) Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung wird beobachtet, daß alle Arten von Substraten, die Amid- und/oder Esterbindungen enthalten, geeignet sind, z.B. Proteine oder andere Peptidderivate, die eine Aminosäure oder Aminosäuresequenz enthalten, die zum aktiven Zentrum von Proteinasen mit der Substratspezifität von Human- und Bovin- Trypsin und Chymotrypsin passend konstruiert sind.
Im Falle der Kallikreinenzymaktivität sind ähnliche Verbindungen, die die Substratspezifität von tierischen und glandulären Kallikreinen besitzen, geeignet. Beispiele für Peptidderivate sind die Naphthylamide von Monoamino-, Dipeptid-, Tripeptidoder Oligopeptid-Verbindungen oder Alkylester von chromogenen Naphthyl-, p-Benzoyl- oder p-Tosyl-Konjugaten von Monoamino-, Dipeptid-, Tripeptid- oder Oligopeptid-Derivaten, die eine zum aktiven Zentrum von Proteinasen mit der Substratspezifität von Human- und Bovin-Trypsin und -Chymotrypsin bzw. mit der Substratspezifität von tierischem glandulären Kallikreinen pas send konstruierte Aminosäure oder Aminosäuresequenz aufweisen.
Ein Testsystem zur Verwendung nach der Erfindung umfaßt wenigstens einen Träger, der ein Substrat von dem Typus wie oben definiert enthält.
Diese analytischen Systeme können ausgeweitet werden auf Substrate zum Test anderer Enzyme oder Enzym-Inhibitoren mit Bedeutung für menschliche Überempfindlichkeitserkrankungen im weitesten Sinne. Die Substrate können in den Kits in gepufferter Lösung oder in der Form von lyophilisierten Präparaten beinhaltet sein. Die Ergebnisse für Extrakte von Umgebungs- Allergenen können durch das Auslesen optischer Dichten unter Messung der Fluoressenzabgabe mit einer der gängigen Laborausrüstungen, die für die Spektrophotometrie, Fluorimetrie oder standard-Enzym-Immunoassays zur Verfügung stehen, quantitativ ausgewertet werden. Die Kits können mit Mehrkammerplastikspritzen ausgerüstet sein, die ein getrenntes Abteil zum Einführen der zu untersuchenden trockenen Staubprobe schaffen, das sich an eine Kammer anschließt, die die Extraktionsflüssigkeit enthält und durch eine durchstechbare Membran abgetrennt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Isolierung von Allergenen tierischer oder insektischer Herkunft. Im Stande der Technik sind Versuche zur Isolierung von Allergenen beschrieben.
Eines der agressivsten Allergene, das sich im Staub menschlicher Behausungen ansammelt, stammt von Milben der Spezies Dermatophagoides. Zwei Hauptallergene aus dieser Quelle sind bekannt, nämlich: ein Allergen P1 (D per I), das hauptsächlich mit den Milbenexkreten verknüpft ist, und ein Allergen DPX (D per II), das hauptsächlich mit (sauberen) ganzen Milbenkörpern verknüpft ist (Chapman M.D., Platts-Mills TAE. Clin exp Immunol 1978; 34: 126-36; J. Immunol 1980; 125: 587-92).
Menschliche Atemallergien gegenüber Katzen sind ein allgemein bekanntes Beispiel für eine Tierallergie beim (atopischen) Menschen. Von den wichtigsten Allergenen, die die spezifischen Symptome auslösen, ist bekannt, daß sie mit tierischen Ausdünstungen verknüpft sind, wie verkörpert durch die (trockenen) Partikel der Schweiß- (Haut, Haare, Fell), Speichel- und Urinsekrete. Ausgiebige Studien über die chemische Eigenart des Allergens sind auf das mit der Haut verknüpfte Antigen beschränkt geblieben, welches als "Katzenallergen 1" oder Fel d l isoliert und charakterisiert worden ist (Ohman, J.L., Lowell, F.C., Block, K.J., J Allergy Clin Immunol 1973; 52: 231-41; Leitermann, K., Ohman, J.L., J Allergy Clin Immunol 1984; 74: 147-53).
Die in den oben genannten Zitaten beschriebenen Verfahren können in den folgenden Schritten zusammengefaßt werden:
- Extraktion von Rohmaterial, um ein Extrakt zu erhalten;
- Dialyse des Extraktes, um ein Retentat zu erhalten;
- Chromatographie des Retentates.
Die mit den bekannten Techniken erhaltenen Allergene haben jedoch die Nachteile, wie oben beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines Allergens, das identisch oder eng verwandt mit einer Serinproteinase aus einer der Umgebung entnommenen Staubprobe oder eines individuellen allergenen Präparates ist, die aus insektischen oder tierischen Quellen durch Affinitätsbindung des Allergens an ein passend zu dem aktiven Zentrum der Proteinase konstruiertes Substrat abgeleitet ist, und die Substratspezifität für die Serinproteinase, mit der das Allergen identisch oder eng verwandt ist, besitzt, wobei das Substrat zum Beispiel eine Serinproteinase inhibierende Substanz ist.
Mit Hilfe der Allergene nach der Erfindung kann der Reinigungs-, Isolierungs- und Standardisierungsprozeß mit Hilfe von hochspezifischen, schnellen und kostengünstigen enzymatischen Techniken geführt werden.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Isolierung von Hauptallergenen aus den Verdauungstrakten von Säuger- und Nichtsäuger-Organismen, die in den Exkreten vorkommen und immunologisch spezifische Überempfindlichkeitsreaktionen bei atopischen Menschen verursachen, wie Verbindungen, die identisch oder nahe verwandt sind mit proteolytischen Enzymen mit den molekularen Eigenschaften von (Bovin-)Trypsin und Chymotrypsin.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren für die Isolierung von Hauptallergenen aus den Verdauungstrakten von Säuger- und Nichtsäuger-Organismen, die in deren ausgeschiedenem Speichel, Urin, Schweiß, in ihrer Haut oder ihren Hautabschilferungen vorkommen, und die immunologisch spezifische Überempfindlichkeitsreaktionen bei atopischen Menschen verursachen, wie Verbindungen, die identisch oder eng verwandt mit den Kallikrein-(Kininogenase)-Enzymen in diesen Absonderungen sind, aus einer der Umgebung entnommenen Staubprobe oder eines allergenen Präparates.
Die physikochemischen Eigenschaften der isolierten trypsin- oder kallikreinartigen Enzyme sind vergleichbar mit den veröffentlichten Daten für einzelne Allergene, die mit Hilfe des traditionellen Hauttests oder von IgE-Bindungstechniken isoliert wurden, was anzeigt, daß die erwarteten besonderen Eigenschaften von atopischen Allergenen, die "sie von anderen Antigenen unterscheiden" tatsächlich solche von proteolytischen Enzymen sein könnten, z.B. Molekülgrößenbereich und isoelektrische Punkte (Berrens, L., The chemistry of Atopic Allergens, Karger AG, Basel 1971). Dies ist um so erfreulicher, da in der medizinischen Literatur berichtete klinische Erfahrungen für einzelne Fälle von berufsmäßiger Exponierung gegenüber regelmäßig proteolytischen Enzymen zeigen, das solche Enzyme tatsächlich für die Auslösung der Semiologie, die mit Überempfindlichkeitsreaktionen vom Sofort-Antwort-Typus, wie sie typisch sind für ausgeprägte atopische Krankheiten, verbunden sind, verantwortlich sind.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Isolierung von Tierallergenen, welches auf der Affinitätsbindung an reversibel enzyminhibierenden Substanzen beruht.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung umfaßt insbesondere die Schritte von
- Extrahieren tierischen Rohmaterials, um einen Extrakt zu erhalten;
- Dialyse des Extraktes, um ein Retentat zu erhalten; und
- Affinitätschromatographie des Retentats mit einem chromatographischen Träger, der einen Enzyminhibitor enthält.
Vorzugsweise werden alle Schritte des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung bei einer Temperatur ausgeführt, bei der keine Verschlechterung der enzymatischen Eigenschaften der Allergene stattfindet. Im allgemeinen wird die Temperatur während der Extraktion und der Dialyse in dem Bereich von 0º C bis etwa 50º C liegen. Einerseits wird eine relativ hohe Teinperatur für eine optimale Extraktion der Allergene benötigt, andererseits wird man versuchen, ihre Zersetzung zu vermeiden. Normalerweise wird man bei Umgebungstemperatur arbeiten. Der Schritt der Affinitätschromatographie (der das Endprodukt liefert) wird bei einer niedrigeren Temperatur, z.B. 0 bis 10º C, vorzugsweise 0 bis 4º C durchgeführt werden.
Allgemein anwendbare Verfahrensweisen für die Extraktion und Dialyse bei dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung können wie folgt sein:
Das rohe Ursprungsmaterial, das das allergene Enzym oder die allergenen Enzyme enthält, wird in neutraler Pufferlösung von 0,01 bis 0,1 molarer Konzentration dispergiert, die wenigstens 0,001 % eines geeigneten antibakteriellen Mittels wie Natriumazid und zwischen 0,1 bis 0,5 % eines mit Wasser mischbaren, nicht ionischen Detergenzes aus der Tween -Reihe enthält. Geeignete Puffer können aus den Natriumsalzen von Phosphaten, Boraten, Barbituraten oder sonstigen Anionen, abhängig von der Art des Ursprungsmaterials, bestehen und werden auf einen pH-Wert zwischen pH 7 - 8 für die Extraktion eingestellt. Die Dispersion wird wenigstens eine Stunde gerührt, wobei die Temperatur 10º C nicht überschreiten darf. Die Mischung wird dann zentrifugiert, der Überstand bei zwischen 4 - 10º C aufbewahrt und der Rückstand nochmals über einen Zeitraum zwischen 1 - 18 Stunden bei 4 - 10º C unter Rühren extrahiert. Nach erneutem Zentrifugieren wird der Rückstand verworfen und die zusammengenommenen überstehenden Extrakte über einen Zeitraum von 4 - 18 Stunden gegen destiliertes Wasser mit handelsüblichen Dialysemembranen mit einer Ausschlußgrenze von 10.000 Dalton Molekulargröße dialysiert. Das Material, das sich nach diesem Zeitraum innerhalb des Dialyseschlauchs befindet (oder das "Retentat"), wird durch Lyophilisieren getrocknet, um das Ausgangsmaterial für die weitere Reinigung des allergenen Enzyms durch Affinitätschromatographie oder auf andere Weise zu ergeben. Alternativ kann die Dialyse auch durch Durchgang des Extraktes durch mit Molekularsiebmaterialien wie Sephadex oder Sephacryl vom Exklusionstyp G10/G25 oder den korrespondierenden S-Größen gefüllten Kolonnen durchgeführt werden. Das Material in der Flüssigkeit des nicht zu rückgehaltenen Durchbruchs-Auslaufs wird durch Lyophilisieren getrocknet und ergibt so das Ausgangsmaterial für weitere Reinigung des allergenen Enzyms durch Affinitätschromatographie oder auf andere Weise.
Die Affinitätschromatographie nach der vorliegenden Erfindung wird mit einem Träger durchgeführt, der mit einem geeigneten (reversiblen) Enzyminhibitor für das betreffende Allergen chemisch konjugiert ist. Beispiele für geeignete Trägergrundlagen für kovalente Bindung an den Inhibitor mit Hilfe eines bifunktionellen Bindungsreagenzes sind: Cellulose oder teilweise substituierte Cellulosederivate und unter diesen die Gruppe der Sephadex - und Sepharose -Reihen und andere unlösliche (Hemi-) Cellulose- oder natürliche Polysaccharid-Produkte wie Agar oder Agarose. Beispiele geeigneter Enzyminhibitoren sind der polyvalente Bovin-Inhibitor BPTI (Trasylol ), Sojabohnen- Trypsininhibitor SBTI, der Limabohneninhibitor LBTI, die Proteinase- und Kallikreininhibitoren aus Hühnereiweiß (Ovomucoid und andere Ovo-Inhibitoren), der Inhibitor aus Kartoffeln, aus Erdnüssen und anderen botanischen Quellen und der Inhibitor aus Seeanemonen oder aus der Schnecke Helix pomatia. Beispiele von geeigneten synthetischen Inhibitoren sind Benzamidin, und die Verbindungen 4-Aminomethylbenzamidin und 4-Amidin-Phenyl- Acetylameisensäure.
Das allgemeine Verfahren für die Affinitätschromatographie nach der vorliegenden Erfindung ist folgendermaßen:
Der dialysierte und gefriergetrocknete allergene Enzymextrakt wird zu einer Konzentration von 1 - 5 % w/V in einem Neutralpuffer aufgelöst, der aus den Natrium- oder Kaliumsalzen von Phosphorsäure, Borsäure, (bi)Carbonsäure oder beliebigen sonstigen geeigneten organischen oder anorganischen Aniondonoren besteht und auf einen pH-Wert von 7,0 - 8,0 eingestellt ist; diese Pufferlösung darf keine Moleküle von Detergenzien enthalten, darf aber ein Konservierungsmittel wie Natriumazid enthalten. Diese Lösung wird über eine Säule gegeben, die mit dem speziell vorbereiteten unlöslichen Affinitäts-Inhibitorträger im gleichen Puffer gepackt ist. Das Verfahren kann auch in einem Batch-Prozeß durchgeführt werden. Nach der Absorption des allergenen Enzyms aus der Lösung an dem insolubiliserten Inhibitor wird der Träger mit dem gleichen Puffer gewaschen.
Das allergene Enzym wird dann durch Aufgeben einer sauren Lösung von pH 2 - 4 durch die Säule oder in den Ansatz desorbiert, was das Enzym aus seiner Verbindung mit dem spezifischen Inhibitor freigibt. Geeignete Desorptionsmittel sind 0,001 n HCl oder bliebige andere anorganische oder organische Säuren oder gepufferte Säuren im genannten pH-Bereich, wie beispielsweise ein 0,1 m Glycin-HCl-Puffer. Alternativ und in bestimmten Fällen kann die Desorption direkt mit einer neutralen wässrigen Lösung erreicht werden, die 3 in KBr oder KCNS für den Austausch des allergenen Enzyms enthält. Alle Arbeitsgänge werden bei einer Temperatur zwischen 4 - 10º C durchgeführt. Die desorbierte Allergenlösung wird schließlich über 4 - 18 Stunden bei 4 - 10º C gegen destilliertes Wasser dialysiert, und das reine Allergen wird durch Lyophilisieren des nicht dialysierbaren Retentats zurückgewonnen.
Während der Desorption kann eine Denaturierung des Enzyms erfolgen, die eine Verringerung der meßbaren katalytischen Eigenschaften verursacht; dies verringert nicht den Wert des Allergens, weil es dennoch als ein biologisch aktives Antigen aktiv bleibt und als solches mit jeder der gängigen immunobgischen oder allergologischen Techniken detektierbar bleibt.

Beispiel I

In einem vorbereitenden Screening-Experiment wurden elf Staubproben auf die Beziehung zwischen RAST-Inhibierungsstärke und Enzymaktivität gegen das chromogene Tripeptid-Substrat H-D-Isoleucyl-L-Prolyl-L-Arginin-p-Nitroanilid-di-HCl. (= I.P.A.) untersucht. Proben von trockenem Staub wurden durch Staubsaugen aus einzelnen Häusern in den Niederlanden gesaminelt. Die Extrakte wurden hergestellt, indem exakt 1 g der Staubprobe abgewogen und über Nacht mit 5 ml Puffer bei +4º C auf einer Rollbank extrahiert wurde. Der für die Extraktion und die Herstellung der Verdünnungen verwendete Puffer bestand aus einem Teil Phosphatpuffer 0,1 m, pH 7,4 und 9 Teilen 0,9 %iger NaCl in destilliertem Wasser, und die Lösung wurde auf 0,01 % Natriumazidgehalt und 0,5 % an dem Detergenz Tween- 20 gebracht. Nach dem Zentrifugieren wurde der klare Überstand eingefroren bei -20º C aufbewahrt. Vor der Analyse wurden die Proben bei Raumtemperatur aufgetaut und nochmals zentrifugiert, woraufhin Aliquot-Proben des Extraktes sorgfältig aus der überstehenden Flüssigkeit abpipettiert wurden.
Für die Radio-Allergo-Sorbent-Test (RAST)-Inhibierung wurden 50 µl-Aliquots von gesammelten menschlichen, Milben-RAST-positivem Serum (verdünnt 1: 5,5) in Plastikrundbodenröhrchen mit Reihenverdünnungen der Extrakte auf ein Gesamtendvolumen von 100 µl vermischt. Die Mischungen wurden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und danach über Nacht bei +4º C belassen. Zu jedem Röhrchen wurde dann eine Papierscheibe von 5 mm Durchmesser zugegeben, die mit Hilfe von Cyanbromid an den Gesamtextrakt einer Kultur der Hausstaubmilbe Dermatophagoides Pteronyssinus gebunden worden war (Scheiben kommerziell erhalten von Pharmacia AB, Uppsala, Schweden, Code d1, Ansatz Nr. 7784). Nach 3 Stunden Inkubieren bei Raumtemperatur und einem nachfolgenden Waschschritt wurden die IgE-Antikörper, die aus der Serumprobe auf den Scheiben fixiert waren, durch Inkubieren mit radioaktivem Anti-IgE, gekauft von Pharmacia AG, Uppsala, Schweden, gemessen. Nach einem weiteren Waschschritt wurde schließlich die fest an die Scheiben gebundene Radioaktivität in einem Gammazähler bestimmt. Es wurden Graphen von den Hausstaubextrakt-Verdünnungen gegen den Prozentsatz der Radioaktivität in dem an die Scheiben gebundenen Testsystem aufgetragen, aus welchen die Verdünnung, die 50 % Inhibierung der IgE-Bindung verursacht, durch Interpolation gefunden wurde. Die Werte wurde umgerechnet auf ml an Extrakt aus der ursprünglichen trockenen Staubprobe, die 50 % RAST-Inhibierung bewirkten, korrigiert um aspezifische Bindung an Reagenz.
In den Extrakten dieser Proben wurde die proteolytische Enzymaktivität getestet indem 300 µl des Extraktes zusammen mit 600 µl Tris-(Hydroxymethyl-)Aminomethan (TRIS)-HCl-Puffer (0,1 in pH 8,4) und 25 µl einer Lösung des synthetische chromogenen Tripeptidsubstrats H-D-Isoleucyl-L-Prolyl-L-Arginin-p-Nitroanilid-di-HCl (= I.P.A.) in Quarzküvetten mit 0,1 cm Lichtweg pipettiert wurden, die in den thermostatisierten (37º C) Halter eines Aufnahmespektrophotometers eingesetzt waren. Die enzymatische Umwandlung des Substrats wurde durch Analyse der Reaktionsgeschwindigkeit verfolgt, wobei die optische Dichte (E) bei 405 nm des freigesetzten p-Nitroanilin (pNA)-Reaktionsprodukts je Minute aufgezeichnet wurde. Das Inkrement der optischen Dichte in dem linearen Bereich der Geschwindigkeitskurve wurde in der dritten Minute als ΔE aus der Geschwindigkeitsaufzeichnung abgelesen und als Grundlage für die Berechnung der enzymatischen Potenz verwendet; für die sehr dunkel gefärbten Extrakte wurde eine Blindprobe genommen, die 100 µl Extrakt in der Blindprobe enthielt (kein Substrat), wobei die enzymatische Aktivität aus der Reaktionsgeschwindigkeit in der ersten Minute berechnet wurde. Die Ergebnisse wurden in mU/ml des Extrakts ausgedrückt, d.h. mU/0,2 g des ursprünglichen trockenen Staubs unter Verwendung eines Umwandlungsfaktors von 210. Die Vergleichsdaten sind in Tabelle A gezeigt.
Tabelle A. Ergebnisse der Analyse durch RAST-Inhibierung und Enzymaktivität gegenüber dem chromogenen Tripeptidsubstrat I.P.A. in Extrakten von 11 verschiedenen in den Niederlanden gesammelten Hausstaubproben. Tabelle A

Zusammensetzung der Reagenzien

TRIS-Puffer: 12,1 g Tris- (Hydroxymethyl-)Aminomethan und 6,2 g NaCl werden in 800 inl destilliertem H&sub2;O aufgelöst; die Lösung wird durch tropfenweise Zugabe von 1 n HCl auf pH 8,4 gebracht und dann auf exakt 1000 ml eingestellt.
H-D-Isoleucyl-L-Prolyl-L-Arginin-p-Nitroanilid-di HCl, (= I.P.A.), spezifisch für trypsinartige Serinproteasen, Molekulargewicht = 577,6, 25 mg lyophilisiertes Produkt aufgelöst in 7,2 ml destilliertem Wasser (1,5 µMol/ml). Die Lösung ist über 2 Monate bei +4º C stabil.

Berechnung

Ein Umrechenfaktor wurde berechnet aus (313 x 0,2)/1000 = 0,0626. Das Extinktionsinkreinent ΔE in der 3. Minute wurde aus der Aufzeichnung abgelesen und das Ergebnis in mU je Menge an trocknern allergenen Material in der Testlösung wurde als ΔE x 1000 x 0,0626 berechnet. Schließlich wurde die Zahl an mU pro mg an allergenen Material berechnet.

Bewertung

Aus diesen vorausgehenden Daten wurde ein Graph konstruiert, der für diese beschränkte Zahl von Proben eine gute Korrelation zwischen den Parametern zeigt, d.h. eine positive Korrelation zwischen der RAST-Inhibierungsstärke der Staubprobenextrakte und der esterolytischen Aktivität gegen das spezifische chromogene I.P.A.-Serinproteinasesubstrat. Die Formel für die lineare Regressionskurve und den Korrelationskoeffizienten sind in Figur 1 gezeigt.

Beispiel II

Durch Staubsaugen wurden aus 74 einzelnen Häusern in den Niederlanden Proben von trockenem Staub gesammelt. Es wurden Extrakte hergestellt, indem exakt 1 g der Staubprobe abgewogen und über Nacht mit 5 ml Puffer bei +4º C auf einer Rollbank extrahiert wurden. Der für die Extraktion und für die Zubereitung der Verdünnungen verwendete Puffer bestand aus 1 Teil Phosphatpuffer 0,1 in pH 7,4 und 9 Teilen 0,9 % NaCl in destilliertem Wasser; die Lösung wurde auf einen Gehalt von 0,01 % Natriumazid und 0,5 % des Detergenzes Tween 20 gebracht. Nach dein Zentrifugieren wurde der klare Überstand eingefroren bei -20º C gelagert. Vor den Analysen wurden die Proben bei Raumtemperatur aufgetaut und wiederum zentrifugiert, woraufhin Aliquot-Proben des Extraktes sorgfältig aus den überstehenden Flüssigkeiten abpipettiert wurden.
Für die Radio-Allergo-Sorbent-Test (RAST)-Inhibierung und den Test der proteolytischen Enzymaktivität gegenüber dem synthetischen chromogenen Tripeptidsubstrat I.P.A. wurden die gleichen Arbeitsschritte durchgeführt wie unter Beispiel I beschrieben. Zusätzlich wurden die folgenden Testkits verwendet für die Bewertung der enzymatischen Aktivität der Extrakte gegenüber dein chromogenen tripeptidischen glandulären Kallikreinsubstrat H-D-Valyl-L-Leucyl-L-Arginin-p-Nitroanilid-di HCl (= V.L.A., Molekulargewicht = 579,6; 25 mg aufgelöst in Phosphataseenzymsubstrat p-Nitrophenylphospat pNA.
Für die Kallikreine wurden 50 µl der allergenen Extraktlösung (1 mg/ml) in die Mulden eines Polystyrol-Microtiterstreifens zusammen mit 140 µl TRIS-HCl-Puffer, pH 8,2, und 10 µl V.L.A.- Lösung pipettiert. Die Streifen wurden 30 Min. bei 37º C in einem Inkubator aufbewahrt, wonach die Reaktion durch Zugabe von 50 µl 50 %iger Essigsäure gestoppt wurde. Die optischen Dichten in jeder Vertiefung wurden dann bei 410 nm in einem Mikrostreifen-ELISA-Auslesegerät im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollproben gelesen. Die Tests wurden doppelt durchgeführt.
Für die saure Phosphatase war das Protokoll wie folgt: 50 µl von dem allergenen Extrakt oder Standard-Referenzenzymlösung wurden jeweils in die Vertiefungen eines flachbodigen Polystyrol-ELISA-Streifens pipettiert, gefolgt von 100 µl p NA (30,4 mM in 0,05 m Zitronensäurepuffer pH 4,9). Die Reaktion wurde min. bei 37º C in einem Inkubator ablaufen gelassen und wurde dann durch pipettieren von 50 µl 1 n NaOH in jede Vertiefung mittels einer Vielkanalpipette beendet. Die optischen Dichten der gefärbten Reaktionsprodukte in den Vertiefungen wurden dann bei 410 nm in einem ELISA-Lesephotometer gemessen und mit Hilfe einer mit einem käuflichen Standardpräparat hergestellten Kalibrierungskurve ausgewertet.
Die kombinierten analytischen Daten sind in Tabelle B aufgelistet. In allen Tests war eine Kontrollprobe von 50 µl ohne Substrat aber stattdessen mit Puffer eingeschlossen, um die (oft ausgeprägte) Hintergrundfarbe des Extrakts selbst zu korrigieren.
Tabelle B. Ergebnisse der RAST-Inhibierung, Protease (I.P.A., V.L.A.) und saure Phosphatase (A.P.) Test in 74 Staubproben. Tabelle B
* Testsystem in Röhrchen; Werte in Klammern wurden in Mikrotiterplatten bestimmt: 50 µl der Probe (= 50 µg), 140 µl Tris-HCl-Puffer pH 8.3, 10 µl Substrat inkubiert über 5 min. bei 37ºC; die Reaktion mit I.P.A. ist unter diesen Bedingungen sehr schnell.
Die Ergebnisse für die RAST-Inhibierung gegen die I.P.A.-Aktivität sind in Figur 2 gezeigt, zusammen init der linearen Regressionskurve und dem Korrelationskoeffizienten. Der Spearman-Rank-Korrelationseffizient betrug 0,421 (N = 59, P > 0,01).
Es besteht daher eine signifikante Korrelation zwischen der RAST-Inhibierungsstärke und der (trypsinartigen) amidolytischen Aktivität, die sich aus den Staubproben extrahieren läßt: je höher die Enzymaktivität auf I.P.A., um so weniger Material wird für 50 %ige RAST-Inhibierung benötigt, was bedeutet, daß die Enzymaktivität und die IgE-bindenden Allergene positiv korreliert sind. Diese Korrelation ist wesentlich besser als die zwischen der Milbenzahl und der RAST-Inhibierung oder zwischen der RAST-Inhibierung und dem in den Proben festgestellten Guaningehalt (Bronswijk JEMH van, Reumer JWF, Pickard R. Exp Appl Acarology 1987; 3: 271-8).
Der Korrelationskoeffizient zwischen log 50 % RAST-Inhibierung und der enzymatischen Aktivität des Kallikreinsubstrates V.L.A. war nur 0,35 (0,01 < P < 0,025) was anzeigt, daß die allergenen Enzyme im Hausstaub größtenteils aus Insekten- oder Arthropoden (Milben)-Exkreten stammen. Die Korrelation zwischen der sauren Phosphataseaktivität und log 50 % RAST- Inhibierung in den Staubprobenextrakten ist graphisch in Figur 3 gezeigt (Korrelationskoeffizient r = 0,61, P < 0,001; Spearman-Rank-Korrelationsdaten: N = 45, r = 0,573, P < 0,002).
Sowohl die Protease- als auch die saure Phosphataseaktivitäten sind demnach mit der RAST-Inhibierungsstärke der Staubextrakte korreliert, und beide Parameter sind demzufolge was das allergene Potential betrifft relevant. Die statistischen Korrelationen implizieren jedoch nicht notwendigerweise, daß die Enzymaktivitäten in den einzelnen Staubproben parallel verlaufen müssen. Die statistischen Daten in dem Streuungsdiagramm von Figur 4 zeigen einen Korrelationskoeffizienten (für 2 unabhängige Parameter) von r = 0,46, Spearman-Rank-Korrelationskoeffizient r = 0,495 (N = 45). Diese Egebnisse zeigen an, daß die Proteinase- und Phosphataseaktivitäten im Hausstaub nicht strikt korrelieren und daher nicht aus der gleichen Quelle stammen müssen, daß da jedoch eine Tendenz bestehen kann für Allergene tierischer (d.h. arthropodischer) Herkunft, sich in Substraten, die relativ reich sind an pflanzlichen Nahrungsmittelkomponenten, zu akkumulieren. Für eine adequate Abschätzung der allergenen Belastung in Staubproben müssen daher beide enzymatischen Aktivitäten nebeneinander getestet werden.

Beispiel III

Die chromogenen Tripeptidsubstrate für Serinesterasen, die in den Beispielen I und II angewendet wurden, sind die bevorzugt in Testkits zu verwendenden Reagenzien, weil sie ziemlich stabil sind, sowohl in gepufferter Lösung als auch im trockenen Zustand. Es können jedoch auch einfachere und ökonomischere Substrate verwendet werden, z.B. die Verbindung N-α-Benzoyl- DL-Arginin-p-Nitroanilid HCl (BAPNA, M = 434,89) die in ähnlicher Weise p-Nitroanilin pNA bei enzymatischer Hydrolyse durch trypsinartige Proteasen produziert. Ihr Hauptnachteil jedoch ist eine geringere Stabilität und Lagerbeständigkeit als I.P.A., was die tägliche Herstellung von frischen Lösungen aus dem trocknen Produkt notwendig macht. Das BAPNA, das in den in Beispiel III aufgezeichneten Experimenten verwendet wurde, wurde von British Drug Houses Inc. (BDH), Poole (Great Britain) gekauft.
Es wurde eine geeignete Mikrotiter-Testtechnik mit BAPNA ent wickelt, indem (pro Mulde in einem Polystyrolmikrotiterstreifen) 50 µl Allergenlösung (bei 1 ing lyophilisiertem nicht dialysiertein Extrakt pro ml) in TRIS-HCl-Puffer (oder einer Verdünnungsreihe von Bovin-Trypsin 50 µg/ml in 0,001 n NaOH), 100 µl 0,1 in TRIS-HCl-Puffer pH 8,3 mit 0,01 m CaCl&sub2;, 60 µl BAPNA-Lösung (20 mg/460 µl Dimethylsulfoxid (DMSO); 1 : 100 verdünnt in TRIS-Puffer) verwendet wurde. Die Streifen wurden mit einem Parafilm -Blatt abgedeckt und 30 min. bei 37º C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 40 µl 50 %iger Essigsäure zu jeder der Mulden beendet, und die optischen Dichten wurden schließlich in einem ELISA-Leser bei 410 nin ausge-lesen. Die Aktivitäten der allergenen Präparate wurden durch Intrapolation an einer Kalibrierungskurve, die mit kristallinem Bovintrypsin und BAPNA erzeugt worden war, in Trypsin-Äquivalenten ausgedrückt.
Ein Vergleichsversuchs-Experiment an 10 Staubproben, wie in Tabelle C aufgelistet, zeigt, daß die Ergebnisse mit den zwei Substraten I.P.A. und BAPNA tatsächlich gut korreliert sind (Spearman-Rank-Korrelationskoeffizient r = 0,852, 0,0001 < P < 0,005), so daß beide zum Zwecke des Testens der allergenen Aktivität von Hausstaubextrakten geeignet sind.
Tabelle C. Ergebnisse der RAST-Inhibierung, I.P.A. und BAPNA- Tests in Mikrotiterstreifen in 10 Extrakten von unterschiedlichen Staubproben. Tabelle C

Andere mögliche Substrate:

Im Verlauf dieser Untersuchungen wurden eine Anzahl anderer Verbindungen für die Anwendung als Substrate für Serinesterasen mit Relevanz für die allergene Aktivität untersucht. Diese betrafen:
N-α-Benzoyl-L-Arainin-Ethylester HCl (BAEe), das bei der Hydrolyse Ethanol und H&spplus;-Ionen produziert. Diese Verbindung erwies sich als sehr wertvoll für die Messung der enzymatischen Aktivität von Staubextrakten mit Hilfe eines pH-Staten-Tests und erzeugt Ergebnisse, die mit den kolorimetrischen I.P.A. und BAPNA-Tests, die in Beispielen II und III gezeigt sind, gut korreliert waren; jedoch ist das Substrat in Lösung ziemlich unstabil.
N-α-Benzoyl-DL-Arginin-β-Naphthylamid HCl (BANA), ein chromogenes Substrat für Enzyme mit Trypsinspezifität. Die Verbindung produziert bei der Hydrolyse β-Naphthylamin, das nachfolgend mit einer Fastfärbung diazotiert werden kann, um ein erkennbar (rot oder blau) gefärbtes Reaktionsprodukt zu ergeben.
H-D-Valyl-Leucyl-Lysine-p-Nitroanilid 2 HCl (V.L.L., M = 551,5) das eine etwas andere (Plasmin) Spezifität als I.P.A. und V.L.A. besitzt. Die Hydrolyse dieses Substrates durch Enzyme in Pollenextrakten ist in Beispiel IV gezeigt.
D-Tosyl-L-Argininmethylester (TAMe), ein spezifisches Substrat für (chymo)trypsinartige Enzyme in Staubproben. Die enzymatische Hydrolyse produziert Methanol und H&spplus;-Ionen; das freigesetzte Methanol kann kolorimetrisch mit chromotroper Säure und konzentrierter H&sub2;SO&sub4; getestet werden. Alternativ können die freigesetzten H&spplus;-Ionen in einem kinetischen pH-Statentest gemessen werden. Dieses Produkt ist unstabil, eine Lösung hat eine Lagerungslebensdauer von 1 Tag.
Synthetische (Tri-)Peptid 4-Methylcoumarin- (oder -Umbelliferon)-Amide als fluorogene Substrate zur Messung der enzymatischen Spaltprodukte durch Fluoreszenzabgabe.
Die chromogenen Naphthylamid- und Nitroanilidsubstrate, aber nicht die BAEE oder TAMe-Ester werden enzymatisch zu Reaktionsprodukten hydrolysiert, die relativ einfach in rote oder blaue gefärbte Pigmente durch Diazotierung überführt werden können. Anstelle der kolorimetrischen Verfolgung der Reaktion ist es deshalb auch möglich, die enzymatische Umwandlung in einem oder auf einem festen (Stärke oder Cellulose-) Träger ablaufen zu lassen, um als halbquantitative "Tauch"-Teststreifen zu dienen. Außerdem sind diese chromogenen Tripeptide recht geeignet für die Verwendung in automatisierten analytischen Testsystemen.

Beispiel IV

Tabelle E. Enzymatische Aktivität von hoch allergenein Material aus Tiersekreten und -exkreten, getestet auf die hochgereinigten Hauptallergene oder die gesamten nicht dialysierbaren lyophilisierten Präparate HMWT mit dem glandulären Kallikreinsubstrat V.L.A. Tabelle E
Diese Analysen zeigen, daß die allergenen Tiersekrete deutliche (Gewebe)-Kallikreinaktivität zeigen, die mit den Hauptallergenen koinzidiert. Die Insektenexkrete sind weit potenter, sogar auf V.L.A., weil diese weitgehend Enzyme mit Trypsin- und Chymotrypsinspezifität sind, die das V.L.A.-Tripeptid gleichermaßen spalten.

Beispiel V

Tabelle F. Enzymatische Umwandlung des chromogenen Tripeptidsubstrats V.L.A. durch hochallergene Präparate aus ganzen Kulturen oder sauberen Körpern von Hausstaubinilben der Spezies Dermatophagoides. Tabelle F
Die Enzymaktivität der Milbenzubereitungen wurde auch mit BAPNA und mit I.P.A. auf Proteaseaktivität in Relation zur sauren Phosphataseaktivität in einem Mikrotiterplatten-Set-up, wie in Beispiel 3 angegeben, getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle G gezeigt. Tabelle G
*) je 50 µg Allergenzubereitung
**) je 20 µg Allergenzubereitung
Diese Daten bestätigen, daß die saure Phosphataseaktivität mit den ganzen Milbenkörpern verknüpft ist, während die Proetinase offenbar ausgeschieden wird und sich in dein Medium sammelt. Die saure Phosphataseaktivität scheint daher mit der Anzahl der Milben verknüpft zu sein. Es ist jedoch aus den (hier nicht gezeigten) RAST- und RAST-Inhibierungsdaten offensicht lich, daß sowohl die alkalische Phosphatase aus den Milbenkörpern als auch die Proteinase aus dein Kulturmedium Allergene sind. Test-Kits für das allergene Potential von Zimmerstaubproben muß demzufolge analytische Systeme für beide Enzyme umfassen.

Beispiel VI

Fibrinolytische Aktivität

Testsets für die quantitative Abshätzung der fibrinolytischen Aktivität allergener Extrakte wurden wie folgt hergestellt. Humanes Fibrinogen (Kabivitrum AB, Schweden, Fabrikationsnummer 57024, 80 mg) wurde in 40 ml destilliertem Wasser aufgelöst; auch wurde eine Mischung aus 1,6 % Agar (Difco Agar Noble) in VSB-Gelatinepuffer pH 7,8 gemacht. Der VSB-Gelatinepuffer bestand aus 0,05 m Veronal - Na, 0,1 in NaCl und 0,25 % Gelatine (Ionenstärke µ = 0,15) und wurde hergestellt durch Auflösen von 10,3 g Veronal-Na, 5,84 g NaCl und 2,5 g Gelatine in 1000 ml bidestiliertem Wasser und durch tropfenweise Zugabe von 1 n HCl auf pH 7,8 gebracht; 40 ml dieses Puffers wurden für die Mischung mit der Fibrinogenlösung verwendet, nachdem beide Lösungen auf 40º C erwärmt worden waren. Zu 7 ml dieser Mischung wurden dann 200 µl Test-Thrombin (20 IU/ml, Behringwerke ORHT, Deutschland, Fabrikationsnummer 506003 D) zugegeben. Die Mischung wurde auf einem Vortex-Rührer gerührt, in eine Petrischale von 8,2 cm Durchmesser gegossen und fest werden gelassen. Alle zu testenden Lösungen wurden mit 10 mg/ml in einem VSB&spplus;&spplus;-Puffer pH 7,8 angesetzt. Aliquots von 10 µl Allergenlösung (bei 10 mg lyophilisiertein Präparat je ml, außer dein WHO-D.Pteronyssinus-Standard 82/518, der eine Konzentration von weniger als 1 mg/ml hatte) wurden in Löcher pipettiert, die in der Fibrin-Agar-Schicht ausgestochen worden waren, und die Petrischalen wurden bei Umgebungstemperatur 48 Stunden, oder bei 37º C über 24 Stunden, stehen gelassen. Der freigelegte Durchmesser wurde dann unter Dunkelfeldbeleuchtung in mm gemessen und das Ergebnis quadriert. Eine Standardkurve wurde mit kristallinein Bovin-Trypsin (Sigma Chemical Corporation, U.S.A.) im Bereich von 25 bis 200 ng Trypsing je 10 µl pro Mulde aufgestellt. Die Ergebnisse mit den allergenen Präparaten wurden auf diese Kurve gelesen und in µg-Äquivalenten Trypsin/mg Allergenzubereitung ausgedrückt.

Pufferzusammensetzung

VSB: Löse 41,5 g NaCl und 5,1 g Veronal-Na (= Natrium-5,5- Diethylbarbiturat) in 750 ml destilliertem Wasser. Bringe auf pH 7,35 mit etwa 17 ml 1 n HCl und fülle mit destilliertem Wasser auf 1000 ml auf.
VSB&spplus;&spplus;: VSB auf etwa 800 ml, füge 5 ml einer Lösung aus 10,16 g MgCl&sub2;.6 H&sub2;O (0,5 m) und 2,46 g CaCl&sub2;.2 H&sub2;O oder 1,665 g CaCl&sub2;. 0 H&sub2;O (0,15 m) in 100 ml destilliertem Wasser zu. Fülle auf 1000 ml mit destilliertem Wasser auf.
Beides sind Vorratslösungen. Zur Verwendung wird die Vorratslösung 5 x mit destilliertem Wasser verdünnt, um die Arbeitslösung mit einer Ionenstärke von µ = 0,149 zu erhalten.
Die mit einigen repräsentativen allergenen Zusammensetzungen erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle H aufgeführt. Wie zu erwarten war, gab es keine Korrelation zwischen der Reaktivität einiger kallikreinartiger Allergene gegenüber dein Tripeptidsubstrat V.L.A. und ihrem fibrinolytischen Potential, das im wesentlichen eine trypsinartige Spezifität ist (unpaired t - Testwert - 0,04, P > 0,4).
Tabelle H. Fibrinolytische Aktivität einiger wichtiger Allergenzubereitungen. Tabelle H
Die stärksten fibrinolytischen Enzyme werden demzufolge unter den Exkretionsprodukten gefunden, die in ganzen Kulturen von Milben und Insekten enthalten sind, welches hauptsächlich trypsinartige Enzyme sind, die mit dein chromogenen I.P.A.-Tripeptidsubstrat zu messen sind.
In den nachfolgenden Beispielen wird Bezug genommen auf Figuren 5 bis 17. Diese Figuren werden auch in der "Legende für die Figuren 5 bis 17" direkt vor den Ansprüchen erläutert.

Beispiel VII

Isolierung trypsinartiger Enzyme aus Kulturen von Dermatophagoides Pteronyssinus und Identität mit dem Hauptallergen "D per I".

1. Isolierung des Hauptallergens D per I nach Chapman und Platts-Mills

D.pteronyssinus Organismen wurden auf einer Mischung aus gewaschenen menschlichen Hautschuppen und getrockneten Hefezellen über etwa 3 Monate angezüchtet. Nach dieser Zeit wurde die ganze Kultur 30 min. auf 60 ºC erhitzt und pulverisiert. Das Präparat wurde kommerziell erhalten (HAL Laboratories, Niederlande, Ansatz Nr. DP 801) und wurde unter vierstündigein Rühren bei 4 ºC in Phosphat- Salzpuffer, der 10&supmin;³ % Natriumazid + 0,5 % Tween-20 enthielt, extrahiert. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Rückstand über Nacht mit demselben Extraktionsmittel nochmals extrahiert. Die zusammengenommenen Überstände wurden 4 Stunden gegen destilliertes Wasser aus einem Visking-Dialyseschlauch (Exklusionsgrenze 10.000 Dalton) dialysiert. Der nicht dialysierbare Teil des Retentats HMWT wurde schließlich durch Lyophilisieren getrocknet.

a. Gelfiltration

Eine chromatografische Säule wurde hergestellt aus Sephadex G100 (90 x 1,6 cm) in boratgepufferter Salzlösung (BBS, 0,01 m Boratpuffer pH 8,0 in 0,9 % NaCl). Eine Lösung aus 25 mg HMWT in 1 ml BBS wurde oben auf das Gel aufgegeben und die Säule wurde dann mit demselben Puffer perkoliert. Es wurden automatisch mit einem Fraktionssammler Volumen von 6 ml gesammelt, und der Auslauf wurde fortlaufend auf UV-Adsorption bei 280 nin als einem Parameter für den Proteingehalt überwacht. Die Umwandlung des chroinogenen Tripeptidsubstrats D-Isoleucyl-L-Prolyl-L- Arginin-p-nitroanilid-di HCl (IPA) wurde in Röhrchen vermessen, indem 0,3 ml-Aliquots jeder Eluatfraktion abgenommen wurden und 0,6 ml Puffer und 25 µl Substratlösung (= 1,5 µMol/ml) zugegeben wurden. Die Reaktion wurde bei 410 nm auf einem Aufnahme-Spectrophotometer verfolgt und das OD-Inkrement in der dritten Minute wurde für die Berechnung verwendet. Die Position des Enzympeaks wurde aus einer in Figur 5 gezeigten grafischen Darstellung bestimmt. Nach der Anleitung aus diesem Plot, wurden drei Sammelfraktionen (Pools) gebildet, wie in der Legende zu dieser Figur angegeben, die gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert wurden. Es wurden drei Durchläufe gemacht, mit 25 ing Beladung bei jedem Durchlauf. Die Gesamtausbeuten waren: SI = 44 mg, der Enzympeak SII = 18 mg (24 % HMWT), SIII = 27 mg, Gesamtrückgewinnung 119 % (wegen der Hygroskopizität der gefriergetrockneten Fraktion III). Bei einer Wiederholung dieser Experimente, wurde die gleiche Enzymverteilung festgehalten und die Gesamtausbeuten aus 75 mg HMWT waren SI = 26 Gesamtrückgewinnung von 66 %. Es wurden RAST-Inhibierungsversuche mit Reihenverdünnungen des Ausgangs-HMWT- Produktes und den drei S-Fraktionen durchgeführt gegenüber 50 µl-Proben verdünntem menschlichen milbenallergischen Blutserum, unter Verwendung von kommerziellen milbenallergen-beschichteten Scheiben und radioaktiven Anti- IgE-Reagenzien nach Anleitung des Herstellers (Phamacia AB, Uppsala, Schweden). Die Ergebnisse sind in Figur 6 gezeigt.
Die Verhältnisse für 50 %ige RAST-Inhibierung waren HMWT: SI: SII : SIII = 0,13 : 7,94 : 0,25 : 7,94 in der Reihenfolge der Potenz (Reziprokwerte) 7,7 : 0,13: 4,0 : 0,13 oder 59 : 1 : 31 : 1
Die Verhältnisse für das amidolytische Potential waren HMWT: SI : SII : SIII = 128 : 16 : 438 : 18 oder 8 : 1 : 27 : 1

b. Pevikon-Block-Elektrophorese

Die chromatografische Pool-SII-Fraktion wurde dann durch Pevikon-Block-Elektrophorese getrennt. In die Plastikschale einer horizontalen Elektrophoresekammer wurde eine Pevikon-Suspension in 0,1 in Veronalpuffer pH 8,6 gegossen, um einen 24 x 13 x 0,6 cm, von zwischen Plastikkanten begrenzten Block zu ergeben. Der Kontakt wurde mit demselben Puffer in der Elektrodenschale mit Hilfe von zwei Whatman-Nr.3-Filterpapierstreifen (13 x 15 cm) gebildet, die mit demselben Puffer vollgesogen waren. Eine Probe von 12 ing der Sephadex-Fraktion SII in 120 µl Puffer wurden in zwei Schlitze des Pevikon-Blocks appliziert, von denen jeder mit 60 µl der Lösung befüllt wurde. Der Elektrophoreselauf wurde bei 4 ºC über 22 Stunden bei 250 Volt Gleichstrom durchgeführt (der Strom stieg von insgesamt 22 mA zu Beginn auf 40 mA am Ende des Durchlaufs an). Nach der elektrophoretischen Trennung wurde der Block init einem scharfen Messer in 22 Sektionen von je 1 cm Breite aufgeteilt. Jeder Bereich wurde in ein Teströhrchen überführt, das 1 ml 0,1 in Tris-HCl-Puffer pH 8, 4 enthielt, überführt. Die sich ergebende Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand entfernt; nach Waschen des Rückstands mit 1 ml Trispuffer wurden der Überstand und die Waschflüssigkeit zu den Pevikon-Blockeluaten zusammengenommen. Die enzymatische Aktivität der Eluate wurde mit I.P.A. als Substrat bestimmt; außerdem wurde die optische Dichte der Eluate direkt in einem Spectrophotometer bei 280 nm gemessen, um einen Rahmen für den Proteingehalt zu liefern. Ein repräsentatives Trennungsprofil ist in Figur 7 gezeigt. Nach Anleitung dieses Profils wurden die Eluate in drei Fraktionen gesammelt, wie in der Legende zu dieser Figur angegeben; diese wurden dialysiert und durch Lyophilisieren getrocknet. Die Ausbeuten waren: SIIP1 = 1,2 mg, SIIP2 = 7,0 mg und SIIP3 = 6,9 mg. Die SIIP2-Fraktion hatte eine Aktivität gegenüber I.P.A. von 595 mU/mg, d.h. eine 36 %ige Zunahme der spezifischen Aktivität gegenüber der Ausgangsfraktion SII.
Die Fraktionen SIIP2 und SIIP3 wurden auch mit direkten intradermalen Hauttests (50 µl i.d.) an milbenallergischen Asthmapatienten untersucht. Die Fraktion SIIP2 erzeugte im nativen Zustand positive Hautreaktionen bei 0,1 µg/ml und besaß unverminderte Aktivität nachdem sie über 10 min. bei 100 ºC gehalten worden war; Fraktion SIIP3 erzeugte ebenfalls positive Hautreaktionen, aber nur bei 1,0 µg/ml, d.h. sie war 10 mal weniger potent. Demnach sind sowohl die IgE-Bindungspotenz als auch die Hautreaktivität mit der Enzymzubereitung verknüpft, benötigen aber keine intakte Tertiärstruktur und funktionale Integrität des Enzyms.

c. Isoelektrische Fokussierung

Der Enzympool SIIP2 (6,0 mg) wurde schließlich durch präparative isoelektrische Fokussierung aufgetrennt, im wesentlichen nach Chapinan und Platts-Mills (J. Immunol. 1980; 125: 587-92) in einem in einer Plastiksäule ausgebildeten Saccharosegradienten (Multiphor, LKB, Schweden). Das Material wurde mit 110 ml destilliertem Wasser vermischt, in welches 2,25 ml eines Ampholinkonzentrats pH 3,5 - 10 als "leichte" Lösung gegeben worden war. Für die "schwere" Gradientenlösung, wurde das gleiche Volumen Ampholinkonzentrat mit 75 ml destilliertem Wasser gemischt, das 50 g Saccharose enthielt. Die elektrophoretische Fokussierung wurde weiter nach den Angaben des Herstellers durchgeführt (LKB, Schweden), bei 500 Volt Gleichstrom und 4,2 mA über 24 Stunden bei 4 ºC. Das Eluieren wurde dann mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min. durchgeführt. Fraktionen von 4 ml wurden automatisch gesammelt und die Eluate wurden auf ihre UV-Absorbtion bei 280 nm, Enzymaktivität gegenüber I.P.A. und pH-Wert überwacht. Ein repräsentatives Trennmuster ist in Figur 8 gezeigt, welches zeigt, daß das Allergen P1 in einem gereinigteren Zustand als bei der klassischen P1-Präparation erhalten werden kann.
Diese Experimente zeigen klar, daß die als "Allergen P1" (Molekulargewicht = 24.000 Dalton) bekannten Hauptproteinkomponenten aus Kulturen von Dermatophagoides pteronyssinus während der Isolierungsuntersuchungen nicht von den Hauptserinproteinaseenzymen unterschieden werden können, wie sie durch amidolytische oder esterolytische Tests aufgezeigt werden. Da diese Verfahren weder komplizierte Hauttests an menschlichen Allergikern erfordern, noch schwierige Antikörpertests an ihren Blutseren, stellt diese Entdeckung einen wichtigen Fortschritt bei der Isolierung und Standardisierung von Staubmilbenallergenen dar.
Für die weitere Charakterisierung des allergenen Enzyms wurden eine Reihe von physikochemischen Parametern bestimmt. Es wurde gefunden, daß das allergene Staubinilbenenzym P1 stark inhibiert wird durch den pankreatischen Proteaseinhibitor Trasylol und durch die Verbindungen Benzamidin, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (SBTI) und Limabohnen-Trypsin-Inhibitor (LBTI). Normales oder allergisches menschliches Blutserum inhibierte nur teilweise die esterolytische Aktivität des Enzyms. Die Molekulargröße des allergenen Enzyms wurde aus Ultrazentrifugation und durch Molekularsieben auf kallibrierten Sephadex- Chromatographiesäulen auf 20 - 25.000 Dalton abgeschätzt (Bovin-Trypsin MG = 24.000 Dalton); die Molekulargröße des Allergens P1 war gleichermaßen mit 24.000 Dalton angegeben worden. Das Enzym zeigt amidolytische und esterolytische Aktivität gegen synthetische Substrate wie I.P.A. und N-p-Tosyl-L-Argininmethylester (TAMe), ist aber auch fähig (denaturierte) Proteine und Fibrin zu hydrolisieren. Das pH-Optimum war recht breit bei pH 8-10 und das Temperatur-Optimum für die enzymatische Aktivität wurde bei 53 ºC bestimmt. Das Enzym ist extrem labil in verdünnter Lösung, wahrscheinlich aufgrund von Adsorption an der Glaswand; es ist auch unstabil in konzentrierterer Lösung, wahrscheinlich aufgrund von Selbstverdauung.
Diese Eigenschaften bestätigen die Natur des allergenen Verdauungsenzyms als einer trypsinartigen Serinesterase, die von den Milbenorganismen ausgeschieden wird.

2. Isolierung von Hauptallergenkonzentrat durch Säulenchromatografie auf Sephacrylgelen

a. Extraktion einer Dermatophagoides pteronyssinus-Kultur auf einer Mischung aus menschlichen Schuppen und getrockneter Hefe

Eine Menge von 1.994 mg trockenen Rohmaterials von hitzeabgetöteten Milben, gezogen auf ausgewaschenem Menschenhaarmedium (ARTU Biologicals NV, Niederlande, Fabrikationsnummer DP 85) wurde unter Rühren über 4 Stunden bei 4 ºC in einer Lösung aus 50 ml 0,1 in Phosphat - 0,9 % Salzpuffer pH 7,4 (PBS) + 10&supmin;³ % Natriumazid + 0,5 % Tween -20 extrahiert. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Rückstand über Nacht mit 60 ml desselben Extraktionsmittels nochmals extrahiert. Ein Teil der zusammengenommen Überstände (= 110 ml) von 10 ml wurde eingefroren als Referenzdokument bei -20 ºC aufbewahrt. Die verbleibenden 100 ml an Überstandsextrakt wurden 4 Stunden gegen 2 x 200 ml destilliertes Wasser aus einem Visking-Dialyseschlauch (Exklusionsgrenze 10.000 Dalton) dialysiert. Der nicht dialysierbare Retentat-Teil HMWT wurde weiter erschöpfend dialysiert gegen 2 x 1 l Wasser und schließlich durch Lyophilisieren getrocknet, um 152 ing an rohem Allergenprodukt HMWT zu ergeben, d.h. 7,6 % der rohen Kultur. In einem zweiten Extraktionsansatz war die Ausbeute an HMWT 12 %.

b. Isolierung der Proteasefraktion

Eine Menge von 100 mg des allergenen HMWT-Produkts wurde in 3 ml PBS pH 7,4 (das keine Azid- oder Tween -Additive enthielt) aufgelöst und oben auf eine Säule aus Sephacryl S-200-Gel (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) aufgegeben, die in demselben Puffer equilibriert war (Betthöhe 43,5 cm, ∅ 2,5 cm). Die Säule wurde dann mit der gleichen Pufferlösung perkoliert, wobei die optische Dichte des Auslaufs bei 280 nm kontinuierlich überwacht wurde und Fraktionen von 6,4 ml Volumen automatisch als Eluate gesammelt wurden. In den Eluaten wurde die Enzymaktivität wie folgt gemessen:
50 µl Fraktion + 140 µl Tris(hydroxymethyl)aminomethan(TRIS)-HCl-Puffer (0,1 m pH 8,3) + 10 µl des chromogenen Tripeptidsubstrates D-Valyl-L-leucyl-L-arginin-p- nitroanilid-diHCl (VLA, 1,5 µMol/ml) wurden in die Mulden einer Flachbodenmikrotiterplatte pipettiert. Die Platten wurden 10 min. bei 37 ºC gehalten und die enzymatische Reaktion wurde dann durch Zugabe von 50 µl 50 %iger Essigsäure zu jeder Mulde abgebrochen. Die optischen Dichten des Reaktionsproduktes p-Nitroanilin wurden dann einem Aufnahmephotometer zum Mikrotiterplattenauslesen bei 410 nm gegen geeignete Kontrollproben bestimmt.
Das Fraktionsierungsdiagramm und die analytischen Daten sind in Figur 9 gezeigt. Die Sammelfraktionen (Pools) aus den Eluatfraktionen wurden gemacht wie angegeben, wobei Pool I den Enzympeak ergibt und Pool II das Material von geringerem Molekulargewicht, kombiniert mit der höhermolekularen Substanz ("ex P1"). Diese Eluat-Sammelfraktionen wurden gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Lyophilisieren getrocknet. Die Ausbeuten waren: Pool I = 32 mg (= 32 % HMWT) und Pool II = 82 mg "exP1" (= 82 % HMWT). Die Enzymaktivitäten gegenüber VLA standen in dem Verhältnis HMWT: Pool I : Pool II = 10 : 50 : 1; die IgE-Bindungsverhältnisse waren ungefähr 4 : 4: 1 (Tabelle A).

3. Isolierung durch präparative Chromatofokussierung

Ein relativ schnelles präparatives Verfahren in einem Schritt für die Isolierung des allergenen Enzyms aus Milbenkulturen wird in dem folgenden Beispiel gezeigt.
Eine Glassäule (0,9 cm ∅, 30 cm Höhe) wurde mit einem Polybuffer -Austauscher PBE 94 (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) gefüllt. Die Säule wurde mit 250 ml eines "Start"-Puffers von 0,025 in Imidazol-HCl pH 7,4 perkoliert, und eine Lösung aus 25 ing D.pteronyssinus HMWT in 3 ml dieses Puffers wurde oben auf die Säule aufgegeben. Die Eluierung wurde dann mit Polybuffer 74 (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) durchgeführt, der auf pH 4,0 mit 0,5 in HCl eingestellt und 1 : 8 mit destilliertem Wasser verdünnt war. Das Eluat wurde automatisch in 3 ml Fraktionen gesammelt, die auf pH-Wert und enzymatische Umwandlung des chromogenen Tripeptidsubstrats VLA gescreent wurden. Ein repräsentatives Eluierungs- und Analysemuster ist in Figur 10 gezeigt.

4. Standardisierung

Ein großes Problem bei der Herstellung und der pharmazeutischen Wirksainkeitsbewertung von Allergenextrakten für die Diagnose und Therapie allergener Krankheiten beim Menschen betrifft ihre richtige Dosierung und Standardisierung. Derzeitige Methoden hängen von Allergenizitätstests durch direkte Hauttests bei allergischen Patienten und von der (Inhibierung der) Bindung spezifischer (IgE-) Antikörper, die in ihrem Blutserum vorhanden sind, ab. Die Entdeckung enzymatischer Eigenschaften, die mit den Hauptallergenen in solchen Extrakten verbunden sind, erlaubt nun auch einen einfachen und direkten Zugang zu dem allergenen Potential. Als Beispiel wurde eine Reihe von allergenen Extrakten hergestellt aus verschiedenen unterschiedlichen Rohmatenaichargen, die derzeit als Quellenprodukte gebräuchlich sind; diese betrafen eine D.pteronyssinus Kultur auf Rinderleberpulver, hergestellt von einem britischen Hersteller (BRL), mehrere Chargen von Kulturen auf ausgewaschenem menschlichen Schuppenpulver von einem holländischen Hersteller (ARTU), eine Zubereitung, bestehend aus mikroskopisch reinen Milbenkörpern von einer amerikanischen Firma (BIOPOL) und ein auf Milbenkulturextrakt, hergestellt von der World Health Organization, dem willkürlich 100.000 internationale Einheiten (I.U.)/mg zugeordnet waren. Für den klassischen Test durch RAST-Inhibierung wurden Seren von holländischen Asthmapatienten mit hohen Titern an spezifischen Antimilben-IgE-Antikörpern im Blutserum zusammengenommen. Für die feste Phase wurden mit kommerziellen Milbenzubereitungen gebundene Zellulosescheiben von Pharmacia AB, Uppsala, Schweden, gekauft.
Eine Vergleichsreihe von RAST-Inhibierungs-Dosis-Antwort- Kurven ist in Figur 11 gezeigt. Die spezifische Aktivität derselben Zubereitungen gegenüber dem synthetischen Sub strat VLA wurde ebenfalls bestimmt (Tabelle I). Die Ergebnisse wurden in internationale Einheiten in Bezug auf die WHO Standardzubereitung 82/518 umgewandelt. Diese Daten sind in Tabelle I aufgelistet.
Tabelle I. Amidolytische Enzymaktivität auf VLA, in mU/mg lyophilisierten Produkts (= 405/MIN x 1000 x 0,003492 x µg im Test System) und IgE-Bindungskapazität in µg für 50 %ige RAST- Inhibierung interpoliert aus Figur 7 oder in Einheiten/mg (= 1000 x 1/µg für 50 %ige Inhibierung) in der reihenfolge zunehmender Potenz. Tabelle I
Tabelle J. "Standardisierung" allergener Präparate von D.pteronyssinus durch Inhibierung der IgE-Bindung aus humanem allergischen Serum ("RAST-Inhibierung") oder durch Amidolysetest, ausgedrückt in definierten Einheitswerten von 100.000 internationalen Einheiten/mg für den WHO-Standard. Tabelle J
Korrelationskoeffizient r = 0,36 (P > 0,25), nicht signifikant
Aus diesen Ergebnissen folgt, daß die enzymatischen Eigenschaften der Hauptallergene in Extrakten von Dermatophagoides pteronyssinus als Markierung für das allergene Gesamtpotential von Extrakten aus den Exkreten, aber nicht aus den reinen Milbenkörpern, die das antigenetisch unterschiedliche, geringere Allergen D per II enthalten, verwendet werden können. Da die enzymatischen Eigenschaften von einer intakten und thermolabilen Tertiärstruktur abhängig sind, während die Hautreaktivität und die IgE-Bindungseigenschaften offensichtlich von der thermostabilen Sekundärproteinstruktur abhängen, folgt daraus, daß die Enzymbestimmung zum Zwecke der Standardisierung an frisch zubereiteten und kaltgelagerten Extrakten durchgeführt werden muß.

Beispiel VIII

Isolierung von allergenen Kallikreinenzymen aus der Haut (Haaren) und Urin der Hauskatze, Felix doinesticus.

Die Beispiele zeigen, daß dieses Allergen identisch oder nahe verwandt mit der Kallikreinenzymaktivität ist, die sowohl in Katzenhaar als auch Urin nachweisbar ist.

1. Isolierung von "Katzenallergen 1" (= Fel d 1) aus Katzenhaar nach Ohman et al.

a. Zubereitung des aktiven Allergenextraktes

10 Gramm acetonbehandeltes gemischtes Katzenhaarursprungsmaterial (ARTU Biologicals, Lelystad, Holland) wurde 3 mal mit je 70 ml PBS/Tween -20-Puffer, pH 7,4, extrahiert. Die zentrifugierten und zusammengenommenen Extrakte wurden aus einem Visking-Schlauch (Exklusionslimit 10.000 Dalton) über 24 Stunden gegen 3 Auswechselungen an destilliertem Wasser dialysiert, und das nicht dialysierbare Retentat wurde schließlich lyophilisiert und ergab 546 mg des HMWT-Präparats, d.h. eine Ausbeute von 5,5 % vom rohen Katzenhaar.

b. Fraktionierung

25 mg Katzenhaar-HMWT wurde in 5 ml Phosphatpuffer 0,01 in, pH 7,4, aufgelöst und auf eine 1,5 x 30 cm Chromatographiesäule gegeben, die mit DE 52 (Diethylaminoethyl-Zellulose, Whatman) gepackt und in demselben Puffer equilibriert war und wurde zunächst mit demselben Puffer perkoliert. Nach Durchlauf von 150 ml wurde die abströmende Eluierung mit demselben Puffer fortgesetzt, gemischt mit einem linearen Salzgradienten von 0,0 in bis zu 0,4 in NaCl. In den Eluatfraktionen wurde die Enzymaktivität auf VLA-Umwandlung in Teströhrchen getestet, durch Inkubieren von 200 µl der Fraktion, 700 µl 0,1 in Tris- HCl-Puffer pH 8,2, 100 µl VLA (1,5 µMol/ml) über 75 min. bei 37 ºC. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 µl 50 %iger Essigsäure abgebrochen, und schließlich wurden die optischen Dichten bei 410 nin in Mikrotiterplatten ausgelesen. Fraktionen von der Säule zwischen 0,10 m und 0,14 m NaCl wurden, entsprechend dem Enzympeak, zusammengenommen und lyophilisiert. Das gefriergetrocknete Produkt wurde in 4 ml destilliertem Wasser aufgenommen und auf eine 2,5 x 90 cm Säule von Sephadex G75 in PBS pH 7,4 aufgegeben; die Eluierung wurde mit demselben Lösungsmittel durchgeführt. Aliquotportionen der Eluatfraktionen wurden auf Enzymaktivität getestet und der entsprechende Kallikreinenzympeak wurde gesammelt. Die Säule war in einem vorausgegangen Durchlauf mit den molekularen Markern Ribonuclease A (MG = 13.700), Chymotrypsinogen A (MG = 25.000), Ovalbumin (MG = 43.000) und Dextran Blau (MG »500.000) kallibriert worden. Das Eluierungsvolumen des Katzenhaarenzyms wurde anhand der Kallibrierungskurve interpoliert und ergab ein anscheinendes Molekulargewicht von M = 40.000 Dalton. Untersuchung in der Ultrazentrifuge in einem Saccharose- Dichtgradienten bei 40.000 UPM über 24 Stunden ergab einen entsprechenden S (20, w)-Wert von 2,5 S. Das Temperaturoptimum des Enzyms für die VLA-Umwandlung bei pH 8,2 wurde zu 52 ºC bestimmt, das pH-Optimum bei 37 ºC lag bei pH 9,0.
Obwohl diese Untersuchungen zeigten, daß Katzenurin- Kallekrein und "Katzenallergen 1" nicht unterschieden werden konnten, wurde die mühsame und geringe Ausbeute ergebende Isolierungsmethode von Ohman et al. aufgegeben zugunsten einer Isolierungstechnik in einem Schritt aus Katzenhaar-HMWT durch Molekularsiebung auf einer Säule aus Sephacryl S-300 auf ähnliche Art, wie für das D per I-Allergen in Beispiel VII.2.b. diskutiert. Ein repräsentatives Eluierungsmuster ist in Figur 12 gezeigt. In einem typischen Isolierungsexperiment wurden 4 g Katzenhaar-Aceton-Pulver (ARTU Biologicals, Lelystad, Niederlande) wie oben beschrieben extrahiert und ergaben 215 mg Rohallergen HMWT (d.h. 5,4 % an Ursprungsmaterial). Die chromatographische Trennung auf Sephacryl S-300 ergab dann eine Rückgewinnung von 56 % des Katzenallergens 1 aus HMWT, d.h. 3 % im Ursprungsmaterial. Das Verhältnis der Enzymaktivitäten in mU/mg gegen VLA war HMWT: Katzenallergen 1 : Katzen "ex 1" = 7,7 : 5,7 : 0,6 oder 13 : 10 : 1. Das Enzym wandelte das Trypsinsubstrat I.P.A. nur schlecht um.

2. Isolierung des allergenen Enzyms aus Katzenhaar durch Affinitätschromatographie

Ein chromatographisches Affinitäts-Trägermaterial wurde hergestellt durch Reagierenlassen von Sepharose -Perlen (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) mit dem Enzyminhibitor Benzamidin mit Hilfe des Kupplungsreagenzes Bromcyan bei pH 11. Der Gelträger wurde mit PBS, pH 7,4, gewaschen und in eine Glassäule (∅ 0,9 cm, Höhe 25 cm) gegossen. Eine Lösung von 25 mg lyophilsiertem Katzenhaar-HMWT in 10 ml PBS wurde langsam durch die Säule gesiebt, gefolgt von Eluieren mit PBS. Der Proteingehalt und die Enzymaktivität gegenüber VLA wurden in dem Durchbruchs-Effluat überwacht, wie in Figur 13 gezeigt (Pool A). Die Säule wurde dann mit einem Glycin-HCl-Puffer (0,1 m, pH 2,9) perkoliert, und das Eluat wurde in ähnlicher Weise analysiert und zusammengenommen. (Figur 13, Pool B). Die Proteinkonzentration in Pools A und B, die mit dem Lowry-Reagenz bestimmt wurde, betrug 0,6 mg/ml bzw. 0,43 mg/ml. Die mit diesen Konzentraten in katzenallergischen Patienten erhaltene Ergebnisse von intradermalen Hauttests sind in Figur 14 gezeigt. Diese Daten zeigen, daß, obwohl das "Katzenallergen 1" - jetzt in der wissenschaftlichen Literatur als das Hauptallergen von Katzenhaar identifiziert - mit dein Kallikreinenzym aus dein Haar zusammenfällt, es nicht das alleinge hautreaktive (oder IgE-bindende) Antigen für katzenallergische Individuen ist.

3. Isolierung der hauptallergenen Kallekreinenzyme aus Katzenurin

Der Urin weiblicher Katzen (220 ml) wurde durch sterile Kathederisierung erhalten (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von der Fakultät für Veterinärmedizin der Universität Utrecht, Niederlande). Die Probe wurde filtriert und feste Di-Natriumethylendiaminotetraessigsäure EDTA wurde bis auf eine Konzentration von 0,001 in zugegeben. Die Lösung wurde dann gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, um 245 mg rohes Urinaller gen HMWT zu ergeben, d.h. 1,11 g/l.
Eine Probe von 75 mg dieses Produktes HMWT wurde durch eine Säule mit Sephadex G200, 90 x 2,5 cm in Borat-gepufferter Salzlösung BBS pH 8,0 gegeben; es wurden automatisch Fraktionen von 6 ml gesammelt. Die Säulenfraktionen wurden auf Enzymaktivität mit dem chromogenen Tripeptidsubstrat VLA überwacht: 0,6 ml Tris-HCl-Puffer, 0,3 ml Eluat, 0,1 ml VLA-Lösung (1,5 µMol/ml) wurden bei 37 ºC in der Küvette eines photometrischen Reaktionsgeschwindigkeitsanalysators inkubiert und das A bei 405 nm wurde in der dritten Minute als Parameter für die Enzymaktivität aufgezeichnet. Die Fraktionen wurden zusammengefaßt, wie in der Legende zu Figur 15 angegeben. Die nach Dialyse und Gefriertrocknen rückgewonnenen Präparate waren leicht hygroskopisch und wurden in 1,5 ml Salzlösung aufgenommen für die Bewertung der IgE-Bindungsstärke durch RAST-Inhibierung, wobei ein Pool von 12 Seren katzenallergischer Patienten verwendet wurde. Es wurden Graphen konstruiert, wie für Milben in Figuren 6 und 11 beispielhaft wiedergegeben, und die Punkte 50 %iger Inhibierung der IgE-Bindung wurden durch Interpolation erhalten; die Ergebnisse sind in Figur 15 eingebracht worden.
Die quantitativen Beziehungen zwischen Pools I bis III waren:
RAST-Inhibierung: Pool I: II: III = 4 : 30 : 1
Enzymaktivität auf VLA: Pool I: II: III = 1 : 30 : 0
Katzenurin HMWT hatte eine spezifische Aktivität auf VLA von 30,0 mU/mg, d.h. viermal größer als Katzenhaar-HMWT. Katzenurin HMWT hatte eine niedrigere spezifische Aktivität gegenüber dem Substrat I.P.A. und konvertierte das chromogene Tripeptidsubstrat < Glu-Gly-Arginin-p-Nitroanilid für klassische Urokinase nur in einem Ausmaß von 10 % des VLA. Katzenurin-Kaihkrein im aktiven Zustand, aber auch nach Erhitzen über 10 min. bei 100º C, rief positive Quaddel- und Hautrötungsreaktionen auf der Haut von Katzenallergikern bei 20 µg/ml hervor, d.h. bei fünfmal höherer Konzentration als das allergene Enzym aus Katzenhaar (Figur 10). Obwohl daher Katzenurin-Kallikrein ein Hauptallergen für den Menschen darstellt, wird das Antigenmolekül über seine Primär- oder Sekundärstruktur erkannt. Frisch zubereitete Urinallergene, die auf Basis ihrer Kallikrein-Aktivität standardisiert wurden, behalten daher ihre Normung selbst wenn das Enzym denaturiert worden ist.

Beispiel IX

Isolierung von allergenen Kallikreinenzymen aus Haut (Fell) und Urin des Hundes, Canis familiaris.

1. Isolierung eines "Hundeallergen 1"-Äquivalentes aus Hundehaar.

a. Zubereitung eines aktiven allergenen Extraktes.

Trockenes acetongewaschenes Hautschuppenpulver aus gemischten Hundezuchten wurde von ARTU Biologicals, Lelystad, Niederlande gekauft (Fabrikationsnummer 86M11/105- 03); 5 g des trockenen Pulvers wurden zweimal unter Rühren in 100 ml 1 % NaCl/1 % Phenol extrahiert. Die zusammengenommenen zentrifugierten Extrakte wurden aus einem Visking-Schlauch (Exklusionsgrenze 10.000 Daltons) dialysiert und lyophilisiert und ergaben 135 ing des rohen Hundeallergens HMWT, d.h. 2,7 % von dein Ursprungsmaterial.

b. Fraktionierung

75 mg Hundefellhaar HMWT in 5 ml PBS pH 8,0 wurden durch eine 2,5 x 45 cm Säule Sephadex G 200 im gleichen Lösungsmittel gesiebt; es wurden 6-ml-Fraktionen gesammelt und die Enzymaktivität der Eluate wurde mit dem VLA-Substrat getestet: 100 µl Fraktion, 10 µl VLA-Lösung (1,5 µMol/ml) und 90 µl 0,1 in Tris-HCl-Puffer pH 8,2 wurden 60 min. bei 37º C inkubiert; die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 100 µl 50 %iger Essigsäure abgebrochen und die erhaltene Farbe wurde bei 400 nm in einem Mikrotiterplattenphotometer ausgelesen. Das Eluierungsmuster und die Verteilung von Protein-Enzymaktivität und IgE-Bindung war sehr ähnlich zu den Ergebnissen, die mit Katzenurin erhalten worden waren (Figur 11). Es wurden zwei Sammelfraktionen hergestellt, nämlich der Enzympeak (Pool 1) und die zusammengenommenen verbleibenden Fraktionen (Pool II), die im trockenen nicht-hygroskopischen Zustand isoliert wurden und 27 bzw. 19 mg ergaben, d.h. 36 % und % im HMWT; Gesamtrückgewinnung 61 %. Das Hundeallergen 1 (oder Can f I) kann daher in einer Ausbeute von ungefähr 1 % aus trockenem Hundehaar erhalten werden.
Die quantitativen Beziehungen waren:
Enzymaktivität auf VLA (in mU/mg) : HMWT : Allergen 1 : "ex 1" = 24 : 44 : 6 oder 4 : 7, 3 : 1 RAST-Inhibierung in µg/ml: HMWT: Allergen 1 : "ex 1" = 11,4 : 55,5 : 6,7 oder in der Reihenfolge der Potenz (Reziprokwerte): 0,088 : 0,149 : 0,018 = 4,9 : 8,3 : 1 Es folgt wiederum, daß das antigene Hundehaar "Allergen 1" und das (Haut) Kininogenaseenzym identisch oder nahe verwandt sind.
Die Isolierung des Enzym-Hauptallergens auf Sephacryl S- 200 oder S-300-Säulen in einem Schritt konnte erfolgreich erreicht werden, wie für Katzenallergen 1 beschrieben worden ist (Beispiel VIII. 1.b). Mit diesem Verfahren wurde das Haupthundehaarallergen aus dein rohen Ursprungsmaterial in einer Ausbeute von 0,5 % isoliert.

2. Isolierung eines Haupturinallergens vom Hund

Nicht kontaminierter steriler Hundeurin (Beagle) wurde durch Kathederisieren erhalten (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von der Universitätsveterinärklinik Utrecht, Niederlande). Zu dem Urin wurden 20 g Natriumbenzoat je Liter gegeben (um die zu handhabenden Volumen zu reduzieren und weil sowohl von (Hausstaub-) Allergenen als auch von Urin-Kallikreinen bekannt ist, daß sie an Benzoesäure adsorbiert werden). Die klare Lösung wurde mit 4 n HCl auf pH 4,0 angesäuert, der Niederschlag abfiltriert, in Aceton gelöst und über Nacht in der Kälte belassen. Der Niederschlag wurde dann zentrifugiert, in PBS suspendiert und der pH-Wert auf 8,0 eingestellt. Die Lösung wurde schließlich dialysiert und gefriergetrocknet. Die Ausbeute betrug 204 ingil Urin für männliche Hunde, Code MHMWT, und 456 mg/l Urin für Hündinnen, Code
FHMWT. Die spezifischen enzymatischen Aktivitäten waren: auf das Kallikreinsubstrat VLA: MHMWT = 101 mU/mg; FHMWT = 92 mU/mg
auf das Trypsinsubstrat I.P.A.: MHMWT = 11,3 mU/mg; FHMWT = 6,4 mU/mg
Für die weitere Reinigung wurden dann 100 mg jedes Produktes (MHMWT oder FHMWT) durch Molekularsieben durch 80 x 2,5 cm Sephadex G-200-Säulen in PBS-Puffer pH 8,0 fraktioniert. Die Säulen wurden mit demselben Puffer perkoliert und 6-ml-Eluatfraktionen wurden automatisch gesammelt. Die Enzymaktivität in 25 µl Aliquots der Fraktionen wurde mit VLA als Substrat in einem Mikrotitertest, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, getestet. Die Fraktionen wurden auch auf Inhibierung der IgE-Bin dung aus einem Pool von menschlichen hundeallergischen Seren (verdünnt 1 : 10, RAST-Hundewert 27 % Bindung) untersucht. Das Eluierungsdiagramm ist für das Beispiel MHMWT in Figur 16 gezeigt. RAST-Inhibierungs-Dosis-Antwort-Plots der zusammengenommenen Haupt-MHMWT-Fraktionen wurden erstellt, wie in Figuren 6 und 11 beschrieben und dargestellt, woraus der Punkt 50 %iger Inhibierung durch Interpolation gefunden wurde. Die Ausbeute der zusammengenommenen Fraktionen in der Reihenfolge abnehmenden Molekulargewichts war: M1 = 16 mg, M2 =21 mg, M3 = 11 mg, M4 = 7 mg, Rückgewinnung 55 %.
Die quantitativen Verhältnisse waren:
Kallikreinaktivität durch Amidolyse: M1 : M2 : M3 : M4 = 1 : 3 : 70 : 28
IgE-Bindungsaktivität : M1 : M2 : M3 : M4 = 1 : 2 : 33 : 17
Das Hauptallergen und das VLA-hydrolysierende Enzym Can f I decken sich daher und treten in einem Verhältnis von etwa 22 mg/l von männlichem Hundeurin auf. Das Enzym wurde nicht durch normales menschliches Serum inhibiert.

Beispiel X

Isolierung des allergenen IgE-bindenden Hauptenzyms aus dem Urin der Maus, Mus musculus.

Als "Berufs-Tierallergie" bekannte klinische Phänomene treten recht häufig unter Menschen auf, die berufsmäßig mit kleinen Tieren in Versuchslabors arbeiten. Die Krankheitssymptome werden auf starke atopische Allergene in der inhalierten Luft zurückgeführt und stammen von den Haaren und insbesondere dein Urin solcher Tiere. Die Urinallergene von Maus und Ratte sind chemisch und immunologisch genauer untersucht worden (z.B. Schumacher MJ. Mol Immunol 1980; 17: 1087-95). Dieses Beispiel zeigt, daß die Haupturinallergene der Maus identisch oder nahe verwandt mit Maus-Urin-Kallikrein sind.
In einem repräsentativen Experiment wurde Urin von weiblichen Inzucht-Schweizer-Mäusen gesammelt, die geopfert worden waren, nachdem sie für die experimentelle Antikörperproduktion gedient hatten (freundlicherweise zur Verfügung gestellt vom Labor für experimentelle Immunologie, Universität Utrecht, Niederlande). Der Urin wurde gegen destilliertes Wasser aus einem Visking-Dialyseschlauch (Exklusionsgrenze 10.000 Dalton) dialysiert und lyophilisiert, um das nicht-hygroskopische nicht dialysierbare Material HMWT zu ergeben. Eine Probe von 20 mg HMWT wurde durch Gelfiltration auf einer 90 x 2,5 cm Sephadex G-100-Säule in Salzlösung (= 0,9 % NaCl) fraktioniert. Das Material wurde mit dein gleichen Lösungsmittel eluiert und 6-ml-Eluatfraktionen wurden automatisch gesammelt. Die Fraktionen wurden auf die Inhibierung der spezifischen IgE-Bindung analysiert, wobei das Serum eines spezifisch sensibilisierten atopischen Laboranten und chemisch mit Mauseurin HMWT gekoppelte Scheiben verwendet wurden. Ebenso wurden Aliquots auf esterolytische Aktivität untersucht, wobei das Substrat N-p-Tosyl-L-Argininmethylester (TAMe) wie folgt verwendet wurde: 1 ml des Eluats wurde mit 3 ing TAMe (British Drug Houses, Poole, England) in 0,5 ml 0,1 in Phosphatpuffer pH 7,5 50 min. bei 37º C inkubiert. Das freigesetzte Methanol wurde dann kolorimetrisch bestimmt mit einem üblichen Reagenz aus chromotroper Säure-H&sub2;SO&sub4; Die Verteilung der Enzymaktivität und der Haupt-IgE-Bindungspeak im Eluierungsdiagramm ist in Figur 17 gezeigt. Wie in den vorausgegangenen Beispielen gezeigt, fällt das Kallikreinenzym aus Mauseurin wiederum eng zusammen mit den allergenen Hauptbestandteilen. Obwohl jedoch die Enzymaktivität durch 10 minütiges Erhitzen bei 100º C völlig zerstört wurde, blieb die IgE-Bindungskapazität scheinbar unverändert.

Beispiel XI

Gemischte Tierallergene (Insekten)

Die medizinische Literatur ist voll von klinischen Beschreibungen von Patienten, die sensibilisiert sind gegenüber spezifischen Allergenen, die mit Insekten oder Tieren in ihrer persönlichen oder beruflichen Umgebung verknüpft sind. Unter bestimmten Bedingungen kann die Sensibilisierung gegenüber bestimmten Tier- oder Insektenexkreten oder -Sekreten weit verbreitet werden, wie durch epidemiologische Studien von Allergien gegenüber Schaben in den U.S.A. und gegenüber dem Käfer Trogoderina angustum in West-Berlin exemplifiziert. Die zugehörigen Untersuchungen zu der vorliegenden Erfindung sind auf die Untersuchung der Beziehungen zwischen den Hauptallergenen in diesen Fällen und den - manchmal sehr starken - proteolytischen Enzymen, die in den jeweiligen allergenen Extrakten nachweisbar sind, ausgedehnt worden. In diesen Fällen sind ähnliche Schlüsse über die Identität oder Verbundenheit Allergen-Enzym erhalten worden, wie in den vorangegangenen Beispie len im Detail diskutiert.
Tabelle K listet einige der bisher nicht beschriebenen spezifischen amidolytischen Aktivitäten wichtiger allergener Materialien auf. Tabelle K

Beispiel XII

Isolierung des Hauptallergens aus Dermatophagoides Pteronyssinus-Kulturen durch Affinitätschromatographie.

Für dieses Experiment wurde ein Affinitätsträgermaterial durch kovalente Bindung von Sepharose 48-Perlen (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) an den polyvalenten Proteinase-Inhibitor von bovinen Organen PBTI mittels Cyanbromid bei pH 11,0 hergestellt. Die PBTI-Quelle war das Handelsprodukt Trasylol (Bayer AG, Deutschland); 20.000 Inhibitor-Einheiten KIE wurden an 75 ml gepackter Sepharose 48 chemisch gebunden. Nach der Kopplungsreaktion wurde der Affinitätsträger kurz mit Ethanolamm behandelt, um nicht abreagierte Iminogruppen zu inaktivieren, und der Träger wurde schließlich mit 0,01 in Phosphatpuffer pH 7,4 gewaschen und in eine chromatographische Säule mit 1,5 cm ∅ und 25 cm Höhe gegeben. Auf diese Säule wurde eine Lösung von 10 mg D.Pteronyssinus HMWT in 1 ml Phosphatpuffer aufgegeben, wie in Beispiel VII. 1. beschrieben.
Die Säule wurde in drei Schritten eluiert.
a. Die Eluierung wurde zunächst mit 0,01 in Phosphatpuffer pH 7,4 durchgeführt, der zur Absorption des Milben-Hauptallergens an das immobilisierte BPTI diente. Das Material im Durchbruchspeak wurde gesammelt, lyophilisiert und gefriergetrocknet und ergab 4,5 mg des Produkts Pool I. Die Säule wurde dann mit weiteren 250 ml des gleichen Puffers zum Zwecke vollständigen Auswaschens perkoliert.
b. Eine Eluierung wurde mit 0,1 m Glycin-HCl-Puffer pH 3,0 für die Desorption des Milben-Hauptenzyms, das reversibel an den Inhibitorträger gebunden war, durchgeführt. Die eluierten Fraktionen wurden wieder zugesammengenommen, gegen destiliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet und ergaben 2 mg des Produkts Pool II.
c. Schließlich wurde die Säule mit einer Lösung aus 3 in KBr (in einem anderen Experiment mit 3 in KCNS) eluiert, um 2 ing des zuletzt eluierten Produkts Pool III zu ergeben.
Die Enzymaktivität gegenüber dem Substrat N-p-Tosyl-L- Argininmethylester (TAMe) wurde wie folgt mit chromotroper Säure bestimmt:
1 ml jeder Sammelfraktion vor dem Gefriertrocknen wurde mit 0,3 ml 1 %iger TAMe in 0,1 in Phosphatpuffer pH 7,4 gemischt und die Mischung wurde 60 min. bei 37º C gehalten. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 0,5 ml 15 %iger Trichloressigsäure abgebrochen. Aus der Lösung wurde dann 1 ml in ein Röhrchen überführt, das 0,1 ml 2 % KMnO&sub4; enthielt, gefolgt von 0,2 ml Na&sub2;SO&sub3; und 4 ml Na-Chromotrop-Säure (Merck, Darmstadt, Deutschland) in konzentrierter H&sub2;SO&sub4;. Die Mischung wurde dann 15 min. bei 100º C für die Farbentwicklung erhitzt, in Eiswasser gekühlt und gegen eine Standardkurve vermessen, indem die optische Dichte in einem Spektrophotometer bei 580 nm abgelesen wurde.
Es wurde keine Enzymaktivität in dein Präparat Pool I nachgewiesen, welches nichts desto weniger den höchsten Proteingehalt besaß. Ähnlich war keine Enzymaktivität mit dem Präparat Pool III verbunden. Der überwiegende Teil der Proteaseaktivität eluierte in dem Produkt Pool II mit dein sauren Glycin-HCl-Puffer und entsprach dem Hauptallergen D per 1. Dieses Material machte etwa 6 % des Gesamtproteins in dem Original D.Pteronyssinus HMWT-Präparat aus.

Legende für die Figuren

Figur 5

Sephadex G-100 Gelfiltration von 25 mg D.pt. HMWT (Säule 90 x 1,6 cm) in Borat-gepufferter Salzlösung. Das Totvolumen erscheint in Röhrchen 8. Die Eluierungsposition der molekularen Marker Bovin-Serum-Albumin (MG = 65.000) und Cytochrom-c (MG = 12.500) sind mit Pfeilen angezeigt. Die waagerechten Balken zeigen die Eluierungsposition der Fraktionen (3 + 4) und der ausgewählten Fraktion F4, wie bei Chapman und Platts-Mills (Clin esp Immunol 1978; 34: 126-36, Fig. 1) berichtet, auf Basis maximaler Hautreaktivität und direkter IgE-Bindung. Es wurden drei Sammelfraktionen gemacht, die die Inhalte von Röhrchen 8 bis 13 (Pool SI), 14 - 21 (Pool SII) und 22 - 34 (Pool SIII) umfaßten.

Figur 6

RAST-Inhibierung von Dermatophagoides Pteronyssinus HMWT und HMWT, das 10 min. bei 100º C erhitzt worden war, zusammen mit den Sammelfraktionen von einer Sephadex G-100 Säule nach Chapman und Platts-Mills. Serum # 810809 wurde verwendet, Verdünnung 1 : 4, Pool Konzentration: 10 mg/ml, 50 µl je Röhrchen in einer 2-Schritt Verdünnungsreihe, unverdünnt 1 : 1 beginnend.

Figur 7

Pevikon-Block-Elektrophorese der Fraktion SII wie im Text beschrieben; positive Elektrode (Anode) rechts. Der waagerechte Balken markiert die Fraktion F4P1, die von Chapman und Platts- Mills (Clin exp Immunol 1978; 34: 126-36, Fig. 2) als das Haupt-RAST-bindende und hautreaktive Allergen berichtet wird. Die getrennten Fraktionen wurden in drei Pools zusammengenominen, nämlich: Pool SIIP1 (Röhrchen 1 - 5), Pool SIIP2 (Röhrchen 6 - 12) und SIIP3 (Röhrchen 13 - 22).

Figur 8

Präparative isoelektrische Fokussierung der gereinigten allergenen Fraktion SIIP2 in einem Sucrose-Dichtegradienten. Der Hauptenzympeak fokussiert zwischen pH 6,6 bis 7,5 und entspricht Fraktion 14 von Chapmann und Platts-Mills (J Immunol 1980; 125: 587-92). Die Proteinkonzentration in den eluierten Fraktionen war zu gering, um mit den üblichen Testsystemen gemessen werden zu können; die dünne, nichtgepunktete Linie stellt das von Chapmann und Platts-Mills, Figur 1, veröffentlichte Proteinmuster dar. Die Balken zeigen die von diesen Autoren als immunochemisch identische Komponenten identifizierte Fraktionen an, beide mit einem anscheinenden Molekulargewicht von 24.000 Dalton und die Haupt-Antigenen und hautreaktiven Eigenschaften tragend; diese Fraktionen wurden kollektiv als Dermatophagoides Pteronyssinus Antigen P1 bezeichnet.

Figur 9

Säulenfraktionierung von 100 mg lyophilisiertem Dermatophagoides Pteronyssinus HMWT-Produkt auf Sephacryl S-200. Zu den Bedingungen siehe Text. Der einzige Enzympeak wurde zusammengenommen zu der Pool I-Fraktion; die Proteinfraktionen links und rechts davon wurden zu dein Produkt Pool II (= "ex P1") zusammengenommen.

Figur 10

Chromatofokussierung einer 25 mg-Probe eines HMWT-Präparats aus D.Pteronyssinus-Kultur. Die Fraktionen 20 - 30 umfassen die hauptallergene Enzymkomponente.

Figur 11

Standardisierung verschiedener Präparate aus Dermatophagoides Pteronyssinus-Extrakt durch Inhibierung der spezifischen IgE- Bindung im Radio-Allergo-Sorbent-Test (RAST). Die Menge für 50 %ige Inhibierung der Serum-IgE-Bindung wird an der Schnittstelle mit den einzelnen Dosis-Antwort-Kurven abgelesen.

Figur 12

Isolierung des Katzenhaar-Hauptallergens Fel d I durch Molekularsieben von 100 mg Katzenhaar-HMWT durch eine Säule mit 2,5 cm ∅ x 40 cm Betthöhe aus Sephacryl S-300. Der schwarze Balken zeigt die eluierten Fraktionen an, die zusammengenommen wurden, um das enzymatische Hauptallergen zu ergeben.

Figur 13

Isolierung des hauptallergenen Katzenhaarenzyms in einem Schritt durch Affinitätschromatographie auf Sepharose -Benzamidin.

Figur 14

Ergebnisse von Intradermaltests bei katzenallergischen Patienten mit Katzenhaar-Poolen A und B, isoliert durch Affinitätschromatographie auf Sepharose -Benzamidin. Die Lösungen waren durch Filtrieren durch Amicon -Filter sterilisiert und wurden mit 4,0 µg/ml getestet, wobei das injizierte Volumen 50 µl betrug. Das HMWT-Produkt war ein nicht fraktionierter dialysierter käuflich erhältlicher Katzenhaarextrakt mit derselben Konzentration.

Figur 15

Molekularsiebung von Katzenurin-HMWT auf Sephadex G-200-Säule (90 x 2,5 cm) und Verteilung der Proteinkonzentration, Kallikreinaktivität und RAST-Inhibierungskraft über die eluierten Fraktionen. RAST-Inhibierung in relativen Einheiten, d.h. in reziproker Verdünnung lyophilisierter Pool-Fraktion (in 1,5 ml 0,9 % NaCl) für 50 %ige Inhibierung der IgE-Bindung aus einem Pool von katzenallergischen humanen Blutseren. Es wurden drei Sammelfraktionen hergestellt, die die Eluate aus Röhrchen 15 - 35 (Pool I), 36 - 59 (Pool II) und 60 - 79 (Pool III) umfassen.

Figur 16

Gelfiltration von 100 mg Urin-MHMWT von männlichen Hunden auf einer 80 x 2,5 cm Säule aus Sephadex G-200 in Phosphat-gepufferter Salzlösung pH 8,0. Eluat analysiert auf enzymatische Aktivität gegenüber chromogenem Tripeptid-Kallikrein-Substrat VLA im Mikrotiterplatten-Test, auf Gesamtproteingehalt (O.D. bei 280 nm) und auf spezifische IgE-Bindungskraft (reziproke µg Pool-Fraktionen M1 bis M4 für 50 %ige Inhibierung) aus 50 µl hundeallergischem Human-Poolserum, unter Verwendung von Hundeurin-MHMWT-Scheiben.

Figur 17

Gelfiltration von 20 mg Mauseurin-HMWT über eine 90 x 2,5 cm Chromatographiesäule aus Sephadex G-100 und eluiert mit 0,9 % NaCl. Esterolytische Aktivität und IgE-Bindungspotential ("RAST-Inhibierung") angegeben.

Claims

1. Verwendung eines zu dem aktiven Zentrum einer Proteinase passend konstruierten Substrats, für das diese Proteinase spezifisch ist, wobei das Substrat ein Protein oder ein Peptid- Derivat ist, das eine zu dem aktiven Zentrum der Proteinase passend konstruierte Aminosäure oder Aminosäure-Sequenz aufweist, und wobei die Verwendung in der Feststellung des allergenen Potentials insektischer oder tierischer Herkunft in aus der Umgebung entnommenen Staubproben und in individuellen allergenen Zubereitungen besteht, indem die Größe der proteolytischen Aktivität der aus der Umgebung entnommenen Staubprobe oder der allergenen Zubereitung bestimmt wird, wobei die Proteinase eine Serin-Proteinase ist, weil ein Allergen mit der Serin-Proteinase identisch oder eng verwandt ist.

2. Verfahren zur Isolierung eines Allergens insektischer oder tierischer Herkunft, das identisch oder eng verwandt mit einer Serin-Proteinase aus einer der Umgebung entnommenen Staubprobe oder einer individuellen allergenen Zubereitung ist, durch affinitive Bindung des Allergens an ein Substrat, das passend zum aktiven Zentrum der Proteinase konstruiert ist und das die Substratspezifität für die Serin-Proteinase hat, die mit dem Allergen identisch oder mit diesem eng verwandt ist, wobei das Substrat zum Beispiel eine Serin-Proteinase-inhibierende Substanz ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, welches die Schritte umfaßt von

- Extrahieren tierischen Materials, um einen Extrakt zu erhalten;

- Dialyse des Extraktes um ein Retentat zu erhalten; und

- Affinitätschromatographie des Retentats mit einem chromatographischen Träger, der als ein. Substrat einen Inhibitor enthält, der für das zu isolierende Allergen spezifisch ist.

4. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Allergen identisch oder eng verwandt mit einer Serin-Proteinase mit der Spezifität von Bovin- oder Human-Trypsin oder Chymotrypsin ist.

5. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Substrat ein Substrat ist, für das glanduläre oder Gewebs-Proteinase vom Kallikrein-Typ spezifisch ist.

6. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die hydrolytische Aktivität einer der Umgebung entnommenen Staubprobe oder einer allergenen Zubereitung gegenüber dem Substrat bestimmt wird, wobei das Substrat Amid und/oder Esterbindungen enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, worin der Inhibitor ausgewählt ist aus polyvalentem Bovin-Inhibitor BPTI (Transylol ), Sojabohnen-Trypsininhibitor SBTI, Limabohnen- Inhibitor LBTI, den Inhibitoren aus Hühnereiweiß (Ovomuccoid) und anderen Ovo-Inhibitoren, dem Inhibitor aus Kartoffeln, aus Erdnüssen und anderen botanischen Quellen und den Inhibitoren aus Seeanemonen oder aus der Schnecke Helix pomatia, Benzamidin, 4-Aminomethylbenzamidin und 4-amidin-phenylacetylameisensäure.

8. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das proteinasespezifische Substrat ein Peptid- Derivat eines Naphthylamids einer Monoamino-, Dipeptid-, Tripeptid- oder Oligopeptid-Verbindung ist.

9. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Substrat ein Alkylester oder ein chromogenes Naphthyl-, p-Benzoyl- oder p-Tosylkonjugat eines Monoamino-, Dipeptid-, Tripeptid- oder Oligopeptid-Derivates ist, welches eine Aminosäure oder Aminosäure-sequenz aufweist, die passend zum aktiven Zentrum einer Serin-Proteinase konstruiert ist, vorzugsweise mit der Substratspezifität von Human- oder Bovin-Trypsin oder Chymotrypsin oder mit der Substratspezifität von tierischem glandulären oder Gewebe- Kallikrein.

10. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Allergen ein Hauptallergen ist.

11. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Allergen Hauptallergen D per I in Kulturen von Dermatofagoides Pteronyssinus ist.

12. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Allergen ein Allergen aus Speichel, Schweiß, trockener Haut, Schuppen und Urin von Säugern ist und das Substrat ein Substrat ist, das zum aktiven Zentrum des Allergens mit der Substratspezifität von tierischem glandulären oder Gewebe-Kallikrein passend konstruiert ist.

13. Verfahren zur Isolierung eines Allergens aus Speichel, Schweiß, trockener Haut, Schuppen und Urin von Tieren, aus einer der Umgebung entnommenen Staubprobe oder individuellen allergenen Zubereitungen, welches das in Kontakt bringen der der Umgebung entnommenen Staubprobe oder der individuellen allergenen Zubereitung mit einem Substrat, das passend zum aktiven Zentrum des Allergens mit der Substratspezifität für glanduläres oder Gewebe-Kallikrein konstruiert ist, während oder nach der chromatographischen Fraktionierung der der Umgebung entnommenen Staubprobe oder allergenen Zubereitung umfaßt.