JP6242575B2

JP6242575B2 - デンドライト伸長抑制剤

Info

Publication number: JP6242575B2
Application number: JP2013001527A
Authority: JP
Inventors: 雅則濱口; 服部　文弘; 文弘服部; 要荒巻
Original assignee: Mikimoto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mikimoto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-01-09
Filing date: 2013-01-09
Publication date: 2017-12-06
Anticipated expiration: 2033-01-09
Also published as: JP2014133708A

Description

本発明は、デンドライト伸長を抑制する製剤に関する。

樹状突起の形成機構には、細胞内における低分子量Gタンパクが関与している。この低分子量Gタンパクは細胞の増殖、接着、遊走、分泌など様々な細胞活動を制御している。
また、低分子量Gタンパクはがん細胞における転移や浸潤などとも密接に関与していることが報告されている。（非特許文献１）
メラノサイトにおいても、デンドライトの形成には、低分子量Ｇタンパクの関与が報告されており、その活性化には炎症性サイトカインとして知られているプロスタグランジンＥ２による作用が報告されている。（非特許文献２）
一方で、色素沈着の詳細な発現機構は十分には解明されていないが、大まかには、次のような機構が考えられている。
皮膚の基底層に存在するメラニン細胞（メラノサイト）の小胞（メラノソーム）内でチロシナーゼを触媒として、チロシンからメラニンが生成されるとともに、成熟したメラノソームを形成する。同時にメラノサイトから樹状突起が形成され、メラノサイトの先端から周囲に存在する角化細胞（ケラチノサイト）へメラノソームが受け渡される。
そして、ケラチノサイトはメラノソームを受け取ることで皮膚が暗色化する。メラノサイトのデンドライトが形成、伸長されないとケラチノサイトへのメラノソームの転移が効率よく行われず、結果的に皮膚に沈着するメラニン色素の量が減少するものと考えられる。
また、メラノサイトを含めデンドライトの伸長を抑制することは神経細胞腫の治療などにおいて有用であることが知られている。（特許文献１）
メラノサイトの樹状突起形成阻害剤としては、ヒドランゲノールまたはその誘導体、酵母抽出物、キサントン誘導体等が知られている。（特許文献２〜４）

ジャトバは、マメ科(Leguminosae)Hymenaea courbaril L.の果実である。ジャトバに関しては、テストステロン−５α−リダクターゼ阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤、美白作用、エラスターゼ阻害剤などについて検討された。（特許文献５〜８）
白朮（ビャクジュツ）は、漢方生薬の１種であり、キク科の植物であるオケラ（Atractylodes japonica）、オオバナオケラ（Atractylodes ovata）等のオケラ属の周皮を除いた根茎部分（ワビャクジュツ）、オオバナオケラ（Atractylodes ovata）の根茎部をいう。
美白、シワ改善等の目的で外用剤に用いられている。（特許文献９〜１０）。
また、イシゲは、褐藻植物門、褐藻網、ナガマツモ目、イシゲ科、イシゲ属の海藻で、学名Ishige okamurai Yendoといい、茨城以南の沿岸で広く分布する褐藻類である。食用には硬いので適さない。
すでに、美白、育毛、痩身或いは抗菌・防腐等の目的で皮膚外用剤や食品に利用されている。（特許文献１１〜１３）

特開２００６−６７９４０公報特開２０００−７５４６号公報特開２００３−２５２７４２号公報特開２００５−２０５６号公報特開平０７−２５８１０６号公報特開平０８−５３３６０号公報特開平１０−２３６９４３号公報特開２０００−７２６４９号公報特開平０９−０７７６３５号公報特開平１０−１９４９４６号公報特開平０４−９５０１２号公報特開平１１−１８０８１３号公報特開２０００−２３６８４６号公報

Nature Medicine 1999 5:221-225 Exp Cell Res 2007 313(18) 3840-3850

本発明の目的はデンドライト伸長を抑制する製剤を得ることにある。

本発明者らが鋭意検討した結果、ジャトバ、白朮、イシゲの抽出物が上記目的を達することがわかった。
ジャトバの実、白朮、イシゲを、抽出効率を考え、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。ジャトバの実、すなわち豆果は成熟すると非常に堅いので、必要な細切、粉砕等の処理を行う。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いる。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部添加することが好ましい。
抽出に使用する有機溶媒の量は、原料となる植物（海藻）に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
尚、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。

本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。

また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。

上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。

油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。

本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。

本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができ、クリーム、乳液、化粧水等の形態とすることができる。

次に実施例（製造例）を挙げて本発明を詳細に説明する。

製造例１
ジャトバの実（成熟した乾燥品）を２０メッシュ以下となるようにミルで粉砕し、そのうち、５０．０ｇをはかりとり、５０％エタノール水溶液４５０ｇを加え、撹拌しつつ１０時間抽出した。
これを遠心分離（２０００Ｇ、１５分間）し、その上澄みを濾過した。（Ｎｏ５Ｃ）
濾液をエバボレーターで濃縮したのち、凍結乾燥した。

製造例２
白朮（日本薬局方ビャクジュツ末栃本天海堂）を１００ｇに精製水５００mlを加え、２時間湯煎（水温９０℃）で抽出した。放冷したのち、濾過した（Ｎｏ５Ｃ）のち、凍結乾燥した。

製造例３
イシゲ５０ｇ（湿重量）に精製水５００ｇを加え、ミキサーを用いてホモジナイズした。これを遠心分離し濾液を得た。この濾液に４倍量のエタノール２Lを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間後に濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、これを凍結乾燥した。

確認試験（メラノサイトのデンドライト伸長抑制試験）
４ｗｅｌｌラブテック２チェンバースライドシステム(nunc製)に正常ヒトメラニン細胞（クラボウ製）を７００cell/well播種する。２４時間培養した後、増殖因子を含まない、基礎培地であるDermaLife M(登録商標)(Lifeline Cell Technology製)へ交換する。
更に２４時間培養したのち、試験品および、樹状突起伸長因子としてＹ−２７６３２（和光純薬）を含むDermaLife Mへ交換し、２４時間培養した。（Ｙ−２７６３２は終濃度５０uMになるように濃度を調整した）
２４時間後、培地を除去しActi-Stain 488 phalloidin(Cytoskeleton,Inc)にて細胞骨格を染色し、DAPI（同仁化学）にて核を染色した。
染色後、画像解析ソフト(Image J)にてメラノサイトの樹状突起の長さを計測し、サンプルにおける樹状突起の長さを比較した。

下記のＭＴＴ活性の確認試験を行い、製造例が細胞の存在に影響のないことを確認を行い、製造例が細胞の存在に影響のない範囲の確認試験（メラノサイトのデンドライト伸長抑制試験）の結果を以下の図１〜３に示す。
24well plateで、確認試験と同一条件で培養した後、培地を交換し、１/１０量の５mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromideを添加してさらに４時間培養後、等量の0.04N HClを含むイソプロパノールを添加して完全に溶解する。この溶液をリファレンス波長630nm、測定波長560nmで測定して、コントロールに対する相対値として算出した。

製造例１のメラノサイトのデンドライト伸長抑制試験の結果であり、終濃度０．０００５％よりメラノサイトのデンドライトの伸長を抑制することがわかった。製造例２のメラノサイトのデンドライト伸長抑制試験の結果であり、終濃度０．０００５％よりメラノサイトのデンドライトの伸長を抑制することがわかった。製造例３のメラノサイトのデンドライト伸長抑制試験の結果であり、終濃度０．０００５％でメラノサイトのデンドライトの伸長を抑制することがわかった。

製造例１〜３をそのまま外用剤としても利用できるが、これに他の原料を配合して外用剤を作成することも可能である。

外用剤１
オリーブ油０．５
ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタンモノステアレート２．０
ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油２．０
エタノール１０．０
精製水８０．０
製造例１０．３
パラオキシ安息香酸メチル０．２

外用剤２
オリーブ油０．５
ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタンモノステアレート２．０
ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油２．０
エタノール１０．０
精製水８０．０
製造例３０．３
パラオキシ安息香酸メチル０．２

外用剤３
Ａ
スクワラン２０．０
オリーブ油２．０
ミンク油１．０
ホホバ油５．０
ミツロウ５．０
セトステアリルアルコール２．０
グリセリンモノステアレート１．０
ソルビタンモノステアレート２．０
Ｂ
精製水５１．０
製造例２０．７
ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタンモノステアレート２．０
ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油１．０
グリセリン５．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０
パラオキシ安息香酸メチル０．１

外用剤４
Ａ
スクワラン２０．０
オリーブ油２．０
ミンク油１．０
ホホバ油５．０
ミツロウ５．０
セトステアリルアルコール２．０
グリセリンモノステアレート１．０
ソルビタンモノステアレート２．０
Ｂ
精製水５１．０
製造例１０．７
ジプロピレングリコール２．０
グリセリン３．０
ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタンモノステアレート２．０
ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油１．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０
パラオキシ安息香酸メチル０．１

Claims

イシゲの抽出物を有効成分とするデンドライト伸長抑制剤。（但し、美白用途を除く）
イシゲの抽出物を有効成分とするメラノサイトのデンドライト伸長抑制剤。（但し、美白用途を除く）