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JP6505599B2 - 遺伝子標的化および形質スタッキングのための特別設計の導入遺伝子組み込みプラットフォーム（ｅｔｉｐ） - Google Patents

遺伝子標的化および形質スタッキングのための特別設計の導入遺伝子組み込みプラットフォーム（ｅｔｉｐ） Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年９月７日出願の米国特許仮出願第６１／６９７，８８２号の恩典の優先権を主張するものである。
本開示は、植物の正確な形質転換、遺伝子標的化、植物における標的ゲノム組み込みおよびタンパク質発現の分野に関する。好ましい実施形態において、本開示は、植物ゲノム内にランダムにまたは植物ゲノム内の標的位置に挿入することができる、特別設計の導入遺伝子組み込みプラットフォーム（Engineered Transgene Integration Platform）（ＥＴＩＰ）を記載する。
高まりつづける世界の食物生産需要という難題に対処するための、農業生産性の改善（例えば、収量向上または遺伝子組換えによる病虫害抵抗性（engineered pest resistance））への典型的な取り組みは、突然変異育種、または形質転換による作物種のゲノムへの新規遺伝子の導入に依存している。これらのプロセスは、本質的に非特異的であり、比較的効率が悪い。例えば、従来の植物形質転換法は、外在性ＤＮＡを送達し、その外在性ＤＮＡがゲノムのランダムな位置に組み込まれる。したがって、望ましい特質を有するトランスジェニック植物系統を同定し、単離するために、構築物ごとに何百もの特有のランダム組み込み事象を生じさせ、その後、所望の個体についてスクリーニングする必要がある。結果として、従来の植物形質操作は、骨が折れる、時間のかかる、予測不能な仕事である。さらに、これらの組み込みのランダム性は、意図しないゲノム破壊に起因して多面的効果が起こったかどうかを予測することを困難にする。
現行の形質転換プロセスのランダム性は、導入遺伝子事象候補の同定および選択のために何百もの事象の発生を必要とする（形質転換および事象スクリーニングは、機能性ゲノム研究から同定される遺伝子候補に比べて律速的である）。加えて、ゲノム内の組み込み位置によっては、ゲノム位置効果の結果として遺伝子発現カセットが異なるレベルで発現されることがある。このゲノム位置効果は、従来の形質転換プロセスを用いるゲノムへのランダム挿入による様々な調節要素および導入遺伝子設計の影響の比較を非常に可変的なものにする。結果として、操作された遺伝子または形質を有する植物系統の産生、単離および特性評価は、成功確率の低い、極めて大きな労働力および費用を要するプロセスになっている。
正確な遺伝子修飾は、植物系における従来の実施の論理的課題を克服するので、植物研究者および農業生物工学者の長年の目標であった。しかし、イネにおける陽性−陰性薬剤選択による「遺伝子標的化」、または事前に操作された制限部位の使用を除き、すべての植物種、モデルおよび作物両方における標的ゲノム修飾は、最近まで、理解し難いものとされていた。非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３。
最近、ゲノムＤＮＡの標的切断のための方法および組成物が記載された。かかる標的切断事象を用いて、例えば、細胞ＤＮＡ配列の標的突然変異誘発もしくは標的欠失を誘導することができ、または所定の染色体遺伝子座での標的組換えを助長することができる。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５、ならびに特許文献６。
特許文献７には、植物ゲノムの標的修飾のための非カノニカルジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用が開示されている。特許文献８には、植物ＥＰＳＰＳ遺伝子座へのＺＦＮ媒介標的組み込みが記載されている。しかし、植物ゲノム内の正確な位置への安定した標的組み込みの同定、選択および迅速な進行のため組成物および方法を見つける必要が依然としてある。
米国特許出願公開２００３／０２３２４１０号明細書 米国特許出願公開２００５／０２０８４８９号明細書 米国特許出願公開２００５／００２６１５７号明細書 米国特許出願公開２００５／００６４４７４号明細書 米国特許出願公開２００６／０１８８９８７号明細書 国際公開第２００７／０１４２７５号パンフレット 米国特許出願公開２００８／０１８２３３２号明細書 米国出願第１２／２８４，８８８号明細書
Terada et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10): 1030 Terada et al. (2007) Plant Physiol 144(2):846 D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnology J. 6(1):93
本発明は以下を提供する。
［１］トランスジェニック植物細胞を生産するための方法であって、
標的化可能な核酸分子を含むゲノムＤＮＡを有する植物細胞を準備する工程（上記標的化可能な核酸分子は、
少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位と、
第一のマーカー遺伝子の第一の断片と、
第二のマーカー遺伝子の第二の断片と
を含む）；
ドナー核酸分子および部位特異的ヌクレアーゼ核酸分子で上記植物細胞を形質転換させる工程；
上記少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位を切断する工程；
上記ドナー核酸分子を上記標的化可能な核酸分子に組み込む工程（ここで、上記標的化可能な核酸分子内への組み込みは、少なくとも１つの機能性マーカー遺伝子を含む）；および
上記標的化可能な核酸分子と、少なくとも１つの機能性マーカー遺伝子を含む組み込まれたドナー核酸分子とを含む、トランスジェニック植物細胞を生産する工程
を含む方法。
［２］上記ドナー核酸分子が、第一および第二の相同アーム核酸配列を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］上記相同アーム核酸配列が、イントロンである、上記［２］に記載の方法。
［４］上記第一および第二の相同アーム核酸配列が、５０％未満の配列同一性を共有する、上記［２］に記載の方法。
［５］上記第一および第二相同アーム核酸配列が、５０ｂｐから３ｋｂｐの長さである、上記［２］に記載の方法。
［６］上記ドナー核酸分子が、非相同性依存型方法により上記標的化可能な核酸分子に組み込まれる、上記［１］に記載の方法。
［７］上記ドナー核酸分子が、相同性依存型方法により上記標的化可能な核酸分子に組み込まれる、上記［１］に記載の方法。
［８］上記ドナー核酸分子の両末端が、ヌクレオチド配列再編成を有する上記標的化可能な核酸分子に組み込まれ、上記ヌクレオチド配列再編成が、挿入、欠失、逆位（inversion）およびリピートを含む、上記［１］に記載の方法。
［９］上記ドナー核酸分子の両末端が、ヌクレオチド配列再編成のない上記標的化可能な核酸分子に組み込まれ、上記ヌクレオチド配列再編成が、挿入、欠失、逆位およびリピートを含む、上記［１］に記載の方法。
［１０］上記ドナー核酸分子の第一の末端が、ヌクレオチド配列再編成のない上記標的化可能な核酸分子に組み込まれ、および上記ドナー核酸分子の第二末端が、ヌクレオチド配列再編成を有する上記標的化可能な核酸分子に組み込まれ、上記ヌクレオチド配列再編成が、挿入、欠失、逆位およびリピートを含む、上記［１］に記載の方法。
［１１］上記トランスジェニック植物細胞が、トランスジェニック植物組織へと産生されるか、またはトランスジェニック植物全体へと再生される、上記［１］に記載の方法。
［１２］上記標的化可能な核酸が、ゲノム遺伝子座に挿入される、上記［１］に記載の方法。
［１３］上記ゲノム遺伝子座内への標的化可能な核酸分子の挿入が、上記植物細胞の耕種学的特性または品質特性に対して悪影響を及ぼさない、上記［１２］に記載の方法。
［１４］上記ゲノム遺伝子座が、ＦＡＤ２ゲノム遺伝子座、ＦＡＤ３ゲノム遺伝子座、およびＩＰＫ１ゲノム遺伝子座から成る群より選択される、上記［１２］に記載の方法。
［１５］上記ＦＡＤ２ゲノム遺伝子座が、ＦＡＤ２Ａ、ＦＡＤ２Ａ’、ＦＡＤ２ＣおよびＦＡＤ２Ｃ’から成る群より選択される、上記［１４］に記載の方法。
［１６］上記ＦＡＤ３ゲノム遺伝子座が、ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ａ’、ＦＡＤ３Ａ”、ＦＡＤ３Ｃ、ＦＡＤ３Ｃ’およびＦＡＤ３Ｃ”から成る群より選択される、上記［１４］に記載の方法。
［１７］上記ドナー核酸分子が、少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含む、上記［１］に記載の方法。
［１８］上記遺伝子発現カセットが、導入遺伝子を含む、上記［１］に記載の方法。
［１９］上記導入遺伝子が、殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤抵抗性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子および選択可能マーカー導入遺伝子から成る群より選択される、上記［１８］に記載の方法。
［２０］上記少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位が、部位特異的ヌクレアーゼで切断される、上記［１］に記載の方法。
［２１］上記部位特異的ヌクレアーゼが、ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインまたは切断ハーフドメインとを含む融合タンパク質である、上記［２０］に記載の方法。
［２２］上記ＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化因子様（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、リコンビナーゼ、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、およびそれらのキメラ的組み合わせから成る群より選択される、上記［２１］に記載の方法。
［２３］上記融合タンパク質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、上記［２１］に記載の方法。
［２４］上記切断ドメインまたは切断ハーフドメインが、ＩＩＳ型制限部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＦｏｋＩ部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＳｔｓＩ部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびホーミング部位特異的ヌクレアーゼから成る群より選択される、上記［２１］に記載の方法。
［２５］上記第一のマーカー遺伝子の第二の断片が、上記ドナー核酸分子の５’末端に位置し、および上記第二のマーカー遺伝子の第一の断片が、上記ドナー核酸分子の３’末端に位置する、上記［１］に記載の方法。
［２６］上記ドナー核酸分子を標的化可能な核酸分子に組み込む工程が、第一のマーカー遺伝子を含む機能性第一マーカー遺伝子をもたらす、上記［２５］に記載の方法。
［２７］上記ドナー核酸分子を標的化可能な核酸分子に組み込む工程が、第二のマーカー遺伝子を含む機能性第二マーカー遺伝子をもたらす、上記［２５］に記載の方法。
［２８］上記第一のマーカータンパク質が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を利用してスクリーニングされる、上記［２６］に記載の方法。
［２９］上記第二のマーカータンパク質が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を利用してスクリーニングされる、上記［２７］に記載の方法。
［３０］上記第一および第二のマーカー遺伝子が、異なる作用機序を有するマーカータンパク質を発現する、上記［２６および上記［２７］に記載の方法。
［３１］上記第一のマーカー遺伝子の第二の断片が、上記ドナー核酸分子の５’末端に位置し、上記ドナー核酸分子の５’末端が、イントロンに作動可能に連結されたプロモーターを含み、および上記第二のマーカー遺伝子の第一の断片が、上記ドナー核酸分子の３’末端に位置し、上記ドナー核酸分子の３’末端が、イントロンに作動可能に連結されたコード配列を含む、上記［１］に記載の方法。
［３２］上記第一または第二のマーカー遺伝子（単数または複数）が、ＰＭＩ、ＹＦＰ、Ｘｙｌ（Ａ）、ＲＦＰ、ＤＳＲ、ＧＦＰ、ＧＵＳ、ＮＰＴＩＩ、ＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１２、ＡＨＡＳ、ＰＡＴ、ＤＳＭ−２、ＤＧＴ−２８、ＨＰＨ、ＢＡＲ、および蛍光タンパク質から成る群より選択される、上記［１］に記載の方法。
［３３］上記トランスジェニック植物細胞が、フローサイトメトリーを利用して単離される、上記［１］に記載の方法。
［３４］上記［１１］に記載の方法によって生産されたトランスジェニック植物組織またはトランスジェニック植物全体。
［３５］配列番号４３１のヌクレオチド１−５７９から配列番号４３２のヌクレオチド１６６−７３２、配列番号４３３のヌクレオチド１−５５０から配列番号４３４のヌクレオチド１９０−６５３、配列番号４３５のヌクレオチド１−２９８から配列番号４３６の５１−６４４、配列番号４３７のヌクレオチド１−５３６から配列番号４３８のヌクレオチド１４６−５４５、ヌクレオチド、配列番号４３９のヌクレオチド１−４３１から配列番号４４０のヌクレオチド１６７−６８５、配列番号４４１のヌクレオチド１−５９９から配列番号４４２のヌクレオチド１１６−５２１、配列番号４４３のヌクレオチド１−２９８から配列番号４４４のヌクレオチド１９３−７７５、および配列番号４４５のヌクレオチド１−６５１から配列番号４４６のヌクレオチド１２０−５７８から成る群より選択される、セイヨウアブラナ（Brassica napus）染色体標的部位。
［３６］少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位と、
第一のマーカー遺伝子の第一の断片と、
第二のマーカー遺伝子の第二の断片と
を含む標的化可能な核酸分子を含む、上記［３４］に記載のセイヨウアブラナ（Brassica napus）染色体標的部位。
［３７］ｐＤＡＳ００００３６またはｐＤＡＳ００００３７を含む、上記［３４］に記載のセイヨウアブラナ（Brassica napus）染色体標的部位。
［３８］外在性ポリヌクレオチド配列を含む、上記［３４］に記載のセイヨウアブラナ（Brassica napus）染色体標的部位。
［３９］トランスジェニック植物細胞を生産するための方法であって、
標的化可能な核酸分子を含むゲノムＤＮＡを有する植物細胞を準備する工程（上記標的化可能な核酸分子は、
少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位と、
第一のマーカー遺伝子の第一の断片と、
非コードポリヌクレオチド配列の第二の断片と
を含む）；
ドナー核酸分子および部位特異的ヌクレアーゼ核酸分子で上記植物細胞を形質転換させる工程；
上記少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位を切断する工程；
上記ドナー核酸分子を上記標的化可能な核酸分子に組み込む工程（ここで、上記標的化可能な核酸分子内への組み込みは、少なくとも１つの機能性マーカー遺伝子を含む）；および
上記標的化可能な核酸分子と、少なくとも１つの機能性マーカー遺伝子を含む組み込まれたドナー核酸分子とを含む、トランスジェニック植物細胞を生産する工程
を含む方法。
［４０］上記ドナー核酸分子が、第一および第二の相同アーム核酸配列を含む、上記［３９］に記載の方法。
［４１］上記第一の相同アーム核酸配列が、イントロンである、上記［３９］に記載の方法。
［４２］上記第二の相同アーム核酸配列が、非コードポリヌクレオチド配列である、上記［３９］に記載の方法。
本開示のある実施形態は、トランスジェニック植物細胞を生産するための方法に関する。さらなる実施形態では、標的化可能な核酸分子を含むゲノムＤＮＡを有する植物細胞を提供する。さらなる実施形態は、少なくとも１つの特異的ヌクレアーゼ認識部位と、第一のマーカー遺伝子の第一の断片と、第二のマーカー遺伝子の第二の断片とを含む、標的化可能な核酸分子を含む。別の実施形態では、植物細胞をドナー核酸分子および部位特異的ヌクレアーゼ核酸分子で形質転換させる。二次的実施形態では、植物細胞のゲノムＤＮＡを少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位で切断する。追加の実施形態は、トランスジェニック植物細胞を生産するための標的可能核酸分子へのドナー核酸分子の組み込みを含み、前記標的可能核酸分子内への組み込みは、少なくとも１つの機能性マーカー遺伝子を含み、前記トランスジェニック植物細胞は、前記標的化可能な核酸分子と、少なくとも１つの機能性マーカー遺伝子を含む組み込まれたドナー核酸分子とを含む。
さらに別の実施形態において、本開示は、配列番号（SEQ ID NO:）４３１のヌクレオチド１−５７９から配列番号４３２のヌクレオチド１６６−７３２、配列番号４３３のヌクレオチド１−５５０から配列番号４３４のヌクレオチド１９０−６５３、配列番号４３５のヌクレオチド１−２９８から配列番号４３６の５１−６４４、配列番号４３７のヌクレオチド１−５３６から配列番号４３８のヌクレオチド１４６−５４５、ヌクレオチド、配列番号４３９のヌクレオチド１−４３１から配列番号４４０のヌクレオチド１６７−６８５、配列番号４４１のヌクレオチド１−５９９から配列番号４４２のヌクレオチド１１６−５２１、配列番号４４３のヌクレオチド１−２９８から配列番号４４４のヌクレオチド１９３−７７５、および配列番号４４５のヌクレオチド１−６５１から配列番号４４６のヌクレオチド１２０−５７８から成る群より選択される、セイヨウアブラナ（Brassica napus）染色体標的部位に関する。
二次的実施形態において、本開示は、トランスジェニック植物細胞を生産するための方法に関する。さらなる実施形態は、少なくとも１つの特異的ヌクレアーゼ認識部位と、第一のマーカー遺伝子の第一の断片と、第二の非コードポリヌクレオチド配列の第二の断片とを含む、標的化可能な核酸分子を含む。別の実施形態では、植物細胞をドナー核酸分子および部位特異的ヌクレアーゼ核酸分子で形質転換させる。二次的実施形態では、植物細胞のゲノムＤＮＡを少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼ認識部位で切断する。追加の実施形態は、トランスジェニック植物細胞を生産するための標的可能核酸分子へのドナー核酸分子の組み込みを含み、前記標的可能核酸分子内への組み込みは、少なくとも１つの機能性マーカー遺伝子を含み、前記トランスジェニック植物細胞は、標的化可能な核酸分子と、少なくとも１つの機能性マーカー遺伝子を含む組み込まれたドナー核酸分子とを含む。
上述の特徴および他の特徴は、添付の図面を参照しながら進める、いくつかの実施形態についての下記の詳細な説明からさらに明らかになる。
図１Ａは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ２遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図１Ｂは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ２遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図１Ｃは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ２遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図１Ｄは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ２遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図１Ｅは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ２遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図２は、近隣結合距離に基づいてＪＡＬＶＩＥＷ（商標）ｖ２．３を使用して生成したＦＡＤ２遺伝子配列の系統樹を示す。 図３Ａは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｂは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｃは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｄは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｅは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｆは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｇは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｈは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｉは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｊは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｋは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｌは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｍは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｎは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｏは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｐは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｑは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｒは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｓは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｔは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｕは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｖは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｗは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｘは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｙは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｚは、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ａ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｂ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｃ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｄ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｅ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｆ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｇ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｈ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｉ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｊ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｋ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｌ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図３Ｍ’は、ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）を使用して生成した、ＦＡＤ３遺伝子配列の配列アラインメントを示す。 図４は、近隣結合距離に基づいてＪＡＬＶＩＥＷ（商標）ｖ２．３を使用して生成したＦＡＤ３遺伝子配列の系統樹を示す。名づけられた配列は、次のように対応する：本出願を通してＦＡＤ３Ａ’／Ａ’’をＦＡＤ３Ａ’と記載する；本出願を通してハプロタイプ２をＦＡＤ３Ｃ’と記載する；本出願を通してハプロタイプ１をＦＡＤ３Ｃ’’と記載する；および本出願を通してハプロタイプ３をＦＡＤ３Ａ’’と記載する。 図５は、ｐＤＡＢ１０４０１０のプラスミドマップを示し、代表的ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）発現カセットを提示する。この構築物のレイアウトは、他のＺＦＮ発現カセットに類似しており、この場合、ジンクフィンガードメイン、２４８２８および２４８２９を下に記載されている代替ジンクフィンガードメインと交換した。 図６は、１０，０００配列リードあたりの標的ＺＦＮ部位に欠失がある配列リードの数を示す複数ラインの折れ線グラフの例である。グラフ上のＸ軸は、欠失された塩基の数を示し、Ｙ軸は、配列リードの数を示し、およびＺ軸は、グラフの右に記載されているとおりのカラーコード化されたサンプルの正体を示す。示されている具体的なサンプルは、３つの標的ＺＦＮ部位、Ａ、ＢおよびＣと、４つの遺伝子ファミリーメンバー、ならびに対照サンプルＡおよびＢとして評定した２つの対照トランスフェクションを含有する、ＦＡＤ２遺伝子ファミリーの遺伝子座１についてのものである。最上部から最下部へと（凡例の最上部のＡ−対照＿ＦＡＤＡ’から凡例の最下部のＣ＿サンプル＿ＦＡＤ２Ｃへと）列挙されたラインが、グラフ上に、ラベル付きＸ軸の最も近く（Ａ＿対照＿ＦＡＤＡ’）から、ラベル付きＸ軸から最も遠く（Ｃ＿サンプル＿ＦＡＤ２Ｃ）へと示されている。 図７Ａは、ＦＡＤ２遺伝子ファミリーの遺伝子座４を標的にするＺＦＮからのデータを表示するものである。前記遺伝子座は、２つのＺＦＮ部位および２つの必要対照トランスフェクションを含有する。 図７Ｂは、ＦＡＤ２ＡおよびＣ遺伝子座のシークエンシングにより単一塩基欠失の観察増加につながる、Ｃ、ＴおよびＧの三塩基リピートを含有するＦＡＤ２ＡおよびＣを同定する、ＺＦＮ標的部位を包囲する特異的配列構成（配列番号４７１−４８０）。 図８は、ｐＤＡＳ０００１３０のプラスミドマップを示す。 図９は、ｐＤＡＳ０００２７１のプラスミドマップを示す。 図１０は、ｐＤＡＳ０００２７２のプラスミドマップを示す。 図１１は、ｐＤＡＳ０００２７３のプラスミドマップを示す。 図１２は、ｐＤＡＳ０００２７４のプラスミドマップを示す。 図１３は、ｐＤＡＳ０００２７５のプラスミドマップを示す。 図１４は、ｐＤＡＳ００００３１のプラスミドマップを示す。 図１５は、ｐＤＡＳ００００３６のプラスミドマップを示す。 図１６は、ｐＤＡＳ００００３７のプラスミドマップを示す。 図１７は、ＥＴＩＰおよびペイロード核酸配置、ならびに植物細胞ゲノムにおけるＥＴＩＰ部位での標的ペイロードの産物を図示する。 図１８は、プロトプラスト細胞の形質転換、続いて、３’および５’両末端での短縮型スコアリング可能かつ選択可能マーカーの再構築を用いる宿主系統におけるＥＴＩＰでの標的ペイロードＤＮＡのＦＡＣＳ選択を図示する。 図１９Ａは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｐＤＡＳ００００７４またはｐＤＡＳ００００７５）によるゲノム遺伝子座の二本鎖ＤＮＡ切断およびカノーラ染色体のＥＴＩＰ遺伝子座へのＤｓ−ｒｅｄドナー（ｐＤＡＳ００００６８、ｐＤＡＳ００００７０、またはｐＤＡＳ００００７２）のその後の組み込みの結果として生ずる、ＥＴＩＰカノーラ事象の相同性指向型修復（homology directed repair）を図示する。前記ドナーの前記ゲノム遺伝子座への組み込みは、十分に機能する高発現性のＤｓ−ｒｅｄ導入遺伝子をもたらす。 図１９Ｂは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｐＤＡＳ００００７４またはｐＤＡＳ００００７５）によるゲノム遺伝子座の二本鎖ＤＮＡ切断およびカノーラ染色体のＥＴＩＰ遺伝子座へのＤｓ−ｒｅｄドナー（ｐＤＡＳ００００６８、ｐＤＡＳ００００７０、またはｐＤＡＳ００００７２）のその後の組み込みの結果として生ずる、ＥＴＩＰカノーラ事象の相同性指向型修復を図示する。前記ドナーの前記ゲノム遺伝子座への組み込みは、十分に機能する高発現性のＤｓ−ｒｅｄ導入遺伝子をもたらす。 図２０は、カノーラプロトプラストのＦＡＣＳ選別と、ｐＤＡＳ００００３１（「ｐＤＡＳ３１」）でトランスフェクトされたカノーラプロトプラストの算出トランスフェクション効率とを示す。加えて、形質転換されていないカノーラプロトプラストのＦＡＣＳ選別結果を陰性対照として提供する。 図２１は、カノーラプロトプラストのＦＡＣＳ選別と、ｐＤＡＳ００００６４／ｐＤＡＳ００００７４（上のグラフ）およびｐＤＡＳ００００６４／ｐＤＡＳ００００７５（下のグラフ）でトランスフェクトされたカノーラＥＴＩＰプロトプラスト事象の算出トランスフェクション効率とを示す。 図２２は、カノーラプロトプラストのＦＡＣＳ選別と、ｐＤＡＳ００００６８／ｐＤＡＳ００００７４（上のグラフ）およびｐＤＡＳ００００６８／ｐＤＡＳ００００７５（下のグラフ）で形質転換されたカノーラＥＴＩＰプロトプラスト事象の算出トランスフェクション効率とを示す。 図２３は、カノーラプロトプラストのＦＡＣＳ選別と、ｐＤＡＳ００００７０／ｐＤＡＳ００００７４（上のグラフ）およびｐＤＡＳ００００７０／ｐＤＡＳ００００７５（下のグラフ）で形質転換されたカノーラＥＴＩＰプロトプラスト事象の算出トランスフェクション効率とを示す。 図２４は、カノーラプロトプラストのＦＡＣＳ選別と、ｐＤＡＳ００００７２／ｐＤＡＳ００００７４（上のグラフ）およびｐＤＡＳ００００７２／ｐＤＡＳ００００７５（下のグラフ）で形質転換されたカノーラＥＴＩＰプロトプラスト事象の算出トランスフェクション効率とを示す。 図２５は、ｐＤＡＳ００００７４のプラスミドマップを示す。 図２６は、ｐＤＡＳ００００７５のプラスミドマップを示す。 図２７は、ｐＤＡＳ００００６４のプラスミドマップを示す。 図２８は、ｐＤＡＳ００００６８のプラスミドマップを示す。 図２９は、ｐＤＡＳ００００７０のプラスミドマップを示す。 図３０は、ｐＤＡＳ００００７２のプラスミドマップを示す。 図３１は、導入遺伝子コピー数推定アッセイのための導入遺伝子標的プライマーおよびプローブの結合部位を示す概略図である。 図３２は、ＦＡＤ２Ａ ＺＦＮ ＤＮＡ認識ドメイン（ｂｃ１２０７５＿Ｆａｄ２ａ−ｒ２７２ａ２およびｂｃ１２０７５＿Ｆａｄ２ａ−２７８ａ２）、ならびにＺＦＮ特異的プライマーの結合部位（ＦＡＤ２Ａ．ＵｎＥ．Ｆ１およびＦＡＤ２Ａ．ＵｎＥ．Ｒ１）および内在性プライマーの結合部位（ＦＡＤ２Ａ／２Ｃ．ＲＢ．ＵｎＥ．Ｆ１およびＦＡＤ２Ａ／２Ｃ．ＲＢ．ＵｎＥ．Ｒ１）を示す、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲファイルを示す。 図３３は、完全ＨＤＲによるＦＡＤ２Ａへの導入遺伝子組み込みの検出に使用した内在性および導入遺伝子標的プライマーの結合部位を示す概略図である。 図３４は、Ｋｐｎ１制限エンドヌクレアーゼ部位が、完全編集ＦＡＤ２Ａ遺伝子座内のどこに発生するのか、およびＦＡＤ２ａ ５’、ｈｐｈおよびＦＡＤ２Ａ ３’サザンプローブがどこに結合するのかを示す略図である。 図３５は、コピー数推定ｑＰＣＲからの代表データ出力を示す。左側のカラムは、単一ランダム導入遺伝子インサートを有する公知Ｔ０トランスジェニック植物から得たデータを表し、すべての他のサンプルが「正規化される」キャリブレーターサンプルとして使用される。右側のカラムは、５導入遺伝子組み込みを有する公知Ｔ０トランスジェニック植物である。両方の植物についてのインサートコピー数を、サザン解析を用いて決定した。残りのカラムは、推定上のトランスジェニック植物についてのコピー数推定値を提供する。これらのカラムには、図の左から右へ（from left to rightffigur）、次のようにラベルが付いている：１コピー対照、３１０４２０、３１１８１９、３１１８２１、３１１８２２、３１１８２３、３１１８２４、３１１８２７、３１２５２４、３１２５２５、３１２５２６、３１２５２７、３１２５２９、３１２５３０、３１２５３２、３１３８１０、３１３８１１、３１３９０５、３１３９４１、３１３９４２、３１３９４４、そして５コピー対照。カラムは、各トランスジェニック植物についての推定コピー数を決定するために使用することができる。コピー数を推定するためにソフトウェアを使用するとき、野生型植物、非形質転換対照植物、およびプラスミドのみの対照は、ｈｐｈおよびＨＭＧ Ｉ／Ｙ標的両方のためのＣｑを保有しないので、コピー数が得られない。 図３６は、Ｔ−ＤＮＡボーダー間に、ＲＢ７ ＭＡＲ配列／ｅＺＦＮ４結合部位ｖ１、ＯｓＵｂｉ３プロモーター／Ｐｈｉ ＹＦＰ／ＺｍＰｅｒ５ ３’ＵＴＲ ｖ２／ｅＺＦＮ１結合部位／ＥＬＰ１ ＨＲ２ ｖ２、ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ８／Ｃｒｙ３４Ａｂ１ ｖ２／ＳｔＰｉｎＩＩ ３’ＵＴＲ ｖ２、ＴａＰｅｒプロモーターｖ３／Ｃｒｙ３５Ａｂ１ ｖ５／ＳｔＰｉｎＩＩ ３’ＵＴＲ ｖ２、ＳＣＢＶｖ２／ＡＡＤ−１ｖ３／ＺｍＬｉｐ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む、標的ＤＮＡ配列を含有するｐＤＡＢ１０５８５５のプラスミドマップを示す。 図３７は、イントロン１を伴うトウモロコシユビキチン１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ２）の発現下のＺＦＮ１コード配列とＺｍＰｅｒ５ ３’ＵＴＲ ｖ２とを含むｐＤＡＢ１０５９４１のプラスミドマップを示す。 図３８は、イネユビキチン３（ＯｓＵｂｉ３）プロモーターのプロモーターを持たないイントロン（ｒｕｂｉ３イントロン）、続いて除草剤抵抗性遺伝子（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）、そしてＺｍＬｉｐ ３’ＵＴＲを含有する、ｐＤＡＢ１１２３６６のプラスミドマップを示す。 図３９は、発現カセットを含むドナーポリヌクレオチドの標的化のためのゲノム内に組み込まれたＥＴＩＰ部位の使用についての概略図を提供する。このスキームに示されているように、ドナーは、ＥＴＩＰ遺伝子座内への組み込みが起こると導入遺伝子を発現することができる。ドナーのランダム組み込みは、発現を駆動することができるプロモーター要素が典型的にないので、導入遺伝子の発現をもたらさない。
植物細胞のゲノムに安定的に組み込まれかつドナー核酸分子の形質転換および組み込みのための宿主生殖質として役立つ、標的化可能な核酸分子を含む、特別設計の導入遺伝子組み込みプラットフォーム（ＥＴＩＰ）の生産のための方法および組成物を、本明細書に開示する。本開示は、植物の正確な形質転換、植物における遺伝子標的化、標的ゲノム組み込みおよびタンパク質発現に関する。好ましい実施形態では、ＥＴＩＰを植物ゲノムにランダムにまたは植物ゲノム内の標的位置に挿入して、そのＥＴＩＰゲノム位置に（３’末端と５’末端両方とも）標的化された１つまたはそれ以上の目的の遺伝子（ＧＯＩ）の迅速な選択および検出を助長することができる。いくつかの実施形態では、特異的２本鎖破断をＥＴＩＰ内に導入することがある。他の実施形態では、標的化され、単離された細胞またはプロトプラストの選択および濃縮、続いてのフローサイトメトリーおよびＦＡＣＳを用いる稔性植物の再生のための方法を説明する。
特定の方法は、トランスジェニック植物細胞であって、該植物およびその後代において安定した遺伝性遺伝子修飾を有するものであるトランスジェニック植物細胞の生産はもちろん、前記トランスジェニック植物の組成物の生産も含む。ある一定の実施形態では、組み込み核酸を含むＥＴＩＰが宿主生殖質に安定的に組み込まれる、正確な植物形質転換システムでの使用について、ＥＴＩＰを説明する。他の実施形態は、植物細胞ゲノムＤＮＡが少なくとも１つの安定的に組み込まれた機能性マーカー遺伝子を含むようなトランスジェニック植物細胞の生産方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、１つまたはそれ以上の標的化部位特異的ヌクレアーゼ認識部位と、第一のマーカー遺伝子の第一の断片と、第二のマーカー遺伝子の第二の断片とを含有する、標的化可能な核酸分子の使用を含む。別の実施形態において、ドナー核酸分子は、目的のヌクレオチド配列と、目的の核酸配列に隣接している２つの核酸配列とを含む。別の実施形態において、前記目的の核酸配列に隣接している２つの核酸配列は、第一および第二の相同アーム核酸配列である。他の実施形態では、前記ドナー核酸分子を使用して植物細胞を形質転換させる。前記相同アーム核酸配列は、前記ＥＴＩＰまたは前記標的化可能な核酸分子配列の領域に相同であってもよく、前記標的化可能な核酸分子の第一および第二のマーカー遺伝子の第一および第二の断片に相同であってもよい。
ドナー核酸が、植物細胞内のＥＴＩＰまたは標的化可能な核酸分子に安定的に組み込まれている外在性核酸配列（例えば、タンパク質またはＲＮＡ分子）の１つまたはそれ以上の産物を発現する、トランスジェニック植物の組成物および生産方法も記載する。いくつかの実施形態において、ＥＴＩＰまたは標的化可能な核酸分子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ結合部位を利用するか、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を発現するタンパク質を含む部位特異的ヌクレアーゼを利用する。代替実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、他の追加の標的化技術、例えば、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬ、ＲＮＡ誘発性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、またはロイシンジッパーで構成される。特定の実施形態において、ＥＴＩＰは、トランスジェニック植物発育過程の初期発育段階の遺伝子候補および植物発現ベクター設計の試験を助長する標的化可能な核酸分子である。いくつかの実施形態において、トランスジェニック植物細胞は、１つまたはそれ以上の標的化部位特異的ヌクレアーゼ認識部位と第一および第二のマーカー遺伝子の第一および第二の断片とを含有するポリヌクレオチド配列を有する組み込み核酸分子を含む。前記マーカー遺伝子断片が機能性マーカー遺伝子発現産物をコードしないこともあることは理解される。さらに、前記マーカー遺伝子は、ある実施形態の場合、イントロン核酸配列を含むことがある。他の実施形態において、前記マーカー遺伝子は、相同アーム核酸配列を含むことがある。
いくつかの実施形態において、前記ドナー核酸分子の１つまたは２つまたはそれ以上の領域には、植物ゲノムＤＮＡ（外在性）との配列相同性がない。追加の実施形態において、前記ドナー核酸分子は、相同アーム核酸配列を含むことがある。前記ドナー核酸分子の相同アーム核酸配列を、前記標的化可能な核酸分子の部位特異的ヌクレアーゼ制限部位に隣接する領域に組み込んでもよい。ある一定の実施形態において、前記相同アーム配列は、５０ｂｐから３ｋｂの長さであってよい。
特定の実施形態において、前記ドナー核酸分子は、ＥＴＩＰ標的化可能核酸分子への標的化を可能にし、正確に標的化された事象についての５’および３’末端での選択を可能にする、外在性核酸配列を含むことがある。外在性核酸配列の産物は、例えば、１つもしくはそれ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意のタイプのコードもしくは非コードヌクレオチド配列、ならびに１つまたはそれ以上の調節遺伝子要素（例えば、プロモーター）を含むことができる。前記ドナー核酸分子の設計は、ドナーＤＮＡのＥＴＩＰへの選択組み込み後、選択可能マーカーをはじめとする（しかしこれに限定されない）コードおよび非コードＤＮＡの切除を可能にする。
特定の実施形態において、前記ＥＴＩＰ標的化可能核酸分子は、第一のマーカー遺伝子の第一の断片、および第二のマーカー遺伝子の第二の断片、および前記第一のマーカー遺伝子の対応する第二の断片と前記第二のマーカー遺伝子の第一の断片とを含有するドナー核酸分子を含むことがある。前記標的化可能な核酸分子の３’末端に位置する前記第二のマーカー遺伝子の第二の断片に伴って、前記第一のマーカー遺伝子の第一の断片が前記標的化可能な核酸分子の５’末端に位置してもよいので、前記第一のマーカー遺伝子の第二の断片と前記第二のマーカー遺伝子の第一の断片とを含むドナー核酸分子のその植物細胞ゲノムへの安定的組み込みは、機能性の第一のマーカー遺伝子および第二のマーカー遺伝子を生じさせる。いくつかの実施形態では、これらのマーカー遺伝子を使用して、ＥＴＩＰの安定的組み込みについて選択してもよい。いくつかの実施形態において、安定したマーカー遺伝子としては、ＰＭＩ、Ｘｙｌ（Ａ）、ＹＦＰ、ＤＳＲ、ＧＦＰ、ＧＵＳ、ＮＰＴＩＩ、ＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１２、ＤＧＴ−２８、ＡＨＡＳ、ＰＡＴ、ＤＳＭ−２、ＨＹＧ、ＢＡＲ、および蛍光タンパク質が挙げられるだろう。他の実施形態において、前記マーカー遺伝子は、視覚的にスクリーニング可能なマーカー遺伝子であり、その存在を、細胞を色の変化についてモニターすることによって判定することができる。他の実施形態において、前記マーカー遺伝子は、（例えば、除草剤または抗生物質耐性遺伝子をコードする）選択可能マーカー遺伝子であり、その存在は、細胞成長を低下させる除草剤または抗生物質の使用について選択される。さらなる実施形態において、前記マーカー遺伝子は、陽性選択可能マーカー遺伝子である。
レポーター遺伝子としても記載する様々な選択可能マーカーを、形質転換植物（「形質転換体」）の同定を可能にするような選ばれた発現ベクターであって、形質転換植物（「形質転換体」）の選択可能な前記発現ベクターに組み込むこともできる。形質転換植物における選択可能マーカーの発現を確認するために多くの方法を利用することができ、それらの方法としては、例えば、ＤＮＡシークエンシングおよびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロット法、ＲＮＡブロット法、ベクターから発現されたタンパク質、例えばホスフィノトリシン耐性を媒介する沈殿タンパク質の検出のための免疫学的方法、または他のタンパク質、例えばレポーター遺伝子コードβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼおよびこれらに類するものの目視観察が挙げられる（Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001を参照されたい）。
選択可能マーカー遺伝子を形質転換細胞または組織の選択に利用する。選択可能マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもの、ならびに除草剤化合物に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。除草剤耐性遺伝子は、一般に、除草剤に対して非感受性の修飾された標的タンパク質をコードしているか、または植物中の除草剤をそれが作用し得る前に分解もしくは解毒する酵素をコードしている。例えば、グリホサートに対する耐性は、突然変異型標的酵素、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子を使用することによって得られた。ＥＰＳＰＳについての遺伝子および突然変異体は周知であり、下でさらに説明する。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する耐性は、それぞれの除草剤を解毒する、ｐａｔもしくはＤＳＭ−２をコードする細菌遺伝子、ニトリラーゼ、ａａｄ−１またはａａｄ−１２遺伝子を使用することによって得られた。
ある実施形態において、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素をはじめとする除草剤は、生長点または分裂組織を阻害することができ、これらの除草剤に対するアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の耐性／抵抗性のための遺伝子は周知である。グリホサート耐性遺伝子としては、突然変異型５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰｓ）およびｄｇｔ−２８遺伝子（組換え型核酸の導入および／もしくは天然ＥＰＳＰｓ遺伝子の様々な形態のインビボ突然変異誘発による）、ａｒｏＡ遺伝子ならびにグルホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子がそれぞれ挙げられる）。他のホスホノ化合物に対する耐性遺伝子としては、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）をはじめとするストレプトマイセス属（Streptomyces）種からのｂａｒ遺伝子、ならびにピリジノキシ（pyridinoxy）またはフェノキシプロピオン酸（proprionic acid）およびシクロヘキソン（ＡＡＣアーゼ阻害剤コード遺伝子）が挙げられる。シクロヘキサンジオンおよび／またはアリールオキシフェノキシプロパン酸（ハロキシホップ、ジクロホップ、フェノキシプロプ、フルアジホップ、キザロホップを含む）に対する耐性を付与する例示的遺伝子としては、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）の遺伝子−−Ａｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３が挙げられる。ある実施形態において、トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベントニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む除草剤は、光合成を阻害することができる。
ある実施形態において、選択可能マーカーとしては、次のものをコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されない：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ；シアナミドヒドラターゼ；アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ；トリプトファンデカルボキシラーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼおよび脱感作型アスパラギン酸キナーゼ；ｂａｒ遺伝子；トリプトファンデカルボキシラーゼ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）；ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）；ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ；アセトヒドロキシ酸シンターゼ；５−エノールピルビルシキミ酸−リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ）；ハロアリールニトリラーゼ；アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ；ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌ Ｉ）；および３２ｋＤ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）。
ある実施形態は、次のものに対する耐性をコードする遺伝子も含む：クロラムフェニコール；メトトレキサート；ヒグロマイシン；スペクチノマイシン；ブロモキシニル；グリホサート；およびホスフィノトリシン。
選択可能マーカー遺伝子の上記リストは、限定を意図したものではない。任意のレポーターまたは選択可能マーカー遺伝子が本発明によって包含される。
ある実施形態では、ＥＴＩＰ標的化可能ポリヌクレオチド分子をゲノム遺伝子座に組み込む。一例では、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３およびＩＰＫ１ゲノム遺伝子座が、ＥＴＩＰ組み込みおよびその後のドナーポリヌクレオチドドナー分子組み込みのための標的として選択され得る。ＦＡＤ２およびＦＡＤ３内在性遺伝子の破壊は、植物細胞の耕種学的特性または品質特性に対して悪影響を及ぼさないことが証明されている。したがって、植物または植物製品性能（カノーラ、大豆、トウモロコシなど）に関連した耕種学的ペナルティーまたは品質ペナルティーがないこと、および特定の油品質特性に関連した形質のバンドリングは、遺伝子移入を促進し、ＦＡＤ２およびＦＡＤ３部位が破壊されると新たな生殖質発生が観察される。特定の実施形態では、ドナーヌクレオチド配列分子を、調節要素、例えば、プロモーター、イントロン、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに連結させてもよい。
ドナー核酸分子のＥＴＩＰへの組み込みを、部位特異的ヌクレアーゼの標的２本鎖切断によって助長してもよい。前記部位特異的ヌクレアーゼは、ＥＴＩＰ標的化可能核酸分子内に位置してもよい。さらに、部位特異的ヌクレアーゼは、特別設計のランディングパッド（Engineered Landing Pad）（ＥＬＰ）を含むＥＴＩＰ標的化可能核酸分子内に位置してもよい。米国特許出願公開第２０１１０１９１８９９号明細書を参照されたい。さらに、前記部位特異的ヌクレアーゼは、選択されたＥＴＩＰ内のＥＬＰ中に位置してもよいし、または前記ＥＬＰに近接して位置してもよい。選択されたＥＴＩＰ内の操作された配列を結合するように設計されている、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメイン、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたは前述のもののキメラ的組み合わせを含む融合タンパク質の使用により、切断をＥＴＩＰに標的化してもよい。かかる切断は、ＥＴＩＰ内の切断部位へのまたはその付近へのペイロードまたはドナー核酸外在性ポリヌクレオチド配列の組み込みを刺激する。本開示方法を用いるドナー核酸分子の組み込みは、相同性依存型メカニズムと相同性非依存型メカニズムの両方によって進行することができ、標的化事象の選択は、ＥＴＩＰの３’領域と５’領域両方に対する標的化事象の際に機能性である新規選択可能およびまたはスコアリング可能マーカーのスクリーニングによって達成される。本開示は、ＥＴＩＰでの選択２本鎖破断を達成するための、新規の操作されたジンクフィンガー結合部位およびＺＦＮの使用を実証する。
代替実施形態において、新規の操作されたＤＮＡ結合部位（例えば、ＺＦＰ、メガヌクレアーゼ、ロイシンジッパー、ＴＡＬ、ＲＮＡ誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）は、ネイティブ植物細胞ゲノム内に存在しないＥＴＩＰ中の１つまたはそれ以上の標的部位に結合する。前記ＤＮＡ結合ドメイン（単数または複数）は、例えば、認識ヘリックスを含む任意の操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、例えば、米国特許出願第１２／９３１，０９６号明細書に記載されているものを含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載するＤＮＡ結合ドメインはいずれも、機能性ドメイン、例えば、切断ドメインまたは切断ハーフドメインをさらに含んでよい。他の実施形態において、前記切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋｌまたはＳｔｓｌからのものであることができる。切断ドメインのさらなる実施形態は、ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば、修飾されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼなどを含むことができる。
本開示の実施形態は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質の使用を含む。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質、「ＺＦＰ」、（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたはそれ以上のジンクフィンガーによって配列特異的様式でＤＮＡを結合するタンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略記される。ジンクフィンガー結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作される」こともある。ジンクフィンガータンパク質の操作方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されるジンクフィンガータンパク質は、自然界に存在しないタンパク質であって、その設計／組成が主として合理的基準から得られるものである。設計のための合理的基準は、既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を記憶しているデータベース内の情報を処理するための代入規則およびコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号および同第６，７８５，６１３を参照されたい；国際公開第９８１５３０５８号、同第９８１５３０５９号、同第９８１５３０６０号、同第０２１０１６５３６号および同第０３１０１６４９６パンフレット、ならびに米国特許第６，７４６，８３８号、同第６，８６６，９９７号および同第７，０３０，２１５号明細書も参照されたい。
本開示の特定の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を利用することがある。ＺＦＮは、本開示に従って植物細胞に送達することができるいずれのジンクフィンガーヌクレアーゼであってもよい。例えば、ＺＦＮは、切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）とジンクフィンガー結合ドメインとを含む融合タンパク質、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびポリペプチドとポリペプチドコードポリヌクレオチドの組み合わせを含んでもよい。ジンクフィンガー結合ドメインは、１つまたはそれ以上のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上のジンクフィンガー）を含んでよく、および目的の任意の領域に結合するようにジンクフィンガー結合ドメインを操作してもよい。したがって、切断または組換えが望まれる目的の標的領域を同定することにより、切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と前記目的の領域内の標的配列を認識するように操作されたジンクフィンガードメインとを含む１つまたはそれ以上の融合タンパク質を、本明細書に開示する方法に従って構築してもよい。細胞内のかかる融合タンパク質（単数または複数）の存在は、前記目的の領域内または付近での融合タンパク質（単数または複数）のその（それらの）結合部位（単数または複数）への結合および切断をもたらすことになる。さらに、目的の領域に相同の外在性ポリヌクレオチドもかかる細胞内に存在する場合、２本鎖破断ヌクレオチド配列と外在性ポリヌクレオチド間の相同組換えが高い率で起こる。本開示のために、「相同組換え」は、例えば、相同性指向型修復メカニズムにより細胞内の２本鎖破断の修復中に発生するような交換の特殊な形を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を用いて「標的」分子（すなわち、２本鎖破断を経たもの）をテンプレート修復し、および「非交差型遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に公知である。なぜなら、それがドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらすからである。いずれの特定の理論によっても拘束されることを望まないが、かかる伝達は、破断した標的とドナーとの間で形成されるヘテロ２本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーを使用して標的の一部になる遺伝情報を再合成する「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連プロセスを必要とし得る。かかる特殊相同組換えは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような、標的分子の配列の改変をもたらすことが多い。
本開示の方法において、本明細書に記載の１つまたはそれ以上の標的部位特異的ヌクレアーゼは、標的配列（例えば、細胞の染色質）内の所定の部位で２本鎖破断を生じさせ、およびその破断の領域内のヌクレオチド配列との相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。２本鎖破断の存在は、ドナー配列の組み込みを助長することが証明されている。ドナー配列を物理的に組み込んでもよいし、または代替的に、ドナーポリヌクレオチドを相同組換えによる破断の修復のためのテンプレートとして使用し、その結果、そのドナー内に見られるようなヌクレオチド配列のすべてまたは一部を細胞の染色質に導入する。かくして、細胞の染色質中の第一の配列を改変することができ、ある一定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列に変換することができる。したがって、用語「置換する」または「置換」の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のものによる置換（すなわち、情報の意味での配列の置換）を表すと解することができ、１つのポリヌクレオチドの別のものによる物理的または化学的置換を必ずしも必要としない。
いくつかの実施形態では、特定のヌクレオチド配列、例えば宿主生物のゲノム内の特定のヌクレオチド配列を認識し、それに結合することができる因子を利用することによって、部位特異的組み込みを果たしてもよい。例えば、多くのタンパク質は、部位特異的様式でＤＮＡを認識し、それに結合することができるポリペプチドドメインを含む。ＤＮＡ結合ポリペプチドにより認識されるＤＮＡ配列を「標的」配列と呼ぶことがある。部位特異的様式でＤＮＡを認識し、それに結合することができるポリペプチドドメインは、そのドメインが当初単離されたタンパク質以外のポリペプチドにおいて発現されたときでさえ、一般に、正しく折り畳まり、独立して機能して、部位特異的様式でＤＮＡに結合する。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドによる認識および結合のための標的配列は、大きいＤＮＡ構造（例えば、染色体）中に存在するときでさえ、特に、その標的配列が位置する部位が可溶性細胞タンパク質に接近できることが公知のもの（例えば、遺伝子）であるときでさえ、一般に、かかるポリペプチドにより認識および結合され得る。
自然界に存在するタンパク質から同定されたＤＮＡ結合ポリペプチドは、典型的に、別個のヌクレオチド配列またはモチーフ（例えば、コンセンサス認識配列）に結合するが、多くのかかるＤＮＡ結合ポリペプチドを異なるヌクレオチド配列またはモチーフを認識するように修飾するための方法が存在し、当分野において公知である。ＤＮＡ結合ポリペプチドとしては、例えば、限定ではないが、次のものが挙げられる：ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン；ロイシンジッパー；ＵＰＡ ＤＮＡ結合ドメイン；ＧＡＬ４；ＴＡＬ：ＬｅｘＡ；ＲＮＡ誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９；Ｔｅｔリプレッサー；ＬａｃＲ；およびステロイドホルモン受容体。
いくつかの例では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ジンクフィンガーである。個々のジンクフィンガーモチーフを、広範なＤＮＡ部位のいずれかに特異的に標的化および結合するように設計することができる。カノニカルＣｙｓ２Ｈｉｓ２（および非カノニカルＣｙｓ３Ｈｉｓ）ジンクフィンガーポリペプチドは、標的ＤＮＡ二重ヘリックスの主溝にα−ヘリックスを挿入することによってＤＮＡを結合する。ジンクフィンガーによるＤＮＡの認識は、モジュール式であり；各フィンガーは、主として、標的内の３連続塩基に接触し、そのポリペプチド中の少数の重要な残基が認識を媒介する。標的化エンドヌクレアーゼ内に複数のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含めることにより、その標的化エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、さらに増加され得る（およびしたがって、それによって付与される任意の遺伝子調節効果の特異性も増加され得る）。例えば、Urnov et al. (2005) Nature 435:646-51を参照されたい。かくして、１つまたはそれ以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチドを、宿主細胞に導入された標的化エンドヌクレアーゼがその宿主細胞のゲノム内に特有であるＤＮＡ配列と相互作用するように操作および利用してよい。
好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、最適な標的部位に結合するように操作されている点で天然起源ではない。例えば、Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660;Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416；米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号明細書を参照されたい。
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的設計および様々なタイプの選択を含むが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用であって、各トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列を結合するジンクフィンガーの１つまたはそれ以上温アミノ酸配列と関連付けられるものであるデータベースの使用を含む。例えば、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい。
ファージディスプレイおよび２−ハイブリッドシステムをはじめとする例示的選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号および同第６，２４２，５６８号明細書、ならびに国際公開第９８／３７１８６号、同第９８／５３０５７号、同第００／２７８７８号、同第０１／８８１９７号パンフレットおよび英国特許２，３３８，２３７号明細書に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、共同所有の国際公開０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメイン、および／または複数のフィンガーを持つジンクフィンガータンパク質を、例えば５アミノ酸またはそれ以上の長さのリンカーをはじめとする、任意の適するリンカー配列を使用して、互いに連結させてもよい。６アミノ酸またはそれ以上の長さの例示的リンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号および同第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載するタンパク質は、そのタンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含んでよい。
融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための、標的部位選択、ＺＦＰおよび方法は、当業者には公知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号、同第７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号明細書；国際公開第９５／１９４３１号、同第９６／０６１６６号、同第９８／５３０５７号、同第９８／５４３１１号、同第００／２７８７８号、同第０１／６０９７０号、同第０１／８８１９７号、同第０２／０９９０８４号、同第９８／５３０５８号、同第９８／５３０５９号、同第９８／５３０６０号、同第０２／０１６５３６号および同第０３／０１６４９６号パンフレットに詳細に記載されている。
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメイン、および／または複数のフィンガーを持つジンクフィンガータンパク質を、例えば５アミノ酸またはそれ以上の長さのリンカーをはじめとする、任意の適するリンカー配列を使用して、互いに連結させてもよい。６アミノ酸またはそれ以上の長さの例示的リンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号および同第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載するタンパク質は、そのタンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含んでよい。
いくつかの例では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＧＡＬ４からのＤＮＡ結合ドメインである。ＧＡＬ４は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるモジュラートランス活性化因子（modular transactivator）であるが、多くの他の生物においてもトランス活性化因子として動作する。例えば、Sadowski et al. (1988) Nature 335:563-4を参照されたい。この調節システムにおいて、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）におけるガラクトース代謝経路の酵素をコードする遺伝子の発現は、利用可能な炭素源によって厳重に調節される。Johnston (1987) Microbiol. Rev. 51:458-76。これらの代謝酵素の転写制御は、陽性調節性タンパク質、ＧＡＬ４と、ＧＡＬ４が特異的に結合する１７ｂｐ対称ＤＮＡ配列（ＵＡＳ）との相互作用によって媒介される。
天然ＧＡＬ４は、９９ｋＤａの分子量を有する、８８１アミノ酸残基から成る。ＧＡＬ４は、機能的に自主性を持つドメインを含み、その総合活性によりＧＡＬ４のインビボ活性が説明される。Ma and Ptashne (1987) Cell 48: 847-53): Brent and Ptashne (1985) Cell 43(3 Pt 2): 729-36。ＧＡＬ４のＮ末端６５アミノ酸がＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを構成する。Keegan et al. (1986) Science 231:699-704; Johnston (1987) Nature 328:353-5。配列特異的結合は、そのＤＮＡ結合ドメインに存在する６つのＣｙｓ残基により配位された二価カチオンの存在を必要とする。この配位カチオン含有ドメインは、ＤＮＡヘリックスの主溝との直接接触により１７ｂｐ ＵＡＳの各末端の保存ＣＣＧトリプレットと相互作用し、そのトリプレットを認識する。Marmorstein et al. (1992) Nature 356:408-14。このタンパク質のＤＮＡ結合機能がＣ末端転写活性化ドメインをプロモーターの近くに位置させるので、その活性化ドメインは転写を指示することができる。
ある一定の実施形態において利用することがある追加のＤＮＡ結合ポリペプチドとしては、例えば、限定ではないが、次のものが挙げられる：ＡＶＲＢＳ３誘導性遺伝子からの結合配列；ＡＶＲＢＳ３誘導性遺伝子からのコンセンサス結合配列またはそこから操作された合成結合配列（例えば、ＵＰＡ ＤＮＡ結合ドメイン）；ＴＡＬ；ＬｅｘＡ（例えば、Brent & Ptashne (1985), 上掲を参照されたい）；ＬａｃＲ（例えば、Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-56; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(12):5072-6 を参照されたい）；ステロイドホルモン受容体（Ellliston et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 11517-121）；Ｔｅｔリプレッサー（米国特許第６，２７１，３４１号明細書）、およびテトラサイクリン（Ｔｃ）の存在下ではｔｅｔオペレーター配列に結合するが不在下ではしない突然変異Ｔｅｔレプレッサー；ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合ドメイン;ならびにＧＡＬ４とホルモン受容体とＶＰ１６の融合体を利用する、Wang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(17): 8180-4に記載されている調節システムの成分が挙げられる。
ある一定の実施形態において、本明細書に記載する方法および組成物において使用されるヌクレアーゼの１つまたはそれ以上についてのＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のまたは操作された（非天然起源の）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。キサントモナス属（Xanthomonas）の植物病原菌は、重要な作物植物において多くの病気の原因となることは公知である。キサントモナス属（Xanthomonas）の病原性は、植物細胞に２５より多くのエフェクタータンパク質を注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）システムに依存する。これらの注入タンパク質には、植物転写活性化因子を模倣し、植物転写を操る、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターがある（Kay et al (2007) Science 318:648-651を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特性評価されているＴＡＬ−エフェクターの１つが、斑点細菌病菌（Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria）からのＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 および国際公開第２０１００７９４３０号パンフレットを参照されたい）。ＴＡＬ−エフェクターは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特性にとって重要である、おおよそ３４のアミノ酸を各リピートが含有する、タンデムリピートの中央ドメインを含有する。加えて、それらは、核局在配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（総説については、Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272を参照されたし）。加えて、植物病原菌・青枯病菌（Ralstonia solanacearum）における、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と呼ばれる２つの遺伝子は、青枯病菌（R. solanacearum）次亜種１ ＧＭＩ１０００株におけるおよび次亜種４ ＲＳ１０００株におけるキサントモナス属（Xanthomonas）のＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同であることが判明した（Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384を参照されたい）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列の点では互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失の点で異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、キサントモナス属（Xanthomonas）のＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、米国特許第８，４２０，７８２号および同第８，４４０，４３１号明細書ならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。
他の実施形態において、前記ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。このシステムのＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化されており等間隔にスペーサーが入っている短い回文型のリピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats））遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575；Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1:7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1:e60）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子はもちろん、ＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラムすることができる非コードＲＮＡ要素も含有する。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特性評価されているシステムの１つであり、４つの逐次的工程で標的ＤＮＡ２本鎖破断を行う。第一に、２つの非コードＲＮＡ、すなわちｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第二に、ｔｒａｃｒＲＮＡがｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個別のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセッシングを媒介する。第三に、その成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとのワトソン・クリック塩基対合（標的認識の追加要件）により、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに指向させる。最後に、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡの切断を媒介して、そのプロトスペーサー内で２本鎖破断を生じさせる。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性は、３つの工程を含む：（ｉ）「順応」と呼ばれるプロセスでの、将来の攻撃を防止するための外来ＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲアレイへの挿入；（ｉｉ）該当するタンパク質の発現、ならびに前記アレイの発現およびプロセッシング；続いて、（ｉｉｉ）前記外来核酸へのＲＮＡ媒介干渉。このように、細菌細胞において、いくつかの所謂「Ｃａｓ」タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの自然な機能に関与し、外来ＤＮＡの挿入などのような機能に複数の役割を果たす。
ある一定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、天然起源のＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってよい。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと同じような質的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、天然配列の断片、ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体を含む（しかしこれらに限定されない）が、但し、それらが対応する天然配列ポリペプチドと同じような生物学的活性を有することを条件とする。ここで企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片へと加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有結合修飾体、およびそれらの融合体、両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適する誘導体としては、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合体、共有結合修飾体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片はもちろんＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体も含む、Ｃａｓタンパク質は、細胞から入手可能であり得、または化学的に合成してもよく、またはこれら２つの手順の組み合わせによるものであってもよい。前記細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に生産する細胞であってもよいし、あるいはＣａｓタンパク質を天然に生産する細胞であって、より高い発現レベルで内在性Ｃａｓタンパク質を生産するように、または内在性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外部より導入された核酸からＣａｓタンパク質を生産するように遺伝子操作される細胞であってもよい。場合によっては、前記細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に生産せず、Ｃａｓタンパク質を生産するように遺伝子操作される。
少なくとも２つの２本鎖破断点を作る特定の実施形態において、前記２本鎖破断点の修復は、前記２本鎖破断点間の物質を除去すること、および前記２本鎖破断点間の配列を切除するようにヌクレオチド配列の末端を再結合することを含み得る。複数の実施形態において、切除される配列は、限定ではないが、高度に、より高度に、非常に高度に、または最も高度に発現されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部をコードする配列を含むことがある。さらなる実施形態において、切除される配列は、限定ではないが、高度に、より高度に、非常に高度に、または最も高度に発現されるタンパク質の発現をもたらす調節配列を含むことがある。かかる実施形態において、前記高度に、より高度に、非常に高度に、または最も高度に発現されるタンパク質の発現は、切断前の発現レベルに比べて減少される。
少なくとも２つの２本鎖破断点を作る代替実施形態において、前記２本鎖破断点の修復は、前記２本鎖破断点間の物質を除去すること、それをドナー配列で置換して、２本鎖破断点間の配列をドナー配列で置き換えることを含む。他の実施形態において、除去される配列は、限定ではないが、高度に、より高度に、非常に高度に、または最も高度に発現されるタンパク質をコードするヌクレオチドのすべてまたは一部をコードする配列を含むことがある。さらなる実施形態において、除去される配列は、限定ではないが、高度に、より高度に、非常に高度に、または最も高度に発現されるタンパク質の発現をもたらす調節配列を含むことがある。かかる実施形態において、前記高度に、より高度に、非常に高度に、または最も高度に発現されるタンパク質の発現は、切断前の発現レベルに比べて減少される。
１つの２本鎖破断点を作る実施形態において、前記２本鎖破断点の修復は、前記２本鎖破断点へのまたは前記２本鎖破断点を渡ってのドナー配列の挿入を含む。ある一定の実施形態では、ドナー配列を、高度に、より高度に、非常に高度に、または最も高度に発現されるタンパク質のコード配列に挿入することがある。複数の実施形態において、かかる配列の挿入は、高度に、より高度に、非常に高度に、または最も高度に発現されるタンパク質のコード配列の転写を、非限定的な例としてインフレーム停止コドンの存在により、中断させることがある。さらなる実施形態において、前記ドナーは、限定ではないが、高度に、より高度に、非常に高度に、または最も高度に発現されるタンパク質の発現をもたらす調節配列の機能を破壊することがある。複数の実施形態において、前記高度に、より高度に、非常に高度に、または最も高度に発現されるタンパク質の発現は、切断前の発現レベルに比べて減少される。
さらに他の実施形態において、ドナー配列は、目的のタンパク質をコードすることがある。さらなる実施形態において、ドナー配列からの目的のタンパク質の発現を、前記ドナー配列中に存在する調節配列、および／または前記ドナー位配列が挿入された配列中に存在する調節配列によって制御してもよく、調節してもよく、または前記調節配列に作動的に関連付けてもよい。追加の実施形態において、目的のタンパク質をコードする核酸配列を、ドナー配列とは異なる細胞に供給してもよく、またはドナー配列と共に細胞に供給してもよい。いくつかの実施形態において、ドナー配列は、目的のタンパク質をコードする配列と同じ核酸配列に含有される。
他の実施形態において、高度に、より高度に、非常に高度に、または最も高度に発現されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列 高度に、より高度に、非常に高度に、または最も高度に発現されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、非限定的な例として、ゲノム、プラスミド、コスミド、人工染色体、エピソーム、または細胞内の他のヌクレオチド構造内に位置し得る。
１つの態様では、２本鎖ドナーポリヌクレオチドを、少なくとも１つのヌクレアーゼを使用する前記ドナーのインビボ切断後の最適な内在性遺伝子座への組み込みについて本明細書に記載する。ドナーヌクレオチドは、内在性遺伝子座に組み込まれることになる外在性配列（導入遺伝子）を含み、かつヌクレアーゼのための少なくとも１つの標的部位を含有する。ドナーヌクレオチドは、導入遺伝子配列に隣接する相同領域（例えば、相同アーム）を含むことができる。ドナー配列に存在する染色体相同性は、ヌクレアーゼ結合部位にあることができる。ドナーを切断するためにヌクレアーゼを使用する、ある一定の実施形態において、前記ヌクレアーゼは、染色体を切断するために使用するヌクレアーゼと同じでなく、および染色体とドナー配列間に相同性がないこともあり得る。他の実施形態において、ドナー分子は、相同性非依存型メカニズム（例えば、ＮＨＥＪ）によって内在性遺伝子座に組み込まれる。他の実施形態において、２本鎖ドナーは、少なくとも１ｋｂの長さの導入遺伝子と、インビボ切断のための前記導入遺伝子のヌクレアーゼ標的部位（単数または複数）３’および／または５’とを含む。ドナー分子は、例えば、プラスミドであってもよい。ある一定の実施形態において、ドナーは、内在性遺伝子座のヌクレアーゼ媒介切断後に組み込まれる。ドナー分子のいずれのヌクレアーゼ媒介組み込みにおいても、ドナーを切断するために使用するヌクレアーゼの１つまたはそれ以上は、内在性遺伝子座を切断するために使用するヌクレアーゼの１つまたはそれ以上と同じであってよい。あるいは、ドナーを切断するために使用するヌクレアーゼの１つまたはそれ以上は、内在性遺伝子座を切断するために使用するヌクレアーゼの１つまたはそれ以上と異なってもよい。
いくつかの実施形態において、ドナーは、プラスミド上に含有される。ドナーは、プラスミド内で少なくとも２つのヌクレアーゼ切断部位がそのドナーに隣接している場合、ヌクレアーゼ媒介切断後に組み込まれる。ある一定の実施形態において、ドナープラスミド内のヌクレアーゼ切断部位の配列は、標的化されることになるＥＴＩＰを含有する染色体遺伝子座内のヌクレアーゼ切断部位の配列と同じである。他の実施形態において、ドナー含有プラスミド上のドナーに隣接するヌクレアーゼ切断部位は、染色体のＥＴＩＰ内の切断部位とは異なる。追加の実施形態において、ドナー含有プラスミド内のドナーに隣接するヌクレアーゼ切断部位は、染色体内のヌクレアーゼ切断部位と同じでなくてよく、異なってもよい。さらなる実施形態において、ドナーは、少なくとも２つのヌクレアーゼ切断部位が隣接しているプラスミド上に含有されることがあり、２つのヌクレアーゼの作用によって生ずる染色体のＥＴＩＰ内の欠失部に組み込まれることもある。かかる実施形態において、プラスミド上のドナーに隣接するヌクレアーゼ切断部位と、染色体内のＥＴＩＰのヌクレアーゼ切断部位は、同じであってもよいし、または異なってもよい。他の実施形態において、ドナーは、単一ヌクレアーゼ切断部位しか含有しないプラスミドであり、染色体内のＥＴＩＰのヌクレアーゼ切断部位は、同じであってもよいし、または異なってもよい。
ドナー分子の目的の配列は、プロモーターとともにまたはなしで、機能性ポリペプチド（例えば、ｃＤＮＡ）をコードする１つまたはそれ以上の配列を含むことがある。ある一定の実施形態において、その核酸配列は、抗体、抗原、酵素、成長因子、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンフォカイン、サイトカイン、レポーター、上記のもののいずれかの機能性断片および上記のものの組み合わせをコードする配列を含む。機能性ポリペプチドコード配列がプロモーターを持たない実施形態では、組み込まれた配列の発現を、目的の領域内の内在性プロモーターまたは他の制御要素により駆動される転写によって確実なものにする。他の実施形態では、タンデムカセットを選択部位にこの要領で組み込む：上記のプロモーターを持たない配列を含む前記カセットの第一の成分、続いて転写終結配列、そして自律的発現カセットをコードする第二の配列。追加の配列（コードまたは非コード配列）をドナー分子内の相同アーム間に含めることができる。追加の実施形態において、ドナー核酸は、機能性ＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
標的切断のための本開示方法および組成物を使用して、ゲノム配列の突然変異を誘導してもよい。標的切断を用いて、遺伝子ノックアウトまたは遺伝子ノックダウンを生じさせてもよく（例えば、ゲノム機能解析または標的検証）、およびゲノムへの配列の標的挿入（すなわち、配列ノックイン）を助長してもよい。挿入は、非限定的な例として相同組換えによる、染色体配列の置換によるものであってもよく、または新たな配列（すなわち、目的の領域内に存在しない配列）を所定の標的部位に挿入する標的組み込みによるものであってもよい。ある一定の例では、かかる新たな配列に、染色体内の目的の領域に相同の配列が隣接していてもよい。同じ方法を用いて、野生型配列を突然変異型配列で置換してもよく、または１つの対立遺伝子を異なる対立遺伝子に変換してもよい。
目的のタンパク質の標的組換え生産のための本開示方法を用いて、任意のゲノム配列を非同一配列と置換してもよい。例えば、突然変異型ゲノム配列をその野生型対応物で置換し、それによって、植物の病気の治療方法が得られること；植物病原体に対する耐性が得られること；作物の収量が増加することなどがある。同様に、遺伝子の一方の対立遺伝子を、本明細書に開示する標的組換え方法を用いて異なる対立遺伝子によって置換してもよい。
これらの場合の多くにおいて、目的の領域は、突然変異を含み、ドナーポリヌクレオチドは、対応する野生型配列を含む。同様に、野生型ゲノム配列を突然変異配列により置換しても、そのようなことが望ましい場合には、よい。例えば、癌遺伝子の過発現を、その遺伝子を突然変異させることによって、またはより低い非病原性レベルの発現を支持する配列でその制御配列を置換することによって、逆転させることができる。実際、いかなる様式であっても特定のゲノム配列に依存する何らかの病状が、本明細書に開示する方法および組成物を使用して修正または緩和されることがある。
標的切断、挿入、切除および／または組換えを用いて、非コード配列（例えば、調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、イニシエーター、ターミネーター、スプライス部位）を改変して、遺伝子産物の発現レベルを改変してもよい。かかる方法を、例えば、治療目的、ゲノム機能解析および／または標的検証研究に用いてもよい。
染色質構造の標的修飾を用いて、細胞染色質への融合タンパク質の結合を助長してもよい。追加の実施形態では、本明細書において開示するジンクフィンガー−切断ドメイン融合体に加えて、または前記融合体の代わりに、ジンクフィンガー結合ドメインとリコンビナーゼ（またはその機能性断片）間の１つまたはそれ以上の融合体を使用して、標的組換えを助長してもよい。例えば、共同所有の米国特許第６，５３４，２６１号明細書、およびAkopian et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8688-8691を参照されたい。追加の実施形態では、本開示方法および組成物を使用して、転写活性化または抑制ドメインであって、それらの活性のためにダイマー化（ホモダイマー化またはヘテロダイマー化のいずれか）を必要するドメインと、ＺＦＰ結合ドメインとの融合体をもたらす。これらの場合、融合ポリペプチドは、ジンクフィンガー結合ドメインと機能性ドメインモノマー（例えば、ダイマー転写活性または抑制ドメインからのモノマー）とを含む。正しい位置にある標的部位へのかかる二つの融合ポリペプチドの結合により、機能性転写活性化または抑制ドメインを再構成するようなダイマー化が可能になる。
さらに、上で開示したように、本明細書に示す方法および組成物を、細胞のゲノム内の目的の領域への外在性配列の標的組み込みに使用してもよく、例えば、この場合、切断が、相同性依存型メカニズム（例えば、所定のゲノム配列（すなわち、標的部位）と同一であるか、または相同であるが同一でない１つまたはそれ以上の配列とともに外在性配列を含むドナー配列の挿入）による挿入を増進させる。
ドナー配列は、ゲノム配列内の２本鎖破断の相同性指向型修復（ＨＤＲ）を支持するために十分な相同性を外在性配列に隣接する領域に有することがあり、それによって、ゲノム標的部位に外在性配列が挿入されることがある。したがって、ドナー核酸は、相同性依存型修復メカニズム（例えば、相同組換え）による外在性配列の組み込みを支持するために十分な任意のサイズのものであってよい。いずれの特定の理論によっても拘束されることを望まないが、外在性配列に隣接する相同領域が、２本鎖破断部位での遺伝情報の再合成のためのテンプレートを破断された染色体にもたらすと考えられる。ある一定の実施形態において、２つの同一配列または２つの相同だが同一でない配列（または各々の一方）が、外在性配列に隣接して存在する。外在性配列（または外在性核酸または外在性ポリヌクレオチド）は、目的の領域内に通常は存在しないヌクレオチド配列を含有するものである。
当然のことながら、誘導性プロモーターの制御下にあるＺＦＮ遺伝子とともにその対応する認識配列を有する構築物を、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）に安定的に組み込むことができ、および前記構築物は、認識部位での非相同末端結合の結果として標的突然変異を導入することが証明されている。例えば、国際特許公開番号国際公開第２００８／０２１２０７号パンフレットには、ＺＦＮ媒介相同組換えによる導入遺伝子の正確な挿入方法が記載されている。逆に言えば、ＺＦＮタンパク質を標的生物の外部で発現および精製することができ、そしてその後、標的植物細胞に送達することができる場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって外科的に特異的な突然変異／遺伝子ノックアウトを誘導してもよい。したがって、本開示は、非トランスジェニック遺伝子修飾植物を生産することができ、これはトランスジェニック作物に対する制限を回避することになり、およびトランスジェニックアプローチを必要としない標的遺伝子編集プロセスが可能になる。
標的遺伝子付加は、典型的に、標的遺伝子座に相同な相当な量のＤＮＡが隣接している選択可能マーカー遺伝子のトランスフェクションによって行われる。自発的２本鎖破断点（ＤＳＢ）が、おそらく停止したＤＮＡ複製フォークから、標的遺伝子座に形成される。通常、姉妹染色体をテンプレートとする相同性指向型修復（ＨＤＲ）によって誤りなく修復されるが、ＨＤＲは、その代わりに相同ドナーＤＮＡを使用して破断を治すことができる。追加のＤＮＡ配列をドナープラスミド内の２つの相同領域間に挿入すると、細胞ＤＮＡ修復機構は、はからずもこの遺伝情報を染色体にコピーする。この相同性ベースの標的化は、ドナー相同領域で内の極めて稀なＤＳＢの捕捉に依存するので、有用な頻度での標的組み込みを達成するには標的遺伝子座への大きな相同性を必要とする。
代替実施形態では、ＮＨＥＪにより効率的な相同性ベースのＤＮＡ修復のない細胞タイプに同様の遺伝子付加能力をもたらすことができる。かかるアプローチは、ＮＨＥＪ ＤＮＡ修復経路を優先的に使用する初代、非分裂細胞において遺伝子付加に特に有用であると分かるだろう。ＮＨＥＪによる遺伝子付加は、骨の折れる予備的クローニングおよびシークエンシングを必要とするゲノムシークエンスを伴わないドナー構築として、シークエンシングされていないゲノムにも有用であり得る。非特異的ＤＮＡをＮＨＥＪ媒介ＤＳＢ修復部位で捕捉することができることは理解される。特定の実施形態では、ＺＦＮ切断によって作られる１本鎖オーバーハングに存在する情報を、ＮＨＥＪ ＤＮＡ修復機構を用いて標的ＤＮＡ組み込みを行うために使用することができる。
他の実施形態では、遺伝子付加能力を、ＮＨＥＪによる効率的な相同性ベースのＤＮＡ修復と相同性指向型修復による効率的な相同性ベースのＤＮＡ修復の両方によって得ることができる。かかる実施形態では、ドナー配列の一端をＮＨＥＪによって染色体標的内に組み込み、前記ドナー配列の他端を相同性指向型修復によって前記染色体標的内に組み込む。
ある一定の実施形態は、植物細胞内のＥＴＩＰに安定的に組み込まれた外在性核酸配列の１つまたはそれ以上の産物（すなわち、タンパク質またはＲＮＡ分子）を発現するドナーまたはペイロードＤＮＡの生産方法を含む（図１７）。
本開示の代替実施形態は、マーカー遺伝子の組み込み、およびＥＴＩＰ標的化可能核酸分子に組み込まれたそのマーカータンパク質のその後の発現を含む。いくつかの実施形態において、ＥＴＩＰ遺伝子座への標的ドナーＤＮＡの選択方法は、ＥＴＩＰの５’および３’末端の一方または両方に組み込まれたマーカー遺伝子の発現についての細胞選別および選択を用いる（図１８）。ＦＡＤ２、ＦＡＤ３もしくはＩＰＫ２遺伝子座へのＥＴＩＰの組み込みまたは植物ゲノム内のランダムな位置内へのＥＴＩＰの組み込みは、宿主植物の再生する能力、開花する能力、種子を生産する能力、ならびに何世代にもわたってＥＴＩＰに標的化されるドナーポリヌクレオチド分子によって送達されるその後の外在性核酸配列産物の選択、再生および遺伝性伝達を可能にする能力を損なわせないようである。
さらに、ＥＴＩＰ使用して、旧来の事象遺伝子移入実験において生じさせなければならないトランスジェニック事象の数を低減させることができる。なぜなら、候補遺伝子および植物発現ベクター設計が同じ内在性植物ゲノム位置内に組み込まれるからである。作物およびモデル種（トウモロコシ、大豆、イネ、カノーラ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、トマト、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、綿、ジャガイモ、モロコシ属（sorghum）、飼料草、アブラナ属（Brassica）種（セイヨウアブラナ（B. napus）、Ｂ．ラパ（B. rapa）、Ｂ．オレラセア（B. oleracea）、クロガラシ（B. nigra）、セイヨウカラシナ（B. juncea）、アビシニアカラシ（B. carrinata）を含むが、これらに限定されない）、サトウキビ・サトウダイコン、ヤマカモジグサ属（Brachypodium）、およびアルファルファを含む）を含む、すべての植物種にわたって、ＥＴＩＰ技術を展開することができる。
特定の実施形態は、本明細書に記載する方法を用いて産生されたトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞を含む。具体的には、１つの実施形態において、トランスジェニック植物細胞は、少なくとも１つの標的化可能な核酸分子を含有するヌクレオチド配列（ゲノムのものであってもよい）を有する核酸分子を含み、前記標的化可能な核酸分子は、部位特異的ヌクレアーゼ切断部位と、少なくとも１つのマーカー遺伝子の断片とを含み、前記断片は、機能性マーカー遺伝子発現産物をコードしない。前記標的化可能な核酸分子の特定の実施形態は、第一のマーカー遺伝子の第一の断片と、第二のマーカー遺伝子の第二の断片とを含むことがある。前記標的化可能な核酸分子の他の実施形態は、１つまたはそれ以上の遺伝子発現カセットを含むことがある。さらなる実施形態において、前記第一および第二の断片は、前記部位特異的ヌクレアーゼ切断部位に隣接していることがある。
いくつかの実施形態において、ドナーヌクレオチド配列は、調節要素、例えば、プロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、イントロン、またはＭＡＲに作動可能に連結されることがある。他の実施形態において、前記ヌクレオチド配列は、２つのマーカー遺伝子を含むことがある。
ＥＴＩＰシステムは、植物ゲノムへのドナー配列の標的組み込みの迅速な選択を可能にするプラットフォーム技術を代表する。ある一定の実施形態では、ＥＴＩＰ技術を、植物細胞培養物はもちろん、藻類、コケ、真菌系、および哺乳動物細胞培養物、例えばＮＫ−１、ＣＨＯなどにおいても用いてよい。ＥＴＩＰシステムは、様々な作物種において形質発現過程を通してハイスループット遺伝子および構築物試験を可能にする正確な植物形質転換システムの開発のための基礎を成す。
本明細書において引用する、出版物、特許および特許出願を含む、すべての参考文献は、本開示の明確な詳細と矛盾しない程度に、参照により本明細書に援用されており、ならびに各参考文献が、個々にかつ具体的に参照により援用されていると示されているのと同程度に、および各参考文献がそっくりそのまま述べられているのと同程度に、そのように援用されている。本明細書において論ずる参考文献は、本出願の出願日より前のそれらの開示について単に提供するものである。先行発明のためかかる開示に先行する権利が本発明者らにはないと解釈すべきものは、本明細書にはない。
以下の実施例を、ある特定の特徴および／または態様を例証するために提供する。これらの実施例を、記載する特定の特徴または態様に本開示を限定するものと解釈すべきではない。
実施例１：細菌人工染色体ライブラリーからのパラロガスＦＡＤ２およびＦＡＤ３標的配列の同定
ＢＡＣ構築
細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーは、商業ベンダー（Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ、ワシントン州プルマン）からのものであった。前記ＢＡＣライブラリーは、セイヨウアブラナ変種（Brassica napus L. var.）ＤＨ１０２７５から単離された高分子量ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）断片を含有する１１０，５９２のＢＡＣクローンから成った。ｇＤＮＡをＢａｍＨＩまたはＨｉｎＤＩＩＩ制限酵素いずれかで消化した。約１３５Ｋｂｐの単離されたｇＤＮＡをｐＣＣ１ＢＡＣベクター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州マディソン）にライゲートし、大腸菌株（Escherichia coli str.）ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させた。前記ＢＡＣライブラリーは、２つの異なる制限酵素を使用して構築された偶数のＢＡＣクローンから成った。したがって、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ構築ＢＡＣライブラリーは、１４４の個別の３８４ウェルプレートから成った。同様に、ＢａｍＨＩ構築ＢＡＣライブラリーは、１４４の別々の３８４ウェルプレートから成った。合計１１０，５９２のＢＡＣクローンを単離し、２８８の個別の３８４ウェルプレートに配列した。２８８の個別の３８４ウェルプレートの各々を、迅速なＰＣＲベースのスクリーニングのために単一ＤＮＡ抽出物として前記ベンダーから得た。結果として生じたＢＡＣライブラリーは、おおよそ１５ＧｂｐのｇＤＮＡをカバーし、これは、セイヨウアブラナ変種（Brassica napus L.var.）ＤＨ１０２７５ゲノムの１２倍ゲノムカバー率に相当する（前記セイヨウアブラナ（Brassica napus L.）ゲノムの推定値は、Johnston et al. (2005) Annals of Botany 95: 229-235に記載されているように約１．１３２Ｇｂｐである）。
ＢＡＣライブラリーから単離されたＦＡＤ２コード配列の配列解析
構築されたＢＡＣライブラリーを使用して、ＦＡＤ２遺伝子コード配列を単離した。シークエンシング実験を行って、セイヨウアブラナ変種（Brassica napus L.var.）ＤＨ１０２７５から４つのＦＡＤ２遺伝子パラログの特異的遺伝子配列を同定した。
ＦＡＤ２遺伝子配列は、最初、モデル種シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）において同定された。その遺伝子配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにローカスタグ：Ａｔ３ｇ１２１２０として収載されている。モデル植物種シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）と、４倍体セイヨウアブラナ（Brassica napus）の祖先の１つである２倍体ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）との間の比較ゲノム関係は、以前に記載されている。（Schranz et al. (2006) Trends in Plant Science 11(11): 535-542）。ＦＡＤ２遺伝子に特に関して、比較解析は、その遺伝子の３〜４コピーが前記２倍体アブラナ属（Brassica）ゲノム中に出現することがあることを予測した。さらなる遺伝子マッピング研究がScheffler et al. (1997) Theoretical and Applied Genetics 94; 583-591によって完了された。これらの遺伝子マッピング研究の結果は、ＦＡＤ２遺伝子の４つのコピーがセイヨウアブラナ（Brassica napus）中に存在することを示した。
セイヨウアブラナ変種（B. napus L.var.）ＤＨ１２０７５から構築されたＢＡＣライブラリーのシークエンシング解析により、結果として、４つのＢＡＣ配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４）を単離し、それらからＦＡＤ２Ａ（配列番号５）、ＦＡＤ２−１（配列番号６）、ＦＡＤ２−２（配列番号７）およびＦＡＤ２−３（配列番号８）遺伝子についてのコード配列を決定した。ＦＡＤ２Ａ、ＦＡＤ２−１、ＦＡＤ２−２およびＦＡＤ２−３遺伝子配列を同定し、遺伝子マップを作成した。配列アラインメントプラグラムを用いて、および同一率を用いる近隣結合樹を用いて、それら４つのＦＡＤ２遺伝子の配列解析を行った。配列アラインメントをＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １１．０コンピュータプログラム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）からのＡＬＩＧＮＸ（登録商標）プログラムによって行い、図１に示す。ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）は、修正Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用して、類似性比較のためのおよび注釈付けのためのタンパク質または核酸いずれかの複数の配列アラインメントを生じさせる。近隣結合樹をＪＡＬＶＩＥＷ ｖ２．３（登録商標）ソフトウェアで作成し、図２に示す。（Waterhouse et al. (2009) Bioinformatics 25 (9) 1189-1191）。図２に示すように、単離された配列の解析は、ＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ２−３配列が高レベルの配列類似性を共有すること、および同様に、ＦＡＤ２−１およびＦＡＤ２−２が高レベルの配列類似性を共有することを示した。前記４配列を２つのクレードにカテゴリー分けすることができ、ＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ２−３は第一クレードを構成し、ＦＡＤ２−１およびＦＡＤ２−２は第二クレードを構成する。
次に、セイヨウアブラナ（Brassica napus）からの新たに単離されたＦＡＤ２配列を、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）ゲノムＢＡＣライブラリーから単離されたＢＬＡＳＴゲノムライブラリーおよびブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）ショットガンゲノム配列リードに使用した。ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）およびブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）は両方とも、複２倍体種（ＡＣゲノム、ｎ＝１９）である、セイヨウアブラナ（Brassica napus）の２倍体祖先である。セイヨウアブラナ（Brassica napus）は、さらにブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）（Ａサブゲノム、ｎ＝１０）とブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）（Ｃサブゲノム、ｎ＝９）間の最近の交配事象から得られたものであった。ＢＬＡＳＴｎ解析を用いて、２倍体祖先配列を、セイヨウアブラナ（Brassica napus）から単離された４つの異なるＦＡＤ２コード配列と比較した。この配列解析により、新たに発見されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＦＡＤ２配列と最高の配列類似性を共有する、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）およびブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）からの特異的、注釈付き遺伝子配列を同定した。表１は、新たに同定されたＦＡＤ２コード配列および対応する祖先参照配列アクセッション番号および由来生物を収載するものである。
ＦＡＤ２遺伝子は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ゲノム中に、サブゲノム１つにつき各遺伝子の２つのコピーとして存在する。各遺伝子の１つのコピーはＡサブゲノム上に位置し、同様に各ゲノムの１つのコピーはＣサブゲノム上に存在する。各遺伝子が位置するのがどちらのサブゲノムであるのかを示すための新たな命名規則を記載する。セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＢＡＣゲノムＤＮＡライブラリーから単離された４つの異なるＦＡＤ２コード配列と祖先配列データとの高レベルの配列類似性は、ＦＡＤ２−３が、ＣサブゲノムからのＦＡＤ２配列の複製であり、ＦＡＤ２Ｃと改称される可能性があること；ＦＡＤ２−１が、ＡサブゲノムからのＦＡＤ２配列の複製であり、したがってＦＡＤ２Ａ’と名づけられる可能性があること；および最後に、ＦＡＤ２−２が、ＣサブゲノムのＦＡＤ２配列から複製された二次コピーであり、ＦＡＤ２Ｃ’と名づけられる可能性があることを示唆する。
ＢＡＣライブラリーから単離されたＦＡＤ３コード配列の配列解析
構築されたＢＡＣライブラリーを使用して、ＦＡＤ３遺伝子コード配列を単離した。シークエンシング実験を行って、セイヨウアブラナ変種（Brassica napus L.var.）ＤＨ１０２７５から５つのＦＡＤ３遺伝子パラログの特異的遺伝子配列を同定した。
ＦＡＤ３遺伝子配列は、最初、モデル種シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）において同定された。その遺伝子配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにローカスタグ：Ａｔ２ｇ２９９８０として収載されている。モデル植物種シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）と、４倍体セイヨウアブラナ（Brassica napus）の祖先の１つである２倍体ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）との間の比較ゲノム関係は、以前に記載されている。（Schranz et al. (2006) Trends in Plant Science 11(11): 535-542）。そのＦＡＤ遺伝子に特に関して、比較解析は、その遺伝子の３〜４コピーが２倍体アブラナ属（Brassica）ゲノム中に出現することがあることを予測した。さらなる遺伝子マッピング研究がScheffler et al. (1997) Theoretical and Applied Genetics 94; 583-591によって完了された。これらの遺伝子マッピング研究の結果は、ＦＡＤ３遺伝子の６つのコピーがセイヨウアブラナ（Brassica napus）中に存在することを示した。
セイヨウアブラナ（Brassica napus）からのＦＡＤ３遺伝子に焦点を合わせた以前のシークエンシング努力により、Ａゲノム特異的コピーとＣゲノム特異的コピーの両方が同定され、遺伝子マップが作成された（Hu et al., (2006) Theoretical and Applied Genetics, 113(3): 497-507）。種子特異的ｃＤＮＡライブラリーからのＥＳＴ配列のコレクションは、以前に、サスカチュワン州、サスカトゥーン、１０７サイエンスプレイス、カナダ農務・農産食品省（Agriculture and Agri-food Canada）のアンドリュー・シャープ（Andrew Sharpe） によって植物系統ＤＨ１２０７５から構築され、シークエンシングされていた。二重半数体カノーラ植物ＤＨ１２０７５完全長遺伝子配列からのＥＳＴのコレクションを入手できなかったので、さらに、正しくコールされるヌクレオチドの配列量および信頼性の表示も入手できなかった。したがって、異なるＦＡＤ遺伝子配列リード間の配列変異が、ＦＡＤ３遺伝子ファミリーの様々なパラログの異なる遺伝子コピーに起因すると無条件に考えることはできず、ゲノム配列を入手することもできなかった。しかし、ＥＳＴならびにHu et al., (2006)に記載されている２つのＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ完全長遺伝子配列を用いて統合配列解析を行ったときに、両方の遺伝子にマッチしたＥＳＴを追加の３つのハプロタイプとともに同定した。結果として、ＦＡＤ３の合計６つの特有のハプロタイプを同定した。それらの様々なＦＡＤ３ハプロタイプについてのすべての入手可能なデータの組み立て後、エクソン１において高レベルのエクソン配列多様性を同定した。エクソン１におけるＦＡＤ３配列のその多様性を、遺伝子／対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの設計に利用できる機会として認定した。加えて、ハプロタイプ間に最小の差が認められたエクソン（例えば、エクソン５、６、７および８はＦＡＤ３ＡとＦＡＤ３Ｃ間で異なる１〜３ｂｐを有した）または配列変異が全くないエクソン（例えば、エクソン２および３）を同定した。
セイヨウアブラナ変種（B.napus L.var.）ＤＨ１２０７５から構築されたＢＡＣライブラリーのシークエンシング解析により、結果として６つのＢＡＣ配列（配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４）を単離し、それらからＦＡＤ３Ａ（配列番号１５）、ＦＡＤ３Ａ’（配列番号１６）、ＦＡＤ３Ａ”（配列番号１７）、ＦＡＤ３Ｃ（配列番号１８）、ＦＡＤ３Ｃ”（配列番号１９）およびＦＡＤ３Ｃ’（配列番号２０）遺伝子についてのコード配列を決定した。ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ａ’、ＦＡＤ３Ａ”、ＦＡＤ３Ｃ、ＦＡＤ３Ｃ”およびＦＡＤ３Ｃ’遺伝子配列を同定し、遺伝子マップを作成した。
配列アラインメントプラグラムを用いて、および同一率を用いる近隣結合樹を用いて、それら６つのＦＡＤ３遺伝子の配列解析を行った。配列アラインメントをＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １１．０コンピュータプログラム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）からのＡＬＩＧＮＸ（登録商標）プログラムによって行い、図３に示す。ＡＬＩＧＮＸ（登録商標）は、修正Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用して、類似性比較のためのおよび注釈付けのためのタンパク質または核酸いずれかの複数の配列アラインメントを生じさせる。近隣結合樹をＪＡＬＶＩＥＷ ｖ２．３（登録商標）ソフトウェアで作成し、図４に示す。（Waterhouse et al. (2009) Bioinformatics 25 (9) 1189-1191）。ＦＡＤ３遺伝子を含有すると同定されたコンティグを、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）遺伝子のデータベースに対するＢＬＡＳＴｎクエリーとして使用した。ＦＡＤ３遺伝子を含有する６つのコンティグの各々についての領域をシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＦＡＤ３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ａｔ２ｇ２９９８０）への比較により同定した。その後、ＦＡＤ３コンティグを、すべてのＦＡＤ３遺伝子が５’から３’への配向になるように配向させた。可能な場合には、上流（５’）２つおよび下流（３’）１つほどのシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）遺伝子を含有するようにＦＡＤ３コンティグをトリミングした。配向させたら、ＦＡＤ３遺伝子の完全コード領域を各コンティグから抽出し、異なるＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバー間の関係を表示するための近隣結合樹を生成するために使用した。６つのＦＡＤ３ファミリーメンバーを、３対のＦＡＤ３遺伝子にアラインした（図４）。
ＰＣＲベースのスクリーニング
ＰＣＲプライマーのコホートを、上述のＢＡＣライブラリーをスクリーニングするために設計した。前記プライマーを、遺伝子ファミリーのすべてのメンバーを増幅することになる万能プライマーとして、または標的対立遺伝子増幅のための遺伝子特異的プライマーとして設計した。前記ＰＣＲプライマーを２０ｂｐ長（＋／−１ｂｐ）であるように設計した。そして前記プライマーは、５０％（＋／−８％）のＧ／Ｃ含量を有する。表２および表３は、設計し、合成したプライマーを収載するものである。ＢＡＣライブラリーのクローンをプールし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってスクリーニングした。

２つの異なる条件セットをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いた。第一の一連のＰＣＲ反応は、１Ｘ ＰＣＲ緩衝液（ｄＮＴＰを含有）；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；２００μＭの０．２５Ｕ ＩＭＭＯＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、英国ロンドン）；２５０ｎＭの各プライマー；および約５〜１０ｎｇ テンプレートＤＮＡを含有した。第二の一連のＰＣＲ反応は、ゲノムＤＮＡの増幅のために開発したものであり、５〜１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１Ｘ ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＭ フォワードおよびリバースプライマー、ならびに０．２５Ｕ ＩＭＭＯＬＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、英国ロンドン）を含有した。増幅物をプールして１３μＬの最終体積にし、ＭＪ ＰＴＣ２００（登録商標）サーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）またはＡＢＩ ９７００ ＧＥＮＥ ＡＭＰ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して増幅した。ブライアンら（Scottish Crops Research Institute annual report: 2001-2002）によって記載されたスクリーニングシステムに基づく４次元スクリーニングと上記ＰＣＲ条件を用いて、特定のプレートのＰＣＲベースのスクリーニングを行った。プールされたＢＡＣライブラリーのＰＣＲベースのスクリーニング後、直接サンガーシークエンシング法を用いて、増幅ＰＣＲ産物をシークエンシングした。ＢＩＧＤＹＥ（登録商標）ｖ３．１プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってエタノール、酢酸ナトリウムおよびＥＤＴＡで増幅産物を精製し、電気泳動をＡＢＩ３７３０ｘｌ（登録商標）自動キャピラリー電気泳動プラットフォームで行った。
ＰＣＲベースのスクリーニングおよび高次構造サンガーシークエンシング（conformational Sanger sequencing）後、様々な異なるＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーを含有するプレートのコレクションを同定した。合計４つの特有のＦＡＤ２およびＦＡＤ３パラロガス遺伝子配列を同定した（表４および表５）。各ＦＡＤ２およびＦＡＤ３パラロガス遺伝子配列につき合計２枚のプレートを選択してプレートスクリーニングに付して、ＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子を含有するプレート内の特定のウェルおよびクローンを同定した（表４および表５）。両方のプレートについての特定のウェルを同定し、ＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーの各々について個々のクローンを選択した。

同定されたＦＡＤ遺伝子ファミリーメンバー各々について単一のＢＡＣクローンをシークエンシングによってさらに解析した。ＢＡＣクローンのＤＮＡを単離し、ＬＡＲＧＥ ＣＯＮＳＴＲＵＣＴ ＫＩＴ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を製造業者の説明書に従って使用してシークエンシングのために調製した。抽出されたＢＡＣ ＤＮＡを、ＧＳ−ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を製造業者の説明書に従って使用してシークエンシングのために調製した。シークエンシング反応は、物理的にセクター分けされたＧＳ−ＦＬＸ ＴＩ Ｐｉｃｏ−ｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ（登録商標）を、最適なデータ出力のために対でプールされたＢＡＣとともに使用して行った。ＢＡＣを対で組み合わせ、この場合、ＦＡＤ２遺伝子をＦＡＤ３遺伝子と対にした。すべての生成配列データをＮＥＷＢＬＥＲ ｖ２．０．０１．１４（登録商標）（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、コネチカット州ブランフォード）によって組み立てた。組み立てられたコンティグを、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ ｖ３．７（登録商標）（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、ミシガン州アナーバー）を使用して対応するＦＡＤ遺伝子の存在について手作業で評定した。
４つのＦＡＤ２および６つのＦＡＤ３遺伝子すべての完全ゲノム配列を同定し、十分に特性評価した後、ジンクフィンガーヌクレアーゼを、各々の特異的遺伝子ファミリーメンバーの配列に結合するように設計した。
実施例２：ＦＡＤ２遺伝子に特異的なジンクフィンガー結合ドメインの設計
ＦＡＤ２遺伝子座の様々な機能的配列をコードするＤＮＡ配列に対して指向されたジンクフィンガータンパク質を以前に記載されたように設計した。例えば、Urnov et al. (2005) Nature 435: 646-651を参照されたし。例示的標的配列および認識ヘリックスを表６および表７（認識ヘリックス領域設計）ならびに表８および表９（標的部位）に示す。表８および表９では、ＺＦＰ認識ヘリックスが接触する標的部位のヌクレオチドを大文字で示し、非接触ヌクレオチドを小文字で示す。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）標的部位を、ＦＡＤ２Ａの５つの標的部位およびＦＡＤ３の７つの標的部位を結合するように設計した。ＦＡＤ２およびＦＡＤ３ジンクフィンガー設計を、ＣＣＨＣ構造を伴う少なくとも１つのフィンガーを有するタンパク質をコードするジンクフィンガー発現ベクターに組み込んだ。米国特許出願公開第２００８／０１８２３３２号明細書を参照されたし。詳細には、各タンパク質の最後のフィンガーは、認識ヘリックスのためのＣＣＨＣ主鎖を有した。非カノニカルジンクフィンガーコード配列を、４アミノ酸ＺＣリンカーおよびトウモロコシ（Zea mays）に由来するｏｐａｑｕｅ−２核移行シグナルによってＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（Wah et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10564-10569の配列のアミノ酸３８４−５７９）に融合させて、ＦＡＤ２Ａジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成した。融合タンパク質の発現を、比較的強い構成的プロモーター、例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーターに由来するプロモーターであって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＯＲＦ２３ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１）が隣接するプロモーターによって駆動した。ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルスからのヌクレオチド配列をコードする自己加水分解性２Ａ（Szymczak et al., 2004）を、その構築物にクローニングされた２つのジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質の間に付加させた。例示的ベクターを下に記載する。
活性ヌクレアーゼを識別することが以前に証明されている発芽酵母ベースの系を使用して、最適なジンクフィンガーを切断活性について検証した。例えば、米国特許出願公開第２００９０１１１１１９号明細書；Doyon et al. (2008) Nat Biotechnol. 26: 702-708; Geurts et al. (2009) Science 325: 433を参照されたし。様々な機能性ドメインのためのジンクフィンガーをインビボ用に選択した。設計し、生産し、試験して推定ＦＡＤゲノムポリヌクレオチド標的部位に結合させた非常に多数のＺＦＮのうち、ある一定のＺＦＮを高レベルのインビボ活性を有すると同定し、さらなる実験のために選択した。これらのＺＦＮは、特有のＦＡＤ２ゲノムポリヌクレオチド標的部位のインプランタでの効率的結合および切断が可能であることを特徴とした。


実施例３：ＦＡＤ２遺伝子のジンクフィンガーヌクレアーゼ切断の評価
構築物組み立て
実施例２において説明したような酵母アッセイを用いて同定した、例示的ジンクフィンガーヌクレアーゼのＺＦＮ発現構築物を含有するプラスミドベクターを、当分野において一般に公知の技術および技法を用いて設計し、完成させた。各ジンクフィンガーコード配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流に位置する、ｏｐａｑｕｅ−２核移行シグナルをコードする配列（Maddaloni et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17(18): 7532）に融合させた。
次に、ｏｐａｑｕｅ−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列を、相補的ｏｐａｑｕｅ−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列と対合させた。したがって、各構築物は、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Mattion et al. (1996) J. Virol. 70: 8124-8127）からの２Ａ配列によって隔てられた２つのｏｐａｑｕｅ−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列で構成されている単一のオープンリーディングフレームから成った。前記融合タンパク質の発現を、比較的強い構成的プロモーター、例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーターに由来するプロモーターであって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＯＲＦ２３ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ）が隣接するプロモーターによって駆動した。
ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いてベクターを組み立てた。制限エンドヌクレアーゼをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；マサチューセッツ州イプスウィッチ）から得、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡライゲーションに使用した。プラスミド調製は、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ベツレヘム）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を供給業者の説明書に従って使用して行った。アガロースＴｒｉｓ−酢酸塩ゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ断片を単離した。すべての組み立てたプラスミドのコロニーを、最初にｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、商業シークエンシングベンダー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、アラバマ州ハンツヴィル）がシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。セイヨウアブラナ（B. napus）プロトプラストへの送達前に、Ｐｕｒｅ Ｙｉｅｌｄ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を供給業者の説明書に従って使用して、大腸菌（E. coli）の培養物からプラスミドＤＮＡを調製した。
得られた１１のプラスミド構築物：ｐＤＡＢ１０４００８（ＺＦＮ２４８４５およびＺＦＮ２４８４４構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４００９（ＺＦＮ２４８２０およびＺＦＮ２４８２１構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４０１０（ＺＦＮ２４８２８およびＺＦＮ２４８２９構築物を含有）（図５）、ｐＤＡＢ１０４００３（ＺＦＮ２４８１０およびＺＦＮ２４８１１構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４０１１（ＺＦＮ２４８３２およびＺＦＮ２４８３３構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４００２（ＺＦＮ２４７９４およびＺＦＮ２４７９５構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４００６（ＺＦＮ２４７９６およびＺＦＮ２４７９７構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４００４（ＺＦＮ２４８１４およびＺＦＮ２４８１５構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４００１（ＺＦＮ２４８００およびＺＦＮ２４８０１構築物を含有）、ｐＤＡＢ１０４００５（ＺＦＮ２４８１８およびＺＦＮ２４８１９構築物を含有）、およびｐＤＡＢ１０４００７（ＺＦＮ２４８３６およびＺＦＮ２４８３７構築物を含有）を、制限酵素消化によっておよびＤＮＡシークエンシングによって確認した。表１０は、切断および結合するように各ＺＦＮを設計した、異なる構築物および特異的ＦＡＤ配列を収載するものである。
得られたプラスミド構築物；ｐＤＡＢ１０７８２４（ＺＦＮｓ ２８０２５−２Ａ−２８０２６）、ｐＤＡＢ１０７８１５（ＺＦＮｓ ２７９６１−２Ａ−２７９６２）、ｐＤＡＢ１０７８１６（ＺＦＮｓ ２７９６９−２Ａ−２７９７０）、ｐＤＡＢ１０７８１７（ＺＦＮｓ ２７９７３−２Ａ−２７９７４）、ｐＤＡＢ１０７８２５（ＺＦＮｓ ２８０３５−２Ａ−２８０３６）、ｐＤＡＢ１０７８２６（ＺＦＮｓ ２８０３９−２Ａ−２８０４０）、ｐＤＡＢ１０７８１８（ＺＦＮｓ ２７９８７−２Ａ−２７９８８）、ｐＤＡＢ１０７８２７（ＺＦＮｓ ２８０５１−２Ａ−２８０５２）、ｐＤＡＢ１０７８２１（ＺＦＮｓ ２８００４−２Ａ−２８００５）、ｐＤＡＢ１０７８１９（ＺＦＮｓ ２７９８９−２Ａ−２７９９０）、ｐＤＡＢ１０７８２８（ＺＦＮｓ ２８０５３−２Ａ−２８０５４）、ｐＤＡＢ１０７８２９（ＺＦＮｓ ２８０５５−２Ａ−２８０５６）、ｐＤＡＢ１０７８２０（ＺＦＮｓ ２７９９１−２Ａ−２７９９２）、ｐＤＡＢ１０７８２２（ＺＦＮｓ ２８０２１−２Ａ−２８０２２）およびｐＤＡＢ１０７８２３（ＺＦＮｓ ２８０２３−２Ａ−２８０２４）を、制限酵素消化によっておよびＤＮＡシークエンシングによって確認した。
トランスフェクションのためのＤＮＡの調製
上記ベクターのプラスミドＤＮＡを、１００％（ｖ／ｖ）エタノールでの沈殿および洗浄によって滅菌し、層流フード内で乾燥させた。そのＤＮＡペレットを、下で説明するようなプロトプラスト細胞へのトランスフェクションのために、３０μＬの滅菌二重蒸留水に０．７μｇ／μｌの最終濃度で浮遊させた。一過性トランスフェクションのためにスーパーコイルプラスミドＤＮＡにおよび安定したトランスフェクションのために線形化プラスミドＤＮＡに結果としてなるようにプラスミドＤＮＡの調製を企てた。キャリアＤＮＡ（例えば、魚精子ＤＮＡ）の形質転換用プラスミドへの付加は、プロトプラスト細胞の一過性トランスフェクションには必要でなかった。一過性研究のために、１０６プロトプラストにつき約３０μｇのプラスミドＤＮＡを形質転換ごとに使用した。
トランスフェクション
セイヨウアブラナ変種（Brassica napus L.var.）ＤＨ１０２７５のトランスフェクションを、Spangenberg et al., (1986) Plant Physiology 66: 1-8に記載されているように完了した。培地配合は、Spangenberg G. and Protrykus I. (1995) Polyethylene Glycol-Mediated Direct Gene Transfer in Tobacco Protoplasts. In: Gene Transfer to Plants. (Protrykus I. and Spangenberg G. Eds.) Springer-Verlag, Berlinに記載されている。セイヨウアブラナ（Brassica napus）種子を７０％エタノールで表面滅菌した。種子を１２ｍＬの７０％エタノール溶液に浸漬し、１０分間、そのカクテルを穏やかに揺動させることによって混合した。その溶液をデカントすることによって７０％エタノール溶液を除去し、１％ ｗ／ｖ 次亜塩素酸カルシウムおよび０．１％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０から成る種子滅菌溶液と交換した。種子を種子滅菌溶液に浸漬し、２５分間、そのカクテルを穏やかに揺動させることによって混合した。その種子滅菌溶液をデカントし、滅菌された種子を５０ｍＬの滅菌水で３回すすいだ。最後に、種子を、ペトリ皿の中に置かれた滅菌８０ｍｍ Ｗｈａｔｍａｎ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ｄｉｓｃ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ミズーリ州セントルイス）に移し、種子に滅菌水を軽く浸み込ませた。そのペトリ皿をＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ミズーリ州セントルイス）で密封し、プレートを２５℃で、完全暗所下で、１から２日間、恒温放置した。種子から実生出芽の形跡が観察された後、固体ＧＥＭ培地が入っているペトリ皿に実生を移して、さらなる種子発芽を助長した。実生をＧＥＭ培地上で、２５℃で、４から５日間、恒温放置した。
ある体積の液体ＰＳ培地（約１０ｍＬ）を滅菌ペトリ皿にデカントした。滅菌ピンセットおよびメスを使用して、４葉成長および発育期の４から５日齢実生の地上部分を除去し、廃棄した。２０〜４０ｍｍの長さの胚軸セグメントにより、小さい、原形質リッチなプロトプラストの最高集団を生産することにした。胚軸セグメントを無菌切除し、液体ＰＳ培地に移植した。切除した胚軸セグメントを集め、横方向に切断して５〜１０ｍｍセグメントにした。次に、それらの胚軸セグメントを新たなＰＳ培地に移植し、室温で１時間、恒温放置した。原形質分離した胚軸を、酵素溶液が入っているペトリ皿に移した。胚軸セグメントのすべてをその溶液に浸漬するように気を付けた。ペトリ皿をＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）で密封し、一晩、１６から１８時間、２０〜２２℃で、穏やかに揺動しながら恒温放置した。
プロトプラスト細胞を胚軸セグメントから放出させた。一晩胚軸消化物を穏やかに撹拌して、プロトプラストを酵素溶液に放出させた。ペトリ皿をわずかに傾けて、酵素溶液および植物破片から成る消化浮遊液を移すのを補助した。１０ｍＬピペットを使用して、消化浮遊液を滅菌プロトプラスト濾過（１００マイクロメートルメッシュのフィルター）ユニットに移して、プロトプラストを植物破片からさらに分離した。濾過ユニットを穏やかにタッピングして、篩に捕らわれていた過剰な液体を放出させた。そのプロトプラスト浮遊液、約８から９ｍＬを穏やかに混合し、１４ｍＬ滅菌プラスチック丸底遠心チューブに分配した。各浮遊液の上に１．５ｍＬのＷ５溶液をかぶせた。Ｗ５溶液を注意深く斜めにプロトプラスト浮遊液一面に分注し、最小限の撹拌で１滴ずつ分注した。プロトプラスト浮遊液へのＷ５溶液への添加により、結果としてプロトプラストリッチ界面が生成された。ピペットを使用してこの界面を回収した。次に、回収したプロトプラストを新たな１４ｍＬ遠心チューブに移し、穏やかに混合した。血球計数計を使用して、収量および得られたプロトプラストを測定して、１ミリリットルあたりのプロトプラストの数を決定した。葉組織を消化して葉肉プロトプラストを生成する前記方法を繰り返した。
次に、Ｗ５溶液を１０ｍＬの体積に添加し、それらのプロトプラストを７０ｇのペレットにし、その後、Ｗ５溶液を除去した。残存するプロトプラスト浮遊液を穏やかな振盪により再浮遊させた。プロトプラストが入っている各チューブに５ｍＬのＷ５溶液を満たし、室温で１から４時間、恒温放置した。それらのプロトプラスト浮遊液を７０ｇのペレットにし、すべてのＷ５溶液を除去した。次に、３００μＬの形質転換緩衝液を、単離されたプロトプラストを含有するペレット化プロトプラスト浮遊液の各々に添加した。各々のチューブのプロトプラスト浮遊液に１０μｇのプラスミドＤＮＡを添加した。プラスミドＤＮＡは、上で説明したジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物（例えば、ｐＤＡＢ１０４０１０）から成った。次に、３００μＬの予熱したＰＥＧ４０００溶液をプロトプラスト浮遊液に添加し、それらのチューブを穏やかにタッピングした。プロトプラスト浮遊液および形質転換混合物を一切撹拌せずに１５分間、室温で恒温放置しておいた。さらなる１０ｍＬのＷ５溶液を１ｍＬ、１ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、２ｍＬおよび３ｍＬの一連のアリコートで各チューブに添加し、Ｗ５溶液の各添加間にチューブを穏やかに反転させた。遠心分離機において７０ｇで回転させることによってプロトプラストをペレットにした。すべてのＷ５溶液を除去して、純粋なプロトプラスト浮遊液を残した。
次に、０．５ｍＬのＫ３培地をペレット化プロトプラスト細胞に添加し、それらの細胞を再浮遊させた。それらの再浮遊させたプロトプラスト細胞を、１：１濃度の５ｍＬのＫ３および０．６ｍＬのＳｅａ Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロース（Ｃａｍｂｒｅｘ、ニュージャージー州イーストラザフォード）が入っているペトリ皿の中央に置いた。それらのペトリ皿を１回の穏やかな渦運動で振盪し、２０〜３０分間、室温で恒温放置しておいた。ペトリ皿をＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）で密封し、プロトプラストを２４時間、完全暗所で培養した。暗所での恒温放置後、それらのペトリ皿を６日間、薄明かり（５μＭｏｌ ｍ−２ｓ−１のＯｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘホワイトチューブ）で培養した。培養工程後、滅菌スパチュラを使用して、プロトプラストを含有するアガロースを四分円に分割した。分離した四分円を、２０ｍＬのＡ培地が入っている２５０ｍＬ プラスチック培養容器内に置き、回転振盪機を用いて８０ｒｐｍおよび１．２５ｃｍ 偏心距離で、２４℃で、継続的に薄明かりで１４日間、恒温放置し、その後、各ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物の活性レベルを判定した。
カノーラプロトプラストからのゲノムＤＮＡ単離
トランスフェクトされたプロトプラストを個別の１．５または２．０ｍＬ遠心チューブに供給した。それらの細胞を緩衝溶液中、チューブの底部でペレット化した。液体窒素で細胞を瞬間冷凍し、続いてそれらの細胞を４８時間、ＬＡＢＣＯＮＣＯ ＦＲＥＥＺＯＮＥ ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、ミズーリ州カンザスシティー）において−４０℃および約１３３ｘ１０−３ ｍＢａｒ圧で冷凍乾燥させることによって、ＤＮＡ抽出を行った。組織破壊を必要としなかったことおよびプロトプラスト細胞を直接溶解緩衝液に添加したことを除き、ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ、カリフォルニア州カールズバッド）植物キットを製造業者の説明書に従って使用して、それらの凍結乾燥細胞をＤＮＡ抽出に付した。
カノーラプロトプラストにおけるゲノムＤＮＡ配列切断についてのＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ３ ＺＦＮの試験
複数のＺＦＮ対を標的部位とオーバーラップするように設計するために、ＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ３遺伝子座についてのＺＦＮ標的部位の設計をクラスター化した。ＺＦＮ標的部位のクラスター化は、オーバーラップしているＺＦＮ標的部位のすべてをカプセル化するような１００ｂｐウインドウの中のすべてのＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーから周囲ゲノム配列を増幅するＰＣＲプライマーを設計することを可能にした。したがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリード配列技術を用いて、トランスフェクトされたプロトプラストの標的ＺＦＮ部位の完全性を評定することができた。加えて、設計したＰＣＲプライマーは、配列リードをＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ３ファミリーの特定の遺伝子メンバーに帰属させることになる特定のヌクレオチド塩基を含む必要があった。したがって、すべてのＰＣＲプライマーには、いずれのＺＦＮ標的切断部位からも５〜１０ヌクレオチド離れて結合することが求められることになる。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性が、プライミング部位を除去し得る、増幅を阻害し得る、およびしたがってＮＨＥＪ活性の評定を歪め得る小規模な欠失の原因となることは公知であるからである。
ＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ３遺伝子ファミリーのＺＦＮ標的遺伝子座のすべてに結合するようにプライマーを設計し（表１１）、ＰＣＲ増幅産物のサンガーベースのシークエンシングによってすべての遺伝子ファミリーメンバーの増幅について実験的に試験した。いくつかの場合、すべての遺伝子ファミリーメンバーを区別するプライマーを開発できなかった（表１２および表１３）が、すべての場合、ＦＡＤ２ＡおよびＦＡＤ３の標的遺伝子配列を区別することができた。ＰＣＲプライマー設計後、カスタムＤＮＡバーコード配列をＰＣＲプライマーに組み込み、それらのプライマーを使用して、異なるＺＦＮ標的遺伝子座を区別し、トランスフェクションおよびＺＦＮに対する特異的配列リードを同定した（表１１、１２および１３）。


ＺＦＮでトランスフェクトされたカノーラプロトプラストのＤＮＡ抽出後、標的ＺＦＮ遺伝子座のＰＣＲ増幅を行って、Ｉｌｌｕｍｉｎａベースの合成によるシークエンシング技術のために正しい形式で必要遺伝子座特異的ＤＮＡ分子を生成した。各アッセイを、２５ｎｇ 出発ＤＮＡ（セイヨウアブラナ（Brassica napus）ゲノムの約１２，５００細胞相当量）で作業するために最適化した。適切なレベルでのＮＨＥＪ効率および特異性の評定に必要なカバー率を生じさせるためにサンプルごとに複数の反応、個々のプロトプラストから得たセイヨウアブラナ（Brassica napus）ゲノムの２００，０００コピーに相当する約１６ ＰＣＲ反応を行った。３回ずつ行う同じアッセイおよび１反応で試験することになるすべてのサンプルのためにＰＣＲ増幅マスターミックスを調製し、標的組織に関して行うための最適なサイクル数を決定するために用いられる定量的ＰＣＲ法を用いてアッセイして、ＰＣＲ増幅が試薬制限されておらず、まだ指数増幅段階にあることを確実なものにした。必要な陰性対照反応での実験を、ＭＸ３０００Ｐ ＴＨＥＲＭＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して９６ウェル形式で行った。定量的ＰＣＲプラットフォームから収集した出力データから蛍光の相対的増加をサイクルごとにプロットし、そして過剰なサイクリングおよび共通転写産物または分子の増幅を低減させるために、十分な増幅をもたらすが反応に試薬制限を被らせないアッセイあたりのサイクル数を決定した。未使用のマスターミックスが、定量的ＰＣＲ解析を終え、サイクル数を決定するまで氷上にあり、そしてその後、そのマスターミックスを所望の反応チューブ数（ＺＦＮアッセイあたり約１６）に等分し、ＰＣＲ反応を行った。増幅後、単一ＺＦＮ遺伝子座についてのサンプルを一緒にプールし、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用してＺＦＮあたり２００μＬのプールされた産物を清浄化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリード技術を用いてサンプルをシークエンシングできるようにするために、さらなる対の末端プライマーを生成された断片上に増幅によって結合させることが必要であった。これを、第一増幅ラウンドにおいて付加された配列に一部は相補的であるが必要とされる対の末端配列も含有するプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅によって果たした。共通断片を過増幅することなく対の末端配列をテンプレートに付加させる、実施するＰＣＲサイクルの最適な数を、前に説明したような定量的ＰＣＲサイクル解析のサンプル通過を用いて再び決定した。ＰＣＲ増幅後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｏｌｕｍｎ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用して生成された産物を清浄化し、２．５％アガロースゲルで分割した。Ｓｙｂｅｒ（登録商標）Ｓａｆｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して正しいサイズのバンドとして可視化されたＤＮＡ断片をゲル抽出して、一切の残留ＰＣＲ生成プライマー−ダイマーまたは他の偽断片を除去し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用してそのゲルスライスからＤＮＡを抽出した。ゲル抽出の完了後、ＡＭＰｕｒｅ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州ブレア）を１：１．７のＤＮＡ対ビーズ比で使用してＤＮＡのさらなる清浄化を行った。その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用の定量的ＰＣＲベースのライブラリー定量キット（ＫＡＰＡ）を使用して、１／４０，０００および１／８０，０００希釈で、および反応を３回ずつ行って、ＤＮＡを濃度について評定した。定量的ＰＣＲ結果に基づき、ＤＮＡを２ｎＭの標準濃度に希釈し、ＤＮＡシークエンシングのためにすべてのライブラリーを併せた。ｃＢｏｔ ｃｌｕｓｔｅｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（登録商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用してシークエンシングのためにサンプルを調製し、製造業者の説明書に従ってＩＬＬＵＭＩＮＡ ＧＡ２ｘ（登録商標）を１００ｂｐペアエンドシークエンシングリードで用いてシークエンシングした。
標的ジンクフィンガー部位での非相同末端結合の検出のためのデータ解析法
シークエンシング反応、およびベースコーリングのためにＩｌｌｕｍｉｎａバイオインフォマティックパイプラインを使用して行った一次データコーリングの完了後、各場合、完全解析を行って標的ＺＦＮ部位における欠失塩基を同定した。入力配列のリストに従ってコンピュータによりＤＮＡ配列からバーコードを抽出し、選別するようにカスタムＰＥＲＬスクリプトを設計した。バーコードは、誤帰属配列リードを低減させるために、許容される３０より大きいＰｈｒｅｄスコアで基準配列とマッチしなければならなかった。使用した異なるバーコード群に配列リードをビニングした後、すべての配列にわたってクオリティフィルターを通した。このクオリティフィルターは、第二のカスタム開発ＰＥＲＬスクリプトであった。「Ｎ」とコールされる塩基が３つより多かった場合、または中央値Ｐｈｒｅｄスコアが２０未満であった場合、または２０未満のＰｈｒｅｄスコアを有する３連続塩基があった場合、または配列リードが４０ｂｐの長さより短かった場合、配列リードを除外した。対の配列リードの両方が入手可能である場合、ＮＥＸＴＧＥＮＥ（登録商標）（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、ペンシルバニア州ステートカレッジ）パッケージを使用して残りの配列をマージした。その後、それらの残りのマージされた配列リードを、第三のカスタムＰＥＲＬスクリプトと、その残りの配列識別子の最後に記録された、同定された重複配列の数のカウントを使用して、特有の配列リードのコレクションに縮小した。その後、ＮＥＸＴＧＥＮＥ（登録商標）ソフトウェアを使用してそれらの特有の配列リードをＦＡＤ２およびＦＡＤ３参照配列にアラインし、ギャップ付きＦＡＳＴＡアラインメントファイルを作成した。
そのギャップ付きＦＡＳＴＡファイルを使用し、４つのカスタムＰＥＲＬスクリプトを使用してギャップ付き塩基位置番号の入力基準への変換を行った。これは、異なる遺伝子ファミリーメンバー（異なる遺伝子ファミリーメンバー間の同祖またはパラロガス配列変異のいずれか）を区別する塩基を、組み立てたデータの中で同定することを可能にした。塩基ナンバリングの変換を実行し次第、各々の特有の配列リードについてハプロタイプレポートを生成することおよびリードを特定の遺伝子ファミリーメンバーに割り当てることが可能であった。リードを遺伝子によりグループ分けし次第、ＺＦＮ標的部位を包囲する１０ｂｐウインドウを同定し、評定した。欠失を有する配列の数を失われた塩基の数とともに遺伝子ごとに記録した。
その後、データを、１０，０００配列リードあたり１から１０塩基が標的ＺＦＮ部位において欠失されている配列の数とともに、複数ライン折れ線グラフとしてグラフ表示した（図６）。この解析を、すべてのＺＦＮトランスフェクションとともに対照トランスフェクションについて行った。いくつかの場合、天然ＤＮＡ配列中のリピートは、標的ＺＦＮ部位におけるシークエンシングエラー、例えば、単一塩基欠失の出現率の増加として一般に見られるエラーをもたらし、これは、すべてのサンプルにおいて、ＺＦＮでトランスフェクトしたサンプルにおいても、対照においても、報告された（図７）。
これらの結果から、ＮＨＥＪのより大きな活性によって判定して、ＦＡＤ２標的部位での最高レベルのＺＦＮ活性を遺伝子座Ｅにおいて同定した。プラスミドｐＤＡＢ１０４０１０上にコードされたＺＦＮ（すなわち、ＺＦＮ２４８２８および２４８２９）を、有意なゲノムＤＮＡ切断活性および最小の非標的活性というその特徴を考えて、特別設計の導入遺伝子組み込みプラットフォーム（ＥＴＩＰ）のインプランタ標的化のために選択した。
実施例４：特別設計の導入遺伝子組み込みプラットフォーム（ＥＴＩＰ）カノーラ植物系統のための遺伝子構築物
下で説明するプラスミドベクター構築物は、当業者に一般に公知の方法および技法を用いて造った。この段落の中で説明する特定の試薬および技法の応用は、当業者には容易に分かり、プラスミドベクター構築物を造るという所望の目的を達成するために他の試薬および技法と容易に交換することができよう。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；マサチューセッツ州イプスウィッチ）から得た。ライゲーションは、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で完了した。１つのエントリーベクターをシングルディスティネーションベクターに組み立てるためにＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＧａｔｅｗａｙ反応を行った。１つのエントリーベクターをシングルディスティネーションベクターに組み立てるためにＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用してＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）反応を行った。プラスミド調製は、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ．，ペンシルバニア州ベツレヘム）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を供給業者の説明書に従って使用して行った。アガロースＴｒｉｓ−酢酸塩ゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ断片を単離した。すべての組み立てたプラスミドのコロニーを、最初にｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、商業シークエンシングベンダー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、アラバマ州ハンツヴィル）がシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。
カノーラのＦＡＤ２Ａ遺伝子座内へのＥＴＩＰの正確な組み込みのための直接−送達ベクター
セイヨウアブラナ（B. napus）のＦＡＤ２Ａ遺伝子への特異的組み込みのためのＥＴＩＰ含有ベクターｐＤＡＳ０００１３０（図８、配列番号１４１のようなＴ鎖インサート）の構築に標準クローニング法を用いた。この構築物を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物ｐＤＡＢ１００４０１０でカノーラプロトプラストに送達されるように設計した。ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物は、ＦＡＤ２Ａ遺伝子座を切断することとなり、そしてその後、ｐＤＡＳ０００１３０構築物が相同性指向型修復メカニズムによってカノーラゲノム内に組み込まれることになり、その構築物を、ＮＨＥＪ媒介組み込みのために相同隣接領域を除去することによって修飾することができる。このＥＴＩＰは、追加のＺＦＮ認識配列によって隔てられた４つの発現カセット（２つは不完全）と、別のＺＦＮ認識配列を含有する特別設計のランディングパッド（ＥＬＰ）とから成る。前記追加のＺＦＮ認識配列は特有のものであり、ＥＴＩＰおよびＥＬＰ導入遺伝子挿入物内へのポリヌクレオチド配列の導入のために標的化されるようにそれらを設計した。同様に、前記ＺＦＮ認識配列は、ポリヌクレオチド配列の切除に利用することができる。第一の遺伝子発現カセットは、不完全なｄｓＲＥＤ発現カセットであり、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ポリユビキチン１０（ＡｔＵｂｉプロモーター）遺伝子からのプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロン（Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493）、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、造礁サンゴ・イソギンチャクモドキ属の１種（Discosoma sp.）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）からの２１０ｂｐのｄｓＲｅｄ遺伝子（ｄｓ ＲＥＤ（双子葉植物最適化）エクソン１）、続いてシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）チオレダクターゼ様遺伝子からのイントロン（Ａｔチオレダクターゼからのイントロン１：アクセッション番号：ＮＣ＿００３７４）、そしてトウモロコシ（Zea mays）Ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ−１（Ｖｐ１）遺伝子の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（Ｚｍｌｉｐターミネーター：Paek et al., (1998) Molecules and Cells, 8(3): 336-342）を含有した。第二の発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルスからの５’ＵＴＲを含む１９Ｓプロモーター（ＣａＭＶ １９Ｓ：Cook and Penon (1990) Plant Molecular Biology 14(3):391-405）、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、大腸菌（E. coli）からのｈｐｈ遺伝子（ｈｐｈ（ＨｙｇＲ）：Kaster et al., (1983) Nucleic Acids Research 11(19): 6895-6911）、そしてＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム１の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲ（Ａｔ−ＯＲＦ１ターミネーター：Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50）を含有した。第三の発現カセットは、不完全ＰＡＴ発現カセットであり、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）４−クマリル−ＣｏＡシンターゼからの第一イントロン（イントロン＃２ ４−クマリルＣｏＡシンターゼｖ：アクセッション番号：Ａｔ３ｇ２１３２０／ＮＣ００３０７４）、続いて、ホフィノトリシン（phophinothricin）、グルホシネートおよびビアラホスを含むグルタミンシンセターゼの阻害剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離された、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の合成、植物最適化バージョンの最後の２５６ｂｐ（ＰＡＴ（ｖ６）３’末端：Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1): 25-37）を含有した。このカセットは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム２３の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲ（ＡｔｕＯＲＦ２３ターミネーター：Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50）を末端に有した。第四の発現カセットは、ｉｐｔ遺伝子カセットであり、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）ＤＮＡ結合タンパク質ＭＹＢ３２遺伝子（Ｕ２６９３３）からのプロモーターおよび５’ＵＴＲの５８８ｂｐ 短縮バージョン（ＡｔＭＹＢ３２（Ｔ）プロモーター：Li et al., (1999) Plant Physiology 121: 313）、続いてＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）からのイソペンチルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子、そしてカリフラワーモザイクウイルスからの転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３５ｓターミネーター（ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター：Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101(4): 1395-1396）を含有した。ＦＡＤ２Ａへの送達のために、ＥＴＩＰ配列の各末端を、セイヨウアブラナ（B. napus）のＦＡＤ２Ａ遺伝子へのｐＤＡＢ１０４０１０にコードされているＺＦＮの送達によって誘導される２本鎖破断の位置のいずれかの側からの１ｋｂのＦＡＤ２Ａゲノム配列に隣接させた。
ＥＴＩＰ配列は、商業遺伝子合成ベンダー（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が合成した。Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）を、製造業者により供給された説明書に従って使用して、セイヨウアブラナ（B. napus）ＤＨ１２０７５の葉組織から精製したゲノムＤＮＡからＦＡＤ２Ａゲノム配列の１ｋｂセグメントを増幅した。Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用して、それらの１ｋｂ ＦＡＤ２Ａ配列をＥＴＩＰベクターにライゲートした。すべての組み立てたプラスミドのコロニーを、最初にｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州）から得た。プラスミド調製は、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰｕｒｅ Ｙｉｅｌｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州）を供給業者の説明書に従って使用して行った。ＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡをシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。
カノーラのＦＡＤ３遺伝子座へのＥＴＩＰの正確な組み込みのための直接−送達ベクター
セイヨウアブラナ（B. napus）のＦＡＤ３ＡまたはＦＡＤ３Ｃ遺伝子座への特異的組み込みのためのＥＴＩＰ含有ベクターｐＤＡＳ０００２７１（図９、配列番号１４２のようなＴ鎖インサート）、ｐＤＡＳ０００２７２（図１０、配列番号１４３のようなＴ鎖インサート）、ｐＤＡＳ０００２７３（図１１、配列番号１４４のようなＴ鎖インサート）、ｐＤＡＳ０００２７４（図１２、配列番号１４５のようなＴ鎖インサート）およびｐＤＡＳ０００２７５（図１３、配列番号１４６のようなＴ鎖インサート）の構築に標準クローニング法を用いた。この構築物を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物ｐＤＡＢ１０７８２８またはｐＤＡＢ１０７８２９でカノーラプロトプラストに送達されるように設計した。特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物がＦＡＤ３Ａ遺伝子座を切断することになり、そしてその後、ｐＤＡＳ０００２７３またはｐＤＡＳ２７５構築物が相同性指向型修復メカニズムによってカノーラゲノム内に組み込まれることになる。同様に、特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物がＦＡＤ３Ｃ遺伝子座を切断することになり、そしてその後、ｐＤＡＳ０００２７１、ｐＤＡＳ０００２７２またはｐＤＡＳ０００２７４構築物が相同性指向型修復メカニズムによってカノーラゲノム内に組み込まれることになる。ＥＴＩＰは、追加のＺＦＮ認識配列によって隔てられた４つの発現カセット（２つは不完全）と、別のＺＦＮ認識配列を含有する特別設計のランディングパッド（ＥＬＰ）とから成る。前記追加のＺＦＮ認識配列は特有のものであり、ＥＴＩＰおよびＥＬＰ導入遺伝子挿入物内へのポリヌクレオチド配列の導入のために標的化されるようにそれらを設計した。同様に、前記ＺＦＮ認識配列は、ポリヌクレオチド配列の切除に利用することができる。第一の遺伝子発現カセットは、不完全なｄｓＲＥＤ発現カセットであり、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ポリユビキチン１０（ＡｔＵｂｉプロモーター）遺伝子からのプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロン（Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493）、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、造礁サンゴ・イソギンチャクモドキ属の１種（Discosoma sp.）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）からの２１０ｂｐのｄｓＲｅｄ遺伝子（ｄｓ ＲＥＤ（双子葉植物最適化）エクソン１）、続いてシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）チオレダクターゼ様遺伝子からのイントロン（Ａｔチオレダクターゼからのイントロン１：アクセッション番号：ＮＣ＿００３７４）、そしてトウモロコシ（Zea mays）Ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ−１（Ｖｐ１）遺伝子の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（Ｚｍｌｉｐターミネーター：Paek et al., (1998) Molecules and Cells, 8(3): 336-342）を含有した。第二の発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルスからの５’ＵＴＲを含む１９Ｓプロモーター（ＣａＭＶ １９Ｓ：Cook and Penon (1990) Plant Molecular Biology 14(3): 391-405）、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、大腸菌（E. coli）からのｈｐｈ遺伝子（ｈｐｈ（ＨｙｇＲ）：Kaster et al., (1983) Nucleic Acids Research 11(19): 6895-6911）、そしてＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム１の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲ（ＡｔＯＲＦ１ターミネーター：Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50）を含有した。第三の発現カセットは、不完全ＰＡＴ発現カセットであり、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）４−クマリル−ＣｏＡシンターゼからの第一イントロン（イントロン＃２ ４−クマリルＣｏＡシンターゼｖ：アクセッション番号：Ａｔ３ｇ２１３２０／ＮＣ００３０７４）、続いて、ホフィノトリシン（phophinothricin）、グルホシネートおよびビアラホスを含むグルタミンシンセターゼの阻害剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離された、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の合成、植物最適化バージョンの最後の２５６ｂｐ（ＰＡＴ（ｖ６）３’末端：Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1): 25-37）を含有した。このカセットは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム２３の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲ（ＡｔｕＯＲＦ２３ターミネーター：Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50）を末端に有した。第四の発現カセットは、ｉｐｔ遺伝子カセットであり、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）ＤＮＡ結合タンパク質ＭＹＢ３２遺伝子（Ｕ２６９３３）からのプロモーターおよび５’ＵＴＲの５８８ｂｐ 短縮バージョン（ＡｔＭＹＢ３２（Ｔ）プロモーター：Li et al., (1999) Plant Physiology 121:313）、続いてＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）からのイソペンチルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子、そしてカリフラワーモザイクウイルスからの転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３５ｓターミネーター（ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター：Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101(4): 1395-1396）を含有した。ＦＡＤ３ＡまたはＦＡＤ３Ｃへの送達のために、ＥＴＩＰ配列の各末端を、セイヨウアブラナ（B. napus）のＦＡＤ３ＡまたはＦＡＤ３Ｃ遺伝子内へのコードされているＺＦＮの送達によって誘導される２本鎖破断の位置のいずれかの側からの１ｋｂのＦＡＤ３ＡまたはＦＡＤ３ｃゲノム配列に隣接させた。
ＥＴＩＰ配列は、商業遺伝子合成ベンダー（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が合成した。Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）を、製造業者により供給された説明書に従って使用して、セイヨウアブラナ（B. napus）ＤＨ１２０７５の葉組織から精製したゲノムＤＮＡからＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃゲノム配列の１ｋｂセグメントを増幅した。Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用して、それらの１ｋｂ ＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ配列をＥＴＩＰベクターにライゲートした。すべての組み立てたプラスミドのコロニーを、最初にｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州）から得た。プラスミド調製は、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰｕｒｅ Ｙｉｅｌｄ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭＡＸＩＰＲＥＰ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州）を供給業者の説明書に従って使用して行った。ＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡをシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。
対照ベクター
対照ベクターを使用して、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）細胞ベースの選別法を開発した。２つの遺伝子発現カセットから成る対照ベクター、ｐＤＡＳ００００３１（図１４：配列番号１４７のようなＴ鎖インサート）の構築に標準クローニング法を用いた。第一の遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス１９ｓプロモーター（ＣａＭＶ １９Ｓプロモーター；Shillito, et al., (1985) Bio/Technology 3; 1099-1103）：：ヒグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ（ＨｙｇＲ）；米国特許第４，７２７，０２８号明細書）：：およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）オープンリーディングフレーム１ ３’非翻訳領域（ＡｔＯＲＦ１ターミネーター：Huang et al., (1990) J. Bacteriol. 1990 172: 1814-1822）を含有した。第二の遺伝子発現カセットは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター；Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493)：：ｄｓＲＥＤ（ｄｓＲＥＤ（Ｄ）；米国特許第６，８５２，８４９号明細書）、およびシロイヌナズナ属（Arabidopsis）からのイントロン（イントロン＃１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０２５６３９．１）：：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）オープンリーディングフレーム２３ ３’非翻訳領域（ＡｔＯＲＦ２３ターミネーター；米国特許第５，４２８，１４７号明細書）をトランス配向（例えば、ヘッドトゥーヘッド配向）でのインフレーム融合体として含有した。ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いてこのプラスミドベクターを組み立てた。
カノーラへのＥＴＩＰのランダム組み込みのためのバイナリーベクターの構築
セイヨウアブラナ（Brassica napus）のゲノム内へのＥＴＩＰ Ｔ鎖配列のランダム組み込みのために２つのバイナリーベクターを構築した。ＥＴＩＰ含有ベクターｐＤＡＳ００００３６（図１５、配列番号１４８のようなＴ鎖インサート）およびｐＤＡＳ００００３７（図１６、配列番号１４９のようなＴ鎖インサート）の構築に標準クローニング法を用いた。これらのＥＴＩＰベクターは、ＺＦＮ認識配列によって隔てられた４つの発現カセット（２つは不完全）と、さらなるＺＦＮ認識配列を含有する特別設計のランディングパッド（ＥＬＰ）とから成る。第一の遺伝子発現カセットは、不完全なｄｓＲＥＤ発現カセットであり、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ポリユビキチン１０（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター）遺伝子からのプロモーター（pomoter）、５’非翻訳領域およびイントロン（Norris et al., (1993) Plant Molecular Biology, 21(5): 895-906）、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、造礁サンゴ・イソギンチャクモドキ属の１種（Discosoma sp.）からの２１０ｂｐのｄｓＲｅｄ遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）、続いてシロイヌナズナ属（Arabidopsis）チオレダクターゼ様遺伝子からのイントロン（アクセッション番号（Accesion No）：ＮＣ＿００３７４）、そしてトウモロコシ（Zea mays）Ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ−１（Ｖｐ１）遺伝子の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）（Ｚｍ Ｌｉｐターミネーター：Paek et al., (1998) Molecules and Cells, 8(3): 336-342）を含有した。第二の発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルスからの５’ＵＴＲを含む１９Ｓプロモーター（ＣｓＶＭＶ １９プロモーター：Cook and Penon (1990) Plant Molecular Biology 14(3): 391-405）、続いて双子葉植物における発現のためにコドン最適化された、大腸菌（E. coli）からのｈｐｈ遺伝子（ｈｐｈ（Ｄ）：Kaster et al., (1983) Nucleic Acids Research 11(19): 6895-6911）、そしてＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲ（ＡｔＯＲＦ１ターミネーター：Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50）を含有した。第三の発現カセットは、不完全ＰＡＴ発現カセットであり、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）４−クマリル−ＣｏＡシンターゼからの第一イントロン（アクセッション番号：Ａｔ３ｇ２１３２０（ＮＣ００３０７４））、続いて、ホフィノトリシン（phophinothricin）、グルホシネートおよびビアラホスを含むグルタミンシンセターゼの阻害剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードしている、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離された、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子の合成、植物最適化バージョンの最後の２５６ｂｐ（ＰＡＴｖ６（エクソン２）；Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1): 25-37）を含有した。このカセットは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム２３（ＯＲＦ２３）の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲ（ＡｔＯＲＦ２３ターミネーター：Barker et al., (1983) Plant Molecular Biology 2(6): 335-50）を末端に有した。第四の発現カセットは、ｉｐｔ遺伝子カセットであり、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）ＤＮＡ結合タンパク質ＭＹＢ３２遺伝子（Ｕ２６９３３）からのプロモーターおよび５’ＵＴＲの５８８ｂｐ 短縮バージョン（ＡｔＭＹＢ３２（Ｔ）プロモーター：Li et al., (1999) Plant Physiology 121:313）、続いてＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）からのイソペンチルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子、そしてカリフラワーモザイクウイルスからの転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３５ｓターミネーター（ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター：Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101(4): 1395-1396）を含有した。
発現カセットおよびＥＬＰは、商業遺伝子合成ベンダー（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）がＭｕｌｔｉ−Ｇａｔｅｗａｙ ｓｉｔｅを用いて合成した。エントリークローンは、ＢＰ ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｐＤＯＮＲ２２１ ｖｅｃｔｏｒ ｓｕｉｔｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して各発現カセットおよびＥＬＰで構築した。その後、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ Ｐｌｕｓ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＧａｔｅｗａｙ可能なバイナリーベクターとのＭｕｌｔｉ−Ｇａｔｅｗａｙ反応にそれらのエントリークローンを使用した。すべての組み立てたプラスミドのコロニーを、最初にｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州）から得た。プラスミド調製は、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）またはＰｕｒｅ Ｙｉｅｌｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州）を供給業者の説明書に従って使用して行った。ＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡをシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。
実施例５：ＥＴＩＰカノーラ植物系統の産生
セイヨウアブラナ（Brassica napus）の形質転換
実施例４において説明した、ＥＴＩＰ構築物（ｐＤＡＳ００００３６、ｐＤＡＳ００００３７）、ＤＳ−Ｒｅｄ対照構築物（ｐＤＡＳ００００３１）、ならびにＦＡＤ２Ａ、ＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ部位特異的構築物（ｐＤＡＳ０００１３０、およびｐＤＡＳ０００２７１〜ｐＤＡＳ０００２７５）ならびに付随ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｐＤＡＢ１０４０１０、ｐＤＡＢ１０７２８およびｐＤＡＢ１０７２９）。バイナリーベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＧＶ３１０１：ＰＭ９０に形質転換した。実施例３において説明したトランスフェクションプロトコルを、多少の変更を加えて用いて、セイヨウアブラナ（Brassica napus）プロトプラスト細胞の形質転換を完了した。
前記プロトコルの変更は、Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロースの代わりのアルギン酸ナトリウムの使用を含んだ。ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物とＥＴＩＰ構築物の両方をセイヨウアブラナ（Brassica napus）プロトプラスト細胞に共送達するトランスフェクション実験を、５：１モル比のプラスミドＤＮＡを含むＤＮＡ濃度で完了した。他のＥＴＩＰおよび対照プラスミド構築物は、３０μｇのプラスミドＤＮＡの濃度で形質転換させた。したがって、ｐＤＡＳ０００１３０は、２７．８μｇのプラスミドＤＮＡの濃度から成り、およびｐＤＡＢ１０４０１０は、２．２μｇのプラスミドＤＮＡの濃度から成った。他のＥＴＩＰおよび対照プラスミド構築物は、３０μｇのプラスミド濃度で形質転換した。
前記プロトコルのさらなる変更は、１．５ｍｇ／ｍＬのヒグロマイシンを含有する培地中の形質転換プロトプラストからの全草の繁殖を含んだ。全草の繁殖には、Ａ培地を２週間ごとに取り換えることおよびプロトプラスト由来のコロニーをモニターすることを必要とした。プロトプラスト由来のコロニーが直径おおよそ２〜３ｍｍに成長した後、固体ＭＳ ｍｏｒｐｈｏ培地が入っている１２−ｗｅｌｌ ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ミズーリ州セントルイス）の個々のウェルにコロニーを移した。プレートを１から２週間、２４℃で、連続的薄明かりのもとで、カルスが直径８〜１０ｍｍのサイズに増殖するまで、恒温放置した。プロトプラスト細胞が直径１〜２ｃｍの直径に達した後、ＭＳ ｍｏｒｐｈｏ培地が入っている個々の２５０ｍＬ培養容器にプロトプラスト細胞を移した。それらの容器を、２４℃で、１６時間昼（２０μＭｏｌ ｍ−２ｓ−１のＯｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘホワイトチューブ）および８時間夜の条件下で恒温放置した。１から２週間以内に、複数の苗条が見られた。それらの苗条が３〜４ｃｍの長さに達した後、ＭＳ培地が入っている２５０ｍＬ培養容器に苗条を移した。それらの２５０ｍＬ培養容器を、２４℃で、１６時間昼（２０μＭｏｌ ｍ−２ｓ−１のＯｓｒａｍ Ｌ３６ Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘホワイトチューブ）および８時間夜の条件下で恒温放置した。それらの苗条が小植物に発育するまで苗条を培養容器内で維持し、小植物に発育した時点で温室に移して成熟するまで成長させた。
実施例６：カノーラへのＴ−ＤＮＡ含有ＥＴＩＰの組み込みについての分子確認
カノーラへのＥＴＩＰのランダム組み込みについての分子確認
ＤＮＥＡＳＹ ９６ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（商標）またはＤＮＥＡＳＹ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、すべての推定トランスジェニック植物の葉組織からゲノムＤＮＡを抽出した。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）の残存率について試験するためにｐＴｉＣ５８フォワード（配列番号１５０ ＣＧＡＧＡＡＣＴＴＧＧＣＡＡＴＴＣＣ）およびｐＴｉＣ５８リバース（配列番号１５１ ＴＧＧＣＧＡＴＴＣＴＧＡＧＡＴＴＣＣ）からｖｉｒＣを増幅するために設計したプライマー、セイヨウアブラナ（B. napus）からアクチンを増幅するために設計したプライマー；アクチンフォワード（配列番号１５２ ＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧ）およびアクチンリバース（配列番号１５３ ＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧ）を使用して、ＰＣＲにより各植物からのゲノムＤＮＡを解析して、それらのゲノムＤＮＡの質を確認した。ｈｐｈ遺伝子を増幅するためにプライマーを設計した；ＥＴＩＰによってコードされたＨＰＨフォワード（配列番号１５４ ＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＣＧ）およびＨＰＨリバース（配列番号１５５ ＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣ）。ｖｉｒＣプライマーから産物をもたらさなかったが、正しいサイズの産物がアクチンおよびｈｐｈへのプライマーで増幅された植物を、トランスジェニックとして分類した。
第二のスクリーニングを完了し、このスクリーニングでは、Ｔ−ＤＮＡ領域の外側でバイナリーベクターを増幅するために設計した５セットのプライマー［［（１Ｆ 配列番号１５６ ＡＴＧＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＣ；１Ｒ 配列番号１５７ ＧＡＡＧＧＧＡＡＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＣＣ）（２Ｆ 配列番号１５８ ＴＧＣＧＣＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＣＡＡＡＴ；２Ｒ ＳＥ ＩＤ ＮＯ：１５９ ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＣ）（３Ｆ 配列番号１６０ ＣＣＴＧＣＡＴＴＣＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣ；３Ｒ 配列番号１６１ ＣＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＧＣ）（４Ｆ 配列番号１６２ ＡＴＴＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴ；４Ｒ 配列番号１６３ ＧＣＣＡＡＣＧＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴＧＣＴ）（５Ｆ 配列番号１６４ ＧＣＣＣＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＡＡＧＴ；５Ｒ 配列番号１６５ ＧＴＡＡＣＴＴＡＧＧＡＣＴＴＧＴＧＣＧＡ）］を使用してＰＣＲにより各トランスジェニック植物からのｇＤＮＡを増幅した。正しいおよび予想されたサイズのＰＣＲ産物がプライマーセット３および４から増幅された植物は、主鎖組み込み（backbone integration）を有するとみなした。
主鎖組み込みのない植物からのＤＮＡを、修正ＣＴＡＢ法（Maguire et al,. (1994) Plant Molecular Biology Reporter, 12(2): 106-109）を用いて２０ｇの葉組織から精製した。単離されたｇＤＮＡをいくつかの制限酵素で消化し、１０μｇのｇＤＮＡをアガロースゲルでの電気泳動によって分離し、標準サザンブロット法プロトコルを用いて膜に転写した。ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｒｏｃｈｅ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）を製造業者の説明書に従って使用して膜をプローブした。各発現カセットへの、ＥＬＰへのおよび内在性対照遺伝子、アクチンへのプローブは、ＥＴＩＰ構築物から、次のプライマーを使用して増幅した：（ＩＰＴ−Ｆ 配列番号１６６ ＴＣＴＣＴＡＣＣＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＧ；ＩＰＴ−Ｒ 配列番号１６７ ＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴＴＡＡＣＴＣＴＧＧＣ；ｄｓＲＥＤ−Ｆ 配列番号１６８ ＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＧＡＧＡＡＣＧ；ｄｓＲＥＤ−Ｒ 配列番号１６９ ＴＴＣＣＧＴＡＴＴＧＧＡＡＴＴＧＡＧＧ；ＰＡＴ−Ｆ 配列番号１７０ ＴＴＧＣＴＴＡＡＧＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＣＧ；ＰＡＴ−Ｒ 配列番号１７１ ＴＧＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＧＧ；ＥＬＰ−Ｆ 配列番号１７２ ＡＴＧＡＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＴＡＧＴＧＧＧ；ＥＬＰ−Ｒ 配列番号１７３ ＡＧＧＧＴＧＴＡＡＧＧＴＡＣＴＡＧＣＣ；Ｈｐｈ−Ｆ 配列番号１７４ ＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＣＧ；Ｈｐｈ−Ｒ 配列番号１７５ ＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣ；アクチン−Ｆ 配列番号１７６ ＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴＡＣＣＣ；アクチン−Ｒ 配列番号１７７ ＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧ）。
ＥＴＩＰの単一コピーしか含有しないすべての植物からＥＴＩＰ配列を増幅し、シークエンシングした。ＡＢＩ３７３０ｘＩ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅａｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＰＣＲ産物の直接シークエンシングによって各Ｔ−ＤＮＡインサートの配列を解析した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ゲノムＤＮＡからＴ−ＤＮＡインサートを増幅した。Ｔ−ＤＮＡの増幅反応を複数のプライマー対で完了させて、長さおおよそ２Ｋｂのオーバーラップ配列を増幅した。各ＰＣＲ産物を複数のプライマーでシークエンシングして、完全カバー率を確保した。シークエンシングＰＣＲ反応の前に、ＰＣＲ反応物をエビ・アルカリホスファターゼおよびエンドヌクレアーゼＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理して過剰なプライマーを不活性化した。各単一コピーＥＴＩＰ系統のＴ−ＤＮＡインサートに隣接する配列を、８つの制限エンドヌクレアーゼでの精製ゲノムＤＮＡの消化、続いて、それらの制限エンドヌクレアーゼによって生成されたオーバーハングに特異的な二本鎖アダプターのライゲーションによって同定した。このライゲーション工程の後、ＥＴＩＰの３’または５’末端いずれかへのビオチン化プライマーおよび各アダプターへのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）ｂｅａｄｓ（商標）（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で捕捉し、清浄化した。ネストＰＣＲを行い、ＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ（商標）シークエンシングプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてすべての産物をシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。
サザンブロット解析
サザンプロ−ビングの前にｇＤＮＡサンプルを消化するために特定の制限酵素を選択した。ＥｃｏＲＩおよびＳｗａＩでゲノムＤＮＡを消化することによって推定トランスジェニック植物を解析した。次に、消化されたｇＤＮＡおよび未切断のｇＤＮＡを、ＰＡＴｖ６を含むポリヌクレオチド断片、ＩＰＴを含むポリヌクレオチド断片またはＥＬＰ遺伝子要素を含むポリヌクレオチド断片いずれかでプローブした。これらのポリヌクレオチドプローブ断片は、ＥｃｏＲＩ消化物中およびＳｗａＩ消化物中の複数のインサートの区別を可能にするからであった。その後、同定された単一コピートランスジェニック植物系統を６つすべてのプローブでさらに解析して、挿入されたベクターのすべての不可欠要素の存在を同定した。
したがって、ＥＴＩＰ−ｐＤＡＳ００００３６で形質転換された６７の独立事象をサンプリングし、導入遺伝子（ｈｐｈ）の存在、およびベクター主鎖の存在について試験した。試験した６７植物のうち、４７は、ゲノム内に組み込まれた導入遺伝子を有することが判明した。それらの４７のトランスジェニック植物からの１７の植物は、ベクター主鎖を含有することが判明した（表１４）。ベクター主鎖の有意な部分を含有しなかった（ＯｒｉまたはＳｐｅｃＲ不在）残りの３０植物をサザン解析のためにサンプリングした。一般則として、植物を最初にＩＰＴプローブでスクリーニングし、推定単一コピー系統と同定された植物系統を、ｄｓＲＥＤ、ＰＡＴ、ＥＬＰおよびｈｐｈ遺伝子要素を含むプローブでさらに試験して、カセット全体の存在を確認した。
同様に、ＥＴＩＰ−ｐＤＡＳ００００３７で形質転換されたおよび土壌で生存している５２の独立事象をサンプリングし、導入遺伝子（ｈｐｈ）の存在、およびベクター主鎖の存在について試験した。試験した５２植物のうち、４８は、ゲノム内に組み込まれた導入遺伝子を有することが判明した。それらの４８のトランスジェニック植物からの２３の植物は、ベクター主鎖も含有することが判明し、３植物は、試験しなかった（表１４）。ベクター主鎖の有意な部分を含有しなかった（ＯｒｉまたはＳｐｅｃＲ不在）残りの２２植物をサザン解析のためにサンプリングした。これらのトランスジェニック植物を最初にＩＰＴプローブでスクリーニングし、推定単一コピー系統と同定された植物系統を、ｄｓＲＥＤ、ＰＡＴ、ＥＬＰ、ｈｐｈおよびアクチンプローブでさらに試験して結果を確認した。５つの独立した単一コピー系統の同定を達成し次第、残りの植物に関するサザン解析を終了させた。合計で１１のＥＴＩＰ−ｐＤＡＳ００００３７系統をサザン解析に付した。
ｐＤＡＳ００００３６およびｐＤＡＳ００００３７で形質転換されたＥＴＩＰトランスジェニックカノーラの結果
ｐＤＡＳ００００３６およびｐＤＡＳ００００３７の形質転換により生じさせたトランスジェニックセイヨウアブラナ（Brassica napus）事象は、単一コピー、完全長Ｔ鎖挿入物を生じさせる結果となった。各植物についての４事象のうちの３事象を十分に特性評価し、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ゲノム内の特定の染色体に推定的にマッピングした。少数の単一塩基対再配列がＴ鎖組み込み中に発生したが、選択された事象は、導入遺伝子の頑強な発現を駆動することができる完全長発現カセットを含有した。選択されたＴ０事象をＴ１発育期に成長させた。上記ＰＣＲアッセイを用いてそのＴ１をｒｅｓスクリーニングして（res-screened）、組み込まれたＴ鎖の接合状態を判定した。スクリーニングした事象を、ホモ接合性、ヘミ接合性またはヌルとカテゴリー分けした。
組み込まれたＥＴＩＰ配列の単一コピーしか含有しないすべてのトランスジェニック事象からＥＴＩＰ配列を増幅し、シークエンシングした。各Ｔ−ＤＮＡインサートの配列を、ＰＣＲ産物の直接シークエンシングによって解析した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ゲノムＤＮＡからＴ−ＤＮＡインサートを増幅した。次に、Ｔ−ＤＮＡを複数のプライマー対で増幅して、長さおおよそ２Ｋｂｐのオーバーラップ配列を増幅した。各ＰＣＲ産物を複数のプライマーでシークエンシングして、完全カバー率を確保した。シークエンシングＰＣＲ反応の前に、ＰＣＲ反応物をエビ・アルカリホスファターゼおよびエンドヌクレアーゼＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理して過剰なプライマーを不活性化した。
各単一コピーＥＴＩＰ系統のＴ−ＤＮＡインサートに隣接する配列を、８つの制限エンドヌクレアーゼでの精製ゲノムＤＮＡの消化、続いて、それらの制限エンドヌクレアーゼによって生成されたオーバーハングに特異的な二本鎖アダプターのライゲーションによって同定した。この工程の後、ＥＴＩＰの３’または５’末端いずれかへのビオチン化プライマーおよび各アダプターへのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（商標）（ＳＰＲＩ）ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で捕捉し、清浄化した。ネストＰＣＲを行い、ＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクルシークエンシングプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてすべての産物をシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、ミシガン州アナーバー）を使用して、配列データを組み立て、解析した。８のＥＴＩＰ系統を同定し、隣接配列解析のために選択した（表１５）。左および右の隣接配列（ボーダーまたはジャンクション配列とも記載する）を配列番号４３１〜配列番号４４６として提供する。下線付きの配列は、プラスミドベクターを示した。下線のない配列は、ゲノム隣接配列を示す。

ｐＤＡＳ００００３６事象詳細：ｅｍ０２−５７８８−１−１ 左ボーダー隣接（配列番号４３１）
TCGAGATTGTGCTGAAGTAAACCATTTTACTTCAAATCTATTTTTAACTATTTACTTTTATTAAGGAGAGAAACTTTGCTGATTAATTCAAATTAGTGATCATTAAGATTCCAAAGATTCCGATTTAGAAAAGTCAAAGATTCAAAGAACAAGTCTAGGTCCTCATGGCTCATGTTGCATCCGATTCACCATCCACTCATCTTTCATATCTTCCTCCACTGTCTCTCTAGAAACAACTCATTTAATTTAGAAAACTCCTTTTTCAATTTAGAAATATTAAAGTTTATCACAATGTATCAATTAAATATTATCCGATGACTCATTCATAGTCAGGACCTTGCTGTCTGTGTCGTCCGTAATTATTATTTCAATACAAAACAAATATATGTTCACTCAGAAAATTACGGCGCAATCATCTAATTTTGTGGACCAAAATAAATAGCGTAGCTTCGAGATTTCAAAGTTGTGTTCAAATTTAATTTTGATTTCCGTTCCTCGTATACTCTTTTATGTATAGAAAATAATAATATCCACTACTAGTAGTTGATAACTACATTACATATATTAAAATTATGATGTCACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATC
ｅｍ０２−５７８８−１−１ 左ボーダー隣接（配列番号４３２）
CATAACCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACACATAGCGACCGAGCTCGAGCCGAAGTTCGGTCGCTGTTTCACTGTTTGGGAAAGCATCAGTAACGCAGAAGACATAATTAAAAATTAATTATATATGGTAGTTTTTCTAGATTCTCCACTATACCTCATTGTGATTGAAAAACAACTATATATATATATATATATGTATTTAAAATTAAGAAATCATTAAATCGTACCATAATGCAGAAAACTTTATAAGTTCCTATTCTTTTGTCAAGATGAGTAGATGACACATCATGTACCACATAACATAACCATAATGGTGCGATACCATACCAAAACTTAATTTAGAAACTAATTAAAATTTTGGTAGTTTAAGATTCCTCCTAATGGTTGTCAAAAAAAAAAAAAGATTCCTCCTAATACATGGTAGAATATATTTTTGAGTTAAAATGAAAGTAAAATCTTCAAATTAGTCATAAGGAAATTCTAAAAAACATCGACTTTCTTTATAAAGATCCCATTGTAATTTTAGATGATTAATTTTATCCCAATCCAATTAAGAATTGTACACATCGGCCTCTATATATATCAAACACCTAAAA
ｐＤＡＳ００００３６事象詳細：ａｄ５８−５７８４−２−１ 左ボーダー隣接（配列番号４３３）
CGATTTGCAGCTATAATCAATCACACCTTATCGTTCTTTCAAAGAAAAATCGAAAGTTGTAAACTTTATCAGCCTGTGTAGTGATTATTTCAATTTGATAAAGAAAAAAAAAGGCTTAGCTTTATTTGGTTTTTTGTTACAATCTTGATTAATTTTAGATTAGCACTCTGATTCTAGCGGAACATGAGAGTGGTTCCATCAAACCTCAGACAGTGAGCACAGTGGTTGCAGCAAACCATTTGGGTGAGAGCTCTTCAGTTTCTTTGCTATTAGCTGGTTCTGGCTCTTCTCTTCAAGAAGCTGCTTCTCAAGCTGCCTCTTGTCATCCTTCTGTTTCCGAGGTAACTAACTACATTCTTCATTTGTCCTTTTTTCTTGTGGGTCTTAAATGTTYGTGCTTTTCTTTATAGGTACTTGTTGCTGATTCAGATAGATTTGAGTACCCTTTAGCTGAACCTTGGGCTAAACTGGTTGACTTTGTTCGCCAACAAAGAGATTACTCTCACATCCTTGCCTTCCTCTAGCTCATTTGGCAAGAACATACTTCCTCTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTC
ａｄ５８−５７８４−２−１ 右ボーダー隣接（配列番号４３４）
CCTGTCATAACCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCGCCGGCCTACCTCGCGTTGCTGCTCTTTTAGATGTCTCTCCTGTTACTGATGTTGTCAAAATCTTAGGATCCAATGAGTTTATCAGGTATACTTCTATCATGTATTGCTTGAGATTTTGGAGTGTTAGTAAAGATTTCAATAAAAGAATTTTTTCAAACAAAATTTTGGGGGCTTGAAGCTAATGTTTGGAAATATGTAACGGAGTTTAAATCTTTTGGCAGGCCTATATATGCGGGAAACGCCTTGTGTAGAGTTCGCTATACTGGTGCTGGTCCTTGTGTGTTGACTATTAGAACTACATCTTTTCCTGTTACCCCAATAACTGAGTCAAAGAAAGCTACTATCTCTCAGATTGATCTCTCGAAATTCAAAGAAGGTTTGTTTAGTATTATTCTCTTGTGCATAGCCTTTTTGCTTTTTTTTTTTTTATAAAAAAAGTTGAGTATGCTTATTGCCCATTGCA
ｐＤＡＳ００００３６事象詳細：ａｄ５８−５８９８−１０−１ 左ボーダー隣接（配列番号４３５）
TAATTTCATTTTCGTCATTTTGGTAAAGTAACAAAAGACAGAATATTGGTTAGTCGTGTTGGTTAGGAATAAAATAAAGAACGTGGACATCGTGGAATAAAAATATTCAGACAAGGAAACTAACAATAAAACAGTAATGAACATGGTTCTGAATCTCATCTTTGTGTATCTCCAATGGAATCCACCGCCACGAATCAGACTCCTTCTCCAAGCTCCACCGTCGACGATGACAATGGCGACGGTGTCTATACCGACGAATTTACCAAACTACCCCCGGACCCGGGGATCCTCTAGAGTCAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTC
ａｄ５８−５８９８−１０−１ 右ボーダー隣接（配列番号４３６）
CGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGATTAAAGATAAAATTTGATTTTTCATTACATAATAATCCATTAATTTTCACGCACGTGGAACCCATTTGGTGTACTTCCACGTCCTCTAAGAGAGCACTGACCCACTCATCAAAAAGATACATCTTTATAAGCCCCTTCATCGTCACACAGACACACACTTCCCTCTCAATTATTCCATATTCTCCTAATTTCTAATTGTTACACCTCAACACATTAGATTCGTACCAAACAAAAACGATTAGCTCCCAAGCCTAAGCTTTTATTTCCTTATAATTTTTCTTGGGTTTCTCTCTATAAAGAATGCAAATGACTGAGAGAGGCCGAGCCATGTGGCACACGTCCCTAGCCTCGGCATTCCGCACAGCTCTAGCTTGCACAATCGTTGGTGCGGCTACGCTCTACGGACCCGAGTGGATCCTCCGTTTTGTGGCATTCCCGGCGTTTTCTTACGTCACGGTCATTCTCATCATTACGGACGCCACGCTAGGCGACACACTACGTGGCTGCTGGCTAGCCCTTTACGCCACATGTCAGAGCGTTGCACCGGCTATCATTACACTAAGGCTTATAGGACCAGCTCGGCTCACGGCCGG
ｐＤＡＳ００００３７事象詳細：ｌｆ３１−６１３９−２−３ 左ボーダー隣接（配列番号４３７）
TTTCTTTCCATCAGTTCTTCGGCACCTTCCTGGCTCTGCGTCTATCTTTCTTTCCATCCCGGCCCATCTCGTACACATTCCACCCAACTACACAAACACGTTATAGTCTTTTACATTATGACCAAATCAACCCTAAAGATACAGCCTTTATAAAAAATATAGGGGTCAAAGCAAAGAAGAGAAAGTTTGCTTACAGTGTGGAGAAAAGAAGTTGGAAGATGAGGAGTAAGAAGAAGAAGAGAAGAGAAAGGGTCTTCTGATGAGGAATAGGAGATAAGGTGGAACTGGAATGTTTGCCGCTAAATACTTGAAGACAAGAGCTTGATTTTCAAGCTCTTCCCATTGTGACTCAGTGAAAGGGATCCTAGTCGTCATGAAGAGATAGAGAAAATTGATGATGAAGGAGGTCTGATGAAGAGAAGAGAGAGAGAGAGATATTACACAAAGAGGGTTGTATTGCAAAATTGAAAGTGTAGAGAGAGTAGTAGGTAAGTTTTTATTAATAATGTTGTTCACACCTGCAGTCTGCAGAATATTGTGGTGTGAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTA
ｌｆ３１−６１３９−２−３ 右ボーダー隣接（配列番号４３８）
TTCAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGAACATATATATACGCATAATATTCTCAGAACCCGACCCATTGGTTGACTCGGATCAAGATCGACCCGATCCGACCCGGTTAAAAGCACGTCGTCTCCTTTGGTTCGCCCCTTATATTCGACGAGTGAGTTCGATTGGATCGCTGTTTGTCATTTCTCACTACCTTAAGAAAAAAAAAAAGGTGCGTCTCTCTCTCACCTTTACCGCTCACTTACCTCTCAGATCTGACATCGATTTTCCAAATCTTC:TCCAGGTACTCTCTCTCCTGGCCGTTGACGGTCCCGTCCCGGCCGTGGATCTGATTTCGCCGCGATCTGAGGTCAAGCATGGCGGCAGCTAACGCCCCCATCACGATGAAGGAGGTCCTAACGGTGAGTCCCGCCTCCATTTTTAGTAACATA
ｐＤＡＳ００００３７事象詳細：ｂｍ５６−６３１５−１−１ 左ボーダー隣接（配列番号４３９）
TACATCGCGATTCATCCTGGTTTGATTAGAATGACGAGGAAGTTGTCATATTCCCAAACAGGAAAATTGGGATCGCCTTATTTGAAAGTGGGATAACTTCTTCATCTTAATTCTTATGAGAATTATTCCACTTCCTGGTGATTCTCCACTACTTTTTGTATATAAATACAGCTTCTTACATCGCGATTCATCCTGATTTGATTAGAATGACGAGAAAGTTGTCATATTCCCAAACAGGAAAACTGGGATCACCTGATTTGAAAGTGGGATAACTTCTTCATCCTAATTCTTATGAGATTTATTCCACTTCCTGGTGATTCTCCACTTCTTTATGTATCCAAATACATCTTCTTACATCGCGATTCATCCTGGTTTGATTAGAATGACGAGGAAGTTGTCATATTCCCAAACATGAAAACTGGGAAAGTGGGATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGAT
ｂｍ５６−６３１５−１−１ 右ボーダー隣接（配列番号４４０）
CCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGACGATAAACTATCAGTCTTTCAAAGCGCATCTATGGCTAGTCATCACGGTTTTTAACTGTTTTACGAAGTCGCGGAGAGGCTCGTCTTCTCCCTAGGATAAACTGCAGAGGTCGACATCGGAGGTTTCTCGATCTATGAACATAGAGTACTGTTTGAGAAACTCCGAGGCGAGTTGGCGGAAACTCCCTATAGAGTTTTTCTTTAGACAAGAGAACCACTCAAGCGCTGCTTCGCGGAGGTTCTCGACGAAGAGGCGGCATTCGCCGGCATCTCTTTCTCTATCTTTAAACTTGGCTCTTCCCATCGCGATCTGGAAAGCCTGCAAGTGTGCCTTAGGATCGGTTGTACCATCGTAAGGAGCCACTTTGACTTTATCAGGATCCGAAACCGTAGTTTCGGTGATGCGGGTGGTGAAGGGCGTTTTTCGAGACTCCTCGAGGAGTAGGGTGATATCGAGTGCAGTACTAGTAGCGTGATGATTTGGGATTTCACCGCTCTAACCTCCGCAGCCGTTTTCA
ｐＤＡＳ００００３７事象詳細：ａｄ５８−６３７２−１−１ 左ボーダー隣接（配列番号４４１）
TTTTACAGTGTTAGAAGAAGTGGATGAAGCTGAAATTGAATTTTCAAACTCGTTCAGCTTGACTAGAGGTGGGAGAGAGTCAAAGCCTCCCATCAAGTACCAAAACATGGAATAGAAGACAGTCCGAGGGAGAGGAAACCGTGGCCGACGAGGCCGTGGCTCCTATCATTAACTAGTGTCTTTCTTACTATTAATGGTTTATTAAGTCTCAGCCTTTGTTGTTTCATTGGTTTGAGATTCACTCATACATGAAACTTGTTTCATTCCAGCTTTTCCAAACTATAAGAATATTTCCAATCTTATCTTGTAATAGTTTAAGTTTTAAATTGAAAGCCCTTAGTTCAAAAAACAAAAAAAAAAAATTAGCCCTTGAATTTATATATAATCACGACGGCCATATTTGGCAGCTACACTGATATGTTTTCAATTGGCTGACAGGCCTTGAGCAGGGTTTGCTGGGTATATTGGTAGGAAGATGTGTTGCGAGGTTGAAGCCTCATTTAGGCAATATAAACATGATCATTAGCGTTATGTCATTAGTTATACTTATACGTAGACTAAGTAACCCACTAAAGGTTGCTGATTCCTTTTGTATCGACTAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGC
ａｄ５８−６３７２−１−１ 右ボーダー隣接（配列番号４４２）
CATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGACTGAATTTTAATTTCTAATTTTTGTAAAAAATTTGTATAACCTCAAATTATTAAAAGGCGGATTTTATTAGAATTATAACTAAATTATCTATAACTCCAAAATTTTGACAATCAATCATGTCTATATCTTTATTTTTTTGCTAAATTATCATGTCTATATCTTTTCTTTCTTCCAAACTTACTTGAGACTAAAAGTCTTTATAAATTTTGATAGGAGTTCCACACACAAACAAAAACAAAACAAATATTTTTCATCAAGGGATACTTATTTAACATCACGGATTCACAGTTTATTAACAAAAATCCAAACAAAGACTGAAAGACAGAAGATTCAATCTAACAATAGTCGGCAAACACCAGTGATTAACTAACGAAATAAATTAACAAGTGGTCAGATCTTCGGGAAA
ｐＤＡＳ００００３７事象詳細：ａｄ５８−６６２０−４−１ 左ボーダー隣接（配列番号４４３）
TAATTTCATTTTCGTCATTTTGGTAAAGTAACAAAAGACAGAATATTGGTTAGTCGTGTTGGTTAGGAATAAAATAAAGAACGTGGACATCGTGGAATAAAAATATTCAGACAAGGAAACTAACAATAAAACAGTAATGAACATGGTTCTGAATCTCATCTTTGTGTATCTCCAATGGAATCCACCGCCACGAATCAGACTCCTTCTCCAAGCTCCACCGTCGACGATGACAATGGCGACGGTGTCTATACCGACGAATTTACCAAACTACCCCCGGACCCGGGGATCCTCTAGAGTCAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTC
ａｄ５８−６６２０−４−１ 右ボーダー隣接（配列番号４４４）
CATAACCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGAAATAATCGGATATTTAATTTTCTTAGACAGTTCATTAGTAGTTGATCTTAAACATTCACGTTTTATTTTCTTTTCTTTTCGAATGCTAGACTCTAGTTTGGTACCCATAGGATTCGAGTTACATGAAGCTATTGACACTGGGAGTGCTTCAAGATCTGTAAGAGGCAAAGATTCACAAACAGAACGTGATTTCTTGGATAGTGATGTGGAGATTGTGATAAGAACCAGCATGAGTATTACTTTTACTGCCCCTGCTGTGGTGAAGACATCACCAAAACAGTCAAGCTCGTGAAGAAATCAGATATTCAACCCGCAAAAAAATCTGACAATGCAAATAAACCTATTGACACTAAGAATGGTTCAAGATCCGAAGACAAGAAGACAAAAAATTTGTCCTGGCTCCCTGCTTATCTCCAGAAGCTGTTTCTTTCTGTTTATGGCCACATCAAAGACAAAGGTACCCTTTCTTTTGGTGCCTTTGGTGTGGACAGGTGTGATTGACTTTGGTTTCTTGGCAGATTCAGGCAAGATAGAGGTTGATTCAAAGTCAACTAACAATGATCTTGGTACCAATAGTGAGGA
ｐＤＡＳ００００３７事象詳細：ａｄ５８−６６２０−１７−１ 左ボーダー隣接（配列番号４４５）
CCGCCTTGAACAACCGCTCCGCCGTTGCTCAGTACATTATCGAGGTTACCAAAAAGTTCAATCCTTTATGCTTGTTTTGGCGTGTGATTCGTTACGAATGAGTAAAATTGATTTGGTTTTTTTCTTTGAACAGCATGGTGGAGATGTGAATGCGACGGATCATACGGGGCAGACTGCGTTGCATTGGAGTGCGGTTCGTGGTGCGGTGCAAGTTGCGGAGCTTTTGCTTCAAGAGGGTGCAAGGGTTGATGCTACGGATATGTATGGATATCAGGTTCTAACCACTTCCTCTTTCTTTGTGGAGATTGTCTTTTTGTTTCAATGCTAGTCAACTTCTTTCTTTCTTTCACAAAACTAAGTAGTATTGCTTGTTTTGTTGTCGTTGCATTTTTTCTTATGGCTGTGTTCTGAGGTTCATGTAGGTATATAAGCACTTCGTACTTTGCCACTTGTTTCATTTAGGCAACATTGTGCACATATCTAAGTAGTTGGTCTTTGTAAAATTAGTTTGTTTGTCTTCAAAGTATATTGAGCAGTTTCATGACTCATTATTCAAAGGTTTGTCTAAATTAGAGAGAACTTTCATTTTGCCTGGATTTAATCAGCATTTAGAATGTTTATAGCGATATCATTTTTAGTTGAAAAAATCTCAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTC
ａｄ５８−６６２０−１７−１ 右ボーダー隣接（配列番号４４６）
GTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTAGATCCCCGACCGACCGCCCATCCTGGACGGCCTCGTGCATGCTGATGTTGTCAAAATCTTAGGATCCAATGAGTTTATCAGGTATACTTCTATCATGTATTGCTTGAGATTTTGGAGTGTTAGTAAAGATTTCAATAAAAGAATTTTTTCAAACAAAATTTTGGGGGCTTGAAGCTAATGTTTGGAAATATGTAACGGAGTTTAAATCTTTTGGCAGGCCTATATATGCGGGAAACGCCTTGTGTAGAGTTCGCTATACTGGTGCTGGTCCTTGTGTGTTGACTATTAGAACTACATCTTTTCCTGTTACCCCAATAACTGAGTCAAAGAAAGCTACTATCTCTCAGATTGATCTCTCGAAATTCAAAGAAGGTTTGTTTAGTATTATTCTCTTGTGCATAGCCTTTTTGSTTTTTTTTTTTTTATAAAAAAAGTTGAGTATGCTTATTGCCCATTGC
ＥＴＩＰのマッピング
ＥＴＩＰの単一コピー挿入物を含有する各トランスジェニック事象について、手作業での組み立て後に隣接配列を獲得し、ローカルＢＬＡＳＴ解析においてクエリーとして使用した。単一コピー組み込みを有する合計８植物がこのプロセスによって同定された（表１６および表１７）。ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）からの５９５，４７８のゲノム由来ショットガン配列のコレクションをＮＣＢＩ ＧＳＳデータベースからダウンロードし、ヌクレオチドＢＬＡＳＴデータベースとしてフォーマットした。その後、隣接ＥＴＩＰ配列をそのデータベースとＢＬＡＳＴｎ比較し、すべてのマッチを手作業で調査した。その後、Ｂ．オレラセア（B. oleracea）データベースから隣接ＥＴＩＰ配列への最も有意な配列マッチを獲得し、オンラインブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）ゲノム配列（http://brassicadb.org/brad/blastPage.php）に対してアラインし、そこで最も有意な配列マッチを有するゲノム内の位置も検索した。５’または３’隣接配列のみがＢ．オレラセア（B. oleracea）ゲノム配列との有意なマッチを提供した場合、アラインされないまたはマッチしない配列は、データベースにない配列同定を有したか、またはＥＴＩＰの組み込み中に有意なゲノム再配列が生じたと仮定した。解析から有意なＢＬＡＳＴｎマッチを生じさせたサンプルについては、その後、隣接ＥＴＩＰ配列、最も有意なＢ．オレラセア（B. oleracea）ＧＳＳマッチング配列とともにＢ．ラパ（B. rapa）ゲノムからの最も有意なマッチング配列をＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ｖ５．０ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ、ミシガン州アナーバー）で８つの単一コピーＥＴＩＰ植物の各々について手作業でアラインした。その後、それらの３配列を比較し、隣接ＥＴＩＰと比較して２倍体アブラナ属（Brassica）種のいずれかからの最も類似した配列を、ＥＴＩＰが位置するゲノムに指定した。大多数のサンプルについて、２つの２倍体アブラナ属（Brassica）ゲノム配列間に有意な変異は存在せず、セイヨウアブラナ（B. napus）由来の隣接ＥＴＩＰ配列は、前記２倍体配列の一方または他方と卓越した関連性を示した。しかし、前記２倍体間の配列変異は不十分であり、連鎖群割り当ては可能であることもあったが、サブゲノム割り当ては可能でなかった。そこで、特異的ゲノム位置をブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）ゲノム配列からの位置から予測した。ＥＴＩＰがＢ．オレラセア（B. oleracea）Ｃゲノムに組み込まれていると同定された場合、Parkin et al. (Genetics 2005, 171: 765-781)に記載されている２倍体アブラナ属（Brassica）ゲノム間の比較シンテニーを用いて、そのゲノム位置をセイヨウアブラナ（Brassica napus）Ｃサブゲノムに外挿した。加えて、Schranz et al. (Trend in Plant Science 2006, 11, 11: 535-542)に記載されているシロイヌナズナ属（Arabidopsis）アブラナ属（Brassica）シンテニーによるゲノム位置の確認ばかりでなく、同定された配列をシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ゲノムコード配列（http://arabidopsis.org/index.jspからダウンロードしたＴＡＩＲ ９ ＣＤＳ）とＢＬＡＳＴｎ比較し、破壊された一切の遺伝子配列の正体も同定した。

ホモ接合事象を用いて、前に説明した方法によりプロトプラストを生産する。その後、それらのプロトプラストを、ＥＴＩＰ配列内に組み込まれているジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されているジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＥＴＩＰの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミドで共形質転換する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＥＴＩＰ遺伝子座を切断し、ドナープラスミドは、相同性指向型修復によってセイヨウアブラナ（Brassica napus）細胞のゲノム内に組み込まれる。ドナープラスミドの組み込みの結果として、部分ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子が完全長ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子に修復される。今や十分に作動可能なＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子の発現を用いて、ＦＡＣＳ法でプロトプラスト細胞を選別する。推定トランスジェニック植物を、実施例７において説明するＦＡＣＳ法を用いて選別し、単離されたプロトプラストを成熟植物へと再生させる。分子確認法を用いて、ＥＴＩＰ標的化植物内のドナープラスミドの組み込みを確認する。したがって、ＥＴＩＰ遺伝子座は、ドナーポリヌクレオチド配列の遺伝子標的組み込みのための部位特異的遺伝子座としての役割を果たす。
ゲノム標的化位置は、植物の正常な表現型を改変しないゲノム位置を提供する。ＥＴＩＰ内の導入遺伝子を標的にする場合、結果として生ずる事象は、それらのＥＴＩＰ事象を対照植物と比較したときに耕種学的に意味のある意図されない差をもたらさない。加えて、ＥＴＩＰ遺伝子座内に組み込まれた導入遺伝子のタンパク質発現レベルは、頑強に発現され、複数のゲノム遺伝子座にわたって一致しており、安定している。配列番号４３１から配列番号４４６の開示するゲノム配列は、導入遺伝子を含む遺伝子発現カセットの組み込みのための標的化可能なアブラナ属（brassica）ゲノム内のゲノム位置を提供する。
ＤＳ−ＲＥＤのＺＦＮ媒介相同組換えでのＥＴＩＰ系列の標的化
ｐＤＡＳ００００３６からのＴ鎖インサートを含有するカノーラ系統を得、Ｔ鎖の完全長、単一コピーを含有することを分子特性評価によって確認した。このカノーラ事象をｐＤＡＳ００００３６−８８と名づけ、前に説明した方法によってプロトプラストを生産するために用いた。それらのプロトプラストを単離し、その後、約５０，０００のカノーラプロトプラスト細胞を、ＥＴＩＰ配列内に組み込まれたジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４（図２５）またはｐＤＡＳ００００７５（図２６）いずれかと、ＥＴＩＰの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミド、ｐＤＡＳ００００６４、ｐＤＡＳ００００６８、ｐＤＡＳ００００７０またはｐＤＡＳ００００７２（それぞれ図２７、図２８、図２９および図３０）とで共形質転換させた。図１９および図２０は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介相同組換えによりＤｓ−ｒｅｄ導入遺伝子の部位特異的組み込みをもたらす相同性指向型修復の実例を提供する。前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを、ＥＴＩＰ遺伝子座を被定義ジンクフィンガー結合配列で切断し、それによってそのゲノム内に二本鎖破断を生じさせるように設計した。次に、ドナープラスミドをセイヨウアブラナ（Brassica napus）プロトプラスト細胞のゲノム内に相同性指向型修復によって組み込んだ。ドナープラスミドのイントロン−１およびイントロン−２領域は、ＥＴＩＰ遺伝子座の対応するイントロン−１およびイントロン−２領域と相同性を共有する。ドナープラスミドの組み込みの結果として、部分ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子は、完全長、高発現性ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子に修復された。その十分に作動可能なＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子の発現を用いて、上記ＦＡＣＳ法でプロトプラスト細胞を選別した。したがって、ＥＴＩＰ遺伝子座は、ドナーポリヌクレオチド配列の標的組み込みのための部位特異的遺伝子座として役立つ。最後に、単離されたプロトプラストを選別し、成熟植物へと再生させることができる。分子確認法を用いてＥＴＩＰ標的化植物内へのドナープラスミドの組み込みを確認することができる。
ドナープラスミドＤＮＡとＺＦＮプラスミドＤＮＡを様々な濃度で混合し、それらを使用して事象ｐＤＡＳ００００３６−８８を有するカノーラプロトプラスト細胞をトランスフェクトし、前に説明したＦＡＣＳトランスフェクションを用いてトランスジェニックプロトプラスト細胞を選別した。表１８は、様々なトランスフェクション実験、および事象ｐＤＡＳ００００３６−８８を有するカノーラプロトプラストのトランスフェクションに使用したＤＮＡ濃度を記載するものである。ＺＦＮおよびドナープラスミドＤＮＡを単離し、前に説明した方法によってトランスフェクションのために調製した。
トランスフェクション実験を完了した後、プロトプラストを室温で４８時間、恒温放置し、上記ＦＡＣＳプロトコルを用いて選別した。各実験を独立して選別し、導入遺伝子のジンクフィンガー媒介遺伝子移入を、ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子を発現する個々の事象の同定によって確認した。図２１〜２４は、ＦＡＣＳ選別の結果を示す。グラフに図示されている結果が示すように、インタクトな十分に組み込まれたＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子を含有する複数の事象が生じた。これらの複数のＤｓ−Ｒｅｄ事象は、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みの結果であった。この部位特異的組み込みは、Ｄｓ−Ｒｅｄ導入遺伝子の高発現性、完全コピーをもたらした。Ｄｓ−Ｒｅｄ導入遺伝子発現の頻度は、全カノーラプロトプラスト細胞（約５０，０００）の約０．０３〜０．０７％の範囲であった。しかし、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みについてのトランスフェクション効率の頻度のほうがはるかに高く、約０．０７〜０．６４％の範囲であった。
図２１は、ドナープラスミドおよびＺＦＮプラスミドを共形質転換させたトランスフェクションの結果を示す。ドナー、ｐＤＡＳ００００６４およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４を２６μｇ対４μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた上のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０３％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらのプロトプラスト細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．２２〜０．０７％の範囲である。同様に、ドナー、ｐＤＡＳ００００６４およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７５を２６μｇ対４μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた下のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０３％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらの細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．２６〜０．０８％の範囲である。ジンクフィンガー媒介相同性指向型修復のこれらの結果は、図２０に示すように、約５０，０００のうちの１つのプロトプラストしか赤色蛍光を有さず、その結果、０．００％の組換え頻度となったことが確認された陰性対照実験より、有意に大きい。
図２２は、ドナープラスミドおよびＺＦＮプラスミドを共形質転換させたトランスフェクションの結果を示す。ドナー、ｐＤＡＳ００００６８およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた上のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０３％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらのプロトプラスト細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．２２〜０．０７％の範囲である。同様に、ドナー、ｐＤＡＳ００００６８およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７５を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた下のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０４％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらの細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．３８〜０．１２％の範囲である。ジンクフィンガー媒介相同性指向型修復のこれらの結果は、図２０に示すように、約５０，０００のうちの１つのプロトプラストしか赤色蛍光を有さず、その結果、０．００％の組換え頻度となったことが確認された陰性対照実験より、有意に大きい。
図２３は、ドナープラスミドおよびＺＦＮプラスミドを共形質転換させたトランスフェクションの結果を示す。ドナー、ｐＤＡＳ００００７０およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた上のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０７％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらのプロトプラスト細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．６４〜０．２１％の範囲である。同様に、ドナー、ｐＤＡＳ００００７０およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７５を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた下のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０４％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらの細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．３４〜０．１１％の範囲である。ジンクフィンガー媒介相同性指向型修復のこれらの結果は、図２０に示すように、約５０，０００のうちの１つのプロトプラストしか赤色蛍光を有さず、その結果、０．００％の組換え頻度となったことが確認された陰性対照実験より、有意に大きい。
図２４は、ドナープラスミドおよびＺＦＮプラスミドを共形質転換させたトランスフェクションの結果を示す。ドナー、ｐＤＡＳ００００７２およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた上のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０７％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらのプロトプラスト細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．６２〜０．２０％の範囲である。同様に、ドナー、ｐＤＡＳ００００７２およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７５を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた下のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０５％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらの細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．４４〜０．１４％の範囲である。ジンクフィンガー媒介相同性指向型修復のこれらの結果は、図２０に示すように、約５０，０００のうちの１つのプロトプラストしか赤色蛍光を有さず、その結果、０．００％の組換え頻度となったことが確認された陰性対照実験より、有意に大きい。
選択された外植体を、ホホトリノシン（phophothrinocin）を含有する再生培地に移植し、培養した。その培養期間後、生存している外植体を培養および植物発育のために伸長培地および根誘導培地に移植した。発育した根および苗条構造から成る全草を土壌に移植し、温室でさらに繁殖させた。組織培養プロセスは、前に上で説明した培地および培養条件を用いた。組織培養プロセスから生産された植物の結果を下の表１９に示す。

カノーラへのＥＴＩＰのＦＡＤ２Ａ組み込みの分子確認
組織を８０μｌのＡＥ緩衝液で溶離したことを除き、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用して、すべての推定トランスジェニック植物の葉組織からゲノムＤＮＡを抽出した。再生植物からの３０ミリグラムの若葉組織を液体窒素で瞬間冷凍した後、粉末に粉砕した。
ＦＡＤ２Ａ遺伝子座の分子特性評価を、３つの独立したアッセイを用いて行った。アッセイを設計し、以下の対照を用いて最適化した：単一のランダムに組み込まれた導入遺伝子を含む特性評価されたトランスジェニック事象、５つのランダムの組み込まれた導入遺伝子を有する特性評価されたトランスジェニック事象、野生型カノーラ園芸品種ＤＨ１２０７５植物および無テンプレート対照反応。ＨＤＲによるＦＡＤ２ＡへのＥＴＩＰの組み込みの証拠を提供するために、以下の３つの分子解析からの結果をともに考慮する。
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による導入遺伝子組み込みの同定
ｈｐｈ（ｈｐｔとも記載する）標的遺伝子に特異的なプライマー（配列番号４４７、ｈｐｔ Ｆ７９１ ５’ＣＴＴＡＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴＣＧＧＡＣＴＴＧ ３’；配列番号：４４８、ｈｐｔ Ｒ９０９ ５’ＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡＡＣＧ ３’；配列番号４４９、ｈｐｔ Ｔａｑｍａｎ ８７２ ５’ＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧ ３’ＦＡＭ）（図３１）、および高移動度群タンパク質Ｉ／Ｙ（ＨＭＧ Ｉ／Ｙ）をコードする参照遺伝子（配列番号４５０、Ｆ ５’ＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＧ ３’；配列番号４５１、Ｒ ５’ＴＴＣＧＡＴＴＴＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＣ ３’；配列番号４５２、プローブ ５’ＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＣＴ ３’ＨＥＸ）を使用して、各植物の４つの複製を解析した。次の条件：１０分間９５℃、続いて４０サイクルの３０秒間９５℃、１分間６０℃を用いて反応を増幅し、各アニール工程終了時に増幅データを収集した。ΔＣｑ＝Ｃｑ（標的遺伝子）−Ｃｑ（参照遺伝子）のΔＣｑ法を用いて、コピー数を算出した。Livak, K.J. and T.D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001. 25(4): p. 402-8。ｈｐｈおよびＨＭＧ Ｉ／Ｙの増幅ならびに０．５またはそれ以上のコピー数を有する植物をトランスジェニックとみなし、その一方で０．５以上かつ１．２以下のコピー数を有する植物を推定単一コピーとしてスコアリングした。増幅は、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システムとＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ（ＲＯＸ）、（Ｒｏｃｈｅ、スイス国バーゼル）で行った。
破壊されたＦＡＤ２Ａ ＺＦＮ部位の検出
主要アッセイである破壊遺伝子座試験で、各植物を内在性標的の増幅の存在または不在について解析した。このアッセイは、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｑＰＣＲアッセイであり、シングルプレックスでのものであるが、各反応が同じＰＣＲプレートで同時に進み、内在性遺伝子座（ＦＡＤ２Ａ／２Ｃ．ＲＢ．ＵｎＥ．Ｆ１、配列番号４５３、５’ＣＴＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴ＊Ｃ ３’およびＦＡＤ２Ａ／２Ｃ．ＲＢ．ＵｎＥ．Ｒ１、５’配列番号４５４、ＧＣＧＴＣＣＣＡＡＡＧＧＧＴＴＧＴＴＧＡ＊Ｇ ３’）およびＺＦＮ遺伝子座（ＺＦＮ ｐＤＡＢ１０４０１０がゲノムに結合し、切断する遺伝子座）（ＦＡＤ２Ａ．ＵｎＥ．Ｆ１、配列番号４５５、５’ＴＣＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧ＊Ｃ ３’およびＦＡＤ２Ａ．ＵｎＥ．Ｒ１、配列番号４５６、５’ＣＣＣＣＧＡＧＡＣＧＴＴＧＡＡＧＧＣＴＡＡＧＴＡＣＡＡ＊Ａ ３’）を標的にする（図３２）。次の条件を用いて両方のプライマー対を増幅した：３０秒間９８℃、続いて３５サイクルの（１０秒間９８℃、２０秒間６５℃、９０秒間７２℃）、それから続いて１０秒間９５℃、その後、５０℃から９５℃まで０．０５秒に０．５℃の増加で、各増加時にプレートを読み取って溶融解析。反応条件を表２０に収載する。
内在性標的の増幅を有するがＺＦＮ標的の増幅を有さない植物を、破壊遺伝子座試験について陽性とスコアリングし、破壊ＺＦＮ遺伝子座を有すると判断した。ＦＡＤ２Ａ遺伝子座における両方の対立遺伝子のＺＦＮ結合部位が破壊されているとき、このアッセイを陽性であると判断した。
相同性指向型修復によるＦＡＤ２Ａへの導入遺伝子組み込みのＰＣＲ検出
導入遺伝子標的ｈｐｈ（ｈｐｈ＿ＥｘｏＤｉｇＰＣ＿Ｆ１、配列番号４５７、５’ＴＴＧＣＧＣＴＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧＡ ３’およびｈｐｈ＿ＥｘｏＤｉｇＰＣ＿Ｒ１、配列番号４５８、５’ＴＣＣＡＴＣＡＧＴＣＣＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡ ３’）と、ＦＡＤ２Ａ内在性遺伝子座（ＦＡＤ２Ａ．Ｏｕｔ．Ｆ１、配列番号４５９、５’ＣＡＴＡＧＣＡＧＴＣＴＣＡＣＧＴＣＣＴＧＧＴ＊Ｃ ３’およびＦＡＤ２Ａ．Ｏｕｔ．Ｒｖｓ３、配列番号４６０、５’ＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＴＴＡＣＡＣＴＧＴＴＣＡ＊Ｇ ３’）と、ＦＡＤ２Ａ遺伝子座への導入遺伝子の上流の、ＨＤＲによりＦＡＤ２Ａ遺伝子座に挿入された任意の導入遺伝子の５’末端に及ぶ領域（ＦＡＤ２Ａ．Ｏｕｔ．Ｆ１、配列番号４６１、５’ＣＡＴＡＧＣＡＧＴＣＴＣＡＣＧＴＣＣＴＧＧＴ＊Ｃ ３’およびＱＡ５２０、配列番号４６２、５’ＣＣＴＧＡＴＣＣＧＴＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧ ３’）と、ＦＡＤ２Ａ遺伝子座への導入遺伝子の下流の、ＨＤＲによりＦＡＤ２Ａ遺伝子座に挿入された任意の導入遺伝子の３’末端に及ぶ領域（ＱＡ５５８、配列番号４６３、５’ＧＴＧＴＧＡＧＧＴＧＧＣＴＡＧＧＣＡＴＣ ３’およびＦＡＤ２Ａ．Ｏｕｔ．Ｒｖｓ３、配列番号４６４、５’ＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＴＴＡＣＡＣＴＧＴＴＣＡ＊Ｇ ３’）とを増幅するために設計したＰＣＲプライマーでのエンドポイントを用いて、各推定植物形質転換体を解析した（図３３）。すべてのプライマー対を、次の条件を用いて増幅した：３０秒間９８℃、続いて３５サイクルの（１０秒間９８℃、２０秒間６５℃、９０秒間７２℃）。反応試薬条件は、表２１に記載のとおりである。
５’導入遺伝子−ゲノム隣接標的の増幅および／または３’ 導入遺伝子−ゲノム隣接標的の増幅は、推定挿入事象を示した。（ＺＦＮ切断部位の直ぐ上流および下流のＦＡＤ２Ａ領域と１００％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む）ｐＤＡＳ０００１３０カセット内のおおよそ１，０００ｂｐ ＦＡＤ２Ａ相同性アームのため、オフターゲットＥＴＩＰ組み込み事象の増幅から生ずるＰＣＲキメリズムのためにＰＣＲ反応を偽陽性ＰＣＲ産物増幅を被りやすいことに注意しなければならない。ｈｐｈ標的の増幅は、導入遺伝子組み込みが起こったことを確証した。ＦＡＤ２Ａ標的の増幅は、ＦＡＤ２Ａ遺伝子座がインタクトであるか、または部分的挿入物しか含有しないことを示唆する。ＥＴＩＰのサイズ（ＥＴＩＰカセットについての１１，４６２ｂｐ、またはＦＡＤ２Ａ相同アームおよびＥＴＩＰカセットを含む１３，４７２ｂｐ）のため、ＦＡＤ２Ａプライマーは、インタクトＥＴＩＰがＦＡＤ２Ａ遺伝子座に組み込まれているときには産物を増幅しないと予想される。
ＦＡＤ２Ａ編集のサザン検出
５’ゲノム−導入遺伝子隣接標的産物の増幅および／もしくは３’導入遺伝子−ゲノム隣接標的の増幅のいずれかを有する、またはＺＦＮ遺伝子標的の増幅を有さない、または両方を有する植物を、ＦＡＤ２Ａ遺伝子座への導入遺伝子組み込みの検出のためにサザン解析に付した。修正ＣＴＡＢ法（Maguire, T.L., G.G. Collins, and M. Sedgley A modified CTAB DNA extraction procedure for plants belonging to the family proteaceae. Plant Molecular Biology Reporter, 1994. 12(2): p. 106-109）を用いて５ｇの葉組織からゲノムＤＮＡを精製した。次に、１２μｇのゲノムＤＮＡをＫｐｎ１−ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化し、消化断片を０．８％アガロースゲルでの電気泳動により分離した後、標準サザンブロット法プロトコルを用いて膜に転写した。ＦＡＤ２Ａ ５’標的領域へのプライマー（Ｆ、配列番号４６５、５’ＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴ ３’およびＲ、配列番号４６６、５’ＡＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡ ３’）、ＦＡＤ２Ａ ３’標的領域へのプライマー（Ｆ、配列番号４６７、５’ＣＡＡＣＧＧＣＧＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＴＡＧ ３’およびＲ、配列番号４６８、５’ＧＴＴＣＣＣＴＧＧＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＧＧ ３’）およびｈｐｈへのプライマー（Ｆ、配列番号４６９、５’ＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＣＧ ３’およびＲ、配列番号４７０、 ５’ＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣ ３’）を使用してプローブを生成して、ＤＩＧ ＥＡＳＹ ＨＹＢ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）を製造業者の説明書に従って使用してＦＡＤ２Ａ遺伝子座内のＥＴＩＰの存在を検出した（図３４）。ＦＡＤ２Ａ ５’領域のために４２℃で、ＦＡＤ２Ａ ３’領域のために４５℃で、およびｈｐｈの検出のために４２℃でハイブリダイゼーションを行った。
膜結合ゲノムＤＮＡを特定の順序でプローブした；先ず、ＦＡＤ２Ａ ５’配列をプローブし、次いでＦＡＤ２Ａ ３’配列をプローブし、そして最後にｈｐｈ配列をプローブした（図３４）。この理論的根拠（rational）は、次のとおりである。第一のプローブ（ＦＡＤ２Ａ ５’）は、診断プローブであり、ＥＴＩＰが完全ＨＤＲによりＦＡＤ２Ａに組み込まれた場合、５，３２１ｂｐ断片が膜上に見えることになる。結果として生ずるバンドサイズは、電気泳動中に容易に区別され、ＤＩＧ標識Ｒｏｃｈｅ ＤＮＡ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＲＫＥＲ ＩＩＩ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）では５，１４８ｂｐの近くに位置することになる。膜の第二のプローブは、ＦＡＤ２Ａ ３’プローブとともにあり、編集された植物は、２２，４３３ｂｐ断片を有することになるが、未編集の植物は、１６，４６８ｂｐ断片を有することになる。ＦＡＤ２Ａ ３’プローブで同定された同じ２２，４３３ｂｐ断片はまた、ｈｐｈプローブによって結合され、ｈｐｈプローブで同定されるはずである。これらの断片は、非常に大きいのでゲルで区別することが困難であり、およびＤＩＧ標識Ｒｏｃｈｅ ＤＮＡ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＷＥＩＧＨＴ ＭＡＲＫＥＲ ＩＩＩ（登録商標）では最大の２１，２２６ｂｐ断片より上または下で出現する断片間のいずれの差も判定することが困難だろう。したがって、これらのプローブは、ＦＡＤ２Ａ ５’プローブを使用する５ｋｂ断片の可視化により、相同性指向型修復（ＨＤＲ）によるＦＡＤ２ＡへのＥＴＩＰ組み込みの同定を強化し得る証拠を提供する。制限酵素、ＫｐｎＩは、ＫｐｎＩ部位が単一の切断遺伝子座、単一遺伝子座におけるＥＴＩＰカセット、内に出現するので、このアッセイでの使用に唯一適している制限エンドヌクレアーゼであり、ＦＡＤ２Ａ ＺＦＮ遺伝子座の２つの部位に存在した。１つの部位は、ＦＡＤ２Ａ相同性アームの上流に、およびもう１つの部位は下流に位置した。加えて、ＫｐｎＩは、メチル化感受性でなく、忠実度が増された組換え酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）として入手可能である。
分子およびサザン解析の結果
トランスフェクション、培養および選択の後、トランスジェニック植物を土壌に移植した。このプロセスを１３９の植物が生き残り、それらをｇＤＮＡ抽出および解析のために組織サンプリングした。１３９すべての植物をコピー数推定のために解析した。これら１３９の植物のうちの５６は、ＥＴＩＰについて陽性であり、それら５６の陽性植物のうちの１１は、推定単一コピー組み込みを有した（図３５）（表２２）。ＥＴＩＰ組み込みについて陽性であった５６の植物のうちの７植物においてＦＡＤ２Ａ ５’−ゲノム−導入遺伝子隣接配列の増幅を起こった。ＥＴＩＰ組み込みについて陽性であった５６の植物のいずれにおいてもＦＡＤ２Ａ ３’−導入遺伝子−ゲノム隣接配列の増幅は起こらなかった。加えて、導入遺伝子組み込みについて陽性であった５６の植物のうちの１１植物は、破壊遺伝子座ｑＰＣＲ試験について陽性であった。ＦＡＤ２Ａ ５’−ゲノム−導入遺伝子隣接配列の増幅につい陽性および／または破壊遺伝子座ｑＰＣＲ試験について陽性であった１４の植物を、上で説明した３つのプローブでサザン解析に付した。サザン解析に進めた１４植物のすべての植物が、ＦＡＤ２Ａ遺伝子座内への部分的組み込みを示したが、これらの植物はいずれも、ＦＡＤ２Ａ ５’プローブ、ＦＡＤ２Ａ ３’およびｈｐｈプローブでプローブしたとき、ＨＤＲによるＦＡＤ２Ａ遺伝子座へＥＴＩＰの完全な完全長組み込みの証拠を示さなかった。ＦＡＤ２Ａ ３’プローブでプローブしたとき、ｉ）ＷＴより大きく見えるおよびｉｉ）これらのサンプルについて観察されたバンドと同一に見えるバンドはなかった（表２２）。
ｐＤＡＳ０００１３０およびｐＤＡＢ１０４０１０で形質転換したＥＴＩＰトランスジェニックカノーラの結果
ｐＤＡＳ０００１３０およびｐＤＡＢ１０４０１０の形質転換によって生じるトランスジェニックセイヨウアブラナ（Brassica napus）事象は、ｐＤＡＳ０００１３０からのＥＴＩＰポリヌクレオチド配列のＦＡＤ２Ａ遺伝子座内へ単一コピー、完全長Ｔ鎖挿入物の組み込みをもたらす。４事象のうちの３事象を十分に特性評価し、組み込まれたＥＴＩＰを含有することを確認する。その確認を、イン−アウトＰＣＲ（in-out PCR）増幅法を用いて完了し、サザンブロットによってさらに検証する。選択されたＴ０事象をＴ１生育期に成長させる。Ｔ１植物を再スクリーニングして、組み込まれたＴ鎖の接合状態を判定する。スクリーングした事象をホモ接合性、ヘミ接合性またはヌルとカテゴリー分けする。
ホモ接合事象を用いて、前に説明した方法によりプロトプラストを生産する。その後、プロトプラストを、ＥＴＩＰ配列内に組み込まれているジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されているジンクフィンガーヌクレアーゼと、ドナーがＨＤＲメカニズムによってＥＴＩＰ内に組み込まれているＥＴＩＰの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミドとで共形質転換させる。同様に、その後、プロトプラストを、ＥＴＩＰ配列内に組み込まれているジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されているジンクフィンガーヌクレアーゼと、ドナーが非相同末端結合メカニズムによってＥＴＩＰ内に組み込まれているＥＴＩＰの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミドとで共形質転換させる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＥＴＩＰ遺伝子座を切断し、ドナープラスミドは、相同性指向型修復または非相同末端結合によってセイヨウアブラナ（Brassica napus）細胞のゲノム内に組み込まれる。ドナープラスミドの組み込みの結果として、部分ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子が完全長ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子に修復される。今や十分に作動可能なＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子の発現を用いて、ＦＡＣＳ法でプロトプラスト細胞を選別する。推定トランスジェニック植物を、実施例７において説明するＦＡＣＳ法を用いて選別し、単離されたプロトプラストを成熟植物へと再生させる。分子確認法を用いて、ＥＴＩＰ標的化植物内へのドナープラスミドの組み込みを確認する。したがって、ＥＴＩＰ遺伝子座は、ドナーポリヌクレオチド配列の遺伝子標的組み込みのための部位特異的遺伝子座としての役割を果たす。
ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびｐＤＡＳ０００２７１〜ｐＤＡＳ０００２７５ ＥＴＩＰ構築物で形質転換させたＥＴＩＰトランスジェニックカノーラの結果
ＥＴＩＰおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物の形質転換によって生じるトランスジェニックセイヨウアブラナ（Brassica napus）事象は、ＦＡＤ３Ａ遺伝子座内へのｐＤＡＳ０００２７３またはｐＤＡＳ２７５からの、およびＦＡＤ３Ｃ遺伝子座へのｐＤＡＳ０００２７１、ｐＤＡＳ０００２７２またはｐＤＡＳ０００２７４からのＥＴＩＰポリヌクレオチド配列の単一コピー、完全長Ｔ鎖挿入物の組み込みをもたらす。４事象のうちの３事象を十分に特性評価し、組み込まれたＥＴＩＰを含有することを確認する。その確認を、イン−アウトＰＣＲ増幅法を用いて完了し、サザンブロットによってさらに検証する。選択されたＴ０事象をＴ１生育期に成長させる。Ｔ１植物を再スクリーニングして、組み込まれたＴ鎖の接合状態を判定する。スクリーングした事象をホモ接合性、ヘミ接合性またはヌルとカテゴリー分けする。
ホモ接合事象を用いて、前に説明した方法によりプロトプラストを生産する。その後、プロトプラストを、ＥＴＩＰ配列内に組み込まれているジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されているジンクフィンガーヌクレアーゼと、ＥＴＩＰの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミドとで共形質転換させる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＥＴＩＰ遺伝子座を切断し、ドナープラスミドは、相同性指向型修復によってセイヨウアブラナ（Brassica napus）細胞のゲノム内に組み込まれる。ドナープラスミドの組み込みの結果として、部分ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子が完全長ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子に修復される。今や十分に作動可能なＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子の発現を用いて、ＦＡＣＳ法でプロトプラスト細胞を選別する。推定トランスジェニック植物を、実施例７において説明するＦＡＣＳ法を用いて選別し、単離されたプロトプラストを成熟植物へと再生させる。分子確認法を用いて、ＥＴＩＰ標的化植物内へのドナープラスミドの組み込みを確認する。したがって、ＥＴＩＰ遺伝子座は、ドナーポリヌクレオチド配列の遺伝子標的組み込みのための部位特異的遺伝子座としての役割を果たす。
実施例７：プロトプラスト細胞のＦＡＣＳベースの選別
ＤＳ−Ｒｅｄ対照構築物、ｐＤＡＳ００００３１でトランスフェクトしたセイヨウアブラナ（Brassica napus）プロトプラストを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｆｌｕｘ−Ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（商標）（カリフォルニア州サンノゼ）を使用してＦＡＣＳ媒介細胞選別により選別した。実施例３において説明したように、プロトプラスト細胞を単離し、トランスフェクトした。細胞をｐＤＡＳ００００３１でトランスフェクトした後、表２３に記載する条件で前記ＦＡＣＳ選別装置を使用して細胞を選別した。
ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子を発現するプロトプラストを選別し、単離した。ＦＡＣＳ単離プロトプラストを、前記選別装置を使用してカウントした。約１ｘ１０５から１．８ｘ１０５個の細胞をＦＡＣＳ単離後第１日に２４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れた。それらの細胞を５から２０日間、ビーズ培地に移植した。約１ｘ１０４個の細胞をＦＡＣＳ単離後第２日に２または４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れる類似の条件を試験した。試験した様々な条件は、単離した全プロトプラスト細胞の生存率または９５〜９８％での細胞の回収をもたらした。ＦＡＣＳ選別プロトプラスト細胞を３〜２０日間、ビーズ培地に移植した。ＦＡＣＳ選別プロトプラスト細胞を、１．５ｍｇ／ｍＬのヒグロマイシンを含有する培地で、上記プロトコルを用いて植物に再生させた。それらの推定トランスジェニック植物がｐＤＡＳ００００３１からのインタクトＴ鎖インサートを含有することを分子確認プロトコルによって確認した。
ＤＳ−ＲＥＤのＺＦＮ媒介相同組換えでのＥＴＩＰ系統の標的化
ｐＤＡＳ００００３６からのＴ鎖インサートを含有するカノーラ系統を得、Ｔ鎖の完全長、単一コピーを含有することを分子特性評価によって確認した。このカノーラ事象をｐＤＡＳ００００３６−８８と名づけ、前に説明した方法によってプロトプラストを生産するために用いた。それらのプロトプラストを単離し、その後、約５０，０００のカノーラプロトプラスト細胞を、ＥＴＩＰ配列内に組み込まれたジンクフィンガー結合部位を標的にするように設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４（図２５）またはｐＤＡＳ００００７５（図２６）いずれかと、ＥＴＩＰの特定の領域と相同性を共有するドナープラスミドｐＤＡＳ００００６４、ｐＤＡＳ００００６８、ｐＤＡＳ００００７０またはｐＤＡＳ００００７２（それぞれ図２７、図２８、図２９および図３０）とで共形質転換させた。図１９および図２０は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介相同組換えによりＤｓ−ｒｅｄ導入遺伝子の部位特異的組み込みをもたらす相同性指向型修復の実例を提供する。前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを、ＥＴＩＰ遺伝子座を被定義ジンクフィンガー結合配列で切断し、それによってそのゲノム内に二本鎖破断を生じさせるように設計した。次に、ドナープラスミドをセイヨウアブラナ（Brassica napus）プロトプラスト細胞のゲノム内に相同性指向型修復によって組み込んだ。ドナープラスミドのイントロン−１およびイントロン−２領域は、ＥＴＩＰ遺伝子座の対応するイントロン−１およびイントロン−２領域と相同性を共有する。ドナープラスミドの組み込みの結果として、部分ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子は、完全長、高発現性ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子に修復された。その十分に作動可能なＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子を使用して、上記ＦＡＣＳ法でプロトプラスト細胞を選別した。したがって、ＥＴＩＰ遺伝子座は、ドナーポリヌクレオチド配列の標的組み込みのための特異的遺伝子座としての役割を果たす。最後に、単離されたプロトプラストを選別し、成熟植物へと再生させることができる。分子確認法を用いてＥＴＩＰ標的化植物内へのドナープラスミドの組み込みを確認することができる。
ドナープラスミドＤＮＡとＺＦＮプラスミドＤＮＡを様々な濃度で混合し、それらを使用して事象ｐＤＡＳ００００３６−８８を有するカノーラプロトプラスト細胞をトランスフェクトし、前に説明したＦＡＣＳトランスフェクションを用いてトランスジェニックプロトプラスト細胞を選別した。表２４は、様々なトランスフェクション実験、および事象ｐＤＡＳ００００３６−８８を有するカノーラプロトプラストのトランスフェクションに使用したＤＮＡ濃度を記載するものである。ＺＦＮおよびドナープラスミドＤＮＡを単離し、前に説明した方法によってトランスフェクションのために調製した。
トランスフェクション実験を完了した後、プロトプラストを室温で４８時間、恒温放置し、上記ＦＡＣＳプロトコルを用いて選別した。各実験を独立して選別し、導入遺伝子のジンクフィンガー媒介遺伝子移入を、ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子を発現する個々の事象の同定によって確認した。図２１〜２４は、ＦＡＣＳ選別の結果を示す。グラフに図示する結果が示すように、インタクトな十分に組み込まれたＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子を含有する複数の事象が生じた。これらの複数のＤｓ−Ｒｅｄ事象は、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みの結果であった。この部位特異的組み込みは、Ｄｓ−Ｒｅｄ導入遺伝子の高発現性、完全コピーをもたらした。Ｄｓ−Ｒｅｄ導入遺伝子発現の頻度は、全カノーラプロトプラスト細胞（約５０，０００）の約０．０３〜０．０７％の範囲であった。しかし、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みについてのトランスフェクション効率の頻度のほうがはるかに高く、約０．０７〜０．６４％の範囲であった。
図２１は、ドナープラスミドおよびＺＦＮプラスミドを共形質転換させたトランスフェクションの結果を示す。ドナー、ｐＤＡＳ００００６４およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４を２６μｇ対４μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた上のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０３％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらのプロトプラスト細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．２２〜０．０７％の範囲である。同様に、ドナー、ｐＤＡＳ００００６４およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７５を２６μｇ対４μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた下のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０３％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらの細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．２６〜０．０８％の範囲である。ジンクフィンガー媒介相同性指向型修復のこれらの結果は、図２０に示すように、約５０，０００のうちの１つのプロトプラストしか赤色蛍光（flouresence）を有さず、その結果、０．００％の組換え頻度となったことが確認された陰性対照実験より、有意に大きい。
図２２は、ドナープラスミドおよびＺＦＮプラスミドを共形質転換させたトランスフェクションの結果を示す。ドナー、ｐＤＡＳ００００６８およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた上のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０３％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらのプロトプラスト細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．２２〜０．０７％の範囲である。同様に、ドナー、ｐＤＡＳ００００６８およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７５を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた下のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０４％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらの細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．３８〜０．１２％の範囲である。ジンクフィンガー媒介相同性指向型修復のこれらの結果は、図２０に示すように、約５０，０００のうちの１つのプロトプラストしか赤色蛍光（flouresence）を有さず、その結果、０．００％の組換え頻度となったことが確認された陰性対照実験より、有意に大きい。
図２３は、ドナープラスミドおよびＺＦＮプラスミドを共形質転換させたトランスフェクションの結果を示す。ドナー、ｐＤＡＳ００００７０およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた上のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０７％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらのプロトプラスト細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．６４〜０．２１％の範囲である。同様に、ドナー、ｐＤＡＳ００００７０およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７５を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた下のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０４％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらの細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．３４〜０．１１％の範囲である。ジンクフィンガー媒介相同性指向型修復のこれらの結果は、図２０に示すように、約５０，０００のうちの１つのプロトプラストしか赤色蛍光（flouresence）を有さず、その結果、０．００％の組換え頻度となったことが確認された陰性対照実験より、有意に大きい。
図２４は、ドナープラスミドおよびＺＦＮプラスミドを共形質転換させたトランスフェクションの結果を示す。ドナー、ｐＤＡＳ００００７２およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７４を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた上のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０７％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらのプロトプラスト細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．６２〜０．２０％の範囲である。同様に、ドナー、ｐＤＡＳ００００７２およびジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＳ００００７５を２８μｇ対２μｇのプラスミドＤＮＡ比で共形質転換させた下のグラフは、約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞の約０．０５％の組換え頻度でのＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込みという結果になった。実際には、組換え頻度は、はるかに高い。トランスフェクション実験中に得られた約５０，０００カノーラプロトプラスト細胞については、これらの細胞の約１０〜３０％しか実際に形質転換されない。したがって、ＥＴＩＰゲノム遺伝子座内へのドナーＤＮＡ構築物の実際のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組み込み、トランスフェクション効率は、約０．４４〜０．１４％の範囲である。ジンクフィンガー媒介相同性指向型修復のこれらの結果は、図２０に示すように、約５０，０００のうちの１つのプロトプラストしか赤色蛍光を有さず、その結果、０．００％の組換え頻度となったことが確認された陰性対照実験より、有意に大きい。
ＦＡＣＳ選別法を任意の蛍光導入遺伝子配列のスクリーニングに直接利用することができ、ＦＡＣＳ選別法を用いて、ゲノム遺伝子座内のＥＴＩＰ領域の特定の部位内で相同性媒介修復により蛍光導入遺伝子で標的化されるセイヨウアブラナ（Brassica napus）プロトプラスト細胞のある一定の割合を単離する。
実施例８：追加のＥＴＩＰ設計
植物形質転換ベクターの構築
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）エントリーおよびディスティネーションベクターを標準分子クローニング法によって構築し、それらを使用して最終発現ベクターを生成した。エントリーベクター（ｐＤＡＢ１０５８５２）は、ＲＢ７ ＭＡＲ配列（Hall et al., 1991）およびｅＺＦＮ４結合部位ｖ１（米国特許出願公開第２０１１０１９１８９９号明細書）を含んだ。もう１つのエントリーベクター（ｐＤＡＢ１０５８５３）は、イネユビキチン３（ＯｓＵｂｉ３）プロモーターを含む発現カセット（Sivamani, E., Qu, R., (2006) PlantMolecular Biology 60; 225-239）、ＳＴ−ＬＳ１（Vancanneyt, G., (1990) Mol Gen Genet. 220; 245-50）イントロンを含有する黄色蛍光タンパク質（Ｐｈｉ ＹＦＰ）マーカー遺伝子コード領域（Shagin, D. A., (2004) Mol Biol Evol. 21;841-50）（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシア、モスクワ）、続いてトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子からの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む断片（ＺｍＰｅｒ５ ３’ＵＴＲ ｖ２；米国特許第６，６９９，９８４号明細書）、ｅＺＦＮ１結合部位、そして特別設計のランディングパッド（ＥＬＰ１ ＨＲ２ ｖ２）（米国特許出願公開第２０１１０１９１８９９号明細書）を含んだ。さらなるエントリーベクター（ｐＤＡＢ１０５８５０）は、イントロン１を伴うトウモロコシユビキチン１プロモーターのコピー（ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ８）の制御下のＣｒｙ３４Ａｂ１タンパク質コード領域（米国特許第８，２７３，５３５号明細書）（Christensen, A. H., Quail, P. H., (1996) Transgenic Research 5; 213-218; Christensen, A. H., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689）、およびジャガイモからのＳｔＰｉｎＩＩ ３’ＵＴＲを含む断片（An, G., (1989) Plant Cell. 1; 115-22）を含んだ。追加のエントリーベクター（ｐＤＡＢ１０５８５１）は、コムギペルオキシダーゼ（ＴａＰｅｒ）プロモーター(Hertig, C., (1991) Plant Mol Biol. 16; 171-4) およびＣｒｙ３５Ａｂ１（米国特許出願公開第２０１１０１９１８９９号明細書)タンパク質コード領域、続いてジャガイモからのＳｔＰｉｎＩＩ ３’ＵＴＲを含む断片を含んだ。
アグロバクテリウム媒介トウモロコシ胚形質転換のための形質転換／発現ベクターを、標準クローニング法と、代表的ディスティネーションバイナリーベクター（ｐＤＡＢ１０９８０５）および上で説明したようなエントリーベクターを利用するＧａｔｅｗａｙ（登録商標）組換え反応とを用いることによって構築した。バイナリーディスティネーションベクターｐＤＡＢ１０９８０５は、本質的には米国特許第６，０９３，５６９号明細書に記載されているような、サトウキビ桿菌状ウイルス（ＳＣＢＶ）プロモーターの発現制御下の除草剤抵抗性遺伝子（アリールオキシアルカノエート（aryloxyalknoate）ジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１）；（米国特許第７，８３８，７３３号明細書）を含んだ。トウモロコシリパーゼ遺伝子からの３’ＵＴＲ（ＺｍＬｉｐ ３’ＵＴＲ、米国特許第７，１７９，９０２号明細書）を含む断片を使用して、ＡＡＤ−１ ｍＲＮＡの転写を終結させた。ＡＡＤ−１の発現は、除草剤化合物、例えば、ハロキシホップおよびキザロホップに対する抵抗性を付与する。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）組換え反応を用いてエントリーベクターｐＤＡＢ１０５８５２、ｐＤＡＢ１０５８５３、ｐＤＡＢ１０５８５０およびｐＤＡＢ１０５８５１をディスティネーションベクターｐＤＡＢ１０９８０５と組み換えて、発現ベクターｐＤＡＢ１０５８５５（図３６）を得、それを標的ベクターとして使用した。ＥＴＩＰプラスミドｐＤＡＢ１０５８５５は、Ｔ−ＤＮＡボーダー間にＲＢ７ ＭＡＲ配列／ｅＺＦＮ４結合部位ｖ１、ＯｓＵｂｉ３プロモーター／Ｐｈｉ ＹＦＰ／ＺｍＰｅｒ５ ３’ＵＴＲ ｖ２／ｅＺＦＮ１結合部位／ＥＬＰ１ ＨＲ２ ｖ２、ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ８／Ｃｒｙ３４Ａｂ１ ｖ２／ＳｔＰｉｎＩＩ ３’ＵＴＲ ｖ２、ＴａＰｅｒプロモーターｖ３／Ｃｒｙ３５Ａｂ１ ｖ５／ＳｔＰｉｎＩＩ ３’ＵＴＲ ｖ２、ＳＣＢＶｖ２／ＡＡＤ−１ｖ３／ＺｍＬｉｐ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む、標的ＤＮＡ配列を含有する。ｐＤＡＢ１０５８５５プラスミドはＥＴＩＰプラスミドであり、ｐＤＡＢ１０５８５５プラスミドをトウモロコシゲノム内への組み込みに使用した。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ１）ベクター（ｐＤＡＢ１０５９４１；図３７）は、イントロン１を伴うトウモロコシユビキチン１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ２）の発現下のＺＦＮ１コード配列、およびＺｍＰｅｒ５ ３’ＵＴＲ ｖ２を含んだ。ドナーベクター（ｐＤＡＢ１１２３６６；図３８）は、イネユビキチン３（ＯｓＵｂｉ３）のプロモーターを持たないイントロン（ｒｕｂｉ３イントロン）、続いて除草剤抵抗性遺伝子（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）；Wehrmann et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 1274-1278）、そしてＺｍＬｉｐ ３’ＵＴＲを含有した。活性プロモーターのないこのドナー構成は、除草剤選択についてのＰＡＴ遺伝子のメッセージを生成しない。ドナーベクター内のそのＺｍＬｉｐ ３’ＵＴＲに後にｅＺＦＮ４およびｅＺＦＮ８、そして米国特許出願公開第２０１１０１９１８９９号明細書に記載されているようなＥＬＰ１ ＨＲ２ ｖ２が続く。ドナー（ｐＤＡＢ１１２３６６）中の５’ｒｕｂｉ３イントロンおよび３’ＥＬＰ１ ＨＲ２ ｖ２配列を、標的（ｐＤＡＢ１０５８５５）との５’および３’相同性のために遺伝子標的化に使用して、その標的中のＰｈｉ ＹＦＰ配列をドナーのＰＡＴ配列で正確に置換し、その結果、イネユビキチン３（ＯｓＵｂｉ３）プロモーターによって駆動される機能性ＰＡＴを得、それによって、遺伝子標的化のための陽性選択を生じさせる。
除草剤抵抗性遺伝子（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）を駆動するイネユビキチン３（ＯｓＵｂｉ３）プロモーター、それに続くＺｍＬｉｐ ３’ＵＴＲを含む陽性ＰＡＴ対照ベクター（ｐＤＡＢ１１２３６４）を構築し、後続の実験で使用した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の形質転換
バイナリー発現ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＤＡｔ１３１９２ターナリー（国際特許公開番号国際公開第２０１２０１６２２２号パンフレット）に形質転換させた。細菌コロニーを単離し、バイナリープラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化によって確認した。
アグロバクテリウム媒介形質転換
アグロバクテリウム媒介形質転換を用いて、上記導入遺伝子を植物ゲノムに安定的に組み込み、かくして、ＡＡＤ−１を生産するトランスジェニックトウモロコシ細胞、組織および植物を産生した。スーパーバイナリーまたはバイナリー形質転換ベクターを利用するトウモロコシ形質転換法は、例えば国際ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１０／１２０４５２号パンフレットに記載されているように、当分野において公知である。形質転換組織を、ハロキシホップ含有培地またはビアラホス含有培地で成長するそれらの能力によって選択した。
アグロバクテリウム培養開始
プロジェクトベクターのグリセロールストックをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主株ＤＡｔ１３１９２（国際公開第第２０１２／０１６２２２号Ａ２パンフレット）に供給した。アグロバクテリウム培養物をグリセロールストックからＡＢ最少培地に画線し、２０℃で、暗所で３日間、恒温放置し、これは、適切な抗生物質を含有した。その後、抗生物質を伴うＹＥＰ培地のプレートに培養物を画線し、２０℃で、暗所で１日間、恒温放置した。
実験当日に、接種培地とアセトシリンゴンの混合物（Frame et al. (2011) Methods in Molecular Biology 710: 327-341）をその実験における構築物の数に適切な体積で調製し、滅菌、使い捨て、２５０ｍＬフラスコにピペットで移した。接種培地は、次のものを含有した：２．２ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン（Frame et al., 同書）６８．４ｇｍ／Ｌ スクロース；３６ｇｍ／Ｌ グルコース；１１５ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；および１００ｍｇ／Ｌ ミオ−イノシトール；ｐＨ５．４で）。接種培地が入っているフラスコにアセトシリンゴンを１００％ジメチルスルホキシド中の１Ｍストック溶液から２００μＭの最終濃度まで添加した。
構築物ごとに、ＹＥＰプレートからのアグロバクテリウムが一杯に詰まった１つまたは２つの接種ループを、滅菌、使い捨て、５０ｍＬ遠心チューブ内の１５ｍＬの接種培地／アセトシリンゴン混合物に浮遊させ、５５０ｎｍでのその溶液の光学密度（ＯＤ５５０）を分光光度計で測定した。その後、追加の接種培地／アセトシリンゴン混合物を使用してその浮遊液を０．３から０．４のＯＤ５５０に希釈した。その後、そのアグロバクテリウム浮遊液チューブを室温で約７５ｒｐｍに設定されたプラットフォームシェーカーに水平に配置し、使用前に１〜４時間、振盪した。
穂滅菌および胚単離
トウモロコシ（Zea mays）園芸品種Ｂ１０４から穂を温室で生産し、受粉の１０から１２日後に収穫した。収穫した穂を脱穀し、層流フード内で、市販用漂白剤（Ｕｌｔｒａ Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）殺菌漂白剤、６．１５％次亜塩素酸ナトリウム；２滴のＴＷＥＥＮ ２０を含有）の２０％溶液への２０分間の浸漬によって表面滅菌し、その後、滅菌脱イオン水で３回すすいだ。未成熟接合胚（１．８から２．２ｍｍ長）を各穂から無菌的に切除し、２μＬの１０％ ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３界面活性剤（Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；ドイツ、エッセン）を添加した２．０ｍＬのアグロバクテリウム浮遊液が入っている１本以上のマイクロ遠心チューブに分配した。
アグロバクテリウム共培養
単離後、胚を５分間、揺動台に載せた。その後、４．３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌ スクロース；７００ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中の３．３ｍｇ／Ｌ ジカンバ（３，６−ジクロロ−ｏ−アニス酸または３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）；１００ｍｇ／Ｌ ミオ−イノシトール；１００ｍｇ／Ｌ カゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３；ＤＭＳＯ中の２００μＭ アセトシリンゴン；および３ｇｍ／Ｌ 寒天（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、植物細胞培養試験済み）を含有するｐＨ５．８の共培養培地のプレート上に、前記チューブの内容物を注入した。その液体アグロバクテリウム浮遊液を滅菌、使い捨て、ホールピペットで除去し、胚が入っている共培養プレートを、蓋を少し開けて３０分間、層流フードの奥に置き、その後、顕微鏡を使って滅菌ピンセットを使用して胚盤が上を向くように胚の方向を合わせた。プレートを、蓋を少し開けてさらに１５分間、層流フードの奥に戻した。その後、プレートを閉じ、３Ｍ（商標）Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ（商標）医療テープで密封し、おおよそ６０μＥｍ−２秒−１光度の連続光で２５℃のインキュベーターの中に配置した。
カルス選択およびトランスジェニック事象の再生
共培養期間の後、４．３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌ スクロース；７００ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中の３．３ｍｇ／Ｌ ジカンバ；１００ｍｇ／Ｌ ミオ−イノシトール；１００ｍｇ／Ｌ カゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３；０．５ｇｍ／Ｌ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・一水和物；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌａｂｒ．；カンザス州レネクサ）；２５０ｍｇ／Ｌ セフォタキシム；および７．０ｇｍ／Ｌ 寒天から成るｐＨ５．８の静止培地に胚を移植した。３６以下の胚を各プレートに移した。プレートをＭｉｃｒｏｐｏｒｅ（商標）テープでラップし、２７℃で、５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１ 光度の連続光で、７から１０日間、恒温放置した。その後、カルスを形成した胚（＜１８／プレート）を、休止培地（上記）だが、６．５ｇｍ／Ｌしか寒天を有さず、適宜、１００ｎＭ Ｒ−ハロキシホップ酸（０．０３６２ｍｇ／Ｌ；ＡＡＤ−１遺伝子を内部に持つ形質転換体の選択用）または５．０ｍｇ／Ｌ ビアラホス（ＰＡＴ遺伝子を内部に持つ形質転換体の選択用）のいずれかを有する休止培地から成る、選択培地Ｉに移植した。ビアラホスは、Ｈｅｒｂｉａｎｃｅ（Herbiace）（登録商標）として供給された。プレートをＭｉｃｒｏｐｏｒｅ（商標）テープでラップし、２７℃で、５０μＥｍ−２秒−１光度の連続光で、７日間、恒温放置した。その後、カルスを形成した胚（＜１２／プレート）を、休止培地（上記）だが、６．５ｇｍ／Ｌしか寒天を有さず、適宜、５０ｎＭ Ｒ−ハロキシホップ酸（０．０１８１ｍｇ／Ｌ）または５．０ｍｇ／Ｌ ビアラホスのいずれかを有する休止培地から成る、選択培地ＩＩに移植した。プレートをラップし、２７℃で、５０μＥｍ−２秒−１光度の連続光で、１４日間、恒温放置した。
この段階で、耐性カルス（＜９／プレート）をプレ再生培地に移した。プレ再生培地は、ｐＨ５．８で；４．３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；４５ｇｍ／Ｌ スクロース；３５０ｍｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌ ミオ−イノシトール；５０ｍｇ／Ｌ カゼイン酵素加水分解物；１．０ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３；０．５ｇｍ／Ｌ ＭＥＳ；ＮａＯＨ中の０．５ｍｇ／Ｌ ナフタレン酢酸；エタノール中の２．５ｍｇ／Ｌ アブシジン酸；１ｍｇ／Ｌ ６−ベンジルアミノプリン；２５０ｍｇ／Ｌ セフォタキシム；５．５ｇｍ／Ｌ 寒天；および適宜、５０ｎＭ Ｒ−ハロキシホップ酸または３．０ｍｇ／Ｌ ビアラホスのいずれかを含有した。プレートをラップし、２７℃で、５０μＥｍ−２秒−１光度の連続光で、７日間、恒温放置した。その後、再生しているカルス（＜６／プレート）をＰｈｙｔａｔｒａｙ（商標）（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）内の再生培地に移植し、２８℃で、１日に１６時間昼／８時間夜で、おおよそ１５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１光度で、１４日間または苗条が発生するまで恒温放置した。再生培地は、ｐＨ５．８で；４．３３ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ ＩＳＵ変性ＭＳビタミン；６０ｇｍ／Ｌ スクロース；０．５０ｇｍ／Ｌ ＭＥＳ；１２５ｍｇ／Ｌ セフォタキシム；５．５ｇｍ／Ｌ 寒天；および適宜、５０ｎＭ Ｒ−ハロキシホップ酸または３．０ｍｇ／Ｌ ビアラホスのいずれかを含有した。その後、一次根を有する小さい苗条を単離し、さらなる成長のために、選択のない伸長培地（すなわち、Ｒ−ハロキシホップ酸もビアラホスも有さない再生培地）に移植した。約６ｃｍまたはそれ以上の丈の根付き小植物を土壌に移植し、寒さに慣れさせるために栽培箱に移した。
アッセイおよび種子生産のためのＴ０植物の温室への移植および温室での苗立ち
ハロキシホップまたはビアラホスのいずれかを適宜含有する培地で成長するそれらの能力によって選択された形質転換植物組織を、Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）から、生長培地（ＰｒｏＭｉｘ ＢＸ；Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｔｅｃｈ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ）を満たした小さな鉢（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ、３．５”ＳＶＤ）に移植し、ヒューミドーム（humidome）（Ａｒｃｏ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）をかぶせ、その後、成長室（２８℃昼／２４℃夜、１６時間光周期、５０〜７０％ＲＨ、２００μＥｍ−２秒−１光度）で寒さに慣れさせた。植物がＶ３〜Ｖ４期に達したら、それらをＳｕｎｓｈｉｎｅ Ｃｕｓｔｏｍ Ｂｌｅｎｄ １６０混合土壌に移植し、温室（露光タイプ；光または同化；光の上限：１２００ＰＡＲ；１６時間 日照時間；２７℃昼／２４℃夜）内で開花まで成長させた。導入遺伝子の相対コピー数を検出するように設計したプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにより推定トランスジェニック植物を導入遺伝子コピー数について解析し、進行に選択した単一コピー事象を５ガロン鉢に移植した。定期的に観察を行って、あらゆる異常表現型を追跡した。
粒子ボンバードメントのための温室でのＴ１Ｓ１ヘミ接合未成熟胚の生産
標的配列に対してトランスジェニックな植物に自家受粉させてＴ１種子を得た。そのＴ１種子を播き、ｑＰＣＲ法を用いて植物を標的導入遺伝子の接合状態について解析した。標的導入遺伝子対してホモ接合性の植物をさらに花粉生産に進めた。ホモ接合標的植物の花粉を使用してＢ１０４トウモロコシ植物を戻し交配して、Ｔ１Ｓ１ヘミ接合未成熟胚を得た。それらの未成熟胚を、ドナーおよびＺＦＮ１ ＤＮＡでの粒子ボンバードメントに使用して、遺伝子標的化を試験した。
微粒子ボンバードメントによるトウモロコシ未成熟胚の標的化
微粒子ボンバードメントの３日前に、１．５〜２．２ｍｍ胚を、表面滅菌した穂から単離し、２．５ｇ／Ｌ Ｇｅｌｚａｎ（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ケンタッキー州シャウニー・ミッション）で凝固させた、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、２．８ｇ／Ｌ プロリン、３０ｇ／Ｌ スクロース、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン酵素加水分解物、１００ｍｇ／Ｌ ミオ−イノシトールおよび４．２５ｍｇ／Ｌ 硝酸銀を含有する、ビタミン入りＮ６基礎培地（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ケンタッキー州シャウニー・ミッション）上に（胚盤を上にして）配置した。微粒子ボンバードメントの４時間前に、約３５〜４０個の胚を、３６．４ｇ／Ｌ ソルビトールおよび３６．４ｇ／Ｌ マンニトールを添加した同じ培地が入っている１００×１５ｍｍ ペトリ皿の中央に（胚盤を上にして）配置した。
金微粒子（０．６マイクロメートル、ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を、１５ｍｇを量り取って滅菌、シリコン処理１．７ｍＬマイクロ遠心チューブ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス、Ｔ３４０６）に入れることにより、ＤＮＡ沈殿用に調製し、５００μＬの氷冷１００％エタノールをゆっくりと添加した。ＦＳ−１４超音波水浴（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルバニア州ナザレ）での１５秒の超音波処理後、３０分間、室温で金を放置して沈降させ、その後、ＭｉｎｉＳｐｉｎ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ニューヨーク州ホーポージ）を使用して６０秒間、３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を除去した後、１ｍＬの氷冷、滅菌水を添加し、ピペットで吸い上げ、吐き出して混合し、３〜５分間、放置して沈降させ、その後、６０秒間、３，０００で遠心分離した。洗浄工程をもう１回繰り返した後、金を５００μＬの氷冷、滅菌水に懸濁させた。その後、その洗浄した金を、別々の１．７ｍＬ滅菌、シリコン処理マイクロ遠心チューブに、チューブ間でピペットで吸い上げ、吐き出すことによって金を十分に混合された状態に保つように注意しながら等分した（チューブ１本につき５０μＬ）。その後、その洗浄した金（５０μＬあたり約１．５ｍｇ）を必要になるまで−２０℃で保管した。
ＤＮＡ沈殿のために、５０μＬの水中の約１．５ｍｇの金が入っている１本のチューブをボンバードする１０標的ごとに解凍し、超音波水浴で１５秒間、超音波処理し、その後、氷上に置いた。プラスミドＤＮＡ（０．６μｇ ＺＦＮ＋４．４μｇ ドナー）を０．６ｍＬマイクロ遠心チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルバニア州ナザレ）の中で予混し、金懸濁液に添加して、穏やかにピペットで数回吸い上げ、吐き出して入念に混合した。５０マイクロリットル（５０μＬ）の氷冷２．５Ｍ 塩化カルシウムを添加し、ピペットで数回吸い上げ、吐き出すことによって穏やかに混合した。その後、２０マイクロリットル（２０μＬ）の氷冷０．１Ｍ スペルミジンを添加し、ピペットで数回吸い上げ、吐き出すことによって穏やかに混合した。その後、チューブにキャップをし、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ ２（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ボヘミア）上に配置し、（「シェーク２」に設定して）１０分間混合させ、その後、混合物を３〜５分間、放置して沈降させた。１５秒間、５，０００ｒｐｍでの遠心分離後、上清を注意深く除去し、２５０μＬの氷冷、１００％エタノールを添加し、チューブにキャップをし、手で激しく混合してペレットを脱落させた。１５秒間、５，０００ｒｐｍでの第二の遠心分離後、１２０μＬの氷冷、１００％エタノールを添加し、チューブにキャップをし、手で激しく混合してペレットを脱落させた。
微粒子ボンバードメントのために、滅菌マクロキャリア（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）をステンレス鋼ホルダー（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）に取り付け、オートクレーブ処理した。１０マイクロリットル（１０μＬ）の金／ＤＮＡ懸濁液を、必ずピペットで吸い上げ、吐き出して十分に混合された状態を保ちながら、マクロキャリアの中央に均等に塗布し、その後、１４０×２５ｍｍ ガラスペトリ皿の中の８メッシュ Ｄｒｉｅｒｉｔｅ（Ｗ．Ａ Ｈａｍｍｏｎｄ Ｄｒｉｅｒｉｔｅ Ｃｏ．，オハイオ州ジーニア）床上の１枚の滅菌１２５ｍｍ Ｗｈａｔｍａｎ ＃４濾紙（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国バキンガムシア）の上に配置した。その金／ＤＮＡを約１０分間放置して完全に乾燥させた。ラプチャーディスク（６５０ｐｓｉ、ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を、数分間イソプロピルアルコールに浸漬することによって滅菌し、その後、微粒子ボンバードメントデバイス（ＰＤＳ−１０００、ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）の保持キャップに装填した。オートクレーブ処理したストッピングスクリーン（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）および装填されたマクロキャリアを発射アセンブリ内に配置し、蓋を回して閉め、ノズルの真下のボンバードメントチャンバに滑り込ませた。スクリーンで覆われた葉標的が入っているペトリ皿の覆いをはずし、ノズルの６ｃｍ下のボンバードメントチャンバ内に配置した。真空を引き（−０．９ｂａｒ）、デバイスを発射させた。
翌日（ボンバードメントの１６〜２０時間後）、ボンバードされた胚を、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、２．８ｇ／Ｌ プロリン、３０ｇ／Ｌ スクロース、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン酵素加水分解物、１００ｍｇ／Ｌ ミオ−イノシトールを含有する、ビタミン入りＮ６基礎培地（ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ケンタッキー州シャウニー・ミッション）に（胚盤を上にして）移植した。
陽性ＰＡＴ対照ベクター（ｐＤＡＢ１１２３６４）を使用する粒子ボンバードメントのためのＰＡＴ最適化
ＰＡＴ対照ベクター（ｐＤＡＢ１１２３６４）を使用して粒子ボンバードしたトウモロコシ胚についての組織培養条件を標準化した。ドナーベクター（ｐＤＡＢ１１２３６６）を、ＺＦＮ１ベクター（ｐＤＡＢ１０５９４１）とともにおよびなしで潜在的バックグラウンド選択について試験した。下の表２５に示すように、ＰＡＴ対照ベクター（ｐＤＡＢ１１２３６４）を使用して９％の形質転換頻度を得た。このデータは、イネユビキチン３（ＯｓＵｂｉ３）プロモーターがＰＡＴ遺伝子の強い発現を駆動して、トウモロコシＢ１０４未成熟胚の粒子ボンバードメントを用いる植物形質転換についての選択を達成することを示す。ＺＦＮ１ベクター（ｐＤＡＢ１０５９４１）とともにまたはなしでドナーベクター（ｐＤＡＢ１１２３６６）を使用してボンバードした未成熟胚については、非常に少数（１〜２）の植物がＰＡＴ選択培地で得られた。これらの結果は、上流プロモーターのないｒｕｂｉ３イントロンを含有するドナーベクター（ｐＤＡＢ１１２３６６）がＰＡＴ遺伝子についての形質転換選択をもたらさないことを確証する。
遺伝子標的化のためにドナーおよびＺＦＮ１を使用する、標的ｐＤＡＢ１０５８５５に対してトランスジェニックな未成熟胚の粒子ボンバードメント
標的ｐＤＡＢ１０５８５５に対してヘミ接合性の未成熟トウモロコシ胚を、ＺＦＮ１とドナーＤＮＡのプレミックス（ｐＤＡＢ１０５９４１／１１２３６６）を使用する粒子ボンバードメントのために処理して、陽性ＰＡＴ選択を用いる遺伝子標的化を達成した。表１７は、その標的事象、および各事象に使用した胚の数を示す。ＰＡＴ選択培地でうまく再生された植物の数も標的事象ごとに表２６に示す。すべての事象をカバーする処理した１３，５６３未成熟胚から合計６８植物が再生された。ＰＡＴ選択培地で得られた植物の少ない数が、非標的化ランダムＰＡＴドナー挿入物の大部分が排除されたことを実証する。
ＥＴＩＰ遺伝子標的化についてのＰＣＲ解析
ＱＰＣＲを行って、ＰＡＴ選択培地で再生された合計６８植物のうちの６７植物においてＹＦＰおよびＰＡＴコード配列を検出した。結果を表２７に要約する。表２７が示すように、５０植物は、ｑＰＣＲアッセイを用いてＰＡＴ陽性であると判明したが、２４植物は、ＹＦＰコード配列について陰性であった。このデータは、ＰＡＴ選択で得られた１７植物が逸脱植物であったこと、およびＺＦＮ１発現が少なくとも２４植物において標的遺伝子座内のＹＦＰを破壊したことを示唆する。
さらなる診断イン／アウトＰＣＲを２４のＹＦＰ陰性事象について行って、遺伝子標的化を測定した。５’イン／アウトＰＣＲは、標的、すなわち、ＯｓＵｂｉ３プロモーターにアニールするＤＮＡ特異的５’オリゴと、ＰＡＴコード配列にアニールする３’オリゴとを利用して、１８３８ｂｐの予想ＰＣＲ産物を得る。この予想ＰＣＲ産物が、標的遺伝子座の５’への正確な遺伝子標的化を支持することになる。ＰＣＲ結果は、予想１８３８ｂｐ産物が２１事象において増幅されたことを確証した。
類似の３’イン／アウトＰＣＲを行った。この方法は、ＰＡＴコード配列にアニールするドナーＤＮＡ特異的５’オリゴと、ＺｍＵｂｉ１プロモーター配列にアニールするドナーＤＮＡ特異的３’オリゴとを利用して、２１８４ｂｐの予想ＰＣＲ産物を得る。この予想ＰＣＲ産物が、標的遺伝子座の３’への正確な遺伝子標的化を支持することになる。ＰＣＲ結果は、２１８４ｂｐの予想アンプリコンが１６事象において生産されたことを確証した。
標的遺伝子座の５’および３’両方についてのイン／アウトＰＣＲデータを表２８に要約する。このデータは、１５事象が予想ＰＣＲ産物をもたらしたことを明示し、これは、全ＰＡＴ陽性再生植物からの約３０％遺伝子標的化頻度を示す。
遺伝子標的化についてのサザンブロット解析
サザンブロット解析を用いる標的事象の特性評価は、事象＃１２における標的導入遺伝子の短縮を明示した。合計１２事象をサザンブロッティングについて解析した。そのデータは、予想バンドパターンが５植物（３ 事象＃１２について、および２ 他の事象）において同定されたことを確証した。これらの結果は、ゲノム内に組み込まれたＥＴＩＰ構築物をその後ドナー配列で再び標的化することができること、およびＥＴＩＰが標的化プラットフォームとして役立つことができることを示した。図３９は、遺伝子発現カセットを含有するドナーポリヌクレオチドの標的化のためのゲノム内に組み込まれたＥＴＩＰ部位の使用についての概略図を提供するものである。このスキームに示されているように、ドナーは、ＥＴＩＰ遺伝子座内への組み込みが起こると誘導遺伝子を発現することができる。ドナーポリヌクレオチドのランダム組み込みは、ドナーポリヌクレオチドがゲノム内にランダムに組み込まれたときに発現を駆動することができるプロモーター要素がないので、導入遺伝子の発現をもたらさない。ＥＴＩＰ部位内へのドナーの標的化は、機能性マーカー遺伝子をもたらし、それを検出することができ、またはそれについて選択することができる。
ある一定の例示的実施形態を本明細書において説明したが、後続のクレームの範囲を逸脱することなくそれらの例示的実施形態に多くの追加、削除および変更を加えてもよいことは、通常の当量者には認められ、理解されるであろう。加えて、１つの実施形態の特徴を別の実施形態の特徴と組み合わせてもよい。

Claims (21)

  1. トランスジェニック植物細胞を生産するための方法であって、
    ドナー核酸分子および部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸分子で植物細胞を形質転換させる工程を含み、
    前記植物細胞が、前記植物細胞のゲノムＤＮＡ中の部位に組み込まれたポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、５’から３’の方向に、
    第一のプロモーター、
    第一の機能的マーカー遺伝子の第一の非機能的断片、
    前記部位特異的ヌクレアーゼのための少なくとも１つの認識部位、および
    第二の機能的マーカー遺伝子の第二の非機能的断片であって、前記第一のプロモーターが、前記第一の機能的マーカー遺伝子の前記第一の非機能的断片に対して作動可能に結合している、第二の非機能的断片を含み、
    前記ドナー核酸分子が、５’から３’の方向に前記第一の機能的マーカー遺伝子の第二の断片、目的のヌクレオチド配列、第二のプロモーター、および前記第二の機能的マーカー遺伝子の第一の断片を含むドナーポリヌクレオチドを含み、前記第二のプロモーターが、前記第二の機能的マーカー遺伝子の前記第一の断片に作動可能に連結しており、
    それにより、前記部位特異的ヌクレオチドを発現して、前記植物細胞の前記ゲノムＤＮＡ中に前記部位特異的ヌクレアーゼの前記認識部位において二本鎖破断を導入し、前記二本鎖破断の修復が前記部位での前記ドナーポリヌクレオチドの組み込みを生じて前記トランスジェニック植物細胞を生産し、
    前記トランスジェニック植物細胞が、前記部位で、５’から３’の方向に、
    前記第一のプロモーター、
    前記第一の機能的マーカー遺伝子、
    前記目的のヌクレオチド配列、
    前記第二のプロモーター、および
    前記第二の機能的マーカー遺伝子を含み、ここで、前記第一のプロモーターが、前記第一の機能的マーカー遺伝子に作動可能に連結しており、前記第二のプロモーターが、前記第二の機能的マーカー遺伝子に作動可能に連結している、方法。
  2. 前記植物細胞のゲノムＤＮＡ中の前記部位に組み込まれたポリヌクレオチドが、５’から３’の方向に、
    前記第一のマーカー遺伝子の前記第一の断片、
    第一の相同アームヌクレオチド配列、
    前記部位特異的ヌクレアーゼのための前記認識部位、
    第二の相同アームヌクレオチド配列、および
    前記第二のマーカー遺伝子の前記第二の断片を含み、前記ドナーポリヌクレオチドが、５’から３’の方向に、
    前記第一の相同アームヌクレオチド配列、
    前記第一のマーカー遺伝子の前記第二の断片、
    前記目的のヌクレオチド配列、
    前記第二のマーカー遺伝子の前記第一の断片、および
    前記第二の相同アームヌクレオチド配列を含み、前記ドナーポリヌクレオチドが、相同性依存的二本鎖破断修復機構により前記部位で組み込まれる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第一または第二の相同アームヌクレオチド配列が、イントロンである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記第一および第二の相同アームヌクレオチド配列が、５０％未満の配列同一性を共有する、請求項２に記載の方法。
  5. 前記第一および第二相同アームヌクレオチド配列が、５０ｂｐから３ｋｂｐの長さである、請求項２に記載の方法。
  6. 前記植物細胞が、植物組織、または植物全体中に含まれる、請求項１に記載の方法。
  7. 前記目的のヌクレオチド配列が、遺伝子発現カセットを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記遺伝子発現カセットが、少なくとも１つの導入遺伝子を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記導入遺伝子が、虫害抵抗性導入遺伝子、除草剤抵抗性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合タンパク質をコードする導入遺伝子および選択可能マーカーをコードする導入遺伝子から成る群より選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記部位特異的ヌクレアーゼが、ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインまたは切断ハーフドメインとを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化因子様（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、リコンビナーゼからのＤＮＡ結合ドメイン、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、およびそれらのキメラ的組み合わせから成る群より選択され、
    前記切断ドメインまたは切断ハーフドメインが、ＩＩＳ型制限部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＦｏｋＩ部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＳｔｓＩ部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびホーミング部位特異的ヌクレアーゼからなる群から選択される、、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインである、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記切断ドメインまたは切断ハーフドメインが、ＩＩＳ型制限部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＦｏｋＩ部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびＳｔｓＩ部位特異的ヌクレアーゼからの切断ハーフドメインから成る群より選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記トランスジェニック植物細胞において前記第一の機能的マーカー遺伝子の発現をスクリーニングする工程、または前記第二の機能的マーカー遺伝子の発現をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  15. 前記第一の機能的マーカー遺伝子および前記第二の機能的マーカー遺伝子の発現をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  16. 前記第一の機能的マーカー遺伝子または第二の機能的マーカー遺伝子が、ＰＭＩ、ＹＦＰ、Ｘｙｌ（Ａ）、ＲＦＰ、ＤＳＲ、ＧＦＰ、ＧＵＳ、ＮＰＴＩＩ、ＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１２、ＡＨＡＳ、ＰＡＴ、ＨＰＨ、およびＢＡＲから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
  17. 前記トランスジェニック植物細胞を、フローサイトメトリーを利用して単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  18. 前記第一および第二の相同アームヌクレオチド配列がイントロンである、請求項２に記載の方法。
  19. 前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物組織またはトランスジェニック植物を再生する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  20. 前記スクリーニングが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を利用する、請求項１に記載の方法。
  21. 前記植物細胞の前記ゲノムＤＮＡ中の前記部位が、
    配列番号４３１および配列番号４３２、
    配列番号４３３および配列番号４３４、
    配列番号４３５および配列番号４３６、
    配列番号４３７および配列番号４３８、
    配列番号４３９および配列番号４４０、
    配列番号４４１および配列番号４４２、
    配列番号４４３および配列番号４４４、または
    配列番号４４５および配列番号４４６を含む、請求項１に記載の方法。
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