KR101303807B1 - 항노화 화장료 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 식물원료를 이용한 항노화 화장료 조성물은, 작살나무 및 층층나무 중 1종 이상의 추출물을 포함하며, 항산화, 미백 및 주름 개선 등 피부노화 방지 효과가 있다.
Description
본 발명은 작살나무 및 층층나무 추출물을 함유하여 항산화, 미백, 주름개선, 항염, 모공수축 및 피지분비억제 효과를 가짐으로써 피부노화를 방지하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 제기관을 온도 및 습도변화와 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해주며, 체온 조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 하고 있다. 그러나 피부를 구성하는 세포 외부로부터 가해진 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스, 영양결핍, 자외선, 환경오염물질, 급격한 기온의 변화등과 같은 세포를 손상시키는 세포손상자극들에 의하여 세포내의 다양한 생화학적 변화가 유도되면 피부 외관에 기미, 주근깨, 잡티, 탄력손실, 각질화, 주름생성과 같은 피부의 노화를 촉진시키게 된다.
피부노화 현상 중 피부의 착색이나 얼룩 등의 색소 침착의 요인으로는 생체 내에서의 대사 장해 등의 내인적 요소와 자외선 등에 의한 외인적 요소를 들수 있는데, 일반적으로 후자의 외인적 요소에 의한 것이 주를 이루며, 이와 같이 피부에 자외선이 조사되는 경우 자외선에 의하여 멜라노사이트가 자극을 받고, 멜라노사이트가 활성화되면 타이로시나이제 효소가 작용하여 피부가 타서 갈색이 되는데, 이것은 멜라닌이 생성되어 과잉광선을 흡수하여 생체를 보호하기 위한 것으로 추측된다. 그래서, 화장품업계에서는 이러한 현상을 방지하기 위해서 멜라노사이트의 활성을 억제하고 타이로시나이제 효소 및 멜라닌 색소의 생성을 억제함으로써 피부의 착색이나 얼룩등의 색소 침착을 방지하는 미백제를 개발하는 것이 종래부터 중요한 이슈가 되고 있다.
또한, 피부노화 현상 중 주름이 형성되는 원인은 자연적 노화에 의한 주름의 생성과 자외선 노출(광노화)에 의한 주름의 생성으로 크게 나눌 수 있으며, 자연적 노화와 광노화에 의한 피부변화와 관련되어 발견되는 공통적인 현상에 관하여 지금까지의 연구결과에 의하면 진피 내 주 단백질인 콜라겐과 엘라스틴의 감소 및 변형이 주름의 생성 및 피부의 탄력저하에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히, 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 콜라겐의 감소가 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다는 연구 결과가 보고 되고 있다. 즉, 콜라겐 감소에 영향을 끼치는 자유 라디칼들은 피부 콜라겐 등의 결합조직 형성파괴, 세포막 기능 저해, DNA 변이 촉진, 단백질 작용 변형, 세포 간 에너지 전이, 신진 대사와 관련된 분자들의 변형을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 피부 노화에 자유 라디칼이 관여한다는 사실은 자유 라디칼을 불활성화시키는 항산화제들을 사용하여 노화 과정을 지연시킬 수 있다는 것을 의미한다. 한편, 정상적인 세포에서도 대사과정 중 어느 정도의 자유 라디칼과 기타 활성 산소 및 과산화물이 생성되며, 이들에 대한 생체방어기구에 이상이 초래되거나 각종 물리적, 화학적 요인들에 의하여 활성산소의 생성이 생체방어계의 용량을 초과하게 될 경우 산화적 스트레스가 야기된다. 따라서, 활성산소를 억제하는 것은 피부노화를 방지하는 화장물 조성료에 중요한 요소이다.
게다가, 이러한 피부노화 현상외에도 피부는 체내에 기질적 변화를 가져오는 화학적 물질, 세균 감염 및 물리적 작용에 의해 발생된 손상 부위를 재생하려는 기전으로 염증반응이 존재하는데, 이러한 염증반응은 유해한 자극, 감명 및 외상등에 의한 염증이 발현되면 국소적으로 염증성 성분과 같은 혈관 활성물질이 유리되어 유발되며, 이와 같은 염증반응이 지속되면 오히려 점막손상을 촉진함에 따라 발적, 발열, 종창, 동통, 기능장애 등의 여러 질환을 발생시키는 원인이 된다.
이러한 피부의 노화 현상 및 지속적인 염증반응를 방지하기 위하여 종래에는 각종 동물, 식물, 미생물 및 유기합성 등에 의해 얻은 생리 활성 물질들이 함유된 화장품을 사용함으로써 피부의 고유기능을 유지시키고 피부세포를 활성화 시켜 피부노화 및 염증반응을 효과적으로 방지하기 위한 노력이 있어 왔다.
그러나, 최근 동물 유래 원료의 성분들에서 인체에 미치는 악영향이 알려짐에 따라 동물유래 원료 사용에 대한 규제가 강해지고 있으며, 인체에 무해한 식물 유래 원료에 대한 관심이 한층 높아지고 있다.
따라서, 식물 원료를 이용하여 항산화, 미백, 및 주름개선과 같은 항노화 효과와 지속적인 염증반응을 방지하는 항염 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공할 수 있는 현실적이고도 활용도가 높은 기술이 절실히 요구되는 실정이다.
따라서, 본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위한 것으로서 작살나무 및 층층나무 추출물을 함유하여 항산화, 미백, 주름개선, 항염, 모공수축 및 피지분비억제와 같은 피부노화 방지 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 실시예에 따른 항노화 화장료 조성물은 작살나무 및 층층나무 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 작살나무 및 층층나무 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 항산화, 미백, 주름개선, 항염, 모공수축 및 피지분비억제와 같은 피부노화 방지 효과가 있다.
본 발명은 작살나무 및 층층나무 추출물을 포함하는 항산화, 미백, 주름개선, 항염, 모공수축 및 피지분비억제와 같은 피부노화 방지 효과를 갖는 항노화 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 함유되는 추출물의 원료인 작살나무는 잎이 마주나기하며 거꿀달걀형, 긴 타원형이고 긴 점첨두, 예형이며 길이와 폭이 각 3 ~ 12㎝ X 2.5 ~ 5㎝로, 양면에 샘이 발달하였으며 표면에 짧은 털이 있고 뒷면에는 별모양 털이 밀생하며, 가장자리에 예리한 톱니가 있고 잎자루 길이는 5 ~ 10㎜로 별모양 털이 밀생한다. 열매는 둥글며 지름 4 ~ 5㎜로 보라색으로 반짝이는 구슬 같고 10월에 보라색으로 익으며 여러개씩 뭉쳐서 액생한 채 오래도록 남아 있다. 꽃은 취산꽃차례로 잎겨드랑이에 달리며 폭 1.5 ~ 3㎝로, 꽃은 8월에 피고 연한 보라색이며 꽃부리통은 길이 2 ~ 2.5㎜로 겉에 잔털과 샘이 있고 4개의 수술과 1개의 암술이 있다. 줄기는 둥글며, 별모양 털이 있으나 점차 없어진다. 원산지는 한국으로 평안남도 및 강원도 이남과 일본, 중국 등에 분포한다.[국가생물종지식정보시스템] 잎, 줄기 및 뿌리를 자주(紫珠)라고 하며, 어혈, 장출혈, 자궁출혈, 호흡기감염증, 편도선염을 치료한다. 사용법은 잎, 줄기, 뿌리 10g에 물 700㎖를 넣고 달인 액을 반으로 나누어 아침 저녁으로 복용한다.[한국의 약용식물, 배기환]
본 발명에 따른 화장료 조성물에 함유되는 추출물의 원료인 층층나무는 잎이 어긋나기하며 달걀형이고 급한 점첨두, 원저이며 길이와 폭이 각 5 ~ 12㎝ X 3 ~ 8㎝로, 표면은 녹색이며 어릴 때 복모가 약간 있고, 뒷면은 흰색으로 잔털 밀생하며 가장자리가 밋밋하다. 측맥은 5 ~ 8 쌍이고 잎자루 길이 3 ~ 5㎝로 붉은빛이 돌고 털은 점차 없어진다. 열매는 핵과로 둥글며 지름 6 ~ 7㎜로 검은색이며 8월 말 ~ 10월 초에 성숙한다. 꽃은 산방상꽃차례로 지름 5 ~ 12㎝로 세가지 끝에 달리며, 털이 있거나 없고 꽃대 길이는 1 ~ 3㎝이다. 꽃은 5월에 백색으로 핀다. 꽃잎은 넓은 피침형이며 꽃받침통과 더불어 겉에는 털이 밀생하고 수술대는 길이 5㎜이고 꽃밥은 정자형(丁字形)으로 달린다. 꽃잎과 수술이 각각 4개씩이다. 줄기는 높이가 20m에 달하고 나무껍질은 얕게 세로로 홈이 져서 터지며 가지는 계단상으로 돌려나기하며 층을 형성하여 수평으로 퍼지고 붉은빛이 돈다. 어린줄기와 가지는 붉은 빛의 윤채가 나고 껍질눈이 산재한다. 낙엽 후 일년생가지는 겨울동안 붉은빛을 띠는 것이 특징이다. 우리나라 전국 및 일본에 분포한다.[국가생물종지식정보시스템] 열매 또는 가지를 등대수(燈臺樹)라고 하며, 열매는 해수에, 줄기는 거풍, 요통에 효능이 있다. 사용법은 열매 또는 줄기 15g에 물 700㎖를 넣고 달인 액을 반으로 나누어 아침 저녁으로 복용한다. 가지가 수평으로 퍼져 층을 이룬것 같다하여 층층나무라고 한다.[한국의 약용식물, 배기환]
본 발명에서 작살나무 및 층층나무는 경동시장과 같은 재래 시장과 같은 오프라인 또는 인터넷 마켓 등으로도 구입할 수 있다.
본 발명에서 작살나무 및 층층나무는 정제수로 깨끗이 세척하여 사용하며, 추출 방법에 따라 건조시켜 세절하거나 가루로 만들어 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 이들의 혼합용매(예를들어, 함수알코올, 함수글리세린 등 2개의 용매혼합 또는 2개 이상의 용매혼합)중에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출하여 제조되며, 또한, 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올 또는 함수알코올, 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 용매로 추출되는 것이 바람직하다. 여기서, 탄소수 1 내지 4의 알코올은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, iso-프로판올, n-부탄올, tert-부탄올 등이 있다.
이들 추출용매 중 함수 에탄올이 가장 바람직하며, 함유된 물의 양은 30 내지 90(wt/wt)% 이내가 바람직하며, 70(wt/wt)%가 보다 더 바람직하다.
본 발명의 작살나무 및 층층나무 추출물은 통상의 기술자에게 알려진 공지된 추출법에 의해 제조된다. 예를 들어, 본 발명에서의 작살나무 및 층층나무 건조물을 세절하고, 그 건조 중량의 1~50배 부피량의 물, 탄소수 1~4의 무수 알코올 또는 함수 알코올중에서 선택된 추출용매를 부가하여 4∼30℃에서 3∼20일간 침적시켜 유효성분을 추출한 후, 추출용매를 감압농축기로 농축하여 수득된다. 또한, 본 발명에서의 와송 건조물을 분쇄하여, 그 건조 중량의 1~30배 부피량의 물, 탄소수 1~4의 무수 알코올 또는 함수알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 사용하며, 이어서 용매가 증발되는 것을 방지하기 위하여 냉각 콘덴서를 구비한 추출기로 30∼100℃에서 1∼48시간 동안 가열 추출하거나 5∼30℃에서 1~10일간 침적시켜 유효성분을 추출하고, 추출 용매를 감압농축기로 농축하여 수득된다.
또한, 위에서 열거한 추출용매에 공지된 초음파 추출법 등을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 작살나무 및 층층나무 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올로 추출하는 것이 바람직하며, 그 추출온도는 50 내지 100℃이 바람직하다.
본 발명의 작살나무 및 층층나무 추출물은 추출 용매로 추출한 추출액을 감압 농축한 농축액, 농축액을 동결 건조한 분말 또는 농축액을 분무 건조하여 건조한 분말 일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서 작살나무 및 층층나무 추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상 형태로 0.001중량%~10중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.01중량%∼5중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 화장수, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 유화형 화운데이션, 고체형 화운데이션, 자외선 차단 크림 등의 제형을 가질 수 있다. 또한, 목욕세정제, 샴푸, 비누 등의 제형일 수도 있다.
또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 작살나무 및 층층나무 추출물 외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 예를 들어, 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 작살나무 및 층층나무 추출물 이외에 항산화, 미백, 주름개선, 항염, 모공수축 및 피지분비억제와 같은 피부노화 방지 효과를 나타내는 다른 유효 성분을 1가지 이상 포함할 수 있다.
이하, 실시예 및 제형예를 들어 본 발명에 따른 항노화 화장료 조성물의 구성 및 효과를 상세히 설명한다.
<실시예 1>
작살나무 추출물 분말의 제조
경동시장에서 구입한 작살나무를 정제수로 세척한 후, 건조시킨 작살나무 100g에 증류수 1㎏을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃~100℃로 2시간 끓여서 추출한다. (이 과정을 3회 반복하여 추출한다.) 이 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 1주일간 실온에서 방치하여 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 40~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이드라이어(모델명:B-290, BUCHI사 제품)를 다음 조건으로 이용하여 건조시킨 표제의 추출 분말 6g을 얻었다.
- Inlet 온도 : 180 ℃
- Aspiratoe 효율 : 100% (35㎤/hr)
- Pump 효율 : 25% (7.5㎖/min)
- Nozzle Cleaner 4
- Rotameter : 30㎜ (357Liter/hr)
<실시예 2 내지 5>
추출 용매에 따른 작살나무 추출물 분말의 제조
추출 용매를 달리하여 실시예 1의 방법과 동일한 방법으로 작살나무 추출물 분말을 제조 하였다. 추출 용매 비율은 하기 [표 1] 과 같다.
| 구분 | 추출 용매 | 분말 (g) |
| 실시예 2 | 30% 에탄올 | 6.2 |
| 실시예 3 | 50% 에탄올 | 6.5 |
| 실시예 4 | 70% 에탄올 | 7.0 |
| 실시예 5 | 100% 에탄올 | 5.0 |
실시예 2 내지 5의 결과 70% 에탄올로 추출하였을 때, 분말 수득률이 높은 것을 확인하였다.
<실시예 6>
층층나무 추출물 분말의 제조
경동시장에서 구입한 층층나무를 정제수로 세척한 후, 건조시킨 층층나무 100g을 증류수 1㎏을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃~100℃로 2시간 끓여서 추출한다. (이 과정을 3회 반복하여 추출한다.) 이 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 1주일간 실온에서 방치하여 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 40~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이드라이어(모델명:B-290, BUCHI사 제품)를 다음 조건으로 이용하여 건조시킨 표제의 추출 분말 4g을 얻었다.
- Inlet 온도 : 180 ℃
- Aspiratoe 효율 : 100% (35㎤/hr)
- Pump 효율 : 25% (7.5㎖/min)
- Nozzle Cleaner 4
- Rotameter : 30㎜ (357Liter/hr)
<실시예 7 내지 10>
추출 용매에 따른 층층나무 추출물 분말의 제조
추출 용매를 달리하여 실시예 6의 방법과 동일한 방법으로 층층나무 추출물 분말을 제조 하였다. 추출 용매 비율은 하기 [표 2] 와 같다.
| 구분 | 추출 용매 | 분말 (g) |
| 실시예 7 | 30% 에탄올 | 5.0 |
| 실시예 8 | 50% 에탄올 | 5.1 |
| 실시예 9 | 70% 에탄올 | 5.5 |
| 실시예 10 | 100% 에탄올 | 3.8 |
실시예 7 내지 10의 결과 70% 에탄올로 추출하였을 때, 분말 수득률이 높은 것을 확인하였다.
<실시예 11 내지 15>
추출 비율에 따른 작살나무 및 층층나무 추출물 분말의 제조
작살나무 및 층층나무의 중량비를 하기 [표 3]과 같이 조절하여 실시예 9와 동일한 추출용매를 사용하고 실시예 6의 방법과 동일한 방법으로 실시예 11 내지 15의 분말을 제조 하였다.
| 구분 | 혼합 비율 (작살나무 : 층층나무) |
분말 |
| 실시예 11 | 1 : 1 (50.0g : 50.0g) | 7.0 |
| 실시예 12 | 2 : 1 (66.7g : 33.3g) | 6.6 |
| 실시예 13 | 3 : 1 (75.0g : 25.0g) | 6.7 |
| 실시예 14 | 1 : 2 (33.3g : 66.7g) | 6.2 |
| 실시예 15 | 1 : 3 (25.0g : 75.0g) | 6.0 |
실시예 11 내지 15의 결과 작살나무와 층층나무의 비율이 1:1 일 때, 분말 수득률이 높은 것을 확인하였다.
<실험예 1>
XanthineOxidase저해효과확인
Xanthine oxidase에 의해 생성된 superoxide radical의 소거 활성을 측정하는 방법으로 Nitro-Blue Tetrazolium(NBT) 환원법을 사용하여 측정하였다.
0.4mM xanthine과 0.24mM NBT를 포함하는 0.1M potassium phosphate buffer(pH7.5) 1㎖과 0.1M potassium phosphate buffer(pH7.5) 0.6㎖에 시료 0.1㎖을 혼합한 후 xanthine oxidase(0.05U/㎖) 1㎖을 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨다. 1M HCl 1㎖을 첨가하여 반응을 종결시킨 후, 520㎚에서 흡광도를 측정하였다.
XO 억제율은 하기 [식 1]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 4]와 같다.
[식 1]
B (Blank) : 0.4mM xanthine을 포함한 0.1M potassium phosphate buffer (pH7.5)와 1M HCl만 첨가한 반응액의 흡광도
C (Control) : 시료 대신 0.24mM NBT를 첨가한 반응액의 흡광도
S (Sample) : 시료를 첨가한 반응액의 흡광도
| 구분 | NBT 환원 저해능 (%) | |||||
| 0.1% | 0.2% | 0.5% | 1.0% | 2.0% | 5.0% | |
| 대조군 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 실시예 1 | 5 | 10 | 24 | 39 | 50 | 62 |
| 실시예 2 | 8 | 13 | 27 | 42 | 57 | 70 |
| 실시예 3 | 11 | 22 | 36 | 48 | 60 | 75 |
| 실시예 4 | 15 | 26 | 43 | 55 | 69 | 81 |
| 실시예 5 | 5 | 9 | 17 | 29 | 44 | 61 |
| 실시예 6 | 5 | 7 | 11 | 24 | 39 | 56 |
| 실시예 7 | 6 | 11 | 20 | 32 | 50 | 69 |
| 실시예 8 | 7 | 13 | 29 | 40 | 55 | 73 |
| 실시예 9 | 11 | 20 | 33 | 45 | 61 | 77 |
| 실시예 10 | 4 | 5 | 10 | 21 | 35 | 50 |
| 실시예 11 | 27 | 38 | 53 | 64 | 75 | 90 |
| 실시예 12 | 13 | 29 | 40 | 52 | 69 | 80 |
| 실시예 13 | 11 | 20 | 34 | 46 | 60 | 76 |
| 실시예 14 | 23 | 33 | 47 | 60 | 70 | 82 |
| 실시예 15 | 12 | 18 | 31 | 44 | 56 | 73 |
[표 4]의 결과 실시예 11이 Xanthine Oxidase 저해 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인 하였다.
<실험예 2>
Superoxide Dismutase (SOD)유사활성효과확인
SOD 유사활성은 마크룬드 등(Marklund S. et al. Eur. J. Biolchem., 47, p468, 1975)의 방법에 따라 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉매하는 피로갈롤(pyrogallol)의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 시료 0.2㎖에 Tris-HCl buffer (50mM Tris [hydroxymethyl] amino methane, 10mM EDTA, pH 8.5) 3㎖과 7.2mM 피로갈롤 0.2㎖을 첨가하여 25℃에서 10분간 반응 후, 1N HCl 1㎖을 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 중 산화된 피로갈롤 양은 420nm에서 흡광도를 측정하였다.
SOD 유사활성은 하기 [식 2]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 5]에 나타내었다.
[식 2]
| 구분 | SOD 유사활성 (%) | |||||
| 0.1% | 0.2% | 0.5% | 1.0% | 2.0% | 5.0% | |
| SOD대조군 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 실시예 1 | 8 | 11 | 20 | 33 | 47 | 61 |
| 실시예 2 | 9 | 20 | 31 | 47 | 59 | 71 |
| 실시예 3 | 13 | 27 | 40 | 52 | 64 | 75 |
| 실시예 4 | 17 | 30 | 44 | 58 | 70 | 82 |
| 실시예 5 | 7 | 10 | 14 | 26 | 38 | 50 |
| 실시예 6 | 6 | 10 | 20 | 32 | 48 | 63 |
| 실시예 7 | 10 | 19 | 27 | 40 | 54 | 76 |
| 실시예 8 | 12 | 26 | 40 | 56 | 70 | 83 |
| 실시예 9 | 23 | 35 | 47 | 61 | 74 | 88 |
| 실시예 10 | 6 | 7 | 10 | 22 | 36 | 52 |
| 실시예 11 | 28 | 40 | 51 | 63 | 77 | 90 |
| 실시예 12 | 19 | 31 | 44 | 59 | 71 | 82 |
| 실시예 13 | 11 | 19 | 28 | 41 | 56 | 70 |
| 실시예 14 | 26 | 39 | 50 | 63 | 73 | 83 |
| 실시예 15 | 31 | 43 | 52 | 66 | 73 | 85 |
[표 5]의 결과 실시예 11이 SOD 유사 활성 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인 하였다.
<실험예 3>
아질산염 (NO) 소거 활성 효과 확인
아질산염(NaNO2)소거작용은 카토 등 (Kato H. et al., Agric. Biol. Chem. 51, p1333, 1987)의 방법에 따라 측정하였다. 1mM의 아질산나트륨(NaNO2)용액 2㎖에 시료를 첨가하고, 0.1N HCl (pH 1.2)과 0.2M 구연산염 완충용액(Citrate buffer)를 사용하였다. 반응 용액의 pH를 각각 1.2, 3.0, 6.0으로 조정한 후, 반응 용액의 부피를 10㎖으로 하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 각각 1㎖씩 취하여 2% 아세트산(acetic acid) 5㎖을 첨가하였다. 그리고 그리스시약(Griess Reagent, A:B=1:1, A:1% sulfanilic acid in 30% acetic acid, B:1% naphthylamine in 30% acetic acid) 0.4㎖ 첨가한 후 실온에서 15분간 반응시켰다. 반응 후 520nm에서 흡광도를 측정하였다.
아질산염 소거 활성은 하기 [식 3]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 6]에 나타내었다.
[식 3]
| 구분 | 아질산염 소거 활성 (%) | |||||
| 0.1% | 0.2% | 0.5% | 1.0% | 2.0% | 5.0% | |
| 대조군 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 실시예 1 | 11 | 20 | 25 | 40 | 49 | 62 |
| 실시예 2 | 16 | 24 | 32 | 48 | 61 | 71 |
| 실시예 3 | 20 | 28 | 37 | 50 | 66 | 79 |
| 실시예 4 | 24 | 32 | 44 | 53 | 70 | 84 |
| 실시예 5 | 6 | 11 | 20 | 29 | 40 | 52 |
| 실시예 6 | 5 | 10 | 17 | 25 | 41 | 53 |
| 실시예 7 | 7 | 13 | 24 | 36 | 47 | 61 |
| 실시예 8 | 8 | 17 | 35 | 43 | 60 | 74 |
| 실시예 9 | 18 | 27 | 40 | 51 | 69 | 80 |
| 실시예 10 | 5 | 8 | 11 | 21 | 30 | 44 |
| 실시예 11 | 25 | 38 | 49 | 61 | 74 | 85 |
| 실시예 12 | 12 | 26 | 39 | 52 | 69 | 80 |
| 실시예 13 | 15 | 28 | 40 | 52 | 70 | 81 |
| 실시예 14 | 7 | 12 | 31 | 46 | 62 | 76 |
| 실시예 15 | 6 | 9 | 27 | 41 | 57 | 70 |
[표 6]의 결과 실시예 11이 아질산염 (NO) 소거 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인 하였다.
<실험예 4> NO 생성 억제 효과 확인
항염 활성 효과를 확인하기 위해 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO(Nitric Oxide) 생성 억제에 대한 효과를 알아보았다. 일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.
Raw 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5 X 105cell/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 시료를 처리하고 30분 배양 후 LPS(Lipopolysaccharide, 1㎍/㎖)를 첨가하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 NO detection kit (iNtRON)를 이용하여 측정한 값을 하기 계산식으로 계산하여 나타내었다. 대조군은 LPS를 단독으로 처리한 실험군으로 하였다.
NO 생성 억제율은 하기 [식 4]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 7]에 나타내었다.
[식 4]
| 구분 | NO 생성 억제율 (%) | |||
| 0.5% | 1.0% | 2.0% | 5.0% | |
| 대조군 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 실시예 1 | 9 | 18 | 30 | 48 |
| 실시예 2 | 11 | 23 | 36 | 55 |
| 실시예 3 | 14 | 27 | 40 | 61 |
| 실시예 4 | 23 | 35 | 49 | 64 |
| 실시예 5 | 8 | 17 | 27 | 41 |
| 실시예 6 | 10 | 18 | 31 | 51 |
| 실시예 7 | 9 | 21 | 35 | 56 |
| 실시예 8 | 20 | 33 | 47 | 63 |
| 실시예 9 | 27 | 40 | 52 | 71 |
| 실시예 10 | 9 | 18 | 28 | 42 |
| 실시예 11 | 33 | 51 | 66 | 80 |
| 실시예 12 | 28 | 43 | 60 | 74 |
| 실시예 13 | 23 | 37 | 54 | 70 |
| 실시예 14 | 30 | 45 | 61 | 76 |
| 실시예 15 | 31 | 45 | 62 | 77 |
[표 7]의 결과 실시예 11이 NO 생성 억제 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인 하였다.
<실험예 5> 프로스타글란딘생성억제효과확인
염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 프로스타글란딘 E2(prostaglandinE2,PGE2)생성 억제 효과를 알아보았다. Cyclooxygenase(COX)는 아라키돈산(arachidonic acid)을 프로스타글란딘으로 전환하는 효소로 COX-1과 COX-2로 분류된다. COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장기능의 유지 등 정상적인 생체기능에 작용하며, COX-2는 염증매개 물질인 PGE2를 형성시킨다. PGE2는 염증반응, 면역반응 그리고 혈관형성(angiogenesis)을 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.
Raw 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5 X 105cell/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 시료를 처리하고 30분 배양 후 LPS(Lipopolysaccharide, 1㎍/㎖)를 첨가하여 24시간 배양하였다. 생성된 PGE2의 양은 PGE2ELISAkit(R&Dsystems,Inc,USA)를 이용하여 측정한 값을 하기 계산식으로 계산하여 나타내었다. 대조군은 LPS를 단독으로 처리한 실험군으로 하였다.
PGE2 생성 억제율은 하기 [식 5]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 6]에 나타내었다.
[식 5]
| 구분 | PGE2생성 억제율 (%) | |||
| 0.5% | 1.0% | 2.0% | 5.0% | |
| 대조군 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 실시예 1 | 11 | 27 | 45 | 59 |
| 실시예 2 | 19 | 36 | 53 | 67 |
| 실시예 3 | 27 | 43 | 60 | 73 |
| 실시예 4 | 38 | 55 | 69 | 81 |
| 실시예 5 | 9 | 21 | 33 | 51 |
| 실시예 6 | 10 | 24 | 35 | 55 |
| 실시예 7 | 10 | 24 | 42 | 63 |
| 실시예 8 | 13 | 32 | 51 | 71 |
| 실시예 9 | 33 | 52 | 66 | 80 |
| 실시예 10 | 8 | 19 | 30 | 44 |
| 실시예 11 | 44 | 60 | 74 | 89 |
| 실시예 12 | 39 | 53 | 70 | 86 |
| 실시예 13 | 37 | 49 | 68 | 85 |
| 실시예 14 | 31 | 45 | 61 | 80 |
| 실시예 15 | 25 | 40 | 56 | 74 |
[표 8]의 결과 실시예 11이 PGE2 생성 억제 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인 하였다.
<실험예 6> TNF-α 생성 억제 효과 확인
항염 활성 효과를 확인하기 위해 초기 염증성 분자 중 하나인 TNF-α 생성 억제 효과를 확인하였다. TNF-α와 같은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 형성은 포스포리파제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로사타글란딘(prostaglandin)으로 바뀌는 과정 및 NO 형성 과정으로 이어지게 된다.
Raw 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5 X 105cell/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 시료를 처리하고 30분 배양 후 LPS(Lipopolysaccharide, 1㎍/㎖)를 첨가하여 24시간 배양하였다. 생성된 TNF-α의 양은 TNF-α ELISA kit (eBioscience, Inc, USA)를 이용하여 측정한 값을 하기 계산식으로 계산하여 나타내었다. 대조군은 LPS를 단독으로 처리한 실험군으로 하였다.
TNF-α 생성 억제율은 하기 [식 6]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 9]에 나타내었다.
[식 6]
| 구분 | TNF-α 생성 억제율 (%) | |||
| 0.5% | 1.0% | 2.0% | 5.0% | |
| 대조군 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 실시예 1 | 8 | 20 | 36 | 51 |
| 실시예 2 | 11 | 29 | 45 | 62 |
| 실시예 3 | 20 | 33 | 51 | 70 |
| 실시예 4 | 24 | 41 | 57 | 74 |
| 실시예 5 | 7 | 17 | 30 | 44 |
| 실시예 6 | 9 | 21 | 34 | 52 |
| 실시예 7 | 20 | 31 | 41 | 60 |
| 실시예 8 | 22 | 34 | 50 | 68 |
| 실시예 9 | 31 | 47 | 61 | 76 |
| 실시예 10 | 8 | 18 | 32 | 45 |
| 실시예 11 | 34 | 51 | 68 | 82 |
| 실시예 12 | 27 | 45 | 60 | 76 |
| 실시예 13 | 25 | 43 | 59 | 74 |
| 실시예 14 | 24 | 41 | 58 | 75 |
| 실시예 15 | 21 | 39 | 56 | 75 |
[표 9]의 결과 실시예 11이 TNF-α 생성 억제 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인 하였다.
<실험예 7> 자외선에 의해 유발되는 염증반응 억제 확인
사람 피부각질세포(human keratinocyte)를 페니실린(100 IU/ml), 스트렙토마이신(100 g/ml), 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM배지를 넣고 37℃를 유지하며 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 수득된 피부각질세포를 6 well plate에 3 X 105 cell/well로 분주한 다음 24시간 배양하였다. 배양 후 세포에 25mJ/㎠ 량의 자외선을 조사한 후 시료를 첨가한 후 24시간 추가 배양하였다. 생성된 TNF-α와 IL-1α의 양은 ELISA kit (eBioscience, Inc, USA)를 이용하여 측정한 값을 하기 계산식으로 계산하여 나타내었다. 대조군은 자외선를 단독으로 처리한 실험군으로 하였다.
TNF-α 및 IL-1α 생성 억제율은 상기 [식 6]과 하기의 [식 7]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 [표 10]과 [표 11]에 나타내었다.
[식 7]
| 구분 | TNF-α 생성 억제율 (%) | |||
| 0.5% | 1.0% | 2.0% | 5.0% | |
| 대조군 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 실시예 1 | 15 | 28 | 37 | 51 |
| 실시예 2 | 12 | 25 | 41 | 60 |
| 실시예 3 | 18 | 33 | 50 | 66 |
| 실시예 4 | 23 | 41 | 56 | 71 |
| 실시예 5 | 7 | 20 | 31 | 44 |
| 실시예 6 | 10 | 22 | 35 | 51 |
| 실시예 7 | 19 | 30 | 45 | 60 |
| 실시예 8 | 27 | 36 | 52 | 69 |
| 실시예 9 | 30 | 48 | 61 | 77 |
| 실시예 10 | 6 | 16 | 27 | 41 |
| 실시예 11 | 33 | 51 | 68 | 81 |
| 실시예 12 | 21 | 37 | 54 | 70 |
| 실시예 13 | 14 | 32 | 51 | 66 |
| 실시예 14 | 25 | 40 | 57 | 72 |
| 실시예 15 | 29 | 46 | 60 | 74 |
[표 10]의 결과 실시예 11이 TNF-α 생성 억제 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인 하였다.
| 구분 | IL-1α 생성 억제율 (%) | |||
| 0.5% | 1.0% | 2.0% | 5.0% | |
| 대조군 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 실시예 1 | 7 | 14 | 30 | 51 |
| 실시예 2 | 9 | 26 | 39 | 60 |
| 실시예 3 | 12 | 31 | 47 | 66 |
| 실시예 4 | 20 | 37 | 53 | 71 |
| 실시예 5 | 27 | 44 | 60 | 75 |
| 실시예 6 | 5 | 7 | 21 | 40 |
| 실시예 7 | 10 | 26 | 40 | 61 |
| 실시예 8 | 13 | 32 | 48 | 68 |
| 실시예 9 | 30 | 47 | 61 | 77 |
| 실시예 10 | 6 | 10 | 23 | 41 |
| 실시예 11 | 36 | 50 | 68 | 83 |
| 실시예 12 | 18 | 31 | 50 | 71 |
| 실시예 13 | 15 | 24 | 43 | 66 |
| 실시예 14 | 24 | 38 | 55 | 74 |
| 실시예 15 | 30 | 44 | 61 | 80 |
[표 11]의 결과 실시예 11이 IL-1α 생성 억제 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인 하였다.
<실험예 8>
세포내 콜라겐 생성 효과 확인
Humanneonatal foreskin에서 유래한 Normal Human Primary Dermal Fibroblasts-Neonatal (HDF-N)를 이용하여 procollagen 합성 정도를 측정함으로써 주름개선 효과를 판단하였다.
1) 세포 배양 실험방법
HDF-N (ATCC PCS-201-010)를 배양접시 바닥에 접종한 후 0.1% insulin, 0.1% rhFGF, 0.1% gentamicin, 2% FBS를 함유하는 Fibroblast Basal Medium (FBM, Lonza, CC-3131) 배지를 넣고, 37℃를 유지하여 5% CO2를 포함하는 배양기내에서 배양하였다.
2) 세포 독성 측정 실험 방법 (MTT assay)
HDF-N 세포를 96 well plate에 6 X 103 cell/well의 농도로 분주한 다음 세포 배양조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거하고 DPBS로 세척한 뒤, 12시간의 기아상태를 유지시킨 후 검액 및 새로운 배지(media supplement 제외)를 넣고, 24시간 동안 배양하였다. 또 검액 및 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1 반응액을 supplement가 제외된 배지에 1/10로 희석하고 이를 각 well당 100㎕씩 처리하여 1시간동안 반응시킨 후, 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
3) Procollagen 합성능 측정 실험 방법
HDF-N 세포를 48 well plate에 1.4 X 104 cell/well로 분주하고 세포배양 조건에서 24시간 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 24시간 세포의 기아상태를 유지하며 이 후 시험 물질을 세포 배양 배지인 FBM(media supplement 제외)에 희석하여 농도별로 세포에 처리한 후 24시간 배양하였다. 24시간 후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 procollagen type c-peptide(PIP) EIA kit (TAKARA, MK101)를 사용하여 procollagen 양을 측정하였다. 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS로 세척한 후, 1N NaOH로 용해(lysis) 시켜 총 단백질 양을 측정하여 일정 단백질 당 procollagen 합성 양을 측정하였다. 각각의 procollagen 양과 단백질 양은 검량선에 따라 계산하였다.
단백질 측정법 중 Lowry method를 기본으로 한 Bio-rad DC protein kit를 사용하여 측정하였다.
⑴ cell lysate (상층액)을 각각 5㎕씩 96 well plate에 넣는다.
⑵ protein standard 제조 : 1.5㎎/㎖ 농도의 Bovine Serum Albumin (BSA, Bio-rad, 500-0007)을 세포 용해 완충액 (cell lysis buffer)에 8가지 농도로 희석하여 5㎕씩 96 well plate에 넣는다.
⑶ kit에 포함된 reagent A와 reagent S를 40:1의 비율로 섞어서 각 well plate에 25㎕씩 넣는다.
⑷ kit에 포함된 reagent B를 각각 200㎕씩 넣는다.
⑸ 상온에서 15분간 반응시킨 뒤 750㎚에서 흡광도를 측정한다.
⑹ BSA 검량선에 따라 cell의 총 단백질 양을 계산한다.
4) 세포 독성 실험 결과
세포생존률은 하기 [식 8]에 의해 산출되었고,
그 결과는 하기 [표 12]에 나타내었다.
[식 8]
| 구분 | 세포 생존율 (%) | |||
| 0.5% | 1.0% | 2.0% | 5.0% | |
| 대조군 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 실시예 1 | 99 | 100 | 100 | 101 |
| 실시예 2 | 100 | 99 | 101 | 100 |
| 실시예 3 | 101 | 100 | 100 | 99 |
| 실시예 4 | 100 | 100 | 101 | 101 |
| 실시예 5 | 99 | 100 | 101 | 100 |
| 실시예 6 | 99 | 100 | 100 | 101 |
| 실시예 7 | 101 | 100 | 99 | 100 |
| 실시예 8 | 100 | 101 | 100 | 99 |
| 실시예 9 | 100 | 100 | 101 | 102 |
| 실시예 10 | 99 | 100 | 100 | 101 |
| 실시예 11 | 100 | 102 | 103 | 105 |
| 실시예 12 | 100 | 101 | 100 | 102 |
| 실시예 13 | 100 | 100 | 102 | 103 |
| 실시예 14 | 100 | 101 | 100 | 101 |
| 실시예 15 | 100 | 100 | 101 | 102 |
[표 12]의 결과 실시예 1 내지 15 모두 세포독성을 나타내지 않음을 확인 하였다.
5)
Procollagen
합성능
실험 결과
| 구분 | Procollagen/Protein | |||
| 0.5% | 1.0% | 2.0% | 5.0% | |
| 대조군 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
| 실시예 1 | 4.0 | 4.2 | 4.8 | 5.0 |
| 실시예 2 | 4.1 | 4.4 | 5.0 | 5.3 |
| 실시예 3 | 4.2 | 4.7 | 7.1 | 8.4 |
| 실시예 4 | 4.5 | 5.1 | 7.5 | 9.0 |
| 실시예 5 | 4.0 | 4.1 | 4.3 | 4.6 |
| 실시예 6 | 4.0 | 4.4 | 5.0 | 5.3 |
| 실시예 7 | 4.1 | 4.6 | 5.2 | 5.9 |
| 실시예 8 | 4.2 | 4.9 | 7.1 | 9.0 |
| 실시예 9 | 4.7 | 5.4 | 7.7 | 9.5 |
| 실시예 10 | 4.0 | 4.3 | 4.8 | 5.3 |
| 실시예 11 | 4.5 | 7.0 | 8.5 | 10.0 |
| 실시예 12 | 4.2 | 4.8 | 7.1 | 8.5 |
| 실시예 13 | 4.1 | 4.4 | 6.8 | 8.2 |
| 실시예 14 | 4.2 | 4.6 | 6.9 | 9.0 |
| 실시예 15 | 4.4 | 5.1 | 7.3 | 9.3 |
[표 13]의 결과 실시예 11이 Procollagen 생성 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인 하였다.
<
실험예
9>
세포내
멜라닌 생성 억제 효과 확인
B16F10 멜라노사이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도에 근거하여 미백 효과를 판단하였다.
본 실험예에 사용된 B16F10 멜라노사이트는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공 배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교평가 하였다.
1) 세포 배양 실험방법
B16F10 melanoma cell은 37℃, 5% CO2의 조건하에서 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco Co), 100 ㎍/㎖ streptomycin, 100U/㎖ penicillin 이 첨가된 DMEM 배지가 사용되었다. B16F10 melanoma cell 은 75㎠ flask (Falcon, USA) 에서 충분히 증식시킨 후 배양 2~3일 간격으로 배양세포 표면을 phosphate buffer saline (PBS) 용액으로 씻어 준 후 0.25% trypsin-EDTA 용액을 넣고 incubator에서 1~2분 처리 하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 15㎖을 새로운 배양용기에 옮겨 1:20 split ratio로 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다
2) 세포 독성 측정 실험 방법 (MTT assay)
MTT assay법은 MTT [3-(4,5-dimethythiasol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포내로 흡수된 후 미토콘드리아의 succinate dehydrogenase에 의해 formazan을 형성하는데 이 물질의 세포내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포의 생장율을 측정하는 대표적인 방법이다.
B16F10 melanoma 세포를 5 X 104cell/well의 밀도로 96well에 200㎕ 배지와 함께 분주한 뒤, 37℃, 5% CO2incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 72시간 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5㎎/㎖ MTT를 20㎕씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 4시간 동안 37℃, 5% CO2incubator에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200㎕를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.
3) 멜라닌 생성 억제 효과 측정 실험 방법
B16F10 melanoma 세포를 24 well plate에 1.4 X 106cell/well의 밀도로 분주한 뒤, 37℃, 5% CO2incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 배양액을 모두 버리고 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well 에 처리하여 48시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 제거하고 1X PBS 로 2회 세척한 다음 1N NaOH 400㎕를 가하고 60℃ incubator에 넣어서 2시간 동안 반응시켜 melanin을 완전히 용해시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4) 세포 독성 실험 결과
세포생존률은 상기 [식 8]에 의해 산출되었고,
그 결과는 하기 [표 14]에 나타내었다.
| 구분 | 세포 생존율 (%) | |||
| 0.5% | 1.0% | 2.0% | 5.0% | |
| 대조군 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 실시예 1 | 100 | 100 | 99 | 100 |
| 실시예 2 | 99 | 100 | 100 | 99 |
| 실시예 3 | 100 | 99 | 101 | 100 |
| 실시예 4 | 99 | 100 | 100 | 101 |
| 실시예 5 | 99 | 100 | 99 | 100 |
| 실시예 6 | 100 | 101 | 100 | 99 |
| 실시예 7 | 100 | 99 | 100 | 100 |
| 실시예 8 | 100 | 100 | 99 | 100 |
| 실시예 9 | 100 | 99 | 101 | 102 |
| 실시예 10 | 100 | 101 | 100 | 99 |
| 실시예 11 | 101 | 102 | 103 | 105 |
| 실시예 12 | 99 | 100 | 101 | 103 |
| 실시예 13 | 100 | 100 | 101 | 101 |
| 실시예 14 | 100 | 100 | 99 | 101 |
| 실시예 15 | 99 | 100 | 101 | 102 |
[표 14]의 결과 실시예 1 내지 15 모두 세포독성을 나타내지 않음을 확인 하였다.
5) 세포 내 멜라닌 생성 억제 실험 결과
멜라닌 생성 억제율은 하기 [식 9]에 의해 산출되었고,
그 결과는 하기 [표 15]에 나타내었다.
[식 9]
| 구분 | 멜라닌 생성 억제율(%) | |||
| 0.5% | 1.0% | 2.0% | 5.0% | |
| 대조군 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 실시예 1 | 26 | 37 | 50 | 63 |
| 실시예 2 | 30 | 45 | 59 | 72 |
| 실시예 3 | 38 | 54 | 66 | 79 |
| 실시예 4 | 42 | 58 | 71 | 84 |
| 실시예 5 | 15 | 27 | 37 | 50 |
| 실시예 6 | 20 | 29 | 51 | 63 |
| 실시예 7 | 23 | 34 | 55 | 70 |
| 실시예 8 | 28 | 40 | 61 | 74 |
| 실시예 9 | 33 | 49 | 66 | 80 |
| 실시예 10 | 17 | 25 | 40 | 51 |
| 실시예 11 | 45 | 61 | 75 | 87 |
| 실시예 12 | 40 | 52 | 68 | 81 |
| 실시예 13 | 36 | 50 | 65 | 79 |
| 실시예 14 | 38 | 50 | 67 | 80 |
| 실시예 15 | 34 | 48 | 62 | 77 |
[표 15]의 결과 실시예 11이 멜라닌 생성 억제 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인 하였다.
<실험예 10>
모공 수축 효과 확인
피부를 대신할 단백질로 알부민을 사용하여 모공수축효과를 확인하였다.
0.3% 알부민을 0.05M 구연산 버퍼 (pH 4.5)에 용해한 후, 2㎖ 가하고 시료를 1㎖ 가하였다. 5분 동안 교반 후 650nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도의 값이 높을수록 모공 수축 효과가 우수하다는 것을 나타내는 것이다.
결과는 하기 [표 16]에 나타내었다.
| 구분 | 흡광도 | |||
| 0.1% | 0.2% | 0.5% | 1.0% | |
| 대조군 | 0.004 | 0.004 | 0.004 | 0.004 |
| 실시예 1 | 0.041 | 0.091 | 0.175 | 0.341 |
| 실시예 2 | 0.055 | 0.106 | 0.201 | 0.394 |
| 실시예 3 | 0.078 | 0.125 | 0.246 | 0.584 |
| 실시예 4 | 0.097 | 0.194 | 0.408 | 0.872 |
| 실시예 5 | 0.033 | 0.084 | 0.135 | 0.274 |
| 실시예 6 | 0.038 | 0.087 | 0.164 | 0.312 |
| 실시예 7 | 0.059 | 0.101 | 0.193 | 0.337 |
| 실시예 8 | 0.075 | 0.117 | 0.238 | 0.492 |
| 실시예 9 | 0.102 | 0.276 | 0.464 | 0.894 |
| 실시예 10 | 0.027 | 0.074 | 0.117 | 0.248 |
| 실시예 11 | 0.115 | 0.340 | 0.597 | 1.063 |
| 실시예 12 | 0.092 | 0.301 | 0.532 | 1.000 |
| 실시예 13 | 0.084 | 0.243 | 0.477 | 0.916 |
| 실시예 14 | 0.086 | 0.275 | 0.501 | 0.973 |
| 실시예 15 | 0.099 | 0.317 | 0.545 | 1.010 |
[표 16]의 결과 실시예 11이 모공 수축 효과가 다른 실시예보다 우수함을 확인 하였다.
<실험예 11>
피지 분비 억제 효과 확인
20 ~ 50세 연령 중 지성 피부 소유자 10명를 대상으로 피지량을 측정하였다. 이마 왼쪽부분에는 시료 (실시예11, 5%)를 처리하였고, 이마 오른쪽부분에는 대조군을 아침, 저녁으로 1일 2회 도포하여 사용하게 한 후 1주, 2주, 3주 및 4주 후에 피부 유분 측정기(Sebum meter SM 810)를 이용하여 피부의 피지 분비량을 측정하였다. 실험은 20℃, 상대습도 20%에서 이루어졌다. 지성피부인 경우 측정값이 220㎍/㎠ 이상이고 정상 피부인 경우 100 ~ 220㎍/㎠ 이다.
결과는 하기 [표 17]에 나타내었다.
| 시료명 | 0일 | 7일 | 14일 | 21일 | 28일 |
| 대조군 | 240 | 235 | 230 | 225 | 230 |
| 실시예11 | 240 | 220 | 210 | 200 | 190 |
[표 17]의 결과 실시예 11이 모공 수축 효과가 있음을 확인 하였다.
<제형예 1>
작살나무 및 층층나무 혼합추출물을 함유한 화장수 제조
작살나무 및 층층나무 혼합추출물 분말을 함유한 화장수(스킨로션)를 하기의 [표 18]의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.
| 번호 | 원 료 | 함량(중량%) |
| 1 | 작살나무 및 층층나무 혼합추출물 분말(실시예11) | 1.0 |
| 2 | 글리세린 | 3.0 |
| 3 | 부틸렌글리콜 | 2.0 |
| 4 | 프로필렌글리콜 | 2.0 |
| 5 | 폴리옥시에칠렌 경화피마자유 | 1.0 |
| 6 | 에탄올 | 10.0 |
| 7 | 트리에탄올아민 | 0.1 |
| 8 | 방부제 | 미량 |
| 9 | 색소 | 미량 |
| 10 | 향료 | 미량 |
| 11 | 정제수 | 잔량 |
상기 [표 18]에서 11번 물질에 2, 3, 4, 8번 물질을 순서대로 반응용기에 투입하고 교반하여 용해시킨 후, 5번 물질을 60℃ 정도로 가열하여 용해시켰다. 이 후, 10번 물질을 투입하여 용해한 후 11번 물질에 투입하였다. 마지막으로 1, 6, 7, 9번 물질을 투입하여 충분히 교반시킨 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 화장수를 제조하였다.
<제형예 2>
작살나무 및 층층나무 혼합추출물을 함유한 영양 로션 제조
작살나무 및 층층나무 혼합추출물 분말을 함유한 하이드로좀 영양로션을 하기의 [표 19]의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.
| 번호 | 원 료 | 함량(중량%) |
| 1 | 작살나무 및 층층나무 혼합추출물 분말(실시예11) | 1.0 |
| 2 | 밀납 | 1.0 |
| 3 | 폴리솔베이트 60 | 1.5 |
| 4 | 솔비탄 세스퀴올레이트 | 0.5 |
| 5 | 유동 파라핀 | 10.0 |
| 6 | 소르비탄 스테아레이트 | 1.0 |
| 7 | 친유형 모노스테아린산 글리세린 | 0.5 |
| 8 | 스테아린산 | 1.5 |
| 9 | 글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트 | 1.0 |
| 10 | 프로필렌글리콜 | 3.0 |
| 11 | 카르복시폴리머 | 0.1 |
| 12 | 트리에탄올아민 | 0.2 |
| 13 | 방부제 | 미량 |
| 14 | 색소 | 미량 |
| 15 | 향료 | 미량 |
| 16 | 정제수 | 잔량 |
상기 [표 19]에서 10, 11, 13, 16번 물질을 혼합 교반 하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12번 물질을 80 ~ 85℃사이로 가열 용해한 후 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반 하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번 물질을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번 물질을 투입하고 35℃에서 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.
<제형예 3>
작살나무 및 층층나무 혼합추출물을 함유한 영양 세럼 제조
작살나무 및 층층나무 혼합추출물 분말을 함유한 하이드로좀 영양세럼을 하기의 [표 20]의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.
| 번호 | 원 료 | 함량(중량%) |
| 1 | 작살나무 및 층층나무 혼합추출물 분말(실시예11) | 1.0 |
| 2 | 잔탄검 | 0.02 |
| 3 | 부틸렌글리콜 | 10.0 |
| 4 | 포스포리피드 | 10.0 |
| 5 | 하이드록시에틸셀룰로오즈 | 0.1 |
| 6 | 소디움히아루로네이트 | 5.0 |
| 7 | 정제수 | 잔량 |
상기 [표 20]에서 2, 3, 5번 물질을 혼합 교반 하면서 40 ~ 45℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 4, 6, 7번 물질을 제조부에 투입하고 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반 하면서 35℃까지 냉각하고 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양 세럼을 제조하였다.
<
제형예
4>
작살나무 및 층층나무 혼합추출물을 함유한 에센스 제조
작살나무 및 층층나무 혼합추출물 분말을 함유한 하이드로좀 에센스를 하기의 [표 21]의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.
| 번호 | 원 료 | 함량(중량%) |
| 1 | 작살나무 및 층층나무 혼합추출물 분말(실시예11) | 1.0 |
| 2 | 시토 스테롤 | 1.7 |
| 3 | 폴리글리세릴 2-올레이트 | 1.5 |
| 4 | 세라마이드 | 0.7 |
| 5 | 스테아레스-4 | 1.2 |
| 6 | 콜레스테롤 | 1.5 |
| 7 | 디세틸포스페이트 | 0.4 |
| 8 | 농글리세린 | 5.0 |
| 9 | 마카다미아 오일 | 15.0 |
| 10 | 카르복시비닐폴리머 | 0.2 |
| 11 | 산탄검 | 0.2 |
| 12 | 방부제 | 미량 |
| 13 | 향료 | 미량 |
| 14 | 정제수 | 잔량 |
상기 [표 21]에서 2, 3, 4, 5 및 6번 물질을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질을 제조하였다. 이 비이온계 양친매성 지질과 1, 7, 8 및 14번 물질을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루이다이져를 통과시키고 이어 9번 물질을 50 ~ 60℃로 가온하여 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시켰다. 그 후, 10, 11, 12, 13번 물질을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켜 표제의 에센스를 제조하였다.
<실험예10 >
제형안정도확인
작살나무 및 층층나무 혼합추출물을 포함하는 제형예 1 내지 4에서 제조한 제형에 대하여 실내(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(45℃)로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 상 분리)하며, 안정성을 확인 하였다.
| 온도 조건 |
안정성 확인 (변색, 변취 및 분리) | |||
| 제형예 1 | 제형예 2 | 제형예 3 | 제형예 4 | |
| 실내(25℃) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 냉장(4℃) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 항온(45℃) | 0 | 0 | 0 | 0 |
<제형 안정 등급>
0 : 변화 없음, 1 : 미세한 변화, 2 : 변화, 3 : 극심한 변화
상기 [표 22]에서 나타난 바와 같이, 제형예 1 내지 4 제형 모두 , 25℃, 4℃ 및 45℃ 온도 조건하에서 변색, 변취 및 분리 현상이 나타나지 않고 안정하였다.
상기와 같이, 본 발명에 따른 작살나무 및 층층나무 중 1종 이상의 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 항산화, 미백, 및 주름개선 등의 피부노화 방지현상 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 작살나무 및 층층나무 중 1종 이상의 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 지속적인 염증반응을 방지하는 항염 효과가 있다.
지금까지 본 발명에 대해서 상세히 설명하였으나, 그 과정에서 언급한 실시예는 예시적인 것일 뿐이며, 한정적인 것이 아님을 분명히 하고, 본 발명은 이하의 특허청구범위에 의해 제공되는 본 발명의 기술적 사상이나 분야를 벗어나지 않는 범위내에서, 균등하게 대처될 수 있는 정도의 구성요소 변경은 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.
Claims (5)
- 작살나무 및 층층나무 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 작살나무 및 층층나무 추출물은,
물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 하나 이상의 추출용매로 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 작살나무 및 층층나무 추출물은,
조성물의 총 중량에 대하여 0.001 중량% ~ 5 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 작살나무 및 층층나무 추출물의 건조중량비가 1:1로 혼합되는 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
화장료가 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 맛사지크림, 영양세럼, 엣센스 및 팩 중 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 항노화 화장료 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020130038584A KR101303807B1 (ko) | 2013-04-09 | 2013-04-09 | 항노화 화장료 조성물 |
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- 2013-04-09 KR KR1020130038584A patent/KR101303807B1/ko active IP Right Grant
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