JP6337905B2 - 表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）を利用して試料液中に含まれる被検出物質を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置に関する。

タンパク質やＤＮＡなどの生体物質を検出する測定において、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できれば、即時に患者の状態を把握し治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質に起因する微弱な光を、高感度かつ定量的に検出する分析方法および分析装置が求められている。被検出物質を高感度で検出する１つの方法としては、表面プラズモン共鳴蛍光分析法（表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：ＳＰＦＳ）が知られている。

ＳＰＦＳでは、金属膜が所定の面上に配置されたプリズムを用いる。そして、プリズムを介して、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光を金属膜に照射すると、金属膜表面上に局在場光（増強された電場）を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が励起されるため、蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。

ＳＰＦＳでは、高感度かつ高精度な検出を行うためには、分析チップの位置を高い精度で合わせる必要がある。被検出物質の量（濃度）を正確に検出するためには、励起光の入射角を高精度に調整することが必要であるが、分析チップの位置がずれていると、励起光の入射角を高精度に調整することができない。また、被検出物質を高感度に検出するためには、励起光の照射スポットの形状および位置と金属膜上の反応場の形状および位置とが一致することが好ましいが、分析チップの位置がずれていると、励起光の照射スポットの形状および位置を高精度に調整することができない。一方で、ユーザーに分析チップの位置を高い精度で合わせることを要求することは、ユーザビリティ（使いやすさ）の観点から好ましくない。

ＳＰＦＳではないが、分析チップに光を照射して被検出物質を検出する方法において、分析チップの位置合わせを行う方法がいくつか提案されている。たとえば、特許文献１には、ＳＰＲ法を利用した検出において、分析チップ（フローセル）に２つの位置確認孔を形成することが開示されている。ユーザーは、この位置確認孔を利用することで分析チップの位置を調整することができる。また、特許文献２には、蛍光物質を利用した検出において、励起光とは別波長の照明光を分析チップ（バイオチップ）に照射し、照明光の反射光または透過光を検出して、分析チップの位置を特定することが開示されている。励起光とは別波長の照明光を利用することで、蛍光物質の退色を防ぎつつ分析チップの位置を特定することができる。

特開２００９−２８８１０３号公報 特開２００７−０９３２５０号公報

特許文献１に記載の位置合わせ方法には、２つの位置確認孔を形成しなければならないため、分析チップの製造コストが増大するという問題がある。また、ユーザーが位置合わせをしなければならないため、ユーザビリティが悪いという問題もある。

また、特許文献２に記載の位置合わせ方法には、励起光源とは異なる光源や波長制限フィルターなどを追加しなければならないため、分析装置の製造コストが増大するという問題がある。

本発明の目的は、分析チップおよび分析装置の製造コストの増大を防ぎつつ、分析チップの位置を高い精度で合わせることができる表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置を提供することである。

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された捕捉体とを含む分析チップを、搬送ステージに固定されたチップホルダーに設置する工程と、前記チップホルダーに設置された前記分析チップに励起光を照射するとともに、励起光の反射光または透過光を検出して、前記分析チップの位置情報を得る工程と、前記位置情報に基づいて前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップを測定位置に移動させる工程と、前記測定位置に配置された前記分析チップに励起光を照射するとともに、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、を含む。

また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された捕捉体とを含む分析チップを着脱可能に保持するためのチップホルダーと、前記チップホルダーを移動させる搬送ステージと、前記チップホルダーに保持された前記分析チップに励起光を照射する励起光照射部と、前記分析チップで反射された励起光または前記分析チップを透過した励起光を検出する励起光検出部と、前記励起光検出部の検出結果に基づいて、前記チップホルダーに保持された前記分析チップの位置を特定するとともに、前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップを測定位置に移動させる位置調整部と、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する蛍光検出部と、を有する。

本発明によれば、安価な受光センサーを追加するのみで、ユーザーの手を煩わせることなく分析チップの高精度な位置合わせを実現することができる。したがって、本発明によれば、製造コストの増大およびユーザビリティの低下を防ぎつつ、被検出物質の高感度かつ高精度な検出を実現することができる。

図１は、本発明の一実施の形態に係るＳＰＦＳ装置の構成を模式的に示す図である。 図２は、図１に示されるＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図３は、図２に示される位置調整工程（Ｓ１４０）内の工程を示すフローチャートである。 図４Ａ〜Ｃは、分析チップの位置情報を得る工程（Ｓ１４１）を説明するための模式図である。 図５Ａ，Ｂは、受光センサーによる反射光の検出結果の例を示すグラフである。 図６Ａ〜Ｃは、分析チップの位置情報を得る工程（Ｓ１４１）を説明するための模式図である。 図７は、分析チップの別の例を示す断面図である。 図８は、分析チップの位置情報を得る工程（Ｓ１４１）を説明するための模式図である。 図９は、分析チップを測定位置に配置する工程（Ｓ１４２）を説明するための模式図である。 図１０は、分析チップを測定位置に配置する工程（Ｓ１４２）を説明するための模式図である。 図１１は、図１に示されるＳＰＦＳ装置の動作手順の別の例を示すフローチャートである。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

図１は、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、励起光検出ユニット１２０、蛍光検出ユニット１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御部１６０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、搬送ユニット１５０のチップホルダー１５４に分析チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、分析チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。

分析チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。通常、分析チップ１０は、分析のたびに交換される。分析チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射ユニット１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面で反射する。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射する。出射面２３は、金属膜３０で反射した励起光αをプリズム２０の外部に出射させる。

プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。

入射面２１は、励起光αが励起光照射ユニット１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。

なお、分析チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０に固定化された被検出物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。

プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。

金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光を生じさせることができる。

金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。

また、図１では図示しないが、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面（金属膜３０の表面）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体を固定化することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。本実施の形態では、金属膜３０上の所定の領域（反応場）に、捕捉体が均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体またはその断片である。

流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、液体が流れる流路４１を形成する。液体の例には、被検出物質を含む試料液や、蛍光物質で標識された抗体を含む標識液、洗浄液などが含まれる。金属膜３０に固定化されている捕捉体は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が注入されると、液体は捕捉体に接触する。

流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される蛍光γに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光γを外部に取り出す部分が蛍光γに対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。

図１に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。このとき、励起光αの一部は、入射面２１で反射して反射光βとなる。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）で入射する。このように金属膜３０に対して励起光αを表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光γが出射される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光γの光量を検出することで、被検出物質の存在または量を検出する。

次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、励起光検出ユニット１２０、蛍光検出ユニット１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御部１６０を有する。

励起光照射ユニット１１０は、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０に励起光αを出射する。蛍光γの測定時には、励起光照射ユニット１１０は、金属膜３０に対する入射角が表面プラズモン共鳴を生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、励起光αは、分析チップ１０の位置決めにも使用される。

励起光照射ユニット１１０は、励起光αをプリズム２０に向けて出射するための構成と、金属膜３０の裏面に対する励起光αの入射角度を走査するための構成とを含む。本実施の形態では、励起光照射ユニット１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。

光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。

光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。

ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。

ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。

温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。

角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））への励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１５４とを相対的に回転させる。

たとえば、角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。

金属膜３０に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光の最大光量を得られる角度が増強角である。増強角またはその近傍の角度に励起光αの入射角を設定することで、高強度の蛍光γを測定することが可能となる。なお、分析チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。本実施の形態では、金属膜３０の法線（図１におけるｚ軸方向の直線）に対する励起光αの好適な出射角は、約７０°である。

光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１の出射光（励起光α）の出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

励起光検出ユニット１２０は、光学測定（例えば、増強角の検出や光学ブランク値の測定、蛍光γの検出など）を行う際の分析チップ１０の位置決めのために、分析チップ１０への励起光αの照射によって生じた反射光βまたは透過光β’を検出する。好ましくは、励起光検出ユニット１２０は、最初の光学測定を行う前に、分析チップ１０の位置決めのために反射光βまたは透過光β’を検出する。多くの場合、最初の光学測定は、増強角の検出であることから、増強角の検出の前に反射光βまたは透過光β’を検出することが好ましい。増強角の検出を実施しない場合は、光学ブランクの測定前に反射光βまたは透過光β’を検出する。増強角の検出および光学ブランクの測定の両方を実施しない場合は、蛍光γの検出前に反射光βまたは透過光β’を検出する。本実施の形態では、励起光検出ユニット１２０は、励起光αの反射光βを検出する。励起光検出ユニット１２０は、受光センサー１２１およびセンサー制御部１２２を含む。

受光センサー１２１は、励起光αの反射光βを検出する。受光センサー１２１の種類は、励起光αの反射光または透過光を検出可能であれば特に限定されない。たとえば、受光センサー１２１は、フォトダイオード（ＰＤ）である。受光センサー１２１の受光面の大きさは、励起光αのビーム径よりも大きいことが好ましい。たとえば、励起光αのビーム径が１〜１.５ｍｍ程度の場合、受光センサー１２１の受光面の１辺の長さは３ｍｍ以上であることが好ましい。

受光センサー１２１は、励起光αの反射光βが入射する位置に配置される。本実施の形態では、受光センサー１２１は、入射面２１からの反射光βが入射する位置に配置される。好ましくは、受光センサー１２１は、蛍光γの検出時と同じかまたはそれに近い角度で出射された励起光αの反射光βが入射する位置に配置される。励起光αの照射位置は、入射角の変化によりわずかに変化するため、分析チップ１０の位置決め時と蛍光γの測定時とで励起光αの入射角を同じかまたはそれに近い角度にすることで、蛍光γの検出時の位置決め精度をより高くすることが可能となる。本実施の形態では、金属膜３０の法線（図１におけるｚ軸方向の直線）に対する励起光αの出射角が約７０°である場合、入射面２１からの反射光βは、搬送ステージの進行方向（図１におけるｘ軸方向）にほぼ水平に進む。したがって、受光センサー１２１は、この水平方向に進む反射光βが入射する位置に配置される（図４Ｃ参照）。

センサー制御部１２２は、受光センサー１２１の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１２１の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２１の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１２２は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

蛍光検出ユニット１３０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じた蛍光γを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出ユニット１３０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光も検出する。蛍光検出ユニット１３０は、例えば、受光ユニット１３１、位置切り替え機構１３２およびセンサー制御部１３３を含む。

受光ユニット１３１は、分析チップ１０の金属膜３０の法線方向（図１におけるｚ軸方向）に配置される。受光ユニット１３１は、第１レンズ１３４、光学フィルター１３５、第２レンズ１３６および受光センサー１３７を含む。

第１レンズ１３４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１３６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１３４で集光された光を受光センサー１３７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１３５は、両レンズの間に配置されている。

光学フィルター１３５は、蛍光成分のみを受光センサー１３７に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光γを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光）を除去する。光学フィルター１３５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１３５は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルターであるが、所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターであってもよい。

受光センサー１３７は、蛍光γを検出する。受光センサー１３７は、微小量の被検出物質からの微弱な蛍光γを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１３７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。

位置切り替え機構１３２は、光学フィルター１３５の位置を、受光ユニット１３１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１３７が蛍光γを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路上に配置し、受光センサー１３７がプラズモン散乱光を検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。位置切り替え機構１３２は、例えば、回転駆動部と、回転運動を利用して光学フィルター１３５を水平方向に移動させる公知の機構（ターンテーブルやラックアンドピニオンなど）とによって構成される。

センサー制御部１３３は、受光センサー１３７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１３７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１３７の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１３３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

送液ユニット１４０は、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０の流路４１内に、試料液や標識液、洗浄液などを供給する。送液ユニット１４０は、薬液チップ１４１、シリンジポンプ１４２および送液ポンプ駆動機構１４３を含む。

薬液チップ１４１は、試料液や標識液、洗浄液などの液体を収容する容器である。薬液チップ１４１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。

シリンジポンプ１４２は、シリンジ１４４と、シリンジ１４４内を往復動作可能なプランジャー１４５とによって構成される。プランジャー１４５の往復運動によって、液体の吸引および排出が定量的に行われる。シリンジ１４４が交換可能であると、シリンジ１４４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ１４４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ１４４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ１４４を交換せずに使用することが可能となる。

送液ポンプ駆動機構１４３は、プランジャー１４５の駆動装置、およびシリンジポンプ１４２の移動装置を含む。シリンジポンプ１４２の駆動装置は、プランジャー１４５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ１４２の送液量や送液速度を管理できるため、分析チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１４２を、シリンジ１４４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。

シリンジ１４４と分析チップ１０との相対的な高さを一定に調整し、分析チップ１０内での残液量を一定に管理する観点からは、送液ユニット１４０は、シリンジ１４４の先端の位置を検出する装置をさらに有することが好ましい。

送液ユニット１４０は、薬液チップ１４１より各種液体を吸引し、分析チップ１０の流路４１内に供給する。このとき、プランジャー１４５を動かすことで、分析チップ１０中の流路４１内を液体が往復し、流路４１内の液体が攪拌される。これにより、液体の濃度の均一化や、流路４１内における反応（例えば抗原抗体反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、分析チップ１０の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ１４４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、分析チップ１０およびシリンジ１４４が構成されていることが好ましい。

流路４１内の液体は、再びシリンジポンプ１４２で吸引され、薬液チップ１４１などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応、洗浄などを実施し、流路４１内の反応場に、蛍光物質で標識された被検出物質を配置することができる。

搬送ユニット１５０は、分析チップ１０を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射ユニット１１０が分析チップ１０に励起光αを照射し、それに伴い発生する蛍光γを蛍光検出ユニット１３０が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液ユニット１４０が分析チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または分析チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。搬送ユニット１５０は、搬送ステージ１５２およびチップホルダー１５４を含む。チップホルダー１５４は、搬送ステージ１５２に固定されており、分析チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１５４の形状は、分析チップ１０を保持することが可能であり、かつ励起光α、反射光βおよび蛍光γの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１５４には、励起光α、反射光βおよび蛍光γが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ１５２は、チップホルダー１５４を一方向（図１におけるｘ軸方向）およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１５２は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。

制御部１６０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、位置切り替え機構１３２、センサー制御部１３３、送液ポンプ駆動機構１４３および搬送ステージ１５２を制御する。また、制御部１６０は、励起光検出ユニット１２０の検出結果に基づいて、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０の位置を特定するとともに、搬送ステージ１５２によりチップホルダー１５４を移動させて、分析チップ１０を適切な測定位置に移動させる位置調整部としても機能する。制御部１６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作（本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法）について説明する。図２は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。図３は、図２に示される位置調整工程（Ｓ１４０）内の工程を示すフローチャートである。

まず、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１５４に分析チップ１０が設置される（工程Ｓ１００）。

次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を送液位置に移動させる（工程Ｓ１１０）。

次いで、制御部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、薬液チップ１４１内の試料液を分析チップ１０の流路４１内に導入する（工程Ｓ１２０）。流路４１内では、抗原抗体反応（１次反応）によって、金属膜３０上に被検出物質が捕捉される。この後、流路４１内の試料液は除去され、流路４１内は洗浄液で洗浄される。なお、分析チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被検出物質を捕捉できるように、試料液を導入する前に流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。

次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を測定位置の近くまで移動させる（工程Ｓ１３０）。

次いで、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０、励起光検出ユニット１２０および搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０の位置情報を得るとともに、得られた位置情報に基づいて分析チップ１０の位置を調整する（工程Ｓ１４０）。図３に示されるように、この工程では、まず、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、励起光αの反射光βを検出して、分析チップ１０の位置情報を得る（工程Ｓ１４１）。これにより、測定位置からの分析チップ１０の位置ずれの程度を特定することができる。次いで、得られた位置情報に基づいて、搬送ステージ１５２によりチップホルダー１５４を移動させて、分析チップ１０を適切な測定位置に配置する（工程Ｓ１４２）。

図４は、分析チップ１０の位置情報を得る工程（Ｓ１４１）を説明するための模式図である。まず、図４Ａに示されるように、分析チップ１０が光源ユニット１１１から離れた位置にある場合、光源ユニット１１１が励起光αを出射すると、励起光αは流路蓋４０で反射して、下側（搬送ステージ１５２側）に向かう。したがって、励起光検出ユニット１２０の受光センサー１２１には、分析チップ１０からの反射光βは入射しない。

この状態で分析チップ１０を光源ユニット１１１に近づけていくと、光源ユニット１１１からの励起光αは、プリズム２０と流路蓋４０との境界部（以下「エッジ部」という）に到達する。この場合、図４Ｂに示されるように、流路蓋４０で反射した励起光α（反射光β）は受光センサー１２１に入射しないが、入射面２１で反射した励起光α（反射光β）は受光センサー１２１に入射する。したがって、受光センサー１２１には、分析チップ１０からの反射光βの一部が入射する。

さらに分析チップ１０を光源ユニット１１１に近づけていくと、光源ユニット１１１からの励起光αは、すべてプリズム２０の入射面２１に到達する。したがって、図４Ｃに示されるように、受光センサー１２１には、分析チップ１０からの反射光βのすべてが入射する。

図５は、受光センサー１２１による反射光βの検出結果の例を示すグラフである。この例では、搬送ステージ１５２により分析チップ１０を一方向（ｘ軸方向）に１００μｍずつ移動させながら、受光センサー１２１により反射光βの強度を測定した。励起光αのビーム径は１〜１.５ｍｍ程度である。図５Ａでは、検出結果のみを示しており、図５Ｂでは、３本の近似直線も示している。

図５Ａに示されるように、分析チップ１０の移動距離が０〜約１０００μｍの間は、受光センサー１２１には、分析チップ１０からの反射光βは入射しない。これは、励起光αが、流路蓋４０で反射して、下側（搬送ステージ１５２側）に向かうためである（図４Ａ参照）。一方、分析チップ１０の移動距離が約１０００〜約２０００μｍの間は、受光センサー１２１に入射する反射光βの光量が徐々に増大する。これは、励起光αの一部が、入射面２１で反射して、受光センサー１２１に入射するためである（図４Ｂ参照）。分析チップ１０の移動距離が約２０００μｍを超えると、受光センサー１２１に入射する反射光βの光量が一定となる。これは、反射光βのすべてが、受光センサー１２１に入射するためである（図４Ｃ参照）。したがって、グラフ中の傾斜部（移動距離：約１０００〜約２０００μｍ）が、エッジ部に対応する。なお、傾斜部の幅は、励起光αのｘ軸方向のビーム径（１〜１.５ｍｍ程度）に対応している。

図５Ｂでは、前半の水平部（移動距離：０〜約１０００μｍ）と、傾斜部（移動距離：約１０００〜約２０００μｍ）と、後半の水平部（移動距離：約２０００μｍ超）のそれぞれを直線近似している。グラフ中の点Ａは、前半の水平部の近似直線と傾斜部の近似直線との交点である。点Ｂは、傾斜部の近似直線と後半の水平部の近似直線との交点である。点Ｃは、点Ａと点Ｂとの中点である。点Ａは、反射光βの光量の最小値に対応する。点Ｂは、反射光βの光量の最大値に対応する。点Ｃは、反射光βの光量の中間値に対応する。

図５Ｂのグラフにおいて、分析チップ１０の位置を特定するには、点Ａ〜Ｃのいずれかを使用すればよい。点Ａおよび点Ｂは、励起光αのビームの縁がエッジ部に到達した地点を示している。したがって、励起光αのビーム径を考慮すれば、エッジ部の位置を特定することができ、結果として分析チップ１０の位置を特定することができる。一方、点Ｃは、励起光αのビームの中心がエッジ部に到達した地点を示している。点Ｃを利用する場合は、励起光αのビーム径を考慮することなく、エッジ部の位置を特定することができ、結果として分析チップ１０の位置を特定することができる。したがって、励起光αのビーム径の影響を抑制する観点からは、励起光αの反射光β（または透過光β’）の光量の中間値を用いて、分析チップ１０の位置を特定することが好ましい。

このように、分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、励起光αの反射光βを検出することで、分析チップ１０の位置を特定することができる。このとき、図６Ａに示されるように、分析チップ１０の１つの面（図６Ａでは入射面２１）に励起光αを照射することで、分析チップ１０の位置を特定してもよい。図６Ａに示される例では、受光センサー１２１の受光面が小さくなっており、受光センサー１２１に反射光βが入射するかどうかで、入射面２１の位置を特定することができる。しかしながら、分析チップ１０の位置を水平方向（ｘ軸方向）だけでなく高さ方向（ｚ軸方向）についても高精度に特定する観点からは、図４に示されるように、分析チップ１０の互いに隣接する２つの面に励起光αを照射することで、分析チップ１０の位置を特定することが好ましい。この場合、搬送ステージ１５２によるチップホルダー１５４の移動方向に対して平行および垂直ではない方向に励起光αを照射することが好ましい。なお、図６Ｂに示されるように、流路蓋４０からの反射光βが入射し、入射面２１からの反射光βが入射しない位置に受光センサー１２１を配置しても、図４に示される例と同様の効果を得られる（反射光βの強度は、移動距離が短いときに高くなり、移動距離が長いときに低くなる）。

また、入射面２１の位置が特に重要であることから、分析チップ１０の互いに隣接する２つの面に励起光αを照射する場合は、分析チップ１０の入射面２１と入射面２１に隣接する面（本実施の形態では流路蓋４０の裏面）とに励起光αを照射することが好ましい。この場合、図６Ｃに示されるように、プリズム２０の入射面２１とプリズム２０の下面とに励起光αを照射してもよい。しかしながら、図６Ｃに示される例では、分析チップ１０の位置を特定するときに（工程Ｓ１４１）、分析チップ１０が測定位置よりも光源ユニット１１１に近づいてしまう。したがって、分析チップ１０を測定位置に移動させるときに（工程Ｓ１４２）、搬送ステージ１５２によりチップホルダー１５４を逆方向に移動させなければならない。このように搬送ステージ１５２を２方向に動作させることは、搬送ステージ１５２を１方向にのみ動作させる場合に比べて、動作精度の低下に繋がるおそれがある。これに対し、図４および図６Ａ，Ｂに示される例では、搬送ステージ１５２によりチップホルダー１５４を逆方向に移動させる必要はない。したがって、分析チップ１０の位置を高精度に調整する観点からは、分析チップ１０の位置情報を得る工程（Ｓ１４１）および分析チップを測定位置に移動させる工程（Ｓ１４２）では、搬送ステージ１５２によりチップホルダー１５４を励起光αの光源（光源ユニット１１１）に近づく方向（ｘ軸方向）にのみ移動させることが好ましい。

なお、上記「分析チップ１０の互いに隣接する２つの面」には、実質的に隣接する２つの面が含まれる。たとえば、図７に示されるように、プリズム２０と、プリズムの成膜面２２上に配置された金属膜３０と、金属膜３０の上に配置されたスペーサー４２と、スペーサー４２の上に配置された流路蓋４０とを有する分析チップ１０’を使用するとする。流路４１の形状は、スペーサー４２により形作られている。一方、流路蓋４０は、透明の平板である。この場合、厳密には、プリズム２０の入射面２１と流路蓋４０の下面との間にスペーサー４２の側面が存在するため、入射面２１と流路蓋４０の下面とは隣接していない。しかしながら、励起光αのビーム径（例えば１〜１.５ｍｍ）に比べてスペーサー４２の厚みが非常に薄い（例えば１００μｍ）場合、入射面２１と流路蓋４０の下面とが実質的に隣接していると考えられる。したがって、この場合は、実質的に隣接する入射面２１および流路蓋４０の下面からの反射光βを検出してエッジ部を検出する。接着剤や両面テープなどの接合部材や金属膜３０などについても同様に無視することができる。

このように反射光βを検出する際に無視できる部材（例えばスペーサー４２）の厚さは、励起光αのビーム径の１／５以下であり、好ましくは１／１０以下である。たとえば、励起光αが、励起光αのビーム径の１／５以下または１／１０以下の厚みのスペーサー４２を含む領域に照射された場合、分析チップ１０からの反射光βは、その大半（４／５以上または９／１０以上）が入射面２１または流路蓋４０の下面からの反射光βであり、位置検出に利用されうる。したがって、スペーサー４２の影響を受けることなく、分析チップ１０の位置を特定することができる。このように、励起光αのビーム径の１／５以下の厚みの部材（スペーサー４２や、接合部材、金属膜３０など）は、反射光βを検出する際に無視することができる。すなわち、分析チップ１０の入射面２１と流路蓋４０の下面は実質的に隣接する２面として考えることができる。

また、図８に示されるように、励起光αの反射光βの代わりに、励起光αの透過光β’を検出しても、分析チップ１０の位置を特定することができる。図８に示される例では、励起光αが流路蓋４０に入射した場合は、透過光β’が生じる。一方、励起光αが入射面２１に入射した場合は、プリズム２０の成膜面２２で全反射が生じるため、透過光β’は生じない。したがって、受光センサー１２１が透過光β’を検出することで、エッジ部の位置を特定することができ、結果として分析チップ１０の位置を特定することができる。

図９は、分析チップ１０を適切な測定位置に配置する工程（工程Ｓ１４２）を説明するための模式図である。まず、図９Ａに示されるように、エッジ部の位置を特定したとする。この場合、エッジ部の位置と金属膜３０裏面の励起光αを照射すべき領域（反応場の裏側の領域）との距離は決まっているため、図９Ｂに示されるように、搬送ステージ１５２にチップホルダー１５４を所定の距離移動させることで、分析チップ１０を適切な測定位置に配置することができる。

また、図１０に示されるように、分析チップ１０が高さ方向（ｚ軸方向）にずれて配置されていた場合（例えば、分析チップ１０とチップホルダー１５４との間にごみが挟まっていた場合）も、分析チップ１０を適切な測定位置に配置することができる。すなわち、図１０Ａに示されるように、エッジ部の位置を特定したとする。この場合、分析チップ１０がｚ軸方向にずれていない場合（図中破線で示す）に比べて、ｘ軸方向における分析チップ１０の位置はずれている。しかしながら、この場合であっても、図１０Ｂに示されるように、エッジ部の位置に基づいて、搬送ステージ１５２にチップホルダー１５４を所定の距離移動させることで、分析チップ１０を適切な測定位置に配置することができる。

ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の説明に戻る（図２参照）。次いで、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および蛍光検出ユニット１３０を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、励起光αと同一波長のプラズモン散乱光を検出して、増強角を検出する（工程Ｓ１５０）。具体的には、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０を操作して金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査しつつ、蛍光検出ユニット１３０を操作してプラズモン散乱光を検出する。このとき、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を操作して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。そして、制御部１６０は、プラズモン散乱光の光量が最大の時の励起光αの入射角を増強角として決定する。

次いで、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および蛍光検出ユニット１３０を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、受光センサー１３７の出力値（光学ブランク値）を記録する（工程Ｓ１６０）。このとき、制御部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。

次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を送液位置に移動させる（工程Ｓ１７０）。

次いで、制御部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、蛍光物質で標識された２次抗体を含む液体（標識液）を分析チップ１０の流路４１内に導入する（工程Ｓ１８０）。流路４１内では、抗原抗体反応（２次反応）によって、金属膜３０上に捕捉されている被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、流路４１内の標識液は除去され、流路内は洗浄液で洗浄される。

次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を工程Ｓ１４０で決定された適切な測定位置に移動させる（工程Ｓ１９０）。

次いで、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および蛍光検出ユニット１３０を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光γを検出する（工程Ｓ２００）。制御部１６０は、検出値から光学ブランク値を引き、被検出物質の量に相関する蛍光強度を算出する。検出された蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。

以上の手順により、試料液中の被検出物質の存在またはその量を検出することができる。

なお、図１１に示されるように、増強角の検出（工程Ｓ１５０）は、１次反応（工程Ｓ１２０）の前に行ってもよい。この場合は、分析チップ１０の測定位置の決定（工程Ｓ１３０および工程Ｓ１４０）も、１次反応（工程Ｓ１１０および工程Ｓ１２０）の前に実施される。このようにすることで、図２に示されるフローチャートにおいて１次反応（工程Ｓ１２０）と２次反応（工程Ｓ１８０）の間に行っていた分析チップ１０を送液位置に移動させる工程（工程Ｓ１７０）を省略することができる。また、１次反応（工程Ｓ１２０）を行う前の分析チップ１０を送液位置に移動させる工程（工程Ｓ１１０）における位置精度が高まり、１次反応（工程Ｓ１２０）および２次反応（工程Ｓ１８０）において、送液ユニット１４０のシリンジ１４４の先端を分析チップ１０内により確実に挿入できるようになる。このため、ユーザーがチップホルダー１５４に分析チップ１０を設置する工程（工程Ｓ１００）において要求される分析チップ１０の位置精度が緩くなり、ユーザビリティが向上する。

また、励起光αの入射角があらかじめ決まっている場合は、増強角の検出（工程Ｓ１５０）を省略してもよい。この場合も、分析チップ１０の測定位置の決定（工程Ｓ１３０および工程Ｓ１４０）は、光学ブランク値の測定（工程Ｓ１６０）の前に実施される。このように、分析チップ１０の測定位置の決定（工程Ｓ１３０および工程Ｓ１４０）は、光学測定（増強角の検出、光学ブランク値の測定または蛍光の検出）を初めて実施する前に実施されることが好ましい。

また、上記の説明では、被検出物質と捕捉体とを反応させる工程（１次反応、工程Ｓ１２０）の後に、被検出物質を蛍光物質で標識する工程（２次反応、工程Ｓ１８０）を行った（２工程方式）。しかしながら、被検出物質を蛍光物質で標識するタイミングは、特に限定されない。たとえば、分析チップ１０の流路内に試料液を導入する前に、試料液に標識液を添加して被検出物質を予め蛍光物質で標識しておいてもよい。また、分析チップ１０の流路内に試料液と標識液を同時に注入してもよい。前者の場合は、分析チップ１０の流路内に試料液を注入することで、蛍光物質で標識されている被検出物質が捕捉体により捕捉される。後者の場合は、被検出物質が蛍光物質で標識されるとともに、被検出物質が捕捉体により捕捉される。いずれの場合も、分析チップ１０の流路内に試料液を導入することで、１次反応および２次反応の両方を完了することができる（１工程方式）。このように１工程方式を採用する場合は、抗原抗体反応の前に増強角の検出（工程Ｓ１５０）が実施され、さらにその前に、分析チップ１０の測定位置の決定（工程Ｓ１３０および工程Ｓ１４０）が実施される。

また、上記実施の形態ではＳＰＦＳ装置について説明したが、本発明に係る分析チップの位置合わせ方法は、ＳＰＲ装置などのＳＰＦＳ装置以外の分析装置にも適用されうる。

本出願は、２０１３年１０月３１日出願の特願２０１３−２２６６６７に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、被検出物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば臨床検査などに有用である。

１０，１０’ 分析チップ
２０ プリズム
２１ 入射面
２２ 成膜面
２３ 出射面
３０ 金属膜
４０ 流路蓋
４１ 流路
４２ スペーサー
１００ ＳＰＦＳ装置
１１０ 励起光照射ユニット
１１１ 光源ユニット
１１２ 角度調整機構
１１３ 光源制御部
１２０ 励起光検出ユニット
１２１ 受光センサー
１２２ センサー制御部
１３０ 蛍光検出ユニット
１３１ 受光ユニット
１３２ 位置切り替え機構
１３３ センサー制御部
１３４ 第１レンズ
１３５ 光学フィルター
１３６ 第２レンズ
１３７ 受光センサー
１４０ 送液ユニット
１４１ 薬液チップ
１４２ シリンジポンプ
１４３ 送液ポンプ駆動機構
１４４ シリンジ
１４５ プランジャー
１５０ 搬送ユニット
１５２ 搬送ステージ
１５４ チップホルダー
１６０ 制御部
α 励起光
β 励起光の反射光
β’ 励起光の透過光
γ 蛍光

Claims (8)

1. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
   入射面、成膜面および下面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された捕捉体とを含む分析チップを、搬送ステージに固定されたチップホルダーに設置する工程と、
   前記チップホルダーに設置された前記分析チップに励起光を照射するとともに、励起光の反射光または透過光を検出して、前記分析チップの位置情報を得る工程と、
   前記位置情報に基づいて前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップを測定位置に移動させる工程と、
   前記測定位置に配置された前記分析チップに励起光を照射するとともに、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、
   を含み、
   前記励起光の反射光は、前記プリズムの入射面で反射した励起光、前記プリズムの下面で反射した励起光、または前記成膜面もしくは前記金属膜上に構造体が配置されている場合における当該構造体で反射した励起光であり、
   前記励起光の透過光は、前記成膜面もしくは前記金属膜上に構造体が配置されている場合における当該構造体を透過した励起光である、
   表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
2. 前記分析チップの位置情報を得る工程では、前記分析チップの互いに隣接する２つの面に励起光を照射する、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
3. 前記分析チップの位置情報を得る工程では、前記分析チップの前記入射面と前記入射面に隣接する面とに励起光を照射する、請求項２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
4. 前記分析チップの位置情報を得る工程では、前記励起光の反射光または透過光が検出部に到達しない状態のときの前記励起光の反射光または透過光の光量と、前記励起光の反射光または透過光の全部が前記検出部に到達する状態のときの前記励起光の反射光または透過光の光量との中間値を用いて、前記分析チップの位置情報を特定する、請求項２または請求項３に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
5. 前記分析チップの位置情報を得る工程では、前記搬送ステージによる前記チップホルダーの移動方向に対して平行および垂直ではない方向に励起光を照射する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
6. 前記分析チップの位置情報を得る工程では、前記入射面で反射した励起光を検出する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
7. 前記分析チップの位置情報を得る工程および前記分析チップを測定位置に移動させる工程では、前記搬送ステージにより前記チップホルダーを励起光の光源に近づく方向にのみ移動させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
8. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
   入射面、成膜面および下面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された捕捉体とを含む分析チップを着脱可能に保持するためのチップホルダーと、
   前記チップホルダーを移動させる搬送ステージと、
   前記チップホルダーに保持された前記分析チップに励起光を照射する励起光照射部と、
   前記分析チップで反射された励起光または前記分析チップを透過した励起光を検出する励起光検出部と、
   前記励起光検出部の検出結果に基づいて、前記チップホルダーに保持された前記分析チップの位置を特定するとともに、前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップを測定位置に移動させる位置調整部と、
   前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する蛍光検出部と、
   を有し、
   前記分析チップで反射された励起光は、前記プリズムの入射面で反射した励起光、前記プリズムの下面で反射した励起光、または前記成膜面もしくは前記金属膜上に構造体が配置されている場合における当該構造体で反射した励起光であり、
   前記分析チップを透過した励起光は、前記成膜面もしくは前記金属膜上に構造体が配置されている場合における当該構造体を透過した励起光である、
   表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。

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