JP6424890B2 - 表面プラズモン増強蛍光測定方法、表面プラズモン増強蛍光測定装置および分析チップ - Google Patents

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）を利用して試料液中に含まれる被検出物質を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法および表面プラズモン増強蛍光測定装置、ならびに試料液中に含まれる被検出物質の検出に使用される分析チップに関する。

タンパク質やＤＮＡなどの生体物質を検出する測定において、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できれば、即時に患者の状態を把握し治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質に起因する微弱な光を、高感度かつ定量的に検出する分析方法および分析装置が求められている。被検出物質を高感度で検出する１つの方法としては、表面プラズモン共鳴蛍光分析（表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：ＳＰＦＳ）が知られている。

ＳＰＦＳでは、金属膜が所定の面上に配置されたプリズムを用いる。そして、プリズムを介して、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光を金属膜に照射すると、金属膜表面上に局在場光（増強された電場）を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が励起されるため、蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。

ＳＰＦＳでは、高感度かつ高精度な検出を行うためには、分析チップの位置を高い精度で合わせる必要がある。被検出物質の量（濃度）を正確に検出するためには、励起光の入射角を高精度に調整することが必要であるが、分析チップの位置がずれていると、励起光の入射角を高精度に調整することができない。また、被検出物質を高感度に検出するためには、励起光の照射スポットの形状および位置と金属膜上の反応場の形状および位置とが一致することが好ましいが、分析チップの位置がずれていると、励起光の照射スポットの形状および位置を高精度に調整することができない。一方で、ユーザーに分析チップの位置を高い精度で合わせることを要求することは、ユーザビリティ（使いやすさ）の観点から好ましくない。

ＳＰＦＳではないが、分析チップに光を照射して被検出物質を検出する方法において、分析チップの位置合わせを行う方法が提案されている。たとえば、特許文献１には、蛍光物質を利用した検出において、励起光とは別波長の照明光を分析チップ（バイオチップ）に照射し、照明光の反射光または透過光を検出して、分析チップの位置を特定することが開示されている。励起光とは別波長の照明光を利用することで、蛍光物質の退色を防ぎつつ分析チップの位置を特定することができる。

特開２００７−０９３２５０号公報

しかしながら、特許文献１に記載の位置合わせ方法には、励起光源とは異なる光源や波長制限フィルターなどを追加しなければならないため、分析装置の製造コストが増大するという問題がある。

本発明の目的は、分析チップおよび表面プラズモン増強蛍光測定装置の製造コストの増大を防ぎつつ、分析チップの位置を高い精度で合わせることができる表面プラズモン増強蛍光測定方法、表面プラズモン増強蛍光測定装置ならびに分析チップを提供することである。

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、入射面、出射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置され、その表面に前記被検出物質を捕捉する捕捉体が固定化された捕捉領域を含む金属膜と、前記金属膜と同一平面に形成され、放出されるプラズモン散乱光の散乱状態が、周囲の領域から放出されるプラズモン散乱光の散乱状態と異なる１または２以上のマークと、を有する分析チップを、搬送ステージに固定されたチップホルダーに設置する工程と、前記チップホルダーに設置された前記分析チップにおける前記マークに対応した前記金属膜の裏面に前記入射面を介して励起光を照射するとともに、前記マークの近傍から放出されたプラズモン散乱光を検出し、検出されたプラズモン散乱光に基づいて、前記捕捉領域の位置情報を得る工程と、前記位置情報に基づいて前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記捕捉領域を検出位置に移動させる工程と、前記検出位置に配置された前記捕捉領域に対応した前記金属膜の裏面に励起光を照射するとともに、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、を含む。

また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、入射面、出射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置され、その表面に前記被検出物質を捕捉する捕捉体が固定化された捕捉領域を含む金属膜と、放出されるプラズモン散乱光の散乱状態が、周囲の領域から放出されるプラズモン散乱光の散乱状態と異なるマークと、を含む分析チップを着脱可能に保持するチップホルダーと、前記チップホルダーを移動させる搬送ステージと、前記金属膜の裏面に前記入射面を介して励起光を照射する励起光照射部と、前記金属膜から放出されたプラズモン散乱光を検出するプラズモン散乱光検出部と、前記マークに対応した前記金属膜の裏面に照射された励起光に基づくプラズモン散乱光の前記プラズモン散乱光検出部による検出結果に基づいて、前記チップホルダーに保持された前記分析チップの前記捕捉領域の位置を特定するとともに、前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップの前記捕捉領域を検出位置に移動させる位置調整部と、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する蛍光検出部と、を有する。

さらに、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る分析チップは、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出するために用いられる分析チップであって、入射面、出射面および成膜面を有するプリズムと、その表面に前記被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化された捕捉領域を含み、前記プリズムの前記成膜面上に配置された金属膜と、放出されるプラズモン散乱光の散乱状態が、周囲の領域から放出されるプラズモン散乱光の散乱状態と異なる位置決め用のマークと、を有する。

本発明によれば、分析チップの高精度な位置合わせを実現することができる。したがって、本発明によれば、製造コストの増大を防ぎつつ、被検出物質の高感度かつ高精度な検出を実現することができる。

図１は、本発明の実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の構成を模式的に示す図である。 図２は、捕捉領域およびマークの位置関係を示す図である。 図３は、図１に示されるＳＰＦＳ装置の動作手順を示すフローチャートである。 図４は、図３に示される位置合わせ工程（Ｓ１４０）内の工程を示すフローチャートである。 図５は、分析チップにおける捕捉領域の端部の位置情報を得る工程（Ｓ１４１）を説明するための模式図である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

図１は、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。図２は、捕捉領域およびマークの位置関係を示す図である。

図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、応答光検出ユニット１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御部１６０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、搬送ユニット１５０のチップホルダー１５４に分析チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、分析チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。

（分析チップの構成）
分析チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置されたマーク５０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。通常、分析チップ１０は、分析のたびに交換される。

プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射ユニット１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面で反射する。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射する。出射面２３は、金属膜３０の裏面で反射した励起光αをプリズム２０の外部に出射させる。

プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。

入射面２１は、励起光αが励起光照射ユニット１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。

なお、分析チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長、測定時に流路内に導入される測定液の屈折率などである。金属膜３０に固定化された被検出物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。

プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。

金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光を生じさせることができる。

金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。

金属膜３０のプリズム２０と対向しない面（金属膜３０の表の面）の少なくとも一部には、捕捉領域Ａが配置されている。捕捉領域Ａには、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体を固定化することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。捕捉領域Ａの平面視形状は、特に限定されない。捕捉領域Ａの平面視形状の例には、円形や多角形などが含まれる。なお、本実施の形態では、捕捉領域Ａの平面視形状は、円形である。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体またはその断片である。

図２に示されるように、マーク５０は、プリズム２０の成膜面２２上または金属膜３０上に配置されている。マーク５０は、捕捉領域Ａの位置決めのときの基準となる。詳細は後述するが、捕捉領域Ａの位置決めは、マーク５０の近傍と、周囲の領域から放出されるプラズモン散乱光の散乱状態に基づいて行われる。そこで、マーク５０は、その他の領域から放出されるプラズモン散乱光の散乱状態と異なるプラズモン散乱光の散乱状態となるように形成されていれば特に限定されない。マーク５０の例には、成膜面２２に形成された凸部または凹部、露出された成形膜またはパターニングされた金属膜、金属膜３０に貼り付けられたシールでもよい。

前述したように、成膜面２２上に金属膜３０が配置された状態で励起光αを照射することでプラズモン散乱光γが生じる。よって、マーク５０が露出された成膜面２２またはパターニングされた金属膜３０の場合、マーク５０で発生するプラズモン散乱光γの強度が減少するため、当該プラズモン散乱光γの強度が減少した位置をマーク５０として検出できる。

また、プラズモン散乱光γは、成膜面２２上の金属膜３０に励起光αが入射した際に発生し、その強度は、励起光αの入射角度に依存する。後述のように、実際の測定では、高強度の蛍光βを検出するために、プラズモン散乱光γの最大光量を得られる角度またはその近傍の角度で蛍光βを測定する。マーク５０が成膜面２２に形成された凸部または凹部の場合、分析チップ１０には、成膜面２２および金属膜３０と異なる角度の面が存在することになる。プラズモン散乱光γの強度は、励起光αの入射角に依存するため、当該プラズモン散乱光γの強度が変化した位置をマーク５０として検出できる。

さらに、マーク５０として遮光性を有するシールを用いる場合、マーク５０から発生するプラズモン散乱光γが減少するため、当該プラズモン散乱光γの強度が減少した位置をマーク５０として検出できる。一方、マーク５０として遮光性を有しないシールを用いる場合では、シールの材料の屈折率が流路４１内の液体の屈折率と異なるものを使用すれば、プラズモン散乱光γの強度が変化した位置をマーク５０として検出できる。プラズモン散乱光γの強度は、プリズム２０の屈折率、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長、測定時に流路内に導入される測定液の屈折率などにより変化する。すなわち、金属膜３０の上にシールが存在するか、または測定液が存在するかによってプラズモン散乱光γの強度が異なるため、当該プラズモン散乱光γの強度が変化した位置をマーク５０として検出できる。これらのように、検出されるプラズモン散乱光γを利用することでマーク５０の位置を検出できる。

マーク５０は、金膜面３０をその法線方向から見た時に、励起光αの進行方向に対して、対向する構造となるように形成することが好ましい。これは、当該対向する構造の部分に励起光αが照射されることで、プラズモン散乱光γの散乱状態をより大きく変化させることができ、マーク５０の位置の検出精度を高めることができる。この励起光αに対向する構造を形成する効果は、前述した凸部、凹部、金属膜のパターニング形状の場合により効果的である。

また、マーク５０が形成される位置は、特に限定されない。金属膜３０をその法線方向からみたとき、捕捉領域Ａの内部に配置されていてもよいし、捕捉領域Ａの外部に配置されていてもよい。本実施の形態では、マーク５０の位置は、捕捉領域Ａの外部に配置されている。また、マーク５０が形成される位置は、金属膜３０をその法線方向からみたとき、励起光αの光路と重なっていてもよいし、励起光αの光路外であってもよい。特にマーク５０が捕捉領域Ａの内部に配置された場合、マーク５０と測定時の測定領域との距離が近いため、より確実に後述の位置合わせできる。一方、マーク５０が捕捉領域Ａの外部に配置された場合では、後述の位置合わせ後に捕捉領域Ａ内に励起光αを照射して、蛍光物質からの蛍光βを検出する際に、マーク５０が蛍光検出の妨げにならないので好ましい。また、マーク５０は、金属膜３０をその法線方向からみたとき、捕捉領域Ａに対して、分析チップ１０が搬送される搬送方向に配置されてもよい。これにより、分析チップ１０の搬送ユニット１５０を用いて、励起光αをマーク５０および捕捉領域Ａの双方に照射できる。

さらに、マーク５０の数は、特に限定されない。マーク５０の数は、１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。本実施の形態では、マーク５０の数は、１つである。金属膜３０をその法線方向からみたときのマーク５０の面積は、特に限定されない。本実施の形態では、マーク５０の面積は、金属膜３０をその法線方向からみたとき、照射光の照射スポット内に収まる大きさであることが好ましい。マーク５０を平面視したときの面積が、照射光の照射スポットを平面視したときの面積より大きい場合、マーク５０の位置を正確に特定することが困難となるおそれがある。

また、２つ以上のマーク５０を配置する場合には、例えば、分析チップ１０の搬送方向に直交する方向にマーク５０を形成する。この場合、分析チップ１０の搬送方向と直交する方向に、分析チップ１０、あるいは励起光照射ユニット１１０、あるいは励起光照射ユニット１１０と応答光検出ユニット１３０が一体となって駆動する駆動機構（図示せず）を配置すれば、２つのマーク５０を用いて２方向（励起光αの照射方向とその直行方向）の位置合わせができる。また、２つ以上のマーク５０を配置する他の場合には、例えば、金膜面３０をその法線方向から見た時に、捕捉領域Ａに対して、対向する位置に２つのマーク５０を形成する。このとき、２つのマーク５０を位置検出することで、その中点位置に捕捉領域Ａが位置することがわかり、一方のマーク５０を検出する精度が低くても、捕捉領域Ａの位置を精度よく検出できる。

流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、液体が流れる流路４１を形成する。液体の例には、被検出物質を含む試料液や、蛍光物質で標識された抗体を含む標識液、洗浄液などが含まれる。金属膜３０の捕捉領域Ａは、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が注入されると、液体は捕捉領域Ａの捕捉体に接触する。

流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される蛍光βおよびプラズモン散乱光γに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光βおよびプラズモン散乱光γを外部に取り出す部分が蛍光βおよびプラズモン散乱光γに対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。

図１に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）で入射する。このように金属膜３０に対して励起光αを表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光βが出射される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光βの光量を検出することで、被検出物質の存在または量を検出する。

（ＳＰＦＳ装置の構成）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、応答光検出ユニット１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御部１６０を有する。

励起光照射ユニット１１０は、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０（金属膜３０の裏面）に励起光αを出射する。蛍光βの測定時には、励起光照射ユニット１１０は、金属膜３０に対する入射角が表面プラズモン共鳴を生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、励起光αは、分析チップ１０の位置決めにも使用される。

励起光照射ユニット１１０は、励起光αをプリズム２０に向けて出射するための構成と、金属膜３０の裏面に対する励起光αの入射角度を変更するための構成とを含む。本実施の形態では、励起光照射ユニット１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。

光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。

光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。

ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。

ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。

温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源から出射される光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源から出射される光の波長およびエネルギーを一定に制御する。

角度調整機構１１２は、金属膜３０の裏面（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））への励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０裏面の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１５４とを相対的に回転させる。

たとえば、角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を変化させても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。

金属膜３０の裏面に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光γの最大光量を得られる角度が増強角である。増強角またはその近傍の角度に励起光αの入射角を設定することで、高強度の蛍光βを測定することが可能となる。なお、分析チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路４１内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４１内の捕捉された被検出物質の種類および量、検体中の夾雑物の非特異吸着、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。本実施の形態では、金属膜３０の法線（図１におけるｚ軸方向の直線）に対する励起光αの好適な出射角は、約７０°である。

光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１の出射光（励起光α）の出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

応答光検出ユニット１３０は、被検出物質の検出時において金属膜３０の裏面への励起光αの照射によって生じた蛍光βと、分析チップ１０の位置決め時および増強角測定時において金属膜３０の裏面への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光γとを検出する。応答光検出ユニット１３０は、例えば、受光ユニット１３１、位置切り替え機構１３２およびセンサー制御部１３３を含む。

受光ユニット１３１は、分析チップ１０の金属膜３０の法線方向（図１におけるｚ軸方向）に配置される。受光ユニット１３１は、第１レンズ１３４、光学フィルター１３５、第２レンズ１３６および受光センサー１３７を含む。

第１レンズ１３４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１３６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１３４で集光された光を受光センサー１３７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１３５は、両レンズの間に配置されている。

光学フィルター１３５は、蛍光成分のみを受光センサー１３７に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光βを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。光学フィルター１３５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１３５は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルターであるが、所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターであってもよい。

受光センサー１３７は、蛍光βまたはプラズモン散乱光γを検出する。受光センサー１３７は、微小量の被検出物質からの微弱な蛍光βまたはプラズモン散乱光γを検出することが可能な高い感度を有する。受光センサー１３７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。

位置切り替え機構１３２は、光学フィルター１３５の位置を、受光ユニット１３１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１３７が蛍光βを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路上に配置し、受光センサー１３７がプラズモン散乱光γを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。位置切り替え機構１３２は、例えば、回転駆動部と、回転運動を利用して光学フィルター１３５を水平方向に移動させる公知の機構（ターンテーブルやラックアンドピニオンなど）とによって構成される。

センサー制御部１３３は、受光センサー１３７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１３７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１３７の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１３３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

送液ユニット１４０は、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０の流路４１内に、試料液や標識液、洗浄液などを供給する。送液ユニット１４０は、薬液チップ１４１、シリンジポンプ１４２および送液ポンプ駆動機構１４３を含む。

薬液チップ１４１は、試料液や標識液、洗浄液などの液体を収容する容器である。薬液チップ１４１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。

シリンジポンプ１４２は、シリンジ１４４と、シリンジ１４４内を往復動作可能なプランジャー１４５とによって構成される。プランジャー１４５の往復運動によって、液体の吸引および排出が定量的に行われる。シリンジ１４４が交換可能であると、シリンジ１４４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ１４４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ１４４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ１４４を交換せずに使用することが可能となる。

送液ポンプ駆動機構１４３は、プランジャー１４５の駆動装置、およびシリンジポンプ１４２の移動装置を含む。シリンジポンプ１４２の駆動装置は、プランジャー１４５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ１４２の送液量や送液速度を管理できるため、分析チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１４２を、シリンジ１４４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。

シリンジ１４４と分析チップ１０との相対的な高さを一定に調整し、分析チップ１０内での残液量を一定に管理する観点からは、送液ユニット１４０は、シリンジ１４４の先端の位置を検出する装置をさらに有することが好ましい。

送液ユニット１４０は、薬液チップ１４１より各種液体を吸引し、分析チップ１０の流路４１内に供給する。このとき、プランジャー１４５を動かすことで、分析チップ１０中の流路４１内を液体が往復し、流路４１内の液体が攪拌される。これにより、液体の濃度の均一化や、流路４１内における反応（例えば抗原抗体反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、分析チップ１０の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ１４４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、分析チップ１０およびシリンジ１４４が構成されていることが好ましい。

流路４１内の液体は、再びシリンジポンプ１４２で吸引され、薬液チップ１４１などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応、洗浄などを実施し、流路４１内の捕捉領域Ａに、蛍光物質で標識された被検出物質を配置することができる。

搬送ユニット１５０は、分析チップ１０を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射ユニット１１０が分析チップ１０に励起光αを照射し、それに伴い発生する蛍光βまたはプラズモン散乱光γを応答光検出ユニット１３０が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液ユニット１４０が分析チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または分析チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。搬送ユニット１５０は、搬送ステージ１５２およびチップホルダー１５４を含む。チップホルダー１５４は、搬送ステージ１５２に固定されており、分析チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１５４の形状は、分析チップ１０を保持することが可能であり、かつ励起光αの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１５４には、励起光αが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ１５２は、チップホルダー１５４を一方向（図１におけるｘ軸方向）およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１５２は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。

制御部１６０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、位置切り替え機構１３２、センサー制御部１３３、送液ポンプ駆動機構１４３および搬送ステージ１５２を制御する。また、制御部１６０は、応答光検出ユニット１３０の検出結果に基づいて、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０における捕捉領域Ａの端部の位置を特定するとともに、搬送ステージ１５２によりチップホルダー１５４を移動させて、分析チップ１０の捕捉領域Ａを適切な測定位置に移動させる位置調整部としても機能する。制御部１６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作（本発明の実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法）について説明する。図３は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。図４は、位置合わせ工程（Ｓ１４０）内の工程を示すフローチャートである。

まず、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１５４に分析チップ１０が設置される（Ｓ１００）。次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を送液位置に移動させる（Ｓ１１０）。

次いで、制御部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、薬液チップ１４１内の試料液を分析チップ１０の流路４１内に導入する（Ｓ１２０）。流路４１内では、抗原抗体反応（１次反応）によって、金属膜３０上に被検出物質が捕捉される。この後、流路４１内の試料液は除去され、流路４１内は洗浄液で洗浄される。なお、分析チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被検出物質を捕捉できるように、試料液を導入する前に流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。

次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を測定位置の近くまで移動させる（Ｓ１３０）。

次いで、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０、応答光検出ユニット１３０および搬送ステージ１５２を操作して、捕捉領域Ａの中心の位置情報を得るとともに、得られた位置情報に基づいて捕捉領域Ａ（分析チップ１０）の位置を調整する（Ｓ１４０）。この工程では、まず、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０におけるマーク５０の直下であって、マーク５０と同じ形状の領域（金属膜３０の裏面の領域）に励起光αを照射するとともに、マーク５０から放出されたプラズモン散乱光γを検出して、分析チップ１０の捕捉領域Ａの端部の位置情報を得る（Ｓ１４１）。具体的には、マーク５０を含むその近傍に対応する金属膜３０の裏面に照射スポットを走査して、マーク５０の近傍およびその他の領域から放出されるプラズモン散乱光γを検出する（図５参照）。ここで、前述したように、マーク５０（マーク５０の近傍）と、周囲の領域では、放出されるプラズモン散乱光γの散乱状態（光量）が異なる。よって、得られたプラズモン散乱光γの光量の変動からマーク５０の位置を特定する。次いで、予め設定されたマーク５０の中心部分と捕捉領域Ａの中心部分の距離から、捕捉領域Ａの中心の位置を特定する。これにより、測定位置からの捕捉領域Ａの位置ずれの程度を特定することができる。次いで、得られた位置情報に基づいて、搬送ステージ１５２によりチップホルダー１５４を移動させて、分析チップ１０の捕捉領域Ａを適切な測定位置に配置する（Ｓ１４２）。

次いで、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および応答光検出ユニット１３０を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、励起光αと同一波長のプラズモン散乱光γを検出して、増強角を検出する（Ｓ１５０）。具体的には、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０を操作して金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査しつつ、応答光検出ユニット１３０を操作してプラズモン散乱光γを検出する。このとき、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を操作して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。そして、制御部１６０は、プラズモン散乱光γの光量が最大の時の励起光αの入射角を増強角として決定する。

次いで、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および応答光検出ユニット１３０を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、受光センサー１３７の出力値（光学ブランク値）を記録する（Ｓ１６０）。このとき、制御部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。

次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を送液位置に移動させる（Ｓ１７０）。

次いで、制御部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、蛍光物質で標識された２次抗体を含む液体（標識液）を分析チップ１０の流路４１内に導入する（Ｓ１８０）。流路４１内では、抗原抗体反応（２次反応）によって、金属膜３０上に捕捉されている被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、流路４１内の標識液は除去され、流路４１内は洗浄液で洗浄される。

次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０をＳ１４０で決定された適切な測定位置に移動させる（Ｓ１９０）。

次いで、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および応答光検出ユニット１３０を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光βを検出する（Ｓ２００）。制御部１６０は、検出値から光学ブランク値を引き、被検出物質の量に相関する蛍光強度を算出する。検出された蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。

以上の手順により、試料液中の被検出物質の存在またはその量を検出することができる。

なお、増強角の検出（Ｓ１５０）は、１次反応（Ｓ１２０）の前に行ってもよい。この場合は、分析チップ１０の測定位置の決定（Ｓ１３０およびＳ１４０）は、１次反応（Ｓ１１０およびＳ１２０）の前に実施される。また、励起光αの入射角があらかじめ決まっている場合は、増強角の検出（Ｓ１５０）を省略してもよい。この場合も、分析チップ１０の測定位置の決定（Ｓ１３０およびＳ１４０）は、光学ブランク値の測定（Ｓ１６０）の前に実施される。このように、分析チップ１０の測定位置の決定（Ｓ１３０およびＳ１４０）は、光学測定（増強角の検出、光学ブランク値の測定または蛍光の検出）を初めて実施する前に実施されることが好ましい。

また、上記の説明では、被検出物質と捕捉体とを反応させる工程（１次反応、Ｓ１２０）の後に、被検出物質を蛍光物質で標識する工程（２次反応、Ｓ１８０）を行った（２工程方式）。しかしながら、被検出物質を蛍光物質で標識するタイミングは、特に限定されない。たとえば、分析チップ１０の流路４１内に試料液を導入する前に、試料液に標識液を添加して被検出物質を予め蛍光物質で標識しておいてもよい。また、分析チップ１０の流路４１内に試料液と標識液を同時に注入してもよい。前者の場合は、分析チップ１０の流路４１内に試料液を注入することで、蛍光物質で標識されている被検出物質が捕捉体により捕捉される。後者の場合は、被検出物質が蛍光物質で標識されるとともに、被検出物質が捕捉体により捕捉される。いずれの場合も、分析チップ１０の流路４１内に試料液を導入することで、１次反応および２次反応の両方を完了することができる（１工程方式）。このように１工程方式を採用する場合は、抗原抗体反応の前に増強角の検出（Ｓ１５０）が実施され、さらにその前に、分析チップ１０の測定位置の決定（Ｓ１３０およびＳ１４０）が実施される。

また、位置合わせ工程（Ｓ１４０）を行うタイミングは、被検出物質を蛍光標識した蛍光物質から放出された蛍光を検出する前であれば、一次反応（Ｓ１２０）の前でなくてもよい。たとえば、位置合わせ工程（Ｓ１４０）を一次反応（Ｓ１２０）の後に行ってもよいし、一次反応（Ｓ１２０）の後であって、二次反応（Ｓ１８０）の前であってもよい。

また、前述したＳＰＦＳ装置１００では、図１におけるＸ方向にのみ搬送ステージ１５２が移動するＳＰＦＳ装置１００について説明したが、図１におけるＹ方向（紙面垂直方向）にも搬送ステージが移動する構成であってもよい。この場合、搬送ステージは、チップホルダー１５４をＸ方向に移動するＸ方向移動機構およびチップホルダー１５４をＹ方向に移動するＹ方向移動機構を有する。また、平面方向に移動可能な搬送ステージ１５２を有するＳＰＦＳ装置では、照射スポットを複数方向に走査することができるため、捕捉領域Ａの端部の検出精度をさらに高めることができる。また、Ｙ方向移動機構は、励起光照射ユニット１１０、あるいは励起光照射ユニット１１０と応答光検出ユニット１３０が一体となって駆動する駆動機構を有してもよい。なお、この場合、マーク５０は、２つ配置されていてもよい。

本出願は、２０１４年５月２９日出願の特願２０１４−１１１２９８に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法、表面プラズモン増強蛍光測定装置および分析チップは、被検出物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば臨床検査などに有用である。

１０ 分析チップ
２０ プリズム
２１ 入射面
２２ 成膜面
２３ 出射面
３０ 金属膜
４０ 流路蓋
４１ 流路
５０ マーク
１００ ＳＰＦＳ装置
１１０ 励起光照射ユニット
１１１ 光源ユニット
１１２ 角度調整機構
１１３ 光源制御部
１３０ 応答光検出ユニット
１３１ 受光ユニット
１３２ 位置切り替え機構
１３３ センサー制御部
１３４ 第１レンズ
１３５ 光学フィルター
１３６ 第２レンズ
１３７ 受光センサー
１４０ 送液ユニット
１４１ 薬液チップ
１４２ シリンジポンプ
１４３ 送液ポンプ駆動機構
１４４ シリンジ
１４５ プランジャー
１５０ 搬送ユニット
１５２ 搬送ステージ
１５４ チップホルダー
１６０ 制御部
α 励起光
β 蛍光
γ プラズモン散乱光

Claims (8)

1. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、
   入射面、出射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置され、その表面に前記被検出物質を捕捉する捕捉体が固定化された捕捉領域を含む金属膜と、前記金属膜と同一平面に形成され、放出されるプラズモン散乱光の散乱状態が、周囲の領域から放出されるプラズモン散乱光の散乱状態と異なる１または２以上のマークと、を有する分析チップを、搬送ステージに固定されたチップホルダーに設置する工程と、
   前記チップホルダーに設置された前記分析チップにおける前記マークに対応した前記金属膜の裏面に前記入射面を介して励起光を照射するとともに、前記マークの近傍から放出されたプラズモン散乱光を検出し、検出されたプラズモン散乱光に基づいて、前記捕捉領域の位置情報を得る工程と、
   前記位置情報に基づいて前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記捕捉領域を検出位置に移動させる工程と、
   前記検出位置に配置された前記捕捉領域に対応した前記金属膜の裏面に励起光を照射するとともに、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、
   を含む、表面プラズモン増強蛍光測定方法。
2. 前記マークは、前記金属膜をその法線方向からみたとき、前記捕捉領域と異なる位置に配置されている、請求項１に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
3. 前記マークの数は、１つである、請求項１または請求項２に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
4. 前記マークは、前記成膜面に形成された凸部または凹部であるか、露出された前記成膜面またはパターニングされた金属面であるか、前記金属膜上に貼り付けられたシールである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
5. 前記マークは、前記金属膜をその法線方向からみたとき、前記金属膜の裏面に照射された励起光の照射スポット内に収まる大きさである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
6. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、
   入射面、出射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置され、その表面に前記被検出物質を捕捉する捕捉体が固定化された捕捉領域を含む金属膜と、放出されるプラズモン散乱光の散乱状態が、周囲の領域から放出されるプラズモン散乱光の散乱状態と異なるマークと、を含む分析チップを着脱可能に保持するチップホルダーと、
   前記チップホルダーを移動させる搬送ステージと、
   前記金属膜の裏面に前記入射面を介して励起光を照射する励起光照射部と、
   前記金属膜から放出されたプラズモン散乱光を検出するプラズモン散乱光検出部と、
   前記マークに対応した前記金属膜の裏面に照射された励起光に基づくプラズモン散乱光の前記プラズモン散乱光検出部による検出結果に基づいて、前記チップホルダーに保持された前記分析チップの前記捕捉領域の位置を特定するとともに、前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップの前記捕捉領域を検出位置に移動させる位置調整部と、
   前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する蛍光検出部と、
   を有する、表面プラズモン増強蛍光測定装置。
7. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出するために用いられる分析チップであって、
   入射面と、成膜面と、前記入射面で入射し前記成膜面で反射した励起光が到達する位置に配置、前記成膜面で反射した励起光を出射させるための出射面とを有するプリズムと、
   その表面に前記被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化された捕捉領域を含み、前記プリズムの前記成膜面上に配置された金属膜と、
   放出されるプラズモン散乱光の散乱状態が、周囲の領域から放出されるプラズモン散乱光の散乱状態と異なる位置決め用のマークと、
   を有し、
   前記マークは、前記金属膜の法線方向から見たときに、励起光の進行方向に対して対向する構造である、
   分析チップ。
8. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出するために用いられる分析チップであって、
   入射面、出射面および成膜面を有するプリズムと、
   その表面に前記被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化された捕捉領域を含み、前記プリズムの前記成膜面上に配置された金属膜と、
   放出されるプラズモン散乱光の散乱状態が、周囲の領域から放出されるプラズモン散乱光の散乱状態と異なる位置決め用のマークと、
   を有し、
   前記マークは、前記金属膜に貼り付けられたシールである、
   分析チップ。

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