[go: up one dir, main page]

UA112968C2 - Штам agrobacterium, модифікований для збільшення частоти трансформації рослин - Google Patents

Штам agrobacterium, модифікований для збільшення частоти трансформації рослин Download PDF

Info

Publication number
UA112968C2
UA112968C2 UAA201302506A UAA201302506A UA112968C2 UA 112968 C2 UA112968 C2 UA 112968C2 UA A201302506 A UAA201302506 A UA A201302506A UA A201302506 A UAA201302506 A UA A201302506A UA 112968 C2 UA112968 C2 UA 112968C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
dna
plasmid
strain
plant
fragment
Prior art date
Application number
UAA201302506A
Other languages
English (en)
Inventor
Дональд Дж. Мерло
Шон М. Рассел
Дайан РЕТАЛЛАК
Аарон Вуслі
Том Мід
Кеннет Е. Нарва
Original Assignee
ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі filed Critical ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі
Publication of UA112968C2 publication Critical patent/UA112968C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/743—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Agrobacterium; Rhizobium; Bradyrhizobium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Винахід стосується способу трансформації рослини, який включає контактування клітини рослини зі штамомщо має недостатність функції RecA, який містить щонайменменше одну допоміжну плазміду рТі, яка включає фрагмент 14,8 КрnТ з pSBl, і плазміду рТі, яка містить щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК, причому ділянка Т-ДНК включає щонайменше праву границю Т-ДНК і екзогенну ДНК, яка прилягає до границі, де плазміди містять точки початку реплікації, які відрізняються міжсобою, а також до штамущо має недостатність функції RecA, також до рослини, одержаної за заявленим способом.

Description

Винахід стосується способу трансформації рослини, який включає контактування клітини рослини зі штамом Адгобрасіелит, що має недостатність функції НесА, який містить щонайменменше одну допоміжну плазміду ртТі, яка включає фрагмент 14,8 КрптТ з ровВІ, і плазміду рті, яка містить щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК, причому ділянка Т-ДНК включає щонайменше праву границю Т-ДНК і екзогенну ДНК, яка прилягає до границі, де плазміди містять точки початку реплікації, які відрізняються між собою, а також до штаму
Адгорасіепит, що має недостатність функції НесА, також до рослини, одержаної за заявленим способом.
За даною заявкою заявляється пріоритет попередньої заявки США Мо 61/368965, поданої 29 липня 2010 року. Розкриття попередньої заявки розглядається як частина розкриття даної заявки.
Відомий рівень техніки
Трансформація рослин звичайно охоплює методи, необхідні і використовувані для введення в рослинні клітини здатного експресуватися в рослинах чужорідного гена, так що можуть бути отримані здатні до запліднення потомки рослин, які стабільно підтримують і експресують чужорідний ген. Були трансформовані численні представники, класифіковані як однодольні і дводольні рослини. Трансгенні сільськогосподарські культури, а також фрукти й овочі становлять комерційний інтерес. Такі культури включають, але не обмежуються цим, маїс, рис, сою, канолу, соняшник, люцерну, сорго, пшеницю, бавовну, арахіс, томати, картоплю тощо.
Незважаючи на розвиток систем трансформації рослин для введення в рослинні клітини здатного експресуватися в рослинах чужорідного гена, бажані додаткові удосконалення, які дозволять підвищити ефективність трансформації і забезпечать істотні переваги для подолання робочих недоліків при трансформації рослин чужорідними генами.
Відомо декілька способів уведення чужорідного генетичного матеріалу в рослинні клітини й отримання рослин, які стабільно підтримують і експресують уведений ген. Такі способи включають доставку генетичного матеріалу, нанесеного на мікрочастинки, із прискоренням прямо в клітини (наприклад, у патенті США Мо 4945050 і патенті США Мо 5141131). Інший спосіб трансформації включає технологію з застосуванням карбіду кремнію або технологію
МІНІЗКЕК5 М, Див., наприклад, патент США Мо 5302523 і патент США Мо 5464765. Метод електропорації також використовувався для трансформації рослин. Див., наприклад, патент М/О 87/06614, патент США Мо 5472869, патент США Мо 5384253, патенти УМО 92/09696 і патент УМО 93/21335. Крім того, може бути використане злиття протопластів рослин з ліпосомами, які містять ДНК, призначену для доставки, пряме введення ДНК, а також інші можливі способи.
Після інтеграції ДНК у рослинний геном, вона звичайно стає відносно стабільною протягом наступних поколінь. Трансформовані клітини ростуть усередині рослин звичайним чином. Вони можуть утворювати статеві клітини і передавати характерну(-ні) особливість(-ості) трансформації потомкам рослин. Такі рослини можуть бути вирощені нормальним чином і
Зо можуть схрещуватися з рослинами, які мають ті ж самі трансформовані наслідувані фактори або інші наслідувані фактори. Отримані в результаті гібридні індивідууми мають відповідні фенотипічні властивості, наприклад, здатність контролювати харчування комах-шкідників рослин.
Для введення ДНК у рослинні клітини-хазяїни може бути також використаний ряд альтернативних методів. Ці методи включають, але не обмежуються цим, трансформацію за допомогою Т-ДНК, яка доставляється Адгорасіегішт їштегасієп5 або Адгобасієгічт гпігодепев як агентів трансформації. Рослини можуть бути трансформовані з використанням методу з застосуванням Адгобасіегішт, як описано, наприклад, у патенті США Мо 5177010, патенті США
Мо 5104310, європейській патентній заявці Мо 013162481, європейській патентній заявці Мо 120516, європейській патентній заявці Мо 15941881, європейській патентній заявці Мо 176112, патенті США Мо 5149645, патенті США Мо 5469976, патенті СЩА Мо 5464763, патенті США Мо 4940838, патенті США Мо 4693976, європейській патентній заявці Мо 116718, європейській патентній заявці Мо 290799, європейській патентній заявці Мо 320500, європейській патентній заявці Мо 604662, європейській патентній заявці Мо 627752, європейській патентній заявці Мо 0267159, європейській патентній заявці Мо 0292435, патенті США Мо 5231019, патенті США Мо 5463174, патенті США Мо 4762785, патенті США Мо 5004863 і патенті США Ме 5159135.
Використання векторів, які містять Т-ДНК, для трансформації рослинних клітин інтенсивно досліджувалося й адекватно описане в європейській патентній заявці 120516; Ап еї аї., (1985,
ЕМВО 9. 4:277-284), Егаїєу сеї аї., (1986, Стії. Веу. Ріапі Зсі. 4:1-46) і ее апа СеМіп (2008, Ріапі
РНузіої!. 146: 325-332), і добре обгрунтовано в даній галузі техніки.
Відома біологія перенесення Т-ДНК із Адгорасіегішт у рослинні клітини. Див., наприклад,
СеМміп (2003) Містобріо!. Моїес. Віо!. Веу. 67:16-37; і Сеїміп (2009) Ріапі Рпузіої. 150:1665-1676. Як мінімум щонайменше правий пограничний повтор Т-ДНК, але часто як правий пограничний повтор, так і лівий пограничний повтор плазміди Ті або Кі повинні бути з'єднані у вигляді фланкуючої ділянки генів, які бажано ввести в рослинну клітину. Лівий і правий пограничні повтори Т-ДНК є ключовими цис-діючими послідовностями, необхідними для перенесення Т-
ДНК. У повному геномі Адгобасіегішт закодовані різні транс-діючі компоненти. Головними серед них є білки, які кодовані генами міг, які звичайно виявляються у вигляді серій оперонів у плазмідах Ті або Кі. Різні плазміди Ті і Кі до деякої міри відрізняються за набором генів міг, 60 наприклад, міг є присутнім не завжди. Білки, які кодовані генами міг, виконують багато різних функцій, включаючи, у вигляді згадування деяких характеристик, впізнавання і сигналізацію при взаємодії рослинна клітина/Сактерії, індукцію транскрипції гена міг, утворення секреторного каналу типу ІМ, впізнавання пограничних повторів Т-ДНК, утворення Т-ланцюгів, перенесення Т- ланцюгів у рослинну клітину, імпорт Т-ланцюгів у ядро рослинної клітини й інтеграцію Т- ланцюгів у хромосомі клітинного ядра рослини. Див., наприклад, Т2йга апа Спйом5Ку (2006) Ситт.
Оріп. Віоїесппо)ї. 17:147-154.
Якщо для трансформації використовують штами Адгорасіегішт, ДНК, призначену для введення в рослинну клітину, можна клонувати у спеціальних плазмідах, наприклад, або в проміжному (човниковому) векторі, або в бінарному векторі. Проміжні вектори не здатні до незалежної реплікації в клітинах Адгобрасіегішт, але маніпуляції з ними їі їхньою реплікацією можна проводити в розповсюджених штамах ЕзспПегіспіа соїї для молекулярного клонування.
Такі проміжні вектори включають послідовності, звичайно обмежені рамками ділянок пограничних правих і лівих повторів Т-ДНК, вони можуть включати маркерний ген селекції для добору трансформованих рослинних клітин, клонуючий лінкер, клонуючий полілінкер або іншу послідовність, яка може функціонувати як сайт для введення генів, призначених для трансформації рослинної клітини. Клонування і керування генами, які бажано перенести в рослини, таким чином, може бути легко здійснене за допомогою стандартних методів у Е. сої з використанням як клонуючого вектора човникового вектора. Після закінчення маніпуляцій човниковий вектор може бути згодом введений у штами Адгобасіегішт, призначені для трансформації рослин, для наступної роботи. Проміжний човниковий вектор може бути перенесений у Адгобасіегішт за допомогою допоміжної плазміди (шляхом кон'югації бактерій), шляхом електропорації, за допомогою опосередкованої хімічно прямої трансформації ДНК або за допомогою інших відомих методів. Човникові вектори можуть бути інтегровані в плазміду Ті або Кі або в їхні похідні за допомогою гомологічної рекомбінації, завдяки послідовностям, які гомологічні в плазміди Ті або Рі або їхніх похідних і в проміжної плазміди. Це подія гомологічної рекомбінації (тобто інтеграції плазміди) тим самим є засобом стабільної підтримки зміненого човникового вектора в Адгобасіегішт із точкою початку реплікації й інших функцій підтримки плазміди, забезпечуваними частиною плазміди Ті або Кі у коінтегративній плазміді. Плазміда Ті або Кі також включає ділянки міг, які включають гени міг, необхідні для перенесення Т-ДНК.
Плазміда, яка несе ділянку міг, звичайно являє собою мутовану Ті або Кі плазміду (допоміжну плазміду), з якої вилучена ділянка Т-ДНК, включаючи праві і ліві пограничні повтори Т-ДНК. Такі плазміди, які походять від рт, які мають функціонуючі гени міг і позбавлені усього або по суті усього з Т-ділянки і супровідних елементів, при описі в даному документі позначаються як допоміжні плазміди.
Супербінарна система являє спеціалізований приклад човникового вектора/системи гомологічної рекомбінації (розглянуто в оглядах Коптагі еї аї., (2006) у: Меїпод іп МоїІесшіаг
Віоіоду (К. У/апод, єа.) Мо.343: Адгорасієгішт Ргоїосоїв (29 Едійоп, Мої. 1) НОМАМА РВАВЕ55 Іпс.,
Тоюула, МУ, рр.15-41; ї Котогі еї аї., (2007) Ріапі РпузіоІї. 145:1155-1160). Штам хазяїна
Адгорасіегіцт їшптеїасіеєпо, застосовуваний із супербінарною системою, являє собою
І ВА4404(р5В1). Штам ІВА4404(р5ВІ) несе дві плазміди рА/ 4404 і ро5ВІ1, які незалежно реплікуються. рА! 4404 являє собою допоміжну плазміду, яка походить від Ті плазміди, яка містить інтактний набір генів міг (від Ті плазміди ртіАсСнНВ5), але яка не має ділянки Т-ДНК (Її, отже, не має послідовностей лівих і правих пограничних повторів). Плазміда роВі постачає додатковим частковим набором генів міг, які походять з ртіво542; цей частковий набір генів міг включає оперон міг і оперон міг, а також гени міг і мі1. Одним прикладом човникового вектора, використовуваного в супербінарній системі, є рОВ11, який містить клонуючий полілінкер, який слугує як сайт введення генів, призначених для трансформації рослинної клітини, до якого примикають ділянки правих і лівих пограничних повторів Т-ДНК. Човниковий вектор рОВ11 не здатний до незалежної реплікації в Адгорасіегічшт, але стабільно підтримується у вигляді коінтегративної плазміди при інтеграції в РОЗВ! за допомогою гомологічної рекомбінації між загальними послідовностями, які є присутніми у реВІ! і реВ11. Таким чином, повністю модифікована ділянка Т-ДНК, введена в І ВА4404(рОВ1) у модифікованому векторі реВ11, продуктивно діє в ньому і переноситься в рослинні клітини за допомогою білків Міг, які ПоХОДЯТЬ від двох різних джерел плазмід Ті Адгорасіегішт (ртіАсСнН5 і ртіво542). Супербінарна система, як доведено, є особливо придатною для трансформації видів однодольних рослин. Див. Ніеї еї аї., (1994) Ріапі 9. (6:271-282 і Івпіда єї а1ї., (1996) Маї. Віотесппої. 14:745-750.
Крім генів міг, які несуть плазміди Ті Адгобасіегішт, інші, які походять з хромосом гени, які контролюють вірулентність (які позначаються як гени см), відомі як контролюючі визначені аспекти взаємодій клітин Адгорасіегічшт і рослинних клітин і в такий спосіб, впливають на бо сумарну частоту трансформації рослин (Рап еї аї., (1995) Моїес. Місгоріої. 17:259-269). Деякі з генів, які походять з хромосом, необхідних для вірулентності і приєднання, згруповані разом у хромосомному локусі на відрізку в 29 тисяч основ (МайПуззе еї а!., (2000) Віоспіт. Віорпув. Асіа 1490:208-212).
Незалежно від конкретної застосовуваної плазмідної системи, клітини Адгобасієгійт, трансформовані таким чином, використовуються для трансформації рослинних клітин. Рослинні експланти (наприклад, частини листя, сегменти стебла, коренів, а також протопласти або культивовані в суспензії клітини) можуть бути успішно прокультивовані з Адгорасієгійт
Іштегасієп5 або Адгорасієегішт гпігодепе5 для перенесення ДНК у рослинну клітину. Потім може бути здійснена регенерація цілих рослин з інфікованого рослинного матеріалу з наступним вміщенням у придатні умови росту і культуральне середовище, яке може містити антибіотики або гербіциди для селекції трансформованих рослинних клітин. Отримані в такий спосіб рослини можна потім тестувати на присутність вставленої ДНК.
Ці методи введення чужорідного генетичного матеріалу в рослини можуть бути використані для введення сприятливих ознак у рослини. Наприклад, мільярди доларів витрачаються щороку для контролювання комах-шкідників і ще мільярди втрачаються через заподіяний ними збиток.
Синтетичні інсектициди на основі органічної хімії є головними засобами, використовуваними для контролювання комах-шкідників, але в деяких ділянках важливу роль відіграють біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, які походять від Васійи5 «Пигіпдіепоіє (ВО. Здатність створювати стійкі до комах рослини шляхом уведення генів інсектицидних білків Ві відіграє революційну роль у сучасному сільському господарстві і підвищує цінність інсектицидних білків і їхніх генів.
Для створення стійких до комах трансгенних рослин використано декілька білків Ві, які успішно розроблені й у багатьох випадках зареєстровані і впроваджені в промисловість. Вони включають СтутАб, Сту1!Са, СтуїРа і СтгузВЬ у кукурудзі, СгтгутАс і Стгу2АБб у бавовні і СтузЗА у картоплі.
Комерційні продукти, які експресують білки Ві, експресують один білок за винятком випадків, коли бажаний об'єднаний спектр із 2 білків (наприклад, об'єднання СтгуТтАб і СтуЗВЬ у кукурудзі для додавання стійкості до лускокрилих метеликів шкідників і довговусих блішок, відповідно) або коли незалежна дія білків робить їх корисними як засіб для затримки розвитку стійкості в
Зо сприйнятливих популяцій комах (наприклад, об'єднання СтутїАс і Сту2АБбБ у бавовні для забезпечення керування стійкістю до гусениці листовійки-брунькоїда тютюну).
Це значить, що деякі з якостей трансгенних рослин, стійких до комах, які привели до швидкого і широкого використання цієї технології, у результаті також приводять до того, що популяції шкідників будуть виробляти стійкість до інсектицидних білків, продукованих цими рослинами. Запропоновано декілька стратегій для збереження придатності ознак стійкості до комах, створених на основі Ві, які включають розгортання білків при високій дозі в поєднанні з укриттям і чергування з різними токсинами або їхнє спільне розгортання (Месацднеу еї аї. 1998,
Маїшиге Віоїесппої. 16:144-146).
Якщо проводять селекцію білків Ві для використання в поєднанні, необхідно, щоб вони виявляли свій інсектгицидний ефект незалежно так, щоб стійкість, яка розвинулася до одного білка, не додавала стійкості до другого білка (тобто щоб не спостерігалося перехресної стійкості до білків). Оцінка надійності перехресної стійкості звичайно здійснюється з використанням популяцій видів шкідників, звичайно чутливих до інсектицидного білка, які були відібрані по стійкості до інсектицидних білків. Якщо, наприклад, популяція шкідників, відібрана по стійкості до "білка А", чутлива до "білка В", то можна вважати, що не існує перехресної стійкості, і що поєднання білка А і білка В повинно бути ефективним відносно стримування стійкості до білка А окремо.
При відсутності популяцій стійких комах оцінки можуть бути зроблені на основі інших характеристик, які приблизно стосуються механізму дії і потенціалу перехресної стійкості.
Припущено використання зв'язування, опосередкованого рецепторами, для ідентифікації інсектицидних білків, імовірно, які не виявляють перехресної стійкості (патент США Мо 6855873).
Ключовим моментом передбачання відсутності сумарної перехресної стійкості в цьому підході є те, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори в чутливих видів комах.
У тому випадку, коли два токсини Сгу з Ві конкурують за той самий рецептор, то потім, якщо цей рецептор мутує у цієї комахи так, що один з токсинів не буде більше зв'язуватися з цим рецептором і в такий спосіб не буде більше інсектицидним відносно цієї комахи, це також повинно бути аргументом на користь того, що комаха буде також стійкою до другого токсину (який конкурентно зв'язується з тим же рецептором). Однак якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, це може слугувати вказівкою на те, що комаха не повинна бути 60 стійкою одночасно до цих двох токсинів.
Стуїба є придатним для контролю багатьох видів лускокрилих шкідників, включаючи європейського кукурудзяного метелика (ЕСВ; Озігіпіа пибріїаій5 (Нибпег)) і трав'яну совку (ЕАМУ; зродоріега Ігидірегаа), і активний проти вогнівки цукрової тростини (ЗСВ; Оіаїгаєа засспагаїїв).
Білок СтуїБа при продукції в зернових рослинах з індукованою подією ТС1507 є відповідальним за лідируючу у галузі ознаку стійкості для контролю ЕАМУ. Сту!Ра додатково використовують у продуктах НЕКСИ ЕХО, БМАКТЗТАХ "М ії ММІОЕЗТКІКЕ "М,
Можливість проведення досліджень (конкурентного або гомологічного) зв'язування з рецептором з використанням білка Стуїбта обмежена, тому що найбільш загальноприйнятий метод, доступний для мічення білків у методах визначення зв'язування з рецептором, веде до інактивації інсектицидної активності білка СтуїРа.
СтутАБ ї СтуїРа являють собою інсектицидні білки, у даний час використовувані (окремо) у трансгенній кукурудзі для захисту рослин від різних комах-шкідників. Головним шкідником кукурудзи, проти якого ці білки надають захист, є європейський кукурудзяний метелик (ЕСВ).
Патентна заявка США Мо 2008/0311096 частково стосується використання СтутАб для контролювання стійкої до СтуїЕ популяції ЕСВ.
У даній заявці описуються штами Адгорасіегішт шптеїасієп5, які модифіковані для підвищення частоти трансформації рослин. При використанні цих штамів надаються нові системи трансформації рослин для введення в рослинні клітини чужорідних генів, здатних експресуватися в рослинах. Крім того, ці штами забезпечують додатковими удосконаленнями, які дозволяють підвищити ефективність трансформації і надають істотні переваги в подоланні робочих недоліків при трансформації рослин чужорідними генами.
Короткий виклад суті винаходу
У даному документі описуються штами Аадгобасіегішт, які несуть гени, які підсилюють трансформацію, у плазміді, здатній реплікуватися незалежно від хромосоми Аадгобасіегіит, плазміді Ті, і бінарні вектори трансформації рослин, а також способи їхнього застосування.
Штами Адгорасіегішт є дефектними відносно функцій рекомбінації ДНК; що веде до нестабільності або реорганізації бінарних векторів трансформації рослин, і вони несуть гени, які підсилюють трансформацію, у плазміді, здатній реплікуватися незалежно від хромосоми
Адгобасіегіцт, плазміді Ті, і бінарні вектори трансформації рослин. Описуються також додаткові
Зо штами Адгобасіегічт, які несуть гени, які підсилюють трансформацію, інтегровані в хромосому
Адгорасіегіцшт, у локусі, який не перешкоджає або яким-небудь іншим чином не порушує нормальний ріст і здатність клітин Адгобасієегішт до трансформації рослин, і їхнє застосування.
В одному варіанті здійснення описаних у даному документі способів рослина трансформується в результаті контактування клітини рослини зі штамом Адгобасіегійт, який має щонайменше одну допоміжну плазміду рті, яка включає 14,8 Крпі! фрагмент рзВІ, і плазміду рті, яка має щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК, причому ділянка Т-ДНК включає щонайменше праву границю Т-ДНК і екзогенну ДНК, яка прилягає до границі, де плазміди мають різні точки початку реплікації відносно один одного.
У додатковому варіанті здійснення описаних у даному документі способів рослина трансформується в результаті контактування клітини рослини з бактерією роду Адгобасіегішт, яка має 14,8 Крпії фрагмент МігВСООС і плазміду рті, яка має щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК, де 14,8 Крпії фрагмент Міг ВСОС інтегрований у нейтральний сайт інтеграції хромосоми бактерії.
У додатковому варіанті здійснення описаних у даному документі способів штам
Адгорасієегішт включає щонайменше одну допоміжну плазміду рті, яка включає 14,8 Крпії фрагмент реВІ1, і плазміду рТі, яка має щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК, де плазміди мають різні точки початку реплікації відносно один одного.
У додатковому варіанті здійснення штам Адгобасіегішт з посилюючими трансформацію властивостями включає 14,8 Крпії фрагмент МігВСОО, виділений з раеВІ, і плазміду рті, яка має щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК.
В іншому варіанті здійснення геномний локус піА Аадгобасіегішт ішптегїасіеп5 включає полінуклеотидну послідовність, яка інтегрована в геномний локус піїА.
У додатковому варіанті здійснення штам І 84404 Адгобасіегічт включає 14,8 Крпі! фрагмент мігтВСро розв у допоміжній плазміді рті і плазміду рті, яка має щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК і яка має екзогенну ДНК, яка прилягає щонайменше до однієї границі Т-ДНК
Адгорасієгійт, де плазміди мають різні точки початку реплікації відносно один одного.
У додатковому варіанті здійснення штам І 84404 Адгорасіегішт включає щонайменше один ген міг з 14,8 Крпії! фрагмента МігВСОО, виділеного з реВ1, інтегрований у нейтральний сайт інтеграції хромосоми Адгобасіегічт.
У додаткових варіантах здійснення пропонуються рослини, які створені відповідно до описаних в даному документі способів трансформації.
У ще одному варіанті здійснення фертильна трансгенна зернова рослина або її нащадок експресує інсектицидні кількості білка Сгу! Са, інсектицидного білка СтуїЕ, інсектицидного білка
СтутТАБІ і толерантні до гербіцидів кількості білка ААО-1, де білки СтуїСа, Стгу1Е, СтутлАБЬІ ії ААО1 спільно експресуються з одного локусу рекомбінантної ДНК, стабільно включеної в геном рослини.
Опис фігур
Фіг. 1. Показана схема клонування для конструкції плазміди ррАВеО292.
Фіг. 2. Показана карта плазміди рООМуУЗ719.
Фіг. 3. Показана схема клонування для конструкції плазміди рОАВОб98.
Фіг. 4. Показані карти бінарних векторних плазмід РОАВ101513 і РОАВІ101514.
Фіг. 5. Показана карта бінарної векторної плазміди рОАВ101556.
Докладний опис винаходу
Штами Адгобрасіегішт відрізняються від інших за своєю здатністю трансформувати рослинні клітини. Онкогенні штами Адгобасіегішт дикого типу відомі своєю здатністю індукувати галли (пухлинний надлишковий ріст) у багатьох рослин-хазяїнів, особливо у видів дводольних. Ця трансформація нормально зростаючих рослинних клітин у пухлинні клітини з відсутністю їхньої саморегуляції виникає як результат перенесення спеціальних послідовностей ДНК (Т-ДНК), які кодують гени, експресовані в рослинах, які кодують рослинні гормони, з індукуючої пухлину (Ті) плазміди в рослинні клітини, де вони стабільно інтегруються в хромосоми рослини. Плазміда Ті зі штаму Во542 (тобто ртіво542) примітна тим, що при розміщенні в хромосомних середовищах
Адгорасіегішт вона стимулює індукцію особливо великих інтенсивно зростаючих пухлин у деяких рослин (Ноой еї аї., (1986) 9). Васіегіої. 168:1291-1301). Гени, відповідальні за цей фенотип "супервірулентності", знаходяться в ртіво542 поза ділянками Т-ДНК. При подальшому дослідженні було виявлено, що плазміда, яка містить "15,8" тисяч пар основ (т.п.о.) фрагмента
Крпії, який походить з ртівВо542, яка містила повні оперони міг, міг(В і мс, стимулювала посилене утворення пухлини штамом Аг81 у порівнянні зі штамами, які не мають плазміду (іп еї аї., (1987) 9. ВасіепйоІЇ. 169:4417-4425). Ген міг плазміди ртТіВо542, як вважається, є
Зо відповідальним за супервірулентний фенотип штаму Адгобасіегішт Аг281. міг з ртівВо542 викликає підвищення експресії мі"В у 1,7 разів у порівнянні з міг: з ртіАЄ через розходження між двома генами в промоторних ділянках, кодуючих послідовностях і 3'-нетрансльованих ділянках (Спеп вї аї., (1991) Моїес. Сеп. Сепеї. 230:302-309). Таким чином, ген міг з ртіво542 може бути вигідно використаний для стимуляції більш високої ефективності перенесення Т-ДНК, і в результаті цього, більш високої частоти трансформації рослин, особливо, коли він присутній у великому фрагменті Крпії! плазміди рТіВо542, яка несе також оперони мігВ і мс плазміди ргіВо542.
Повна, анотована послідовність ртіво542 була відправлена в СЕМВАМК з номером надходження 00058764 12 травня 2005 р. Аналіз карти рестрикції фрагмента Крпі ї анотації генів показують, що повний оперон мігВ (який включає гени мігВ1, мігВ2, мігїв3, міг84, мігв5, мігвб, міг87, мітВ8, мігВУ, мігВ10 і мігВ11), ген міг, оперон мігС (який включає гени мігС1 і мігС2) і частина оперона мігО, яка включає ген мігО1, можливо виділити з фрагмента Крпі, який включає 14815 пар основ (п.0о.). Передбачається, що розмір "15,8 т.п.о." фрагмента Крпї, на який посилаються в статті п еї аЇ. (вище), був визначений за рухливістю фрагмента в агарозному гелі, і що реальний розмір зазначеного фрагмента складає в дійсності 14,8 т.п.о. Фахівець в галузі молекулярної біології повинен розуміти, що визначення розміру таких великих фрагментів ДНК за допомогою визначення рухливості при електрофорезі в агарозному гелі може відрізнятися від реального розміру фрагмента, визначеного аналізом послідовності ДНК на 1 т.п.о. або більше. Для полегшення опису цей фрагмент, який походить з рТтіво542, у даному документі буде позначатися як фрагмент 14,8 Крпі МігВСОО.
Варіант здійснення способів, описаних у даному документі, включає використання для трансформації рослини посилюючих трансформацію властивостей, кодованих у фрагменті 14,8
Крп! мМі?ВСОС, виділеному з р5ВІ, у штамах Адгорасіегішт, які несуть щонайменше одну обеззброєну допоміжну плазміду Ті, де фрагмент 14,8 Крпі МігВСОС несеться плазмідою, яка має точку початку реплікації групи несумісності, відмінної від ІпсР. Додатковий варіант здійснення включає штам Адгобасіегічт, як описано, для використання в цьому способі. Ділянку
Т-ДНК, призначену для введення в рослину з використанням штаму Адгорасіегішт, може переносити плазміда, яка має ділянку Т-ДНК, яка примикає щонайменше до однієї границі Т-
ДНК Аадгобасіегішт, причому плазміда має точку початку реплікації групи несумісності ІпсР або бо групи несумісності, яка сумісна з групою несумісності фрагмента 14,8 Крпі МігВСОС, який переноситься плазмідою, яка має точку початку реплікації групи несумісності, відмінної від ІпсР.
Ділянка Т-ДНК цієї плазміди може прилягати до правої і лівої границь Т-ДНК Адгобасіегійт.
Плазміди приписують до груп несумісності (генотипове позначення: іпс; позначення групи
Іпс) на основі послідовностей, які містяться в плазміді. Детермінанта іпс звичайно служить як перешкода для співіснування в того самого хазяїна інших плазмід тієї ж або родинної групи несумісності і допомагає підтримувати визначену кількість копій плазміди в клітині. Див., наприклад, ЕРегпападе?-І оре, єї аї., (2006) РЕМ5 МісгобіоІ. Вем. 30:942-66; і АдатсгукК апа
Уадига-Вига?у (2003) Асіа Віоспіт. Рої. 50:425-53. Дві плазміди несумісні, якщо одна з них у присутності іншої менш стабільна, ніж сама по собі. Коли дві плазміди однієї і тієї ж групи несумісності знаходяться в одній і тій же клітині, може відбуватися конкуренція за клітинні ресурси. Та плазміда, яка здатна реплікуватися швидше або надає яку-небудь іншу перевагу, буде представлена серед копій у непропорційному ступені, що допускається системою несумісності. Зненацька виявилося, що плазміди можуть бути також несумісними, коли обидві вони мають ті самі функції свого розподілу в дочірніх клітинах.
Плазміди звичайно потрапляють тільки в одну з багатьох існуючих груп несумісності.
Нараховується більш 30 відомих груп несумісності. Плазміди, які належать до групи несумісності ІпсР, всебічно досліджені, і сконструйована велика кількість плазмід, які походять з цієї групи ІпсР (Зсптіднацизег еї аї., (1988) Віотесппоїоду 10:287-332). Приклади плазмід, які містять групу несумісності ІпсР, включають: РМРООКК, рКкК2013, рКК290, рЕКа404 і рККаА15. Ці плазміди можуть підтримуватися в численних бактеріальних штамах, включаючи Е. соїї і
Адгобасієегішт іштегасіеп5. Приклади інших груп несумісності включають, але не обмежуються цим: ІпсМ, ІпсУМ, ТП /М, Іпст, Іпси, ІпсУМ, ІпсУ, ІпсВ/О, ІперіЇ, Тасії, ІпсК, ІпсСотоя, Іпсрї, пері,
ІпсЕНІ, ІнсНІЇ, ТисНІг, ІнсХ, ІпсА/С, ІпсО, ІйсгїМ, ІпсЕМ/ЕО, ІпеЕМІі, ІнснНІ 3, ІпсНІЇ, Іпсіг, Іпсі, Іпсу,
ІпсМ, ІпсО тощо, включаючи їхні варіанти, наприклад, які мають істотну подібність послідовності або функціональне відношення. У таблиці 1 перераховано декілька загальновідомих груп несумісності і представлені приклади плазмід, які представляють ці групи несумісності (це перерахування груп несумісності і плазмід пропонується тільки як приклад і не призначене для обмеження груп несумісності і плазмід, використовуваних у штамах Адгобасіегішт і описаних у даному документі способах).
Зо Інший варіант здійснення описаних у даному документі способів включає використання посилюючих трансформацію властивостей, кодованих фрагментом 14,8 Крпі мМміг«ВСОро, виділеним з роВ!, у штамах Адгорасіегішт, які мають недостатність функції КесА і несуть щонайменше одну обеззброєну допоміжну плазміду рті, де фрагмент 14,8 Крпі мі?«ВСЮОС несеться плазмідою, яка має точку початку реплікації групи несумісності, відмінної від ІпсР.
Додатковий варіант здійснення включає штам Адгорасіегішт, як описано в даному документі, для використання в цьому способі. Ділянка Т-ДНК, призначена для введення в рослину з використанням цього штаму Адгобасіегішт, може переноситися плазмідою, яка має ділянку Т-
ДНК, яка примикає щонайменше до однієї границі Т-ДНК Адгобасіегічт, причому плазміда має точку початку реплікації групи несумісності ІпсР або групи несумісності, яка сумісна з групою несумісності фрагмента 14,8 Крп!і мігВСОС, який несеться плазмідою, яка має точку початку реплікації групи несумісності, відмінної від ІпоР.
Ще один варіант здійснення описаних у даному документі способів включає використання посилюючих трансформацію властивостей, кодованих фрагментом 14,8 Крпі мМміг«ВСОро, виділеним з роВ1, і вставленим щонайменше в одну обеззброєну допоміжну плазміду рті, де фрагмент 14,8 Крпі МгВСОС інтегрований у нейтральний сайт інтеграції, локалізований на хромосомі штаму Адгобасіегішт, відмінного від штаму С58. Додатковий варіант здійснення включає штам Адгобрасіегішт, як описано, для використання в цьому методі. Ділянка Т-ДНК, призначена для введення в рослину з використанням цього штаму Адгорасіегічт, додатково включає плазміду, яка має ділянку Т-ДНК, яка примикає щонайменше до однієї границі Т-ДНК
Адгорасієетит.
Хоча відомі супербінарні системи, наприклад, див. патенти УМО 94/00977А1, УМО 95/06722А1 і МО 95/16031АЇ, і вони додатково описані Копагчгі єї аї., (вище) і Котогі еї аї., (вище), ці системи мають ряд недоліків. Робочий недолік супербінарної системи, який долається штамами
Адгобрасіегішт і описаними в даному документі способами, полягає в необхідності створення коінтегративної плазміди з рОВІ1 і р5В11 (і їхніми похідними), як засіб, за допомогою якого змінена Т-ДНК, переноситься на похідних роВІ11, стабільно підтримується в Адгобасіегішт. Ця подія коіїнтеграції створює пару великих (приблизно 2,3 т.п.о.;; прямо повторюваних послідовностей через рекомбінацію між гомологічними ділянками рОВІ! і ро5В11. Як добре відомо фахівцям в галузі молекулярної біології, великі повторювані послідовності, такі як ці, є бо кращими мішенями для внутрішньомолекулярної рекомбінації, що в кінцевому підсумку приводить до делецій ДНК і інших перебудов, особливо, коли повтори є частиною структури плазміди. У супербінарній системі Адгобасієгішт такі перебудови можуть привести до часткової перебудови або повної втрати ділянки Т-ДНК, уведеної похідними рОВ11, приводячи в кінцевому підсумку до незначного перенесення або до відсутності перенесення бажаних чужорідних генів у клітини рослини-хазяїна.
Додатковий недолік описаної вище супербінарної системи, який також долається штамами
Адгорасіегішт і описаними в даному документі способами, полягає в тому, що створення коінтегративної плазміди з похідних реВІ1 і роВ11 генерує велику плазміду (мінімум більше 43 т.п.о.), яка має дві різні точки початку реплікації (огі) СоІЕї1-типу (група несумісності рРМВ1/СОЕ1), а також третій огі, який походить від плазміди ККЗ (група несумісності ІпсР). Хоча в нормальних умовах СОЇЕ1 огі є нефункціонуючим у Адгобасіегічт, відомі геномні мутації, які дозволяють стабільно підтримувати плазміди, які мають СОЇЕ1 огі, у Адгорасієгчт (КивзіуаКкома еї а!., (1999) Виввіап 9. Сепеї. 35:327-331). У клітинах, які мають такі мутації, плазміда, така як коїнтегративна плазміда похідних роВ1:р5ВіЇ, яка має З функціонуючих точки початку реплікації, як можна чекати, буде вкрай нестабільною. Таким чином, супербінарна система має дефекти, на які вигідно спрямовані елементи штамів Адгобасієгішт і способи трансформації рослин, описані в даному документі.
Структура ДНК чужорідного гена або генів, призначених для введення й експресії в трансгенних рослинних клітинах за допомогою трансформації, опосередкованої Адгобрасіегійт, може мати сильний вплив на стабільність бінарної векторної плазміди або човникової векторної плазміди, які несуть ці гени в клітинах Е5сПегіспіа сої ії Адгобасіегішт. Нестабільність частково виявляється, коли чужорідні гени включають компоненти генів, які застосовуються множину разів у генних конструктах. Наприклад, не є незвичайним, що конкретний промотор, здатний до експресії в рослинах, може бути використаний для стимуляції експресії ділянок різних білків, які кодують, у трансгенній рослині. Інші компоненти гена, такі як 3'-нетрансльовані ділянки (З'ОЮТК) (тобто послідовності термінації транскрипції і послідовності, які визначають додавання поліаденілування) і навіть дуже подібні кодуючі ділянки білків можуть дуплікуватися або бути присутнім у множинних копіях у межах однієї ділянки Т-ДНК. Як указувалося вище, ці елементи повторюваних послідовностей, які можуть існувати або в інвертованій, або в прямій орієнтації, є
Зо мішенями для внутрішньомолекулярних рекомбінацій, що може приводити до делецій ДНК і інших перебудов, особливо коли повтори є частиною структури плазміди.
Розроблена множина спеціалізованих штамів ЕЕ. соїЇї, які слугують як хазяїни для молекулярного клонування, що допомагає подолати такі труднощі як нестабільність (наприклад, штами ЗТВІ27мМм, 5ТВІ Зм ії 5ТВІ4 М, пропоновані ІММІТЕОСЕМ; Сагіб5рад, СА). Загальною характеристикою всіх таких клонуючих штамів Е. соїї є присутність геномної мутації в гені гесА.
Білок КесА являє собою багатофункціональний фермент, який відіграє роль у гомологічній рекомбінації, репарації ДНК і індукції бактеріальної відповіді 505. У процесі гомологічної рекомбінації білок функціонує в якості ДНК-залежної АТФази, стимулюючи кон'югацію хромосом, утворення гетеродуплексу й обмін ланцюгами між гомологічними ДНК. Таким чином, клітина з недостатністю функції КесА більш схильна до збереження стійкості гомологічних послідовностей ДНК без перебудови або делеції.
Штами Адгобрасієгішт з недостатністю КесА розроблені з метою сприяння в рішенні проблем нестабільності, які спостерігаються при клонуванні великих фрагментів ДНК, які містять повторювані послідовності (КіІарм/іс) еї аї., (1979) Моїес. Сеп. Сепеї. 173:171-175; Ратапа еї аї., (1989) У. Васіетпіої. 171:5314-5321; І а?о еї аї., (1991) Віо/Тесппоіоду 9:963-967). Ці штами, як доведено, придатні для сприяння стабілізації конструктів високої молекулярної маси, які трансформують, в деяких випадках (Егагу апа Натійоп, (2001) Ттапздепіс Нев. 10:121-132), але не у всіх випадках (5опо еї аї., (2003) Тпеог. Аррі. Сепеї.107:958-964). Таким чином, можуть бути вигідно використані хромосомні середовища Адгобасіегішт, які є дефектними відносно гесА у розроблювальних штамах, які високоефективні в підтримці плазміди і здатності трансформувати рослину. У доповнення до використання хромосомних середовищ
Адгобасіегішт з недостатністю гесА у розроблювальних штамах для застосування в способах, описаних у даному документі, функціонування гесА може бути відключене в існуючого або отриманого штаму з метою зробити штам, придатним для способів, описаних у даному документі. Див., наприклад, Раггапа еї аЇ. (вище). Наприклад, може бути створений штам з функціонуючим КесА і будь-якими бажаними хромосомними добавками, наприклад, додаванням генів міг, потім функція КесА може бути блокована.
Можуть бути використані вектори ВІВАС, сконструйовані для можливості ефективної трансформації великими фрагментами ДНК рослинних і нерослинних клітин-хазяїнів. Див., 60 наприклад, патент США Мо 5733744, патент США Мо 5977439 і патентну заявку США Мо
2002/0123100А1. Одним штамом Адгорасіегішт, який може бути використаний з векторами
ВІВАС, є штам ШІА143 з недостатністю КесА, розроблений Раїгтапа еї аї., (вище). При вдосконаленнях системи ВІВАС для підвищення здатності створених штамів Адгобасієегійт до трансформації рослин використані підгрупи генів, розташованих у фрагменті 14,8 Крпі МігВСОО, у поєднанні з іншими генами міг. Зокрема, був використаний ген міг із фрагмента 14,8 Крпі мігтворо, один або в поєднанні з генами мігЕ1 і мігЕ2 з ртіАб у штамі ШІА143 з недостатністю
КесА. Див., наприклад, Натійоп еї а!., (1996) Ргос. Маї!. Асай. 5сі. 93:9975-9979; Натіюп, (1997)
Сепе 200:107-116; Егагу апа Натіноп (вище).
Крім того вектор, який підходить, використовуваний для трансформації рослинної клітини з застосуванням способів, описаних у даному документі, може містити ген маркера селекції, який кодує білок, який надає трансформованим рослинним клітинам стійкості до антибіотика або гербіциду. Індивідуально застосовуваний ген маркера селекції може дозволити відповідно відібрати трансформовані клітини, у той час як ріст клітин, які не містять вставленої ДНК, може бути подавлений за допомогою обраної сполуки. Вибір конкретного(-их) застосовуваного(-их) генас-ів) маркерів селекції може залежати від дизайну експерименту або переваги, але може бути використаний кожен з наступних маркерів селекції, також як будь-який інший ген, не перерахований у даному описі, який може функціонувати як маркер селекції. Приклади маркерів селекції включають, але не обмежуються цим, гени, які забезпечують стійкість або толерантність до антибіотиків, таких як канаміцин, с418, гігроміцин, блеоміцин і метотрексат, або до гербіцидів, таких як фосфінотрицин (біалафос), гліфосат, імідазолінони, похідні сульфонілсечовини, триазолопіримідини, хлоросульфурон, бромоксиніл і ОАГАРОМ.
У доповнення до маркера селекції може бути також використаний репортерний ген. У деяких випадках репортерний ген може бути використаний без маркера селекції. Репортерні гени являють собою гени, які звичайно не надають переваг у рості організму або тканини реципієнта.
Репортерні гени звичайно кодують білок, який надає фенотипічну зміну або ферментативну властивість. Придатні репортерні гени включають, але не обмежуються цим, гени, які кодують глюкуронідазу (305), люциферазу світлячка або флуоресцентні білки, такі як зелений флуоресцентний білок і жовтий флуоресцентний білок.
У доповнення до численних способів трансформації рослин, тип тканини, яка вводиться в контакт із чужорідними генами, також може варіюватися. Така тканина може включати, але не обмежуватися цим, ембріональну тканину, тканину калуса типів І і ЇЇ, гіпокотиль і меристему.
Майже всі рослинні тканини можуть бути трансформовані в процесі дедиференціювання з використанням придатних методів у межах даного рівня техніки. Фахівець в галузі трансформації рослин повинен розуміти, що для отримання трансформованих рослин доступні численні методи і що вони можуть бути модифіковані і спеціалізовані для пристосування до біологічних розходжень між різними видами рослин-хазяїнів.
Незалежно від конкретного застосовуваного методу трансформації, чужорідний ген може бути включений у вектор для перенесення генів, адаптований для експресії чужорідного гена в рослинній клітині в результаті включення у вектор рослинного промотору. У доповнення до рослинних промоторів для експресії чужорідних генів у рослинних клітинах можуть бути ефективно використані промотори з різноманітних джерел. Наприклад, можуть бути використані промотори бактеріального походження, такі як промотор октопінсинтази, промотор нопалінсинтази, промотор манопінсинтази; промотори вірусного походження, такі як промотори 355 і 195 вірусу мозаїки цвітної капусти (Самм), промотор з паличкоподібного вірусу цукрової тростини тощо. Промотори, які походять від рослин, включають, але не обмежуються цим, промотор малої субодиниці (551) рибулозо-1,6-біросфат (КОВР) карбоксилази, промотор бета- конгліциніну, промотор фазеоліну, промотор АОН (алкогольдегідрогенази), промотори білків теплового шоку, промотор АОЕ (фактора деполімеризації актину) і тканиноспецифічні промотори. Промотори можуть також містити визначені елементи енхансерних послідовностей, які можуть поліпшувати ефективність транскрипції. Типові енхансери включають, але не обмежуються цим, інтрон 1 алкогольдегідрогенази 1 (АОНІ) і інтрон 6 АЮОНІ. Можуть бути використані конститутивні промотори. Конститутивні промотори керують постійною експресією генів майже у всіх типах клітин і майже в усі періоди часу (наприклад, промотор актину, промотор убіквітину, промотор СамМм 355). Тканиноспецифічні промотори відповідають за експресію генів у конкретних типах клітин або тканин, таких як листя або насіння. Приклади інших промоторів, які можуть бути використані, включають промотори, які активні протягом визначеної стадії розвитку рослини, а також активні в конкретних тканинах і органах рослин.
Приклади таких промоторів включають, але не обмежуються цим, промотори, які специфічні для коренів, промотори, специфічні для пилка, специфічні для ембріональної стадії, специфічні для кукурудзяних рилець, специфічні для бавовняного волокна, специфічні для ендосперму насіння і специфічні для флоеми.
За певних умов може бути бажане використання індуцибельного промотору. Індуцибельний промотор відповідає за експресію генів у відповідь на специфічний сигнал, такий як фізичний стимул (наприклад, промотори генів білків теплового шоку); світло (наприклад, промотор рибулоза-біс-фосфат-1,5-карбоксилази): гормон (наприклад, глюкокортикоїд); антибіотик (наприклад, тетрациклін); метаболіти і стрес (наприклад, посуху). Можуть бути також використані інші бажані елементи транскрипції і трансляції, які функціонують у рослинах, такі як, наприклад, 5'-нсетрансльовані лідируючі послідовності, послідовності термінації транскрипції
РНК ії послідовності додавання сигналу поліаденілування. Може бути використаний будь-який придатний, специфічний для рослин трансферний вектор для гена, відомий у даній галузі техніки.
Трансгенні зернові культури, які містять ознаки стійкості до комах (ІК), переважають у зернових і бавовняних рослинах по всій північній Америці, і використання цих ознак розширюється в усьому світі. Комерційні трансгенні зернові культури, які поєднують ознаки ІК і стійкості до гербіцидів (НТ), створені багатьма посівними компаніями. Вони включають поєднання ознак ІР, які додаються інсектицидними білками Ві (Васіїи5 ІПигіпдіепвів), і ознак НТ, таких як толерантність до інгібіторів ацетолактатсинтази (А! 5), таких як похідні сульфонілсечовини, імідазолінони, триазолопіримідин, сульфонаніліди тощо, інгібіторів глутамінсинтетази (55), таких як біалафос, глуфосинат тощо, інгібіторів /4- гідроксифенілпіруватдіоксигенази (НРРО), таких як мезотрион, ізоксафлутол тощо, інгібіторів 5- енолпірувілшикімат-З-фосфатсинтази (ЕРБР5), таких як гліфосат тощо, і інгібіторів ацетил- коензим А-карбоксилази (АСсСази), таких як галоксифоп, хізалофоп, диклофоп тощо. Відомі інші приклади, у яких пропоновані у вигляді трансгенних білки забезпечують толерантність рослини до хімічних класів гербіцидів, таких як гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі піридилоксіацетатів (див. патент УМО 2007/053482А2) або гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі арилоксифеноксипропіонатів (див. патент МО 2005107437А2,АЗ). Здатність контролювати множинні проблеми відносно шкідників за допомогою ознак ІК є цінною концепцією комерційного продукту, і перевага цієї концепції продукту збільшується, якщо ознаки
Зо контролю над комахами й ознаки контролю над бур'янами поєднуються в тій самій рослині.
Більш того, підвищена цінність може бути досягнута шляхом поєднань в одній рослині ознак І, які додаються інсектицидним білком Ві, з однією або більше додатковими ознаками НТ, такими як зазначені вище ознаки, плюс одна або більше додаткових ознак, які вводяться (наприклад, інша стійкість до комах, яка додається іншими інсектицидними білками або які походять від Ві, або стійкість до комах, яка додається такими механізмами як ЕКМАї тощо, стійкість до захворювань, толерантність до стресу, поліпшене використання азоту тощо), або ознак виходу (наприклад, високий вміст олій, склад корисних для здоров'я олій, поліпшення поживних властивостей тощо). Такі поєднання можуть бути отримані або шляхом звичайної селекції (наприклад, за допомогою селекційного набору), або разом з новою подією трансформації, яка включає одночасну індукцію множинних генів (наприклад, за допомогою молекулярного набору).
Переваги включають здатність керувати комахами-шкідниками і поліпшений контроль над бур'янами в зернових культур, що надає вторинні переваги виробнику і/або споживачу. Таким чином, штами Адгобасієегішт і способи, описані в даному документі, можуть бути використані для надання трансформованих рослин зі поєднаннями ознак, які включають повний агрономічний пакет, який поєднає поліпшену якість зернових культур із здатністю гнучкого й ефективного за ціною контролю над кількістю виходу агрономічної продукції.
Гени міг різних плазмід ртТі були досліджені для розуміння їхньої здатності підвищувати частоту трансформації рослин. Гі еї аї., (1992, Ріапі Моїес. Віо!. 20:1071-1087) визначили, що додаткові копії генів міг із множинних джерел (тобто з різних плазмід рті, але включаючи ртіВо542) підвищували транзиторну трансформацію деяких рослин, і величина ефекту залежала від особливості допоміжної плазміди рті, з якою був з'єднаний конкретний ген міго.
Мутант гена міг (приблизно з ртіАб), названий мігоМ540 (мутація з заміною амінокислоти
А5зп54 на Авр), конститутивно експресувався в Адгорасіегішт (індукція генів мібз дикого типу вимагає кислого рН, високої концентрації моносахаридів і присутності фенольних індукторів, таких як ацетосирінгон). Див. Раоиг еї аї., (1992) 9. Васіегіої. 174:4169-4174. МігОМ540 плазміди ртіАб був ефективний відносно трансформації маїсу, у той час як множинні копії батьківського міг дикого типу були неефективні. Див. Напзеп еї аї., (1994) 9. ВасіегіоїЇ. 174:4169-4174.
Описана "потрійна" система (тобто система з трьох плазмід), у якій копія конститутивного мутанта гена міг М540 з ртТі15955 одночасно знаходилася в плазміді, яка походить від РВВК1, у бо штамі Адгорасіегішт шптегасіеєп5, який містив обеззброєну допоміжну рті плазміду рАЇ 4404, і бінарний вектор, який несе гени для трансформації рослин. Див. мап дег Рії5 еї аї., (2000) Ріапі
Моїес. Віої. 43:495-502. Конститутивно експресуючий ген міг3М540О, як виявлено, значно підвищував ефективність як транзиторної, так і стабільної трансформації в деяких видів рослин.
Плазміди, які містять ділянку контролю реплікції РВЕКІ, не можуть бути класифіковані як приналежні до будь-якої відомої групи несумісності і, отже, можуть співіснувати із широким спектром інших плазмід в одного хазяїна. Більш того, у тютюну, бавовни і рису була спеціально протестована здатність впливати на ефективність трансформації рослин у різних поєднань генів міг; мутантного гена міг М540, який походить з ртіАбЄ, гена міг з ртіВо542, генів МігЕ1/Е2 з ртіАб, і поєднання останніх двох наборів генів. Див. Рак еї аї., (2000) Тпеог. Аррі. Сепеї. 101:1015-1020. Підвищення ефективності трансформації спостерігали в деяких видів рослин і при додаткових копіях генів міг.
У європейській патентній заявці Ме 2042602А1 і патентній заявці США Ме 2010/0132068А1 описуються космідні бінарні вектори і "бустерні" плазміди, які у випадку присутності в клітині
Адгорасієегішт, яка несе допоміжну плазміду рті, складають додаткові приклади потрійних плазмідних систем. Бустерні плазміди, як розкривається в цих документах, мають точку початку реплікації групи несумісності ІпсУМ і включають плазміду РМОМУ, яка має ген мігоМ540, і плазміду руУсууа2, яка є похідною від рРУСМуУ, яка має модифікації для полегшення клонування і селекції.
Функції, кодовані генами хромосом у Адгобасіегішт, класично визначаються за допомогою двох генетичних підходів. Перший, або прямий, генетичний метод включає отримання молекулярного клону гена, який піддається дослідженню, з наступним вміщенням клонованого гена в генетичне середовище, у якому може бути оцінений фенотип "посилення функції".
Другий, або "метод зворотної генетики", вимагає порушення структури гена шляхом вставки або делеції послідовностей у гені або довкола нього в хромосомі з наступним визначенням того, які білки або фенотипи вилучені в результаті втрати функції гена. Цей підхід використовували для конструювання раніше описаного мутанта штаму С58 з недостатністю КесА. Див. Рагтапа еї аї., вище. Фахівці в галузі генетичного конструювання в клітинах Адгобасіегіит повинні розуміти, що для створення можливості здійснення таких експериментів по порушенню структури генів описані різноманітні вектори і численні методи. Як доведено, метод є особливо придатним при використанні для ідентифікації генів, які не втягнені в життєздатність, ріст і здатність до
Зо трансформації мутантного штаму. Один такий генетичний локус у штамі С58 Адгорасіегійт являє собою локус раї/рісА. Див. І ее еї аї., (2001) Ріапі Місгобе Іпієгасі. 14:57 7-579; і Ї ее (2006)
Іп: Меїйод35 іп МоїІесціаг Віоіоду (К. УМапод, еа.) Мо 343: Адгобасіегічшт Ргоїосої5 (214 Еайіоп, Мої. 1)
НОМАМА РАЕБ55 Іпс., Тоїожа, МУ. рр.55-66. Клітини, у яких ген міг02 інтегрований у цей хромосомний локус за допомогою гомологічної рекомбінації, як виявлено, мають фенотип трансформованої рослини, ідентичний фенотипу, який виникає в штамів А. іШшптегїасіеп5, які несуть ген мігр2, локалізований на плазміді, яка реплікується. Див. ГІ ее еї аї., вище. Крім того, ділянка Т-ДНК, інтегрована в локус раі/рісА штаму С58, може бути функціонально доставлена в рослинну клітину (ОШтаппз5 еї аї., 2010. Ріапі Рпузіої. 152:1 158-1166). Таким чином, у штамі С58 локус роді/рісА може слугувати в якості "нейтрального сайта інтеграції" для введення генів у хромосому С58. При застосуванні в даному описі "нейтральний сайт інтеграції" позначає ген або хромосомний локус, у природі присутній у хромосомі клітини Адгобасієгішт, чия нормальна функція не потрібна для росту клітини або для здатності клітини здійснювати всі її функції, необхідні для трансформації рослини. При порушенні структури шляхом інтеграції послідовності
ДНК, у нормі не присутньої в гені, клітина, яка несе ген з порушеним нейтральним сайтом інтеграції, може продуктивно здійснювати трансформацію рослини. Як приклад НоеКета еї аї. (1984, ЕМВО 4). 3:2485-2490) продемонстрували, що функціональна Т-ділянка, інтегрована в неохарактеризований локус у хромосомі С58 за допомогою транспозиції Тп3, продуктивно переносилася в рослинні клітини.
Штами Адгобасіегішт, обговорювані в даному описі, можуть бути вигідно використані для введення одного або більше генів у рослину, наприклад, для додавання рослині індивідуальних або множинних інсектицидних або гербіцидних властивостей. Наприклад, штами Адгобасіегішт можуть бути використані для введення одного або більше, двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше генів у рослину. Шляхом використання штамів Адгобасіегішт, описаних у даному документі, полінуклеотид, який містить послідовності обраного гена, вставляють в одне місце розташування в рослинну клітину при трансформації рослинної клітини. Відносно розміру ділянок Т-ДНК, використовуваних для вставки генів, ділянки Т-ДНК можуть дорівнювати або складати більше 15000 пар нуклеотидних основ, дорівнювати або складати більше 20000 пар нуклеотидних основ, дорівнювати або складати більше 25000 пар нуклеотидних основ, дорівнювати або складати більше 26000 пар 60 нуклеотидних основ, дорівнювати або складати більше 27000 пар нуклеотидних основ,
дорівнювати або складати більше 28000 пар нуклеотидних основ, дорівнювати або складати більше 29000 пар нуклеотидних основ або дорівнювати або складати більше 30000 пар нуклеотидних основ. При використанні штамів Адгобасіегішт, описаних у даному документі, обрані послідовності генів можуть мати гомологію послідовностей, яка дорівнює або становить 6096, яка дорівнює або становить 6595, яка дорівнює або становить 6795, яка дорівнює або становить 69,595, яка дорівнює або становить 7095, яка дорівнює або становить 7595, яка дорівнює або становить 8095, і зберігати ідентичність їхній транскрибованих послідовностей.
Типи генів, які можуть бути введені, можуть кодувати інсектицидні білки, гербіцидні білки або суміш інсектицидних білків і гербіцидних білків. Конкретні приклади генів, які можуть бути введені, включають гени, які кодують інсектицидний білок Сгу1!Са, інсектицидний білок СгуїРЕ, інсектицидний білок СтутАбБ1, і гербіцидний білок ААЮОІ, які можуть бути введені в різних поєднаннях або у вигляді набору, який включає всі чотири гени. З використанням цих штамів
Адгорасіегішт можуть бути трансформовані види однодольних (з однією сім'ядолею) і дводольних (із двома сім'ядолями) рослин.
У даному описі розкривається також геномний локус піїА Адгобасіегічт іштегТасієп5, у який може бути інтегрована полінуклеотидна послідовність. Така інтегрована полінуклеотидна послідовність може включати будь-який ген міг або оперон міг або інші придатні гени. У прикладах 17-20 представлена ідентифікація, характеристика і використання геномного локусу пІА Адгобасіегічт (шптегасіеп5, а також продукція штамів Адгорасіегіит ішптегїасіеп5 з множиною генів міг, локалізованих у хромосомі. Геномний локус піА або будь-який локус, який характеризується 85-10095 ідентичністю послідовності, може бути ідентифікований в інших штамах Адгорасіегічт, використовуваних в описаних у даному документі методах ідентифікації і характеристики, і будь-які такі ідентифіковані локуси під можуть бути використані подібним з описаним у даному документі чином для інтеграції генів мг або інших придатних генів, які можуть, наприклад, підвищувати ефективність трансформації рослин. Методи ідентифікації і характеристики таких геномних локусів, описаних у даному документі, можуть також використовуватися для ідентифікації інших нейтральних сайтів інтеграції в хромосомі
Адгобасіегішт, у яку можуть бути інтегровані полінуклеотидні послідовності, які містять гени міг або інші гени так, щоб штам Адгобасіегішт залишався здатним до трансформації рослин. Уже
Зо відомі деякі хромосомні сайти, які можуть бути використані в якості нейтральних сайтів інтеграції, наприклад, сайт КесА у штамі з недостатністю КесаА, і локус рої/рісА у штамі С58
Адгорасієгійт Шптптеїасіеп5. Однак існує необхідність в ідентифікації нових нейтральних сайтів у штамах Адгорасіегіит їштетасієп5 у доповнення до С58, тому що локус раї/рісА не визначається в деяких інших штамах, наприклад, у штамі /ВА4404 (Отапп5 еї аї., вище). Додаткові хромосомні сайти, які можуть бути використані в якості нейтральних сайтів інтеграції, описані в патенті США Мо 6323396. Таким чином, розкритий також штам Адгобасіегішт з геном міг, інтегрованим у нейтральний сайт інтеграції в хромосомі Адгорасіегішт. Такий штам
Адгобасіегішт може використовувати геномний локус піїА або інший нейтральний сайт інтеграції для інтеграції генів міг.
Таким способом можуть бути додані в хромосому множинні типи придатних генів, забезпечуючи відсутність необхідності у використанні Т-допоміжних плазмід. Наприклад, можуть бути використані додаткові гени міг і множинні копії придатних генів міг з різних штамів.
У даному документі розкритий також штам Адгобасіегічт, який містить гени міг на допоміжній плазміді, яка має точку початку реплікації групи несумісності, відмінної від ІпсР, і плазміду, яка має ділянку Т-ДНК, яка прилягає щонайменше до однієї границі Т-ДНК Адгобасієгічшт, причому плазміда має точку початку реплікації групи несумісності ІпсР.
Додатково розкриті рослини, створені за допомогою описаних у даному документі способів, з використанням штамів Адгобасіегішт, описаних у даному документі. Такі рослини стабільно інтегрують будь-які ділянки Т-ДНК, уведені з використанням розкритих у даному описі способів.
Більш того, такі рослини експресують будь-які гени і виявляють будь-які генетичні ознаки, які додаються цими ділянками Т-ДНК. Крім того, будь-який нащадок рослин, створених за допомогою описаних у даному документі способів, з використанням штамів Адгобасіегішт, описаних у даному документі, стабільно експресує будь-які гени і виявляє будь-які генетичні ознаки, які додаються тими ділянками Т-ДНК, які знайдені в батьківської рослини.
У конкретному варіанті здійснення описується рослина, яка стабільно експресує інсектицидні білки СтуїСа, інсектицидні білки Сту1Е, інсектицидні білки СтутАбІ1 і гербіцидні білки ААОТ1Т. Це рослина, наприклад, може являти собою маїс.
Поряд з тим, що в даному документі описуються визначені приклади штамів Адгобасіегічт, обговорювана функціональність може бути переміщена в інші штами Адгорасіегіцшт з тими ж 60 самими критеріями, наприклад, в інші штами, які мають недостатність КесА або можуть бути створені з недостатністю КесА. Приклади інших штамів, які можуть бути використані з описаними в даному документі штамами і способами, включають, але не обмежуються цим, штам С58 Адгорасіегішт їшптеїасієп5, штам Спгуб5 Адгобасіегішт їшптеїасіеп5, штами
Адгорасіегішт гпігодепе5, штам ЕНАТО1 Адгобасіегішт (шптеїгасіеп5, штам ЕНА1ТО5 Адгобасіегіит
Іштегасівеєп5, штам МОС101 Адгобасієгіит ішптегасієп5 і штам Т37 Адгобасіегіит їштегасіепв.
Усі патенти, патентні заявки, попередні заявки і публікації, на які посилаються в даному описі або які цитуються в ньому, включені як посилання в повному обсязі в тому ступені, у якому вони не є несумісними з точними вказівками цього опису.
Далі випливають приклади, які ілюструють методи використання штамів АдгобБасієгіит і використання описаних у даному документі методів на практиці. Ці приклади не повинні розглядатися як лімітовані. Усі відсотки розраховані по масі і всі пропорції сумішей розчинників - по об'єму, якщо не зазначено інакше. Усі температури приведені в градусах Цельсію.
Якщо спеціально не зазначено або не позначено інакше, терміни "а", "ап" ї "Ше" при застосуванні в даному описі позначають "щонайменше один".
Приклад 1: Конструювання делеційного варіанта плазміди РОСО2
Конструкція плазміди РОСО2 була описана Сіозе еї аї., (1984, Ріахтіа 12:111-118), і повна послідовність 13239 п.о. ДНК розкрита вперше в даному описі у вигляді ОМА 5ЕО ІЮ МО:1. рОсор2 несе чотири гени, які додають бактеріальну стійкість до антибіотиків: конкретно стійкість до спектиноміцину, канаміцину, тетрацикліну й ампіциліну (Фіг. 1). Стандартні методи молекулярної біології, як вказується, наприклад, у Затьгоок еї аї., (1989, МоїІесшаг Сіопіпа: А
І арогаїогу Мапиаї (2па Еайіоп., СОГО З5РЕЇМО НАКВОК І АВОКАТОЕКУ РКЕЗ55, Ріаїпмієм/, М.М.) ії
Айзирбеї еї аї., (1995, Ситепі Ргоїосоїв5 іп МоїІесшціаг Віооду, (ФВЕЕМЕ РОВІІЗНІМО АМО УМІСЕМ-
ІМТЕКЗСІЕМСЕ, Мем мМогкК) і їх відновленнях, застосовували на цій і іншій стадіях, описаних у цьому прикладі і в інших прикладах даного розкриття. Перша модифікація відносно РОСО2 була зроблена за допомогою розщеплення ДНК рОСО2 ферментами рестрикції Зас | ї Зас ІІ і лігування в основному дволанцюжкового фрагмента, який має придатні "липкі кінці", які звішуються, сумісні зі створеними під дією 5ас І- або Зас ІІ звішуваннями. Цей дволанцюжковий олігонуклеотид (Фіг. 1) був створений за допомогою відпалу двох комплементарних олігонуклеотидних послідовностей, розкритих як ЗЕО ІЮ МО:2 і БЕО ІО МО:3. Послідовності БЗЕО
Зо ІЮ МО:2 ї 5ЕО І МО:З3 конструюються для відновлення функціонуючого гена стійкості до канаміцину при лігуванні ДНК рОосСо2, розщепленої зас І і Зас ІІ. За допомогою цієї маніпуляції створена плазміда рравВе290 (Фіг. 1), яка відрізняється від РОСО2 делецією кодуючої ділянки стійкості до спектиноміцину, видаленням сайту впізнавання ферментом рестрикції Крп І з кодуючої ділянки стійкості до канаміцину, і створенням нового сайту Крп І нижче кодуючої ділянки стійкості до канаміцину.
Для додавання відсутності функціональності генам, які кодують стійкість до тетрацикліну і стійкість до ампіциліну, проводили подальші маніпуляції з ДНК плазміди ррАВУО290 за допомогою первісного розщеплення ферментами рестрикції Реї І ї За! І, обробки кінців, які звішуються ліворуч, цими ферментами за допомогою набору ОШІСК ВГОМТІМОтМ (МЕМ
ЕМСГАМО ВІОГАВ5; Ірзм/ісп, МА) для створення тупих кінців і самолігування для замикання в коло утворених у такий спосіб фрагментів. Отримана плазміда (ррАВеО291) зберігає тільки ген стійкості до бактеріального антибіотика канаміцину і має унікальний сайт для розщеплення за допомогою Крп І нижче гена стійкості до канаміцину. Послідовність РОАВУО291 розкрита як ЗЕО
ІО МО:4. Плазміда ррАВУО291 має дві точки початку реплікації, одну (група несумісності СОЇЕТ), яка походить від плазміди рВКЗ322, і другу, яка походить від плазміди рза (група несумісності
УМ). Таким чином, плазміда ррАВеО291 здатна підтримувати середню кількість копій у Е. соїї і
Адгобасієетійт.
Приклад 2: Клонування фрагменту 14,8 Крп І мгВСОС у ррАВУОг291
Фрагмент 14,8 т.п.о. Крп !, який містить оперони міг, мі((В і міг і ген міг! з "супервірулентною" ртіВвВо542 (Фіг. 1), був виділений із плазміди ро5ВІ1 (Копагі еї аї., вище; і
Коптогі еї аІ., вище) і клонований в унікальний сайт Крп І ррАВО291. Були отримані плазміди, які містять кожну з двох можливих орієнтацій вставленого фрагмента, і названі ррАВУО292 і рорАВО293. Одна плазміда ррАВеО292 (Фіг. 1) була обрана для подальшої роботи. Послідовність
ДНК ррадве292 розкрита як ЗЕО ІЮ МО:5.
Приклад 3: Конструювання штаму Адгобасіегішт з недостатністю КесА, який несе допоміжну плазміду РТІЕНА1ТО5
Штам ШІА143 Адгобасіегішт являє собою штам з недостатністю КесА, який має генетичний фон С58, і він був сконструйований і описаний Ра!їтапа еї аї., (вище). Хромосомний ген гесА був вилучений і замінений касетою генів, які додають стійкість до еритроміцину при 150 мкг/мл. 60 Штам ШАТ143 не містить плазміди Ті або похідного плазміди Ті.
Штам ЕНАТО5 Адгобасіегішт сконструйований і описаний Ноой еї аї., (1993, Тгапздепіс
Везеєагсп 2:208-221), несе допоміжну плазміду (називану в даному описі рТтіЕНА1О5), яка походить від "супервірулентної" плазміди рТтівВо542. ДНК плазміди рТтіЕНАТО5 отримували зі штаму ЕНАТО5 і вводили за допомогою електропорації в клітини штаму ША143, приготовлені як електрокомпетентні за допомогою стандартних методів (Му/еїдеІ апа СіІагебгоокК, (2002)
Агарідорвів: А І арогаїогу МапиаІм. СОГО 5РВІМИ НАВВОА РАЕ55, Соїд 5рііїпа Набог, ММ, 354 радев; Мегзегеацй еї аї., (1990) Сепе 90:149-151; Манапомісн, єї а!., (1989) Мисі. Асійв Вев. 17:6747)). Клітини штаму ШІА143, трансформовані плазмідою ртіЕНАТ1ТО5, відбирали по їхній здатності рости в мінімальному середовищі АВ (Умаїзоп, еї аї., (1975) У. Васієгіо!Ї. 123:255-264) з використанням очищеного агару і манопіну (2 мг/мл) як єдине джерело вуглецю й азоту для росту (Спшиуоп еї аї., (1980) Ргос. Маї. Асай. Зсі. 77:2693-2697; Оеззаих еї а!., (1987) Моїівєс. Сеп.
Сепеї. 208:301-308).
Присутність рТІЕНАТО5 підтверджували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням праймерів, створених для ампліфікації фрагментів генів мігбО2 і міго плазміди ртТіВо542, і додатково характеризували, аналізуючи за допомогою блотингу по
Саузерну сумарної ДНК, отриманої з кандидатних колоній, зондуючи З"Р-міченої ДНК плазміди ртІЕНАТО1, очищеної центрифугуванням у градієнті хлориду цезію. Цей штам Адгобасіегійт (тобто ШІА143, який містить рТіЕНА1ТО5) названий СА2552.
Приклад 4: Конструювання штаму Адгобасіегішт з недостатністю КесА, який несе допоміжну плазміду ртіСьвА
Штам 2707 походить шляхом заміни повної ділянки Т-ДНК плазміди ртіСЬ8 штаму С58
Адгорасієегічт Ішптегасієп5 геном прі І Тп903, який додає стійкості до канаміцину. Повна ділянка міг отримана в результаті плазміди, яка називається в даному описі ртісС5вА, була інтактною ліворуч (Нербитп еї аї., (1985) 9. Сзеп. Місгобіої. 131:2961-2969). Допоміжну плазміду ртісС5вА зі штаму 24707 очищали центрифугуванням у градієнті хлориду цезію і вводили електропорацією у електрокомпетентні клітини ШІАТ43. Трансформант відбирали на основі, який походить з плазміди ртісС5вА гена стійкості до канаміцину і гена, який походить з хромосоми, стійкості до еритроміцину, і штам був названий ЮА2569. Присутність ртіс5вА у ЮА2569 підтверджували
ПЛР-ампліфікацією, з використанням праймерів для визначення відібраних ділянок генів міг і
Зо аналізуючи за допомогою блотингу по Саузерну сумарної ДНК, отриманої з кандидатних колоній раАіг2569, зондуючи З"Р-міченою ДНК плазміди ртіСсь84, очищеної центрифугуванням у градієнті хлориду цезію з клітин штаму 2707.
Приклад 5: Конструювання штаму Адгобасіегішт з недостатністю КесА, який несе допоміжну плазміду РМРОО
Штам М3101(рМРУО) Адгорасіегішт їІштетасієп5 несе делеційний варіант ртісзв, називаний рРМРОО, з якого вилучена повна ділянка Т-ДНК і замінена геном, який додає стійкості до гентаміцину (Копс7 апа 5спеїІЇ, (1986) Мої. Сбеп. Сепеї. 204:383-396). ДНК плазміди РМРО9О отримують такими методами як центрифугування в градієнті хлориду або цезію МАСНЕКЕУ-
МАСЕЇ МОСІ ЄОВОМО ХТВА МАХІ КІТ "ГОМ СОРУ" (МАСНЕНЕУ-МАСЕЇГ Іпс.; Вешеїет, РА) і вводять електропорацією у клітини ШІА143. Трансформант відбирають на основі, який походить з плазміди РМРОО гена стійкості до гентаміцину (100 мкг/мл) і штам позначають ЮАї20538.
Присутність РМРОО у БАї20538 підтверджують ПЛР-ампліфікацією, з використанням праймерів для визначення відібраних ділянок генів міг і аналізуючи за допомогою блотингу по Саузерну сумарної ДНК, отриманої з ОДІ20538.
Приклад 6: Конструювання штаму Адгобасіегішт з недостатністю КесА, який несе допоміжну плазміду РМРООКК
Допоміжну плазміду РМРОО, описану в прикладі 5, додатково модифікували за допомогою введення (шляхом подвійного кросинговера з гомологічною рекомбінацією) 42 т.п.о. фрагмента
Есок І, який походить з плазміди рЕК2013 (Рідиге5Кі апа Неїїп5кі, (1979) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 79:1648-1652). 42 т.п.о. фрагмент містить гени, які походять з плазміди КК2, для реплікації і мобілізації плазміди (наприклад, ІА, їга!, їга?2, їгазЗ і огії), і ген, який додає стійкості до канаміцину. За допомогою цієї маніпуляції заміняли ген стійкості до гентаміцину плазміди
РМРОО, і отриману в результаті плазміду позначили як РМРООКК (Копс апа зспеїІ, вище). ДНК плазміди РМРООКК отримують такими методами як центрифугування в градієнті хлориду або цезію МАСНЕКЕМ-МАСЕЇ МОСІЕєОВОМО ХТКА МАХІ КІТ "ГОМУ СОРУ" і вводять електропорацією у електрокомпетентні клітини ШІАТ43. Трансформант відбирають на основі, який походить з плазміди рРМРООКК гена стійкості до канаміцину, і штам позначають як рА20539. Присутність рМРООКК у ОрАї20539 підтверджують ПЛР-ампліфікацією з використанням праймерів для визначення відібраних ділянок генів міг і аналізуючи за бо допомогою блотингу по Саузерну сумарної ДНК, отриманої з ОА(20539.
Приклад 7: Електропорація ДНК ррАвВУ9292 у штам СА2552 Адгобасіегійт
Електрокомпетентні клітини ЮА2552 отримували, використовуючи стандартний протокол (див. приклад 3). 50 мкл компетентних клітин БА2552 відморожували на льоді і трансформували з використанням від 300 до 400 нг ДНК плазміди ррАВеУ292. Суміш ДНК ії клітин піддавали електропорації з використанням попередньо охолоджених кювет для електропорації (0,2 см) і електропоратора ВІО-ВАОЮО СЕМЕ РОЇ ЕВ (ВІО-КАбБ Іпс.; Негсцез, СА.) при наступних умовах: напруга: 2,5 кВ, тривалість імпульсу: 5 мсек, вихідна ємність: 25 мкФ, опір: 200 Ом. Після електропорації до кювети додавали 1 мл бульйону ХЕР (г/л: екстракт дріжджів 10, пептон 10, масі 5), і суспензію клітин у МЕР переносили в 15 мл пробірку для культивування. Клітини інкубували при 28 "С при обережному перемішуванні протягом 4 годин, після цього культуру висівали на чашки з ХЕР -- агаром, який містить канаміцин 50 мкг/мл і еритроміцин 150 мкг/мл.
Чашки інкубували протягом від 2 до 4 днів при 28 "С, і колонії збирали і висівали штрихом на свіжі чашки МЕР -- агар з антибіотиками, як зазначено вище, і інкубували при 28 "С протягом від 1 до З днів. Приналежність цих колоній до Адгорасіегішт підтверджували при використанні тесту на кетолактозу (Воилаг еї аї., (1995) Іп: Мешйоа35 іп МоїІесшаг Віоіоду (К. Сашапа апа М. Вамеу, ед5.) Адгобасієгішт Ргоїосоіїв. (Мої. 443 НОМАМА РАЕБЗ5, Тоїожша, Му. рр. 9-13. Декілька позитивних відносно кетолактози колоній відбирали для вихідних З мл МЕР (з антибіотиками) культур, які висіваються, які росли протягом ночі при 28 "С при перемішуванні. 300 мкл кожної висіяної культури використовували для інокуляції 200 мл МЕР (з антибіотиками) з ростом культури протягом ночі при 28 "С при перемішуванні при 200 об./хв. Плазмідну ДНК отримували з 165 мл кожних 200 мл культури, яка виростала протягом ночі, з використанням набору
МАСНЕВЕМ-МАСЕЇ МОСІЕОВОМОФ ХТКА МАХІ РІАЗМІО ОМА /РОКІРІСАТІОМ.
Дотримувались протоколу виробника за винятком використання 30 мл кожного з буферів КЕ5,
ГМ5іМЕШ. Елюйовану ДНК зберігали при 4 "С.
Гідроліз ферментом рестрикції Ватн І плазмідної ДНК використовували для підтвердження присутності РОАВУ292 у цих ізолятах, і колонії, які мають коректні патерни, потім додатково очищали, використовуючи два пасажі ізоляту одиночної колонії. Плазмідну ДНК отримували з культур, інкубованих протягом ночі, як описано вище, і аналіз за допомогою гідролізу ферментами рестрикції використовували для підтвердження присутності інтактної ррАВУО292.
Зо Як гідролізований стандарт включали плазмідну ДНК вектора рорАВ9У292, початково використаного для трансформації ОА2552. Чотири окремих реакції гідролізу (Р5ї І, Ват І, М'є Ії
Ніпа Ії) проходили з використанням від 750 нг до 1 мкг ДНК. Реакції давали проходити протягом від 1 до 2 годин, і результат аналізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі (0,890 мас./об.), і фрагменти ДНК візуалізували фарбуванням бромідом етидію. Цей штам
Адгорасіегічт (тобто ЮОА2552, який несе ррдАвВ9292) названий ЮАН3192. Цей штам створює основу для рекомбінантно-дефіцитної "потрійної" системи трансформації рослин.
Приклад 8: Електропорація ДНК ррАВеУ292 у штам ЗМ3101(рМРЗО) Адгобасієей ит
Клітини штаму 5М3101(рМРОО) Адгобасіегішт Кшптегасієп5 (Копс апа 5спеїІЇ, вище) робили електрокомпетентними за допомогою стандартного протоколу (див. приклад 3). 50 мкл компетентних клітин ЗМ3101(рМРОО) відморожували на льоді і трансформували з використанням від 300 до 400 нг ДНК плазміди ррАВУ292. Суміш ДНК і клітин піддавали електропорації з використанням попередньо охолоджених кювет для електропорації (0,2 см) і електропоратора ВІО-КАО СЕМЕ РИОЇ ЗЕК при наступних умовах: напруга: 2,5 кВ, тривалість імпульсу: 5 мсек, вихідна ємність: 25 мкФ, опір: 200 Ом. Після електропорації до кювети додавали 1 мл бульйону МЕР і суспензію клітин у МЕР переносили в 15 мл пробірку для культивування. Клітини інкубували при 28 "С при обережному перемішуванні протягом 4 годин, після цього культуру висівали на чашки з МЕР «т агаром, який містить канаміцин 50 мкг/мл і гентаміцин 100 мкг/мл. Чашки інкубували протягом від 2 до 4 днів при 28 "С, і колонії збирали і висівали штрихом на свіжі чашки МЕР « агар з антибіотиками, як зазначено вище, і інкубували при 28 "С протягом від 1 до З днів. Приналежність цих колоній до Адгобасієгіит підтверджували при використанні тесту на кетолактозу. Декілька позитивних відносно кетолактози колоній відбирали для вихідних З мл УЕР (з антибіотиками) культур, які висіваються, які росли протягом ночі при 28 "С при перемішуванні. 300 мкл кожної висіяної культури використовували для інокуляції 200 мл МЕР (з антибіотиками) з ростом культури протягом ночі при 28 С при перемішуванні при 200 об/хв. Плазмідну ДНК отримували з 165 мл кожних 200 мл культури, яка виростала протягом ночі, з використанням набору МАСНЕКЕХ-МАСЕЇ МОСГЕОВОМОФ ХТКА
МАХІ РІАЗМІО ОМА РИМІРІСАТІОМ. Дотримуючись протоколу виробника за винятком використання 30 мл кожного з буферів КЕ5, І 5 і МЕО. Елюйовану ДНК зберігали при 4 "С.
Гідроліз ферментом рестрикції Ватн І плазмідної ДНК використовували для підтвердження бо присутності рОАВУО292 у цих ізолятах, і колонії, які мають коректні патерни, потім додатково очищали, використовуючи два пасажі ізоляту одиночної колонії. Плазмідну ДНК отримували з культур, інкубованих протягом ночі, як описано вище, і аналіз за допомогою гідролізу ферментами рестрикції використовували для підтвердження присутності інтактної ррАв9292.
Як гідролізований стандарт включали плазмідну ДНК вектора рорАВ9УО292, початково використаного для трансформації зМУ3101(рМРО0). Чотири окремих реакції гідролізу (Рв І,
Ватн І, Мге І ї Ніпа І) проходили з використанням від 750 нг до 1 мкг ДНК. Реакції давали проходити протягом від 1 до 2 годин, і результат аналізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі (0,895 мас./об.), і фрагменти ДНК візуалізували фарбуванням бромідом етидію.
Ізолят ЗМУ3101 А. Шшптегасіеп5, який несе допоміжну плазміду РМРОО Ті ії ррАВУО292, названий рдїгол12.
Приклад 9: Електропорація ДНК ррАВУ9292 у штам І ВА4404 Адгорасіегіит
Клітини штаму І ВА4404 Адгобрасіегішт Іішптеїасіеп5 (Оо0т5 еї аї!., (1982) Ріазтій 7:15-29) робили електрокомпетентними за допомогою стандартного протоколу (див. приклад 3). 50 мкл компетентних клітин І ВА4404 відморожували на льоді і трансформували з використанням від 300 до 400 нг ДНК плазміди ррАВУ292. Суміш ДНК і клітин піддавали електропорації з використанням попередньо охолоджених кювет для електропорації (0,2 см) і електропоратора
ВІО-КАЮО СЕМЕ РИЇЗЕК при наступних умовах: напруга: 2,5 кВ, тривалість імпульсу: 5 мсек, вихідна ємність: 25 мкФ, опір: 200 Ом. Після електропорації до кювети додавали 1 мл бульйону
МЕР, і суспензію клітин у МЕР переносили в 15 мл пробірку для культивування. Клітини інкубували при 28 "С при обережному перемішуванні протягом 4 годин, після цього культуру висівали на чашки з МЕР « агаром, який містить канаміцин 50 мкг/мл і стрептоміцин 250 мкг/мл.
Чашки інкубували протягом від 2 до 4 днів при 28 "С, і колонії збирали і висівали штрихом на свіжі чашки МЕР -- агар з антибіотиками, як зазначено вище, і інкубували при 28 "С протягом від 1 до З днів. Приналежність цих колоній до Адгорасіегішт підтверджували при використанні тесту на кетолактозу і їх додатково очищали, використовуючи два пасажі ізоляту одиночної колонії.
Декілька позитивних відносно кетолактози колоній відбирали для вихідних З мл МЕР (з антибіотиками) культур, які висіваються, які росли протягом ночі при 28 "С при перемішуванні. 300 мкл кожної висіяної культури використовували для інокуляції 200 мл МЕР (з антибіотиками) з ростом культури протягом ночі при 28 "С при перемішуванні при 200 об/хв. Плазмідну ДНК
Зо отримували з 165 мл кожних 200 мл культури, яка виростала протягом ночі, з використанням набору МАСНЕКЕХ-МАСЕЇ МОСІЕОВОМОДЮ ХТКА МАХІ РІГАЗМІО ОМА РИРКІРІСАТІОМ.
Дотримуючись протоколу виробника за винятком використання 30 мл кожного з буферів КЕ5,
ГМ5іМЕШ. Елюйовану ДНК зберігали при 4 "С.
Присутність інтактної плазміди ррАВУО292 підтверджували за допомогою гідролізу ферментами рестрикції. Як гідролізований стандарт включали плазмідну ДНК вектора ррАВУ292, початково використовуваного для трансформації І ВА4404. Три окремих реакції гідролізу (РБї І, Ватн І ї Ніпа Ії) проходили з використанням від 750 нг до 1 мкг ДНК. Реакції давали проходити протягом від 1 до 2 годин, і результат аналізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі (0,895 мас./об.), і фрагменти ДНК візуалізували фарбуванням бромідом етидію. Ізолят І ВА4404 А. ішптегїасіеп5, який несе ррАВеО292, названий ЮАї20711. Цей штам створює основу для рекомбінантно-профіцитної "потрійної" системи.
Приклад 10: Електропорація ДНК рравВе292 у штам БАї20538 Адгобасіегіит
Електрокомпетентні клітини САІ20538 отримують з використанням стандартного протоколу (див. приклад 3). 50 мкл компетентних клітин БАї20538 розморожують на льоді і трансформують за допомогою від 300 до 400 нг ДНК плазміди ррАВе292. Суміш ДНК ії клітин електропорують, використовуючи попередньо охолоджені кювети для електропорації (0,2 см) і електропоратор
ВІО-КАЮО СЕМЕ РОЇ ЕК, при наступних умовах: напруга: 2,5 кВ, тривалість імпульсу: 5 мсек, вихідна ємність: 25 мкФ, опір: 200 Ом. Після електропорації в кювету додають 1 мл бульйону
МЕР, і суспензію клітин у МЕР переносять у 15 мл пробірку для культивування. Клітини інкубують при 282С при легкому перемішуванні протягом 4 годин, після чого культуру висівають на ХЕР -- агар, який містить канаміцин у концентрації 50 мкг/мл і гентаміцин у концентрації 100 мкг/мл. Чашки інкубують протягом від 2 до 4 днів при 282С, відбирають колонії і наносять їх штрихом на свіжі чашки з МЕР « агар з антибіотиками, як зазначено вище, і інкубують при 2820 протягом від 1 до З днів. За допомогою кетолактозного тесту підтверджують, що ці колонії являють собою Адгорасіегішт, і позитивні відносно кетолактози колонії потім виділяють за допомогою двох пасажів ізоляту одиночної колонії.
Відбирають колонії для ініціації культур у З мл УЕР (з антибіотиками) для інокуляції, які вирощують протягом ночі при 2823 при струшуванні. 300 мкл кожної з культур для інокуляції використовують для інокуляції 200 мл МЕР (з антибіотиками) нічної культури, вирощуваної при бо 2890 зі струшуванням при 200 об/хв. Плазмідну ДНК отримують з 165 мл з кожних 200 мл нічної культури за допомогою набору МАСНЕКЕХ-МАСЕЇ МОСІ ЕОВОМОФ ХТРЕА МАХІ РІ АЗБМІОЮ ОМА
РИМКІРІСАТІОМ. Дотримуючись протоколу виробника, за винятком того, що використовують 30 мл кожного з буферів КЕ5, І У5 ії МЕО. Елюйовану ДНК зберігають при 4с.
Для підтвердження наявності інтактної плазміди ррАВО292 використовують рестрикційний аналіз. Як гідролізований стандарт включають плазмідну ДНК вектора ррАВеО292, початково використаного для трансформації САї20538. Проводять чотири окремі реакції гідролізу, такі як
РІ, Ватн І, Мге І ї Ніпа ІП, з використанням від 750 нг до 1 мкг ДНК. Реакції дають розвинутися протягом від 1 до 2 годин й аналізують за допомогою електрофорезу в агарозному гелі (0,890 мас./об.), і фрагменти ДНК візуалізують фарбуванням етидію бромідом. Ізолят А. Шшптегасіеп5 рдАї20538, який несе ррАВО292, названий ВА20538(рравВог292).
Приклад 11: Конструювання векторів для трансформації рослин, які містять багаторазово повторювані елементи послідовності, і введення в штами Адгобасіегійт
У даному описі ілюструється придатність сконструйованого штаму Адгобасіегіит шптегасіепь з недостатністю функції КесА у поєднанні з допоміжними генами, забезпечуваними фрагментом 14,8 Крпі МігВСОО. Бінарний вектор для трансформації рослин, рОАВІ101513 (фіг. 4А), був сконструйований у штамі Е. соїї для клонування 5ТВІ 2"7М за допомогою поєднання стандартних методів клонування (як описано, наприклад, у ЗатрбгоокК еї аї., (1989, вище) і А!з5ибеї еї аї., (1995, вище)) і технології ЗАТЕУМАМУ "М (ІММІТЕОСЕМ). Бінарний вектор рОАВ101513 базується на точці початку реплікації типу ІпПсР плазміди КК, і основа вектора містить бактеріальний ген, який додає стійкості у спектиноміцину (5роекК на фігурі 4) у концентрації 100 мкг/мл. Граничні повтори Т-ДНК беруть початок від ділянки ТІ. рті15955. Усередині правої граничної ділянки (Т-
ДНК граничної ділянки В на Фіг. 4) і потрійної лівої граничної ділянки (Т-ДНК граничної ділянки А на Фіг. 4) ділянки Т-ДНК плазміди рОАВ101513 розташовані 4 експресовані в рослинах, які містять оптимізовані для рослин кодони, які кодують білки послідовності (СО5), транскрипція кожної з який керується промотором убіквітину 1 маїсу з 1991 п.н. з асоційованим інтроном 1 (патент США Мо 5510474). Три кодуючі ділянки кодують окремі білки Ві Сту! (СгтуїСа, 5ЗЕО ІЮ
МО:7; СтуїРа, ЗЕО ІЮО МО:9; і СтгуУтТАБ, 5ЕО ІО МО: 11), причому кожна з них містить приблизно 3500 п.н. Ці кодуючі ділянки були оптимізовані для експресії в рослинах маїсу з використанням таблиці кращих для маїсу (7еа тауз) кодонів, розрахованої на основі аналізу 706 ділянок, які кодують білки маїсу, які були отримані з депозитів ЗЕМВАМК. Додаткові вказівки, які стосуються конструювання й отримання синтетичних генів, можна знайти, наприклад, у УМО 97/13402А1, патенті США Мо 6166302 і патенті США Мо 5380831. Три ділянки, які кодують білки Ві, співвідносяться одна з одною у такий спосіб: ділянка, яка кодує, сгуїСа (5ЕО ІО МО: б) і ділянка, яка кодує, сгуї!Ра (5ЕО ІЮ МО:8) мають 6795 гомологію послідовності; кодуючі ділянки сгуїСа (ЗЕБЕО І МО: 6) і сгутАр (5БО ІО МО: 10) мають 69,595 гомологію послідовності, а кодуючі ділянки сгу!Ра (5ЕО ІЮ МО:8) і сгулАб (5ЗЕО ІО МО: 10) мають 6795 гомологію послідовності. Крім того, С-кінцеві 1600 п.н. СО5 сгуїСа, сгуїРа і сгутАБб мають 7395 гомологію послідовності. Кожна з цих трьох кодуючих ділянок закінчується Рего 3'-нетрансльованою ділянкою маїсу (З'ЮТК) (патент США Мо 6384207). Четвертий ген включає ділянку, яка кодує, аад1 з оптимізованими для рослин кодонами (ЗЕО ІО МО: 12), яка кодує маркерний білок селекції ААЮ1 (ЗЕО ІЮО МО: 13) (патент США Мо 7838733). Ділянка, яка кодує, аад1 не є спорідненою СО5 сгу1!Са, сгу!Ра або сгутлАр. Ділянка, яка кодує, аад! була сконструйована з використанням таблиці кращих для рослин кодонів. Таблиця кращих для маїсу кодонів була розрахована на основі аналізу 706 послідовностей, які кодують білки маїсу, які були отримані з послідовностей, депонованих у
СЕМВАМК. Таблиці використовуваних кодонів для тютюну (Місойапа їабасит, 1268 СО5), каноли (Вгаззіса пари5, 530 СО5), бавовни (Со55урішт Вігешішт, 197 СО) і сої (СіІусіпе тах; са. 1000 СО5) були завантажені із сайту пЕр:/Лумли.Каиза. ог.Ір/содоп/. Кращий набір кодонів, який включає часто використовувані кодони, загальні для наборів даних для маїсу і дводольних, при відповідній зміні масштабу середніх відносних величин розраховували після видалення будь- якого додаткового кодона, використовуваного рідше, ніж приблизно 1095 від сумарного використання кодонів для даної амінокислоти в одному з типів рослин. Ген аай1 закінчується
З'ЮТК ліпази маїсу (патент США Мо 7179902). Таким чином, усередині ділянки Т-ДНК роАВ101513, яка містить 22729 п.н., чотири копії промотору цбрії1 маїсу включають у цілому 7964 основ, організованих у вигляді чотирьох прямих повторів з майже 2 т.п.н. (тисяч пар нуклеотидів), причому кожен повтор на 10095 подібний до інших. Три копії Рег5 ЗОТК включають у цілому 1095 основ, організованих у вигляді трьох прямих повторюваних одиниць, причому кожна з них на 10095 подібна до інших, а три кодуючі ділянки сгу1Са, сгуї!Ра і сгутлАб організовані у вигляді прямих повторів, які мають гомологію одна з одною від 6795 до 7395. У цілому Т-ділялнка рораАВ101513 включає приблизно 8695 послідовностей 3 високою 60 повторюваністю і для зручності може бути зображена в такий спосіб:
КВ» промотор ОріїсгуїбСа СбО5Регб5 З'ОТЕ»промотор ШБії: осгуїба СО5:Рег5
З'ТК»промотор Обрії сгутАб СО5:Рего З'ОТК»промотор Обрії: аааї СО5:Гір З'ОЮТЕІ В
Природа високої повторюваності цього конструкта необхідна для того, щоб завершити стадії клонування в штамі Е. соїї для клонування 5ТВІ 2"М, який був спеціально сконструйований для підтримки цілісності клонів, які містять такі послідовності ДНК із високою повторюваністю.
Плазміду рОАВ101513 уводили шляхом електропорації в електрокомпетентні клітини А.
Іштеїасіеп5 штаму ЕНАТ1ТО5 (який набув стійкості до стрептоміцину в результаті спонтанної хромосомної мутації), і стійкі до спектиноміцину/стрептоміцину ізоляти перевіряли за допомогою рестрикційного аналізу на предмет наявності інтактної плазміди РОАВ101513 перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80"С. Цей штам названий
ЕНАТО5(ррАВ101513). Було виявлено, що численні індивідуальні культури з клітин, отриманих із заморожених у гліцерині партій ЕНАТО5(ррАВ101513), містять перебудовані версії або версії з делеціями плазміди ррАВ101513. Для трансформацій маїсу збирали всі клітини штаму
ЕНАТО5(ррАВ101513) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх точно, як описано в прикладі 13.
Плазміда рОАВ101513 була успішно введена шляхом електропорації в електрокомпетентні клітини А. їштеїасіеп5 штаму СА2552 (по суті штаму, який є версією, ЕНА1ТО05 з недостатністю
КесА) з отриманням штаму ОА2552(рраАВ101513). Трансформанти, відібрані на основі стійкості до еритроміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80"С. Було виявлено, що численні індивідуальні культури з клітин, отриманих із заморожених у гліцерині партій, містять інтактну плазміду РОАВІ101513. Збирали всі клітини штаму БА2552(ррАВІ101513) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу (приклад 13).
Плазміда рОАВІ101513 була успішно введена шляхом електропорації в електрокомпетентні клітини А. іштеїасіеп5 штаму ЮАМ3192 (штаму ЮА2552, який несе плазміду ррАВУ292) з отриманням штаму ВАН 3192(ррАВ101513). Трансформанти, відібрані на основі стійкості до еритроміцину, канаміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням
Зо при -802С. Було виявлено, що численні індивідуальні культури з клітин, отриманих із заморожених у гліцерині партій, містять інтактну плазміду РОАВІ101513. Збирали всі клітини штаму ЮАМИЗ3192(ррАВІ101513) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу (див. приклад 13).
Подібним чином було сконструйоване похідне роВ11 (човникового вектора супербінарної системи), яке містить ділянку Т-ДНК, аналогічну ділянці Т-ДНК ррАВ101513. Декількаразові спроби сконструювати супербінарну плазміду за допомогою стандартних методів у
І ВА4404(рЗВІ) були невдалими. Усі спроби приводили до виділення коінтегративних плазмід на основі рЗВІ1 з великими перебудовами і делеціями.
Приклад 12: Конструювання вектора ррАВ101514, який трансформує, рослини, який містить множинні повторювані елементи послідовності, і введення в штами Адгобасієей Чт
У даному описі додатково ілюструється придатність сконструйованого штаму А. іштегасіеп5 з недостатністю функції КесА у поєднанні з допоміжними генами міг, забезпечуваними фрагментом 14,8 Крпі мігвСОо. Бінарний вектор, який трансформує рослини, рОАВІ101514 (Фіг.
АВ) був сконструйований у клонуючому штамі 5ТВІ2"М БЕ. соїї. Структура бінарного вектора рОАВІ01514 є майже такою ж, як і структура ррАВ101513 (див. попередній приклад), за винятком експресійних елементів, використовуваних для керування експресією гена сгуїСа.
Транскрипція сгуїСа СО5 у ррАВІТ01514 керується промотором бацилоподібного вірусу цукрової тростини з 1429 п.н. (5СВУ; Т7аїйіг еї аї., (1998) Ріапі Моїес. ВіоІ. 38:347-356). ОТ складається по суті з інтрону 6 гена алкогольдегідрогенази маїсу (ЗЕМВАМК номер реєстрації хХОо4049), із прилягаючими 20 основами екзону 6 і 11 основами екзона 7. Транскрипція цього гена термінується ріпі! З'ЮТК картоплі (Ап еї аї., (1989) Ріапі СеїІ. 1:115-122). Експресійні елементи, використовувані для контролю експресії генів сгу!Ра, сгутАб ї аайд1ї, є тими ж, як і використані в РОАВ101513. Таким чином, у межах ділянки Т-ДНК роАВ101514, яка складається 3 22586 п.н., три копії промотору ибії маїсу включають у цілому 5973 основ, організованих у вигляді З прямих повторів, кожен з яких складається з майже 2 т.п.н., причому кожен повтор на 10095 подібний до інших. Дві копії Рег5 З'ЮТК включають у цілому 730 основ, організованих у вигляді двох прямих повторюваних одиниць, причому кожна з них на 10095 подібна до інших, а три кодуючі ділянки сгу!Са, сгуї!Ра і сгутАр організовані у вигляді прямих повторів, які мають гомологію послідовності ДНК одна з одною від 6795 до 7395. У цілому Т-ділянка РОАВІ101514 включає приблизно 7695 послідовностей з високою повторюваністю, і фізична організація для зручності може бути зображена в такий спосіб:
КВ»промотор 5СВМ: осгуїСа СбОБ5:ріп! ЗОТК»промотор ШОБії: сгуїба СО5:Рег5
З'ТК»промотор Обрії сгутАб СО5:Рего З'ОТК»промотор ОбБі:ааа! СО5:Сір З'ОЮТЕІ В
Природа високої повторюваності цього конструкта необхідна для того, щоб завершити стадії клонування в штамі Е. сої для клонування 5ТВІ2'"М, який спеціально сконструйований для підтримки цілісності клонів, які містять такі послідовності ДНК із високою повторюваністю.
Плазміду ррАВ101514 уводили шляхом електропорації в електрокомпетентні клітини А. їштеїасіеп5 штаму ЕНАТО5 (який набув стійкості до стрептоміцину в результаті спонтанної хромосомної мутації), і стійкі до спектиноміцину/стрептоміцину ізоляти перевіряли за допомогою рестрикційного аналізу на предмет наявності інтактної плазміди РОАВ101514 перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80"С. Цей штам був названий
ЕНАТО5(рОАВ101514). Було виявлено, що численні індивідуальні культури з клітин
ЕНАТО5(ррАВ101514), отриманих із заморожених у гліцерині партій, містять перебудовані версії або версії з делеціями плазміди ррАВ101514. Для трансформацій маїсу збирали всі клітини штаму ЕНАТО5(рОАВ101514) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх за допомогою методів, розкритих у прикладі 13.
Плазміда ррАВ101514 була успішно введена шляхом електропорації в електрокомпетентні клітини А. їштеїасіеп5 штаму СА2552 (по суті штаму, який є версією, ЕНА1ТО05 з недостатністю
КесА) з отриманням штаму ОА2552(ррАВІ101514). Трансформанти, відібрані на основі стійкості до еритроміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80"С. Було виявлено, що численні індивідуальні культури з клітин, отриманих із заморожених у гліцерині партій, містять інтактну плазміду рРОАВІ101514. Збирали всі клітини штаму ОА2552(ррАВІ101514) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу за допомогою методів, розкритих у прикладі 13.
Плазміда рОАВІ101514 була успішно введена шляхом електропорації в клітини А. їмтеїасіеєп5 штаму ОАН3192 (штаму БА2552, який несе плазміду ррАВУ292) з отриманням
Зо штаму ОАН 3192(рОАВІ101514). Трансформанти, відібрані на основі стійкості до еритроміцину, канаміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -807С.
Було виявлено, що численні індивідуальні культури з клітин ОДИ13192(рОАВІ101514), отриманих із заморожених у гліцерині партій, містять інтактну плазміду РОАВ101514. Збирали всі клітини штаму ОАИЗ3192(ррАВІ101514) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу за допомогою методів, розкритих у прикладі 13.
Подібним чином було сконструйоване похідне роВ11 (човникового вектора супербінарної системи), яке містить ділянку Т-ДНК, аналогічну ділянці Т-ДНК ррАВІ101514. Декількаразові спроби сконструювати супербінарну плазміду за допомогою стандартних методів у
І ВА4404(рЗВІ) були невдалими. Усі спроби приводили до виділення коінтегративних плазмід на основі рЗВІ1 з великими перебудовами і делеціями.
Приклад 13: Трансформація маїсу штамами Адгобасіегішт, які несуть бінарні вектори рОрАВ101513 ії РОАВІ101514
Опосередковувана Адгорасіегчт трансформація маїсу. Насіння гібриду НІ-П ЕТ (Аптвігпд еї а!., (1991) Маї2е Сепеї. Соор. Мемузіє!ї. 65:92-93) висаджували в 5-галлонові (18,9 л) горщики, які містять суміш з 9595 середовища МЕТНАО-МІХ 360 для вирощування без грунту (ЗОМ СКО
НОКТІСОСТОКЕ; ВеПемие, МА) і 595 суглинного грунту. Рослини вирощували в оранжереї з використанням поєднання натрієвих і метал-галоїдних ламп високого тиску з режимом освітлення світло 16 годин:темрява 8 годин. Робили контрольоване перезапилення сестриних рослин з отриманням незрілих зародків 2 для трансформації. Колоски маїсу збирали через приблизно 8-10 днів після запилення, коли незрілі зародки мали розмір між 1,0 мм і 2,0 мм.
Інфікування і спільне культивування. Колоски маїсу очищали, і поверхню стерилізували за допомогою щітки і рідкого мила, занурення в 2095 наявний у продажі відбілювач (який містить 596 гіпохлориту натрію) протягом приблизно 20 хвилин і наступного триразового промивання стерильною водою. Суспензію клітин А. іштегїасіеп5, які несуть РОАВІО1513 або ррАВ101514, бінарні вектори, які містять три гени, які кодують білки ВІ СтуїСа, СгуїРа і СгутАБб і які містять маркерний ген селекції рослин аад-1, отримували перенесенням 1 або 2 петель бактерій (вирощених протягом 2-3 днів при 282С у середовищі агару з МЕР, яке містить відповідні бо антибіотики) у 5 мл рідкого середовища для інфікування (І 5 Ваза! Медішт (Гіпетаїег апа 5Косд,
(1965) РПпузіоіодіа Ріапіагит 18: 100-127) з вітамінами Мб (Спи еї аї., (1975) Зсієпіа 5іпіса 18:659-668), 1,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксіоцтовою кислотою (2,4-О3), 68,5 г/л сахарозою, 36,0 г/л глюкозою, 6 мМ І -проліном, р 5,21, яке містить 200 мкМ ацетосирінгону. Розчин перемішували до отримання однорідної суспензії, і концентрацію доводили до кінцевої оптичної густини приблизно 0,4 при 550 нм.
Незрілі зародки виділяли прямо в мікроцентрифугальну пробірку, яка містить 2 мл середовища для інфікування. Середовище видаляли і заміняли 1 мл розчину Адгобасіегіцй п, і розчин Адгорасіегішт/зародок інкубували протягом від 5 до 10 хвилин при кімнатній температурі. Після цього зародки переносили в середовище для спільного культивування (І 5
Ваза! Медіит, вітаміни Мб, 1,5 мг/л 2,4-0, 30,0 г/л сахарози, 6 мМ І-пролін, 0,85 мг/л ЛоМО», 2,8 г/л ЗЕ 'АМ СОМ'М (РНУТОТЕСНМОГ ОС І АВОБАТОРВІЕ5; І епеха, КБ), рН 5,8), яке містить 200 мкМ ацетосирінгону, і культивували протягом 3-4 днів при 202С у темряві.
Після спільного культивування зародки переносили в заспокійливе середовище, яке містить солі М5 і вітаміни (Ргате єї аЇ., 2011 , Сепеїйс Тгапетоптайоп Ов5іпа Маїге Іттаїйшге 7удоїїс
Етбгуо5. В: Ріапі Етргуо Сийиге Меїпод5 апа Ргоїосоїб5: Меїйоаз іп МоїІесшіаг Віоіоду. Т. А.
ТНогре апа Е. б. Уеипо, (Едз), БРВІМСЕВ 5СІЕМСЕ АМО ВОБІМЕЗ5 МЕПІА, 1 І С. рр 327-341), 6
ММ С-проліну, 100 мг/л міо-інозиту, 500 мг/л МЕ5 (2-(М-морфоліно)етансульфокислоти моногідрату; РНУТОТЕСНМОЇГ ОСІЕЗ І АВЕ.), 30 г/л сахарози, 1,5 мг/л 2,4-0, 0,85 А9МО», 250 мг/л цефотаксиму, 2,8 г/л ЗЕ АМ СОМ", р 5,8. Через приблизно 7 днів зародки переносили в те ж середовище з добавкою 100 нМ галоксифопу. Трансформовані ізоляти були ідентифіковані через приблизно 8 тижнів і були об'єднані шляхом перенесення у свіже селективне середовище з 2--тижневими інтервалами для регенерації й аналізу.
Регенерація й отримання насіння. Для регенерації культури переносили в середовище для індукції "28" (солі М5 і вітаміни, 30 г/л сахарози, 5 мг/л бензиламінпурину, 0,25 мг/л 2,4-0, 250 мг/л цефотаксиму, СЗЕГГАМ СОМ'М, р 5,7) з добавкою 100 нм галоксифопу. Інкубація відбувалася протягом 1 тижня в умовах слабкого освітлення (14 мкЕйнштейн'м'":сек") і потім протягом 1 тижня в умовах сильного освітлення (приблизно 89 мкКЕйнштейн:м: сек"). Тканини потім переносили в середовище для регенерації "36" (таке ж, як середовище для індукції, крім відсутності регуляторів росту рослин). Коли проростки досягали довжини від З см до 5 см, їх
Зо переносили в скляні пробірки для культивування, які містять середовище 5НОА (солі і вітаміни
Ззспепк апа НіїдЗебгапаї, РНУТОТЕСНМОЇ ОСІЕЗ І АВК.), 1,0 г/л міо-інозиту, 10 г/л сахарози і 2,0 г/л СЕП АМ СИМ'"М, р 5,8), для забезпечення подальшого росту і розвитку пагонів і коріння.
Рослини переносили на ту ж грунтову суміш, що й описана раніше, і вирощували до цвітіння в оранжереї. Збирали зразки тканин рослини і використовували в біотестах з комахами за допомогою методів, розкритих у прикладі 14, і для молекулярних і біохімічних аналізів.
Фахівці в галузі техніки трансформації маїсу повинні розуміти, що для трансформації маїсу і добору трансформованих рослин придатні інші методи при використанні інших експресованих маркерних генів селекції рослин (наприклад, генів стійкості до гербіцидів).
Приклад 14: Іп міїго біотести зразків листя проти комах-шкідників маїсу
Аналізованими видами лускокрилих були кукурудзяна щипавка (СЕМУ; Неїїсомегра 7єа (Водаїє)), кукурудзяний метелик (ЕСВ; Озігіпіа пибіїайв (Нибпег)) і трав'яна совка (ЕАМУ;
Зродорієга їгидірегда (У.Е. Зтійй)). Яйця цих комах були отримані від ВЕМ2ОМ КЕЗЕАКСН (Сапізіє, РА).
Біотест першого рівня: Високопродуктивний 96-ямковий біотест. 96-ямкові планшети (ТРР- 5; 5. Гоці5, МО) частково заповнювали 295 розчином агару (БІСМА-АГОКІСН), і давали агару застигнути. За допомогою стандартного ручного пробійника для паперів готували по три зразки дисків з листя діаметром 1/8 дюйма (3,2 мм) для кожного з двох видів комах (СЕМ ії РАМУ), які тестуються у цьому форматі. Один диск листка вміщували в одну ямку 96-ямкового планшета; використовували три планшети для кожної тестованої комахи (один для кожної репліки/диск листка). Для введення яєць комахи в кожну ямку 96-ямкового планшета використовували пристрій для висівання яєць. Планшети потім закривали перфорованими клейкими кришками, а також накривали пластиковою кришкою, прикладеною до планшета. Планшети витримували при 309, 4095 відносної вологості (КН) в режимі освітлення 16 годин світло:8 годин темрява протягом трьох днів. Класифікацію проводили з використанням шкали 0-1-2, у якій 0 позначає ушкодження «2595 диска листка, 1 позначає ушкодження 25-5095 диска листка, а 2 позначає ушкодження 25095 диска листка в кожній ямці. Показники ушкодження для кожного тесту усереднювали і використовували в парі з аналізом експресії білка для проведення кореляційного аналізу. Активними проти шкідника, який тестується, вважали рослини з показником ушкодження комахою 0,67 або менше.
Біотест другого рівня: 32-ямковий біотест. 32-ямкові планшети (0-0 ІМТЕВМАТІОМАЇ ;
Рійтап, М)) частково заповнювали 295 розчином агару, і давали агару застигнути. З кожної рослини брали фрагменти листків розміром приблизно 1 квадратний дюйм (6,45 см") і вміщували по одному в ямки 32-ямкових планшетів. У кожну ямку вміщували один шматочок листка, і тестували по два шматочки листка на одну рослину і на одну комаху. Комахи (СЕМУ і
ЕАМ) у масовому порядку переносили за допомогою кисті, поміщаючи в кожну ямку по 10-20 новонароджених личинок. Планшети закривали перфорованими клейкими кришками, які забезпечували вентиляцію під час тестування. Планшети витримували при 282С, 4095 КЕН при режимі освітлення 16 годин світло-:8 годин темрява протягом трьох днів. Після закінчення тестування для кожного шматочка листка отримували показник простого відсотка ушкодження.
Показники ушкодження для кожного тесту усереднювали і використовували в парі з аналізом експресії білка для проведення кореляційного аналізу. Активними проти шкідника, який тестується, вважали рослини із середніми оцінками ушкодження комахою 2595 або менше.
Статистичний аналіз. Всі аналізи проводили в МР 8.0.2 (БАЗ ІМ5ТІТИТЕ Іпс., Сагу, Могій
Сагоїпа). Для виявлення значимих розходжень між впливами і рослинами негативного контролю для даних з ушкодженням комахою використовували односторонній аналіз АМОМА.
Для подальшої оцінки значимих розходжень між впливами також використовували метод Такі-
Крамера НБЗО порівняння середніх значень. Крім того, для аналізу кореляції між кількістю експресованого білка і вимірами активності комах використовували лінійний регресійний (метод найменших квадратів) аналіз.
Результати біотестів підсумовані в таблиці 2.
Приклад 15: Біохімічна і молекулярна характеристика тканин маїсу, трансформованих рорАВ101513
Були проведені численні експерименти по трансформації сконструйованими штамами А. Штеїасієпе ЕНАТО5(рОАВІ101513), ЮА2552(рраАВ101513) і САИ3192(ррАВ101513). Кількість копій чотирьох трансгенів у трансгенних рослинах То була встановлена за допомогою тестів гідролізу зондів (Вибпег апа Ваїдм/п, (2004) Ріапі Се! Кер. 23:263-271) з використанням специфічних для генів олігонуклеотидів. Білкові екстракти з рослин, які містять від 1 до З копій ("низька копійність") генів, додатково перевіряли на предмет продукції білків ВІ СтуїСа, СтуїГРа і
Зо СтутАБ і білка ААОІ за допомогою методів ЕГІЗА з використанням наявних у продажі наборів антитіл (ЕММІВОГ ОСІХ "М, Ропапа, МА). Були виявлені рослини, які продукують усі чотири білки (таблиця 3). Крім того, шматочки листків рослин піддавали біотестуванню на предмет активності проти трьох комах-шкідників маїсу: кукурудзяної щипавки (СЕМУ, Неїїсомегра 7еа), трав'яної совки (БАМУ, Зродоріега їШшидірегда) і європейського кукурудзяного метелика (ЕСВ, Об5ггіпіа пибіїайб) у тестах поїдання (приклад 14). Були виявлені рослини, які містять усі чотири трансгени в малій кількості копій, продукують усі чотири білки і мають активність проти всіх трьох комах-шкідників (таблиця 4). В експериментах зі штамами ЕНАТО5(ррАВІ101513) або раі2552(ррадВ101513) не було отримано трансформованих рослин, які не відповідали цим критеріям (таблиця 4). Таким чином, особливістю штаму ОА13192, який має делецію хромосомного гена гесА, який додатково включає повний набір генів міг з ртіво542, який міститься на ртіЕеЕНАТО5, і також який додатково включає частковий набір генів міг ртіво542, який міститься у фрагменті 14,8 Крпі МігіВСОс вектора ррАВУО292, служить те, що він здатний ефективно продукувати трансформовані рослини маїсу з великими ділянками Т-ДНК, які складаються з елементів послідовності з високою повторюваністю.
Приклад 16: Біохімічна і молекулярна характеристика тканин маїсу, трансформованих рорАВ101514
Були проведені численні експерименти по трансформації сконструйованими штамами А. їштетасіеп5 ЕНАТО5(рОАВІ101514), БА2552(ррдіВ101514) і ВАИЗ3192(ррАВІ101514). Кількість копій чотирьох трансгенів у трансгенних рослинах То була встановлена за допомогою тестів гідролізу зондів (Вирпег апа ВаїЇдм/п, вище) з використанням специфічних для генів олігонуклеотидів. Білкові екстракти з рослин, які містять від 1 до З копій ("низька копійність") генів додатково перевіряли на предмет продукції білків ВІ СтуїСа, СтуїРа і СтутАБбБ і білка ААО1 за допомогою методів ЕГІ5А з використанням наявних у продажу наборів антитіл (ЕММІВОГ ОСІХ'"М, Ропшапа, МА). Крім того, шматочки листків рослин піддавали біотестуванню на предмет активності проти трьох комах-шкідників маїсу в тестах поїдання (приклад 14). Були виявлені рослини, які містять усі чотири трансгени в малій кількості копій, продукують усі чотири білки і мають активність проти всіх трьох комах-шкідників (таблиця 5). В експериментах зі штамами ЕНАТО5(ррАВ101514) або ОАД2552(ррАВ101514) не було отримано трансформованих рослин, які не відповідали цим критеріям. Таким чином, особливістю штаму ОДН 3192, який має 60 делецію хромосомного гена гесА, який додатково включає повний набір генів міг з ртіво542,
який міститься на ртіЕНАТО5, і також який додатково включає частковий набір генів міг ртіВво542, який міститься у фрагменті 14,8 Крпі МВСрО вектора ррАВеО292, служить те, що він здатний ефективно продукувати трансформовані рослини маїсу з великими ділянками Т-ДНК, які складаються з елементів послідовності з високою повторюваністю.
Приклад 17: Ідентифікація і характеристика нейтрального сайту інтеграції в хромосомі
Адгобасієтійт Штеїасівпз5 І ВА4404
Індукований у рослині локус рісА/ра!І хромосоми штаму С58 А. ішптеїасіеп5 (ЗЕМВАМК номер реєстрації АЕ0009243) був ідентифікований як несуттєвий ген, у який можуть бути інтегровані фрагменти ДНК (Копо еї аї., (1990) 9. Васіегіо!Ї. 172:5828-5836; Нопа еї а!., (1991) 9. Васіегіо)!. 173:5110-5120). Про схожий нейтральний сайт інтеграції в геномі штаму І ВА4404 А. їшптеїасієп5 не повідомлялося. У даному описі заявники описують ідентифікацію і секвенування геномної ділянки І ВА4404, яка включає послідовності з частковою гомологією локусу рісА/роа! С58.
Клітини ГВА4404 (ІММІТКОСЕМ) вирощували в середовищі УМ (г/л: дріжджовий екстракт, 0,4; маніт, 10; масі, 0,1; Мо5О»х 7НгО, 0,2; К"НРО»Х ЗНО, 0,5) при 302С протягом ночі. Геномну ДНК отримували з 1 мл культури за допомогою набору ЕАБУ ОМА (ІММІТКОСЕМ) відповідно до протоколів виробника. Були сконструйовані вироджені праймери на основі двох ділянок гомології між послідовністю білка РісА С58 і гомологами, виявленими в Агабрідорвзі5 Шаїїапа,
Са!дісеїПиІозігиріог засспагоїуїйсив, АїКаїїрпйи5 теїаїйгедідепеб5 і Сіобігідішт асетюоршуїсит.
Геномну ДНК І ВА4404 використовували як матрицю для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) із застосуванням НЕЕСШОГАБЕ"М МАБЗТЕРВ МІХ (ЗТЕАТАСЕМЕ; Зап Оіедо, СА) і вироджених праймерів АйпійїРа (5-САСАСТОСМААТАС5ОАМОС-3; 5ЕБЕО ОО МО:14; відповідного амінокислотам 273-279 білка РісА С58) і АпіїзК (5-атУгзАСМСаБАСЗОССЗСЯнТОоВИТ-3;
ЗЕО ІЮО МО:15, який відповідає комплементарному ланцюгу, який кодує амінокислоти 364-369 білка РісА С58). Використовували наступні умови термоциклу: 1 цикл 949С, 2 хв; 25 циклів (949С,
ЗО сек; 5590 30 сек; 7220, 60 сек); 1 цикл 722С, 7 хв. Позначення вироджених нуклеотидів у послідовностях праймерів відповідають нуклеотидам ДНК у такий спосіб: М - А, С, з або Т; М -
ТабосС;к А або со; і 5 - С або б. Був виділений продукт із 285 пар основ (п.н.), клонований у вектор рСК2.1-ТОРО (ІММІТКОСЕМ) у клітинах Езспегіспіа соїї ТОР 10 (ІММІТКОСЕМ), і була визначена послідовність ДНК. Було виявлено, що послідовність гомологічна, але не ідентична ділянці гена рісА С58 (8595 ідентичність послідовності), і геномна ділянка І ВА4404, яку вона представляє, позначається в даному описі як фрагмент піїА.
Були сконструйовані додаткові праймери, комплементарні фрагменту з 285 п.н. пПА
І ВА4404, для використання як якорі при ампліфікації за допомогою ПЛР геномних фрагментів, які примикають по обидва боки до послідовності з 285 п.н. У реакціях ПЛР їх використовували в парах із праймерами, сконструйованими на основі послідовностей фланкуючих ділянок гена ріс С58. Були визначені послідовності ампліфікованих фрагментів, які беруть початок від послідовності з 285 п.н. і розширених в обидва боки, які примикають до фрагмента піїА, і використані для конструювання інших праймерів для наступних реакцій ПЛР. При використанні матриці геномної ДНК І ВА4404 із праймерами піА2Е (5'ЄССАТОСТСАТААСАССАССТ-3 5ЕО
ІО МО:16) і під2к (5-єСАСАТСАТССПСАТАСОСАССА-3" 5ЕО ІЮ МО':17), був отриманий фрагмент
ПЛР із приблизно 2 тисячі основ (т.п.н.), який був клонований у РСЕФ-ВІ ОМТ П/ХІ-ТОРОФ з використанням набору для клонування ТОРО ТА (ІММІТКОСЕМ) з отриманням плазміди рроммуЗ719 (Фіг. 2). Аналіз послідовності уставленого фрагмента рромуз719 дав послідовність з 1796 п.н. (ЗЕО ІЮ МО:18), яка включає найбільш довгу відкриту рамку зчитування (ОРЕ), яка кодує передбачуваний білок з 531 амінокислот. Більш коротка ОКЕ у тій же рамці зчитування кодує передбачуваний білок з 523 амінокислот. Передбачуваний білок з 523 амінокислот
І ВА4404 має 8895 подібність, 8595 ідентичність з білком РісА С58. Послідовності, які кодують, для передбачуваного білка з 523 амінокислот І ВА4404 і білка РісА С58 мають 8195 ідентичність.
Таким чином, фрагмент піА І ВА4404 являє собою геномний сегмент, який включає передбачуваний ген, істотно дивергуючий від гена рісі С58. У даному розкритті геномна послідовність з 1,8 т.п.н., представлена ЗЕО ІЮ МО:18, позначається як локус піІА.
Як очікується, плазміда ророОУууУЗ719, яка містить точку початку реплікації соїЕї1, не реплікується автономно в клітинах А. (Шштеїасіеєп5. ДНК плазміди рроууЗ719 використовували для трансформації штаму І ВА4404 А. Шштегасіеп5 шляхом електропорації. Відбір по стійкості до канаміцину (яка носиться ррому3719) виявив трансформанти з рроууз719, інтегрованої в хромосому І ВА4404 за допомогою рекомбінації, опосередкованої ділянками гомології з 1,8 т.п.н., які є в хромосомі І ВА4404 і рромуз719. Таке явище інтеграції веде до створення лінійної копії послідовності плазмідного вектора рроОууЗ3719, оточеної по обидва боки відтепер дуплікованою ділянкою гомології з 1,8 т.п.н. Трансформанти І ВА4404 зі стійкістю до канаміцину бо були виділені і піддані скринінгу на наявність вставки РООУУЗ3719 за допомогою аналізу ПЛР. Як матрицю використовували препарати геномної ДНК трансформантів з 5 наборами праймерів: Її) праймера МІЗЕ у парі з праймером МІЗЕК, який примикає до вставки в РООМУЗ719, ії) праймера
МІЗЕ у парі з праймером АБАК (який включає основи, комплементарні залишкам з 1041 по 1060
ЗЕБЕО ІЮО МО: 18), ії) праймера МІЗЕ у парі з праймером АБІОК (який включає основи, комплементарні залишкам з 1320 по 1337 5БО ІО МО: 18), їм) праймера МІЗЕ у парі з праймером А5І11К (який включає основи, комплементарні залишкам з 1391 по 1406 5ЕО ІЮ МО: 18), і м) праймера МІЗК у парі з праймером АБОЕ (який включає основи з 634 по 649 5ЕО ІВ
МО: 18). У контрольних реакціях усі ці набори праймерів ампліфікували фрагменти очікуваного розміру при використанні в якості матриці ДНК плазміди РООМУЗ719. Однак, коли як матрицю використовували геномну ДНК зі стійкого до канаміцину трансформанту І ВА4404, ПЛР. із використанням пари праймерів МІЗЕ їі МІЗК не дала ампліфікованих продуктів, що вказує на те, що інтактна (неінтегрована) ДНК плазміди рроуузЗ719 не очищалася разом з геномною ДНК.
Аналіз ПЛР зразків геномної ДНК із чотирма іншими парами праймерів показав утворення фрагментів ДНК очікуваного розміру. Ці результати вказують на те, що стійкість до канаміцину трансформантів І ВА4404 забезпечується ДНК рроууз3719, яка була інтегрована в геном.
Один такий трансформант (ГВА4404піА-іпи| був використаний для перевірки явища, яке полягає в тому, що геномна вставка в локус піА включає здатність штаму трансформувати
Агарідорзів ІПайіапа. Бінарним вектором ррАВЗ779, який містить експресований у рослинах ген, який кодує білок РАТ (який додає стійкості до гербіциду ВА5ТА"М), трансформували клітини штамів І ВА4404піїА-іпи і | ВА4404 з відбором по стійкості до спектиноміцину. Ці штами потім використовували для проведення експериментів із трансформацією Агабрідорвхі5 з використанням методів УМУеіїдеІ апа СіІалергоокК (вище). Різниці в частоті трансформації, отримуваної для двох штамів, не спостерігалося. Таким чином, особливість варіантів здійснення і методів, описаних у даному описі, полягає в тому, що вставка фрагмента чужорідної ДНК у хромосомний локус піїА штаму І ВА4404 А. ішптегасієп5, який включає ЗЕО ІЮ МО: 18, не робить впливу на ріст рослини або здатність рослини до трансформації таким сконструйованим штамом.
Приклад 18: Конструювання суїцидного похідного РООМУЗ719 для інтегрування в локус піА
І ВА4404
Зо Вставка сайту множинного клонування в локус піПА, клонований у рОроОУуУЗ719, була здійснена за допомогою ПЛР із подовженням за допомогою сплайсингового перекриття (ЗОЕ) (Нопоп еї аї., (1990) ВіоТесппіднез 8:528-535). Реакції ПЛР БОЕ проводили з використанням
НЕАКСШІАБЕТМ тавзіег тіх відповідно до протоколів виробника. Частину локусу піПА ампліфікували з використанням ДНК рроууУЗ19 як матрицю з праймером ппАб (5- сса,аасТсТсСАастосСТСАТаСАССААСААСОСАСАААСОАСОо-3 ЗЕБЕО ІЮ МО: 19) у парі з праймером ПА МО 5ОЕБ (5-
СААТастаАААССТОТАСАТТААТТААСаАтТосССасваТАССО,ААААаСССсаАСАТТОС-3 ЗЕО
ІЮ МО:20) з отриманням фрагмента з приблизно 800 п.н. Другу частину локусу піА ампліфікували з використанням ДНК рроууЗ719 як матрицю і праймера піІА МО5 5ОЕБ (5- всСААТОТСССООСТТтОосатАсССа,ааапАТОСТТААТТААТСТАВАСИ ТТ САССАТТО-3; ЗЕО
ІО МО:21) у парі з праймером піїдЗ3' (5-а4СйААТТоТоАасСТаастт ТтсАТтасат т ттотоса-3 5ЕО ІЮ
МО:22) з отриманням фрагмента з приблизно 900 п.н. Отримані фрагменти потім очищали в гелі (МОСГЕОБРІМ'М, СІГОМТЕСН; Моипіайп Міем, СА) і використовували як матрицю для ампліфікації з праймерами піїд5' і піАЗ' з отриманням фрагмента з 1,6 т.п.н., послідовність якого розкрита як ЗЕО ІЮ МО:23 (піА МО5). Отриманий фрагмент гідролізували за допомогою
Рми І ї Бар І (МЕВ) і лігували з використанням ДНК-лігази Т4 (МЕВ) із ДНК рво5КазасвВІ (ІММІТКОСЕМ), гідролізованої тими ж самими ферментами рестрикції. Клітини Е. соїї ТОР1О трансформували сумішшю лігування, і трансформанти відбирали на агарі із соєю ЇВ ТЕКМОМА;
Ноїйїстег, СА) з добавкою 30 мкг/мл хлорамфеніколу. Клони піддавали скринінгу за допомогою рестрикційного гідролізу з використанням Рми І і Крп І (МЕВ). Ділянка локусу піїд позитивних клонів була підтверджена секвенуванням, і отримана плазміда була названа рромуз3721.
Особливість РООУУ3721 полягає в тому, що до сайту множинного клонування (МСО5), який містить послідовності, пізнавані ферментами рестрикції 5рі І, Крп І, Зта І, Ватн І, Рас І, Азе | ї
Хра І, примикає з однієї сторони послідовність І ВА4404 з 852 п.н., а з іншої сторони послідовність І ВА4404 з 745 п.н.
Таким чином, фрагмент чужорідної ДНК може бути клонований у МС5 рромуз3721 і, отже, інтегрований у хромосомний локус пИПА І ВА4404 шляхом гомологічної рекомбінації, опосередковуваної фланкуючими послідовностями з І! ВА4404. Одиночні події кросовера, за допомогою яких уся послідовність плазміди рромууУЗ721 інтегрується в хромосому І ВА4404, бо можуть бути розділені на подвійні події кросовера за допомогою зворотної селекції на середовищах, які містять сахарозу. На таких середовищах сахароза перетворюється в токсичний продукт після ферментативного розкладання під дією білка ЗасвВв, кодованого геном засв (Кеїд апа СоПтег, (1987) Сепе 57:239-246; Оцапаї еї аї!., (1993) Сепе 127:15-21). Таким чином, трансформанти, здатні виживати на середовищі вирощування, яке містить сахарозу, повинні бути піддані другій події кросовера, яке видаляє основу векторної плазміди рРООМУЗ721 із хромосоми і залишає зруйнований локус піїА, який містить інтегрований фрагмент чужорідної
ДНК. У багатьох повідомленнях за останні 10 років було показано, що перенесення послідовностей основи вектора є повністю звичайним явищем. Частина рослин із придбаними послідовностями основи вектора в трансформантах звичайно варіювала між 2095 і 5095 і іноді досягала 7595 або більше.
У якості одного приклада придатності ррОМуУЗ721 був отриманий фрагмент 14,8 Крпі мМігВСООо із плазміди рО5ВІ і лігований за допомогою ДНК-лігази Т4 із ДНК рроууз721, гідролізованої Крпі. Клітини Е. сої ТОРІО трансформували сумішшю лігування, і трансформанти відбирали на агарі із соєю ЇВ з добавкою 30 мкг/мл хлорамфеніколу. Клони були піддані скринінгу за допомогою рестрикційного гідролізу ЕсомМ І ї Ніпа І. Отримана плазміда була названа РООМУЗ722.
Приклад 19: Ідентифікація нуклеотидних послідовностей вище і нижче піїд
Штам І ВА4404піА-їпИ А. ішптегасіеєп5, який містить інтегровану в геном плазміду РООМУЗ719 (Фі. 2 і приклад 18), використовували для ідентифікації додаткових послідовностей, розташованих вище і нижче геномної ділянки під. ррому3719 містить ПЛР амплікон з 1796 п.н. локусу піА штаму ІВА4404 А. ішптеїасіеп5, клонованого в РСК-ВГОМТ ТИХІ -ТОРОФ (ІММІТКОСЕМ). Ця плазміда була інтегрована в геном штаму І ВА4404 А. Штеїасієп5 за допомогою гомологічної рекомбінації. Колонії, які містили інтегровану плазміду, були ідентифіковані по стійкості до канаміцину (приклад 17). Інтегрована плазміда й елементи, які містяться в ній, можуть бути використані як інструменти для виділення і характеристики додаткових нуклеотидних послідовностей методом "порятунку плазміди".
Геномну ДНК (ГгДНК) отримували з клітин штаму І ВА4404піА-іпи відповідно до протоколу виділення бактеріальної геномної ДНК (Затьгоок еї а!., вище). Один мікрограм гДНК роздільно гідролізували наступними ферментами (усі отримані від МЕВ): Ніпа Ії, Ватн І, Рої І, Авс І і зас
Зо ІП. Ці ферменти рестрикції були обрані спеціально для отримання фрагментів гДНК, які розташовані вище і нижче локусу піА. Ферменти рестрикції Ніпа ІП, Ваптн І ї Реї І були обрані тому, що пізнавані ними сайти унікальні в послідовності РООУУЗ3719. Більше того, ці пізнавані ферментами сайти розташовані в ділянках сполуки ампліконового фрагмента локусу піїйА і вектора РСК-ВГОМТ /ХІ-ТОРОФ (Фі, 2). Розщеплення гДНК цими ферментами (і, самолігування отриманих фрагментів приводить, таким чином, до порятунку фрагмента плазміди, який містить неохарактеризовані геномні послідовності, ліговані поруч із сайтами зв'язування прямого універсального праймера М13 або зворотного універсального праймера
М13 плазміди рроууУЗе17. Такі клони виділлють шляхом трансформації сумішшю лігування клітин Е. сої з відбором по гену стійкості до канаміцину, який несеться РООМУЗ917.
Крім того, плазміда рРООМУЗ719 не містить сайти, пізнавані ферментами рестрикції Авс І і зас
ІІ. Тому фрагменти ГгДНК, створювані цими ферментами рестрикції, повинні давати гібридний фрагмент ДНК, який охоплює всю довжину послідовності інтегрованої плазміди рромуузЗ719 і включає ділянки ГДНК, які примикають по обидва боки до інтегрованого плазміді РООМУЗ719.
Фрагменти гДНК, отримані в результаті гідролізу ферментами рестрикції, як описано вище, самолігували за допомогою лігази 714 (КОСНЕ АРРІЇТЕЮО ЗСІЕМСЕ5; Іпаїіапароїї5, ІМ).
Продуктами лігування трансформували клітини Е. сої ОМЕЗНОТФ ТОРІ10 (ІММІТКОСЕКМ), і клітини висівали на середовище І В, яке містить канаміцин (50 мкг/мл). Відбирали індивідуальні колонії, і плазмідну ДНК виділяли і характеризували по патернам гідролізу ферментами рестрикції плазміди. Клони, які містили плазміди, які виявляють узгоджуваний один із одним патерн смуг після гідролізу ферментами рестрикції, відокремлювали для використання в реакціях секвенування.
Нуклеотидні послідовності ГДНК вище і нижче локусу піїА визначали за допомогою методу "прогулянки по геному". Були сконструйовані секвенуючі праймери, які відповідають відомій послідовності ГДНК (яка присутня у рроОмУЗ719), і використані з набором СЕО7М ОМЕ
ТЕКМІМАТОК СУСІЕ БЕОШЕМСІМО відповідно до рекомендацій виробника (ВЕСКМАМ
СОЦІ ТЕК; Ешіепоп, СА). На основі виявленої послідовності був сконструйований другий ряд праймерів, розташованих у раніше невідомої геномної послідовності, і ці праймери були використані для отримання додаткових даних секвенування. Цей процес повторювали доти, поки не була визначена вся наявна нуклеотидна послідовність ГДНК. Цей метод дав 2936 п.н. бо послідовності вище локусу піїА і 4361 п.н. послідовності нижче локусу пііА. Разом з 1796 п.н.
раніше ідентифікованого локусу піїА вперше ідентифіковані послідовності фланкуючих зверху і знизу ділянок охоплюють послідовність з 9093 п.н., яка включає геномну ділянку піА (ЗЕО ІЮ
МО:24), яка поширюється в обох напрямках від початково ідентифікованого локусу пійА.
Приклад 20: Конструювання вектора для інтегрування в геномну ділянку піїА І ВА4404
Був сконструйований і створений інтеграційний вектор для опосередковуваної гомологією інтеграції послідовностей чужорідної ДНК у геномну ділянку під А. іштеїасіеп5 ІВА4404.
Фрагмент із 6,3 т.п.н. геномної ділянки піПА, який охоплює локус піїА, ампліфікували за допомогою ПЛР із використанням набору для ПЛР РАЇЇ.ЗАРЕ"М (ЕРІСЕМТРЕФ, Мадізоп, УМ).
Ампліфікований фрагмент лігували у вектор РСКФВ/ЗМИТОРОФ (ІММІТКОСЕМ), і позитивні клони були підтверджені за допомогою гідролізу ферментами рестрикції і перевірки послідовності ДНК. Отриманий вектор, ррАВеОб15, був додатково модифікований додаванням олігонуклеотидного фрагмента, який містить множину унікальних сайтів впізнавання ферментами рестрикції. Ці сайти рестрикції, оточені ділянками з 3244 п.н. і 3128 п.н. геномної ділянки пі, служать у якості сайтів клонування для введення чужорідних нуклеотидних послідовностей. Отриманий вектор був названий рраАвВоеб18 (Фіг. 3).
Фрагмент із 15549 п.н., який містить фрагмент 14,8 Крпі мігВСОс з рзавВІ і бактеріальний ген стійкості до канаміцину, отримували шляхом гідролізу ДНК ррАВеО292 за допомогою Крп І плюс
В5И107 І. Цей фрагмент потім лігували з ДНК ррАВОб18, яка була гідролізована Крп І плюс Зу/а
І, з отриманням вектора ррАВеОб621 (Фіг. 3). Потім використовували реакцію САТЕУУАУФ для переміщення частини ррАВОб621, яка містить 14,8 Крпі мігВвСОро і бактеріальний ген стійкості до канаміцину й оточеного з кожної сторони послідовностями з З т.п.н. геномної ділянки піА
ІВА4404, у вектор САТЕУМАМФ РОЕБЗТ"М14 за допомогою реакції АМ І-К СГОМАБЕФ (ІММІТКОСЕМ). Отримана плазміда, ррАВеОб698 (Фіг. 3, ЗЕО ІЮО МО:25), була підтверджена за допомогою гідролізу ферментами рестрикції і реакцій секвенування ДНК. ррАв9698 служила як інтеграційний вектор для інтегрування генів міг з ртіВо542 р5ВІ1 (які знаходяться у фрагменті 14,8 Крпі мігВСОс) у хромосомну ділянку піїА штаму І ВА4404 А. Тшптегасієпв.
Приклад 21: Хромосомна інтеграція фрагмента 14,5 Крп!І Міг«ВСОсС за допомогою гомологічної рекомбінації
ДНК плазміди ррАВе9б698 отримували з використанням набору МОСС ЄЕОВОМОФ АХ АМІОМ
Зо ЕХСНАМОЕ СНАОМАТОСВАРНУ РІ АБЗМІОЮО ОМА ІБЗОЇГАТІОМ (МАСНЕКЕХ-МАСЕМ). Очищену плазмідну ДНК електропорували в клітини І ВА4404 А. їшптегтасіеп5 (ІММІТКОСЕМ). Коротко, 500 нг плазмідної ДНК інкубували з клітинами при 42 протягом 10 хвилин. Цю суміш переносили піпеткою в охолоджену на льоді 0,2 см кювету СЕМЕ РОЇ 5ЗЕКФ (ВІО-КАВ) і електропорували за допомогою ВІО-КАО СЕМЕ РИОЇЗЕК при наступних установках: вихідна ємність 25 мкФ, розширник ємності 960 мкФ, опір 200 Ом і напруга 2,5 кВ. Відразу після електропорації додавали 950 мкл середовища ОС (ІММІТКОСЕМ), і суміш переносили в пробірку РаЇсоп 2059 (ВЕСТОМ ОІСКІМ5БОМ АМО СО.; ЕгапКійп ІїаКе5, МУ). Після цього трансформовані клітини інкубували при 282С протягом від 5 до 6 годин. Після інкубації клітини висівали на окремі чашки із середовищем МЕР, яке містить канаміцин (50 мкг/мл). Чашки вирощували в переверненому стані при 282С протягом від 36 до 48 годин. Одиночні колонії відбирали і розмножували в 5 мл рідкого середовища УЕР, яке містить канаміцин (50 мкг/мл), протягом приблизно 36 годин при 282С. Ці культури використовували для отримання партій культур у гліцерині шляхом ретельного перемішування з рівним об'ємом 10095 стерильного гліцерину з наступним заморожуванням і збереженням при -802С.
Приклад 22: Фенотипічне і молекулярне підтвердження хромосомної інтеграції фрагмента 14,68 Крпі міг«ВСЮОС
Як очікується, ррАВОб98, який містить точку початку реплікації соЇЕЇї, не реплікується автономно в клітинах А. іштеїасіеп5. Після трансформації клітин І ВА4404 ДНК ррАвеб698 стабільна стійкість до канаміцину виникає в результаті інтеграції ДНК ррАВеОб698 в автономно репліковані генетичні елементи Адгобасіегіит. Ці плазмідні інтегранти звичайно поділяються на чотири класи, які можуть бути використані відповідно до різних варіантів здійснення штамів
Адгорасіегішт і методами їхнього використання, як описано в даному описі. Перший клас включає клітини, у яких ДНК ррАВоОб698 інтегрована в сайт, віддалений від геномної ділянки піїА, за допомогою негомологічної рекомбінації. Ці клітини повинні бути стійкі до канаміцину завдяки гену стійкості до канаміцину, розташованому поруч із фрагментом 14,8 Крп! МіїВСОО, і додатково стійкі до ампіциліну завдяки гену стійкості до ампіциліну, який міститься в основі вектора ррадвВв9об698 (ррЕБТ"М14). Другий клас включає клітини, у яких ДНК рраАвоб98 інтегрована в автономно репліцюючу допоміжну плазміду рАЇї 4404 Ті (у природних умовах яка є резидентною у І! ВА4404) за допомогою гомологічної рекомбінації, опосередковуваної генами 60 мМігвВСОрОо з ртіВо542, які знаходяться на ррАВОУб698, і генами МігВСОС з ртіАсСНЬ5, які знаходяться на рАЇ 4404. Ці клітини також повинні бути стійкі і до канаміцину, і до ампіциліну.
Третій клас включає клітини, у яких ДНК ррАВоОб698 інтегрована в геномну ділянку піїА І ВА4404 за допомогою одиночної події гомологічної рекомбінації (кросовера), опосередковуваного або послідовностями геномної ділянки піА із приблизно З т.п.н., які знаходяться на рраВеОб698 і примикають до фрагмента з 15549 п.н., який містить фрагмент 14,8 Крпі мігВСОО з рев і ген стійкості до канаміцину. Ці клітини також повинні бути стійкі і до канаміцину, і до ампіциліну.
Четвертий клас включає клітини, у яких одиночна подія кросовера клітин зазначеного вище класу З піддається другій події кросовера, опосередковуваного відтепер дуплікованими послідовностями геномної ділянки пі з З т.п.н., які виникли в результаті одиночної події кросовера. Залежно від того, яка з послідовностей, які примикають до геномної ділянки піїйА з З т.п.н., викликала одиночну подію кросовера, і яка з цих послідовностей, які примикають, викликає другу подію кросовера, отримані клітини повинні бути або чутливими до канаміцину і стійкими до ампіциліну, або стійкими до канаміцину і чутливими до ампіциліну. Кращі клітини, описані в даному описі, включають останній клас, тобто клітини, які стійкі до канаміцину і чутливі до ампіциліну. Ці події подвійного кросовера, які не містять основу РОЕ5Т М14 плазміди, бажані, оскільки вони не містять зверхрухливих генетичних елементів, таких як точка початку реплікації
СОЇЕТ і ген стійкості до ампіциліну.
Позитивні трансформанти, виділені в прикладі 21, були піддані скринінгу на бажану подію інтеграції, опосередковану подвійною гомологічною рекомбінацією. Стійкі до канаміцину ізоляти, які містять фрагмент із 15549 п.н., який включає фрагмент 14,8 Крпі МгВСОО з розв і ген стійкості до канаміцину (і не включає основу вектора ррЕБТ"М14), були ідентифіковані по чутливості до ампіциліну. Позитивні трансформанти вирощували в З мл середовища ХЕР, яке містить канаміцин (50 мкг/мл), при 282С протягом приблизно 36 годин. Ці культури потім висівали штрихом на тверді середовища УЕР, які містять роздільно наступні різні антибіотики (концентрації в мкг/мл): рифампіцин, 100; канаміцин, 50; стрептоміцин, 125; хлорамфенікол, 50; еритроміцин, 200; тетрациклін, 12,5; і ампіцилін, 100. Чашки інкубували при 282С протягом 48 годин, і колонії, які виросли, підраховували. Був ідентифікований штам, який був стійкий до канаміцину, рифампіцину (хромосомний маркер) і стрептоміцину (маркер рАГ 4404; Оотз еї аї., вище). Більш того, штам був чутливий до хлорамфеніколу, еритроміцину і тетрацикліну. Але
Зо найважливіше, штам був чутливий до ампіциліну. Цей лікарський скринінговий фенотип указує на бажану подію подвійної кросоверної гомологічної рекомбінації, де фрагмент із 15549 п.н., який містить фрагмент 14,8 Крпі мМігВСОО з рев і ген стійкості до канаміцину, інтегрований у хромосому І ВА4404 А. Шштпеїгасіеп5. Цей штам названий ОАНВ174.
Наявність генів МігВСОСс з ртіво542 у штамі САМНб174 було додатково підтверджене за допомогою молекулярної характеристики. Геномна ДНК штаму БАН6174 була виділена з використанням протоколу виділення бактеріальної геномної ДНК (ЗатогоокК еї аї., вище, ії відновлення). Були сконструйовані ПЛР праймери для ампліфікації фрагментів, які перекриваються, інтегрованих у хромосому генів МігВСОСс. Реакції ПЛР із використанням праймерів, описаних у таблиці 6, були проведені за допомогою набору ПЛР ГАЇ ЗАБЕ"М (ЕРІСЕМТКЕФ) відповідно до указівок виробника. Через великий сумарний молекулярний розмір інтегрованих генів Мі("ВСОсС були проведені реакції ампліфікації з отриманням п'яти фрагментів, які перекриваються. Амплікони очікуваного розміру очищали з агарозних гелів за допомогою набору ОІДЕХ І СЕ ЕХТКАСТІОМ КІТ (ОІАСЕМ; Маїепсіа, СА) відповідно до протоколу виробника. Ці фрагменти були клоновані у вектор РСК2.15-ТОРОФТА з використанням набору РСК2.19-ТОРОФТА СІ ОМІМОФ КІТ (ІММІТКОСЕМ). Колонії бактерій з передбачуваною наявністю клонів ампліконів ПЛР були підтверджені за допомогою гідролізу ферментами рестрикції. Послідовності ДНК ампліконових фрагментів були визначені за допомогою набору СЕО"М ОМЕ ТЕЕМІМАТОВ СУСІ Е БЕОШЕМСІМО КІТ відповідно до інструкцій виробника, і дані секвенування були проаналізовані з використанням програми
ЗЕОШЕМСНЕНВ"М, версія 4.1.4 (ЗЕМЕ СООЕ5 СОРБР.; Апп Агбог, МІ). Отримані послідовності дали безупинну послідовність з 22 т.п.н., яка охоплювала весь фрагмент із 15549 п.н., який містить фрагмент 14,8 Крпі МігВСОС з рев і ген стійкості до канаміцину, плюс обидві ділянки з приблизно З т.п.н., які примикають до геномної ділянки піїА і додатково розширені вгору і вниз від геномних ділянок пі (тим самим включаючи хромосомну послідовність І! ВА4404, яка початково не містилася в ррАВеОб98).
Приналежність штаму ЮАЇНб174 до Адгобрасіегішт їшптеїасіеп5 була перевірена за допомогою кетолактозного тесту. Приблизно трансформовані колонії висівали штрихом на агар з лактозою і інкубували при 282С протягом 48 годин. Чашки потім наповняли розчином
Бенедикта і відслідковували при кімнатній температурі. Ізоляти, які перетворювали розчин
Бенедикта і підстилаючий агар із синього в жовтий, були в такий спосіб підтверджені як
Адгобасієетійт.
Особливість штаму ЮАН6174 А. іштеїасіеєп5 полягає в тому, що його можна з користю використовувати як агент трансформації рослин для перенесення генів Т-ДНК із бінарних векторів, які містять точки початку реплікації, наприклад, класів ІпсР, ІпсУМ або М51. У широкому плані введений бінарний вектор може містити точку початку реплікації будь-якого класу, здатного до реплікації в Адгорасіегішт за умови, що він сумісний із точкою початку реплікації рті (і зв'язаними функціями) резидентної плазміди рА!/ 4404 у ЮАМ6174. Таким чином, ділянка можливих застосувань штаму САІИ16174 охоплює спільна присутність у штамі ОАМНВ174 більше однієї бінарної векторної плазміди, якщо плазміди містять сумісні точки початку реплікації (тобто стосуються різних груп несумісності). Селекція таких уведених бінарних векторів не повинна бути зв'язана з маркерами селекції, які додають стійкість до канаміцину, рифампіцину або стрептоміцину, оскільки штам ЮДІИ16174 стійкий до цих трьох антибіотиків.
Бінарні вектори можуть реплікуватися автономно в клітинах і Е. сої, і Адгорасіегійт. Вони включають послідовності, обрамлені правою і лівою ділянками пограничних повторів Т-ДНК, які можуть включати маркерний ген селекції, придатний для добору трансформованих клітин рослини, клонуючий лінкер, клонуючий полілінкер або іншу послідовність, яка може діяти як сайт введення генів, призначених для трансформації рослинної клітини. Ними можна прямо трансформувати клітини Адгобрасіегіцт шляхом електропорації шляхом прямої опосередкованої хімічно трансформації ДНК, уведенням за допомогою бактеріальної кон'югації або за допомогою інших методів. Використовувана як клітина-хазяїн Адгобасіегішт містить щонайменше одну плазміду, яка несе ділянку міг. Ділянка міг необхідна для отримання білків Міг, які виконують усі необхідні функції, які приймають участь у перенесенні Т-ДНК у рослинну клітину. Плазміда, яка несе ділянку міг, звичайно являє собою мутантну плазміду Ті або Кі (допоміжну плазміду), з якої була вилучена ділянка Т-ДНК, включаючи лівий і правий пограничні повтори Т-ДНК. Приклади штамів Адгобасіегічт, які містять допоміжні плазміди і придатні для трансформації рослин, включають, наприклад, І ВА4404, ЗМУ3101(рМРОО0), 5У3101(рМРЗОКК), -М2260, 5МУ3850, ЕНАТО1, ЕНА1ТО5 і АСІ1. Численні приклади бінарних векторних систем розглянуті в огляді НеїІепз еї а!., (2000, Тгепаз Ріапі 5сі. 5:446-451).
Зо Крім того, переваги трансформації рослин, які додаються штаму ІВА4404(р5В1)
Івикористовуваному в супербінарній системі| опероном мігВ з ртіво542 (який включає гени мігВ1, мігВ2, мітВ3, міг84, мігВ5, мігвб, міг87, мігВ8, мігВо, міг810 ії мігВ11), геном міг, опероном мігс (який включає гени мігС1 ії мігС2) і частиною оперону міго, який включає ген мігО1, які містяться в плазміді рЗ2ВІ1, зберігаються в штамі ОАНЄ174. Оскільки перераховані вище супербінарні гени міг інтегровані в хромосому І ВА4404, штам САМ16174 позначається як штам БХОРЕКСНКОМЕ.
На відміну від супербінарної системи, для використання штаму ОА16174 не потрібно утворення нестабільних супербінарних плазмід за допомогою гомологічної рекомбінації між реВі1 і човниковими векторами, такими як реВ11. Додатковою перевагою штаму ЗОРЕКСНКОМЕ є можливість введення в штам стандартних бінарних векторів для трансформації рослин.
Приклад 23: Біохімічна і молекулярна характеристика тканин маїсу, трансформованого різними штамами Адгобасіегішт, які несуть РОАВ101556
Бінарний вектор для трансформації рослин ррАВ101556 (Фіг. 5) був сконструйований шляхом поєднання стандартних методів клонування і технології ЗАТЕУМАУ М. Бінарний вектор рорАВІ101556 грунтується на точці початку реплікації типу ІпсР плазміди КК2, і основа вектора містить бактеріальний ген, який додає стійкості до спектиноміцину в концентрації 100 мкг/мл.
Пограничні повтори Т-ДНК беруть початок від ділянки ТІ. рті15955. Усередині правої границі (КВ) ії множинних лівих границь (В) ділянки Т-ДНК плазміди рОАВ101556 розташовані 2 експресуємі в рослинах послідовності, які кодують білок (СО5). Перший ген (маркер селекції) включає ділянку, яка кодує, для білка-маркера селекції ААО1 (5ЕО ІЮО МО: 13) (патент США Мо 7838733), який знаходиться під транскрипційним контролем промотору убіквітину 1 маїсу з 1991 п.н. з асоційованим інтроном 1 (патент США Мо 5510474). Цей ген закінчується З'ОТК ліпази маїсу (патент США Мо 7179902). Другий ген (маркер для скринінгу) включає СОЗ для жовтого флуоресцентного білка (УЕР, у точності як розкрито в патенті США Мо 7951923), транскрипція якої контролюється промотором убіквітину 1 маїсу з асоційованим інтроном 1. Цей ген закінчується З'ОТК Рег5 маїсу (патент США Мо 6384207).
Плазміда ррАВІ101556 була успішно введена шляхом електропорації в клітини штаму
ІВА4404 А. іштеїасіеєп5 з отриманням штаму ГГ ВА4404(рр4АВ101556). Це поєднання штам/плазміда, таким чином, включає стандартну бінарну систему трансформації рослин.
Трансформанти, відібрані на основі стійкості до стрептоміцину і спектиноміцину, перевіряли за бо допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -809Сб. Збирали всі клітини штаму
І ВА4404(ррАВ101556) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу за допомогою методів, розкритих у прикладі 24.
Плазміда ррАВІ101556 була успішно введена шляхом електропорації в клітини штаму рАНЗ192 А. Шштегїасіеєп5 (див. приклад 7) з отриманням штаму САНИ 3192(ррАВІ101556)..: Це поєднання штам/плазміда, таким чином, включає потрійну систему трансформації рослин з недостатністю рекомбінації. Трансформанти, відібрані на основі стійкості до еритроміцину, канаміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80960.
Збирали всі клітини штаму ОБАНЗ3192(ррАВ101556) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу за допомогою методів, розкритих у прикладі 24.
Було почато декілька спроб уведення ДНК плазміди рОАВ101556 у штам ОАї20711 (див. приклад 9), потрійну систему з ефективною рекомбінацією. В усіх випадках було виявлено, що в цьому штамі плазміда рОрАВ101556 нестабільна, і штам Оаї2071(рОАВІ101556) не був сконструйований.
Плазміда ррАВІ1О01556 була успішно введена шляхом електропорації в клітини штаму рАМП6174 А. Шптптегасіеп5 (приклад 22) з отриманням штаму ОАМИб6174(ррАВІ101556). Це поєднання штам/плазміда, таким чином, включає 5ИОРЕКСНКОМЕ/бінарну систему трансформації рослин. Трансформанти, відібрані на основі стійкості до стрептоміцину, канаміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80960.
Збирали всі клітини штаму БАНб6174(ррАВІ101556) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу за допомогою методів, розкритих у прикладі 24.
Приклад 24: Трансформація маїсу штамами Адгобасієгішт, які несуть бінарний вектор рорАВ101556
Отримання незрілих зародків. Насіння сорту В104 було висаджене в 3,5-дюймові (88,9 мм) горщики 5МО з МЕТКО МІХ 360 (ЗОМ КО НОКТІСИЇ ТОКЕ Іпс.; ВеПемие, УМА). Коли рослини
Зо досягали стадії росту М4-М5, їх переносили в 4-галонові (15,1 л) горщики, які містять суміш 1:1
МЕТКО МІХ 360 їі кальциновану глину РКОРІ'Е СКЕЕЕМЗ СКАОЕ (РКОРІГЕ РКОВБИОСТ5 І С;
Вийаю Сгоме, І) з 20 грамами ОБМОСОТЕ 19-6-12 і 20 грамами ІКОМІТЕ"М як добавки.
Рослини вирощували в оранжереї при використанні поєднання 1000 Вт НРБ (натрієва лампа високого тиску) і 1000 Вт МН (метал-галоїдних) ламп із установленим режимом освітлення 16:8 освітлення/темрява, якщо освітленість зовні не перевищувала 450 Вт/м7. Для отримання незрілих зародків для трансформації проводили контрольоване сестрине запилення або самозапилення. Незрілі зародки були отримані через 10-13 днів після запилення, коди зародки мали розмір приблизно від 1,6 до 2,0 мм.
Інфікування і спільне культивування. Поверхню колосків маїсу стерилізували зануренням у 2095 наявний у продажі відбілювач з поверхнево-активною речовиною ПОШІМОХ М (1 або 2 краплі на 500 мл) протягом 20 хвилин і наступним триразовим промиванням стерильною водою.
Суспензію клітин Адгобасіегішт, які містять бінарний вектор рОАВІ101556, отримували з бактерій, вирощених на твердому середовищі АВ при 202С протягом від 2 до З днів, з наступним вирощуванням на твердому середовищі МЕР при 282С протягом від 1 до З днів. Обидва середовища АВ і МЕР містили добавки відповідних антибіотиків, як описано в прикладі 23, для кожного штаму Адгобасієгішт, тестованого з бінарним вектором ррАВ101556. Петлі з клітинами, які зшкребли з чашки УЕР, переносили в рідке середовище для інфікування об'ємом від 10 до 15 мл, яке містить: солі М5 (Егате еї аї!., вище), модифіковані ІЗИО вітаміни М5 (Егате еї аї., вище), 3,3 мг/л дикамба-етанолу, 68,4 г/л сахарози, 36 г/л глюкози, 700 мг/л І -проліну, рН 5,2, і утримуючу 100-200 мкМ ацетосирінгону. Розчин м'яко відбирали і зливали піпеткою з використанням 5 мл стерильної піпетки або перемішували в змішувачі до отримання однорідної суспензії, і концентрацію доводили до оптичної густини приблизно 1,0 при 600 нм (ОГвоо) з використанням спектрофотометра Немлен-РаскКкага Р845г2а.
Спільне культивування. Незрілі зародки виділяли прямо в мікроцентрифугальну пробірку, яка містить 2 мл середовища для інфікування. Середовище видаляли і заміняли свіжим середовищем для інфікування об'ємом від 1 до 2 мл, після чого його замінювали 1,5 мл розчину
Адгобрасіегішт. Розчин Адгорасіегішт і зародок інкубували протягом 5 хвилин при кімнатній температурі і потім переносили в середовище для спільного культивування, яке містить солі
М5, модифіковані ІЗО вітаміни М5, 3,3 мг/л дикамба-етанолу, 30 г/л сахарози, 700 мг/л 1- 60 проліну, 100 мг/л міо-інозиту, 100 мг/л ферментативного гідролізату казеїну, 15 мг/л АЗ9МО», 100-
200 мкМ ацетосирінгону і 2,3 м/л СЕГКІТЕ"М (БІЗМА-АГОМВІСН; ЗІ. І оці5, МО), при рН 5,8.
Інкубація спільного культивування продовжувалася протягом З днів у темряві при 2096.
Відновлення і відбір. Після спільного культивування зародки переносили в неселективне відновлювальне середовище на основі М5, яке містить солі М5, модифіковані ІЗО вітаміни М5, 3,3 мг/л дикамба-етанолу, 30 г/л сахарози, 700 мг/л І-проліну, 100 мг/л міо-інозиту, 100 мг/л ферментативного гідролізату казеїну, 15 мг/л А9МО», 0,5 г/л МЕ5, 250 мг/л цефотаксиму і 2,3 г/л
СЕЇ ВІТЕ"М при рн 5,8. Інкубацію продовжували протягом 7 днів у темряві при 282С. Після 7 днів періоду відновлення зародки переносили в селективне середовище. Для відбору тканин маїсу, трансформованих супербінарною або бінарною плазмідою, яка містить експресований у рослинах маркерний ген селекції аай-1, використовували відновлювальне середовище на основі МО (вище) з добавкою галоксифопу. Зародки спочатку переносили в селективне середовище І, яке містить 100 нм галоксифопу, і інкубували протягом 2 тижнів, а потім переносили в селективне середовище І з 500 нм галоксифопу і інкубували ще протягом 2 тижнів. Трансформовані ізоляти були отримані протягом періоду приблизно 5 тижнів при 282С у темряві. При необхідності, виділені ізоляти поєднували шляхом перенесення у свіже селективне середовище ІІ ще на 2 тижні перед перенесенням у середовища для регенерації.
Фахівці в галузі техніки трансформації маїсу повинні розуміти, що для відбору трансформованих рослин придатні інші методи при використанні інших експресуємих маркерних генів селекції рослин (наприклад, генів стійкості до гербіцидів).
Регенерація І. Після процесу відбору культури переносили в середовище для регенерації І на основі М5, яке містить солі М5, модифіковані ІЗИ вітаміни М5, 60 г/л сахарози, 350 мг/л 1- проліну, 100 мг/л міо-інозиту, 50 мг/л ферментативного гідролізату казеїну, 1 мг/л АоОМОз, 250 мг/л цефотаксиму, 2,5 г/л СЕЇ КІТЕ "М і 500 нМ галоксифопу, при рН 5,8. Інкубацію продовжували протягом 2 тижнів при 282С у темряві.
Регенерація ІІ. Культури переносили в середовище для регенерації ІЇ на основі М5, яке містить солі М5, модифіковані ІЗИ вітаміни М5, 30 г/л сахарози, 100 мг/л міо-інозиту, 250 мг/л цефотаксиму, 2,5 г/л СЕЇ ВІТЕ "М ї 500 НМ галоксифопу, при рН 5,8. Через З тижні при 282С при режимі освітлення 16/8 годин білим флуоресцентним світлом (приблизно 80 мкЕйнштейн: м" 2.сек") проростки вилучали і переносили в середовище для подовження пагонів/коренів на
Зо основі М5 (або на основі 75 М5), яке складається із солей М5 (або солей 75 М5), модифікованих
ІЗ вітамінів М5, 0,5 г/л МЕ5, 30 г/л сахарози, 100 мг/л міо-інозиту, 2,5 г/л СЕЇ ВІТЕ"М, при рН 5,8. Коли проростки досягали довжини від 4 до б см, їх переносили в ростову камеру і в остаточному підсумку в оранжерею.
Отримання насіння. Регенеровані рослини переносили в 3,5-дюймові (88,9 мм) горщики 5МО з МЕТКО МІХ 360 їі вміщували в ростову камеру для загартовування. Коли рослини досягали стадії росту М3, їх переміщали в оранжерею, а на стадії росту МАЛ/5 їх переносили в 5-галонні (18,9 л) горщики, які містять суміш 1:11 МЕТКО МІХ 360 і кальциновану глину РКОРІ'Е СКЕЕМ5
СОВАОЕ з 20 грамами О5МОСОТЕ 19-6-12 і 20 грамами ІВОМІТЕ"М як добавки. Рослини вирощували в оранжереї при режимі освітлення 16:8 освітлення/темрява. За допомогою контрольованого запилення (зворотне схрещування з В104) було отримане насіння Т1. Насіння збирали через 6 тижнів після запилення.
Були проведені численні експерименти по трансформації маїсу сконструйованими штамами
А. Штеїасієпе І! ВА4404(ррАВ 101556), ЮАИЗ3192(рраВ101556) і САМ6174(рОАВІ101556), і трансгенні клітини, відібрані при інгібуючих концентраціях галоксифопу, використовували для регенерації проростків і подальших досліджень. У цілому при трансформаціях
І ВА4404(ррАВ101556) було зафіксовано 16 подій, при трансформаціях ВАН 3192(ррАВ101556) було зафіксовано 49 подій, а при трансформаціях ОАИ6174(ррАВІ1Т01556) було зафіксовано 60 подій (таблиця 7).
Кількість копій трансгена аад-1 у трансгенних рослинах ТО було встановлено за допомогою тестів гідролізу зондів (Вибпег апа Ваїдм/п, вище) з використанням специфічних для гена олігонуклеотидів. Аналізи Саузерн-блотингом розщепленої Мсо! ДНК, отриманої з відібраних подій методом екстракції цетилтриметиламонію бромідом, були проведені з використанням ампліфікованого ПЛР фрагмента гена аад-1 у вигляді міченого З2Р зонда. Крім того, за допомогою тестів гідролізу зондів була виявлена наявність інтегрованих послідовностей основи вектора, які беруть початок від РОАВ101556.
Таким чином, штам САН6Є174, БОРЕКЕСНКОМЕ штам, який включає повний набір генів міг з ртіАсСнНяу, які знаходяться на рАЇ 4404, і додатково включає частковий набір генів міг з ртіво542, інтегрованих у локус піїА хромосоми І ВА4404, здатний ефективно продукувати трансформовані рослини маїсу. Крім того, хоча загальна ефективність трансформації цим штамом трохи нижче бо ефективності потрійного штаму, якість викликуваних ЗОРЕКСНКОМЕ подій є чудовою, оскільки в 9095 викликаних подій є вставки єдиної копії при відсутності виявлюваних забруднень основою.
Хоча даний винахід був описаний у вигляді конкретних ілюстративних варіантів здійснення, призначених для ілюстрації деяких аспектів винаходу, даний винахід може бути додатково модифікований в межах сутності й об'єму даного розкриття. Заявка, таким чином, призначена для охоплення будь-яких варіацій, або застосувань адаптацій винаходу, які використовують його загальні принципи. Крім того, дана заявка призначена для охоплення таких додатків даного розкриття, які стосуються відомої або ділової практики в тій ділянці техніки, якої стосується даний винахід, і які виявляються в межах прикладеної формули винаходу.
Усі посилання, включаючи публікації, патенти і патентні заявки, цитовані в даному описі, тим самим включені як посилання тією ж мірою, як якби для кожного посилання було окремо і спеціально зазначене, що вона включена як посилання, і були представлені у своєму повному об'ємі в даному описі. Посилання, які обговорювалися в даному описі представлені винятково для їхнього розкриття до дати реєстрації даної заявки. У даному описі ніщо не слід тлумачити як допущення того, що винахідники не уповноважені датувати таке розкриття на підставі попереднього винаходу.
Таблиця 1
Репрезентативні групи несумісності і деякі приклади плазмід, які класифіковані як такі, які належать до цих груп несумісності. 11111111 вва, вві, в483(щонайменше опідгруп).З/ 11111111 11111111 вРАВКЕ 11111111 77777
Таблиця 2
Зведення результатів біотестування іп міго
Середній показник Середній показник Середній 90
Конструкт СЕМУ/ (96-ямковий ЕАМУ (96-ямковий ушкодження ЕСВ (32- тест) тест) ямковий тест) 101513 101514
Таблиця З
Продукція (у м. ч.; частках на мільйон) білків АОО1, СтуїСа, СтгуїРа і СтуТтАб у рослинах маїсу, трансформованих бінарним вектором РОАВІ101513
ААРІ СтутАь 101513(371-008.002 101513(371-020.001 101513/39)-011.002 101513|441-031.003 101513(45)-022.002 380 | 270 | 86 | з2 101513/451-023.001 101513(49)-040.002 101513/491-040.003 101513/491-041.001
Таблиця 4
Результати експериментів по трансформації маїсу штамами А. їштегїасієп5, які містять плазміду РОАВ101513 77717 ЇЇ с | 0 | Е є | є | в | н
Події Події
Низько- " ЮДІЇ кіл. б,
Регенеро- Події з копійні кіл. Р із активні
Оброб- й щ То : щ про- . вані події : усіма 4 події З й проти
Штам лені Аналізо- й дукцією й (96 Х-форм. й - | генами усіма 4 й всіх зародки - вані події всіх 4 ефективність) (У) генами білків трьох (Ус) (об) шкідни-
Й ків (96)
ЕНАТОБ | 2469 6(024) | 4 | 1(25) | 1025) | 00) | 00) рдгб552 | 630 | 00) | 0 | 000 | 00) | 00) | 090) рдіт3192 1945 34 (1,75 21 (84 14 (56 9 (100
Зо
Таблиця 5
Результати експериментів по трансформації маїсу штамами А. їштегїасієп5, які містять плазміду РОАВ101514
А ЇЇ В Її с | 0 | ЕЕ | є | а | н - Події
Низько- Події кіл. б,
Регенеро- ш ще кіл. Е із . (| Вані події то Події з копійні продук- активні
Штам Оброблені (до Х-форм. | Аналізовані усіма 4 поді! З цією проти зародки ц ' о генами | усіма 4 . всіх ефектив- події всіх 4
І (Ус) генами 2. трьох ність) о білків . (Ус) (об) шкідни-
Й ків (95)
ЕНАТО5 3499 110,91) | 11 | 208) | 10500 0(0) | о(0) рдг5б52 | 771 | 00) | 0 | 00) | 00) | 00) | 00) рАНЗІ92 17 (1,83 12 (80
Таблиця 6
Праймери ПЛР, використані для молекулярного підтвердження інтеграції фрагмента з 15549 п.н., який містить фрагмент 14,8 Крпі мМігВСОо з рев! і ген стійкості до канаміцину, у геномну ділянку піїА хромосоми штаму ОДНОВ174 Адгобрасієегічт їшпегтасіепь
Пари ЗЕО І Назва . . й ши , Розмір
Б | НЗ2 Оомп | АТСТТАССТТОСТТТТОСТТТТОСААС 1 - 4248 п.н.
ЯР | Вер СТОСТТОСАТОСССОАСОСАТАСАС яв | се | САТССААССАССААССОССТТАСО 2 5ЕО ІО Міг Зстеєп 7696 п.н
МО: 29 атотТАТасСстоаааСАТССААдаСАС
Я | Бе |) ОАСАСССТАССТСАТААСТТОСОС
З 5ЕО ІО Міг Зстеєп 6917 п.н
І ' ТстТсАТТТАсСасСоастаасТтоСААС
МО:31 83 мн ТаСОАОСААСАТОСТСАААСТСАС 4 ЕО Ір 3650 п.н
МО:33 Мі"В 1 3 сАСАТаСАСААСААСОсСАСАААСаА
РОВІ-15' 0 / ОСАСАСССАААТОСТТОСТСТАСА
ЕО Іо 4126 п.н
МО:35 пІА Рог еассстасСсАСааСАТСААТСТОССАА
Таблиця 7
Аналіз трансгенних подій, викликуваних трьома штамами Адгобасіегпит, які містять плазміду рОАВІ1Т01556
Фо З Кількість з
Сумарна Частота оо З Щ однокопій- однокопій- . кількість однокопій- ними ними
Система Адгобасієгічт мощі трансформа- . . подій із її (оо) ними вставками і | вставками і вставками ц вставками відсутністю | відсутністю основи основи
Потрійна зЗГирегспготе
Бінарна спОМсСОоЄ пОСлЛІДОВНОЄТЕМ «іх Межіс, ремнаїта ковваеії, Бевяп вВеквахівсЕ, Бій
МНосаїієу, Агов
Макуа, Ювдлесв
Меадце, Кота «170» Теми АоВОоВвАСсТЕИИМ, НОИФіКОВАНІ пий ЗБІЛЬШЕНИЙ ЗАСТЮТВИ ТеВИСФОВМеНЦУї
КОСлКЕ «13йз ІрМ ява «Щівпя ЗБ «Мій» БавелкХо чекніст 3.8 «а» «айв аа «ій» ДНК «іх Штузна послі новністві» каші «ай» ланміда ВОКОХ каст» 1 седсячечас асезесечея чадесьаасс дуесяускссс десдааювня сфеафжесееоу ге тпачасссат автбуссдвас асочуссаєсь гвасаєсоще сссеясваааса всскесасУй 135 тЯйпячасеча Зсяадсайав вецевувеаве жаба е акасстясва вяссоссасчє їй аксважертсв БЯсесасцає чясвассаваус забяпесаса абгавстаєта сдесадалвсе вай спвссапваеї девквацейя сассчаевач чага абазосоцач ззазававтя Зо вазкастака ссасазссяй Кеасаасває часуцвачаея девачзескач Бзавососве ЗЕ шессзтаєттє вакчсчяаєа ЕЕЯсваєтас сбеусеваст аседсЗакай кава ававає ато севцдсесктЕс зсадвакаквс ксесваскоу кЧЕваЗУчсе аккасясвся собайаласа заФ асавзазясая асітдасєсья вЕаЯбЕїЯЯдес БОбцацсвак зЕчЕЧства чЧедевсесева ЗІ с«веесчевУкЕ авчссдесеєс аечбазсцеу десадесЕдя ясезвіакс зУдеВоеаКЕ Би бкосваєвсча сЕсцаєцако ссвесвЕвса сайвчєваве аваккссксс ваявчассвя ка спсасевоце савдїчасск кстЕкекЯсх ссвчасайоє тещею Кто та споЧчеспаса стедасячях адясаквска кружссачьс чусадедаса бестседест тв сазЕбЕсЯсе зФчЕсЗсЕЧеч ссасассава госуддасна спбвадсвев асавбеседеї ва «еВЕсЧЕсчцЄ севсссФаче Таспастьсес агачясЕскав чаЕжссевс ачсесстода апо вЕзузБоесоо гбтзасавес «пдссаавча авбвспресяс фпсофовассе ассавачева ее сзехакчкЕс сеесвесКК ясзачсвоча тапствачасс вжкеакевтс вссрустаера є їчиа поавочвкасс сасвачазкя ссавеЗеЯсе десаттежсо адаткчсаве годедссеву тава ссччзсайся свасучуцака зечссавеВЕ Зенедасаає еесаасеесь зЕвчсасама 1140
«очкскочск сЕсчуссВочЯ авадссуває сстесаєавад зссасеваос вакжесетеє тт чсаБсеСьБс абсавесекЕ зсуєссвову Кахесвнова аксвнаєаєся сеесасуцею їлЕй
Кксадеєссвюс агесаскуся дачссзсаса азвгдсвасоде свасявсясї заксосачак із ачсаустсаак чЧасуссснує ассеіссвака чекаусеста затссеовеч чесассуєса 1380 ессбсцечає дфсвавсяє гоасаєтацу Засуссава яосессвяєєс сбедувсаво 1440 сессксцвея чавчячества чсаєсассятс збусвечскс ддактесст серевссява ї5Об ссебскасас чуєсучассв всосеченвЯє ббасодраєс срососсеся аассосастеЕ і5ЕФ берсосчеаесв робзаєсесе сзсвачесає бсочечасоз чсссзеекая ассвечЯсв. 1555 секваацаве вБедвнасичес йастсзасса Чеачесеснайс саческсеєеь ссозаацшесбе івай тсесачеве чає оес ЧдесазБчасі чясесайвсе деаБастесї чузссаевее 174 сЕбсеЕвсеса сеабссякос ссцеткесвя дассвнояса сдассуФаєа Езксспаксо ївав чесекссабь садсаккуса відсажнуаа кейсопвеке едсестава всясеевцех івко ашкассчкес стчсасаєся чдсвааесаєся зесечвасвшо жекесассс сяссассева 193 «авЕакчача Кечакесачс сасссасача ссяакесдсанч досавдесся ябевЕдлацес ї198о чсавчсясчас чузавсяаяся січсЕЯЧвшеса севЕчеьдка сбссоцгдаєвт соєваствву пай
БЕЕсвЯчася астчсестує кчскасзакак сусЕВсЕЧеЕ ссесавсасєс ваавсаєтУуае 10 шесеаорччсочва асадевевЕде сескуясЯ сточезчесак звзасЕчкния заваазсвує ів сабавсявое сасувзайсе чесаєесчезче сусвассасе чесцезькся дкеааччее 39 ктачасснекЕ чеУкаувустє атасустьсь бусакбасве Боссаєзазос чавсацеєьк зах асчесзастя сесксчсцсе стсвЕссавЕ бссастуєче шецбсасосу чевасескечая вай зсачсвасаа вассзаачеа Коста є часвачсава сзачецевас ЗЕБЕСЯЯВсЕ зап ссасясзбея ксазссвБкЯа сдсчасскбяс Кебесьеева сзасзаччвя сечкавасеа Я акекцесссФ осЕссадшах ассодвадає сксдяесцс дсодежевя ссдекечеУє БЖ
ЕФфассесуда КФаатеЧе сасавссевся чЕБЕеесоса адпсодасак себе БВ сесашдсетвест Чкассдязся Засактсята бсачечачЯч бЕЕчшанськ зеаЧеЕеяава кет аксеотцасіє сввепасенує аесядесаєси басчечаччя саачччстсс заддабесе КУ! секечасакс всесдадцаде кеучдсассев зссечссаа дцеацссцесе сдсясесеве 2759 часчавазасея чеЕйвазаесЕ «кчасасвой садстсєсеЗ азасячесас ачесьчьевж аа бавасчаака сспдовасва йсаачессцх саоаасесяє садсяяябоє сассяччкаВ ча тая с-е-сакчаєссв сксасУкаче Явбачцеущає сабасаєвчя себавееаку вай сучтаєкача псацескоєа скзаяачьає аесцеавтея зкусщанаса софсасацай засо чеЧЕдастао надягассс дссазшецев сЕбседекКе сесдсссасе застоасвяс ЗЕ цессзаеяе Бочдебусеє сзачедчсає сзвясессасстс айзечсоята агвсзавеаЕ 3325 псасалавьс асозчезсавсе ссветааног зсаефеневє ваватастсво ставажеєса ЗІ зчаайсечена Звабчесчса «СЕЧУ ся СЕЕбссавна зесбесесспо секезечаце зай вЕсасазана Кедасясвса здюсвдвач адопазлатес засаднаста Єзавевеаєс з34й заседеЕссх ссосбдчозаче бссбесукає чсестескцЕ кссязесску седсвквссу ззЕо часаєсьнес сяссестстс сстксоднуав собкддсєє Ебсісакаде Ковжедсвуєа за ччусассксяя СЕсовсчкач ЗЕечЕкодшес ссаяуєрояяя сечЕчсасає садсососоз зако бісадсоссуа сечсецсевсс Ббарссячев весасецісї спзафссавас сеудеваадяє 3545 вецдасетаре десвассодеа усатссаскЯ чевасвачак баясачаясу азабасвцеву яко чеччсуєссас аоазеЕсеска аазбпабочс свадекаєчу сбасаєссаяа адовсачкиє зве тбчясаєстч езекскчоку аачссачсба ссббсячава зазвакечяь аФевсевтяє ати созасзавса пдсеасевеЕ часа зеЕЕБКЕещЖЕ Бешсвачстя саше ЕЕ зсецавжянва ацеакстсва чнавжьссье ЄтавсьЕБЕс гасодауете дасесьсяте зва чавасодваавй сЕсасчЕсав «ЧаВо З ЕсеЕдВвяаВЕ вЕсадаваця ЗЕсСЕБсвось. ЗО ведЕссеЕСь йнаїгжазава бзавувЕвьа ангсвакста завзсасакаЕ чЧачеавясЕ зав зекссавсвя СЕвссавтас ставесваву вучусасескає стсадодчате бдескаткве захо ческеакесаї атеечестяв сЕссеечкоЯ даявеавс сассчакасеу заваусскає ФВ свкссццсес сечкчссуев «Козакасече чЧацчасссасу сксавесчуєє ссачасєскає іч сзасватгавна сСеацєсачот члаауачЧесЯ воасусячаня Бавесскаса асксясссу сети) ссгссабсса честаєтаяс счЬБУуссЯню вачстадаєь аветаскся ссачетаака ЗЕ чЕБЕЧеЧева сестчзсвзсє зсеясрЕоусаз зЗеавсябаче ЧЗесвасосься БсзбеЕкчева. 4356 беасЕбсев сачексевя бксевасчає савучечаче басаєчуаєсе сбесатчкечЕ зна чеаваавзаус чеЕсвеетес БЕсЯябесрег сцвесоцЕсяєЄ Ссетаадьвят БечясочесВу «43
ЕчБкаєсвсо сатческакя чсадсвескеє взбваксскогї Каєкавсабя ссабесаква 45ас
Чавес БеЕдассеяь чаштастева ссвашесавь седвавасає БеБастедщце зБка чассчачьсу СЕсКЕКесесе всВссвасас чечакваквс сасевсвсве ваебадеаесе БУТ)
Едазаясчеє сатбкаксяча аваечЕКесК ссоачєчнад асссресваазче абеКрассдю вий
ЕЧКЕЧацВКЕС сачессчавкц савссватьс чкдевсссаа сбвавессбся ФфовЕЄЕКвЕЗ ят4о секрсовосаУ са весазЯ Клпвосаавай азцаасеса айвсшесаса ваванеєса чай савусессвс бсцчававяє кчваєасков бастстєсскв сбЕЕсваєає саседвадев ав
ЕБсассацав ктаксяксев асаацсеня дсесквссьаа всщкакЕтау задавсаває «930 ванбасацев Бссосчсаса ббесссецив авясуссвсс Ечаєзкства дазассаєса «ай краксакчас акрапссьві ваавпачтачес здрассассваз дессссебсЯє себсавзодвнає вач ссесабаке: часаяєекаб саюсятатсває ссераасосу згаческсасе асазкевзане 5102 сесгаасяся ЧЕсадасасо зсЯЧеасдавв Ксбазсаатя сясьсаксяв сабсстссде зів авессцрісассо гздасчесує ачдезасазоо сеча сасяс садсассвсс яадассостокя вдо чтчешчасасст сссасетсца сСечесассзен зчЕсаставч ся пцовщаев заесясевксак БВ чечУелцасоє айБсьссавЯ спсассеесь сродудавосяє гексозассу сьвЕчассче В срессачвсс тасбсяекЕс ястасктова сссавкаксоа аскжсчеавь савачоднас ап зстастесЯякст «аеванесяв стасцссчна сте счкаш содесабсво сфдоедосаєя БОСТЯ адчечечавЕа стався ваксадссувс пссессчас: дадвачаєспя Феассезгеве чекав
Кссдеаскса єчЧачецсоїїя КоссСсзаоясЯ Яд асачеа свуцеессовяс вретерсрерсух Ти стпітЯачуса ссаєсесссь дсатуєвесв СЕсСЕсосща созеатеєсь савеачесве вБ4В затєстастає сдчуєсеуєих себсазвссєвч чачессевся згаччЧачатся єсчасслаєт ТОВ сссьбопачач себросзасос явтсацетес рісслугєчоє сасозечясак застав тай чссясасста сязесуєсся стгстассася савекесьзеа зведе дасадсаеве важи качассакес саасовзача ссустьссує кедачесцева счабчассця себексасьс ввас чЧстдкаскст чайкексссв сЯсесесясу садеассебеу ссасьачьсо сдссассава 84 сдЕБЕсЯдет апавшесасає сабкаєсясс ячсавоечетуш соуасесасе заусвасаке водо
ЕкЕасЕздеЯЧЕ всчечдастея азеексчнавя чсстестсса ЕКекщажвеж Кеседееоосс кетадети ачезасатет чбФеасчеведе ЧЕБасзсзсе зкЕаекУвсов аасачавава Кеавечаєсае вай сацетаєвяє сресхаваднес аексусучет сткассався бааскеЕсцак сабтсачяс то 18 сспассяєся сачечакеса кдосдескоу спспадлсаєсвї опавеаучКк дисакедясе СК цтадцсцсесе сестарасстї сУуссЕдссс сссосаєсас сЕсоеФерУЄ асдсасесат зо
Чесасстісца сссдаасоуца ауссодсадс асскесоссяа сацчцаєссаєсс аскесвачтна Бзап 5Ечццвуссай сааїкесье судвоаазнсвУ сЧавінедса васеваасості судеадавса відо саєссавссуєс ябсеаусевес бесечсадск чеасчесвчеЗ КасссоуЧує зач Іво скгксдесаєч часточесатя абсоресрсє бабсятеєтсая часесудеска зЗссччсчтщ Бай чкасескас казщЕсзасзЯ зветаввсас ссабасусса єсдаяеячвяЯа восзаскясх Ел четпевваве честдевасе Есацсазеаа сабвавечає сбвссФфускко сесдеЕваве вай айачессача азсзсязаве ссацезесес Ясассабкат секосясакс спосте 7І часчсЕчетд Яетасестої дсвасасста свзесьебакс пзосчвачесву сопдусавенає та сствачечав КетЕсСТстве гссезеевосЗ босатассяс сзяссяоска ссебевеавє вчїай ческсаз:йа ссешесатую ссаєсавєсач тавсесЯтрає соебозякакс єбобекеяке Басай
Зб їкаксочеає саєкассссс абуаасялвня вісссоскка езеідабчуєвза ссачедатсса ге айсацедава айссцеессЕ авсасечосе дебкеаксяв авашосядаєся ббавевзевве 702 сачацайась сайсчацесе шасстсшаася аасастеєсача саксссьвав ссаскксасв тав ассастсіяа БозаскссяЄ поуєдепсаса уссзкауєо сбсазучасе аучеетату 7154 спсцсацечее чЕКУсаеКес сопдасяскев єЯВЧсячавЯ Баїсеусеся ссдачвчеавес 725 срдлссясня ВЕсСЕоЄчЧЕЕс Бідезсачса сасасаєсся ассцасссвс чавасаеае така сабпецеЕсає сабсзсакав акчассячие есЕксавцечє сесвксайвнох касова зва весаздкаєвцє аксахеааяє скоссаєсвхс еакассстє стушсаєбояЯяс сецсуасече таво сЕкасьсецес зусчтссаса жкаксочаас спсдусавчак седсгсзудєс акбссвааєав т44а скстасоаєса асадістаса сосаєсвкяст здваачесслас дасдессддая впсцевсасе тав чеггчавасе ебцеседесес Беветачвча вовче адешеавевке адкесквев тео чаксесзсіво сессуєаєча ведуссаїтсац бусецусаксе васосаесяве кесожававе тв с тфессттсв ЕссчсечЧчася дссядсввся ЧсссчЧЕсЯкЄ еюстяпвеЕяча сСосвасоссь Тева ссяесреєсває ачестсвасеш ЯовеЕсецаєся сссачкасац совтебессв звавасдаєяе 7745 седекоктсс ссакссксву дкааседевчс десесочечс десексеке сечеесовее за
БечеЕксаєса Чесвравсвес Себрасезакс ВБЧЕчЧУЄєЬЯ Засодяаесе чесна ве асссвсаєса сессавсязе сасасдечес Фассьіазвя счесодоссь сабебачеве тадй
Еакдасусте ЕСеЕсасцнЯ Чевадсасса чнассавЕсс таБЕсацеве сілавсуват тя зсезчаксаю Кксасесауес ЕКС: кЕчЕас чсесякауя свцчавсаває свасвттеса аачо ксЕнбассче авпсячужсає кеЕчабкссса сбквакскає Зстачаатя часа вка яіво пссцдааєска асякжсксєс кславатосо ааазБаськає зескасессс ададкекецея БІ гчасчзесаа чассочяваз астввадата саадесБЕЯЧскс давкасчеча зоЧдессааавЯт ваго стесозгаесу скасвоззеся азувазнаве єЗссвасаца чсвавяєЯьст засто ех вав саацсссеча зсзаєсавеч азайазуссяа Чепедесцаєс чЕчсЕассча сесодУувдає Зав басастсвек сесаЧасксся сестсдесяс скгшоавакеЕ сксзадесЗя счачоувася ва сячесівасс яксеакукев сптадасовчайв часвіІсаБщ дагоусаєос сасадйвоєта БЕТчИ сахссасуяси ассебеєска дсеседесЯс асвчайсява сзасавЕЕса Ексавцевек я
Езсевсгдая чедстасаза Еспссаєсатя чечезнсавя зстсисчче чвсесааеує вив свзусзаварся айсоссьєса ачссшесвсвя печЯкавецак чваукасвач сасасуєзав. неяай стесаФстка седсвзацтс дсосадссях ЯбБекказяє дезадисесв асассекчев вто сесчсссвес вавсдесяоа асавсайдсо сасвавквсь ачассляссаа боаесаєвес ве чазчассччна савсевосос зяитазсваса аафсссссте севссесае пасчвщаєся Ваийа тсакчассая себсясчесс званеоцЧача акесеецеза ачсодуссва чесвчеваєа. вано
Бадесеукьж сосок Ясна подасеатше ссоасасеза ссосввтнес адебасьввт емо ачетсассяав бчеЕсаєоеке асевЕдеЕсша езассечсва топос засос Запо всячетсвак чЧесдечеаве Кецесвасе єдвтагбасас совиаєоявя ставсдаває Зоо ассесцьУЄь саасебстас содцісдсаве сядавсєїсе зсайапасіс дфузаєосвся 13й сочисдчосЯ БеЕасасудес асссессяса аксаччечев асассеасЕ кеакссясда ЗАВ кксеясЕКЯсС сапедадсай фасавсцаск СеЗЯдсаксча сднасдседьс аодостаде Зо чечексекео абЕсьччайс ссесваачосячес сачавзчаєсе Фесассавуя чЧавазсясее 355
Ксавспобсяс вуЯдсувЕвЕе сісчаччуаня тсасоечете зсеадвЕсев асксдавксоя аа астасесєцеяа сессесасояа саческесЯе кеусчасуча саєстасаєя суцстаавех Віза зссусчЧеЕцьк сесукстусте чессаасажес чЧосессвсяб ясаавксееб сяде счессе іно
Гасзаченцса аббеццеєса бсстіаєцеса десдевсаєт садексцесс давсідчаєя За атавшчссся втаєеатся заечсетчеса сакбсчствя скссвааеае засеесвайа вай ачецдествсв савачеЕчеЕч атечксьасс сеуауусвая седстефеаке чдавзчаєадео Баш чецавсцесе дсусасовав ссСсасасаюс басаєдесас ссусясаєссо доусаалоуєт а72о сЕсцсабсяч пссоссесевю асесдаєссац жесазедсса соассваЯЧсес дассавуссе ато тессвессяв саяссецеев бсчачезуцс БеЕВеКаєсс сесзцчаачссе чЕЧдасадна зніс
Фтукачсвакс сасякуааає сускгавуєс ссусадачес Єбчцавессвоя дудетевесо з900 тесецексей зазассасст асчвайайьс чуствавсача чбасчедвая ссестнакев зв50 чачевсябца вабсасіває: затярсася чаавнесасса веЕсвайавначу сасчкчвауна. запай сцставтаєче сстттсвачає савсавсься свавсасессе ссзсксеучс авчрачсває зво ашсзачсачь абуєксвась аческессва срасанакак зкабассаве ЕвЕБУчЕсче вп14й себбучскч сячЧасавкяєс чекасясуса сеушеросяє ссоаботаняйа шещеавеея Т1аджо
БЕдсосасся сеувясясеЄ Кбдоссасяй сесоасуаєсс чдсаасачаве ЗЕесЕвквах 1о85а жЕкЕбКЕрССБ Євзазаачна адачосозай ячдасудевас сбсбеччасе секедаєте 10170 счассзасас зччачсочсе сеосазачсяч сбЯсеесада всгабсацує садачасаєє 10390 ачассесзач акоцегсЕов Едватссшево ЕвЧЕВЕвсаф евЕсаєзєпйя сабаскаєат 30449 касачаєчсе сусаздавоя єсаасесасва аасавачасає гседесуйока чессчакчада ово «качасессув аадеасседу сссасеєсув ссессувуся саадавасьс заеаЗечеа їпБ5Ер чевксасаає севсккЕсецак дсвакузсся авсушаввал ссдставачасю яросаєесеше 1бешш ссвсзксаца сесаєкдсся чКсчсацеся абсдачевЕсе Єдседадскв допсавевево 1пБ кавсЗчсває сясесєочесу сасуссвасЯ сссуцсвкох сзаавасстт звасачаєту ї074п зчцссдасая ядецруесаве ачсевасаас Еблесцавдє закопавсев чоссяасаєсь 12805 тенсесаєча аввсудесат соссдесавс Чачедансся Февставссье абачаасте бий ачечездасва Чекудестає сачессасеч зачедавнася седеяцеас чаацадеваа зага аспадсбосяаї пуаазвачеєс васссавечец ягазечачос сакечеачес сетозвасача з1ачво ссаваєдаватс сагбосчачеЯе десосеауєс сасааучеса уачсодаваос сЕсВвавоаоє т11 040 ачстсцесав КсСесасачсс Фбсвсдавна салату сав асдебеввя сет вке 1119 сессссксує чсудесасує ссасеЧвсЧе сставтсЯвс ачЧеЗвассоя ссЕчОчеета, 116 секссоудасче чавчксякес чавбескеув сзакчесась звстасась: счусчнасет 13280 тсадассатс сасукаачях сезсстатає кдасусьсся чавзусааєс вадескесЯу Іва скссєзБУсь счесаясцяде Есогсдаєсє щдасеббесудс савчцачабіс вадетдаюеста. 11340 вваачачев: чабсяпеєсвещ деседсаєтес БозачеЕсуєт тастусдевук Едсаятасее 1400 садезаєссва асасаасься ссзасаксвла сусчцавсакц Зесайчавя чеаБеачееке 114е яЧчстбассеб гассасадсв зассавссяв соспеачаєщ саотаттася авазачасе 11529 сечсесуесаа задссосдцеасе кБсощшЕсвша сесдвасчеє сазуадестє чавззасощев 11580 тсчсчестеа авазаеассв сдавосьчася сездесвеце сесевасвев азусчуєстей 11645 часасчвсеча абсбасососс дечасшессе Єсцбсссуаєс аекЕссадає спссаачсу МУ сесзясчесу ваефбсассода веедассесва сясвясуявя звастчсався софБбаваєе 1 чедсдадесвас састесвсяс завчезачсв сявсаєчаєу дазпавачає сатбадвсотас 11620 асасчєсяєсч адсадевона дасвастас седеацсеце авдядсаціє яедеснаве ЕХВЕО чаачцсачане сесведедсеє пекессекес сееосаодесе десавекероує сдваавексея 1194й вавпавчоєса яачасавкцв асесвЕчсеь пацайссасяа Яажусччасе асазацацесе 15п0й сятсавачачс бацеавассве дссвшаєдесс всівадачєв ссаасчесва сесрує ее Мао «чусчаєцева вавачессаяє сассузцдева саасааявче чедачдсаяе зядсадачає зії авацчесссцеу сачатчансь рсастасеас пездвасече чедвавсска есдтудеете їв180 чеЕчаксуцес чдсассаакає скавтсваєх сзадесавеч асадсечеос аудевечаєс 1224й вЕБсСЕЧсвсЯ авсуєцсеце бУсескедоче дпездазазач счавчаєчаз спвесавсЧеЯ зазпп чавассачьв аєссясасяч ссосасеччв весчуєсецеса всжсатауче счедевава їі23БО саведцасаче зуадсачаєччв аазаастччс дсадцесечау васакадуєву сеаасцвете іданио тчавечЧкосЕ асечоучсяа сабедсяеве десечуваваь бсеЧезасЕЄ сакзавчате і450 сспецсадіс чазовзасся сессбсаайе гессссавак спкзседаве чоскучаноа 1254 асо сЕє Федосьоссс Фкдсесдайсо асссбуасяс сткбасааса чоеКесввасу 1265 задсасачее суастЕсавс чковатероа агсчдевсяяе БЕЕСсСЕакєсоя пекан 1265 сУБбаччсяє сцаччаєьес саачесецес сясеуначса ддасаєдесь авадаєсеци 12720 звабаєсечс чЧачсяссясу сабскекчссо Каччеавсоа сяпасессав сешссвоесесе 137 асоказцесе Чаєссасеатє стдачесавєж бесзеччвчвя СЕбсассоає досавчаєеє 2840 цессаасчья ясесскудес саєдадякея сефеавеЕсе дусдесексе сага сце кава сактсясосає басабсчучеа Зазсваечкча чеЧевнеаач зеезекчаке дасстссвся 12965й кЕкссеюручЧа себезчезас чЧечяаечава сусачсчеца Чусспасузу чаззсечевча 13220 надазЕчесецч сесесасечьЯ ссоуясстасс аосссясаєят єчсЧсчватся сеадвсеозсая 13080 ссуаєчоєста сечі ссясас асядкадеса Ечсросесся свасеівссчЧа зсеззчавзесо 13140 асясечсяач сачаванстяє сайсссваца сезаазуцсв дувавасицєея чдевдасавеу їз сечсесксвсе чсесчавцає стпаесяачк ува с 13132732 «війх Ж «х11» 891 «кій ПНК «ТіЗ3» Щеечна пес едевнаст» «ие «23» Бериній ланцют слітонумлеотниає «йабе чачесасвоя сЕвсесччак сасча Вес авесцсЕвоаєс аЕЧадечуєх зсевачттеу «й сесацесткЕЯа часчкесосо бечабучазя часкавасає саскеецеа ЕсасесцаАе М чеселасцЕя БЕкузассяЕ дсасасудес зучассакссея чачечоцврає ачкасевсеє їн сЕСЕсавасс сеясбрЕсЕс чгачсяаєстя абсчусесяса ач сесУч сеавчечяє 40 чЧеЕЕдЧчаєсі ЕсчЕБдаськЕс деадаєсаєія авсачсаасс саассачаде 253 «ай» З «нії ва «кігз ДНК «пі3х йемчня послідовність «пай х «ЖХаї» Нижній ленцер свжгонухуесави дя «ййбз Її ссапесечаде бостасспах сдакессааа чісассзачя Ессвласцеж ссезкедесе ва адсайсьсчє чичезакссу йсдстасуве зязасячачс ссявуачаса адеваскаса 120 вссассссаз аБочссосаце сччеасаво ЧЕКсязасас псгзчтсасіх сойчсува са ї8во сесачечата ссбазссевбь ссавсцауво Зовсасссва задсетчесче сескоссеа 123а ссстсвиЗьх: аздеаскзав смитсжкчате созвсащечя щдеяюшсотови ше «21йх 4 «Вії» 8465
«рій» дих ! «вії» ШЖучнх пюослідавність «ай «ВИЗ» йПлачміола рда «402 я сечечачаса ссоуссатсс чдзвксакане зЕссавече Кувсабсчаза чУчсЯдссаву во зЗзасдссачис сеЕдсаєсуюс соссісзаєа чавдоччссач дсагсвстдє ЧдеЕдЕксусте 320 чЧавкасекач счбдетктаа ссаєаівсаєс ддекдчасея ЕстзедЧаснч совсашіас ій кеЧсскесся аассосдесе гсесабвчса ссуцаєевев сцолацесяєс ксотоцасея шах шпЕседЧеЕЕкча атстеацкаа сЕвсоччавс дЕтптаасацо звосгралоссяа чддостедаво Зх зачектааьЕ сопавцесьє кесссатевш бЯвзедсавко сосавевдаск Яддесвактее ЕТ)
Чедсастсс ячассечеес стжсткссеа пссвесодеою бсцектесяаа чеасвасоса ай счастецеса БасссавьеЯ чекебесаве сзусаєечсяа аббЕабулач ЄЧасодаєссе ав їБатчесавна йсесеБшуса аябавецеїс сіФфраснеса чсавацедесу десЗасвеє ав
ЕЕсЕссясес сассасвсза сявсабуача сезавєсваде сасесатаувю Февксвсаву жд
Яссавчсєса зесакдачеає чеаукченас ззааксУчея стуєеучеса савезсвака яко скЕсЕЧЕчаЕЯ сстваєфксв БККЕБачочея асецсссокас счечеаасав секс є ла ссагазсасс ааасатсцає ссасччсяса зсясуссвчс счсббочаєч «сстастжсає чай адаскдіаса ааавайсато саєбавсвачс саєдавааєс яосасіцсос суєтаєсаєс ага чексчецЕвоз чЕсваччевс соцясвадтеЕ чечдевачсяс абасасвтаєт Едсаксасає ай еезсдавес дайсзанськ зсцтсазева зусеедЕуле КтеавесаЕт ЕссаеадЕдЕ яво чпочЕсвссся чеавесьбля Ядсаєовасса азбтзачяса Сесттесяь Заееачевяа їоза счавчедчевная «Есесстексе ссвсцсакся Ссаовсатсе дсяясеввяс есе ссва іо58595 саочезвччеч сеаЯсясастх асебассоскч чакссаучвУу ассудаацає сбсоецусовво 1149 счусчсЕвЯ сеЧЧЕааеаяс бсассесава ЕЗпачеЯУке сосасесвеч чсеЕКессоФи 12099 аччссзшсає «ЧЕ ся сосадебьсь вбакдаеася Засасчкуди ев зи
БЕкудснйстья сан аячя ВістеЧавоо старойсеас аечаєсаиев Бесавчаачу 3520 тадпшдесест алидакпоща сеттцакцек дсессядацє ЕЕердєстнсся десеаснстга ї580 ченчеєчсео счсжфевЕвЕс заказкдася чсдававясоє содшасаєтья садебссея 144 адасядцьсасє асдсттовеєс казусядакч ссдопдвчсвя асаавсссЯе сацаценее 15 сачеччуєчє ссссдотЕу сдапЯсусву ссаїдассса пдссасякачє пак у 15869 тпсвакастач сскавстату содсессаця зсадавсЯса сотачадісс ассасакоса 1528 чзкасчаваєв ссчусасачає чусокаакова ававсвосоє агсадуєсєтес себесуєсье зо сксосксаес пассецссЯє дусьтсавксЯЕ Боддскосоє сдадеасьає садусесасьс 1740 заавоасУучка асасотстав севасацавье зачачакаас зеаудавача века іо сазацаассяч сазвачцеса ддваосусва завадесося стчсеяасче беЕбссасаФ ів
Чсекссдссосс сскчастаце аттасазава ссзасосьса ацесачачаб дасдавасес ї52а часаччаста Кавзачякзвесе доски вьсс сстбацавос ссссбсвтвс Фобоса їз теслпассськ ссдсвсаєся Часассьяво сдесбевстє сесхсдтува деп 2ч4а сстесасаус бсасесвава чдеассесаф тесачьвасая оКечЕссЯск ссайуськеє 2302: сЕЧЕЯЕчтас дайсстесесу СКсадекоВи сечссусчст бЕаЕссячка асесасецке є 238
Едячксесайс сецоайтас йсеаскЕайс пессаєссдчса дсадшесаскя деЕзнасачцає Ман
Евдсачачтч вупсатціад чЧеаусчетаАс ададвьссвя зачеаоЧтяде севастаєое ПІД гЕасастаца апдласадеаж сідвавеєт ецебеечеЕд явуссацеса себесеацчада 2340 зачадтсучЕ зЗзсеЕсскаак сеудсвааєя застстасоуєє яадбадсоцкя дек запо
Ебосавосвя сячассасяс чсачазааяаза зччассссаа двачиєсссь скедсерЕкЕс К-Т) тастячасет часаексач часних сЕсасцдисав чазавЕсеаЧ БЄсаєчахтаве аж аксазвавує ЕСЕ сасиь ачавееЕЕ зааствнийав бЯзачеесса вассавсосва 2580 вачкакакаб дФазбатасьв ччсссдвасвя Бсвссавьчс бразесечсЯ взедсассває зб сесечечасс сдесвабеве зЕрсабссяй адьбассьяса сігссесядроЯ гакзуаєаає БЖ ївасзаБасяч тачацстває сабсрсдесс савтастаса атудятасеяє чадчасссяся че
ЕсасевуєсЕ ссвяавкбає садсавкама ссвмесюквтфес ав ест вес вену вай кчаЧксекжеа асЕксаксец естесавсва явебаксаяне ЄЧЕеЧеечЧОя вашекачаці вай зацбацьсся сеазксаянка ЧЕБЕЧсясяж саКЕуЖоуєс асБессчсст Еепауацек зай тгаасссащі саЗбвосвЕс счусчЧасодс недчсасчає сабсакедсе ядсавссвева зав сеяссЕссЕЕ хаєсаєовна сссагацятяс аФевсчевуде зпечевевяд чЕсСЯКЕСКІ во ав чЧсузчозесч сесесуссоч ачечеаасчя ЄЧатечосеї Фесцусквчес чсзвесочая 3134 бекксзвзсяс сокечсвсав чесебкоуєра сеооцкссеае сатовавеЗ СесЯЗсуата ЗІ вдсачстссав ЕВЗссЯссЯЯс абчЧпесоЗссч аспсусточч сбасчесекУ ссааечвеу зач сдасасавяч сбчЯвЕччес СбсоссвкБа бтуабтосьсь суссссеяус десакеячча запа єдеседеоЧБЕ делздссася стічсссацає зачесячасуа ссаяссвессяу зддасацебко зап заячаєстсі сФстасБерЕ нссадоссва себсявссак бопдесаеся вбсяхсасоя 3470 сезбкЕВвкше свссісоесч зосасатцой вечечекЯдче зкачасьЯчса счсясеуссо зав тасвесвЕшеЕ ссдоскоєве деп децес Четерогабу садесєдоавос десобожтатек. 35 заасзлавас соспсодсаєс ретстзасяу агссастась ссаачадксЯ садсєсанхся ЗЕ зекеЕЕЯсця атазасбусув арцедесаваис сваєсесевщя садваєвкаї ссаксясябе зей кшекавессее ацсацесшеа сосячеясає сесосусвоє ЗЕ ЧЕссо злосасеЯпяе 3720 чЧедеаецяте бссдексеВек стесчвачас ссоачскадяс соус ччЕ вдосьсассоя зно сЕатсацааЄ данесассца састсезосх авсуссадеє зессяскасе удсайнасесс знао сесовассюда дсавсавсяє зчайкоЗкеКе сек сесує Зсессакная ябсгасаває зпе кров іся цсоссскуса ссавсатуєє ссадасстотс аїсусацяві зседсечуєє 560 асессчешев асасстясає сЕдбаїсавс Завасаускоуз саєтсяєсссь дадедаввее 406 гсіссацесс сесеусассе зтастдсеяаЯ СЕЗБЕКанЄс СсасаясцЕЄ соевУввасео апп тйесатускся Тежжскачкана скор чеаздсасоске вскстккска вс асса 4140 квсссссасЯ йасачаваєс сеосккасас Зчдачасвека чбдастязаєс ачуаааєвває згай єпоссбравс акапессяст стазбсвзава ссазасвека везбвкосяя адалаевсав Бо тзазсЕччнс зей азс аецсадвекнь ебекчаакев зКЕсасчасе аетстаакей з32о чСЕКЕНЧЕсоє чедсзсчччце асечсоевссЯ даддассава сстацеЗнея саду «Зо чсошевтессв асчесстеЧа уеддавуєав ссусуєдеся Фусвксссвя яседеячКЕс ач «ЧяЧеЕкес сусауусаснє ФевкЕссдвся дасссвевяча осяє сяе сефшрсдесяе яЗп0 свсакчвеви аксксеадаасоь бсадсуєаке СесввесясУ сецдіазваса афеауасаке я5ЕЙ асузачсесся ссасатшечса сасесєсфе саєбечесЯ ссасфеекі сфессеевке чай чЯастастаста гЕсзаасечЕ чсадчавсвя сксадесаст седасуєеке саєчасчатх «чай абЕтасаєвс авчЕцЕсЯвВа зпЕсЯЧеЧУуєЄ чссечЧацсне Чдеведесауєх сдасуєсчюте аїкй седесессва стасецаячає чбазадсзчс асзадесаве ессадзецуак Беазобвосес ан кчечсчваца ссагсувеве сасятезаає Ззссачесае зззавяєсст сесгосавев яв чсЕдвЕдчес Чацсасдсачсс саше кряасс суді чсасрсє гасссевеся кос ЕВаЕ 4920 чсачесадев госбдлецдьЕс ацтяасадесу бебБЕссцаза зсстасаКекеа акчсесккеа зво
ЕЕСЕсКоачка чЧебдечезцуг ссчебоедек БЕсЕКетею себе бксересаае ОЗ
Кеахсасесск асссасевося сечсісеовас Бздасьсачдеє сваєавжаєс сага ійе сассочісяє асзосьсяас сесачечеяе судесестає Фепеестка частечекоє ями їсвідвуясї Ффесассванав ссвавсоває КЗазсасска васчавччєс печссаскса задо сесацесккЕ сс тасесо саквятосау засажаєссая «част ябвоседсавне чай вачаевеЕжа віксскаєте авкстссост атавсдасес ябевБіваєс чайревчасу ЕТ тЕЕЕсосЕце ввасассвавя віасізсасс Баксссстяч «БЕсчечЕща соцсгзацнс 54де ссоувалатс вавзакЕвсяя БебФскоцвв Єйсеруадєс ссавааечеке ебепесестя ав сапвкедате авуавакЕдо садсасяадса вауспвсьсеєс бслазоевеняа Ффексодауоа вай вЕсЯтОВена зсадосчасея гфоледасуєй срвясозуасуєс спзачаєтас Фешевкосвоє авіа чакЕссоєссс сепесяссЕв зааансвовс дазусавсуа зспаососво сстааесяес Ей сакакчаста засачавехе саксатсучевсе обезесерає зайазесчаса савсоедсваєс вто чевсЕсадЧев ЕЧЯсСейсасв Часечатсоя касттїскавьс адясасякає сасеватуєтє зЗ76а «тасаачес сезчцачнеу сетцсаачасау сбсечясяаєс ссвзвадучєеву слайесуває ва чЧесссцавцс гпдасадсся Састдввчаа деесвядасве епесзавесо бочекодесу БАВИ санацістсЯ савсечацех чькатасякс звсесесаса пссбасдесо дексвесвая БафЕ скчссццавия бсапасостес жвасастазва ссаастаєся ссаксєсува Чауавасва БИ сагусекдаа авсаасаязаз ссссосучема Ксукаєсьяс чацаесасса адассадесе ваей сесасессва звччаччате сСесчзсчадос качЧевеачеес ччскасавчт сссдьеассю БЕ
Кзбасавзевз асксаєчстсесє асассуйдссо сзадассачс савсессладєс деассавтят 81іБШ сабечЕсасєе СЕЧеечаєса скапдсавдее чєачевеодаус есугесквся чкесеаєвес аа чедесасерьЕв скбусссадЧа слгчеассяа чЗсеукщедя асджаезсаєсс ссчеескчая. 653 сшсесучесяу ссзсвассУЧ аасссесаса вечасксечла акдсасвосч агадесЯкеа Біща шапсццесасв сбкосдєааке зачесцсавоя бек а сссавчавь сдесвечсосчя вч счЧачсавччс авЕчасьссЗ зсабечдачавн сЯрбсассак зесаваячсочеФ сосктеЕссаве «чай псесдчавесссо аачодуссаФ вачаксачас ческаєяччає адевсосвсв всавсасяВ 540 «чавексЕса чазччЧайасся сосчЧексасс ячЧкестакс счавнесявоє асосуєсавкяс вп свЕЯдсоєсая їсіссвеБЕя счайчтласав ЕБбасасякоя свцасеваєс дедежввссь вав чЕЕЧсояссс вадуцесвес ссЕвБечьасв зассессвоФ дЕсЯсссвЕЯЗс ваазедсавве БУки саицессатєес такадевуєс Зенсаєдзсва сесчвсстая срубвеЧава аузесечада. тя цечацеача себзсачсве Есуссачесь сеаважасаве гтеванвнаце дестасаеев. кяай втсаекцато чбебзсссеч ачдпсовацеяа скпсассвав зактасачся вабоесвяс жа сасрвазсеор нсасдестяс асяссасгоч едсассосоюе авяЧчсдссс деягесавооє ев гсесЕсесдвер єдассашоєс авесастасас ЕсаЧсЕсоЧЄ савясоррсо сакссавсво "ах ссесасеассх ачеавасеек сстассесео зазору яазгажаєдеє афевакссяє зов чЧЕчазашесоє бавакчесеосд саваазосскУу асесасчччч сССЕЕссавес сеорерссвавя "ха: аскасссаєз Кдаваксиєт заїсасчата сасзавнасся сезакЕсувну тасгчєФтаває това счекаватхвавнз чЕесзеЯкцав йсевскааїс зазаазаусас зЗЕдЧадааєевие тадеЕвсюсь. тей
КЕсачаєсая сайсесКасав Бсвасссссся стбсодеавя бадттасаде вафеачевЕу з359 тЕсвавкаяле Кебксвааска саавкатанкяа каєсеавттає бедеседцесее вздесвасау 73 асваслечсс аспседсасся усосочсосо редесавсео свадсааска ссевесуся 744 аздсадосЕвБся сесвсавссо доспзоссяса асазаБечее КеЕвзввзаксе КЕБЕССсЕща Кен зайве ЦеседайаФте сеусавсссс СедовесЕсо ЗснЕссссда ЕСвасвсв я тя васеФететя вазадсачехт бссачавсї агбапесйсесу зшаєвсеауа ЕБессаваакт тей чессетаскаа зскавечсвя тавасазсаї снтасавсак астасачсаєс аодядесове лева вачеакацєв ерсастаяаає зачасакссв ссоавсевск Чеаслаайсься асосстаяо тай саєксечесст асіЕсууессе сСеЧцкчсуєаа саваєссесвза васчдсацес севесваєсає "вав
ЕхскФакцдев акзуєксчавні пежаннасся савчассєтчес ассстчсевкс сагрсвавасяє 7ЕБо асЕчссучек дсауссваєсу зесзессвчс сдазевкатє азабчсусвве чевсвавово тва сстдаослсас чЧесвасуєте Факс оасяй вадакодучаай сачассзвоч седасаазас 75 чесавесвоас сачсачеекя сессазесває сзвассвяте дасассьсов сеспедазай чо кчассвчстс сдечавзссав Бтайусаесі бзаатстата зЗвасесувеає йсавевайячс Ва заседассац сЕгОосуйаа Счаансцсся сачецпесаайа зааствансє чсешяжеяса вієв азадетевше савежстаса асчадчстайх сааддссстс авасводсса адап ваше стадсасявс десацієїчєс дзазссауце дфуаадеесес яаазавсзач бедесавкев вІят сасадссуїс ЕТпааавсає цзадсявася асуаадвуе сесектоссяє севеЕгсаву 8345 пкЕсЗсеуєсся стутеусссо авкоуксаят згуєсссасьс досесавске седоочсаная аво чьссакссуяа Ссесосчуясяц руасаєссаєс часябкссуц гчаайсечбся Фассакотє ак
Ччечачассач ссявсасетча сзсассяачавй адсядссвац собсвоживс сецеочюсево ва сазнсчясься ссодчаствдяс стесечесва часирісвач Сяасодчавая нчадчЕсчас нена сздезгчФес досяссстрецч чдсечестсас дедесФеЕссе забаоссгорі пудессанвася. неж севатьслста асавсядкче свісасуче саадаяачеса Едфесетчаує БЕдссзвеах вто кастасапйвє саасочаєтс дсячасчеас чадеасчава лазазаєствя стзссваєчу ве сЕсодескЕв даксатасес узавоасьсву чезоскбУуча азкччтется Фпеськаава вяй аагцсеасда векщаєсвося ябсасцессс КВЯКссаасЯ едесдевозе асубсевваве вай тассусєсаЯду вечссвсвоЯ Есесодсанї кссвчщЕсяе сасевясчеас вусусефаа зай сапосцааач псецсдаєсвь забадпачцас чЧчсавсяеся Бкозаасечся сузасассяає жошо чзсасясоаз цсоатсттча сасявсссая двачассак дасетзасасц сесечате рев зазззаваца сзайсотоце йвчссоусвец васачесцєся ссазаяаЕчва Зеоддявааєса. ЗЕ сеасосстясе дес сдав дсвудесясо здевччоссча анісссзава двадесвзаяя ЗІ чдезагсспавсе сетсясттцає джскасевча чодчаскаса «назчаєсссче авазазсках зга завстасаис адасцєсасі акдадевссв ясассвясся чебЕчашсяс аску аз зачсизтсвї пуацуснсев садутосвез аоддедчеляє слузчачтайї деесоофевх ЗзКй асшзакссев срдуссвеасвь Завнеечдаеу ааасстасою ссшесевчке вес ецев. Вжа ссваїзаска вцсакссах сослаєсврака чдесусссаноя свспвксаве севсвбдеас зада чецесеєкяк Кесечесвся дацаавекоа. атаспавсоа севіяпсачана взксавЕсаке «вче пасасечеся сессдшаакс фсесоювасе сесжаенутсце чена сяя вдасвасяо запо авчабсачтазая дассешесута срок всате вігсенцеяева всявсястяа спека севея Бо педа сечкає сузаскеуде кодваелзбсся зоадсЕкцяХ вазавяссва спсвзавсаау ап еячуксассо «ксувактяє сесвзватеве здесдавнецее саезаєувау сЕеВетащео ВТ
Чесвссоуєа сецнвесякє зкааецескЕ Кзедвеваєк тевавоуєсу сасавесеча Зв тЕБСспсвасЯ саеЯсвнасо ФевкяпееЕ скакеуачеся КеУЧеспЯсЯє бачпчсаєста вва ччасЕсткаа чевЕчсстЯ сяпввасзсалой сабеюссвва дассечвазе вбсоуєссяяє зав сасеуесцеат вкЕакочкяя чсассзасад ссосясксся сЕБУседЧасу савзсвсуВе 1900250 саєтаєстекФ чевсасския сецкекУкее сесбаавоче збджсееок саакчвчее ЯК щВа кЕкчасссаї чЧацсессасся Бек сссосюв чсвІвсссяЕ чаавштат псодессвея 10145 чеЕсяЯчсацая сасебезусе свосадюєсс пегзаксувс сосевевекк содещееевя заз чччсдастх чзаседеасує йесчсовауєс сСайсоусва зссековаде аабоєсасає ї1пйБа саксгчецесу ЧЕстассаси сясасоцічЧЕ ЧоЧачаске аксцечасоя акчсечеєсу зва кЕСЧВасСЯАСИ ЧКАЦЄсСВЕоєс БадорессяаєсЯя чкасеоязес зчадшесовся спо цичКая зпана авнаусассав сесаачасоя аваудсазаа вавачозога ябсаєтсасоя пебсвесяос аа кднадассач ччечачестни Еддаса пава «й1й «Ві» вагу «іже МНЕ жі меч пе одн ск «ай» «иа» Ппоажміла радвехах «аз ччасасспчс асседеукса саЯвеУєсстая сусЕксдасак тапжцесеочи савофефевеє 8 дасоскетца Виссссестєс засучаатоя ККадчевссв екасукаевс Ффоссдааєе ї29 сЕзосежячсе сЯвассякзо асасячесве зесавскчяє Яхчакиасая гассккеосЕ 180 сЕсдавиоси ЯоБсЕсевак азсавсетчає сшексясває скЕсекогпчся аеагреєеее 24
КЕдчавесько чечЧасексоу Фвбевесдаяа садолясбся Зссадвусвх чайсвацеке 350 чУсгсссвая ссбЕбассса ЯБсебчввтро зБЕочесаве щаскчнеевя Есссдетеає Зк тосттцасся ЯБЕресЕесЕ сссаставсе досссечекЕ ссааоацсвя сусСасувеку и ечсасвспив висяяскост свекташесях. сусадьоквЕ ччассщесоє вссесещеус ай
Кажаасенск яса чсас зктссввкзе дссашсвва яссявцечье ессескогос я цесесаєссає сСсдвсечакає Ффачаксувее бачесесвстса свзавчсакся садочесася вод сксдесси й адлсасаякУ хчаспяйвакс часту десасувксс бекасеккає ес
Фасопсекаас ветастстсаз чпдезассдео сеоекуєдея зкасзчвеацс кЯсессясяй тва саксайвсяв пуасосасов сасвасасек КЕЧекчесся часУєссстад яЯсасаваоско "ва твасвааннав азуссвваае йежесавува авссяосась зЗсоссаскає савссаскаке Ва
БЕСЯчЕсавзе жЖЕЕсопцущасе ачксустеда сФеосакасфе КАстевеаЕК дезесстней 5 азсозаасна Феккакчека аскоаЧаскио бекекксакс саккссесасу зва дедеса вет «ессцедасс кбодапячев чдсеваяесця чаша освЯ соска аевяя сквасуваєя 1720 саасасссст Чдосссплото абечссвзуцс абскачецрацсс сет сЕ Ескасацдене 1285 чЧесчесоецс асечасссує ссізаєсесяа здацавеоув ацвсежкаче «кокс 1155 секчссаВва чевскаассс сууакчавяк «Зсрсевевое свсадевскс Кеди 120 чесвакечкЕЕя Сксаєссатс ЕКстебаксс абвсеслчсвкя созакнсадеа вада соуєх 186 асеусцтясс влеадчаєссьтв акстсдавса судсвєдвсс вбечее сего вежа 1352й сЕссазета?т счочесссов сесавсеста чаптоскечесв сосауєескає безазчсвчее із чЧесксодсусау сСексадеаає даєчакоана всесекФдаса свтетевеско Сезевайенії 144 бспойеевтя склався ЯяВЕчаовУЯча Чеачасваче бек тсвеяо педбесвяя ЗБ чЕчЕсячеча ЯЕсрсосезше Ясавосабаа сронубпсзов СзЗзочаквнує ззакеакаках ЗБ сбачебевас Какчєдесак садавсаваек Бябасечесла сФешсвзеснста Кесачкаває зва авсассесяає апасасакаа пчзлававса ссвеаксаФче сесеевкесЯ евбесьспеЕ їв своасчаесся сьясуєстця КоевСксщУусь весен ся часа асспааацеє їт4а ччсалсасоаа бівбссвсянч айаксачтчча байсесауча аауаасяасяк дассвасава їЕпа севсчевавну чесазавасо діавазадяс сусяжсчека Чдоукествсс асведскося 1 «сссесебцас Чацевесасв звавсечасо сехксвачесая аузсчуєсчна асеедасвом іа зскатавача Кассевяачечь вЕсссесівУ ваястесекс деясчеесьс сеУБЕСсОВи 158 секессчсвс вссузаєасс вабесцесвЕ вегосетіся одаасевчвяя сдекетсвса 2140 тацебвсасечє Есбазжкаєс святе пкадекеЗЕЕ зас еслвяє каз еека 100
Чевецвассс ссєвпттсвос єспвсоцея сеескисесє зесвассвос яко жЗай кавстссочаса ачасвєсцвсс свсояссяео шеусаосичеє весбучсааса пееккачсат Р) апезазовас «тапосяцея сбасвтаць ссучаачеяя кчцессвасе дечеебвеає Во каззассаєсв пеозкЕсезса ссізсчессс Ясечвачося чксвессісе чЧапвезчяя За кодежеетсс сдакссядсв аясаваєсає сацскячезає яебчнесЕке сетеЕБдесаа Хана чевозасаке асусдсвдаа зававуцчаєс рсазцазнак ссскчайїсь БЕбскасече звай дксковсчсь сецбоснася внадастсасу севачацасеЕ стачксакча часа сесвад вий вазанесксс восстасяссе сЕстазасяа даааєчавц: беЕВавйосав Єбкавафкає 2580 всасойовай ФсесцЯвстФ асвускасев воссткааес вабчаєсає ЗКзксссае 2840 паєсьяресй БСЕсЯЕсссав ссяЗЕаЧЕсЯе сгдаскесес чесясакаЗи Бавсеасчає жТОй зсчнчачаше СЕвассвкса дсексавіне Касавічдата ссчепауасо сасассевсе те ачскссачав Кассачсвна авассацее зассудазеє десузасяса савссовреє ІВ
Кчсавнсьсса сссоесстсса єссачцієтає тав васкас суучавуєса дадсавуєву з2вай скЕсяссецть аакачессає чсаасуєеУує соссвБесяст фосссечава чссебсваєо 2840 казісваскс сбіссучьзУ зсчсЯчячса бчуессассяс серодевок асчасьясее зай
ЕсЕБсарсяб асавесбсевра довсвачеце стасзасчес седзачЕсаке КЕсячзедаЗт зава аседетктса «Бодацечее асчававеса чсековсЯєь Бдсевтаткс зазаксьває 32 асаксовсвьє беанчоссеьс цусасьячс спуссаєсяв зош сЯвс пачавчсяяЯ ЗЕВИ спатсвссусє стзсасячеся дседасдеде Сеадчстаєв ссдесцуЧея сесосодефо за чзачастядає ядествєссеоес аєевЕЧВЕве ЕЕсЕсцевЕс саусудсавс дачаєдссея зай сяг тдсацує саєдесчксс ацасавзокає вкдастасся гезоотасаз стесвадаає зво сусксзсцас ссебассаде сказебссза ссаскуцасс Зебовестуве зездезекее 3420 вечесаспсс зесуаесаса спядасачажх Сечсясячак бябаччсуєс дееттасако За седсеруєсь сессесуєся сзссусавсч сабдчацеся Ффрсевсскея асесспеая зай вадесячсач сасстодева аеячаєссає сасрссавца всЕддниясся ябсаажюсят авт яеччачайск чецваасцвоЯе азаетавссе ттчвзсачаве всассесзься осдсесяссвє зе6О сЕссадеачс сясасуєстеє «саєсЕсяда сачесевЕсяя Кссідаєсає дочечечеак тай заксцічсвс сеЯвеЧчеЕаа здвесесодеї задеєсаєва чакгцсствя стачквбаєса зва ставоцпадіса сечасаицеВ вас еаес заченаскзе састасапвна сеБсгесяво зай седачсваса асасдвабоЯ ссесееЧки севещсексу сазвуєсечч ваайсосавна 3зао
Чссачсечесс сдсастаєта сасессчває сівчсаєсєстсй зуафаесясї чдасрассеве зви кчавасвсоте асатстурає газсувачся сьвусавсеяа коскувасчя сеКкететеке 4029
ЧеЕссечсевас асссвакаєся севдЕЕпеЕКе всосесвосва сябессацей аессдсує со зано сссваксатса ЗдеЕвнасеезев гсзсядассас ссбескстьсяу бксавтезра Епсаєстасссе з1іза саєцдвасаця жакссесств асводчачас вісасзряжсе зйвсаодава авасоясост 256 гаасаєФацсс сесеекаєса даадсспово зккайсцсЕ сбчсвадаавс саясевасе чав чавезетсав Чаасачасац асаєстясоа абкуссксяя ч«атсастсвя аЕЧаесевсЯ ж вечсчЕЧево Зазсакаяся чсЕдавуває сасясочуату зссдсачечя секбесжеве зано ссочастеєс єксуаасууаа зсзссасас зосансакс себацсеявя ясесеадЯю вага сскцсцсаєс асасясарсс дассчарсста стдвосчяЧєЯ сеЯдеЧесЯ есавсвсабу чо
Бакдассачя сстттезцед сдсстссаай счбчсснтач засзачсвчя сабсассчаву 4560 гседссасаєс сцедесассес сесзсевессея беоусчасая ссксаессся садсудеває ча чавсакссяаа ссясусвуча побзсксЯче саббссуаєч Бстссасдаєс Фабчавскас че заезсабчкяс ЕчввеацЕсоЯ сер оесащда засос свс сФекечЧакеає зсвасеасше тай стсаскавоєя азавасачеЗ садечеваче спваєссеоце дчуйкесевекя сесєцечеч знай авачесакоч чЕдсодсяке звакУчесЧу сбдсодейяч Бсестсссенс сбесаседнЕ ана пуста свос дососарече бесссЗасЯЧ авссавсосс ссочЧсебяЯсва бадтасадее 520 ядсьссьчас деЕєсадеуса ядесуЧєсеЕсЕ двавасчаєсв секучЕшЕсс сесаєьсься «980 пчечучссасу сувессевве суєеесстс всауссстає сбсабЕсуєс аукексатсв ян ссескасецаЄ сабчдеяддеєе яса часе садосваєсна чдасссаваюс абяскасоче іо стсзсачтсяч: седесЕЕаяс Яесвсячесе БезЕЧЕчЯсЕ Біаєдастюч стевссаєта БЕЄО
ЧясЕддеасс вчйадеснаке старЕсадся сесзЕавасяаа зуесчачоса серасседде о сЕБЕЕЄЄДЕа сдшесашноЗ Чеачаасвва дев ЕЄ дестатавач сзвеачачев ваво
БЕКаВЕесоь асстслассьоЯ счствачвавч ацусававЕе азсесавте: Засасвевсе а сЕЗеаавезє савадквсьа Бесесаксве єдеаБЕЕсЯє дедасувєса адассеаува вмій касеавазавт зеазшкЕе счвакведея аасцесвавая десведсдсє десасадаве СТИ
Чадаавсмав сеесевссає вдтаначаве созсясаваче чезачсвоедця висавксвео най чЧввнясєвес вусувоцева сезкассясво асасечвача Фкасоаєчсає сесеФуєьоє БИ
Чесесксуєту сесеопдщавне ретесанацео пезачеуваєс зсцаеставе счессвееєе 5540 ассазасада апаксавсає дсасачсвас сбасавадеЯ асассаьочє йвсеусцеь ща часскдФскУ сасачаксда усоудсавссс асесвддсвс зіассассяв зесусеясав вто чЕсассваав «сусодега зуасясесЯяч стасесавад чдсадевавнаєс дадедесься щвав зважседчаса Фесетасеча сязацсасач чесвквсясча ассскоучес Фесцсвавцє жа садсдсадсся вассцесаучЧ сзрсачссев сасассісяє зесьсебкаб сядасуєєсч вла засассаває ссасаадеас гадассвааєс восавесакас сочачасцуна зсязсавете во тавчазсаде азацессеся чесассутає савсодацабс вссвнадуаєсуй псссвасасе вай спаваєучач чдасцесепцся авоссчудекв: засседскає вЕоассеаче чсетераса БІЖИ вясдассаєд ссссвсасся зссссаядцаєс савсбасьье зачецсеств аедататете тів. тассієчсся зЕСВЕЧУЧса ачсесявасас стасстасоєс касуцткстся каєсуєчеає Бе. сесечЗсстчев сочасавзсва ссчаччесЯє Яодавнедаай пессесуєь таавсеееаа вза тсЯчЕсусвя ссеедавсекс сасаваєдасє сучдвдаєтевс аестуаєопчеє чееасасаце ее ю сасескЕсяс авгсаєядеячє аавусесяес сссатесаку ассссусься сездизауса вад «дЧсазкоаєс весубеасбяЯ взавсяссЯе сабеЕчссвая сЯсаевсКес бдЕбсЕдуая, в3ао тТесевачеУч ссачвачасс чезесяскасш здчатадеасо сскасесьсе садядсявесе ББай стЕксавасяав аКеассеуєв сассдавроє гекссазаєс дасраєсьяс асаесвкася ве
Фкавтнтек сбкчечакче асяатитсасяс учессвасос катсдсчеаь ЕссвУБсВоЯ тв)
Ччсевааюфуте сосссесссу гусвансесе скпеуссосе сскусавуєче вясрсадцике тів зсссбБасздсе адесдєезесас деайевоцдес суваєсЯдає часа тсс фетацотяце ато зчадсодесв чсастецеся ческсаваса сааєкксяаав заядсасекає дюдгвакре є вва чЧаїтасесаЕ соссазчзсав чдсдаскжсве счавчакцас чдетедвавчсс вдсоватева асо звЕссвсаєчцєт стщеасавса сососчевас сзсезвячЯс чдерсосакоя десесескеє БОБИ частксаєсв ФуесавеФск зечектевек СУпесевацен ссестассова асвасвечає трай
ЧеісчапсоФе секекесасо сссуцаацсс сясочвсваа зацусацсвас ссасееааай тов стксостваБес сосясвайяс ссєдасссяс упав ос спесецсьсс вавзяскате ятьай пасзбсаваб сястанссвт ччкасясуаа абсуссвавс узачкасоєе зазкососкаа тара тваччсеасуУ фзвавКсзек зассганазя чсаеУсчаув аячпсаакау стер кссаюа таб
Єсвакадеек тдспайсаксє сссесіссод сазКкачЕвКа сезсаачкая басчкссаве 7320 свдсссксса абсасдазса гасасвесав гсаксодесе сесстадеск Федоавсавсо 7385 састсаслече ассодсісся сссасчдаса ассусавцея ЧЕсдессасс Фрсдацедес заз сЕкЧессаса асесодецує сосавсазчав сСУБЕБбабва асЕСЕСЕКЕС гедазазаца "вай зазацесеза зацдчецасяй сексісчвес Сеебадасек ссраесаае сачаачеещЕ тва
Бесдвавціа сосбчекесач авкраєзЯяче чЧсазачасве сидакесеза забавки тах салаті асадбсаєчса Фсаксасбяєв асакассаяася дбасачацяє подеадааав Тева зусзассасі завзсазавса кесдоєдацє азесчнолаа седевсясся зашесаєсся тай чесосвсвЕся дсесцесшсцє Зсаачаавсь содадоуєазчк австксаєваа севекества тапд дсвабччсї давісчаваа ассасаачаєс сзссвсесу сесбвассво стей тазо часкдсачес васодасавс кіассчачеє Засаасчеч сетвкдачоеся сФедеосьчає тзга цсаслссавнс дссесасьвЯ зсааабвассо зайвсачавес сасосеЗзася запечаесве т75аг свзссачсвя себдсставо саатсчазчев абссейснес Бссассеесч вавайкувеня. воза зпссепосяза совуєтавст адекедавстс такччайстс дадцсдсцвся вескдерееох вхо сизепстасе Зазчечааас дбсагаасча сдавчансса вассяскаса Базазайесе зіва сисосбвасче Чакзвсчачя скаксчачує седсяавсяч дссвачявя Зевса вай счссвесації стаевачевс апасєваяс ссксвявтая саччесосся весссасатчо о суксстдааяй асацтаєюса зяставсзацвя йчечевсьтя ссяссоест сесядсссвея аз с десастдеся СесравссЯк сачечсасев Ясебадусс зеЕбесачач бував ягай ечакссеися аеадкайсає Бавсопвезве Єбешедавнсо зрсадасстяв сезсзбчатча века сеччссявЕя БЕдасясвес чдазнасаде савасськов ясіссечЕвс Естосааєцт БЖ «сЕедееявеЕ ЕЧаСсЕВКеЯ созацчачукюо саздкцаєсят аавзадзудс бозавсаФвае яЕЯО пчссекасіс КепачсЯє Есасусцеся БЕдсавеаее есздетасея насдеваєта акай ассавсассв збаетатсак чЧесісваадая ччсаспусие Чдодсксасся КЕжесатр ялап авассайсея асуєтесача? часдчачеатс пайазачатя сососочеса асфассеге ато сьсьучесай асесчаяакчс бсадяацесе сесаавароєе десусяссос чЧааваавачсе вва асчаассяас асозяясася сесоссчсрес часусусстс ваддесастсот ааЕскавесае вві «чес сееубеєсяв сасетссава Кечесяибаче чдсасачсовс ев аз азчацесаса зечкачкана ченко еави есте счавнос пдасчсувася ссвречсаєт запо счадаясчачи кідасатчає чдачувпавца ссабдасесда сасусзссяс чаясадеваа чо задасявнасч ссддвачстся савчачсаці сусчееадава єдавасядчая ассаєдевеє 8125 кУсЕчзчЧесЕЕ содаудсацес сусесвавеоя ссдваакссс улаачанясе авачесааку зіай авесесткУсЕ Гуацзасзгає гачайсуває сасаачачає седеозавчач стазагаєса захи суссачасце сассзаацачс асеаасцесв асстдосбда зедсоасвеса Чазачсоютсяв ззОо ссабседалос дсзасаччсс сеечаччтаиєх бадчесвовса Фазадессяс сад осяває З3Е0 ттсвесЯсса сусзчаасся пставассе аседспоссе гусуассоФс сесассавеся захо «чстасчссвЕ всабессЯват чЧасачесцесс сзпчсвоЯаб саєссьясах заастетеса завка «ЕчЕвссФая сосудадаила чеЕдвачебеа асявссавбцє Ядааавеаче Ваберсясвост а чЕсоасоуєссуа аабєсясссос васссасвяя ссесерсвата сшваєтесая стдесачастт зайо цизанасеся сусадассяа цачсясчадає чебааєсдава севаєакоде Блсошеоя чай якчексосасв гочеечаана срсдчясазав вчатавасав скачать счвесастее зап щесссссчаа срессксана сезКасства БесЕесаенак чачавсЯсвЕ ячсадевчео чив сакасетаде сввсебавея ветксасовас ачеетеване щетитштаяє сстайсстає зі ач авя закезесЕЗа Ессе оФ зУсявачета чсУкКачнеч бсчаЧдвсе ваш спгавасскас соФесшавоє зечдасаесчсс базачассяя авегасесує сват вай чкассккзас сбуслсаксо зсадссссяє ксезсЕЕдеЕ дасавізачес ссвеєссввнцаь 1528
ЕСсвлчусєсак КЕеФецаках тБЕссасьоа Кедевсчаєс сутттаавув ЯЯсБеЕБЯтс о, зпавО ссавчатаве цсечЕвЕес свцБесексв сечкаакава дсясссясся ЄЕасцевео вОїх4а зсаввсзасчкя даспсавсвя ачесосеан: суассоустає зБесосочаЯч аеєочадеда 15200 сасдчвсзає чсеесадетса зачесайвсса счаввсяЕч авотачечея фсассивеВЕ 14зей чесучеЕкас сасседсясо чкаукосуачє десааксокеа дссувкечея йссебксоєа. 10330 сасачкансс акаскчсссс астачсасбу ауссузачес часуссясва ясадяаакиса. з1о3но сосааєссзач ассагавчаєс аечаззадас чевадьсаєс десурсссає счессчавла 10440 сезоошссач січаіячася сечсеччяса сссасссЯса застдаватту акессебдеса їй хЕтЧезссад стсвствсоЯ савесевчЯє содаастЯЕс сесзачетавй веслесавят їпБей аеесЕтеусска саєвасевне чсскаєзссга зчсавЕесцу сЯкасачаа чБекасьву їіовао катчакасєс вебетцецеч чдассесвБас стусавчутсь свававчєвь асзскочаяс іовай азввнаввасся честавусав зЕстссевеЄ ЕЧчсасечвс асаєсааЯкс даскавєеоо мч
Кесесдскесва ЗщасЕчассе свастсуавай сучасна ЧФцечасаав севетучаєе ій5а0 акЕскначякс савеєдвоссюї Фесавссдтос дасчсвессьа супасуєдає чассствавеа 10580 вЕодсЕЕшсОосС аїексЕссЗа сачассудеЯ своадзетає адфетосаве девесеежее їз астїЕцатаа сдЧакттсяава аввасбаєска счеасЗсеоь сксадасете сеуєаєцсе ї1оно тавчтсаїса чтансскека зексскасавс сзесккавса ссчаскоцав саасчасчсс 31040 кчсчакчовч ясаксуцека КЕЯсеКочкЕ вайпесзаавоя соскосчвеся зкедечачас Міо ксячссачечя Бббісачоакяч забчацеябак боЧесусна збееснсьча чзавсвсавов іїліжо чсскдсдяст уссясассію савчаєсадеа девасвачаї сагестбоза Фодавзчасас 117720 стЕактвасяся ЕФЧЕЧчЧЕЕЧасд асЕкссясек ецдсЧахещаї. сежетеверь ссстасваєа 11285 чазЕцесЯЕс: Зезаквазаче зЯчекекеус Зесзацаєа асстексеча вакчасевеє 11390 сесттекЕстас збасссзайц саззсавсцаа зБеатетате Чеучесвала часах 11400 тЕдазашсас сстбадссаде сазбесссбя чосвасаоса чеваседсяйе: аегбаяочаате ї5450
ФЕЕчесЕвеве свсзсвачсЯ агекзчааця асбатсесає сасекваддес деасасесве ЗЕБай азаєскаччь зцсававсеЯя бекаавЕВа аксесвсввяя зеКЕНаскоу зачесане З1ББВО акавоссдес ссоцебебся бажсвосзає Бееуаакчча стався екесКБЕщЕК 31640 сссваваєавя сосчусуссяся Єдессусасас бовесчсееь баксайсчєс втече 31700 чдоевеЕсвацас зЗачсессуссе сФпцасачаєся бЕсвкаактя абасеаевес сеЕававесе Біт чоебатавЕст сБЕбЯбасчеа ЕчЯсЧєсчачЯ сачасчбеке зчассатаве стчанеакса тТ18то
ТеЕБссявеає ЕссЯжсаца авЧуксуксає Чабсвясааує ссесукакео Ядецусесвеся 188 всагесядст асседдаавса фсачпчактан Часоаспусе авасчччаєс стесетведе 11545 часЕЕдаєса ссаящаєвса састасЕЯвс дабоєсчаєо чЧЕкоужесуях Фет тсе і2094 сЕдвсзЧеФе ЧЕсавдоссая бдассдєсує відасставня севеБЕКаса ааквакеуєт 120852
Качащчснсук скскаскаас зуасвайдов какчакаста зсаочасваня авсвеккаов ке задсадсваче здасавуцчє сазкаскосо десзацваоя аксозааеча адстєсееФе зіва тезвтсзазеу уакебасеча сазозкЕзнис сгецскчатса бкбседевотї Задеосвайее 13244 бдассазокца спуєесказас ЗапеЕстасос поч сеоекач ссвевчасяє зеачекевия 15300 ппессзсасеа счсессавда сосочцучева чуже сяс сссваскчах вбазсажаця 2368 зсзатксчаз авскЕсочач взасос ксеспвсвве ссксвасания веаєваєоюя 13328 «овясессва сешеачацє часах дспядиканж таза збесс ва. іга
Звістучес се еВеск шескечаєоч Єстсосекссю Кс сЯвВЧє зічКсВКує 18 састттсакс сусецачкок паосасясєся сксдеажуєт дстесвков зкозуєдаєкх їси сквсцсссас Ззуєчаснусї азс жа чеку Боско св абоспясцяса ВЕБ вхасчасеце суевасчске састозсазу зксасаусса адсваасссаа чесцєсацує вита всочісреча зусасошоае ксустзчакУ скадаисвесві шесзаатвнаає сскецазаке із тЕЛеЕакасЕ суч сбовав ссжєтласчару сзустсовачс Зблевсветя бакскасся і15848 кЕчсваака чЧекспадвааце сеЕсаЕчеВя чех совавс ческзчасчач авсозаттса із єжеккочкоу за5счавсксс пееасанса соФчравско сестеуєаує вебвеааяс 235 декасзсссе звзнуксйза асезссдссо азссщетсеве дессесчкса закспавексе УЗ сваазацасца бсасчазчася стазавтсосу аадевеасев фреска ча свеВе зазас «сечсстссе Ясасзазаас чУсФфскФчася чсЕсавссце сстчксвеся соиВиоВу 13145 всавстесяа вкссесазас Заснаксане Кексажссча «ЕКзсасоав Фадачакчимо згас зіІєдвсчсда сассесцаце забассевв асакстжаже сесстекояо ксвожавтає ззаБЕ чвезакочкас чідакаесда Чссдочессос ахяесЕстщс уФеусавстя пабоФатеай. 513328 ккссксакся чдашисаеся сявзсусвато кусзоавеаес пзозескчаво поЗссвсаВЕ ї358 пчЕкнасваЕ вЕасасясЯк бЕВЗЕссьЕга БосяЯсЕсамс паоксакеза сук ксУу із сасбцесасе збечачарся секочавЗее сзазеаеЕ кесфектЗачи Бек 4525 кдесцтспає досактаквка ктаїЗзЕткоу ЗусОнчесве скоучесаза сяскоаееоя кашаз стачеацеств сессеазеч ск тонпадиа Ссодассесок ассбсосяче сасаєвудесе із здраскяскос ксзсдоціввс ассявсастя здеаяцчесеає сававЕУВЕ сефеездевве зва
Чксвокчася Боусскацеа свозебесас зЗавуссясвс всеваечЕЕ ахачесезЗив. ї3749 чессдвстна коасачацеЯ вчвскасяве сезчсзасея вешесевчев асавскасоя заг зпсчсвачаз заацсахбза сачецдсачев яса севстаЕтад сссвнатсеия ак зккачеческс соссзсязуз чачазчнасу чЕчЧЕтаЕчеЕ сзсцоуаав дувасувсся ізчаа ззазчакссуч Кчацчакосбає согесетатєа скдуєсассве сазсазсевє авочееевве із кЕЧвацасЧч псстаксатяж ассвекоусяа яхвсБоакаа сескасаско дае з1аа4й авзектаваЕ сеснсавесяЯся «есбассясе соФебслатає дссзвецсЯс ватассясст хЯ10 акчаксакстї десвакасає ядстсассьсФф Баєзсесвкацє севоясасса ссабосасуе 1ЯЩ6х стустаєнстт сезКацсекЕ Еседесеєєся пествавсча усе цвя сачсцсокає їжхво тексеспценя еалрсекстсяс авестаасаєт гссттасеесе жаксавсрвс соасачисте 414280 сккїсвтчцая чугавацвчя васчЕссабса адесезаатзш авазацаячає пасзаєсьса 143140 седфуссасає сяасенвасятя тавчвееьек чусАакчекає сцстсаексв се ванас з4ч4по закаческаса БецеекКяче зтссясовача возсваяЗЕеЕ ЧпбсеЕвсаєє Чавассячея аа авченчсЕлея ЧЕБдавсясуЧ восбодесачі воезеассЯадЕ боОПлЛесуЄе адсозасксає З452й їесашецетЕс Заветягаєс часацястса ствусоцеаз зедасдавскс пачатсвдаа 1458 сцесзайача «ваксасаке аФфикосявех астсаїксся совакзосео Чдсваадасає 1564 чиссацудеахє зсссавасасе скчссасссс ботассскос асксосіскс везсаздаціє 14700 встсеітссе дасісцесеа сзаяпсдсвся ставасскву ссісвахсся зассвавакеє їж"? кявассосяч спцасаваєчес зіпаєсссява сезосаваєс вкслдаячеь чаяЗатчсвє ї282е ккзеЧансва счаваксечке втбозссеас зієвьстояч сесксдстеє свбосВчатЯ 336555 жЕсЕсаатже ксЕБаджачас зададспече тадсь«кудає асевдовачеЯ чЧвесазняея 1х1-ж4а сезречзеЕЕч: ссазвздаадає аїсаекасяш аясодасста седесссва Скассовяшя БО асквсаачкя дсасвсасуює сере Бсевскесвсо савстссвєса зааБЕбуьеь їй сбЕБсяавай сво ссачвя Фчсцесвчцек сачуєсаєска зЧцусаасеся вЕБусесстай ї5ао
Еесцсассва ЕдЧеячазоя себтЕсевик вВівгсссся бовясасваї чЕтодеакта ЗБїв сучЧесваває: суадесснІєс зазваЗадЕа адвецдясасі сасбчаксуєьв дегерядееа 159240 касссаласа здачсасучес засезсбеа сгясуотеце чессссвчас запасу то
Чкчдусязак: чсклУкссас Чесасешеа заакагасте Засвесвсас яадаолсесве вче ссачсащеко ядечсетбЕн сакччессввя аадеасасаче Фусстсасвс забере іа здседнасчтсає сасоддессіс асстачтачкоя абчЧессуатУ Єчечесексь ссччявачаєся і85аво йесспесцето «аесеус цях асссвесчсс васкобеЗЕ сдвсстаєаз акчедексад ї554п сезстучаєс вебедавтік ФссЯкКксчцсавч ядссодксся адчстевезча сечею їзаол йабескачец сеууачєсак зсесссяас дечсзоЕкца созславує? Часезахсав їі5ЕБа зФаксайвсле птеввеЕсвет досЕссвала Бдасясявкеї сскслав'ає пасезажевах ії чедевсвсце гдагзасвсаї сксегсвате зсрагЕФфсаце сагсекеуає чпеесзесуце ато стусчаєчад сецеозказеа сктсзсесеї ВЕсЕУстава сссівавско сСстассясся 35 вЕсЧасеажккК чесне с зессоваава асавсячяас зЗстаатаска зеваеасаєе Мао засевзчацев ЕЯстссдоая кКедесоєсва зачесваско чакопетесяйя гФфраєсдасув кеЕвЕО ацабкстсса бсоаковесса адссесадеако чабссесска сеггдакада ссеаваєава кво25 седаазачта асо зЕссціодвах зезещасесь соосвесоує ваябЕкосьес 1508 ссавасчата аззсозЗзваче чксассоаеу васесчасек чкессакасу сЯєзавсаку 151 ксессчкчнк ксенон чесаакааЯ кдсчекскЯє васссчцаєка сестасвшсає 3652оп зваавачнсвя сеосвЕсссас бозсісачся ватссвеящс сеяссассяс забасахаає ЗвІва зЕбовізацай тасюзвнайсов кдавдесснє чсавскеаее Фоавсачеко Есасстєсає ібзаа екЕсесакже акссацеєсся сесуоопека чес єЕ ачсдассецу савсоатує їБавВіх -даснсопесс Чечастдсос сеуедасвоє саванцавесвс астсацчаєти гадечаєаує кві сасавассцсте зседесадесе асудецеієас гозастаєва ясстозеков ассвеудаяях їв «сачтяЕссе созасданує асссагасая бозаявекек Бедсочодва супссавсяво 1Е5Ж частсаєсчака кекасласса ссвусчакас асзосоасеаса зкесзеозеса дедасаесеца ї6625 аясячасскя сбестарсяс адабссяссяя ббосЯсвавс ваесееруєся ссесучесва. 15455 тзакссязаз йассасудаса азезсебчас зчезезввяск закасусеке «дачі зт сечакстьсче авсваксакоє ачакаасеячЕ бассвавкачк Кс оєєт фо сювь аку їчЧасасваабя зкссввався басачасяах аечесваска весясЯвстя седсчусачує ЗБави сецсеБссас засесччаяа аопсудесеє савнсусавя Чесезесаввяа асассещсеє збзай сакстебаУє шетсорессої «ззЯссчячс Чавес вса есаксевсв Боесрещотое 165955 везсчачеке аБВкКсаксеа зсястатлся асазассаць свааєфкесвчє ЕссавЕсавЕ 17245 сдаактскпаса дбтссочсчес собеквсочс сактевевся абетскечасу бадсексове Уей асзачсскя часгосабеас кіцадасаЄ ссацузучся зБЧаяспеше сакессвслає 17140 сЕчБУєсВвсЕ стітваста ссЯсЕсзяду сбвЕсткаяес акасусоцсо вадсоедаєяс 17356 сецчбсазевУ зЕєВвеЕсдеЗ Едассасудо свегавоєре ЯКешесетаяа вЕдЕгОКФеВ. ізаао честавскатх сяивуаєстаєя БеФрсвссяс ссессазаву вседесссна зетстщется. їіт3жо певчіссач: зсвассяусь бчестсьята Звсбдітеса зЗсзсацеєуу зсведаєеве їтапо счдссякцасс сдеачоочесЕ сксзайававс бусзсссцай ассузоссча куавсаасся їтавБо пласатбссвк зсЕКЕссавя спусасачка ватксежктає Фасасясеев епесецесЕе зай сяпачеккас пзсосссесу пазеескезе завхчедетї сссустакев апесвеецяє ут5Еб сссспесспта аск асочезейеЗ Ядасасецева бставявтсрза ссоЗдсВваСЕ. утБ4б квосвнсятає сассксткце бесксткетЕ вавсексонцЕл Фовасеавет Ковелі вітає сизачечаст бошетсассєт бтракссксев Бчсавьсвзсс ЇБбедесечка кдвесехоще 17780 сезачесабс сабсістався застсояабах зббескеска вовчаччакя сус цЕ 17826 сусетьчеся чЧепцасоясоя чеансаєтею зезсачесво Беспаосюуєся савоєсавє їтая8о касоваквяє СЕчСВссце чсЕЄсеЯсксв Февссасева часа кшЕся спедававее 171940 сяссссяаре чазаакссьа гдазокакко секФскесяс ссацкселісу ссекоувусоу зво скчссвааса йвасовасавта; Кабсчачакч «асачяссся арссвстоде кезаєзеочУ ло сетакайснч ссівсвсаК хауніссість зсісзасвав гсуузкацає деївсдасят 18120
Зческоааса бассауесма діфесасаса аавцестеце совчсвекає заеупавасаа їЕТпо казссктЕса звебфечеяа чедазаксчя счсЯзекок спшсзанеобо ассясяеве 183545 ксусачебакє сцсчасЕКЕЗ Фузазеуксу стксазясясо спегсаєвацеє асаасрецчеце їівзаа счЕечдаєсач ясткдслосе Фкабасстав дозасасдєос товпсодеасс усевсаче їв аФачкдкесяЕ скецезассо ссечсзасес вапвостасее сувечекаве честсявеяе звід пччачезеЗЕ сссскасчс Чабаевкакч зечцеодасаєс сасбозеває зоссоасовос їі8лях сччеакозла сстозвЕост ссазовчсяс чдоовочаста сгадмиааке Кесваєтаюи їаБ4О севзавксосаф кссзсскквав чЕсаєсесКа чсвавсясає сазеекесач ЗКсЯдасасх 1883
Бевскксайа КеакчевнсЕ сетвачедеде азсавакоя сійбайдачя асесесогсу їівево сбцасцасав аябодиссасе зкчащеасик баасезсяес вабосдестаєс чдазавзуч щи. 1872 ссачевечЧес сядевцасіо ачяскнасса асссцесвоє січе асесвссватс 187но ачавсаєсоаоа ковеаєсцсї ссавасзвяу дссасадеєва ассяєдасся звавадеясе. 1ів840
ЕкЕсаЕсЕКа дезеакксяс рідсецевас дассецедеа завоєсвеач асаскесняаї 1їя5об ччсзочсвня статавссяс ясавасвоска кеБазЗзесксаєс заабсесзавс аазбучсесЯ їБоКа ссксісчаса чечпчскяадаа каско каЕ ефсвасьвкє десасанася заведчецас івОщи зчечпеецсо ЯЧесесзвабса техазчавск ацсацссоса ссясудедаа веБасебаєь їв сккЕсзаццов пвеєвацисс ссасцеебев Чдосазсазео стпстлвсоса свадетаєве 15140 пчсеакасче сускабчссЕ гсвувакаав гЕсспавастї сетпІсееасе єеФлЕваатя. 1520 чесвасесяве стобавсаса чешесевасе сусвбассее Ззссзсяаея сад воя ізиБи сетазчпдач зезсваасала асестярсас зчпасвачасев свзсясчаане сасвасаєса 1332 асчоназесс зачаатесеає кодасрезосес счссасвасе скпедсерсею седасвекаа ззава бечасастас чссчссоввя чсчакетсс ясвассяссв стсвааетсе ксдасваєоє з34о акибаєсдася зсабтшсвив весстачсва ЕФеЕасясвев сесрссяссв асвссвесав зва тестзасцше авучеааска сдссваста ббсачтеіааз чачачстаєз ссзачвьсее їв сисчуєовес сзачесркаас чЕсезаевзача сптадсстасаса чЕасевЕдта КсЕсдвасас із еВебЕнсцао сосбяскачос заезазспеася авсяттеяся чрчаачеесст зЕдЕававех 15689 севсевсцавиа посдассавчУ закчавсяае часазесязс вачсезсаса гсВауБЕває 39794
Чевестадає состдчееко сужсазаває сяссдясявс БбеедаФуєе Есацугааєьт з9вов зссзседовоз чевьацсксв едсестатта Екаадсесав КсЕчаскачЯ гасасяссва ва. аачалозсча абчачаасує зЕєсцуесчься астесчабся слзасваясає свацесавее ізагй сажсстацесе счагьчачяє яссяссодає ссессвусоЯ сЕсавдавує вукесвассЕ 19зай
Чесчетеесе сассоссдвя зодсодвасез Фачечасвоу авосовсячсо дпаадажвноса 2504 сесчасеекбя сагасачсає содецаксав Зесвсевуєва авсцсуссає єсваФфсувс ФО всячессуаа дасвачавуч сзачсусцяс шасавесессь сесечвасея стаадеявси 2160 дЧасцатаату асскусечцав есясасфава сссасссаас єчусадуссесвая седеусевоя «ака сспесяесяє йсесечаве: Бавбадесвасч савяддчасня клактесчсеа еавесвечсва вав ассяасайсся асасадатте чЧеасазессак чезавскасч есвасскса ЗУаавкарсете 20340 чаззпаасяа восвататсок ЯстісскчйаЕ сябясавса сечесчвбтх сдалабаєвня зпапо сакчесскас вакацаита Едтдсвсов сЕБеБеЕБоє Здадассясяєе єуацудсаєсь аж чассаєчети счаБсьсуєт аасавсасса аесжсуєвес засесечееч сесацчвеся за589 седешесісод Есчасачеся єбкскеусат сесебскасєст чЧадсвакчєв сведадечее аБУ асксавачея сеткссевучс адесадсатс баслесоцеа ясссдаясоч сдопаказос зпБеп
КЕсазсачск Бесааазсва епфугсадснЯ зевасссадя сафеествяв ддсавсеяте ато азасакаєсєсує саасесскЧаа давався пасцясясев Вішак сечкжеснюєе ства часстстаб: БебескЧасек Етассвастс сассвдась Чезцсассвс дсачеФтеау 208560 нвасеядсстст сттаасчавь садветссес сессадачав зячакнтак: чайаваеччвя ОБО чЧЕшчасссоте засгасЯств сьвсечавв ссоавеЕсвач зваеЯчевеча Бчассецавт 20945 зсечавчавна сепеевесва Єсадоссьяча чадасавевя бдедссавяєс судевевее ро) ассадцвсце себвассеЯє соесксабчає засексшаяч асаксдесвЕ сегавсое тов чечестчачтав; адсазччаечЕ сядастасек вастсстксЕ Зсастасеая асексстщУЕ важ ю
Члспавасчас басевактсеу бссчвснсся асоувесссю сзауєаскак сачексавеє хм аЕссчавсчче савУуєеосчеу себеЕсекадЕ сетасвуава бобостчеся Есвепакась зі соч оча ассаобчячса часасчазуєт азасцесянвна ягсацчасда сдаацссаре із сєсбБсешшеабЕ брчаєваєске ччасксасаа ЯдсесЕсеБЯс асдсатадецеЕ сягсвосста ізай ссасватУє сасіватвтсеа сестяассоча азсччсаача сбаасавсває савдавсься віза аксачеуєста бесарснсса счавачасьв аксаєссабач аздакастст сдавськче хін агбссяасвнсоя абаатсвеує базассасес тасеєссааса все ЗсБоч стерво жав шсЧачсуєсєсу вюсасЕБчЧеЕ ссдлачсважфс ссчдецусаєше чЧассядасея чдатавєвуске ЖАВ чЧсасчачасче чдедагдавас адезЕЗаЯеЕ саєсеЗзачея зачіечессо тЯдрасакосу ів чоеакедатєко саастатсвся сешедедват созаесевзя уасвеваява згьаусеевсо сЕт3а стїуксвавя дтасдезесева ауасуєсачо бссвадабе зсасвєбове гвасакчете зі"во тссастаеза Бечасассав сакЕссавтс оакдестасо взабзепоїжа казав 38435 чачасссцас ссясудетщда одсасопасас суподозаов сбабайчова Фебсскранх 215ас сзазтачсаяс суквассквч зачечеессь сеечбайсай гуаксчасаяає сесттокоаЕ 195 аайвскдаяа касксевькс ссакесЕсуж сассецоечує сеадссясяат Всбаводейє дока шчссстакЕса яссяазазасеа еЕешчкасвс сьесяасасча давтєсскса аашсдст тя. вав аз«ггачечісо аческосача сзайвочнцку васечсечва всаєсцксеке страврсцвя 214 асочваиводе габусчцев сксаскасся васасстваєс завссасеєх стсзаваеча яв ссусаяціває суйсеачсаєсо сачсссастя чадсаттстє стбевесоаєд чесавакаувея ззана тачЧЕко:Еда сссвазсвра ячесечЕдава вепсествея абсюсзьгсна заст Уче 320 сазацксесча ЕвЕксезасе аказЕБасся Зечасуасся ссбеспаччау зсутакстьаму вів скяасбесаєсї езазетачча дезказбчавс баксуєсая яЯессцЕвкКачь зосчазачац звая45
БЕсскасвої скатксаччкс зосксасося Едспсесосав стек саг сссазвзаеє вавай чаєсдекеврс СсЯКсКЕаср здаскячасаєю гкавнбебсац беайасчтсвев Евтаєвесоу лачьй звзацесцекач Єдвежсввнаа сррасасач зкевачсксаз бекбсрсссе дечкеЕжкта 227 ацаевасссоч счасаксксв села чс пастЕсьсяв бессазсеза зкасяочниев ЕРяхе ашзацаткса совсатчаєі абачтаєдькс Ісасьссасч зскзсосячс впаасссчацю еїтай сечаксстукс авчоссесва сідневадаа свусаатату ЕФесфеусвяо ЕсЕвЕдася єгайай соцасусуса дакЕссесає сзусочнеця кеодсвцеєста ачесдастшс вессодевоє зво свабстаєсьа асксадазая сдаскуачев сзсдассачс усстсаває ссасаєтстаа 33820 таєтедаедя ччдесеста сяде Провссваке дсссядакдуе вЕсковсеву зав сеазяззаєти ссосопацечея деповадеся дескасаяес заваяскоча оаєюртюста «23п45 асссовзасач ассвпачзаєда сксслацеда сесечадсяль пасявсосзая авсаєасякоу 53 М зечЕсовас дасансячає свотстЯкач седавоєчав сазВаеЕваке КЕсЯЧдяссВ 23кео сеуслзгакуя їсбсавесєдеє апсасчевЕв едадаточсіе саасцосиує срсаванека -3Еио кссакадеця ссеслаоза вЕЯдсакеЧесе зеасчацчтї дееажажнск сссожевоке затна пачолсостай сЧатсасчсе чазачтнайвюж секачачсьс секебеочас ясаечеяч а т33ча
БГазеруссасс сакваккавне козаче закеччавеж вевнасчста бБетассавта МЕЧА часестсазст Кезсвостосе КЕсЕсЯхеуч сбокЕЕксаЗза сазасяскЯч зачЕссачех «336 сссоцезайс засєсчксиут сСтпезчасоЯс днпассксяяя Ксдаяєвсса бсаацеєцес ав зеФектсдєс дасстасває десттасебяс Явасссссве ссбосвадесв есвацяевее 235 чесавгсвоЧс ггседаазвосув ссасодеско ссссвеЕсдев абссочцайчас бсевсескає аз цадцєчеасе чксудаєства шссссчсщЕс бачкзакоса всасчсавсв ково о 2370 сетсабсуєш шсазаєчевт сЕСсЕсССсЯсО сабчадатаєс ячкасавскяЯ садоачевеве завО сачечссЕсї десаесскде уксдефаков сессавтсетца сеуасизача сасебтавея 582 каавасацчес здтавчавсктя ссааашсебс впессавсяаяс ячевсанееа ссср еле явачасаче чесссавєсча гутсодазесяч счвеаясава чЕЧЧочатса дазасачсе аа
Ечзясрачся аечастцкаЕ сФЕецадевс чЧевсдачеся ссасуєдеве сучдспадече авг акааксавав сссбевдачск Судесавебес акечосьяст ссазулаччч зсавсівсяве "зва
Чусоууеаказ «сЕссласядс чаччдаїссса стасечексЕ дкаадасяве вЕсссессає в Я) стедфісадав чесовЕсЕсе дЕсопдевнтсай ладазццоєса сбедесбасе стевекеаєс 2458 айавчевчече авадассскає тадсееес ЧЕЕКЕФегак сзашсессоЕКе дайзавасая 24240 апасуєссадава зсбасаваке сечасороссяс оБаїесеря азасоачаче статева 430
ЕсЕкЯсЕсЯс абавасевев бресузЕсяс єеЧчасЧвчсая зазеЗБЕтвЕ асвекавеок хазЕа касжЕсСсасаб ссебтаказа асваскасна зобеБачсава Євзракссачев аксовссява 244520 з«асчсассчк Єфакєсевка содчачеватгу сбсачасквся збесабстве сечецеасвє 24450
БЕсакУєскчє зяБавбссача секс сьЕ беру зась зайасвсаєсо 4545 ачачесасае сУзчвчанчас9 бассабсавс бачеасесеав сессоаааеє сова ке віспа зазчесявчуа усяЯссечеЕсв дсчабсядсе давукабчайа севєееесося бсзачеясЧе «ак стцсвзодає БЕЕсЯдавач гаєдусавсе сесцббосяя БЯсцдесясаб сеауедевЕк 478 сесстазатад асоєсачисаєс асзачазавну асучавусса ЕдекЕсашіс сабсецязей Уві сбессапоса аБукакссаб яскЕсеаксь пестаєусеу задчассескся абсучакстя 24840 йвоачсеясацс чдасассазед свЕбЧссЕсе дусуауяеке Кефесастс сявеччастя 740 сЕЧсасьеса ЕКсЕуєссеУк атевевасяв зчЧассяасго тееЧессясі ассдвнааєче жа тесрееваце аєкЕввссвс ссасстуаєя чдчацазавія дуасаяссосчЧа сечдсяссева 5Боха тіавьсаккс чеваїкчбосс аччачокяче ассаасчассс їЕсадсачає зассавс ся 5 стчсачьасе счЧЕсстЧавна чУчавачсьз чаассесаде дессачсссЯ чивкессаві 51458 авттсссеавсо суссачасса адбссусесая секдесевавн чесяаяЕсас довдасеве за абттсаєзасе абедесачес зчасувсввс возсаасаау асьевасває асаевкЕаЕЕ 5. чЕватсесст стю 5 «Зій» б І «831» 3493 тій» ДВК «аз13х Швтучнма мвослірсвність
233» КодуУюча себляєть шкніСа з сгпеивізенвікиямя для маїсу кедочамя «аб агечаснаса ассесаваасат гзаозацеас акошецьась зспассьстю твабссвода Ба завясастст сачаксаста сачавЕсЕсу весЯчтсався ческссабсов сажееесесе іга
Ксствцчетс зчЕБссскЯЧь яЕсебазсво жфсссродев чеоусекссв КЗЕкудесев є 182 ебсовсьбеч бессчлччааь бубсочасос вессвоувацоя дечесоїКЕек чдеєдесвапава зва чачеачекда Безаспачат шасосевову стсзочачцна яесасьчсявяі: сассавваетсее КТ чЧавечасьву зсавсавеКЕ павйевкеткєс чеццачусує саваячадіЯч таза ку сЕКайяанакс кадесуваєссаяз захаацеаЧчеєс всвачтясочеє кЕсеусзсссь едабозеске 42
Еслоадасех асабсссяде себесосяєс годеадасссо аодстсевст дскстсаЧке «во
Басчстсавя сеясеватєтсь шсасстівеасс ассседачев астсачесак ссскудочав, ча сестачечсс сЕвсуаскає саасусдавс Зачайскаса вяеосячекчає Есеясасаєа 50О часчуачсасч сецассаскЯ суссдаснсс басавраяччя ячЕсеЕдчаасав Естдссавач БО
ЕсвасасвЕс взяасечЧає засстасває адестсачає ччассбвас єсЕсСЯссЧеу таз скЯчасавкану сеЕчесЕЕсЕК Бестааєтас Яасадосоча часвшесьве бевасссябе тах зиксачсвся «сце ставаєтаат десеісавта жосЕсзавсоя ссачссясва нав ссезбсосає ачевцсссаєс сеКсзавчьуу асечанавеб свосеавбсся чЧайрессеат впо срок еЕдаса Бносбкансай сеБсасьебс сЕсСсассячатєсо яФЕсеЕсачс Боудасдевшеє ко кЕхекагкщая чводасасзвя аФбчавсься адсстсвева дадчедична саксаєвкед 1526 сесзвскаео даачуазачс сваассаачад ссвсесвазчак еевесвсске евасУдЕсеа 180
ЧЕЧСЕсадаа састсйосаа КсссапавкЯ сУссЕчекКоє жасаченака Чссаеснося 34 ссаєссавкс Бдасоцазчазе чздачоясаку чачсксевсча сассьвсайя спсесвкаєя 1300 басадачдса чачетасааі ядасссассд вовзяаайсвсс сассєдачца савсссвасе ЗибОо сс ааш аддадесасьс дсасодчасте спосаєчеся сствсдісса чажассводе т120 восческЕбве стассаєтаФф ЯЧЕЕчвсСЕвЕ ашекудасьс аседстсаде Часустьдасе х132Бо аасасаабсч асосадчачау дасесавтсвач атсесвесуу каву аске весасутскУє 1440 ячЕЧасасай чечечавсае седавстечЕ ЕКсвастоачьа учуасассес сачасасавї 152 асчеввтнса актсечкчай сСессевантс авсатесваке ессваавсає седдазвеае 152 сцусксодої бсазаезеде стссакссваяя чвепеввадЯ веВЕсдЕсоЕ тасіяддадев 1525 чЧосачцсасоз чадесодер ссавці вас ЧЕсваєвеце сФЕЕщевцяя вассаєодаа 16нИ. ассазсчавя асстсапссач садаассвЕЕ сесевенеач ассесадеая сесіжессвее Ето кБсадвяєса абсеччасас вавссецесава Есесазсвує есевУвсеяч БЯдсезячесе 1500 вксеосбоКЯ чочачесяси свсссасавя вбедваатев Бевеясвяе совок е таб чаччссеаек сеяцассееа ваешччсасає ваасдесаФесвя асусекекеве сассаєФфовся 1920 вабсвдакся чдссскавоуве сдасостсасе дастассвев кедасачаце скствасеее їв чЕсоачкес сосесуведа чеЕскукске дисцавааоа аччвастсее саачаанява 204 задевецица звсдсскссс ччвечаасяя вассбяскаєс запабосчав сбесачачяє з128 аєсаассчес аеЕбесабад аддсьозчача зчассзаєса йосзразссає гсазадчеачу ія часчасчЕчо Бсавечааващя сктасеревсв БЕВсКсцеєа собееФасев чекав ее аветсатетос аЕсяонавза БувсеФеашксе аваевсаватш ссбатластсоя «свБеачево ВВ ачацчсьаса Єезацчасье ссайабсссс заваавстаєсь єдарсафава вайсаєсаку 2340 сзсувацасяач КдаватсчеЕссс Садчасіцев Єсасьяедоє сесеусецеас асссксуюса мати) вгЕгФдававоє чечдсрсасса садссассас вкексеєсеЗ зевевУзЕЧЕ єдаеЧкЯкве тх4Бо
Часттсвасе атповістаоя счусосауася зесвЕЕаняя ссСевчассса асвкддесвх 530 пече девассквца чес аав даавачессьс козбсоцаа «оевеечєе 2589 сачсчсдаача чЧУдсеЧадвза пдазгасцчачу часаачаячУ вчааасеуче чседФасясс 2вай засзсаФшечс аснаячаччс сдадвячачеся зепедечеве БевеБцЕсав БЕсссастат ато часеачеусьсе ваасаевсйс чавсввсясс абчавссвьо свусечасав че весве 2755
ЕссаканцЯч дечессавсь росаЯочауске Бсачеісаєіс седоацеесвй сесацосаво ме
БЕєЯдлЯцвах чЧопачуяач яаБсбЕсасс ясевеовевес сФсаечасую Бетадасабе хвяй арсавдвава чьчасьссяа савбудвссо ачосдскода асубдвааня девечеетВ кети вЕЕЧлацале адаасвнавса сезсачсеву екдческее сеча ета ятеетадеви забо тсасвачаач тсадаченсе сесстовавая часа БоасечдЕсас весесвенає зей чааччьсася чсваачацога вЯябедечаье сасчачасся азадсайвсявс вежею зе? авябЕсЕося асбесчсста Фодаччатчцс басєссааса зтаєхдевас уБопсавечає зіяй
Ккасападсра сссавдваича ясассашете авссасвесе стедсайесвє вещесбасяле заши ччЕдссгася ачссавасвя сгссясяеса дедчаєсаєя сстецясова сячазуадвас зап чезсасвсся асоцесоцяч Човезассве сдецдацваєся акачаєясса Еддсцастає зяБо астсскскос сзасецчска сердассвану Фадседааче астскссуда дасадяасявя Зжхо чістацчасьа зузесачачв дасачвацеє зсусесакод ачасосвяє сдавстестя зано скшасоцачо ау заіз2 «ай сйїїз л84 «вій» БІЛОК «Т33в Васіії3Миа ЕНакіпчівляї ж
«(в 7
Ме Авр оАвп жо рко бяв очі дей піц Суд ї31е РК Тук Аві Су Бе 4 СЯ 10 15 дак База рЕо ЗМ мій Уж Хм Тен АвробіжЖ піп Ат Бі Як ТЕ бІ1у 20 ба бек бек Ії др оті Яек йей бек їжи Уа1 8ід ре пец чаї пет з 42 5 йша Брж о Маї Рко біу ВЕУ сіб Би ей чаї п3у ви хів мер Бе Уді
СТ Я БО
Ттр зіж І1їе чаї Зі Бте бек ЗіБ Тур дер Аза Ре ін Уві біп Іїе -- то 75 й бій бів їжа ї1сє Ав обі дке тів Аза бі: Бе йів Ак Ахв Вів Бі
ЗБ я ЗБ тів Віз вв Гей пів 01Уу ву біт Ави Зап о Ба Айва Те Жук тні ФЕи іпо 105 Мо
Аїа Ре пу ЗМО Жжр 1 січ ав Кто Пуя АБ о Кто А1в ТЕ Ако те 135 ке 325 йжха Чаї 112 вро Ака ЕВ вка Хе цей Аврошіу ей ем Зі АКУ Авр їз Із З ті БЕб беж Ре дкЧ гіе шеко сік Бр бів Мав Беє Мед йод зех таї 158 1ї1513 155 їі
Тук ліз під ді вза дв Беш Шія їм Ажв ті рез дкУ дор Бек уаї
ТЕЖ 17 178
Іїа Бре Щі Зі Аа ТхробіУ ви ТВЖ ТЕ 112 дей ові деп Осі вай 153 хви 1512 тет дя йкш реч ІЗ дк Нів І11е Авробів Тк Аза АвроВів ув дів ік ЕВ) 2 лап о тТвЕ ЖУк днк Аке бо іа дав дай ем Бут Бу Зв Так тут Зій 21 ТІ «й авор тЕв ог1є тв ту Зп одкт раб дк АжяЯ Авро опе Тлх о їжо ТНЕ УВІ.
ТЕ Зо 235 24о їз Бар оЇїє ів Авіа ре Бе Рго Аз о Тук Авр ойвап о Агя вка Тут кко
Кі біл РЕ Уві ЗіЖ б3попей Так о АкЯ піц Уаї Тк ТВх Аяр око Ббеб ме) 255 270
Іі Взв БМе деп Ркбо бій Ше З1іл беж Мазі А1а сіп їм Бо твкЕ вце ит зас 5
Вп Уві Мес 314 АБа Бек Афа Іів пк дяй Ржо Нів Без РБе Ар Т1Є за КУ зо тт Авї Ав Бей Таж їз вне ТНК АЗБ о Ткр Бі дек Уа Зіу ке Ав за ХО 315 зай
Рне Тук Тюр б1уУ БЕу Нів дкЯ Уві Іїве Ббет Берт вм їїа піт ціх БЕЖ 325 130 135 вйвп о З1« Тк бек го Ї15 Тук сіу Агя 1 дів дез 21в 310 Еко вко зао за зб
АЕЧ Бет РБе Тбк Бе дят опір рез» чаї Вре дкЕ ТІ їж Бек дЕВ Бго зба зво зе5
Тпт ба дя Сей ши Зп о З1іп Бго Ткробко Аіз ра реко Ве АнпоПей 370 зт Зч вдха ві уві 916 Зім уві біз бе Бек Так рЖОо Тв йБап Бех вве ТЕ з85 зай 355 06
Тих Ака Зіу дку Піх ТЕ о Уаь дар обег пес Твт зів Беж ркЕб Бго бій 05 41 315
АБИ Ав бек ма) вхо ро АКТ бі бі Тух Бек Нія Ага ел Сув Ні ил! аж 35
Віз Тпк о рбе чаю бай АкУу Чек ЗКУ Тк вВко Ве бец їж так бБіУ мві 415 ко ча5 чаї ре бек Ткр Тбк Нів вВтч бек Дія Жйк їви ТБк два Тх І1з4е Вер фи й ря
Ркс би тя т11е дво іп Іїфв Бго Шеш Уві пув З1у рів АвЯ Уві тер
Як «то іт 4 біу бі" тік чех Маї Її ТБк бі Ехз зРу Ве Тк свт Б1Уу вяр ї1е 485 йо чаб
Гем дко дкчЯ дя Тк о БНе Сіу дер Рпе баї Бек ей сьм маії дей Те
«оо 55 ва дп онех Бте КіФф ТБЕ Сіп вхо Тух дж ЬБи А Вее АКЯ Тук вів бек
БІБ ай вав дет Акч дар діа Акч сві Хі Уві їєа Тк Б1у 5із Аїа бек Тк фу вав вав Ей Й
Таз ЕФ Ту діп чаї бек чаї Вей Ме бге їжше Зів Буз Тнх Має сій
БО ча зво
Тів БІ біз дей Тая Тс бек йкш о ТЛю Ре Ах о тук ТВЕ лЛер Ре Зак іх Бл 575 ввзпБв рима Вре дек Бе Ак Вів Али Ро яр Іч11е Ізе Фі Т16 дес 5
Бай Б вч сій ре Беи тре ЗіУ йіа сіу бек її бвк бек бі БМ) Ббец Тут 116 -5УВ БП воая дар о йув ї1є ії Тіє тіж гей Аза дер Аза Твк цен піз діа бі Зех й 515 ва
Вар їз біч йкя Віа біпобксз дія чаї но Аіїа йеип рбБе ТйЕ беж о Яву 5 аа Ів ваш де зів І1їе бі ред Гуз Твк ляр чві тіж Аве тут нів ч112 Аяею Ахя ка в Бе чаї Нек АФи Кей ав б; Су ей бек дяр зів Ве См без дер Я
БО БЕ «то уз був б їн бек пах гув Мав жа Нін Аївя па дЕЯ Їєлі бек Авр
Б75 ей С ст ВкУ Ват ши Ме) Зіп дер РКО лЛюловме Аке ші» Хі йшло Ат Сів
ЖЖ ка то тен Авр бкт В1Уу Ткр о Ака бік бек ТК Авв оті ТНК о Кзіе бій сію буу тої то 715 та
Вар Дяр Уві Ре ув 1 дат о Тук уві Тк Тез те Зі» ТЕ Ре двр 7аБ 73 735 біз Ски ут то Ту Жук їли Тух бай БМ т1зіе дшробіч ек Бук ре 740 746 зве їжа Лія Жук Тит Ахч ТУк бій ем дЕч піт Тук Кіє За лев бек бів тв тей тв
Авр їеи Чіп ї12 Тут Без ї1в Ак о Тук дело діва Був Нів Со Твж уза а 775 тво
Ана чаї Рез фу ТИХ Ку Зах їж; Тхр Бко її Бек АТ ВКо Бек ркоа ле Її тва та об
Іїе сіу цен Сун ліва Нін нія Беж нів НіЯЗ Бе бек цешщ А; І16 Авр 865 а10 нів чаі сім Сув Тв Авр їжи Авпоб1ін бер обел б1у Майї Ттр уа1ї ЖІ» ре най я в3о
Був Кіє ув ЖТНх іп оляр Сі Ніз Вів АкЯ Бе) 4іу айва Гей піч вне 855 вай ва5
Без 1 п3)з ув РЖО Іби Чаї зі Сім Аіа інш лін АтЯ Чаї тв АКОТ
БО ная аб
Аза сь цув отв Тер йкФ АББОІУв Ак 1 І рев біч Ткр Зі тк 865 йо вт яв
ЖАБ Її1« Чі Туг Був бів Аїа був ЗБ бек о Уаії йвр діа Беха Рів Уві на вно на:
Ваз бет піп Тут Анр АхЯ Па бій вів ляр ТВт вАвп о хів Аза Ме її зпа за ЩЕ
Ків віз 48 дер ци дев уві Ків бек їїіж Ага бів діа Ту Беш вка 2 чай сіщш тал ве ві бів бко піу маі два Аіяа Аа Ле Бе БЗЬБ ЗЕ ть ей 35 ай
БМмі чі» джч ї3іе рінз Шк Ліва тів Бек Ге тую ве Лів Ат Бвт Маї чав кети чи ко
Ї1і1в їув Ав Зі» Дер» Ве Азп одап о біуУ ве Бек бтуа ТЕродяп чаї ТУ5 зв 279 яз
Сі нія уаї бар зі З1й БІ; біп Ай Ай нів веду Бек мав ей УВА я зн за чі вк бій ТЕр іч Аза біц Уві Бек Зіп обі Уві АкЯ баї Су вка заб ва 1405 сіє йуч біу Тук Їїв ївеп Ака о Маї ТЕ АТ Жук о йма біш б1іу Тут
1010 1015 їа20 біу їй 91іуУ Сув Уві ТБх Ще нів сій Ії 01 дай АвпотТак Авр 025 1039 то35 біш пе Пув Ре Бех Авп о Сув о уві біб біч бів Уа) о Тух Ро Авд зі 1650
Авп Тк Узі ТвЕЖ о Сув АвпоАвро Тухк Тис Аїв Тк о біп 013 015 Тук ї855 той 10965 бів сіу ВЕ Тує Ту бек Акд о Двов Аха біу Тух Двро с1у Віа Тух тТа70 1075 мо іч бех АвпоВек бек Уві ко А1їа Авр о тух діа беж Аза Тук ств 10855 1250 1095
Січ пу Аіїа ТУух ТІ Авр сіу Аку АКЯ Дар дей рга Суб 43 беж 1100 1105 зї10
Анподта зіу тую зіу АвроТтТут ТЬх Рко бев Бго Аїа пІу Тух Уві 1115 1125 1125
ТЕ Був б рез щі Тук Ре ркО сій ТИх Авр о цуб мМаї тІр 118 ізо 1135 її50 бій І19 біу біб Тк біб с1у їх Ре їзє чаї бер бек Уаї бій 1155 1150 1155
БТев рей дев Мек сти їв 160 «війз В «ії. 3444 «12» ДНК «ІЗ» Штучна псслідсвність «же» «2332 Кодуюча соластв скуїва з олтимізованмими для максу коданами «ах 8 аслдасчааса абаєссачаа ссачкубуєе ссабасаась чесеезасаа Босбчвачес 50 чачаєсстіса ассзачачач зчачсаєсуєса. сусесксесс стуасаєсве секекесске 28 асаачатсос боссдсссва ЯсЕЕЧессее часоєдачвя сдаесЕсеуу сексеседас іно сесавстдед ясебсаєсає сссарссуве сдбадссьсь сссрсстсса Часссавсаз зап
Есаабсавус ачачувісда дасосссоцяв ачувасачає сесаксассве асскесусацс 300 себчевцаов уссавчазає сеасабсава чсасєсеяеу ачсоцдаваче савеЕсссвас 360
"аакостсвяс їссчсдаваса счЧкчадчаєс сассесасеса асасачаєува соска аве аз асачесасса асаасЕєсає сстсвссачес ЄсСебцачаєсс серБсассскс адсссаваєє 490 саачсосусаа ассессасії дадчсесЧссс азучаєсусвя сЧсссесссоу асвачаєстуя ій тчасссчаса бадссассує саасавссас басвасадас ссарсаасеє частсаєбсоое вав тасаєсаває аїбсосссЯча сасстасаає савачаскоє аданссісацд адасасеває вед астсчссває чудсваческ саассачЕс аугачуучаєс ссасасеісаєс бабосткуас 720 звгбаядстасЕс бексссососаа сгзсозасУЕ сусассеасс сааєссзаас саусбсосва то сісасавччя взвабсбтасас стссссаувс асЕчадчаса чсссачеЕсо БЄуссваєсаєа. ца сесзасауєт ссаассоясає счачссбоучі: чссачдассас сесаєсєсає очасессаеод зай азсЕссссеЄ СбосСчаєссоєс счачасєуєс адассссада сеасусСоца аччассаєссьс збо чксачсксос дсавасассяс соусаассяє аксвзассьсс сакссекакуч єс ссаве 1020 ссрдссачаєч ссаєссачає бопсачаєзуач часссзачусєс ссссссасву васескеєса 4980 чассссакеє ссуссачачч зчасьссдас засссасасе абаєкебєсач ссЕЧачстяча 1140 чЧчеЕччЧссЕСКс здсадчасєечу сассавєсає асссясасає ссадавасач сядсассаєсь 1200 часачесекКУ аєцадаєссс асстсавцаєс азсазчесучач сасессуФтав сассасвсос їзеой савсчЕчЧсЕса яссасуєсає сЕскЧЕчЧоде Бодсссоувса адаєсацеца сссауавкої 13290 сччачачсас саабчесосгсс веЕчовсосак сястстосса сасосасада саєссаєесчах 1380 ссачацчачаз Ссаєссацчцає ссссссодсч аадусасаса сассгсаціс сдЧчаассаса 1440 чсЕсЧЕсачач часссудеаєс састсдчсоча часаєбстся дасусассєвс садачуусса 1500 ссБасесаса ссасбдєбсав саєсааєдвауч савсікКесссос ачдечессасеу Сессадааєс їівБо счсгабасеЕ ссассассва ссраауааке сзсусєсСасадч сСссаоссУчсча заччассске ї«20 зесодессацчі Ксзасаачас васечасаєсє чесааессає бБуасавесса чесаєбесесе 1680 баєчесвоса совасастує аксксвасскек ссаакчзусс ачсссвасЕс сасачсеадє ььз4о псачаєсассе бсадстссЯдф сааєсацуєа басаєссаєс чесееЧчачеЕс чассссаєсу і800 асЕдссасвсо сЕЧадассЯа чссезастся чадсчсоаскс адаацуєсєсяс чаасасесьс бо бЕсасесссї садаєсачає Бдуусссаяау асачаєчєсда седчассасса габачассдЧе 1320 чЕєсссааєс сЕоссЧачеья ссбсессчає Чачссевасе гучаєссачаа чапачачнка 1885 ксададчавцчч ссавусаєсчє саачачасес бсбезесача учаассеясь бсаачаєссе 2949 вастєсачач ччассаваєся ссвакєсУцчає себачасача ддодадайсвас бчдасасадее 2100 абвбсавучач чЕчасчасас чїссзаччад вастаєяєса сасбсткЧчач чвсссскове 51560 чавтєкасс еаасатассс стассачаву агачасчаза чсавчебсав чесссасаса 3220 ачакаєсаче тдачачасса сассдадчас Бсбсаадасс седааасссва ссессассацда 2280 басвасасся засаєцачас ачсезаєсцчеє сскоавваєтя дЕссавасссса досасстєсев. 2340 чЧесссааусс ссвксдудсава ЯсчЧеЕчессає савсбсасаєс асессвессьс очасасачає 2400 чесечесуса сечдасекчав созучасссє счубасестая Єчасссссав уабсавувес 460 саачаєчеєсс асусазуЧчіс чвчасазвесьЕ чачЕсЕсьсу аачачавасс встсоскода зай чадцдсссссу ссачЧачечаа чаччассчач вадаваєуча чдодасаацуат ачачзачьсе 2580 чачсдучЧана сазасаєсчє чсасзавуза чЧесавачавс сачесчакчєе квас 26540 айсксесаає асчасачасі ссзадстЯдяс ассадсасач саасавекеа суседчеааас тай азаачччссс асвасакссЯя Єазачсасасє сеессєчазе сеБсадваЯаав вБесечдвдве 2750 засчссасаа кспбседаача чсссозачца суасакіськса скчсесЕвстс секоєаєЗакє 2820 псезаууазася Ссаксазава Єдеєчастес аасазасуаєє сігссесбесвЯ дчавсуєтава 2880
Ччччсасуссч асЯссдзача чсачаасяас сассясєссе кесекаЕсеє ссокававоу 240 чаавчссуЧавч сСЕссасвата азсссЯсЯассе сусессвдЧєе дсоадесасає сосеетеаке зап асечесссаса аадзачусєса сочачааяччеЕ сЧЕЧЕсасса гссастачає адачвасаве зо асксчактаває сазачсссач саастасаїху чачааачачч Естассосвааа савбасечее ЗЕ зесЕчдсаава астасаєссцсе засссавачаз уузасаєчачта дсассбасає беЕсссЯсвас 3189 счсчассасу асучдачссса Счачачсаас бсавссясуєс седесчасса счсвссачее йлао какдгвадача ачоасаєасас Ссчаксдчавучєч осусЧасваєсс сссагчаавач саасачачує Зо
ЕзЕчочЧаст асасзаєссесе ссездсеЯдус саєусдасса зададевбуча чевевессеє 3350 чазассуаса аччкскЯочахї Єсчадчасвуча зазасечаач дсасасссає ауседассеє 3320 чеечансесс счсесабЯча ачавч 3444 «ай З «2їїз 1146 «й12з БІЛОК «713з Васіїїця ЄБишкіпдієпвія «400з 9 меб сій двп о дяп ої1е біл декй бів о Сув уаї Рко Тук АЕпоСув Бечй дяв 1 5 | М 15
Авай Рко Зіч Уаї б10 ї1е Пец Ав бі Зі Аку бек таж сбіу Акч Бу зо ко реп Авр І1е бек їв бек Гей Ту Ак ВБе їво Бей бек б1з вве а 4ї уаї рко біу уві біу Уві діа РБе б1у ем риє Авр еп т1е Ткр сіу 5а яв вв бе Ті Твжх Зко бак бер о Ттр беж о іми. бе Сей Без бій хів їм 515 55 ТК а во їм Хі ів пів дуч бів 0350 Тк пев бі) Ах бай о АтЯ Аза ї1е ТЕ
ТВк їн Ах йіу їви Віа Авр бек Тух шій Ті Тух їі Сьш Азія Бе 90 105 її
Ак Зіч ТЕжр Зіз Лія Ав тко ав Ав) о Аіа ів без Аха біб Хвр Узі 115 і58 135
Акч їі Акч Ре діа Аа ТВ АВЕ Авр о Аза пев Хі їТвВЕ АТа ї1єе дев ща її 140
Аа о Бне Кр бен ТвВх бек впе Фіз Тіе рРко Мем бе беж Чай ТУк Уві
Зо ї55 і50 із Аіз Аза Аква за Нів ме бек Без без ку вар Аза Маі ек ВБае 1855 же ЩІ і бій біу Тхр бі ее Азор Її6 Аза Тих У«і Де Аза Ні Тух Ада їво ії ї59
Вжу їі її Аяпопей 1 Нів Бк Тух їх Був Нів Св їеиа дяр Тк 185 09 205 тук Ава сій Біт ез Зі6 Ав цем Аку СБУ ЖВх Аяп Тк Акч б1В ттр їв 5 кю
Аіз дку рве Ав» оЗБів Рпе Ака лк Ер без ТЕЖ Пез Твж аа без дар 228 238 235 248 їіе ч83 Аза без Бе Ро Аз Жух двр Уві ВкчЧ ТЕ Туж вто її» бій тних бек дек сів Змі ТВ дка Зія ків Тух ЖВх ех Явк чаї Ті 51 хво 25 аа
Яр бек ро Уаі бек Аза Ави Ті реко дБ Сі Ббе Ави Акта Аа ЗХ зв зо 2я5 вве Щу Ущі Акз рко РКО Нів Гео Ме дар Бе Мес дви бек Бей РВє
ТВі Тв Аїа біз Тв Мі дкЯ бек бія ТвкК Узі Ск опьУу БУ нів Бей
З зії зо
Чаї Бех пет йжа дев ТВж Аза сіУ Ави АхЧ їі Бен бе РКО Бех Туж 355 138 335 аіу уаї Ре Адви Рюхс піуУу 0іу Аза Ті Тк Їїе дії вро 01й др рко 348 45 350
Ач РКО РБе Тух Ах ТИХ іво бек Авробко Уві ве Уаї Ага бі Ф1у 355 зво 365
Ріж п4іу Авп о Бко Нія Тук Чаї без Зіу ви Ака ці Уаї діа ря бір
КК зе 380
Зін Тк с0іу ТБ АвпоНівя ТВжх Аку Тйх Бе Ак Ав дек щу тТВЖ їїв з 49 3935 448
Авробек цей дДвр із Х1іе Рко Бгто бін Авр Аянп бек 01Уу Азія ВЕО Ттр зп5 410 335
Авт Авр о Тух Бех Нів Уві ем Авп Ні Чаї Тх Ре баї йке Тк Бка 0 485 43
ЗіУ Бо Іїз Бех пфуУу Бвк Авр о Бек Ткр АхчЧ Аза Рхто Мебє Ре бех Тхр 335 зай 45
Тв Вів Аку бек Ата Ти Рко ТЕ Ав ТаХ тів Авв о рко біб Аку Ті1в 450 455 188
ТВх пів хів Рхо їжи Уаї Був Аза Ні ТЕ (ем бій дек біу ТвЕ ТЕ алі ат ав уві Уві лкУ біу рус ЧіуУу рпе Тв Зіу піу Аве 1 їей Аку Аке ТВх зна Я 5 Я В цех Щ1У 01Уу рхо Не Віа Тух Тпх Сів Уа) Авж Те Авпосіу Зб Бех вий 505 БІ
Бкє Зіп Аке Тук Акя Аза ха К1е Аху Тух Аіїа йех ТЕ Тих дви їй
Би БО 55 дхч її Тук чаї Ту Уаї Аіа З1іу 03) Ако Ті ре Аза біу Ф1іпй Ве во ца 54 дм бує Ту Ме Аве Тих ЗіУ др РЕ їй Таж вне сів Беж Рів дек ка 55 555 КІ тТух Віа ТБж Їїе вп Тк Азія Бе ТЬк Рбе Рез Меб бек ЩіБ Беж Бах
Б | 5? 575
Бе тпк чах 01у Аза Авр Твх Ре бек Бех б1у ввп бій Ууаї Тух її:
БНО 585 Б
Авр ахч Ре біб беюм їі Рхо Уаї ТЬх діа ТБ беи Зі дія біз ех 585 БО ов
Авр пе Зі дке Аза бів пув діа чаї Авп зів їн рве Твт беж бак ві 515 2
Анп сів Ї16 б1у їй пув Тву Авр о уаї Твж Дер Тук Нів її Авр АкУ виб 63о 535 540 чаї Беж Ап ва Узі сім Сув Пес Зау Авр ши Ве був Тем Алар іч
БІВ БО 5 ув ув сій Пец бек січ пув Маії Пує Ків Аз Пуз Ахч їец беж дар
БО 685 Бо із Аж Авп осей ви бів Авр о Бго Ава рве Ака 01уУ Ї16 Азп о Ага Зі 575 Я 5
Тез АвБр Аку б1іу ТкЕр АкФ Сіу бек Тпж АвроТіє Трх Їі1еє сію 8іУу ЩУ 555 709
Авр о Аво Уві Бе був 415 Ави їТух Уаь Таж їз Бен й1іу ТВх Бе АБр 705 тій 715 72 біз Сув Тух Рго Тпж Тук зеи Тух Чіп Мув Х16 Авр бі дах бує їй . 75 730 т3в їув дів Тук ТМШЕ Ач Тух біп іі Ак фу ТуУукК їЇЗїв біз Ар бек бів 7ай 745 75
Авор реч бій їі Тук ем ІїІ1еє Вху Ту дяп Аів цув Нів бі Твк Уві 785 76 те
Авп Уві Рко біу Так сіу бек їі Ткр Бк Бей бек Дія рето дек РК 775 775 тво їіїє Щіу Був Сув Аза Нів Вів Бех Нів Нів Рнае бех цей Азвр Її Авр 785 730 т95 оо
Уві аіу Сув ТнНж Ар Ппеи Аваи Бім Авропво ЗіУу аії Ткв Чаї хів Реве за яїо в15
Був Ї1ї2 цув Тр 015 Ар біу Ні йіа Ак бе 01у Аво їжа 330 рве ва ва5 вла бен бів біс Їде ко ем баі 01іу З) Ада гей Аза Ак Маї муз Аху зе чай ай віз іч Був Був Тр Аку Ар цу вхя Зі Був без Зій Тер 34 ТБЕ
Бо 55 нео
Авп оті Уаї ТуУук Пцув бій Аія Був Зі бек Уві Акр Аів Пен РН Уві 855 87о вт во дзв Зак бій Тух Ар о дхая ей зів іа Аво ТВЕ Ані їі йіа Ме її вно во 855
Нів Аіз Віа бар Був Акя Уаї Нів бек 16 Аку Зі Аіз Тух ем РКО зо а яко піз їв бах узі гі рко йіу узі Ави лів Аза Х1іє Ре ЗМО 10 їжо з20 за5 біо Ту Аху її Бе тТнНЕ Аза ге бек пез Туж Авр Аза Ака Аве Уді аз5 240 їі цув Ав О1у Ар бвбе Авп о Аяп 01» Беч бек Сув Тур дви Уаї Був з5о Ба зво і Ні Уаї Авр Маії 413 930 бів дез Ав оНів Ах ех Маї еч уві 385 зо я
Уаї рхо 1) ТЕ біз Віз бі) Уаї бек шів бій Узі Акт уай Сув вхо зва ан зво
БУ Ажа спі тТук їі їво Аку уві ТВж дів Тук ув біз зу Тук пІ1У 9 ЗО іп05 чів бі сСуз ві ТВЕ її Нів 013 (12 бід дяй Авп о ТЕ Авв іч воло 1015 1029 їеч був вБМа беж Ап о Сувз уаї б1з 10 біз Уві Тух вхо Ап АвИ їох5 не) 1235 тТвх Уві ТЕ Сув Аве» дер о ТуУух тах Аїв ТУ Зіп аб бі Тук ши 1940 ї1045 10650 пі ТнЕ тТух ТВх Зек Аку дяй Аку ЗКУ Тук Авр З1іу Аза тТух аіц 1255 ї08а ї065 бек бай бек бек Ук хо З1із дер тТтХ Лів дек лів Тухк віз З3ій 1070 Ше: 1088
Муз Аїз ТуУух Трж дар Б1іу Ак АкУ Авробяв Рко Сув біо бех два 10985 1030 їпа5
Ака Фіу Тук Зіу Ар Тух Тих РКО Гей Вхо Аза Зіу Тухк маї ТЕ иа їхав її пу бій 0еи бій Тук Ре Рхто 035 ТБх дер був узі Тер о Ї1ів 01 1135 1129 1125
Тіз 0ї1у піз тах біз сіу ТвжЖ ре ї1і6 чаї дяр дех маї Б ї2е 1130 35 11580 без ем Меб бім Та 1145 «й» а «йїї» 3405 «кій НК «йіЗ» ШрУєнНа носліІдовність «223» ЖКодуюча салаєть скуїАЮю з оптимізованими для маїсу колонами «400» 18 асадчасааса асссбсаасає сваєсачече астассасасяа асбябсскач бзвасссатай Бо чесдаччсс счочсзчача чадчасачач астччасаса сесосзасача саскссуєсЯ 125 ксзоєасує аакбоссесу чсесечуавкЕе чЕвеововва сбуцаєессяє чессааеея УВО чсдчаесвиса ббесозччочваєс ссссудасосу коссазксече абдсскекск а ссатаєе зад чассатееча ссаабсачач захечаччац сесесасуса дссавцеса воссацаєее 355 чазччссУкЕ сєдазеекаса Ссавасесас дсачачацев Єсачазачку увазасадає 350 ссдасузгасс сачессксач езаззачасу азчасссваяє ссайасувев Заасссауєса 420 севдасбаєбаЯа ссабессосеї стбеЯессЯсс садаасеве азчбяссаєб чсбувсещбе 480 сгасаесксазч сачдечавеесх чЧезесесвзУс чзеескоачаУу зсуксссУвЕ чсЕКсЧщесВУ 548 теаскЧччучеЕ ксдЧасчсазс зЗаезвосаве засачасаса зсувоссове вазчсеувее Фо ччзавссвса ссодассбасяс ачсЕсчстяч сасаасасотч чссссдвася сассеааааа ай сесочваєсссаєс зсозвссонях сачаєвсаваєс сачессвузе дечачзсксас сскаассае тво стччасасач ссчеаєссссЕ єседвастсаєс дасацсвова загаксесуає саччасочеЕ МО тавссзаЯсвсая сосавдадазає стахтассзак сосукуєтсУ авзассккча седеачекее я зудачадуся сссзачусає бзазаччаче ассачавссс сасаєсссає Фчасвбеска ой застсавьса счасссасаєе сбагасасає веуччєсасе азсгасскеуач сеочессассяч Зо вксабцлусет сдссачечая чес ссучажьсся свссссаск зусасузувеа 3029 зкддчаавнку свусассояса васазсудаєс сососксовує судессавя ччкувасаця ї5ав асоястстксак счасаєссуса сесзчачЧессс брсзасасву чевзссвасав совчсааске 11340 ксачессткуЗз асоусассза зсссзсясає дудасасссї ссаасссссс ЧФеебчссчеу 1309 бассцсвачь ссачаасячо счасссчсбч часчачаєсс сессасачаа савсавсубе ї365о стексссавчас аачвсесссс ЄсасачаєсЯ азссабасяа Ядсаваїссся соссадесЕс їзхо
Кссзаскссс сачсчсссчає сассзууаса сезавчвкс сббудасаса ссудадсуєа із чачсссааса асаксаєсссо Чісавчосач аксасусача ксссасбуасе свачессасс з440 засстсезс: ссаучасаау суссосувач чассесещсс ссассоечсат доуасассесу ї500 сччасєчастх ососсчесса чабессаасс сксачачсса асассаєсдЯе асеосесксв хо сачсескассо дезскеусає васествсясо сесаєсдасса агесцдсааєс ссасаєсвує тб ассавечачуа ччсстассяя ссваччсавсе сКессесадсчв севЕвессве дачесесваво 16850 секозуєсся дсачессеза засудкучеу Сссассаєте сактсзасктв сесдаає995 щ749 ссаачечтцЕ бесассссчач сЯсеісасатч сесааєсесся чавзвасавасі Фдбасаєсває 1890 сцезсачаче ссчЕчссвус ваавчЕсзеа сСесзавесса зУусасуассе бузчуаччУса вав саваавазчссЯ Єбаасявасе сЕЕсассаче Ессавессача ссзчвсвчав вассавсяка їівго асучастсакс асасечакся ачесссаваєс Єсучбечаче чебеЯсскца Єчачсбебує 880 сксчуасуаза ачавччавсь чбссузазач збсавчсася ссавасччеє бачсзасчва 2040 счсавсктас Кесазчассе ававсескача чЧедассавасіс чесачесесда бачачаветеу 2180 ачачзассаа ссовсаєсвс васссаазує суачаєчасу сесбсазуча заставу 2169 асасбчсссе чзаассссєча счачсавбсає сссасасаєс Сясассачава часСачасява аг бсазвоассса взачсосасас бечссассаУ Скодачазчасо зсассдачча КЕсчсезацчає еВ сЕсчазаєсь абсссабаач агасзаєтосу зачсасчача сччсуавсяє ссссевгась 2340 часссастст здчацчьсцве соастсесссс бегагбсдудса закчкасссв ссассесеве 249 састссазс: сСечасасача кЧсаЯачЧссЯс ассчассевда всчачовїсь чачЧечосх 2460 зчсчассеЕссз вуассзачаєс асавувсуча сабсчессачає ссчсчваєсо ддачивисеє зви
Часзававцче стстсчсав счвчзсоссЯ чезсосечсса ззвацзауеуча звачавакчеУ 2580 зуаЧасавас чсчачаассє сязасоудаа асваасаєся стоасавучЧа Чдаслававчад 2549
Еспасччяст сбсросеКах сазасесасач сасудсячас сСтсавуєєстчя сасгтазасасе 270 чесакчавсс асусвусача Савасечесес сабессаєбса чачавсчсьса бсбсссаувя тво сЕсссзусчЧча сЕсссчасЧЕ саасуссзчсу аксуссчацч зУсесчаччя сучас 282 зессістсс суссуєасуя сеасуаччавс счессабсзача збеуєдасьо савсавсозує 2аВо скЕссцвчсе удзасчссва адуссавуєс часусачаця касадавасяя сеассясксс ай чбсессасоз ссссацчааку зчавчссчувУ чссссосавеу асусссуєчи ссесесссо запо вучечссаса ссстсвоавУє зЗассуссваєс азазчаузчесї асучачаччч сдечесасу зоба асссасчача Ксчаавасяа сасечасуач сечавчєсеє сазассуєуї суачевачає з130 чсстаєсоса зсаасвсзує саєстесчесвас здгтгтасзсву ссасдсавча зчавксвоечав 3360 чесасстаса соксасецай саччадчасаєс часачсчосє зсдадачсва БсссесаЯееЕ 3940 ссачсочаво асусчессаче чсасазачау аачусстаса сочасчучач зазчоечактавес 3309 тсасчсчача чусазбсачочч всачоуєчас сасавососсс сессачесЯ ссасакуасс з3еа заучазсекч аасасскссс ачачассчас аазчкоасаза сСсчачассяч счазасазчаа 3420 счавосвгса ссабуЧаєсо ЄчЕсолесса ссасссасчч звчач 34655 «ій» 1 «21іїз 1155 «ії» БІЛОК «віз» Васіі1цв сВигівцієвзій «Ф0б» її
Меб Авр о Авп о Ап РКО Ав охіє Авв обі) Сув Т1іе рхб Тух Авйп оСув ви ї 5 19 15 дек Ави Ро сій уаї біз Чаї Без бі" віу Зі0 АКкЯ ї1ї1е с1ів Твх Оу 20 КН 30
Тух Тйж рко її Аср їі бек без бек беи ТВх зів Ре бе без бех зв І й 45 біч вре Ма1ї Рко з1іу Аіз чіу Ре Уві їз біж йец Чаї Авр їі її
Ба в тТкр піт гі Бра сбіу го бех сіп Тжр Авр Аіа Ре зво Уві біп їїє
І3 ча 75 ЩО віч сій без Ї1а Авп бів ху Ті бін Зім Ре Аза Акач Ав Зіп Аїд 85 за з
Її бек Акч їжи піз біу їз бек дво їм Тух дію Тіє ТУ Аза 81 109 05 119 бек Впе Ах біз Тр сі Аївз Ав орто Тс Авап о Вго А1з без Акч 1 115 1290 125
Зі Мес Акч Іїе біп ре Бяп Дер Мег Авп бек дів ей Тах ТвЕх діа 3 135 ї49
Ії ро Бей; рие дія ма1ї бів Ана Тк сів Ма) ро ц Ге беж узі 145 150 155 ї80
Тук узі іп Аза дія Ашп цей Нія цей Бех Чаї Без Аку Аяро уві дек ї55 470 ї75
Уві Ре іу бів Аку Тр біу Ре Авр Аза Аїз ТИХ Х3Зіє Авап о бек Ка во і85 190
Тук ап дер во ТОЖ Ажч о Пез ї1і1е О1у Авюи Тут ТНК Авр Тух Аіїв Уві їт95 дай 05
Ака Ткр Тух АвпоТвх З1У рез Зі Аку Ма) Тв З1у Рко бяр бек АКч з10 215 22
Авр Ткр уві Ажу Тух Авпосію Бе АкчЯ Акч біб ей Твж цей ТвВк чаї 885 30 235 540 цей Аве о Кіє Уаї Аза їм вРНЦе Ехо Ав Тук вар дет Ак АкЧ Тук РКО 245 250 зв її Акч ТК таї бек бій цев ТБх вкЯ Зі Ті Тух ТвжЖ дя рхо Уві 260 за5 ата їйе) бій Азп Ре Ар С1іу бек Бпе Ака Фіу беж Аїа ча зу Ї18 01 275 яко за5
Ак бек їіє Ака беж Рко Нів ем Меб Авр о Бі Бец Ап бек її. ТЕ и 235 300 їїз Тух Тк Авр Аза Нів Акч О1у Тух Тук Тут Ткр Зех біу Нія 51п зо5 310 ЗІ З2о
Іїе Ме дія бек рю чаї бдіу Ре бек су руо сіб Рва Трж рве рко чав 330 з їжи Тук (Щ1у ТБк Ме З1у Ав Аза лі Ро Зіп біб Аку Ті Чаї ліз 346 345 350 зів йдем сіу Зі оіу У Ту Ахя Так (пе дек лек ТНЕ Грец тух Ах 355 36о 365
Ах Рто Ре Авпоїіє Щ1Уу її Авп Авп бій бів (ем бек Уві пе) Авр 370 375 зо
Зі Тк бів рбе діа тТук біу ТвК Зех бек Ав пецзч Ржо Бех лів Уві 385 ї150 395 400
Тух ВтчЧ Шцув Бех Зіу ТВк Чаї звер бдех ей Авр о біч ІЗ ро Рко зів аа їй 415 два Ави Ана Уаї Рко Рко Ага Чіп Зіу Рве бег Ніз Зху Пей Зах Нів ча 445 Ай чаї беж Ме Бе Аку бек бі Бе бек Ази бех Бек Уві бек їЇ1їє ї1є 435 45 445 джч Аів Бжо Мес: риє Яек ТЕр Тіє Ніз дкчЯ бак Аїа 91 ре дво яп 450 455 ко
Хіе її РЕб Бех пек б1п Т1іе Трх бій сіє ре ем Тйж Суб беж ТВЕ аа «7 475 зв ва Бей сіу Бех Зіу Тк Бех Уві Уаі цув СБУ Рко 01у Бе ТБх бу 85 во 435 сту Авр ї1і6 би Ака АКЧ тах беж РТОо піу піб5 ї1е Бек ТВх Бей АХхФ вад 55 БО
Уві дев їіе ТВвк Атїа рт Ге) Беж Зі» БкЧ ТУЮ Аку Чаї йху ЇТ1є Ак 518 ди ви
Ту діа Бех ТП Тих Авп о їви бів Рнє Нів ТЕ бек Кі Авр аіу Аке ьо 515 549 рко 16 двп обі піу Ап о РБе Чех А1їз Тиж Меб бех бек сіу Бех Авй
А 5Бвао а БО їм Б3іюп Бех З1у Чеж Ра Аху Твйж Уаіїі п1у РбБе ТЕ Тк Бко Бе Ав
ЕВ 575 в'я
РБе бетг аб) сіу бек бек чаї Ре Тих їв) бек Ада Ніз Узі Бе Ав
БВ а Зо ех Я Ав біз Уві Тук Іїє Аве АкчЯ Т1е 010 Бббе Чаї Бко Аза 919 595 00 аз чуаї ТвЕжЕ Бе січ Аїа біо Тук дер ойей біз дке зів зів цу Віва Уві 61о 515 БО ка піц їі ре Тв Бех бек дав сів Ті щіу о був Твх Аяр Уві
БІБ 53 вів Бай
ТВж дер Тук Нів Іі Авр сій Уаї бех дяп во Узі біз СуУує ем Бех ва5 є5о 55
Азов бій Ре Сузв їви авр піч пу Шцув бій їви Бех 01 Буз уві Був
БО ве вто
Ніз Аіа Був АкЧ Гей бек Авр ів Аху Ави печ Ми Зіп Авр Рко Ап 515 580 ав
Ре дхч ШЩіу ІЇїв йвпоАку бів Беи Авр Ак біу Тр Аху б1іу йех Тве во 95 т ва ті ТЕ І1їе сів віу Б1у Аяр Алр Уві Рів Буш із АвопоТух УВА 795 710 ТІ й:
ТВ ев без біу ТВ Бе Ав бів Су Ту їм Так Тух їни Тух ВІВ 735 730 735
Муз Кі Авр пім беж був еч Був Аіа Тук Тк АКУ Тук бід бе АФ 740 785 5
Фіу Тух Ііїє бій Авр бек біл Авр їза біз їіє ТУук їн 118 Аха тує 58 7650 765
Ав в1а був Нівз бій Тих Уві Ап Чаї Рко зіу Тк щіу бек мез Ткр то ТВ 7во ака Мей бек діа рко бек Бхо їі ЗІУу Був Сув Ат Ні ів бек Вів та5 то тав 8оо нів Ве бах Пен дар т1іе дар Уві б1іу Сув ТВЕ Авр бви дви біз дер ва вів 815 їх піу Уві Ттр уаї Її Рре цуз Її: Був Тк бів Бвур сС1у Нів ліз вай 25 За
Ака ви біу дяо ви Зі. ве цей бій Зі Був Ркго Пец уаії Зіу вій 835 вай ві5 ліз ївц Аза Ах чаї був Аху Аіа бій уз був ТХр Аку Аво цуя ка ящо 55 бо дім пу пез біз Ткр біз тах Авп о ї3е мав тую БУВ бій Аза Був Ві
ВЕ зо во 880
Бек чаї Авр віз ем бе чаї Аяйп бах біп Тук Ар Акя пеїз 015 Іа я 80 вз5
Зв ТВж дви Ї1є із Мебє Т1іе йів Аза Аза Звр був Ах Чаї Нів Бек зо 905 за її Ач 035 Віз Тук їви ро піч бСео бек Уаї Ті Бко Зту уаії дев з20 з25 іа Аза гіє ре бій біш пец біз Фі дея ї3ї6 ББе тах Аїа Бре бах зі35 зей їем: Тут Авр Аза Акз Вал уаї Хі "в Ава З1у Бар Не Аза йдп 1 зав зо 555 за їве Бек Суа Ткр о Ава Уяі цув щіу нів уві Авв Маї бів ве бік Ав зе5 78 75 вай нів Аху шек уві їва узі Маї Бка сід ткр ші вія Зі) Уві Бех 80 зве зво пів із Уві лк чаї Сув рко БіУ Ах п1уУу тух Хі пей дж Уа тТвх зв 000 я Дя ліз тТук був ій (1у Тух піу 1 Зіу Сує Уві тТВж жіє нів вій 181380 1015 10295
Іїв біз Ав Аве Таж дар СБ Бей Був рве Бек Аа Сув Ууді «ій
КН 1030 що
Зіч дії Узі Жуює Бу Ави дав Жвк Уа3і ТЕЖ СуУув дво дар оТук ТВЕ но 1045 їаза аіа Тнх біз 010 бі ТУх біз біУу тТрж тТуУХ ТВЖ Бек АхЯ Ава АКд 1055 таба 1065 аїУу ТУук Авр о щіу Аза Тут 910 бек вар бак ех Уа) рРко Аза Авр за 1075 686
ТуУух Аіз йекх Аза тТук біз біз ув Ма туї ТПх Авро Зіу Акд АК і085 3099 ї0в9к
АвВроАви о рко Сув біз Бех Ап о Ака ОЗ1У Тух З1у АЕЮО тТук ТЕ РКО 1100 1105 9 їн рко діа З1іу тТук Уві Тк Був біл пеб біч Ту вра Рко 5іц 3115 ЗО 3125
Тк дво о був Уяі Ткр Тіз біз лів біу бій Тк 01в 01Уу ТВх Ре 1139 ї1х35 1149 її12е уаї Авр Зек Чаї Зі їм Пе) пе) Меє Зіч а і45 1359 її55 «піО» 35 «вай ВВА «їй» ДИ
«2ї3» Штучна послідовність «вай кім Кодуюча оопасть зай) з оптимізовзними для шашлиМм кодом «ай0» 15 акоччсвоаУ свчсосссзу сесестсьос садедесеоося зузчавсаує сесесачеов о сісвствуєе Бссссочочс Сочацвссасу їЧачецУас сЧазодазсо зсеЕдаєсае ї128 засасосача абчачасасу зчасчсекрс сасвоссасс азчссасста скексско ї8б стваусзаєса сизасчацчсвз усасасспса Ксссватав з«ЗссазЗасо азсслаксвпа 240 чЧеЕчЧескосЕс гсвадачевь сзазачекає сесвдаочкс зузсовсссу сачвчавчсс 300 засзаУкску чазчзчсавЕ сззгзакуде кКоуевсвзсач зссосСаевве севеуавася Бо секссвуєкЯ стессУсчає Чеууаєсвта часчсссскУу азсасдусоч ззасаскосу Яхй тсесЕЕссав сСадбасасаче ссаччачасе КСЯобссяав ссагосавчє свссвесуаа 48а чучсссавеч всочсзсассс КассвсасУє зешеосчЕ собссссасса ачсасачатье За сявочссгсв чедасвсске азгсавччея збезчасоєка збеассучсаа сачададесав во чессевкосо сечЕСасевс ссвссосочс согочаватча зазасссвта сазбазавсваа БЕ чЕстастсассо зпачаабсоа Ффуасасчаса часусачанЕ сСазачесвеЕє ЧдовБсоачеее ЩО скссасвеес абшесассву ассеуанссс асксессчка счачУсчува чазачассай тво чеЕссовцс чучасадоесе деусвесвка сассзчкеєка Ксссеовста СУуссучсвая дя сссвчзакасє счасгсасас сасвуєесвеє зчачесвасас сепссоте ва «Ві0з 13 «ії» 96 «В12з БІЛОЮ к2іїх БюдМмщОоВічшв декрісідйокапа «(02 15
Меє Аіїа Нів Ала Аіа їжа пет Бто Бе) бек Пік Ака Бре со вка Т1іє 3 В їі ї5
Аїа чаї бій Ро Пей ТБх сТу Уаі Пец фіу Аза 01 Хі ТвВх біу Уаї що 75 Зо вв оїзшеи Ако Зіз Вкс Бей АвроАвройек Та Тер ваза бій тів рей Авр 4 45
Аза вне Нів Тих Тук сію Маії ї16 Тук КВе Рко піч б1рз діа їзе Те
БО З5 5
Авп осі біп Кіб їі Атїа РБе бву Акз Аху Ре пу Рко Маії дврорко ве 7 та п
Уві Бжо Пец їз Св беж Тів в ЗУ Тук Вко ші уУаії сів Ме Її 85 зо ЗЕ виз вка біз вія Ава бі; Бех піт Ак Маї Це пбіу вв АБр ТХр нів і00 105 10 тТвж Аяр Яех ТВж РПпе Пемй дар Аза РКО Рко Азія діа узі Уві Меб АХЧ 115 їй 125
Аія хів Авр о чаї Ехо ій нів пі Зі Авр» тах Зі Ре Ппео бек мес
Хо 135 148
Тух ТБх Аза Тжр бій ТВкК о ївз Бех Рко Тк Меб бій Ала тах ге 01 145 150 ї55 150
СЬУу ем Азв Уві Чаї Ків бек Аїз Тих Аку Узі Бе сіу бек шеч Тук 168 ха іта біз Аїза сій Азоп одкч люд Ре беж Азп отТВг Бек узі Був Уаії Ме Авр зво ї855 ва
Чаї бвр віз 51 Авр дк сво ТЕЖ Маї Мів бо без увь Уаі ЖвЕ Нів 155 МАТ) 05
Бо Зфу бек БІіуУу Ак Ппув оту ге тую уаї Ави Зі Чай тТух Суд ЗІ 219 215 220
Акч хі вза п4іу Меє ТВЖ дар Аіа сі йех Пт Бжо Бей Без бід Ре га 230 в «4 їеи Тук бій Ніз Аїа ЖБК Ахе Ре Авр Ре Тк Су Аку Чаї Ах ТЖр «45 259 255 бує Су дар піп маі Бей Чаї ТКр Ар Аза ей Сув ТК Меб нів Ах або ЕВ та дів уаї ро Бер Тух Аіїз б1іу Був Рбе Аку Тух ївч ТБх Аку ТВж ТВуг 275 НО дав
Чаї БУ б1іу Узі Ажу Ро Аза Аке 80 235 «Бій» ій кхаїї» 8 «йїхз ДК «2ї3з йіхучна послідовність й «ай» ква» Праймер ВЕН 1ТАЗЕ
«ай» «пі» щтізс Євасцке «аз 491..8 «З» м оавляє собою й, Є, т ЗО є «00» 14 дасачісспа абаснуаущу 20 «ій» 15 ейїїз 6 «іїз ДНК «233» Штучна послідовність І «Ва» «шиї» праймею АтпіїдаЕ «тех «а2із щвівс Кевбитеа «ай» (9)..19 «иїЗ» пп являє собою в, Є, чЧ або б «4002 15 чеУїсваунс чеадесснод гссвє а «ій» 16 «ії» 70 «біб» ДНК «ії» ШтУчна послідовність «ай «223» Праймер піїАбЕ «400» 16 ссавесссає азсассацеє 20 «10 А? «її» й «5125» ДНК «и1із Втучна послідовність «пай «ші» Праймер пії1дей «ой» 17 цсачатсасс часзсуаєса во «10» 18 хЕеїїз і7965 «2ї2» ДЕ «Зї13з АФхкораскекхат Єошетасівне «ай кагї» тівс Гевсчте х «вий локус пПіїА «Фо» 18 чсачдассвес чагасевссаз ахчаєтетсї удесвавнесс зассцасчас азбачесесще во счсчсесуся чедасзччсек сссстатсочу єБоссоУцувУ асасуцасає бсссдссцдчає 129 чес сЧеч Зчасаєсчеаєс чазсзасцва азасчвоасяк Чазссладесе Хескассакоз іа сусвессоаус дедвасачся чеоекккдсо гедсЕшкаєс соцбосоасув саЕсасесвує 240 сосачасече везчеччсся авсЕссясавч аксучечасе асчвуссуча авааспесся й сзчсечечас чобусвясає дабегасато судаєасаєсу Ябасссасес дзаєчеачасо 350 ччссзсаач сесачаУссс зуувсачечє секосясача зссодесчая чезасядсає 420
Есксяссуас чесечасасєє чечсссчЧасу асчазуссуч сусасусчсо васпоассесу зво сткссччЧчавча зсачесясєс чссясоасссУ сечасчдсас чесасувсвЕ дссаосоущео БІЙ кседчасацєе щсвбсссчсу сучесоаава усавсавчає чсЕссавєеве зечаавуд БО ссчсчскасЯ сусасесстсс ассстусааєя ЗссУдесчас секчсстасс сосвастада Ей соччссусає чесеочеаче ЄЧчечааечас сассчаасуєе сСЗсЕЕсЯсЕ псочссЯЧесс 720 акдссаксчч сСусачаєває сссясчаєсу азоусасача сзссссесас чассссучсяу "ва асадзачоча ссччсачачес сучсставач авасссуєчва сечочечече счассЯсчед 849 честасабсе саїскіссває сусзаєчеЕся дессксксчЯ ЕсссассавЕ сусазеасає 900 счбсссузчас задвессаєсса сазазуєчеч ачасоссдає засучсуач сксасааєса зей чечекссуза базасацесос запассузсЯ ЧчЕсссзассс дудааадекає сасвасЯєода 1020 счасассвач сеУсусасЕи гсачкчозсая зсчаскчсає сасочецазу чдезадсаває 1080 чечассчаа садодачаао зЗассасосує сачазасася сузстссаде чечзеассабе 1140 чЧчессчасача чеусачссає уосачассуч счассучевсс оцчазаєсчса зУусччещеще 14209 зечастсаас сакачазчас ЄчсчЧасаєач Сбудсасоза БсясзУусста суБсесааав 1269 счеччечезеа сечеуЧечУї гевауссадесу акассассає чеассусаєу ссопссодаса 1320 чечсосасас сяЯясоасесесо дссваєчсссо аскассассу счасассячяає чоазсаєсавеа 1385 чскЧачсуса чЧесчсЧчачаєс сстасассся ссоувсчасуч часссосУїЕЕ вксдасоадчая 1140 расбчЕсЧа зуазсчЕчзаа авседесаєс бачсаєсавче счесвдасаве сЕкссеЯшКе 1500 кадсачачес сесавксочс аабабечеса Сссусавесв сасзаєочео бочдезсУвВЕе 1559 сесачесяє чоссасасся ссазссаєзау ссчасччуче чсасссесаєся ссгопсассвоу ї62о счассасек: счтазсазасу зааваксаєске чсчасевбес сдсостесбу ачсессіссу 1е80 сецессосса сксвсвчасу сСсаассчача вдасссакєча аачссзсеча саксскдає 1740 саассстсса чдссоссасау здсассасаза зосуядчавдесє ФтасЯстасзча част іт «32105 19 «їв» 43 . «217» ДНК «243» Штучна побпідаевніств
«аа «аЕ3з пПраймев віза «00» 18 сеччсссссо сзусосссса Сосасчааса асзацзавсо яру 3 чив о «1» 53 «їх» ДЕК «Зі3-»ж ЦеЕвУучна послі девнісві» «Май х кавіх Праймер зі3А МОБ ВОК «ОПО» я зчзвасзчсчаз асстстазекє Сзастсавчда сссосодека ссдвзазачосс счасвЕсає Б «їз ді «Мі» 59 «ий ДНК «13з Штучна послідавністі
СТОК КВся ч«иеї» Праймер піїв МС ВОК «Ой хі чсаветисЯч чес стУє зссосФоаааа собсаасквя бсбачаччКе сасевеее з хаїйх» я «ніїз З «ій» ДНК к«віїз штучна послідовність «ЕК «хів Праймею пізАд «Щ0йх 2 зччазсссиса збБачессса бачу св от їх каїх г «кхії» 4655 хиійхж ДНЕ «Вії» Шеучна послідовність ких «айіз МІТА МОВ «800» 53 стакчсзсзчаа савсдадаза савусасчаа счвассстсе зксгавсцсще собефосвоя во засччсчоасу сЕскЧвоксЯя сідцівссоща сусасевкя сосоруєсаєс ззасузсакУ їха чсачстчасЕ ссуслачасч чодасесесзсо зассзпазайа асеуссвсся ач 18 чесчнасне сезчечеосЯЗ вівсасччса сессзссзаа чо бедсввукиє 30 ччевасксазча асаусєусест зезозачч стбозачцея зоечасвосКс сасквассео 350 чазсвссчесч сстозсузео азспссяцсяс зсусассвас дессасусео бадавчвУче 150 вескоассоасе ЗсзсссцсчЯ чсезсасако зЗсзасссусе десоазесвсє часове зо ксесуєасод сЕцаазачсу всакчасчкЕ ссасессуєч заазчоасасеу усе сусує 485 ассекссквос сспсавеЕвуєх диссувессї ЧчесідессчУс чагспасласовя зпссозсакас зай стзчсеачесач чаачдасктас сзаасчсссяЯ СксечсочеУ сечакссаєч сеоастоуеех вх здаєзваксстс чусуассуаач деасачусув сосбеуасвяє сссочечаса чзЯдсевика ей чезавчстаа ссзвавцаза ссосасаасяу сустусасеча сецозсоучсс соасасекса та скссічссзс аасчесчочс СЕсксочсас ссоуччассс сЕдасбавос газу ви ассзгксазса абасасочки скччасяуєс сакссасазу зукусчачаєс сегувсаде Я
Чезчечсстсв сзассачсус ксосчсатзас йоесесаата ссзакачЕеє саасосоца зав ацекуссяса асчгдасчаї агсазччсасу езссЕсссза сачУсувеуа срдевЕКуке ЗБ
ЯпсЯвасусач дсаавсуєуу чесузаєуадс чазасцасе агссочсадв авасасусуде 1020 чесачеусус чссаскуссо зчасзезчсяс ччссавочсу зчевачечає сце сядна зав асеассецачкЯ чсчсасакча сосавесуса чачейнсочся зсасУЯссчЯя басччасеяе КО шцесесасЯсс ссзадчасосо зедачоасоує часУчсесачд Ссвзусчасає сассавуєоє їн сусуєчксщше сазчасочечЕ ЧевкассЯася сескссасса абдсссясса ссассчсчає 1250 чссувссдетгс асчасчасоа зчсусачкоя сузаасоссся овсстуссча счасоччате зго сечстгассч зсчдавагсаєс сУксуззуак зкузавассс чссакескчас асакчосасс ї3ва чесакевЕсес ссУудкссаас зддадасссся агосусаака Бозссаєсеу саакестесаса 1340 ассзссвсас зсчзакосгЯає ачесасучев асаєссасеча ссасочесча суччасосче МБО сисавасеьас абєуазчаччає счссстссва садчекузав бсавссясаа счасссечоя ав сьасечачся сссствусеяЕ Сесесасбся сачавессав ссдвчяавнас ссвбоаавує чего састота ваз «ВИ» 8 «21ї» 3053 «ій ДНК «253» Адковастекічт Сотеєасівпа «вки «вай відс геасиаюке «83» ганомна область о піїв «Ой» 24 засузсккак чесссевасазс зускксаасте сессастчаау заваксскає сус осач БО саксусесавс сбчрескзс сСсазкухсчо зассосусайв ссчсвабасєв соски ссся ї20 счассоксачо сччсозчаса чкксикасс зстасучУе сесесуцсвс гас уВ 180 суссткЕКо ФесЕбкаєсдс ссубчсзесЕ ссесесастоу сіпссстсча зсасуувузча 24 ачесчсссяї чсозЧасчесу ссадсаяцбсо зсадасясся чісбасасоч ссесзессоа зай чекщесчесУу цчещорчавех сучеЕскесев КЕссовасес збасчовода савсцасе збо сесзчозаося ссчвкекаєс суссскеяях суасвяавастакє сссзчітпачсе сдсоасксва 320 зоБсссесвес засассвсся вадсстісаа зсучавссУє воску чеча суБсачещее 85 часчавсаза ссбЧиуєстоа всзбУусЕЕ сусоцсуєа сдусахккся ссзаауччає 49 песЯссезче чЧддЧчабссааза сстчзазаточ дезачочеес засесазава Ккессчваваа БО чкскакочкч чсваскссав чего све Фдасаєсвакс сочавассза зчасучечау кЕй стссасаВссї БсасеЧенсс ЧеесЯЧевус Зссалатсса сеаеуєстяєа сабозсачев тай дедекоцаає завсолеса сачеочаввес сссассодву ассвзусаєсає сазсзасске тва подоссучса асчегсове Соассоасувсч ссссачавосє асясастсса гссоасакаєса вай зацччбусЧчсеч чесевавссечс скЕсучесес зачасвечссу тбБескуссза сссоувувко зов чацчззвочева Бодзсаасвх сзечсосасе сесодвааєся засосссусс часу з50 ссузазссац сессссочсу Часачсасоса асуєзссосс ссусзуссуєч сесесассда 1020 чЧаавсседес «чсУссснкак Бодасзачсс секисесчавк сссвавчсчв вшссасасиє жав сессабсчече чгЧсдсаста сочасссяса ссусозчусса азвучесоачаду дсосасессо 140 зассеусоуїе басуєсазезо воздассввас удавчесвго асевкзачех ассатаксев ї2а0 сиссасзсач чесяччезса Соасчсведе сассасзссо зацузаєєсстї асазсесуцес зо сассавесвя соозссцсса чес сеголссоуцаа «сувасско соуавесое ї320 чаксуведас аоссаачуєеса сао зсвасесове сочаєвчдач ассзвероача зво заачовцчскЕ їозоссаздаєс счзсадасче сассассече акссусссаче адсасессес 4 чІкачссучи чаччссзасея зуссрусасх чсачаствав сбдассавоя ссуааєксає ї50а чІчасесчач чЕскакссКею вовоссчасек ччачсччасец зачсссевЯа асо а їі зчсадсесцав соочаЧасеє Сссочсчева сосисок севссзуавнЯс содвссссоа Ба чаачсесвсас асссссузса задчесзабсчуя сочсваєсяєс ссссочсчач заочна Деві щшечсясссча сЕсоссчазх асуацаауаа сзасчвачає часчасзчакя асчачавсза їт74а тече зЧеояасчс щсстасстз ссасчасаУс счсосессУся чо сЯ їі8в0о судааскуст бабцесавоу ссосдосучоу заадесочвсв гаксуссвої сазавудеда ї86о ствдесоесод суссадазаа сзсзассаса саабсазаоя сЧааасксвсс засессаза 1925 чакасссжув ванассуасо всзпсавасчя сезасвачаи час сзає ассУкссача ва казассуусс згачабчссв сЕчеКсссса зазасзУсоче заЧсевкасе дасте сЯй зусхцчаазсс ссесоавсссе ссоасаабсуду ссчацасуча сссучзапеч зассссвеаа зівпа зеачачсвасЕ бевачадески ссачЧесвоса сесассвуєся севщвосКеК сссзавчсся ївй ссасетссув чдзачзассезе зсссавассо ссававсаби зчЧаєчавске ббофшодеаа МЕЧ свазвассває савудчаавац ссосудсвада ассаксаєсзе скссваєдес ЯЕвавачаєча 2280 сечсссачеб ссбсусчаса ссососстсву беусачаавас сяуваасчає ссоучкседчасо 2349 ссаздвоесаа седеуєсясе сууасуссчуч асчавессоус дзавазктасс соусбодсоу 2408 дсвадетуе Чуазассуце ссезвсбссЯес сессвзувавва зчавасявасс часаоесвася 2450 бсзаксежсва єдаяванцссе ссугадЧееоЯ анзчесатає састчексос бабсузаєаеу в2б асстссзасста сссоуаавєвс уссуаєссссс счадаучаєсая усзачевесЯ аваасссявас 2580 сечасоссява доксЯссуз чесасваасчз аачтчстчвеса ссасваачесо бстасоеФсе БВ
Ебскасесс саававессоз зацуавсссру задсачсаже чсвазвссска аасксчссвче 2730 бувасзавес бозаЗуєсасе закчечесеу чедсчкесс содчесьауссс десесозаче Іво ссчеччусуса чечкссуєрує часаачачья воссччааче чечсчссясс айсуссаЕоЯ 2850 тсакучеаас ВЕсСЕоЧасся чсачикЕсте сосссвасоаа асасссачаа васодессса заво чесссавсяй Басасточач чавсасчесе зсудсесвуєсь дасутсучва чачесядева «зай ассатсуаса саассзаєча собєсьяцос заассоуаєс дасузсзаєу чессдсса са 3900 сетчсцсесач сЧчачессевб асссячесас сеччсвасає зувдсавсоссс дссчассуве 3960 кЕсаясаччас збдсасуаає зваспадалає чадсасзаас дазесовева совсесуєусе 3120
ЕЕсоаФдсястча асачсяЯчедес ссбдоссесас чукасосяде чЧеусузваєс ясседяссаса зІ1вй засдасасчч соуссчасьє сясавчаєзу суасссасуа уссудааааа седесаседе 3240 цасчасчссч седсаєсєчаєс сасокссоча Ббасасачеаь ссасссуааєч сузасчуаєє 3300 сесаацесьч чазсссачуа сачсусосся сцезачесев Чдссчачусча судсабсоеес ззБ четаассося чакассвоує Ссазечасча вусодусссва сусдссаася сосасастсє зага
Чазачацчса чесвсечеся гдссгЧчечуч седсавасеу счаксецесу ссуусесеєу 3480 часачцецчееє сесуєцсяує Сдазазуєча сасдаєячЕсЕ сасстєчезч авадчачесУє зн4б касасаса сестссассс чдсваассастч чесчабссвч ссбясесася асчазчасоче ЗБ0О сецеведесте чесааевову аауузекаєс чавеческає сссзссуєче сеусесавце ЗбБО сассятчсечса часвасєсссу боЧассузачч сасазусчсе сстсзабччсе сечочсчасад ЕН ачастасечу вззЗзафсьаеє сеча осасдвсво чедечцетжає сасчесвнее кт чсвсссесавЕс сестяссчса абуксучасс сЕССсСУучЕСс вссаскссЯса асдсассуєе зва сЕчуасЧуєс сакосасазу учсссдчачас сесоасадся зсуєчьсьса свзаєсацете 390 кссусасзас ассессавра сочасазекх саасссудая зчсечесяса асесчасуве 395й аксвачсзся сЯссЕЕссСяЯ соачасчасува єбасасЕвсе чсзавудсач чсавасчозе ого веседЗавсаує чадзасдаєс аїсьтчусуча засасусоууе десачеукає усевЕкаоеЕ ов
Чаєчвдассчс увссакачеу зчссячсчаєс сучсЕсаЗвна актсечаЧЕИ чедсосасда 4140 сусавссцва дааззассоусу зесезещеєссоу сводчаксуєс Феостчсчес геодвачаєсус 450 чезвччсезї че свяа ссазсузсає свссзбЯясяс сусубУувгас содасацеце 455 псасасечоч ссбсссдеса асасссасса ссзсбасзає чесравоччс абзпасччсбу 4159 чессачиеч счуацасоста сеасстувоа сузсчечасе севссхахся зсачаакскас 4389 таксаваичатї чкачавассс чесаксеоус асакчесуєс ячечкссвЕс ге сЕВас 44 чаноччЧесссра аїсецсазвса Бедссасссу сааїсссвсв абсуєессче чусчаєсекче 4595 вусечусачес асзссчсоуз сезкччесяа сечЧечешеще ссевеаовце зЕдачЧоцчОзЕ 450 сУсЕсссова сазусєвчава ссаксбосав сзасссечоб ссосбовоусу ссбссуєсце 4аб2й сесосаскса саувстксяа Ссувознайс ссасовавоє састчуаскає есчабоває ав тссссздєсаЯ ссасаддсве басвазочея зчасіочеа єсасуазаах чо «тай саидсасстеї ссозашсчас сечсавоссаа счссвдвася васавссоава бесзсскечоє 480 чазсасссача гацодасвзча сезчачсассе чесучссасо абссапсазця асасавсаєе чаво чаксвсабссс: ксяссччеся сакссссесек сссссччсач содавасуцча счабессасЧе за
Басстсуєка сазсшузаса сосрстчсучух севаскоесула здссвсессуЄЯ сасуузсао з часавесас: чусзозачаз зе касссу сабсацеєсе аусевзаєчеа собак ваза чаасЕссес: бесацаєсуа асасчсуєсва чдеддассауєч асусодавсх багсчасоає 5І0О0 чеяскасазче авсесстсвао созсасссовсу сбузсчезч абасечивач чексбаБчее БА саєчакстабу асаваацесу сазвссачечес бачдесовсс сечедацесо ссавебсссся 528 чосеччсасача сесчедссоує сччсуаздскс чесаєчесує счЧассовезс чсозеЧая Бан тсдесадсво вкадсасвасє чассчдасеє сучдаасасч счачестасе сегачесоце зай зсесчскдссо Чесазчассва аассууєске скуЧасосачу себсзавсвава ссодасссс 5400 ссчузавсса счвзуцчавасє бесустксуч счассчсссуєс стасуєссьва ссусачясея 5460 ечсччЕкача чис сасая чаачцаззаау савакчсячс КесссКесдаса усе 5вБла сеусссзваче сссусссовЯ аадсвуєсса афвубодаста зазучесатс чЧессостеесса БЕНа сицчевсся чсасчссасоа чассесучеЯ чебссочазчяа свавькаєсяс чакечакеке аю сезаЕевксвВ ссесавосавоа ссеучкезеаб сечакязсвс савачасякс зччосускоа 79о казсчасеса суссоувавяс сечексекчу сасозсузеу сочссавсех дасудусаса 5750 часу сучсагсчазя ссасбчесраєсб сгбсчлссавза ссзосасовУ чассзазесе зай каУЕеЕЕВЕУЄ через сочай БУубтасєсаку совесаваус чсксчессчає СЕсСЕсСкчЧеВ аВНО аБцзесазчас соватессосас звссзцузасс аск сесс ясессчадаєс фасссоваве -Яао авазчсвеца зазсееццее чаєсацексс дедазатує сасочестко асоцсцуУВеє ай зсваасувоча ссссуєсбсвс чЕссксЯЧЕЄ ачасевассс час зкссасодає вова часячсасся аччасзаЧчаї сасосаадує сосЕеєсавас дсзваЯезавя счдссскдах 120 чаєсассчеч честесоцес вБеасазачес чатсдезкса дозсавсеца чассздазад 5180 тссчустівзася ассссусоза чааяссвчсс часасочакс зсоссчасоч сабсобудсє 40 савїсссеса сусасвазчся заасчасясе акссосуаєя зечеЕксвясо собсаачеасе в5ЗОй сассазчессак ссусссоаек стеечесче сесчаєчавс Кссдссочся часасаєсяєсв База
Чачесастода асестсавзає сасочдссачео падоссасувсу зддсасаєксе часссвсоса 541420 кЕдссосесве сазчсачеЗа чсчачсесуЄ Ссавооцсссу сессчубучсу сучасесеас Б4нО сеччасску: ссссувсада Суд ауєд зассаєсяяч кссЧаваєсте чсадсачече во ссСсссвосає чдесаадузчач сеччсчассс бсссадсооє паззчасауаз асазсвауєсає Ой тчссаачаас чабезвусося агссасаєчс спвававесе ссадоесусвес поуасасаве Бай сеабасчсяу агбЕбссася ассачесавс сесеБссссо саусуєстаєа ясечссассу та
Ччечсастаєс сссазасчея бсечассасав ссадедасаса садессоассяа асескчсдева ТВО чачссКЕЕсс сСвзаваасіссє чеавусаксес сессаазчаєс асссссауче час ссцее БЯ4О савсчсуцаз абсвчусстуче сосбосатсч адаооусечеу сесудосаєа сксасадсавй БО вучсаачасс чедачсаасо ячеесаасач созсаєссча сезсучечас бдсавсессь БО чаєссуссаєс сасачесуса адсчечасуа ссоусдаєсчає ууадассавс авсадтусох того ечасвесучеЕв сесплачсозя сстесабецчава сасеазсача чЕсесачассе саассяссаєх заво стучЧезассо ссвессдсоза судЕсссава уаксудачее соуусаєсяч сеЕксаацесе 7140 чЕкусасває сечсосасса асасчїсчаєс учадсачсса аасучессяєс часесксосе 7200 сешсасазца єсавасадесе чассаечада зачдавзсеуд ссудасссоає сзводавдає 7260
Екссзасача ссузвсссесЯя ссессуєсвЯа сеЕсчасессес ссассчєвУч сУубудвсуае 7350 ччаачсусецЕ кссучассоч судсовадес сдапааассв савдесдасоя асуачесзсу 7зве вчячсасттсе бчваазсасся сясззсчевач сасячсесвч асссчсчсся ев есевх 7446 сзчассазач зач уссяа чабсачесуєс пдчсассааве сссадосова суассоучес то часассстсс бедчачезсся ссзадачавс засзччсаса сесучесяче часове 75ай аксуєсдасач абаєссачає садааєсакс судсачсавс асцссчацчса суаєчачаєсс 7520 чачассазчач саччсчавсі чЕсссссочна сксасуєсту Єсодссчсса сачазасоаса 7680 заавасссстяєс чадсесзчачає агсссоасува свасуєасує абссссучає саєсвсссас 7749 чЧассвахаса сасчссасеся вавсьчбсуєсє озвбабссатесс вассттскча бссвсквез т7асо сасзачсода усалацдцазає ЗЧасачасеве єдсазсдзаа цексастЧач асоасесвуде 7т7ВЕо загасесаче Касавасацчя ссчечезЕча васаачаєссс чоазсаєсає чассававжєс 7820 ччаавеУсЕх аусстссаес УсссЕсссва Чесадававс чаззазасчвиу чкваваее т7аво заасастеса асозссвоису секс ксУє: часавсеясс сесущееесее садесасеве вого сечачетвасч Зачсазаася зассачсчсс чесзавзсассу давсвувоса сассчессе 51300 чессачіссе уассбоФчие севаєвасеч Сессадацсва зезскУуссоує абдсссасаг Вів часчучссчеч сосчачасоЯс Сасусссяцуа ЕасуасоФаЯ ссучасакає коачасессоча нава тасасвучцеат ссодуєсчасша запевкоФфсє ачсввчавасо басобсачся сасаоосечя вано асачсесеУс ссчсчасася стсечсоссУу себсвсекка секевссУче чесачсагУд 8345 седессаєуає ссскаєсчксо доассоуцсацу сесесцессу гбасгасеесу заєчаєскови вабо ставустчЧисе счазесчеву КсясЕвсасс ссасаяссато згссассасЯ ссоаЗучсчЯ 5469 сеузсчочеЯе зсчсдазазче чеасаїсточ ууссодаксає бсбосасев: асзасуссус 8520 сесачсасаса «зсучезака засссчаєса чссезчсасе чассеееЕоеЕ беЕсччУЧЕЕя яко псасоусосьу чезеЗузаес угесбевеку ссодзасяату дасоусчася аксссоцєке 864 ктечасочес чччЧечдевея чавсЕссвес сЯсечанесчу сечу есвдаєсцсує 8790 кусседсвЯс сузаведесвеЕ зесдаїскто ссассудеча ддаватесусу удсучасеєує ато гсЧеЕдсазча часесзчечкаа асезсссаса сваксескесее сучбасесбес весессесоа вищо сасбочаєсяч Кастссувее усУбссгасос Ккодусассує сбоссссодес асозбсевсеа вена кстсддеска сецусссасєва сезкессеса чсазасуває єсооусаєча асесакесяе 8940 часдзхучсу ассссукютеє ссабссссуєс зоазсуасессе асяцдесезсе асусдтасаує запо ссаседчессЯч абсссЯчеЕсЕЕ дсадсеуЧес ЄсСЧссачеса бсбасасаче «УСЕ з06о вчучссавсях секс обоса асасеасесу че зо295 «Зійз 75 ка3іїз 5644 «ії ДНК «8ї13з Штучмза послідовність
ЗК КЬя «ваїі» МПлазмійа родича «ОО» 8 ксоЧсасавау сучсувечас ссузскУусся асазачессо аазочааусє чауседаске в евкдесавссас бчадевасза севоасабайс сессврачаче стесаавсояч чЕссвдаоа ї2о чес Усї дазазувузча аскасакхееу чдаквкесаса часу ччксвссака іо аксасуєсвах саасвусузс сссавутаяче чЧавесчауса зузссдчУса ясудссавая 4 тачеЕсочаеза чЧечссссувоа засузуєчсу сасадезавтє чсаєсазеяас акакачсуєе зва зцсачевоуе сакачктщасє учсуасчекУ сесувасзча стасассося саадчацусее Зо зчевачсассу чсасаваєссва честакчссо всаядсассса чзазечЧасаче чЧесочачавия 30 всзасчачса саєстуєкача ЕбЕсасасво зУсчсасавсе сосубевдев асесазевух 480 чЧасаввссас сосаєссаває сссассчакч асаачскокс зазсзсчаца асссседаве 540 асцааавцуце сесуєсякас ЧосБасЕКЕЄ абасуєєзлає сгсакузгаз БааєуекЕке ва стсвчасячсєса ччсзчеасву сссчочочвай сСЗсасасеча асссскасекх чес бо ссавакасв ссазасасяс зкссястоає Чадасааєва сессуакааа Суссссавта Тай акассуззав вадавчазса совасагеіса асакссссає чссасссєка скосссскскс 7во косачасВЕв куссбссеву сссскоссса сосачаавеЯ ссачеоваву сзазачаєає 84 ссвачагсвЯ гсоачсчсаєс чадсЧЯаЧева сабссузаєсся закоссазаса чедеасзачає за сстбчачЧаче сосоусессся аавуаасчїсї сесвзаєчасч зЯсассстса вадчсвссФсс чо асчечусосу убабвабесс Чеісссуасує сдудевачач савстсудес зссасзсаса 1025 сбасссісва засчастсоа сбсазусассс ассадфссаса зазавасвсо ссвсузасає їако саєдасачса ацдацааєстає дсачічесус сасавссабу ацечасавса сбеседесаа 3140 свевсссссту асзаєсзаєсо часдуассява давУуссаасе чесБЕвеЕЯос зсзасаєсача 12590 ччаксаєчьа всссяЯсству агезскууча ассучачесу забєчавауссоа бассззаєча жабо счачсЯсЧас зссасчаєоас стусазоває часвасзася сбЧсусаваєс бассзассяє 1339 сазастаєсье асісевасс: сесцчясаасяа асезатачас сучасучасоя седасавацче ЗВО тпсаццаєса ссЕстдсусЕ сочЧессЕсес Чесіччуссеч сссСассассЯ асазаєсьац ї434о задоссечкуач субсечческе чесзусассає сесадсасся чаодссаззсУу збаяачосеке 1506 ссчкгагсуса зекасстаса счасчузччау ссазчоасавасе асоччасчаяс зЗзазасазачаса з5Бо чассчсечач абашуєчесе састцассза дсаскучсза сечЕсачаєсс зацчеесвсьс ї520 арасаєвсєс бачасесчес Сазвзаассеса СЕСЕсСаасс звазецчассс ачзасотавадчає 1680 сежеЕсеЕскзас забсстсаєца ссазваксосо Єбаасчсчат ССЕКещссос зосссчачесЯс ї740 ачассссуса узваачяаїсса авадувесссс ссЧачаєсесє КЕсСЕсессує усасавсокУ ївшо скЧсссоесва асаваааагає сессчстасс ачсучкУЗЕ ЕЧЕссоссуч ассаззачик 1859 ассадсест беБссузачу блассуусве садевчзусч садасассва асзвзссасесе Ен) сехсвусуєаз ссзбачессау дссассастї саачавстстї усзасасочдо стасатаєсесє 188а счесетаЯсса акссслессас сачедаскче кЧссвасаче чатазассЯає чесскассца 2840 чкевучассся асасуабсаус Сассязчасва чесусвусуу сесадаскзав соус 00 чЕссасасау сесацсссучЧ адсздазедас сбасассува стуачасасо Ббасацдезеда 2160 чссасдадаз засчесасуєс сесссуаачя дадзавачеса Часзучеасс супксаздчсач 2280 стацучесача асзуцачачс чсевзсзчатууза чесссссзозуч Ячазасуссої УУкаєссесав 2280 тачесесаке чечЕсссаєс зестеєсчаєсс суаусаєсята ССС Яєдає усесзєсаоє 2340 чааЗсячЧчадс сбасочавав асчссачева счсявсосеЕ Єбасоачевсс бечусссост 2490 скчесебЕвЕ чсссзсаєае ЕсЕЕссссчс чсСаєсессї чассссчьча асвассоєве зів тассдестсЕ дадезачека акзевЯсктса ссдсачесда зсузосчадо чеачедаас БІО зчсчачзечачс тавачстчаач засасесчає зсачтасссе ссосссасяс абссдсчсчУ 258
Барсссвсас сусясабаєу деесассстс аапсасаасєск чосскоасяс сесасаасва 2545 вчссачсзса сассосчеса Ксстваеусч зсеоузссає зассуєсусос счасаєссяає 2700 саасасссЯас кчастедссо єзасапочесо чсссуссесе Ччосабесчев сасацчазевад тва сезечЧасеяеї сессоччачо СзсасчсчеЕс ачазчУссссс ассчссакса ссуааасяса ев счзучсачес чсаЗсаавас бсабсзусае чассЯєчдвач счаєссасач абуєстасо ВИ чЕкесевксесце чЧеесвуссса СбеЧазесє сезузачеве каасУуєеЕТ сЕКерЧасаа 2540 зусуєуєсає зссазчвчся Яшесссвссо зусессачвсвзс спасцесесе стопсзасавча з00а чассЕскасЄ сасччечеса асчасзссзча сузаводаче чаєчасчссс зочуасасчЧУ 3069 ссаскоакдча совасаєсасс садестассоа аасчссчсоа яазагавасва седчсЧукве зі чзцаєдчедася дуассазача вазассасбєс зедчеЕсазва ссаусаюєсес десвасасяє зі8о абачасачоса: бссазсаочеє ацчсозвусаче аксегсусчає чесзчасесоч аасасбаваєзу 3240 бспсачучсас сЧасссссяс чЕсСсосачає сесаставас асччанасоч вачассаскс з300 асчеЕсусЕчЧе ксатуєсяса часясьскас зпсадсацес чзесесасуєс сасесачодеа з36О ксЯядесчассс асеЕсечЧчстаа ссацчтаацче авссосясса чдессазчесча чЕссссавеЧ 342а зсатяиссас чаксасесус аоссозсаЧчсс азчасссавсе чосасссоавоа зкусасеачса 3480
ЕЧесчасстчеє чдачасечеу часусчасча зсабчЕсесо ссазачуєсу чЕссасасає 3540 ксасачкЕсс ссасазачває сєчассочсаеке савесеєсссчя ачсоччеЕязає ссяссзЧсча зей ячсчссассЯ чсесссасес асдоссдачас засеседсве сасясассяс дасуєсваєчео збо ччудваЧеасач асазачксаса чЧЧсЧасусс сасааессях дссаасвоя Кеосаєчечеє 3730 еЯссчачасЯ чсасазаєсая сечечасачас сачсачксеса «Ечассааач ссачассччЕ 3780 зачацесося адсчаєсссї чаадссоцссо седасчоакся саєссасст деседчасає 3840 сабазестує засусчечез сесесдчаєсусс десзававчед азузацаасса саасуєчевсая 3559 чассаїссва себечсуєсся счаасуєсау савчвсувєад сосачечесеуї судсеуєсає зчЕо
Ччесзддсчаса асуФсссоусі ссссдесуав асчессоустьЯ усуачассяч сСуасуавуве за20 сбчачечача чеусчсаача сессуаавас сусавуєчає зууєсчаєса Сеубосуссе зва ссачсудазва сазсессесаяс стазазасчас ссачацсчсє десачсасеє чкестасчва 4150 стіссабуаса аадавзчасач ссасаачтас здсчасчаса чдесабцдссос чдеоФесссасох 4200 чавадуачеєу ассяуассда адуєтессаа судсовесуде суассдаєде жексссеває «26 чсуасіссбч саксаучавя садсссавчса убатчссчач вссяссчадс аседссцсоу 320 сваччаасоу сесакссаву зачасочоує ссавсвчксєс сссучсосаса часа 41380 ссасзсссас усссазасвза чосФосссасоувз чсссовачся ясчаусссзча кокКЕссосах 4545 тзчЧчеЧаеЗїс учечЧчасасазу чпсечсесацсав седсаксвечє дУсессачея асдесседсса 4309 савЕЧцеассс чесчсачацчця ассчачассе сузксеосчсУ завкскавсас дастсястає 4550 зчачацаєса савсеуєекс сссстаувес асаацееває асазавзваце азаясессява йго
Ссясссєса чессбеЧеЕсо свазазкссу ссЯбеесЕсх Чссссчусіса счсвсваса ан пасгсвазачч ксячасчасв сеудсдасявс ес часа сакассєваа кечсузавца 740 бдавссучач асасутасає Єодсосоасчаа збахевсзччс гечевочече Кесесевес епОд бакчучсзасс уасзачесчбу азсксоваца асачеЕссуєс Едесбссуаєс созаєссссає «вай счсусЕСсСЗає чечасуєтуує сячатечесс садестсцає асоебБЧесуєч асссссвача «520 речесауєсу сусасчессося Бсаскскссь часачечске зачувачзасу саассоцчає 49885 сего Уусса давасічасу ссуасчавета собсдчдсаав соссоссваєс сесовцаасть вого часачечеча вссазуцесЯ восрчсоесу счсачтассї садчвачтіас сксасодеве 5іФпа абссовссяс: басучьсеб сучассесас счесчавссу чаасачсдсо ссубсабсса Зі счссаусоуї чадузодатсу зяссуасузу зуасачадекес чатесадессаа аадчксекесе зап сзасачасосо чадсечасеке СбЕссссасча ссадстассс чассссвсУс зчечсавуча вона сспсадассяЯ сссззвесЯчее седеецасує ккоЯзЕЧаце соссвасаев здавчесевда віай вассзчакчсс судассссва сесссвавас сУукссусавс зЗесЯцссасс аздасевеух 5540 сачассача асесосчЧчесач Сусавєесчака зчеКсяссса чЧааассусає счсецчсвоска БА кбсцЧатсеєсе ссассабсяс чассассусуя сссасавссу сччеаосача ссачасвове ве сачссуссяе суссачаєус сассассову сеочесцссс ясвясесває сеусецсеока 558 ассасаяцесоа засесдассс сосассусва саасссууєс астксеосає скуззсзаавя зе«о ссчссвузачу чечаєсетуа судалеуєсе ксоувусскс сачазаяацас собкусасяє З'ВО чзссаЧчечЧачс сасчсассяє вассчсдаво счсуусчсесва чазуєзакче сссачсоачея Ба чсгасазсус бозсдадаевач сотзасуческо чесчсудава сессесакає одчсесскесес зва седцчсЯЯасс чязачвскее сачсахусЯчч акеуоачесяа ссасстссвоч свзщесасЕаее 5ано чЕссссаксо бсчссассац вавовссвес счссссссся зсабсчогача взвзасаєсасе 54 зсазасассу часссзаєцу БЕсзсбвасес сасесуєсач азасазццвсс зедеЕчзавсе во0о сесяссасуз сясапцссс: чазсувасебс усссусесусс бузаячсяце засечавава вобо ссчаакчсче сксясочсая ссчссСачоса сзчассксача зесосваєча сссесасчся Ід ссбусачЗса чавессабсЯ завасуаєча вауачсачаЗс авакчастяч сучассссда БАН ччайасьцавс уссвзесчеуч згацочесвЕ Бобдесваву счсуаучаву сЗадсесачев 240 сассчссаеач абсчасстата сСедеасвччсе Коссоосстав зссуссвоасу аасееестсча «За
КексоЗккає четезкусос кедазссесає дазассадай сссуссакдча гсассзадчче «зо счсессасьс фезссквавая чачссссеся садасстсвес сесвасуєся ссасссасця ща аслазасчес асоечакстчак ствассчачЯа асозачачсочза ччссчеЯЕ асадсссЯчед 54 асчавччсес гУчсактесЯ сачазвассча Кбсзусечаак скссочауєсо ссср зай їедатсссач зечасчавау сочЧасеессе асусззачс час есачесс зесяссачат ай звассвссча чЧевсссгсзчУ часасчаєсса свассуссчаа ссвсзаайаай саУЧУсскоВ апа бесзувстат чаксесзуса завзсутсв чабевсзвує сасававсаєс сс сесу ази ккКаздекЧас сасчсснЕса соссаазачс «уче суч саке пасе БУВ сесдасясссе садсачссаєе чЧчабсасавсс зускечЧкса чусавсяаксс судадаєссса «Ва й
Кксчсзчаксавс сасоссбсуза ассусечачч сссзсочасзе чеассчагчос ззчачесса ЗО всчабассосе ЄБЕсосссве ссівзчачоває ссстсавчса чучссссаву сусччасеяа ЗБ сссассчава чачсоцсавх бесебвосвок сескосвана уссосаваєся ссачоссо 7озо ачизазасаї зачодазсає суссааачсоя заезкосе сусазкекес чусаачавос зово ччссбагсса засссцдсаєс сеузуаесЯч ссссачесвЯ ссзчосаасв з:ассодсса 7149 чЧеазачсатуєсс сдсдещусвсс судзачьсстчя гечуккдецес абсадесуде заасакевсся тов зсаесассуає сачсуссасу зезчачессащес сзасучсчся оссакасс чссочачасх тако ччесчессас чаааксачес сазчесчесеУ сеча с Чдссаказеса садасасаха 7335 цессассуче агссуссЯсс азечсчаску сопЕспадаа Ссаскокачс чсаєсаседа 73не казчессччес десассачес десессдуєсзсає асксзвссто чазазчаває сесакабава 7440 ччосасосау ссазасессуа счЧевдавєаває чевкессяса совасвасса соядсоесв Тта9о стасасачаба ассзсзчачє СЧчсвоусва чаваскесяс сасажсзача Базечсачає ТЕО сЯасссчссЕс састассазя чоузваасадая гдсчассязс часчаєсчсча гсчасассує 7852 зкбсстсує ассякаасса дсуавусаєте сусстчссяє сабесчедка безассадас Тева чакчсачака сксессссач сзсесруссячс сепксощясес двасаччояс ресаванссе 7740 сесавсоссаї азсяасевачек сосуєсобрУу сзаяжаассїзЕ ачсячтесзча чаасеЕзасса таба авабавссвя БасосЕссає ччясеЕсьс чассалавсс бУубсчазсоачч зааеЧаасяда тя часчсссаче апсточсачус чечссвеучесс зчессасчає сестакктаа вочоческо 7з86 засксазчусчс додеасесева саєссссяста хезустасясо асечччксак сеча Вяк счасассоче садсасссеас бузоедсчоссс созсчЧесе шЕсгастссс чУдевЕсос вт тасзузсаац стчічЧассяє стссузаачєс сдсасакуєс вузачееесс вассЯксвкса вій ссузаасуєа суазуєвеєк Фобос еве соус зачсксреча зсзасвеода во часссчасос сгддвасосо сусесссссоя сасчаєчаєс чЗічссазссає суавакєссау вай «КсесЕеансс садсааскуса зассскокск чабесесакУу СссЦКкесак почне во
Фусозасява саасциссяс собосачайа зссозасцаву сопвяссаєссос сасесудуче 834 садсвссвосс засаадедес чечасчессо азусосксся вксссосоава десачуцсву засо акссуєасас ассассксЯс сусадавачаа саусавечос Зссавсчесї авсчакасує чав чаззассчваа зссккасЯасе сесссусова ссзадасачя звабясссточа сееозссчсе вла
Чессвачаке чесззчгчЧас дсасзесЯсч чаваєстасо зазбусясова сесачссдає во звеавуєскчЕ ссучессчса зассеєввоч савутачечо вкзсасоово девасоччее нкяа чачаассука асстаасочса чеачсочсйа сечсечсачка чоеччЕЕвЕса КЧчесЕЯвЕа 700 сзассУСЕКе сееФтесзевзак ствсдескот дасвеєсосвад сачевзазочо ЧЕЕВощчсечЕ вла чезосчакес гечасчетає зчоавоасаддеза счасчесаоч сазсачезчса сссцссскав вяко засззацчеса часаксасна ачсасацеви счоцвосвасє адсзесяве седЕсвоевеє БІО чечосетсасу астувосакя звссекосуви чссссвсУва сачессазаес заксссвеає взає сцссязасуЧ содоччсодая аздаацчевоу сесчасаєвЕ 4екЧасястас задазсваса запо сксчесавусє ЧЕК висує заздачессоцчі: сасессаєає аскусазезс єуаасочача зо5о
Чесчасхуча сакчессач счсасяксвасе бБескууааче зуччзстчає чека віи зцазассчас ссвадчазчтас зсоедчавезца ссаяссвсса доузасетсв сасаасе о вьяй свазчУєсскч чдайссвавчс БеучЕксаас сссаасчач сБескаббса аедасососца зач ачісассавч абссавасчє всссессасс узасвассся счачсчассс Часассвева запа чавзадечччч сісЧачауус зазугассес зассвссссз часячутесвч сосзсоусвосв з36 часссаваса суссвзцсає сосчазчсчЧчавс асчевесзає чдессаяссси бесассаауу Зах чЧусдасжксса аччучегцчася ссосвгвудесяа сесксвсакує савасзстач асакевкаає з480 сссучсачас счасолчвачи скачесссшє ссзасСсасюева ассяясачеа саєстасаУє зБ4о саакзстовза гвасасссесе зозвосЕчсав КоЗссІкава асодвакакчз заслававиа чи чсчесзаслає чесЕссвстс агсуаєсвасс зозававсве єтАабасзааєе звазаєаєвда зви акоивскоссу зрсесасауч аказасаччва ссачаасвея саасевеца саке 740 тЕссвавцуч чусоссодсз азассясаоцчсх асесасячає ссссасчеке скоса свав аа тчвсчзсдааз счазбоцесе весшксчаук сучсзааавоб сзУсеБеояа бчсчасччай зяЯго зувзавсяксос ссвсавачса чезссзоча ссоксцссекач ааУусесзеко суссанизав зо акассссккс седазчсазе стасдваває чесузасссч йаччакскча стактсуєя Зо чесчабсасоуєе чсадсячссе дчадчесаусес аасзасавай ссабсчссза сбесваасева ій029 сесстсрабссо ссаєсасяеб дасусотобс часвесЧася аччусаєстаєс Сасссасоче іо свсусозксЯ аустасевЕе чачсчавааі сЕччусоваскс стасаєчскеє ЕСсосуєсва 0148 счечксссачЧ ссуЧесЧавк дасаасасся саасусвауча сдтсвчадас чесевуваває 10309 сстссзЯвкУу сассессссс сасбусасєдаа ачачаєдсає ссуссустає даазузасає 10260 часасчссчс ассксасасї ассааасаєч ччаасезчаєс сзчзасчакчся ссссзгазає 10329 авчавсессе «уасечезчає зчзадчавахс чеччссасвЕ сувавсеЯа садсавввие 1380 сучас: Ччазчасчуса всбспдсвафс сспасаксуєс дчссоЧсуза зсасачеоує 10450 гсескзучсЯдс сочасссуач всссассвсс ссаасосуае зсокассосс садаачесуд 10500 асстссацса сЕБЧссесдая ваачсечасу зчаавувсся зусаасуєуву собесбецьеу їіо5БО сдассасає ЕсвсзЯсссоа чаксчасаас Есавуєссвас Бчукачавчес сЕсачсссас тоб сссспессос Чазвавачдссс сачачсссесс ссеЕсзасаєоч ассдсосася сосісавоєчЕ 10680 «Звазасяава бузвсзвасоебе усгсузеває асачьссоссє чЧаветбсозєса свавесдчасее їОо74а сааучечече чЕедчасчає сесчаавуєа сесезасача сечассвисе сусаєаассе і0805 сязазачЕка Бесчатсссо безасвасач зазавсссяє сксбсусссв ассбсасуєса зай сасесссач: Кусессчссс чвеучеоусес чаачессвсє кеаєссовУ дУучеЕсаднха 10550 сецетецчаує ЕЕтсзуссас ввусьацчева ссосседевев сесябсавЕс сеБустоЧчає їазва зчазвуссаєс чазусааскочч сузачазуча сссассддая сссстсасса звкассчаці заз о чЕзчУввечЧа чуссчсчус сяЯсчєсевса чесвеевьЕ Чадсосзчаба аставуваєє ї3вь00 завсчсваєє чусрсаччсс десассубес ссссяубвсдЧа засскусавя Ессчсуєсав ві1ео0 зчавасаасе чусасокасе сс ста ссазуєтвазчу чебсуасята бссассесай 523 чеЕжсасоачеч сацесусааа агчзудвасатє стстасастссв зссявааасс сестсвесас 11280 чезесезчасеЕ вусзасувуз ачеобусссас здсаасацчаваес чЧесчсаччя ббобссзвдай 1134й асчезчаччат авчассцвас Ксасскчесч сзачЕсксас сссасссся чесессодаса 146 їтсзадосдасу ссуссбузча сбазусуссс зуссачксаза асаздавуає себсазтове 11450 адачсачас васчосдочя счсасусчсв аззсааєссч закзеусУуса аузвасссьс 1х840
Есчрасваза сччесЕсачесу абсаааєсає КеусЕссІВа сксЧачеаса зсавсвевакє і1580 сезЕссссстс аацчеоавсу ссастзасаа сСсасуаєссоу загассваає сессассусса 11540 чассессузає часбсесавоас ссаессссас часссазаї гсачассвзаса дбсасавиве ура стрвсесчссас зчаачдазчазче ассссячсча асечччсасе чесазчсіасс чсучесасє її пзазччста чзассткавоу бабстсзасаа свначабдсса сасвусчаса боУуксассча 11820 їзасазацчадє чкУбЕБсваас ЯасотевасоКЕ ссзабстзав асскстуайассс стцексасад ї1хвно сесесдацеаеа «КЕКЕсСВоЯс чЧааччасята сяаксабскс садсгавасу дусачексох ії84б сачаассзсоу чобЧчассуся часцзсчава асясаавоса засаєсссвза сЕскагсчася 12000 зазвасксксз аксзсеЗсса саевасзвавс дсссесчачує басажзсбсасе зебоазЕсавх 12060 чачаседцесе абччссссчс ссеезчеЧісу суєЧсессес чсчацдесата сеседестає 15120 сссаксавасу ссстсаєвуу сасочаасуєч засзаїзчаса ссчатсусесо казачачсає 12180 чесавесатче: чсЧечакск ссзачсбаяс вссбсачУсе стасстссоа савччазазва кет сачЕвЕсткоУ заксосткуца єкузарЕсас чссагоасасе чесзчазаксяу ассесадчаку їа3ай бессосчацаєч асебсасссоз узсказвзасссв счсбасаєся бсоусасаєсЕ сусеадчева їи350 сагосєчасос зуусосдовсвс чсачасксЯс сСсоуадсвзач сяссспувас ссасачевосс 1242 сацессвуєса ссакссссза ачсазачсац сстаасаєсча ссассясчса чавасуасова ї-ава всечачееа сесссбакУуч Єчеассатеси ссесссочаеЗУ чазакччсяс Сузесавчтв 2546 сЕсусбсаке чссЯсоссас сУуссессочеає азудеосасає задсавсассч ссзассЯдЧеЕ 126095 часуасоасаєЄ зечЕчсвуза зодасесеаз всссесЯссУ ссаваасчсЄ дтазузасаче 288 сссассаксос сазЕсссоще Ззсесоссксеу бусстдссаєс сачсбссвос бсузачовсе їдтай акзасчачез чачастссосс сзадассаца засасусцау сесудесцктес дааєдаксва 12780 чскадасачиу сссчачтзчаа сечсЗчЧоУч сзуасачаєєс сабачесУєс сассассацу вавяо зазуєксацеч чеасачзачч ечстасчвот єссаєсаксе сЯсЕЄвесса Ясцсчесеце 12900 сзазвасачеч зсакссссав чассаєсаса зоачасачас авачасаєсс сччсвававе 2960 чЧесчуескЕЯч сясасаваєв сесссссачач ссчаєссчасс деаасЕвссе сацшесеседаа 13920 чісассчачс саєсссавав ссудсЕсоач аачазачечс азбоасачаї сбавссвсояе ї3080 ксзедасрчта Бессакскосє зачсзчнайкх ссазакссає сазчачедче Феесевово із148 сечсдсочедч содссвусеа часочачсвоч зеадасасса авузавесуз пускає їзхопй кзсчавзаасч чазасччктч: сассетЯавів сЕбесссаза чссчасячса вБчсчаєсє ї3260 тзсесскаачУ чия сесву Сас расто ассатсасео кававаскУк безачевеВе 131326 сесаесасос чадесдесоу ссазчвсасе адсбассеча авочеооске даасавевоеє 113860 слячачсата яскосЯссваа аасуссасся зайве ссуассЗвчо ссоусвабос 13440 сазвцсавсся зугсссчссса сясекоадоуа басезасчач абссасєсусає чясовачстче 5350 сессцепсча бессасадсав саваавсася сесабессесс счссчсазас сасуєсЯяває хзави
КхКчссзасяа всудсассос сасодвссавч яааусасчаса кас сасеч ссссасааи є 13830 ассесбсуазчс заязсасвої бсасабачсс бессааабсє чзечесезчасвея сечсбсасва із680 часусасоеча восаскоксес сссдсуссас сзсвзанассу зучЧешсонса вуатетеос 174 чесчсечуде бусачебсяа содахсссабє асосаєстас заабсувЕся суссадасас ї3звпо
БЕсвосаєсо чезачзвує сссуссасу ссесоссвсЄ бессвбеЕсуує сечеЕчЧЕсуКе 13860 сксчазазсачеч суєесаесда сесесссувкс зеечебсудева сабдезазза сезасусеке ї39720 ссессачесеє часссасуєсс чегссуЧеьвс чссосісЯаЧе часачачаву саусазччевд і13з8о засацдестекї сдчцавссдеха дапузтссз сучсасстсв згезазЧчеву дзкузаасою 1424а сесачочссе чечсуакєса аачссчасеяц сувсусясоо ссаббсвссб ссесссоФЧеу 14100 стесасскаде сагаєчаучс єсвасчасав сзсзачавсу зсавоссста счвесвасее 14150 екдадасссе цавадвсчсс зчещасаЕЕ Чесузвазнос здудчасссач зведсаесвас ія сссасосуєс чоЕТчЧссавс гаксяскаск сакесексса сесссуксоза чдасусакско 14285 асвсечучес сеассчсесс сУсЕЕчсЧЧс сЕЕЕЗчЧсесва счучаєсута засаческс 14343 савзабасаса зсассцеУєУу досасессско ачасуссаас сесоучтааає счавоавасс 14500 течвсассцс сссескаас сзвасачока чевасауєте секечесакс вачассчаса ї4460 чЕЧсазасае аччеасасчсоа бзсабсвассс ччазачсчаа акасезссечх ааакессаєсае їа5а26 савзчассе сечу чсав качечавнсва ссчесесовя счасечснУкя ссзасевсеу 14580 вссдссеусяс саазччскає цасзяаасеча сссзакавак сбсгсачестее ссзссчаає 14443
ЕчзЕЧевсесЗ сесасаде чЕссвсааса ЗесккесасЕ чдсЧсовессв ссассЧачее 14720 чесчсаксух спепацуєз поспваскавє аспекавайє вузуаседеч седесссекеа 14760 їтсзчачесучу асацачессє учазсвсака стувавасає авеччеасає сесучачесу 14820 скЕсасоуєса ясасчаскас гочсечаачо чезчачавоссї засос Заззавтгацча і13В88о
Єаартссссс пеодасачаце БУустачассь своссасесу зазасоадсавс сдевассасе 14945 чисксддессу Кедеуаасух васзвоссвва чеваекосза седесдесда чвазецчевес 15 аскбчЧаєсчу чассчсавас савасвасас асусусячає совасевЯсо сессасеввеа і5йКО чЕЧуЕссксач себоссасс аадссссаасгу дсаваєсваас асуссавлвнає Чаааауєчеє ї5ІіЖО тЕсссдатсса сЯчсЕсЯсвч Бучестасаї сЕзавасяче ассетсстає чкссчасвяч 15189 зачедасавс сазасесчес уза єта дтевкевавсесЕ зсесавасавя стацчесвасеє 185248 сеЕссуєачеч васєсьссчед чсссасуєає ссвессасауа сабессасеся гсаасоведа 18300 ччаечоессЕвЕ асапечааеж Кассусасас гтчцчачесеас ассассеааа чЧедасчвчее ї5ЗБО спачвсекосас сесассдсак Кедссазчда сааствУуН сязассчаза ссоЧозезЯ їБАХО ссвачааскуУ скачсваассо беадесуєвокоа сесчуччасасе узачкессяає ассвУучеоЯе їівіне ачасясассе ачсачсЯксо здсассасавс сссбсясясвя псдввсекас бессвасвааєу 155450 ачесассвзає чдасччсстсо ссскУузасу свзудсавкся счачасачас ассксеекає 15400 сзвеччсосс сссоУссує абссзтачає згаспоачсеас зазаесичсес аасадевесв 15650 ссчечастає ачечазечеї счачсваасає скессававе счточасачео усузвевзаск 35720 савсчачксє зФсасазчасев сяесдесчаке ссзстесуєяе зчусетчаава чесесевевЕ 15780 ссесазбачся сссорчсаачя сесСссзсосу ссасбадсаї чеасабаєсса аачссссуєся 15840 тачечеЕссас ссочазьсацес чачобчаача Ссбчасечач сзучссасса бодссосаса 15909
Ессассзада ачакссовоаєс БЕкосачеке дсгзасакУє себсеЕотесу деадесасье 1580 заавчечасзна соадучсасау сазчсоватас Беосатазває бсбосассуз чеасчааскке 15020 девсуассї вусессечссо аасссчачоеч азасчасвуте асзадеєуєє часачаєссУ івонЗ чекосяссояс сссачсвасЕ зескссааєц єсЧссудсча ссоссудсвза азсочасавка 15140 ачецдсасссс сеЧесацаза азасакатсц здастсдєвая дассааєчає сссдчесуєв 15290 чесусассуч созачУсчатє Сасасовачо зсбаачучсза усесачосяс срозУчвкая ІБаБИ асчасчассу Ессссасзчау Зессаздчачу ачдвзачезачя дассчезауч чЧчасвзаЧчесас 632 седчакесасе гачесасслає пдссссясчвч счаксавнай Бабабссчас чатчаксацча 1638й ччсссчасся суачааусаєс Кессчсуача ассссазсяя сзїсчквавс сссчвасуєса 15440 чассачачся счесукаваач часссассчеЕ чссосссоадуа зачдсазечає чес зва сксассочас счасекссяча ЄвсочвеЕЕсс Сдазавасча сссодчусає часчаасасє 15560 чеасссзасї чФрчссзчЧазс азссточсаєта часавоссяз ббасастазва скассчааса. 16520 зач:ссспЯача соубстсссо даачаєучав ассасаєсзаає сссочсзуєе адсссдчесса 1680 асазссачву саасаячсчає ччсчЧассубуч вссасссява счасбассусєсе асчччавасст 16740 асевсЯсєсус усаєчассаа дасассссуа асазсаавсе авачвуєстуас асаччсечаєс 16800 авбуцеасає беассуєсскс стччасаєьс бсавачсаєсу зЯосавуєс сасесччаво 16860 честасаєста ачакссуєасу аасчуссчта засучеусся чазкедесдав асЕсассаве 15920 кучвсссуава свечасеває ссясвусаса асустудаса звасуачеве зсасесудеЯ 16980 здчасасууд сечасузаса аабсятєсссзу сссбачачча додсассава чабдасвася 17049 шесЕкЕЕдає зетосесосЯ сеЕЧадезчсс десбоскссу сессуєчаза деседеское 17100 шсучсачьса Ссчбсзакач чсккЕвкКечсс бУугвсакске чазесзкоас десасодасс 17160
ЕцпсссчЧачай асазассаст адесасоучЕс доссасавуа сакЕдсечаца гсучдчазаде 17220 счачсачатч кассачивЕЄ сессчссазч саКСЕчБсса безсссосач ассассачес 17285 чсавесчЧесач суссчсссас чавсочоаса ассеосдчасс дсаасацаєс суссссаочеса 17343 їсассяассса суассясасу ассвасасся ссачсчасся сасуєасся удбедасасх їіт490 часасктсусч чечвавааксав втгсгавсцчесс аяаЕсссссЯ ссчавачака стЯдакесесе 17460 сачссЧадеч зачбсазсач сссачсвааса ссусазассу асчєсавсає сусзассвис 17559
Чесатгадеск чачечачас ссссосяасс дедазсасац тсЯсуяасаЯє сссвуссвес 17580 чесадссячяче сеасезасває зазегчезсс сусасачУусь чавсоакагсач азацссусає 17548
Чесааваєссеа скусзасазя ссясавсчїс сбсаксеоЧЕвеЕ ссбасеккає савестсека 17700 ссесчусЯчУкЯ асеудцесаєч аакссуссча дссачесача бБазассвасеє став асою 17768 сцсасвчУсся ачссодснаву сусассуєує вадсасусес саевавцсаса чезасаваєє 17820 сгасусєвкакс ссусацактся аактсосача кавасастксс асЕКЕсСКець Екзазавоеаа ітсвабв асссасазче: чссчассусс абУксеЕссає зЧаассососч ааастоссеве ссаасасаве їтаай гсаясссаве здасаєзачес заєечаквеку сзчускучева кезасазава аЕесссцеса їіво0о сасаскзчсує аассавчсту дсрсстадчсу чсчасєссве айсабаестс чесечсвчед 18069 гсвесачЕзе гачевкесссЯя ЄЕУСКЕКЕКс дзасвуссазу чдаацчавессу седагезеву 18129 ссачасааесс зач ссазс ззасачусяс Чазасесаєс чсезуєссаєс асвзааасоаче і8ів0 чассчесопас сасчзскоса асссуабєчея зчачасасас сасачзсузда усесавасеиє 18240 ссисатассс дачзачаєчс чісаєтссув ачссааксваєс счасчдавсо заєссксаске ів сассазсссо сесугсазає чсоссзяассаа зсесасччес ссудсассая сексвоазасо 18350 чечесессус ЧесЕссачед чусссасаса асаазавевс асчьевасссс зочасбааас надо чеаскесчсяч ассааасзчач ачскечвочає Зчасассасу зассацасачя сечессвске 8480 сеччуачааає сосасспоча ссвьсасеЕсв сузбєдачачс сасчабессає бесдсасачаа ї18550 зассобасча учссчевуєа стсвБевадяс сасасавсяв соссаасесу ссудакакоє хво сЕсЕЯЧЕЧНач сСессвзаасає чЕЕссбссіч ЕдодсдсЧаве садсяааєсся стасессаче їнебо сссрдесайа уавсасчвсс чсасскусає ччсодассає чекссЯкЕсся ацусаоучева зат720 чаасааасях сзбсадсуєс чес асессо ссссчаксадча сссузакакс дссуєсасас ї878во заасатсчеч сссзсозсоду асаєвоседа даччєдЕссс чесягсодясва сузаасечаЧ 18845 саассЯсЯїи Фдесосвубуч ссгчадесоч сесескссЯЯ авадекоссу зазуачасая 18509 асестасяза асєрбасосузва чсчасбЧсас саучусабас чеусесастса азаввссеса 185960 чсеаассоауа ссаасаявсс чесіссасає саасасоксс сбудасаасс зсаасасесса 15020 сайсссассає єсусуксеза чессососує соссексссс задастаєст ачаксУкеке 18080 сасачасцси чаччсисааа счасУусчаце ссахсайсава єс КсЯсЕс ЧдеанЧчеЯсчє 48140 ссссаческо удасавссся ссчзекешач соасудевсє абсуссдцав сесачсаєсь 193300
Ччасссдаєте чдЧадостаацє сгссосуєчсд стгасачаса зассСвудаво дававасесе 19259 чеуечазаас азубсачзаава ссозоадсаса дсачечесясє чдачдсасассс десечощове іззга ксусачеЧкя сгсасзааас узасачасущш акбссаасчва ассфссекЕ чусоасссесва 1938 їсесчацзеес гсасессуєсся сазаєчаєсос чес каса авссуавчєя ссчачецаче 13548 спестцчастаєс сучавесоує чЕдаассчас сачесвсчає саасесдтаче одсббсодссаа 13508 їессозчсоза чзасасассс састссбоче ччасуссвач асуасуєвуч ссабасуєсье 18550 бзачачачес заудсовсаасв свссвазчає себссакаЯсе сесувессач сссякдачає него сеессксос сескосУусКо застою стуа ассессксосє гассксосо: зазассчссЕ 1з880 аЕчзччУсачас аассвасуєса аччавоакчЕЕ сзсссчсечУзч чаочссечзесЯ чазчацчсасце 13740 чекчеесава зчсЕссускс гузсЕзчеУЗ сочазазсасЕ зсечавачБає счсучечееся 18850 звечабсчасас Яссаасасєча счбасчаачу чачсасарає Сдасасаєца ссассацдеча 198860 каксчсчсаз сацечкчссУу застсясуає засасясає: чечсасеЕсса чсссескева 19920 чессчавеос авасуссакса асксссесав бечесастає совбессУусі кСзазаачоча 13985 счахгакччєс чебсчачуєзу ссеаакаєавня ччачдаївчас сссаєссауає сЕЕссЗчсЯ 20440
Ксссасьсас чисчачсакс асаєсаєтес ссссссесчє ччаччавсос сдпдаєтоцасє 28100 сЧчясснасв чеачдедсосо сосаваєтоєс асеаксавку сессстсссеЯ сдасосуєава. 20160 ззаєзасзоац асчасчсіся сечсассчба чесссястсс асчаєчачес чечесасваа 2о2а2 ссвсайсчас асчачаасяа стссчсачач саке скча зсечасайств бузезаачеє 20285 шечаасасс агузасвасс сгуссзасчє сачсучсасо ссзачаваса азбосаччесу заз4й стасучесосч зучсазазуч созактовте савзасуаєся уссаєсався асбсассацеч (мо вцестсскаче счаччавчев сдссесаздое абдабаасав баеовсецаєс дасчсесуєсв 03650 ассацессаа чсеовачссся соесуавнсаєс сабоваассс счаєзусчас авзгусодчача 20528 асачсчачсч асеачесчаа созассаача асвавеубчєс асабакрЯсх азссаєсоку 2О580 зеЧччЧЕсад кусесдссасс сусачаєтає зесасодечч десесччасуз дазаасоасес зОо640 сакусаасся сассусасавй чес сачесесуаба гсзсасасах сассасасес 2а700 чазацссача часчасстая акчевнайсоуя бакссстсяа адсабесусає сазесчедсає лото сЕССсСсКадта свадЕсоаавсї ваачастссчас ЄЧесаскос аЧчасесдесЯ гсоссесаче хо823 псачеуєче сачачецасє лайссуєсад едесаксескс сгбусувуєзя сдскдавава 29885 асссссавас абсссаєсєчсс ЕссЕсучаєс Ккадецесес дечасесзсеє ссеудзечеє 20940 сеаєсзаоус чдасвссвує Чаєтчавчезв скухкссаае СЕЕКечевавЯ Качдесасеку за саазвасоцес чЧасанаяасса сечо задсадацчає суссссасча аасусаваєсе гіпо ческсссурс дассусссса ссусеовбусає авссевссЕео саусавтуєск дсаспсуцевя жії20 аЕзасчаєсусє чсасусссоч ачечсассує сзассчсесва зссяаусаєа чаазавесес зії чачазчссксає ссосасчадя ссвасатсса асчазсассу єЯсаєссчача сучсесогбав 1940 сзаскстчачеЕ счсосЯасчева сзассссясо ачсчаачече сссусесячс часа сає 71300 чаассчстза вучаксазяз стасосссса сессазесає суссчсавуєс чЧсачасчест ЗІ3БО саассчаксзчз чосзсзсева совусаабак азссвавссє васачаказу ачсчасяяу 21420 свазчусссуа сузасяачавац чзатассаєса зЧусвачача зачсжасссс дассесскаа 214на чсасаесска сосбссхтачео сСедгаасєвна сассубокої сеечесчава сзачечеоес 21549 чесссастеЕ Чазчуаесстаєсс зЗечачаасУ чскасссва засесоаає Сас осЕка гів стчаскксаас: сазачечазде васскеусис сдусакесскзу ваесусаасає зчвссчасаз іо сстачсусасес асассазус зассуваєся зестгасссау чесусачесвоа зссачосеве 21729 чессвазасу зазасчссса чезвучссас десУссезса васссасссу абчаасзача тв засос сузксуссст сСечовачаве аскудессяє дпессчосбує песЕсдсаая зіва кщчексстасе чес кзУусас сабавкчессо зсссуєсвас апдаавочдсасє бствачепає 21805 «тассєосзава засаксссад ссвбасчасея пссвсудасу спасоссясся гЕсацсосаву зівво всчзчасстучс савссассЯч сассдчасавно аадсуєчвасе єкачсечсса васодесаеф ава2о ччазсессс асасзассає счассседасс седекческе садесдссяе засо айва всусуцасас вуцаассяєс заксеабоасу звсайббсбаєс дазачссксУ чФайвоссаває 22140
Ссвувабєаєа абсссеуаєу ссбоссЕсас чесаєсоабас зазоасувікУу базсачаїко аа2ай
Басаччавис Усабсчасса зувасуєсвч севацучосуч чиссчсссеч аадсуссаєх заява зчзастуасав з«абсасоссуєс зчзссавесчсес чадсасусчас усечсесаво базааасада лизай ччуассзааса звсазєесак сезааєсууєЄ часаєсаавач седозасчяУ бЕвВЕсвасча 22380 «еессавасс задссссвляс чаавсававає сазассЧчасє бБасавасесаЯ восваврчеце -х440 чеЕчдсуцеска засзасчава СечЯксескссе ачабсасссс сабуд каса савсасссся ка5Ой сачтассасс чдеассвасс седссаччча аствчаскччс аааччакасое седсаєчасс лава
ЧокессскЗд сезедасаза счасктеуєє зссассскчя чеасосадаа ФЧечазазує 22620 сабассудач азаскссксс сучсасчаца чесбоєкста гссасзасячо асессаскує явево сапччаасача ссзчассаєкт сасааччсча авесодесаа сасасчсчве абсазчусавсї 22749 ресетсЧаво часчаїссва сечЧесдссва сСстчзвечеч соддсадесує ададсауабоє 22800 часессавчеч сзассвдсзч сазазвсасо састсаоста завассаєка дечавцьевеу ней счвесздасу засчссссКс асесвасчас аспазвсабсся абасссятсає сасвУучече ав чесассссач ссаасассаа вустчсусву Явассавача Єсассдчаєсча сссачасУгу екзо сксеасчаучсс бчачасчасч сусчтсацчаста секс сваза ассаєсбасса зазсЧасс 2340 сіссочоваза дессаєсаєс ссбасасся Бсесцссзчав ачасчучсва чсавсаєтає 2310 часссгсчеЗ сссасасаєв сасбузаєча сгазсзууусс васочасссча адвкосакеся 23150 чазчассчєс зсесьтатес сссекіссув чЕсеЗзачосВ чессскадає чачасчасве х3220 звассдчзсссу асустасаат десвадчауза зузвессЯсоє вассозаєьт соседеєсав зво чЧечказчссь асезчаачесї тдесодчсаєша сусссасусс азазчаатає сссбасавяєа Ка 34о даасаїксту сасаєсстава бесЕкузчсЯс зчасаєсчає басчочасса заасссвеза 23450 сачеЕсседсь сдозЧассає сСессузесача засзосазац сбодзаскуасЯя ссавасчаєсве 23450 чавесоссво соубесусача сауусасоуч абсоссусвоач абечесцсва всчассксая 23590 сссдессдаа засчаєсосс Єсасчсачса счдчоасчусас сссассаФос відаєссощет а235ай чеічечассас чассасачча Єсасчсчасаяа сочассчсаає ассЯодватя чочасаєсдо 3Бад ччассачуце сессуссааа ссдачавача сзссуцеооє акчсчссата бечовавсе 23700 ссасвесссс чдасяачсває ссЯссчаєза асудучессс чдссусяаса часа 235 стсасзчасьу сасссацсся озкусссве счузсасовсв збузсаавчу Чеаксччечеа 2320 зазчсчсоче акасасчосяа Сссачсавса сочсучесасас чУсщасаєсу січаседчаве ЗВО суссасачес ссаесусасс кодазасуса зоссотедаєс сакдсесаасс зЕчесчсацє 33840 ссосеасУЧ сасуєсаєсясє асессаєсоч асассєссова усечассасс аусссассає 24009 ччссусеекс сассзууєсаа Суусасасує сдвасуєсуєя саксвссусе ачабузесує 24960 сетсуссат сецесоусцу сопесеасооб ксасацевах дсвааєсуєся сесаскдааа 24320 засусаєдчсс єЗавассуве асубкчеудуе азестЕесезу чЕсузаассяа сесздтаєсвуц 2аБнО ччсЕчЧЕсасу соучачечесоЯ зсбЯсдачає єсуссясьЯЄ саоуссесЯ саесссесасЯ 24340 чакччассяє ссазуасччє чсассусєчав сууєававос Заазадесоя асаєсчечує 24300 вучачасувсе асусачасся сУсачсечеас чечеассеасе всзчаСЕЕсь ббсачесвУє аж сесассачес чесЕсвакеу сеччавссає сзаччвечсс бчсвессссу ассасавувє 24429 сабссасчсс чабдчесаєоч ассячечсач счаавсазчс асбссауваєе ссоєксссаає 24480 кчесоачсає чсчучсссчес бсавсусууЯ садесвучає сучсевасся сечдсасаса 24540 вчцусдсосу сачевсаудес сессссусаа дакодавасує сактчессясск стсаассуса 24600 с«чЧеччавасчс сакссачачу ссачдсаустаа вссусавасУує дсосдсвосуса сшсвечасуу аавео сааскческсо Есссачазчез сазасчкеЯ сасабасЗсс ЧдассЕсУуєсяЯ сесзадеозсва. 247 сакссюусус садсузаває чссЯкстсос сзуасавдесс сасчсвучає чесФдесесвда. 24780 асгссазчЯсЕ сдсдаассса сссассксуг асацчаєкаєсу сасассесдча сусадаєсає 2авао чдсацезасеє сассвсучьЯ са ес сзусесясав ассассаєсь сосуаасчеса 25990 чзссуссаєує сзкобусаче вудссасасс зсусассаач сасачсчазч саавчечосу заз сечсесасас счавачєсчсяа асуасадачу дстедсссак дскссуєрссь суєсасссає 25080 чсасуєесся суззадсзвзає счусаччавеЕ Ффоссайувса сссучсвасес яадабазадач з5ОоВОо сесоссассу сзадсасуче адддесаєссої сассаассоа асссдуєссау засоєсаєта 25149 чеЕсЯдсассза саакстчеся сессбсесоас судубсачесод ссзказччсевасе автессссад еБяпо счсзбссчасу аачессудаче зчавссссогя вЕЗЕксчсЯ затччсцдааа совесачесс авакО ачаїсчссоасс асуасчасуч сассччсадс десдсассссс часссаєссо ЄтесчсссаЯ 25Заай асцсечсЯсс чезоассЕсЧЧ зачсацчусач чдсесусчачас чбчссзачеч сабсчасасе гБЗАНО
«сЕсвачесся сссазсваячс взасссзУчаб ссосчесчсс Фокса косе ваваКе 25449 тб5ссчацаєа аазачасса Сусаведчеїе усуабазаєч сзсбессаЕса судсзссоує 25500 зацестсаде аєсаусасад астссадсас скдоссякес сесадачав: суясакассе 25550 счааквучеія чзваассесакх саквочааєс зУсчасесяя сесбсочасс асчасоче 2588 їтссасаааче сбазоечбрас савбсачисас ссобссЕЕс СЄчочассява бочачеоочу «5ева тессвссаче Брбассчасов асузчабаєсс Сбсосцдссвяє СосессччсЯ боссзадчечас 25'4В зсдаскачеЕс ссоздчсева ссазакосуєс ссусудексс сасассасчу сстаусуєсає 25800 чачавуєкач чсаесссоси сСсасучсако узацчсесаа суабсосещчс счачеоссесе 5840 сссчасччЕкс сек оссу счавчавсес абсесабчіс сбчФучаеЕ савецесаче 259 чЕЕсгодазя соч чсчї СЯдааавазаа сасасачесу собу чача соузаацуне 58 сеічнядсвсс сеосесасач васесуєсьсс сауасссуєс сседеесаве усузавовЕс з5040 зачину си ацссчасося чассадсава зсобксасса Ссссбадаза асаусазсає еБІОО чсасзуссач сесасссцая сузкаєсаде сессоФдесес сесдесвее зеувеачесад 28150 кЕЕссссзЯа Баєссабеаз вуссоцбаза ЄбсасевЕбу ассябавочс сУусаєвесе ивайо вссасвачеч ясаассчсст сссозвчУєуЧс часаєзвсуч ссстецдосас сссассвеза 25280 сасасоасаце Єссусчасаєс ссассзчсазю сдсашесасс збудесачає аччсацсес За ччссачцсавс чдссассяєре ссуссатссеє себсасессс аббцєсесесс сссссовсча 254 вазайсачеас асчсссцЕсе сессссссаса чсдвчасасе зсечесаксу чдссобаведуа 264 азасакасво собстсудає сесдчесеса чссусазавс десуксасяс ссазясассе 26520 зузваксссцас сусксесасо авастезеда чсвеескассс чЧессадакся зсабчсвУве 2550 адесебсуєч сессасчаах бсаЧчесУуєсеЯ безусскаце азазусчавт ксуасессаже 28540 вес Бе «вій» 36 «ії» 37 «йіяхз ДНК «5і3з Штучна послідзвність «820» чевів Праймевр НІ-Я Во «00 6 вЕсєтаєссть соссеесЯсє сессвас 27 «Вій» 87 «Вії» Я «від» ДНК «2і13з Штучна послідовніств Й «20»
«223» Праймер бесй й «00 87 сідсгтоцає дессззвудса бБадас 25 «Щ30з В «й» 4 «1» НДНК «13: Штучна посльдовність сих «аа» Праймер Мік бсезеп 1 У «ом я сакссавчса чозачечеч сасч 24 «ій» 29 «2їїз Б «212» ДНК «213» Штучнз послідовність «йо «вай праймер Мік Ястеєп 4 3! «00» 8 чЕскабячсесе содосвесса зусад зе «вій» 30 «Ва 4 «Хійз ДНК «ВіЗ» Штучна послідовність «их «283» Пранмер Мік Зстевип 5 8 «00 39 чачассясва чсчасаачех чесе 24 «й» 31 «ВАВ са «ВІ» ДНК «ії» Штучна послідовність «ах «паї» праймер міх ЯсЕФВеп 8 3 «4005 З
Ксесвеєкач дадссдвсто саве 24 «10» 3 «хіїзх 24 «Війх ВЕК «щіїз ШТУЧНО ПОсПіАДОВНА СТЕ І кидай» . к«еЗз Пранмеюв Мік «400 38 сусзвусавс асоуссвавс бсаФф 24
«дій» 33 «Мі» й ка1їй» НЕ «віїх Штучна послідовність «ий» «Ей» Праймеюр МІЖ М З «4005 33 часасчсача асвасчечав ясцчя 34 «1» 34 «сії аж «вій» ДНК «і3з ЦЦтухна послідовні стів кий сеЕкйз Пезимер БЕВІ»І 5" «Я» ОЗ чсасассчаа зЕЧосєоеса бада 24 «йійх 35 «йії» 5 «ей» 0 ДиК «вії» Щбтучна послідовність «ие «Кей» Праймер пі1їА5 Божі хай 38
Чессчечсас цасаєсаакс ссдай 25

Claims (37)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб трансформації рослини, який включає контактування клітини рослини зі штамом Адгорасіелит, що має недостатність функції НКесА, який містить щонайменменше одну допоміжну плазміду ртТі, яка включає фрагмент 14,8 Крпі з рзВІ, і плазміду рті, яка містить щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК, причому ділянка Т-ДНК включає щонайменше праву границю Т-ДНК і екзогенну ДНК, яка прилягає до границі, де плазміди містять точки початку реплікації, які відрізняються між собою.
2. Спосіб за п. 1, де фрагмент 14,8 Крпі мігВСОс, виділений з рЗзВІ, у штамах Адгтобасіепит має недостатність функції КесаА.
3. Спосіб трансформації рослини, який включає контактування клітини рослини з бактерією роду Адгорасіепит, що має недостатність функції КесА, яка містить фрагмент 14,8 Крп! мМігВСОоО з рЗВІ і плазміду рті, яка містить щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК, причому ділянка Т-ДНК включає щонайменше праву границю Т-ДНК та екзогенну ДНК, яка прилягає до границі, де фрагмент 14,8 Крпі мігВСОс інтегрований у нейтральний сайт інтеграції хромосоми бактерії.
4. Спосіб трансформації рослини за будь-яким з пп. 1-2, де бактерія додатково включає плазміду, яка містить ділянку Т-ДНК, яка прилягає щонайменше до однієї границі Т-ДНК Адгорасіепит, причому плазміда містить точку початку реплікації групи несумісності ІпеР.
5. Спосіб трансформації рослини за п. 3, де бактерія додатково включає плазміду, яка містить ділянку Т-ДНК, яка прилягає щонайменше до однієї границі Т-ДНК Адгобасіепит.
6. Спосіб трансформації рослини за будь-яким з пп. 4-5, де ділянка Т-ДНК містить послідовності трьох або більше генів.
7. Спосіб трансформації рослини за будь-яким з пп. 4-6, де ділянка Т-ДНК містить 25000 або більше пар нуклеотидних основ.
8. Спосіб трансформації рослини за будь-яким з пп. 4-7, де ділянку Т-ДНК вставляють в єдине місце локалізації в рослинній клітині при трансформації рослини.
9. Спосіб трансформації рослини за будь-яким з пп. 4-8, де ділянка Т-ДНК містить послідовність більше одного гена, і послідовності генів мають гомологію послідовності, яка дорівнює або перевищує 60 95.
10. Спосіб трансформації рослнини за будь-яким з пп. 4-9, де ділянка Т- ДНК кодує один або більше інсектицидних білків, гербіцидних білків або поєднання інсектицидних білків і білків стійкості до гербіцидів.
11. Спосіб трансформації рослини за будь-яким з пп. 4-10, де ділянка Т-ДНК кодує інсектицидний білок СгуїСа, інсектицидний білок СтутїЕ і інсектицидний білок СтгуТтАб1.
12. Спосіб трансформації рослини за будь-яким з пп. 4-11, де ділянка Т-ДНК кодує інсектицидний білок Сгу1Са, інсектицидний білок СтуїР, інсектицидний білок СтуТАбБІ1 і білок стійкості до гербіцидів ААБ-Ї.
13. Спосіб за будь-яким з пп. 1-12, де рослина є однодольною.
14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, де фрагмент 14,8 Крпі МІ ВСОсС клонований у сайт Крпі плазміди рОАВО291.
15. Спосіб за будь-яким з пп. 1-14, де допоміжна плазміда рті являє собою плазміду РМРОО.
16. Спосіб за будь-яким з пп. 1-15, де допоміжна плазміда рті являє собою плазміду ртісьвд.
17. Спосіб за п. 16, який додатково включає трансформацію штаму Адгобасіелпит за допомогою ДНК плазміди ррАВе292.
18. Спосіб за будь-яким з пп. 1-17, який додатково включає стадію відбору трансформованої клітини або трансформованої тканини після того, як зазначена культивована тканина була піддана трансформації.
19. Штам Адгтобасіепит, що має недостатність функції КесА, який містить щонайменше одну допоміжну плазміду рті, яка включає фрагмент 14,8 Крпі! з рзВІ, і плазміду рті, яка містить щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК, причому ділянка Т-ДНК включає щонайменше праву границю Т-ДНК і екзогенну ДНК, яка прилягає до границі, де плазміди містять точки Зо початку реплікації, які відрізняються між собою.
20. Штам Адгобасіегпіитє за п. 19, де бактерія додатково включає плазміду, яка містить ділянку Т- ДНК, яка прилягає щонайменше до однієї границі Т-ДНК Адгобасіепит.
21. Штам Адгобасіепит за п. 20, де ділянка Т-ДНК містить послідовності трьох або більше генів.
22. Штам Адгобасіелит за будь-яким з пп. 20-21, де ділянка Т-ДНК містить 25000 або більше нуклеотидів.
23. Штам Адгобасіепит за будь-яким з пп. 20-22, де ділянка Т-ДНК включає послідовності більше ніж одного гена, і послідовності генів мають гомологію послідовності, яка перевищує 60
Чо.
24. Штам Адгтобасіегішт за будь-яким з пп. 20-23, де ділянка Т-ДНК кодує один або більше інсектицидних білків, гербіцидних білків або поєднання інсектицидних білків і білків стійкості до гербіцидів.
25. Штам Адгобасіегіит за будь-яким з пп. 20-24, де ділянка Т-ДНК кодує інсектицидний білок СгуїСа, інсектицидний білок СтгуїЕ і інсектицидний білок СгутАбБ1.
26. Штам Адгобасіегіит за будь-яким з пп. 20-25, де ділянка Т-ДНК кодує інсектицидний білок СтуїСа, інсектицидний білок СтуїЕ, інсектицидний білок СгуТАБ! і білок стійкості до гербіцидів ААБ-1.
27. Геномний локус піїА Адгобасіепит тег?асіепв, де геномний лоукс піїА з послідовністю БЕС ІО МО:18 має інтегровану полінуклеотидну послідовність.
28. Геномний локус піїйА за п. 27, де полінуклеотидна послідовність включає ген міг.
29. Штам Адгобасіепит, що має недостатність функції КесА, із фрагментом 14,8 Крпі! МігВСОО з рЗВІ, інтегрованим у нейтральний сайт інтеграції на хромосомі Адгобасіепит.
30. Штам Адгобасіепит за п. 29, де нейтральний сайт інтеграції являє собою геномний локус піА з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:18.
31. Штам Адгобасіепит за будь-яким з пп. 29-30, де штам Адгобасіелит являє собою Адгобасіепит (тегасіепв.
32. Штам І 84404 Адгобасіепит, що має недостатність функції КесА, який включає фрагмент 14,8 Крпі міо з рзвВІ на допоміжній плазміді рті і плазміду рті, яка містить щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК і екзогенну ДНК, яка прилягає щонайменше до однієї границі Т- ДНК Аагобасіепит, де плазміди містять точки початку реплікації, які відрізняються між собою. 60
33. Рослина, одержана способом за будь-яким з пп. 1-18.
34. Рослина за п. 33, де будь-які генетичні ознаки, введені в рослину шляхом трансформації, стабільно відтворюються в потомках рослини.
35. Штам І 84404 Адгобасіепит, який включає щонайменше один ген міг із фрагмента 14,8 Крпі мМігВСро, що має недостатність функції КесА, виділеного з реевВІ, інтегрованого в нейтральний сайт інтеграції на хромосомі Адгобасіел ит.
36. Здатна до розмноження трансгенна зернова рослина, одержана способом за п. 13, або її потомство, яка експресує інсектицидні кількості білка СгуїСа, інсектицидного білка СгуїЕ, інсектицидного білка СтутТАБбІ і стійкі до гербіцидів кількості білка ААО-1, де рослина містить праву границю Т-ДНК та екзогенну ДНК, що прилягає до границі, і де білки СгуїСа, СгуїЕ, СгулАБіІ ії ААО-1 спільно експресуються з єдиного локусу рекомбінантної ДНК, стабільно включеної в геном рослини.
37. Здатна до розмноження трансгенна зернова рослина за п. 36, де єдиний локус рекомбінантної ДНК по суті вільний від послідовностей основи вектора з ДНК плазміди рті.
час Й ся Засі фот КВН : е о р сташія Є . - ча їжу і Кап Кочрізкнанаия бив КЕ, не ці С дев Неруйняка в Свт еаНІКА З це Моно ! али і, Ярніеьнни проАвомо ва ї й ДОоеекзвовсововооаюсососсовеееененфь | талан.
М вда ; АЖ денс ' Р ; ри тав Стдіж? х енрізунаней РУКЕ М СМбрізаіанн кіняекня Є ке мив діування З м сверов вверон слі мужа кінь Хьет рі і ший Краї і ге | і ' пк КВН чи ща уОМОНО НИК и н й м ВИ Є Фрагивнт мя Краї УКОСЮЕ: кі рев ; ТАБ в.
Знікнвуннзмя з х ВВАВІ2ОЇ й ч ; «и чан. фрагментом Кри к Стадія З зженнянн ре ання : о ; Лігування | Вирізвння Крпї нс Ус що РА кра мідна ША ой с ДН о МЕЖ точка початку реплікації Н подат ЗТ дз с С ВЕ точка ккаьку. реп се бресн Чу, "Занз ше т.
Копії Олігонуклестид для стадії У КТ АСССОСТАСССО ОВ КОСТА СТАВИ КАСА ОСЛО ССС АВС ТО ВА СОПОБСЯЛМ ОА ССАВТАСТАСЛОДТТОСАДЯ СТАЄ ОСТ ССО МО ОАЖЕСТО СТОССССТСОАТОСАВОТ ТАС САСТОО ТТ ОТ АТО СТВО ТО ААССАТОТАСАСОЮ СМУМОСАССТАССТЕСССВАТОУ МАО САКАЛОСО ВОСТІ АС ЗАССОСАСНАВСТТСОУАСКТИТОСС СТОСАССАТСТОЮТОТ ТАС ТАССТТОССТОВОАВАССОСОСТТ СКОТТА САТО АТО СТООСАЕ ЗАСТОСО САССААТУ ТА ККАСОВИАЄТ ЕКО СОВААЛСМ КАС ТАСТАЦМСЯ КА ТОСТСООСОЛСОВОТ СОТ ТОСАТС ККУ ТАС ОК ЕСАТТОВАСАОСАВСТСАВССАСАЄНСХ АООКОССОЕСВ КОС АСАААССТАВААССАСТЯАНОСОСТАОЕААСТТЗЕСЯТ КОД ТОВТО ня Фіг
МІЗЕ праймер (-203 Ра! 10 /МІЗЕ праймер (-40) НА 4 у локує ду роОУУЗ719 і--Капв 5315 п.н. Ватні оче і НІЙ От, МІЗК праймер" ьч й І | їеоВ сої точка початку реплікації
Фиг. 2 по локус Зниня сторова ло м ода ОД крові Фо ми лькус жео й вай КЛОНУВНННЯ з й Ї етни хЯ У РОАВУВТВ т і зва тивап.м, ха передня сторони ка. ай у «й Шик БОже х 73» 1 рий ї МА ЗА прабв точка печатку реплікації сок) ре 5 Сталік 1 ів) Розрічування ВІЗА ВОВІВ а Її плює раї в Ліунання з фрагментом БОАВОО? ВАНОЇ І плює Ка г. (ві Лігу фра р я Кри фіг. ЦЗ вив КВЧ т злиття заднясторона ойй Ї кате ТОРО сойт КЛоНУВЗННХ ЩО со веввоц оленя Ше Вас, ка щ-к щи ий ; чочка початку резлікаці с. є. Б шт щ рРОдВОВІї |. свя жі й ши ВІТ пн, Б Со евенй в Торо сайт клонування . перелич сторона ння й У дна оперен: Стедня 2 и ссссссавй Рая мс бен є « ай кт точка почате рейнікнції соді ТР брвйнор "Ж Зпрй Зно я Твена ру нафіен тоРО сій клонування зва 7 аб 000 задня сторона вія передня сторсна ся Зк а шщин, Трек Кра! р свй пн. їх х ВА оперою а й ж м ек с он Й фіг. З вчанк тив чек. р РВНК процотор Границя А ДНК / 4 щоенит суть Границя АТДНК Ху , Гранняих А ДНК Я... .ЯХтрег5 7 з , РОАВТО1513 дії , промотор ) і зчілк оч й й став ОЧНУ ктреїв йтцуьмо тек провотор вро пани ВТК СВУ, Гракнця А Т-ДНК й | стутса Грання А ТДНК, ХМ Її - Граняня А ТДНК ее м. Влріпі бите я роАВ101514 й гай ці доб па тив ШИ, Г, премотор Ітвогв-7 КМ стутЕ ик і, НН сгутТАБії т бе хтарег ттцьй З Те промотор
Фіг. 4
Гравнця В 'Т-ДНК стан; УК В ик що ФтМШБИ промотор м2 Їх «р гпрегі У о ррАВ101556 | ут 13052 п.Н. м "ТдтШви промотор Границя -д ТАДНК Р ефь Я нин Границя А Т-ДНК | Ух ще Границя АТДНК др ут
Чне. 5
UAA201302506A 2010-07-29 2011-07-29 Штам agrobacterium, модифікований для збільшення частоти трансформації рослин UA112968C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36896510P 2010-07-29 2010-07-29
PCT/US2011/046028 WO2012016222A2 (en) 2010-07-29 2011-07-29 Strains of agrobacterium modified to increase plant transformation frequency

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA112968C2 true UA112968C2 (uk) 2016-11-25

Family

ID=45530762

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201302506A UA112968C2 (uk) 2010-07-29 2011-07-29 Штам agrobacterium, модифікований для збільшення частоти трансформації рослин

Country Status (17)

Country Link
US (2) US9617551B2 (uk)
EP (2) EP2597943B1 (uk)
JP (2) JP6530887B2 (uk)
KR (1) KR20130132405A (uk)
CN (1) CN103269577B (uk)
AU (2) AU2011283689B2 (uk)
BR (1) BR112013002189A2 (uk)
CA (1) CA2805263A1 (uk)
CL (1) CL2013000270A1 (uk)
CO (1) CO6650390A2 (uk)
MX (1) MX346072B (uk)
NZ (1) NZ605584A (uk)
PH (2) PH12013500186A1 (uk)
RU (1) RU2611188C2 (uk)
UA (1) UA112968C2 (uk)
WO (1) WO2012016222A2 (uk)
ZA (1) ZA201300330B (uk)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY34014A (es) 2011-04-15 2012-11-30 Dow Agrosciences Llc Genes sintéticos para expresar proteínas en células de maíz, construcciones, plantas transgénicas, métodos para controlar pestes y composiciones
CA3116898C (en) 2012-08-17 2022-09-27 Dow Agrosciences Llc Use of a maize untranslated region for transgene expression in plants
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
CN102972243B (zh) * 2012-12-11 2017-05-17 北京大北农科技集团股份有限公司 控制害虫的方法
RU2016116914A (ru) 2013-10-04 2017-11-13 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Регуляторные элементы гена металлотионеин-подобного белка из zea mays и их применение
BR102014025574A2 (pt) 2013-10-15 2015-09-29 Dow Agrosciences Llc elementos regulatórios de zea mays e usos dos mesmos
BR102014025499A2 (pt) 2013-10-15 2015-09-29 Dow Agrosciences Llc elementos regulatórios de zea mays e uso dos mesmos
CN103719137B (zh) * 2013-11-15 2015-05-13 北京大北农科技集团股份有限公司 控制害虫的方法
BR102014029437A2 (pt) 2013-11-26 2015-07-07 Dow Agrosciences Llc Produção de ácidos graxos ômega-3 polinsaturados de cadeia longa em culturas oleaginosas por uma pufa sintase de traustoquitrídio
CN106028838A (zh) 2013-12-20 2016-10-12 美国陶氏益农公司 赋予鞘翅目害虫抗性的rnapii-140核酸分子
BR102014031844A2 (pt) 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
US10683513B2 (en) 2013-12-31 2020-06-16 Dow Agrosciences Llc Tissue-specific expression and hybrid plant production
AR099800A1 (es) 2014-03-21 2016-08-17 Agrigenetics Inc Cry1d para controlar el gusano de la mazorca del maíz
CA2947756A1 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Dow Agrosciences Llc Dre4 nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
BR102015021321A2 (pt) * 2014-09-04 2016-09-20 Dow Agrosciences Llc métodos e composições para a recombinação de cepas deficientes de gene de agrobacterium tumefaciens
US20160194658A1 (en) 2014-12-22 2016-07-07 Dow Agrosciences Llc Nucampholin nucleic acid molecules to control coleopteran insect pests
US20160264991A1 (en) 2015-03-13 2016-09-15 Dow Agrosciences Llc Rna polymerase i1 nucleic acid molecules to control insect pests
BR112017021703B1 (pt) 2015-04-15 2023-11-28 Corteva Agriscience Llc Promotor de planta para expressão de transgene
JP2018511333A (ja) 2015-04-15 2018-04-26 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 導入遺伝子発現のための植物プロモータ
BR102016012010A2 (pt) 2015-05-29 2020-03-24 Dow Agrosciences Llc Molécula de ácido nucleico, de ácido ribonucleico (rna) e de ácido ribonucleico de filamento duplo (dsrna), usos de célula, planta e semente, produto primário, bem como métodos para controlar uma população de pragas coleópteras e/ou hemípteras, para melhorar o rendimento de uma cultura, e para produzir uma célula vegetal transgênica e uma planta transgênica
EP3341483B1 (en) 2015-08-28 2019-12-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ochrobactrum-mediated transformation of plants
TW201718862A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 Dow Agrosciences Llc 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
TW201718861A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 道禮責任有限公司 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
US10370671B2 (en) 2015-10-20 2019-08-06 Bahar Zare Binary vectors with minimized biosafety concerns and high transformation rates by engineered plant-derived transfer-DNA
EP3371313B1 (en) * 2015-11-06 2020-10-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions of improved plant transformation
EP3342780A1 (en) 2016-12-30 2018-07-04 Dow AgroSciences LLC Pre-mrna processing factor 8 (prp8) nucleic acid molecules to control insect pests

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
EP0320500B1 (en) 1983-01-13 2004-11-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Non-oncogenic ti plasmid vector system and recombinant DNA molecules for the introduction of expressible genes into plant cell genomes
WO1984002919A1 (en) 1983-01-17 1984-08-02 Monsanto Co Plasmids for transforming plant cells
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
NL8401048A (nl) 1984-04-03 1985-11-01 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van eenzaadlobbige planten.
US5231019A (en) 1984-05-11 1993-07-27 Ciba-Geigy Corporation Transformation of hereditary material of plants
NL8401780A (nl) 1984-06-04 1986-01-02 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten.
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
AU7360087A (en) 1986-04-30 1987-11-24 Boyce Thompson Institute For Plant Research Inc. Electric field mediated dna transformation of plant cells and organelles
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
EP0267159A3 (de) 1986-11-07 1990-05-02 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
CN87100603A (zh) 1987-01-21 1988-08-10 昂科公司 抗黑素瘤疫苗
ES2121803T3 (es) 1987-05-20 1998-12-16 Novartis Ag Plantas de zea mays y plantas transgenicas de zea mays generadas a partir de protoplastos o celulas derivadas de protoplastos.
ES2060765T3 (es) 1988-05-17 1994-12-01 Lubrizol Genetics Inc Sistema promotor de ubiquitina en plantas.
US6855873B1 (en) 1989-05-31 2005-02-15 Bayer Bioscience, N.V. Recombinant plant expressing non-competitively binding Bt insecticidal cryatal proteins
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5188960A (en) 1989-06-27 1993-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US5141131A (en) 1989-06-30 1992-08-25 Dowelanco Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter
EP0558676B1 (en) 1990-11-23 2000-04-19 Plant Genetic Systems, N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
US5679558A (en) 1992-04-15 1997-10-21 Plant Genetic Systems, N.V. Transformation of monocot cells
WO1994000977A1 (en) 1992-07-07 1994-01-20 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
ATE209685T1 (de) 1993-02-03 2001-12-15 Monsanto Technology Llc Gegen plrv-infektion resistente pflanzen
US5469976A (en) 1993-04-30 1995-11-28 Burchell; James R. Shelf allocation and management system
EP0627752B1 (en) 1993-06-04 1997-07-23 CAVIS S.r.l. An inertia device for interrupting the electrical circuit of a vehicle with an internal combustion engine
DE69433809T2 (de) 1993-09-03 2005-06-16 Japan Tobacco Inc. Verfahren zur transformation von monocotyledonen mittels des schildes von unreifen embryonen
US5731179A (en) * 1993-12-08 1998-03-24 Japan Tobacco Inc. Method for introducing two T-DNAS into plants and vectors therefor
RU2149187C1 (ru) * 1994-11-09 2000-05-20 Ниппон Пейпер Индастриз Ко., Лтд. Вектор для введения желаемого гена в растение (варианты), способ получения трансгенного растения и способ введения, по крайней мере, двух желаемых генов в растение
US5733744A (en) 1995-01-13 1998-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Binary BAC vector
ATE443437T1 (de) 1995-10-13 2009-10-15 Dow Agrosciences Llc Modifiziertes bacillus thuringiensis gen zur kontrolle von lepidoptera in pflanzen
JP3350753B2 (ja) 1996-09-26 2002-11-25 科学技術振興事業団 新規大容量バイナリーシャトルベクター
US6713063B1 (en) * 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
US6369298B1 (en) * 1997-04-30 2002-04-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Agrobacterium mediated transformation of sorghum
MX257801B (en) * 1997-06-02 2008-06-10 Syngenta Participations Ag Plant transformation methods
CA2293738A1 (en) 1997-06-12 1998-12-17 Dow Agrosciences Llc Regulatory sequences for transgenic plants
CN1188525C (zh) 1997-08-25 2005-02-09 纽海姆·泽登有限公司 改良的农杆菌介导的植物转化
US7057090B1 (en) * 1998-07-17 2006-06-06 Rutgers, The State University Of New Jersey Agrobacterium-mediated transformation of turfgrass
AU764100B2 (en) * 1998-10-01 2003-08-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method of plant transformation
US7393946B1 (en) * 1999-02-05 2008-07-01 Rijksuniversiteit Leiden Method of modulating metabolite biosynthesis in recombinant cells
US20020123100A1 (en) 2000-10-19 2002-09-05 Hanson Maureen R. Binary BAC vector and uses thereof
AU2003256373A1 (en) 2002-06-27 2004-01-19 Dow Agrosciences Llc Use of regulatory sequences in transgenic plants
EP2100958A1 (en) 2002-11-12 2009-09-16 Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo 'Evrogen' Fluorescent proteins and chromoproteins from non-aequorea hydrozoa species and methods for using same
WO2004056967A2 (en) 2002-12-18 2004-07-08 Agrinomics Llc Generation of plants with altered oil content
MXPA05002541A (es) 2004-03-05 2006-04-27 Agrigenetics Inc Combinaciones de cry1fa como una herramienta para el control de la resistencia de los insectos.
PL2308977T5 (pl) * 2004-04-30 2017-10-31 Dow Agrosciences Llc Nowy gen odporności na herbicydy
ES2612119T3 (es) 2005-10-28 2017-05-12 Dow Agrosciences Llc Nuevos genes de resistencia a herbicidas
AU2006326940B2 (en) * 2005-12-22 2012-04-19 Vib Vzw Means and methods for mediating protein interference
WO2008001414A1 (fr) 2006-06-23 2008-01-03 Japan Tobacco Inc. Vecteur cosmide destiné à transformer une plante et son procédé d'utilisation
US20090075358A1 (en) * 2007-03-29 2009-03-19 Cambia Vectors for transformation of plant cells
CN102812034B (zh) * 2010-01-22 2016-08-03 陶氏益农公司 靶向基因组改造

Also Published As

Publication number Publication date
NZ605584A (en) 2014-12-24
RU2611188C2 (ru) 2017-02-21
WO2012016222A2 (en) 2012-02-02
WO2012016222A3 (en) 2012-06-21
JP2018027084A (ja) 2018-02-22
CO6650390A2 (es) 2013-04-15
CL2013000270A1 (es) 2014-03-07
US20170183673A1 (en) 2017-06-29
MX346072B (es) 2016-10-06
RU2013108769A (ru) 2014-09-10
ZA201300330B (en) 2014-03-26
US20150267213A1 (en) 2015-09-24
JP2013537412A (ja) 2013-10-03
AU2011283689A1 (en) 2013-01-31
JP6530887B2 (ja) 2019-06-12
BR112013002189A2 (pt) 2016-05-31
US9617551B2 (en) 2017-04-11
EP2597943A2 (en) 2013-06-05
CA2805263A1 (en) 2012-02-02
CN103269577B (zh) 2017-12-26
AU2016225872B2 (en) 2017-12-14
MX2013001191A (es) 2013-06-28
PH12017501078A1 (en) 2018-09-24
EP2597943B1 (en) 2018-02-07
KR20130132405A (ko) 2013-12-04
AU2011283689B2 (en) 2016-06-09
CN103269577A (zh) 2013-08-28
EP3066915A1 (en) 2016-09-14
AU2016225872A1 (en) 2016-09-29
PH12013500186A1 (en) 2023-04-28
EP2597943A4 (en) 2014-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA112968C2 (uk) Штам agrobacterium, модифікований для збільшення частоти трансформації рослин
Bordas et al. Transfer of the yeast salt tolerance gene HAL1 to Cucumis melo L. cultivars and in vitro evaluation of salt tolerance
JPH11262394A (ja) グルタミン合成酵素阻害剤に対する耐性を有する遺伝子操作により得られた植物細胞及び植物、前記細胞及び植物を産生するために使用するｄｎａフラグメント及び組換え体
Franklin et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of eggplant (Solanum melongena L.) using root explants
EP4012028A1 (en) Nucleic acid sequence for detecting soybean plant dbn8002 and detection method therefor
CN110066824B (zh) 一套用于水稻的碱基编辑人工系统
CN104878096A (zh) 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9868的核酸序列及其检测方法
US20190017067A1 (en) Glyphosate tolerant plants having modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene regulation
CN112430684B (zh) 一种用于检测水稻植物h23的核酸序列及其检测方法
CN106119245B (zh) 用于检测除草剂耐受性大豆植物dbn9001的核酸序列及其检测方法
US20210261975A1 (en) Dna construct to be used in genome editing of plant
KR102265780B1 (ko) 식물체의 개화기 조절 efg1 유전자 및 이의 용도
US11932861B2 (en) Virus-based replicon for plant genome editing without inserting replicon into plant genome and uses thereof
JP4228072B2 (ja) アビジンをコードする人工合成遺伝子
CN116064509B (zh) 一种植物组成型启动子CEPro432及其应用
US9796981B2 (en) Methods for transforming tarwi and for producing molecular farming products in transgenic tarwi seed
JP2003000082A (ja) 選択マーカーを含まない組換え植物の作出方法、ならびに該方法により作出される組換え植物
KR101825959B1 (ko) 식물 종자의 배 특이적 ＯｓＰＰ２Ｃ５１ 프로모터 및 이의 용도
CN117866958A (zh) 一种OsRUBQ2pro启动子及其应用
CN104878090A (zh) 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9877的核酸序列及其检测方法
KR101272473B1 (ko) 형질전환 억새 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체
CN118374517A (zh) Dna分子、生物材料以及获得抗草甘膦转基因植物的方法
CN114667345A (zh) 用于检测转基因事件的多核苷酸、引物和方法，遗传构建体，用于检测来自植物样品的材料的试剂盒，事件ctc91087-6，抗虫甘蔗植物，以及用于产生抗虫甘蔗植物、植物细胞、植物部分或种子的方法
TAGHIPOUR et al. Bromoxynil resistant tobacco (Nicotiana tabacum L.) generation using a synthetic bxn gene