JP6175055B2 - ウイルス感染増強特性を有するペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、ウイルスの標的細胞への形質導入効率を改善するためのペプチドおよびその機能的誘導体ならびにその使用に関する。
遺伝子療法アプローチは、組換えウイルスベクターによる標的細胞の形質導入効率が低いことにより妨げられることが多い。レトロウイルスベクター、詳細にはヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)ベースのレンチウイルスベクター(LV)は、遺伝子療法用の有望なビークルである(D'Costa et al.、2009)。これらベクターは、現在、種々の疾患、例えば、免疫不全、神経変性性または神経学的疾患、貧血症、HIV感染症を治療するための臨床適用に用いられている。レトロウイルスベクターの該適用のあるものは、ex vivoにおける特定の標的細胞、例えば、CD34マーカー発現造血幹/前駆細胞の形質導入を利用する。組換えレンチウイルス粒子を使用する際の制限要因は、組換えレンチウイルスベクター粒子の生産中に高感染力価を得る能力である。この制限を回避する１つの方法は、精製工程中にウイルス上清を濃縮することである(Rodrigues et al.、2007)。しかしながら、精製手順は、GALVTR-LV(両種向性ネズミ白血病ウイルス(MLV-A)エンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部と融合したテナガザル白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質で偽型としたLV(Sandrin et al.、2002))の場合のように偽型ウイルス粒子に用いるエンベロープ糖タンパク質に応じてLVを樹立するのが難しい。したがって、多くのレンチウイルスベクター調製物の力価は低く、形質導入効率は限られている。別の制限要因は、レンチウイルスベクター自身の標的細胞と感染する能力である。種々のエンベロープ糖タンパク質、例えば、VSV-G、RD114TR、GALVTRは、偽型レンチウイルスベクターに用いることができ、標的細胞、例えばCD34+細胞に対する種々の感染性を有する(Sandrin et al.、2002)。これらの制限を回避する１つの戦略は、カチオン性ポリマー(例えば、ポリブレン)またはフィブロネクチン断片(例えば、レトロネクチン)などの形質導入手順を最適化するためのコファクターを加えることである(Davis et al.、2004； Pollok et al.、1999)。米国特許No.7,759,467は、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン断片の存在下で造血細胞の感染を含むレトロウイルスによる造血細胞の形質導入効率を増加させる方法を開示している。しかしながら、提案された方法は、少なくとも２つの理由によりすべてが満足できるわけではない。第一に、レトロウイルスの効率を改善するために用いるフィブロネクチン断片は、通常、約270またはそれ以上のアミノ酸を含むため、大きな経済的欠点がある。さらに、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン断片を使用するには、培養プレートをコーティングし、ウイルス上清で固定化フィブロネクチン断片上を前処理する必要がある。これらの２工程は標準化するのが難しく、用いるフィブロネクチン断片およびウイルス上清の濃度に応じて標的細胞の形質導入のある程度の飽和をもたらすことができる(Novelli et al.、1999)。
興味深いことに、SEVIと呼ばれる天然カチオン性ペプチドが最近ヒト精液においてHIV-1感染性の強力なエンハンサーとして同定された(Munch et al.、2007； Roan et al.、2009)。このファミリーのペプチドは、細胞のウイルス感染を促進するヒト前立腺酸性フォスファターゼのアミノ酸残基240〜290の断片について記載した国際出願PCT/EP2007/050727にも開示されている。
国際出願PCT/FR02/01772は、pH7.4で2またはそれ以上の絶対荷電を有し、少なくとも１の親水性部分（ここで、該部分は、pH7.4以下でプロトン化し、細胞に核酸またはタンパク質を導入することができる少なくとも３残基を含む）を含む両親媒性カチオン性ペプチドを開示している。この文献は、ウイルスまたはウイルスベクターの形質導入効率を改善するために該ペプチドを使用することは開示も示唆もしていない。さらに、該両親媒性カチオン性ペプチドは抗生物質活性を有する(Mason et al.、2009)。
本発明者らの目的は、例えば標的細胞への遺伝子の送達を改善するための、ウイルスまたはウイルスベクターの形質導入効率を改善するための手段を提供することであった。ペプチドは、その生分解性特性、サイズの小ささ、特徴付けと大規模生産の簡単さの点で興味深いため、フィブロネクチンおよびSEVIペプチドの代替物を同定するために広範囲に及ぶ研究が行われてきた。
（発明の要約）
本発明者らは、特許請求の範囲に記載の特定のペプチドが、真核細胞、詳細にはヒト原始造血前駆/幹細胞へのウイルスの形質導入効率を改善する特性を有することをみいだした。
本発明者らは、特許請求の範囲に記載の特定のペプチドが、真核細胞、詳細にはヒト原始造血前駆/幹細胞へのウイルスの形質導入効率を改善する特性を有することをみいだした。
ある局面によれば、本発明は、真核細胞へのウイルスまたはウイルスベクターの感染を改善するためのLAH4ペプチドまたはその機能的誘導体の使用に関する。
別の局面によれば、本発明は、真核細胞にウイルスまたはウイルスベクターを感染させるための方法、詳細にはin vitroまたはex vivo法であって、LAH4ペプチドまたはその機能的誘導体の存在下で該細胞とウイルスまたはウイルスベクターを接触させることを含む方法に関する。
別の局面によれば、本発明は、ウイルスベクターによる標的細胞への遺伝子導入効率を増加させる方法、詳細にはin vivoまたはex vivo法であって、標的細胞への核酸配列(例えば、遺伝子、cDNA、siRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドの生成をもたらす配列)の伝達を促進するためにLAH4ペプチドまたはその機能的誘導体の存在下で標的細胞とウイルスベクターを接触させることを含む方法に関する。
さらなる局面によれば、本発明は、対象におけるウイルス感染の診断方法であって、対象の試料を真核細胞およびLAH4ペプチドまたはその機能的誘導体とインキュベーションし、該試料に含まれるあらゆるウイルスを増幅し、増幅されたウイルスを同定することを含む方法に関する。
さらなる局面によれば、本発明は新規LAH4由来ペプチドに関する。
別の局面によれば、本発明は、真核細胞へのウイルスまたはウイルスベクターの感染を促進するための遺伝子療法に用いるためのペプチドに関する。さらに、本発明は、遺伝子療法においてウイルスまたはウイルスベクターと組み合わせて用いるためのペプチドに関する。
（発明の詳細な説明）
本発明の文脈において、用語「LAH4ペプチド」は、配列番号１からなるアミノ酸配列を有するペプチドを表す。
本発明の文脈において、用語「LAH4ペプチド」は、配列番号１からなるアミノ酸配列を有するペプチドを表す。
本明細書で用いている用語「LAH4機能的誘導体」およびそのデクリネーション（declinations）は、その配列がLAH4ペプチドの一次構造に基づいて設計されており、ウイルスまたはウイルスベクターの形質導入効率を改善する能力を有するあらゆるペプチドを意味する。特定の態様において、LAH4機能的誘導体は、GALV、RD114、MLV、VSV、またはGP64エンベロープでキャプシド形成されたウイルスの真核細胞、詳細にはヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、またはハムスター細胞、詳細にはヒトCD34+細胞への形質導入効率を改善する能力を有するペプチドである。具体的態様において、該LAH4機能的誘導体は、GALV エンベロープでキャプシド形成されたウイルスのヒトCD34+細胞への形質導入効率を改善する能力を有するペプチドである。本発明のLAH4機能的誘導体は以下の特徴も含む：
・該ペプチドは、19またはそれ以上のアミノ酸、詳細には20、21またはそれ以上のアミノ酸を含む。特定の態様において、該ペプチドは、20〜30アミノ酸、詳細には21〜26、詳細には24〜26を含む；
・そのN末端が、pH7.4で正に荷電した１またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。特定の態様において、該N末端が、pH7.4で正に荷電した１または２残基を含む。特定の態様において、該アミノ酸残基はリジンおよび/またはアルギニンである；および
・その中心領域は、Schiffer-Edmundsonのホイール表示(Schiffer et al.、1967)に従って表すと、当該分野でよく知られた、該ペプチドの中心ドメインを形成するであろう18アミノ酸残基に対応するらせんを形成する。特定の態様において、該らせんはSchiffer-Edmundsonのホイール表示によればα-らせんである。さらなる態様において、本発明のペプチドは無極性らせんを含むペプチドまたはカチオン性両親媒性ペプチドである。この態様によれば、該ペプチドの中心らせん領域は、らせんを形成する強い傾向を有するアミノ酸残基に対応する(Georgescu et al、2010)。この態様において、該ペプチドの中心らせん領域は、無極性らせんの片側に疎水性のクラスターおよび該らせんの他の側に連続アラニン残基を保持する無極性らせん（ここで、該連続アラニン残基はSchiffer-Edmundsonのホイール表示において60〜180°、選択的に140°の角度で規定される）であるか；または、両親媒性らせんの片側に疎水性アミノ酸残基のクラスター、および該らせんの他の側に２〜４個のヒスチジン残基を有する両親媒性らせん（ここで、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において60°〜180°、選択的に140°の角度の親水性角度を規定する）でありうる。
・該ペプチドは、19またはそれ以上のアミノ酸、詳細には20、21またはそれ以上のアミノ酸を含む。特定の態様において、該ペプチドは、20〜30アミノ酸、詳細には21〜26、詳細には24〜26を含む；
・そのN末端が、pH7.4で正に荷電した１またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。特定の態様において、該N末端が、pH7.4で正に荷電した１または２残基を含む。特定の態様において、該アミノ酸残基はリジンおよび/またはアルギニンである；および
・その中心領域は、Schiffer-Edmundsonのホイール表示(Schiffer et al.、1967)に従って表すと、当該分野でよく知られた、該ペプチドの中心ドメインを形成するであろう18アミノ酸残基に対応するらせんを形成する。特定の態様において、該らせんはSchiffer-Edmundsonのホイール表示によればα-らせんである。さらなる態様において、本発明のペプチドは無極性らせんを含むペプチドまたはカチオン性両親媒性ペプチドである。この態様によれば、該ペプチドの中心らせん領域は、らせんを形成する強い傾向を有するアミノ酸残基に対応する(Georgescu et al、2010)。この態様において、該ペプチドの中心らせん領域は、無極性らせんの片側に疎水性のクラスターおよび該らせんの他の側に連続アラニン残基を保持する無極性らせん（ここで、該連続アラニン残基はSchiffer-Edmundsonのホイール表示において60〜180°、選択的に140°の角度で規定される）であるか；または、両親媒性らせんの片側に疎水性アミノ酸残基のクラスター、および該らせんの他の側に２〜４個のヒスチジン残基を有する両親媒性らせん（ここで、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において60°〜180°、選択的に140°の角度の親水性角度を規定する）でありうる。
特定の態様において、LAH4機能的誘導体のアミノ酸は、アラニン、ヒスチジン、ロイシン、およびリジンからなる群から選ばれる。
本発明の文脈において、用語「両親媒性ペプチド」は、Schiffer-Edmundsonのホイール表示で示される少なくとも１の親水性領域および少なくとも１の異なる疎水性領域を規定（定義）可能な疎水性および親水性アミノ酸を含むペプチドを表す。
本発明の文脈において、用語「無極性らせんペプチド」は、Schiffer-Edmundsonのホイール表示で示される少なくとも１の異なる疎水性領域を規定可能なアラニンおよび疎水性アミノ酸残基を含むペプチドを表す。本発明のペプチド中に存在しうる代表的疎水性残基は、+1.9またはそれ以上のヒドロパシー指数を有する(Kyte et al、1982)。したがって、本発明のペプチド中に存在しうる代表的疎水性残基は、バリン、イソロイシン、およびロイシンを含む。好ましい態様において、該疎水性残基はロイシン残基である。
本発明の文脈において、用語「カチオン性ペプチド」は、pH7.4で絶対正荷電を有するペプチドを表す。好ましい態様において、該正荷電は、アルギニンおよび/またはリジン残基によりもたらされる。遺伝子コードによりコードされないカチオン性天然アミノ酸、例えばオルニチンも、本発明のペプチドにおいて正荷電をもたらすことができる。
別の態様において、正荷電部分はアミノ酸残基と結合する。該正荷電部分には、例えば、当該分野でよく知られたエチレンイミン、スペルミン、およびスペルミジンが含まれる。
本発明に用いるLAH4機能的誘導体ペプチドは、ウイルスまたはウイルスベクターの形質導入効率を増加する特性を有し、例えば実施例に記載の方法を用いて当業者が容易に選択することができる。該LAH4ペプチドのそのような機能的誘導体の同定方法は本明細書に記載されている。特定の態様において、該方法には、
LAH4ペプチドまたはその既知の機能的誘導体（例えば、本明細書に記載の以下の配列番号１〜２７の１つ）、目的とするウイルスまたはウイルスベクター、および目的とする細胞を選択し、
LAH4ペプチドまたはその既知の機能的誘導体を修飾して変異体ペプチドを作成し、
該変異体ペプチドの存在下で該ウイルスまたはウイルスベクターによる細胞の形質導入効率を測定する（ここで、該変異体ペプチドは効率的形質導入を検出するときに機能的誘導体と考えられる）ことが含まれる。
LAH4ペプチドまたはその既知の機能的誘導体（例えば、本明細書に記載の以下の配列番号１〜２７の１つ）、目的とするウイルスまたはウイルスベクター、および目的とする細胞を選択し、
LAH4ペプチドまたはその既知の機能的誘導体を修飾して変異体ペプチドを作成し、
該変異体ペプチドの存在下で該ウイルスまたはウイルスベクターによる細胞の形質導入効率を測定する（ここで、該変異体ペプチドは効率的形質導入を検出するときに機能的誘導体と考えられる）ことが含まれる。
該方法は、該変異体ペプチドを用いて得られるウイルスまたはウイルスベクターの形質導入効率を、該変異体ペプチドなしで得られる該形質導入効率または細胞中のウイルスまたはウイルスベクターの該形質導入効率を改善する能力が知られているペプチドを用いて得られる該形質導入効率と比較する工程も含むことができる。
LAH4ペプチドまたはその既知の機能的誘導体を修飾する工程は、変異体ペプチドを製造するためのLAH4ペプチドまたはその既知の機能的誘導体の第1アミノ酸残基の突然変異などの修飾を含みうる。変異体の態様において、該修飾は、以下で得られるLAH4ペプチドまたはその既知の機能的誘導体の１またはそれ以上のアミノ酸残基の共有結合的修飾を含む。別の変異体では、該修飾は、(該ペプチドの１またはそれ以上の位置、具体的にはすべての位置における)天然のLアミノ酸のDアミノ酸による置換を含む。
そのような方法を用いて試験することができるLAH4ペプチドの典型的な機能的誘導体は配列番号2〜27で示される好ましい機能的誘導体を含む。配列番号2〜27の該機能的誘導体および配列番号1のLAH4ペプチドは、本発明のさらなる機能的誘導体を設計する基準として用いることもできる。さらに、配列番号1〜27のペプチドは、本発明の機能的誘導体の同定方法においてコントロールとして用いることができる。
本発明の特定の態様において、該ペプチドは、アラニン、ロイシン、ヒスチジン、アルギニン、およびリジンからなる群から選ばれるアミノ酸残基を含む。
本発明の使用および方法の特定の態様において、該ペプチドのN末端は、１、２、または３個の正荷電を含む。この態様の特定の変異体において、該ペプチドのN末端の正荷電はアルギニンまたはリジン残基によりもたらされる。さらなる変異体において、正荷電残基は、該N末端の先端にある。さらなる変異体の態様において、第1アミノ酸(例えば、第1、または第1および第2残基、または第1および第3残基など)は中性残基である。
本発明の使用および方法のさらなる態様において、最もC末端の残基はアラニンであり、さらなる局面において該ペプチドのC末端がpH7.4で正に荷電するアミノ酸残基を含む場合はそれらはC末端アラニンの次に位置するか、最もN末端の先端に位置する。
該C末端に正荷電をもたらし得る代表的残基はアルギニンおよび/またはリジン残基である。
本発明の使用および方法の特定の態様において、該ペプチドは４個のヒスチジン残基を含む。具体的態様において、該ヒスチジン残基は、Schiffer-Edmundsonのホイールによって示されるらせん中で隣り合った２対のヒスチジンを形成する。この態様の変異体では、LAH4由来ペプチドは、該ヒスチジン対間の最小角度により規定されるα-らせんの位置にロイシン残基のみまたはアラニン残基のみを含む。
特定の態様では、該ペプチドは、４個のヒスチジン残基を含み、下記配列で示される：
(K/R)a(K/R)b(K/A/L)cLdL(A/H/L)(A/H/L)(A/L)L(A/H/L)(A/H/L)(A/L)(A/L)(A/L)(H/L)(A/L)(H/L)(A/H/L)(A/L)(A/L)(A/H/L)(A/H/L)eLf(K/R)g(K/R)hAi
［式中、a、b、c、およびdは0または1を表し、a+b+c+dは2または3、または好ましくは4に等しい。e、f、g、h、およびiは独立して0または1を表し、e+f+g+h+iは、2または3または4、または好ましくは5に等しい。］。
(K/R)a(K/R)b(K/A/L)cLdL(A/H/L)(A/H/L)(A/L)L(A/H/L)(A/H/L)(A/L)(A/L)(A/L)(H/L)(A/L)(H/L)(A/H/L)(A/L)(A/L)(A/H/L)(A/H/L)eLf(K/R)g(K/R)hAi
［式中、a、b、c、およびdは0または1を表し、a+b+c+dは2または3、または好ましくは4に等しい。e、f、g、h、およびiは独立して0または1を表し、e+f+g+h+iは、2または3または4、または好ましくは5に等しい。］。
ある変異体の態様において、ヒスチジン残基は、酸性pHでプロトン化する他の基で置換され、該他の基はイミダゾール含有基またはジアミノプロピオン酸残基を含む。
本発明で用いる特定のペプチドは、以下の配列番号1〜27で示されるものであり得る：
LAH4: KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA(配列番号1)
LAH4-L1: KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA(配列番号2)
LAH4-L1-dKC: KKALLAHALHLLALLALHLAHALA(配列番号3)
LAH4-L1-R: RRALLAHALHLLALLALHLAHALRRA(配列番号4)
LAH4-L0: KKALLAHALAHLALLALHLALHLKKA(配列番号5)
LAH4-L2: KKALLALALHHLALLALHLAHALKKA(配列番号6)
LAH4-L3: KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA(配列番号7)
LAH4-L4iso: KKALLHLALLHAALLAHHLALALKKA(配列番号8)
LAH4-L5: KKALLHLALLHAALLAHLAALHLKKA(配列番号9)
LAH4-L6iso: KKALLHLALLLAALHAHLAALHLKKA(配列番号10)
LAH4-A1: KKALLAHALHLLAALALHLAHLLKKA(配列番号11)
LAH4-A2: KKALLLAALHHLAALALHLAHLLKKA(配列番号12)
LAH4-A3: KKALLLAALHHLLALAHHLAALLKKA(配列番号13)
LAH4-A4: KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(配列番号14)
LAH4-A5: KKALLHALLAHLAALLHALLAHLKKA(配列番号15)
LAH4-A6iso: KKALLHALLAALLAHLHALLAHLKKA(配列番号16)
LAH4-A4-K1N : KALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(配列番号17)
LAH4-A4-K3N : KKKLLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(配列番号18)
LAH4-A4-dKC : KKALLHAALAHLLALAHHLLALLA(配列番号19)
LAH4-A4-d1aa : KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKK(配列番号20)
LAH4-A4-d2aa : KKLLHAALAHLLALAHHLLALLKK(配列番号21)
LAH4-A4-d2Caa : KKALLHAALAHLLALAHHLLALKK(配列番号22)
LAH4-A4-d3aa : KKLHAALAHLLALAHHLLALLKK(配列番号23)
LAH4-A4-d5aa : KKLHAALAHLLALAHHLLAKK(配列番号24)
LAH2-A6 : KKALLHAALAHLLALAAALLALLKKA(配列番号25)
K2-L10A12-K2 : KKALLAAALAALLALAAALLALLKKA(配列番号26)
LAH4-A4-Leu: KKLLLHALLAHLLALLHHLLALLKKL(配列番号27)。
LAH4: KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA(配列番号1)
LAH4-L1: KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA(配列番号2)
LAH4-L1-dKC: KKALLAHALHLLALLALHLAHALA(配列番号3)
LAH4-L1-R: RRALLAHALHLLALLALHLAHALRRA(配列番号4)
LAH4-L0: KKALLAHALAHLALLALHLALHLKKA(配列番号5)
LAH4-L2: KKALLALALHHLALLALHLAHALKKA(配列番号6)
LAH4-L3: KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA(配列番号7)
LAH4-L4iso: KKALLHLALLHAALLAHHLALALKKA(配列番号8)
LAH4-L5: KKALLHLALLHAALLAHLAALHLKKA(配列番号9)
LAH4-L6iso: KKALLHLALLLAALHAHLAALHLKKA(配列番号10)
LAH4-A1: KKALLAHALHLLAALALHLAHLLKKA(配列番号11)
LAH4-A2: KKALLLAALHHLAALALHLAHLLKKA(配列番号12)
LAH4-A3: KKALLLAALHHLLALAHHLAALLKKA(配列番号13)
LAH4-A4: KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(配列番号14)
LAH4-A5: KKALLHALLAHLAALLHALLAHLKKA(配列番号15)
LAH4-A6iso: KKALLHALLAALLAHLHALLAHLKKA(配列番号16)
LAH4-A4-K1N : KALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(配列番号17)
LAH4-A4-K3N : KKKLLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(配列番号18)
LAH4-A4-dKC : KKALLHAALAHLLALAHHLLALLA(配列番号19)
LAH4-A4-d1aa : KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKK(配列番号20)
LAH4-A4-d2aa : KKLLHAALAHLLALAHHLLALLKK(配列番号21)
LAH4-A4-d2Caa : KKALLHAALAHLLALAHHLLALKK(配列番号22)
LAH4-A4-d3aa : KKLHAALAHLLALAHHLLALLKK(配列番号23)
LAH4-A4-d5aa : KKLHAALAHLLALAHHLLAKK(配列番号24)
LAH2-A6 : KKALLHAALAHLLALAAALLALLKKA(配列番号25)
K2-L10A12-K2 : KKALLAAALAALLALAAALLALLKKA(配列番号26)
LAH4-A4-Leu: KKLLLHALLAHLLALLHHLLALLKKL(配列番号27)。
第2の局面によれば、本発明は新規LAH4由来ペプチドに関する。この第2の局面において、本発明は、19またはそれ以上のアミノ酸、詳細には20、21またはそれ以上のアミノ酸を含むカチオン性両親媒性ペプチドに関する。特定の態様において、該ペプチドは、20〜30アミノ酸、詳細には2〜26、特に24〜26アミノ酸；
pH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むN末端；
Schiffer-Edmundsonのホイール表示において80°〜180°の親水性角度、より具体的には140°の角度を規定する少なくとも２のヒスチジン残基、詳細には４個のヒスチジン残基；
アラニン残基とロイシン残基の間で選ばれる該ペプチドの他のアミノ酸を含む；
ここで、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において、該ペプチドは該ヒスチジン残基により規定される最小角度における最も遠位のヒスチジン残基間にアラニン残基のみを含む。
pH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むN末端；
Schiffer-Edmundsonのホイール表示において80°〜180°の親水性角度、より具体的には140°の角度を規定する少なくとも２のヒスチジン残基、詳細には４個のヒスチジン残基；
アラニン残基とロイシン残基の間で選ばれる該ペプチドの他のアミノ酸を含む；
ここで、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において、該ペプチドは該ヒスチジン残基により規定される最小角度における最も遠位のヒスチジン残基間にアラニン残基のみを含む。
該第2の局面のこれら新規ペプチドは上記LAH4ペプチドの機能的誘導体である。
第２の局面の特定の態様において、該親水性角度は120〜180°、最も好ましい角度は140°である。
第２の局面の特定の態様において、該親水性角度は120〜180°、最も好ましい角度は140°である。
第２の局面の特定の態様によれば、本発明のペプチドのN末端は、pH7.4で１、２、または３（特に１または２）個の正荷電を含む(詳細には、アルギニンまたはリジン残基、好ましくはリジン残基によりもたらされる)。正荷電残基は、好ましくはN末端の先端に、２以上の正荷電残基が存在する場合は好ましくは隣接して位置する。
第２の局面の別の特定の態様において、本発明のペプチドは、pH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むC末端を有する。該C末端に正荷電をもたらしうる代表的残基はアルギニンおよび/またはリジン残基である。
第２の局面のさらなる態様において、該C末端残基はアラニンであり、さらなる局面において、該ペプチドのC末端がpH7.4で正荷電アミノ酸残基を含む場合は、それらはC末端アラニンの次に位置するか、または最もN末端の先端に位置する。
第２の局面の別の特定の態様によれば、本発明のペプチドは４個のヒスチジン残基を含む。具体的態様において、該ヒスチジン残基は、Schiffer-Edmundsonのホイールによって示されるα-らせん中に隣り合った２対のヒスチジンを形成する。
第２の局面のさらなる態様において、該LAH4由来ペプチドは該LAH4ペプチドの異性体であり、すなわち、一次配列中に異なる順番で同数のアラニン、ヒスチジン、ロイシン、およびリジン残基を含む。
この定義に含まれる第２の局面の代表的ペプチドを配列番号11〜25および27に示す。すなわち、本発明は、配列番号11〜25および27からなる群から選ばれるペプチドに関する。
第3の局面において、本発明は、19またはそれ以上のアミノ酸、詳細には20、21またはそれ以上のアミノ酸を含む新規LAH4由来ペプチドに関する。特定の態様において、該ペプチドは、20〜30アミノ酸、詳細には21〜26、詳細には24〜26アミノ酸；
pH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むN末端；
Schiffer-Edmundsonのホイール表示で60〜180°の角度、優先的には140°の角度を示す該らせんの一方の側疎水性アミノ酸残基のクラスターまたは該らせんの他の側に連続アラニン残基を有する無極性らせんを含む。
pH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むN末端；
Schiffer-Edmundsonのホイール表示で60〜180°の角度、優先的には140°の角度を示す該らせんの一方の側疎水性アミノ酸残基のクラスターまたは該らせんの他の側に連続アラニン残基を有する無極性らせんを含む。
この第3の局面の特定の変異体において、該ペプチドの他のアミノ酸は、アラニンおよびロイシン残基間から選ばれる。
第3の局面のこれら新規ペプチドは、上記LAH4ペプチドの機能的誘導体である。
これらペプチドは無極性らせんを含む。すなわち、該らせんのアミノ酸残基は疎水性(または無極性)である。好ましくは本発明のペプチドの無極性らせんに含まれる代表的疎水性アミノ酸残基は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、およびバリン残基、詳細にはアラニンおよびロイシン残基を含む。
これらペプチドは無極性らせんを含む。すなわち、該らせんのアミノ酸残基は疎水性(または無極性)である。好ましくは本発明のペプチドの無極性らせんに含まれる代表的疎水性アミノ酸残基は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、およびバリン残基、詳細にはアラニンおよびロイシン残基を含む。
第３の局面の特定の態様において、疎水性アミノ酸のクラスター中のアミノ酸は、ロイシンおよびアラニン残基からなる群から選ばれる。別の特定の態様において、疎水性アミノ酸のクラスター中のアミノ酸はロイシン残基である。
ペプチドK2-L10A12-K2(配列番号26)は、この定義の代表的ペプチドである。
第３の局面の特定の態様によれば、本発明のペプチドのN末端は、pH7.4で１、２、または３（特に１または２）個の正荷電(詳細にはアルギニンまたはリジン残基、リジン残基によりもたらされる)を含む。
正荷電残基は、好ましくは該N末端の先端、および２またはそれ以上の正荷電残基が存在する場合は好ましくは隣接して位置する。
第３の局面の別の特定の態様において、本発明のペプチドは、pH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むC末端を有する。該C末端に正荷電を提供することができる代表的残基はアルギニンおよび/またはリジン残基である。
第３の局面のさらなる態様において、該C末端残基はアラニンであり、さらなる局面において、該ペプチドのC末端がpH7.4で正荷電アミノ酸残基を含む場合は、それらは、C末端アラニンの次に位置するか、または最もN末端の先端に位置する。
第４の局面では、本発明は、19またはそれ以上のアミノ酸、詳細には20、21またはそれ以上のアミノ酸を含むLAH4機能的誘導体であるカチオン性両親媒性ペプチドに関する。特定の態様において、該ペプチドは、20〜30アミノ酸、詳細には21〜26、詳細には24〜26；
pH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むN末端；
Schiffer-Edmundsonのホイール表示で140°〜180°を含む親水性角度、より具体的には140°の角度を示す少なくとも２のヒスチジン残基、好ましくは４個のヒスチジン残基；
ここで、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において、該ペプチドは該ヒスチジン残基により規定される最小角中の最も遠位のヒスチジン残基間にロイシン残基のみを含む。
pH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むN末端；
Schiffer-Edmundsonのホイール表示で140°〜180°を含む親水性角度、より具体的には140°の角度を示す少なくとも２のヒスチジン残基、好ましくは４個のヒスチジン残基；
ここで、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において、該ペプチドは該ヒスチジン残基により規定される最小角中の最も遠位のヒスチジン残基間にロイシン残基のみを含む。
第４の局面の特定の態様において、該ペプチドの他のアミノ酸はアラニンおよびロイシン残基から選ばれる。
この第4の局面のペプチドは、配列番号36のLAH4-L4ペプチドではなく、配列番号37のLAH4-L6ペプチドではない。
第４の局面の特定の態様において、本発明のペプチドは、アミノ酸配列が8アラニン、4ヒスチジン、10ロイシン、および4リジン残基からなる、配列番号1のLAH4ペプチドの異性体である。
第４の局面の特定の態様によれば、本発明のペプチドのN末端は、pH7.4で１、２、または３（特に１または２）正荷電（詳細にはアルギニンまたはリジン残基、好ましくはリジン残基によりもたらされる)を含む。該正荷電残基は、好ましくは、N末端の先端、２以上の正荷電残基が存在する場合は隣接して位置する。
第４の局面の別の特定の態様において、本発明のペプチドは、pH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むC末端を示す。該C末端に正荷電をもたらすことができる代表的残基は、アルギニンおよび/またはリジン残基である。
第４の局面のさらなる態様において、該C末端残基はアラニンであり、さらなる局面において、該ペプチドのC末端がpH7.4で正荷電アミノ酸残基を含む場合は、それらはC末端アラニンの次に位置するか、または最もN末端の先端に位置する。
この第４の局面でカバーされる代表的ペプチドには、ペプチドLAH4-L4iso、LAH4-L5、およびLAH4-L6iso(配列番号8〜10)が含まれる。したがって、本発明は、配列番号8〜10からなる群から選ばれるペプチドにも関する。
本発明のペプチドを製造するには種々の方法が利用可能であり、当業者に知られている。第1の方法では、本発明のペプチドをコードする酢酸配列は、細菌、例えばE. coliまたはあらゆる他の発現系で発現する。次に、該ペプチドは常套的方法により精製される。第2の方法では、該ペプチドは合成装置（例えばBechinger、1996参照）を用いて合成される。
本発明のペプチドはLAH4ペプチドから誘導される。後者は真核細胞への核酸のトランスフェクションを促進すると認識されるが、ウイルスの形質導入におけるその有利な特性は、今まで開示も示唆もされていない。ここに、本発明者らは、LAH4ペプチドおよびその誘導体が標的細胞のウイルス感染を促進し、ウイルスによる細胞の感染性を増強することを示す。
本発明のさらなる態様は、上記LAH4ペプチドまたは以下の共有結合修飾の少なくとも１を含むその機能的誘導体由来のペプチドである：
好ましくはN末端のアシル化、アセチル化、非ペプチド高分子担体基との結合；
好ましくはC末端のアミド化、非ペプチド高分子担体基との結合；
好ましくはアミノ酸側鎖のグリコシル化；
該ペプチドの細胞内への取り込みを促進する結合、または疎水性基、好ましくは脂質、脂肪酸、ダンシル、カルボベンズオキシル、またはt-ブチルオキシカルボニル基との結合；
酸化、硫酸塩化（sulphatization）、エステル化、ラクトン形成、および/またはリン酸化。
好ましくはN末端のアシル化、アセチル化、非ペプチド高分子担体基との結合；
好ましくはC末端のアミド化、非ペプチド高分子担体基との結合；
好ましくはアミノ酸側鎖のグリコシル化；
該ペプチドの細胞内への取り込みを促進する結合、または疎水性基、好ましくは脂質、脂肪酸、ダンシル、カルボベンズオキシル、またはt-ブチルオキシカルボニル基との結合；
酸化、硫酸塩化（sulphatization）、エステル化、ラクトン形成、および/またはリン酸化。
本発明は、上記ペプチドの多量体、例えば二量体または三量体も含む。本発明の文脈において、「多量体」は、互いに共有結合している機能的LAH4ペプチドを表す。一緒に結合する２つの機能的LAH4ペプチドである二量体は、例えば、CまたはN末端にチオール基を挿入し、次いで、該基を用いてジスルフィド架橋を形成することにより二量体を生成することができる。もちろん、他の試薬を用いてそのような多量体を生成することもできる。
本発明のLAH4ペプチドまたはその機能的誘導体(例えば配列番号1〜27のいずれか)は、そのC末端がアミド化されているか、またはC末端が修飾されていない。
好ましい高分子担体基には、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリオキシアルキレングリコール、ポリソルベートエステル、マンナン、アミロペクチン、プルラン、自己凝集疎水化多糖のヒドロゲルナノ粒子、ポリリジン、抗体、またはアルブミンがある。
特定の態様において、本発明は、本明細書に記載の形質導入促進特性を保持する上記ペプチドのレトロ、インベルソ、またはレトロ−インベルソ誘導体も含む。
該ペプチドは、少なくとも１のDアミノ酸およびイミノアミノ酸、および希アミノ酸を含みうる。本発明は、本発明のペプチドのペプチド模倣物にも関する。これらは、例えば１またはそれ以上のペプチド結合の修飾、例えば逆ペプチド結合もしくはエステル結合により特徴づけることができる。しかし、本発明はβまたはγ−アミノ酸などを有するペプチドも含む。
本発明のペプチドは、細胞のウイルス感染を促進する。本明細書で用いている「ウイルス」は、天然ウイルスおよび人工ウイルスに関する。例えば、パラミクソウイルス(例えば、呼吸器合胞体ウイルス、麻疹ウイルス)、オルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、フラビアウイルス(例えば、C型肝炎ウイルス)、ヘパドナウイルス(例えば、B型肝炎ウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病、VSV)、コロナウイルス(例えば、SARS)、トガウイルス(例えば、シンドビスウイルス、チクングンヤ熱ウイルス)、フィロウイルス(例えば、エボラウイルス)、アレナウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ブニヤウイルス、ボルナ、ウイルス、アルテリウイルス、バキュロウイルス。特定の態様では、該ウイルスは、遺伝子療法用に設計された核酸を含む人工ウイルスである。好ましい態様において、該ウイルスはエンベロープ保有ウイルスである。好ましい態様において、該ウイルスはレトロウイルス、詳細にはレンチウイルスである。本発明者らは、本発明のペプチドが、水胞性口内炎ウイルス(VSV)、修飾ネコ内因性レトロウイルス(RD114)、両種指向性（amphotrophic）ネズミ白血病ウイルス(MLV)、修飾テナガザル白血病ウイルス(GALV)由来の糖タンパク質、ならびにAcMNPVバキュロウイルス(GP64)由来の糖タンパク質（後者は通常、昆虫細胞に特異的なウイルスである）を有する偽型エンベロープを含むHIV-1由来レンチウイルスベクター(LV)による真核細胞の感染を促進することができることを示した。本発明のペプチドにより得られた形質導入の効率、およびここに開示した実験に用いた糖タンパク質の多様性から、本発明のペプチドは、真核細胞におけるエンベロープ保有ウイルスの形質導入効率を増加する一般的手段として用いることができることが明らかである。
標的細胞は、あらゆる種類の真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、詳細にはヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、またはハムスター細胞でありうる。特定の態様において、標的細胞は、CD34+細胞、詳細には造血系の遺伝子療法が必要な患者から回収したCD34+細胞である。他の代表的な非限定的標的組織/細胞は、皮膚、筋肉、肝臓、目、ニューロン、リンパ球、繊維芽細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、筋芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞、より一般的には、ウイルスの標的として知られているかまたは同定されるあらゆる真核細胞である。
該ウイルスおよび該標的細胞を用いる該ペプチドの活性は、レポーターアッセイ、例えば実施例に記載のルシフェラーゼアッセイまたはGFP発現アッセイを用いて測定することができる。特に、該ペプチドは、以下の方法により試験することができる：
該細胞(例えば、HCT116細胞または293T細胞)を培養皿、例えば12ウェルプレートに入れ（例えば、105細胞/ウェルで)、37℃で一夜維持し；
GFPトランス遺伝子を含むウイルスを種々の濃度(例えば、3、6および/または12μg/ml)のペプチドの存在下または非存在下で37℃で15分間インキュベーションし；
次に、単独または該ペプチドと混合した該ウイルスを該細胞と混合し；
所望により、感染が生じるのに充分な時間後、例えば先の工程後６時間で、培地を除去し、新鮮培養液に交換することができる；
該細胞をさらに2〜3日間培養し；
該形質導入効率を適合する手段、例えばフローサイトメトリーを用いてGFP発現をモニターすることにより決定する。
該細胞(例えば、HCT116細胞または293T細胞)を培養皿、例えば12ウェルプレートに入れ（例えば、105細胞/ウェルで)、37℃で一夜維持し；
GFPトランス遺伝子を含むウイルスを種々の濃度(例えば、3、6および/または12μg/ml)のペプチドの存在下または非存在下で37℃で15分間インキュベーションし；
次に、単独または該ペプチドと混合した該ウイルスを該細胞と混合し；
所望により、感染が生じるのに充分な時間後、例えば先の工程後６時間で、培地を除去し、新鮮培養液に交換することができる；
該細胞をさらに2〜3日間培養し；
該形質導入効率を適合する手段、例えばフローサイトメトリーを用いてGFP発現をモニターすることにより決定する。
(エンベロープ保有)ベクターによる細胞の形質導入を促進するのに有用なペプチドの同定方法も本発明の一部である。この方法は、細胞へのウイルス感染を、該ペプチドの非存在下の細胞へのウイルス感染と比較して少なくとも２倍、より好ましくは３、５、または１０倍増強するペプチドを同定するために先の段落に記載の工程を実施することができよう。
本発明の使用および方法では、LAH4ペプチドおよびその機能的誘導体を有効量で用いる。本発明において、該ペプチドの用語「有効量」は、ウイルスベクターの形質導入効率を有意に増加させるのに必要な量を表す。この有効量は、一般的には、試験する特定のペプチド、用いた標的細胞およびウイルスベクターに依存するだろう。この量は、当該分野でよく知られた方法、具体的には実施例に記載のレポーターアッセイを実施する上記方法にしたがって決定することができる。例えば、本発明者らは、CD34+細胞へのGALVTR-LVの形質導入を促進するのに必要なLAH4-L1の最適濃度は約12μg/ml(形質導入培地中の最終濃度)であることを示した。
さらなる局面によれば、本発明は、LAH4ペプチドまたはその機能的誘導体とウイルス粒子、詳細にはエンベロープ保有ウイルス粒子、より詳細には遺伝子療法のためのエンベロープ保有ウイルスベクターとの複合体に関する。さらに、本発明の別の局面は、該ペプチドとウイルス粒子を混合することを含む該複合体の製造方法に関する。
別の局面によれば、本発明は、LAH4ペプチドまたはその機能的誘導体とウイルス粒子(特に、エンベロープ保有ウイルス粒子、より詳細には遺伝子療法のためのエンベロープ保有ウイルスベクター)および細胞との混合物に関する。さらに、本発明の別の局面は、該ペプチドとウイルス粒子および細胞を混合することを含む該混合物の製造方法に関する。
本発明のペプチドは、医薬組成物に用いることができる。すなわち、本発明は、上記ペプチドと適切な医薬的に許容されるビークルを含む組成物に関する。本発明の医薬組成物は、１またはそれ以上の本発明のペプチドまたは該ペプチドの生理学的に許容される塩を含む。本発明の医薬組成物は、例えば該組成物の溶解性、安定性、または無菌性に寄与するか、または体内への取り込み効率を増加する医薬的に有用な助剤も含むことができる。
本発明の局面は、医薬として用いるための上記ペプチドにも関する。特定の態様において、該医薬は、遺伝子療法ウイルスベクターの該効率を増加させるのに用いる(D'Costa et al.、2009)。
該ペプチドを含む医薬組成物の形と含有量は投与経路に依存する。好ましくは、該ペプチドが非分解状態で標的部位に到達するガレヌス製剤および適用形態が選ばれる。該医薬は、注射剤、点滴剤、スプレー、錠剤、坐剤、クリーム、軟膏、ゲルなどとして局所投与することができる。該医薬は、一定期間にわたり反復的にかまたはボーラスとして投与することができる。
本発明のペプチド、複合体または医薬組成物、または医薬は、in vivo、例えば筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または頭蓋内経路で注射することにより投与することができる。すなわち、本発明は、遺伝子療法を必要とする患者に、上記ペプチド、複合体、または医薬組成物を投与することを含む遺伝子療法のための方法にも関する。該方法は、本発明のペプチドを投与する前、後、または該投与と一緒に遺伝子療法のためのウイルスベクターを投与することも含む。
特定の局面において、本発明は、ウイルスまたはウイルスベクター、詳細にはエンベロープ保有ウイルスまたはウイルスベクターによる細胞の形質導入を促進するための感染促進試薬として用いるための、培地中に上記ペプチドを含む組成物にも関する。すなわち、本発明は、適切な媒質、詳細には適切な培地中に本発明のペプチドを含むウイルス感染促進試薬にも関する。
別の局面によれば、本願は、LAH4ペプチドまたはその機能的誘導体の抗菌剤としての使用を開示する。
別の局面によれば、本願は、LAH4機能的誘導体の細胞浸透ペプチド(CPP)としての使用を開示する。特に、該ペプチドは、生理活性化合物、例えば核酸、例えばプラスミドDNA、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および他の生理活性化合物(ペプチドまたはタンパク質、詳細には治療用ペプチドまたはタンパク質、マーカーペプチド、抗体など)のデリバリーシステムとして用いられる。該CPPは、生理活性化合物と共有結合または非共有結合することができる。特定の態様において、該ペプチドはLAH4ペプチド機能的誘導体である。
別の局面によれば、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸、および本発明のペプチドのための発現ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、およびウイルスベクターも提供する。
本明細書に記載の該ペプチドは、広範囲の治療および診断的適用に用いられ、細胞中へのウイルスの侵入の実施および研究のための有用な実験室的手段である。
本発明の好ましい態様は、該LAH4ペプチドまたはその機能的誘導体の、ウイルスベクター系に基づく常套的実験室作業または遺伝子療法アプローチのためのウイルス感染または形質導入効率の一般的増強物質としての使用である。該ペプチドは、遺伝子療法用に設計されたベクターの、細胞へのin vitro、ex vivo、またはin vivoでの取り込みを増強する。該ペプチドは、遺伝子療法用のウイルスベクターと組み合わせて投与することができ、該ウイルスベクターの該標的細胞内への侵入を仲介することができる。該ペプチドは、ウイルスの細胞内への侵入を促進するので、in vitroでも有用である。すなわち、該ペプチドは、その作用機序およびウイルスの研究手段として有用である。本発明の別の態様は、診断的アプローチ、特に、HIV-1様ウイルスおよび他のエンベロープ保有ウイルスの診断的アプローチのための該LAH4ペプチドまたはその機能的誘導体の使用である。該LAH4ペプチドおよびその機能的誘導体は、ウイルス粒子の感染力価を増加させ、細胞への侵入を増加させ、残存するウイルス汚染の検出を可能にする。したがって、該ペプチドは、対象、詳細にはウイルス、より具体的にはエンベロープ保有ウイルスによる感染が疑われるヒト対象由来の血清、血液、血漿、精子、または組織などの試料からウイルス粒子を単離するのに用いることができる。本発明のペプチドは、水、食物（トリインフルエンザ、SARS)由来のウイルス粒子、またはバイオテロに用いられるあらゆる(エンベロープ保有)ウイルスの研究に用いることもできる。ウイルス単離効率は、常套的診断方法に比べて数倍よいだろう。好ましい方法には、安全な溶液を得るためにウイルスを含むことが知られているか疑われる溶液からウイルスを定量的に除去する結合親和性アッセイおよび方法がある。そのような方法において、本発明のペプチドは、好ましくは支持体またはカラムに共有結合する。
本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関するものであり、該ポリヌクレオチドは、好ましくは、DNA、RNA、ゲノムDNA、またはPNAを構成する。本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞に関する。
本発明のペプチドは、一般的には標的細胞内へのウイルス粒子の侵入を増強するのに用いることができる。該ペプチドは、水胞性口内炎ウイルス(VSV-G)のGタンパク質、MLVのEnvタンパク質などの外来エンベロープ糖タンパク質(擬似粒子)を保持するエンベロープ保有ウイルス粒子の感染/形質導入率の一般的増強物質として用いることもできる。本発明の上記ペプチドは、すべての分析したエンベロープ保有ウイルス粒子の感染率を促進する。これは、特に、以前には行うことができなかった一次細胞における感染実験を行うことを可能にする。すなわち、本発明のペプチドは、in vitroで実験室用手段として有用である。
本発明のペプチドは、ベクター系、詳細にはエンベロープ保有ベクター系に基づくex vivoまたはin vivo遺伝子療法アプローチにおける遺伝子送達率を増強するのに用いることもできる。したがって、本発明は、遺伝子療法を必要とする対象におけるウイルスまたはウイルスベクターによる真核細胞の感染を促進するための遺伝子療法に用いるための上記ペプチドにも関する。
本発明のペプチドは、遺伝子療法においてウイルスまたはウイルスベクターと組み合わせて用いることができる。該ペプチドは、遺伝子療法ベクターと同時に、別に、または連続的に投与することができる。遺伝子療法、特に幹細胞のex vivo遺伝子療法のための高感染性レトロウイルスベクターの生成は困難な手段である。特に、幹細胞のためのレトロウイルスベクターの形質導入効率は低い。しかしながら、本発明のペプチドの存在下では、幹細胞および細胞系をレトロウイルスベクターで効率的に形質導入することができ、該ペプチドを含まない試料に比べて高効率で標的細胞内への遺伝子送達が生じる。
本発明のin vitroおよびex vivo法では、該ペプチドは固体支持体上に予め固定化するかしないで用いることができる。好都合には、形質導入効率を増加させるために固定化は必要でない。
本発明のin vitro法の特定の態様において、別の形質導入改善手段は、該LAH4ペプチドまたはその機能的誘導体と一緒に用いられる。例えば、特定の態様において、形質導入効率は、本発明のペプチドおよびレトロネクチンまたはSEVIペプチドの両方を用いて増加する。
別の態様において、本発明は、上記ペプチドおよびウイルスまたはウイルスベクターを含むキットを提供する。
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
材料と方法
ペプチドおよび試薬
ペプチドを、標準的Fmoc固相ペプチド合成により精製し、プレパラティブRP HPLCにより精製し、次いでHPLCおよびMS(Genecust、Dudelange、Luxembourg)により分析した。LAH4-A4-dNH2およびSEVIを除くすべての該ペプチドのC末端をアミド化した。7-アミノ-アクチノマイシンD(7-AAD)はSigma-Aldrich(St Quentin Fallavier、france)から得た。レトロネクチンはTakara Bio Inc.(St-Germain-en-laye、France)から得た。pEGFP-C1プラスミドは、Clontech(St-Germain-en-laye、France)から得た。抗体はMiltenyi(Paris、France)から得た。
ペプチドおよび試薬
ペプチドを、標準的Fmoc固相ペプチド合成により精製し、プレパラティブRP HPLCにより精製し、次いでHPLCおよびMS(Genecust、Dudelange、Luxembourg)により分析した。LAH4-A4-dNH2およびSEVIを除くすべての該ペプチドのC末端をアミド化した。7-アミノ-アクチノマイシンD(7-AAD)はSigma-Aldrich(St Quentin Fallavier、france)から得た。レトロネクチンはTakara Bio Inc.(St-Germain-en-laye、France)から得た。pEGFP-C1プラスミドは、Clontech(St-Germain-en-laye、France)から得た。抗体はMiltenyi(Paris、France)から得た。
配列番号1〜27で示される該ペプチドに加えて、以下のペプチドも本試験に用いた：
LAH4-A4-P14: KKALLHAALAHLLPLAHHLLALLKKA(配列番号28).
LAK4-L1 : KKALLAKALKLLALLALKLAKALKKA(配列番号29)
LAH8-L1 : HHALLAHALHLLALLALHLAHALHHA(配列番号30)
LAH4-L1-dK : ALLAHALHLLALLALHLAHALA(配列番号31)
LAH4-L1-dKN : ALLAHALHLLALLALHLAHALKKA(配列番号32)
LAH4-A4-dKN : ALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(配列番号33)
LAH2-A4 : KKALLAAALAALLALAHHLLALLKKA(配列番号34)
SEVI: GIHKQKEKSRLQGGVLVNEILNHMKRATQIPSYKKLIMY(配列番号35)
LAH4-A4-P14: KKALLHAALAHLLPLAHHLLALLKKA(配列番号28).
LAK4-L1 : KKALLAKALKLLALLALKLAKALKKA(配列番号29)
LAH8-L1 : HHALLAHALHLLALLALHLAHALHHA(配列番号30)
LAH4-L1-dK : ALLAHALHLLALLALHLAHALA(配列番号31)
LAH4-L1-dKN : ALLAHALHLLALLALHLAHALKKA(配列番号32)
LAH4-A4-dKN : ALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(配列番号33)
LAH2-A4 : KKALLAAALAALLALAHHLLALLKKA(配列番号34)
SEVI: GIHKQKEKSRLQGGVLVNEILNHMKRATQIPSYKKLIMY(配列番号35)
細胞系培養
ヒト結腸直腸癌由来のヒトHCT116細胞(CCL-247、ATCC、Manassas、VA、USA)および293T細胞(Merten et al、2011)を、10％加熱不活化ウシ胎児血清(FCS)(Invitrogen/Gibco)添加Dulbecco変法Eagle培地(DMEM+Glutamax、Invitrogen/Gibco、Cergy-Pontoise、France)を用い、37℃、5％CO2で培養した。
ヒト結腸直腸癌由来のヒトHCT116細胞(CCL-247、ATCC、Manassas、VA、USA)および293T細胞(Merten et al、2011)を、10％加熱不活化ウシ胎児血清(FCS)(Invitrogen/Gibco)添加Dulbecco変法Eagle培地(DMEM+Glutamax、Invitrogen/Gibco、Cergy-Pontoise、France)を用い、37℃、5％CO2で培養した。
ウイルスベクター生成およびベクター力価測定
HIV-1由来レンチウイルスベクター(LV)を、以下の４つのプラスミドを用いる293T細胞の一過性リン酸カルシウムトランスフェクションにより生成した：GFP発現導入ベクタープラスミド(pCCLsin-cPPT-hPGK-eGFP-WPRE)(Follenzi et al、2000)、HIV-1 Rev(pK.Rev)をコードするプラスミド(Merten et al、2011)、HIV-1 gagpolをコードするプラスミド(pKLgagpol)(Merten et al、2011)、および適切なエンベロープ糖タンパク質(GP)構築物：VSV-G-LVを生じるpMDG(水胞性口内炎ウイルス GP(Naldini et al、1996))；RD114TR-LVを生じるpHCMV-RD114TR(修飾ネコ内因性レトロウイルス GP(Sandrin et al、2002)；MLV-A-LVを生じるpBA-Ampho(両種向性ネズミ白血病ウイルス GP)、GP64-LVを生じるpBA_AcMNPV_gp64(バキュロウイルス GP)、およびGALVTR-LVを生じるpBA-GALVampho-Kana(修飾テナガザル白血病ウイルス GP(Sandrin et al、2002)。ウイルス上清をトランスフェクション後48時間で回収し、ろ過し(0.45μ)、部分標本に分け、次いで-80℃で保存した。感染力価を先に記載のごとく(Kutner et al、2009)フローサイトメトリー(FacsCalibur、BD Biosciences、San Jose、CA、USA)で測定した。簡単には、HCT116細胞をベクターストックの連続希釈で形質導入し、洗浄し、次いで3日後に、形質導入効率をGFP発現をモニターすることにより決定した。hCD34+細胞の形質導入について、最終力価を形質導入単位/ミリリットル(TU/ml)で表し、感染の多様性(MOI)を定義した。物理的粒子力価を市販ELISAキット(PerkinElmer life science、Boston、MA、USA)を用いるHIV-1 p24カプシッド含有量(ng/ml)を測定することにより決定した。
GALV エンベロープ糖タンパク質の偽型MLVレトロウイルスベクターのウイルス上清をプロデューサー細胞系PG13-MFG-GFP(Merten 2004)から得た。
HIV-1由来レンチウイルスベクター(LV)を、以下の４つのプラスミドを用いる293T細胞の一過性リン酸カルシウムトランスフェクションにより生成した：GFP発現導入ベクタープラスミド(pCCLsin-cPPT-hPGK-eGFP-WPRE)(Follenzi et al、2000)、HIV-1 Rev(pK.Rev)をコードするプラスミド(Merten et al、2011)、HIV-1 gagpolをコードするプラスミド(pKLgagpol)(Merten et al、2011)、および適切なエンベロープ糖タンパク質(GP)構築物：VSV-G-LVを生じるpMDG(水胞性口内炎ウイルス GP(Naldini et al、1996))；RD114TR-LVを生じるpHCMV-RD114TR(修飾ネコ内因性レトロウイルス GP(Sandrin et al、2002)；MLV-A-LVを生じるpBA-Ampho(両種向性ネズミ白血病ウイルス GP)、GP64-LVを生じるpBA_AcMNPV_gp64(バキュロウイルス GP)、およびGALVTR-LVを生じるpBA-GALVampho-Kana(修飾テナガザル白血病ウイルス GP(Sandrin et al、2002)。ウイルス上清をトランスフェクション後48時間で回収し、ろ過し(0.45μ)、部分標本に分け、次いで-80℃で保存した。感染力価を先に記載のごとく(Kutner et al、2009)フローサイトメトリー(FacsCalibur、BD Biosciences、San Jose、CA、USA)で測定した。簡単には、HCT116細胞をベクターストックの連続希釈で形質導入し、洗浄し、次いで3日後に、形質導入効率をGFP発現をモニターすることにより決定した。hCD34+細胞の形質導入について、最終力価を形質導入単位/ミリリットル(TU/ml)で表し、感染の多様性(MOI)を定義した。物理的粒子力価を市販ELISAキット(PerkinElmer life science、Boston、MA、USA)を用いるHIV-1 p24カプシッド含有量(ng/ml)を測定することにより決定した。
GALV エンベロープ糖タンパク質の偽型MLVレトロウイルスベクターのウイルス上清をプロデューサー細胞系PG13-MFG-GFP(Merten 2004)から得た。
細胞系の形質導入
HCT116細胞（GP64-LVで形質導入するための293T細胞)を12ウェルプレート(105細胞/ウェル)に入れた。その翌日に、LVを種々の濃度のLAH4-L1(3、6、または12μg/ml)の存在下または非存在下、37℃で15分間インキュベーションした。次に、LVを細胞単層上にロードした。形質導入後６時間で、細胞を洗浄し、さらに2〜3日間培養した。形質導入効率は、フローサイトメトリーを用いてGFP発現をモニターすることにより決定した。
HCT116細胞（GP64-LVで形質導入するための293T細胞)を12ウェルプレート(105細胞/ウェル)に入れた。その翌日に、LVを種々の濃度のLAH4-L1(3、6、または12μg/ml)の存在下または非存在下、37℃で15分間インキュベーションした。次に、LVを細胞単層上にロードした。形質導入後６時間で、細胞を洗浄し、さらに2〜3日間培養した。形質導入効率は、フローサイトメトリーを用いてGFP発現をモニターすることにより決定した。
ヒトCD34+細胞供給源、培養、および形質導入
臍帯血前駆細胞CD34+細胞を、French National Bioethics法に従って、Hopital Louise Michel、Evry、Franceで合併症のない出生児から得た臍帯血試料の単核細胞分画から免疫磁性選択(Miltenyi Biotec、Paris、France)により得た。最初に、hCD34+細胞を、先に記載のごとく(charrier et al、2011)サイトカイン添加X-vivo 20培地(Lonza、Levallois Perret、France)で一夜、予め活性化した。次に、予め活性化したhCD34+細胞を48ウェルプレートに播いた(100μlの予備活性培地中2,5x104細胞/ウェル)。形質導入は、ペプチドの存在下または非存在下、37℃で15分間予めインキュベーションしたLV上清100μlを加えて完結した。形質導入後6時間ですべての条件を、分化培地(50U/mlペニシリン、50mg/mlストレプトマイシン、および2mM L-グルタミン(Gibco/Invitrogen)、SCF(25ng/ml)、Flt-3リガンド(50ng/ml)、IL-6(20ng/ml)、およびIL-3(10ng/ml)(R&D系、Lille、France)添加X-Vivo 20)で1mlに希釈した。形質導入後２日間で細胞浮遊液の半分を新鮮分化培地で交換した。捨てた細胞の生存率を7-AADで標識後にフローサイトメトリーで評価した。形質導入後5〜6日に、形質導入効率を、フローサイトメトリーを用いて細胞ポピュレーションにおけるGFP発現のパーセンテージを追うことにより評価した。レトロネクチン存在下で行ったレンチウイルス形質導入プロトコールでは、先に記載のごとく(Jacome et al、2009)レトロネクチンコートしたプレート(20μg/cm2)上へのGALVTR-LVのダイナミックプレロードプロトコールを用いた。
臍帯血前駆細胞CD34+細胞を、French National Bioethics法に従って、Hopital Louise Michel、Evry、Franceで合併症のない出生児から得た臍帯血試料の単核細胞分画から免疫磁性選択(Miltenyi Biotec、Paris、France)により得た。最初に、hCD34+細胞を、先に記載のごとく(charrier et al、2011)サイトカイン添加X-vivo 20培地(Lonza、Levallois Perret、France)で一夜、予め活性化した。次に、予め活性化したhCD34+細胞を48ウェルプレートに播いた(100μlの予備活性培地中2,5x104細胞/ウェル)。形質導入は、ペプチドの存在下または非存在下、37℃で15分間予めインキュベーションしたLV上清100μlを加えて完結した。形質導入後6時間ですべての条件を、分化培地(50U/mlペニシリン、50mg/mlストレプトマイシン、および2mM L-グルタミン(Gibco/Invitrogen)、SCF(25ng/ml)、Flt-3リガンド(50ng/ml)、IL-6(20ng/ml)、およびIL-3(10ng/ml)(R&D系、Lille、France)添加X-Vivo 20)で1mlに希釈した。形質導入後２日間で細胞浮遊液の半分を新鮮分化培地で交換した。捨てた細胞の生存率を7-AADで標識後にフローサイトメトリーで評価した。形質導入後5〜6日に、形質導入効率を、フローサイトメトリーを用いて細胞ポピュレーションにおけるGFP発現のパーセンテージを追うことにより評価した。レトロネクチン存在下で行ったレンチウイルス形質導入プロトコールでは、先に記載のごとく(Jacome et al、2009)レトロネクチンコートしたプレート(20μg/cm2)上へのGALVTR-LVのダイナミックプレロードプロトコールを用いた。
HIS(BALB-Rag/γC)マウスの生成およびモニタリング
BALB/c rag2-/-γC-/-マウスを、特定病原体フリー条件下でGenethonに収容し、動物倫理委員会のガイドライン、プロトコールCE11003(承認日：03/01/2011-03/01/2012)に従って処理した。簡単には、形質導入または非形質導入hCD34+細胞(105細胞/マウス)を放射線照射BALB/c rag2-/-γC-/-新生仔の肝臓内に注射した。注射後11〜13週でHIS(BALB-Rag/γC)マウスを安楽死し、ヒト造血細胞の有効生着レベルを、血液、胸腺、脾臓、および骨髄を用いてフローサイトメトリーによりモニターした。
BALB/c rag2-/-γC-/-マウスを、特定病原体フリー条件下でGenethonに収容し、動物倫理委員会のガイドライン、プロトコールCE11003(承認日：03/01/2011-03/01/2012)に従って処理した。簡単には、形質導入または非形質導入hCD34+細胞(105細胞/マウス)を放射線照射BALB/c rag2-/-γC-/-新生仔の肝臓内に注射した。注射後11〜13週でHIS(BALB-Rag/γC)マウスを安楽死し、ヒト造血細胞の有効生着レベルを、血液、胸腺、脾臓、および骨髄を用いてフローサイトメトリーによりモニターした。
LAH4-L1誘導体による細胞系のトランスフェクション
293T細胞(1,5x10E5/ウェル)をトランスフェクション前日に48ウェルプレートに播いた。トランスフェクションのために、1μgのpEGFP-C1を50μlの150mM NaCl溶液中の所望の量のペプチドと混合し、攪拌し、室温で15分間インキュベーションした。次に、DNA/ペプチド混合物を、200μlのFCS不含DMEMで希釈し、細胞単層上にロードした。トランスフェクション後3時間で培地を10％FCS含有DMEMで交換した。48時間後、トランスフェクション効率をフローサイトメトリーを用いてGFP発現をモニターすることにより評価した。
293T細胞(1,5x10E5/ウェル)をトランスフェクション前日に48ウェルプレートに播いた。トランスフェクションのために、1μgのpEGFP-C1を50μlの150mM NaCl溶液中の所望の量のペプチドと混合し、攪拌し、室温で15分間インキュベーションした。次に、DNA/ペプチド混合物を、200μlのFCS不含DMEMで希釈し、細胞単層上にロードした。トランスフェクション後3時間で培地を10％FCS含有DMEMで交換した。48時間後、トランスフェクション効率をフローサイトメトリーを用いてGFP発現をモニターすることにより評価した。
結果および考察
遺伝子療法に用いたプロトタイプLVによる標的細胞形質導入に対するLAH4-L1の効果
LV感染性に対するLAH4-L1の効果を試験するため、HCT116細胞(またはGP64-LV用には293T細胞)を、GALVTR-LV、RD114TR-LV、MLV-A-LV、およびVSV-G-LVで形質導入した(図1A)。図１Bに示すように、LAH4-L1は、種々の程度でLV感染性を促進する（GALVTR-LVで最も高い効果が見られた）。興味深いことに、あらゆるエンベロープ糖タンパク質構築物の非存在下で生成されるLVに対応するウイルス様粒子(VLP)は、LAH4-L1存在下でも標的細胞を形質導入することができない（図1A）。この結果は、LVに対するLAH4-L1活性が細胞内へのレセプター介在侵入経路の確立に依存することを示す。
遺伝子療法に用いたプロトタイプLVによる標的細胞形質導入に対するLAH4-L1の効果
LV感染性に対するLAH4-L1の効果を試験するため、HCT116細胞(またはGP64-LV用には293T細胞)を、GALVTR-LV、RD114TR-LV、MLV-A-LV、およびVSV-G-LVで形質導入した(図1A)。図１Bに示すように、LAH4-L1は、種々の程度でLV感染性を促進する（GALVTR-LVで最も高い効果が見られた）。興味深いことに、あらゆるエンベロープ糖タンパク質構築物の非存在下で生成されるLVに対応するウイルス様粒子(VLP)は、LAH4-L1存在下でも標的細胞を形質導入することができない（図1A）。この結果は、LVに対するLAH4-L1活性が細胞内へのレセプター介在侵入経路の確立に依存することを示す。
GALVTR-LVによるヒト造血前駆細胞の形質導入に対するLAH4-L1の効果
GALVTR-LVは、ヒト造血前駆細胞を標的化するために設計された遺伝子療法手順によく用いられる(Jacome et al、2009)。したがって、ヒトCD34+細胞を臍帯血(UCB)試料から得、種々の濃度のLAH4-L1の存在下または非存在下、GALVTR-LVで形質導入した。hCD34+細胞の形質導入を促進するのに必要な最適濃度のLAH4-L1は12μg/mlと定義され(図2A)、HCT116細胞でみられたものよりわずかに高かった(図1A)。32μg/ml以下ではLAH4-L1のいかなる毒性作用も観察されなかった(図2A)。さらに、LAH4-L1存在下のhCD34+細胞の形質導入は、GALVTR-LVの投入量に比例して増加し、あるUCBドナーから別のドナーに再現可能である(図2B)。
GALVTR-LVは、ヒト造血前駆細胞を標的化するために設計された遺伝子療法手順によく用いられる(Jacome et al、2009)。したがって、ヒトCD34+細胞を臍帯血(UCB)試料から得、種々の濃度のLAH4-L1の存在下または非存在下、GALVTR-LVで形質導入した。hCD34+細胞の形質導入を促進するのに必要な最適濃度のLAH4-L1は12μg/mlと定義され(図2A)、HCT116細胞でみられたものよりわずかに高かった(図1A)。32μg/ml以下ではLAH4-L1のいかなる毒性作用も観察されなかった(図2A)。さらに、LAH4-L1存在下のhCD34+細胞の形質導入は、GALVTR-LVの投入量に比例して増加し、あるUCBドナーから別のドナーに再現可能である(図2B)。
GALVTR-LV-形質導入-hCD34+細胞を移植したHIS(BALB-rag/gC)マウスのモニタリング: LAH4-L1ペプチドの安全性評価
hCD34+細胞を注射するための新生BALB/c rag2-/-γC-/-免疫不全マウスの使用は、確実なヒト免疫系再構築をもたらす。得られる動物を「ヒト免疫系」(HIS)(BALB-Rag/γC)マウスという(Legrand et al、2008)。この動物モデルは、ヒト造血前駆細胞と接触している化合物の安全性評価に有用である。したがって、本発明者らは、LAH4-L1またはレトロネクチン（コントロールとして）存在下、GALVTR-LVで形質導入したhCD34+細胞について、rag2-/-/γC-/-モデルにおけるヒト造血細胞移植の質について研究することにした。図３Ａに示すように、rag2-/-/γ7γC-/-マウスに注射後12週間で、LAH4-L1またはレトロネクチン存在下で形質導入したヒトCD45+細胞は、血液、骨髄(BM)、脾臓、および胸腺において容易に検出可能である。総ヒト細胞ポピュレーションに対するLAH4-L1のあらゆる細胞毒性または有害作用を排除するために、有効移植レベルを、非形質導入(図3B-D-F)および形質導入(図3C-E-G)ヒト細胞についてHIS(BALB-Rag/γC)マウスでモニターした。図3Bおよび3Cに示すように、すべてのマウスが、ヒトTCRγ/β発現、ヒト二重陽性CD4/CD8および単陽性CD4およびCD8ヒトT細胞のパーセンテージにより明らかなように胸腺中で活性ヒト胸腺細胞増殖を示した(図3B-C)。マウスの脾臓およびBM(図3D〜3G)は、活性ヒトBリンパ球発生を示すヒトCD19+細胞の大ポピュレーションおよびヒト単球および天然キラー細胞ポピュレーションを含む。ヒト造血前駆細胞(hCD34+ hCD45+細胞)もBMにおいて検出可能である(図3F-G)。要するに、これらマウスにおけるヒト免疫系再構築に対するLAH4-L1のいかなる細胞毒性または有害作用も認められなかった。形質導入または非形質導入細胞におけるヒト免疫系の異なる細胞サブセットの正常な発生が観察され、LAH4-L1は安全で効率的な培養添加物であることの根拠を示す。
hCD34+細胞を注射するための新生BALB/c rag2-/-γC-/-免疫不全マウスの使用は、確実なヒト免疫系再構築をもたらす。得られる動物を「ヒト免疫系」(HIS)(BALB-Rag/γC)マウスという(Legrand et al、2008)。この動物モデルは、ヒト造血前駆細胞と接触している化合物の安全性評価に有用である。したがって、本発明者らは、LAH4-L1またはレトロネクチン（コントロールとして）存在下、GALVTR-LVで形質導入したhCD34+細胞について、rag2-/-/γC-/-モデルにおけるヒト造血細胞移植の質について研究することにした。図３Ａに示すように、rag2-/-/γ7γC-/-マウスに注射後12週間で、LAH4-L1またはレトロネクチン存在下で形質導入したヒトCD45+細胞は、血液、骨髄(BM)、脾臓、および胸腺において容易に検出可能である。総ヒト細胞ポピュレーションに対するLAH4-L1のあらゆる細胞毒性または有害作用を排除するために、有効移植レベルを、非形質導入(図3B-D-F)および形質導入(図3C-E-G)ヒト細胞についてHIS(BALB-Rag/γC)マウスでモニターした。図3Bおよび3Cに示すように、すべてのマウスが、ヒトTCRγ/β発現、ヒト二重陽性CD4/CD8および単陽性CD4およびCD8ヒトT細胞のパーセンテージにより明らかなように胸腺中で活性ヒト胸腺細胞増殖を示した(図3B-C)。マウスの脾臓およびBM(図3D〜3G)は、活性ヒトBリンパ球発生を示すヒトCD19+細胞の大ポピュレーションおよびヒト単球および天然キラー細胞ポピュレーションを含む。ヒト造血前駆細胞(hCD34+ hCD45+細胞)もBMにおいて検出可能である(図3F-G)。要するに、これらマウスにおけるヒト免疫系再構築に対するLAH4-L1のいかなる細胞毒性または有害作用も認められなかった。形質導入または非形質導入細胞におけるヒト免疫系の異なる細胞サブセットの正常な発生が観察され、LAH4-L1は安全で効率的な培養添加物であることの根拠を示す。
LAH4-L1の構造−機能試験
LV感染性の増強におけるリジンおよびヒスチジン残基の特異的役割をよりよく理解するためにLAH4-L1の誘導体を合成した（図４A）。図４Bに示すように、４ヒスチジン残基の４リジン残基による置換(LAK4-L1)は、GALVTR-LVによるCD34+細胞形質導入の改善にとって有害であるが、強い細胞毒性作用の結果ではない(図4C)。本発明者らの中性pHの培養条件において、LAH4-L1中のヒスチジン残基はプロトン化せず、LAH4-L1が貫膜方向性を示すのを可能にする。LAK4-L1において、全ペプチドに沿って位置するリジン残基は、中性pHでプロトン化し、この後者が貫膜方向性を示すのを確実に妨げる。さらに、LAK4-L1は、中性pHで９個のカチオン荷電が存在するにも関わらず効果がない。この結果は、LAH4-L1がウイルスおよび細胞膜表面における反発荷電の中和だけに制限されるのではない分子メカニズムを介して作用していることを強く示す。
LV感染性の増強におけるリジンおよびヒスチジン残基の特異的役割をよりよく理解するためにLAH4-L1の誘導体を合成した（図４A）。図４Bに示すように、４ヒスチジン残基の４リジン残基による置換(LAK4-L1)は、GALVTR-LVによるCD34+細胞形質導入の改善にとって有害であるが、強い細胞毒性作用の結果ではない(図4C)。本発明者らの中性pHの培養条件において、LAH4-L1中のヒスチジン残基はプロトン化せず、LAH4-L1が貫膜方向性を示すのを可能にする。LAK4-L1において、全ペプチドに沿って位置するリジン残基は、中性pHでプロトン化し、この後者が貫膜方向性を示すのを確実に妨げる。さらに、LAK4-L1は、中性pHで９個のカチオン荷電が存在するにも関わらず効果がない。この結果は、LAH4-L1がウイルスおよび細胞膜表面における反発荷電の中和だけに制限されるのではない分子メカニズムを介して作用していることを強く示す。
次に、LAH4-L1の両先端に存在する２リジン残基に注目した。４リジン残基の４アルギニン残基による置換(LAH4-L1-R)は有害作用を生じない。LAH4-L1-Rは、LAH4-L1と同様の効率でGALVTR-LVによるhCD34+細胞の形質導入を促進し(図4B)、明らかな細胞毒性はみられない(図4C)。これに対し、４リジン残基のヒスチジン残基による置換(LAH8-L1)は有害である。したがって、中性pHでのカチオン荷電の存在（リジンまたはアルギニン）は、LV感染性を増強するのに必要なようである。N末端またはC末端の先端に存在するどちらのリジン残基が重要であるかを決定するため、以下の３個のLAH4-L1 誘導体を設計した(図4A): LAH4-L1-dK(無リジン)、LAH4-L1-dKN(N末端リジン残基が欠失)、およびLAH4-L1-dKC(C末端リジン残基が欠失)。図4Bに示すように、hCD34+細胞のGALVTR-LVによる形質導入は、LAH4-L1-dKおよびLAH4-L1-dKN存在下で検出不能である。LAH4-L1のN末端の先端にリジン残基を欠くと有害である。これに対し、LAH4-L1-dKCは、LAH4-L1と同じ効率でhCD34+細胞の形質導入をもたらす。
D-アミノ酸をL-アミノ酸の代わりに用いることができるか否かを明らかにするため、LAH4-L1ペプチドをD-アミノ酸を用いて合成した(D-LAH4-L1)。図4Bに示すように、D-LAH4-L1は、レンチウイルス形質導入を促進するが、LAH4-L1に比べて低効率(43%)である。
D-アミノ酸をL-アミノ酸の代わりに用いることができるか否かを明らかにするため、LAH4-L1ペプチドをD-アミノ酸を用いて合成した(D-LAH4-L1)。図4Bに示すように、D-LAH4-L1は、レンチウイルス形質導入を促進するが、LAH4-L1に比べて低効率(43%)である。
Schiffer-Edmundsonのホイール表示中のヒスチジン残基により範囲を定めた角度(60°〜180°)間にロイシンまたはアラニン残基を有するLAH4-L1異性体の設計および試験
LAH4-L1異性体のペプチドシリーズを製造した(図5AおよびD)。これらLAH4-L1異性体の第一の特徴は、該ペプチドが中性pHでα-らせん構造をとるときヒスチジン残基により範囲が定められたその角度(60〜180°)の違いである（図5BおよびE)。第2の特徴は、該ペプチドがα-らせん構造をとるときの隣り合った２対のヒスチジン残基間に位置するアミノ酸残基の選択である。これら残基は、Lシリーズではロイシン残基(図5B)、Aシリーズではアラニン残基(図5E)からなる。したがって、ペプチド名の命名は、Schiffer-Edmundsonのホイール表示における隣り合った２対のヒスチジン残基間に存在するアラニンまたはロイシン残基の数を反映する。例えば、LAH4-A4というペプチドは、140°の親水性角度をもたらす隣り合った２対のヒスチジン残基間に４アラニン残基を有するペプチドである(図5E)。これらすべてのペプチドの、hCD34+細胞のGALVTR-LVによる形質導入を促進する能力を試験した。興味深いことに、LおよびAシリーズにおいて、最も効率的なペプチド、すなわちLAH4-L4およびLAH4-A4の親水性角度は140°であった。親水性角度が160°のLAH4-A5も効率が高い。これらデータは、用量反応曲線で確認された(図6A)。3および6μg/mlで、LAH4-A4は、LAH4-L1より約４倍効率が高く、明らかな細胞毒性はみられない(図6B)。
LAH4-L1異性体のペプチドシリーズを製造した(図5AおよびD)。これらLAH4-L1異性体の第一の特徴は、該ペプチドが中性pHでα-らせん構造をとるときヒスチジン残基により範囲が定められたその角度(60〜180°)の違いである（図5BおよびE)。第2の特徴は、該ペプチドがα-らせん構造をとるときの隣り合った２対のヒスチジン残基間に位置するアミノ酸残基の選択である。これら残基は、Lシリーズではロイシン残基(図5B)、Aシリーズではアラニン残基(図5E)からなる。したがって、ペプチド名の命名は、Schiffer-Edmundsonのホイール表示における隣り合った２対のヒスチジン残基間に存在するアラニンまたはロイシン残基の数を反映する。例えば、LAH4-A4というペプチドは、140°の親水性角度をもたらす隣り合った２対のヒスチジン残基間に４アラニン残基を有するペプチドである(図5E)。これらすべてのペプチドの、hCD34+細胞のGALVTR-LVによる形質導入を促進する能力を試験した。興味深いことに、LおよびAシリーズにおいて、最も効率的なペプチド、すなわちLAH4-L4およびLAH4-A4の親水性角度は140°であった。親水性角度が160°のLAH4-A5も効率が高い。これらデータは、用量反応曲線で確認された(図6A)。3および6μg/mlで、LAH4-A4は、LAH4-L1より約４倍効率が高く、明らかな細胞毒性はみられない(図6B)。
LAH4-A4の構造−機能試験
ヒスチジン残基の役割を検討するため、以下の３つのLAH4-A4誘導体を設計した(図7A)：Schiffer-Edmundsonのホイール表示で100°の親水性角度を示す２ヒスチジン残基のみを有するLAH2-A4(図7B)；140°の親水性角度を示す２ヒスチジン残基のみを有するLAH2-A6(図7B)；および該らせんの各末端にリジン残基を有する無極性らせんペプチドであるK2-L10-A12-K2。このペプチドは、すべてのヒスチジン残基がアラニン残基で置換しているLAH4-A4に対応する(図7A)。図6Cに示すように、LAH2-A6は、LAH4-A4と同様の効率でhCD34+細胞のGALVTR-LVによる形質導入を促進し、明らかな細胞毒性はみられない(図7D)。これに対して、LAH2-A4は機能的でない。このペプチドは、Edmundsonのホイール表示において２ヒスチジン残基で範囲が定められた非最適角度(100°)を有する(図7B)。興味深いことに、K2-L10A12-K2ペプチドは、LAH4-A4に比べてhCD34+形質導入レベルを17％促進する。したがって、ヒスチジン残基は、LAH4-A4ペプチドの該効率を改善するが、レンチウイルス形質導入を促進するためには厳密には必要ではない。
ヒスチジン残基の役割を検討するため、以下の３つのLAH4-A4誘導体を設計した(図7A)：Schiffer-Edmundsonのホイール表示で100°の親水性角度を示す２ヒスチジン残基のみを有するLAH2-A4(図7B)；140°の親水性角度を示す２ヒスチジン残基のみを有するLAH2-A6(図7B)；および該らせんの各末端にリジン残基を有する無極性らせんペプチドであるK2-L10-A12-K2。このペプチドは、すべてのヒスチジン残基がアラニン残基で置換しているLAH4-A4に対応する(図7A)。図6Cに示すように、LAH2-A6は、LAH4-A4と同様の効率でhCD34+細胞のGALVTR-LVによる形質導入を促進し、明らかな細胞毒性はみられない(図7D)。これに対して、LAH2-A4は機能的でない。このペプチドは、Edmundsonのホイール表示において２ヒスチジン残基で範囲が定められた非最適角度(100°)を有する(図7B)。興味深いことに、K2-L10A12-K2ペプチドは、LAH4-A4に比べてhCD34+形質導入レベルを17％促進する。したがって、ヒスチジン残基は、LAH4-A4ペプチドの該効率を改善するが、レンチウイルス形質導入を促進するためには厳密には必要ではない。
LAH4-A4のN末端またはC末端の先端にあるリジン残基の役割をより明らかにするため、以下の４つのLAH4-A4誘導体を設計した(図8A)：LAH4-A4-dKN(N末端リジン残基が欠失)、LAH4-A4-K1N(１個のN末端リジン残基のみが欠失)、LAH4-A4-K3N(３位のアラニンをリジンで置換)、およびLAH4-A4-dKC(C末端リジン残基が欠失)。LAH4-A4-dKNの存在下におけるhCD34+細胞のGALVTR-LVによる形質導入は検出不能である(図8B)。この形質導入の欠如は、強い細胞毒性作用の結果ではない(図8C)。LAH4-A4-K1NのN末端の先端の1個のリジン残基のみの存在は、LAH4-A4に比べてhCD34+形質導入レベルを60％修復するのに充分である。さらに、LAH4-A4の作用は、N末端の先端にさらにリジンを付加することにより改善されない。実際に、LAH4-A4-K3NはLAH4-A4と同様に効率的である(図8B)。
LAH4-A4における最小活性配列を決定するため、より短いペプチドを設計した(図9A)。図9Bに示すように、C末端アラニンの欠失(LAH4-A4-d1aa)は、LAH4-A4の効率をわずかに低下させる。該ペプチドの両側の１個のアミノ酸残基の欠失(LAH4-A4-d2aa)は、LAH4-A4に比べて効率を30％に低下させる。最後に、C末端側の2アミノ酸残基(LAH4-A4-d2Caa)、または3アミノ酸残基(LAH4-A4-d3aa)、または5アミノ酸残基(LAH4-A4-d5aa)の欠失は、LAH4-A4に比べて該効率を15％以下低下させる。結論として、LAH4-A4ペプチド長のわずかな短縮は、hCD34+細胞のレンチウイルス形質導入の促進に有害である。
LAH4-A4を特徴づける4アラニン残基がLAH4-A4の有効性に必要な唯一の4アラニン残基であるか否かを検討するため、LAH4-A4に存在するその他のすべてのアラニン残基(3、8、16、および26位)をロイシン残基で置換した(LAH4-A4-Leu)。このペプチドはまだ活性であるが、有効性はLAH4-A4より２倍低い(図9B)。
次に、LAH4誘導体のらせん構造がレンチウイルス形質導入の促進に極めて重要か否かを検討するため、該らせんの中間(14位)にプロリンを有するペプチドを設計した(LAH4-A4-P14)。図9Bに示すように、該らせんを破壊するプロリンの挿入は、レンチウイルス形質導入を80％無効にし、レンチウイルス形質導入の促進におけるLAH4-A4のらせん構造の役割が極めて重要であることを示唆する。試験したLAH4誘導体はすべてアミド化されているので、アミド化されていないLAH4-A4ペプチド(LAH4-A4-dNH2)を合成した。図9Bに示すように、アミド化LAH4-A4は、アミド化されていないものより約２倍効率が高い。
2007年に、HIV-1感染性の強力な増強因子であることが確認されたヒト前立腺酸性フォスファターゼの断片(アミノ酸残基240〜290)を精液から単離した(Munch et al.、2007)。SEVIと呼ばれるこのペプチド(ウイルス感染のヒト精液増強因子)は、レンチウイルスベクターの形質導入を促進することができる(Wurm et al.、2010)。本発明者らは、SEVIおよびLAH4-A4の、hCD34+細胞のGALVTR-LVによる形質導入を促進する能力について試験した。LAH4-A4またはSEVIペプチドを2,2μMの同じモル濃度で用いた。図10Aに示すように、異なる３臍帯血ドナーから得られたデータは、LAH4-A4存在下の形質導入がSEVI存在下より効率が高いことを示し、形質導入後２日間で明らかな細胞毒性はみられない(図10B)。
LAH4誘導体は、DNAトランスフェクション剤として先に記載されている(Kichler et al、2003)。したがって、本発明者らは、LAH4-A4の、GFPタンパク質発現プラスミドによる293T細胞のトランスフェクション能力を試験した。図11に示すように、12μg/mlのLAH4-A4は、293T細胞のトランスフェクションを効率的に促進するには不十分である。しかしながら、LAH4-A4濃度を24μg/mlに増加させるとLAH4-L1コントロールペプチドで観察されたように293T細胞をより効率的にトランスフェクションすることができる。興味深いことに、同濃度の24μg/mlで、K2-L10A12-K2は、細胞のトランスフェクションを促進することができない。ヒスチジン残基が存在しないことはこの活性にとって有害であるが、同時に12μg/mlのK2-L10A12-K2は、まだLAH4-A4に比べてレンチウイルス形質導入をいくらか促進することができる(図7B)。
ヒト造血前駆細胞のRD114TR-LVまたはGALV-MLVによる形質導入に対するLAH4-L1、LAH4-L4 ISO 、LAH4-A4、およびLAH4-A5の効果
ヒトCD34+細胞を、臍帯血(UCB)試料から得、12μg/mlのLAH4-L1 LAH4-L4ISO、LAH4-A4、またはLAH4-A5の存在下または非存在下でGFPレポーター遺伝子を有するRD114TR-LV(3.8x10E6 TU/ml)またはGALVTR-MLV(5x10E5 TU/ml)で形質導入した。該ペプチドのいかなる細胞毒性作用もみられず、それらすべてが両ウイルスの侵入を促進した(図12)。LAH4-A4ペプチドが最も効率的であった。GALVTR-MLVウイルスを用いる実験は、HIVとは異なるウイルスゲノムによっても感染が改善されることを示す。
ヒトCD34+細胞を、臍帯血(UCB)試料から得、12μg/mlのLAH4-L1 LAH4-L4ISO、LAH4-A4、またはLAH4-A5の存在下または非存在下でGFPレポーター遺伝子を有するRD114TR-LV(3.8x10E6 TU/ml)またはGALVTR-MLV(5x10E5 TU/ml)で形質導入した。該ペプチドのいかなる細胞毒性作用もみられず、それらすべてが両ウイルスの侵入を促進した(図12)。LAH4-A4ペプチドが最も効率的であった。GALVTR-MLVウイルスを用いる実験は、HIVとは異なるウイルスゲノムによっても感染が改善されることを示す。
参考文献
Claims (37)
- ウイルスまたはウイルスベクターによる真核細胞の感染を促進するための、配列番号１で示される配列を有するLAH4ペプチドまたはウイルスまたはウイルスベクターの形質導入効率を改善する能力を有するその機能的誘導体のin vitroまたはex vivo使用であって、 該機能的誘導体が以下のものを含む：
19〜30アミノ酸；
リジンおよび/またはアルギニンから選ばれるpH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むN末端；および
以下からなる群から選ばれる中心らせん領域：
a)該らせんの片側に疎水性アミノ酸残基のクラスターおよび該らせんの他の側に連続アラニン残基を有する無極性らせん、ここで、該連続アラニン残基はSchiffer-Edmundsonのホイール表示において60〜180°の角度を規定する；または
b)該らせんの片側に疎水性アミノ酸残基のクラスターおよび該らせんの他の側にSchiffer-Edmundsonのホイール表示において120〜180°の親水性角度を規定する２〜４個のヒスチジン残基を有する両親媒性らせん、
使用。 - 該機能的誘導体が20〜30アミノ酸を含む、請求項１記載の使用。
- 該機能的誘導体が21〜30アミノ酸を含む、請求項１記載の使用。
- a)に記載のSchiffer-Edmundsonのホイール表示の角度が140°の角度である、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
- b)に記載のSchiffer-Edmundsonのホイール表示の角度が140°の角度である、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
- 該ペプチドのN末端が、アルギニンまたはリジン残基によりもたらされる１または２の正荷電を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
- 該正荷電残基が最もN末端の残基である、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
- 該ペプチドが、アルギニンおよび/またはリジン残基によりもたらされるpH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むC末端を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
- 最もC末端の残基がアラニンであり、該ペプチドのC末端の正荷電アミノ酸残基がC末端アラニンの次にあるか、または
最もC末端の残基が１または２の正荷電アミノ酸である、請求項８記載の使用。 - 該中心らせん領域がb)に記載の両親媒性らせんであり、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において、該ペプチドが該ヒスチジン残基により規定される最小角度のヒスチジン残基間にロイシンまたはアラニン残基のみを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
- 該ペプチドが配列番号1および3〜27からなる群から選ばれる、請求項１記載の使用。
- 以下のものを含む、ウイルスまたはウイルスベクターの形質導入効率を改善する能力を有する配列番号１で示される配列のLAH4ペプチドの機能的誘導体であるカチオン性両親媒性ペプチド：
19〜30アミノ酸；
pH7.4で正に荷電する１〜３個のアミノ酸残基を含むN末端；
Schiffer-Edmundsonのホイール表示において80°〜180°の親水性角度を規定する少なくとも２のヒスチジン残基；および
アラニンおよびロイシン残基から選ばれる該ペプチドのその他のアミノ酸；
ここで、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において、該ペプチドは、該ヒスチジン残基により規定される最小角度中の最も遠位のヒスチジン残基間にアラニン残基のみを含む。 - 該LAH4ペプチドの機能的誘導体が20〜30アミノ酸を含む、請求項１２記載のペプチド。
- 該LAH4ペプチドの機能的誘導体が21〜30アミノ酸を含む、請求項１２記載のペプチド。
- 該少なくとも２のヒスチジン残基が２対のヒスチジン残基である、請求項１２〜１４のいずれかに記載のペプチド。
- 該N末端が、pH7.4で正に荷電する１または２のアミノ酸残基を含む、請求項１２〜１５のいずれかに記載のペプチド。
- 該親水性角度が120〜180°である、請求項１２〜１６のいずれかに記載のペプチド。
- 該親水性角度が140°である、請求項１７に記載のペプチド。
- 以下のものを含む、ウイルスまたはウイルスベクターの形質導入効率を改善する能力を有する配列番号１で示される配列のLAH4ペプチドの機能的誘導体であるペプチド：
19〜30アミノ酸；
pH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むN末端；および
Schiffer-Edmundsonのホイール表示において60〜180°の角度を規定する、該らせんの片側に疎水性アミノ酸残基のクラスター、および該らせんの他の側に連続アラニン残基を有する無極性らせん。 - 以下のものを含む、ウイルスまたはウイルスベクターの形質導入効率を改善する能力を有する配列番号１で示される配列のLAH4ペプチドの機能的誘導体であるカチオン性両親媒性ペプチド：
19〜30アミノ酸；
pH7.4で正に荷電する１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むN末端；および
Schiffer-Edmundsonのホイール表示において140〜180°の親水性角度を規定する少なくとも２のヒスチジン残基；
ここで、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において、該ペプチドは、該ヒスチジン残基により規定される最小角度中の最も遠位のヒスチジン残基間にロイシン残基のみを含む；ただし、該ペプチドは、配列 KKALLALALHHLALLAHLLALHLKKA(配列番号36)およびKKKKALLHLHLLALHLHLLALLALKKK(配列番号37)からなるペプチドを除く。 - 該少なくとも２のヒスチジン残基が４ヒスチジン残基である、請求項２０に記載のペプチド。
- 該LAH4ペプチドの機能的誘導体が20〜30アミノ酸を含む、請求項１９〜２１のいずれかに記載のペプチド。
- 該LAH4ペプチドの機能的誘導体が21〜30アミノ酸を含む、請求項１９〜２１のいずれかに記載のペプチド。
- Schiffer-Edmundsonのホイール表示の角度が140°の角度である、請求項１９〜２３のいずれかに記載のペプチド。
- 8アラニン、4ヒスチジン、10ロイシン、および4リジン残基からなる、配列番号１のLAH4ペプチドの異性体である、請求項２０記載のペプチド。
- 配列番号8〜27からなる群から選ばれるペプチド。
- 真核細胞をウイルスまたはウイルスベクターで感染させるためのin vitroまたはex vivo方法であって、請求項1〜26のいずれかに記載のLAH4ペプチドまたはその機能的誘導体の存在下で該細胞をウイルスまたはウイルスベクターと接触させることを含む、方法。
- 標的細胞へのウイルスベクターによる核酸導入効率を増加させるためのin vitroまたはex vivo方法であって、
核酸(例えば、遺伝子、cDNA、siRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列)の標的細胞への導入を促進するための請求項1〜26のいずれかに記載のLAH4ペプチドまたはその機能的誘導体の存在下で標的細胞を該ウイルスベクターと接触させることを含む、方法。 - 該細胞が造血前駆/幹細胞である、請求項２７または２８に記載の方法。
- 該細胞がCD34+細胞である、請求項２７または２８に記載の方法。
- 該細胞がヒトCD34+細胞である、請求項２７または２８に記載の方法。
- 対象の試料を真核細胞および請求項12〜26のいずれかに記載のLAH4ペプチドまたはその機能的誘導体とインキュベーションし、該試料中に含まれるあらゆるウイルスを増幅し、増幅されたウイルスを同定することを含む対象のウイルスによる感染の診断方法において使用するための、請求項12〜26のいずれかに記載のLAH4ペプチドまたはその機能的誘導体。
- 真核細胞のウイルスまたはウイルスベクターによる感染を促進するための遺伝子療法に用いるための、請求項12〜26のいずれかに記載のペプチド。
- 遺伝子療法においてウイルスまたはウイルスベクターと組み合わせて用いるための、請求項12〜26のいずれかに記載のペプチド。
- ウイルスまたはウイルスベクターがエンベロープ保有ウイルスまたはウイルスベクターである、請求項1〜11のいずれかに記載の使用。
- ウイルスまたはウイルスベクターがエンベロープ保有ウイルスまたはウイルスベクターである、請求項27〜31のいずれかに記載の方法。
- ウイルスまたはウイルスベクターがエンベロープ保有ウイルスまたはウイルスベクターである、請求項32〜34のいずれかに記載のペプチド。
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