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TW202221126A - 用於鑑別及特徵化指環病毒之方法及其用途 - Google Patents

用於鑑別及特徵化指環病毒之方法及其用途 Download PDF

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TW202221126A
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賽門 德拉葛瑞夫
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美商旗艦先鋒創新公司
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Abstract

本發明大體上關於投與指環載體(例如合成指環載體)之組合物及方法，該指環載體可用作遞送媒劑，例如：遞送遺傳物質、遞送例如有效負載之效應子、或遞送治療劑或治療性效應子至真核細胞(例如人類細胞或人類組織)。亦提供擴增包含指環病毒序列之環狀核酸的方法。

Description

用於鑑別及特徵化指環病毒之方法及其用途
持續需要開發用於製造適合之載體以向患者遞送治療性效應子的組合物及方法。
本發明提供用於投與指環載體(例如合成指環載體)之組合物及方法，該指環載體可用作遞送媒劑，例如用於遞送遺傳物質、用於遞送例如有效負載之效應子或用於遞送治療劑或治療性效應子至真核細胞(例如人類細胞或人類組織)。本文中描述例如遞送效應子之方法，其包含向個體投與第一複數個指環載體，且接著投與第二複數個指環載體。在一些實施例中，第二複數個指環載體包含與第一複數個指環載體相同的蛋白質外部。在一些實施例中，第二複數個指環載體包含與第一複數個指環載體中之指環載體有共同之處的具有至少一個表面抗原決定基之蛋白質外部。不希望受理論所束縛，用於基因療法之某些病毒載體引起針對病毒蛋白之免疫反應(例如中和抗體)，使得彼等病毒載體不適合用於向個體重複遞送。如所示，例如在本文實例1中，指環載體似乎不觸發中和免疫反應，且因此適用於多次劑量形式之投與。
本發明進一步提供用於擴增包含指環病毒( Anellovirus)序列之核酸分子的方法，及與此類方法相關之組合物(例如反應混合物及其產物)。該等方法一般涉及提供包含核酸分子(例如環狀核酸分子)之樣品，該核酸分子與引子(例如與簡併引子或對例如如本文所描述之指環病毒序列具有特異性之引子)及DNA聚合酶(例如DNA依賴型DNA聚合酶)接觸。一般而言，若核酸分子包含指環病毒序列(例如包含由引子識別之目標位點的指環病毒序列)，則其與引子及DNA聚合酶之相互作用引起核酸分子之滾環擴增。在一些情況下，引子為複數個引子(例如複數個簡併引子，其中引子之非簡併核苷酸在很大程度上一致；或複數個指環病毒特異性引子，其中該等指環病毒特異性引子各自包含與例如如本文所描述之指環病毒序列結合之一致序列)中之部分。在一些情況下，引子包含如表A中所列之序列。在某些實施例中，複數個引子均包含如表A之單列中所列的序列。
本發明進一步提供用於測定根據本文所描述之擴增方法進行擴增之核酸分子序列的方法，以及分析針對複數個此類經擴增核酸分子所獲得之定序資料的方法。在一些情況下，經擴增核酸分子之序列藉由例如如本文所描述之深度定序方法(亦稱為次世代定序法)測定。在一些情況下，藉由例如如本文所描述之計算方法分析定序資料，以例如自如本文所描述進行擴增之核酸分子鑑別指環病毒序列。
本發明另外提供與指環載體(例如合成指環載體)相關之組合物及方法，該等指環載體例如：包含遺傳元件之指環載體，該遺傳元件包含根據本文所描述之方法鑑別或分離之指環病毒序列；及/或包含一或多個組分(例如衣殼蛋白，例如ORF1分子)之指環載體，該一或多個組分由根據本文所描述之方法鑑別或分離之指環病毒序列編碼。
可用於該等用於遞送本文所描述之效應子的方法中的指環載體及其組分(例如使用如本文所描述之組合物或方法所產生)一般包含囊封於蛋白質外部(例如包含指環病毒衣殼蛋白，例如指環病毒ORF1蛋白質或由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽的蛋白質外部，例如如本文所描述)中之遺傳元件(例如包含或編碼效應子，例如外源性或內源性效應子(例如治療性效應子)之遺傳元件)，該指環載體能夠將遺傳元件引入至細胞(例如，哺乳動物細胞，例如人類細胞)中。在一些實施例中，指環載體為包含蛋白質外部之感染性媒劑或粒子，該蛋白質外部包含由指環病毒ORF1核酸(例如α細環病毒( Alphatorquevirus)、β細環病毒( Betatorquevirus)或γ細環病毒( Gammatorquevirus)之ORF1核酸，例如α細環病毒分枝系1、α細環病毒分枝系2、α細環病毒分枝系3、α細環病毒分枝系4、α細環病毒分枝系5、α細環病毒分枝系6或α細環病毒分枝系7之ORF1，例如如本文所描述)編碼的多肽。本發明之指環載體之遺傳元件通常為環狀及/或單股DNA分子(例如，環狀及單股的)，且一般包括與包圍其之蛋白質外部結合的蛋白質結合序列或包括與其連接之多肽，此可促進遺傳元件包封在蛋白質外部內及/或使遺傳元件相對於其他核酸在蛋白質外部內富集。在一些實施例中，使用如本文所描述之組合物或方法產生指環載體之遺傳元件。
在一些情況下，可用於該等遞送本文所描述之效應子之方法中的指環載體包含遺傳元件，該遺傳元件包含或編碼例如可在細胞中表現之效應子(例如核酸效應子，諸如非編碼RNA，或多肽效應子，例如蛋白質)。在一些實施例中，效應子為治療劑或治療性效應子，例如如本文所描述。在一些實施例中，效應子為內源性效應子或外源性效應子，例如針對野生型指環病毒或目標細胞。在一些實施例中，效應子針對野生型指環病毒或目標細胞為外源性的。在一些實施例中，指環載體可藉由接觸細胞且將編碼效應子之遺傳元件引入細胞中而將效應子遞送至細胞中，使得效應子由細胞製成或表現。在某些情況下，效應子係內源性效應子(例如針對目標細胞為內源性的，但例如藉由指環載體以增加的量提供)。在其他情況下，效應子為外源性效應子。在一些情況下，效應子可調節細胞功能或調節細胞中目標分子之活性或水準。例如，效應子可降低細胞中目標蛋白之水準(例如，如PCT/US19/65995之實例3及4中所描述)。在另一實例中，指環載體可活體內遞送及表現效應子，例如外源性蛋白質(例如，如PCT/US19/65995之實例10及14中所描述)。指環載體可用於例如將遺傳物質遞送至目標細胞、組織或個體；將效應子遞送至目標細胞、組織或個體；或用於治療疾病及病症，例如藉由遞送可作為治療劑操作之效應子至所需細胞、組織或個體。
在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可用於產生待用於投與例如宿主細胞中之本文所描述之指環載體之方法中的合成指環載體之遺傳元件。合成指環載體與野生型病毒(例如野生型指環病毒，例如本文所描述)相比具有至少一個結構差異，例如相對於野生型病毒的缺失、插入、取代、修飾(例如酶修飾)。一般而言，合成指環載體包括包封於蛋白質外部內之外源性遺傳元件，其可用於將遺傳元件或其中所編碼之效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)(例如多肽或核酸效應子)遞送至真核(例如人類)細胞中。在實施例中，指環載體不引起可偵測及/或非所需免疫或炎症反應，例如不會使炎症分子標記物(例如TNF-α、IL-6、IL-12、IFN)以及B細胞反應(例如反應性或中和抗體)增加超過1%、5%、10%、15%，例如指環載體可基本上對目標細胞、組織或個體無免疫原性。
在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可用於產生指環載體之遺傳元件，該指環載體例如可用於遞送本文所描述之效應子的方法中的指環載體，該指環載體包含：(i)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼效應子(例如內源性或外源性效應子)之序列及蛋白質結合序列(例如外部蛋白質結合序列，例如封裝信號)；及(ii)蛋白質外部；其中遺傳元件包封於蛋白質外部(例如衣殼)中；且其中指環載體能夠將遺傳元件遞送至真核(例如，哺乳動物，例如人類)細胞中。在一些實施例中，遺傳元件為單股及/或環狀DNA。替代地或組合地，遺傳元件具有以下特性中之一者、兩者、三者或全部：為環狀，為單股，以小於進入細胞之遺傳元件的約0.0001%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合至細胞之基因體中，及/或以每個基因體小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個複本整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，整合頻率藉由對自游離載體分離之基因體DNA的定量凝膠純化分析法來測定，例如如描述於Wang等人(2004, Gene Therapy11: 711-721，以全文引用的方式併入本文中)中。在一些實施例中，遺傳元件包封於蛋白質外部內。在一些實施例中，指環載體能夠將遺傳元件遞送至真核細胞中。在一些實施例中，遺傳元件包含核酸序列(例如，300-4000個核苷酸之間、例如300-3500個核苷酸之間、300-3000個核苷酸之間、300-2500個核苷酸之間、300-2000個核苷酸之間、300-1500個核苷酸之間的核酸序列)，該核酸序列與野生型指環病毒之序列(例如野生型細環病毒(Torque Teno virus，TTV)、小細環病毒(Torque Teno mini virus，TTMV)或TTMDV序列，例如如本文所描述之野生型指環病毒序列)具有至少75% (例如至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的序列一致性。在一些實施例中，遺傳元件包含核酸序列(例如至少300個核苷酸、500個核苷酸、1000個核苷酸、1500個核苷酸、2000個核苷酸、2500個核苷酸、3000個核苷酸或更多之核酸序列)，該核酸序列與野生型指環病毒之序列(例如如本文所描述之野生型指環病毒序列)具有至少75% (例如至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的序列一致性。在一些實施例中，核酸序列經密碼子最佳化，例如用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現。在一些實施例中，核酸序列中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之密碼子經密碼子最佳化，例如用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現。
在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可用於產生包含衣殼(例如包含指環病毒ORF(例如ORF1)、多肽之衣殼)之感染性(例如針對人類細胞)指環載體、媒劑或粒子之遺傳元件，該衣殼囊封遺傳元件，該遺傳元件包含與衣殼結合之蛋白質結合序列及編碼可用於投與本文所描述之指環載體之方法中的治療性效應子的異源(針對指環病毒)序列。在實施例中，指環載體能夠將遺傳元件遞送至哺乳動物(例如人類)細胞中。在一些實施例中，遺傳元件與野生型指環病毒基因體序列具有小於約6% (例如小於10%、9.5%、9%、8%、7%、6%、5.5%、5%、4.5%、4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.5%或更低)的一致性。在一些實施例中，遺傳元件與野生型指環病毒基因體序列具有不超過1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%或6%的一致性。在一些實施例中，遺傳元件與野生型指環病毒具有至少約2%至至少約5.5% (例如2%至5%、3%至5%、4%至5%)的一致性。在一些實施例中，遺傳元件具有大於約2000、3000、4000、4500或5000個核苷酸之非病毒序列(例如非指環病毒基因體序列)。在一些實施例中，遺傳元件具有大於約2000至5000、2500至4500、3000至4500、2500至4500、3500或4000、4500個(例如約3000至4500個之間)核苷酸之非病毒序列(例如非指環病毒基因體序列)。在一些實施例中，遺傳元件為單股、環狀DNA。替代地或組合地，遺傳元件具有以下特性中之一者、兩者或三者：為環狀，為單股，以小於進入細胞之遺傳元件之約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合至細胞之基因體中，以每個基因體小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個複本整合至目標細胞之基因體中，或以小於進入細胞之遺傳元件之約0.0001%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合(例如相對於細胞裂解物之遺傳元件序列，藉由比較整合至基因體DNA中的頻率)。在一些實施例中，整合頻率藉由對自游離載體分離之基因體DNA的定量凝膠純化分析法來測定，例如如描述於Wang等人(2004, Gene Therapy11: 711-721，以全文引用的方式併入本文中)中。
在一些實施例中，根據本文所描述之方法投與之指環病毒或指環載體可用作有效遞送媒劑，用於將藥劑，諸如本文所描述之效應子引入至目標細胞，例如待治療性或預防性治療之個體中的目標細胞。
在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可用於產生可用於本文所描述之投與方法中的指環載體之遺傳元件，該指環載體包含有包含多肽(例如合成多肽，例如ORF1分子)之蛋白質外部，該多肽包含(例如按順序)： (i)第一區，其包含富含精胺酸區，例如至少約40個胺基酸之序列，該序列包含至少60%、70%或80%鹼性殘基(例如精胺酸、離胺酸或其組合)， (ii)第二區，其包含凝膠捲域(jelly-roll domain)，例如包含至少6個β股之序列， (iii)第三區，其包含本文所描述之N22域序列， (iv)第四區，其包含本文所描述之指環病毒ORF1 C端域(CTD)序列，及 (v)視情況，其中該多肽與例如如本文所描述之野生型指環病毒ORF1蛋白具有小於100%、99%、98%、95%、90%、85%、80%序列一致性的胺基酸序列。
在一態樣中，本發明提供一種擴增包含指環病毒序列之環狀核酸分子的方法，該方法包含：(a)提供一種樣品，其包含有包含指環病毒序列之環狀核酸分子，及與該指環病毒序列之部分具有至少7、8或9個互補處的引子；及(b)使該環狀核酸分子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸；其中該接觸引起該核酸分子或其部分之線性擴增(例如滾環擴增或多股置換擴增)。
在一態樣中，本發明提供一種擴增包含指環病毒序列之環狀核酸分子的方法，該方法包含：(a)提供一種樣品，其包含有包含指環病毒序列之環狀核酸分子；及(b)使該環狀核酸分子與複數個引子接觸，其中，在DNA依賴型DNA聚合酶分子存在下，該等複數個引子中之第一引子具有至少7、8或9個與該指環病毒序列之部分互補的核苷酸；其中該接觸引起該核酸分子或其部分之線性擴增(例如滾環擴增或多股置換擴增)。
在一態樣中，本發明提供一種擴增環狀核酸分子之方法，該方法包含：(a)提供一種樣品，其包含環狀核酸分子及第一引子及第二引子，其中該第一引子與該第二引子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列一致性，且其中該第一引子與該第二引子並不一致；及(b)使該環狀核酸分子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸；其中該接觸引起該核酸分子或其部分之線性擴增(例如滾環擴增或多股置換擴增)。
在一態樣中，本發明提供一種擴增環狀核酸分子之方法，該方法包含：(a)提供一種樣品，其包含環狀核酸分子及複數個不同引子，其中該等複數個引子中之每一者相對於該核酸分子共有相同定向；及(b)使該環狀核酸分子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸；其中該接觸引起該核酸分子或其部分之線性擴增(例如滾環擴增或多股置換擴增)。
在一態樣中，本發明提供一種擴增包含指環病毒序列之環狀核酸分子的方法，該方法包含：(a)提供一種樣品，其包含環狀核酸分子及各自與該指環病毒序列之部分互補之複數個引子；及(b)使該環狀核酸分子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸；其中：(i)該環狀核酸分子包含複數個藉由該一或多個引子識別之序列；(ii)該等複數個引子均為正股引子或均為負股引子；(iii)該等複數個引子均為同股引子；(iv)該等複數個引子均包含至少3、4、5、6、7、8、9或10個共同的連續核苷酸；及/或(v)該等複數個引子包含至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多個不同引子。
在一態樣中，本發明提供一種擴增包含指環病毒序列之環狀核酸分子的方法，該方法包含：(a)提供一種樣品，其包含有包含指環病毒序列之環狀核酸分子，及一或多個與該指環病毒序列之部分互補之引子；及(b)使該環狀核酸分子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸；其中：(i)該環狀核酸分子包含複數個藉由該一或多個引子識別之序列；(ii)該一或多個引子均為正股引子或均為負股引子；(iii)該一或多個引子均為同股引子；(iv)該一或多個引子均包含至少3、4、5、6、7、8、9或10個共同的連續核苷酸；及/或(v)該一或多個引子包含至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多個不同引子。
在一態樣中，本發明提供一種擴增包含指環病毒序列之環狀核酸分子的方法，該方法包含：(a)提供一種樣品，其包含有包含指環病毒序列之環狀核酸分子，及複數個與該指環病毒序列之部分互補之引子；及(b)使該環狀核酸分子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸；其中該接觸引起該核酸分子或其部分之滾環擴增；且其中該等複數個引子之序列彼此至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。
在一態樣中，本發明提供包含根據SEQ ID NO: 1-24中之任一者，例如SEQ ID NO: 1、3、4、6、8、10、12、14、17、19、21或23中之任一者之核酸序列的引子。
在一態樣中，本發明提供一種包含複數個不同引子之混合物，其中該等複數個引子中之每一者結合於包含一或多個序列之核酸分子，該一或多個序列藉由具有如表A中所列之序列的引子識別。
在一態樣中，本發明提供一種套組或包含複數個不同引子之混合物，其中該等複數個引子中之每一者結合於具有SEQ ID NO: 1-24中之任一者，例如SEQ ID NO: 2、5、7、9、11、13、15、16、18、20、22或24中之任一者之序列的核酸分子。
在一態樣中，本發明提供一種套組或混合物，其包含根據SEQ ID NO: 1-24中之任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多者，例如SEQ ID NO: 1、3、4、6、8、10、12、14、17、19、21或23中之任一者之核酸序列。
在一態樣中，本發明提供一種具有SEQ ID NO: 13-24中之任一者之序列的經分離核酸分子。
在一態樣中，本發明提供一種經分離核酸分子(例如環狀核酸分子，例如環狀DNA分子)，其包含：包含硫代磷酸酯之引子序列，該引子序列包含根據SEQ ID NO: 1-12中之任一者之序列；及指環病毒序列之至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000個連續核苷酸。
在一態樣中，本發明提供一種經分離核酸分子(例如環狀核酸分子，例如環狀DNA分子)，其包含：複數個指環病毒序列或其各自包含指環病毒序列之至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000個連續核苷酸的片段；其中指環病毒序列或其片段各自包含有(例如在一末端處)包含硫代磷酸酯之引子序列，該引子序列包含根據SEQ ID NO: 1-12中之任一者的序列。
在一態樣中，本發明提供一種經分離核酸分子(例如核酸構築體)，其包含遺傳元件之序列，該遺傳元件包含可操作地連接於編碼效應子(例如有效負載)之序列的啟動子元件及外部蛋白質結合序列。在一些實施例中，外部蛋白質結合序列包括與指環病毒之5'UTR序列至少75% (至少80%、85%、90%、95%、97%、100%)一致的序列，例如如本文所揭示。在實施例中，遺傳元件為單股DNA，為環狀，以小於進入細胞之遺傳元件之約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合，及/或以每個基因體小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個複本整合至目標細胞之基因體中，或以小於進入細胞之遺傳元件之約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合。在一些實施例中，整合頻率藉由對自游離載體分離之基因體DNA的定量凝膠純化分析法來測定，例如如描述於Wang等人(2004, Gene Therapy11: 711-721，以全文引用的方式併入本文中)中。在實施例中，效應子不來源於TTV且不為SV40-miR-S1。在實施例中，核酸分子不包含TTMV-LY2之聚核苷酸序列。在實施例中，啟動子元件能夠導引效應子在真核(例如哺乳動物，例如人類)細胞中之表現。
在一些實施例中，核酸分子為環狀的。在一些實施例中，核酸分子為線性的。在一些實施例中，本文所描述之核酸分子包含一或多個經修飾之核苷酸(例如鹼基修飾、糖修飾或主鏈修飾)。
在一些實施例中，核酸分子包含編碼ORF1分子(例如指環病毒ORF1蛋白，例如如本文所描述)之序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼ORF2分子(例如指環病毒ORF2蛋白質，例如如本文所描述)之序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼ORF3分子(例如指環病毒ORF3蛋白質，例如如本文所描述)之序列。在一態樣中，本發明提供包含以下中之一者、兩者或三者的遺傳元件：(i)啟動子元件及編碼效應子，例如外源性或內源性效應子之序列；(ii)至少72個與野生型指環病毒序列具有至少75% (例如至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性的連續核苷酸(例如至少72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100或150個核苷酸)；或至少100個(例如至少300、500、1000、1500個)與野生型指環病毒序列具有至少72% (例如至少72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性的連續核苷酸；及(iii)蛋白質結合序列，例如外部蛋白質結合序列，且其中核酸構築體為單股DNA；且其中核酸構築體為環狀，以小於進入細胞之遺傳元件之約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合，及/或以每個基因體小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個複本整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，編碼效應子(例如外源性或內源性效應子，例如如本文所描述)之遺傳元件經密碼子最佳化。在一些實施例中，遺傳元件為環狀的。在一些實施例中，遺傳元件為線性的。在一些實施例中，本文所描述之遺傳元件包含一或多個經修飾之核苷酸(例如鹼基修飾、糖修飾或主鏈修飾)。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼ORF1分子(例如指環病毒ORF1蛋白質，例如如本文所描述)之序列。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼ORF2分子(例如指環病毒ORF2蛋白，例如如本文所描述)之序列。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼ORF3分子(例如指環病毒ORF3蛋白，例如如本文所描述)之序列。
在一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含：(a)核酸分子，其包含編碼ORF1分子、ORF2分子或ORF3分子中之一或多者的序列(例如，編碼本文所描述之指環病毒ORF1多肽的序列)，例如其中該核酸分子為質體，為病毒核酸，或整合至染色體中；及(b)遺傳元件，其中遺傳元件包含(i)可操作地連接於編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)的啟動子元件及(ii)結合(a)之多肽的蛋白質結合序列，其中視情況地，該遺傳元件不編碼ORF1多肽(例如ORF1蛋白質)。例如，宿主細胞包含順式(相同核酸分子之兩部分)或反式(不同核酸分子之每一部分)之(a)及(b)。在實施例中，(b)之遺傳元件為環狀單股DNA。在一些實施例中，宿主細胞為製造細胞株，例如如本文所描述。在一些實施例中，宿主細胞為黏附的或懸浮的，或兩者。在一些實施例中，宿主細胞或輔助細胞在微載體中生長。在一些實施例中，宿主細胞或輔助細胞與cGMP製造實踐相容。在一些實施例中，宿主細胞或輔助細胞在適合於促進細胞生長之培養基中生長。在某些實施例中，在宿主細胞或輔助細胞已充分生長(例如生長至適當細胞密度)後，培養基可與適合於宿主細胞或輔助細胞產生指環載體之培養基進行交換。
在一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含指環載體(例如合成指環載體)，例如可藉由本文所描述之方法投與之指環載體。在實施例中，醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在實施例中，醫藥組合物包含單位劑量，該單位劑量包含每公斤目標個體之約10 5-10 14(例如約10 6-10 13、10 7-10 12、10 8-10 11或10 9-10 10)基因體當量之指環載體。在一些實施例中，包含製劑之醫藥組合物在可接受之時段及溫度內將為穩定的，及/或與所需投與途徑及/或此投與途徑將需要之任何裝置相容，例如針或注射器。在一些實施例中，醫藥組合物經調配而以單次劑量或多次劑量投與。在一些實施例中，醫藥組合物在投與部位處調配，例如由醫療專家調配。在一些實施例中，醫藥組合物包含所需濃度之指環載體基因體或基因體當量(例如如根據每體積之基因體數目所定義)。
在一態樣中，本發明提供一種治療個體之疾病或病症之方法，該方法包含向個體投與指環載體，例如合成指環載體，例如如本文所描述。
在一態樣中，本發明提供一種向細胞、組織或個體遞送效應子或有效負載(例如內源性或外源性效應子)之方法，該方法包含向個體投與指環載體，例如合成指環載體，例如如本文所描述，其中該指環載體包含編碼效應子之核酸序列。在實施例中，有效負載為核酸。在實施例中，有效負載為多肽。
在一態樣中，本發明提供一種將指環載體遞送至細胞之方法，其包含使指環載體，例如合成指環載體，例如如本文所描述，與細胞，例如真核細胞，例如哺乳動物細胞，例如活體內或離體接觸。
在一態樣中，本發明提供一種製備指環載體，例如可用於投與本文所描述之指環載體之方法中的合成指環載體之方法。該方法包括： (a)提供宿主細胞，其包含： (i)第一核酸分子，其包含例如如本文所描述之指環載體之遺傳元件的核酸序列；及 (ii)第二核酸分子，其編碼指環病毒ORF1多肽，或選自ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2的胺基酸序列(例如如本文所描述)或與其具有至少70% (例如至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性的胺基酸序列中之一或多者；以及 (b)在適於複製(例如，滾環複製)遺傳元件之核酸序列的條件下培育宿主細胞，由此產生遺傳元件；及 視情況(c)在適於遺傳元件包封在蛋白質外部(例如，包含由第二核酸分子編碼之多肽)中的條件下培育宿主細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種製造指環載體組合物，例如可用於本文所描述之投與方法中的指環載體組合物之方法，該方法包含(a)、(b)及(c)中之一或多者(例如全部)： a)提供宿主細胞，其包含例如表現指環載體(例如合成指環載體，例如如本文所描述)之一或多種組分(例如所有組分)； b)在適於自該宿主細胞產生指環載體製劑之條件下培養宿主細胞，其中製劑之指環載體包含囊封遺傳元件(例如如本文所描述)之蛋白質外部(例如包含指環載體ORF1多肽)，藉此製備指環載體製劑；及 視情況，c)調配指環載體製劑，例如呈適於向個體投與之醫藥組合物形式。
例如，此製造方法中提供之宿主細胞包含(a)核酸，其包含編碼本文所描述之指環病毒ORF1多肽的序列，其中核酸為質體，為病毒核酸或基因體，或經整合至輔助細胞染色體中；及(b)能夠產生遺傳元件之核酸構築體(例如包含遺傳元件序列及/或遺傳元件區，例如如本文所描述)，例如其中該遺傳元件包含(i)可操作地連接於編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)的啟動子元件，及(i)結合(a)之多肽的蛋白質結合序列(例如封裝序列)，其中宿主細胞包含順式或反式之(a)及(b)。在實施例中，(b)之遺傳元件為環狀單股DNA。在一些實施例中，宿主細胞為製造細胞株。
在一些實施例中，在生產時(例如藉由短暫轉染)將指環載體之組分引入宿主細胞中。在一些實施例中，宿主細胞穩定表現指環載體之組分(例如其中編碼指環載體之組分的一或多種核酸例如藉由穩定轉染引入宿主細胞或其祖細胞中)。
在一態樣中，本發明提供一種製造指環載體組合物之方法，其包含：a)提供複數個本文所描述之指環載體或本文所描述之指環載體製劑；及b)調配指環載體或其製劑，例如調配為適用於向個體投與之醫藥組合物。
在一態樣中，本發明提供一種製造宿主細胞，例如第一宿主細胞或生產細胞(例如，如PCT/US19/65995之圖12中所示)，例如包含指環載體之第一宿主細胞群體之方法，該方法包含將能夠產生遺傳元件(例如如本文所描述)之核酸構築體引入至宿主細胞且在適合於產生指環載體之條件下培養宿主細胞。在實施例中，該方法進一步包含向宿主細胞中引入輔助細胞，例如輔助病毒。在實施例中，該引入包含轉染(例如化學轉染)或電穿孔具有指環載體之宿主細胞。
在一態樣中，本發明提供一種製造指環載體之方法，其包含提供宿主細胞，例如第一宿主細胞或生產細胞(例如PCT/US19/65995之圖12中所示)，該宿主細胞包含例如如本文所描述之指環載體且自宿主細胞純化指環載體。在一些實施例中，在提供步驟之前，該方法進一步包含使宿主細胞與核酸構築體或例如如本文所描述之指環載體接觸，且在適用於產生指環載體之條件下培育宿主細胞。在實施例中，宿主細胞為上述製備宿主細胞之方法中所描述之第一宿主細胞或生產細胞。在實施例中，自宿主細胞純化指環載體包含裂解宿主細胞。
在一些實施例中，該方法進一步包含使由第一宿主細胞或生產細胞產生之指環載體與第二宿主細胞，例如容許細胞(例如如PCT/US19/65995之圖12中所示)，例如第二宿主細胞群體接觸的第二步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含在適用於產生指環載體的條件下培育第二宿主細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含自第二宿主細胞純化指環載體，例如藉此產生指環載體種子群體。在實施例中，自第二宿主細胞群體產生之指環載體比第一宿主細胞群體產生之指環載體多至少約2-100倍。在實施例中，自第二宿主細胞純化指環載體包含裂解第二宿主細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含使由第二宿主細胞產生之指環載體與第三宿主細胞，例如容許細胞(例如如PCT/US19/65995之圖12中所示)，例如第三宿主細胞群體接觸的第二步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含在適用於產生指環載體的條件下培育第三宿主細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含自第三宿主細胞純化指環載體，例如藉此產生指環載體儲備群體。在實施例中，自第三宿主細胞純化指環載體包含裂解第三宿主細胞。在實施例中，自第三宿主細胞群體產生之指環載體比第二宿主細胞群體產生之指環載體多至少約2-100倍。
在一些實施例中，宿主細胞在適合於促進細胞生長之培養基中生長。在某些實施例中，在宿主細胞已充分生長(例如生長至適當細胞密度)後，培養基可與適用於藉由宿主細胞產生指環載體之培養基交換。在一些實施例中，在與第二宿主細胞接觸之前，由宿主細胞產生的指環載體與宿主細胞分離(例如藉由裂解宿主細胞)。在一些實施例中，宿主細胞產生的指環載體不經中間純化步驟而與第二宿主細胞接觸。
在一態樣中，本發明提供一種製造醫藥指環載體製劑，例如待用於本文所描述之投與方法中之製劑的方法。該方法包含(a)製造如本文所描述之指環載體製劑；(b)評估製劑(例如醫藥指環載體製劑、指環載體種子群體或指環載體儲備群體)的一或多個醫藥品質控制參數，例如一致性、純度、效價、效能(例如以基因體當量/指環載體粒子計)；及/或核酸序列，例如來自由指環載體所包含之遺傳元件，及(c)調配用於醫藥用途之製劑，以滿足預定準則的評估，例如滿足醫藥規範。在一些實施例中，評估一致性包含評估(例如確認)指環載體之遺傳元件的序列，例如編碼效應子之序列。在一些實施例中，評估純度包含評估雜質之量，該雜質如以下：例如黴漿菌、內毒素、宿主細胞核酸(例如宿主細胞DNA及/或宿主細胞RNA)、生物衍生之過程雜質(例如血清白蛋白或胰蛋白酶)、複製勝任型試劑(RCA)，例如複製勝任型病毒或非所需之指環載體(例如除所需指環載體外之指環載體，例如如本文所描述之合成指環載體)、游離病毒衣殼蛋白、外來物質(adventitious agent)及聚集物。在一些實施例中，評估效價包含評估製劑中功能性指環載體相對於非功能性指環載體(例如感染性相對於非感染性)之比率(例如如藉由HPLC所評估)。在一些實施例中，評估效能包含評估製劑中可偵測之指環載體功能(例如其中編碼之效應子的表現及/或功能或基因體當量)的水準。
在實施例中，調配製劑基本上不含病原體、宿主細胞污染物或雜質；具有預定水準之非感染性粒子或具有非感染性粒子：感染性單元之預定比率(例如＜300:1、＜200:1、＜100:1或＜50:1)。在一些實施例中，可在單個批次中產生多個指環載體。在實施例中，可評估批次中產生之指環載體之水準(例如單獨或一起)。
在一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含： (i)第一核酸分子，其包含如本文所描述之核酸構築體，及 (ii)視情況，第二核酸分子，其編碼選自ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2的胺基酸序列(例如如本文所描述)或與其具有至少約70% (例如至少約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性的胺基酸序列中之一或多者。
在一態樣中，本發明提供一種反應混合物，其包含本文所描述之指環載體及可用於本文所描述之投與方法中的輔助病毒，其中該輔助病毒包含編碼外部蛋白質(例如能夠結合至外部蛋白質結合序列之外部蛋白質及視情況脂質包膜蛋白)之聚核苷酸、編碼複製蛋白質(例如聚合酶)之聚核苷酸或其任何組合。
在一些實施例中，指環載體(例如合成指環載體)經分離，例如自宿主細胞分離及/或自溶液(例如上清液)中之其他成分分離。在一些實施例中，指環載體(例如合成指環載體)例如自溶液(例如上清液)純化。在一些實施例中，相對於溶液中之其他成分，指環載體在溶液中富集。
在前述指環載體、組合物或方法中之任一者之一些實施例中，提供指環載體包含自包含產生指環載體細胞之組合物分離(例如收集)指環載體，例如如本文所描述。在其他實施例中，提供指環載體包含例如自第三方獲得指環載體或其製劑。
在前述指環載體、組合物或方法中之任一者的一些實施例中，遺傳元件包含指環載體基因體，例如如根據本文所描述之方法鑑別。在實施例中，指環載體基因體包含TTV-tth8核酸序列，例如如下之TTV-tth8核酸，例如具有TTV-tth8核酸序列之核苷酸3436-3707中之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的缺失。在實施例中，指環載體基因體包含TTMV-LY2核酸序列，例如如下之TTMV-LY2核酸序列，例如TTMV-LY2核酸序列之核苷酸574-1371、1432-2210、574-2210及/或2610-2809中之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%經缺失。在實施例中，遺傳元件能夠自我複製及/或自我擴增。在實施例中，遺傳元件不能夠自我複製及/或自我擴增。在實施例中，遺傳元件能夠反式複製及/或反式擴增，例如在輔助細胞，例如輔助病毒存在下。
前述指環載體、組合物或方法中之任一者之額外特徵包括以下所列舉實施例中之一或多者。
熟習此項技術者僅使用常規實驗將認識到或能夠確定本文所描述之本發明之特定實施例的許多等效物。此類等效物意欲由以下所列舉之實施例涵蓋。
所列舉之實施例  1.   一種向先前已經投與第一複數個指環載體之人類個體遞送效應子之方法，該方法包含： 向該個體投與第二複數個指環載體，其中： (i)該等第一複數個指環載體包含： (a)蛋白質外部，其包含ORF1分子； (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)，且 (ii)該等第二複數個指環載體包含： (a)與該等第一複數個指環載體相同之蛋白質外部， 蛋白質外部，其包含與該等第一複數個指環載體之蛋白質外部中之多肽(例如ORF1分子)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的多肽(例如ORF1分子)，或 與該等第一複數個指環載體有共同之處的具有至少一個表面抗原決定基的蛋白質外部，及 (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼效應子(例如(i)(b)之效應子或第二效應子，例如第二外源性或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)， 藉此向該個體遞送該效應子。 2.   如實施例1之方法，其包含向該個體投與該等第一複數個指環載體。 3.   一種向人類個體遞送效應子之方法，其包含： (i)向該個體投與第一複數個指環載體，該等指環載體包含： (a)蛋白質外部，其包含ORF1分子； (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)，且 (ii)隨後向該個體投與第二複數個指環載體，該等指環載體包含： (a)與該等第一複數個指環載體相同之蛋白質外部， 蛋白質外部，其包含與該等第一複數個指環載體之蛋白質外部中之多肽(例如ORF1分子)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的多肽(例如ORF1分子)，或 與該等第一複數個指環載體有共同之處的具有至少一個表面抗原決定基的蛋白質外部，及 (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼效應子(例如(i)(b)之效應子或第二效應子，例如第二外源性或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)， 藉此向該個體遞送該效應子。 4.   一種選擇人類個體接受效應子之方法， 其中該個體先前接受過或經鑑別為已接受，第一複數個指環載體，該等指環載體包含： (a)蛋白質外部，其包含ORF1分子； (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)， 該方法包含選擇該個體接受第二複數個指環載體，該等指環載體包含： 與該等第一複數個指環載體相同之蛋白質外部， 蛋白質外部，其包含與該等第一複數個指環載體之蛋白質外部中之多肽(例如ORF1分子)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的多肽(例如ORF1分子)，或 與該等第一複數個指環載體有共同之處的具有至少一個表面抗原決定基的蛋白質外部。 5.   一種鑑別適合於接受第二複數個指環載體之人類個體的方法，其包含： 將該個體鑑別為已接受第一複數個指環載體，該等指環載體包含： (a)蛋白質外部，其包含ORF1分子； (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)， 其中該個體經鑑別為已接受該等第一複數個指環載體指示該個體適合於接受該等第二複數個指環載體，其中該等第二複數個指環載體包含： 與該等第一複數個指環載體相同之蛋白質外部， 蛋白質外部，其包含與該等第一複數個指環載體之蛋白質外部中之多肽(例如ORF1分子)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的多肽(例如ORF1分子)，或 與該等第一複數個指環載體有共同之處的具有至少一個表面抗原決定基的蛋白質外部。 6.   如實施例4或5之方法，其中該個體係基於已接受該等第一複數個指環載體進行選擇。 7.   如實施例6之方法，其中該個體在輸血中接受該等第一複數個指環載體。 8.   如實施例4或5之方法，其中該個體係在投與該等第一及第二複數個指環載體之間評估，例如對於針對該等第一複數個中之一或多個指環載體之免疫反應(例如抗體)的存在進行評估。 9.   如實施例8之方法，其中若未偵測到免疫反應之存在，則投與該等第二複數個指環載體。 10.  如實施例8之方法，其中若偵測到免疫反應之存在，則投與該等第二複數個指環載體。 11.  如實施例5或6之方法，其中該個體係在投與該等第一及第二複數個指環載體之間評估，例如對於來自該第一複數個中之指環載體或其子代之存在(例如持久性)進行評估。 12.  如實施例11之方法，其中若未偵測到來自該第一複數個中之指環載體或其子代之存在，則投與該等第二複數個指環載體。 13.  如實施例11之方法，其中若偵測到來自該第一複數個中之指環載體或其子代之存在，則投與該等第二複數個指環載體。 14.  一種供用作治療人類個體之藥劑的組合物， 其中該個體先前已經投與第一複數個指環載體，該等指環載體包含： (a)蛋白質外部，其包含ORF1分子； (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)， 該供使用之組合物包含第二複數個指環載體，該等指環載體包含： (a)與該等第一複數個指環載體相同之蛋白質外部， 蛋白質外部，其包含與該等第一複數個指環載體之蛋白質外部中之多肽(例如ORF1分子)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的多肽(例如ORF1分子)，或 與該等第一複數個指環載體有共同之處的具有至少一個表面抗原決定基的蛋白質外部，及 (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)。 15.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該第一及該第二複數個包含約相同劑量之指環載體，例如其中該等第一複數個及該等第二複數個指環載體包含約相同數量及/或濃度之指環載體。 16.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體與該等第一複數個指環載體包含約相同數目之指環載體，例如該第二複數個包含該第一複數個中之指環載體數目的90%-110%，例如95%-105%。 17.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中當在投與時相對於該個體之體重正規化時，該等第二複數個指環載體與該等第一複數個指環載體包含約相同數目之指環載體，例如當在投與時相對於該個體之體重正規化時，該第二複數個包含該第一複數個中之指環載體數目的90%-110%，例如95%-105%。 18.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該第一複數個包含比該第二複數個更大劑量之指環載體，例如其中該第一複數個包含相對於該第二複數個更大數量及/或濃度之指環載體。 19.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該第一複數個包含比該第二複數個更低劑量之指環載體，例如其中該第一複數個包含相對於該第二複數個更低數量及/或濃度之指環載體。 20.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中在向該個體投與該等第一複數個指環載體之後至少1、2、3或4週，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月，或1、2、3、4、5、10或20年，向該個體投與該等第二複數個指環載體。 21.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中在向該個體投與該等第一複數個指環載體之後1-2週、2-3週、3-4週、1-2個月、3-4個月、4-5個月、5-6個月、6-7個月、7-8個月、8-9個月、9-10個月、10-11個月、11-12個月、1-2年、2-3年、3-4年、4-5年、5-10年或10-20年之間，向該個體投與該等第二複數個指環載體。 22.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其進一步包含在投與該等第一複數個指環載體之後及在投與該等第二複數個指環載體之前評定以下中之一或多者： a)該個體中之該效應子之水準或活性(例如藉由例如由ELISA偵測蛋白質效應子；藉由例如由RT-PCR偵測核酸效應子；或藉由偵測效應子之下游效應，例如受效應子影響之內源性基因之水準)； b)該個體中之該等第一複數個指環載體的水準或活性(例如藉由偵測該指環載體之ORF1的水準)； c)投與該指環載體以進行治療之該個體中之疾病之存在、嚴重程度、進展或病徵或症狀。 23.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其進一步包含向該個體投與第三、第四、第五及/或另外複數個指環載體，該等指環載體包含： (a)與該等第一複數個指環載體相同之蛋白質外部， 蛋白質外部，其包含與該等第一複數個指環載體之蛋白質外部中之多肽(例如ORF1分子)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的多肽(例如ORF1分子)，或 與該等第一複數個指環載體有共同之處的具有至少一個表面抗原決定基的蛋白質外部，及 (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之核酸序列(例如DNA序列)。 24.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其包含在至少1、2、3、4或5年之時程內投與重複劑量之指環載體。 25.  如實施例24之方法或供使用之組合物，其中該重複劑量係約每至少1、2、3或4週，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月投與。 26.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該第一複數個及該第二複數個指環載體係經由相同投與途徑投與，例如經由靜脈內投與。 27.  如實施例1至25中任一項之方法或供使用之組合物，其中該第一複數個及該第二複數個指環載體係經由不同投與途徑投與。 28.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及該等第二複數個指環載體係由同一實體(例如同一健康照護提供者)投與。 29.  如實施例1至28中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及該等第二複數個指環載體係由不同實體(例如不同健康照護提供者)投與。 30.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中對於針對指環病毒之免疫反應(例如抗體)的存在來評估該個體，例如其中在投與該第一複數個之前、在投與該第二複數個之前或在投與該第二複數個之後評估該個體。 31.  如前述實施例中之任一項之方法或供使用之組合物，其中向該個體投與免疫抑制劑與該等第一及/或第二複數個指環載體(例如，同時投與，或在之前或在之後投與，使得當該等指環載體存在於該個體中時該免疫抑制劑在該個體中具有活性)。 32.  如實施例1至30中任一項之方法或供使用之組合物，其中不向該個體投與免疫抑制劑與該等第一及/或第二複數個指環載體。 33.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體包含與該等第一複數個指環載體有共同之處的具有至少一個表面抗原決定基的蛋白質外部。 34.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體包含與該等第一複數個指環載體相同之蛋白質外部。 35.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體包含與該等第一複數個指環載體所包含之ORF1分子具有相同胺基酸序列的ORF1分子。 36.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體包含與該等第一複數個指環載體之蛋白質外部具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性之蛋白質外部。 37.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體包含與該等第一複數個指環載體之ORF1分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的ORF1分子。 38.  如實施例37之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體之蛋白質外部包含與該等第一複數個指環載體之蛋白質外部之一或多個胺基酸序列差異(例如保守性突變)。 39.  如實施例18之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體之蛋白質外部包含與該等第一複數個指環載體之蛋白質外部相同的三級結構(例如所計算之均方根偏差(RMSD)為約0，例如0)。 40.  如實施例37之方法或供使用之組合物，其中結合該等第一複數個指環載體之蛋白質外部的抗體亦結合於該等第二複數個指環載體之蛋白質外部。 41.  如實施例40之方法或供使用之組合物，其中該抗體包含於該個體中。 42.  如實施例40或41之方法或供使用之組合物，其中該抗體以對於該等第一複數個指環載體之蛋白質外部關於該等第二複數個指環載體之蛋白質外部約相同的親和力(例如，K D為約90%-110%，例如95%-105%)結合。 43.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體遞送比該等第一複數個指環載體更多的效應子複本(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍之諸多複本)至該個體。 44.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體遞送與該等第一複數個指環載體之約相同數目之效應子複本至該個體。 45.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體以藉由該等第一複數個指環載體向該個體所遞送之效應子複本之至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之水準向該個體遞送該效應子(例如其中藉由該第一複數個遞送之該效應子可與藉由該第二複數個遞送之該效應子相同或不同)。 46.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該效應子為外源性效應子。 47.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體為合成指環載體。 48.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體為重組指環載體。 49.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一複數個指環載體之該效應子為內源性效應子及該等第二複數個指環載體之該效應子為外源性效應子。 50.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該效應子包含生長激素(例如人類生長激素(hGH))。 51.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該效應子包含紅血球生成素(EPO)，例如人類EPO。 52.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體之該效應子與該等第一複數個指環載體之該效應子相同。 53.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體之遺傳元件與該等第一複數個指環載體之遺傳元件相同，或其中該等第一複數個指環載體之遺傳元件與該等第二複數個指環載體之遺傳元件具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。 54.  如實施例1至51中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體之該效應子與該等第一複數個指環載體之該效應子不同。 55.  如實施例1至51及54中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體之該遺傳元件與該等第一複數個指環載體之該遺傳元件不同。 56.  如實施例1至51及54至55中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一複數個指環載體之該效應子為第一外源性效應子，且該等第二複數個指環載體之外源性效應子為第二外源性效應子。 57.  如實施例1至51及54至56中任一項之方法或供使用之組合物，其中： 投與該等第一複數個指環載體以治療該個體之第一疾病或病狀，且 投與該等第二複數個指環載體以治療該個體之第二疾病或病狀。 58.  如實施例1至51中任一項之方法或供使用之組合物，其中： 投與該等第一複數個指環載體以治療該個體之第一疾病或病狀，且 投與該等第二複數個指環載體以治療該個體之該第一疾病或病狀。 59.  一種向人類個體遞送外源性效應子之方法，其包含： (i)向該個體投與第一複數個指環載體，該等指環載體包含： (a)蛋白質外部，其包含ORF1分子； (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼外源性效應子之核酸序列(例如DNA序列)，且 (ii)隨後向該個體投與第二複數個指環載體，該等指環載體包含： (a)包含ORF1分子之蛋白質外部，該ORF1分子與該第一複數個指環載體中之該蛋白質外部中之該ORF1分子具有相同序列，及 (b)遺傳元件，其具有與等第一複數個指環載體之該遺傳元件相同的核酸序列； 藉此向該個體遞送該外源性效應子。 60.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該個體患有血友病。 61.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該個體已接受輸血。 62.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該效應子為內源性效應子。 63.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一複數個指環載體為封裝缺陷型及/或複製缺陷型。 64.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體為封裝缺陷型及/或複製缺陷型。 65.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一複數個指環載體包含活性及非活性粒子之混合物。 66.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第二複數個指環載體包含活性及非活性粒子之混合物。 67.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中包含於該等第一複數個指環載體中之遺傳元件在其投與之後至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150天，例如藉由高解析度熔融(HRM)分析，例如如實例1中所描述，在該個體中可偵測。 68.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中包含於該等第二複數個指環載體中之遺傳元件在其投與之後至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150天，例如藉由高解析度熔融(HRM)分析，例如如實例1中所描述，在該個體中可偵測。 69.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體係自生產細胞分離。 70.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體並非獲自自該個體獲得之生物樣品(例如血液)。 71.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中向該個體投與該等第一複數個指環載體作為第一醫藥組合物之部分。 72.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中向該個體投與該等第二複數個指環載體作為第二醫藥組合物之部分。 73.  如實施例71或72之方法或供使用之組合物，其中該第一醫藥組合物中指環載體之該遺傳元件的至少70%、80%、90%、95%或100%彼此相同。 74.  如實施例71或72之方法或供使用之組合物，其中該第一醫藥組合物中之指環載體之該遺傳元件的至少70%、80%、90%、95%或100%與所需遺傳元件序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%序列一致性。 75.  如實施例71或72之方法或供使用之組合物，其中該第二醫藥組合物中指環載體之該遺傳元件的至少70%、80%、90%、95%或100%彼此相同。 76.  如實施例71或72之方法或供使用之組合物，其中該第二醫藥組合物中之指環載體之該遺傳元件的至少70%、80%、90%、95%或100%與所需遺傳元件序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%序列一致性。 77.  如實施例71或72之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二醫藥組合物不包含紅血球。 78.  如實施例71或72之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二醫藥組合物不包含細胞。 79.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該遺傳元件包含指環病毒5' UTR或與其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。 80.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該遺傳元件包含SEQ ID NO: 41之核苷酸323-393之核酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。 81.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該遺傳元件包含長度為至少100個核苷酸之序列，其在至少80%位置處係由G或C組成。 82.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該遺傳元件包含具有以下富含GC區核苷酸序列的序列： CGGCGGX 1GGX 2GX 3X 4X 5CGCGCTX 6CGCGCGCX 7X 8X 9X 10CX 11X 12X 13X 14GGGGX 15X 16X 17X 18X 19X 20X 21GCX 22X 23X 24X 25CCCCCCCX 26CGCGCATX 27X 28GCX 29CGGGX 30CCCCCCCCCX 31X 32X 33GGGGGGCTCCGX 34CCCCCCGGCCCCCC，其中： X 1= G或C X 2= G、C或不存在 X 3= C或不存在 X 4= G或C X 5= G或C X 6= T、G或A X 7= G或C X 8= G或不存在 X 9= C或不存在 X 10= C或不存在 X 11= G、A或不存在 X 12= G或C X 13= C或T X 14= G或A X 15= G或A X 16= A、G、T或不存在 X 17= G、C或不存在 X 18= G、C或不存在 X 19= C、A或不存在 X 20= C或A X 21= T或A X 22= G或C X 23= G、T或不存在 X 24= C或不存在 X 25= G、C或不存在 X 26= G或C X 27= G或不存在 X 28= C或不存在 X 29= G或A X 30= G或T X 31= C、T或不存在 X 32= G、C、A或不存在 X 33= G或C X 34= C或不存在(SEQ ID NO: 743)。 83.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等指環載體包含胺基酸序列SEQ ID NO: 45或與其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。 84.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體包含一或多個多肽，該一或多個多肽包含選自指環病毒ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1、ORF1/1或ORF1/2的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列中之一或多者。 85.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體包含核酸序列，其編碼選自表12之ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。 86.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體不包含與指環病毒ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。 87.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該遺傳元件為環狀單股DNA。 88.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該遺傳元件以小於進入個體細胞之該等指環載體之1%的頻率整合。 89.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體不包含編碼複製因子及衣殼蛋白中之一者或兩者的聚核苷酸。 90.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一及/或第二複數個指環載體為複製缺陷型的。 91.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該效應子包含： (i)除奈米-螢光素酶以外之胞內多肽； (ii)胞內核酸(例如，miRNA或siRNA)； (iii)分泌多肽，其選自抗體分子、酶、激素、細胞介素分子、補體抑制劑、生長因子或生長因子抑制劑或前述任一者之功能變異體；或 (iv)在突變時引起人類疾病之多肽或該多肽之功能變異體。 92.如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一複數個、該等第二複數個或該等第一及第二複數個指環載體係藉由包含以下之方法製成： a)提供核酸構築體，該核酸構築體包含： i)第一指環病毒遺傳元件，其包含編碼外源性效應子之序列；及 ii)與該第一指環病毒遺傳元件串聯置放之第二指環病毒遺傳元件或其片段；及 iii)視情況，位於(i)與(ii)之間的間隔序列；且 b)使細胞(例如哺乳動物宿主細胞)與該核酸構築體在允許該核酸構築體之該指環病毒遺傳元件被複製或擴增之條件下接觸； 藉此製造該指環載體遺傳元件。 93.  如實施例92之方法或供使用之組合物，其中該第二指環病毒遺傳元件或其片段之長度小於2800、2700、2600、2500、2000、1500、1000、900、800、700、600或500個核苷酸。 94.  如實施例92或93之方法或供使用之組合物，其中該第二指環病毒遺傳元件或其片段相對於第一指環病毒基因體定位3'。 95.  如實施例92至94中任一項之方法或供使用之組合物，其中該第二指環病毒遺傳元件或其片段相對於該第一指環病毒基因體定位5'。 96.  如實施例92至95中任一項之方法或供使用之組合物，其中該核酸構築體包含該間隔序列，其中視情況該間隔序列之長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個胺基酸，或長度在1-5、5-10、10-15或15-20個胺基酸之間。 97.  如實施例92至96中任一項之方法或供使用之組合物，其中該核酸構築體不包含該間隔序列。 98.  如前述實施例中任一項之方法或供使用之組合物，其中該等第一複數個、該等第二複數個或該等第一及第二複數個指環載體係藉由包含以下之方法製成： (i)提供一種昆蟲細胞，其包含： a)指環病毒遺傳元件，該遺傳元件包含可操作地連接於編碼外源性效應子之序列的啟動子，及 b)指環病毒ORF1分子； (ii)在適用於將該指環病毒遺傳元件包封在包含該指環病毒ORF1分子之蛋白質外部中的條件下培育該昆蟲細胞。 99.  如實施例98之方法或供使用之組合物，其中提供該昆蟲細胞包含將編碼指環病毒ORF1分子之核酸構築體引入至該昆蟲細胞中。 100. 如實施例99之方法或供使用之組合物，其中該核酸包含適用於複製昆蟲細胞中之核酸構築體之主鏈區(例如桿狀病毒主鏈區)，視情況其中該主鏈區亦適用於複製細菌細胞中之核酸構築體。 101. 如實施例98至100中任一項之方法或供使用之組合物，其中提供該昆蟲細胞包含將該指環病毒遺傳元件引入至該昆蟲細胞中。 102. 一種擴增包含指環病毒序列之環狀DNA分子的方法，該方法包含： (a)提供一種樣品，其包含有包含指環病毒序列之環狀DNA分子，及具有至少7、8或9個與該指環病毒序列之部分互補的核苷酸之第一引子；且 (b)使該環狀DNA分子與聚合酶分子(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)接觸； 其中該接觸引起該DNA分子或其部分之線性擴增(例如滾環擴增或多股置換擴增)。 103.如實施例102之方法，其中(a)包含使該環狀DNA分子與該引子接觸。 104.一種擴增包含指環病毒序列之環狀DNA分子的方法，該方法包含： (a)提供一種樣品，其包含有包含指環病毒序列之環狀DNA分子；且 (b)使該環狀DNA分子與複數個引子接觸，其中，在聚合酶(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)存在下，該等複數個引子中之第一引子具有至少7、8或9個與該指環病毒序列之部分互補的核苷酸； 其中該接觸引起該DNA分子或其部分之滾環擴增。 105. 如實施例104之方法，其中(b)包含使該環狀DNA分子與該聚合酶分子接觸。 106.如實施例102至105中任一項之方法，其中該樣品包含複數個引子，其具有至少7、8或9個與該指環病毒序列之部分互補的核苷酸。 107.如實施例102至106中任一項之方法，其中該第一引子與複數個第二引子具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列一致性，且其中該第一引子與該第二引子並不一致。 108.如實施例102至107中任一項之方法，其中該等複數個引子中之每一者相對於該環狀DNA分子共有相同定向。 109.如實施例102至108中任一項之方法，其中： (i)該環狀DNA分子包含複數個由該等複數個引子識別之序列； (ii)該等複數個引子均為正股引子或均為負股引子； (iii)該等複數個引子均為同股引子； (iv)該等複數個引子均包含至少3、4、5、6、7、8、9或10個共同的連續核苷酸；及/或 (v)該等複數個引子包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多個不同引子。 110. 如實施例102至109中任一項之方法，其中該第一引子與該第二引子在1、2、3或4個位置處不同，其中視情況該第一引子及該第二引子之長度各自為9個核苷酸。 111.如實施例102至110中任一項之方法，其進一步包含在接觸步驟之前，針對一或多種所關注之成分富集該樣品。 112.如實施例111之方法，其中該一或多種所關注之成分包含核酸分子。 113.如實施例112之方法，其中該一或多種所關注之成分包含非染色體核酸分子，例如環狀非染色體核酸分子及/或病毒核酸分子(例如指環病毒核酸分子，例如指環病毒基因體)。 114.如實施例102至113中任一項之方法，其進一步包含在該接觸步驟之前，使該環狀DNA分子變性，例如藉由使該環狀DNA分子暴露於至少約80℃、85℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃之溫度例如持續至少約1、2、3、4或5分鐘。 115.如實施例114之方法，其進一步包含在變性步驟之後，將該環狀DNA分子冷卻例如至約2℃、3℃、4℃、5℃、6℃或7℃。 116.如實施例102至115中任一項之方法，其進一步包含在該接觸步驟之後，例如在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃下培育該樣品例如持續至少約10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或30小時。 117.如實施例116之方法，其進一步包含在培育步驟之後，在適合於使該聚合酶分子失活之條件(例如在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃下培育該樣品例如持續至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分鐘)下培育該樣品。 118.如實施例102至117中任一項之方法，其中經擴增之核酸分子係藉由PCR，例如使用一或多種泛指環病毒引子驗證，例如如Ninomiya等人. 2008中所描述( J . Clin . Microbiol .46: 507-514；關於泛指環病毒引子及與其相關之方法以引用之方式併入本文中)。 119.如實施例102至118中任一項之方法，其中該經擴增之核酸分子係藉由例如如本文例如實例36中所描述之庫品質控制(QC)技術來評定。 120.如實施例102至119中任一項之方法，其中(b)之該接觸在具有以下特徵中之一或多者的混合物中進行： (i)一或多個引子之濃度為約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8 µM/引子，或0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7或0.7-0.8 µM/引子； (ii)適用於聚合酶分子(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)合成DNA之聚合酶(例如DNA聚合酶)緩衝液(例如Phi29 DNA聚合酶緩衝液)； (iii)包含牛白蛋白血清，例如其濃度為約100、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或300 ng/µL，或約100-150、150-175、175-190、190-200、200-210、210-225、225-250或250-300 ng/µL； (iii)包含dNTP，例如其濃度為約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或2 mM，或約0.5-0.7、0.7-0.9、0.9-1.0、1.0-1.1、1.1-1.3、1.3-1.5或1.5-2 mM；及/或 (iv)其中該聚合酶分子(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)包含Phi29聚合酶，例如其濃度為約1、1.5、2、2.5或3 U/µL，或1-1.5、1.5-2、2-2.5或2.5-3 U/µL。 121.如實施例102至120中任一項之方法，其中該方法不包含熱循環，例如，其中該方法係等溫地執行。 122.如實施例102至121中任一項之方法，其中該擴增包含置換(例如部分或完全置換)藉由該聚合酶分子(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)自該環狀DNA分子合成之股。 123.如實施例102至122中任一項之方法，其中將藉由該聚合酶分子(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)合成之該股釋放至周圍溶液中。 124.如實施例123之方法，其中該聚合酶分子(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)使合成股裂開，藉此釋放該合成股。 125.如實施例102至124中任一項之方法，其中聚合酶分子(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)合成產物股，該產物股包含有環狀DNA分子之序列的複數個複本或其包含其至少1000、2000、2500、3000、3500或4000個連續核苷酸的片段。 126.如實施例125之方法，其中該環狀DNA分子之序列的複數個複本或其片段串聯排列在該產物股內。 127.如實施例102至124中任一項之方法，其中聚合酶分子(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)合成產物股，該產物股包含有環狀DNA分子之序列的一個複本或其包含其至少1000、2000、2500、3000、3500或4000個連續核苷酸的片段。 128.如實施例102至127中任一項之方法，其進一步包含對經擴增環狀DNA分子進行定序。 129.如實施例128之方法，其中該定序包含次世代定序法(例如藉由合成進行定序(例如伊路米那(Illumina)定序)、焦磷酸定序、可逆終止子定序、藉由接合進行定序或奈米孔定序或其任何組合)。 130.如實施例128之方法，其中該定序包含桑格(Sanger)定序。 131.如實施例128至130中任一項之方法，其進一步包含對定序結果進行計算分析。 132.如實施例131之方法，其中該計算分析包含鑑別該等經擴增核酸分子之序列中所表示的一或多個指環病毒序列。 133.如實施例131或132之方法，其中該計算分析包含確定基因體序列或其中所包含及/或編碼之一或多個元件在複數個(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500個)不同擴增核酸分子序列內之序列相似性。 134.如實施例131至133中任一項之方法，其中該計算分析包含測定各樣品、各個體、各組織或細胞類型及/或各時間點所存在之指環病毒序列。 135.如實施例131至134中任一項之方法，其中該計算分析包含測定各樣品、各個體、各組織或細胞類型及/或各時間點所存在之獨特指環病毒譜系。 136.如實施例131至135中任一項之方法，其中該計算分析包含將一個樣品中存在之序列與另一個樣品進行比較。 137.如實施例131至136中任一項之方法，其中該計算分析包含將一個個體中存在之序列與另一個個體進行比較。 138.如實施例131至137中任一項之方法，其中該計算分析包含將一種組織或細胞類型中存在之序列與另一種組織或細胞類型進行比較。 139.如實施例131至138中任一項之方法，其中該計算分析包含將一個時間點時存在之序列與另一個時間點時存在之序列進行比較。 140.如實施例131至139中任一項之方法，其中該計算分析包含對該等序列或其部分(例如，包含或編碼以下中之一或多者的部分：TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、TAIP、三開放閱讀框架區、聚(A)信號及/或富含GC區)進行多維縮放(MDS)。 141.如實施例131至140中任一項之方法，其中該計算分析包含系統發生分析。 142.如實施例133之方法，其中包含及/或編碼於該指環病毒之基因體序列中的該一或多個元件包含以下中之一或多者：TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、TAIP、三開放閱讀框架區、聚(A)信號及/或富含GC區。 143.如實施例102至142中任一項之方法，其中該樣品係獲自個體(例如人類個體，例如健康或無症狀人類個體)。 144.如實施例143之方法，其中該樣品為生物樣品。 145.如實施例144之方法，其中該生物樣品包含血液或血清。 146.如實施例102至145中任一項之方法，其中該樣品包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個不同環狀DNA分子(例如包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個不同指環病毒序列)。 147.如實施例102至146中任一項之方法，其中該方法係對複數個樣品(例如至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、125、126、127、128、129、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000個樣品)例如同時進行。 148.如實施例147之方法，其中該等複數個樣品係例如依序或同時自複數個個體(例如人類個體)獲得，例如至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、125、126、127、128、129、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000個個體。 149.如實施例147或148之方法，其中該等複數個樣品係獲自複數個時間點(例如複數個樣品在多個時間點獲自同一個體，或複數個樣品在多個時間點獲自複數個個體)。 150.如實施例147至149中任一項之方法，其中該等複數個樣品係獲自複數種組織或細胞類型，例如至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100種不同組織或細胞類型。 151. 一種引子，其包含根據SEQ ID NO: 1-24中之任一者，例如SEQ ID NO: 1、3、4、6、8、10、12、14、17、19、21或23中之任一者的核酸序列。 152. 如實施例151之引子，其長度為9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。 153.一種套組或混合物，其包含複數個不同引子， 其中該等複數個引子中之每一者結合於具有SEQ ID NO: 1-24中之任一者，例如SEQ ID NO: 2、5、7、9、11、13、15、16、18、20、22或24中之任一者之序列的核酸分子。 154. 一種套組或混合物，其包含複數個不同引子，該等引子包含根據SEQ ID NO: 1-24中之任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多，例如SEQ ID NO: 1、3、4、6、8、10、12、14、17、19、21或23中之任一者之核酸序列。 155. 如實施例153至154中任一項之套組或混合物，其中該等複數個引子中之一或多個引子包含根據CGAATGGYW之核酸序列(SEQ ID NO: 1)，例如其中複數個引子包含根據2、3或所有CGAATGGCA、CGAATGGCT、CGAATGGTA或CGAATGGTT之任何組合的核酸序列。 156. 如實施例153至155中任一項之套組或混合物，其中該等複數個引子中之一或多個引子包含根據YTGYGGBTG之核酸序列(SEQ ID NO: 3)，例如其中複數個引子包含根據2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有CTGCGGCTG、CTGCGGGTG、CTGCGGTTG、CTGTGGCTG、CTGTGGGTG、CTGTGGTTG、TTGCGGCTG、TTGCGGGTG、TTGCGGTTG、TTGTGGCTG、TTGTGGGTG或TTGTGGTTG之任何組合的核酸序列。 157. 如實施例153至156中任一項之套組或混合物，其中該等複數個引子中之一或多個引子包含根據YAGAMACMM之核酸序列(SEQ ID NO: 4)，例如其中複數個引子包含根據2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或所有CAGAAACAA、CAGAAACAC、CAGAAACCA、CAGAAACCC、CAGACACAA、CAGACACAC、CAGACACCA、CAGACACCC、TAGAAACAA、TAGAAACAC、TAGAAACCA、TAGAAACCC、TAGACACAA、TAGACACAC、TAGACACCA或TAGACACCC之任何組合的核酸序列。 158. 如實施例153至157中任一項之套組或混合物，其中該等複數個引子中之一或多個引子包含根據GTACCAYTTR之核酸序列(SEQ ID NO: 977)，例如其中複數個引子包含根據2、3或所有GTACCACTTA (SEQ ID NO: 984)、GTACCACTTG (SEQ ID NO: 985)、GTACCATTTA (SEQ ID NO: 986)、GTACCATTTG (SEQ ID NO: 987)之任何組合的核酸序列。 159. 如實施例153至158中任一項之套組或混合物，其中該等複數個引子中之一或多個引子包含根據SACCACWAAC之核酸序列(SEQ ID NO: 6)，例如其中複數個引子包含根據2、3或所有GACCACAAAC (SEQ ID NO: 988)、GACCACTAAC (SEQ ID NO: 989)、CACCACAAAC (SEQ ID NO: 990)或CACCACTAAC (SEQ ID NO: 991)之任何組合的核酸序列。 160. 如實施例153至159中任一項之套組或混合物，其中該等複數個引子中之一或多個引子包含根據CACCGACVA之核酸序列(SEQ ID NO: 979)，例如其中複數個引子包含根據2或所有CACCGACAA、CACCGACCA或CACCGACGA之任何組合的核酸序列。 161.如實施例153至160中任一項之套組，其中視情況，各引子在單獨容器中。 162.如實施例153至161中任一項之混合物。 163. 如實施例153至162中任一項之混合物，其進一步包含聚合酶分子(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)或包含指環病毒序列之環狀核酸分子中之一者或兩者。 164.一種經分離核酸分子，其包含序列為SEQ ID NO: 13-24中之任一者的一或多個序列。 165.一種擴增環狀核酸分子之方法，該方法包含： (a)提供一種樣品，其包含如實施例63之環狀核酸分子及如實施例153至163中任一項之混合物或如實施例153或154之引子； (b)使該環狀核酸分子與該聚合酶分子(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)接觸； 其中該接觸引起該核酸分子或其部分之線性擴增(例如滾環擴增或多股置換擴增)。 166.一種環狀DNA分子，其包含：包含硫代磷酸酯之引子序列，該引子序列包含根據SEQ ID NO: 1-12中之任一者之序列；及指環病毒序列之至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000個連續核苷酸。 167.如實施例166之環狀DNA分子，其中該引子序列包含一或多個(例如1或2個)硫代磷酸酯鍵聯。 168. 如實施例167之環狀DNA分子，其包含1或2個硫代磷酸酯鍵聯，其中視情況，該環狀DNA分子中之所有其他鍵聯為磷酸酯鍵聯。 169.一種DNA分子，其包含複數個指環病毒序列或其各自包含該指環病毒序列之至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000個連續核苷酸的片段； 其中該等指環病毒序列或其片段各自包含有(例如，在一末端處)包含硫代磷酸酯之引子序列，該引子序列包含根據SEQ ID NO: 1-12中之任一者之序列。 170.如實施例169之DNA分子，其中該等指環病毒序列或其片段串聯排列。 171.如實施例169或170之DNA分子，其中該等引子序列各自包含一或多個(例如1或2個)硫代磷酸酯鍵聯。 172.如實施例169至171中任一項之DNA分子，其包含一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個)序列，該等序列各自與如PCT/US2019/065995之表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1-B5、1、3、5、7、9、11、13、15或17中之任一者所列之指環病毒元件具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。 173.如實施例172之DNA分子，其中該等序列與如PCT/US2019/065995之表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1-B5、1、3、5、7、9、11、13、15或17中之任一者所列之TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、TAIP、三開放閱讀框架區、聚(A)信號或富含GC區具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。 174.如實施例102至173中任一項之引子、方法、混合物或核酸分子，其中該引子包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。 175.如實施例102至174中任一項之方法、混合物或核酸分子，其中該複數個中之各引子的長度係獨立地選自9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。 176.如實施例102至175中任一項之方法、混合物或核酸分子，其中該複數個中之各引子之核苷酸長度相同。 177.如實施例102至176中任一項之方法、混合物或核酸分子，其中該複數個中之各引子之長度為9個核苷酸。 178.如實施例102至177中任一項之方法或混合物，其中該聚合酶分子為DNA依賴型DNA聚合酶分子，例如Phi29 DNA聚合酶分子。 179.如實施例102至178中任一項之方法或混合物，其中該聚合酶分子(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)可合成至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60或70 kb之DNA產物。 180.如實施例102至179中任一項之方法、混合物或核酸分子，其中各引子包含一或多個(例如1或2個)硫代磷酸酯鍵聯。 181.如實施例180之方法、混合物或核酸分子，其中一或多個硫代磷酸酯修飾各定位於該引子中之三個最3'核苷酸中的兩者之間。 182.如實施例181之方法、混合物或核酸分子，其中一個硫代磷酸酯修飾定位於該引子之3'端處的第一與第二核苷酸之間。 183.如實施例181或182之方法、混合物或核酸分子，其中一個硫代磷酸酯修飾定位於該引子之3'端處的第二與第三核苷酸之間。 184.如實施例102至183中任一項之方法、混合物或核酸分子，其中該環狀DNA分子為單股的。
本發明之其他特徵、目標及優點將自實施方式及圖式及自申請專利範圍顯而易知。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與於本發明所屬領域一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻均以全文引用之方式併入本文中。另外，該等材料、方法及實例僅為說明性的且不意欲為限制性的。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年6月17日申請之美國臨時申請案第63/040,371號；2020年12月23日申請之第63/130,074號；及2021年2月8日申請之第63/147,029號的權益。前述申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
定義將關於特定實施例及參考某些圖式描述本發明，但本發明不限於此，而僅僅受申請專利範圍限制。除非另外指示，否則如下文所闡述之術語一般應按其常識來理解。
當術語「包含」用於本發明說明書及申請專利範圍時，不排除其他要素。出於本發明之目，認為術語「由……組成(consisting of)」為術語「包含(comprising of)」之較佳實施例。若下文中將群組定義為包含至少一定數目個實施例，則此亦理解為揭示較佳僅由此等實施例組成之群組。
除非另外具體規定，否則若在提及單數名詞時使用不定冠詞或定冠詞，例如「一(a)」、「一(an)」或「該(the)」，則其包括複數個該名詞。
措辭「用於治療、調節等的化合物、組合物、產物等」應理解為係指適用於治療、調節等指示目的之化合物、組合物、產物等本身。措辭「用於治療、調節等的化合物、組合物、產物等」另外揭示，作為一實施例，此類化合物、組合物、產物等用於治療、調節等。
措辭「用於……之化合物、組合物、產物等」、「化合物、組合物、產物等在製造用於……之藥劑、醫藥組合物、獸醫組合物、診斷組合物等中的用途」或「用作藥劑……之化合物、組合物、產物等」指示此類化合物、組合物、產物等將待用於可在人類或動物體上實施之治療方法中。其被視為關於治療方法等的實施例及申請專利範圍之等效揭示內容。若實施例或技術方案因此係指「用於治療疑似患有疾病之人類或動物的化合物」，則此亦被視為揭示「化合物在製造用於治療疑似患有疾病之人類或動物之藥劑中之用途」或「藉由向疑似患有疾病之人類或動物投與化合物進行治療之方法」。措辭「用於治療、調節等的化合物、組合物、產物等」應理解為係指適用於治療、調節等指示目的之化合物、組合物、產物等本身。
若在下文中將術語、值、數目等之實例提供於括號中，則此應理解為括號中提及之實例可構成實施例之指示。例如，若其陳述為「在實施例中，核酸分子包含與表1之編碼指環病毒ORF1的核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列(例如，表1之核酸序列的核苷酸571-2613)」，則隨後一些實施例係關於包含與表1之核酸序列的核苷酸571-2613具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列的核酸分子。
如本文所用，術語「擴增」係指複製核酸分子或其一部分以產生核酸分子或其一部分之一或多個額外複本(例如遺傳元件或遺傳元件區)。在一些實施例中，擴增引起核酸序列部分複製。在一些實施例中，經由滾環複製進行擴增。
如本文所用，術語「指環載體」係指包含包封於蛋白質外部之遺傳元件(例如環狀DNA)的媒劑，例如遺傳元件實質上受保護而不經蛋白質外部之DNA酶I消化。如本文所用，「合成指環載體」通常係指非天然存在之指環載體，例如具有相對於野生型病毒(例如如本文所述之野生型指環病毒)不同的序列。在一些實施例中，合成指環載體經工程改造或重組，例如包含相對於野生型病毒基因體(例如如本文所述之野生型指環病毒基因體)包含差異或修飾的遺傳元件。在一些實施例中，包封於蛋白質外部內涵蓋由蛋白質外部100%覆蓋以及小於100%，例如95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更小覆蓋。例如，只要遺傳元件保留在蛋白質外部中或受保護而不被DNA酶I消化，例如在進入宿主細胞之前，則蛋白質外部中可存在間隙或不連續處(例如，使蛋白質外部對水、離子、肽或小分子可透)。在一些實施例中，指環載體經純化，例如其與其原始來源分離及/或實質上不含(＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%)其他組分。在一些實施例中，指環載體能夠將遺傳元件引入至目標細胞中(例如經由感染)。在一些實施例中，指環載體為感染性合成指環病毒病毒粒子。
如本文所用，術語「指環病毒序列」係指天然存在之指環病毒或其片段之序列。該術語包括已在申請日時經鑑別之指環病毒序列以及尚未鑑別或定序之其他指環病毒序列。在一些情況下，如本文關於核酸序列所用之術語「指環病毒序列」係指包含具有至少約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、3500或4000個核苷酸之核酸序列的核酸分子，其中該核酸序列與包含於例如如本文所述之已知指環病毒基因體中的具有相同長度之連續序列具有至少約50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些情況下，指環病毒序列可包含完整病毒(例如指環病毒)基因體序列。在其他情況下，指環病毒序列可包含部分病毒(例如指環病毒)基因體序列。在一些情況下，指環病毒序列包含以下中之一或多者的核酸序列：具有天然存在(例如野生型)之指環病毒(例如，具有如本文提供之表中之任一者中所註釋或如由所列之序列編碼的指環病毒)的TATA盒、加帽位點、起始元件、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1編碼序列、ORF1/1編碼序列、ORF1/2編碼序列、ORF2編碼序列、ORF2/2編碼序列、ORF2/3編碼序列、ORF2t/3編碼序列、三個開放閱讀框架區、聚(A)信號、富含GC之區或其任何組合。在一些情況下，指環病毒序列包含至少一個不同於例如如本文所述之已知指環病毒基因體的差異(例如，相對於其之點突變、取代、缺失、插入或修飾)。
如本文所用，術語「抗體分子」係指一種蛋白質，例如包含至少一個免疫球蛋白可變域序列的免疫球蛋白鏈或其片段。術語「抗體分子」涵蓋全長抗體及抗體片段(例如scFv)。在一些實施例中，抗體分子為多特異性抗體分子，例如該抗體分子包含複數個免疫球蛋白可變域序列，其中該複數個中之第一免疫球蛋白可變域序列對第一抗原決定基具有結合特異性且該複數個中之第二免疫球蛋白可變域序列對第二抗原決定基具有結合特異性。在實施例中，多特異性抗體分子為雙特異性抗體分子。雙特異性抗體分子之一般由對於第一抗原決定基具有結合特異性之第一免疫球蛋白可變域序列及對於第二抗原決定基具有結合特異性之第二免疫球蛋白可變域序列特徵化。
如本文所用，術語「互補」當用於描述第一核苷酸序列與第二核苷酸序列關係時，係指第一及第二核苷酸序列在指定條件下經由匹配鹼基對而雜交及形成雙螺旋結構的能力。例如，此類條件可為嚴格雜交條件，諸如在1x phi29 DNA聚合酶緩衝液(NEB)中。可應用其他條件，諸如可能在生物體內部遇到的生理學相關條件。熟習此項技術者將能夠確定最適於根據雜交核苷酸之最用應用測試兩個序列之互補性的條件集合。互補之兩個序列可完全互補(100%匹配鹼基對)或可含有一或多個失配(例如1、2、3、4、5個失配或至多約1%、2%或5%失配)。
如本文所用，「編碼」之核酸係指編碼胺基酸序列或聚核苷酸，例如mRNA或功能性聚核苷酸(例如非編碼RNA，例如siRNA或miRNA)的核酸序列。
如本文所用，「外源性」試劑(例如效應子、核酸(例如RNA)、基因、有效負載、蛋白質)係指不包含或不由對應野生型病毒(例如如本文所述之指環病毒)編碼的試劑。在一些實施例中，外源性試劑並非天然存在，諸如具有相對於天然存在之蛋白質或核酸改變(例如藉由插入、缺失或取代)之序列的蛋白質或核酸。在一些實施例中，外源性試劑並不天然存在於宿主細胞中。在一些實施例中，外源性試劑天然存在於宿主細胞中但對於病毒為外源性的。在一些實施例中，外源性試劑天然存在於宿主細胞中，但不以所需含量或所需時間存在。
如本文所用，關於另一試劑或元件(例如效應子、核酸序列、胺基酸序列)的「異源性」試劑或元件(例如效應子、核酸序列、胺基酸序列)係指例如在野生型病毒(例如指環病毒)中未天然發現於一起的試劑或元件。在一些實施例中，異源核酸序列可如天然存在之核酸序列(例如指環病毒中天然存在之序列)存在於相同核酸中。在一些實施例中，異源性試劑或元件相對於指環病毒為外源性的，其中指環載體之其他元件(例如剩餘部分)係基於該指環病毒。
如本文所用，術語「遺傳元件」係指包封於或可包封於(例如免於被DNA酶I消化)蛋白質外部內，例如以形成如本文中所述之指環載體的核酸分子。應理解，遺傳元件可以裸DNA形式產生且視情況進一步組裝成蛋白質外部。亦應理解，指環載體可將其遺傳元件插入細胞中，使得遺傳元件存在於細胞中且蛋白質外部不一定進入細胞。
如本文所用，「遺傳元件構築體」係指包含至少一個(例如兩個)遺傳元件序列或其片段之核酸構築體(例如質體、桿狀病毒質體、黏質體或微型環)。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含至少一個全長遺傳元件序列。在一些實施例中，遺傳元件包含全長遺傳元件序列及部分遺傳元件序列。在一些實施例中，遺傳元件包含兩個或更多個部分遺傳元件序列(例如以5'至3'之順序，5'截短之遺傳元件序列與3'截短之遺傳元件序列串聯排列，例如如圖27C中所示)。
如本文所用，術語「遺傳元件區」係指包含遺傳元件之序列的構築體區。在一些實施例中，遺傳元件區包含與野生型指環病毒序列或其片段具有足夠一致性之序列，以由蛋白質外部包封，藉此形成指環載體(例如與野生型指環病毒序列或其片段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列)。在實施例中，遺傳元件區包含蛋白質結合序列，例如如本文所述(例如如本文所述之5' UTR、3' UTR及/或富含GC之區，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列)。在一些實施例中，遺傳元件區可進行滾環複製。在一些實施例中，遺傳元件包含Rep蛋白結合位點。在一些實施例中，遺傳元件包含Rep蛋白置換位點。在一些實施例中，包含遺傳元件區之構築體不包封於蛋白質外部中，但由構築體產生之遺傳元件可包封於蛋白質外部中。在一些實施例中，包含遺傳元件區之構築體進一步包含載體主鏈。
如本文所用，當相對於基因體(例如指環病毒基因體)或其片段使用時，術語「突變體」係指相對於對應的野生型指環病毒序列具有至少一種變化的序列。在一些實施例中，突變體基因體或其片段包含相對於對應的野生型指環病毒序列的至少一種單核苷酸多型性、添加、缺失或框移。在一些實施例中，突變體基因體或其片段包含相對於對應野生型指環病毒序列的至少一個指環病毒ORF (例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2中之一或多者)的缺失。在一些實施例中，突變體基因體或其片段包含相對於對應野生型指環病毒序列的所有指環病毒ORF (例如所有ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及ORF1/2)的缺失。在一些實施例中，突變體基因體或其片段包含相對於對應野生型指環病毒序列的至少一個指環病毒非編碼區(例如5' UTR、3' UTR及/或富含GC之區中之一或多者)的缺失。在一些實施例中，突變基因體或其片段包含或編碼外源性效應子。
「ORF分子」係指具有指環病毒ORF蛋白(例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2蛋白)或其功能片段之活性及/或結構特徵的多肽。當一般使用(亦即「ORF分子」)時，多肽可包含本文所述之指環病毒ORF (例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2)或其功能片段中之任一者的活性及/或結構特徵。當與修飾劑一起用於指示特定開放閱讀框架(例如「ORF1分子」、「ORF2分子」、「ORF2/2分子」、「ORF2/3分子」、「ORF1/1分子」或「ORF1/2分子」)時，通常意謂多肽包含對應指環病毒ORF蛋白質或其功能片段(例如如下文所定義之「ORF1分子」)之活性及/或結構特徵。舉例而言，「ORF2分子」包含指環病毒ORF2蛋白或其功能片段的活性及/或結構特徵。
如本文所用，術語「ORF1分子」係指具有指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述的指環病毒ORF1蛋白)或其功能片段之活性及/或結構特徵的多肽。在一些情況下，ORF1分子可以包含以下一或多者(例如1、2、3或4者)：包含至少60%鹼性殘基(例如至少60%精胺酸殘基)之第一區、包含至少約六條β股之第二區(例如至少4、5、6、7、8、9、10、11或12條β股)、包含指環病毒N22域(例如如本文所述，例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白的N22域)之結構或活性的第三區、及/或包含指環病毒C端域(CTD) (例如如本文所述，例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白的CTD)之結構或活性的第四區。在一些情況下，ORF1分子以N端至C端之順序包含第一、第二、第三及第四區。在一些情況下，指環載體包含有以N端至C端之順序包含第一、第二、第三及第四區的ORF1分子。在一些情況下，ORF1分子可包含由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽。在一些情況下，ORF1分子可進一步包含異源序列，例如高變區(HVR)，例如來自指環病毒ORF1蛋白之HVR，例如如本文所述。如本文所用，「指環病毒ORF1蛋白」係指由指環病毒基因體(例如野生型指環病毒基因體，例如如本文所述)編碼之ORF1蛋白。
如本文所用，術語「ORF2分子」係指具有指環病毒ORF2蛋白(例如如本文所述的指環病毒ORF2蛋白)或其功能片段之活性及/或結構特徵的多肽。如本文所用，「指環病毒ORF2蛋白」係指由指環病毒基因體(例如野生型指環病毒基因體，例如如本文所述)編碼之ORF2蛋白。
如本文所用，術語「引子」係指核酸序列，其可結合至模板核酸且允許互補股在適當酶及緩衝劑條件存在下聚合。在一些實施例中，引子包含DNA。在一些實施例中，引子之長度在8與15個核苷酸之間，例如在9與13個核苷酸之間，例如超過4個但小於30、25、20、15或10個核苷酸。
如本文所用，術語「蛋白質外部」係指主要為(例如＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%)蛋白質之外部組分。
如本文所用，術語「調控核酸」係指修飾編碼表現產物之DNA序列的表現(例如轉錄及/或轉譯)的核酸序列。在實施例中，表現產物包含RNA或蛋白質。
如本文所用，術語「調控序列」係指修飾目標基因產物之轉錄的核酸序列。在一些實施例中，調控序列為啟動子或強化子。
如本文所用，術語「Rep」或「複製蛋白」係指促進病毒基因體複製之蛋白質，例如病毒蛋白。在一些實施例中，複製蛋白為指環病毒Rep蛋白。
如本文所用，術語「Rep結合位點」係指由Rep蛋白(例如指環病毒Rep蛋白)識別且結合之核酸分子內之核酸序列。在一些實施例中，Rep結合位點包含5' UTR (例如包含髮夾環)。在一些實施例中，Rep結合位點包含複製起點(ORI)。
如本文所用，術語「Rep置換位點」係指核酸分子內之核酸序列，其能夠引起與核酸分子相關聯(例如結合至)之Rep蛋白(例如指環病毒Rep蛋白)以在到達Rep置換位點後釋放核酸分子。在一些實施例中，Rep置換位點包含5' UTR (例如包含髮夾環)。在一些實施例中，Rep置換位點包含複製起點(ORI)。
如本文所用，「實質上非病原性」生物體、粒子或組分係指不會例如在宿主生物體(例如哺乳動物，例如人類)中引起或誘導不可接受之疾病或病原性病狀之生物體、粒子(例如病毒或指環載體，例如如本文所述)或其組分。在一些實施例中，向個體投與指環載體可引起作為護理標準之一部分可接受的輕微反應或副作用。
如本文所用，術語「非病原性」係指例如在宿主生物體(例如哺乳動物，例如人類)中不會引起或誘導不可接受之疾病或病原性病狀的生物體或其組分。
如本文所用，「實質上非整合型」遺傳元件係指一種遺傳元件，例如病毒或指環載體中之遺傳元件，例如如本文所述，其中進入宿主細胞(例如真核細胞)或生物體(例如哺乳動物，例如人類)中之小於約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%或1%之遺傳元件整合至基因體中。在一些實施例中，遺傳元件不會以可偵測方式整合至例如宿主細胞之基因體中。在一些實施例中，可使用如本文中所述之技術，例如核酸定序、PCR偵測及/或核酸雜交來偵測遺傳元件至基因體中之整合。在一些實施例中，整合頻率藉由對自游離載體分離之基因體DNA的定量凝膠純化分析法來測定，例如Wang等人(2004， Gene Therapy11: 711-721，以全文引用的方式併入本文中)中所述。
如本文所用，「實質上非免疫原性」生物體、粒子或組分係指例如在宿主組織或生物體(例如哺乳動物，例如人類)中不會引起或誘導非所需或非靶向免疫反應的生物體、粒子(例如病毒或指環載體，例如如本文所述)或其組分。在實施例中，實質上非免疫原性生物體、粒子或組分不產生臨床上顯著之免疫反應。在實施例中，實質上非免疫原性指環載體不產生針對蛋白質的臨床上顯著之免疫反應，該蛋白質包含胺基酸序列或由指環病毒或指環載體遺傳元件之核酸序列編碼。在實施例中，免疫反應(例如非所需或非靶向免疫反應)係藉由分析個體中之抗體(例如中和抗體)存在或含量(例如抗指環載體抗體之存在或含量，例如針對如本文所述之指環載體之抗體的存在或含量)來偵測，例如根據Tsuda等人中所述之抗TTV抗體偵測方法(1999; J . Virol . Methods77: 199-206；以引用之方式併入本文中)及/或Kakkola等人中所述之用於測定抗TTV IgG含量之方法(2008; Virology382: 182-189；以引用之方式併入本文中)。針對指環病毒或基於指環病毒之指環載體的抗體(例如中和抗體)亦可藉由此項技術中用於偵測抗病毒抗體之方法來偵測，例如偵測抗AAV抗體之方法，例如如Calcedo等人(2013; Front . Immunol .4(341): 1-7；以引用之方式併入本文中)中所述。
如本文所用，「子序列」係指分別包含於較大核酸序列或胺基酸序列中的核酸序列或胺基酸序列。在一些情況下，子序列可以包含較大序列之域或功能片段。在一些情況下，子序列可以包含當與較大序列分離時能夠形成二級及/或三級結構之較大序列的片段，當與較大序列之其餘部分存在時該較大序列的片段類似於由子序列形成之二級及/或三級結構。在一些情況下，子序列可經另一序列置換(例如，包含外源序列之子序列或與較大序列之其餘部分異源的序列，例如來自不同指環病毒之對應子序列)。
如本文所用，「治療(treatment)」、「治療(treating)」及其同源詞係指對意欲改善、減輕、穩定、預防或治癒疾病、病理性病狀或病症之患者的醫療管理。此術語包括主動性治療(針對改善疾病、病理性病狀或病症之治療)、病因性治療(針對相關疾病、病理性病狀或病症之病因的治療)、緩解性治療(針對症狀緩解而設計之治療)、預防性治療(針對預防、最小化或部分或完全地抑制相關疾病、病理性病狀或病症之發展的治療)及支持性治療(用於補充另一療法之治療)。
本發明大體上關於投與指環載體之方法及其用途。本發明提供指環載體、包含指環載體之組合物及製成或使用指環載體之方法。指環載體通常可用作遞送媒劑，例如用於將治療劑遞送至真核細胞。一般而言，指環載體將包括遺傳元件，該遺傳元件包含包封於蛋白質外部內之核酸序列(例如編碼效應子，例如外源性效應子或內源性效應子)。指環載體可包括相對於指環病毒序列(例如如本文所述)之一或多個序列缺失(例如如本文所述之區或域)。指環載體可用作實質上非免疫原性媒劑，用於將遺傳元件或其中編碼之效應子(例如多肽或核酸效應子，例如如本文所述)遞送至真核細胞中，例如用於治療包含該等細胞之個體之疾病或病症。本發明大體上關於擴增包含指環病毒序列之核酸分子的方法、對此類擴增之核酸分子進行定序的方法、分析針對此類擴增之核酸分子獲得之序列資料的方法及用於此類方法之組合物。使用本文所述之方法測定的指環病毒序列在一些情況下可用於產生指環載體，例如合成指環載體，例如包括於如本文所述之指環載體之遺傳元件中。
目錄  I.用於製成指環載體之組合物及方法 A.指環載體之組分及組裝 i.用於組裝指環載體之ORF1分子 ii.用於組裝指環載體之ORF2分子 B.遺傳元件構築體 i.質體 ii.環狀核酸構築體 iii.活體外環化 iv.順式/反式構築體 v.表現卡匣 vi.遺傳元件構築體之設計及產生 C.效應子 D.宿主細胞 i.將遺傳元件引入至宿主細胞中 ii.提供呈順式或反式之指環病毒蛋白質的方法 iii.輔助物 iv.例示性細胞類型 E.培養條件 F.收集 I.用於製成指環載體之組合物及方法 A.指環載體之組分及組裝 i.用於組裝指環載體之ORF1分子 ii.用於組裝指環載體之ORF2分子 B.遺傳元件構築體 i.質體 ii.環狀核酸構築體 iii.活體外環化 iv.順式/反式構築體 v.表現卡匣 vi.遺傳元件構築體之設計及產生 C.效應子 D.宿主細胞 i.將遺傳元件引入至宿主細胞中 ii.提供呈順式或反式之指環病毒蛋白質的方法 iii.輔助物 iv.例示性細胞類型 E.培養條件 F.收集 G.富集及純化 II.指環載體 A.指環病毒 B. ORF1分子 C. ORF2分子 D.遺傳元件 E.蛋白質結合序列 F. 5' UTR區 G.富含GC之區 H.效應子 I.調控序列 J.複製蛋白質 K.其他序列 L.蛋白質外部 III.核酸構築體 IV.組合物 V.宿主細胞 VI.使用方法 VII.投與/遞送 VIII.擴增指環病毒序列之方法 A. DNA擴增 a.滾環擴增 b.引子 c.樣品及目標序列 B.定序 C.計算分析
I.用於製成指環載體之組合物及方法  在一些態樣中，本發明提供用於遞送效應子之指環載體及其方法。在一些實施例中，可如下文所述製成指環載體或其組件。在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可用於產生遺傳元件或遺傳元件構築體。在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可以用於產生一或多個指環病毒ORF分子(例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2分子，或其功能片段或剪接變異體)。在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可用於例如在宿主細胞中產生蛋白質外部或其組分(例如ORF1分子)。在一些實施例中，可使用串聯構築體製成指環載體或其組分，例如如美國臨時申請案63/038,483中所述，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，可使用桿狀病毒質體/昆蟲細胞系統製成指環載體或其組分，例如如美國臨時申請案第63/038,603號中所述，其以全文引用的方式併入本文中。
不希望受理論所束縛，滾環擴增可經由Rep蛋白與Rep結合位點(例如包含5' UTR，例如包含髮夾環及/或複製起點，例如如本文所述)結合而發生，該結合位點位於相對於遺傳元件區之5'處(或在5'區內)。Rep蛋白可接著繼續通過遺傳元件區，引起遺傳元件之合成。遺傳元件可接著環化且接著包封於蛋白質外部內以形成指環載體。
指環載體之組分及組裝本文中之組合物及方法可用於產生指環載體。如本文所述，指環載體一般包含包封於蛋白質外部(例如包含由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如如本文所述)內之遺傳元件(例如單股環狀DNA分子，例如包含如本文所述之5' UTR區)。在一些實施例中，遺傳元件包含一或多個編碼指環病毒ORF (例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2中之一或多者)之序列。如本文所用，指環病毒ORF或ORF分子(例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2)包括多肽，該多肽包含與對應指環病毒ORF序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，例如如PCT/US2018/037379或PCT/US19/65995中所述(其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)。在實施例中，遺傳元件包含編碼指環病毒ORF1或其剪接變異體或功能片段的序列(例如凝膠捲區，例如如本文所述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含由指環病毒ORF1核酸(例如指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段)編碼之多肽。
在一些實施例中，藉由在蛋白質外部(例如如本文所述)內包封遺傳元件(例如如本文所述)來組裝指環載體。在一些實施例中，遺傳元件包封於宿主細胞中之蛋白質外部內(例如如本文所述)。在一些實施例中，宿主細胞表現蛋白質外部所包含之一或多種多肽(例如由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如ORF1分子)。例如，在一些實施例中，宿主細胞包含編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列，例如指環病毒ORF1多肽之剪接變異體或功能片段(例如野生型指環病毒ORF1蛋白或由野生型指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如如本文所述)。在實施例中，編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列包含於核酸構築體(例如質體、病毒載體、病毒、微型環、桿狀病毒質體或人造染色體)中，該核酸構築體包含於宿主細胞中。在實施例中，編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列整合至宿主細胞之基因體中。
在一些實施例中，宿主細胞包含遺傳元件及/或包含遺傳元件之序列的核酸構築體。在一些實施例中，核酸構築體係選自質體、病毒核酸、微型環、桿狀病毒質體或人造染色體。在一些實施例中，遺傳元件自核酸構築體切除，且視情況自雙股形式轉化成單股形式(例如藉由變性)。在一些實施例中，遺傳元件由基於核酸構築體中之模板序列之聚合酶產生。在一些實施例中，聚合酶產生遺傳元件序列之單股複本，其可視情況環化以形成如本文所述之遺傳元件。在其他實施例中，核酸構築體為藉由活體外環化遺傳元件之核酸序列產生之雙股微型環。在實施例中，將經活體外環化(IVC)之微型環引入至宿主細胞中，在宿主細胞中其轉化為適用於包封於蛋白質外部中之單股遺傳元件，如本文所述。
例如用於組裝指環載體之 ORF1 分子 指環載體可例如藉由將遺傳元件包封於蛋白質外部內而製成。指環載體之蛋白質外部一般包含由指環病毒ORF1核酸(例如指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段，例如如本文所述)編碼之多肽。在一些實施例中，ORF1分子可包含以下中之一或多者：包含富含精胺酸之區之第一區，例如具有至少60%鹼性殘基(例如至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%鹼性殘基；例如60%-90%、60%-80%、70%-90%或70-80%之間的鹼性殘基)之區，及包含凝膠捲域之第二區，例如至少六條β股(例如4、5、6、7、8、9、10、11或12條β股)。在實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1富含精胺酸之區、凝膠捲區、N22域、高變區及/或C端域中之一或多者(例如1、2、3、4或全部5者)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1凝膠捲區(例如如本文所述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1富含精胺酸之區(例如如本文所述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1 N22域(例如如本文所述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒高變區(例如如本文所述)。在一些實施例中，蛋白質外部包含指環病毒ORF1C端域(例如如本文所述)。
在一些實施例中，指環載體包含ORF1分子及/或編碼ORF1分子之核酸。一般而言，ORF1分子包含具有指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白)或其功能片段之結構特徵及/或活性的多肽。在一些實施例中，ORF1分子包含相對於指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白)之截短。在一些實施例中，ORF1分子經截短指環病毒ORF1蛋白之至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或700個胺基酸。在一些實施例中，ORF1分子包含與例如如本文所述之α細環病毒屬(Alphatorquevirus)、β細環病毒屬(Betatorquevirus)或γ細環病毒屬(Gammatorquevirus) ORF1蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。ORF1分子通常可結合至核酸分子，諸如DNA (例如遺傳元件，例如如本文所述)。在一些實施例中，ORF1分子定位至細胞核。在某些實施例中，ORF1分子定位至細胞之細胞核。
不希望受理論所束縛，ORF1分子可能能夠結合至其他ORF1分子，例如以形成蛋白質外部(例如如本文所述)。此類ORF1分子可描述為能夠形成衣殼。在一些實施例中，蛋白質外部可包封核酸分子(例如如本文中所述之遺傳元件，例如使用如本文中所述之組合物或構築體產生)。在一些實施例中，複數個ORF1分子可形成多聚體，例如以產生蛋白質外部。在一些實施例中，多聚體可為均多聚體。在其他實施例中，多聚體可為雜多聚體。
在一些實施例中，向個體投與包含如本文所述之ORF1分子的第一複數個指環載體。在一些實施例中，包含本文所述之ORF1分子的第二複數個指環載體隨後在投與第一複數個指環載體後投與至個體。在一些實施例中，第二複數個指環載體包含具有與第一複數個指環載體包含之ORF1分子相同的胺基酸序列的ORF1分子。在一些實施例中，第二複數個指環載體包含與第一複數個指環載體包含之ORF1分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的ORF1分子。
例如用於組裝指環載體之 ORF2 分子 使用本文所述之組合物或方法產生指環載體可涉及表現指環病毒ORF2分子(例如如本文所述)或其剪接變異體或功能片段。在一些實施例中，指環載體包含ORF2分子或其剪接變異體或功能片段，及/或編碼ORF2分子或其剪接變異體或功能片段之核酸。在一些實施例中，指環載體不包含ORF2分子或其剪接變異體或功能片段，及/或編碼ORF2分子或其剪接變異體或功能片段之核酸。在一些實施例中，產生指環載體包含表現ORF2分子或其剪接變異體或功能片段，但ORF2分子不併入至指環載體中。
例如用於組裝指環載體之遺傳元件構築體如本文所述之指環載體之遺傳元件可由包含遺傳元件區及視情況存在之其他序列(諸如載體主鏈)之遺傳元件構築體產生。一般而言，遺傳元件構築體包含指環病毒5' UTR (例如如本文所述)。遺傳元件構築體可為適用於將遺傳元件之序列遞送至宿主細胞中之任何核酸構築體，其中遺傳元件可包封於蛋白質外部內。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含啟動子。在一些實施例中，遺傳元件構築體為線性核酸分子。在一些實施例中，遺傳元件構築體為環狀核酸分子(例如質體、桿狀病毒質體或微型環，例如如本文所述)。在一些實施例中，遺傳元件構築體可為雙股的。在其他實施例中，遺傳元件為單股的。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含DNA。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含RNA。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含一或多個經修飾之核苷酸。
在一些態樣中，本發明提供一種複製及繁殖如本文所述之指環載體之方法(例如在細胞培養系統中)，其可包含以下步驟中之一或多者：(a)將遺傳元件(例如線性化)引入(例如轉染)至對指環載體感染敏感之細胞株中；(b)收集細胞且視情況分離展示遺傳元件存在之細胞；(c)培養步驟(b)中獲得之細胞(例如持續至少三天，諸如至少一週或更久)，其取決於實驗條件及基因表現；及(d)收集步驟(c)之細胞，例如如本文所述。
質體在一些實施例中，遺傳元件構築體為質體。質體將一般包含如本文所述之遺傳元件之序列以及適用於在宿主細胞中複製之複製起點(例如細菌細胞中複製之細菌複製起點)及可選標記(例如抗生素抗性基因)。在一些實施例中，遺傳元件之序列可自質體切除。在一些實施例中，質體能夠在細菌細胞中複製。在一些實施例中，質體能夠在哺乳動物細胞(例如人類細胞)中複製。在一些實施例中，質體之長度為至少300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000或5000 bp。在一些實施例中，質體之長度為小於600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000 bp。在一些實施例中，質體之長度在300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-4000或4000-5000 bp之間。在一些實施例中，遺傳元件可自質體切除(例如藉由活體外環化)，例如以形成微型環，例如如本文所述。在實施例中，遺傳元件之切除將遺傳元件序列與質體主鏈分開(例如將遺傳元件與細菌主鏈分開)。
小環狀核酸構築體在一些實施例中，遺傳元件構築體為環狀核酸構築體，例如缺乏主鏈(例如缺乏細菌複製起點及/或可選標記)。在實施例中，遺傳元件為雙股環狀核酸構築體。在實施例中，雙股環狀核酸構築體係藉由活體外環化(IVC)產生，例如如本文所述。在實施例中，雙股環狀核酸構築體可引入至宿主細胞中，在其中其可轉化為或用作用於產生單股環狀遺傳元件之模板，例如如本文所述。在一些實施例中，環狀核酸構築體不包含質體主鏈或其功能片段。在一些實施例中，環狀核酸構築體之長度為至少2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400或4500 bp。在一些實施例中，環狀核酸構築體之長度小於2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5500或6000 bp。在一些實施例中，環狀核酸構築體之長度在2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、2900-3000、3000-3100、3100-3200、3200-3300、3300-3400、3400-3500、3500-3600、3600-3700、3700-3800、3800-3900、3900-4000、4000-4100、4100-4200、4200-4300、4300-4400或4400-4500之間。在一些實施例中，環狀核酸構築體為微型環。
活體外環化在一些情況下，待封裝至蛋白質外部中之遺傳元件為單股環狀DNA。在一些情況下，遺傳元件可經由具有除單股環狀DNA以外之形式的遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。舉例而言，遺傳元件構築體可為雙股環狀DNA。雙股環狀DNA隨後可在宿主細胞(例如包含適用於滾環複製之酶的宿主細胞，例如指環病毒Rep蛋白，例如Rep68/78、Rep60、RepA、RepB、Pre、MobM、TraX、TrwC、Mob02281、Mob02282、NikB、ORF50240、NikK、TecH、OrfJ或TraI，例如如Wawrzyniak等人 2017, Front . Microbiol .8: 2353中所述；其就所列酶而言以引用的方式併入本文中)中轉化為單股環狀DNA。在一些實施例中，雙股環狀DNA係藉由活體外環化(IVC)產生，例如如實例15中所述。
一般而言，活體外環化DNA構築體可藉由消化待封裝之遺傳元件構築體(例如包含遺傳元件之序列的質體)產生，使得該遺傳元件序列作為線性DNA分子切除。所得線性DNA可接著例如使用DNA連接酶連接，以形成雙股環狀DNA。在一些情況下，藉由活體外環化產生之雙股環狀DNA可經歷例如如本文所述之滾環複製。不希望受理論所束縛，經考慮活體外環化產生可在無進一步修飾之情況下進行滾環複製之雙股DNA構築體，由此能夠產生具有適合待封裝於指環載體中之尺寸的單股環狀DNA，例如如本文所述。在一些實施例中，雙股DNA構築體小於質體(例如細菌質體)。在一些實施例中，雙股DNA構築體自質體(例如細菌質體)切除且接著例如藉由活體外環化而環化。
順式 / 反式構築體在一些實施例中，如本文所述之遺傳元件構築體包含一或多個編碼一或多個指環病毒ORF之序列，例如蛋白質外部組分(例如由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如如本文所述)。例如，遺傳元件構築體可包含編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列。此類遺傳元件構築體可適於以順式將遺傳元件及指環病毒ORF引入至宿主細胞中。在其他實施例中，如本文所述之遺傳元件構築體不包含編碼一或多個指環病毒ORF之序列，例如蛋白質外部組分(例如由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如如本文所述)。例如，遺傳元件構築體可不包含編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列。此類遺傳元件構築體可適用於將遺傳元件引入至宿主細胞中，其中一或多個指環病毒ORF以反式提供(例如經由引入編碼指環病毒ORF中之一或多者的第二核酸構築體，或經由整合至宿主細胞之基因體中的指環病毒ORF卡匣)。
在一些實施例中，遺傳元件構築體包含編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段的序列(例如凝膠捲區，例如如本文所述)。在一些實施例中，不包含遺傳元件序列之遺傳元件部分包含編碼指環病毒ORF1分子之序列或其剪接變異體或功能片段(例如在包含啟動子及編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段之序列的卡匣中)。在其他實施例中，包含遺傳元件序列之構築體部分包含編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段(例如凝膠捲區，例如如本文所述)的序列。在實施例中，將此類遺傳元件包封於蛋白質外部(例如如本文所述)中產生複製組分指環載體(例如在感染細胞後使得細胞能夠產生指環載體之額外複本而不將其他核酸構築體(例如編碼如本文所述之一或多個指環病毒ORF)引入至細胞中的指環載體)。
在其他實施例中，遺傳元件不包含編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段的序列(例如凝膠捲區，例如如本文所述)。在實施例中，將此類遺傳元件包封於蛋白質外部(例如如本文所述)中產生複製缺陷型指環載體(例如在感染細胞後不能使感染細胞產生額外指環載體之指環載體，例如在不存在一或多種額外構築體，例如編碼如本文所述之一或多個指環病毒ORF的情況下)。
表現卡匣在一些實施例中，遺傳元件構築體包含一或多個用於表現多肽或非編碼RNA (例如miRNA或siRNA)的卡匣。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含用於表現效應子(例如外源性或內源性效應子)，例如如本文所述之多肽或非編碼RNA的卡匣。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含用於表現指環病毒蛋白質(例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2或其功能片段)的卡匣。在一些實施例中，表現卡匣可位於遺傳元件序列內。在實施例中，效應子之表現卡匣位於遺傳元件序列內。在實施例中，指環病毒蛋白質之表現卡匣位於遺傳元件序列內。在其他實施例中，表現卡匣位於遺傳元件構築體內遺傳元件序列之外的位置處(例如主鏈中)。在一些實施例中，指環病毒蛋白質之表現卡匣位於遺傳元件構築體內遺傳元件序列之外的位置處(例如主鏈中)。
多肽表現卡匣一般包含啟動子及編碼多肽之編碼序列，該多肽例如效應子(例如如本文所述之外源性或內源性效應子)或指環病毒蛋白(例如編碼指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2或其功能片段的序列)。可包括於多肽表現卡匣中(例如以驅動多肽表現)之例示性啟動子包括但不限於組成性啟動子(例如CMV、RSV、PGK、EF1a或SV40)、細胞或組織特異性啟動子(例如骨骼α-肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白輕鏈2A啟動子、肌縮蛋白啟動子、肌肉肌酸激酶啟動子、肝白蛋白啟動子、B型肝炎病毒核心啟動子、骨鈣化素啟動子、骨唾液蛋白啟動子、CD2啟動子、免疫球蛋白重鏈啟動子、T細胞受體a鏈啟動子、神經元特異性烯醇化酶(NSE)啟動子或神經絲輕鏈啟動子)及誘導性啟動子(例如鋅誘導性綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子；地塞米松(Dex)誘導性小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子；T7聚合酶啟動子系統、四環素抑制性系統、四環素誘導性系統、RU486誘導性系統、雷帕黴素誘導性系統)，例如如本文所述。在一些實施例中，表現卡匣進一步包含強化子，例如如本文所述。
遺傳元件構築體之設計及產生各種方法可用於合成遺傳元件構築體。舉例而言，遺傳元件構築體序列可分成更易於合成之較小重疊片段(例如在約100 bp至約10 kb區段或個別ORF範圍內)。此等DNA區段由一組重疊單股寡核苷酸合成。接著將所得重疊合成子組裝成較大DNA片段，例如遺傳元件構築體。區段或ORF可例如藉由活體外再結合或5'及3'末端處之獨特限制位點組裝成遺傳元件構築體，以實現連接。
遺傳元件構築體可由設計演算法合成，該演算法將構築體序列解析為寡核苷酸長度的片段，產生適用於合成之設計條件，其考慮序列空間之複雜性。隨後在基於半導體之高密度晶片上化學合成寡核苷酸，其中每個晶片合成超過200,000個個別寡核苷酸。用諸如BioFab®之組裝技術組裝寡核苷酸，以自較小寡核苷酸建構較長DNA區段。此係以並行方式進行，因此一次性建構數百至數千個合成DNA區段。
各遺傳元件構築體或遺傳元件構築體區段可經序列驗證。在一些實施例中，RNA或DNA之高通量定序可使用允許監測生物過程(例如miRNA表現或對偶基因變化性(SNP偵測)之AnyDot.chips (Genovoxx, Germany)進行。其他高產量定序系統包括Venter, J., 等人 Science 2001年2月16日；Adams, M.等人, Science 2000年3月24日；及M. J, Levene等人 Science 299:682-686, 2003年1月以及美國公開申請案第20030044781號及第2006/0078937號中所揭示之彼等定序系統。總體而言，此類系統涉及經由在核酸分子上量測之聚合反應藉由暫時添加鹼基來定序具有複數個鹼基之目標核酸分子，亦即，即時追蹤核酸聚合酶在待定序之模板核酸分子上的活性。在一些實施例中，進行霰彈槍定序(shotgun sequencing)。
遺傳元件構築體可經設計以使得用於複製或封裝之因子可相對於遺傳元件以順式或反式提供。例如，當以順式供應時，遺傳元件可以包含編碼指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3的一或多個基因，例如如本文所述。在一些實施例中，複製及/或封裝信號可併入至遺傳元件中，例如以誘導擴增及/或囊封。在一些實施例中，將效應子插入至基因體中之特定位點中。在一些實施例中，一或多個病毒ORF經效應子置換。
在另一實例中，當複製或封裝因子以反式提供時，遺傳元件可缺乏編碼指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3中之一或多者的基因，例如如本文所述；此種蛋白質或多種蛋白質可例如由另一核酸，例如輔助核酸提供。在一些實施例中，最小順式信號(例如5' UTR及/或富含GC之區)存在於遺傳元件中。在一些實施例中，遺傳元件不編碼複製或封裝因子(例如，複製酶及/或衣殼蛋白)。在一些實施例中，此類因子可由一或多種輔助核酸(例如輔助病毒核酸、輔助質體或整合至宿主細胞基因體中之輔助核酸)提供。在一些實施例中，輔助核酸表現足以誘導擴增及/或封裝之蛋白質及/或RNA，但可能缺乏其自身的封裝信號。在一些實施例中，將遺傳元件及輔助核酸引入至宿主細胞中(例如同時或分開)，引起遺傳元件之擴增及/或封裝，但不引起輔助核酸之擴增及/或封裝。
在一些實施例中，可使用電腦輔助設計工具設計遺傳元件構築體。
製造構築體之一般方法描述於例如Khudyakov及Fields, Artificial DNA : Methods and Applications, CRC Press (2002)；Zhao, Synthetic Biology : Tools and Applications, (第一版), Academic Press (2013)；以及Egli及Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids, (第一版), Wiley-VCH (2012)中。
效應子本文所述之組合物及方法可用於產生包含編碼效應子(例如外源性效應子或內源性效應子)之序列的指環載體之遺傳元件，例如如本文所述。在一些情況下，效應子可為內源性效應子或外源性效應子。在一些實施例中，效應子係治療性效應子。在一些實施例中，效應子包含多肽(例如治療性多肽或肽，例如如本文所述)。在一些實施例中，效應子包含非編碼RNA (例如miRNA、siRNA、shRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反義RNA或gRNA)。在一些實施例中，效應子包含例如如本文所述之調控核酸。
在一些實施例中，效應子編碼序列可例如在非編碼區處插入至遺傳元件中，例如安置於遺傳元件之開放閱讀框之3'及富含GC之區之5'的非編碼區、在TATA盒上游之5'非編碼區中、在5' UTR中、在多腺苷酸信號下游之3'非編碼區中或在富含GC之區上游。在一些實施例中，效應子編碼序列可插入至遺傳元件中，例如編碼序列中(例如編碼指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3之序列中，例如如本文所述)。在一些實施例中，效應子編碼序列替代開放閱讀框架之全部或一部分。在一些實施例中，遺傳元件包含可操作地連接於效應子編碼序列之調控序列(例如啟動子或強化子，例如如本文所述)。
宿主細胞本文所述之指環載體可以在例如宿主細胞中產生。一般而言，提供包含指環載體遺傳元件及指環載體蛋白質外部組分(例如由指環病毒ORF1核酸或指環病毒ORF1分子編碼之多肽)的宿主細胞。接著在適用於將遺傳元件包封於蛋白質外部內之條件(例如如本文所述之培養條件)下培育宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞在適用於將指環載體自宿主細胞釋放至例如周圍上清液中之條件下進一步培育。在一些實施例中，裂解宿主細胞以自細胞裂解物收集指環載體。在一些實施例中，可將指環載體引入至生長至高細胞密度的宿主細胞株中。
將遺傳元件引入至宿主細胞中可將包含遺傳元件之序列的遺傳元件或核酸構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，將遺傳元件本身引入至宿主細胞中。在一些實施例中，將包含遺傳元件(例如如本文所述)之序列的遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。遺傳元件或遺傳元件構築體可例如使用此項技術中已知之方法引入至宿主細胞中。例如，可藉由轉染(例如穩定轉染或短暫轉染)將遺傳元件或遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。在實施例中，藉由脂染胺(lipofectamine)轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。在實施例中，藉由磷酸鈣轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，藉由電穿孔將遺傳元件或遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，使用基因槍將遺傳元件或遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，遺傳元件或遺傳元件構築體藉由核轉染引入至宿主細胞中。在一些實施例中，藉由PEI轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，藉由使宿主細胞與包含遺傳元件之指環載體接觸而將遺傳元件引入至宿主細胞中。
在一些實施例中，遺傳元件構築體一旦引入至宿主細胞中便能夠複製。在一些實施例中，一旦引入至宿主細胞中遺傳元件可自遺傳元件構築體中產生。在一些實施例中，遺傳元件藉由聚合酶，例如使用遺傳元件構築體作為模板在宿主細胞中產生。
在一些實施例中，將遺傳元件或包含遺傳元件之載體引入(例如轉染)至表現病毒聚合酶蛋白質之細胞株中，以實現指環載體之表現。為此目的，表現指環載體聚合酶蛋白質之細胞株可用作適當宿主細胞。宿主細胞可類似地經工程改造以提供其他病毒功能或額外功能。
為製備本文揭示之指環載體，遺傳元件構築體可用於轉染提供複製及生產所需之指環載體蛋白質及功能的細胞。替代地，細胞可經第二構築體(例如病毒)轉染，在藉由本文揭示之遺傳元件或包含遺傳元件之載體轉染之前、期間或之後提供指環載體蛋白質及功能。在一些實施例中，第二構築體可適用於補充不完全病毒粒子之產生。第二構築體(例如病毒)可具有條件性生長缺陷，諸如宿主範圍限制或溫度靈敏度，例如其允許轉染子病毒之後續選擇。在一些實施例中，第二構築體可提供宿主細胞所利用之一或多種複製蛋白質以實現指環載體之表現。在一些實施例中，宿主細胞可經編碼病毒蛋白質，諸如一或多種複製蛋白質之載體轉染。在一些實施例中，第二構築體包含抗病毒靈敏度。
在一些情況下，使用此項技術中已知之技術，本文所揭示之遺傳元件或包含遺傳元件之載體可複製且產生至指環載體中。例如，各種病毒培養方法描述於例如美國專利第4,650,764號；美國專利第5,166,057號；美國專利第5,854,037號；歐洲專利公開案EP 0702085A1；美國專利申請案序列號09/152,845；國際專利公開案PCT WO97/12032；WO96/34625；歐洲專利公開案EP-A780475；WO 99/02657；WO 98/53078；WO 98/02530；WO 99/15672；WO 98/13501；WO 97/06270；及EPO 780 47SA1中，其各自以全文引用之方式併入本文中。
提供呈順式或反式之指環病毒蛋白質的方法在一些實施例(例如本文所述之順式實施例)中，遺傳元件構築體進一步包含一或多個表現卡匣，該一或多個表現卡匣包含指環病毒ORF之編碼序列(例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2，或其功能片段)。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含表現卡匣，該表現卡匣包含指環病毒ORF1或其剪接變異體或功能片段之編碼序列。包含效應子以及一或多個指環病毒ORF之表現卡匣的此類遺傳元件構築體可引入至宿主細胞中。在一些情況下，包含此類遺傳元件構築體之宿主細胞能夠產生用於蛋白質外部之遺傳元件及組分，且能夠在蛋白質外部內包封遺傳元件，而無需額外核酸構築體或將表現卡匣整合至宿主細胞基因體中。換言之，例如如本文所述，此類遺傳元件構築體可用於宿主細胞中之順式指環載體產生方法。
在一些實施例(例如本文所述之反式實施例)中，遺傳元件不包含表現卡匣，該表現卡匣包含一或多個指環病毒ORF (例如指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2，或其功能片段)之編碼序列。在一些實施例中，遺傳元件構築體不包含有包含指環病毒ORF1或其剪接變異體或功能片段之編碼序列的表現卡匣。包含效應子之表現卡匣但缺乏一或多個指環病毒ORF (例如指環病毒ORF1或其剪接變異體或功能片段)之表現卡匣的此類遺傳元件構築體可引入至宿主細胞中。在一些情況下，包含此類遺傳元件構築體之宿主細胞可能需要額外核酸構築體或將表現卡匣整合至宿主細胞基因體中以用於產生指環載體之一或多種組分(例如蛋白質外部蛋白質)。在一些實施例中，包含此類遺傳元件構築體之宿主細胞不能在缺乏編碼指環病毒ORF1分子之額外核酸構築體之情況下在蛋白質外部內包封遺傳元件。換言之，例如如本文所述，此類遺傳元件構築體可用於宿主細胞中之反式指環載體產生方法。
輔助物在一些實施例中，將輔助構築體引入至宿主細胞(例如包含如本文所述之遺傳元件構築體或遺傳元件的宿主細胞)中。在一些實施例中，在引入遺傳元件構築體之前將輔助構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，在引入遺傳元件構築體的同時，將輔助構築體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，在引入遺傳元件構築體之後將輔助構築體引入至宿主細胞中。
例示性細胞類型適用於產生指環載體之例示性宿主細胞包括但不限於哺乳動物細胞，例如人類細胞及昆蟲細胞。在一些實施例中，宿主細胞為人類細胞或細胞株。在一些實施例中，細胞為免疫細胞或細胞株，例如T細胞或細胞株、癌細胞株、肝細胞或細胞株、神經元、神經膠質細胞、皮膚細胞、上皮細胞、間質細胞、血細胞、內皮細胞、眼細胞、胃腸道細胞、祖細胞、前驅細胞、幹細胞、肺細胞、心臟細胞或肌肉細胞。在一些實施例中，宿主細胞為動物細胞(例如小鼠細胞、大鼠細胞、兔細胞或倉鼠細胞或昆蟲細胞)。
在一些實施例中，宿主細胞為淋巴細胞。在一些實施例中，宿主細胞為T細胞或永生化T細胞。在實施例中，宿主細胞為Jurkat細胞。在實施例中，宿主細胞為MOLT細胞(例如MOLT-4或MOLT-3細胞)。在實施例中，宿主細胞為MOLT-4細胞。在實施例中，宿主細胞為MOLT-3細胞。在一些實施例中，宿主細胞為急性淋巴母細胞白血病(ALL)細胞，例如MOLT細胞，例如MOLT-4或MOLT-3細胞。在一些實施例中，宿主細胞為B細胞或永生化B細胞。在一些實施例中，宿主細胞包含遺傳元件構築體(例如如本文所述)。
在一些實施例中，宿主細胞為MOLT細胞(例如MOLT-4或MOLT-3細胞)。
在一些實施例中，宿主細胞為急性淋巴母細胞白血病(ALL)細胞，例如MOLT細胞，例如MOLT-4或MOLT-3細胞。
在一態樣中，本發明提供一種製造包含包封於蛋白質外部之遺傳元件的指環載體之方法，該方法包含提供包含指環載體遺傳元件之MOLT-4細胞及在允許指環載體遺傳元件變為包封於MOLT-4細胞中之蛋白質外部之條件下培育MOLT-4細胞。在一些實施例中，MOLT-4細胞進一步包含一或多種形成蛋白質外部之部分或全部之指環病毒蛋白質(例如指環病毒ORF1分子)。在一些實施例中，在MOLT-4細胞中，例如自遺傳元件構築體(例如如本文所述)產生指環載體遺傳元件。在一些實施例中，該方法進一步包含將指環載體遺傳元件構築體引入至MOLT-4細胞中。
在一態樣中，本發明提供一種製造包含包封於蛋白質外部之遺傳元件的指環載體之方法，該方法包含提供包含指環載體遺傳元件之MOLT-3細胞及在允許指環載體遺傳元件變為包封於MOLT-3細胞中之蛋白質外部之條件下培育MOLT-3細胞。在一些實施例中，MOLT-3細胞進一步包含一或多種形成蛋白質外部之部分或全部之指環病毒蛋白質(例如指環病毒ORF1分子)。在一些實施例中，在MOLT-3細胞中，例如自遺傳元件構築體(例如如本文所述)產生指環載體遺傳元件。在一些實施例中，該方法進一步包含將指環載體遺傳元件構築體引入至MOLT-3細胞中。
在一些實施例中，宿主細胞為人類細胞。在實施例中，宿主細胞為HEK293T細胞、HEK293F細胞、A549細胞、Jurkat細胞、Raji氏細胞、Chang氏細胞、HeLa細胞、Phoenix細胞、MRC-5細胞、NCI-H292細胞或Wi38細胞。在一些實施例中，宿主細胞為非人類靈長類細胞(例如Vero細胞、CV-1細胞或LLCMK2細胞)。在一些實施例中，宿主細胞為鼠類細胞(例如McCoy細胞)。在一些實施例中，宿主細胞為倉鼠細胞(例如CHO細胞或BHK 21細胞)。在一些實施例中，宿主細胞為MARC-145、MDBK、RK-13或EEL細胞。在一些實施例中，宿主細胞為上皮細胞(例如上皮譜系之細胞株)。
在一些實施例中，指環載體在連續動物細胞株(例如可連續繁殖之永生化細胞株)中培養。根據本發明之一個實施例，細胞株可包括豬細胞株。在本發明之情形下設想之細胞株包括永生化豬細胞株，諸如(但不限於)豬腎上皮細胞株PK-15及SK、單骨髓細胞株3D4/31及睪丸細胞株ST。
培養條件包含遺傳元件及蛋白質外部組分之宿主細胞可在適用於遺傳元件包封在蛋白質外部內之條件下培育，藉此產生指環載體。適合的培養條件包括例如實例4、5、7、8、9、10、11或15中之任一者中所述的彼等培養條件。在一些實施例中，宿主細胞在液體培養基(例如，格里斯氏補充(Grace's Supplemented) (TNM-FH)、IPL-41、TC-100、施奈德果蠅(Schneider's Drosophila)、SF-900 II SFM或EXPRESS-FIVE™ SFM)中培育。在一些實施例中，宿主細胞在黏附培養物中培育。在一些實施例中，宿主細胞在懸浮培養物中培育。在一些實施例中，宿主細胞在管、瓶、微載體或燒瓶中培育。在一些實施例中，宿主細胞在培養皿或孔(例如板上之孔)中培育。在一些實施例中，在適合於宿主細胞增殖之條件下培育宿主細胞。在一些實施例中，在適合於宿主細胞之條件下培育宿主細胞以將其中產生之指環載體釋放至周圍上清液中。
根據本發明之含有指環載體之細胞培養物的產生可以不同規模(例如在燒瓶、滾瓶或生物反應器中)進行。用於培養待感染細胞之培養基一般包含細胞存活率所需之標準營養物，但亦可包含視細胞類型而定之額外營養物。視情況，培養基可不含蛋白質及/或不含血清。視細胞類型而定，細胞可在懸浮液中或在受質上培養。在一些實施例中，不同培養基用於宿主細胞之生長及用於指環載體之產生。
收集可例如根據此項技術中已知之方法收集由宿主細胞產生之指環載體。舉例而言，培養物中宿主細胞釋放至周圍上清液中的指環載體可自上清液收集(例如如實例4中所述)。在一些實施例中，上清液自宿主細胞分離以獲得指環載體。在一些實施例中，在收集之前或期間裂解宿主細胞。在一些實施例中，自宿主細胞裂解物收集指環載體(例如如實例10中所述)。在一些實施例中，自宿主細胞裂解物及上清液兩者收集指環載體。在一些實施例中，指環載體之純化及分離係根據病毒生產中已知之方法進行，例如如Rinaldi等人, DNA Vaccines: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), 第3版. 2014, Humana Press中所述，以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，在用醫藥賦形劑調配之前，可基於生理學特性，例如離子交換層析或切向流過濾，藉由分離溶質來收集及/或純化指環載體。
富集及純化可純化及/或富集所收集之指環載體，例如以產生指環載體製劑。在一些實施例中，所收集之指環載體與存在於收集溶液中之其他成分或污染物分離，例如使用此項技術中已知用於純化病毒粒子之方法(例如藉由沈積、層析及/或超過濾進行純化)。在一些實施例中，純化步驟包含自製劑中移除血清、宿主細胞DNA、宿主細胞蛋白質、缺乏遺傳元件之粒子及/或酚紅中之一或多者。在一些實施例中，所收集之指環載體相對於收集溶液中存在之其他成分或污染物富集，例如使用此項技術中已知用於富集病毒粒子之方法。
在一些實施例中，所得製劑或包含製劑之醫藥組合物在可接受之時間段及溫度內將為穩定的，及/或與所需投與途徑及/或此投與途徑將需要之任何裝置相容，例如針或注射器。
II.指環載體  在一些態樣中，本文所述之本發明包含使用及製成指環載體、指環載體製劑及治療性組合物之組合物及方法。在一些實施例中，使用如本文所述之組合物及方法製成指環載體。在一些實施例中，指環載體包含一或多種核酸或多肽，該一或多種核酸或多肽包含基於指環病毒(例如如本文所述之指環病毒)或其片段或部分，或其他實質上非致病性病毒，例如共生性病毒、共生病毒、天然病毒之序列、結構及/或功能。在一些實施例中，基於指環病毒之指環載體包含至少一個對於指環病毒為外源性的元件，例如外源性效應子或編碼安置於指環載體之遺傳元件內之外源性效應子的核酸序列。在一些實施例中，基於指環病毒之指環載體包含至少一個與來自指環病毒之另一元件異源的元件，例如與另一連接核酸序列，諸如啟動子元件異源之效應子編碼核酸序列。在一些實施例中，指環載體包含遺傳元件(例如環狀DNA，例如單股DNA)，其包含相對於遺傳元件及/或蛋白質外部之其餘部分異源的至少一個元件(例如編碼效應子之外源性元件，例如如本文所述)。指環載體可為用於有效負載至宿主(例如人類)中之遞送媒劑(例如實質上非病原性遞送媒劑)。在一些實施例中，指環載體能夠在真核細胞，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞中複製。在一些實施例中，指環載體為實質上非病原性及/或實質上非整合於哺乳動物(例如人類)細胞中。在一些實施例中，指環載體在哺乳動物(例如人類)中實質上為非免疫原性的。在一些實施例中，指環載體為複製缺陷型的。在一些實施例中，指環載體為複製勝任型的。
在一些實施例中，指環載體包含curon或其組分(例如遺傳元件，例如包含編碼效應子之序列及/或蛋白質外部)，例如如PCT申請案第PCT/US2018/037379中所述，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，指環載體包含指環載體或其組分(例如遺傳元件，例如包含編碼效應子之序列及/或蛋白質外部)，例如如PCT申請案第PCT/US19/65995中所述，其以全文引用之方式併入本文中。
在一態樣中，本發明包括一種指環載體，其包含(i)包含啟動子元件之遺傳元件、編碼效應子之序列(例如內源性效應子或外源性效應子，例如有效負載)及蛋白質結合序列(例如外部蛋白質結合序列，例如封裝信號)，其中該遺傳元件為單股DNA，且具有以下特性中之一或兩者：為環狀及/或以小於進入細胞之遺傳元件的約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合至真核細胞之基因體中；及(ii)蛋白質外部；其中該遺傳元件包封閉在該蛋白質外部內；且其中該指環載體能夠將該遺傳元件遞送至真核細胞中。
在本文所述之指環載體之一些實施例中，遺傳元件以小於進入細胞之遺傳元件的約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%之頻率整合。在一些實施例中，來自投與至個體之複數個指環載體的小於約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%或5%的遺傳元件將整合至個體之一或多種宿主細胞之基因體中。在一些實施例中，例如如本文所述之指環載體群體之遺傳元件以小於可比AAV病毒群體之頻率的頻率，例如以比可比AAV病毒群體低約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或以上的頻率，整合至宿主細胞之基因體中。
在一態樣中，本發明包括一種指環載體，其包含：(i)遺傳元件，該遺傳元件包含啟動子元件、編碼效應子(例如內源性效應子或外源性效應子，例如有效負載)之序列及蛋白質結合序列(例如外部蛋白質結合序列)，其中該遺傳元件與野生型指環病毒序列(例如野生型細環病毒屬(Torque Teno virus，TTV)、微型細環病毒屬(Torque Teno mini virus，TTMV)或TTMDV序列，例如如本文所述之野生型指環病毒序列)具有至少75% (例如至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的序列一致性；及(ii)蛋白質外部；其中該遺傳元件包封在該蛋白質外部內；且其中該指環載體能夠將該遺傳元件遞送至真核細胞中。
在一個態樣中，本發明包括一種指環載體，其包含： a)遺傳元件，其包含(i)編碼外部蛋白質(例如非病原性外部蛋白質)之序列、(ii)將遺傳元件結合至非病原性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列及(iii)編碼效應子(例如內源性或外源性效應子)之序列；及 b)與遺傳元件相關聯之外部蛋白質，例如封閉或包封該遺傳元件。
在一些實施例中，指環載體包括來自非封閉、環狀、單股DNA病毒(或與非封閉、環狀、單股DNA病毒具有＞70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、100%同源性)之序列或表現產物。動物環狀單股DNA病毒一般係指單股DNA (ssDNA)病毒之子組，其感染真核非植物宿主且具有環狀基因體。因此，動物環狀ssDNA病毒可與感染原核生物之ssDNA病毒(亦即微小噬菌體科(Microviridae)及絲狀噬菌體科(Inoviridae))及感染植物之ssDNA病毒(亦即雙生病毒科(Geminiviridae)及矮化病毒科(Nanoviridae))區分。其亦可與感染非植物真核生物之線性ssDNA病毒(亦即小病毒科(Parvoviridiae))區分。
在一些實施例中，指環載體例如短暫或長期地調節宿主細胞功能。在某些實施例中，細胞功能經穩定改變，諸如調節持續至少約1小時至約30天，或至少約2小時、6小時、12小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更長時間或其間的任何時間。在某些實施例中，細胞功能短暫改變，例如諸如調節持續至多約30分鐘至約7天，或至多約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、4天、5天、6天、7天或其間任何時間。
在一些實施例中，遺傳元件包含啟動子元件。在實施例中，啟動子元件係選自RNA聚合酶II依賴性啟動子、RNA聚合酶III依賴性啟動子、PGK啟動子、CMV啟動子、EF-1α啟動子、SV40啟動子、CAGG啟動子或UBC啟動子、TTV病毒啟動子、組織特異性U6 (pollIII)、具有活化子蛋白之上游DNA結合位點之最小CMV啟動子(TetR-VP16、Gal4-VP16、dCas9-VP16等)。在實施例中，啟動子元件包含TATA盒。在實施例中，啟動子元件對於野生型指環病毒為內源性的，例如如本文所述。
在一些實施例中，遺傳元件包含以下特徵中之一或多者：單股、環狀、負股及/或DNA。在實施例中，遺傳元件包含游離基因體。在一些實施例中，不包括效應子之遺傳元件部分具有約2.5-5 kb (例如約2.8-4 kb、約2.8-3.2 kb、約3.6-3.9 kb或約2.8-2.9 kb)、小於約5 kb (例如，小於約2.9 kb、3.2 kb、3.6 kb、3.9 kb或4 kb)或至少100個核苷酸(例如至少1 kb)之組合尺寸。
如本文所述之指環載體、包含指環載體之組合物、使用此類指環載體之方法等，在一些情況下，部分基於實例不同效應子，例如miRNA (例如針對IFN或miR-625)、shRNA等及蛋白質結合序列，例如將結合至衣殼蛋白(如Q99153)之DNA序列與蛋白質外部結合，例如於Arch Virol (2007) 152: 1961-1975中所揭示之衣殼，以產生指環載體，其可接著用於將效應子遞送至細胞(例如動物細胞，例如人類細胞或非人類動物細胞，諸如豬或小鼠細胞)中。在一些實施例中，效應子可使諸如干擾素之因子的表現靜默。實例進一步描述可如何藉由將效應子插入至衍生自例如指環病毒之序列中來製備指環載體。基於此等實例，下文描述涵蓋實例中所考慮之特定發現及組合之各種變化形式。例如，熟習此項技術者將自實例理解，特定miRNA僅用作效應子之一個實例且其他效應子可為例如其他調控核酸或治療性肽。類似地，實施例中所用之特定衣殼可經下文所述之實質上非病原性蛋白質置換。實例中所述之特定指環病毒序列亦可經下文所述之指環病毒序列置換。此等考慮因素類似地適用於蛋白質結合序列、諸如啟動子之調控序列及其類似者。獨立於此，熟習此項技術者將尤其考慮與實例密切相關之此類實施例。
在一些實施例中，將指環載體或包含於指環載體中之遺傳元件引入至細胞(例如人類細胞)中。在一些實施例中，例如在指環載體或遺傳元件已引入至細胞中之後，例如由指環載體之遺傳元件編碼之效應子(例如RNA，例如miRNA)在細胞(例如人類細胞)中表現。在一些實施例中，將指環載體或包含於其中之遺傳元件引入至細胞中以例如藉由改變細胞之目標分子的表現量來調節(例如提高或降低)細胞中之目標分子(例如目標核酸，例如RNA或目標多肽)之含量。在一些實施例中，引入指環載體或包含於其中之遺傳元件以降低細胞所產生之干擾素含量。在一些實施例中，將指環載體或包含於其中之遺傳元件引入至細胞中以調節(例如提高或降低)細胞之功能。在一些實施例中，將指環載體或包含於其中之遺傳元件引入至細胞中以調節(例如提高或降低)細胞之存活率。在一些實施例中，將指環載體或包含於其中之遺傳元件引入至細胞中以降低細胞(例如癌細胞)之存活率。
在一些實施例中，本文所述之指環載體(例如合成指環載體)誘導小於70%之抗體流行率(例如小於約60%、50%、40%、30%、20%或10%抗體流行率)。在一些實施例中，抗體流行率係根據此項技術中已知之方法測定。在一些實施例中，抗體流行率係例如根據Tsuda等人(1999; J. Virol. Methods 77: 199-206；以引用之方式併入本文中)所述之抗TTV抗體偵測方法，及/或Kakkola等人(2008; Virology 382: 182-189；以引用之方式併入本文中)所述之用於測定抗TTV IgG血清陽性率之方法，藉由偵測生物樣品中針對指環病毒(例如如本文所述)或基於指環病毒之指環載體的抗體來測定。針對指環病毒或基於指環病毒之指環載體的抗體亦可藉由此項技術中用於偵測抗病毒抗體之方法來偵測，例如偵測抗AAV抗體之方法，例如如Calcedo等人(2013; Front. Immunol. 4(341): 1-7；以引用之方式併入本文中)中所述。
在一些實施例中，複製缺失型、複製缺陷型或複製不勝任型遺傳元件不編碼複製遺傳元件所需之所有必需機構或組分。在一些實施例中，複製缺陷型遺傳元件不編碼複製因子。在一些實施例中，複製缺陷型遺傳元件不編碼一或多個ORF (例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3，例如如本文所述)。在一些實施例中，不由遺傳元件編碼之機構或組分可以反式提供(例如使用輔助物，例如輔助病毒或輔助質體，或在包含宿主細胞之核酸中編碼，例如整合至宿主細胞之基因體中)，例如使得遺傳元件可在以反式提供之機構或組分存在下經歷複製。
在一些實施例中，封裝缺失型、封裝缺陷型或封裝不勝任型遺傳元件無法封裝至蛋白質外部(例如其中蛋白質外部包含衣殼或其一部分，例如包含由ORF1核酸編碼之多肽，例如如本文所述)。在一些實施例中，相比於野生型指環病毒(例如如本文所述)，封裝缺失型遺傳元件以小於10% (例如小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%或0.001%)之效率封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，封裝缺失型遺傳元件即使在准許封裝野生型指環病毒(例如如本文所述)之遺傳元件的因子(例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3)存在下亦無法封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，相比於野生型指環病毒(例如如本文所述)，封裝缺陷型遺傳元件以小於10% (例如小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%或0.001%)之效率封裝至蛋白質外部中，即使在准許封裝野生型指環病毒(例如如本文所述)之遺傳元件的因子(例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3)存在下亦如此。
在一些實施例中，封裝勝任型遺傳元件可封裝至蛋白質外部中(例如其中蛋白質外部包含衣殼或其一部分，例如包含由ORF1核酸編碼之多肽，例如如本文所述)。在一些實施例中，相比於野生型指環病毒(例如如本文所述)，封裝勝任型遺傳元件以至少20% (例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%或更高)的效率封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，封裝勝任型遺傳元件在准許封裝野生型指環病毒(例如如本文所述)之遺傳元件的因子(例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3)存在下可封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，在准許封裝野生型指環病毒(例如如本文所述如)之遺傳元件的因子(例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3)存在下，相比於野生型指環病毒(例如如本文所述)，封裝勝任型遺傳元件以至少20% (例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%或更高)的效率封裝至蛋白質外部中。
指環病毒  在一些實施例中，例如如本文所述之指環載體包含衍生自指環病毒之序列或表現產物。在一些實施例中，指環載體包括相對於指環病毒為外源性的一或多種序列或表現產物。在一些實施例中，指環載體包括相對於指環病毒為內源性的一或多種序列或表現產物。在一些實施例中，指環載體包括相對於指環載體中之一或多種其他序列或表現產物為異源的一或多種序列或表現產物。指環病毒一般具有帶負極性之單股環狀DNA基因體。指環病毒通常不與任何人類疾病相關聯。然而，將指環病毒感染與人類疾病關聯起來的嘗試被以下各者混淆：對照組群體中無症狀指環病毒病毒血症之高發病率、指環病毒病毒家族內之顯著基因體多樣性、歷史上無法在活體外繁殖該病原體以及缺乏指環病毒疾病動物模型(Yzebe等人, Panminerva Med. (2002) 44:167-177；Biagini, P., Vet. Microbiol. (2004) 98:95-101)。
指環病毒通常藉由口鼻或糞口感染、母嬰及/或子宮內傳輸來傳播(Gerner等人, Ped. Infect. Dis. J. (2000) 19:1074-1077)。在一些情況下，感染者之特徵可為長期(數月至數年)的指環病毒病毒血症。人類可同時感染有超過一個基因組或病毒株(Saback等人, Scad. J. Infect. Dis. (2001) 33:121-125)。有跡象表明此等基因組可在經感染人類體內重組(Rey等人, Infect. (2003) 31:226-233)。已在若干組織，諸如肝臟、周邊血液單核細胞及骨髓中發現雙股同功異型物(複製型)中間物(Kikuchi等人, J. Med. Virol. (2000) 61:165-170；Okamoto等人, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2002) 270:657-662；Rodriguez-lnigo等人, Am. J. Pathol. (2000) 156:1227-1234)。
在一些實施例中，遺傳元件包含一核苷酸序列，該核苷酸序列編碼胺基酸序列或其功能片段，或與本文所述之胺基酸序列中之任一者(例如指環病毒胺基酸序列)具有至少約60%、70% 80%、85%、90% 95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，如本文所述之指環載體包含一或多個核酸分子(例如如本文所述之遺傳元件)，其包含與例如如本文所述之指環病毒序列或其片段具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，如本文所述之指環載體包含一或多個核酸分子(例如如本文所述之遺傳元件)，其包含與以下中之一或多者具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列：指環病毒之TATA盒、加帽位點、起始元件、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、三個開放閱讀框架區、聚(A)信號、富含GC之區或其任何組合，例如如本文所述。在一些實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，該衣殼蛋白例如本文所述之任一指環病毒的ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3序列。在實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，該衣殼蛋白包含與指環病毒ORF1蛋白(或其剪接變異體或功能片段)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列或由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽。
在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF1核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF1/1核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF1/2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF2/2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF2/3核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒ORF2t/3核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒TATA盒核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒起始元件核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒轉錄起始位點核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒5' UTR保守域核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒三個開放閱讀框架區核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒聚(A)信號核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1之指環病毒GC富集核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒ORF1核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒ORF1/1核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒ORF1/2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒ORF2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒ORF2/2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒ORF2/3核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒TATA盒核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒起始元件核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒轉錄起始位點核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒5' UTR保守域核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒三個開放閱讀框架區核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒聚(A)信號核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1之指環病毒GC富集核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒ORF1核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒ORF1/1核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒ORF1/2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒ORF2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒ORF2/2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒ORF2/3核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒TAIP核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒TATA盒核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒起始元件核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒轉錄起始位點核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒5' UTR保守域核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒三個開放閱讀框架區核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒聚(A)信號核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1之指環病毒GC富集核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中，遺傳元件包含一核苷酸序列，該核苷酸序列編碼胺基酸序列或其功能片段，或與本文所述之胺基酸序列中之任一者(例如指環病毒胺基酸序列)具有至少約60%、70% 80%、85%、90% 95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，如本文所述之指環載體包含一或多個核酸分子(例如如本文所述之遺傳元件)，其包含與例如如本文所述之指環病毒序列或其片段具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在實施例中，指環載體包含選自以下之核酸序列：表A1-M2中之任一者中所示之序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在實施例中，指環載體包含多肽，該多肽包含如表A2-M2中之任一者中所示之序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，如本文所述之指環載體包含一或多個核酸分子(例如如本文所述之遺傳元件)，其包含與以下中之一或多者具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列：本文所述之任一指環病毒(例如如表A-M中之任一者中所註釋或如由所列之序列編碼的指環病毒序列)之TATA盒、加帽位點、起始元件、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、三個開放閱讀框架區、聚(A)信號、富含GC之區或其任何組合。在一些實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，例如本文所述之任一指環病毒(例如如表A-M中之任一者中所註釋或由所列之序列編碼的指環病毒序列)之ORF1、ORF1/1、ORF1/2，ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，該衣殼蛋白包含與指環病毒ORF1或ORF2蛋白(例如表A2-M2中之任一者中所示之ORF1或ORF2胺基酸序列，或由表A1-M1中之任一者中所示之核酸序列編碼的ORF1或ORF2胺基酸序列)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，該衣殼蛋白包含與指環病毒ORF1蛋白(例如表A2-M2中之任一者中所示之ORF1胺基酸序列，或由表A1-M1中之任一者中所示之核酸序列編碼的ORF1胺基酸序列)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，如本文所述之指環載體為嵌合指環載體。在一些實施例中，嵌合指環載體進一步包含一或多種來自除指環病毒以外之病毒的元件、多肽或核酸。
在一些實施例中，嵌合指環載體包含複數個多肽(例如指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3)，該等多肽包含來自複數個不同指環病毒(例如如本文所述)之序列。例如，嵌合指環載體可包含來自一種指環病毒之ORF1分子(例如環1 ORF1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF1分子)，及來自不同指環病毒之ORF2分子(例如環2 ORF2分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF2分子)。在另一實例中，嵌合指環載體可包含來自一種指環病毒之第一ORF1分子(例如環1 ORF1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF1分子)，及來自不同指環病毒之第二ORF1分子(例如環2 ORF1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性的ORF1分子)。
在一些實施例中，指環載體包含嵌合多肽(例如指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3)，例如包含來自指環病毒(例如如本文所述)之至少一部分及來自不同病毒(例如如本文所述)之至少一部分。
在一些實施例中，指環載體包含嵌合多肽(例如指環病毒ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3)，例如包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之至少一部分及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之至少一部分。在一些實施例中，指環載體包含嵌合ORF1分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF1分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF1分子，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF1分子的至少一部分。在一些實施例中，嵌合ORF1分子包含來自一種指環病毒之ORF1凝膠捲域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒之ORF1胺基酸子序列(例如如本文所述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，嵌合ORF1分子包含來自一種指環病毒之ORF1富含精胺酸之區，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列，及來自不同指環病毒之ORF1胺基酸子序列(例如如本文所述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，嵌合ORF1分子包含來自一種指環病毒之ORF1高變域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒之ORF1胺基酸子序列(例如如本文所述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，嵌合ORF1分子包含來自一種指環病毒之ORF1 N22域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒之ORF1胺基酸子序列(例如如本文所述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在一些實施例中，嵌合ORF1分子包含來自一種指環病毒之ORF1 C端域，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，及來自不同指環病毒之ORF1胺基酸子序列(例如如本文所述)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。
在一些實施例中，指環載體包含嵌合ORF1/1分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF1/1分子或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF1/1分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF1/1分子或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF1/1分子的至少一部分。在一些實施例中，指環載體包含嵌合ORF1/2分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF1/2分子或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF1/2分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF1/2分子或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF1/2分子的至少一部分。在一些實施例中，指環載體包含嵌合ORF2分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF2分子或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF2分子或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2分子的至少一部分。在一些實施例中，指環載體包含嵌合ORF2/2分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF2/2分子或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2/2分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF2/2分子或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2/2分子的至少一部分。在一些實施例中，指環載體包含嵌合ORF2/3分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF2/3分子或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2/3分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF2/3分子或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2/3分子的至少一部分。在一些實施例中，指環載體包含嵌合ORF2T/3分子，該分子包含來自一種指環病毒(例如如本文所述)之ORF2T/3分子或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2T/3分子的至少一部分，及來自不同指環病毒(例如如本文所述)之ORF2T/3分子或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之ORF2T/3分子的至少一部分。
其中包含可用於本文所述組合物及方法中之序列或子序列之額外例示性指環病毒基因體(例如以形成指環載體之遺傳元件，例如如本文所述)描述於例如PCT申請案第PCT/US2018/037379號及第PCT/US19/65995號(以全文引用之方式併入本文中)中。在一些實施例中，例示性指環病毒序列包含如以引用之方式併入本文中之PCT/US19/65995之表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1-B5、1、3、5、7、9、11、13、15或17中之任一者中所列的核酸序列。在一些實施例中，例示性指環病毒序列包含以引用之方式併入本文中之PCT/US19/65995之表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1-C5、2、4、6、8、10、12、14、16或18中之任一者中所列的胺基酸序列。在一些實施例中，例示性指環病毒序列包含ORF1分子序列或編碼其之核酸序列，例如如以引用之方式併入本文中之PCT/US19/65995之表21、23、25、27、29、31、33、35、D2、D4、D6、D8、D10或37A-37C中之任一者中所列。 表 A1 . 例示性指環病毒核酸序列 ( α 細環病毒屬 ， 分枝系 3 )
名稱 環1
屬/分枝系 α細環病毒屬，分枝系3
寄存編號 AJ620231.1
全序列：3753 bp
1        10        20        30        40        50|        |         |         |         |         |TGCTACGTCACTAACCCACGTGTCCTCTACAGGCCAATCGCAGTCTATGTCGTGCACTTCCTGGGCATGGTCTACATAATTATATAAATGCTTGCACTTCCGAATGGCTGAGTTTTTGCTGCCCGTCCGCGGAGAGGAGCCACGGCAGGGGATCCGAACGTCCTGAGGGCGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCAGGACTGGCCGGGCTTTGGGCAAGGCTCTTAAAAATGCACTTTTCTCGAATAAGCAGAAAGAAAAGGAAAGTGCTACTGCTTTGCGTGCCAGCAGCTAAGAAAAAACCAACTGCTATGAGCTTCTGGAAACCTCCGGTACACAATGTCACGGGGATCCAACGCATGTGGTATGAGTCCTTTCACCGTGGCCACGCTTCTTTTTGTGGTTGTGGGAATCCTATACTTCACATTACTGCACTTGCTGAAACATATGGCCATCCAACAGGCCCGAGACCTTCTGGGCCACCGGGAGTAGACCCCAACCCCCACATCCGTAGAGCCAGGCCTGCCCCGGCCGCTCCGGAGCCCTCACAGGTTGATTCGAGACCAGCCCTGACATGGCATGGGGATGGTGGAAGCGACGGAGGCGCTGGTGGTTCCGGAAGCGGTGGACCCGTGGCAGACTTCGCAGACGATGGCCTCGATCAGCTCGTCGCCGCCCTAGACGACGAAGAGTAAGGAGGCGCAGACGGTGGAGGAGGGGGAGACGAAAAACAAGGACTTACAGACGCAGGAGACGCTTTAGACGCAGGGGACGAAAAGCAAAACTTATAATAAAACTGTGGCAACCTGCAGTAATTAAAAGATGCAGAATAAAGGGATACATACCACTGATTATAAGTGGGAACGGTACCTTTGCCACAAACTTTACCAGTCACATAAATGACAGAATAATGAAAGGCCCCTTCGGGGGAGGACACAGCACTATGAGGTTCAGCCTCTACATTTTGTTTGAGGAGCACCTCAGACACATGAACTTCTGGACCAGAAGCAACGATAACCTAGAGCTAACCAGATACTTGGGGGCTTCAGTAAAAATATACAGGCACCCAGACCAAGACTTTATAGTAATATACAACAGAAGAACCCCTCTAGGAGGCAACATCTACACAGCACCCTCTCTACACCCAGGCAATGCCATTTTAGCAAAACACAAAATATTAGTACCAAGTTTACAGACAAGACCAAAGGGTAGAAAAGCAATTAGACTAAGAATAGCACCCCCCACACTCTTTACAGACAAGTGGTACTTTCAAAAGGACATAGCCGACCTCACCCTTTTCAACATCATGGCAGTTGAGGCTGACTTGCGGTTTCCGTTCTGCTCACCACAAACTGACAACACTTGCATCAGCTTCCAGGTCCTTAGTTCCGTTTACAACAACTACCTCAGTATTAATACCTTTAATAATGACAACTCAGACTCAAAGTTAAAAGAATTTTTAAATAAAGCATTTCCAACAACAGGCACAAAAGGAACAAGTTTAAATGCACTAAATACATTTAGAACAGAAGGATGCATAAGTCACCCACAACTAAAAAAACCAAACCCACAAATAAACAAACCATTAGAGTCACAATACTTTGCACCTTTAGATGCCCTCTGGGGAGACCCCATATACTATAATGATCTAAATGAAAACAAAAGTTTGAACGATATCATTGAGAAAATACTAATAAAAAACATGATTACATACCATGCAAAACTAAGAGAATTTCCAAATTCATACCAAGGAAACAAGGCCTTTTGCCACCTAACAGGCATATACAGCCCACCATACCTAAACCAAGGCAGAATATCTCCAGAAATATTTGGACTGTACACAGAAATAATTTACAACCCTTACACAGACAAAGGAACTGGAAACAAAGTATGGATGGACCCACTAACTAAAGAGAACAACATATATAAAGAAGGACAGAGCAAATGCCTACTGACTGACATGCCCCTATGGACTTTACTTTTTGGATATACAGACTGGTGTAAAAAGGACACTAATAACTGGGACTTACCACTAAACTACAGACTAGTACTAATATGCCCTTATACCTTTCCAAAATTGTACAATGAAAAAGTAAAAGACTATGGGTACATCCCGTACTCCTACAAATTCGGAGCGGGTCAGATGCCAGACGGCAGCAACTACATACCCTTTCAGTTTAGAGCAAAGTGGTACCCCACAGTACTACACCAGCAACAGGTAATGGAGGACATAAGCAGGAGCGGGCCCTTTGCACCTAAGGTAGAAAAACCAAGCACTCAGCTGGTAATGAAGTACTGTTTTAACTTTAACTGGGGCGGTAACCCTATCATTGAACAGATTGTTAAAGACCCCAGCTTCCAGCCCACCTATGAAATACCCGGTACCGGTAACATCCCTAGAAGAATACAAGTCATCGACCCGCGGGTCCTGGGACCGCACTACTCGTTCCGGTCATGGGACATGCGCAGACACACATTTAGCAGAGCAAGTATTAAGAGAGTGTCAGAACAACAAGAAACTTCTGACCTTGTATTCTCAGGCCCAAAAAAGCCTCGGGTCGACATCCCAAAACAAGAAACCCAAGAAGAAAGCTCACATTCACTCCAAAGAGAATCGAGACCGTGGGAGACCGAGGAAGAAAGCGAGACAGAAGCCCTCTCGCAAGAGAGCCAAGAGGTCCCCTTCCAACAGCAGTTGCAGCAGCAGTACCAAGAGCAGCTCAAGCTCAGACAGGGAATCAAAGTCCTCTTCGAGCAGCTCATAAGGACCCAACAAGGGGTCCATGTAAACCCATGCCTACGGTAGGTCCCAGGCAGTGGCTGTTTCCAGAGAGAAAGCCAGCCCCAGCTCCTAGCAGTGGAGACTGGGCCATGGAGTTTCTCGCAGCAAAAATATTTGATAGGCCAGTTAGAAGCAACCTTAAAGATACCCCTTACTACCCATATGTTAAAAACCAATACAATGTCTACTTTGACCTTAAATTTGAATAAACAGCAGCTTCAAACTTGCAAGGCCGTGGGAGTTTCACTGGTCGGTGTCTACCTCTAAAGGTCACTAAGCACTCCGAGCGTAAGCGAGGAGTGCGACCCTCCCCCCTGGAACAACTTCTTCGGAGTCCGGCGCTACGCCTTCGGCTGCGCCGGACACCTCAGACCCCCCCTCCACCCGAAACGCTTGCGCGTTTCGGACCTTCGGCGTCGGGGGGGTCGGGAGCTTTATTAAACGGACTCCGAAGTGCTCTTGGACACTGAGGGGGTGAACAGCAACGAAAGTGAGTGGGGCCAGACTTCGCCATAAGGCCTTTATCTTCTTGCCATTTGTCAGTGTCCGGGGTCGCCATAGGCTTCGGGCTCGTTTTTAGGCCTTCCGGACTACAAAAATCGCCATTTTGGTGACGTCACGGCCGCCATCTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGGACAATTTCTTCCGGGTCAAAGGTTACAGCCGCCATGTTAAAACACGTGACGTATGACGTCACGGCCGCCATTTTGTGACACAAGATGGCCGACTTCCTTCCTCTTTTTCAAAAAAAAGCGGAAGTGCCGCCGCGGCGGCGGGGGGCGGCGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCCG (SEQ ID NO: 16)  
註釋：
假定域 鹼基範圍
TATA盒 83 - 88
加帽位點 104 - 111
轉錄起始位點 111
5' UTR保守域 170 - 240
ORF2 336 - 719
ORF2/2 336 - 715 ; 2363 - 2789
ORF2/3 336 - 715 ; 2565 - 3015
ORF2t/3 336 - 388 ; 2565 - 3015
ORF1 599 - 2830
ORF1/1 599 - 715 ; 2363 - 2830
ORF1/2 599 - 715 ; 2565 - 2789
三個開放閱讀框架區 2551 - 2786
聚(A)信號 3011 - 3016
富含GC之區 3632 - 3753
表 A2 . 例示性指環病毒胺基酸序列 ( α 細環病毒屬 ， 分枝系 3 )
環1 (α細環病毒屬分枝系3)
ORF2 MSFWKPPVHNVTGIQRMWYESFHRGHASFCGCGNPILHITALAETYGHPTGPRPSGPPGVDPNPHIRRARPAPAAPEPSQVDSRPALTWHGDGGSDGGAGGSGSGGPVADFADDGLDQLVAALDDEE (SEQ ID NO: 17)
ORF2/2 MSFWKPPVHNVTGIQRMWYESFHRGHASFCGCGNPILHITALAETYGHPTGPRPSGPPGVDPNPHIRRARPAPAAPEPSQVDSRPALTWHGDGGSDGGAGGSGSGGPVADFADDGLDQLVAALDDEELLKTPASSPPMKYPVPVTSLEEYKSSTRGSWDRTTRSGHGTCADTHLAEQVLRECQNNKKLLTLYSQAQKSLGSTSQNKKPKKKAHIHSKENRDRGRPRKKARQKPSRKRAKRSPSNSSCSSSTKSSSSSDRESKSSSSSS (SEQ ID NO: 18)
ORF2/3 MSFWKPPVHNVTGIQRMWYESFHRGHASFCGCGNPILHITALAETYGHPTGPRPSGPPGVDPNPHIRRARPAPAAPEPSQVDSRPALTWHGDGGSDGGAGGSGSGGPVADFADDGLDQLVAALDDEEPKKASGRHPKTRNPRRKLTFTPKRIETVGDRGRKRDRSPLAREPRGPLPTAVAAAVPRAAQAQTGNQSPLRAAHKDPTRGPCKPMPTVGPRQWLFPERKPAPAPSSGDWAMEFLAAKIFDRPVRSNLKDTPYYPYVKNQYNVYFDLKFE (SEQ ID NO: 19)
ORF2t/3 MSFWKPPVHNVTGIQRMWPKKASGRHPKTRNPRRKLTFTPKRIETVGDRGRKRDRSPLAREPRGPLPTAVAAAVPRAAQAQTGNQSPLRAAHKDPTRGPCKPMPTVGPRQWLFPERKPAPAPSSGDWAMEFLAAKIFDRPVRSNLKDTPYYPYVKNQYNVYFDLKFE (SEQ ID NO: 20)
ORF1 MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRVRRRRRWRRGRRKTRTYRRRRRFRRRGRKAKLIIKLWQPAVIKRCRIKGYIPLIISGNGTFATNFTSHINDRIMKGPFGGGHSTMRFSLYILFEEHLRHMNFWTRSNDNLELTRYLGASVKIYRHPDQDFIVIYNRRTPLGGNIYTAPSLHPGNAILAKHKILVPSLQTRPKGRKAIRLRIAPPTLFTDKWYFQKDIADLTLFNIMAVEADLRFPFCSPQTDNTCISFQVLSSVYNNYLSINTFNNDNSDSKLKEFLNKAFPTTGTKGTSLNALNTFRTEGCISHPQLKKPNPQINKPLESQYFAPLDALWGDPIYYNDLNENKSLNDIIEKILIKNMITYHAKLREFPNSYQGNKAFCHLTGIYSPPYLNQGRISPEIFGLYTEIIYNPYTDKGTGNKVWMDPLTKENNIYKEGQSKCLLTDMPLWTLLFGYTDWCKKDTNNWDLPLNYRLVLICPYTFPKLYNEKVKDYGYIPYSYKFGAGQMPDGSNYIPFQFRAKWYPTVLHQQQVMEDISRSGPFAPKVEKPSTQLVMKYCFNFNWGGNPIIEQIVKDPSFQPTYEIPGTGNIPRRIQVIDPRVLGPHYSFRSWDMRRHTFSRASIKRVSEQQETSDLVFSGPKKPRVDIPKQETQEESSHSLQRESRPWETEEESETEALSQESQEVPFQQQLQQQYQEQLKLRQGIKVLFEQLIRTQQGVHVNPCLR (SEQ ID NO: 21)
ORF1/1 MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRIVKDPSFQPTYEIPGTGNIPRRIQVIDPRVLGPHYSFRSWDMRRHTFSRASIKRVSEQQETSDLVFSGPKKPRVDIPKQETQEESSHSLQRESRPWETEEESETEALSQESQEVPFQQQLQQQYQEQLKLRQGIKVLFEQLIRTQQGVHVNPCLR (SEQ ID NO: 22)
ORF1/2 MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRAQKSLGSTSQNKKPKKKAHIHSKENRDRGRPRKKARQKPSRKRAKRSPSNSSCSSSTKSSSSSDRESKSSSSSS (SEQ ID NO: 23)
表 B1 . 例示性指環病毒核酸序列 ( β 細環病毒屬 )
名稱 環2
屬/分枝系 β細環病毒屬
寄存編號 JX134045.1
全序列：2797 bp
1        10        20        30        40        50|        |         |         |         |         |TAATAAATATTCAACAGGAAAACCACCTAATTTAAATTGCCGACCACAAACCGTCACTTAGTTCCCCTTTTTGCAACAACTTCTGCTTTTTTCCAACTGCCGGAAAACCACATAATTTGCATGGCTAACCACAAACTGATATGCTAATTAACTTCCACAAAACAACTTCCCCTTTTAAAACCACACCTACAAATTAATTATTAAACACAGTCACATCCTGGGAGGTACTACCACACTATAATACCAAGTGCACTTCCGAATGGCTGAGTTTATGCCGCTAGACGGAGAACGCATCAGTTACTGACTGCGGACTGAACTTGGGCGGGTGCCGAAGGTGAGTGAAACCACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGTTCAGTCTAGCGGAACGGGCAAGAAACTTAAAATTATTTTATTTTTCAGATGAGCGACTGCTTTAAACCAACATGCTACAACAACAAAACAAAGCAAACTCACTGGATTAATAACCTGCATTTAACCCACGACCTGATCTGCTTCTGCCCAACACCAACTAGACACTTATTACTAGCTTTAGCAGAACAACAAGAAACAATTGAAGTGTCTAAACAAGAAAAAGAAAAAATAACAAGATGCCTTATTACTACAGAAGAAGACGGTACAACTACAGACGTCCTAGATGGTATGGACGAGGTTGGATTAGACGCCCTTTTCGCAGAAGATTTCGAAGAAAAAGAAGGGTAAGACCTACTTATACTACTATTCCTCTAAAGCAATGGCAACCGCCATATAAAAGAACATGCTATATAAAAGGACAAGACTGTTTAATATACTATAGCAACTTAAGACTGGGAATGAATAGTACAATGTATGAAAAAAGTATTGTACCTGTACATTGGCCGGGAGGGGGTTCTTTTTCTGTAAGCATGTTAACTTTAGATGCCTTGTATGATATACATAAACTTTGTAGAAACTGGTGGACATCCACAAACCAAGACTTACCACTAGTAAGATATAAAGGATGCAAAATAACATTTTATCAAAGCACATTTACAGACTACATAGTAAGAATACATACAGAACTACCAGCTAACAGTAACAAACTAACATACCCAAACACACATCCACTAATGATGATGATGTCTAAGTACAAACACATTATACCTAGTAGACAAACAAGAAGAAAAAAGAAACCATACACAAAAATATTTGTAAAACCACCTCCGCAATTTGAAAACAAATGGTACTTTGCTACAGACCTCTACAAAATTCCATTACTACAAATACACTGCACAGCATGCAACTTACAAAACCCATTTGTAAAACCAGACAAATTATCAAACAATGTTACATTATGGTCACTAAACACCATAAGCATACAAAATAGAAACATGTCAGTGGATCAAGGACAATCATGGCCATTTAAAATACTAGGAACACAAAGCTTTTATTTTTACTTTTACACCGGAGCAAACCTACCAGGTGACACAACACAAATACCAGTAGCAGACCTATTACCACTAACAAACCCAAGAATAAACAGACCAGGACAATCACTAAATGAGGCAAAAATTACAGACCATATTACTTTCACAGAATACAAAAACAAATTTACAAATTATTGGGGTAACCCATTTAATAAACACATTCAAGAACACCTAGATATGATACTATACTCACTAAAAAGTCCAGAAGCAATAAAAAACGAATGGACAACAGAAAACATGAAATGGAACCAATTAAACAATGCAGGAACAATGGCATTAACACCATTTAACGAGCCAATATTCACACAAATACAATATAACCCAGATAGAGACACAGGAGAAGACACTCAATTATACCTACTCTCTAACGCTACAGGAACAGGATGGGACCCACCAGGAATTCCAGAATTAATACTAGAAGGATTTCCACTATGGTTAATATATTGGGGATTTGCAGACTTTCAAAAAAACCTAAAAAAAGTAACAAACATAGACACAAATTACATGTTAGTAGCAAAAACAAAATTTACACAAAAACCTGGCACATTCTACTTAGTAATACTAAATGACACCTTTGTAGAAGGCAATAGCCCATATGAAAAACAACCTTTACCTGAAGACAACATTAAATGGTACCCACAAGTACAATACCAATTAGAAGCACAAAACAAACTACTACAAACTGGGCCATTTACACCAAACATACAAGGACAACTATCAGACAATATATCAATGTTTTATAAATTTTACTTTAAATGGGGAGGAAGCCCACCAAAAGCAATTAATGTTGAAAATCCTGCCCACCAGATTCAATATCCCATACCCCGTAACGAGCATGAAACAACTTCGTTACAGAGTCCAGGGGAAGCCCCAGAATCCATCTTATACTCCTTCGACTATAGACACGGGAACTACACAACAACAGCTTTGTCACGAATTAGCCAAGACTGGGCACTTAAAGACACTGTTTCTAAAATTACAGAGCCAGATCGACAGCAACTGCTCAAACAAGCCCTCGAATGCCTGCAAATCTCGGAAGAAACGCAGGAGAAAAAAGAAAAAGAAGTACAGCAGCTCATCAGCAACCTCAGACAGCAGCAGCAGCTGTACAGAGAGCGAATAATATCATTATTAAAGGACCAATAACTTTTAACTGTGTAAAAAAGGTGAAATTGTTTGATGATAAACCAAAAAACCGTAGATTTACACCTGAGGAATTTGAAACTGAGTTACAAATAGCAAAATGGTTAAAGAGACCCCCAAGATCCTTTGTAAATGATCCTCCCTTTTACCCATGGTTACCACCTGAACCTGTTGTAAACTTTAAGCTTAATTTTACTGAATAAAGGCCAGCATTAATTCACTTAAGGAGTCTGTTTATTTAAGTTAAACCTTAATAAACGGTCACCGCCTCCCTAATACGCAGGCGCAGAAAGGGGGCTCCGCCCCCTTTAACCCCCAGGGGGCTCCGCCCCCTGAAACCCCCAAGGGGGCTACGCCCCCTTACACCCCC (SEQ ID NO: 54)  
註釋：
假定域 鹼基範圍
TATA盒 237- 243
加帽位點 260 - 267
轉錄起始位點 267
5' UTR保守域 323 - 393
ORF2 424 - 723
ORF2/2 424 - 719 ; 2274 - 2589
ORF2/3 424 - 719 ; 2449 - 2812
ORF1 612 - 2612
ORF1/1 612 - 719 ; 2274 - 2612
ORF1/2 612 - 719 ; 2449 - 2589
三個開放閱讀框架區 2441 - 2586
聚(A)信號 2808 - 2813
富含GC之區 2868 - 2929
表 B2 . 例示性指環病毒胺基酸序列 ( β 細環病毒屬 )
環2 (β細環病毒屬)
ORF2 MSDCFKPTCYNNKTKQTHWINNLHLTHDLICFCPTPTRHLLLALAEQQETIEVSKQEKEKITRCLITTEEDGTTTDVLDGMDEVGLDALFAEDFEEKEG (SEQ ID NO: 55)
ORF2/2 MSDCFKPTCYNNKTKQTHWINNLHLTHDLICFCPTPTRHLLLALAEQQETIEVSKQEKEKITRCLITTEEDGTTTDVLDGMDEVGLDALFAEDFEEKEGFNIPYPVTSMKQLRYRVQGKPQNPSYTPSTIDTGTTQQQLCHELAKTGHLKTLFLKLQSQIDSNCSNKPSNACKSRKKRRRKKKKKYSSSSATSDSSSSCTESE (SEQ ID NO: 56)
ORF2/3 MSDCFKPTCYNNKTKQTHWINNLHLTHDLICFCPTPTRHLLLALAEQQETIEVSKQEKEKITRCLITTEEDGTTTDVLDGMDEVGLDALFAEDFEEKEGARSTATAQTSPRMPANLGRNAGEKRKRSTAAHQQPQTAAAAVQRANNIIIKGPITFNCVKKVKLFDDKPKNRRFTPEEFETELQIAKWLKRPPRSFVNDPPFYPWLPPEPVVNFKLNFTE (SEQ ID NO: 57)
ORF1 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVRPTYTTIPLKQWQPPYKRTCYIKGQDCLIYYSNLRLGMNSTMYEKSIVPVHWPGGGSFSVSMLTLDALYDIHKLCRNWWTSTNQDLPLVRYKGCKITFYQSTFTDYIVRIHTELPANSNKLTYPNTHPLMMMMSKYKHIIPSRQTRRKKKPYTKIFVKPPPQFENKWYFATDLYKIPLLQIHCTACNLQNPFVKPDKLSNNVTLWSLNTISIQNRNMSVDQGQSWPFKILGTQSFYFYFYTGANLPGDTTQIPVADLLPLTNPRINRPGQSLNEAKITDHITFTEYKNKFTNYWGNPFNKHIQEHLDMILYSLKSPEAIKNEWTTENMKWNQLNNAGTMALTPFNEPIFTQIQYNPDRDTGEDTQLYLLSNATGTGWDPPGIPELILEGFPLWLIYWGFADFQKNLKKVTNIDTNYMLVAKTKFTQKPGTFYLVILNDTFVEGNSPYEKQPLPEDNIKWYPQVQYQLEAQNKLLQTGPFTPNIQGQLSDNISMFYKFYFKWGGSPPKAINVENPAHQIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 58)
ORF1/1 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 59)
ORF1/2 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRSQIDSNCSNKPSNACKSRKKRRRKKKKKYSSSSATSDSSSSCTESE (SEQ ID NO: 60)
表 C1 . 例示性指環病毒核酸序列 ( γ 細環病毒屬 )
名稱 環4
屬/分枝系 γ細環病毒屬
寄存編號   
全序列：3176 bp
1        10        20        30        40        50|        |         |         |         |         |TAAAATGGCGGGAGCCAATCATTTTATACTTTCACTTTCCAATTAAAAATGGCCACGTCACAAACAAGGGGTGGAGCCATTTAAACTATATAACTAAGTGGGGTGGCGAATGGCTGAGTTTACCCCGCTAGACGGTGCAGGGACCGGATCGAGCGCAGCGAGGAGGTCCCCGGCTGCCCATGGGCGGGAGCCGAGGTGAGTGAAACCACCGAGGTCTAGGGGCAATTCGGGCTAGGGCAGTCTAGCGGAACGGGCAAGAAACTTAAAACAATATTTGTTTTACAGATGGTTAGTATATCCTCAAGTGATTTTTTTAAGAAAACGAAATTTAATGAGGAGACGCAGAACCAAGTATGGATGTCTCAAATTGCTGACTCTCATGATAATATCTGCAGTTGCTGGCATCCATTTGCTCACCTTCTTGCTTCCATATTTCCTCCTGGCCACAAAGATCGTGATCTTACTATTAACCAAATTCTTCTAAGAGATTATAAAGAAAAATGCCATTCTGGTGGAGAAGAAGGAGAAAATTCTGGACCAACAACAGGTTTAATTACACCAAAAGAAGAAGATATAGAAAAAGATGGCCCAGAAGGCGCCGCAGAAGAAGACCATACAGACGCCCTGTTCGCCGCCGCCGTAGAAAACTTCGAAAGGTAAAGAGAAAAAAAAAATCTTTAATTGTTAGACAATGGCAACCAGACAGTATAAGAACTTGTAAAATTATAGGACAGTCAGCTATAGTTGTTGGGGCTGAAGGAAAGCAAATGTACTGTTATACTGTCAATAAGTTAATTAATGTGCCCCCAAAAACACCATATGGGGGAGGCTTTGGAGTAGACCAATACACACTGAAATACTTATATGAAGAATACAGATTTGCACAAAACATTTGGACACAATCTAATGTACTGAAAGACTTATGCAGATACATAAATGTTAAGCTAATATTCTACAGAGACAACAAAACAGACTTTGTCCTTTCCTATGACAGAAACCCACCTTTTCAACTAACAAAATTTACATACCCAGGAGCACACCCACAACAAATCATGCTTCAAAAACACCACAAATTCATACTATCACAAATGACAAAGCCTAATGGAAGACTAACAAAAAAACTCAAAATTAAACCTCCTAAACAAATGCTTTCTAAATGGTTCTTTTCAAAACAATTCTGTAAATACCCTTTACTATCTCTTAAAGCTTCTGCACTAGACCTTAGGCACTCTTACCTAGGCTGCTGTAATGAAAATCCACAGGTATTTTTTTATTATTTAAACCATGGATACTACACAATAACAAACTGGGGAGCACAATCCTCAACAGCATACAGACCTAACTCCAAGGTGACAGACACAACATACTACAGATACAAAAATGACAGAAAAAATATTAACATTAAAAGCCATGAATACGAAAAAAGTATATCATATGAAAACGGTTATTTTCAATCTAGTTTCTTACAAACACAGTGCATATATACCAGTGAGCGTGGTGAAGCCTGTATAGCAGAAAAACCACTAGGAATAGCTATTTACAATCCAGTAAAAGACAATGGAGATGGTAATATGATATACCTTGTAAGCACTCTAGCAAACACTTGGGACCAGCCTCCAAAAGACAGTGCTATTTTAATACAAGGAGTACCCATATGGCTAGGCTTATTTGGATATTTAGACTACTGTAGACAAATTAAAGCTGACAAAACATGGCTAGACAGTCATGTACTAGTAATTCAAAGTCCTGCTATTTTTACTTACCCAAATCCAGGAGCAGGCAAATGGTATTGTCCACTATCACAAAGTTTTATAAATGGCAATGGTCCGTTTAATCAACCACCTACACTGCTACAAAAAGCAAAGTGGTTTCCACAAATACAATACCAACAAGAAATTATTAATAGCTTTGTAGAATCAGGACCATTTGTTCCCAAATATGCAAATCAAACTGAAAGCAACTGGGAACTAAAATATAAATATGTTTTTACATTTAAGTGGGGTGGACCACAATTCCATGAACCAGAAATTGCTGACCCTAGCAAACAAGAGCAGTATGATGTCCCCGATACTTTCTACCAAACAATACAAATTGAAGATCCAGAAGGACAAGACCCCAGATCTCTCATCCATGATTGGGACTACAGACGAGGCTTTATTAAAGAAAGATCTCTTAAAAGAATGTCAACTTACTTCTCAACTCATACAGATCAGCAAGCAACTTCAGAGGAAGACATTCCCAAAAAGAAAAAGAGAATTGGACCCCAACTCACAGTCCCACAACAAAAAGAAGAGGAGACACTGTCATGTCTCCTCTCTCTCTGCAAAAAAGATACCTTCCAAGAAACAGAGACACAAGAAGACCTCCAGCAGCTCATCAAGCAGCAGCAGGAGCAGCAGCTCCTCCTCAAGAGAAACATCCTCCAGCTCATCCACAAACTAAAAGAGAATCAACAAATGCTTCAGCTTCACACAGGCATGTTACCTTAACCAGATTTAAACCTGGATTTGAAGAGCAAACAGAGAGAGAATTAGCAATTATATTTCATAGGCCCCCTAGAACCTACAAAGAGGACCTTCCATTCTATCCCTGGCTACCACCTGCACCCCTTGTACAATTTAACCTTAACTTCAAAGGCTAGGCCAACAATGTACACTTAGTAAAGCATGTTTATTAAAGCACAACCCCCAAAATAAATGTAAAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAAAAATTGCAAAAATTCGGCGCTCGCGCGCATGTGCGCCTCTGGCGCAAATCACGCAACGCTCGCGCGCCCGCGTATGTCTCTTTACCACGCACCTAGATTGGGGTGCGCGCGCTAGCGCGCGCACCCCAATGCGCCCCGCCCTCGTTCCGACCCGCTTGCGCGGGTCGGACCACTTCGGGCTCGGGGGGGCGCGCCTGCGGCGCTTTTTTACTAAACAGACTCCGAGCCGCCATTTGGCCCCCTAAGCTCCGCCCCCCTCATGAATATTCATAAAGGAAACCACATAATTAGAATTGCCGACCACAAACTGCCATATGCTAATTAGTTCCCCTTTTACAAAGTAAAAGGGGAAGTGAACATAGCCCCACACCCGCAGGGGCAAGGCCCCGCACCCCTACGTCACTAACCACGCCCCCGCCGCCATCTTGGGTGCGGCAGGGCGGGGGC (SEQ ID NO: 886)  
註釋：
假定域 鹼基範圍
TATA盒 87- 93
加帽位點 110 - 117
轉錄起始位點 117
5' UTR保守域 185 - 254
ORF2 286 - 660
ORF2/2 286 - 656 ; 1998 - 2442
ORF2/3 TAIP 286 - 656 ; 2209 - 2641 385 - 484
ORF1 501 - 2489
ORF1/1 501 - 656 ; 1998 - 2489
ORF1/2 501 - 656 ; 2209 - 2442
三個開放閱讀框架區 2209 - 2439
聚(A)信號 2672 - 2678
富含GC之區 3076 - 3176
表 C2 . 例示性指環病毒胺基酸序列 ( γ 細環病毒屬 )
環4 ( γ 細環病毒屬)
ORF2 MVSISSSDFFKKTKFNEETQNQVWMSQIADSHDNICSCWHPFAHLLASIFPPGHKDRDLTINQILLR DYKEKCHSGGEEGENSGPTTGLITPKEEDIEKDGPEGAAEEDHTDALFAAAVENFER (SEQ ID NO: 887)
ORF2/2 MVSISSSDFFKKTKFNEETQNQVWMSQIADSHDNICSCWHPFAHLLASIFPPGHKDRDLTINQILLRDYKEKCHSGGEEGENSGPTTGLITPKEEDIEKDGPEGAAEEDHTDALFAAAVENFESGVDHNSMNQKLLTLANKSSMMSPILSTKQYKLKIQKDKTPDLSSMIGTTDEALLKKDLLKECQLTSQLIQISKQLQRKTFPKRKRELDPNSQSHNKKKRRHCHVSSLSAKKIPSKKQRHKKTSSSSSSSSRSSSSSSRETSSSSSTN (SEQ ID NO: 888)
ORF2/3 MVSISSSDFFKKTKFNEETQNQVWMSQIADSHDNICSCWHPFAHLLASIFPPGHKDRDLTINQILLRDYKEKCHSGGEEGENSGPTTGLITPKEEDIEKDGPEGAAEEDHTDALFAAAVENFERSASNFRGRHSQKEKENWTPTHSPTTKRRGDTVMSPLSLQKRYLPRNRDTRRPPAAHQAAAGAAAPPQEKHPPAHPQTKRESTNASASHRHVTLTRFKPGFEEQTERELAIIFHRPPRTYKEDLPFYPWLPPAPLVQFNLNFKG (SEQ ID NO: 889)
TAIP MRRRRTKYGCLKLLTLMIISAVAGIHLLTFLLPYFLLATKIVILLLTKFF (SEQ ID NO: 890)
ORF1 MPFWWRRRRKFWTNNRFNYTKRRRYRKRWPRRRRRRRPYRRPVRRRRRKLRKVKRKKKSLIVRQWQPDSIRTCKIIGQSAIVVGAEGKQMYCYTVNKLINVPPKTPYGGGFGVDQYTLKYLYEEYRFAQNIWTQSNVLKDLCRYINVKLIFYRDNKTDFVLSYDRNPPFQLTKFTYPGAHPQQIMLQKHHKFILSQMTKPNGRLTKKLKIKPPKQMLSKWFFSKQFCKYPLLSLKASALDLRHSYLGCCNENPQVFFYYLNHGYYTITNWGAQSSTAYRPNSKVTDTTYYRYKNDRKNINIKSHEYEKSISYENGYFQSSFLQTQCIYTSERGEACIAEKPLGIAIYNPVKDNGDGNMIYLVSTLANTWDQPPKDSAILIQGVPIWLGLFGYLDYCRQIKADKTWLDSHVLVIQSPAIFTYPNPGAGKWYCPLSQSFINGNGPFNQPPTLLQKAKWFPQIQYQQEIINSFVESGPFVPKYANQTESNWELKYKYVFTFKWGGPQFHEPEIADPSKQEQYDVPDTFYQTIQIEDPEGQDPRSLIHDWDYRRGFIKERSLKRMSTYFSTHTDQQATSEEDIPKKKKRIGPQLTVPQQKEEETLSCLLSLCKKDTFQETETQEDLQQLIKQQQEQQLLLKRNILQLIHKLKENQQMLQLHTGMLP (SEQ ID NO: 891)
ORF1/1 MPFWWRRRRKFWTNNRFNYTKRRRYRKRWPRRRRRRRPYRRPVRRRRRKLRKWGGPQFHEPEIADPSKQEQYDVPDTFYQTIQIEDPEGQDPRSLIHDWDYRRGFIKERSLKRMSTYFSTHTDQQATSEEDIPKKKKRIGPQLTVPQQKEEETLSCLLSLCKKDTFQETETQEDLQQLIKQQQEQQLLLKRNILQLIHKLKENQQMLQLHTGMLP (SEQ ID NO: 892)
ORF1/2 MPFWWRRRRKFWTNNRFNYTKRRRYRKRWPRRRRRRRPYRRPVRRRRRKLRKISKQLQRKTFPKRKR ELDPNSQSHNKKKRRHCHVSSLSAKKIPSKKQRHKKTSSSSSSSSRSSSSSSRETSSSSSTN (SEQ ID NO: 893)
在一些實施例中，指環載體包含有包含以全文引用之方式併入本文中之PCT申請案第PCT/US2018/037379號中所列之序列的核酸。在一些實施例中，指環載體包含有包含以全文引用之方式併入本文中之PCT申請案第PCT/US2018/037379號中所列之序列的多肽。在一些實施例中，指環載體包含有包含以全文引用之方式併入本文中之PCT申請案第PCT/US19/65995號中所列之序列的核酸。在一些實施例中，指環載體包含有包含以全文引用之方式併入本文中之PCT申請案第PCT/US19/65995號中所列之序列的多肽。
ORF1 分子在一些實施例中，指環載體包含ORF1分子及/或編碼ORF1分子之核酸。一般而言，ORF1分子包含具有指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白)之結構特徵及/或活性的多肽。在一些實施例中，ORF1分子包含相對於指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述之指環病毒ORF1蛋白)之截短。ORF1分子可能能夠結合至其他ORF1分子，例如以形成蛋白質外部(例如如本文所述)，例如衣殼。在一些實施例中，蛋白質外部可包封核酸分子(例如，如本文所述之遺傳元件)。在一些實施例中，複數個ORF1分子可形成多聚體，例如以形成蛋白質外部。在一些實施例中，多聚體可為均多聚體。在其他實施例中，多聚體可為雜多聚體。
在一些實施例中，ORF1分子可包含以下中之一或多者：包含富含精胺酸之區之第一區，例如具有至少60%鹼性殘基(例如至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%鹼性殘基；例如60%-90%、60%-80%、70%-90%或70-80%之間的鹼性殘基)之區，及包含凝膠捲域之第二區，例如至少六條β股(例如4、5、6、7、8、9、10、11或12條β股)。
富含精胺酸之區富含精胺酸之區與本文所述之富含精胺酸之區序列或包含至少60%、70%或80%鹼性殘基(例如精胺酸、離胺酸或其組合)之至少約40個胺基酸的序列具有至少70% (例如至少約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性。
凝膠捲域凝膠捲域或區包含多肽(例如包含於較大多肽中之域或區) (例如由其組成)，該多肽包含以下特徵中之一或多者(例如1、2或3者)： (i)凝膠捲域之胺基酸中之至少30% (例如至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%或更多)為一或多個β片之一部分； (ii)凝膠捲域之二級結構包含至少四條(例如至少4、5、6、7、8、9、10、11或12條) β股；及/或 (iii)凝膠捲域之三級結構包含至少兩個(例如至少2、3或4個) β片；及/或 (iv)凝膠捲域包含至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1之β片與α螺旋之比。
在某些實施例中，凝膠捲域包含兩個β片。
在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含約八條(例如4、5、6、7、8、9、10、11或12條) β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含八條β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含七條β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含六條β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含五條β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含四條β股。
在一些實施例中，凝膠捲域包含與第二β片呈反平行定向之第一β片。在某些實施例中，第一β片包含約四條(例如3、4、5或6條) β股。在某些實施例中，第二β片包含約四條(例如3、4、5或6條) β股。在實施例中，第一及第二β片總共包含約八條(例如6、7、8、9、10、11或12條) β股。
在某些實施例中，凝膠捲域為衣殼蛋白(例如如本文所述之ORF1分子)之組分。在某些實施例中，凝膠捲域具有自組裝活性。在一些實施例中，包含凝膠捲域之多肽結合至包含凝膠捲域之多肽的另一複本。在一些實施例中，第一多肽之凝膠捲域結合至多肽之第二複本之凝膠捲域。
N22 域ORF1分子亦可包括包含指環病毒N22域(例如如本文所述，例如來自如本文所述之指環病毒ORF1蛋白的N22域)之結構或活性的第三區，及/或包含指環病毒C端域(CTD) (例如如本文所述，例如來自如本文所述之指環病毒ORF1蛋白的CTD)之結構或活性的第四區。在一些實施例中，ORF1分子以N端至C端次序包含第一、第二、第三及第四區。
高變區 ( HVR )在一些實施例中，ORF1分子可進一步包含高變區(HVR)，例如來自指環病毒ORF1蛋白之HVR，例如如本文所述。在一些實施例中，HVR位於第二區與第三區之間。在一些實施例中，HVR包含至少約55個(例如至少約45、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或65個)胺基酸(例如約45-160、50-160、55-160、60-160、45-150、50-150、55-150、60-150、45-140、50-140、55-140或60-140個胺基酸)。
例示性 ORF1 序列例示性指環病毒ORF1胺基酸序列及例示性ORF1域之序列提供於下表中。在一些實施例中，本文所述之多肽(例如ORF1分子)包含與一或多個指環病毒ORF1子序列(例如如表N-Z中之任一者中所述)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所述之指環載體包含ORF1分子，其包含與一或多個指環病毒ORF1子序列(例如如表N-Z中之任一者中所述)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所述之指環載體包含核酸分子(例如遺傳元件)，該核酸分子編碼包含與一或多個指環病毒ORF1子序列(例如如表N-Z中之任一者中所述)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列的ORF1分子。
在一些實施例中，一或多個指環病毒ORF1子序列包含以下中之一或多者：精胺酸(Arg)富集域、凝膠捲域、高變區(HVR)、N22域或C端域(CTD) (例如如表N-Z中之任一者中所列)或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性的序列。在一些實施例中，ORF1分子包含來自不同指環病毒之複數個子序列(例如選自表N-Z中所列之α細環病毒屬分枝系1-7子序列的ORF1子序列之任何組合)。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：Arg富集域、凝膠捲域、N22域及來自一種指環病毒之CTD及來自另一種之HVR。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：凝膠捲域、HVR、N22域及來自一種指環病毒之CTD及來自另一種之Arg富集域。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：Arg富集域、HVR、N22域及來自一種指環病毒之CTD及來自另一種之凝膠捲域。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：Arg富集域、凝膠捲域、HVR及來自一種指環病毒之CTD及來自另一種之N22域。在實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：Arg富集域、凝膠捲域、HVR及來自一種指環病毒之N22域及來自另一種之CTD。
ORF1分子或其剪接變異體或功能片段可用於本文所述之組合物及方法中(例如以形成指環載體之蛋白質外部，例如藉由包封遺傳元件)的其他例示性指環病毒描述於例如PCT申請案第PCT/US2018/037379號及第PCT/US19/65995號(以全文引用之方式併入本文中)中。 表 N . 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 ( α 細環病毒屬 ， 分枝系 3 )
名稱 環1
屬/分枝系 α細環病毒屬，分枝系3
寄存編號 AJ620231.1
蛋白質寄存編號 CAF05750.1
全序列 ：743 AA    1        10        20        30        40        50 |        |         |         |         |         | MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRVRRRRRWRRGR RKTRTYRRRRRFRRRGRKAKLIIKLWQPAVIKRCRIKGYIPLIISGNGTF ATNFTSHINDRIMKGPFGGGHSTMRFSLYILFEEHLRHMNFWTRSNDNLE LTRYLGASVKIYRHPDQDFIVIYNRRTPLGGNIYTAPSLHPGNAILAKHK ILVPSLQTRPKGRKAIRLRIAPPTLFTDKWYFQKDIADLTLFNIMAVEAD LRFPFCSPQTDNTCISFQVLSSVYNNYLSINTFNNDNSDSKLKEFLNKAF PTTGTKGTSLNALNTFRTEGCISHPQLKKPNPQINKPLESQYFAPLDALW GDPIYYNDLNENKSLNDIIEKILIKNMITYHAKLREFPNSYQGNKAFCHL TGIYSPPYLNQGRISPEIFGLYTEIIYNPYTDKGTGNKVWMDPLTKENNI YKEGQSKCLLTDMPLWTLLFGYTDWCKKDTNNWDLPLNYRLVLICPYTFP KLYNEKVKDYGYIPYSYKFGAGQMPDGSNYIPFQFRAKWYPTVLHQQQVM EDISRSGPFAPKVEKPSTQLVMKYCFNFNWGGNPIIEQIVKDPSFQPTYE IPGTGNIPRRIQVIDPRVLGPHYSFRSWDMRRHTFSRASIKRVSEQQETS DLVFSGPKKPRVDIPKQETQEESSHSLQRESRPWETEEESETEALSQESQ EVPFQQQLQQQYQEQLKLRQGIKVLFEQLIRTQQGVHVNPCLR (SEQ ID NO: 185)
  
註釋：
假定域 AA 範圍
富含Arg之區 1 - 68
凝膠捲域 69 - 280
高變區 281 - 413
N22 414 - 579
C端域 580 - 743
表 O . 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 ( α 細環病毒屬 ， 分枝系 3 )
環1 ORF1 (α細環病毒屬分枝系3)
富含Arg之區 MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRVRRRRRWRRGRRKTRTYRRRRRFRRRGRK (SEQ ID NO: 186)
凝膠捲域 AKLIIKLWQPAVIKRCRIKGYIPLIISGNGTFATNFTSHINDRIMKGPFGGGHSTMRFSLYILFEEHLRHMNFWTRSNDNLELTRYLGASVKIYRHPDQDFIVIYNRRTPLGGNIYTAPSLHPGNAILAKHKILVPSLQTRPKGRKAIRLRIAPPTLFTDKWYFQKDIADLTLFNIMAVEADLRFPFCSPQTDNTCISFQVLSSVYNNYLSI (SEQ ID NO: 187)
高變域 NTFNNDNSDSKLKEFLNKAFPTTGTKGTSLNALNTFRTEGCISHPQLKKPNPQINKPLESQYFAPLDALWGDPIYYNDLNENKSLNDIIEKILIKNMITYHAKLREFPNSYQGNKAFCHLTGIYSPPYLNQGR (SEQ ID NO: 188)
N22 ISPEIFGLYTEIIYNPYTDKGTGNKVWMDPLTKENNIYKEGQSKCLLTDMPLWTLLFGYTDWCKKDTNNWDLPLNYRLVLICPYTFPKLYNEKVKDYGYIPYSYKFGAGQMPDGSNYIPFQFRAKWYPTVLHQQQVMEDISRSGPFAPKVEKPSTQLVMKYCFNFN (SEQ ID NO: 189)
C端域 WGGNPIIEQIVKDPSFQPTYEIPGTGNIPRRIQVIDPRVLGPHYSFRSWDMRRHTFSRASIKRVSEQQETSDLVFSGPKKPRVDIPKQETQEESSHSLQRESRPWETEEESETEALSQESQEVPFQQQLQQQYQEQLKLRQGIKVLFEQLIRTQQGVHVNPCLR (SEQ ID NO: 190)
表 P . 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 ( β 細環病毒屬 )
名稱 環2
屬/分枝系 β細環病毒屬
寄存編號 JX134045.1
蛋白質寄存編號 AGG91484.1   
全序列 ：666 AA    1        10        20        30        40        50 |        |         |         |         |         | MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVRPTYTTIPLKQWQ PPYKRTCYIKGQDCLIYYSNLRLGMNSTMYEKSIVPVHWPGGGSFSVSML TLDALYDIHKLCRNWWTSTNQDLPLVRYKGCKITFYQSTFTDYIVRIHTE LPANSNKLTYPNTHPLMMMMSKYKHIIPSRQTRRKKKPYTKIFVKPPPQF ENKWYFATDLYKIPLLQIHCTACNLQNPFVKPDKLSNNVTLWSLNTISIQ NRNMSVDQGQSWPFKILGTQSFYFYFYTGANLPGDTTQIPVADLLPLTNP RINRPGQSLNEAKITDHITFTEYKNKFTNYWGNPFNKHIQEHLDMILYSL KSPEAIKNEWTTENMKWNQLNNAGTMALTPFNEPIFTQIQYNPDRDTGED TQLYLLSNATGTGWDPPGIPELILEGFPLWLIYWGFADFQKNLKKVTNID TNYMLVAKTKFTQKPGTFYLVILNDTFVEGNSPYEKQPLPEDNIKWYPQV QYQLEAQNKLLQTGPFTPNIQGQLSDNISMFYKFYFKWGGSPPKAINVEN PAHQIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQ DWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQ QQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 215)   
  
註釋：
假定域 AA 範圍
富含Arg之區 1 - 38
凝膠捲域 39 - 246
高變區 247 - 374
N22 375 - 537
C端域 538 - 666
表 Q . 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 ( β 細環病毒屬 )
環2 ORF1 (β細環病毒屬)
富含Arg之區 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVR (SEQ ID NO: 216)
凝膠捲域 PTYTTIPLKQWQPPYKRTCYIKGQDCLIYYSNLRLGMNSTMYEKSIVPVHWPGGGSFSVSMLTLDALYDIHKLCRNWWTSTNQDLPLVRYKGCKITFYQSTFTDYIVRIHTELPANSNKLTYPNTHPLMMMMSKYKHIIPSRQTRRKKKPYTKIFVKPPPQFENKWYFATDLYKIPLLQIHCTACNLQNPFVKPDKLSNNVTLWSLNT (SEQ ID NO: 217)
高變域 ISIQNRNMSVDQGQSWPFKILGTQSFYFYFYTGANLPGDTTQIPVADLLPLTNPRINRPGQSLNEAKITDHITFTEYKNKFTNYWGNPFNKHIQEHLDMILYSLKSPEAIKNEWTTENMKWNQLNNAG (SEQ ID NO: 218)
N22 TMALTPFNEPIFTQIQYNPDRDTGEDTQLYLLSNATGTGWDPPGIPELILEGFPLWLIYWGFADFQKNLKKVTNIDTNYMLVAKTKFTQKPGTFYLVILNDTFVEGNSPYEKQPLPEDNIKWYPQVQYQLEAQNKLLQTGPFTPNIQGQLSDNISMFYKFYFK (SEQ ID NO: 219)
C端域 WGGSPPKAINVENPAHQIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 220)
表 R . 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 ( γ 細環病毒屬 )
名稱 環4
屬/分枝系 γ細環病毒屬
寄存編號   
蛋白質寄存編號      
全序列 ：662 AA    1        10        20        30        40        50|        |         |         |         |         |MPFWWRRRRKFWTNNRFNYTKRRRYRKRWPRRRRRRRPYRRPVRRRRRKLRKVKRKKKSLIVRQWQPDSIRTCKIIGQSAIVVGAEGKQMYCYTVNKLINVPPKTPYGGGFGVDQYTLKYLYEEYRFAQNIWTQSNVLKDLCRYINVKLIFYRDNKTDFVLSYDRNPPFQLTKFTYPGAHPQQIMLQKHHKFILSQMTKPNGRLTKKLKIKPPKQMLSKWFFSKQFCKYPLLSLKASALDLRHSYLGCCNENPQVFFYYLNHGYYTITNWGAQSSTAYRPNSKVTDTTYYRYKNDRKNINIKSHEYEKSISYENGYFQSSFLQTQCIYTSERGEACIAEKPLGIAIYNPVKDNGDGNMIYLVSTLANTWDQPPKDSAILIQGVPIWLGLFGYLDYCRQIKADKTWLDSHVLVIQSPAIFTYPNPGAGKWYCPLSQSFINGNGPFNQPPTLLQKAKWFPQIQYQQEIINSFVESGPFVPKYANQTESNWELKYKYVFTFKWGGPQFHEPEIADPSKQEQYDVPDTFYQTIQIEDPEGQDPRSLIHDWDYRRGFIKERSLKRMSTYFSTHTDQQATSEEDIPKKKKRIGPQLTVPQQKEEETLSCLLSLCKKDTFQETETQEDLQQLIKQQQEQQLLLKRNILQLIHKLKENQQMLQLHTGMLP (SEQ ID NO: 925)   
  
註釋：
假定域 AA 範圍
富含Arg之區 1 - 58
凝膠捲域 59 - 260
高變區 261 - 339
N22 340 - 499
C端域 500 - 662
表 S . 例示性指環病毒 ORF1 胺基酸子序列 ( γ 細環病毒屬 )
環4 (γ細環病毒屬)
富含Arg之區 MPFWWRRRRKFWTNNRFNYTKRRRYRKRWPRRRRRRRPYRRPVRRRRRKLRKVKRKKK (SEQ ID NO: 926)
凝膠捲域 SLIVRQWQPDSIRTCKIIGQSAIVVGAEGKQMYCYTVNKLINVPPKTPYGGGFGVDQYTLKYLYEEYRFAQNIWTQSNVLKDLCRYINVKLIFYRDNKTDFVLSYDRNPPFQLTKFTYPGAHPQQIMLQKHHKFILSQMTKPNGRLTKKLKIKPPKQMLSKWFFSKQFCKYPLLSLKASALDLRHSYLGCCNENPQVFFYYL (SEQ ID NO: 927)
高變域 NHGYYTITNWGAQSSTAYRPNSKVTDTTYYRYKNDRKNINIKSHEYEKSISYENGYFQSSFLQTQCIYTSERGEACIAE (SEQ ID NO: 928)
N22 KPLGIAIYNPVKDNGDGNMIYLVSTLANTWDQPPKDSAILIQGVPIWLGLFGYLDYCRQIKADKTWLDSHVLVIQSPAIFTYPNPGAGKWYCPLSQSFINGNGPFNQPPTLLQKAKWFPQIQYQQEIINSFVESGPFVPKYANQTESNWELKYKYVFTFK (SEQ ID NO: 929)
C端域 WGGPQFHEPEIADPSKQEQYDVPDTFYQTIQIEDPEGQDPRSLIHDWDYRRGFIKERSLKRMSTYFSTHTDQQATSEEDIPKKKKRIGPQLTVPQQKEEETLSCLLSLCKKDTFQETETQEDLQQLIKQQQEQQLLLKRNILQLIHKLKENQQMLQLHTGMLP (SEQ ID NO: 930)
在一些實施例中，第一區可結合至核酸分子(例如DNA)。在一些實施例中，鹼性殘基係選自精胺酸、組胺酸或離胺酸或其組合。在一些實施例中，第一區包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%精胺酸殘基(例如60%-90%、60%-80%、70%-90%或70%-80%精胺酸殘基)。在一些實施例中，第一區包含約30-120個胺基酸(例如約40-120、40-100、40-90、40-80、40-70、50-100、50-90、50-80、50-70、60-100、60-90或60-80個胺基酸)。在一些實施例中，第一區包含病毒ORF1富含精胺酸之區(例如來自指環病毒ORF1蛋白之富含精胺酸之區，例如如本文所述)的結構或活性。在一些實施例中，第一區包含核定位信號。
在一些實施例中，第二區包含凝膠捲域，例如病毒ORF1凝膠捲域(例如來自指環病毒ORF1蛋白之凝膠捲域，例如如本文所述)的結構或活性。在一些實施例中，第二區能夠結合至另一ORF1分子之第二區，例如以形成蛋白質外部(例如衣殼)或其一部分。
在一些實施例中，第四區暴露於蛋白質外部(例如包含ORF1分子之多聚體的蛋白質外部，例如如本文所述)之表面上。
在一些實施例中，第一區、第二區、第三區、第四區及/或HVR各自包含少於四個(例如0、1、2或3個) β片。
在一些實施例中，第一區、第二區、第三區、第四區及/或HVR中之一或多者可由異源性胺基酸序列(例如來自異源性ORF1分子之對應區)替換。在一些實施例中，異源性胺基酸序列具有所需功能性，例如如本文所述。
在一些實施例中，ORF1分子包含複數個保守模體(例如，包含約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多個胺基酸的模體) (例如，如PCT/US19/65995之圖34中所示)。在一些實施例中，保守模體可展示與一或多種野生型指環病毒分枝系(例如α細環病毒屬，分枝系1；α細環病毒屬，分枝系2；α細環病毒屬，分枝系3；α細環病毒屬，分枝系4；α細環病毒屬，分枝系5；α細環病毒屬，分枝系6；α細環病毒屬，分枝系7；β細環病毒屬；及/或γ細環病毒屬)之ORF1蛋白的60、70、80、85、90、95或100%序列一致性。在實施例中，保守模體各自之長度為在1-1000個(例如5-10、5-15、5-20、10-15、10-20、15-20、5-50、5-100、10-50、10-100、10-1000、50-100、50-1000或100-1000個)之間的胺基酸。在某些實施例中，保守模體由ORF1分子之序列的約2-4% (例如約1-8%、1-6%、1-5%、1-4%、2-8%、2-6%、2-5%或2-4%)組成，且各自展示與野生型指環病毒分枝系之ORF1蛋白中之對應模體100%序列一致性。在某些實施例中，保守模體由ORF1分子之序列的約5-10% (例如約1-20%、1-10%、5-20%或5-10%)組成，且各自展示與野生型指環病毒分枝系之ORF1蛋白中之對應模體80%序列一致性。在某些實施例中，保守模體由ORF1分子之序列的約10-50% (例如約10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、20-40%、20-50%或30-50%)組成，且各自展示與野生型指環病毒分枝系之ORF1蛋白中之對應模體60%序列一致性。在一些實施例中，保守模體包含一或多個如表19中所列之胺基酸序列。
在一些實施例中，ORF1分子相對於野生型ORF1蛋白包含至少一個差異(例如突變、化學修飾或表觀遺傳改變)，例如如本文所述。
N22 域中之保守 ORF1 模體在一些實施例中，本文所述之多肽(例如ORF1分子)包含胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。舉例而言，X 2指示任何兩個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)包含於ORF1分子之N22域內，例如如本文所述。在一些實施例中，本文所述之遺傳元件包含編碼胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)之核酸序列(例如編碼ORF1分子之核酸序列，例如如本文所述)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。
在一些實施例中，多肽(例如ORF1分子)包含保守二級結構，例如側接及/或包含YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體之一部分，例如在N22域中。在一些實施例中，保守二級結構包含第一β股及/或第二β股。在一些實施例中，第一β股之長度為約5-6個(例如3、4、5、6、7或8個)胺基酸。在一些實施例中，第一β股包含在YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體之N端的酪胺酸(Y)殘基。在一些實施例中，YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體包含無規捲曲(例如約8-9個胺基酸之無規捲曲)。在一些實施例中，第二β股之長度為約7-8個(例如5、6、7、8、9或10個)胺基酸。在一些實施例中，第二β股包含在YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體之C端的天冬醯胺(N)殘基。
例示性YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體側接二級結構描述於PCT/US19/65995之實例47及圖48中；該案以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，ORF1分子包含有包含PCT/US19/65995之圖48中所示之一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或全部)二級結構元件(例如β股)的區。在一些實施例中，ORF1分子包含有包含PCT/US19/65995之圖48中所示之一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或全部)二級結構元件(例如β股)的區，側接YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體(例如如本文所述)。
ORF1 凝膠捲域中之保守二級結構模體在一些實施例中，本文所述之多肽(例如ORF1分子)包含指環病毒ORF1蛋白(例如如本文所述)所包含之一或多個二級結構元件。在一些實施例中，ORF1分子包含指環病毒ORF1蛋白之凝膠捲域所包含之一或多個二級結構元件(例如如本文所述)。通常，ORF1凝膠捲域包含二級結構，該二級結構按N端至C端方向之順序包含第一β股、第二β股、第一α螺旋、第三β股、第四β股、第五β股、第二α螺旋、第六β股、第七β股、第八β股及第九β股。在一些實施例中，ORF1分子包含二級結構，該二級結構按N端至C端方向之順序包含第一β股、第二β股、第一α螺旋、第三β股、第四β股、第五β股、第二α螺旋、第六β股、第七β股、第八β股及/或第九β股。
在一些實施例中，一對保守二級結構元件(亦即β股及/或α螺旋)由間隙胺基酸序列隔開，例如包含無規捲曲序列、β股或α螺旋或其組合。保守二級結構元件之間的間隙胺基酸序列可包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個胺基酸。在一些實施例中，ORF1分子可進一步包含一或多個額外β股及/或α螺旋(例如在凝膠捲域中)。在一些實施例中，可組合連續β股或連續α螺旋。在一些實施例中，第一β股及第二β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第三β股及第四β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第四β股及第五β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第六β股及第七β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第七β股及第八β股包含於較大β股中。在一些實施例中，第八β股及第九β股包含於較大β股中。
在一些實施例中，第一β股之長度為約5-7個(例如3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸。在一些實施例中，第二β股之長度為約15-16個(例如13、14、15、16、17、18或19個)胺基酸。在一些實施例中，第一α螺旋之長度為約15-17個(例如13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸。在一些實施例中，第三β股之長度為約3-4個(例如1、2、3、4、5或6個)胺基酸。在一些實施例中，第四β股之長度為約10-11個(例如8、9、10、11、12或13個)胺基酸。在一些實施例中，第五β股之長度為約6-7個(例如4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸。在一些實施例中，第二α螺旋之長度為約8-14個(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個)胺基酸。在一些實施例中，第二α螺旋可分解為兩個較小α螺旋(例如由無規捲曲序列隔開)。在一些實施例中，兩個較小α螺旋中之每一者之長度為約4-6個(例如2、3、4、5、6、7或8個)胺基酸。在一些實施例中，第六β股之長度為約4-5個(例如，2、3、4、5、6或7個)胺基酸。在一些實施例中，第七β股之長度為約5-6個(例如3、4、5、6、7、8或9個)胺基酸。在一些實施例中，第八β股之長度為約7-9個(例如5、6、7、8、9、10、11、12或13個)胺基酸。在一些實施例中，第九β股之長度為約5-7個(例如，3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸。
例示性凝膠捲域二級結構描述於PCT/US19/65995之實例47與本文圖25中。在一些實施例中，ORF1分子包含有包含本文圖25中所示之任一凝膠捲域二級結構之一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或全部)二級結構元件(例如β股及/或α螺旋)的區。
共有ORF1域序列  在一些實施例中，例如如本文所述之ORF1分子包含凝膠捲域、N22域及/或C端域(CTD)中之一或多者。在一些實施例中，凝膠捲域包含具有如本文所述(例如如表37A-37C中之任一者中所列)之凝膠捲域共有序列的胺基酸序列。在一些實施例中，N22域包含具有如本文所述(例如如表37A-37C中之任一者中所列)之N22域共有序列的胺基酸序列。在一些實施例中，CTD域包含具有如本文所述(例如如表37A-37C中之任一者中所列)之CTD域共有序列的胺基酸序列。在一些實施例中，呈型式「(X a - b )」的表37A-37C中之任一者中所列之胺基酸包含一系列連續胺基酸，其中該系列包含至少 a個且至多 b個胺基酸。在某些實施例中，該系列中之所有胺基酸均相同。在其他實施例中，該系列包含至少兩個(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個)不同胺基酸。 表 37A . α 細環病毒 ORF 1 域共有序列
域 序列 SEQ ID NO:
凝膠捲 LVLTQWQPNTVRRCYIRGYLPLIICGEN(X 0-3)TTSRNYATHS DDTIQKGPFGGGMSTTTFSLRVLYDEYQRFMNRWTYSNEDLDLARYLGCKFTFYRHPDXDFIVQYNTNPPFKDTKLTAPSIHP(X 1-5)GMLMLSKRKILIPSLKTRPKGKHYVKVRIGPPKLFED KWYTQSDLCDVPLVXLYATAADLQHPFGSPQTDNPCVTFQVLGSXYNKHLSISP;    其中X=任何胺基酸。 227
N22 SNFEFPGAYTDITYNPLTDKGVGNMVWIQYLTKPDTIXDKTQS(X 0-3)KCLIEDLPLWAALYGYVDFCEKETGDSAIIXNXGRV LIRCPYTKPPLYDKT(X 0-4)NKGFVPYSTNFGNGKMPGGSGY VPIYWRARWYPTLFHQKEVLEDIVQSGPFAYKDEKPSTQLVMKYCFNFN;    其中X=任何胺基酸。 228
CTD WGGNPISQQVVRNPCKDSG(X 0-3)SGXGRQPRSVQVVDPKY MGPEYTFHSWDWRRGLFGEKAIKRMSEQPTDDEIFTGGXPKRPRRDPPTXQXPEE(X 1-4)QKESSSFR(X 2-14)PWESSSQEXES ESQEEEE(X 0-30)EQTVQQQLRQQLREQRRLRVQLQLLFQQLL KT(X 0-4)QAGLHINPLLLSQA(X 0-40)*;    其中X=任何胺基酸。 229
表 37B . β 細環病毒 ORF 1 域共有序列
域 序列 SEQ ID NO:
凝膠捲 LKQWQPSTIRKCKIKGYLPLFQCGKGRISNNYTQYKESIVPHHEPGGGGWSIQQFTLGALYEEHLKLRNWWTKSNDGLPLVRYLGCTIKLYRSEDTDYIVTYQRCYPMTATKLTYLSTQPSRMLMNKHKIIVPSKXT(X 1-4)NKKKKPYKKIF IKPPSQMQNKWYFQQDIANTPLLQLTXTACSLDRMYLSSDSISNNITFTSLNTNFFQNPNFQ;    其中X=任何胺基酸。 230
N22 (X 4-10)TPLYFECRYNPFKDKGTGNKVYLVSNN(X 1-8)TG WDPPTDPDLIIEGFPLWLLLWGWLDWQKKLGKIQNIDTDYILVIQSXYYIPP(X 1-3)KLPYYVPLDXD(X 0-2)FLHGRS PY(X 3-16)PSDKQHWHPKVRFQXETINNIALTGPGTPKL PNQKSIQAHMKYKFYFK;    其中X=任何胺基酸。 231
CTD WGGCPAPMETITDPCKQPKYPIPNNLLQTTSLQXPTTPIETYLYKFDERRGLLTKKAAKRIKKDXTTETTLFTDTGXXTSTTLPTXXQTETTQEEXTSEEE(X 0-5)ETLLQQLQQLR RKQKQLRXRILQLLQLLXLL(X 0-26)*;    其中X=任何胺基酸。 232
表 37C . γ 細環病毒 ORF 1 域共有序列
域 序列 SEQ ID NO:
凝膠捲 TIPLKQWQPESIRKCKIKGYGTLVLGAEGRQFYCYTNEKDEYTPPKAPGGGGFGVELFSLEYLYEQWKARNNIWTKSNXYKDLCRYTGCKITFYRHPTTDFIVXYSRQPPFEIDKXTYMXXHPQXLLLRKHKKIILSKATNPKGKLKKKIKIKPPKQMLNKWFFQKQFAXYGLVQLQAAACBLRYPRLGCCNENRLITLYYLN;    其中X=任何胺基酸。 233
N22 LPIVVARYNPAXDTGKGNKXWLXSTLNGSXWAPPTTDKDLIIEGLPLWLALYGYWSYJKKVKKDKGILQSHMFVVKSPAIQPLXTATTQXTFYPXIDNSFIQGKXPYDEPJTXNQKKLWYPTLEHQQETINAIVESGPYVPKLDNQKNSTWELXYXYTFYFK;    其中X=任何胺基酸。 234
CTD WGGPQIPDQPVEDPKXQGTYPVPDTXQQTIQIXNPLKQKPETMFHDWDYRRGIITSTALKRMQENLETDSSFXSDSEETP(X 0-2)KKKKRLTXELPXPQEETEEIQSCLLSLCEEST CQEE(X 1-6)ENLQQLIHQQQQQQQQLKHNILKLLSDLKZ KQRLLQLQTGILE(X 1-10)*;    其中X=任何胺基酸。 235
在一些實施例中，凝膠捲域包含如表21、23、25、27、29、31、33、35、D2、D4、D6、D8、D10或37A-37C中之任一者中所列之凝膠捲域胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，N22域包含如表21、23、25、27、29、31、33、35、D2、D4、D6、D8、D10或37A-37C中之任一者中所列之N22域胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，CTD域包含如表21、23、25、27、29、31、33、35、D2、D4、D6、D8、D10或37A-37C中之任一者中所列之CTD域胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
鑑別 ORF1 蛋白 序列在一些實施例中，可自指環病毒之基因體(例如經鑑別之假定指環病毒基因體，例如藉由核酸定序技術，例如深度定序技術)鑑別指環病毒ORF1蛋白序列或編碼ORF1蛋白之核酸序列。在一些實施例中，ORF1蛋白序列係藉由以下選擇標準中之一或多者(例如1、2或全部3者)鑑別： ( i ) 長度選擇 ：蛋白質序列(例如符合下文(ii)或(iii)中所述之準則的假定指環病毒ORF1序列)可對於大於約600個胺基酸殘基之彼等進行尺寸選擇，以鑑別假定指環病毒ORF1蛋白。在一些實施例中，指環病毒ORF1蛋白序列之長度為至少約600、650、700、750、800、850、900、950或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，α細環病毒ORF1蛋白序列之長度為至少約700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、900或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，β細環病毒ORF1蛋白序列之長度為至少約650、660、670、680、690、700、750、800、900或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，γ細環病毒ORF1蛋白序列之長度為至少約650、660、670、680、690、700、750、800、900或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，編碼指環病毒ORF1蛋白之核酸序列的長度為至少約1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500個核苷酸。在一些實施例中，編碼α細環病毒ORF1蛋白序列之核酸序列的長度為至少約2100、2150、2200、2250、2300、2400或2500個核苷酸。在一些實施例中，編碼β細環病毒ORF1蛋白序列之核酸序列的長度為至少約1900、1950、2000、2500、2100、2150、2200、2250、2300、2400或2500或1000個核苷酸。在一些實施例中，編碼γ細環病毒ORF1蛋白序列之核酸序列的長度為至少約1900、1950、2000、2500、2100、2150、2200、2250、2300、2400或2500或1000個核苷酸。 ( ii ) ORF1 模體之存在 ：蛋白質序列(例如符合以上(i)或以下(iii)中所述之準則的假定指環病毒ORF1序列)可經過濾以鑑別在上文所述之N22域中含有保守ORF1模體之彼等蛋白質序列。在一些實施例中，假定指環病毒ORF1序列包含序列YNPXXDXGXXN (SEQ ID NO: 829)。在一些實施例中，假定指環病毒ORF1序列包含序列Y[NCS]P XXD X[GASKR] XX[NTSVAK] (SEQ ID NO: 992)。 ( iii ) 富含精胺酸之區 之存在 ：蛋白質序列(例如符合以上(i)及/或(iii)中所述之準則的假定指環病毒ORF1序列)可對於包括富含精胺酸之區(例如如本文所述)之彼等進行過濾。在一些實施例中，假定指環病毒ORF1序列包含至少約30、35、40、45、50、55、60、65或70個胺基酸之連續序列，其包含至少30% (例如至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%)精胺酸殘基。在一些實施例中，假定指環病毒ORF1序列包含約35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65或65-70個胺基酸之連續序列，其包含至少30% (例如至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%)精胺酸殘基。在一些實施例中，富含精胺酸之區位於假定指環病毒ORF1蛋白之起始密碼子下游至少約30、40、50、60、70或80個胺基酸處。在一些實施例中，富含精胺酸之區位於假定指環病毒ORF1蛋白之起始密碼子下游至少約50個胺基酸處。
ORF2分子  在一些實施例中，指環載體包含ORF2分子及/或編碼ORF2分子之核酸。一般而言，ORF2分子包含具有指環病毒ORF2蛋白(例如如本文中所述之指環病毒ORF2蛋白，例如如表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1-C5、2、4、6、8、10、12、14、16或18中之任一者中所列)或其功能片段之結構特徵及/或活性的多肽。在一些實施例中，ORF2分子包含與表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1-C5、2、4、6、8、10、12、14、16或18中之任一者中所示之指環病毒ORF2蛋白序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，ORF2分子包含與α細環病毒、β細環病毒或γ細環病毒ORF2蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF2分子(例如與α細環病毒ORF2蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之ORF2分子)的長度為250個或更少胺基酸(例如約150-200個胺基酸)。在一些實施例中，ORF2分子(例如與β細環病毒ORF2蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之ORF2分子)的長度為約50-150個胺基酸。在一些實施例中，ORF2分子(例如與γ細環病毒ORF2蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之ORF2分子)的長度為約100-200個胺基酸(例如約100-150個胺基酸)。在一些實施例中，ORF2分子包含螺旋-轉角-螺旋模體(例如包含兩個側接轉角區之α螺旋的螺旋-轉角-螺旋模體)。在一些實施例中，ORF2分子不包含TTV分離株TA278或TTV分離株SANBAN之ORF2蛋白的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF2分子具有蛋白質磷酸酶活性。在一些實施例中，相對於野生型ORF2蛋白，例如如本文所述(例如如表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1-C5、2、4、6、8、10、12、14、16或18中之任一者中所示)，ORF2分子包含至少一個差異(例如突變、化學修飾或表觀遺傳改變)。
保守 ORF2 模體在一些實施例中，本文所述之多肽(例如ORF2分子)包含胺基酸序列[W/F]X 7HX 3CX 1CX 5H (SEQ ID NO: 949)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。在實施例中，X 7指示任何七個胺基酸之連續序列。在實施例中，X 3指示任何三個胺基酸之連續序列。在實施例中，X 1指示任何單一胺基酸。在實施例中，X 5指示任何五個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，[W/F]可為色胺酸或苯丙胺酸。在一些實施例中，[W/F]X 7HX 3CX 1CX 5H (SEQ ID NO: 949)包含於ORF2分子之N22域內，例如如本文所述。在一些實施例中，本文所述之遺傳元件包含編碼胺基酸序列[W/F]X 7HX 3CX 1CX 5H (SEQ ID NO: 949)之核酸序列(例如編碼ORF2分子之核酸序列，例如如本文所述)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。
遺傳元件  在一些實施例中，指環載體包含遺傳元件。在一些實施例中，遺傳元件具有以下特徵中之一或多者：與宿主細胞之基因體實質上不整合，為游離型核酸，為單股DNA，為環狀，為約1至10 kb，存在於細胞核內，可與內源性蛋白結合，產生靶向宿主或目標細胞之基因、活性或功能的效應子，諸如多肽或核酸(例如RNA、iRNA、微小RNA)。在一個實施例中，遺傳元件為實質上非整合DNA。在一些實施例中，遺傳元件包含封裝信號，例如結合衣殼蛋白之序列。在一些實施例中，在封裝或衣殼結合序列之外，遺傳元件與野生型指環病毒核酸序列具有小於70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%序列一致性，例如與指環病毒核酸序列(例如如本文所述)具有小於70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%序列一致性。在一些實施例中，在封裝或衣殼結合序列之外，遺傳元件具有小於500 450、400、350、300、250、200、150或100個連續核苷酸，該等連續核苷酸與指環病毒核酸序列至少70%、75%、80%、8%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。在某些實施例中，遺傳元件為環狀單股DNA，其包含啟動子序列、編碼治療性效應子之序列及衣殼結合蛋白。
在一些實施例中，遺傳元件之長度為小於20 kb (例如小於約19 kb、18 kb、17 kb、16 kb、15 kb、14 kb、13 kb、12 kb、11 kb、10 kb、9 kb、8 kb、7 kb、6 kb、5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb或更小)。在一些實施例中，遺傳元件之長度獨立地或另外為1000 b (例如至少約1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5kb或更大)。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.5-4.6 kb、2.8-4.0 kb、3.0-3.8 kb或3.2-3.7 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約1.5-2.0 kb、1.5-2.5 kb、1.5-3.0 kb、1.5-3.5 kb、1.5-3.8 kb、1.5-3.9 kb、1.5-4.0 kb、1.5-4.5 kb或1.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.0-2.5 kb、2.0-3.0 kb、2.0-3.5 kb、2.0-3.8 kb、2.0-3.9 kb、2.0-4.0 kb、2.0-4.5 kb或2.0-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.5-3.0 kb、2.5-3.5 kb、2.5-3.8 kb、2.5-3.9 kb、2.5-4.0 kb、2.5-4.5 kb或2.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約3.0-5.0 kb、3.5-5.0 kb、4.0-5.0 kb或4.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約1.5-2.0 kb、2.0-2.5 kb、2.5-3.0 kb、3.0-3.5 kb、3.1-3.6 kb、3.2-3.7 kb、3.3-3.8 kb、3.4-3.9 kb、3.5-4.0 kb、4.0-4.5 kb或4.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約3.6-3.9 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.8-2.9 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.0-3.2 kb。
在一些實施例中，遺傳元件包含本文所述之特徵中之一或多者，例如編碼實質上非病原蛋白之序列、蛋白質結合序列、編碼調控核酸之一或多個序列、一或多個調控序列、編碼複製蛋白之一或多個序列及其他序列。
在一些實施例中，遺傳元件由雙股環狀DNA產生(例如由活體外環化產生)。在一些實施例中，遺傳元件藉由自雙股環狀DNA滾環複製而產生。在一些實施例中，滾環複製發生在細胞(例如宿主細胞，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞，例如HEK293T細胞、A549細胞或Jurkat細胞)中。在一些實施例中，遺傳元件可藉由細胞中之滾環複製以指數方式擴增。在一些實施例中，遺傳元件可藉由細胞中之滾環複製以線性方式擴增。在一些實施例中，雙股環狀DNA或遺傳元件能夠藉由細胞中之滾環複製產生原始量的至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、518倍、1024倍或更多倍。在一些實施例中，將雙股環狀DNA引入至細胞中，例如如本文所述。
在一些實施例中，雙股環狀DNA及/或遺傳元件不包含一或多個細菌質體元件(例如細菌複製起點或可選標記，例如細菌抗性基因)。在一些實施例中，雙股環狀DNA及/或遺傳元件不包含細菌質體主鏈。
在一個實施例中，本發明包括一種遺傳元件，其包含編碼以下各者之核酸序列(例如DNA序列)：(i)實質上非致病性外部蛋白質；(ii)將遺傳元件結合至實質上非致病性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列；及(iii)調控核酸。在此類實施例中，遺傳元件可包含一或多個與天然病毒序列(例如天然指環病毒序列，例如如本文所述)之核苷酸序列中之任一者具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性的序列。
蛋白質結合序列  許多病毒採用之策略為病毒衣殼蛋白識別其基因體中之特異性蛋白質結合序列。舉例而言，在具有未分段基因體之病毒(諸如酵母之L-A病毒)中，在基因體之5'端處存在二級結構(莖-環)及特定序列，兩者均用於結合病毒衣殼蛋白。然而，具有分段基因體之病毒，諸如呼腸孤病毒科( Reoviridae)、正黏液病毒科( Orthomyxoviridae) (流感)、布尼亞病毒( Bunyaviruses)及沙狀病毒科( Arenaviruses)需要封裝基因體區段中之每一者。一些病毒利用區段之互補區以幫助病毒包括各基因體分子中之一者。其他病毒對不同區段中之每一者具有特異性結合位點。參見例如Curr Opin Struct Biol. 2010年2月; 20(1): 114-120；及Journal of Virology (2003), 77(24), 13036-13041。
在一些實施例中，遺傳元件編碼結合至實質上非病原性蛋白質之蛋白質結合序列。在一些實施例中，蛋白質結合序列有助於將遺傳元件封裝至蛋白質外部中。在一些實施例中，蛋白質結合序列特異性結合實質上非病原性蛋白質之富含精胺酸之區。在一些實施例中，遺傳元件包含如PCT/US19/65995之實例8中所述之蛋白質結合序列。
在一些實施例中，遺傳元件包含與指環病毒序列之5' UTR保守域或GC富集域具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的蛋白質結合序列，例如如本文所述。
在一些實施例中，蛋白質結合序列與指環病毒5' UTR保守域核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，例如如本文所述。
5' UTR區  在一些實施例中，如本文所述之核酸分子(例如遺傳元件、遺傳元件構築體或遺傳元件區)包含5' UTR序列，例如如本文(例如在表A1、B1或C1中的任一者中)所述之5' UTR保守域序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。
在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTGAAACCACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGGGX 1CAGTCT (SEQ ID NO: 993)，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTGAAACCACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGGGX 1CAGTCT (SEQ ID NO: 993)，或相對於其具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異(例如取代、缺失或添加)的核酸序列。在實施例中，X 1為A。在一些實施例中，X 1不存在。
在一些實施例中，5' UTR序列包含α細環病毒(例如環1)之5' UTR之核酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含表A1中所列之5' UTR保守域核酸序列或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1中所列之5' UTR保守域具有至少95%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1中所列之5' UTR保守域具有至少95.775%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1中所列之5' UTR保守域具有至少97%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表A1中所列之5' UTR保守域具有至少97.183%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGC (SEQ ID NO: 994)，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGC (SEQ ID NO: 994)，或相對於其具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異(例如取代、缺失或添加)的核酸序列。
在一些實施例中，5' UTR序列包含β細環病毒(例如環2)之5' UTR的核酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含表B1中所列之5' UTR保守域核酸序列或與其具有至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少85%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少87%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少87.324%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少88%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少88.732%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少91%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少91.549%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少92%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少92.958%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少94%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少94.366%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少95%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少95.775%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少97%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表B1中所列之5' UTR保守域具有至少97.183%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTGAAACCACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGATCAGTCT (SEQ ID NO: 995)，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTGAAACCACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGATCAGTCT (SEQ ID NO: 995)，或相對於其具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異(例如取代、缺失或添加)的核酸序列。
在一些實施例中，5' UTR序列包含γ細環病毒(例如環4)之5' UTR的核酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含表C1中所列之5' UTR保守域核酸序列或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1中所列之5' UTR保守域具有至少97%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表C1中所列之5' UTR保守域具有至少97.183%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTGAAACCACCGAGGTCTAGGGGCAATTCGGGCTAGGGCAGTCT (SEQ ID NO: 996)，或與其具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，5' UTR序列包含核酸序列AGGTGAGTGAAACCACCGAGGTCTAGGGGCAATTCGGGCTAGGGCAGTCT (SEQ ID NO: 996)，或相對於其具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異(例如取代、缺失或添加)的核酸序列。
在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與指環病毒5' UTR序列(例如表38中所示之核酸序列)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含具有表38中所示之共有5' UTR序列的核酸序列，其中X 1、X 2、X 3、X 4及X 5各自獨立地為任何核苷酸，例如其中X 1=G或T，X 2=C或A，X 3=G或A，X 4=T或C，且X 5=A、C或T)。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之共有5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之例示性TTV 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-CT30F 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-HD23a 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-JA20 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-TJN02 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之TTV-tth8 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。
在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒屬共有5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒屬分枝系1 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒屬分枝系2 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒屬分枝系3 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒屬分枝系4 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒屬分枝系5 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒屬分枝系6 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表38中所示之α細環病毒屬分枝系7 5' UTR序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。 表 38 . 來自指環病毒之例示性 5 ' UTR 序列
來源 序列 SEQ ID NO:
共同 CGGGTGCCGX 1AGGTGAGTTTACACACCGX 2AGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCX 3GGACTGGCCGGGCX 4X 5TGGG X 1= G或T X 2= C或A X 3= G或A X 4= T或C X 5= A、C或T 105
例示性TTV序列 CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTWTGGG 106
TTV-CT30F CGGGTGCCGTAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 107
TTV-HD23a CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCCCTGGG 108
TTV-JA20 CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTTTGGG 109
TTV-TJN02 CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 110
TTV-tth8 CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCAGGACTGGCCGGGCTTTGGG 111
α細環病毒屬共有5' UTR CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGC X 1X 2TGGG；其中X 1包含T或C，且其中X 2包含A、C或T。 112
α細環病毒屬分枝系1 5' UTR (例如TTV-CT30F) CGGGTGCCGTAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 113
α細環病毒屬分枝系2 5' UTR (例如TTV-P13-1) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCCCGGG 114
α細環病毒屬分枝系3 5' UTR (例如TTV-tth8) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCAGGACTGGCCGGGCTTTGGG 115
α細環病毒屬分枝系4 5' UTR (例如TTV-HD20a) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGAGGCCGGGCCATGGG 116
α細環病毒屬分枝系5 5' UTR (例如TTV-16) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCCCCGGG 117
α細環病毒屬分枝系6 5' UTR (例如TTV-TJN02) CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 118
α細環病毒屬分枝系7 5' UTR (例如TTV-HD16d) CGGGTGCCGAAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGCTATGGG 119
鑑別 5 ' UTR 序列在一些實施例中，可在指環病毒之基因體(例如鑑別之假定指環病毒基因體，例如藉由核酸定序技術，例如深度定序技術)內鑑別指環病毒5' UTR序列。在一些實施例中，藉由以下步驟中之一或兩者鑑別指環病毒5' UTR序列： (i) 鑑別環化接合點：在一些實施例中，5' UTR將位於全長環化指環病毒基因體之環化接合點附近。可例如藉由鑑別序列之重疊區來鑑別環化接合點。在一些實施例中，序列之重疊區可自序列修整以產生已環化之全長指環病毒基因體序列。在一些實施例中，基因體序列以此方式使用軟體環化。不希望受理論所束縛，計算環化基因體可使得序列之起始位置在非生物中定向。序列內之地標可用於在恰當方向上重新定向序列。舉例而言，地標序列可包括與如本文所述之指環病毒基因體內之一或多個元件(例如以下中之一或多者：TATA盒、加帽位點、起始元件、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、三個開放閱讀框架區、聚(A)信號或指環病毒之富含GC之區，例如如本文所述)具有實質性同源性的序列。 (ii) 鑑別 5 ' UTR 序列：一旦已獲得假定指環病毒基因體序列，則可將序列(或其部分，例如長度為約40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100個核苷酸)與一或多個指環病毒5' UTR序列(例如如本文所述)相比，以鑑別與其具有實質性同源性之序列。在一些實施例中，假定指環病毒5' UTR區與如本文所述之指環病毒5' UTR序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
富含GC之區  在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之核酸序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之GC富集序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。
在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之36個核苷酸之GC富集序列(例如36個核苷酸之共有富含GC之區序列1、36個核苷酸之共有富含GC之區序列2、TTV分枝系1 36個核苷酸之區、TTV分枝系3 36個核苷酸之區、TTV分枝系3分離株GH1 36個核苷酸之區、TTV分枝系3 sle1932 36個核苷酸之區、TTV分枝系4 ctdc002 36個核苷酸之區、TTV分枝系5 36個核苷酸之區、TTV分枝系6 36個核苷酸之區或TTV分枝系7 36個核苷酸之區)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含一核酸序列，該核酸序列包含具有如表39中所示之36個核苷酸之GC富集序列(例如36個核苷酸之共有富含GC之區序列1、36個核苷酸之共有富含GC之區序列2、TTV分枝系1 36個核苷酸之區、TTV分枝系3 36個核苷酸之區、TTV分枝系3分離株GH1 36個核苷酸之區、TTV分枝系3 sle1932 36個核苷酸之區、TTV分枝系4 ctdc002 36個核苷酸之區、TTV分枝系5 36個核苷酸之區、TTV分枝系6 36個核苷酸之區或TTV分枝系7 36個核苷酸之區)的至少10、15、20、25、30、31、32、33、34、35或36個連續核苷酸。
在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與α細環病毒屬富含GC之區序列具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列，該α細環病毒屬富含GC之區序列例如選自TTV-CT30F、TTV-P13-1、TTV-tth8、TTV-HD20a、TTV-16、TTV-TJN02或TTV-HD16d，例如如表39中所列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含一核酸序列，該核酸序列包含具有α細環病毒屬富含GC之區序列之至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、104、105、108、110、111、115、120、122、130、140、145、150、155或156個連續核苷酸，該α細環病毒屬富含GC之區序列例如選自TTV-CT30F、TTV-P13-1、TTV-tth8、TTV-HD20a、TTV-16、TTV-TJN02或TTV-HD16d，例如如表39中所列。
在一些實施例中，36個核苷酸之GC富集序列係選自： (i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC (SEQ ID NO: 160)， (ii) GCGCTX 1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC (SEQ ID NO: 164)，其中X 1係選自T、G或A； (iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG (SEQ ID NO: 165)； (iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG (SEQ ID NO: 166)； (v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT (SEQ ID NO: 167)； (vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC (SEQ ID NO: 168)； (vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC (SEQ ID NO: 169)； (viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC (SEQ ID NO: 170)； (ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC (SEQ ID NO: 171)；或 (x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC (SEQ ID NO: 172)。
在一些實施例中，遺傳元件(例如，遺傳元件之蛋白質結合序列)包含核酸序列CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC (SEQ ID NO: 160)。
在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含具有表39中所示之共有GC富集序列的核酸序列，其中X 1、X 4、X 5、X 6、X 7、X 12、X 13、X 14、X 15、X 20、X 21、X 22、X 26、X 29、X 30及X 33各自獨立地為任何核苷酸，且其中X 2、X 3、X 8、X 9、X 10、X 11、X 16、X 17、X 18、X 19、X 23、X 24、X 25、X 27、X 28、X 31、X 32及X 34各自獨立地不存在或為任何核苷酸。在一些實施例中，X 1至X 34中之一或多者(例如全部)各自獨立地為表39中所指定之核苷酸(或不存在)。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV GC富集序列(例如全序列、片段1、片段2、片段3或其任何組合，例如依序片段1-3)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-CT30F GC富集序列(例如全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8或其任何組合，例如依序片段1-7)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-HD23a GC富集序列(例如全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6或其任何組合，例如依序片段1-6)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-JA20 GC富集序列(例如全序列、片段1、片段2或其任何組合，例如依序片段1及片段2)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-TJN02 GC富集序列(例如全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8或其任何組合，例如依序片段1-8)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之TTV-tth8 GC富集序列(例如全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8、片段9或其任何組合，例如依序片段1-6)具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之片段7具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之片段8具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件(例如遺傳元件之蛋白質結合序列)包含與表39中所示之片段9具有至少約75% (例如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性的核酸序列。 表 39 . 來自指環病毒之例示性 GC 富集序列
來源 序列 SEQ ID NO:
共同 CGGCGGX 1GGX 2GX 3X 4X 5CGCGCTX 6CGCGCGCX 7X 8X 9X 10CX 11X 12X 13X 14GGGGX 15X 16X 17X 18X 19X 20X 21GCX 22X 23X 24X 25CCCCCCCX 26CGCGCATX 27X 28GCX 29CGGGX 30CCCCCCCCCX 31X 32X 33GGGGGGCTCCGX 34CCCCCCGGCCCCCC    X 1= G或C X 2= G、C或不存在 X 3= C或不存在 X 4= G或C X 5= G或C X 6= T、G或A X 7= G或C X 8= G或不存在 X 9= C或不存在 X 10= C或不存在 X 11= G、A或不存在 X 12= G或C X 13= C或T X 14= G或A X 15= G或A X 16= A、G、T或不存在 X 17= G、C或不存在 X 18= G、C或不存在 X 19= C、A或不存在 X 20= C或A X 21= T或A X 22= G或C X 23= G、T或不存在 X 24= C或不存在 X 25= G、C或不存在 X 26= G或C X 27= G或不存在 X 28= C或不存在 X 29= G或A X 30= G或T X 31= C、T或不存在 X 32= G、C、A或不存在 X 33= G或C X 34= C或不存在 120
例示性TTV序列 全序列 GCCGCCGCGGCGGCGGSGGNGNSGCGCGCTDCGCGCGCSNNNCRCCRGGGGGNNNNCWGCSNCNCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGKCCCCCCCCCNNCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 121
片段1 GCCGCCGCGGCGGCGGSGGNGNSGCGCGCTDCGCGCGCSNNNCRCCRGGGGGNNNNCWGCSNCNCCCCCCCCCGCGCAT 122
片段2 GCGCGGGKCCCCCCCCCNNCGGGGGGCTCCG 123
片段3 CCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 124
TTV-CT30F 全序列 GCGGCGG-GGGGGCG-GCCGCG-TTCGCGCGCCGCCCACCAGGGGGTG--CTGCG-CGCCCCCCCCCGCGCAT GCGCGGGGCCCCCCCCC--GGGGGGGCTCCGCCCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 125
片段1 GCGGCGG 126
片段2 GGGGGCG 127
片段3 GCCGCG 128
片段4 TTCGCGCGCCGCCCACCAGGGGGTG 129
片段5 CTGCG 130
片段6 CGCCCCCCCCCGCGCAT 131
片段7 GCGCGGGGCCCCCCCCC 132
片段8 GGGGGGGCTCCGCCCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 133
TTV-HD23a 全序列 CGGCGGCGGCGGCG-CGCGCGCTGCGCGCGCG---CGCCGGGGGGGCGCCAGCG-CCCCCCCCCCCGCGCAT GCACGGGTCCCCCCCCCCACGGGGGGCTCCG CCCCCCGGCCCCCCCCC 134
片段1 CGGCGGCGGCGGCG 135
片段2 CGCGCGCTGCGCGCGCG 136
片段3 CGCCGGGGGGGCGCCAGCG 137
片段4 CCCCCCCCCCCGCGCAT 138
片段5 GCACGGGTCCCCCCCCCCACGGGGGGCTCCG 139
片段6 CCCCCCGGCCCCCCCCC 140
TTV-JA20 全序列 CCGTCGGCGGGGGGGCCGCGCGCTGCGCGCGCGGCCC-CCGGGGGAGGCACAGCCTCCCCCCCCCGCGCGCATGCGCGCGGGTCCCCCCCCCTCCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCC 141
片段1 CCGTCGGCGGGGGGGCCGCGCGCTGCGCGCGCGGCCC 142
片段2 CCGGGGGAGGCACAGCCTCCCCCCCCCGCGCGCATGCGCGCGGGTCCCCCCCCCTCCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCC 143
TTV-TJN02 全序列 CGGCGGCGGCG-CGCGCGCTACGCGCGCG---CGCCGGGGGG----CTGCCGC-CCCCCCCCCGCGCAT GCGCGGGGCCCCCCCCC-GCGGGGGGCTCCG CCCCCCGGCCCCCC 144
片段1 CGGCGGCGGCG 145
片段2 CGCGCGCTACGCGCGCG 146
片段3 CGCCGGGGGG 147
片段4 CTGCCGC 148
片段5 CCCCCCCCCGCGCAT 149
片段6 GCGCGGGGCCCCCCCCC 150
片段7 GCGGGGGGCTCCG 151
片段8 CCCCCCGGCCCCCC 152
TTV-tth8 全序列 GCCGCCGCGGCGGCGGGGG-GCGGCGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGCG---CCCCCCCCCGCGCAT GCGCGGGGCCCCCCCCC-GCGGGGGGCTCCG CCCCCCGGCCCCCCCCG 153
片段1 GCCGCCGCGGCGGCGGGGG 154
片段2 GCGGCGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGCG 155
片段3 CCCCCCCCCGCGCAT 156
片段4 GCGCGGGGCCCCCCCCC 157
片段5 GCGGGGGGCTCCG 158
片段6 CCCCCCGGCCCCCCCCG 159
片段7 CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC 160
片段8 CCGCCATCTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGG 161
片段9 CTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGGACAATTTCTTCCGGGTCAAAGGTTACAGCCGCCATGTTAAAACACGTGACGTATGACGTCACGGCCGCCATTTTGTGACACAAGATGGCCGACTTCCTTCC 162
額外GC富集序列 36個核苷酸之共有富含GC之區序列1 CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC 163
36個核苷酸之共有富含GC之區序列2 GCGCTX 1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC，其中X 1係選自T、G或A 164
TTV分枝系1 36個核苷酸之區 GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG 165
TTV分枝系3 36個核苷酸之區 GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG 166
TTV分枝系3分離株GH1 36個核苷酸之區 GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT 167
TTV分枝系3 sle1932 36個核苷酸之區 GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC 168
TTV分枝系4 ctdc002 36個核苷酸之區 GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC 169
TTV分枝系5 36個核苷酸之區 GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC 170
TTV分枝系6 36個核苷酸之區 GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC 171
TTV分枝系7 36個核苷酸之區 GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC 172
額外α細環病毒屬富含GC之區序列 TTV-CT30F GCGGCGGGGGGGCGGCCGCGTTCGCGCGCCGCCCACCAGGGGGTGCTGCGCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGGGGGGGCTCCGCCCCCCCGGCCCCCCCCCGTGCTAAACCCACCGCGCATGCGCGACCACGCCCCCGCCGCC 801
TTV-P13-1 CCGAGCGTTAGCGAGGAGTGCGACCCTACCCCCTGGGCCCACTTCTTCGGAGCCGCGCGCTACGCCTTCGGCTGCGCGCGGCACCTCAGACCCCCGCTCGTGCTGACACGCTTGCGCGTGTCAGACCACTTCGGGCTCGCGGGGGTCGGG 802
TTV-tth8 GCCGCCGCGGCGGCGGGGGGCGGCGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCCG 803
TTV-HD20a CGGCCCAGCGGCGGCGCGCGCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGTCCCCCCCCG 804
TTV-16 CGGCCGTGCGGCGGCGCGCGCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGCTGCCGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCCCCCCCG 805
TTV-TJN02 CGGCGGCGGCGCGCGCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCCGCCCCCCCCCCGCGCATGCGCGGGGCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGCCCCCC 806
TTV-HD16d GGCGGCGGCGCGCGCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGAGCTCTGCCCCCCCCCGCGCATGCGCGCGGGTCCCCCCCCCGCGGGGGGCTCCGCCCCCCGGTCCCCCCCCCG 807
效應子  在一些實施例中，遺傳元件可包括一或多個編碼效應子，例如功能性效應子，例如內源性效應子或外源性效應子，例如治療性多肽或核酸，例如細胞毒性或細胞溶解RNA或蛋白質的序列。在一些實施例中，功能性核酸為非編碼RNA。在一些實施例中，功能性核酸為編碼RNA。效應子可調節生物活性，例如提高或降低酶活性、基因表現、細胞信號傳導及細胞或器官功能。效應子活性亦可包括結合調控蛋白以調節調節因子之活性，諸如轉錄或轉譯。效應子活性亦可包括活化子或抑制劑功能。舉例而言，效應子可藉由觸發酶中受質親和力的提高來誘導酶活性，例如果糖2,6-雙磷酸活化磷酸果糖激酶1且提高響應於胰島素之糖酵解速率。在另一實例中，效應子可抑制受質與受體結合且抑制其活化，例如納曲酮(naltrexone)及納洛酮(naloxone)在不活化類鴉片受體之情況下結合類鴉片受體且阻斷受體結合類鴉片之能力。效應子活性亦可包括調節蛋白質穩定性/降解及/或轉錄物穩定性/降解。舉例而言，蛋白質可經靶向以藉由多肽輔因子泛素降解至蛋白質上，以標記蛋白質用於降解。在另一實例中，效應子藉由阻斷酶活性位點來抑制酶活性，例如甲胺喋呤為四氫葉酸之結構類似物，該四氫葉酸為酶二氫葉酸還原酶之輔酶，與二氫葉酸還原酶之結合比天然受質更緊密1000倍，且抑制核苷酸鹼基合成。
在一些實施例中，編碼效應子之序列為遺傳元件之一部分，例如其可插入如本文所述之插入位點處。在一些實施例中，將編碼效應子之序列在非編碼區處，例如安置於遺傳元件之開放閱讀框架之3'及富含GC之區之5'的非編碼區、在TATA盒上游之5'非編碼區中、在5' UTR中、在聚A信號下游之3'非編碼區中或在富含GC之區上游，插入至遺傳元件中。在一些實施例中，編碼效應子之序列在例如如本文所述之TTV-tth8質體之約核苷酸3588處，或在例如如本文所述之TTMV-LY2質體之約核苷酸2843處插入至遺傳元件中。在一些實施例中，編碼效應子之序列在例如如本文所述之TTV-tth8質體之核苷酸336-3015處或其內，或在例如如本文所述之TTMV-LY2質體之核苷酸242-2812處或其內插入至遺傳元件中。在一些實施例中，編碼效應子之序列替代開放閱讀框架(例如如本文所述之ORF，例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3)之部分或全部。
在一些實施例中，編碼效應子之序列包含100-2000、100-1000、100-500、100-200、200-2000、200-1000、200-500、500-1000、500-2000或1000-2000個核苷酸。在一些實施例中，效應子為例如如本文所述之核酸或蛋白質有效負載。
調控核酸在一些實施例中，效應子為調控核酸。調控核酸修飾內源性基因及/或外源性基因之表現。在一個實施例中，調控核酸靶向宿主基因。調控核酸可包括但不限於與內源性基因雜交之核酸(例如如本文其他地方所述之miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反義RNA、gRNA)、與諸如病毒DNA或RNA之外源性核酸雜交之核酸、與RNA雜交之核酸、干擾基因轉錄之核酸、干擾RNA轉譯之核酸、諸如經由靶向而使RNA穩定或使RNA不穩定以進行降解之核酸、及調節DNA或RNA結合因子之核酸。在一些實施例中，調控核酸編碼miRNA。在一些實施例中，調控核酸對於野生型指環病毒為內源性的。在一些實施例中，調控核酸對於野生型指環病毒為外源性的。
在一些實施例中，調控核酸包含通常含有5-500個鹼基對之RNA或RNA樣結構(視特定RNA結構而定，例如miRNA 5-30 bp、lncRNA 200-500 bp)，且可具有與細胞內表現之目標基因中之編碼序列或編碼細胞內表現之目標基因之序列一致(或互補)或幾乎一致(或實質上互補)的核鹼基序列。
在一些實施例中，調控核酸包含核酸序列，例如嚮導RNA (gRNA)。在一些實施例中，DNA靶向部分包含嚮導RNA或編碼嚮導RNA之核酸。gRNA短合成RNA由與不完全效應部分結合所必需的「骨架」序列及使用者定義之基因體目標之約20個核苷酸靶向序列構成。實際上，嚮導RNA序列通常經設計以具有17-24個核苷酸(例如19、20或21個核苷酸)之間的長度且與所靶向核酸序列互補。常規gRNA產生器及演算法可商業購得，用於設計有效嚮導RNA。亦使用嵌合「單嚮導RNA」(「sgRNA」)實現基因編輯，該單嚮導RNA為模擬天然存在之crRNA-tracrRNA複合物且含有tracrRNA (用於結合核酸酶)及至少一種crRNA (以將核酸酶導引至經靶向以進行編輯之序列)的經工程改造(合成)之單一RNA分子。亦已證明經化學修飾之sgRNA在基因體編輯中有效；參見例如Hendel等人 (2015) Nature Biotechnol., 985 - 991。
調控核酸包含識別特異性DNA序列(例如鄰近於基因之啟動子、強化子、靜止子或抑制子或在其內之序列)的gRNA。
某些調控核酸可經由RNA干擾(RNAi)之生物過程抑制基因表現。RNAi分子包含RNA或RNA樣結構，該等結構通常含有15-50個鹼基對(諸如約18-25個鹼基對)且具有與細胞內所表現之目標基因中之編碼序列一致(互補)或幾乎一致(實質上互補)的核鹼基序列。RNAi分子包括但不限於：短干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、部分雙螺旋體及切丁酶受質(美國專利第8,084,599號、第8,349,809號及第8,513,207號)。
長的非編碼RNA (lncRNA)被定義為長於100個核苷酸之非蛋白質編碼轉錄物。此略微任意之限制將lncRNA與較小調控RNA (諸如微小RNA (miRNA)、短干擾RNA (siRNA)及其他短RNA)區分開來。一般而言，大部分(約78%)之lncRNA表徵為組織特異性的。在與附近蛋白質編碼基因相反之方向上轉錄之發散lncRNA (佔哺乳動物基因體中總lncRNA之顯著比例，約20%)可能調節鄰近基因之轉錄。
遺傳元件可編碼具有與內源性基因或基因產物(例如mRNA)之全部或片段實質上互補或完全互補之序列的調控核酸。調控核酸可與內含子與外顯子之間的邊界處之序列互補，以防止特定基因之新產生的細胞核RNA轉錄物成熟為mRNA以便轉錄。與特定基因互補之調控核酸可與該基因之mRNA雜交且防止其轉譯。反義調控核酸可為DNA、RNA或其衍生物或混成體。
雜合至所關注轉錄本之調控核酸之長度可為5至30個核苷酸、約10至30個核苷酸或約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個核苷酸。調控核酸與所靶向轉錄物之一致性程度應為至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。
遺傳元件可編碼調控核酸，例如與目標基因之約5至約25個連續核苷酸具有一致性的微小RNA (miRNA)分子。在一些實施例中，miRNA序列靶向mRNA且以二核苷酸AA開始，包含約30-70% (約30-60%、約40-60%或約45-55%)之GC含量，且與欲引入之哺乳動物基因體中除目標以外之任何核苷酸序列不具有高比例一致性，例如如藉由標準BLAST搜尋所確定。
在一些實施例中，調控核酸為至少一個miRNA，例如2、3、4、5、6或更多個。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼與該核苷酸序列中之任一者至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核苷酸序列一致性的miRNA的序列或與本文所述(例如表40中)之序列互補的序列。 表 40 ：調控核酸，例如 miRNA 之實例 .
病毒株之寄存編號 例示性子序列核苷酸 Pre_miRNA SEQ ID NO: miRNA_5prime_ per_MiRdup SEQ ID NO: miRNA_3prime_per_MiRdup SEQ ID NO:
AB008394.1 AB008394_ 3475_3551 GCCAUUUUAAGUAGCUGACGUCAAGGAUUGACGUAAAGGUUAAAGGUCAUCCUCGGCGGAAGCUACACAAAAUGGU 300 AGUAGCUGACGUCAAGGAUUGAC(5') 395 CAUCCUCGGCGGAAGCUACACAA(3') 490
AB008394.1 AB008394_ 3579_3657 GCGUACGUCACAAGUCACGUGGAGGGGACCCGCUGUAACCCGGAAGUAGGCCCCGUCACGUGACUUACCACGUGUGUA 301 CAAGUCACGUGGAGGGGACCCG(5') 396 GGCCCCGUCACGUGACUUACCAC(3') 491
AB017613.1 AB017613_ 3462_3539 GCCAUUUUAAGUAGCUGACGUCAAGGAUUGACGUGAAGGUUAAAGGUCAUCCUCGGCGGAAGCUACACAAAAUGGUG 302 AAGUAGCUGACGUCAAGGAUUGACG(5') 397 UCAUCCUCGGCGGAAGCUACACAA(3') 492
AB017613.1 AB017613_ 3566_3644 GCACACGUCAUAAGUCACGUGGUGGGGACCCGCUGUAACCCGGAAGUAGGCCCCGUCACGUGAUUUGUCACGUGUGUA 303 AUAAGUCACGUGGUGGGGACCCG(5') 398 GGCCCCGUCACGUGAUUUGUCAC(3') 493
AB025946.1 AB025946_ 3534_3600 CUUCCGGGUCAUAGGUCACACCUACGUCACAAGUCACGUGGGGAGGGUUGGCGUAUAGCCCGGAAG 304 UGGGGAGGGUUGGCGUAUAGCCCGGA(3') 399 CCGGGUCAUAGGUCACACCUACGUCAC(5') 494
AB025946.1 AB025946_ 3730_3798 GCCGGGGGGCUGCCGCCCCCCCCGGGGAAAGGGGGGGGCCCCCCCCGGGGGGGGGUUUGCCCCCCGGC 305 CCCCCCCCGGGGGGGGGUUUGCCC(3') 400 GGCUGCCGCCCCCCCCGGGGAAAGGGGG(5') 495
AB028668.1 AB028668_ 3537_3615 AUACGUCAUCAGUCACGUGGGGGAAGGCGUGCCUAAACCCGGAAGCAUCCUCGUCCACGUGACUGUGACGUGUGUGGC 306 AUCAGUCACGUGGGGGAAGGCGUGC(5') 401 AUCCUCGUCCACGUGACUGUGA(3') 496
AB028669.1 AB028669_ 3440_3513 CAUUUUAAGUAAGGCGGAAGCAGCUCGGCGUACACAAAAUGGCGGCGGAGCACUUCCGGCUUGCCCAAAAUGG 307 AAGUAAGGCGGAAGCAGCUCGG(5') 402 GAGCACUUCCGGCUUGCCCAA(3') 497
AB028669.1 AB028669_ 3548_3619 GUCACAAGUCACGUGGGGAGGGUUGGCGUUUAACCCGGAAGCCAAUCCUCUUACGUGGCCUGUCACGUGAC 308 AGUCACGUGGGGAGGGUUGGC (5') 403 CAAUCCUCUUACGUGGCCUG(3') 498
AB037926.1 AB037926_ 162_232 CGACCGCGUCCCGAAGGCGGGUACCCGAGGUGAGUUUACACACCGAGGUUAAGGGCCAAUUCGGGCUUGG 309 CCCGAAGGCGGGUACCCGAGGU(5') 404 CGAGGUUAAGGGCCAAUUCGGGCU(3') 499
AB037926.1 AB037926_ 3454_3513 CGCGGUAUCGUAGCCGACGCGGACCCCGUUUUCGGGGCCCCCGCGGGGCUCUCGGCGCG 310 UAUCGUAGCCGACGCGGACCCCG(5') 405 GGGCCCCCGCGGGGCUCUCGGCG(3') 500
AB037926.1 AB037926_ 3531_3609 CGCCAUUUUGUGAUACGCGCGUCCCCUCCCGGCUUCCGUACAACGUCAGGCGGGGCGUGGCCGUAUCAGAAAAUGGCG 311 AUUUUGUGAUACGCGCGUCCCCUCCC(5') 406 GCGGGGCGUGGCCGUAUCAGAAAAUGG(3') 501
AB037926.1 AB037926_ 3637_3714 GCUACGUCAUAAGUCACGUGACUGGGCAGGUACUAAACCCGGAAGUAUCCUCGGUCACGUGGCCUGUCACGUAGUUG 312 AAGUCACGUGACUGGGCAGGU (5') 407 CCUCGGUCACGUGGCCUGU(3') 502
AB038621.1 AB038621_ 3511_3591 GGCUSUGACGUCAAAGUCACGUGGGRAGGGUGGCGUUAAACCCGGAAGUCAUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACAGCC 313 UGACGUCAAAGUCACGUGGGRAGGGU(5') 408 CCUCGUCACGUGACCUGACGUCACAG (3') 503
AB038622.1 AB038622_ 227_293 GCCCGUCCGCGGCGAGAGCGCGAGCGAAGCGAGCGAUCGAGCGUCCCGUGGGCGGGUGCCGAAGGU 314 GAUCGAGCGUCCCGUGGGCGGGU(3') 409 CCGUCCGCGGCGAGAGCGCGAGCGA (5') 504
AB038622.1 AB038622_ 3510_3591 GGUUGUGACGUCAAAGUCACGUGGGGAGGGCGGCGUUAAACCCGGAAGUCAUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACGGCC 315 UGACGUCAAAGUCACGUGGGGAGGGCGG(5') 410 AUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACG(3') 505
AB038623.1 AB038623_ 228_295 GCCCGUCCGCGGCGAGAGCGCGAGCGAAGCGAGCGAUCGAGCGUCCCGUGGGCGGGUGCCGUAGGUG 316 GAUCGAGCGUCCCGUGGGCGGGU(3') 411 CCGUCCGCGGCGAGAGCGCGAGCGA (5') 506
AB038624.1 AB038624_ 228_295 GCCCGUCCGCGGCGAGAGCGCGAGCGAAGCGAGCGAUCGAGCGUCCCGUGGGCGGGUGCCGUAGGUG 317 GAUCGAGCGUCCCGUGGGCGGGU(3') 412 CCGUCCGCGGCGAGAGCGCGAGCGA (5') 507
AB038624.1 AB038624_ 3511_3592 GGCUGUGACGUCAAAGUCACGUGGGGAGGGCGGCGUUAAACCCGGAAGUCAUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACGGCC 318 UGACGUCAAAGUCACGUGGGGAGGGCGG(5') 413 AUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACG(3') 508
AB041957.1 AB041957_ 3414_3493 AGACCACGUGGUAAGUCACGUGGGGGCAGCUGCUGUAAACCCGGAAGUAGCUGACCCGCGUGACUGGUCACGUGACCUG 319 ACGUGGUAAGUCACGUGGGGGCAGCU(5') 414 CUGACCCGCGUGACUGGUCACGUGA (3') 509
AB049608.1 AB049608_ 3199_3277 CGCCAUUUUAUAAUACGCGCGUCCCCUCCCGGCUUCCGUACUACGUCAGGCGGGGCGUGGCCGUAUUAGAAAAUGGUG 320 AUUUUAUAAUACGCGCGUCCCCUCC(5') 415 CGGGGCGUGGCCGUAUUAGAAAAUGG (3') 510
AB050448.1 AB050448_ 3393_3465 UAAGUAAGGCGGAACCAGGCUGUCACCCUGUGUCAAAGGUCAAGGGACAGCCUUCCGGCUUGCACAAAAUGG 321 AAGGGACAGCCUUCCGGCUUGC(3') 416 AGUAAGGCGGAACCAGGCUGUCACCCUGU(5') 511
AB054647.1 AB054647_ 3537_3615 UGCCUACGUCAUAAGUCACGUGGGGACGGCUGCUGUAAACACGGAAGUAGCUGACCCGCGUGACUUGUCACGUGAGCA 322 CAUAAGUCACGUGGGGACGGCUGCU(5') 417 UAGCUGACCCGCGUGACUUGUCAC(3') 512
AB054648.1 AB054648_ 3439_3511 UUGUGUAAGGCGGAACAGGCUGACACCCCGUGUCAAAGGUCAGGGGUCAGCCUCCGCUUUGCACCAAAUGGU 323 UAAGGCGGAACAGGCUGACACCCC(5') 418 GGUCAGCCUCCGCUUUGCA(3') 513
AB054648.1 AB054648_ 3538_3617 UACCUACGUCAUAAGUCACGUGGGAAGAGCUGCUGUGAACCUGGAAGUAGCUGACCCGCGUGGCUUGUCACGUGAGUGC 324 UACGUCAUAAGUCACGUGGGAAGAGCUG(5') 419 GCUGACCCGCGUGGCUUGUCACGUGAGU(3') 514
AB064595.1 AB064595_ 116_191 UUUUCCUGGCCCGUCCGCGGCGAGAGCGCGAGCGAAGCGAGCGAUCGGGCGUCCCGAGGGCGGGUGCCGGAGGUG 325 UCGGGCGUCCCGAGGGCGGGUG(3') 420 GGCCCGUCCGCGGCGAGAGCGCGAG(5') 515
AB064595.1 AB064595_ 3283_3351 AAAGUGAGUGGGGCCAGACUUCGCCAUAGGGCCUUUAACUUCCGGGUGCGUCUGGGGGCCGCCAUUUU 326 AAAGUGAGUGGGGCCAGACUUCGCC(5') 421 UCCGGGUGCGUCUGGGGGCCGCCAUUU(3') 516
AB064595.1 AB064595_ 3427_3500 GUGACGUUACUCUCACGUGAUGGGGGCGUGCUCUAACCCGGAAGCAUCCUCGACCACGUGACUGUGACGUCAC 327 CUCUCACGUGAUGGGGGCGUGC(5') 422 AUCCUCGACCACGUGACUGUG(3') 517
AB064595.1 AB064595_ 41_116 AGCGUCUACUACGUACACUUCCUGGGGUGUGUCCUGCCACUGUAUAUAAACCAGAGGGGUGACGAAUGGUAGAGU 328 UCUACUACGUACACUUCCUGGGGUGUGU(5') 423 AUAAACCAGAGGGGUGACGAAUGGUAGAGU(3') 518
AB064596.1 AB064596_ 3424_3497 GUGACGUCAAAGUCACGUGGUGACGGCCAUUUUAACCCGGAAGUGGCUGUUGUCACGUGACUUGACGUCACGG 329 UGGCUGUUGUCACGUGACUUGA(3') 424 CAAAGUCACGUGGUGACGGCCAU(5') 519
AB064597.1 AB064597_ 3191_3253 GCUUUAGACGCCAUUUUAGGCCCUCGCGGGCACCCGUAGGCGCGUUUUAAUGACGUCACGGC 330 AGACGCCAUUUUAGGCCCUCGCGG(5') 425 GUAGGCGCGUUUUAAUGACGUCACGG (3') 520
AB064597.1 AB064597_ 3221_3294 CACCCGUAGGCGCGUUUUAAUGACGUCACGGCAGCCAUUUUGUCGUGACGUUUGAGACACGUGAUGGGGGCGU 331 UGUCGUGACGUUUGAGACACGUGAU(3') 426 UAGGCGCGUUUUAAUGACGUCACGGCAG(5') 521
AB064597.1 AB064597_ 3262_3342 GUCGUGACGUUUGAGACACGUGAUGGGGGCGUGCCUAAACCCGGAAGCAUCCCUGGUCACGUGACUCUGACGUCACGGCG 332 UGACGUUUGAGACACGUGAUGGGGGCGUGC(5') 427 AUCCCUGGUCACGUGACUCUGACGUCACG(3') 522
AB064598.1 AB064598_ 3179_3256 CGAAAGUGAGUGGGGCCAGACUUCGCCAUAAGGCCUUUAACUUCCGGGUGCGUGUGGGGGCCGCCAUUUUAGCUUCG 333 AGUGAGUGGGGCCAGACUUCGC (5') 428 GCGUGUGGGGGCCGCCAUUUUAGCUU (3') 523
AB064598.1 AB064598_ 3323_3399 CUGUGACGUCAAAGUCACGUGGGGAGGGCGGCGUGUAACCCGGAAGUCAUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACGG 334 UGUGACGUCAAAGUCACGUGGGGAGGGCGG(5') 429 UCAUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACG(3') 524
AB064598.1 AB064598_ 3412_3485 CUGUCCGCCAUCUUGUGACUUCCUUCCGCUUUUUCAAAAAAAAAGAGGAAGUAUGACGUAGCGGCGGGGGGGC 335 AAAAGAGGAAGUAUGACGUAGCGGCGG(3') 430 CGCCAUCUUGUGACUUCCUUCCGCUUUUU(5') 525
AB064599.1 AB064599_ 108_175 GGUAGAGUUUUUUCCGCCCGUCCGCAGCGAGGACGCGAGCGCAGCGAGCGGCCGAGCGACCCGUGGG 336 AGCGAGCGGCCGAGCGACCCG (3') 431 UAGAGUUUUUUCCGCCCGUCCG(5') 526
AB064599.1 AB064599_ 3389_3469 GCUGUGACGUUUCAGUCACGUGGGGAGGGAACGCCUAAACCCGGAAGCGUCCCUGGUCACGUGAUUGUGACGUCACGGCC 337 UUCAGUCACGUGGGGAGGGAACGC(5') 432 GUCCCUGGUCACGUGAUUGUGAC(3') 527
AB064599.1 AB064599_ 3483_3546 CCGCCAUUUUGUGACUUCCUUCCGCUUUUUCAAAAAAAAAGAGGAAGUGUGACGUAGCGGCGG 338 AAAAGAGGAAGUGUGACGUAGCGG(3') 433 CAUUUUGUGACUUCCUUCCGCUUUUU (5') 528
AB064600.1 AB064600_ 3378_3456 GACUGUGACGUCAAAGUCACGUGGGGAGGGCGGCGUGUAACCCGGAAGUCAUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACGG 339 UGUGACGUCAAAGUCACGUGGGGAGGGCGG(5') 434 UCAUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACG(3') 529
AB064600.1 AB064600_ 3469_3542 CUGUCCGCCAUCUUGUGACUUCCUUCCGCUUUUUCAAAAAAAAAGAGGAAGUAUGACGUGGCGGCGGGGGGGC 340 AAAAGAGGAAGUAUGACGUGGCGG(3') 435 CCGCCAUCUUGUGACUUCCUUCCGCUUUUU(5') 530
AB064601.1 AB064601_ 3318_3398 GGUUGUGACGUCAAAGUCACGUGGGGAGGGCGGCGUGUAACCCGGAAGUCAUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACGGCC 341 UGACGUCAAAGUCACGUGGGGAGGGCGG(5') 436 AUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACG(3') 531
AB064601.1 AB064601_ 3412_3477 CCCGCCAUCUUGUGACUUCCUUCCGCUUUUUCAAAAAAAAAGAGGAAGUGUGACGUAGCGGCGGG 342 AAAAAAGAGGAAGUGUGACGUAGCGGCGG(3') 437 CGCCAUCUUGUGACUUCCUUCCGCUUUUUC(5') 532
AB064602.1 AB064602_ 125_192 GCCCGUCCGCGGCGAGAGCGCGAGCGAAGCGAGCGAUCGAGCGUCCCGUGGGCGGGUGCCGUAGGUG 343 GAUCGAGCGUCCCGUGGGCGGGU(3') 438 CCGUCCGCGGCGAGAGCGCGAGCGA (5') 533
AB064602.1 AB064602_ 3368_3446 GACUGUGACGUCAAAGUCACGUGGGGAGGAGGGCGUGUAACCCGGAAGUCAUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACGG 344 UGUGACGUCAAAGUCACGUGGGGAGGAGGG(5') 439 UCAUCCUCGUCACGUGACCUGACGUCACG(3') 534
AB064603.1 AB064603_ 3385_3447 UCGCGUCUUAGUGACGUCACGGCAGCCAUCUUGGUCCUGACGUCACUGUCACGUGGGGAGGG 345 UUGGUCCUGACGUCACUGUCA (3') 440 CUUAGUGACGUCACGGCAGCCAU(5') 535
AB064603.1 AB064603_ 3422_3498 UGACGUCACUGUCACGUGGGGAGGGAACACGUGAACCCGGAAGUGUCCCUGGUCACGUGACAUGACGUCACGGCCG 346 CGUCACUGUCACGUGGGGAGGGAACAC(5') 441 GUCCCUGGUCACGUGACAUGACGUC (3') 536
AB064604.1 AB064604_ 3436_3514 CGCCAUUUUAAGUAAGCAUGGCGGGCGGUGAUGUCAAAUGUUAAAGGUCACAGCCGGUCAUGCUUGCACAAAAUGGCG 347 UAAGUAAGCAUGGCGGGCGGUGAU(5') 442 CACAGCCGGUCAUGCUUGCACAAA(3') 537
AB064605.1 AB064605_ 3440_3518 CGCCAUUUUAAGUAAGCAUGGCGGGCGGUGACGUGCAAUGUCAAAGGUCACAGCCUGUCAUGCUUGCACAAAAUGGCG 348 AAGUAAGCAUGGCGGGCGGUGA(5') 443 ACAGCCUGUCAUGCUUGCACAA(3') 538
AB064606.1 AB064606_ 3377_3449 CCAUCUUAAGUAGUUGAGGCGGACGGUGGCGUCGGUUCAAAGGUCACCAUCAGCCACACCUACUCAAAAUGG 349 UAAGUAGUUGAGGCGGACGGUGGC(5') 444 CACCAUCAGCCACACCUACUCAAA(3') 539
AB064607.1 AB064607_ 3502_3569 GCCUGUCAUGCUUGCACAAAAUGGCGGACUUCCGCUUCCGGGUCGCCGCCAUAUUUGGUCACGUGAC 350 UCAUGCUUGCACAAAAUGGCGGACUUCCG(5') 445 CGGGUCGCCGCCAUAUUUGGUCACGUGA(3') 540
AF079173.1 AF079173_ 3475_3551 GCCAUUUUAAGUAGCUGACGUCAAGGAUUGACGUAAAGGUUAAAGGUCAUCCUCGGCGGAAGCUACACAAAAUGGU 351 AGUAGCUGACGUCAAGGAUUGAC(5') 446 CAUCCUCGGCGGAAGCUACACAA(3') 541
AF116842.1 AF116842_ 3475_3551 GCCAUUUUAAGUAGCUGACGUCAAGGAUUGACGUAAAGGUUAAAGGUCAUCCUCGGCGGAAGCUACACAAAAUGGU 352 AGUAGCUGACGUCAAGGAUUGAC(5') 447 CAUCCUCGGCGGAAGCUACACAA(3') 542
AF116842.1 AF116842_ 3579_3657 GCAUACGUCACAAGUCACGUGGGGGGGACCCGCUGUAACCCGGAAGUAGGCCCCGUCACGUGACUUACCACGUGUGUA 353 ACAAGUCACGUGGGGGGGACCCG(5') 448 GGCCCCGUCACGUGACUUACCAC(3') 543
AF122913.1 AF122913_ 3475_3551 GCCAUUUUAAGUAGCUGACGUCAAGGAUUGACGUGAAGGUUAAAGGUCAUCCUCGGCGGAAGCUACACAAAAUGGU 354 AAGUAGCUGACGUCAAGGAUUGACG(5') 449 UCAUCCUCGGCGGAAGCUACACAA(3') 544
AF122913.1 AF122913_ 3579_3657 GCACACGUCAUAAGUCACGUGGUGGGGACCCGCUGUAACCCGGAAGUAGGCCCCGUCACGUGAUUUGUCACGUGUGUA 355 AUAAGUCACGUGGUGGGGACCCG(5') 450 GGCCCCGUCACGUGAUUUGUCAC(3') 545
AF122914.1 AF122914_ 3476_3552 GCCAUUUUAAGUCAGCUCUGGGGAGGCGUGACUUCCAGUUCAAAGGUCAUCCUCACCAUAACUGGCACAAAAUGGC 356 AAGUCAGCUCUGGGGAGGCGUGACUU(5') 451 GUCAUCCUCACCAUAACUGGCACAA (3') 546
AF122915.1 AF122915_ 3475_3551 GCCAUUUUAAGUAGCUGACGUCAAGGAUUGACGUAAAGGUUAAAGGUCAUCCUCGGCGGAAGCUACACAAAAUGGU 357 AGUAGCUGACGUCAAGGAUUGAC(5') 452 CAUCCUCGGCGGAAGCUACACAA(3') 547
AF122915.1 AF122915_ 3579_3657 GCAUACGUCACAAGUCACGUGGAGGGGACACGCUGUAACCCGGAAGUAGGCCCCGUCACGUGACUUACCACGUGUGUA 358 CAAGUCACGUGGAGGGGACACG(5') 453 GGCCCCGUCACGUGACUUACCAC(3') 548
AF122916.1 AF122916_ 3458_3537 GCGCCAUGUUAAGUGGCUGUCGCCGAGGAUUGACGUCACAGUUCAAAGGUCAUCCUCGACGGUAACCGCAAACAUGGCG 359 UGUUAAGUGGCUGUCGCCGAGGAUUGA(5') 454 AUCCUCGACGGUAACCGCAAACAUG (3') 549
AF122916.1 AF122916_ 3565_3641 CAUGCGUCAUAAGUCACAUGACAGGGGUCCACUUAAACACGGAAGUAGGCCCCGACAUGUGACUCGUCACGUGUGU 360 UAAGUCACAUGACAGGGGUCCA(5') 455 GGCCCCGACAUGUGACUCGUC(3') 550
AF122916.1 AF122916_ 91_164 UGGCAGCACUUCCGAAUGGCUGAGUUUUCCACGCCCGUCCGCGGAGAGGGAGCCACGGAGGUGAUCCCGAACG 361 CGGAGAGGGAGCCACGGAGGUG(3') 456 AGCACUUCCGAAUGGCUGAGUUUUCCA(5') 551
AF122917.1 AF122917_ 3369_3447 GCCAUUUUAAGUCAGCGCUGGGGAGGCAUGACUGUAAGUUCAAAGGUCAUCCUCACCGGAACUGACACAAAAUGGCCG 362 AAGUCAGCGCUGGGGAGGCAUGA(5') 457 AUCCUCACCGGAACUGACACAA(3') 552
AF122918.1 AF122918_ 3460_3540 GCCAUCUUAAGUGGCUGUCGCCGAGGAUUGACGUCACAGUUCAAAGGUCAUCCUCGGCGGUAACCGCAAAGAUGGCGGUC 363 UCUUAAGUGGCUGUCGCCGAGGAUUGAC(5') 458 CAUCCUCGGCGGUAACCGCAAAGAUG (3') 553
AF122918.1 AF122918_ 3566_3642 AUACGUCAUAAGUCACAUGUCUAGGGGUCCACUUAAACACGGAAGUAGGCCCCGACAUGUGACUCGUCACGUGUGU 364 AAGUCACAUGUCUAGGGGUCCACU(5') 459 UAGGCCCCGACAUGUGACUCGU(3') 554
AF122919.1 AF122919_3370_3447 CCAUUUUAAGUAAGGCGGAAGCAGCUGUCCCUGUAACAAAAUGGCGGCGACAGCCUUCCGCUUUGCACAAAAUGGAG 365 AAGUAAGGCGGAAGCAGCUGUCC(5') 460 ACAGCCUUCCGCUUUGCACAA(3') 555
AF122920.1 AF122920_ 3460_3540 GCCAUCUUAAGUGGCUGUCGCUGAGGAUUGACGUCACAGUUCAAAGGUCAUCCUCGGCGGUAACCGCAAAGAUGGCGGUC 366 AUCUUAAGUGGCUGUCGCUGAGGAUUGAC(5') 461 CAUCCUCGGCGGUAACCGCAAAGAUGG(3') 556
AF122920.1 AF122920_ 3565_3641 CAUACGUCAUAAGUCACAUGACAGGAGUCCACUUAAACACGGAAGUAGGCCCCGACAUGUGACUCGUCACGUGUGU 367 UAAGUCACAUGACAGGAGUCCACU(5') 462 UAGGCCCCGACAUGUGACUCGUC(3') 557
AF122921.1 AF122921_ 3459_3540 CGCCAUCUUAAGUGGCUGUCGCCGAGGAUUGGCGUCACAGUUCAAAGGUCAUCCUCGGCGGUAACCGCAAAGAUGGCGGU 368 AAGUGGCUGUCGCCGAGGAUUG(5') 463 UCCUCGGCGGUAACCGCAAA(3') 558
AF122921.1 AF122921_ 3565_3641 CAUACGUCAUAAGUCACAUGACAGGGGUCCACUUAAACACGGAAGUAGGCCCCGACAUGUGACUCGUCACGUGUGU 369 UAAGUCACAUGACAGGGGUCCA(5') 464 GGCCCCGACAUGUGACUCGUC(3') 559
AF129887.1 AF129887_ 3579_3657 GCAUACGUCACAAGUCACGUGGGGGGGACCCGCUGUAACCCGGAAGUAGGCCCCGUCACGUGACUUACCACGUGGUGU 370 ACAAGUCACGUGGGGGGGACCCG(5') 465 GGCCCCGUCACGUGACUUACCAC(3') 560
AF247137.1 AF247137_ 3453_3530 CCGCCAUUUUAGGCUGUUGCCGGGCGUUUGACUUCCGUGUUAAAGGUCAAACACCCAGCGACACCAAAAAAUGGCCG 371 AUUUUAGGCUGUUGCCGGGCGUUUGACU(5') 466 UCAAACACCCAGCGACACCAAAAAAUGG(3') 561
AF247137.1 AF247137_ 3559_3636 CUACGUCAUAAGUCACGUGACAGGGAGGGGCGACAAACCCGGAAGUCAUCCUCGCCCACGUGACUUACCACGUGGUG 372 AUAAGUCACGUGACAGGGAGGGG(5') 467 CCUCGCCCACGUGACUUACCAC(3') 562
AF247138.1 AF247138_ 3455_3532 GCCAUUUUAAGUAGGUGACGUCCAGGACUGACGUAAAGUUCAAAGGUCAUCCUCGGCGGAACCUAUACAAAAUGGCG 373 AAGUAGGUGACGUCCAGGACU (5') 468 CCUCGGCGGAACCUAUACAA(3') 563
AF247138.1 AF247138_ 3561_3637 CUACGUCAUAAGUCACGUGGGGACGGCUGUACUUAAACACGGAAGUAGGCCCCGUCACGUGAUUUACCACGUGGUG 374 CAUAAGUCACGUGGGGACGGCUGU(5') 469 GCCCCGUCACGUGAUUUACCAC(3') 564
AF261761.1 AF261761_ 3431_3504 GCCAUUUUAAGUAAGGCGGAAGAGCUCUAGCUAUACAAAAUGGCGGCGGAGCACUUCCGCUUUGCCCAAAAUG 375 UAAGUAAGGCGGAAGAGCUCUAGCUA(5') 470 GCGGCGGAGCACUUCCGCUUUGCCCAAA(3') 565
AF351132.1 AF351132_ 3475_3552 GCCAUUUUAAGUAGCUGACGUCAAGGAUUGACGUAGAGGUUAAAGGUCAUCCUCGGCGGAAGCUACACAAAAUGGUG 376 AGUAGCUGACGUCAAGGAUUGAC(5') 471 CAUCCUCGGCGGAAGCUACACAA(3') 566
AF351132.1 AF351132_ 3579_3657 GCAUACGUCACAAGUCACGUGGGGGGGACCCGCUGUAACCCGGAAGUAGGCCCCGUCACGUGACUUACCACGUGUGUA 377 ACAAGUCACGUGGGGGGGACCCG(5') 472 GGCCCCGUCACGUGACUUACCAC(3') 567
AF435014.1 AF435014_ 3344_3426 GGCGCCAUUUUAAGUAAGCAUGGCGGGCGGCGACGUCACAUGUCAAAGGUCACCGCACUUCCGUGCUUGCACAAAAUGGC 378 UAAGUAAGCAUGGCGGGCGGCGAC(5') 473 CACCGCACUUCCGUGCUUGCACAAA(3') 568
AF435014.1 AF435014_ 3453_3526 UGCUACGUCAUCGAGACACGUGGUGCCAGCAGCUGUAAACCCGGAAGUCGCUGACACACGUGUCUUGUCACGU 379 AUCGAGACACGUGGUGCCAGCAGCU(5') 474 UCGCUGACACACGUGUCUUGUCAC(3') 569
AJ620212.1 AJ620212_ 3360_3438 GCCAUUUUAAGUAAGCACCGCCUAGGGAUGACGUAUAAGUUCAAAGGUCAUCCUCAGCCGGAACUUACACAAAAUGGU 380 UCAUCCUCAGCCGGAACUUACACAAAAUGG(3') 475 CAUUUUAAGUAAGCACCGCCUAGGGAUGAC(5') 570
AJ620212.1 AJ620212_ 3470_3542 ACGUCAUAUGUCACGUGGGGAGGCCCUGCUGCGCAAACGCGGAAGUAGGCCCCGUCACGUGUCAUACCACGU 381 AUAUGUCACGUGGGGAGGCCCUGCUG(5') 476 GUAGGCCCCGUCACGUGUCAUACCAC (3') 571
AJ620218.1 AJ620218_ 3381_3458 CCAUUUUAAGUAAGGCGGAAGCAGCUCCACUUUCUCACAAAAUGGCGGCGGGGCACUUCCGGCUUGCCCAAAAUGGC 382 AAGUAAGGCGGAAGCAGCUCCACUUU(5') 477 GGCGGGGCACUUCCGGCUUGCCCAA(3') 572
AJ620226.1 AJ620226_ 3451_3523 CCAUUUUAAGUAAGGCGGAAGUUUCUCCACUAUACAAAAUGGCGGCGGAGCACUUCCGGCUUGCCCAAAAUG 383 AAGUAAGGCGGAAGUUUCUCCACU(5') 478 CGGCGGAGCACUUCCGGCUUGCCCAA (3') 573
AJ620227.1 AJ620227_ 3379_3451 CCAUCUUAAGUAGUUGAGGCGGACGGUGGCGUGAGUUCAAAGGUCACCAUCAGCCACACCUACUCAAAAUGG 384 UAAGUAGUUGAGGCGGACGGUGGC(5') 479 CACCAUCAGCCACACCUACUCAAA(3') 574
AJ620231.1 AJ620231_ 3429_3505 CGCCAUCUUAAGUAGUUGAGGCGGACGGUGGCGUGAGUUCAAAGGUCACCAUCAGCCACACCUACUCAAAAUGGUG 385 UAAGUAGUUGAGGCGGACGGUGG(5') 480 ACCAUCAGCCACACCUACUCAAA(3') 575
AY666122.1 AY666122_ 3163_3236 UUUCGGACCUUCGGCGUCGGGGGGGUCGGGGGCUUUACUAAACAGACUCCGAGAUGCCAUUGGACACUGAGGG 386 GACCUUCGGCGUCGGGGGGGUCGGGGG(5') 481 GACUCCGAGAUGCCAUUGGACACUGAGG(3') 576
AY666122.1 AY666122_ 3388_3464 CCAUUUUAAGUAGGUGCCGUCCAGCACUGCUGUUCCGGGUUAAAGGGCAUCCUCGGCGGAACCUAUACAAAAUGGC 387 AUCCUCGGCGGAACCUAUA(3') 482 AGUAGGUGCCGUCCAGCA(5') 577
AY666122.1 AY666122_ 3494_3567 CUACGUCAUCGAUGACGUGGGGAGGCGUACUAUGAAACGCGGAAGUAGGCCCCGCUACGUCAUCAUCACGUGG 388 AUCGAUGACGUGGGGAGGCGUACUAU(5') 483 AAGUAGGCCCCGCUACGUCAUCAUCAC(3') 578
AY823988.1 AY823988_ 3452_3525 CCAUUUUAAGUAAGGCGGAAGAGCUGCUCUAUAUACAAAAUGGCGGAGGAGCACUUCCGGCUUGCCCAAAAUG 389 UGGCGGAGGAGCACUUCCGGCUUG(3') 484 AAGGCGGAAGAGCUGCUCUAUAU(5') 579
AY823988.1 AY823988_ 3554_3629 UGCCUACGUAACAAGUCACGUGGGGAGGGUUGGCGUAUAACCCGGAAGUCAAUCCUCCCACGUGGCCUGUCACGU 390 AACAAGUCACGUGGGGAGGGUUGGC(5') 485 CAAUCCUCCCACGUGGCCUGUCAC(3') 580
AY823989.1 AY823989_ 3551_3623 UAAGUAAGGCGGAACCAGGCUGUCACCCCGUGUCAAAGGUCAGGGGUCAGCCUUCCGCUUUACACAAAAUGG 391 AGGGGUCAGCCUUCCGCUUUA (3') 486 AAGGCGGAACCAGGCUGUCACCCCGU (5') 581
AY823989.1 AY823989_ 3551_3623 UAAGUAAGGCGGAACCAGGCUGUCACCCCGUGUCAAAGGUCAGGGGUCAGCCUUCCGCUUUACACAAAAUGG 392 AGGGGUCAGCCUUCCGCUUUA (3') 487 AAGGCGGAACCAGGCUGUCACCCCGU (5') 582
DQ361268.1 DQ361268_ 3413_3494 GCAGCCAUUUUAAGUCAGCUUCGGGGAGGGUCACGCAAAGUUCAAAGGUCAUCCUCACCGGAACUGGUACAAAAUGGCCG 393 UAAGUCAGCUUCGGGGAGGGUCAC(5') 488 CAUCCUCACCGGAACUGGUACAAA(3') 583
DQ361268.1 DQ361268_ 3519_3593 UGCUACGUCAUAAGUGACGUAGCUGGUGUCUGCUGUAAACACGGAAGUAGGCCCCGCCACGUCACUUGUCACGU 394 UCAUAAGUGACGUAGCUGGUGUCUGCU(5') 489 UAGGCCCCGCCACGUCACUUGUCACG (3') 584
siRNA及shRNA類似內源性微小RNA (miRNA)基因之加工路徑中之中間物(Bartel, Cell 116:281-297, 2004)。在一些實施例中，siRNA可充當miRNA且反之亦然(Zeng等人, Mol Cell 9:1327-1333, 2002；Doench等人, Genes Dev 17:438-442, 2003)。微小RNA，如siRNA一般，使用RISC下調目標基因，但不同於siRNA，大部分動物miRNA不使mRNA裂解。實際上，miRNA經由轉譯遏制或多聚A移除及mRNA降解來減少蛋白質輸出(Wu等人, Proc Natl Acad Sci USA 103:4034-4039, 2006)。已知miRNA結合位點在mRNA 3' UTR內；miRNA似乎靶向與來自miRNA 5'端之核苷酸2-8具有接近完美的互補性之位點(Rajewsky, Nat Genet 38 增刊:S8-13, 2006；Lim等人, Nature 433:769-773, 2005)。此區稱為種子區。由於siRNA及miRNA為可互換的，因此外源性siRNA下調與siRNA具有種子互補性之mRNA (Birmingham等人, Nat Methods 3:199-204, 2006。3' UTR內之多個目標位點提供較強下調(Doench等人, Genes Dev 17:438-442, 2003)。
已知miRNA序列之清單可見於諸如以下之研究組織所維護之資料庫中：Wellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center及European Molecule Biology Laboratory。已知的有效siRNA序列及同源結合位點亦充分呈現於相關文獻中。RNAi分子容易藉由此項技術中已知之技術設計及產生。此外，存在增加發現有效及特定序列模體之機率的計算工具(Lagana等人, Methods Mol. Bio., 2015, 1269:393-412)。
調控核酸可調節由基因編碼之RNA的表現。因為多個基因可彼此共有一定程度之序列同源性，所以在一些實施例中，調控核酸可經設計以靶向具有足夠序列同源性之一類基因。在一些實施例中，調控核酸可含有與在不同基因目標中共有或特定基因目標所獨有之序列互補的序列。在一些實施例中，調控核酸可經設計以靶向在若干基因之間具有同源性之RNA序列的保守區，藉此靶向基因家族中之若干基因(例如不同基因同功異型物、剪接變異體、突變基因等)。在一些實施例中，調控核酸可經設計以靶向為單個基因之特定RNA序列所獨有的序列。
在一些實施例中，遺傳元件可包括一或多個編碼調節一或多個基因之表現之調控核酸的序列。
在一個實施例中，本文他處所述之gRNA用作用於基因編輯之CRISPR系統的一部分。出於基因編輯之目的，指環載體可經設計以包括一或多個對應於所需目標DNA序列的嚮導RNA序列；參見例如Cong等人 (2013) Science, 339:819-823；Ran等人 (2013) Nature Protocols, 8:2281 - 2308。gRNA序列之至少約16或17個核苷酸通常允許發生Cas9介導之DNA裂解；對於Cpf1，需要gRNA序列之至少約16個核苷酸來實現可偵測DNA裂解。
治療性效應子 ( 例如 肽或多肽 )在一些實施例中，遺傳元件包含治療性表現序列，例如編碼治療性肽或多肽之序列，例如胞內肽或胞內多肽、分泌型多肽或蛋白質替代療法。在一些實施例中，遺傳元件包括編碼蛋白質(例如治療性蛋白)之序列。治療性蛋白質之一些實例可包括但不限於激素、細胞介素、酶、抗體(例如編碼至少重鏈或輕鏈之一種或複數種多肽)、轉錄因子、受體(例如膜受體)、配位體、膜轉運體、分泌型蛋白質、肽、載體蛋白、結構蛋白、核酸酶或其組分。
在一些實施例中，遺傳元件包括編碼肽(例如治療性肽)之序列。肽可為線性的或分支的。肽之長度為約5至約500個胺基酸、約15至約400個胺基酸、約20至約325個胺基酸、約25至約250個胺基酸、約50至約200個胺基酸或其間的任何範圍。
在一些實施例中，由治療性表現序列編碼之多肽可為以上中之任一者之功能性變異體或其片段，例如與參考其UniProt ID揭示於本文之表中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%之一致性的蛋白質。
在一些實施例中，治療性表現序列可編碼結合以上中之任一者之抗體或抗體片段，例如針對與參考其UniProt ID揭示於本文之表中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%之一致性的蛋白質的抗體。術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其呈現所需抗原結合活性即可。「抗體片段」係指包括至少一個重鏈或輕鏈且結合抗原之分子。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab') 2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
例示性胞內多肽效應子在一些實施例中，效應子包含細胞溶質多肽或細胞溶質肽。在一些實施例中，效應子包含細胞溶質肽，其為DPP-4抑制劑、GLP-1信號傳導之活化劑或嗜中性球彈性蛋白酶之抑制劑。在一些實施例中，效應子提高生長因子或其受體(例如FGF受體，例如FGFR3)之含量或活性。在一些實施例中，效應子包含n-myc相互作用蛋白質活性之抑制劑(例如，n-myc相互作用蛋白質抑制劑)；EGFR活性之抑制劑(例如，EGFR抑制劑)；IDH1及/或IDH2活性之抑制劑(例如，IDH1抑制劑及/或IDH2抑制劑)；LRP5及/或DKK2活性之抑制劑(例如，LRP5及/或DKK2抑制劑)；KRAS活性之抑制劑；HTT活性之活化劑；或DPP-4活性之抑制劑(例如，DPP-4抑制劑)。
在一些實施例中，效應子包含調控性胞內多肽。在一些實施例中，調控性胞內多肽結合對於目標細胞為內源性的一或多個分子(例如蛋白質或核酸)。在一些實施例中，調控性胞內多肽提高對於目標細胞為內源性的一或多個分子(例如蛋白質或核酸)的含量或活性。在一些實施例中，調控性胞內多肽減小對於目標細胞為內源性的一或多個分子(例如蛋白質或核酸)的含量或活性。
例示性分泌型多肽效應子例示性分泌型治療劑描述於本文中，例如下表中。 表 50 . 例示性細胞介素及細胞介素受體
細胞介素 細胞介素受體 Entrez 基因 ID UniProt ID
IL-1α、IL-1β或其雜二聚體 IL-1 1型受體、IL-1 2型受體 3552, 3553 P01583, P01584
IL-1Ra IL-1 1型受體、IL-1 2型受體 3454, 3455 P17181, P48551
IL-2 IL-2R 3558 P60568
IL-3 IL-3受體α + β c (CD131) 3562 P08700
IL-4 IL-4R I型，IL-4R II型 3565 P05112
IL-5 IL-5R 3567 P05113
IL-6 IL-6R (sIL-6R) gp130 3569 P05231
IL-7 IL-7R及sIL-7R 3574 P13232
IL-8 CXCR1及CXCR2 3576 P10145
IL-9 IL-9R 3578 P15248
IL-10 IL-10R1/IL-10R2複合物 3586 P22301
IL-11 IL-11Rα 1 gp130 3589 P20809
IL-12 (例如p35、p40或其雜二聚體) IL-12Rβ1及IL-12Rβ2 3593, 3592 P29459, P29460
IL-13 IL-13R1α1及IL-13R1α2 3596 P35225
IL-14 IL-14R 30685 P40222
IL-15 IL-15R 3600 P40933
IL-16 CD4 3603 Q14005
IL-17A IL-17RA 3605 Q16552
IL-17B IL-17RB 27190 Q9UHF5
IL-17C IL-17RA至IL-17RE 27189 Q9P0M4
e SEF 53342 Q8TAD2
IL-17F IL-17RA, IL-17RC 112744 Q96PD4
IL-18 IL-18受體 3606 Q14116
IL-19 IL-20R1/IL-20R2 29949 Q9UHD0
IL-20 L-20R1/IL-20R2及IL-22R1/ IL-20R2 50604 Q9NYY1
IL-21 IL-21R 59067 Q9HBE4
IL-22 IL-22R 50616 Q9GZX6
IL-23 (例如p19、p40或其雜二聚體) IL-23R 51561 Q9NPF7
IL-24 IL-20R1/IL-20R2及IL-22R1/ IL-20R2 11009 Q13007
IL-25 IL-17RA及IL-17RB 64806 Q9H293
IL-26 IL-10R2鏈及IL-20R1鏈 55801 Q9NPH9
IL-27 (例如p28、EBI3或其雜二聚體) WSX-1及gp130 246778 Q8NEV9
IL-28A、IL-28B及IL29 IL-28R1/IL-10R2 282617, 282618 Q8IZI9, Q8IU54
IL-30 IL6R/gp130 246778 Q8NEV9
IL-31 IL-31RA/OSMRβ 386653 Q6EBC2
IL-32    9235 P24001
IL-33 ST2 90865 O95760
IL-34 群落刺激因子1受體 146433 Q6ZMJ4
IL-35 (例如p35、EBI3或其雜二聚體) IL-12Rβ2/gp130; IL-12Rβ2/IL-12Rβ2; gp130/gp130 10148 Q14213
IL-36 IL-36Ra 27179 Q9UHA7
IL-37 IL-18Rα及IL-18BP 27178 Q9NZH6
IL-38 IL-1R1, IL-36R 84639 Q8WWZ1
IFN-α IFNAR 3454 P17181
IFN-β IFNAR 3454 P17181
IFN-γ IFNGR1/IFNGR2 3459 P15260
TGF-β TβR-I及TβR-II 7046, 7048 P36897, P37173
TNF-α TNFR1, TNFR2 7132, 7133 P19438, P20333
在一些實施例中，本文所述之效應子包含表50之細胞介素或其功能性變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所述之效應子包含與參考其UniProt ID在表50中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能性變異體以比在相同條件下對應野生型細胞介素對相同受體之Kd高或低不超過10%、20%、30%、40%或50%之Kd結合至對應細胞介素受體。在一些實施例中，效應子包含融合蛋白質，其包含第一區(例如表50之細胞介素多肽或其功能性變異體或片段)及第二異源區。在一些實施例中，第一區為表50之第一細胞介素多肽。在一些實施例中，第二區為表50之第二細胞介素多肽，其中第一及第二細胞介素多肽在野生型細胞中彼此形成細胞介素雜二聚體。在一些實施例中，表50之多肽或其功能性變異體包含信號序列，例如對於效應子為內源性的信號序列，或異源性信號序列。在一些實施例中，編碼表50之細胞介素的指環載體或其功能性變異體用於治療本文所述之疾病或病症。
在一些實施例中，本文所述之效應子包含結合表50之細胞介素的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，本文所述之效應子包含結合表50之細胞介素受體的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，抗體分子包含信號序列。
例示性細胞介素及細胞介素受體描述於例如Akdis等人, 「Interleukins (from IL-1 to IL-38), interferons, transforming growth factor β, and TNF-α: Receptors, functions, and roles in diseases」2016年10月 第138卷, 第4期, 第984-1010頁中，其以全文引用之方式併入本文中，包括其中之表I。 表 51 . 例示性多肽激素及受體
激素 受體 Entrez 基因ID UniProt ID
利尿鈉肽，例如心房利尿鈉肽(ANP) NPRA, NPRB, NPRC 4878 P01160
腦尿鈉肽(BNP) NPRA, NPRB 4879 P16860
C型利尿鈉肽(CNP) NPRB 4880 P23582
生長激素(GH) GHR 2690 P10912
人類生長激素(hGH) hGH受體(人類GHR) 2690 P10912
催乳素(PRL) PRLR 5617 P01236
甲狀腺刺激激素(TSH) TSH受體 7253 P16473
促腎上腺皮質激素(ACTH) ACTH受體 5443 P01189
促卵泡激素(FSH) FSHR 2492 P23945
促黃體生成激素(LH) LHR 3973 P22888
抗利尿激素(ADH) 血管加壓素受體，例如V2；AVPR1A；AVPR1B；AVPR3；AVPR2 554 P30518
催產素 OXTR 5020 P01178
降鈣素 降鈣素受體(CT) 796 P01258
副甲狀腺激素(PTH) PTH1R及PTH2R 5741 P01270
胰島素 胰島素受體(IR) 3630 P01308
升糖素 升糖素受體 2641 P01275
在一些實施例中，本文所述之效應子包含表51之激素或其功能性變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所述之效應子包含與參考其UniProt ID在表51中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能性變異體以比在相同條件下對應野生型激素對相同受體之Kd高不超過10%、20%、30%、40%或50%之Kd結合至對應受體。在一些實施例中，表51之多肽或其功能性變異體包含信號序列，例如對於效應子為內源性的信號序列，或異源性信號序列。在一些實施例中，編碼表51之激素或其功能性變異體的指環載體用於治療本文所述之疾病或病症。
在一些實施例中，本文所述之效應子包含結合表51之激素的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，本文所述之效應子包含結合表51之激素受體的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，抗體分子包含信號序列。 表 52 . 例示性生長因子
生長因子 Entrez 基因ID UniProt ID
PDGF家族
PDGF (例如，PDGF-1、PDGF-2或其雜二聚體) PDGF受體，例如PDGFRα、PDGFRβ 5156 P16234
CSF-1 CSF1R 1435 P09603
SCF CD117 3815 P10721
VEGF家族      
VEGF (例如同功異型物VEGF 121、VEGF 165、VEGF 189及VEGF 206) VEGFR-1, VEGFR-2 2321 P17948
VEGF-B VEGFR-1 2321 P17949
VEGF-C VEGFR-2及VEGFR-3 2324 P35916
PlGF VEGFR-1 5281 Q07326
EGF家族      
EGF EGFR 1950 P01133
TGF-α EGFR 7039 P01135
雙調蛋白 EGFR 374 P15514
HB-EGF EGFR 1839 Q99075
β細胞調節素 EGFR, ErbB-4 685 P35070
表皮調節素 EGFR, ErbB-4 2069 O14944
調蛋白 EGFR, ErbB-4 3084 Q02297
FGF家族      
FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9 FGFR1、FGFR2、FGFR3及FGFR4 2246, 2247, 2248, 2249, 2250, 2251, 2252, 2253, 2254 P05230, P09038, P11487, P08620, P12034, P10767, P21781, P55075, P31371
胰島素家族      
胰島素 IR 3630 P01308
IGF-I IGF-I受體，IGF-II受體 3479 P05019
IGF-II IGF-II受體 3481 P01344
HGF家族      
HGF MET受體 3082 P14210
MSP RON 4485 P26927
神經滋養素家族      
NGF LNGFR, trkA 4803 P01138
BDNF trkB 627 P23560
NT-3 trkA, trkB, trkC 4908 P20783
NT-4 trkA, trkB 4909 P34130
NT-5 trkA, trkB 4909 P34130
血管生成素家族      
ANGPT1 HPK-6/TEK 284 Q15389
ANGPT2 HPK-6/TEK 285 O15123
ANGPT3 HPK-6/TEK 9068 O95841
ANGPT4 HPK-6/TEK 51378 Q9Y264
在一些實施例中，本文所述之效應子包含表52之生長因子或其功能性變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所述之效應子包含與參考其UniProt ID在表52中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能性變異體以比在相同條件下對應野生型生長因子對相同受體之Kd高不超過10%、20%、30%、40%或50%之Kd結合至對應受體。在一些實施例中，表52之多肽或其功能性變異體包含信號序列，例如對於效應子為內源性的信號序列，或異源性信號序列。在一些實施例中，編碼表52之生長因子或其功能性變異體的指環載體用於治療本文所述之疾病或病症。
在一些實施例中，本文所述之效應子包含結合表52之生長因子的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，本文所述之效應子包含結合表52之生長因子受體的抗體分子(例如scFv)。在一些實施例中，抗體分子包含信號序列。
例示性生長因子及生長因子受體描述於例如Bafico等人, 「Classification of Growth Factors and Their Receptors」 Holland-Frei Cancer Medicine. 第6版中，其以全文引用之方式併入本文中。 表 53 . 凝結 相關因子
效應子 適應症 Entrez 基因ID UniProt ID
因子I (血纖維蛋白原) 無纖維蛋白原血症 2243, 2266, 2244 P02671, P02679, P02675
因子II 因子II缺乏症 2147 P00734
因子IX B型血友病 2158 P00740
因子V 奧倫氏病(Owren's disease) 2153 P12259
因子VIII A型血友病 2157 P00451
因子X 斯圖亞特因子缺乏症(Stuart-Prower Factor Deficiency) 2159 P00742
因子XI C型血友病 2160 P03951
因子XIII 纖維蛋白穩定因子缺乏症 2162, 2165 P00488, P05160
vWF 馮威里氏病(von Willebrand disease) 7450 P04275
在一些實施例中，本文所述之效應子包含表53之多肽或其功能性變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所述之效應子包含與參考其UniProt ID在表53中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能性變異體催化與對應野生型蛋白質相同的反應，例如以比野生型蛋白質低不少於10%、20%、30%、40%或50%之速率。在一些實施例中，表53之多肽或其功能性變異體包含信號序列，例如對於效應子為內源性的信號序列，或異源性信號序列。在一些實施例中，編碼表53之多肽的指環載體或其功能性變異體用於治療表53之疾病或病症。
例示性蛋白質置換治療劑例示性蛋白質置換治療劑描述於本文中，例如下表中。 表 54 . 例示性酶效應子及對應適應症
效應子 缺乏症 Entrez 基因ID UniProt ID
3-甲基巴豆醯基-CoA羧化酶 3-甲基巴豆醯基-CoA羧化酶缺乏症 56922, 64087 Q96RQ3, Q9HCC0
乙醯基-CoA-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶 黏多糖病MPS III (聖菲利柏氏症候群(Sanfilippo's syndrome)) III-C型 138050 Q68CP4
ADAMTS13 血栓性血小板減少性紫癲 11093 Q76LX8
腺嘌呤磷酸核糖轉移酶 腺嘌呤磷酸核糖轉移酶缺乏症 353 P07741
腺苷去胺酶 腺苷去胺酶缺乏症 100 P00813
ADP-核糖蛋白質水解酶 麩胺醯基核糖-5-磷酸貯積病 26119, 54936 Q5SW96, Q9NX46
α葡糖苷酶 2型肝糖貯積病(龐貝氏病(Pompe's disease)) 2548 P10253
精胺酸酶 家族性高精胺酸血症 383, 384 P05089, P78540
芳基硫酸酯酶A 異染性腦白質營養不良 410 P15289
組織蛋白酶K 密骨發育障礙 1513 P43235
神經醯胺酶 法伯氏病(Farber's disease) (脂肪肉芽腫病) 125981, 340485, 55331 Q8TDN7, Q5QJU3, Q9NUN7
胱硫醚B合成酶 高胱胺酸尿 875 P35520
多萜醇-P-甘露糖合成酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ie 8813, 54344 O60762, Q9P2X0
多萜醇-P-Glc:Man9GlcNAc2-PP-多萜醇葡萄糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ic 84920 Q5BKT4
多萜醇-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-多萜醇甘露糖基轉移酶 先天性N-糖基化障礙CDG Id 10195 Q92685
多萜醇基-P-葡萄糖:Glc-1-Man-9-GlcNAc-2-PP-多萜醇基-α-3-葡萄糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ih 79053 Q9BVK2
多萜醇基-P-甘露糖:Man-7-GlcNAc-2-PP-多萜醇基-α-6-甘露糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ig 79087 Q9BV10
因子II 因子II缺乏症 2147 P00734
因子IX B型血友病 2158 P00740
因子V 奧倫氏病 2153 P12259
因子VIII A型血友病 2157 P00451
因子X 斯圖亞特因子缺乏症 2159 P00742
因子XI C型血友病 2160 P03951
因子XIII 纖維蛋白穩定因子缺乏症 2162, 2165 P00488, P05160
半乳胺糖-6-硫酸酯硫酸酯酶 黏多糖病MPS IV (莫奎歐氏症候群(Morquio's syndrome)) IV-A型 2588 P34059
半乳糖基神經醯胺β-半乳糖苷酶 克拉伯氏病(Krabbe's disease) 2581 P54803
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 全身性GM1神經節苷脂貯積病 2720 P16278
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 GM2神經節苷脂貯積病 2720 P16278
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 I型神經鞘脂貯積症 2720 P16278
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 II型神經鞘脂貯積症(幼年型) 2720 P16278
神經節苷脂β-半乳糖苷酶 III型神經鞘脂貯積症(成人型) 2720 P16278
葡糖苷酶I 先天性N-糖基化障礙CDG IIb 2548 P10253
葡糖神經醯胺β-葡糖苷酶 高歇氏病(Gaucher's disease) 2629 P04062
乙醯肝素-S-硫酸酯硫酸醯胺酶 黏多糖病MPS III (聖菲利柏氏症候群) III-A型 6448 P51688
尿黑酸氧化酶 黑尿症 3081 Q93099
玻尿酸酶 黏多糖病MPS IX (玻尿酸酶缺乏症) 3373, 8692, 8372, 23553 Q12794, Q12891, O43820, Q2M3T9
艾杜糖醛硫酸酯硫酸酯酶 黏多糖病MPS II (亨特氏症候群(Hunter's syndrome)) 3423 P22304
卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶(LCAT) 完全LCAT缺乏症、魚眼病、動脈粥樣硬化、高膽固醇血症 3931 606967
離胺酸氧化酶 戊二酸血症I型 4015 P28300
溶酶體酸性脂肪酶 膽甾醇酯貯積病(CESD) 3988 P38571
溶酶體酸性脂肪酶 溶酶體酸性脂肪酶缺乏症 3988 P38571
溶酶體酸性脂肪酶 沃爾曼氏病(Wolman's disease) 3988 P38571
溶酶體胃酶抑素不敏感性肽酶 幼兒型蠟樣脂褐質沈積症(CLN2、詹-比二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)) 1200 O14773
甘露糖(Man)磷酸酯(P)異構酶 先天性N-糖基化障礙CDG Ib 4351 P34949
甘露糖基-α-1,6-糖蛋白-β-1,2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶 先天性N-糖基化障礙CDG IIa 4247 Q10469
金屬蛋白酶-2 溫徹斯特症候群(Winchester syndrome) 4313 P08253
甲基丙二醯基-CoA變位酶 甲基丙二酸血症(維生素b12無反應型) 4594 P22033
N-乙醯基半乳糖胺α-4-硫酸酯硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶B) 黏多糖病MPS VI (馬洛特-拉米症候群(Maroteaux-Lamy syndrome)) 411 P15848
N-乙醯基-D-胺基葡糖苷酶 黏多糖病MPS III (聖菲利柏氏症候群) III-B型 4669 P54802
N-乙醯基-胺基半乳糖苷酶 I型辛德勒氏病(Schindler's disease) (嬰兒嚴重型) 4668 P17050
N-乙醯基-胺基半乳糖苷酶 II型辛德勒氏病(神琦病(Kanzaki disease)，成年發作型) 4668 P17050
N-乙醯基-胺基半乳糖苷酶 III型辛德勒氏病(中間型) 4668 P17050
N-乙醯基-葡萄糖胺-6-硫酸酯硫酸酯酶 黏多糖病MPS III (聖菲利柏氏症候群) III-D型 2799 P15586
N-乙醯基葡糖胺基-1-磷酸轉移酶 黏脂貯積症ML III (假賀勒氏多種營養不良(pseudo-Hurler's polydystrophy)) 79158 Q3T906
N-乙醯基葡糖胺基-1-磷酸轉移酶催化次單元 黏脂貯積症ML II (I細胞病) 79158 Q3T906
N-乙醯基葡糖胺基-1-磷酸轉移酶，受質識別次單元 黏脂貯積症ML III (假賀勒氏多種營養不良) III-C型 84572 Q9UJJ9
N-天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶 天冬胺醯葡萄糖胺尿症 175 P20933
神經胺糖酸苷酶1 (唾液酸酶) 唾液腺病 4758 Q99519
軟脂醯基-蛋白質硫酯酶-1 成人型蠟樣脂褐質沈積症(CLN4、庫夫斯病 (Kufs' disease)) 5538 P50897
軟脂醯基-蛋白質硫酯酶-1 嬰兒型蠟樣脂褐質沈積症(CLN1、桑塔沃里-哈爾蒂亞病(Santavuori-Haltia disease)) 5538 P50897
苯丙胺酸羥化酶 苯酮尿症 5053 P00439
磷酸甘露糖酶-2 先天性N-糖基化障礙CDG Ia (僅神經及神經-多內臟型) 5373 O15305
膽色素原去胺酶 急性間歇卟啉症 3145 P08397
嘌呤核苷磷酸化酶 嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症 4860 P00491
嘧啶5'核苷酸酶 溶血性貧血及/或嘧啶5'核苷酸酶缺乏症 51251 Q9H0P0
神經磷脂酶 尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease) A型 6609 P17405
神經磷脂酶 尼曼-匹克病B型 6609 P17405
固醇27-羥化酶 腦腱黃瘤病(膽甾醇脂沈積症) 1593 Q02318
胸苷磷酸化酶 粒線體神經胃腸道腦肌病(MNGIE) 1890 P19971
三己糖神經醯胺α-半乳糖苷酶 法布立氏病(Fabry's disease) 2717 P06280
酪胺酸酶，例如OCA1 白化病，例如眼白化病 7299 P14679
UDP-GlcNAc:多萜醇基-P NAcGlc磷酸轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ij 1798 Q9H3H5
UDP-N-乙醯基葡糖胺-2-表異構酶/N-乙醯甘露糖胺激酶，唾液酸轉運蛋白(sialin) 法國型涎尿(Sialuria French type) 10020 Q9Y223
尿酸酶 萊尼症候群(Lesch-Nyhan syndrome)、痛風 391051 No protein
二磷酸尿苷葡萄糖醛酸轉移酶(例如UGT1A1) 克果-納傑氏症候群(Crigler-Najjar syndrome) 54658 P22309
α-1,2-甘露糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Il (608776) 79796 Q9H6U8
α-1,2-甘露糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙，I型(前高基體醣基化缺陷) 79796 Q9H6U8
α-1,3-甘露糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ii 440138 Q2TAA5
α-D-甘露糖苷酶 α-甘露糖苷貯積病I型(重度)或II型(輕度) 10195 Q92685
α-L-岩藻糖苷酶 岩藻糖苷貯積症 4123 Q9NTJ4
α-l-艾杜糖苷 黏多糖病MPS I H/S (賀勒-施艾氏侯症群(Hurler-Scheie syndrome)) 2517 P04066
α-l-艾杜糖苷 黏多糖病MPS I-H (賀勒氏症候群) 3425 P35475
α-l-艾杜糖苷 黏多糖病MPS I-S (施艾氏症候群(Scheie's syndrome)) 3425 P35475
β-1,4-半乳糖苷基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG IId 3425 P35475
β-1,4-甘露糖基轉移酶 先天性N-醣基化障礙CDG Ik 2683 P15291
β-D-甘露糖苷酶 β-甘露糖苷貯積病 56052 Q9BT22
β-半乳糖苷酶 黏多糖病MPS IV (莫奎歐氏症候群) IV-B型 4126 O00462
β-葡萄糖醛酸苷酶 黏多糖病MPS VII (斯利症候群(Sly's syndrome)) 2720 P16278
β-己糖苷酶A 泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease) 2990 P08236
β-己糖苷酶B 桑德霍夫氏病(Sandhoff's disease) 3073 P06865
在一些實施例中，本文所述之效應子包含表54之酶，或其功能性變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所述之效應子包含與參考其UniProt ID在表54中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，功能性變異體催化與對應野生型蛋白質相同的反應，例如以比野生型蛋白質低不少於10%、20%、30%、40%或50%之速率。在一些實施例中，編碼表54之酶的指環載體或其功能性變異體用於治療表54之疾病或病症。在一些實施例中，指環載體用於將葡萄糖醛酸苷轉移酶或其功能性變異體遞送至目標細胞，例如肝細胞。在一些實施例中，指環載體用於將OCA1或其功能性變異體遞送至目標細胞，例如視網膜細胞。 表 55 . 例示性非酶效應子及對應適應症
效應子 適應症 Entrez 基因ID UniProt ID
存活運動神經元蛋白質(SMN) 脊髓性肌萎縮 6606 Q16637
肌縮蛋白或微肌縮蛋白 肌肉萎縮症(例如杜氏肌肉萎縮(Duchenne muscular dystrophy)或貝氏肌肉萎縮(Becker muscular dystrophy)) 1756 P11532
補體蛋白，例如補體因子C1 補體因子I缺乏症 3426 P05156
補體因子H 非典型性溶血性尿毒症症候群 3075 P08603
胱胺酸素(溶酶體胱胺酸轉運體) 胱胺酸症 1497 O60931
附睾分泌蛋白1 (HE1；NPC2蛋白) 尼曼-匹克病C2型 10577 P61916
GDP-岩藻糖轉運體-1 先天性N-糖基化障礙CDG IIc (拉瑪-哈薩隆症候群(Rambam-Hasharon syndrome)) 55343 Q96A29
GM2活化蛋白質 GM2活化蛋白缺乏症(泰-薩克斯病AB變異體，GM2A) 2760 Q17900
溶酶體跨膜CLN3蛋白質 幼年型蠟樣脂褐質沈積症(CLN3、巴氏病(Batten disease)、沃格特-施皮耳麥耶病(Vogt-Spielmeyer disease)) 1207 Q13286
溶酶體跨膜CLN5蛋白 幼兒型蠟樣脂褐質沈積症變異體，芬蘭型(CLN5) 1203 O75503
Na磷酸協同轉運蛋白，唾液酸轉運蛋白 嬰兒唾液酸貯積病 26503 Q9NRA2
Na磷酸協同轉運蛋白，唾液酸轉運蛋白 芬蘭型涎尿(薩拉病(Salla disease)) 26503 Q9NRA2
NPC1蛋白質 尼曼-匹克病C1型/D型 4864 O15118
寡聚高基體複合物-7 先天性N-醣基化障礙CDG IIe 91949 P83436
鞘脂激活蛋白原 鞘脂激活蛋白原缺乏症 5660 P07602
保護蛋白/組織蛋白酶A (PPCA) 半乳糖唾液酸貯積症(戈德堡症候群(Goldberg's syndrome)、神經胺糖酸苷酶與β-半乳糖苷酶組合缺乏症) 5476 P10619
與甘露糖-P-多萜醇利用有關之蛋白質 先天性N-醣基化障礙CDG If 9526 O75352
鞘脂激活蛋白B 鞘脂激活蛋白B缺乏症(硫苷脂活化子缺乏症) 5660 P07602
鞘脂激活蛋白C 鞘脂激活蛋白C缺乏症(高歇氏活化子缺乏症(Gaucher's activator deficiency)) 5660 P07602
硫酸酯酶修飾因子-1 黏硫脂病(多硫酸酯酶缺乏症) 285362 Q8NBK3
跨膜CLN6蛋白質 幼兒型蠟樣脂褐質沈積症變異體(CLN6) 54982 Q9NWW5
跨膜CLN8蛋白質 蠟樣脂褐質沈積症進展性癲癇症伴智力障礙 2055 Q9UBY8
vWF 馮威里氏病(von Willebrand disease) 7450 P04275
因子I (血纖維蛋白原) 無纖維蛋白原血症 2243, 2244, 2266 P02671, P02675, P02679
紅血球生成素(hEPO)         
在一些實施例中，本文所述之效應子包含紅血球生成素(EPO)，例如人類紅血球生成素(hEPO)或其功能性變異體。在一些實施例中，編碼紅血球生成素之指環載體或其功能性變異體用於刺激紅血球生成。在一些實施例中，編碼紅血球生成素或其功能性變異體之指環載體用於治療疾病或病症，例如貧血。在一些實施例中，指環載體用於將EPO或其功能性變異體遞送至目標細胞，例如紅血球。
在一些實施例中，本文所述之效應子包含表55之多肽或其功能性變異體，例如同源物(例如直系同源物或旁系同源物)或其片段。在一些實施例中，本文所述之效應子包含與參考其UniProt ID在表55中所列之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，編碼表55之多肽或其功能性變異體的指環載體用於治療表55之疾病或病症。在一些實施例中，指環載體用於將SMN或其功能性變異體遞送至目標細胞，例如脊髓及/或運動神經元之細胞。在一些實施例中，指環載體用於將微肌縮蛋白遞送至目標細胞，例如肌細胞。
例示性微肌縮蛋白描述於Duan, 「Systemic AAV Micro-dystrophin Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.」 Mol Ther. 2018年10月3日;26(10):2337-2356. doi: 10.1016/j.ymthe.2018.07.011. 電子版2018年7月17日中。
在一些實施例中，本文所述之效應子包含凝血因子，例如本文之表54或表55中所列之凝血因子。在一些實施例中，本文所述之效應子包含當突變時引起溶酶體貯積病之蛋白質，例如本文之表54或表55中所列之蛋白質。在一些實施例中，本文所述之效應子包含轉運蛋白，例如本文之表55中所列之轉運蛋白。
在一些實施例中，野生型蛋白質之功能性變異體包含具有野生型蛋白質之一或多種活性的蛋白質，例如功能性變異體催化與對應野生型蛋白質相同的反應，例如以比野生型蛋白質低不少於10%、20%、30%、40%或50%之速率。在一些實施例中，功能性變異體以例如比在相同條件下對應野生型蛋白質對相同結合搭配物之Kd高不超過10%、20%、30%、40%或50%之Kd結合至由野生型蛋白質結合之相同結合搭配物。在一些實施例中，功能性變異體之多肽序列與野生型多肽至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，功能性變異體包含對應野生型蛋白質之同源物(例如，直系同源物或旁系同源物)。在一些實施例中，功能性變異體為融合蛋白。在一些實施例中，融合包含與對應野生型蛋白質具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之一致性的第一區及第二異源區。在一些實施例中，功能性變異體包含對應野生型蛋白質之片段或由其組成。
再生、修復及纖維化因子本文所述之治療性多肽包括例如如表56中所揭示之生長因子，或其功能性變異體，例如與藉由參考UniProt ID而揭示於表56中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%一致性的蛋白質。亦包括針對此類生長因子之抗體或其片段，或促進再生及修復之miRNA。 表 56 . 例示性再生、修復及纖維化因子
目標 基因寄存編號 蛋白質寄存編號
VEGF-A NG_008732    NP_001165094   
NRG-1 NG_012005    NP_001153471   
FGF2 NG_029067    NP_001348594   
FGF1 基因ID：2246    NP_001341882
miR-199-3p MIMAT0000232      
miR-590-3p MIMAT0004801   
mi-17-92 MI0000071    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2732113/figure/F1/
miR-222 MI0000299      
miR-302-367 MIR302A及MIR367 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4400607/
轉型因子本文所述之治療性多肽亦包括轉型因子，例如將纖維母細胞轉型成分化細胞之蛋白質因子，例如如表57中所揭示之因子，或其功能性變異體，例如與藉由參考UniProt ID而揭示於表57中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%一致性的蛋白質。 表 57 . 例示性轉型因子
目標 適應症 基因寄存編號 蛋白質寄存編號
MESP1 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：55897    EAX02066   
ETS2 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：2114    NP_005230   
HAND2 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：9464    NP_068808   
MYOCARDIN 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：93649 NP_001139784   
ESRRA 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：2101    AAH92470
miR-1 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 MI0000651 n/a
miR-133 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 MI0000450 n/a
TGFb 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：7040    NP_000651.3   
WNT 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：7471    NP_005421   
JAK 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：3716    NP_001308784   
NOTCH 藉由纖維母細胞轉型之器官修復 基因ID：4851    XP_011517019   
刺激細胞再生之蛋白質本文所述之治療性多肽亦包括刺激細胞再生之蛋白質，例如如表58中所揭示之蛋白質，或其功能性變異體，例如與藉由參考UniProt ID而揭示於表58中之蛋白質序列具有至少80%、85%、90%、95%、967%、98%、99%一致性的蛋白質。 表 58 . 刺激細胞再生之例示性蛋白質
目標 基因寄存編號 蛋白質寄存編號
MST1 NG_016454 NP_066278
STK30 基因ID：26448 NP_036103
MST2 基因ID：6788 NP_006272
SAV1 基因ID：60485 NP_068590
LATS1 基因ID：9113 NP_004681
LATS2 基因ID：26524 NP_055387
YAP1 NG_029530 NP_001123617
CDKN2b NG_023297 NP_004927
CDKN2a NG_007485 NP_478102
STING 調節物效應子在一些實施例中，本文所述之分泌效應子調節STING/cGAS信號傳導。在一些實施例中，STING調節物為多肽，例如病毒多肽或其功能性變異體。舉例而言，效應子可包含描述於Maringer等人. 「Message in a bottle: lessons learned from antagonism of STING signalling during RNA virus infection」 Cytokine & Growth Factor Reviews 第25卷, 第6期, 2014年12月, 第669-679頁中之STING調節物(例如抑制劑)，該等內容以全文引用的方式併入本文中。額外STING調節物(例如活化劑)描述於例如Wang等人. 「STING activator c-di-GMP enhances the anti-tumor effects of peptide vaccines in melanoma-bearing mice.」 Cancer Immunol Immunother. 2015年8月;64(8):1057-66. doi: 10.1007/s00262-015-1713-5. Epub 2015年5月19日; Bose 「cGAS/STING Pathway in Cancer: Jekyll and Hyde Story of Cancer Immune Response」 Int J Mol Sci. 2017年11月; 18(11): 2456；及Fu等人. 「STING agonist formulated cancer vaccines can cure established tumors resistant to PD-1 blockade」 Sci Transl Med. 2015年4月15日; 7(283): 283ra52中，其各自以全文引用的方式併入本文中。
肽之一些實例包括但不限於螢光標籤或標記物、抗原、治療性肽、來自天然生物活性肽之合成或模擬肽、促效性或拮抗性肽、抗微生物肽、靶向或細胞毒性肽、降解或自毀肽及降解或自毀肽。本文所述之適用於本發明之肽亦包括抗原結合肽，例如抗原結合抗體或抗體樣片段，諸如單鏈抗體、奈米抗體(參見例如Steeland等人. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113)。此類抗原結合肽可結合細胞溶質抗原、細胞核抗原或細胞器內抗原。
在一些實施例中，遺傳元件包含編碼小肽、肽模擬物(例如，類肽)、胺基酸及胺基酸類似物之序列。此類治療劑通常具有每莫耳低於約5,000公克之分子量、每莫耳低於約2,000公克之分子量、每莫耳低於約1,000公克之分子量、每莫耳低於約500公克之分子量及此類化合物之鹽、酯及其他醫藥學上可接受之形式。此類治療劑可包括但不限於神經傳遞素、激素、藥物、毒素、病毒或微生物粒子、合成分子及其促效劑或拮抗劑。
在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體包括連接至能夠靶向特定位置、組織或細胞之配位體的多肽。
基因編輯組分指環載體之遺傳元件可包括編碼基因編輯系統之組分的一或多個基因。例示性基因編輯系統包括成簇規律間隔短回文重複序列(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR)系統、鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFN)及基於類轉錄活化因子效應子之核酸酶(Transcription Activator-Like Effector-based Nucleases，TALEN)。基於ZFN、TALEN及CRISPR之方法描述於例如Gaj等人. Trends Biotechnol. 31.7(2013):397-405中；基因編輯之CRISPR方法描述於例如Guan等人, Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: Pre-clinical progress in animal model. DNA Repair 2016年10月;46:1-8. doi: 10.1016/j.dnarep.2016.07.004; Zheng等人, Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. BioTechniques, 第57卷, 第3號, 2014年9月, 第115-124頁中。
CRISPR系統為最初在細菌及古菌中發現的適應性防禦系統。CRISPR系統使用稱為CRISPR相關性或「Cas」核酸內切酶(例如，Cas9或Cpf1)之RNA引導之核酸酶以分解外來DNA。在典型CRISPR/Cas系統中，核酸內切酶係藉由靶向單股或雙股DNA序列之序列特定性非編碼「嚮導RNA」指向目標核苷酸序列(例如，待進行序列編輯之基因體中的位點)。已鑑別出三類(I-III) CRISPR系統。II類CRISPR系統使用單一Cas核酸內切酶(而非多個Cas蛋白質)。一個II類CRISPR系統包括II型Cas核酸內切酶，諸如Cas9、CRISPR RNA (「crRNA」)及反式活化crRNA (「tracrRNA」)。crRNA含有「嚮導RNA」，通常約20個核苷酸RNA序列對應於目標DNA序列。crRNA亦含有結合至tracrRNA以形成由RNase III裂解之部分雙股結構之區，產生crRNA/tracrRNA混成物。crRNA/tracrRNA混成物隨後引導Cas9核酸內切酶識別及分解目標DNA序列。目標DNA序列通常必須鄰近於對指定Cas核酸內切酶具有特異性之「原間隔序列相鄰模體」(「PAM」)；然而，PAM序列出現在整個給定基因體中。
在一些實施例中，指環載體包括CRISPR核酸內切酶之基因。舉例而言，自多種原核物種鑑別之一些CRISPR核酸內切酶具有不同PAM序列要求；PAM序列之實例包括5'-NGG (化膿性鏈球菌)、5'-NNAGAA (嗜熱鏈球菌CRISPR1)、5'-NGGNG (嗜熱鏈球菌CRISPR3)及5'-NNNGATT (腦膜炎雙球菌)。一些核酸內切酶，例如Cas9核酸內切酶係與G富集PAM位點，例如5'-NGG相關，且在PAM位點上游(5')之位置3核苷酸處進行目標DNA之平端裂解。另一II類CRISPR系統包括V型核酸內切酶Cpf1，其小於Cas9；實例包括AsCpf1 (來自胺基酸球菌屬物種)及LbCpf1 (來自毛螺菌科物種)。Cpf1核酸內切酶與T富集PAM位點，例如5'-TTN相關。Cpf1亦可識別5'-CTA PAM模體。Cpf1如下地裂解目標DNA：藉由引入具有4-或5-核苷酸5'突出物之偏移或交錯雙股斷裂，例如使用位於編碼股上之PAM位點下游(3') 18個核苷酸及互補股上之PAM位點下游23個核苷酸的5-核苷酸偏移或交錯切口裂解目標DNA；由此類偏移裂解產生之5-核苷酸突出物使得藉由同源重組之DNA插入與藉由插入平端裂解的DNA相比更精確的基因體編輯。參見例如Zetsche等人 (2015) Cell, 163:759 - 771。
多種CRISPR相關(Cas)基因可包括於指環載體中。基因之特定實例為編碼來自包括Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cpf1、C2C1或C2C3之II類系統之Cas蛋白的彼等基因。在一些實施例中，指環載體包括編碼Cas蛋白，例如Cas9蛋白之基因，可來自多種原核物種中之任一者。在一些實施例中，指環載體包括編碼Cas蛋白，例如Cas9蛋白之基因，經選擇以識別特定前間隔子相鄰模體(PAM)序列。在一些實施例中，指環載體包括編碼兩個或更多個不同Cas蛋白或兩個或更多個Cas蛋白之核酸，可引入至細胞、受精卵、胚胎或動物中，例如以允許識別及修飾包含相同、類似或不同PAM模體之位點。在一些實施例中，指環載體包括編碼具有去活化核酸酶之經修飾Cas蛋白，例如核酸酶缺陷型Cas9的基因。
儘管野生型Cas9蛋白質在由gRNA靶向之特定DNA序列處產生雙股斷裂(DSB)，但已知具有經修飾功能之多種CRISPR核酸內切酶，例如：Cas核酸內切酶之「切口酶」型式(例如Cas9)僅產生單股斷裂；無催化活性Cas核酸內切酶，例如Cas9 (「dCas9」)不切割目標DNA。編碼dCas9之基因可與編碼效應子域之基因稠合以抑制(CRISPRi)或活化(CRISPRa)目標基因之表現。舉例而言，基因可使用轉錄靜止子(例如，KRAB域)或轉錄活化因子(例如，dCas9-VP64融合)編碼Cas9融合。可包括編碼融合至FokI核酸酶之無催化活性Cas9 (dCas9)之基因(「dCas9-FokI」)，以在與兩個gRNA同源之目標序列處產生DSB。參見例如揭示於Addgene repository (Addgene, 75 Sidney St., Suite 550A, Cambridge, MA 02139; addgene.org/crispr/)且公開可購自其中之許多CRISPR/Cas9質體。引入兩個單獨雙股斷裂(各自藉由單獨嚮導RNA引導)之「雙切口酶」Cas9由Ran等人 (2013) Cell, 154:1380 - 1389描述為實現更精確的基因體編輯。
用於編輯真核生物之基因的CRISPR技術揭示於美國專利申請公開案2016/0138008A1及US2015/0344912A1中，及美國專利8,697,359、8,771,945、8,945,839、8,999,641、8,993,233、8,895,308、8,865,406、8,889,418、8,871,445、8,889,356、8,932,814、8,795,965及8,906,616中。Cpf1核酸內切酶及對應嚮導RNA及PAM位點揭示於美國專利申請公開案2016/0208243 A1中。
在一些實施例中，指環載體包含編碼本文所述之多肽，例如經靶向核酸酶，例如Cas9，例如野生型Cas9、切口酶Cas9 (例如，Cas9 D10A)、死亡Cas9 (dCas9)、eSpCas9、Cpf1、C2C1或C2C3及gRNA的基因。編碼核酸酶及gRNA之基因的選擇係藉由所靶向突變是否為核苷酸之缺失、取代或添加，例如將核苷酸缺失、取代或添加至所靶向序列來確定。編碼無催化活性核酸內切酶之基因，例如與(一或多個)效應子域(例如VP64)之全部或一部分(例如，生物活性部分)繫留之死亡Cas9 (dCas9，例如D10A；H840A)產生可調節一或多個目標核酸序列之活性及/或表現的嵌合蛋白質。
在一些實施例中，指環載體包括編碼dCas9與一或多個效應子域(例如，全長野生型效應子域或其片段或變異體，例如其生物活性部分)之全部或一部分之融合物的基因以產生適用於本文所述之方法的嵌合蛋白。因此，在一些實施例中，指環載體包括編碼dCas9甲基化酶融合物之基因。在其他一些實施例中，指環載體包括編碼與位點特異性gRNA之dCas9-酶融合物的基因以靶向內源性基因。
在其他態樣中，指環載體包括編碼與dCas9融合之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個效應子域(全部或生物活性部分)的基因。
調控序列  在一些實施例中，遺傳元件包含可操作地連接於編碼效應子之序列的調控序列，例如啟動子或強化子。
在一些實施例中，啟動子包括與編碼表現產物之DNA序列相鄰定位的DNA序列。啟動子可以操作方式連接於相鄰DNA序列。相比於不存在啟動子時表現產物之量，啟動子通常增加自DNA序列表現之產物的量。來自一個生物體之啟動子可用於增強來自來源於另一生物體之DNA序列的產物表現。舉例而言，脊椎動物啟動子可用於在脊椎動物中表現水母GFP。因此，一個啟動子元件可增強一或多種產物之表現。多個啟動子元件為一般熟習此項技術者熟知的。
在一個實施例中，需要高含量組成性表現。此類啟動子之實例包括但不限於反轉錄病毒勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)長末端重複序列(LTR)啟動子/強化子、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期啟動子/強化子(參見例如Boshart等人, Cell, 41:521-530 (1985))、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、細胞質.β.-肌動蛋白啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。
在另一實施例中，可能需要誘導性啟動子。誘導性啟動子為由外源提供之化合物調控之彼等啟動子，例如以順式或反式提供，包括但不限於鋅誘導性綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子；地塞米松(Dex)誘導性小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子；T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088)；四環素抑制性系統(Gossen等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992))；四環素誘導性系統(Gossen等人, Science, 268:1766-1769 (1995)；亦參見Harvey等人, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998))；RU486誘導性系統(Wang等人, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)及Wang等人, Gene Ther., 4:432-441 (1997)]；及雷帕黴素誘導性系統(Magari等人, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)；Rivera等人, Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996))。在此情形下可適用之其他類型之誘導性啟動子為藉由特定生理狀態，例如溫度、急性期或僅在複製細胞中調節之啟動子。
在一些實施例中，使用所關注之基因或核酸序列之天然啟動子。當期望基因或核酸序列之表現應模擬天然表現時，可使用天然啟動子。當基因或其他核酸序列之表現必須在時間上或發育上，或以組織特異性方式，或回應於特定轉錄刺激進行調節時，可使用天然啟動子。在另一實施例中，其他天然表現控制元件，諸如強化子元件、聚腺苷酸化位點或Kozak共有序列，亦可用於模擬天然表現。
在一些實施例中，遺傳元件包含可操作地連接至組織特異性啟動子的基因。舉例而言，若期望骨胳肌肉中之表現，則可使用在肌肉中有活性之啟動子。此等啟動子包括來自編碼骨骼α-肌動蛋白、肌凝蛋白輕鏈2A、肌縮蛋白、肌肉肌酸激酶之基因的啟動子，以及具有高於天然存在之啟動子之活性的合成肌肉啟動子。參見Li等人, Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)。組織特異性啟動子之實例為吾人所知：肝白蛋白，Miyatake等人 J. Virol., 71:5124-32 (1997)；B型肝炎病毒核心啟動子，Sandig等人, Gene Ther. 3:1002-9 (1996)；α-胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人, Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)]；骨(骨鈣化素，Stein等人, Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)；骨唾液蛋白，Chen等人, J. Bone Miner. Res. 11:654-64 (1996))；淋巴球(CD2，Hansal等人, J. Immunol., 161:1063-8 (1998)；免疫球蛋白重鏈；T細胞受體a鏈)；神經元(神經元特異性烯醇化酶(NSE)啟動子，Andersen等人 Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)；神經絲輕鏈基因，Piccioli等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)；神經元特異性vgf基因，Piccioli等人, Neuron, 15:373-84 (1995)]；以及其他。
遺傳元件可包括強化子，例如與編碼基因之DNA序列相鄰定位的DNA序列。強化子元件通常位於啟動子元件上游或可位於編碼DNA序列(例如，轉錄或轉譯成一或多種產物之DNA序列)下游或其內。因此，強化子元件可位於編碼產物之DNA序列上游或下游100個鹼基對、200個鹼基對或300個或更多個鹼基對處。強化子元件可將自DNA序列表現之重組產物之量增加至高於由啟動子元件提供之增加的表現。多個強化子元件可易於供一般熟習此項技術者使用。
在一些實施例中，遺傳元件包含一或多個側接編碼本文所述之表現產物之序列的反向末端重複序列(ITR)。在一些實施例中，遺傳元件包含一或多個側接編碼本文所述之表現產物之序列的長末端重複序列(LTR)。可使用之啟動子序列之實例包括但不限於猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)即刻早期啟動子及勞氏肉瘤病毒啟動子。
複製蛋白質  在一些實施例中，指環載體，例如合成指環載體之遺傳元件可包括編碼一或多個複製蛋白質之序列。在一些實施例中，指環載體可藉由滾環複製方法複製，例如前導股及滯後股之合成為非偶聯的。在此類實施例中，指環載體包含三個元件額外元件：i)編碼起始蛋白之基因，ii)雙股起點，及iii)單股起點。包含複製蛋白之滾環複製(RCR)蛋白複合物結合至前導股且使複製起點不穩定。RCR複合物裂解基因體以產生游離3'OH末端。細胞DNA聚合酶自游離3'OH末端起始病毒DNA複製。在基因體已複製後，RCR複合物共價閉合環。此引起正環狀單股親本DNA分子及由負親本股及新合成之正股構成之環狀雙股DNA分子的釋放。單股DNA分子可經衣殼化或參與第二輪複製。參見例如Virology Journal 2009, 6:60 doi:10.1186/1743-422X-6-60。
遺傳元件可包含編碼聚合酶，例如RNA聚合酶或DNA聚合酶之序列。
其他序列  在一些實施例中，遺傳元件進一步包括編碼產物(例如核糖核酸酶、編碼蛋白質之治療性mRNA、外源性基因)之核酸。
在一些實施例中，遺傳元件包括一或多個影響以下之序列：物種及/或組織及/或細胞向性(例如衣殼蛋白序列)、感染性(例如衣殼蛋白序列)、免疫抑制/活化(例如調控核酸)、病毒基因體結合及/或封裝、免疫逃避(非免疫原性及/或耐受性)、藥物動力學、內吞作用及/或細胞附著、核進入、胞內調節及定位、胞外分泌調節、繁殖及宿主或宿主細胞中指環載體之核酸保護。
在一些實施例中，遺傳元件可包含包括DNA、RNA或人工核酸之其他序列。其他序列可包括但不限於基因體DNA、cDNA或編碼tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子之序列。在一個實施例中，遺傳元件包括編碼siRNA以靶向與調控核酸相同之基因表現產物之不同基因座的序列。在一個實施例中，遺傳元件包括編碼siRNA以靶向與調控核酸不同之基因表現產物的序列。
在一些實施例中，遺傳元件進一步包含以下序列中之一或多者：編碼一或多個miRNA之序列、編碼一或多個複製蛋白之序列、編碼外源性基因之序列、編碼治療劑之序列、調控序列(例如啟動子、強化子)、編碼一或多個靶向內源性基因(siRNA、lncRNA、shRNA)之調控序列的序列以及編碼治療性mRNA或蛋白質之序列。
其他序列之長度可為約2至約5000 nt、約10至約100 nt、約50至約150 nt、約100至約200 nt、約150至約250 nt、約200至約300 nt、約250至約350 nt、約300至約500 nt、約10至約1000 nt、約50至約1000 nt、約100至約1000 nt、約1000至約2000 nt、約2000至約3000 nt、約3000至約4000 nt、約4000至約5000 nt，或其間任何範圍。
經編碼之基因舉例而言，遺傳元件可包括與傳訊生化途徑相關之基因，例如傳訊生化途徑相關基因或聚核苷酸。實例包括疾病相關基因或聚核苷酸。「疾病相關」基因或聚核苷酸係指相比於非疾病對照之組織或細胞，在衍生自受疾病影響之組織的細胞中以異常含量或以異常形式產生轉錄或轉譯產物的任何基因或聚核苷酸。其可為以異常高含量表現之基因；其可為以異常低含量表現之基因，其中改變之表現與疾病之出現及/或進展相關。疾病相關基因亦指具有直接負責或與負責疾病病因之基因處於連鎖不平衡之突變或遺傳變異的基因。
疾病相關基因及聚核苷酸之實例係購自McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.)及National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.)。疾病相關基因及聚核苷酸之實例列於美國專利第8,697,359號之表A及B中，該專利以全文引用之方式併入本文中。疾病特定資訊可獲自McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.)及National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.)。信號傳導生化途徑相關基因及聚核苷酸之實例列於美國專利第8,697,359號之表A-C中，該專利以全文引用之方式併入本文中。
此外，遺傳元件可編碼靶向部分，如本文其他處所述。此可例如藉由插入編碼糖、醣脂或蛋白質，諸如抗體之聚核苷酸來實現。熟習此項技術者已知用於產生靶向部分之額外方法。
病毒序列在一些實施例中，遺傳元件包含至少一個病毒序列。在一些實施例中，序列與一或多個來自單股DNA病毒，例如指環病毒(Anellovirus)、雙DNA病毒(Bidnavirus)、環狀病毒(Circovirus)、雙生病毒(Geminivirus)、基因體病毒(Genomovirus)、絲狀病毒(Inovirus)、微小病毒(Microvirus)、矮化病毒(Nanovirus)、小病毒(Parvovirus)及螺旋病毒(Spiravirus)的序列具有同源性或一致性。在一些實施例中，序列與一或多個來自雙股DNA病毒，例如腺病毒(Adenovirus)、壺腹病毒(Ampullavirus)、囊泡病毒(Ascovirus)、非洲豬瘟病毒(Asfarvirus)、桿狀病毒(Baculovirus)、微小紡錘形噬菌體屬(Fusellovirus)、球狀病毒(Globulovirus)、滴狀病毒(Guttavirus)、肥大唾腺炎病毒(Hytrosavirus)、疱疹病毒(Herpesvirus)、虹彩病毒(Iridovirus)、脂毛病毒(Lipothrixvirus)、線極病毒(Nimavirus)及痘病毒(Poxvirus)的序列具有同源性或一致性。在一些實施例中，序列與一或多個來自RNA病毒，例如α病毒(Alphavirus)、真菌傳棒狀病毒(Furovirus)、肝炎病毒(Hepatitis virus)、大麥病毒(Hordeivirus)、菸草花葉病毒(Tobamovirus)、菸草脆裂病毒(Tobravirus)、三角病毒(Tricornavirus)、風疹病毒(Rubivirus)、雙RNA病毒(Birnavirus)、囊狀病毒(Cystovirus)、分病毒(Partitivirus)及里奧病毒(Reovirus)的序列具有同源性或一致性。
在一些實施例中，遺傳元件可以包含一或多個來自非致病性病毒，例如共生性病毒，例如共生病毒，例如天然病毒，例如指環病毒之序列。命名法之近期變化將能夠感染人類細胞之三種指環病毒分類為病毒之指環病毒科的α細環病毒(TT)、β細環病毒(TTM)及γ細環病毒(TTMD)屬。迄今，指環病毒尚未與任何人類疾病相關聯。在一些實施例中，遺傳元件可包含與細環病毒(Torque Teno Virus，TT)，一種具有環狀、反義基因體之無包膜、單股DNA病毒具有同源性或一致性的序列。在一些實施例中，遺傳元件可包含與SEN病毒、哨兵病毒(Sentinel virus)、TTV樣微型病毒及TT病毒具有同源性或一致性之序列。已描述不同類型之TT病毒，包括TT病毒基因型6、TT病毒組、TTV樣病毒DXL1及TTV樣病毒DXL2。在一些實施例中，遺傳元件可包含與以下具有同源性或一致性之序列：較小病毒細環樣微型病毒(TTM)，或基因體尺寸在TTV與TTMV之間的第三病毒，稱為細環樣中型病毒(TTMD)。在一些實施例中，遺傳元件可包含一或多個來自非致病性病毒之序列或序列片段，其與本文所述之核苷酸序列中之任一者具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性。
在一些實施例中，遺傳元件可包含一或多個來自實質上非致病性病毒之序列或序列片段，其與本文，例如表41所述之核苷酸序列中之任一者具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性。 表 41 ： 指環病毒及其序列之實例 .如參考2018年12月11日，可在www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/寄存編號及相關序列資訊獲得。
寄存編號 描述
AB017613.1 細環病毒16 DNA，完全基因體，分離株：TUS01
AB026345.1 ORF1及ORF2之TT病毒基因，完全cd，分離株：TRM1
AB026346.1 ORF1及ORF2之TT病毒基因，完全cd，分離株：TK16
AB026347.1 ORF1及ORF2之TT病毒基因，完全cd，分離株：TP1-3
AB028669.1 ORF1及ORF2之TT病毒基因，完全基因體，分離株：TJN02
AB030487.1 pORF2a、pORF2b、pORF1之TT病毒基因，完全cd，純系：JaCHCTC19
AB030488.1 pORF2a、pORF2b、pORF1之TT病毒基因，完全cd，純系：JaBD89
AB030489.1 pORF2a、pORF2b、pORF1，完全cd，純系：JaBD98
AB038340.1 ORF2s、ORF1、ORF3之TT病毒基因，完全cd
AB038622.1 ORF2、ORF1、ORF3之TT病毒基因，完全cd，分離株：TTVyon-LC011
AB038623.1 ORF2、ORF1、ORF3之TT病毒基因，完全cd，分離株：TTVyon-KC186
AB038624.1 ORF2、ORF1、ORF3之TT病毒基因，完全cd，分離株：TTVyon-KC197
AB041821.1 VP1之TT病毒mRNA，完全cd
AB050448.1 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4之細環病毒基因，完全cd，分離株：TYM9
AB060592.1 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4之細環病毒基因，純系：SAa-39
AB060593.1 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4之細環病毒基因，完全cd，純系：SAa-38
AB060595.1 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4之TT病毒基因，完全cd，純系：SAj-30
AB060596.1 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4之TT病毒基因，完全cd，純系：SAf-09
AB064596.1 細環病毒DNA，完全基因體，分離株：CT25F
AB064597.1 細環病毒DNA，完全基因體，分離株：CT30F
AB064599.1 細環病毒DNA，完全基因體，分離株：JT03F
AB064600.1 細環病毒DNA，完全基因體，分離株：JT05F
AB064601.1 細環病毒DNA，完全基因體，分離株：JT14F
AB064602.1 細環病毒DNA，完全基因體，分離株：JT19F
AB064603.1 細環病毒DNA，完全基因體，分離株：JT41F
AB064604.1 細環病毒DNA，完全基因體，分離株：CT39F
AB064606.1 細環病毒DNA，完全基因體，分離株：JT33F
AB290918.1 細環中型病毒1 DNA，完全基因體，分離株：MD1-073
AF079173.1 TT病毒株TTVCHN1，完全基因體
AF116842.1 TT病毒株BDH1，完全基因體
AF122914.3 TT病毒分離株JA20，完全基因體
AF122917.1 TT病毒分離株JA4，完全基因體
AF122919.1 TT病毒分離株JA10未知基因
AF129887.1 TT病毒TTVCHN2，完全基因體
AF247137.1 TT病毒分離株TUPB，完全基因體
AF254410.1 TT病毒ORF2蛋白及ORF1蛋白基因，完全cd
AF298585.1 TT病毒拋光分離株P/1C1，完全基因體
AF315076.1 TTV樣病毒DXL1未知基因
AF315077.1 TTV樣病毒DXL2未知基因
AF345521.1 TT病毒分離株TCHN-G1 Orf2及Orf1基因，完全cd
AF345522.1 TT病毒分離株TCHN-E Orf2及Orf1基因，完全cd
AF345525.1 TT病毒分離株TCHN-D2 Orf2及Orf1基因，完全cd
AF345527.1 TT病毒分離株TCHN-C2 Orf2及Orf1基因，完全cd
AF345528.1 TT病毒分離株TCHN-F Orf2及Orf1基因，完全cd
AF345529.1 TT病毒分離株TCHN-G2 Orf2及Orf1基因，完全cd
AF371370.1 TT病毒ORF1、ORF3及ORF2基因，完全cd
AJ620212.1 細環病毒，分離株tth6，完全基因體
AJ620213.1 細環病毒，分離株tth10，完全基因體
AJ620214.1 細環病毒，分離株tth11g2，完全基因體
AJ620215.1 細環病毒，分離株tth18，完全基因體
AJ620216.1 細環病毒，分離株tth20，完全基因體
AJ620217.1 細環病毒，分離株tth21，完全基因體
AJ620218.1 細環病毒，分離株tth3，完全基因體
AJ620219.1 細環病毒，分離株tth9，完全基因體
AJ620220.1 細環病毒，分離株tth16，完全基因體
AJ620221.1 細環病毒，分離株tth17，完全基因體
AJ620222.1 細環病毒，分離株tth25，完全基因體
AJ620223.1 細環病毒，分離株tth26，完全基因體
AJ620224.1 細環病毒，分離株tth27，完全基因體
AJ620225.1 細環病毒，分離株tth31，完全基因體
AJ620226.1 細環病毒，分離株tth4，完全基因體
AJ620227.1 細環病毒，分離株tth5，完全基因體
AJ620228.1 細環病毒，分離株tth14，完全基因體
AJ620229.1 細環病毒，分離株tth29，完全基因體
AJ620230.1 細環病毒，分離株tth7，完全基因體
AJ620231.1 細環病毒，分離株tth8，完全基因體
AJ620232.1 細環病毒，分離株tth13，完全基因體
AJ620233.1 細環病毒，分離株tth19，完全基因體
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AY026466.1 TT病毒分離株L02 ORF2及ORF1基因，完全cd
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DQ003344.1 細環病毒純系P2-9-16 ORF2 (ORF2)、ORF1A (ORF1A)及ORF1B (ORF1B)基因，完全cd
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DQ186998.1 細環病毒純系BM1A-13 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cd
DQ186999.1 細環病毒純系BM1B-05 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cd
DQ187000.1 細環病毒純系BM1B-07 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cd
DQ187001.1 細環病毒純系BM1B-11 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cd
DQ187002.1 細環病毒純系BM1B-14 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cd
DQ187003.1 細環病毒純系BM1B-08 ORF2 (ORF2)基因，完全cd；及非功能性ORF1 (ORF1)基因，完全序列
DQ187004.1 細環病毒純系BM1C-16 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cd
DQ187005.1 細環病毒純系BM1C-10 ORF2 (ORF2)及ORF1 (ORF1)基因，完全cd
DQ187007.1 細環病毒純系BM2C-25 ORF2 (ORF2)基因，完全cd；及非功能性ORF1 (ORF1)基因，完全序列
DQ361268.1 細環病毒分離株ViPi04 ORF1基因，完全cd
EF538879.1 細環病毒分離株CSC5 ORF2及ORF1基因，完全cd
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EU305676.1 細環病毒分離株LTT10 ORF1基因，完全cd
EU889253.1 細環病毒分離株ViPi08非功能性ORF1基因，完全序列
FJ392105.1 細環病毒分離株TW53A25 ORF2基因，部分cd；及ORF1基因，完全cd
FJ392107.1 細環病毒分離株TW53A27 ORF2基因，部分cd；及ORF1基因，完全cd
FJ392108.1 細環病毒分離株TW53A29 ORF2基因，部分cd；及ORF1基因，完全cd
FJ392111.1 細環病毒分離株TW53A35 ORF2基因，部分cd；及ORF1基因，完全cd
FJ392112.1 細環病毒分離株TW53A39 ORF2基因，部分cd；及ORF1基因，完全cd
FJ392113.1 細環病毒分離株TW53A26 ORF2基因，完全cd；及非功能性ORF1基因，完全序列
FJ392114.1 細環病毒分離株TW53A30 ORF2及ORF1基因，完全cd
FJ392115.1 細環病毒分離株TW53A31 ORF2及ORF1基因，完全cd
FJ392117.1 細環病毒分離株TW53A37 ORF1基因，完全cd
FJ426280.1 細環病毒株SIA109，完全基因體
FR751500.1 細環病毒完全基因體，病毒株TTV-HD23a (rheu215)
GU797360.1 細環病毒純系8-17，完全基因體
HC742700.1 來自專利WO2010044889之序列7
HC742710.1 來自專利WO2010044889之序列17
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KU243129.1 TTV樣微型病毒分離株TTMV-204，完全基因體
KY856742.1 TTV樣微型病毒分離株zhenjiang，完全基因體
LC381845.1 細環病毒Human/Japan/KS025/2016 DNA，完全基因體
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MH649186.1 指環病毒物種分離株ctcb33，完全基因體
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MH649254.1 指環病毒物種分離株ctjb007，完全基因體
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MK012439.1 指環病毒物種分離株cthe000，完全基因體
MK012440.1 指環病毒物種分離株ctjd008，完全基因體
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MK012492.1 指環病毒物種分離株ctbb005，完全基因體
MK012493.1 指環病毒物種分離株ctcj014，完全基因體
MK012500.1 指環病毒物種分離株ctcb001，完全基因體
MK012504.1 指環病毒物種分離株ctcj010，完全基因體
MK012516.1 指環病毒物種分離株ctcf003，完全基因體
NC_038336.1 細環病毒5分離株TCHN-C1 Orf2及Orf1基因，完全cd
NC_038338.1 細環病毒11分離株TCHN-D1 Orf2及Orf1基因，完全cd
NC_038339.1 細環病毒13分離株TCHN-A Orf2及Orf1基因，完全cd
NC_038340.1 細環病毒20 ORF4、ORF3、ORF2、ORF1基因，完全cd，純系：SAa-10
NC_038341.1 細環病毒21分離株TCHN-B ORF2及ORF1基因，完全cd
NC_038342.1 細環病毒23 ORF2、ORF1基因，完全cd，分離株：s-TTV CH65-2
NC_038343.1 細環病毒24 ORF4、ORF3、ORF2、ORF1基因，完全cd，純系：SAa-01
NC_038344.1 細環病毒29 ORF2、ORF1、ORF3基因，完全cd，分離株：TTVyon-KC009
NC_038345.1 微型細環病毒10分離株LIL-y1 ORF2、ORF1、ORF3及ORF4基因，完全cd
NC_038346.1 微型細環病毒11分離株LIL-y2 ORF2、ORF1及ORF3基因，完全cd
NC_038347.1 微型細環病毒12分離株LIL-y3 ORF2、ORF1、ORF3及ORF4基因，完全cd
NC_038350.1 細環中型病毒3分離株2PoSMA ORF2及ORF1基因，完全cd
NC_038351.1 細環中型病毒4分離株6PoSMA ORF2、ORF1及ORF3基因，完全cd
NC_038352.1 細環中型病毒5 DNA，完全基因體，分離株：MDJHem2
NC_038353.1 細環中型病毒6 DNA，完全基因體，分離株：MDJHem3-1
NC_038354.1 細環中型病毒7 DNA，完全基因體，分離株：MDJHem3-2
NC_038355.1 細環中型病毒8 DNA，完全基因體，分離株：MDJN1
NC_038356.1 細環中型病毒9 DNA，完全基因體，分離株：MDJN2
NC_038357.1 細環中型病毒10 DNA，完全基因體，分離株：MDJN14
NC_038358.1 細環中型病毒11 DNA，完全基因體，分離株：MDJN47
NC_038359.1 細環中型病毒12 DNA，完全基因體，分離株：MDJN51
NC_038360.1 細環中型病毒13 DNA，完全基因體，分離株：MDJN69
NC_038361.1 細環中型病毒14 DNA，完全基因體，分離株：MDJN97
NC_038362.1 細環中型病毒15 DNA，完全基因體，分離株：Pt-TTMDV210
在一些實施例中，遺傳元件包含與來自以下之一或多個序列具有同源性或一致性的一或多個序列：一或多個非指環病毒，例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、痘瘡病毒、SV40、乳頭狀瘤病毒；RNA病毒，諸如反轉錄病毒，例如慢病毒；單股RNA病毒，例如肝炎病毒；或雙股RNA病毒，例如輪狀病毒。在一些實施例中，由於缺乏重組反轉錄病毒，因此可提供輔助以產生感染性粒子。此類輔助可例如藉由使用輔助細胞株來提供，該等輔助細胞株含有在LTR內之調控序列控制下編碼反轉錄病毒之所有結構基因的質體。適合於複製本文所述之指環載體的細胞株包括此項技術中已知之細胞株，例如A549細胞，其可如本文所述地修飾。該遺傳元件可另外含有編碼可選標記之基因，以使得可鑑別所需遺傳元件。
在一些實施例中，遺傳元件包括非靜默突變，例如在編碼多肽中產生胺基酸差異之鹼基取代、缺失或添加，只要序列保持與由第一核苷酸序列編碼之多肽至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或以其他方式適用於實踐本發明。就此而言，可進行通常認為不使總體蛋白質功能不活化的某些保守胺基酸取代，諸如關於帶正電荷的胺基酸(且反之亦然)：離胺酸、精胺酸及組胺酸；關於帶負電荷的胺基酸(且反之亦然)：天冬胺酸及麩胺酸；以及關於帶中性電荷之某些胺基酸群組(且在所有情況下，亦反之亦然)：(1)丙胺酸及絲胺酸，(2)天冬醯胺、麩醯胺酸及組胺酸，(3)半胱胺酸及絲胺酸，(4)甘胺酸及脯胺酸，(5)異白胺酸、白胺酸及纈胺酸，(6)甲硫胺酸、白胺酸及異白胺酸，(7)苯丙胺酸、甲硫胺酸、白胺酸及酪胺酸，(8)絲胺酸及蘇胺酸，(9)色胺酸及酪胺酸，以及(10)例如酪胺酸、色胺酸及苯丙胺酸。可根據物理特性及對二級與三級蛋白質結構的影響來對胺基酸進行分類。保守取代在此項技術中公認為一個胺基酸取代具有類似特性之另一胺基酸。
具有相同或指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基的兩個或更多個核酸或多肽序列之一致性(例如當在比較窗口或指示區上比較及比對最大一致性時，在指定區上之約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性)可使用BLAST或BLAST 2.0序列比較演算法在下文所述之預設參數下，或藉由手動比對及目視檢查來量測(參見例如NCBI網站www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/或其類似者)。一致性亦可指或可應用於測試序列之互補序列。一致性亦包括具有缺失及/或添加之序列，及彼等具有取代者。如本文所述，演算法考慮空隙及其類似物。一致性可存在於：至少約10個胺基酸或核苷酸長度、約15個胺基酸或核苷酸長度、約20個胺基酸或核苷酸長度、約25個胺基酸或核苷酸長度、約30個胺基酸或核苷酸長度、約35個胺基酸或核苷酸長度、約40個胺基酸或核苷酸長度、約45個胺基酸或核苷酸長度、約50個胺基酸或核苷酸長度或更多個胺基酸或核苷酸長度的區域。由於遺傳密碼簡併，因此同源核苷酸序列可包括任意數目個靜默鹼基變化，亦即仍然編碼相同胺基酸的核苷酸取代。
蛋白質外部  在一些實施例中，指環載體，例如合成指環載體，包含包封遺傳元件之蛋白質外部。蛋白質外部可包含未能在哺乳動物中引發非所需免疫反應之實質上非致病性外部蛋白質。指環載體之蛋白質外部通常包含可自行裝配成構成蛋白質外部之二十面體結構的實質上非致病性蛋白質。
在一些實施例中，蛋白質外部蛋白質由指環載體之遺傳元件之序列(例如，與遺傳元件呈順式)編碼。在其他實施例中，蛋白質外部蛋白質由與指環載體之遺傳元件分離之核酸(例如，與遺傳元件呈反式)編碼。
在一些實施例中，蛋白質，例如實質上非致病性蛋白質及/或蛋白質外部蛋白質，包含一或多個醣基化胺基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個。
在一些實施例中，蛋白質，例如實質上非致病性蛋白質及/或蛋白質外部蛋白質，包含至少一個親水性DNA-結合區、富含精胺酸之區、富含蘇胺酸之區、富含麩醯胺之區、N端聚精胺酸序列、可變區、C端聚麩醯胺酸/麩胺酸序列、及一或多個二硫橋鍵。
在一些實施例中，蛋白質為衣殼蛋白，例如具有以下之序列：與由編碼本文所述之衣殼蛋白，例如指環病毒ORF1分子及/或衣殼蛋白序列，例如如本文所述，的核苷酸序列中之任一者編碼之蛋白質具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，蛋白質或衣殼蛋白之功能片段由與指環病毒ORF1核酸，例如如本文所述，具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，指環載體包含編碼衣殼蛋白或衣殼蛋白之功能片段之核苷酸序列，或與如本文所述之指環病毒ORF1分子具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，具有較低序列一致性之胺基酸的範圍可提供本文所述之特性及細胞/組織/物種特異性(例如向性)之差異中之一或多者。
在一些實施例中，指環載體缺乏蛋白質外部之脂質。在一些實施例中，指環載體缺乏脂質雙層，例如病毒包封。在一些實施例中，指環載體之內部完全藉由蛋白質外部覆蓋(例如，100%覆蓋)。在一些實施例中，指環載體之內部低於100%由蛋白質外部覆蓋，例如95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更低覆蓋度。在一些實施例中，蛋白質外部包含間隔或不連續處，例如允許對水、離子、肽或小分子之滲透性，只要遺傳元件保留於指環載體中。
在一些實施例中，蛋白質外部包含一或多種蛋白質或多肽，其特異性識別及/或結合宿主細胞，例如互補蛋白質或多肽，以介導遺傳元件進入宿主細胞中。
在一些實施例中，蛋白質外部包含以下中之一或多者：富含精胺酸之區、凝膠捲(jelly-roll)區、N22域、高變區及/或C端域，例如ORF1分子，例如如本文所述。在一些實施例中，蛋白質外部包含以下中之一或多者：一或多個醣基化蛋白質、親水性DNA-結合區、富含精胺酸之區、富含蘇胺酸之區、富含麩醯胺之區、N端聚精胺酸序列、可變區、C端聚麩醯胺酸/麩胺酸序列及一或多個二硫橋鍵。舉例而言，蛋白質外部包含由指環病毒ORF1核酸，例如如本文所述，編碼之蛋白質。
在一些實施例中，蛋白質外部包含以下特徵中之一或多者：二十面體對稱性，識別及/或結合與一或多個宿主細胞分子相互作用以介導進入宿主細胞中之分子，缺乏脂質分子，缺乏碳水化合物，pH及溫度穩定性、耐清潔劑，及在宿主中為實質上非免疫原性或非致病性的。
在一些實施例中，複數個指環載體(例如第一複數個指環載體或第二複數個指環載體，例如如本文所述)包含多個相同指環載體之複本。在一些實施例中，複數個指環載體(例如第一複數個指環載體或第二複數個指環載體，例如如本文所述)包含多個不同的指環載體。
在一些實施例中，向個體投與如本文所述之包含蛋白質外部之第一複數個指環載體。在一些實施例中，在投與第一複數個指環載體後，隨後向個體投與包含本文所述之蛋白質外部之第二複數個指環載體。在一些實施例中，第二複數個指環載體包含與第一複數個指環載體相同的蛋白質外部。在一些實施例中，第二複數個指環載體包含與第一複數個指環載體之蛋白質外部具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性之蛋白質外部。在一些實施例中，第二複數個指環載體包含與第一複數個指環載體之ORF1分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的ORF1分子。在一些實施例中，第二複數個指環載體包含具有與第一複數個指環載體包含之ORF1分子相同的胺基酸序列的ORF1分子。在一些實施例中，第二複數個指環載體之蛋白質外部包含與第一複數個指環載體之蛋白質外部中之多肽(例如ORF1分子)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的多肽(例如ORF1分子)。在一些實施例中，第二複數個指環載體之蛋白質外部包含與第一複數個指環載體之蛋白質外部中之多肽(例如衣殼蛋白)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的多肽(例如衣殼蛋白)。在一些實施例中，第二複數個指環載體包含與第一複數個指環載體有共同之處的具有至少一個表面抗原決定基之蛋白質外部。在一些實施例中，第二複數個指環載體包含與第一複數個指環載體之ORF1有共同之處的具有至少一個表面抗原決定基之ORF1分子。在一些實施例中，第二複數個指環載體包含具有不同於第一複數個指環載體之蛋白質外部的一或多個胺基酸序列差異(例如保守性突變)之蛋白質外部。在一些實施例中，結合至第一複數個指環載體之蛋白質外部的抗體，例如個體內之抗體，亦結合至第二複數個指環載體之蛋白質外部。在一些實施例中，抗體以與結合至第二複數個指環載體之蛋白質外部約相同親和力結合(例如，KD為約90-110%，例如95-105%)至第一複數個指環載體之蛋白質外部。
在一些實施例中，第一複數個指環載體之蛋白質外部包含與第二複數個指環載體之蛋白質外部相同的三級結構。在一些實施例中，第一及第二複數個指環載體之蛋白質外部的結構，例如三級結構，可使用低溫電子顯微術(cryo-EM)、X射線結晶或核磁共振(NMR)測定。在一些實施例中，使用結構比對及蛋白質結構中原子之原子座標之量測，例如均方根偏差(RMSD)之量測，將第一複數個指環載體之蛋白質外部之結構與第二複數個指環載體之蛋白質外部之結構進行比較。在一些實施例中，可針對所比較結構之多肽鏈的主鏈、所比較結構之多肽鏈的α碳或所比較結構之所有原子，例如第一複數個指環載體之蛋白質外部及第二複數個指環載體之蛋白質外部，計算RMSD。在一些實施例中，較低值(例如≤5埃)之RMSD指示第一複數個指環載體之蛋白質外部與第二複數個指環載體之蛋白質外部之間的結構相似性。在一些實施例中，較低值(例如≤3埃)之RMSD指示第一複數個指環載體之蛋白質外部與第二複數個指環載體之蛋白質外部之間的較高結構相似性。在一些實施例中，0埃之RMSD指示兩種蛋白質包含相同結構，例如第一複數個指環載體之蛋白質外部之結構與第二複數個指環載體之蛋白質外部的結構相同。
III.核酸構築體  本文中所述之遺傳元件可包括於核酸構築體(例如，如本文中所述之核酸構築體)中。
在一個態樣中，本發明包括一種包含有包含以下之遺傳元件的核酸遺傳元件構築體：(i)編碼非致病性外部蛋白質(例如，指環病毒ORF1分子或剪接變異體或其功能片段)之序列，(ii)將遺傳元件結合至非致病性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列，及(iii)編碼效應子之序列。
遺傳元件或遺傳元件內之序列中之任一者可使用任何適合之方法獲得。各種重組方法為此項技術中已知的，諸如自具有病毒序列之細胞中篩選庫、自已知包括序列之核酸構築體中衍生該序列或使用標準技術自含有其之細胞及組織中直接分離。替代地或組合地，遺傳元件之一部分或全部可以合成方式產生，而非選殖。
在一些實施例中，核酸構築體包括調控元件、與目標基因同源之核酸序列及/或用於在活細胞內及/或當胞內分子存在於目標細胞內時引起報導分子之表現的各種報導子構築體。
報導基因用於鑑別潛在經轉染細胞及評估調控序列功能性。一般而言，報導基因為接受體生物體或組織中不存在或表現且編碼表現藉由一些可易於偵測之特性(例如，酶活性)體現之多肽的基因。在DNA已引入至接受體細胞中之後的適合時間分析報導基因之表現。適合報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因(例如Ui-Tei等人, 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適合的表現系統已熟知且可使用已知技術製備或商業購得。一般而言，具有展示報導基因之最高表現量之最小5'側接區的構築體鑑別為啟動子。此類啟動子區可連接至報導基因且用於評估試劑調節啟動子驅動之轉錄的能力。
在一些實施例中，核酸構築體在宿主細胞中為實質上非致病性及/或實質上非整合的，或在宿主中為實質上非免疫原性的。
在一些實施例中，核酸構築體呈足以調節表型、病毒含量、基因表現、與其他病毒之競爭、疾病病狀等中之一或多者的量，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。
IV.組合物  本文所述之指環載體亦可包括於具有例如如本文所述之醫藥賦形劑的醫藥組合物中。在一些實施例中，醫藥組合物包含至少10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13、10 14或10 15個指環載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含約10 5-10 15、10 5-10 10或10 10-10 15個指環載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含約10 8(例如，約10 5、10 6、10 7、10 8、10 9或10 10)個基因體當量/mL之指環載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含10 5-10 10、10 6-10 10、10 7-10 10、10 8-10 10、10 9-10 10、10 5-10 6、10 5-10 7、10 5-10 8、10 5-10 9、10 5-10 11、10 5-10 12、10 5-10 13、10 5-10 14、10 5-10 15或10 10-10 15個基因體當量/mL之指環載體，例如根據如PCT/US19/65995之實例18之方法所確定。在一些實施例中，醫藥組合物包含足以將包含於每細胞之至少1、2、5、或10、100、500、1000、2000、5000、8,000、1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7或更多個指環載體中的遺傳元件之複本遞送至真核細胞群體的指環載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含足以將每個細胞包含於指環載體中之至少約1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7、或約1×10 4-1×10 5、1×10 4-1×10 6、1×10 4-1×10 7、1×10 5-1×10 6、1×10 5-1×10 7或1×10 6-1×10 7個遺傳元件之複本遞送至真核細胞群體的指環載體。
在一些實施例中，醫藥組合物具有以下特徵中之一或多者：醫藥組合物符合醫藥或良好作業規範(GMP)標準；醫藥組合物根據良好作業規範(GMP)製成；醫藥組合物具有低於預定參考值之病原體含量，例如實質上不含病原體；醫藥組合物具有低於之污染物含量，例如實質上不含污染物；或醫藥組合物具有較低免疫原性或實質上無免疫原性，例如如本文所述。
在一些實施例中，醫藥組合物包含低於臨限量之一或多個污染物。醫藥組合物中宜排除或降至最低之例示性污染物包括但不限於宿主細胞核酸(例如，宿主細胞DNA及/或宿主細胞RNA)、動物衍生之組分(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、複製勝任型病毒、無感染性粒子、無病毒衣殼蛋白、外源性物質及凝集物。在實施例中，污染物為宿主細胞DNA。在實施例中，該組合物包含每劑量低於約10 ng之宿主細胞DNA。在實施例中，組合物中之宿主細胞DNA之含量藉由過濾及/或酶降解宿主細胞DNA而降低。在實施例中，醫藥組合物由低於10重量% (例如，低於約10重量%、5重量%、4重量%、3重量%、2重量%、1重量%、0.5重量%、或0.1重量%)之污染物組成。
在一個態樣中，本文所述之本發明包括一種醫藥組合物，其包含： a)指環載體，其包含遺傳元件，該遺傳元件包含(i)編碼非致病性外部蛋白質之序列、(ii)將該遺傳元件結合至非致病性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列及(iii)編碼調控核酸之序列；及與遺傳元件相關，例如圍封或包封遺傳元件之蛋白質外部；及 b)醫藥賦形劑。
囊泡  在一些實施例中，組合物進一步包含載體組分，例如微粒、脂質體、囊泡或胞外體。在一些實施例中，脂質體包含由圍繞內部水性隔室之單層或多層脂質雙層及相對不可滲透之外部親脂性磷脂雙層構成的球狀囊泡結構。脂質體可為陰離子型、中性或陽離子型的。脂質體具有生物相容性，無毒性，可遞送親水性及親脂性藥物分子，保護其負荷不被血漿酶降解，且將其負載轉運穿過生物膜(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。
囊泡可由若干種不同類型的脂質製成；然而，磷脂最常用於生成脂質體作為藥物載劑。劑量可包含但不限於單獨的DOTMA、DOTAP、DOTIM、DDAB，或連同膽固醇產生DOTMA及膽固醇、DOTAP及膽固醇、DOTIM及膽固醇以及DDAB及膽固醇。用於製備多層囊泡脂質之方法係此項技術中已知的(參見例如美國專利第6,693,086號，其關於多層囊泡脂質製備之教示內容以引用的方式併入本文中)。雖然當脂質膜與水溶液混合時，囊泡形成可為自發的，但其亦可藉由使用均質機、音波處理器或擠出設備以震盪形式施加力來加快(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。擠壓脂質可藉由擠壓穿過尺寸減小之過濾器來製備，如Templeton等人, Nature Biotech, 15:647-652, 1997中所述，其中與擠壓脂質製備有關之教示內容以引用之方式併入本文中。
如本文所述，可將添加劑添加至囊泡中以修改其結構及/或特性。舉例而言，可將膽固醇或神經鞘磷脂中之任一者添加至混合物中以幫助使結構穩定及防止內部負荷洩漏。此外，囊泡可由氫化卵磷脂醯膽鹼或卵磷脂醯膽鹼、膽固醇及磷酸二鯨蠟酯製備。(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。此外，囊泡可在合成期間或之後經表面修飾以包括與受體細胞上之反應性基團互補的反應性基團。此類反應性基團包括但不限於順丁烯二醯亞胺基。舉例而言，可合成囊泡以包括順丁烯二醯亞胺結合磷脂，諸如但不限於DSPE-MaL-PEG2000。
囊泡調配物可主要由天然磷脂及脂質，諸如1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯膽鹼(DSPC)、神經鞘磷脂、卵磷脂醯膽鹼及單唾液酸神經節苷脂構成。由磷脂構成之調配物僅在血漿中較不穩定。然而，用膽固醇操縱脂質膜減少經囊封負荷之快速釋放或1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)增加穩定性(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。
在一些實施例中，脂質可用於形成脂質微粒。脂質包括但不限於DLin-KC2-DMA4、C12-200及共脂質二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(disteroylphosphatidyl choline)、膽固醇及PEG-DMG可使用自發性囊泡形成程序調配(參見例如Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3)。組分莫耳比可為約50/10/38.5/1.5 (DLin-KC2-DMA或C12-200/二硬脂醯基磷脂醯膽鹼/膽固醇/PEG-DMG)。Tekmira在美國及海外具有大致95個專利系列，涉及脂質微粒及脂質微粒調配物之各種態樣(參見例如美國專利第7,982,027；7,799,565；8,058,069；8,283,333；7,901,708；7,745,651；7,803,397；8,101,741；8,188,263；7,915,399；8,236,943及7,838,658號，及歐洲專利第1766035；1519714；1781593及1664316號)，其皆可用於及/或適用於本發明。
在一些實施例中，微粒包含以隨機方式配置之一或多種固化聚合物。微粒可為可生物降解的。可使用例如此項技術中已知之方法合成可生物降解之微粒，包括但不限於溶劑蒸發、熱熔微囊封裝、溶劑移除及噴霧乾燥。用於合成微粒之例示性方法係由Bershteyn等人, Soft Matter 4:1787-1787, 2008及在US 2008/0014144 A1中描述，其與微粒合成相關之特定教示內容以引用的方式併入本文中。
可用以形成可生物降解微粒之例示性合成聚合物包括(不限於)脂族聚酯、聚(乳酸) (PLA)、聚(乙醇酸) (PGA)、乳酸與乙醇酸之共聚物(PLGA)、聚己內酯(PCL)、聚酸酐、聚(鄰)酯、聚胺基甲酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)及聚(丙交酯-共-己內酯)、及天然聚合物，諸如白蛋白、海藻酸鹽及其他多醣，包括聚葡萄糖及纖維素、膠原蛋白、其化學衍生物，包括化學基團之取代、添加，諸如烷基、伸烷基、羥基化、氧化、及藉由熟習此項技術者常規進行之其他改質)、白蛋白及其他親水性蛋白質、玉米蛋白及其他醇溶蛋白及疏水性蛋白，其共聚物及混合物。一般而言，此等材料藉由酶水解或暴露於水、藉由表面或整體侵蝕而降解。
微粒之直徑範圍在0.1-1000微米(µm)。在一些實施例中，其直徑之尺寸範圍為1-750 µm或50-500 µm或100-250 µm。在一些實施例中，其直徑之尺寸範圍為50-1000 µm、50-750 µm、50-500 µm或50-250 µm。在一些實施例中，其直徑尺寸範圍為0.05-1000 µm、10-1000 µm、100-1000 µm或500-1000 µm。在一些實施例中，其直徑為0.5 µm、約10 µm、約50 µm、約100 µm、約200 µm、約300 µm、約350 µm、約400 µm、約450 µm、約500 µm、約550 µm、約600 µm、約650 µm、約700 µm、約750 µm、約800 µm、約850 µm、約900 µm、約950 µm或約1000 µm。如在微粒直徑之情形下所用，術語「約」意謂所陳述之絕對值+/-5%。
在一些實施例中，配位體經由存在於粒子表面上且存在於所連接之配位體上的功能性化學基團(羧酸、醛類、胺硫氫基及羥基)與微粒之表面共軛。功能性可藉由例如在微粒之乳液製備期間將穩定劑併入功能性化學基團引入至微粒中。
將官能基引入至微粒之另一實例為在粒子製備後期間藉由使粒子及配位體與均雙官能交聯劑或異雙官能交聯劑直接交聯來進行。此程序可使用適合之化學及一類交聯劑(如下文更詳細地論述之CDI、EDAC、戊二醛等)或在製備之後經由粒子表面之化學改質將配位體耦接至粒子表面的任何其他交聯劑。此亦包括兩親媒性分子，諸如脂肪酸、脂質或功能性穩定劑藉此可被動地吸附且接著至粒子表面，藉此引入用於繫留至配位體之功能性端基的方法。
在一些實施例中，微粒可經合成以在其外部表面上包含一或多個目標基團以靶向特定細胞或組織類型(例如心肌細胞)。此等靶向基團包括但不限於受體、配位體、抗體及其類似基團。此等靶向基團結合在細胞表面上之其搭配物。在一些實施例中，微粒將整合至包含細胞表面之脂質雙層中且使線粒體遞送至細胞。
微粒亦可在其最外表面上包含脂質雙層。此雙層可由一或多種相同或不同類型之脂質構成。實例包括但不限於磷脂，諸如磷酸膽鹼及磷酸肌醇。特定實例包括但不限於DMPC、DOPC、DSPC及各種其他脂質，諸如本文針對脂質體所述之脂質。
在一些實施例中，載劑包含奈米粒子，例如如本文所述。
在一些實施例中，本文所述之囊泡或微粒係用診斷劑功能化。診斷劑之實例包括但不限於用於正電子發射斷層攝影術(PET)、電腦輔助斷層攝影術(CAT)、單光子發射電腦斷層攝影術、x射線、螢光檢查及磁共振成像(MRI)之商業購得成像劑；及造影劑。適用作MRI中之造影劑之適合的材料之實例包括釓螯合物，以及鐵、鎂、錳、銅及鉻。
載體  本文所述之組合物(例如，醫藥組合物)可包含用載劑調配及/或在載劑中遞送。在一個態樣中，本發明包括一種包含有包含(例如，囊封)本文所述之組合物(例如，本文所述之指環載體、指環病毒或遺傳元件)之載劑(例如，囊泡、脂質體、脂質奈米粒子、胞外體、紅血球、胞外體(例如，哺乳動物或植物胞外體)、融質體（fusosome）)的組合物，例如醫藥組合物。
在一些實施例中，本文所述之組合物及系統可在脂質體或其他類似囊泡中調配。通常，脂質體為由圍繞內部水性區室之單層或多層脂質雙層及相對不可滲透之外部親脂性磷脂雙層構成的球狀囊泡結構。脂質體可為陰離子型、中性或陽離子型的。脂質體通常具有以下特徵中之一或多個(例如全部)：生物相容性、無毒性、可遞送親水性及親油性藥物分子二者、可保護其負荷免於受血漿酶降解，且可將其負載轉運穿過生物膜及血腦屏障(BBB) (參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679; 以及Zylberberg及Matosevic. 2016. Drug Delivery, 23:9, 3319-3329, doi: 10.1080/10717544.2016.1177136)。
囊泡可由若干種不同類型的脂質製成；然而，磷脂最常用於生成脂質體作為藥物載劑。用於製備多層囊泡脂質之方法為已知的(參見例如美國專利第6,693,086號，其關於多層囊泡脂質製備之教示內容以引用的方式併入本文中)。雖然當脂質膜與水溶液混合時，囊泡形成可為自發的，但其亦可藉由使用均質機、音波處理器或擠出設備以震盪形式施加力來加快(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章標識469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。擠壓脂質可藉由例如擠壓穿過尺寸減小之過濾器來製備，如Templeton等人, Nature Biotech, 15:647-652, 1997中所述。
脂質奈米粒子(LNP)為向本文所述之醫藥組合物提供生物相容及可生物降解的遞送系統的載劑之另一實例。參見例如Gordillo-Galeano等人. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 第133卷, 2018年12月, 第285-308頁。奈米結構脂質載劑(NLC)為保留SLN特徵、改善藥物穩定性及負載能力且防止藥物滲漏之經修飾固體脂質奈米粒子(SLN)。聚合物奈米粒子(PNP)為藥物遞送之重要組成部分。此等奈米粒子可有效地將藥物遞送引導至特定目標，且改良藥物穩定性及受控藥物釋放。亦可採用脂質-聚合物奈米粒子(PLN)，其為組合脂質體及聚合物之一種新型載劑。此等奈米粒子具有PNP及脂質體之互補優點。PLN由核殼結構構成；聚合物核提供穩定結構，且磷脂殼提供良好生物相容性。因此，兩種組分增加藥物囊封效率，促進表面修飾，且防止水溶性藥物滲漏。關於綜述，參見例如Li等人 2017, Nanomaterials 7, 122; doi:10.3390/nano7060122。
胞外體亦可用作本文所述之組合物及系統的藥物遞送媒劑。關於綜述，參見Ha等人 2016年7月. Acta Pharmaceutica Sinica B. 第6卷, 第4期, 第287-296頁；doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
離體分化之紅血球亦可用作本文所述之組合物的載劑。參見例如WO2015073587；WO2017123646；WO2017123644；WO2018102740；wO2016183482；WO2015153102；WO2018151829；WO2018009838；Shi等人2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136；美國專利9,644,180；Huang等人2017. Nature Communications 8: 423；Shi等人2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136。
例如如WO2018208728中所述之融質體組合物亦可用作載劑以遞送本文所述之組合物。
膜滲透多肽  在一些實施例中，組合物進一步包含膜滲透多肽(MPP)，以攜帶組分進入細胞中或穿過膜，例如細胞或細胞核膜。能夠促進將物質轉運穿過膜之膜滲透多肽包括但不限於細胞滲透肽(CPP)(參見例如美國專利第8,603,966號)、用於植物胞內遞送之融合肽(參見例如Ng等人, PLoS One, 2016, 11:e0154081)、蛋白質轉導域、Trojan肽及膜移位信號(MTS) (參見例如Tung等人, Advanced Drug Delivery Reviews 55:281-294 (2003))。一些MPP富含具有帶正電側鏈之胺基酸，諸如精胺酸。
膜滲透多肽具有誘導組分之膜滲透及允許在全身性投與時在多個組織之細胞內巨分子活體內移位的能力。膜滲透多肽亦可指當在適當條件下與細胞接觸時以遠大於被動擴散所能達到的量自外部環境進入胞內環境，包括細胞質、細胞器(諸如粒線體)或細胞核的肽。 轉運穿過膜之組分可以可逆或不可逆方式連接至膜滲透多肽。連接子可為化學鍵，例如一或多個共價鍵或非共價鍵。在一些實施例中，連接子為肽連接子。此類連接子可在2-30個胺基酸之間或更長。連接子包括可撓性、剛性或可裂解連接子。
組合  在一個態樣中，本文所述之指環載體或包含指環載體之組合物亦可包括一或多個異源性部分。在一個態樣中，本文所述之指環載體或包含指環載體之組合物亦可包括融合物中之一或多個異源性部分。在一些實施例中，異源性部分可與遺傳元件連接。在一些實施例中，異源性部分可包封於蛋白質外部作為指環載體之部分。在一些實施例中，異源性部分可與指環載體一起投與。
在一個態樣中，本發明包括細胞或組織，其包含本文所述之指環載體及異源性部分中之任一者。
在另一態樣中，本發明包括一種醫藥組合物，其包含本文所述之指環載體及異源性部分。
在一些實施例中，異源性部分可為病毒(例如效應子(例如藥物、小分子)、靶向劑(例如DNA靶向劑、抗體、受體配位體)、標籤(例如螢光團、感光劑，諸如KillerRed)或本文所述之編輯或靶向部分。在一些實施例中，本文所述之膜易位多肽連接至一或多個異源性部分。在一個實施例中，異源性部分為小分子(例如，肽模擬物或分子量低於2000道爾頓之小有機分子)、肽或多肽(例如，抗體或其抗原結合片段)、奈米粒子、適體或藥劑。
病毒在一些實施例中，指環載體或組合物(例如如本文所述)可進一步包含來自除指環病毒以外之病毒的一或多個組分或元件(例如核酸或多肽)，例如作為異源性部分，例如單股DNA病毒，例如雙DNA病毒、環狀病毒、雙生病毒、基因體病毒、絲狀病毒、微小病毒、矮化病毒、小病毒及螺旋病毒。在一些實施例中，該組合物可進一步包含雙股DNA病毒，例如腺病毒、壺腹病毒、囊泡病毒、非洲豬瘟病毒、桿狀病毒、微小紡錘形噬菌體屬、球狀病毒、滴狀病毒、肥大唾腺炎病毒、疱疹病毒、虹彩病毒、脂毛病毒、線極病毒及痘病毒。在一些實施例中，該組合物可進一步包含RNA病毒，例如α病毒、真菌傳棒狀病毒、肝炎病毒、大麥病毒、菸草花葉病毒、菸草脆裂病毒、三角病毒、風疹病毒、雙RNA病毒、囊狀病毒、分病毒及里奧病毒。在一些實施例中，指環載體係與作為異源性部分之病毒一起投與。
在一些實施例中，異源性部分可包含非致病性，例如共生性、共生、天然病毒。在一些實施例中，非致病性病毒為一或多個指環病毒，例如α細環病毒(TT)、β細環病毒(TTM)及γ細環病毒(TTMD)。在一些實施例中，指環病毒可包括細環病毒(TT)、SEN病毒、哨兵病毒、TTV樣微型病毒、TT病毒、TT病毒基因型6、TT病毒組、TTV樣病毒DXL1、TTV樣病毒DXL2、細環樣微型病毒(TTM)或細環樣中型病毒(TTMD)。在一些實施例中，非致病性病毒包含與本文所述之核苷酸序列中之任一者具有至少至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性的一或多個序列。
在一些實施例中，異源性部分可包含鑑別為在個體中缺乏之一或多個病毒。舉例而言，可向鑑別為具有病毒病(dyvirosis)之個體投與包含指環載體及在該個體中不平衡或具有不同於參考值之比率的一或多個病毒組分或病毒之組合物，例如健康個體。
在一些實施例中，異源性部分可包含一或多個非指環病毒，例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、痘瘡病毒、SV40、乳頭狀瘤病毒；RNA病毒，諸如反轉錄病毒，例如慢病毒；單股RNA病毒，例如肝炎病毒；或雙股RNA病毒，例如輪狀病毒。在一些實施例中，指環載體或病毒為有缺陷的，或需要輔助以便產生感染性粒子。此類輔助可例如藉由使用輔助細胞株來提供，該等輔助細胞株含有在LTR內之調控序列控制下編碼複製缺陷性指環載體或病毒之結構基因中之一或多者(例如全部)的核酸，例如整合至基因體中之質體或DNA。適合於複製本文所述之指環載體的細胞株包括此項技術中已知之細胞株，例如A549細胞，其可如本文所述地修飾。
靶向部分在一些實施例中，本文所述之該組合物或指環載體可進一步包含靶向部分，例如特異性結合至存在於目標細胞上之所關注分子的靶向部分。靶向部分可調節所關注分子或細胞之特定功能，調節特定分子(例如酶、蛋白質或核酸)，例如路徑中之所關注分子下游的特定分子，或特異性結合至目標以定位指環載體或遺傳元件。舉例而言，靶向部分可包括與所關注特定分子相互作用以提高、降低或以其他方式調節其功能的治療劑。
標記或監測部分在一些實施例中，本文所述之該組合物或指環載體可進一步包含用以標記或監測本文所述之指環載體或遺傳元件的標籤。標記或監測部分可藉由化學劑或酶裂解，諸如蛋白分解或內含肽剪接來移除。親和標籤可適用於使用親和技術純化經標記多肽。一些實例包括幾丁質結合蛋白質(CBP)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)及聚(His)標籤。溶解標籤可適用於輔助在伴隨蛋白缺失型物種，諸如大腸桿菌，中表現之重組蛋白質以幫助蛋白質之恰當摺疊且阻止其沈澱。一些實例包括硫化還原蛋白(TRX)及聚(NANP)。標記或監測部分可包括光敏標籤，例如螢光。螢光標記可用於觀測。GFP及其變異體為常用作螢光標籤之一些實例。蛋白質標籤可允許發生特異性酶修飾(諸如藉由生物素連接酶進行之生物素標記)或化學修飾(諸如與FlAsH-EDT2反應以便螢光成像)。通常合併標記或監測部分，以便將蛋白質連接至多個其他組分。標記或監測部分亦可藉由特異性蛋白分解或酶裂解(例如藉由TEV蛋白酶、凝血酶、Xa因子或腸肽酶)移除。
奈米粒子在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體可進一步包含奈米粒子。奈米粒子包括尺寸在約1與約1000奈米之間、尺寸在約1與約500奈米之間、尺寸在約1與約100 nm之間、尺寸在約50 nm與約300 nm之間、尺寸在約75 nm與約200 nm之間、尺寸在約100 nm與約200 nm之間及其間任何範圍的無機材料。奈米粒子通常具有奈米尺度尺寸之複合結構。在一些實施例中，奈米粒子通常為球形的，但取決於金屬奈米粒子組合物，不同形態為可能的。與奈米粒子之外部環境接觸的奈米粒子之部分通常鑑別為奈米粒子之表面。在本文所述之奈米粒子中，尺寸限制可限於二維，且因此，奈米粒子包括直徑為約1至約1000 nm之複合結構，其中特定直徑取決於金屬奈米粒子組合物及根據實驗設計之奈米粒子的預期用途。舉例而言，用於治療性應用之奈米粒子通常具有約200 nm或更低之尺寸。
奈米粒子之額外所需特性，諸如表面電荷及空間穩定性，亦可鑒於所關注之特定應用而變化。諸如癌症治療之臨床應用中可能需要的例示性特性描述於Davis等人, Nature 2008 第7卷, 第771-782頁; Duncan, Nature 2006 第6卷, 第688-701頁; 及Allen, Nature 2002 第2卷，第750-763頁中，其各自以全文引用的方式併入本文中。在閱讀本發明時，熟習此項技術者可鑑別額外特性。奈米粒子尺寸及特性可藉由此項技術中已知之技術來偵測。用以偵檢粒子尺寸之例示性技術包括但不限於動態光散射(DLS)及多種顯微法，諸如穿透式電子顯微法(TEM)及原子力顯微法(AFM)。用於偵測粒子形態之例示性技術包括但不限於TEM及AFM。用於偵測奈米粒子之表面電荷的例示性技術包括但不限於ζ電位方法。適合於偵測其他化學特性之額外技術包含 1H、 11B及 13C及 19F NMR、UV/Vis及紅外線/拉曼光譜及螢光光譜(在奈米粒子與螢光標記組合使用時)及可藉由熟習此項技術者鑑別之額外技術。
小分子在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體可進一步包含小分子。小分子部分包括但不限於小肽、肽模擬物(例如類肽)、胺基酸、胺基酸類似物、合成聚核苷酸、聚核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、通常具有低於約5,000公克/莫耳之分子量的有機及無機化合物(包括異質性及/或有機金屬化合物)，例如具有低於約2,000公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物，例如具有低於約1,000公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物，例如具有低於約500公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物，及此類化合物之鹽、酯及其他醫藥學上可接受之形式。小分子可包括但不限於神經傳遞素、激素、藥物、毒素、病毒或微生物粒子、合成分子及促效劑或拮抗劑。
適合之小分子的實例包括描述於「The Pharmacological Basis of Therapeutics」Goodman及Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), 第九版, 以下章節：Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites; Drugs Acting on the Central Nervous System; Autacoids: Drug Therapy of Inflammation; Water, Salts and Ions; Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism; Cardiovascular Drugs; Drugs Affecting Gastrointestinal Function; Drugs Affecting Uterine Motility; Chemotherapy of Parasitic Infections; Chemotherapy of Microbial Diseases; Chemotherapy of Neoplastic Diseases; Drugs Used for Immunosuppression; Drugs Acting on Blood-Forming organs; Hormones and Hormone Antagonists; Vitamins, Dermatology; and Toxicology中之彼等小分子，其全部以引用之方式併入本文中。小分子之一些實例包括但不限於朊病毒藥物，諸如他克莫司(tacrolimus)、泛蛋白連接酶或HECT接合酶抑制劑，諸如heclin；組蛋白修飾藥物，諸如丁酸鈉；酶抑制劑，諸如5-氮雜-胞苷；蒽環黴素，諸如小紅莓；β-內醯胺，諸如青黴素；抗菌劑；化學治療劑；抗病毒劑；來自其他生物體之調節劑，諸如VP64；及具有不充分生物可用性之藥物，諸如具有缺陷型藥物動力學之化學治療劑。
在一些實施例中，小分子為表觀遺傳調節劑，例如de Groote等人. Nuc. Acids Res. (2012):1-18中所述之彼等。例示性小分子表觀遺傳調節劑描述於例如Lu等人. J. Biomolecular Screening 17.5(2012):555-71中，例如表1或2中，以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑包含伏立諾他(vorinostat)或羅米地辛(romidepsin)。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑包含I、II、III及/或IV類組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)抑制劑。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑包含SirTI之活化劑。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑包含山竹醇(Garcinol)、Lys-CoA、C646、(+)-JQI、I-BET、BICI、MS120、DZNep、UNC0321、EPZ004777、AZ505、AMI-I、吡唑醯胺7b、苯并[d]咪唑17b、醯基化二胺苯碸衍生物(例如PRMTI)、甲基司他(methylstat)、4,4'-二羧基-2,2'-聯吡啶、SID 85736331、氧肟酸鹽類似物8、丹尼賽普羅米(tanylcypromie)、雙胍及二胍多元胺類似物、UNC669、維達紮(Vidaza)、地西他濱(decitabine)、苯丁酸鈉(SDB)、類脂酸(LA)、槲皮素、丙戊酸、肼酞𠯤(hydralazine)、複方新諾明(bactrim)、綠茶提取物(例如，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG))、薑黃素(curcumin)、蘿蔔硫素(sulforphane)及/或大蒜素/二烯丙基二硫化物。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑抑制DNA甲基化，例如為DNA甲基轉移酶之抑制劑(例如為5-氮胞苷及/或地西他濱(decitabine))。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑調節組蛋白修飾，例如組蛋白乙醯化、組蛋白甲基化、組蛋白類泛素化及/或組蛋白磷酸化。在一些實施例中，表觀遺傳調節劑為組蛋白脫乙醯基酶之抑制劑(例如，為伏立諾他及/或曲古黴素A (trichostatin A))。
在一些實施例中，小分子為醫藥活性劑。在一個實施例中，小分子為代謝活性或組分之抑制劑。適用類別之醫藥活性劑包括但不限於抗生素、消炎藥、血管生成或血管活性劑、生長因子及化學治療(抗贅生)劑(例如腫瘤抑制劑)。可使用來自本文所述之類別及實例或來自(Orme-Johnson 2007, Methods Cell Biol. 2007;80:813-26)之一個分子或分子之組合。在一個實施例中，本發明包括包含抗生素、消炎藥、血管生成或血管活性劑、生長因子或化學治療劑之組合物。
肽或蛋白質在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體可進一步包含肽或蛋白質。肽部分可包括但不限於肽配位體或抗體片段(例如結合受體，諸如胞外受體之抗體片段)、神經肽、激素肽、肽藥物、毒性肽、病毒或微生物肽、合成肽及促效性或拮抗性肽。
肽部分可為線性的或分支的。肽之長度為約5至約200個胺基酸、約15至約150個胺基酸、約20至約125個胺基酸、約25至約100個胺基酸或其間任何範圍。
肽之一些實例包括但不限於螢光標籤或標記物、抗原、抗體、抗體片段(諸如單域抗體)、配位體及受體(諸如類升糖素肽-1 (GLP-1)、GLP-2受體2、膽囊收縮素B (CCKB)及生長抑素受體)、肽治療劑(諸如結合至特定細胞表面受體，諸如G蛋白偶聯受體(GPCR)或離子通道之彼等)、合成肽或來自天然生物活性肽之類似物肽、抗微生物肽、成孔肽、靶向腫瘤或細胞毒性肽及降解或自毀壞肽(諸如誘導細胞凋亡之肽信號或感光劑肽)。
本文所述之適用於本發明之肽亦包括較小抗原結合肽，例如抗原結合抗體或抗體樣片段，諸如單鏈抗體、奈米抗體(參見例如Steeland等人. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113)。此類小抗原結合肽可結合細胞溶質抗原、細胞核抗原或細胞器內抗原。
在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體包括連接至能夠靶向特定位置、組織或細胞之配位體的多肽。
寡核苷酸適體在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體可進一步包含寡核苷酸適體。適體部分為寡核苷酸或肽適體。寡核苷酸適體為單股DNA或RNA (ssDNA或ssRNA)分子，其可結合至包括具有高親和力及特異性之蛋白質及肽的預先選擇目標。
寡核苷酸適體為可經由重複數輪之活體外選擇或同等方法，SELEX (指數富集的配位體系統進化)工程改造以便結合至諸如小分子、蛋白質、核酸及甚至細胞、組織及生物體之多種分子目標的核酸物種。適體提供辨別性分子識別，且可由化學合成產生。另外，適體可具有所需儲存特性，且在治療性應用中引發極少免疫原性或無免疫原性。
DNA及RNA適體均可對各種目標展現出穩固的結合親和力。舉例而言，已選擇DNA及RNA適體用於t溶菌酶、凝血酶、人類免疫不全病毒反式作用反應元件(HIV TAR) (參見en.wikipedia.org/wiki/Aptamer - cite_note-10)、氯化血紅素、干擾素γ、血管內皮生長因子(VEGF)、前列腺特異性抗原(PSA)、多巴胺及非典型致癌基因、熱休克因子1 (HSF1)。
肽適體在一些實施例中，本文所述之組合物或指環載體可進一步包含肽適體。肽適體具有一個(或多個)短不同肽域，包括具有較低分子量12-14 kDa之肽。肽適體可經設計以特異性結合且干擾細胞內之蛋白質-蛋白質相互作用。
肽適體為經選擇或工程改造以結合特定目標分子之人工蛋白質。此等蛋白質包括可變序列之一或多個肽環。其通常自組合庫分離，且通常隨後藉由定向突變或數輪可變區突變誘發及選擇來改良。肽適體可活體內結合細胞蛋白質目標且發揮生物效應，包括干擾其所靶向分子與其他蛋白質之正常蛋白質相互作用。特定言之，針對連接至轉錄因子活化域之目標蛋白質篩選連接至轉錄因子結合域之不同肽適體環。經由此選擇策略將肽適體活體內結合至其目標係偵測為下游酵母標記基因之表現。此類實驗鑑別由適體結合之特定蛋白質及因適體破壞引起之蛋白質相互作用，以產生表現型。另外，用適當功能性部分衍生之肽適體可引起其目標蛋白質之特異性轉譯後修飾，或改變目標之亞細胞定位。
肽適體亦可活體外識別目標。其已發現代替生物感測器中之抗體使用且用於偵測來自含有無活性及活性蛋白質形式兩者之群體的蛋白質之活性同功異型物。稱為蝌蚪之衍生物，其中肽適體「頭部」經共價連接至特異性序列雙股DNA「尾部」，允許藉由其DNA尾部之PCR (使用例如定量即時聚合酶鏈反應)在混合物中定量稀有的目標分子。
可使用不同系統選擇肽適體，但當前酵母雙雜交系統使用最多。肽適體亦可選自藉由噬菌體呈現及其他表面呈現技術，諸如mRNA呈現、核糖體呈現、細菌呈現及酵母呈現構築之組合肽庫。此等實驗程序亦稱為生物淘選(biopannings)。在自生物淘選獲得之肽中，可將模擬抗原決定基(mimotope)視為一種肽適體。自組合肽庫淘洗之所有肽已儲存於名為MimoDB之特殊資料庫中。
V.宿主細胞  本發明進一步係針對一種包含本文所述之指環載體的宿主或宿主細胞。在一些實施例中，宿主或宿主細胞為植物、昆蟲、細菌、真菌、脊椎動物、哺乳動物(例如人類)或其他生物體或細胞。在某些實施例中，如本文所確認，提供的指環載體感染一系列不同宿主細胞。目標宿主細胞包括中胚層、內胚層或外胚層來源之細胞。目標宿主細胞包括例如上皮細胞、肌肉細胞、白血球(例如淋巴球)、腎臟組織細胞、肺組織細胞。
在一些實施例中，指環載體在宿主中為實質上非免疫原性的。指環載體或遺傳元件未藉由宿主之免疫系統產生非所需實質性反應。一些免疫反應包括但不限於體液免疫反應(例如抗原特異性抗體之產生)及細胞介導之免疫反應(例如淋巴球增殖)。
在一些實施例中，宿主或宿主細胞與指環載體接觸(例如感染)。在一些實施例中，宿主為哺乳動物，諸如人類。在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞，例如人類細胞。宿主中之指環載體的量可在投與之後在任何時間量測。在某些實施例中，確定指環載體在培養物中生長之時程。
在一些實施例中，指環載體，例如如本文所述之指環載體為可遺傳的。在一些實施例中，指環載體在流體及/或細胞中自母親至兒童線性地傳輸。在一些實施例中，來自原始宿主細胞之子細胞包含指環載體。在一些實施例中，母體以至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之效率，或自宿主細胞至子細胞之至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之傳輸效率將指環載體傳輸至兒童。在一些實施例中，宿主細胞中之指環載體在減數分裂期間具有25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之傳輸效率。在一些實施例中，宿主細胞中之指環載體在有絲分裂期間具有至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之傳輸效率。在一些實施例中，細胞中之指環載體具有約10%-20%、20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、95%-99%或其間之任何百分比的傳輸效率。
在一些實施例中，指環載體，例如指環載體在宿主細胞內複製。在一個實施例中，指環載體能夠在哺乳動物細胞，例如人類細胞中複製。在其他實施例中，指環載體為複製缺陷型或複製非勝任型。
雖然在一些實施例中，指環載體在宿主細胞中複製，但指環載體未例如與宿主之染色體一起整合至宿主之基因體中。在一些實施例中，指環載體例如與宿主之染色體具有可忽略的重組頻率。在一些實施例中，指環載體例如與宿主之染色體的重組頻率例如低於約1.0 cM/Mb、0.9 cM/Mb、0.8 cM/Mb、0.7 cM/Mb、0.6 cM/Mb、0.5 cM/Mb、0.4 cM/Mb、0.3 cM/Mb、0.2 cM/Mb、0.1 cM/Mb或更低。
VI.使用方法  本文所述之指環載體及包含指環載體之組合物可用於治療例如有需要之個體(例如哺乳動物個體，例如人類個體)之病症、疾病或病狀的方法中。投與本文所述之醫藥組合物可例如藉助於非經腸(包括靜脈內、瘤內、腹膜內、肌肉內、腔內及皮下)投與。指環載體可單獨投與或調配為醫藥組合物。在一些實施例中，指環載體可以單次劑量，例如第一複數個單次劑量投與。在一些實施例中，可以至少兩次劑量，例如第一複數個劑量，隨後第二複數個劑量，投與指環載體。在一些實施例中，指環載體可以多次劑量投與，例如第一複數個、第二複數個、第三複數個、視情況第四複數個、視情況第五複數個及/或視情況進一步複數個劑量。
指環載體可以單位劑量組合物，諸如單位劑量非經腸組合物形式投與。此類組合物通常藉由摻合來製備，且可適合地經調適用於非經腸投與。此類組合物可例如呈可注射及可輸注溶液或懸浮液或栓劑或氣溶膠形式。
在一些實施例中，投與指環載體或包含該指環載體(例如如本文所述)之組合物可使得將包含指環載體之遺傳元件遞送至目標細胞，例如個體之目標細胞。
本文所述之指環載體或其組合物，例如包含效應子(例如，內源性或外源性效應子)，可用於將效應子遞送至細胞、組織或個體。在一些實施例中，指環載體或其組合物用於將效應子遞送至骨髓、血液、心臟、GI或皮膚。藉由投與本文所述之指環載體組合物遞送效應子可調節(例如增加或減少)細胞、組織或個體之非編碼RNA或多肽的表現量。以此方式調節表現量可引起使效應子遞送至細胞中之功能活性改變。在一些實施例中，經調節功能活性在本質上可為酶、結構或調控性的。
在一些實施例中，指環載體或其複本可在遞送至細胞中之後24小時(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、30天或1個月)在細胞中偵測到。在一些實施例中，指環載體或其組合物介導對目標細胞之作用，且該作用持續至少1、2、3、4、5、6或7天，2、3或4週，或1、2、3、6或12個月。在一些實施例中(例如，其中該指環載體或其組合物包含編碼外源性蛋白質之遺傳元件)，該作用持續低於1、2、3、4、5、6或7天，2、3或4週，或1、2、3、6或12個月。
可用本文所述之指環載體或包含指環載體之組合物處理的疾病、病症及病狀的實例包括但不限於：免疫病症、干擾素病變(例如，I型干擾素病變)、傳染病、發炎性病症、自體免疫病狀、癌症(例如，實體腫瘤，例如肺癌；非小細胞肺癌，例如表現對mIR-625反應之基因，例如凋亡蛋白酶-3的腫瘤)及腸胃疾病。在一些實施例中，指環載體調節(例如提高或降低)與指環載體接觸之細胞中之活性或功能。在一些實施例中，指環載體調節(例如提高或降低)與指環載體接觸之細胞中之分子(例如核酸或蛋白質)之含量或活性。在一些實施例中，指環載體減小與指環載體接觸之細胞(例如癌細胞)的存活率，例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高。在一些實施例中，指環載體包含與指環載體接觸之細胞(例如癌細胞)的存活率，例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高的效應子，例如miRNA，例如miR-625。在一些實施例中，指環載體例如藉由提高凋亡蛋白酶-3活性來提高與指環載體接觸之細胞(例如癌細胞)的細胞凋亡，例如提高至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多。在一些實施例中，指環載體包含例如藉由提高凋亡蛋白酶-3活性來提高與指環載體接觸之細胞(例如癌細胞)的細胞凋亡，例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高的效應子，例如miRNA，例如miR-625。
VII.投與/遞送  該組合物(例如，包含如本文所述之指環載體的醫藥組合物)可經調配以包括醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥組合物可視情況包含一或多種額外活性物質，例如治療性及/或預防性活性物質。本發明之醫藥組合物可無菌及/或不含熱原質。在調配及/或製造藥劑中之一般考慮因素可見於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第21版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (以引用之方式併入本文中)中。
儘管描述本文所提供之醫藥組合物主要針對適用於向人類投與之醫藥組合物，但熟習此項技術者應理解，此類組合物一般適用於向任何其他動物投與，例如向非人類動物，例如非人類哺乳動物投與。應充分理解，為使組合物適用於向各種動物投與，對適用於向人類投與之醫藥組合物進行修改，且一般熟練的獸醫藥理學家可僅用一般實驗(若存在)設計及/或進行此類修改。醫藥組合物之投藥所涵蓋的個體包括但不限於人類及/或其他靈長類動物；哺乳動物，包括商業相關之哺乳動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠及/或大鼠；及/或鳥類，包括商業相關之鳥類，諸如家禽、雞、鴨、鵝及/或火雞。
在一些實施例中，所涵蓋的被投與醫藥組合物之個體為人類。在一些實施例中，個體為例如0與4週齡之間的新生兒。在一些實施例中，個體為例如4週齡與1歲之間的嬰兒。在一些實施例中，個體為例如1歲與12歲之間的兒童。在一些實施例中，個體小於18歲。在一些實施例中，個體為例如12歲與18歲之間的青少年。在一些實施例中，個體超過18歲。在一些實施例中，個體為例如18歲與25歲之間的年輕成人。在一些實施例中，個體為例如介於25歲至50歲之間的成人。在一些實施例中，個體為老人，例如至少50歲或更大的成人。
本文所述之醫藥組合物的調配物可藉由藥理學技術中已知或此後研發之任何方法來進行製備。一般而言，此類製備方法包括使活性成分與賦形劑及/或一或多種其他附屬成分結合，且隨後必要時及/或需要時將產物分割、成型及/或封裝之步驟。
在一個態樣中，本發明提供一種向個體遞送指環載體之方法。該方法包括向個體投與包含如本文所述之指環載體的醫藥組合物。在一些實施例中，所投與之指環載體在個體中複製(例如，成為個體之病毒體的一部分)。
醫藥組合物可包括野生型或天然病毒元件及/或經修飾病毒元件。指環載體可包括一或多個指環病毒序列(例如，核酸序列或編碼其胺基酸序列之核酸序列)或與其具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性的序列。指環載體可包含有包含與一或多個指環病毒序列(例如，指環病毒ORF1核酸序列)具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%序列一致性之核酸序列的核酸分子。指環載體可包含編碼與指環病毒胺基酸序列(例如，指環病毒ORF1分子之胺基酸序列)具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%序列一致性之胺基酸序列的核酸分子。指環載體可包含有包含與指環病毒胺基酸序列(例如，指環病毒ORF1分子之胺基酸序列)具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%序列一致性之胺基酸序列的多肽。
在一些實施例中，指環載體足以提高(刺激)內源性基因及蛋白質表現，例如與參考，例如健康對照相比，提高至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。在某些實施例中，指環載體足以降低(抑制)內源性基因及蛋白質表現，例如與參考，例如健康對照相比，降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。
在一些實施例中，指環載體抑制/增強宿主或宿主細胞中之一或多種病毒特性，例如向性、感染性、免疫抑制/活化，例如與參考，例如健康對照相比，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。
在一個態樣中，本發明提供一種向先前已投與指環載體，例如第一複數個指環載體之個體，例如人類個體遞送效應子之方法，該方法包含投與第二複數個指環載體。在另一態樣中，本發明提供一種向個體，例如人類個體遞送效應子之方法，該方法包含向該個體投與第一複數個指環載體且隨後向該個體投與第二複數個指環載體。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包含投與第三、第四、第五及/或進一步複數個指環載體。在一些實施例中，第一及第二複數個指環載體經由相同投與途徑投與，例如靜脈內投與。在一些實施例中，第一及第二複數個指環載體經由不同投與途徑投與。在一些實施例中，第一複數個指環載體作為第一醫藥組合物之一部分投與至個體。在一些實施例中，第二複數個指環載體作為第二醫藥組合物之一部分投與至個體。
在一些實施例中，第一及第二複數個指環載體包含約相同劑量之指環載體，例如其中第一複數個指環載體及第二複數個指環載體包含約相同數量及/或濃度之指環載體。在一些實施例中，第二複數個指環載體包含第一複數個指環載體之數目的90-110%，例如95-105%。在一些實施例中，第一複數個指環載體包含比第二複數個指環載體大的指環載體劑量，例如其中第一複數個指環載體包含相對於第二複數個指環載體更大數量及/或濃度的指環載體。在一些實施例中，第一複數個指環載體包含比第二複數個指環載體低的指環載體劑量，例如其中第一複數個指環載體包含相對於第二複數個指環載體更大數量及/或濃度的指環載體。在一些實施例中，個體接收重複劑量之指環載體，其中該重複劑量在至少1、2、3、4或5年之時程內投與。在一些實施例中，重複劑量約每1、2、3或4週，或約每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月投與。
在一些實施例中，包含於向個體投與之第一複數個指環載體中的遺傳元件在其投與之後至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150天，例如藉由高解析度熔融(HRM)分析在該個體中偵測到，例如如實例1中所述。在一些實施例中，包含於向個體投與之第二複數個指環載體中之遺傳元件在其投與之後至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150天，例如藉由高解析度熔融(HRM)分析在該個體中偵測到，例如如實例1中所述。
在一些實施例中，向個體投與之第一及/或第二複數個指環載體包含效應子。在一些實施例中，第一及/或第二複數個包含外源性效應子。在一些實施例中，第一及/或第二複數個包含內源性效應子。在一些實施例中，第二複數個指環載體之效應子為與第一複數個指環載體之效應子相同的效應子。在一些實施例中，第二複數個指環載體之效應子不同於第一複數個指環載體之效應子。在一些實施例中，第二複數個指環載體將與由第一複數個指環載體遞送之效應子的數目約相同的數目個效應子複本遞送至個體。在一些實施例中，第二複數個指環載體將效應子以由第一複數個指環載體向個體遞送之效應子之複本的至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的量遞送至個體(例如其中由第一複數個遞送之效應子可與由第二複數個遞送之效應子相同或不同)。在一些實施例中，第二複數個指環載體將比第一複數個指環載體多的效應子之複本(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000倍多的複本)遞送至個體。在一些實施例中，第二複數個指環載體對個體具有生物效應(例如，目標基因之減弱，或生物標記物之上調)，其不低於投與第一複數個指環載體的生物效應。
在一些實施例中，基於已接受複數個指環載體來鑑別或選擇個體包含對來自個體之樣品進行分析。在一些實施例中，基於已接受複數個指環載體來鑑別或選擇個體包含自第三方(例如實驗室)獲得資訊，其中該第三方對來自個體之樣品進行分析。在一些實施例中，基於已接受複數個指環載體來鑑別或選擇個體包含查核個體之病史。
在一些實施例中，向個體投與進一步包含未在病毒遺傳資訊中表示之一或多個病毒株的醫藥組合物。
在一些實施例中，包含本文所述之指環載體的醫藥組合物以足以調節病毒感染之劑量及時間投與。病毒感染之一些非限制性實例包括腺相關病毒、愛知病毒(Aichi virus)、澳大利亞蝙蝠狂犬病毒、BK多瘤病毒、班納病毒(Banna virus)、巴馬森林病毒(Barmah forest virus)、布尼安維拉病毒(Bunyamwera virus)、拉克羅斯本揚病毒(Bunyavirus La Crosse)、雪足野兔布尼亞病毒(Bunyavirus snowshoe hare)、獼猴疱疹病毒(Cercopithecine herpesvirus)、金迪普拉病毒(Chandipura virus)、屈公病毒(Chikungunya virus)、科薩病毒A (Cosavirus A)、牛痘病毒(Cowpox virus)、柯薩奇病毒(Coxsackievirus)、克里米亞-岡果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、登革熱病毒(Dengue virus)、多理病毒(Dhori virus)、達格畢病毒(Dugbe virus)、杜文海格病毒(Duvenhage virus)、東部馬腦炎病毒、伊波拉病毒(Ebolavirus)、腸道細胞病變性人類孤兒病毒(Echovirus)、腦心肌炎病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)歐洲蝙蝠狂犬病毒(European bat lyssavirus)、GB病毒C/G型肝炎病毒、漢坦病毒(Hantaan virus)、亨德拉病毒(Hendra virus) A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、E型肝炎病毒、D型肝炎病毒、馬痘病毒、人類腺病毒、人類星狀病毒、人類冠狀病毒、人類巨細胞病毒、人類腸病毒68、人類腸病毒70、人類疱疹病毒1、人類疱疹病毒2、人類疱疹病毒6、人類疱疹病毒7、人類疱疹病毒8、人類免疫缺乏病毒、人類乳頭狀瘤病毒1、人類乳頭狀瘤病毒2、人類乳頭狀瘤病毒16、人類乳頭狀瘤病毒18、人類副流感、人類小病毒B19、人類呼吸道合胞病毒、人類鼻病毒、人類SARS冠狀病毒、人類泡沫病毒、人類嗜T淋巴球病毒、人類環曲病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、伊斯法罕病毒(Isfahan virus)、JC多瘤病毒、日本腦炎病毒、胡寧沙粒病毒(Junin arenavirus)、KI多瘤病毒、庫京病毒(Kunjin virus)、拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat virus)維多利亞湖馬堡病毒(Lake Victoria marburgvirus)、蘭加特病毒(Langat virus)、賴薩熱病毒(Lassa virus)、洛茲達雷病毒(Lordsdale virus)、跳躍病病毒(Louping ill virus)、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒、馬丘波病毒(Machupo virus)、馬雅羅病毒(Mayaro virus)、MERS冠狀病毒、麻疹病毒、門戈腦心肌炎病毒(Mengo encephalomyocarditis virus)、梅克爾細胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus)、莫科拉病毒(Mokola virus)、傳染性軟疣病毒、猴痘病毒(Monkeypox virus)、腮腺炎病毒、莫雷谷線腦炎病毒(Murray valley encephalitis virus)、紐約病毒(New York virus)、立百病毒(Nipah virus)、諾沃克病毒(Norwalk virus)、奧尼永-尼永病毒(O'nyong-nyong virus)、口瘡病毒(Orf virus)、奧羅普切病毒(Oropouche virus)、皮欽德病毒(Pichinde virus)、脊髓灰白質炎病毒、龐塔托魯白蛉熱病毒(Punta toro phlebovirus)、撲嗎拉病毒(Puumala virus)、狂犬病病毒、東非瑞夫特河谷羊熱病病毒(Rift valley fever virus)、羅沙病毒A (Rosavirus A)、羅斯河病毒(Ross river virus)、輪狀病毒A (Rotavirus A)、輪狀病毒B、輪狀病毒C、德國麻疹病毒(Rubella virus)、鷺山病毒(Sagiyama virus)、薩利病毒A (Salivirus A)、西西里糠蚊熱病毒(Sandfly fever sicilian virus)、劄幌病毒(Sapporo virus)、勝利基森林病毒(Semliki forest virus)、漢城病毒(Seoul virus)、猴泡沫病毒(Simian foamy virus)、猴病毒5、辛得比斯病毒(Sindbis virus)、南安普頓病毒(Southampton virus)、聖路易腦炎病毒(St. louis encephalitis virus)、蜱傳播波瓦生病毒(Tick-borne powassan virus)、細環病毒、托斯卡納病毒(Toscana virus)、尤尤庫尼米病毒(Uukuniemi virus)、痘瘡病毒(Vaccinia virus)、水痘帶狀皰狀病毒、天花病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、水泡性口炎病毒、西部馬腦炎病毒、WU多瘤病毒、西尼羅河病毒(West Nile virus)、亞巴猴腫瘤病毒(Yaba monkey tumor virus)、亞巴樣病病毒、黃熱病病毒(Yellow fever virus)及茲卡病毒(Zika Virus)。在某些實施例中，指環載體足以勝過及/或取代已存在於個體中之病毒，例如與參考相比至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。在某些實施例中，指環載體足以與慢性或急性病毒感染競爭。在某些實施例中，可預防性投與指環載體以保護免於病毒感染(例如前病毒)。在一些實施例中，指環載體之量足以調節(例如，表型、病毒含量、基因表現、與其他病毒競爭、疾病病狀等，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多)。在一些實施例中，治療(treatment)、治療(treating)及其同源詞包含個體之醫療管理(例如，藉由投與指環載體，例如如本文所述製成之指環載體)，例如意欲改善、改進、穩定、預防或治癒疾病、病理性病狀或病症。在一些實施例中，治療包含主動性治療(針對改善疾病、病理性病狀或病症的治療)、病因性治療(針對相關疾病、病理性病狀或病症之病因的治療)、緩解性治療(針對症狀緩解而設計之治療)、預防性治療(針對預防、最小化或部分或完全地抑制相關疾病、病理性病狀或病症之發展的治療)及/或支持性治療(用於補充另一療法之治療)。
VIII.擴增指環病毒序列之方法  在一些態樣中，本發明提供擴增包含指環病毒序列之核酸分子的方法。在一些實施例中，此類方法包含滾環式擴增，例如經靶向滾環式擴增。在一些實施例中，此類方法可用於鑑別及分離來自樣品之指環病毒序列。在一些實施例中，本發明提供測定個體之指環病毒概況(亦稱為指環體)的方法。在實施例中，個體之指環病毒概況包含自獲自個體之樣品鑑別之指環病毒序列的彙編。在實施例中，個體之指環病毒概況可用於鑑別個體中存在之指環病毒株或自其獲得之樣品的群體。
DNA 擴增 本文中之方法可用於鑑別及分離來自樣品(例如來自個體之樣品，例如如本文所述)之指環病毒序列。在一些實施例中，本發明係關於一種擴增包含指環病毒序列之環狀核酸分子的方法。在一些實施例中，方法包含提供包含環狀核酸分子的樣品之步驟，該環狀核酸分子包含指環病毒序列及結合至(例如與其互補)指環病毒序列之至少一部分的引子。在一些實施例中，方法包含使包含指環病毒序列之環狀核酸分子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸的步驟。在一些實施例中，方法包含使核酸分子或其一部分滾環擴增，其中核酸分子包含指環病毒序列。雖然本文所述之諸多方法(例如涉及滾環擴增)可適用於擴增環狀DNA，但應理解本文所述之方法亦可用於擴增線性模板。舉例而言，線性模板可為指環病毒基因體之片段。在一些實施例中，使用多股置換擴增來擴增線性模板。在一些實施例中，擴增可為指數的(例如使用PCR擴增)或線性的(例如使用滾環擴增或多股置換擴增)。
滾環擴增滾環擴增為促進環狀核酸分子之複製及擴增的DNA及/或RNA複製之形式。在一些情況下，滾環擴增係使用具有股替代活性之DNA聚合酶(例如DNA依賴型DNA聚合酶)進行，以延伸一或多個經退火至環狀核酸模板之引子。在一些實施例中，股替代活性使得置換新合成之核酸股能夠允許進一步模板化，且產生包含與環狀核酸模板互補之重複序列的長單股DNA或RNA分子。
在一些實施例中，本文所述之滾環擴增之方法包含一種提供包含環狀核酸分子及一或多個與環狀核酸分子之至少一部分互補之引子的樣品的步驟及一種使包含環狀核酸分子及一或多個引子之樣品與DNA聚合酶分子(例如DNA依賴型DNA聚合酶分子)接觸的步驟。
在一些實施例中，滾環擴增之方法進一步包含例如在環狀核酸分子與引子及/或DNA聚合酶接觸之前，富集包含環狀核酸分子之樣品用於一或多種相關成分的步驟。在一些實施例中，一或多種相關成分包含核酸分子。舉例而言，在一些實施例中，一或多種相關成分包含非染色體核酸分子，例如環狀非染色體核酸分子及/或病毒核酸分子(例如指環病毒核酸分子，例如指環病毒基因體，或其部分，例如包含至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500或3000個指環病毒基因體之核苷酸。
在一些實施例中，滾環擴增之方法進一步包含在使樣品與DNA依賴型聚合酶接觸之步驟之前使樣品中之環狀核酸分子變性的步驟。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約80℃、85℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃之溫度下一段時間，例如至少約1、2、3、4或5分鐘。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約80℃之溫度下。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約85℃之溫度下。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約90℃之溫度下。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約91℃之溫度下。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約92℃之溫度下。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約93℃之溫度下。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約94℃之溫度下。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約95℃之溫度下。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約96℃之溫度下。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約97℃之溫度下。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約98℃之溫度下。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約99℃之溫度下。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約80℃、85℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃之溫度下至少約1分鐘。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約80℃、85℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃之溫度下至少約2分鐘。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約80℃、85℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃之溫度下至少約3分鐘。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約80℃、85℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃之溫度下至少約4分鐘。在一些實施例中，使環狀核酸分子變性之步驟包含使環狀核酸分子暴露於至少約80℃、85℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃之溫度下至少約5分鐘。
在一些實施例中，滾環擴增之方法進一步包含冷卻環狀核酸分子之步驟，例如在使環狀核酸分子變性之步驟之後且在使樣品與DNA依賴型DNA聚合酶接觸之步驟之前。在一些實施例中，冷卻環狀核酸分子之步驟包含使環狀核酸分子冷卻至約2℃、3℃、4℃、5℃、6℃或7℃之溫度。在一些實施例中，冷卻環狀核酸分子之步驟包含使環狀核酸分子冷卻至約2℃之溫度。在一些實施例中，冷卻環狀核酸分子之步驟包含使環狀核酸分子冷卻至約3℃之溫度。在一些實施例中，冷卻環狀核酸分子之步驟包含使環狀核酸分子冷卻至約4℃之溫度。在一些實施例中，冷卻環狀核酸分子之步驟包含使環狀核酸分子冷卻至約5℃之溫度。在一些實施例中，冷卻環狀核酸分子之步驟包含使環狀核酸分子冷卻至約6℃之溫度。在一些實施例中，冷卻環狀核酸分子之步驟包含使環狀核酸分子冷卻至約7℃之溫度。
在一些實施例中，滾環擴增之方法進一步包含在使樣品與DNA依賴型DNA聚合酶接觸之步驟之後培育樣品之一或多個步驟。在一些實施例中，第一培育步驟包含在DNA依賴型DNA聚合酶存在下在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品持續一段時間，例如至少約10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或30小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約26℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約27℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約28℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約29℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約30℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約31℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約32℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約33℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約34℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約35℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約10小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約15小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約16小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約17小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約18小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約19小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約20小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約21小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約22小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約23小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約24小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約25小時。在一些實施例中，第一培育步驟包含在約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃之溫度下培育樣品一段時間，例如至少約30小時。在一些實施例中，第二培育步驟包含在適合於不活化DNA依賴型聚合酶之條件下培育樣品。舉例而言，在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之溫度下培育樣品持續一段時間，例如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分鐘。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約61℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約62℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約63℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約64℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約65℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約66℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約67℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約68℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約69℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約70℃之溫度下培育樣品。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之溫度下培育樣品至少5分鐘。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之溫度下培育樣品至少6分鐘。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之溫度下培育樣品至少7分鐘。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之溫度下培育樣品至少8分鐘。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之溫度下培育樣品至少9分鐘。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之溫度下培育樣品至少10分鐘。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之溫度下培育樣品至少11分鐘。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之溫度下培育樣品至少12分鐘。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之溫度下培育樣品至少13分鐘。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之溫度下培育樣品至少14分鐘。在一些實施例中，第二培育步驟包含在約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之溫度下培育樣品至少15分鐘。
在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有以下濃度的混合物中：每個引子約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8 µM，或每個引子約0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7或0.7-0.8 µM。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.1 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.2 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.3 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.4 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.5 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.6 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.7 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.8 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7或0.7-0.8 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.1-0.2 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.2-0.3 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.3-0.4 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.4-0.5 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.5-0.6 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.6-0.7 µM之濃度的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於一或多個引子具有每個引子約0.7-0.8 µM之濃度的混合物中。
在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有適合於DNA依賴型DNA聚合酶以合成DNA之DNA聚合酶緩衝液(例如Phi29 DNA聚合酶緩衝液)的混合物中。
在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如以下濃度之牛白蛋白血清的混合物中：約100、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或300 ng/µL，或約100-150、150-175、175-190、190-200、200-210、210-225、225-250或250-300 ng/µL。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如以下濃度之牛白蛋白血清的混合物中：約100、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或300 ng/µL。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約100 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約150 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約160 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約170 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約180 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約190 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約200 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約210 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約220 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約230 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約240 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約250 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約300 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如以下濃度之牛白蛋白血清的混合物中：約100-150、150-175、175-190、190-200、200-210、210-225、225-250或250-300 ng/µL。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約100-150 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約150-175 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約175-190 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約190-200 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約200-210 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約210-225 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約225-250 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約250-300 ng/µL之濃度之牛白蛋白血清的混合物中。
在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如以下濃度之dNTPs的混合物中：約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或2 mM，或約0.5-0.7、0.7-0.9、0.9-1.0、1.0-1.1、1.1-1.3、1.3-1.5或1.5-2 mM。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如以下濃度之dNTPs的混合物中：約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或2 mM。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約0.5 mM之濃度之dNTPs的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約0.6 mM之濃度之dNTPs的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約0.7 mM之濃度之dNTPs的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約0.8 mM之濃度之dNTPs的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約0.9 mM之濃度之dNTPs的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約1.0 mM之濃度之dNTPs的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約1.1 mM之濃度之dNTPs的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約1.2 mM之濃度之dNTPs的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約1.3 mM之濃度之dNTPs的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約1.4 mM之濃度之dNTPs的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約1.5 mM之濃度之dNTPs的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於包含例如約2 mM之濃度之dNTPs的混合物中。
在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有例如以下濃度之Phi29聚合酶的混合物中：約1、1.5、2、2.5或3 U/µL，或約1-1.5、1.5-2、2-2.5或2.5-3 U/µL。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有例如以下濃度之Phi29聚合酶的混合物中：約1、1.5、2、2.5或3 U/µL。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有例如約1 U/µL之濃度之Phi29聚合酶的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有例如約1.5 U/µL之濃度之Phi29聚合酶的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有例如約2 U/µL之濃度之Phi29聚合酶的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有例如約2.5 U/µL之濃度之Phi29聚合酶的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有例如約3 U/µL之濃度之Phi29聚合酶的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有例如約1-1.5、1.5-2、2-2.5或2.5-3 U/µL U/µL之濃度之Phi29聚合酶的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有例如約1-1.5 U/µL之濃度之Phi29聚合酶的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有例如約1.5-2 U/µL之濃度之Phi29聚合酶的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有例如約2-2.5 U/µL之濃度之Phi29聚合酶的混合物中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，使環狀核酸分子及一或多個引子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸之步驟發生於具有例如約2.5-3 U/µL之濃度之Phi29聚合酶的混合物中。
在一些實施例中，滾環擴增之方法不包含熱循環，例如以等溫進行。在一些實施例中，滾環擴增之方法包含置換(例如部分或完全置換)藉由DNA依賴型DNA聚合酶自環狀核酸分子合成之股。在一些實施例中，在滾環擴增之方法中，藉由DNA依賴型DNA聚合酶合成之股釋放至周圍溶液中。在一些實施例中，在滾環擴增方法中，DNA依賴型DNA聚合酶使合成股裂開，藉此釋放合成股。
在一些實施例中，在滾環擴增之方法中，DNA依賴型DNA聚合酶合成產物股，該產物股包含環狀核酸之序列的複數個複本或其片段之複數個複本，該片段包含至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500或4000個其連續核苷酸。在一些實施例中，環狀核酸之序列或其片段之複數個複本串聯排列在產物股中。在實施例中，串聯排列之複數個複本各自由介於0-1、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100個之間的核苷酸(例如約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100個核苷酸)隔開。在一些實施例中，在滾環擴增之方法中，DNA依賴型DNA聚合酶合成包含環狀核酸序列或其片段之一個複本的產物股，該片段包含至少1000、2000、2500、3000、3500或4000個其連續核苷酸。
在一些實施例中，滾環擴增部分之方法藉由PCR，例如使用一或多個泛指環病毒引子驗證，例如如Ninomiya等人. 2008 ( J . Clin . Microbiol .46: 507-514; 關於泛指環病毒引子及與其相關之方法以引用之方式併入本文中)中所述。在一些實施例中，藉由例如如本文所述之滾環擴增方法製備的擴增之核酸分子係藉由例如如本文所述之庫品質控制(QC)技術評定。在實施例中，QC技術包括例如在定序之前，評定庫尺寸。在實施例中，QC技術包括例如在定序之前，評定庫濃度。在一實施例中，使用Agilent Tapestation 4200 (例如，具有D5000篩選膠帶)評定庫尺寸及/或濃度。在實施例中，擴增之核酸分子係藉由凝膠電泳(例如藉由鑑別預期尺寸，例如約110、115、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、140或150 bp之帶的存在)來評定。在一實施例中，帶之預期尺寸為128 bp。
引子本文所述之擴增方法一般涉及使包含指環病毒序列之核酸分子與引子接觸，藉此允許DNA聚合酶(例如DNA依賴型DNA聚合酶)起始自引子之DNA合成。在一些實施例中，本文中所述之方法中所用的複數個引子係基於簡併序列，例如包含一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)可變位置(例如，使得複數種簡併引子可在一或多個可變位置包含複數種不同核苷酸)。在一些實施例中，用於本文所述方法中的引子係對指環病毒序列具有特異性的引子，或該方法使用複數個指環病毒特異性引子。在實施例中，引子包含與指環病毒序列中所包含之核酸序列反向互補的核酸序列，例如如本文所述。在一些實施例中，複數個引子(例如如本文所述)用於本文所述之方法中。在一些實施例中，複數個引子包含具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個或更多個不同序列的引子(例如由於在引子內一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)位置處之簡併)。
在一些實施例中，複數個簡併引子用於本文所述之方法中。在一些實施例中，其中一或多個引子用於本文所述之方法中，第一引子與第二引子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且其中第一引子及第二引子不相同。在一些實施例中，其中一或多個引子用於本文所述之方法中，第一引子與第二引子具有至少70%序列一致性，且其中第一引子及第二引子不相同。在一些實施例中，其中一或多個引子用於本文所述之方法中，第一引子與第二引子具有至少75%序列一致性，且其中第一引子及第二引子不相同。在一些實施例中，其中一或多個引子用於本文所述之方法中，第一引子與第二引子具有至少80%序列一致性，且其中第一引子及第二引子不相同。在一些實施例中，其中一或多個引子用於本文所述之方法中，第一引子與第二引子具有至少85%序列一致性，且其中第一引子及第二引子不相同。在一些實施例中，其中一或多個引子用於本文所述之方法中，第一引子與第二引子具有至少90%序列一致性，且其中第一引子及第二引子不相同。在一些實施例中，其中一或多個引子用於本文所述之方法中，第一引子與第二引子具有至少95%序列一致性，且其中第一引子及第二引子不相同。在一些實施例中，其中一或多個引子用於本文所述之方法中，第一引子與第二引子具有至少96%序列一致性，且其中第一引子及第二引子不相同。在一些實施例中，其中一或多個引子用於本文所述之方法中，第一引子與第二引子具有至少97%序列一致性，且其中第一引子及第二引子不相同。在一些實施例中，其中一或多個引子用於本文所述之方法中，第一引子與第二引子具有至少98%序列一致性，且其中第一引子及第二引子不相同。在一些實施例中，其中一或多個引子用於本文所述之方法中，第一引子與第二引子具有至少99%序列一致性，且其中第一引子及第二引子不相同。
在一些實施例中，本文所述之方法使用複數個引子。在一些實施例中，相對於本文所述之方法之環狀核酸分子，複數個引子共有相同定向。在一些實施例中，複數個引子均為正股引子或均為負股引子。在一些實施例中，複數個引子均為正股引子。在一些實施例中，複數個引子均為負股引子。在一些實施例中，複數個引子包含至少3、4、5、6、7、8、9或10個共同的連續核苷酸。在一些實施例中，複數個引子包含至少3個共同的連續核苷酸。在一些實施例中，複數個引子包含至少4個共同的連續核苷酸。在一些實施例中，複數個引子包含至少5個共同的連續核苷酸。在一些實施例中，複數個引子包含至少6個共同的連續核苷酸。在一些實施例中，複數個引子包含至少7個共同的連續核苷酸。在一些實施例中，複數個引子包含至少8個共同的連續核苷酸。在一些實施例中，複數個引子包含至少9個共同的連續核苷酸。在一些實施例中，複數個引子包含至少10個共同的連續核苷酸。在一些實施例中，複數個引子包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100個或更多個不同引子。在一些實施例中，複數個引子包含至少2個不同引子。在一些實施例中，複數個引子包含至少3個不同引子。在一些實施例中，複數個引子包含至少4個不同引子。在一些實施例中，複數個引子包含至少5個不同引子。在一些實施例中，複數個引子包含至少10個不同引子。在一些實施例中，複數個引子包含至少12個不同引子。在一些實施例中，複數個引子包含至少15、20、25、30、35、40、45或50個不同引子。
在一些實施例中，本文所述方法中所用的引子包含選自表A中所列之引子的核酸序列。在一些實施例中，本文所述方法中所用的引子包含表A中所列之有義序列的核酸序列。在一些實施例中，本文所述方法中所用的引子包含表A中所列之反義序列的核酸序列。在一些實施例中，引子包含選自由以下組成之群的核酸序列：CGAATGGYW (SEQ ID NO: 1)、AAGGGGCAA (SEQ ID NO: 2)、YTGYGGBTG (SEQ ID NO: 3)、YAGAMACMM (SEQ ID NO: 4)、YAARTGGTAC (SEQ ID NO: 5)、SACCACWAAC (SEQ ID NO: 6)、TBGTCGGTG (SEQ ID NO: 7)、CACTCCGAG (SEQ ID NO: 8)、GAGGAGTGC (SEQ ID NO: 9)、CAGACTCCG (SEQ ID NO: 10)、GTGAGTGGG (SEQ ID NO: 11)及CTTCGCCAT (SEQ ID NO: 12)。在一些實施例中，引子包含選自由以下組成之群的核酸序列：WRCCATTCG (SEQ ID NO: 13)、TTGCCCCTT (SEQ ID NO: 14)、CAVCCRCAR (SEQ ID NO: 15)、KKGTKTCTR (SEQ ID NO: 976)、GTACCAYTTR (SEQ ID NO: 977)、GTTWGTGGTS (SEQ ID NO: 978)、CACCGACVA (SEQ ID NO: 979)、CTCGGAGTG (SEQ ID NO: 980)、GCACTCCTC (SEQ ID NO: 981)、CGGAGTCTG (SEQ ID NO: 982)、CCCACTCAC (SEQ ID NO: 983)及ATGGCGAAG (SEQ ID NO: 24)。在一些實施例中，引子包含選自由以下組成之群的核酸序列：CGAATGGYW (SEQ ID NO: 1)、TTGCCCCTT (SEQ ID NO: 14)、YTGYGGBTG (SEQ ID NO: 3)、YAGAMACMM (SEQ ID NO: 4)、GTACCAYTTR (SEQ ID NO: 977)、SACCACWAAC (SEQ ID NO: 6)、CACCGACVA (SEQ ID NO: 979)、CACTCCGAG (SEQ ID NO: 8)、GCACTCCTC (SEQ ID NO: 981)、CAGACTCCG (SEQ ID NO: 10)、CCCACTCAC (SEQ ID NO: 983)及CTTCGCCAT (SEQ ID NO: 12)。在一些實施例中，引子為CGAATGGYW (SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，引子為AAGGGGCAA (SEQ ID NO: 2)。在一些實施例中，引子為YTGYGGBTG (SEQ ID NO: 3)。在一些實施例中，引子為YAGAMACMM (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，引子為YAARTGGTAC (SEQ ID NO: 5)。在一些實施例中，引子為SACCACWAAC (SEQ ID NO: 6)。在一些實施例中，引子為TBGTCGGTG (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，引子為CACTCCGAG (SEQ ID NO: 8)。在一些實施例中，引子為GAGGAGTGC (SEQ ID NO: 9)。在一些實施例中，引子為CAGACTCCG (SEQ ID NO: 10)。在一些實施例中，引子為GTGAGTGGG (SEQ ID NO: 11)。在一些實施例中，引子為CTTCGCCAT (SEQ ID NO: 12)。在一些實施例中，引子為WRCCATTCG (SEQ ID NO: 13)。在一些實施例中，引子為TTGCCCCTT (SEQ ID NO: 14)。在一些實施例中，引子為CAVCCRCAR (SEQ ID NO: 15)。在一些實施例中，引子為KKGTKTCTR (SEQ ID NO: 976)。在一些實施例中，引子為GTACCAYTTR (SEQ ID NO: 977)。在一些實施例中，引子為GTTWGTGGTS (SEQ ID NO: 978)。在一些實施例中，引子為CACCGACVA (SEQ ID NO: 979)。在一些實施例中，引子為CTCGGAGTG (SEQ ID NO: 980)。在一些實施例中，引子為GCACTCCTC (SEQ ID NO: 981)。在一些實施例中，引子為CGGAGTCTG (SEQ ID NO: 982)。在一些實施例中，引子為CCCACTCAC (SEQ ID NO: 983)。在一些實施例中，引子為ATGGCGAAG (SEQ ID NO: 24)。 表 A . 引子之例示性有義序列及反義序列
SEQ ID NO: 有義序列 SEQ ID NO: 反義序列
1 CGAATGGYW 13 WRCCATTCG
2 AAGGGGCAA 14 TTGCCCCTT
3 YTGYGGBTG 15 CAVCCRCAR
4 YAGAMACMM 976 KKGTKTCTR
5 YAARTGGTAC 977 GTACCAYTTR
6 SACCACWAAC 978 GTTWGTGGTS
7 TBGTCGGTG 979 CACCGACVA
8 CACTCCGAG 980 CTCGGAGTG
9 GAGGAGTGC 981 GCACTCCTC
10 CAGACTCCG 982 CGGAGTCTG
11 GTGAGTGGG 983 CCCACTCAC
12 CTTCGCCAT 24 ATGGCGAAG
表 B ： 除非另外規定 ， 否則本文中使用之 UPAC 核苷酸密碼 .
UPAC 核苷酸密碼 鹼基
A 腺嘌呤(A)
C 胞嘧啶(C)
G 鳥嘌呤(G)
T 胸腺嘧啶(T)
R A或G
Y C或T
S G或C
W A或T
K G或T
M A或C
B C或G或T
D A或G或T
H A或C或T
V A或C或G
N 任何鹼基
在一些實施例中，引子包含一或多個硫代磷酸酯修飾(例如受一或多個硫代磷酸酯修飾保護)。在一些實施例中，引子包含1、2、3或4個硫代磷酸酯修飾。在一些實施例中，引子包含1個硫代磷酸酯修飾。在一些實施例中，引子包含2個硫代磷酸酯修飾。在一些實施例中，引子包含3個硫代磷酸酯修飾。在一些實施例中，引子包含4個硫代磷酸酯修飾。在一些實施例中，引子包含位於3'端處之最後2個核苷酸之間的硫代磷酸酯修飾。在一些實施例中，引子包含位於第二與第三3'大部分核苷酸之間的硫代磷酸酯修飾。在一些實施例中，引子包含3'端處之最後3個核苷酸中之每一者之間的2個硫代磷酸酯修飾。在一些實施例中，引子包含3'端處之最後4個核苷酸中之每一者之間的3個硫代磷酸酯修飾。在一些實施例中，引子包含3'端處之最後5個核苷酸中之每一者之間的4個硫代磷酸酯修飾。
樣品及目標序列在一些實施例中，樣品獲自一或多個個體(例如一或多名人類個體，例如一或多名健康或無症狀人類個體)。在一些實施例中，樣品為生物樣品。在一些實施例中，樣品為自一或多個個體(例如一或多名人類個體，例如一或多名健康或無症狀人類個體)獲得之生物樣品。在一些實施例中，生物樣品包含血液或血清。
在一些實施例中，擴增，例如滾環擴增之方法對複數個樣品(例如至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、125、126、127、128、129、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000個樣品)例如同時進行。在一些實施例中，複數個樣品係例如依序或同時自複數個個體(例如人類個體)獲得，例如至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、125、126、127、128、129、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000個個體。在一些實施例中，複數個樣品係自複數個時間點獲得(例如，複數個樣品在多個時間點處自同一個體獲得，或複數個樣品在多個時間點處自複數個個體獲得)。在一些實施例中，複數個樣品自複數種組織或細胞類型獲得，例如至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100種不同組織或細胞類型。
在一些實施例中，樣品包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個不同環狀核酸分子(例如包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個不同指環病毒序列)。在一些實施例中，樣品包含至少2個不同的環狀核酸分子。在一些實施例中，樣品包含至少3個不同的環狀核酸分子。在一些實施例中，樣品包含至少4個不同的環狀核酸分子。在一些實施例中，樣品包含至少5個不同的環狀核酸分子。在一些實施例中，樣品包含至少6個不同的環狀核酸分子。在一些實施例中，樣品包含至少7個不同的環狀核酸分子。在一些實施例中，樣品包含至少8個不同的環狀核酸分子。在一些實施例中，樣品包含至少9個不同的環狀核酸分子。在一些實施例中，樣品包含至少10個不同的環狀核酸分子。在一些實施例中，樣品包含至少2個不同的指環病毒序列。在一些實施例中，樣品包含至少3個不同的指環病毒序列。在一些實施例中，樣品包含至少4個不同的指環病毒序列。在一些實施例中，樣品包含至少5個不同的指環病毒序列。在一些實施例中，樣品包含至少6個不同的指環病毒序列。在一些實施例中，樣品包含至少7個不同的指環病毒序列。在一些實施例中，樣品包含至少8個不同的指環病毒序列。在一些實施例中，樣品包含至少9個不同的指環病毒序列。在一些實施例中，樣品包含至少10個不同的指環病毒序列。在一些實施例中，環狀核酸分子編碼來自指環病毒之基因體序列的一或多個元件。在一些此類實施例中，包含及/或編碼於指環病毒之基因體序列中的一或多個元件包含以下中之一或多者：TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、TAIP、三個開放閱讀框架區、聚(A)信號及/或富含GC之區。
定序 包含指環病毒序列(例如根據本文所述之方法擴增)之核酸分子可根據此項技術中已知之定序方法定序。可使用之定序方法包括傳統桑格定序(Sanger sequencing)以及下一代深度定序方法，其中大量核酸分子以大規模平行方式定序。
在一些實施例中，本文所述之方法進一步包含定序根據本文所述之方法擴增的環狀核酸分子(例如富集包含指環病毒序列之環狀核酸分子)。在一些實施例中，定序包含下一代定序(例如藉由合成定序(例如伊路米那定序(Illumina sequencing))、焦磷酸定序、可逆性終止子定序、藉由接合定序或奈米孔定序)。在一些實施例中，定序包含桑格定序。在一些實施例中，定序包含使用台式定序儀器(例如Illumina iSeq 100或Illumina NextSeq 550)。在一些實施例中，兩種或更多種不同定序方法用於本文所述之方法中。
在一些實施例中，藉由此類方法獲得之複數個定序讀段可經分析且組裝成較大連續序列(在本文中一般稱為片段重疊組)，其對應於源核酸序列之較大部分(例如如本文所述之單一環狀核酸分子)。在一些實施例中，片段重疊組包含指環病毒基因體序列或其連續片段，例如包含至少50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1500、1600、1800、2000、2500或3000個其連續核酸。在一些實施例中，片段重疊組包含編碼以下中之一或多者的指環病毒序列：例如本文所述之指環病毒的TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、TAIP、三個開放閱讀框架區、聚(A)信號及/或富含GC之區，或其片段(例如包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200 300、400、500、600、700、800、900或1000個其連續核苷酸)。在一些實施例中，片段重疊組包含編碼指環病毒ORF1分子或其片段之核酸序列(例如包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200 300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800或2000個其連續核苷酸)。在一些實施例中，片段重疊組包含指環病毒5' UTR之核酸序列或其片段(例如包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100個其連續核苷酸)。
在一些實施例中，指環病毒序列為α細環病毒序列(例如α細環病毒5' UTR序列或α細環病毒ORF1分子編碼序列)。在一些實施例中，指環病毒序列為β細環病毒序列(例如β細環病毒5' UTR序列或β細環病毒ORF1分子編碼序列)。在一些實施例中，指環病毒序列為γ細環病毒序列(例如γ細環病毒5' UTR序列或γ細環病毒ORF1分子編碼序列)。
計算分析 在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含定序結果之計算分析。在一些實施例中，此類計算分析可用於鑑別及/或分類(例如在本文所描述之指環病毒分枝系內)存在於包含經定序之核酸分子的樣品中的一或多個指環病毒株。在一些實施例中，計算分析可用於確定包含經定序之核酸分子的樣品的指環病毒概況或指環體。在一些情況下，計算分析可進一步用於比較來自複數個樣品之指環病毒概況或指環體(例如，以確定一個樣品相對於另一樣品中之某些指環病毒分枝系或病毒株的相對頻率)。
在一些實施例中，計算分析包含鑑別經擴增核酸分子之序列中所表示的一或多個指環病毒序列。在一些實施例中，計算分析包含確定基因體序列或其中所包含及/或編碼之一或多個元件在複數個(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500個)不同擴增核酸分子序列內之序列相似性。在一些實施例中，計算分析包含根據本文所描述之方法測定各樣品、各個體、各組織或細胞類型及/或各時間點所存在的指環病毒序列。在一些實施例中，計算分析包含根據本文所描述之方法測定各樣品、各個體、各組織或細胞類型及/或各時間點所存在之獨特指環病毒譜系。
在一些實施例中，計算分析包含比較存在於樣品中之序列與一或多個參考序列，例如來自資料庫(例如GenBank)之參考序列。在一些實施例中，計算分析包含比較樣品中存在之序列與來自其他已知指環病毒之序列。在一些實施例中，計算分析包含比較樣品中存在之序列與除指環病毒以外的病毒的序列(例如人類乳突病毒HPV、腺相關病毒AAV、登革熱病毒、中東呼吸症候群相關冠狀病毒MERS-CoV、伊波拉病毒、賴薩熱病毒及A型流感病毒、人類免疫缺乏病毒-1 HIV-1)。在一些實施例中，計算分析包含比較一個樣品中存在之序列與另一個樣品。在一些實施例中，計算分析包含比較一個個體中存在之序列與另一個個體。在一些實施例中，計算分析包含比較一種組織或細胞類型中存在之序列與另一種組織或細胞類型(例如同一個體或不同個體中)。在一些實施例中，計算分析包含比較在一個時間點存在之序列與在另一時間點存在之序列(例如比較在一個時間點來自一個體之樣品與在不同時間點(例如稍後時間點)來自同一個體之樣品)。
在一些實施例中，計算分析包含對序列或其部分(例如，包含或編碼以下中之一或多者的部分：TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、TAIP、三開放閱讀框架區、聚(A)信號及/或富含GC區)進行多維縮放(MDS)。在一些實施例中，計算分析包含進行系統發生分析，例如以對存在於一或多個樣品中之複數個指環病毒序列進行分類(例如藉由其序列相似性及/或可能進化歷史)。在一些實施例中，將序列進行比對且簇聚成群組，其中成員在核苷酸層面上至少70%、75%、80%、85%、90%或95%一致。在一些實施例中，將序列進行比對且簇聚成群組，其中成員在核苷酸層面上至少75%一致。在一些實施例中，將序列進行比對且簇聚成群組，其中成員在核苷酸層面上至少80%一致。在一些實施例中，將序列進行比對且簇聚成群組，其中成員在核苷酸層面上至少85%一致。在一些實施例中，將序列進行比對且簇聚成群組，其中成員在核苷酸層面上至少90%一致。在一些實施例中，序列之部分(例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2及/或ORF2/3區)的MDS用於構築最大似然系統發生樹。在一些實施例中，系統發生分析進一步包含重組分析。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別突變。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸內發生的具有至少2、3、4、5或6個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約5個核苷酸內發生的具有至少2個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約7個核苷酸內發生的具有至少2個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約10個核苷酸內發生的具有至少2個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約5個核苷酸內發生的具有至少3個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約7個核苷酸內發生的具有至少3個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約9個核苷酸內發生的具有至少3個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約10個核苷酸內發生的具有至少3個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約11個核苷酸內發生的具有至少3個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約12個核苷酸內發生的具有至少3個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約15個核苷酸內發生的具有至少3個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約7個核苷酸內發生的具有至少4個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約10個核苷酸內發生的具有至少4個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約15個核苷酸內發生的具有至少4個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約10個核苷酸內發生的具有至少5個突變的簇。在一些實施例中，系統發生樹及序列比對用於鑑別在彼此約15個核苷酸內發生的具有至少5個突變的簇。
本文中引用之所有參考文獻及公開案均以引用之方式併入本文中。
提供以下實例以進一步說明本發明之一些實施例，但不意欲限制本發明之範圍；藉由其示例性之性質，應瞭解，可替代地使用熟習此項技術者已知之其他程序、方法或技術。
實例目錄  實例1：人類輸注患者中之指環病毒多次給與 實例2：人類輸注患者中之反覆指環病毒給與 實例3：合成指環載體之製備 實例4：指環載體之組裝及感染 實例5：指環載體之選擇性 實例6：複製缺陷型指環載體及輔助病毒 實例7：複製勝任型指環載體之製造方法 實例8：複製缺陷型指環載體之製造方法 實例9：使用懸浮液細胞產生指環載體 實例10：利用指環載體在小鼠中表現外源性蛋白質 實例11：表現外源性微小RNA序列之指環載體的功能性效應 實例12：用以表現外源性非編碼RNA之指環載體的製備及產生 實例13：來自指環載體之內源性miRNA的表現及內源性miRNA之缺失 實例14：外源性蛋白質之指環載體活體內遞送 實例15：活體外環化指環病毒基因體 實例16：產生含有具有來自不同細環病毒株之高變域的嵌合ORF1的指環載體 實例17：產生含有非TTV蛋白質/肽而非高變域之嵌合ORF1 實例18：基於tth8及LY2之指環載體各自成功地將EPO基因轉導至肺癌細胞中 實例19：在靜脈內(i.v.)投與之後可活體內偵測到具有治療性轉殖基因之指環載體 實例20：活體外環化基因體作為用於活體外產生指環載體之輸入材料 實例21：指環病毒基因體之串聯複本 實例22：來自串聯指環載體構築體之指環載體的有效複製 實例23：例示性串聯指環載體構築體設計 實例24：來自哺乳動物細胞中之串聯指環病毒構築體之基因的轉錄 實例25：由哺乳動物細胞中之串聯指環病毒構築體產生之ORF1及ORF2蛋白質 實例26：串聯指環載體之感染性的評定 實例27：串聯指環病毒基因體經由桿狀病毒遞送至Sf9昆蟲細胞中 實例28：在桿狀病毒表現系統中產生指環病毒蛋白質 實例29：環1 ORF在Sf9細胞中之表現 實例30：環2 ORF在Sf9細胞中之表現 實例31：在Sf9細胞中同時表現所有環2 ORF 實例32：在Sf9細胞中共遞送及獨立表現指環病毒基因體及重組指環病毒ORF 實例33：指環病毒ORF1與Sf9細胞中之DNA結合以形成藉由等密度離心分離之複合物 實例34：使用桿狀病毒自一系列不同的指環病毒表現ORF1蛋白 實例35：桿狀病毒構築體之活體外組裝
實例1：人類輸注患者中之指環病毒多次給與  在此實例中，追蹤接受多次輸血之人類患者的自供體引入之指環病毒株的持久性及與宿主指環病毒株相比之相對持久性。在輸注當日或之前不久獲取血液樣品以建立各患者之原始指環病毒概況。如圖1中所示，監測總共十五個人類輸注接受體用於此研究。為評定輸注之後隨時間推移之指環病毒概況的改變，在輸注之後至多280天定期獲取血液樣品。在研究過程中，自各患者獲取五個樣品，一個在輸注之前獲取且四個在輸注後時間點獲取。一般而言，對於各患者每數週或數月獲取血液樣品。15個接受體中的12個在輸注日期6個月內完成其輸注後所有血液抽取。
評定血液樣品是否存在指環病毒株。簡言之，自血液樣品分離含指環病毒序列之核酸，隨後進行擴增及高通量定序。接著鑑別各樣品中之指環病毒株，藉此在每次取樣時構築特定針對於各患者的指環病毒概況。
此實例中之患者以單次輸注事件自不同供體接受一或多次輸注(亦即，非匹配供體輸注)。接受體血液樣品係在輸注後四次收集，因此可使用上文所描述之方法在輸注接受體中隨時間推移追蹤藉由各供體引入之指環病毒株。藉由比較指環病毒概況隨時間推移之變化，可測定供體指環病毒與接受宿主之原始指環病毒之相對持久性。
此外，亦可評定自各供體引入之指環病毒株之間的相似性。接受與在輸注之前已存在於患者中的彼等指環病毒高度相似的指環病毒的患者實際上接受了指環病毒之再給與。此等患者可接著用作再給與之代表(proxy)，例如以推斷再給與指環病毒是否誘導免疫反應。此處，在接受與輸注前已存在於接受體中的指環病毒高度相似之指環病毒(亦即，ORF1中胺基酸相似性大於90%)的三名患者中鑑別出五種指環病毒。如圖2A及圖2B中所示，此等患者顯示全部三個指環病毒屬(亦即α細環病毒、β細環病毒及γ細環病毒)之代表性再給與。
另外，對標記物SNP之分析指示，代表性再給與病毒株在輸注後在縱向上續存至多167天。高解析度熔融(HRM)分析用於在輸注後時間點偵測及區分輸注接受體中之高度相似的指環病毒株。簡言之，吾等尋找在核苷酸層面上具有＞90%成對一致性之來自供體及在輸注前接受體之病毒株。吾等接著設計將黏接至兩種病毒株且在擴增子內具有至少一個核苷酸差異之引子。使用飽和染料，吾等進行高解析度熔融曲線分析，其基於何種病毒株存在於樣品中產生獨特概況曲線。如圖3中所示，在輸注之後24天，代表性再給與患者之指環病毒概況曲線主要係由患者自身的指環病毒組成。輸注後82天，指環病毒概況曲線係由患者及供體病毒株之混合物組成。到輸注後110-167天時，指環病毒概況曲線主要類似於供體之指環病毒概況曲線。此等資料證明高度相似的再給與供體指環病毒株之相當持久，表明經由血液輸注與已存在於患者中之病毒株高度相似的病毒株進行指環病毒傳輸。
實例2：人類輸注患者中之反覆指環病毒給與  在此實例中，人類患者將接受多次反覆性供體匹配式輸血。簡言之，患者將接受來自特定供體之初始輸注。每一患者將接著接受來自同一供體或相同的多個供體之後續輸血。此將允許吾等追蹤血液中之供體的指環病毒以及感染且續存於接受體中之病毒株的變化，因此亦允許吾等監測經由輸血之指環病毒之可能反覆性再給與。
實例 3 ：合成指環載體之製備此實例展現合成指環載體之活體外產生。
將來自TTMiniV之LY1及LY2病毒株的EcoRV限制酶位點之間的DNA序列(Eur Respir J. 2013年8月;42(2):470-9)選殖至康黴素載體(Integrated DNA Technologies)中。在實例4及5中，基於來自TTMiniV之LY1及LY2病毒株的DNA序列之所得遺傳元件構築體分別被稱為指環載體1 (指環1)及指環載體2 (指環2)。使經選殖構築體轉型至10-β勝任型大腸桿菌(E.coli.)(New England Biolabs Inc.)中，隨後根據製造商方案進行質體純化(Qiagen)。
DNA構築體(圖4及圖5)在37℃下經EcoRV限制消化物(New England Biolabs, Inc.)線性化6小時，得到含有TTMiniV基因體且不包含細菌主鏈元件(諸如複製起點及可選標記物)之雙股線性DNA片段。繼此之後為瓊脂糖凝膠電泳，切除TTMiniV基因體片段(2.9千鹼基對)之恰當尺寸DNA帶，且根據製造商方案使用凝膠提取套組(Qiagen)對來自所切除瓊脂糖帶的DNA進行凝膠純化。
在一些實施例中，根據此實例之方法可用於產生待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體之構築體。
實例 4 ： 指環載體之組裝及感染此實例表明使用如實例3中所描述之合成DNA序列成功活體外產生感染性指環載體。
使用脂質轉染劑(Thermo Fisher Scientific)將雙股線性化凝膠純化的指環病毒基因體DNA (實例3中所獲得)轉染至在完整質體中或在經線性化形式下的HEK293T細胞(人類胚胎腎細胞株)或A549細胞(人類肺癌細胞株)中。使用6 μg質體或1.5 μg經線性化指環病毒基因體DNA來轉染T25燒瓶中70%匯合的細胞。包括於指環載體中之缺乏病毒序列的空載體主鏈係用作陰性對照。轉染後六小時，用PBS洗滌細胞兩次，且使其在37℃及5%二氧化碳下在新製生長培養基中生長。由IDT合成編碼人類EF1α啟動子繼之以YFP基因的DNA序列。此DNA序列鈍端接合至選殖載體(Thermo Fisher Scientific)。所得載體用作對照以評定轉染效率。轉染後72小時使用細胞成像系統(Thermo Fisher Scientific)偵測YFP。HEK293T及A549細胞之轉染效率分別計算為85%及40% (圖6)。
轉染後96小時收集經指環載體轉染之293T及A549細胞的上清液。收集之上清液在4℃下在2000 rpm下短暫離心10分鐘以移除任何細胞碎片。所收集之上清液中之每一者分別用於感染在24孔盤之各孔中70%匯合的新293T及A549細胞。在37℃及5%二氧化碳下培育24小時之後，洗掉上清液，之後用PBS洗滌兩次，且用新製生長培養基置換。在37℃及5%二氧化碳下再培育此等細胞48小時之後，單獨地收集細胞用於基因體DNA提取。根據製造商方案，使用基因體DNA提取套組(Thermo Fisher Scientific)收集來自樣品中之每一者的基因體DNA。
為了確認藉由活體外產生之指環載體對293T及A549細胞之成功感染，使用對β-細環病毒或LY2特異性序列具有特異性之引子，將如本文所描述收集之100 ng基因體DNA用於執行定量聚合酶鏈反應(qPCR)。按照製造商方案，將SYBR綠色試劑(Thermo Fisher Scientific)用於執行qPCR。對GAPDH之基因體DNA序列具有特異性之引子的qPCR用於正規化。使用之所有引子的序列列於表42中。 表 42 ：
引子序列 (5 ' ＞ 3 ')
目標 正向 反向
β細環病毒 ATTCGAATGGCTGAGTTTATGC (SEQ ID NO: 690) CCTTGACTACGGTGGTTTCAC (SEQ ID NO: 693)
LY2 TTMiniV病毒株 CACGAATTAGCCAAGACTGGGCAC (SEQ ID NO: 691) TGCAGGCATTCGAGGGCTTGTT (SEQ ID NO: 694)
GAPDH GCTCCCACTCCTGATTTCTG (SEQ ID NO: 692) TTTAACCCCCTAGTCCCAGG (SEQ ID NO: 695)
如圖7A、圖7B、圖8A及圖8B中所描繪之qPCR結果中所示，活體外產生及如實例中所描述之指環載體為感染性的。
在一些實施例中，根據此實例之方法可用於產生待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體。
實例 5 ： 指環載體之選擇性此實例表明活體外產生之合成指環載體感染多種組織來源之細胞株的能力。
在37℃及5%二氧化碳下在24孔盤之各孔中，將具有感染性TTMiniV指環載體之上清液(描述於實例3中)與70%匯合的293T、A549、Jurkat (急性T細胞白血病細胞株)、Raji (伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤B細胞株)及Chang細胞株一起培育。感染後24小時，用PBS洗滌細胞兩次，之後用新製生長培養基置換。接著再次在37℃及5%二氧化碳下再培育細胞48小時，之後收集用於基因體DNA提取。根據製造商方案，使用基因體DNA提取套組(Thermo Fisher Scientific)收集來自樣品中之每一者的基因體DNA。
為了確認藉由先前實例中產生之指環載體對此等細胞株之成功感染，使用對β-細環病毒或LY2特異性序列具有特異性之引子，將如本文所描述收集之100 ng基因體DNA用於執行定量聚合酶鏈反應(qPCR)。按照製造商方案，將SYBR綠色試劑(Thermo Fisher Scientific)用於執行qPCR。對GAPDH之基因體DNA序列具有特異性之引子的qPCR用於正規化。使用之所有引子的序列列於表42中。
如圖7A-圖11B中所描繪之qPCR結果中所示，活體外產生之指環載體不僅具有感染性，其亦能夠感染多種細胞株，包括上皮細胞、肺組織細胞、肝臟細胞、癌細胞、淋巴球、淋巴母細胞、T細胞、B細胞及腎細胞之實例。亦觀測到合成指環載體能夠感染HepG2細胞(肝臟細胞株)，使得相對於對照增加超過100倍。
在一些實施例中，此實例之方法可使用待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體進行。
實例6：複製缺陷型指環載體及輔助病毒
為了複製及封裝指環載體，一些元件可以反式形式提供。此等包括引導或支援DNA複製或封裝之蛋白質或非編碼RNA。在一些情況下，反式元件可自指環載體之替代來源(諸如輔助病毒、質體)或自細胞基因體提供。
其他元件通常以順式形式提供。此等元件可為例如充當複製起點(例如以允許擴增指環載體DNA)或封裝信號(例如以結合至蛋白質以將基因體負載至衣殼中)之指環載體DNA中之序列或結構。通常，複製缺陷型病毒或指環載體將缺失此等元件中之一或多者，使得即使以反式形式提供其他元件，DNA仍無法封裝至感染性病毒粒子或指環載體中。
複製缺陷型病毒可適用作輔助病毒，例如用於控制相同細胞中之指環載體(例如，複製缺陷型或封裝缺陷型指環載體)的複製。在一些情況下，輔助病毒將缺乏順式複製或封裝元件，但表現反式元件，諸如蛋白質及非編碼RNA。通常，治療性指環載體將缺乏此等反式元件中之一些或全部，且因此將無法自行複製，但將保留順式元件。在共轉染/感染至細胞中時，複製缺陷型輔助病毒將驅動指環載體之擴增及封裝。收集之封裝粒子因此將僅包含治療性指環載體，而無輔助病毒污染。
為產生複製缺陷型指環載體，將移除指環病毒之非編碼區中之保守元件。詳言之，將分別及一起測試保守5' UTR域及富含GC之域的缺失。預期兩種元件對於病毒複製或封裝而言為重要的。另外，將在整個非編碼區上進行系列缺失以鑑別先前未知的所關注區。
複製元件之成功缺失將引起細胞內之指環載體DNA擴增降低，例如如藉由qPCR所量測，但將支援一些感染性指環載體產生，例如如藉由經感染細胞上之分析所監測，該等分析可包括qPCR、西方墨點、螢光分析或發光分析中之任一者或全部。封裝元件之成功缺失將不破壞指環載體DNA擴增，因此藉由qPCR在經轉染細胞中將觀測到指環載體DNA之增加。然而，指環載體基因體將未囊封，因此未觀測到感染性指環載體產生。
在一些實施例中，根據此實例之方法可用於產生待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體。
實例7：複製勝任型指環載體之製造方法
此實例描述一種用於回收且按比例擴大複製勝任型指環載體之生產的方法。當指環載體在其基因體中編碼在細胞中複製所需的所有必需遺傳元件及ORF時，指環載體為複製勝任型。由於此等指環載體在其複製中為非缺陷性的，所以其不需要反式提供的補充活性。然而，其可能需要輔助活性，諸如轉錄增強子(例如丁酸鈉)或病毒轉錄因子(例如腺病毒E1、E2、E4、VA；HSV Vp16及即刻早期蛋白質)。
在此實例中，將編碼呈線性或環狀形式之合成指環載體的完整序列的雙股DNA藉由化學轉染引入至T75燒瓶中之5E+05黏附哺乳動物細胞中，或藉由電穿孔引入至懸浮液中之5E+05細胞中。在最佳時段(例如，轉染後3-7天)之後，藉由將細胞刮至上清液培養基中來收集細胞及上清液。將諸如膽鹽之溫和洗滌劑添加至最終濃度為0.5%，且在37℃下培育30分鐘。將氯化鈣及氯化鎂添加至最終濃度分別為0.5mM及2.5mM。添加核酸內切酶(例如DNA酶I，核酸酶)，且在25-37℃下培育0.5-4小時。將指環載體懸浮液在4℃下在1000×g下離心10分鐘。將澄清上清液轉移至新管中，且用低溫保護緩衝液(亦稱為穩定緩衝液) 1:1稀釋，且必要時儲存於-80℃下。此產生0代指環載體(P0)。為了使洗滌劑濃度低於待在經培養細胞上使用之安全限值，視指環載體效價而定，將此接種物在無血清培養基(SFM)中稀釋至少100倍或更多倍。
使T225燒瓶中之新製哺乳動物細胞單層與足以覆蓋培養物表面之最小體積重疊，且在37℃及5%二氧化碳下在平緩搖動下培育90分鐘。用於此步驟之哺乳動物細胞可能或可能不與P0回收所用之細胞類型相同。在此培育之後，接種物經40 ml無血清、無動物來源之培養基置換。將細胞在37℃及5%二氧化碳下培育3-7天。添加4 mL先前使用之相同溫和洗滌劑的10×溶液以達成0.5%之最終洗滌劑濃度，且接著在平緩攪拌下在37℃下培育混合物30分鐘。添加核酸內切酶，且在25-37℃下培育0.5-4小時。接著收集培養基且在4℃下在1000×g下離心10分鐘。將澄清上清液與40 ml穩定緩衝液混合，且儲存於-80℃下。此產生種子儲備液或1代指環載體(P1)。
取決於儲備液之效價，其在SFM中稀釋不低於100倍，且添加至在所需尺寸之多層燒瓶上生長的細胞。感染倍率(MOI)及培育時間以較小標度最佳化以確保最大指環載體產生。收集後，可接著純化指環載體且視需要濃縮。顯示工作流(例如如此實例中所描述)之示意圖提供於圖12中。
在一些實施例中，根據此實例之方法可用於產生待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體。
實例8：複製缺陷型指環載體之製造方法  此實例描述一種用於回收且按比例擴大複製缺陷型指環載體之生產的方法。
指環載體可藉由參與複製之一或多個ORF (例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3)的缺失而呈現複製缺陷型。複製缺陷型指環載體可生長於補充細胞株中。此類細胞株構成性地表現促進指環載體生長但在指環載體之基因體中為缺失的或無功能性的組分。
在一個實例中，將參與指環載體傳播之任何ORF的序列選殖至適用於產生編碼選擇標記物之穩定細胞株的慢病毒表現系統中，且如本文所描述產生慢病毒載體。能夠支援指環載體傳播之哺乳動物細胞株經此慢病毒載體感染，且藉由選擇標記物(例如嘌呤黴素或任何其他抗生素)經受選擇性壓力以選擇已穩定整合之經選殖ORF的細胞群體。一旦此細胞株經表徵及認證以補充經工程改造指環載體中之缺陷，且因此支援此類指環載體之生長及傳播，則該細胞株經擴增且儲備於低溫儲存器中。在此等細胞之擴增及維持期間，將選擇抗生素添加至培養基中以維持選擇性壓力。一旦將指環載體引入至此等細胞中，則可保留選擇抗生素。
一旦建立此細胞株，便進行複製缺陷型指環載體之生長及生產，例如如實例7中所描述。
在一些實施例中，根據此實例之方法可用於產生待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體。
實例9：使用懸浮液細胞產生指環載體  此實例描述在懸浮液中之細胞中產生指環載體。
在此實例中，使經調適以在懸浮液條件中生長之A549或293T生產細胞株在37℃及5%二氧化碳下在WAVE生物反應袋中在無動物組分及無抗生素懸浮液培養基(Thermo Fisher Scientific)中生長。以1×10 6個活細胞/毫升接種之此等細胞在當前良好作業規範(cGMP)下使用脂染胺2000 (Thermo Fisher Scientific)用包含指環載體序列之質體以及適合或封裝指環載體(例如，在複製缺陷型指環載體之情況下，例如如實例8中所描述)所需的任何補充質體轉染。補充質體可在一些情況下編碼已自指環載體基因體(例如基於病毒基因體(例如指環病毒基因體，例如如本文所描述)之指環載體基因體)缺失，但適合複製及封裝指環載體或其所需的病毒蛋白。使經轉染細胞在WAVE生物反應袋中生長且在以下時間點收集上清液：轉染後48、72及96小時。使用離心自各樣品之細胞集結粒分離上清液。接著使用離子交換層析自收集之上清液及裂解之細胞集結粒純化封裝之指環載體粒子。
可例如如下地確定指環載體之純化製劑中之基因體當量：藉由使用純化製劑之小等分試樣以使用病毒基因體提取套組(Qiagen)收集指環載體基因體，之後使用靶向指環載體DNA序列之引子及探針進行qPCR，例如如PCT/US2018/037379 (以引用之方式併入本文中)之實例18中所描述。
可藉由製備純化製劑之連續稀釋液以感染新A549細胞來定量純化製劑中之指環載體的感染性。轉染後72小時收集此等細胞，之後使用對指環載體DNA序列具有特異性之引子及探針對基因體DNA進行qPCR分析。
在一些實施例中，根據此實例之方法可用於產生待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體。
實例10：利用指環載體在小鼠中表現外源性蛋白質
此實例描述其中細環微型病毒(TTMV)基因體經工程改造以在小鼠中表現螢火蟲螢光素酶蛋白質之指環載體的用途。
將對編碼螢火蟲-螢光素酶基因之經工程改造TTMV之DNA序列進行編碼的質體藉由化學轉染引入至A549細胞(人類肺癌細胞株)中。18 μg質體DNA用於轉染10 cm組織培養盤中70%匯合的細胞。缺乏TTMV序列之空載體主鏈用作陰性對照。轉染後五小時，用PBS洗滌細胞兩次，且使其在37℃及5%二氧化碳下在新製生長培養基中生長。
轉染後96小時收集轉染之A549細胞，以及其上清液。在37℃下用0.5%去氧膽酸鹽(重量/體積)處理收集之物質1小時，之後進行核酸內切酶處理。使用離子交換層析法自此裂解物純化指環載體粒子。為測定指環載體濃度，使指環載體儲備液之樣品穿過病毒DNA純化套組，且使用靶向指環載體DNA序列之引子及探針藉由qPCR來量測基因體當量/毫升。
經由多種注射途徑(例如靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內)在8-10週齡小鼠中進行1×磷酸鹽緩衝鹽水中指環載體之基因體當量的劑量-範圍。注射後3、7、10及15天，對各動物進行腹側及背側生物發光成像。成像藉由根據製造商方案將螢光素酶受質(Perkin-Elmer)在指定時間點時腹膜內添加至各動物，之後活體內成像進行。
在一些實施例中，此實例之方法可使用待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體進行。
實例11：表現外源性微小RNA序列之指環載體的功能性效應  此實例表明使用原生啟動子自指環載體基因體成功表現外源性miRNA (miR-625)。
在24孔盤中將500 ng以下質體DNA轉染至HEK293T細胞之60%匯合的孔中： i)   空質體主鏈 ii)  含有TTV-tth8基因體之質體，其中基因剔除(KO)內源性miRNA iii) TTV-tth8，其中內源性miRNA經非靶向加擾miRNA置換 iv) TTV-tth8，其中內源性miRNA序列經編碼miR-625之miRNA置換
轉染後72小時，使用Qiagen miRNeasy套組自經轉染細胞中收集總miRNA，之後使用miRNA Script RT II套組進行反轉錄。使用應特異性地偵測miRNA-625或RNU6小RNA之引子在反轉錄DNA上進行定量PCR。RNU6小RNA用作管家基因，且資料繪製於圖13中作為相對於空載體之倍數變化。如圖13中所示，miR-625指環載體使得miR-625之表現增加約100倍，而未偵測到空載體、miR-基因剔除(KO)及加擾miR之信號。
在一些實施例中，此實例之方法可使用待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體進行。
實例12：用以表現外源性非編碼RNA之指環載體的製備及產生  此實例描述用於表現外源性小非編碼RNA之指環載體的合成及產生。
將來自TTV之tth8病毒株的DNA序列(Jelcic等人, Journal of Virology, 2004)合成且選殖至含有細菌複製起點及細菌抗生素抗性基因之載體中。在此載體中，編碼TTV miRNA髮夾之DNA序列經置換為編碼外源性小非編碼RNA，諸如miRNA或shRNA之DNA序列。接著將經工程改造構築體轉型至電勝任型細菌中，之後根據製造商方案使用質體純化套組進行質體分離。
將編碼外源性小非編碼RNA之指環載體DNA轉染至真核生產細胞株中以產生指環載體粒子。在轉染後不同時間點收集含有指環載體粒子之經轉染細胞的上清液。來自過濾上清液或純化之後的指環載體粒子用於下游應用，例如如本文所描述。
在一些實施例中，根據此實例之方法可用於產生待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體。
實例13：來自指環載體之內源性miRNA的表現及內源性miRNA之缺失  在一個實例中，使用包含經修飾之TTV-tth8基因體(其中TTV-tth8基因體用富含GC區中之36-核苷酸(nt)序列(CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC (SEQ ID NO: 160))缺失修飾，如PCT/US19/65995 (以引用之方式併入本文中)之實例27中所描述)的指環載體感染培養物中之Raji B細胞。此等指環載體包含編碼TTV-tth8指環病毒(其為靶向編碼n-myc相互作用蛋白質(NMI)之mRNA的miRNA)之內源性有效負載的序列，且由將包含指環病毒基因體之質體引入至宿主細胞中產生。NMI在JAK/STAT路徑下游操作以調節各種細胞內信號之轉錄，該等細胞內信號包括經干擾素刺激之基因、增殖及生長基因及發炎反應之介體。如圖14中所示，在目標Raji B細胞中偵測到病毒基因體。與對照細胞相比，亦在目標Raji B細胞中觀測到NMI之成功阻斷基因表現(圖15)。與對照細胞相比，包含針對NMI之miRNA的指環載體誘導NMI蛋白質含量降低超過75%。此實例表明，具有原生指環病毒miRNA之指環載體可阻斷宿主細胞中之目標分子的基因表現。
在另一實例中，缺失基於指環病毒之指環載體的內源性miRNA。接著將所得指環載體(Δ miR)與宿主細胞一起培育。接著將Δ miR指環載體遺傳元件之基因體當量與其中保留內源性miRNA之相應指環載體的基因體當量進行比較。如圖16中所示，在與針對其中仍存在內源性miRNA之指環載體基因體所觀測到的含量相當的含量下之細胞中偵測到其中缺失內源性miRNA之指環載體基因體。此實例表明，基於指環病毒之指環載體的內源性miRNA可經突變或完全缺失，且仍可在目標細胞中偵測到指環載體基因體。
在一些實施例中，根據此實例之方法可用於產生待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體。
實例14：外源性蛋白質之指環載體活體內遞送  此實例表明在投與之後指環載體之活體內效應功能(例如蛋白質之表現)。
製備包含編碼奈米-螢光素酶(nLuc)之轉殖基因的指環載體(圖17A-圖17B)。簡言之，將含有TTMV-LY2非編碼區及nLuc表現卡匣之雙股DNA質體與編碼完整TTMV-LY2基因體之雙股DNA質體一起轉染至HEK293T細胞中，以充當反式複製及封裝因子。在轉染之後，培育細胞以允許指環載體產生，且收集指環載體物質且經由核酸酶處理、超過濾/透濾及無菌過濾進行富集。額外HEK293T細胞經含有nLuc表現卡匣及TTMV-LY2 ORF轉染卡匣但缺乏複製及封裝必需之非編碼域的非複製DNA質體轉染，以充當「非病毒」陰性對照。根據與指環載體物質相同的方案製備非病毒樣品。
向三個健康小鼠群組肌肉內投與指環載體製劑，且藉由IVIS Lumina成像(Bruker)在九天之時程內進行監測(圖18A)。作為非病毒對照，向三隻額外小鼠投與非複製製劑(圖18B)。第0天向左後腿投與25 µL指環載體之注射液或非病毒製劑，且在第4天向右後腿再投與(參見圖18A及圖18B中之箭頭)。在IVIS成像9天之後，與非病毒製劑(圖18B)相比，在注射指環載體製劑(圖18A)之小鼠中觀測到nLuc發光信號出現更多，其與在活體內指環載體轉導之後的反式基因表現一致。
實例15：活體外環化指環病毒基因體  此實例描述包含具有最小非病毒DNA之環狀雙股指環病毒基因體DNA的構築體。此等環狀病毒基因體更密切地匹配在野生型指環病毒複製期間發現的雙股DNA中間物。當引入至細胞中時，具有最小非病毒DNA之此類環狀雙股指環病毒基因體DNA可經歷滾環複製以產生例如如本文所描述之遺傳元件。
在一個實例中，攜帶TTV-tth8變異體及TTMV-LY2之質體經鑑別側接基因體DNA之位點的限制性核酸內切酶消化。接著使所得線性化基因體接合以形成環狀DNA。此等接合反應在變化的DNA濃度下進行，以使分子內接合最佳化。將接合之環直接轉染至哺乳動物細胞中，或藉由用限制性核酸內切酶消化以裂解質體主鏈且用核酸外切酶消化以降解線性DNA來進一步處理，以移除非環狀基因體DNA。對於TTV-tth8，XmaI核酸內切酶用於使DNA線性化；接合的環含有在富含GC之區與5'非編碼區之間的53 bp非病毒DNA。對於TTMV-LY2，使用IIS型限制酶Esp3I，得到不含非病毒DNA之病毒基因體DNA環。此方案改編自先前公佈之TTV-tth8環化(Kincaid等人., 2013, PLoS Pathogens 9(12): e1003818)。為了證實指環病毒產生之改進，將經環化TTV-tth8及TTMV-LY2轉染至HEK293T細胞中。在培育7天之後，裂解細胞，且進行qPCR以比較經環化之指環病毒基因體與基於質體之指環病毒基因體之間的指環病毒基因體之含量。增加含量之指環病毒基因體顯示，病毒DNA之環化為適用於增加指環病毒產生之策略。
在另一實例中，TTMV-LY2質體(pVL46-240)及TTMV-LY2-nLuc分別經Esp3I或EcoRV-HF線性化。在電溶離或Qiagen管柱純化且用T4 DNA接合酶接合之前，在1%瓊脂糖凝膠上純化經消化質體。在轉染之前在100 kDa UF/DF膜上濃縮環化DNA。如圖19A中所示，環化藉由凝膠電泳確認。在用脂染胺2000進行脂質體轉染之前一天，以3×10 4個細胞/平方公分用HEK293T接種T-225燒瓶。在燒瓶接種後一天，共轉染九微克環化TTMV-LY2 DNA及50 μg環化TTMV-LY2-nLuc。作為比較，額外T-225燒瓶經50 μg線性化TTMV-LY2及50 μg線性化TTMV-LY2-nLuc共轉染。
指環載體產生進行持續八天，在Triton X-100收集緩衝液中收集細胞之前。通常，指環載體可例如藉由宿主細胞之裂解、裂解物之澄清、過濾及層析進行富集。在此實例中，所收集之細胞在氯化鈉調節及1.2 μm/0.45 μm正常流動過濾之前經核酸酶處理。濃縮澄清的收集物，且在750 kDa MWCO mPES中空纖維膜上緩衝交換至PBS中。TFF保留物使用0.45 μm過濾器進行過濾，隨後負載於PBS中之預先平衡的Sephacryl S-500 HR SEC管柱上。指環載體在30 cm/hr下在SEC管柱中處理。收集個別溶離份，且藉由qPCR分析病毒基因體複本數及轉殖基因複本數，如圖19B中所示。在SEC層析圖之空隙體積(溶離份7)開始觀測到病毒基因體及轉殖基因複本。在溶離份15處觀測到殘餘質體峰值。TTMV-LY2基因體及TTMV-LY2-nLuc轉殖基因之複本數與使用在溶離份7-溶離份10處之環化輸入DNA產生的指環載體良好一致，表明含有nLuc轉殖基因之封裝的指環載體。合併SEC溶離份且使用100 kDa MWCO PVDF膜濃縮，且接著在活體內投與之前進行0.2 μm過濾。
在與線性化指環載體DNA相比時，輸入指環載體DNA之環化引起在整個純化過程中受核酸酶保護之基因體的回收百分比增加三倍，表明使用如表46中所示之環化輸入指環載體DNA具有改良的製造效率。 表 46 . 純化過程產率
步驟 經線性化TTMV-LY2 經環化TTMV-LY2
總病毒基因體複本 總 nLuc 轉殖基因基因體複本 總病毒基因體複本 總 nLuc 轉殖基因基因體複本
收集核酸酶前體(pre-nuclease) 2.78E+12 2.17E+12 1.04E+11 4.39E+11
澄清收集物 9.96E+09 5.48E+09 6.55E+08 9.81E+08
TFF 1.01E+10 7.66E+09 2.58E+08 3.56E+08
SEC 3.18E+07 8.73E+06 9.16E+06 7.75E+06
UF/DF 8.82E+06 3.25E+06 1.78E+06 2.73E+06
無菌過濾 5.60E+06 2.64E+06 8.66E+05 1.63E+06
純化過程產率(%) 0.0002% 0.0001% 0.0006% 0.0004%
在一些實施例中，根據此實例之方法可用於產生待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體。
實例16：產生含有具有來自不同細環病毒株之高變域的嵌合ORF1的指環載體  此實例描述ORF1之高變區的域交換以產生含有以下之嵌合指環載體：ORF1富含精胺酸之區、凝膠捲域、N22及一個TTV病毒株之C端域，及來自不同TTV病毒株之ORF1蛋白質的高變域。
已將β細環病毒之全長基因體LY2病毒株選殖至表現載體中以用於在哺乳動物細胞中表現。此基因體經突變以移除LY2之高變域，且將其用遠親β細環病毒之高變域置換(圖19C)。接著使含有具有交換高變域之LY2基因體(pTTMV-LY2-HVRa-z)的質體線性化，且使用先前公佈之方法(Kincaid等人, PLoS Pathogens 2013)環化。使HEK293T細胞經環化基因體轉染，且培育5-7天以允許指環載體產生。在培育期之後，藉由梯度超速離心自經轉染細胞之上清液及細胞集結粒純化指環載體。
為了確定嵌合指環載體是否仍具有感染性，將分離的病毒粒子添加至未感染細胞中。培育細胞5-7天以允許病毒複製。在培育之後，嵌合指環載體建立感染之能力將藉由免疫螢光、西方墨點及qPCR監測。嵌合病毒之結構完整性藉由陰性染色及低溫電子顯微法評定。可進一步測試嵌合指環載體活體內感染細胞之能力。建立經由高變域交換實現產生功能性嵌合指環載體之能力可允許病毒之工程改造以改變趨向性且潛在地避開免疫偵測。
在一些實施例中，根據此實例之方法可用於產生待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體。
實例17：產生含有非TTV蛋白質/肽而非高變域之嵌合ORF1  此實例描述用其他所關注之蛋白質或肽置換ORF1之高變區以產生含有以下之嵌合ORF1蛋白質：富含精胺酸之區、凝膠捲域、N22及一個TTV病毒株之C端域，及非TTV蛋白質/肽而非高變域。
如實例16中所示，LY2之高變域自基因體中缺失且可將所關注蛋白質或肽插入至此區域中(圖19D)。可引入至此區域中之序列類型的實例包括(但不限於)親和標籤、抗體之單鏈可變區(scFv)及抗原肽。如實例16中所描述使質體中之經突變基因體(pTTMV-LY2-ΔHVR-POI)線性化且環化。經環化基因體轉染至HEK293T細胞中且培育5-7天。在培育之後，適當時經由超速離心及/或親和性層析法自上清液及細胞集結粒純化含有POI之嵌合指環載體。
使用多種技術評定產生含有POI之功能性嵌合指環載體的能力。首先，將經純化病毒添加至未感染細胞，以確定嵌合指環載體是否可將有效負載複製及/或遞送至未處理細胞。另外，使用電子顯微法評定嵌合指環載體之結構完整性。對於具有活體外功能性之嵌合指環載體，亦評定活體內複製/遞送有效負載的能力。
在一些實施例中，根據此實例之方法可用於產生待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體。
實例18：基於tth8及LY2之指環載體各自成功地將EPO基因轉導至肺癌細胞中  在此實例中，使用攜載紅血球生成素基因(EPO)之兩個不同指環載體轉導非小細胞肺癌株(EKVX)。指環載體係藉由如本文所描述之活體外環化來產生，且包括基於LY2或tth8主鏈之兩種類型的指環載體。LY2-EPO及tth8-EPO指環載體中之每一者包括遺傳元件，該遺傳元件分別包括EPO編碼卡匣及LY2或tth8基因體之非編碼區(5' UTR、富含GC區)，但不包括指環病毒ORF，例如如PCT/US19/65995(以引用之方式併入本文中)之實例39中所描述。使細胞接種經純化指環載體或陽性對照(在較高劑量或與指環載體相同之劑量下的AAV2-EPO)且培育7天。指環病毒ORF以反式提供於單獨活體外環化DNA中。接種後3、5.5及7天對培養物上清液取樣且使用商業ELISA套組進行分析以偵測EPO。LY2-EPO及tth8-EPO指環載體均成功地轉導細胞，顯示出與未處理(陰性)對照細胞相比顯著更高的EPO效價(在所有時間點P＜0.013)(圖20)。
在一些實施例中，此實例之方法可使用待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體進行。
實例19：在靜脈內(i.v.)投與之後可活體內偵測到具有治療性轉殖基因之指環載體  在此實例中，在靜脈內(i.v.)投與之後活體內偵測到編碼人類生長激素(hGH)之指環載體。基於LY2主鏈及編碼外源性hGH (LY2-hGH)之複製缺陷型指環載體係由如本文所描述之活體外環化來產生。LY2-hGH指環載體之遺傳元件包括LY2非編碼區(5' UTR、富含GC區)及hGH編碼卡匣，但不包括指環病毒ORF，例如如PCT/US19/65995(以引用之方式併入本文中)之實例39中所描述。向小鼠靜脈內投與LY2-hGH指環載體。指環病毒ORF以反式提供於單獨活體外環化DNA中。簡言之，在第0天靜脈內注射指環載體(LY2-hGH)或PBS (n=4隻小鼠/組)。以每隻小鼠4.66E+07個指環載體基因體向獨立動物組投與指環載體。
在第一實例中，偵測指環載體病毒基因體DNA複本。在第7天，收集血液及血漿，且藉由qPCR分析hGH DNA擴增子。在活體內感染後7天之後，LY2-hGH指環載體存在於全血之細胞級分中(圖21A)。此外，血漿中不存在指環載體顯示此等指環載體無法活體內複製(圖21B)。
在第二實例中，在活體內轉導之後偵測到hGH mRNA轉錄物。在第7天，收集血液且藉由qRT-PCR分析hGH mRNA轉錄物擴增子。GAPDH用作對照管家基因。在全血之細胞級分中量測hGH mRNA轉錄物。活體內偵測來自經指環載體編碼之轉殖基因的mRNA(圖22)。
在一些實施例中，此實例之方法可使用待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體進行。
實例20：活體外環化基因體作為用於活體外產生指環載體之輸入材料  此實例表明，作為如本文所描述之指環載體遺傳元件之源材料的活體外環化(IVC)雙股指環病毒DNA在質體中比指環病毒基因體DNA更穩固，得到具有預期密度之經封裝指環載體基因體。
在T75燒瓶中之1.2E+07 HEK293T細胞(人類胚胎腎細胞株)經11.25 μg之(i)活體外環化雙股TTV-tth8基因體(IVC TTV-tth8)、(ii)質體主鏈中之TTV-tth8基因體，或(iii)含有僅TTV-tth8 (非複製TTV-tth8)之ORF1序列的質體轉染。轉染後7天收集細胞，用0.1%曲拉通(Triton)裂解，且用100單位/毫升核酸酶處理。裂解物用於氯化銫密度分析；量測密度且針對各溶離份之氯化銫線性梯度進行TTV-tth8複本定量。如圖23中所示，與TTV-tth8質體相比，IVC TTV-tth8在1.33之預期密度下產生顯著更多的病毒基因體複本。
1E+07個Jurkat細胞(人類T淋巴細胞細胞株)經活體外環化LY2基因體(LY2 IVC)或質體中之LY2基因體核轉染。轉染後4天收集細胞且使用含有0.5%曲拉通及300 mM氯化鈉之緩衝液裂解，之後進行兩輪瞬時凍融。裂解物用100單位/ml核酸酶處理，之後進行氯化銫密度分析。對各溶離份之氯化銫線性梯度進行密度量測及LY2基因體定量。如圖24中所示，Jurkat細胞中之活體外環化LY2基因體的轉染與含有LY2基因體之質體的轉染相比產生在預期密度處之尖峰，其在圖24中未顯示出可偵測之峰。
在一些實施例中，根據此實例之方法可用於產生待用於投與本文所描述之指環載體之方法中的指環載體。
實例21：指環病毒基因體之串聯複本  此實例描述攜帶單個指環病毒基因體之兩個複本的基於質體之表現載體，該等複本以串聯佈置使得上游基因體之富含GC區接近下游基因體之5'區(圖26A)。
在一些實施例中，指環病毒可經由滾環複製，其中複製酶(Rep)蛋白質結合至在指環病毒Rep結合位點處之基因體(例如，如本文所描述，例如包含5' UTR，例如包含髮夾環及/或複製起點)，且起始環周圍的DNA合成。對於質體主鏈中所含之指環病毒基因體，此通常涉及比原生病毒基因體長的完整質體長度的複製，或涉及產生包含具有最小主鏈之基因體之較小環之質體的重組。因此，脫離質體之病毒複製可能為低效的。為了改進病毒基因體複製效率，質體經TTMV-LY2之串聯複本工程改造。不希望受理論所束縛，此等質體可呈現指環病毒基因體之環狀排列，使得不管Rep蛋白質結合之位置如何，其將能夠驅動病毒基因體之複製自上游指環病毒Rep結合位點至下游指環病毒Rep取代位點(例如，包含5' UTR，例如包含髮夾環及/或複製起點，例如如本文所描述)。
串聯TTMV-LY2經由金-門組裝(Golden-gate assembly)來組裝，同時將基因體之兩個複本併入至主鏈中且在基因體之間不留額外核苷酸。串聯TTMV-LY2質體包含指環病毒基因體之兩個相同複本，開始於第一5'NCR至第一富含GC之區，且隨即為第二5'NCR至第二富含GC之區(圖26A)。質體亦包含具有細菌源及可選標記物之細菌主鏈。
攜帶TTMV-LY2之串聯複本的質體經由核轉染轉染至MOLT-4細胞中。具有TTMV-LY2基因體之單個複本的質體類似地轉染為對照。培育細胞四天，接著收集細胞集結粒。各細胞集結粒之部分用於南方墨點法(Southern blotting)。使用Qiagen DNeasy血液及組織套組自細胞分離總DNA。使用限制性核酸內切酶在10µg各總DNA樣品上進行四個替代性消化，該等酶消化對TTMV-LY2基因體及質體具有不同作用之基因體DNA：一個消化未在未切割基因體或質體內切割；第二消化在細菌主鏈，但並非指環病毒基因體內之單一處切割；第三消化在TTMV-LY2基因體內，但並非細菌主鏈內之單一基因座處切割；且最終消化在TTMV-LY2基因體及未在細菌主鏈內切割，但亦包括將消化在細菌中產生之僅輸入質體DNA且未在哺乳動物細胞中複製之DNA內切割的對甲基化敏感之DpnI酶。消化在1xTAE中在0.5V/cm下在7mm厚的1%瓊脂糖凝膠上進行3小時。接著處理凝膠以使DNA脫嘌呤化且變性。接著經由毛細管轉移使DNA轉移至帶正電荷之耐綸膜隔夜。經由紫外光使DNA與膜交聯。接著用針對TTMV-LY2基因體之經無規六聚體產生的片段探測墨點，將生物素-dUTP併入至探針中。使用抗生蛋白鏈菌素結合之IRDye-800偵測探針，且在LiCor Odyssey成像器上成像。
南方墨點法證實，串聯TTMV-LY2質體能夠複製野生型尺寸之環狀雙股指環病毒基因體(圖26B)。對於攜帶TTMV-LY2基因體之單個複本的質體，觀測到4與10 kb之間的未切割超螺旋DNA (泳道1)，當在質體主鏈內(泳道2)或在TTMV-LY2基因體內(泳道3)切割時，其經線性化至5.1 kb。未自具有TTMV-LY2基因體之單個複本的質體觀測到與經回收野生型長度TTMV-LY2基因體(環狀或線性)一致之條帶。具有單個複本之整個質體在MOLT-4細胞中複製，如藉由經線性化質體之DpnI-抗性之複本分解所觀測(泳道4)。然而，未自單個複本之TTMV-LY2質體回收到野生型長度基因體。
對於攜帶TTMV-LY2基因體之串聯複本的質體，觀測到4與10 kb之間的超螺旋質體(泳道5)，當在質體主鏈內切割時，其經線性化至8.8 kb (泳道6)。重要的是，自未切割及主鏈切割泳道中觀測到與雙股DNA TTMV-LY2基因體之單個複本一致的約1.8 kb條帶，與野生型TTMV-LY2基因體之回收一致(泳道5及6)。此在用TTMV-LY2基因體內切割之酶消化時，1.8 kb條帶經與經線性化TTMV-LY2基因體DNA一致之3.0 kb條帶置換(泳道7)。此經線性化TTMV-LY2基因體條帶為DpnI抗性的，表明其在哺乳動物細胞內複製，而非經由串聯DNA之重組產生(泳道8)。連同此等資料證實，野生型長度TTMV-LY2基因體係自MOLT-4細胞中之串聯TTMV-LY2質體回收。
經串聯TTMV-LY2質體轉染之額外細胞集結粒在0.5%曲拉通(Triton)存在下藉由冷凍/解凍裂解，接著在線性CsCl梯度上操作，以自未封裝DNA中分離病毒粒子。溶離份係獲自線性梯度，且使用塔克曼探針對TTMV-LY2基因體序列進行qPCR。在1.30與1.35 g/cm 3之間的CsCl密度下觀測到TTMV-LY2基因體之峰，其中預期發現指環病毒大小的粒子(圖26C)。此指示MOLT-4細胞中產生之TTMV-LY2基因體成功地封裝至病毒粒子中。總體而言，此等資料證實，經工程改造的串聯指環病毒基因體可增加病毒基因體複製且可用作用於增加指環病毒產生之策略。
實例22：來自串聯指環載體構築體之指環載體的有效複製  在此實例中，顯示串聯指環載體成功地在哺乳動物宿主細胞，諸如HEK293或MOLT-4細胞中經歷擴增。建構串聯指環載體構築體以包括指環病毒基因體之兩個全長複本(例如，環1、環2或環4，例如如本文所描述)。基因體之各複本按5'至3'之次序包括：包含高度保守域之5'非編碼區、包含取代原生指環病毒開放閱讀框架之負荷序列的區及包含富含GC區的3' UTR。第一基因體複本之3'端與第二基因體複本之5'端在無介入核苷酸之情況下彼此直接相連。
簡言之，藉由PEI轉染劑或核轉染將構築體引入至HEK293或MOLT-4細胞中。反式複製及封裝元件，包括指環病毒ORF1，係由單獨質體以反式形式提供。在37℃下培育經轉染細胞持續四天。藉由qPCR及南方墨點來量測指環病毒基因體之複製。對於陰性對照，包括攜帶指環載體之單個複本及不含反式元件之串聯指環載體的質體。
實例23：例示性串聯指環載體構築體設計  在下文所描述之實例中，測試用於串聯指環病毒之多個例示性構築體設計在MOLT-4宿主細胞中進行滾環擴增的能力。不希望受理論所束縛，指環病毒滾環擴增經考慮在複製酶結合位點(例如，5' UTR，例如包含髮夾環及/或複製起點)處開始及結束。在環化單個指環病毒基因體中，相同複製酶-結合位點可充當起始及終止位點兩者。串聯指環病毒，以及此實例中所描述之替代性設計，定位在待複製之基因體兩端處之此類複製酶-結合位點，使得基因體如同經環化單個複本基因體一般有效地操作。
具有 3 ' 端上之 部分指環病毒基因體的構築體在此實例中，設計例示性串聯指環載體，其中指環病毒基因體之全長複本位於相對於部分指環病毒基因體之5'。如圖27A中所示，第一替代性構築體( pRTx - 843)按5'至3'之次序包含指環病毒基因體(環2)之全長複本，繼之為由5'NCR、包含病毒開放閱讀框架之全集之區、及缺乏富含GC區的3'NCR組成之部分指環病毒基因體。如圖27A中所示，第二替代性構築體(pRTx-844)按5'至3'之次序包含指環病毒基因體( 環 2)之全長複本，繼之為來自環2之核苷酸1至2812的由5'NCR及包含病毒開放閱讀框架之全集之區組成的部分指環病毒基因體。如圖27A中所示，第三替代性構築體( pRTx - 845)按5'至3'之次序包含指環病毒基因體(環2)之全長複本，繼之為來自環2之核苷酸1至2583的由5'NCR及包含病毒開放閱讀框架之僅一部分的區組成的部分指環病毒基因體。如圖27A中所示，第四替代性構築體( pRTx - 846)按5'至3'之次序包含指環病毒基因體( 環 2)之全長複本，繼之為來自環2之核苷酸1至2264的由5'NCR及包含病毒開放閱讀框架之僅一部分的區組成的部分指環病毒基因體。如圖27A中所示，第五替代性構築體( pRTx - 847)按5'至3'之次序包含指環病毒基因體( 環 2)之全長複本，繼之為來自環2之核苷酸1至723的由5'NCR及包含病毒開放閱讀框架之僅一部分的區組成的部分指環病毒基因體。如圖27A中所示，第六替代性構築體( pRTx - 848)按5'至3'之次序包含指環病毒基因體( 環 2)之全長複本，繼之為來自環2之核苷酸1至423的由5'NCR組成的部分指環病毒基因體。如圖27A中所示，第七替代性構築體( pRTx - 849)按5'至3'之次序包含指環病毒基因體( 環 2)之全長複本，繼之為來自環2之核苷酸1至267的由5'NCR之部分組成的部分指環病毒基因體。
簡言之，藉由核轉染將串聯構築體中之每一者引入至MOLT-4細胞中。用於滾環擴增之複製酶蛋白質係由完全病毒基因體以順式形式提供。ORF1蛋白質係由完全病毒基因體以順式形式提供。
具有兩個完整基因體之全長串聯環2構築體(pVL46-257)係用作用於病毒複製及封裝之陽性對照。對於陰性對照，使用攜帶環2基因體之單個複本的質體(pVL46-240)。在37℃下培育經轉染細胞持續4天，接著收集細胞用於南方墨點及qPCR分析。對於南方墨點，使用Qiagen DNeasy血液及組織套組自細胞分離總DNA，且10 µg總DNA經在質體主鏈中切割一次之酶及消化在細菌中產生之任何輸入DNA的DpnI消化。消化在1xTAE中在0.5V/cm下在7mm厚的1%瓊脂糖凝膠上進行3小時。接著處理凝膠以使DNA脫嘌呤化且變性。接著經由毛細管轉移使DNA轉移至帶正電荷之耐綸膜隔夜。經由紫外光使DNA與膜交聯。接著用針對TTMV-LY2基因體之經無規六聚體產生的片段探測墨點，將生物素-dUTP併入至探針中。使用抗生蛋白鏈菌素結合之IRDye-800偵測探針，且在LiCor Odyssey成像器上成像。應注意，未藉由南方墨點測試來自質體pRTx-845之樣品。對於pRTx-843及844，但並非對於pRTx-846-849，觀測到經複製環狀雙股DNA環2基因體之回收(圖27D)。對於pRTx-843、844及848亦觀測到質體DNA之複製，類似於針對單個複本基因體質體所觀測到的複製。
使用冷凍/解凍及0.5%曲拉通來裂解額外細胞集結粒。裂解物在氯化銫階段梯度上方通過且收集含指環病毒之溶離份。藉由DNA酶保護之qPCR來量測指環病毒基因體之複製。如由完整串聯pRTx-257所觀測，pRTx-843-846產生類似含量之環2病毒基因體/細胞，表明成功產生經殼體包裹之病毒(圖27E)。pRTx-847亦產生受保護之基因體，儘管低於針對完整串聯所觀測到的，而pRTx-848及849未藉由qPCR測試。
具有5'端上之部分指環病毒基因體的構築體  在此實例中，設計例示性串聯指環載體，其中指環病毒基因體之全長複本位於相對於部分指環病毒基因體之3'。如圖27B中所示，測試一系列構築體，使用以下部分環2基因體，繼之以全長環2基因體：pRTx-836，其中部分指環病毒基因體由高度保守5'NCR域、指環病毒開放閱讀框架之全集及包括富含GC區的3'NCR組成(環2核苷酸267至2979)；pRTx-837，其中部分指環病毒基因體由指環病毒開放閱讀框架之全集及包括富含GC區的3'NCR組成(環2核苷酸423至2979)；pRTx-838，其中部分指環病毒基因體由指環病毒開放閱讀框架之部分及包括富含GC區的3'NCR組成(環2核苷酸723至2979)；pRTx-839，其中部分指環病毒基因體由指環病毒開放閱讀框架之部分及包括富含GC區的3'NCR組成(環2核苷酸2273至2979)；pRTx-840，其中部分指環病毒基因體由指環病毒開放閱讀框架之部分及包括富含GC區的3'NCR組成(環2核苷酸2452至2979)；pRTx-841，其中部分指環病毒基因體由包括富含GC區的3'NCR組成(環2核苷酸2812至2979)；及pRTx-842，其中部分指環病毒基因體由富含GC區組成(環2核苷酸2867至2979)。
簡言之，藉由核轉染將串聯構築體中之每一者引入至MOLT-4細胞中。用於滾環擴增之複製酶蛋白質係由完全病毒基因體以順式形式提供。ORF1蛋白質係由完全病毒基因體以順式形式提供。具有兩個完整基因體之全長串聯環2構築體(pVL46-257)係用作用於病毒複製及封裝之陽性對照。對於陰性對照，使用攜帶環2基因體之單個複本的質體(pVL46-240)。在37℃下培育經轉染細胞持續4天，接著收集細胞用於南方墨點及qPCR分析。對於南方墨點，使用Qiagen DNeasy血液及組織套組自細胞分離總DNA，且10 µg總DNA經在質體主鏈中切割一次之酶及消化在細菌中產生之任何輸入DNA的DpnI消化。消化在1xTAE中在0.5V/cm下在7mm厚的1%瓊脂糖凝膠上進行3小時。接著處理凝膠以使DNA脫嘌呤化且變性。接著經由毛細管轉移使DNA轉移至帶正電荷之耐綸膜隔夜。經由紫外光使DNA與膜交聯。接著用針對TTMV-LY2基因體之經無規六聚體產生的片段探測墨點，將生物素-dUTP併入至探針中。使用抗生蛋白鏈菌素結合之IRDye-800偵測探針，且在LiCor Odyssey成像器上成像。對於pRTx-836至839，但並非對於pRTx-840-842，觀測到經複製環狀雙股DNA環2基因體之回收(圖27D)。
使用冷凍/解凍及0.5%曲拉通來裂解額外細胞集結粒。裂解物在氯化銫階段梯度上方通過且收集含指環病毒之溶離份。藉由DNA酶保護之qPCR來量測指環病毒基因體之複製。如由完整串聯pRTx-257所觀測，pRTx-836-840產生類似含量之環2病毒基因體/細胞，表明成功產生經殼體包裹之病毒(圖27E)。對於pRTx-841及842，極少觀測到甚至未觀測到受保護之病毒基因體。
具有兩個部分指環病毒基因體之構築體  在此實例中，例示性串聯指環載體經設計以包含指環病毒基因體之兩個部分複本，該等複本經佈置以使得其充分模擬串聯結構之結構以允許有效的滾環擴增。六個此類排列示於圖27C中：排列1，其自5'至3'包含：在5'NCR保守區起始之部分環2基因體，具有完整環2開放閱讀框架及具有富含GC區的3'NCR (環2核苷酸267至2979)，繼之為具有5'NCR及高度保守區之部分環2基因體(環2核苷酸1至423)；排列2，其自5'至3'包含：以完整環2開放閱讀框架及具有富含GC區的3'NCR起始之部分環2基因體(環2核苷酸423至2979)，繼之為具有5'NCR以及高度保守區及開放閱讀框架之一部分的部分環2基因體(環2核苷酸1至723)；排列3，其自5'至3'包含：以環2開放閱讀框架之部分及具有富含GC區的3'NCR起始之部分環2基因體(環2核苷酸723至2979)，繼之為具有5'NCR及指環病毒開放閱讀框架之部分的部分環2基因體(環2核苷酸1至2273)；排列4，其自5'至3'包含：以部分環2開放閱讀框架及具有富含GC區的3'NCR起始之部分環2基因體(環2核苷酸2273至2979)，繼之為具有5'NCR及指環病毒開放閱讀框架之部分的部分環2基因體(環2核苷酸1至2452)；排列5，其自5'至3'包含：以部分環2開放閱讀框架及具有富含GC區的3'NCR起始之部分環2基因體(環2核苷酸2452至2979)，繼之為具有5'NCR及完整環2開放閱讀框架之部分環2基因體(環2核苷酸1至2812)；及排列6，其自5'至3'包含：在具有富含GC區的3'NCR處起始之部分環2基因體(環2核苷酸2812至2979)，繼之為具有5'NCR及完整環2開放閱讀框架及不含富含GC區的3'NCR的部分環2基因體(環2核苷酸1至2867)。
簡言之，藉由核轉染將串聯構築體中之每一者引入至MOLT-4細胞中。用於滾環擴增及病毒封裝之蛋白質，包括Rep因子及環2 ORF1，自其他質體以反式形式提供。經轉染細胞在37℃下培育4天。藉由qPCR及南方墨點來量測指環病毒基因體之複製。具有兩個完整基因體之全長串聯環2構築體(pVL46-257)係用作用於病毒複製及封裝之陽性對照。對於陰性對照，使用攜帶環2基因體之單個複本的質體(pVL46-240)。
實例24：來自哺乳動物細胞中之串聯指環病毒構築體之基因的轉錄  在此實例中，基於作為主鏈之環1產生一系列指環載體構築體(如圖27F中所指示)。構築體包括串聯構築體，其包含編碼eGFP-ORF1融合蛋白(經密碼子最佳化)之環1序列及串聯環1序列。接著使構築體轉染至Jurkat細胞中。接著藉由對長RNA讀段定序來評定指環病毒(環1) ORF1之轉錄。
如圖27F中所示，與經替代性構築體轉染之Jurkat細胞相比，在經基於環1之串聯GFP構築體轉染的Jurkat細胞中偵測到更大數量之全長環1 ORF1轉錄物。
實例25：由哺乳動物細胞中之串聯指環病毒構築體產生之ORF1及ORF2蛋白質  在此實例中，基於作為主鏈之指環病毒環2產生一系列指環載體構築體(如圖27G中所指示)。構築體包括串聯構築體，其包含呈串聯形式之第一環2序列及第二環2序列。使構築體核轉染至MOLT4細胞(人類T淋巴母細胞細胞株)中，且接著藉由西方墨點偵測環2 ORF1蛋白質。簡言之，1E07 MOLT4細胞經25 μg之含有串聯環2基因體(Rep)之質體或含有149 bp之環2基因體的陰性對照質體核轉染。將經核轉染樣品中之每一者接種於25 mL生長培養基(RPMI+10% FBS+0.01% Polyaxmer+1 mM丙酮酸鈉)中。核轉染後第1天至第3天每日自各樣品粒化1 ml培養物。藉由使細胞再懸浮於50 ul裂解緩衝液(0.5%曲拉通、300 mM NaCl、50 mM Tris，pH 8.0)中，之後進行2輪凍融來裂解粒化細胞。接著藉由在10,000xg下自旋30分鐘使裂解物澄清。20 ul澄清裂解物用於西方墨點分析，以藉由使用針對環2 ORF1培養之兩個兔多株抗體的混合液偵測環2 ORF1蛋白質。
如圖27G中所示，在核轉染之後第2天及第3天，在經基於環2之串聯GFP構築體核轉染之MOLT-4細胞中偵測到環2 ORF1蛋白質。
實例26：串聯指環載體之感染性的評定  在此實例中，產生作為囊封編碼外源性基因之遺傳元件的蛋白質外部之串聯指環載體。產生串聯指環載體，例如如實例21-24中之任一者中所描述。簡言之，宿主細胞經串聯指環載體DNA轉染，且在適用於複製串聯指環載體遺傳元件之條件下培育，且囊封於蛋白質外部內。接著自培養物中分離經囊封指環載體，例如如本文所描述。接著在適用於感染細胞之條件下使指環載體與細胞(例如，MOLT-4或Jurkat細胞)接觸。
感染性可例如使用定量即時PCR (qPCR)偵測經感染細胞中之指環病毒核酸來評定。舉例而言，可收集經感染細胞之DNA，且接著使用對指環病毒特異性序列具有特異性之引子進行qPCR。對例如GAPDH之基因體DNA序列具有特異性之引子的qPCR可用於正規化。qPCR可用於根據所偵測之指環病毒DNA之基因體當量來定量感染性。或者，感染性可藉由偵測外源性基因之表現或外源性基因之下游活性評定。舉例而言，可例如藉由偵測螢光或藉由使用鑑別標記物之抗體的免疫分析偵測外源性螢光標記物，諸如GFP或奈米-螢光素酶。
實例27：串聯指環病毒基因體經由桿狀病毒遞送至Sf9昆蟲細胞中  在此實例中，製備攜帶環2基因體之串聯複本的桿狀病毒且將其遞送至Sf9細胞。串聯環2基因體如上文所描述組裝。全長環2基因體經由PCR添加IIS型限制位點擴增，且經由金門組裝插入至具有細菌複製起點及可選標記物之質體主鏈中。所得質體包含彼此緊接且無介入核苷酸之兩個完全環2基因體，佈置為自5'非編碼區至富含GC區的第一基因體，繼之為自5'非編碼區至富含GC區的第二基因體。基因體對由質體主鏈中之AsiSI及PacI限制酶位點側接。
為了將串聯環2基因體插入至桿狀病毒中，首先組裝經修飾pFastBac。經修飾pFastBac已移除昆蟲-細胞啟動子，且啟動子及標準多選殖位點經含有AsiSI及PacI位點之定製多選殖位點置換。經由用AsiSI及PacI消化，繼之進行接合使串聯環2基因體構築體選殖至pFastBac質體中。最終pFastBac-串聯環2質體包含Tn7L重組序列、串聯環2基因體、健大黴素(Gentamycin)抗性基因及Tn7R重組序列，繼之為具有細菌複製起點及安比西林(ampicillin)抗性標記物之質體主鏈(圖27H)。藉由定序及PCR產物分析確認包括串聯環2基因體。pFastBac用於產生攜帶串聯環2基因體之穿梭載體，之後產生如上文所描述之桿狀病毒。
攜帶串聯環2基因體之桿狀病毒用於在1之MOI下感染Sf9細胞。另外，使樣品包括於經單獨環2 ORF1表現桿狀病毒感染，或經環2串聯基因體桿狀病毒及環2 ORF1表現桿狀病毒共感染的Sf9細胞中。在3天之後，藉由離心使Sf9細胞粒化。使用Qiagen DNeasy血液及組織套組收集總DNA。10µg總DNA經Esp3I限制酶消化，其在緊鄰串聯環2基因體之桿狀病毒內切割(參見圖27I)。經消化DNA在瓊脂糖凝膠上操作。接著使DNA化學變性且脫嘌呤化，且藉由毛細管轉移轉移至帶正電荷之耐綸膜。使DNA與膜UV交聯，接著與針對環2基因體設計之含生物素的探針雜合。使用抗生蛋白鏈菌素-IRDye800偵測探針，且在LiCor Odyssey成像器上成像。
在經串聯環2桿狀病毒感染之所有樣品中觀測到與串聯環2基因體尺寸一致之條帶，表明將串聯環2基因體成功遞送至Sf9細胞(圖27I)。另外，觀測到與自桿狀病毒分離之環2基因體之單個複本一致的條帶，表明一些DNA重組在桿狀病毒產生期間出現，引起在桿狀病毒群體之一部分中環2基因體的一個複本損失。約50%之桿狀病毒顯示單個複本環2基因體而非串聯複本。未自桿狀病毒偵測到環狀環2基因體(與引入至MOLT-4細胞中之串聯環2構築體，其中偵測到環狀單個複本dsDNA基因體相比；圖27I)。然而，此重組未抑制串聯基因體複本成功遞送至SF9細胞。
實例28：在桿狀病毒表現系統中產生指環病毒蛋白質  在此實例中，來自ThermoFisher Scientific之桿狀病毒表現系統(目錄號A38841)適用於表現指環病毒蛋白質。簡言之，將所關注基因(例如編碼如本文所描述之指環病毒ORF的基因)選殖至pFastBac質體中，其接著轉型至含有桿狀病毒基因體之DH10Bac大腸桿菌細胞中。轉型體係根據製造商說明書在指示盤上生長且選擇白色菌落用於液體培養及提取穿梭載體DNA。藉由PCR驗證指環病毒ORF重組至穿梭載體中。
接著將顯示指環病毒ORF基因之成功重組的經驗證穿梭載體構築體轉染至ExpiSf9昆蟲細胞中。細胞在27℃非加濕、非CO 2氛圍培育箱中在設定為125 rpm之定軌振盪器上培育。轉染後72小時之後，自上清液收集第0代儲備(P0)重組桿狀病毒。
使用25-100 μL P0桿狀病毒儲備液感染ExpiSf9細胞以製備用於蛋白質生產之第1代(P1)桿狀病毒。在感染後96小時(約4天)之後，收集上清液以獲得P1桿狀病毒。
P1重組桿狀病毒藉由在新製ExpiSf CD培養基中以1200 μL總體積製備測試病毒之五個10倍連續稀釋液進行滴定。將800 μL Expisf9細胞以1.25×10 6個活細胞/毫升接種於深孔盤中，且將1000 μL測試病毒之不同稀釋液添加至各孔中。將一個孔設定為陰性對照。接著將盤在27℃下在以225±5 rpm之振盪平台上的非加濕培育箱中培育隔夜。在培育大約14-16小時後，自培育箱中移出盤且將所有物質轉移至微量離心管中，且以300×g旋轉5分鐘。抽吸上清液且將各細胞集結粒再懸浮於100 μL含有0.15 μg/mL之最終濃度之抗桿狀病毒包膜蛋白gp64 APC抗體的稀釋緩衝液(PBS+2%胎牛血清)中。將管在室溫下培育30分鐘。樣品接著用1 mL PBS洗滌，之後以300×g離心自旋10分鐘。抽吸上清液且將細胞集結粒再懸浮於1 mL稀釋緩衝液中。在流式細胞儀上使用以下參數分析樣品：紅色雷射激發：633-647 nm；發射：660 nm。記錄具有表現陽性gp64百分比之不同病毒稀釋度的樣品且用於計算病毒效價。
對於此實例及以下實例，使用上文所描述之方法產生一系列重組穿梭載體及桿狀病毒載體用於表現。如下表47中所示，將來自LY2、tth8及其他指環病毒株之各種ORF選殖至穿梭載體中。ORF用有或無人類鼻病毒3C (HRV 3C)蛋白水解裂解位點之N端His標籤、C端His標籤標記或保持未標記，如所指示。 表 47 . 產生之重組穿梭載體構築體。「 FullORF 」 = 含完全 ORF 之 區 ， 其中非編碼區經移除 ； ORF2 / 3 經 標記。
構築體編號 / 名稱 病毒株 環編號 ORF 標籤類型 標籤位置 pFastBac 穿梭載體 桿狀病毒 製造
tth8 ORF1 tth8 環1 ORF1 無標籤 NA 有 有 無 內部
tth8 ORF1 N-His tth8 環1 ORF1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) N-ter 有 有 有 內部
tth8 ORF1 C-His tth8 環1 ORF1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
tth8 ORF2 tth8 環1 ORF2 無標籤 NA 有 有 有 內部
tth8 ORF2 C-His tth8 環1 ORF2 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
tth8 ORF1/1 tth8 環1 ORF1/1 無標籤 NA 有 有 有 內部
tth8 ORF1/1 C-His tth8 環1 ORF1/1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
tth8 ORF1/2 tth8 環1 ORF1/2 無標籤 NA 有 有 有 內部
tth8 ORF1/2 C-His tth8 環1 ORF1/2 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
tth8 ORF2/2 tth8 環1 ORF2/2 無標籤 NA 有 有 有 內部
tth8 ORF2/2 C-His tth8 環1 ORF2/2 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
tth8 ORF2/3 tth8 環1 ORF2/3 無標籤 NA 有 有 有 內部
tth8 ORF2/3 C-His tth8 環1 ORF2/3 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
tth8完全ORF tth8 環1 完全ORF 無標籤 NA 有 有 有 內部
tth8完全ORF C-His tth8 環1 完全ORF 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
tth8 ORF2 C-His tth8 環1 ORF2/ORF1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
環3.1 ORF1 6B.CD8.片段重疊組3 環3.1 ORF1 無標籤 NA 無 無 無 內部
環3.1 ORF1 C-His 6B.CD8.片段重疊組3 環3.1 ORF1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
環3.1 ORF2 6B.CD8.片段重疊組3 環3.1 ORF2 無標籤 NA 無 無 無 內部
環3.1 ORF2 C-His 6B.CD8.片段重疊組3 環3.1 ORF2 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
環3.1 ORF2/ORF1 C-His 6B.CD8.片段重疊組3 環3.1 ORF2/ORF1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
LY2完全ORF LY2 環2 完全ORF 無標籤 NA 有 有 無 內部
LY2完全ORF N-His LY2 環2 完全ORF 6xHis (SEQ ID NO: 1013) N-ter 有 有 有 內部
LY2完全ORF C-His LY2 環2 完全ORF 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF1 LY2 環2 ORF1 無標籤 NA 有 有 無 內部
LY2 ORF1 N-His LY2 環2 ORF1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) N-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF1 C-His LY2 環2 ORF1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF1(dR) LY2 環2 ORF1(△-富含精胺酸區) 無標籤 NA 有 無 無 內部
LY2 ORF1(dR) N-His LY2 環2 ORF1(△-富含精胺酸區) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) N-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF1(dR) C-His LY2 環2 ORF1(△-富含精胺酸區) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF1/1 LY2 環2 ORF1/1 無標籤 NA 有 有 無 內部
LY2 ORF1/1 N-His LY2 環2 ORF1/1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) N-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF1/1 C-His LY2 環2 ORF1/1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF1/2 LY2 環2 ORF1/2 無標籤 NA 有 有 無 內部
LY2 ORF1/2 N-His LY2 環2 ORF1/2 6xHis (SEQ ID NO: 1013) N-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF1/2 C-His LY2 環2 ORF1/2 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF2 LY2 環2 ORF2 無標籤 NA 有 有 無 內部
LY2 ORF2 N-His LY2 環2 ORF2 6xHis (SEQ ID NO: 1013) N-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF2 C-His LY2 環2 ORF2 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF2/2 LY2 環2 ORF2/2 無標籤 NA 有 有 無 內部
LY2 ORF2/2 N-His LY2 環2 ORF2/2 6xHis (SEQ ID NO: 1013) N-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF2/2 C-His LY2 環2 ORF2/2 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF2/3 LY2 環2 ORF2/3 無標籤 NA 有 有 無 內部
LY2 ORF2/3 N-His LY2 環2 ORF2/3 6xHis (SEQ ID NO: 1013) N-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF2/3 C-His LY2 環2 ORF2/3 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF2/ORF1 C-His LY2 環2 ORF2/ORF1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 內部
LY2 ORF1 HisE354 LY2 環2 ORF1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) 在E354之後 有 有 無 內部
LY2 ORF1 HisN299 LY2 環2 ORF1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) 在N299之後 有 有 無 內部
LY2 ORF1 HisL267 LY2 環2 ORF1 6xHis (SEQ ID NO: 1013) 在L267之後 有 有 無 內部
tth8 ORF1 (JA20 HVR) tth8 環1 ORF1 (具有JA20之高變區) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 無 無 內部
tth8 ORF1 (TJN02 HVR) tth8 環1 ORF1 (具有TJN02之高變區) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 無 無 內部
tth8 ORF1 (TTV16 HVR) tth8 環1 ORF1 (具有TTV16之高變區) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 無 無 內部
環2 ORF1 (經密碼子最佳化) LY2 環2 ORF1 (經密碼子最佳化) 無標籤 NA 有 有 有 Medigen
環2 ORF1 (經密碼子最佳化) HRV3C-6His LY2 環2 ORF1 (經密碼子最佳化) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 Medigen
環4 ORF1 (經密碼子最佳化) 6B.CD8.片段重疊組2 環4 ORF1 (經密碼子最佳化) 無標籤 NA 有 有 有 Medigen
環4 ORF1 (經密碼子最佳化) HRV3C-6His 6B.CD8.片段重疊組2 環4 ORF1 (經密碼子最佳化) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 Medigen
環5.2 ORF1 (經密碼子最佳化) CT30F 環5.2 ORF1 (經密碼子最佳化) 無標籤 NA 有 有 有 Medigen
環5.2 ORF1 (經密碼子最佳化) HRV3C-6His CT30F 環5.2 ORF1 (經密碼子最佳化) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 Medigen
環6 ORF1 (經密碼子最佳化) 190783.3 環6 ORF1 (經密碼子最佳化) 無標籤 NA 有 有 有 Medigen
環6 ORF1 (經密碼子最佳化) HRV3C-6His 190783.3 環6 ORF1 (經密碼子最佳化) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 Medigen
環1 ORF1 (CosOpt) His tth8 環1 ORF1 (經密碼子最佳化) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 Medigen
環3.1 ORF1 (經密碼子最佳化) His 6B.CD8.片段重疊組3 環3.1 ORF1 (經密碼子最佳化) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 Medigen
環7 ORF1 (經密碼子最佳化) His 190783.4 環7 ORF1 (經密碼子最佳化) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) C-ter 有 有 有 Medigen
環2 (經密碼子最佳化) N-His LY2 環2 ORF1 (經密碼子最佳化) 6xHis (SEQ ID NO: 1013) N-ter 有 有 有 Medigen
環2 (經密碼子最佳化) N-His (PS) LY2 環2 ORF1 (經密碼子最佳化) 6xHis (SEQ ID NO: 1013)-PreScision蛋白酶識別序列) N-ter 有 有 有 Medigen
環2串聯 LY2 環2 2×全基因體(無多角體蛋白啟動子) 無標籤 NA 有 有 有 Medigen
WTLY2 LY2 環2 全基因體 無標籤 NA 有 有 有 內部
WTtth8 tth8 環1 全基因體 無標籤 NA 有 有 有 內部
WTtth8(反向) tth8 環1 全基因體(具有反向5'多角體蛋白啟動子) 無標籤 NA 有 有 有 內部
LoxPWTLY2 LY2 環2 LoxP-全基因體-LoxP 無標籤 NA 有 有 有 內部
Cre-R NA NA Cre重組酶 無標籤 NA 有 有 有 內部
在感染前一天，ExpiSf9細胞在125 ml Nalgene單次用PETG Erlenmeyer平底燒瓶[Thermofisher Scientific目錄號：4115-0125]中以5x10 6個細胞/毫升接種於25 ml室溫ExpiSf9 CD培養基中。監測細胞存活率以確保其維持在95%或更高。以逐滴方式將100 μL ExpiSf Enhancer溶液添加至細胞中。將細胞在27℃未加濕、空氣調節、非CO 2氛圍培育箱中使用定軌振盪器以125±5 rpm振盪隔夜情況下培育。在第1天，在添加ExpiSf Enhancer之後大約18-24小時，用指定桿狀病毒以5之感染倍率(MOI)感染細胞且在相同條件下培育。在感染後72小時收集細胞且發現存活率在60%與80%之間的範圍內。為分析樣品，藉由添加1× Bolt LDS樣品緩衝液[Invitrogen目錄號：B0007]及1× Bolt還原劑[Invitrogen目錄號：B0009]且超音處理2.5分鐘來裂解細胞。如圖28中所示，C-His標記之LY2 ORF1截至感染後第2天成功表現於經感染ExpiSf9細胞中，如由使用抗聚組胺酸抗體進行西方墨點法所測定。另外，藉由考馬斯(Coomassie)染色法偵測到桿狀病毒蛋白質，指示成功感染。
如圖29中所示，C-his標記之tth8 ORF1及ORF1/1截至感染後第2天亦成功表現於經感染ExpiSf9細胞中。
亦在經感染ExpiSf9細胞中偵測到N端His標記之LY2 ORF1表現(圖30)。此處，構築體包含N端His標籤，其後緊接著為野生型ORF1序列(泳道1、2、9、10或14)，或N端His標籤，其後接著為鼻病毒3C裂解序列(泳道3、11)。泳道1至7中之樣品為直接裝載於凝膠上之裂解物，而泳道9-15中之樣品係藉由首先經由超速離心自條件培養基粒化蛋白質且以小100倍之體積再懸浮集結粒來製備。以小(5 mL)規模生長泳道1-3及9-11中所示之樣品。泳道6及14中之樣品係獲自10L培養物。因此，此實例顯示自複數個具有N端或C端聚組胺酸標籤之病毒株產生ORF1可以5 mL至10 L範圍內之規模成功進行，且ORF1可見於Sf9裂解物或培養物上清液(條件培養基)中。
實例29：環1 ORF在Sf9細胞中之表現
在此實例中，用環1 ORF之替代佈置產生一系列重組桿狀病毒，各ORF標記有C端聚組胺酸(圖31)。重組桿狀病毒設計包括針對環1 ORF剪接變異體(亦即，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2及ORF2/3)中之每一者的一個桿狀病毒構築體，以及含有由桿狀病毒多角體蛋白啟動子驅動之來自環1之完全ORF區的「完全ORF」構築體。此等桿狀病毒係如實例28中所描述產生。
接著藉由西方墨點使用抗聚組胺酸抗體來偵測蛋白質表現。如圖31中所示，偵測到His標記之環1 ORF ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2及ORF2/3。
實例30：環2 ORF在Sf9細胞中之表現  在一個實例中，用環2 ORF之替代佈置產生一系列重組桿狀病毒，各ORF在C端用聚組胺酸標籤進行標記(圖32)。重組桿狀病毒設計包括針對環2 ORF剪接變異體(亦即，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2及ORF2/3)中之每一者的一個桿狀病毒構築體、其中N端富含精胺酸區(RRR)缺失的變異體(ORF1ΔRRR)以及含有來自由桿狀病毒多角體蛋白啟動子驅動之環2之完全ORF區的「完全ORF」構築體。對於各實驗條件，ExpiSf9細胞用表現個別環2變異體之重組桿狀病毒以5之MOI感染。針對此之實驗條件如實例28及29中所描述。
接著使用抗His，藉由西方墨點偵測蛋白質表現。如圖32中所示，His標記之環2 ORF ORF1、ORF1ΔRRR、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2及ORF2/3全部被偵測到。
在作為此實例之一部分的另一實驗中，包含環2 ORF1編碼序列及/或環2 ORF2剪接變異體編碼序列之重組桿狀病毒用於感染Sf9細胞。測試之表現條件包括單獨的ORF1，或ORF1+「完全ORF」、ORF1+ORF2、ORF1+ORF2/2及ORF1+ORF2/3之共感染，以及陰性對照標記之『Neg』。針對各條件，ExpiSf9細胞以5之MOI與桿狀病毒共感染。實驗條件如實例28及29中所描述。接著針對各條件藉由西方墨點使用抗His或抗環2 N22評定ORF1、ORF2、ORF2/2及ORF2/3之蛋白質表現。後者為藉由用大腸桿菌中產生之環2 ORF1之N22片段使小鼠免疫且接著產生融合瘤而獲得的單株抗體。
如圖33中所示，在各ORF1感染條件下，兩個西方墨點均偵測到作為約81kD處之條帶的ORF1。ORF1條帶在抗N22西方墨點中由虛線框突顯，且在陰性對照(Neg)樣品中不可見。藉由兩種抗體偵測到的較低分子量(約10 kD)條帶被視為ORF1之C端片段。亦在對應樣品中偵測到ORF2、ORF2/2及ORF2/3 (抗His墨點)。因此，此實例說明ORF1及ORF2之個別剪接變異體可在昆蟲細胞中共表現。
實例31：在Sf9細胞中同時表現所有環2 ORF  在一個實例中，產生一系列六種重組桿狀病毒，其各自經設計以表現特定環2 ORF(亦即ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2及ORF2/3)，各自用His標籤標記(圖34)，如實例30中所描述。Sf9細胞用環2 ORF桿狀病毒之各種組合感染-特定言之，各情況涉及用除一個ORF構築體以外的所有構築體感染細胞，如圖34中所指示。接著使用抗His藉由全細胞懸浮液之西方墨點來偵測蛋白質表現。如圖34中所示，以預期模式偵測到His標記之環2 ORF。偵測到所有ORF，或除省略之一個ORF以外的所有ORF。
實例32：在Sf9細胞中共遞送及獨立表現指環病毒基因體及重組指環病毒ORF  在此實例中，藉由轉染活體外環化(IVC)指環病毒基因體且用編碼在C端用六-組胺酸(SEQ ID NO: 1013)標記之ORF1的桿狀病毒感染細胞來在Sf9細胞中共遞送指環病毒ORF及基因體(圖35)。接著藉由西方墨點使用靶向N22片段之抗His、抗ORF2及抗ORF1單株抗體來偵測蛋白質表現。如(圖35，項目編號1)所示，在此製劑中偵測到His標記之ORF1，顯示來自桿狀病毒載體之成功重組ORF1表現。與此結果一致，使用抗ORF1抗體偵測到相同ORF1蛋白(圖35，下圖，最右泳道)。
在經處理細胞之相同樣品中，天然指環病毒啟動子在Sf9細胞中顯示轉錄活性，因為偵測到ORF2表現(圖35，項目編號3)且僅可藉由轉染至細胞中之IVC基因體產生。
另外，使用活體外環化(IVC)構築體及完全ORF桿狀病毒，指環病毒ORF共遞送且表現於Sf9細胞中。接著藉由西方墨點，使用抗His、抗環2 ORF2及抗環2 ORF1 N22來偵測蛋白質表現。在細胞中偵測到ORF1蛋白(圖35，項目編號4)且可為IVC或完全ORF桿狀病毒構築體之產物。出人意料地，容易偵測到ORF2蛋白且其強度表明該表現源自完全ORF桿狀病毒構築體(圖35，項目編號2)。
作為指環病毒基因體在昆蟲細胞中表現其基因之能力的另一測試，將tth8指環病毒編碼區在兩個方向上選殖至pFastBac載體中。此產生『完全ORF』tth8桿狀病毒構築體，其中多角體蛋白啟動子定位於編碼區之有義或反義方向上游。後一組態極不可能起始指環病毒基因轉錄。與吾等在環2中出人意料的觀測結果一致，tth8 ORF2之表現獨立於編碼區相對於桿狀病毒多角體蛋白啟動子之定向，表明表現係由指環病毒啟動子驅動(圖36，約15及20 kDa之條帶)。
此實例顯示IVC轉染及桿狀病毒感染可將功能性指環病毒基因共遞送至Sf9昆蟲細胞且天然指環病毒啟動子在此等細胞中具有活性。
實例33：指環病毒ORF1與Sf9細胞中之DNA結合以形成藉由等密度離心分離之複合物  在此實例中，Sf9細胞經IVC指環病毒基因體LY2轉染，經具有C端聚-組胺酸標籤之編碼LY2 ORF1的桿狀病毒感染，且接著分級分離以確定使用桿狀病毒表現系統表現之ORF1是否形成可在活體外分離之蛋白質-DNA複合物。
藉由將8 ml 1.2 g/ml CsCl溶液(於TN緩衝液中；20 mM Tris pH 8.0、140 mM NaCl)添加至SW32.1 Ti轉子之超速離心管(Ultra-Clear 17 ml-Beckman #344061)中來製備CsCl梯度。管用8 ml 40% CsCl (於TN緩衝液中)覆蓋，接著蓋上蓋子且在Gradient Master程式上以5-50%運行13分鐘以製備線性梯度。移除蓋子，且梯度用0.5 ml-2 ml Sf9裂解物覆蓋至各管中，且用含有0.001% Poloxamer-188之TN緩衝液加滿至接近頂部。超速離心在22,500×RPM下持續18.5小時。藉由刺穿管底部自梯度收集級分且允許約600 μl級分流入深孔區塊之孔中。量測各樣品之折射率以測定其密度。
接著藉由首先自級分提取DNA，且接著藉由進行qPCR來測定級分中之指環病毒DNA含量。Pure Link病毒DNA提取套組[ThermoFisher Scientific目錄號12280050]用於自50 μL級分純化病毒DNA。樣品用蛋白酶K處理且使用裂解緩衝液藉由在56℃下培育15分鐘裂解，用99%乙醇洗滌且轉移至Viral Spin Column。樣品以6800×g離心，用套組提供之500 μL洗滌緩衝液洗滌兩次且再次離心。將100 μL無RNA酶之水添加至管柱中以溶離DNA。
對於qPCR，將2×TaqMan基因表現預混液、100μM LY2引子正向(AGCAACAGGTAATGGAGGAC (SEQ ID NO: 997))、100μM LY2反向(TGAAGCTGGGGTCTTTAAC (SEQ ID NO: 998))連同100μM LY2探針(TCTACCTAGGTGCAAAGGGCC (SEQ ID NO: 999))一起稀釋於5.83 μL無核酸酶之水中以用於各反應。以下條件用於各qPCR循環：在Applied Biosystems Quant Studio 3 Real-Time PCR機器上50℃保持2分鐘，95℃保持10分鐘，之後為95℃保持15秒及60℃保持1分鐘的40個循環。一式三份地運行各樣品且重複整個分析三次且用於繪製圖表。
如圖37中所示，等密度級分藉由西方墨點法、定量PCR及穿透式電子顯微法表徵。梯度級分之抗his西方墨點法在密度為1.32 g/mL及1.21 g/mL之級分中針對LY2 ORF1顯示明顯的預期分子量之條帶。另外，介於1.25至1.29 g/mL範圍內的級分具有明顯的比預期分子量更高及更低之條帶。此外，qPCR指示在某些級分中存在LY2基因體DNA，其中峰位於大約1.21 g/mL、1.29 g/mL及1.32 g/mL處。
對1.32 g/mL及1.21 g/mL級分以及1.25至1.29 g/mL範圍內之級分集區進行陰性染色穿透式電子顯微法。該集區顯示大量粒子，包括具有蛋白酶體外觀的若干粒子。蛋白酶體之存在可解釋在低分子量及高分子量下之西方墨點帶。前者可歸因於蛋白水解降解且後者歸因於泛素化ORF1，或在降解過程中與蛋白酶體蛋白質共價結合的ORF1片段。1.21 g/mL級分顯示各種尺寸之粒子，包括似乎與基於脂質之粒子一致的若干粒子。1.32 g/mL級分顯示顯著DNA樣結構，其與裸DNA不同地染色，表明與諸如蛋白質之大分子結合。
為確定LY2 ORF1是否與電子顯微照片中觀測到的結構結合，使用抗聚組胺酸抗體進行免疫金偵測。圖38顯示在1.32及1.21 g/mL級分中觀測到的結構上之金標記積聚，與在1.32 g/mL級分中可見的與DNA結合之ORF1-His的存在及在1.21 g/mL級分中可見之粒子一致。
綜合而言，此等結果顯示，Sf9細胞中表現之ORF1可與DNA結合以形成密度與指環病毒粒子一致的複合物。
實例34：使用桿狀病毒自一系列不同的指環病毒表現ORF1蛋白  在此實例中，Sf9細胞經桿狀病毒感染，該等桿狀病毒經工程改造以表現來自指環病毒株環3.1、環4、環5.2、環6以及環1及環2的C端His標記之ORF1蛋白。如圖39中所示，源自各指環病毒株之ORF1蛋白均成功表現於Sf9細胞中。如 表 Y中所示，測試來自代表所有三個屬(α細環病毒、β細環病毒及γ細環病毒)之病毒株的指環病毒ORF1，且其表現量見於圖28、圖29、圖30及圖39中。一般而言，吾等發現在此系統中，來自β細環病毒之ORF1的表現量最高，γ細環病毒中等，且α細環病毒最低。 表 Y . 重組 ORF1 表現成功之病毒株
名稱 屬
環1 α
環2 β
環3.1 γ
環4 γ
環5.2 α
環6 α
HLH β
ctgh3 β
LY1 β
實例35：桿狀病毒構築體之活體外組裝  在此實例中，藉由活體外組裝產生適用於表現指環病毒蛋白質(例如ORF1)之桿狀病毒構築體。
編碼指環病毒ORF1 (野生型蛋白、嵌合蛋白或其片段)之DNA表現於昆蟲細胞株(Sf9及/或HighFive)中，該ORF1可未標記或含有在N端、C端融合之標籤，或在ORF1蛋白本身中攜帶突變以引入標籤，以經由免疫染色分析(諸如但不限於ELISA或西方墨點)幫助純化及/或一致性確定。指環病毒ORF1可單獨或與任何數目之輔助蛋白質組合表現，該等輔助蛋白質包括但不限於指環病毒ORF2及/或ORF3蛋白質。
蛋白質使用開發的純化技術純化，該等技術潛在地包括但不限於螯合純化、肝素純化、梯度沈降純化及/或尺寸排阻純化。評估ORF1形成衣殼體或VLP之能力且用於核酸衣殼化之後續步驟中。
在一個實例中，編碼與N端HIS 6-標籤(SEQ ID NO: 1013)融合之環2 ORF1 (HIS-ORF1)的DNA經密碼子最佳化以用於昆蟲表現，且選殖至桿狀病毒表現載體pFASTbac系統中，以根據製造商的方法使用Bac-至-BAC表現系統(ThermoFisher Scientific)產生表現環2 ORF-HIS重組蛋白質的桿狀病毒。10公升昆蟲細胞(Sf9)經環2 HIS-ORF1桿狀病毒感染且在感染後3天藉由離心收集細胞。細胞經裂解，且使用本領域中之標準技術，使用螯合樹脂管柱純化裂解物。對含有HIS-ORF1之溶離份進行滲析且用DNA酶處理以消化宿主細胞DNA。所得物質再次使用螯合樹脂管柱純化且保留含有ORF1之溶離份用於核酸衣殼化及病毒載體純化。
核酸衣殼化及病毒載體純化 ：環ORF1 (野生型蛋白、嵌合蛋白或其片段)用足以解離VLP或病毒衣殼之條件處理，以使得能夠與核酸負荷重組。核酸負荷可定義為雙股DNA、單股DNA或編碼希望遞送作為治療劑之所關注基因的RNA。足以解離VLP或病毒衣殼之潛在條件可為但不限於不同pH之緩衝液、限定電導率之條件(鹽含量)、含有洗滌劑之條件(諸如SDS、吐溫(Tween)、曲拉通)、含有離液劑之條件(諸如脲)或涉及限定溫度及時間之條件(重黏合溫度)。限定濃度之核酸負荷與限定濃度之環ORF1組合且用足以允許核酸衣殼化之條件處理。所得粒子(定義為病毒載體)隨後例如使用開發的標準病毒純化程序純化。
在一個實例中，將GFP表現質體之單股環狀DNA添加至環2 HIS-ORF1之溶液中，且將所得樣品在37℃下用含0.1% SDS之50 mM Tris pH 8緩衝液處理30分鐘。所得溶液使用肝素管柱進一步純化且使用增加NaCl濃度之梯度自管柱溶離病毒載體。病毒載體之完整性藉由轉導細胞株EKVX及HEK293，且藉由螢光顯微法觀測至少一個細胞株中的GFP產生來測試，表明藉由ORF1蛋白對核酸負荷之衣殼化以形成病毒載體。
實例 36 ： 指環病毒基因體資料集之產生在此研究中，對輸血供體-接受體對進行深入定序與公共基因體資源相結合以用於新穎指環病毒基因體之大規模組裝，以表徵總體及個人指環病毒隨時間推移之多樣性。開發了靶向指環病毒定序方法，其允許直接自人類樣品對指環病毒進行大規模概況分析，且用於研究來自由供體-接受體對組成之輸血群組的縱向樣品。針對個體內及個體之間的指環體之動力學及傳輸性，組裝大規模序列資料集且加以研究。結果顯示，指環體之廣度(在本文中用於提及個體或群體中所存在之指環病毒株或變異體之集合及/或其中此類指環病毒株或變異體之相對數量)比先前所瞭解的要大，且個體攜帶及傳輸可續存至少若干個月之多個獨特指環體。另外，其顯示指環病毒多樣性與廣泛重組有關。
簡言之，對來自國家心肺血液研究所(National Heart, Lung & Blood Institute，NHLBI)之縱向傳播傳輸病毒研究(Transfusion-transmitted Viruses Study，TTVS)的血液及血清樣品進行篩選以鑑別新指環病毒序列。自TTVS獲得血清樣品(寄存編號HLB01910909a)。使用來自Invitrogen之purelink病毒DNA/RNA套組自200 µl血清提取核酸。將樣品根據製造商方案進行處理，其中對於蛋白酶K培育則增加至60 min。將樣品溶離在50 μL無核酸酶水中。
開發及採用特異性靶向指環病毒基因體序列之擴增方法，以增加在TTVS群組之各個體中所鑑別之指環病毒基因體序列的產量。因此，該方法能夠發現數十至數百種新穎指環病毒譜系。擴增方法採用倍增引發之滾環式擴增，其利用覆蓋指環病毒基因體之保守區的簡併擴增引子。簡併擴增引子經設計以基於由pubmed及元基因體資料庫上之公開基因體產生的指環病毒科基因體之比對來覆蓋充分保守區(參見下表1)。引子受3'處之最後三個核苷酸中之每一者之間的兩個硫代磷酸酯修飾保護。靶向滾環式擴增方法含有將根據表1中所示之12個序列的最終濃度各為0.4 µM之指環特異性引子、1×phi29 DNA聚合酶緩衝液(NEB)、2 µl DNA樣品及dH 20 (最終體積為10 µl)進行預混合。接著，使DNA混合物在95℃下變性3分鐘且冷卻至4℃，隨後置於冰上。接著將變性樣品添加至10 µl擴增溶液，其含有指環特異性引子(最終濃度各為0.4 µM)、1×phi29 DNA聚合酶緩衝液(NEB)、200 ng/µl牛白蛋白血清、1 mM dNTP及2 U/µl phi29聚合酶及dH 20 (最終濃度為10 µl)。將樣品在30℃下培育20小時，隨後使酶在65℃下失活10分鐘。最終產物接著藉由添加無核酸酶水以降低樣品之黏度來稀釋至50 µl，且藉由Qubit評估DNA之濃度。Nextera Flex(Illumina ect)套組用於製備樣品以遵循製造商方案針對100-500 ng輸入物進行定序。藉由使用D5000篩選膠帶在Agilent Tapestation 4200上進行庫QC。 表 1 . 例示性指環病毒特異性簡併引子
引子名稱 序列 SEQ ID NO:
TTV-RCA-1 CGAATGG*Y*W 1000
TTV-RCA-2 TTGCCCC*T*T 1001
TTV-RCA-3 YTGYGGB*T*G 1002
TTV-RCA-4 YAGAMAC*M*M 1003
TTV-RCA-5 GTACCAYT*T*R 1004
TTV-RCA-6 SACCACWA*A*C 1005
TTV-RCA-7 CACCGAC*V*A 1006
TTV-RCA-8 CACTCCG*A*G 1007
TTV-RCA-9 GCACTCC*T*C 1008
TTV-RCA-10 CAGACTC*C*G 1009
TTV-RCA-11 CCCACTC*A*C 1010
TTV-RCA-12 CTTCGCC*A*T 1011
* = 硫代磷酸酯鍵
所有庫在illumina iSeq 100或NextSeq 550上定序。使用kraken(Wood及Salzberg, 2014)針對自定義內部構築之指環病毒資料庫使用預設參數產生原始定序讀段中之指環病毒含量的初始讀取。使用NCBI之BLASTn(Camacho等人, 2009)使用預設參數進一步驗證此等所得分類序列，以證實來自kraken之輸出為有效的指環病毒序列。使用FastQC (Andrews,無日期(n.d.))在各成對端讀段集上對原始定序讀段進行品質控制，以量測關於各定序運行之各種統計資料。使用MultiQC (Ewels等人, 2016)將FastQC生成之報告中之每一者匯合為單個報告。來自此等報告之量度影響分析期間進一步下游的品質控制步驟之參數選擇。
使用具有以下參數之bbduk (Bushnell, 2014)移除低品質序列資料及共同銜接子： ktrim = r， k = 23， mink= 11， tpe = t, tbo = t， qtrim = rl， trimq = 20， minlength = 50， maxns= 2。藉由自覆蓋若干細菌物種之NCBI GenBank拉取目標污染物序列以及待移除之人類遺傳元件來組裝經提供之污染物檔案。含有特定序列之寄存清單提供於補充資料中。
接下來，使用NextGenMap (Sedlazeck等人, 2013)及BWA (Li, 2013)兩者針對人類參考基因體之GRCh37/hg19建構以兩次移除人類序列。以參數 -- affine、 - s 0 . 7、 - p運行NextGenMap且以預設參數運行BWA。使用SAMtools (Li等人, 2009)及Picard(Broad Institute, 2018)之經組配有參數 VALIDATION _ STRINGENCY = 「 silent 」的SamToFastq公用程式，將以SAM檔案格式輸出之映射讀段轉換為成對端FASTQ格式。使用具有以下參數之bbmap (Bushnell, 2014)移除rRNA污染物及常見實驗室細菌污染物： minid = 0 . 95， bwr = 0 . 16， bw = 12， quickmatch = t， fast = t， minhits = 2。所篩選之所有參考序列之解釋可見於所提供之補充資料中。最後，吾等使用經組配有參數 dedupe = t之clumpify (Bushnell, 2014)對通過所有QC及去污步驟之短讀段資料進行去重以加速基因體組裝且幫助提高基因體組裝品質。
使用metaSPAdes (Nurk等人, 2017)經由使用 -- only - assembler參數跳過誤差校正模組來對微調、去污及去重定序資料進行組裝。使用經組配有參數 out _ format 1、 - lc _ method dust及 lc _ threshold 20之PRINSEQ精簡版(Schmieder及Edwards, 2011)篩選經組裝之片段重疊組。自各樣品組裝之片段重疊組以99.5%相似性簇聚，以使用usearch軟體之 cluster _ fast演算法(Edgar, 2010)移除任何重複序列。
使用orfm (Woodcroft等人, 2016)自經組裝之片段重疊組調用ORF序列，其中orfm的參數組配為列印終止密碼子( - p)及在與終止密碼子相同之框架中列印ORF( - s )，且限定ORF序列不短於50個胺基酸( - m 150)。經預測之ORF序列係使用序列seqkit之 seq及 grep公用程式(Shen等人, 2016)進一步篩選以將ORF序列細分為ORF1、ORF2及ORF3。ORF1序列係藉由使用seqkit grep篩選不短於600個胺基酸之ORF序列( - m 600 )且使用seqkit grep以僅搜尋序列資料( - s)、啟動regex型態搜尋( - r)且藉由查詢保守模體YNP X 2 D XG X 2 N (SEQ ID NO: 829) ( - p 「 YNP .{ 2 } D . G .{ 2 } 」)來鑑別。ORF2序列係使用先前在文獻(Takahashi等人, 2000)中所鑑別之保守模體W X 7 H X 3 C XC X 5 H (SEQ ID NO: 1012)經由seqkit之 grep公用程式( - p 「 W .{ 7 } H .{ 3 } C . C .{ 5 } H 」)來鑑別。除ORF1及ORF2以外，亦在TTVS資料集中471個指環病毒基因體中之ORF1之3'端附近預測第三開放閱讀框架(ORF3)。ORF3使用ORF1所使用之終止密碼子下游的終止密碼子且後一終止密碼子之閱讀框架與ORF1及ORF2之終止密碼子不同。ORF3閱讀框架中經標記ORF2/3之蛋白質先前已經表徵為人類指環病毒(Qiu等人, 2005)且對諸如海豹、貓及大猩猩之其他物種進行感染之指環病毒的研究(Hrazdilová等人, 2016)(Fahsbender等人. 2017；Zhang等人. 2016；Hrazdilova等人2016)已顯示ORF3之證據。經由MEME (Bailey等人. 1994)對471個ORF3序列(中值長度：68aa，最小長度：50aa，最大長度：159aa)進行解析揭示兩個先前未知的且高度保守的模體位於ORF3之3'端附近的存在。在471個序列中之467個中觀測到模體1 (26 aa) (99%)，而在471個序列中之463個中觀測到模體2 (5 aa) (98%) (圖42B)。根據orfm之功能，鑑別為ORF1、ORF2或ORF3之ORF序列常常含有在典型起始密碼子上游的肽。此等序列經由搜尋自5'端定位之第一個甲硫胺酸的內部編寫python語言腳本修整成適當的起始及終止密碼子，且在ORF1的情況下，藉由首先定位富含精胺酸區及定位上游的第一個甲硫胺酸來預測起始密碼子。在一些情況下，藉由僅在富含精胺酸區上游搜尋胺基酸亦即蘇胺酸-脯胺酸-色胺酸或蘇胺酸-丙胺酸-色胺酸來預測非典型起始密碼子作為ORF1起始密碼子。
藉由使用usearch軟體(Edgar, 2010)及 cluster _ fast演算法，以97.5%相似性簇聚ORF1序列來鑑別存在於各供體樣品中之獨特譜系集，估算供體-接受體資料集之每個縱向時間點各樣品中之個別指環病毒譜系的比例估值。接著在接受體縱向樣品中藉由使用Novoalign軟體(Novocraft,無日期)將所衍生之短讀段定序資料相對於該等縱向樣品映射來搜尋此等獨特供體衍生之指環病毒譜系，該軟體具有以下參數： - H 15、 - l 30、 - t 500、 - r Random、 - g 50、 - x 6、 - F STDFQ。
所得BAM映射檔案用於藉由自定義腳本使用下式計算各供體譜系之相對指環病毒比例估值：
Figure 02_image003
各供體-接受體資料集中所有供體譜系之相對比例一起整理成一個制表符分隔之檔案用於進一步下游分析。
使用ggplot2 (Wickham, 2016,第2頁)及ggTimeSeries封裝以R (R Core Team, 2013)生成描繪個體中指環病毒比例隨時間推移之變化的流圖圖式。
在QuantStudio 3.0熱循環儀(Applied Biosystems, Thermo)中，使用MeltDoctor HRM主混合物(Applied Biosystems, Thermo)在10 µl反應體積中進行高解析度曲線分析。對所有試樣進行重複三次測試且其熔融概況曲線使用高解析度熔融v3.1軟體(High Resolution melt v3.1 software)及根據製造商提供之HRM演算法分析。對接受體及供體(＞95%成對一致性)中病毒株之ORF1區進行選殖及桑格(Sanger)定序，隨後進行高解析度熔融。樣品中不同對偶基因之表徵係基於其熔融曲線確定。
為驗證新型指環病毒序列發現方法，量測標準滾環式擴增(RCA)方法(Niel等人, 2005)與本文所描述之新發現方法之間的指環病毒基因體序列產量的差異。與標準RCA相比，新發現方法引起自來自吾等TTVS群組之血清樣品量測的指環病毒覆蓋度之1,046至52,812倍增加(表2)。 表 2 . 新穎發現方法之基準評效
樣品 RCA 類型 總讀段 TTV 讀段 TTV 百分比 倍數變化
   R04D01 無規六聚體 722,717 0 0.000%    ∞
TTV-RCA 642,901 85,530 13.46%
   R04D02 無規六聚體 823,172 19 0.002%    1,046
TTV-RCA 622,596 15,026 2.41%
   R04T00 無規六聚體 798,299 1 0.000%    41,894
TTV-RCA 304,654 15,988 5.25%
   R04T01 無規六聚體 759,930 168 0.022%    3,083
TTV-RCA 785,323 535,237 68.16%
   R04T02 無規六聚體 649,627 5 0.001%    21,073
TTV-RCA 595,526 96,592 16.22%
   R04T03 無規六聚體 732,105 6 0.001%    52,812
TTV-RCA 528,421 228,715 43.28%
   R04T04 無規六聚體 434,485 11 0.003%    10,060
TTV-RCA 409,314 104,244 25.47%
確定縱向樣品中之指環病毒存在，以便定量各時間點處之指環病毒譜系之數目且量測各個體中所發現之多樣性。新發現方法應用於來自67個個體之128個樣品。總共有53個年齡在17歲及62歲(中值年齡：34)範圍內之健康志願者供體(21名女性，32名男性)及15個接受體，其詳情提供於表3中。亦檢驗75個縱向接受體樣品。樣品取自五個時間點範圍內(一次在輸注前，四次在輸注後)。來自供體及接受體之序列讀段繪製於圖40中，其顯示來自供體及接受體樣品之全部讀段以及指環病毒讀段。總計，回收300.1 Gbp之序列資料，其中159.6 Gbp來源於指環病毒。根據序列資料，鑑別1,656個高品質指環病毒片段重疊組(中值長度=2,916bp，最小長度=2,190bp，最大長度=4,917bp)。先前鑑別之指環病毒基因體獲自NCBI GenBank儲存庫(Benson等人, 2012；以全文引用之方式併入本文中)，以產生用於比較之已知序列之基線。根據大小篩選來自儲存庫之序列，且移除非人類及公開之指環病毒序列以產生445個經篩示(curated)之序列的集合。建立含有2,101個指環病毒序列之合併資料集用於進一步下游分析。 表 3 . 接受體人口統計資料
接受體 性別 年齡 手術程序
R01 女性 62 膝關節置換術
R02 男性 27 頸動脈內膜切除術
R03 男性 57 CABG
R04 男性 54 膝關節置換術
R05 女性 64 主動脈瓣膜置換術
R06 男性 50 CABG
R07 女性 59 二尖瓣置換術
R08 男性 46 CABG
R09 女性 38 頸部手術
R10 男性 20 主動脈瓣膜置換術
R11 男性 61 CABG
R12 女性 20 剖腹產手術
R13 男性 57 主動脈瘤修復
R14 女性 65 直腸乙狀結腸切除術
R15 女性 21 CABG
實例 37 ： 指環病毒基因體之系統發生分析在此研究中，經由對來自實例36中所描述之指環病毒序列資料集的ORF1序列進行同源性及系統發生分析評估人類指環病毒之多樣性。經由鑑別N22區中發現之新穎胺基酸模體YNP X 2 D XG X 2 N (SEQ ID NO: 829)，自1,177個新穎指環病毒序列之集合分離1,177個ORF1序列。國際病毒分類委員(ICTV)提出之35%序列相似性截止值(Adams等人, 2016)過分限制而不能充分表徵資料集之亞種，因此1,177個ORF1序列被定義為不同指環病毒譜系，其中存在至少97.5%相似性。813個獨特ORF1序列因此歸類為屬於不同的指環病毒譜系。在此等813個ORF1序列中，767個(94%)基於大於或等於NCBI RefSeq非冗餘蛋白質(nr)資料庫中發現之全部指環病毒序列之25%的序列相異性歸類為獨特的(O'Leary等人, 2016)。
人類指環病毒已在分類學上分類成三個廣泛屬，亦即α細環病毒、β細環病毒及γ細環病毒。將公開可獲得的及新描述之指環病毒序列分成三個屬，其中有689個α細環病毒序列、619個β細環病毒序列及271個γ細環病毒序列，且修整成ORF1區。使用MAFFT (FFT-NS-i×1000設定)及所計算胺基酸序列之間的成對距離來轉譯及比對ORF1序列。所有三種比對(α、β及γ)接著使用MAFFT (G-INS-i設定)進行共有序列比對。使用RAxML (CAT序列進化模型，BLOSSUM62取代矩陣)構築所有2,101個指環病毒衣殼蛋白(來自TTVS群組之1,177個及449個經下載自NCBI GenBank)的最大似然系統發生學，且揭示來自TTVS群組之序列分成三個屬，從而使得α細環病毒、β細環病毒及γ細環病毒屬中之序列數目分別增加了28%、27%及15% (圖41，圖A)。
系統發生分析根據以下假設操作：所分析之生物體遵循純系進化模型。然而，由於重組可能在已觀測到之遺傳變異中起重要作用，純系模型可能不足以分析此等研究中所建立之序列資料集。為進一步表徵指環病毒多樣性程度，使用多維縮放(MDS)分析指環病毒ORF1序列。另外，比較指環病毒ORF1序列之多樣性與在以下八個其他適合之候選表面蛋白質中發現之多樣性：DNA病毒(指環病毒、人類乳突病毒(HPV)、腺相關病毒(AAV))；未知重組之反義單股RNA病毒(A型流感病毒第2組、伊波拉病毒、拉沙病毒)；及已知重組之正義單股RNA病毒(HIV1、登革熱病毒、MERS冠狀病毒)。跨越三個各展現緩慢或快速進化速率、單股或雙股分子且已知或未知重組之不同族群選擇病毒，以提供針對具有廣泛多樣性程度之病毒的比較。人類乳突病毒(HPV，多樣性涵蓋HPV 41型)晚期蛋白質(L1)、腺相關病毒(AAV，人類中所發現之所有多樣性)衣殼蛋白、登革熱病毒(所有已知血清型)包膜蛋白、中東呼吸症候群相關冠狀病毒(MERS-CoV，所有已知多樣性)刺突蛋白(S)、伊波拉病毒(屬級)醣蛋白(GP)蛋白質及賴薩熱(所有已知多樣性)病毒醣蛋白複合物(GPC)蛋白質之Genbank資料集自GenBank下載。A型流感病毒第2組血凝素(HA)序列之額外資料集自流感研究資料庫(Influenza Research Database)下載且人類免疫缺乏病毒-1 (HIV-1)包膜蛋白序列自洛斯阿拉莫斯國家實驗室(Los Alamos National Laboratory)預製比對序列資料庫獲得。使用MAFFT(自動設定)轉譯及比對序列且降取樣至3000個序列。將序列分組為四組(完全片段重疊組、ORF1衣殼、ORF2及5' UTR)且分析整個譜系中之成對基因距離。所有序列中成對一致性百分比之分佈由圖42中之柱組描繪。經由分析各位置處獨特胺基酸之數目來探測病毒蛋白序列之位點多樣性。胺基酸多樣性之此分析以圖43中之曲線說明。作為說明性實例，在圖44中描繪各類別之指環病毒的5' UTR區之系統發生，突出顯示跨序列之核苷酸比對。
為解釋指環病毒之潛在非純系進化，使用例如多維縮放(MDS)檢驗指環病毒多樣性。使用Scikit-learn，將MDS施用至所有病毒蛋白序列以將其投影至二維中。使用Scikit-learn，將凝聚聚類演算法(Agglomerative clustering)額外施用至指環病毒之成對胺基酸距離，以鑑別10個(為易於比較而任意選擇)簇。使用matplotlib使經MDS投影之序列可視化且在指環病毒之情況下按所指定之簇來著色。
繪製於圖41之圖B中的MDS分析之結果，指示指環病毒佔據大量所投影之空間。以與指環病毒分析相同的標度投影八種比較物病毒之MDS結果指示，指環病毒多樣性顯著高於(大了3至4倍)經選擇用於比較之病毒。即使相較於已知快速累積突變之病毒(諸如流感及HIV)及已知重組之病毒(諸如MERS-CoV)，指環病毒仍佔據更多的MDS之2D投影空間。量測涵蓋所有表面蛋白質之所有MDS座標(序列)之凸包區域提供了各病毒之病毒多樣性之單一量度。本研究之指環病毒的此量測結果超過具有最接近值之病毒的兩倍；相比於已知具有高多樣性程度之病毒，指環病毒展現大三倍至四倍之量測結果。此等屬中之每一者之序列中所觀測到的增長在15%至28%之間。亦確定β細環病毒(每序列每胺基酸位點0.114個取代)屬及γ細環病毒(0.148個)屬相較於α細環病毒(0.039個)中之每個新序列的系統發生分支長度貢獻。
實例 38 . 輸血供體及接受體中之指環病毒共感染在此研究中，測量實例36中描述之樣品以量測在輸注之後各種縱向時間點存在之指環病毒的量。使用PCR及定序來測量各時間點存在之指環病毒譜系且表徵各個體中之指環體。發現群組中之所有十五個輸血接受體含有諸多指環病毒譜系之共感染。
使用泛指環病毒PCR分析快速評估所有供體及接受體樣品中是否存在指環病毒DNA。藉由PCR使用由Ninomiya 2008(以全文引用之方式併入本文中)研發之泛指環病毒引子來測試血清樣品中指環病毒科之存在。簡言之，將10 µl樣品添加至1×PCR主混合物(Sigma Aldrich PCR Master套組第11636103001號)及4種最終濃度為1 µM之簡併引子(各自最終體積為25 μL)。根據在2%瓊脂糖凝膠中存在128 bp帶鑑別陽性樣品。圖45A顯示PCR分析之結果；亦即，用於各接受體之供體樣品中是否存在指環病毒經標示，以及在各接受體中偵測到指環病毒之天數。
在53%供體樣品(33/53)及86% (65/75)接受體樣品中偵測到指環病毒。在各供體-接受體輸注組中偵測到至少一個陽性樣品；而在供體集中之四個(用於接受體1、8、9及14之血液供體)中未偵測到指環病毒，但隨後在來自此等接受體中之每一者之至少一個樣品中偵測到指環病毒。總體而言，藉由PCR在76% (98/128)之吾等樣品中發現指環病毒，偵測比率支援先前在全血或血漿樣品中觀測到之彼等結果。
使用結合上文所描述之新擴增方法之靶向深度定序以量測此研究中各個體中及各時間點之指環病毒之數目。分析獨特數目之指環病毒衣殼蛋白序列，且各自經分離為可使用本文所描述之YNP X 2 D XG X 2 N (SEQ ID NO: 829)胺基酸模體鑑別的獨特標記基因。圖45B描繪指示供體及接受體之子組中之指環病毒株之數目的圖。群組中之大部分個體每個體含有6種不同的指環病毒譜系之中值，其中個別輸血接受體含有27種譜系之中值，且三個個體在所記錄之所有五個時間點含有超過100種獨特譜系。複數個個體經鑑別各自含有超過20種獨特譜系。當僅檢驗輸注接受體時，譜系之中值數目增加超過四倍。此等發現指示，輸注接受體中之指環病毒譜系之豐度增加係藉由自血液供體傳輸譜系而升高。
鑒於已鑑別出相當大的指環病毒多樣性，吾等接下來求證在ORF1序列中發現之多樣性是否限於特定區域或在整個基因中分佈廣泛。吾等標繪了針對自輸注群組分離之序列(1,861個序列之比對)被劃定為三個屬的整個ORF1序列中發現的獨特胺基酸之數目。另外，將此等發現對照藉由檢驗HIV-1包膜蛋白、A型流感病毒第2組HA及AAV衣殼蛋白之集合所發現的彼等發現進行比較(圖43)。經發現，平均在ORF1序列中可見之獨特胺基酸之數目廣泛變化，但在許多情況下，所有26個胺基酸均存在於多個位點處。在三個所比較之指環病毒屬中，吾等注意到，每個位點之胺基酸多樣性在α細環病毒及β細環病毒中更大，且獨特胺基酸之數目在基因之可能接近富含精胺酸區及凝膠捲域的5'端處較低。胺基酸多樣性之最大量遵循推定之高變區中之此等兩個特徵。吾等亦觀測到，指環病毒中之胺基酸多樣性高於或等於在用作比較點之HIV、流感病毒及AAV病毒中發現之胺基酸多樣性。總體而言，發現每個位點之平均獨特胺基酸數在整個ORF1序列中升高且大於經選擇用於比較之三個病毒中之兩者(AAV及A型流感病毒)中所發現的胺基酸數(圖43)。觀測到，三個指環病毒屬之ORF1胺基酸多樣性各自大於三種對照比較之病毒中之兩種中的所有當前所描述表面蛋白，其中僅HIV-1包膜蛋白展現主要由其高變環驅動的相等或更大多樣性。
實例 39 . 對個人指環體之多樣性之分析在此研究中，評估包含實例36中所描述之個體中之指環體的指環病毒的多樣性。此分析探測多樣性在個體內之進化空間中受限制(或不受限制)的程度及每一個人指環體獨特的程度。發現各個體具有不同的指環體，在個體間共有極少譜系。各個體內之整體多樣性的廣度跨越在整個資料集內所見之廣度。結果指示流行率高於先前由較低敏感性研究報告之流行率，且指示指環病毒可棲息於幾乎所有健康個體中。 藉由使用各ORF1序列之平均胺基酸一致性(AAI)，經由成對比較分析指環病毒譜系之相似性來檢驗各供體/接受體個體集內之多樣性(圖46)。在自各供體-接受體個體分離之指環病毒譜系之間觀測到相對較小的相似性，其中所有供體-接受體集的平均成對AAI為12.1%。相對於具有較少指環病毒譜系之個體集，在具有較高數目之指環病毒譜系之個體(例如個體4、5及15)中，觀測到較低平均成對AAI值。觀測到比具有較少指環病毒譜系之個體集中之平均成對AAI值更低的平均成對AAI值。吾等亦觀測到，在具有較少譜系之個體中，多樣性之廣度恰好為廣泛的(接受體3、7、11、14)，表明即使在具有較小指環體之個體中，所發現譜系之多樣性仍可相當高。為支援此等觀測結果，吾等使用在吾等之總體分析中計算之相同單一彙總統計來概述MDS之投影2D空間之總佔據面積，且發現此等值支援吾等之觀測結果。吾等觀測到，輸注集4、5及15中之最高值，與吾等之評估一致，亦即此等集含有TTVS群組中之最高程度多樣性。此等結果指向個體內之指環病毒譜系之豐富多樣性，如根據ORF1序列相似性所量測。
接下來，吾等對完全組裝之片段重疊組、ORF2序列及5'UTR序列進行搜尋，在整個完整資料集中進行相同成對序列相似性比較以分析多樣性是否擴展超過吾等在ORF1蛋白中所觀測到的程度(圖42C)。指環病毒序列之5'UTR區展現高保守性且具有比其他指環病毒構件(feature)中發現之相似性水準更高的相似性水準。此等發現指示5'UTR可以比當前認可之ORF1模型更高的特異性充當對指環病毒譜系進行分類的適合識別子。
遵循實例37中所描述之方法，使用MDS分析來量測、觀測及比較接受個體集中之個體多樣性(圖45C)。將每個體之分析投影在針對總指環體之資料集所使用的相同2D空間上，描繪於圖41之圖B中。此研究之結果指示，在存在足夠大的指環病毒譜系(亦即，40種或更多種譜系)之樣本大小的情況下，多樣性涵蓋大部分所投影MDS空間且反映在檢驗整個資料集時發現的相同組織。類似地，在含有較小比例之譜系之彼等個體中，仍觀測到跨越所投影之多樣性空間之散佈，其中譜系在大多數情況下涵蓋多個屬。計算全部資料集之相同多樣性統計值以表示由各個體集中發現之指環病毒譜系佔據之投影空間的量。此外，具有較高指環病毒譜系數目之個體在此統計中最高。具有最大數目之指環病毒譜系之個體集(4、5、15)均展現最大量之多樣性，且最大多樣性統計值發現於具有最高數目之譜系的集合中。具有最高譜系數目之三個個體集之間的統計差為4。
實例 40 ： 經由輸血傳輸之指環病毒的持久性可在多個生物樣品類型中偵測到指環病毒，且傳輸可經由諸如唾液、母乳、精液、口-糞、黏膜、皮膚或血液之途徑進行。在此研究中，輸血群組中之指環病毒的傳輸動力學係藉由根據序列相似性及根據映射至供體病毒株之讀段的比例追蹤供體與接受體之間的病毒株隨時間推移之傳輸來探測。
結果指示指環病毒傳輸在多個個體中一致地進行。大部分輸血接受體具有若干自一或多個供體傳輸之譜系。對供體及接受體之完全組裝之推定指環病毒基因體進行表徵，且在接受體中存在之經傳輸譜系之比例藉由比較完全組裝之推定指環病毒基因體之存在及量測經由映射指環病毒定序讀段存在之經傳輸譜系之比例來量測。資料證明，經傳輸譜系在輸注事件之後至多達至少270天存在。
輸血接受體中之獨特指環病毒譜系歸類為常駐於特定接受體或自供體傳輸。為產生各供體獨有之指環病毒譜系集，使用自供體分離之譜系與自接受體輸注前分離之譜系之ORF1序列之間的在95%相似性截止值下的成對比較。在輸注後若干時間點搜尋供體接受體中是否存在供體指環病毒譜系之此等獨特集合的痕跡，且在ORF1序列中之顯著序列同源性指示經傳輸譜系之情況下進行提取。在8/15個接受體個體中觀測到至少一種指環病毒譜系之傳輸(中值=5，最小值=0，最大值=53)，且鑑別所有供體/接受體個體集中之總共133種經傳輸譜系。另外，6種譜系經鑑別為存在於輸注前接受體樣品中，且亦經由自供體之傳輸而增加，與再給與指環病毒譜系之可能性一致。圖47A描繪輸注接受體中之指環病毒豐度隨時間推移之圖；此等圖追蹤經傳輸譜系及常駐譜系隨時間推移之變化。
量測每個樣品之指環病毒定序讀段之比例且將其歸於各指環病毒譜系以便估計指環體在縱向上之變化。此比例係藉由將去污及QC篩選的元基因體讀段映射至各樣品中各ORF1蛋白之編碼序列來計算。輸注後，接受體之時間點樣品主要藉由序列相似性同源性來查詢是否存在來自成對供體之經傳輸譜系。利用各供體-接受體集之獨特供體譜系集，以95%或大於90%之供體譜系的序列相似性，搜尋四個輸注後時間點之指環病毒譜系。在被傳輸至少一種指環病毒譜系之接受體中，觀測到常駐指環病毒之比例的顯著變化(圖47A)。接受體4、5、6、11及15全部在輸注之初始日期之後的50天內展現經傳輸譜系之比例的穩定增加，其中一些供體譜系在全部三個個體中取樣之最遲時間點處存在。在大部分接受體中，經傳輸的指環病毒譜系在縱向研究過程中續存，其中自輸注日期超過100天(中值=88天)偵測到29種譜系。
實例 41 ： 指環病毒之獨立傳輸在此研究中，探測指環病毒獨立於序列決定子進行傳輸之能力，該等序列決定子諸如相對於較小或較大段或整個譜系中共有之保守模體的序列相似性。舉例而言，此研究評估，若指環病毒譜系與接受體之指環體中之譜系高度相似(或相異)，則指環病毒譜系是否更可能傳輸。比較來自經傳輸、不經傳輸且常駐於接受體之指環病毒譜系集的序列，且在大多數情況下與常駐譜系接受體指環體之序列相似性對譜系是否更具可傳輸性並無影響。
使用ORF1序列及其與供體及接受體樣品中鑑別之譜系的相似性/相異性，將指環病毒譜系分成三個先前定義之類別(亦即經傳輸、不經傳輸及常駐)。除在供體與接受體樣品之間傳輸的123種指環病毒譜系之外(參見實例40)，亦鑑別出43種指環病毒譜系，其對於供體為獨特的但不傳輸至其對應接受體樣品。
將供體衍生之指環病毒譜系之兩個集合在每一排列中以成對方式與多種接受體常駐譜系(在數十種至數百種譜系範圍內)進行比較，以量測序列相似性是否在譜系之可傳輸性中起作用(圖47B)。此等三類指環病毒之比較之間的胺基酸相似性百分比相對極小地不同。在所有六次比較中，胺基酸一致性百分比中值為32.44%。指環病毒譜系之小集合與常駐譜系共有高序列相似性且被傳輸至接受體，指示儘管指環病毒可能通常不需要與接受體之指環體相似，但其在一些情況下可幫助傳輸。舉例而言，在經傳輸及常駐譜系之比較中，經傳輸譜系中之79種與對應接受體中之常駐譜系＞80%相似。
實例 42 ： 在指環病毒中進行重組作為增加多樣性之機制在此研究中，藉由搜尋及評估ORF1基因中之重組來探測用於產生ORF1序列之多樣性的機制。藉由在同一基因體上拆分基因座，重組在序列資料中留下許多信號-例如，由假定嚴格純系進化之系統發生方法所引起之過度重複突變(非同源相似性)、基因體之不同部分之間的不一致系統發生樹拓樸結構及基因座之間的統計相關性隨其間之距離增加而降低。由於難以比對指環病毒序列，因此此研究之重組推斷限於可鑑別之最佳可能比對。將三個指環病毒屬之轉譯比對序列分組為簇，其中所有成員在核苷酸層面上與另一成員至少80%一致，產生28個具有超過10個成員之簇(23個α細環病毒簇、四個β細環病毒簇及一個γ細環病毒簇)。選擇各屬之單個代表以用於更深入分析，得到具有23個α細環病毒、11個β細環病毒及10個γ細環病毒序列之簇。各簇內之序列使用MAFFT (更精確的E-INS-i設定)進行再比對，以改良比對。接著將各比對分成500個核苷酸片段且使用PhyML (HKY+Γ 4取代模型)及中點賦根自各片段推斷系統發生。自相鄰片段推導出之系統發生以纏結鏈顯示，其中各分類單元經由連續樹追蹤。沿著ORF1序列之500個核苷酸片段樹的拓樸結構的不一致性描繪於圖48之圖A中。
使用PhyML (HKY+Γ 4取代模型)，未劃分之相同簇比對用於推斷單樹。接著使用κ設定為2.0之ClonalFrameML，各樹及比對用於重構在整個樹中出現之突變。對於經重構為僅在樹中出現一次之每一突變，突變出現之分支用小記號(tick)標記，且推斷在樹中出現超過一次之每一突變係藉由將突變連接至其在樹中別處之一致對應物(亦即，單獨考慮逆轉)之線指示。在單一樹上重構突變且突顯在樹中僅出現一次之突變(亦即，共衍性狀，在分支上用小記號標記)相對於出現多次之突變(亦即，非同源相似性，用連接其中相同突變發生之分支的線指示)揭示大量重複突變，即使在相對低水準之分異度下，指示重組(圖48，圖B)。
接下來，多態核苷酸位點之物理距離與其之間的連鎖不平衡之間的關係係以各屬內之轉譯-比對序列形式評估。使用χ 2 df統計值評估連鎖不平衡(LD)之衰減，該χ 2 df統計值與雙對偶基因座之較常見r 2統計值表現一致。為此目的，使用與689個α細環病毒、619個β細環病毒及271個γ細環病毒序列之全屬(genus-wide)比對。忽略有效位點(A、C、T或G)低於10%之比對行，亦忽略少數變異體低於5%頻率之位點。針對位點之間的距離標繪在可變位點對之間量測的LD，其中以100個核苷酸長之窗計算平均LD (圖48，圖C)。圖48之圖C顯示多態核苷酸位點之物理距離與各屬內之轉譯-比對序列中之位點之間的連鎖不平衡的量度之間的關係。在重組情況下，重組發生之機率隨著位點之間的距離增加而增加，其中在相鄰位點之間觀測到最高連鎖不平衡且隨著物理距離增加。存在兩個極端，此類關係為非期望的-根本不存在重組及自由重組。對於非重組基因體，僅重複突變可自1.0之基線降低連鎖不平衡，且對於自由重組而言，相鄰基因座之間的連鎖不平衡為0.0。三個屬之連鎖不平衡的標繪圖顯示，各屬展現接近零的連鎖不平衡，此指示在大規模上，指環病毒基因座可有效地獨立進化。
由於完全環化基因體可供用於多種指環病毒，因此探測基因體之非編碼部分中之網狀進化程度。為此目的，將各屬(22個α細環病毒、467個β細環病毒及23個γ細環病毒)之完全基因體進行比對且提取非編碼區，隨後使用ClonalFrameML進行祖先性狀(ancestral state)重構。為鑑別推定重組段，針對在彼此之十個核苷酸內具有至少三個突變之簇中出現之重複突變(非同源相似性)分析序列。在α細環病毒之非編碼基因體區內鑑別之突變之此類簇描繪於圖49中。圖50突顯此等重組段之系統發生位置，指示突變跨越整體α細環病毒多樣性。此等結果證明研究群組以及公共資料中之頻繁重組。本文所提供之實例顯示多個不同譜系之指環病毒之頻繁共感染，此將為個體內發生重組提供機會。重組之證據在低水準之分異度下最清晰，在供體-接受體對之緊密相關ORF1序列、患者內序列簇之間或在指環病毒基因體之更保守區之間的分異度下。此等資料表明嚴格純系進化模型(例如系統發生樹)可能不能充分推斷指環病毒序列之間的關係或距離，且指環病毒基因體之極少區域或沒有區域可能完全不含重組。
結論概言之，本研究探索15個輸血接受體及其匹配供體之指環體且鑑別表明各個體攜帶獨特指環病毒集的動態前景。此藉由利用指環病毒靶向擴增方法結合深度定序以鑑別112個樣品中之獨特指環病毒譜系來進行。藉由使用指環病毒ORF1序列作為探索主鏈，以及獨特標記特徵，以實質上比藉由分析全部指環病毒基因體可能之程度更深的水準評估各個體中之多樣性。回收完全指環病毒基因體受非編碼區中之高GC含量阻礙。使用當前ICTV截止值對指環病毒進行分類，使樣品內發現之大部分多樣性崩塌且因此可受益於藉由實驗證據補充以劃分物種邊界之亞種/譜系定義。
在輸血接受體中鑑別出超過200種傳輸的指環病毒譜系且在6/15 (40%)接受體中觀測到指環病毒傳輸(圖47A)。供體譜系與宿主指環體之相似性似乎對傳輸成效幾乎沒有影響(圖47B)。實際上，儘管與常駐譜系具有高序列相似性(＞90%)，但仍觀測到成功傳輸之供體譜系之情況，指示再感染且可有效再給與治療性指環載體(例如，如本文所描述)。基於出生第一年中之指環病毒之普遍性獲取，本文亦涵蓋經由其他非醫原性途徑，諸如呼吸道及糞-口之指環病毒傳輸(REF)。
靶向指環病毒定序能夠使得數百種獨特指環病毒譜系隨時間推移得以分化及追蹤。在多種指環病毒譜系下發現共感染發生率高(16/16接受體)。觀測到常駐及經傳輸的指環病毒譜系，其續存此研究之持續時間(輸注後至多270天)。不希望受理論所束縛，經由輸血新傳輸之譜系的持久性進一步指示經靜脈內遞送之治療劑可為遞送媒劑。
本文所描述之指環病毒及其關鍵構件之特徵表明指環體之模型，其中新譜系循環進出由多樣常駐譜系環境共棲之空間。其獨立於序列相似性及不存在疾病關聯進行感染之能力表明低免疫原性且引起持久感染，由此允許多個病毒株之共感染且促進頻繁重組。指環病毒之特徵，諸如其在人類中普遍存在及持久性以及低免疫原性及病原性，與重組促進指環病毒多樣化之觀測結果一致。
不希望受理論所束縛，在來自輸注群組中之個體血液的指環病毒中觀測到的多樣性提供可用於遞送治療性有效負載之病毒模板(例如，如本文所描述)。經重組態以攜帶治療性有效負載之指環病毒(例如如本文所描述之指環載體)可具有對前期抗體具有抗性且具有組織向性之優勢。此可允許再給與複製缺陷型指環病毒且減少以當前遞送形式所需之可能產生毒性的高劑量。
圖1為顯示所有接受體患者在輸注後數天內之各次血液抽取之相對時間的圖式。
圖2A及圖2B描繪輸注前供體病毒株相對於接受體病毒株中之指環病毒衣殼蛋白之相似性(A)。以紅色圈出之病毒株為分類為再給與候選物之病毒株。此等病毒株在輸注前與輸注後一或多個時間點均被觀測到(B)。
圖3為一系列顯示如藉由高解析度熔融(HRM)分析所測定之患者中再給與指環病毒之持久性的圖式。在輸注後24、82、110及167天測試接受體患者之指環病毒概況，且將所得概況與接受體患者在第0天之指環病毒概況與供體之指環病毒概況進行比較。
圖4描繪編碼TTMiniV之LY1病毒株之康黴素載體(「指環載體1」)的示意圖。
圖5描繪編碼TTMiniV之LY2病毒株之康黴素載體(「指環載體2」)的示意圖。
圖6描繪293T及A549細胞中之合成指環載體的轉染效率。
圖7A及圖7B描繪說明合成指環載體對293T細胞之成功感染的定量PCR結果。
圖8A及圖8B描繪說明合成指環載體對A549細胞之成功感染的定量PCR結果。
圖9A及圖9B描繪說明合成指環載體對Raji細胞之成功感染的定量PCR結果。
圖10A及圖10B描繪說明合成指環載體對Jurkat細胞之成功感染的定量PCR結果。
圖11A及圖11B描繪說明合成指環載體對Chang細胞之成功感染的定量PCR結果。
圖12為顯示用於產生指環載體(例如，如本文所描述之複製勝任型或複製缺陷型指環載體)之例示性工作流的示意圖。
圖13為顯示在經指定質體轉染之HEK293T細胞中miR-625表現之倍數變化的圖式。
圖14為顯示用編碼靶向n-myc相互作用蛋白質(NMI)之miRNA的指環載體感染Raji B細胞之圖式。顯示在用編碼NMI miRNA之指環載體感染Raji B細胞(箭頭)或對照細胞之後偵測到的指環載體之基因體當量的定量。
圖15為顯示用編碼靶向n-myc相互作用蛋白質(NMI)之miRNA的指環載體感染Raji B細胞之圖式。西方墨點顯示編碼針對NMI之miRNA的指環載體降低Raji B細胞中之NMI蛋白質表現，而經缺乏miRNA之指環載體感染的Raji B細胞顯示出與對照相當的NMI蛋白質表現。
圖16為一系列顯示在用包含內源性miRNA編碼序列之指環載體及其中缺失內源性miRNA編碼序列之對應指環載體感染之後，在宿主細胞中產生之指環載體粒子之定量的圖式。
圖17A-圖17B為一系列顯示用於產生表現奈米-螢光素酶之指環載體(A)及用於轉染細胞之一系列指環載體/質體組合(B)之構築體的圖式。
圖18A-圖18C為一系列顯示在注射指環載體之小鼠中之奈米-螢光素酶表現的圖式。(A)在注射之後第0-9天時小鼠中之奈米-螢光素酶表現。(B)注射如所指示之各種指環載體/質體構築體組合的小鼠中之奈米-螢光素酶表現。(C)在注射後小鼠中偵測到的奈米-螢光素酶發光之定量。A組接受TTMV-LY2載體+奈米-螢光素酶。B組接受奈米-螢光素酶蛋白質及TTMV-LY2 ORF。
圖19A為顯示TTMV-LY2質體pVL46-063及pVL46-240之環化的凝膠電泳影像。
圖19B為顯示如由尺寸排阻層析法(SEC)所確定之線性及環狀TTMV-LY2構築體之複本數的層析圖。
圖19C為顯示指環病毒ORF1分子之域及經來自不同指環病毒之高變域置換之高變區的示意圖。
圖19D為顯示ORF1之域及經來自非指環病毒來源之所關注之蛋白質或肽(POI)置換之高變區的示意圖。
圖20為顯示經工程改造以含有編碼人類紅血球生成素(hEpo)之序列之基於tth8或LY2的指環載體可將功能性轉殖基因遞送至哺乳動物細胞的圖式。
圖21A及圖21B為一系列圖式，其顯示在靜脈內注射之後七天向小鼠投與之經工程改造指環載體為可偵測的。
圖22為顯示在靜脈內投與編碼hGH之經工程改造指環載體之後七天在全血之細胞級分中偵測到hGH mRNA的圖式。
圖23為顯示活體外環化(IVC) TTV-tth8基因體(IVC TTV-tth8)與質體中之TTV-tth8基因體相比在HEK293T細胞中以預期密度產生TTV-tth8基因體複本之能力的圖式。
圖24為一系列顯示活體外環化(IVC) LY2基因體(WT LY2 IVC)及質體中之野生型LY2基因體(WT LY2質體)在Jurkat細胞中以預期密度產生LY2基因體複本之能力的圖式。
圖25為顯示來自α細環病毒(Alphatorquevirus)、β細環病毒(Betatorquevirus)及γ細環病毒(Gammatorquevirus)之指環病毒ORF1蛋白質之凝膠捲域(SEQ ID NO: 950-975)之二級結構的比對的圖式。此等二級結構元件高度保守。
圖26A-圖26C為一系列顯示串聯指環病毒質體可增加指環病毒產生之圖式。(A)例示性串聯指環病毒質體之質體圖。(B)用串聯指環病毒質體轉染MOLT-4細胞引起野生型大小的指環病毒基因體之回收。(C)MOLT-4細胞中產生之來自串聯指環病毒質體的指環病毒基因體以經殼體包裹之病毒粒子的預期密度遷移。GCR=富含GC之區。細菌SM=細菌選擇標記物。細菌ori=細菌複製起點。ORF=開放閱讀框架。Prom.=啟動子。5CD=5'未轉譯區保守域。
圖27A-圖27E為一系列顯示基於環2基因體之例示性串聯構築體的圖式。(A)串聯構築體包含遺傳元件之第一複本及位於相對於第一複本之3'處的遺傳元件之完整或部分第二複本。各連續構築體包括第二複本之3'端的更大截斷。構築體可包括促進下游複製之序列(dRFS)，例如包含如所指示之5CD (5' UTR保守域)。(B)串聯構築體包含遺傳元件之第一複本及位於相對於第一複本之5'處的遺傳元件之完整或部分第二複本。各連續構築體包括第二複本之5'端的更大截斷。(C)串聯構築體包含遺傳元件之部分第一複本(例如，包含uRFS)及位於相對於第一複本之5'處的遺傳元件之部分第二複本(例如，包含dRFS)。各連續構築體包括第一複本之5'端的更大截斷及第二複本之3'端的更大比例。(D)自經2A及2B中所示之構築體轉染的MOLT-4細胞收集的總DNA上之南方墨點法證實野生型長度指環病毒基因體之回收。(E)根據CsCl密度梯度之指環病毒基因體的DNA酶保護qPCR證實在具有2A及2B中所示之構築體的MOLT-4細胞中產生的指環病毒基因體之包封。
圖27F為一系列顯示來自經包括在環1主鏈之第一複本中編碼序列(該序列編碼eGFP-ORF1融合蛋白質)之串聯環1構築體的多種環1構築體(如所指示)轉染之Jurkat細胞的全長環1 ORF1 mRNA的長RNA讀段的圖式。
圖27G為一系列顯示偵測已藉由核轉染引入環2串聯構築體之MOLT-4細胞中ORF1蛋白質表現之圖式。
圖27H為顯示包含串聯佈置之兩個環2基因體之例示性桿狀病毒構築體的圖式。
圖27I為一系列顯示經由桿狀病毒將串聯環2基因體遞送至Sf9細胞之圖式。
圖28描繪具有C端His標籤之環2 ORF1於昆蟲細胞中之表現。
圖29描繪具有C端His標籤之環1 ORF1及ORF1/1於昆蟲細胞中之表現。
圖30描繪具有N端His標籤，具有或不具有PreScission裂解序列之環2 ORF1於昆蟲細胞中之表現。「6xHis標籤」揭示為SEQ ID NO: 1013。
圖31描繪作為C端His標記之重組蛋白之環1 ORF 1/1、1/2、2、2/2及2/3於昆蟲細胞中之表現。
圖32描繪個別環2 ORF於昆蟲細胞中之表現。同一墨點之兩次曝光示於中圖及右圖中。左圖顯示如所指示測試之環2構築體的結構。
圖33描繪昆蟲細胞中環2 ORF1 + 「完全ORF」、ORF1 + ORF2、ORF1 + ORF2/2及ORF1 + ORF2/3之桿狀病毒介導之共表現。
圖34描繪使用桿狀病毒在昆蟲細胞中多個環2蛋白質之同時共表現。
圖35描繪來自藉由桿狀病毒及藉由轉染遞送至昆蟲細胞中之指環病毒基因體之ORF的表現。
圖36顯示環1 ORF2之表現獨立於Sf9細胞中之多面體啟動子(箭頭標記之pH)。
圖37描繪將環2 ORF1-His及環2基因體DNA共遞送至Sf9細胞中，之後進行培育且基於CsCl線性密度梯度進行分級分離。在圖式頂部顯示級分之抗His標籤西方墨點，以及各級分之qPCR分析。下圖顯示兩個個別級分及一個級分集區之穿透式電子顯微鏡影像，如由西方墨點上之方框指示。中間圖中之插圖為顯示蛋白酶體樣結構之放大視圖。
圖38描繪Sf9等密度級分藉由免疫金電子顯微法之表徵。
圖39描繪來自額外指環病毒株之ORF1的表現。
圖40描繪實例36之個體中之指環病毒之序列讀段計數的繪圖。呈現來源於供體樣品之讀段及來源於輸注接受體樣品之讀段的讀段總數目。藍色陰影條表示總讀段，而紅色陰影條指示鑑別為指環病毒讀段之讀段。淺藍色條=供體總讀段；淺紅色條=供體指環病毒讀段；深藍色條=接受體總讀段；深紅色條=接受體指環病毒讀段。
圖41說明指環病毒多樣性程度之圖譜。圖41之圖A描繪指環病毒ORF1胺基酸序列之最大似然系統發生(n=1575)。基於成對胺基酸距離之聚結性簇聚來使頂端著色以產生10個任意簇。灰色分支將先前公開的序列連接至根部及黑色分支表示此研究中報告的序列。樹右側之黑色短劃線指示新序列之位置及體積。圖41之圖B描繪對1575個指環病毒ORF1胺基酸序列之多維縮放(MDS)分析(點如同圖A中著色)，與以下八種其他病毒表面蛋白進行比較：2627個人類乳突病毒(HPV) L1、86個腺相關病毒(AAV)衣殼、3000個人類免疫缺乏病毒1 (HIV1)包膜蛋白(env)、3000個登革熱病毒包膜蛋白、425個中東相關呼吸症候群冠狀病毒(MERS-CoV)刺突蛋白(Spike)、3000個A型流感病毒HA (第2組，亞型H3、H4、H7、H10及H14)、172個伊波拉病毒(Ebolavirus)(全屬) GP、632個賴薩熱病毒(Lassa fever virus) GPC蛋白質序列。所有病毒之MDS繪圖以相同的比例顯示；比例尺等於MDS投影空間中每一位點0.2個胺基酸取代。
圖42A為顯示例示性指環病毒基因體上之模體位置的示意圖。顯示開放閱讀框架(ORF)位置及其在理論指環病毒基因體上之對應鑑別模體的佈局。
圖42B為顯示指環病毒ORF3序列中保守模體的圖。在TTVS資料集中471個指環病毒基因體之3'端附近，除ORF1及ORF2以外，亦預測第三開放閱讀框架(ORF3)。鑑別ORF3之3'端附近的兩個新穎及高度保守模體：模體1 (a)在471個序列中之467個中觀測到(99%)；模體2 (b)在471個序列中之463個中觀測到(98%)。
圖42C描繪整個指環病毒譜系中配對一致性百分比之繪圖。將序列分組為四組(完全片段重疊組、ORF1衣殼蛋白、ORF2及5' UTR)以評估整個區域中的相似性。
圖43說明病毒蛋白之位點多樣性。圖43中之曲線描繪病毒蛋白序列中各位點處之獨特胺基酸之數目。屬於α細環病毒(黃色)、β細環病毒(綠色)及γ細環病毒(紅色)之指環病毒ORF1序列顯示於左側，HIV-1包膜蛋白、流感病毒第2組HA及腺相關病毒衣殼序列顯示於右側，以用於比較。病毒蛋白中之每一者中獨特胺基酸之數目與平滑平均值(50個胺基酸長窗)之比對以黑色顯示。排除包含至少90%空位之比對行。指環病毒比對的前150個胺基酸用透明灰色框突出顯示，以指示根據HHpred顯著類似環狀病毒衣殼序列的指環病毒ORF1序列的近似位置。
圖44說明指環病毒序列之5'未轉譯區的系統發生分析。左側之系統發生樹顯示5'未轉譯區中之三個指環病毒屬(呈紅色之α細環病毒、呈藍色之β細環病毒及呈紫色之γ細環病毒)之間的關係。系統發生樹右側為73個核苷酸之比對(紅色為腺嘌呤，藍色為胞苷，綠色為胸苷，黃色為鳥嘌呤及灰色為空位及不明確核苷酸)。一組五種γ細環病毒(基於整個基因體如此分類)似乎相較於其他γ細環病毒與β細環病毒更緊密地相關。
圖45A-圖45C說明個人指環體(anellome)之表徵(亦即，指環病毒序列之集合，且在一些情況下，其存在於單個個體，諸如人類患者中之相對頻率)。圖45之圖A提供泛指環病毒PCR測試之結果。十五個輸注接受體與一或多個血液供體配對且在手術後接受輸血。接受體樣品在輸注後經280天之時段收集。泛指環病毒PCR陽性樣品以紅色顯示。圖45之圖B描繪每個體所鑑別之獨特指環病毒譜系之數目的繪圖。圖45之圖C描繪各輸注接受體中之指環病毒多樣性。MDS分析證明，研究個體內之指環病毒多樣性跨越總體已知之指環病毒多樣性之空間。凸包描繪涵蓋於各個體集中之多樣性空間之量。各面上所呈現之數字指示患者之指環病毒之凸包佔據面積相比於所取樣之所有指環病毒之凸包面積的分數。
圖46描繪個體內之平均胺基酸一致性(AAI)之繪圖。計算各輸注接受個體中發現之指環病毒譜系之間的平均胺基酸一致性。各圖中之虛線垂直線表示各個體中之平均AAI。
圖47A-圖47B說明經由輸血之指環病毒譜系之傳輸。圖47A描繪顯示在輸血之後，在縱向上輸注接受體中之指環病毒譜系的相對豐度的流圖。著色呈紅色陰影之譜系指示來自供體之經傳輸之病毒株，而藍色陰影指示對接受體常見之指環病毒譜系。圖47B描繪自輸注個體分離之不同子集之指環病毒之間的成對距離之比較。供體與輸注之前接受體中之指環病毒之間的指環病毒相似性並不能預測傳輸性。
圖48說明指環病毒重組對指環病毒多樣性之影響。圖48之圖A描繪由指環病毒ORF1之500個核苷酸片段推斷之中點賦根(midpoint-rooted)系統發生之纏結鏈的繪圖，其中連續系統發生中之各譜系之位置顯示為根據其在第一系統發生中之相對位置著色之線條。在整個指環病毒基因體中之非連鎖進化為重組證據。圖48之圖B經由非同源相似性提供指環病毒中之重組證據。在核苷酸層面彼此具有80%一致性內之序列之間的原始序列重構顯示許多重複突變-各線連接不同分支上出現之一致突變，其中沿著分支長度之分數指示指環病毒基因體中之突變之相對位置。分支上之小記號指示唯一出現在所論分支上之突變。分支根據具有非同源相似性之所有突變之分數著色，其中最高值(所有突變均具有非同源相似性/無獨特突變)以白色突出顯示。圖48之圖C描繪連鎖不平衡(量測為
Figure 02_image001
df，其等效於r 2，但亦適用於具有超過兩個對偶基因之位點)衰減隨多態位點之間的物理距離而變之繪圖。各點對應於一對多態ORF1位點，其中兩個位點均為超過10%的非空位及明確字元。紅線指示100個核苷酸長之窗中之局部LD平均值。
圖49說明α細環病毒之非編碼基因體區中所鑑別的長重組段(tract)。所描繪之重組段包含在系統發生樹中出現至少兩次之在10個核苷酸之跨度內之至少三種突變。概述各推定重組段，以黑色顯示。自具有推定重組段之分支下伸之所有序列之核苷酸狀態示為具有指定核苷酸之有色方框(紅色為腺嘌呤，藍色為胞苷，綠色為胸苷，黃色為鳥嘌呤)。一致段用灰色方框連接以突顯相似性。
圖50說明α細環病毒之非編碼基因體區中所鑑別之重組段的系統發生位置。重組段涵括整個α細環病毒多樣性，且表明甚至在遠親基因體之間亦存在最小的遺傳物質交換障礙。
當結合附圖閱讀時，將更好地理解本發明之實施例的以下詳細描述。出於說明本發明之目的，在圖式中顯示當前例示之實施例。然而，應理解，本發明不限於圖式中所示實施例之精確佈置及工具。 
                        
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          cataagtcac ccacaactaa aaaaaccaaa cccacaaata aacaaaccat tagagtcaca     1620
          atactttgca cctttagatg ccctctgggg agaccccata tactataatg atctaaatga     1680
          aaacaaaagt ttgaacgata tcattgagaa aatactaata aaaaacatga ttacatacca     1740
          tgcaaaacta agagaatttc caaattcata ccaaggaaac aaggcctttt gccacctaac     1800
          aggcatatac agcccaccat acctaaacca aggcagaata tctccagaaa tatttggact     1860
          gtacacagaa ataatttaca acccttacac agacaaagga actggaaaca aagtatggat     1920
          ggacccacta actaaagaga acaacatata taaagaagga cagagcaaat gcctactgac     1980
          tgacatgccc ctatggactt tactttttgg atatacagac tggtgtaaaa aggacactaa     2040
          taactgggac ttaccactaa actacagact agtactaata tgcccttata cctttccaaa     2100
          attgtacaat gaaaaagtaa aagactatgg gtacatcccg tactcctaca aattcggagc     2160
          gggtcagatg ccagacggca gcaactacat accctttcag tttagagcaa agtggtaccc     2220
          cacagtacta caccagcaac aggtaatgga ggacataagc aggagcgggc cctttgcacc     2280
          taaggtagaa aaaccaagca ctcagctggt aatgaagtac tgttttaact ttaactgggg     2340
          cggtaaccct atcattgaac agattgttaa agaccccagc ttccagccca cctatgaaat     2400
          acccggtacc ggtaacatcc ctagaagaat acaagtcatc gacccgcggg tcctgggacc     2460
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          aatcaaagtc ctcttcgagc agctcataag gacccaacaa ggggtccatg taaacccatg     2820
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          ctggaacaac ttcttcggag tccggcgcta cgccttcggc tgcgccggac acctcagacc     3180
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          tcagccacac ctactcaaaa tggtggacaa tttcttccgg gtcaaaggtt acagccgcca     3540
          tgttaaaaca cgtgacgtat gacgtcacgg ccgccatttt gtgacacaag atggccgact     3600
          tccttcctct ttttcaaaaa aaagcggaag tgccgccgcg gcggcggggg gcggcgcgct     3660
          gcgcgcgccg cccagtaggg ggagccatgc gccccccccc gcgcatgcgc ggggcccccc     3720
          cccgcggggg gctccgcccc ccggcccccc ccg                                  3753
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 127]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
          Met Ser Phe Trp Lys Pro Pro Val His Asn Val Thr Gly Ile Gln Arg 
          1               5                   10                  15      
          Met Trp Tyr Glu Ser Phe His Arg Gly His Ala Ser Phe Cys Gly Cys 
                      20                  25                  30          
          Gly Asn Pro Ile Leu His Ile Thr Ala Leu Ala Glu Thr Tyr Gly His 
                  35                  40                  45              
          Pro Thr Gly Pro Arg Pro Ser Gly Pro Pro Gly Val Asp Pro Asn Pro 
              50                  55                  60                  
          His Ile Arg Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Glu Pro Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asp Ser Arg Pro Ala Leu Thr Trp His Gly Asp Gly Gly Ser Asp 
                          85                  90                  95      
          Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Pro Val Ala Asp Phe Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Asp Gly Leu Asp Gln Leu Val Ala Ala Leu Asp Asp Glu Glu 
                  115                 120                 125         
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 268]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          Met Ser Phe Trp Lys Pro Pro Val His Asn Val Thr Gly Ile Gln Arg 
          1               5                   10                  15      
          Met Trp Tyr Glu Ser Phe His Arg Gly His Ala Ser Phe Cys Gly Cys 
                      20                  25                  30          
          Gly Asn Pro Ile Leu His Ile Thr Ala Leu Ala Glu Thr Tyr Gly His 
                  35                  40                  45              
          Pro Thr Gly Pro Arg Pro Ser Gly Pro Pro Gly Val Asp Pro Asn Pro 
              50                  55                  60                  
          His Ile Arg Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Glu Pro Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asp Ser Arg Pro Ala Leu Thr Trp His Gly Asp Gly Gly Ser Asp 
                          85                  90                  95      
          Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Pro Val Ala Asp Phe Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Asp Gly Leu Asp Gln Leu Val Ala Ala Leu Asp Asp Glu Glu Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Lys Thr Pro Ala Ser Ser Pro Pro Met Lys Tyr Pro Val Pro Val 
              130                 135                 140                 
          Thr Ser Leu Glu Glu Tyr Lys Ser Ser Thr Arg Gly Ser Trp Asp Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Thr Arg Ser Gly His Gly Thr Cys Ala Asp Thr His Leu Ala Glu 
                          165                 170                 175     
          Gln Val Leu Arg Glu Cys Gln Asn Asn Lys Lys Leu Leu Thr Leu Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ser Gln Ala Gln Lys Ser Leu Gly Ser Thr Ser Gln Asn Lys Lys Pro 
                  195                 200                 205             
          Lys Lys Lys Ala His Ile His Ser Lys Glu Asn Arg Asp Arg Gly Arg 
              210                 215                 220                 
          Pro Arg Lys Lys Ala Arg Gln Lys Pro Ser Arg Lys Arg Ala Lys Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Pro Ser Asn Ser Ser Cys Ser Ser Ser Thr Lys Ser Ser Ser Ser 
                          245                 250                 255     
          Ser Asp Arg Glu Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser 
                      260                 265             
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 276]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Met Ser Phe Trp Lys Pro Pro Val His Asn Val Thr Gly Ile Gln Arg 
          1               5                   10                  15      
          Met Trp Tyr Glu Ser Phe His Arg Gly His Ala Ser Phe Cys Gly Cys 
                      20                  25                  30          
          Gly Asn Pro Ile Leu His Ile Thr Ala Leu Ala Glu Thr Tyr Gly His 
                  35                  40                  45              
          Pro Thr Gly Pro Arg Pro Ser Gly Pro Pro Gly Val Asp Pro Asn Pro 
              50                  55                  60                  
          His Ile Arg Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Glu Pro Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asp Ser Arg Pro Ala Leu Thr Trp His Gly Asp Gly Gly Ser Asp 
                          85                  90                  95      
          Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Pro Val Ala Asp Phe Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Asp Gly Leu Asp Gln Leu Val Ala Ala Leu Asp Asp Glu Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Lys Ala Ser Gly Arg His Pro Lys Thr Arg Asn Pro Arg Arg Lys 
              130                 135                 140                 
          Leu Thr Phe Thr Pro Lys Arg Ile Glu Thr Val Gly Asp Arg Gly Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Arg Asp Arg Ser Pro Leu Ala Arg Glu Pro Arg Gly Pro Leu Pro 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Val Ala Ala Ala Val Pro Arg Ala Ala Gln Ala Gln Thr Gly 
                      180                 185                 190         
          Asn Gln Ser Pro Leu Arg Ala Ala His Lys Asp Pro Thr Arg Gly Pro 
                  195                 200                 205             
          Cys Lys Pro Met Pro Thr Val Gly Pro Arg Gln Trp Leu Phe Pro Glu 
              210                 215                 220                 
          Arg Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ser Ser Gly Asp Trp Ala Met Glu Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Ala Ala Lys Ile Phe Asp Arg Pro Val Arg Ser Asn Leu Lys Asp 
                          245                 250                 255     
          Thr Pro Tyr Tyr Pro Tyr Val Lys Asn Gln Tyr Asn Val Tyr Phe Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Lys Phe Glu 
                  275     
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 167]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          Met Ser Phe Trp Lys Pro Pro Val His Asn Val Thr Gly Ile Gln Arg 
          1               5                   10                  15      
          Met Trp Pro Lys Lys Ala Ser Gly Arg His Pro Lys Thr Arg Asn Pro 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Lys Leu Thr Phe Thr Pro Lys Arg Ile Glu Thr Val Gly Asp 
                  35                  40                  45              
          Arg Gly Arg Lys Arg Asp Arg Ser Pro Leu Ala Arg Glu Pro Arg Gly 
              50                  55                  60                  
          Pro Leu Pro Thr Ala Val Ala Ala Ala Val Pro Arg Ala Ala Gln Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Thr Gly Asn Gln Ser Pro Leu Arg Ala Ala His Lys Asp Pro Thr 
                          85                  90                  95      
          Arg Gly Pro Cys Lys Pro Met Pro Thr Val Gly Pro Arg Gln Trp Leu 
                      100                 105                 110         
          Phe Pro Glu Arg Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ser Ser Gly Asp Trp Ala 
                  115                 120                 125             
          Met Glu Phe Leu Ala Ala Lys Ile Phe Asp Arg Pro Val Arg Ser Asn 
              130                 135                 140                 
          Leu Lys Asp Thr Pro Tyr Tyr Pro Tyr Val Lys Asn Gln Tyr Asn Val 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Phe Asp Leu Lys Phe Glu 
                          165         
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 743]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Arg Lys Thr Arg Thr Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Phe Arg Arg 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Arg Lys Ala Lys Leu Ile Ile Lys Leu Trp Gln Pro Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Lys Arg Cys Arg Ile Lys Gly Tyr Ile Pro Leu Ile Ile Ser Gly 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Thr Phe Ala Thr Asn Phe Thr Ser His Ile Asn Asp Arg Ile 
                      100                 105                 110         
          Met Lys Gly Pro Phe Gly Gly Gly His Ser Thr Met Arg Phe Ser Leu 
                  115                 120                 125             
          Tyr Ile Leu Phe Glu Glu His Leu Arg His Met Asn Phe Trp Thr Arg 
              130                 135                 140                 
          Ser Asn Asp Asn Leu Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ala Ser Val Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Tyr Arg His Pro Asp Gln Asp Phe Ile Val Ile Tyr Asn Arg Arg 
                          165                 170                 175     
          Thr Pro Leu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Leu His Pro Gly 
                      180                 185                 190         
          Asn Ala Ile Leu Ala Lys His Lys Ile Leu Val Pro Ser Leu Gln Thr 
                  195                 200                 205             
          Arg Pro Lys Gly Arg Lys Ala Ile Arg Leu Arg Ile Ala Pro Pro Thr 
              210                 215                 220                 
          Leu Phe Thr Asp Lys Trp Tyr Phe Gln Lys Asp Ile Ala Asp Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Phe Asn Ile Met Ala Val Glu Ala Asp Leu Arg Phe Pro Phe Cys 
                          245                 250                 255     
          Ser Pro Gln Thr Asp Asn Thr Cys Ile Ser Phe Gln Val Leu Ser Ser 
                      260                 265                 270         
          Val Tyr Asn Asn Tyr Leu Ser Ile Asn Thr Phe Asn Asn Asp Asn Ser 
                  275                 280                 285             
          Asp Ser Lys Leu Lys Glu Phe Leu Asn Lys Ala Phe Pro Thr Thr Gly 
              290                 295                 300                 
          Thr Lys Gly Thr Ser Leu Asn Ala Leu Asn Thr Phe Arg Thr Glu Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Ile Ser His Pro Gln Leu Lys Lys Pro Asn Pro Gln Ile Asn Lys 
                          325                 330                 335     
          Pro Leu Glu Ser Gln Tyr Phe Ala Pro Leu Asp Ala Leu Trp Gly Asp 
                      340                 345                 350         
          Pro Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Asn Glu Asn Lys Ser Leu Asn Asp Ile 
                  355                 360                 365             
          Ile Glu Lys Ile Leu Ile Lys Asn Met Ile Thr Tyr His Ala Lys Leu 
              370                 375                 380                 
          Arg Glu Phe Pro Asn Ser Tyr Gln Gly Asn Lys Ala Phe Cys His Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Gly Ile Tyr Ser Pro Pro Tyr Leu Asn Gln Gly Arg Ile Ser Pro 
                          405                 410                 415     
          Glu Ile Phe Gly Leu Tyr Thr Glu Ile Ile Tyr Asn Pro Tyr Thr Asp 
                      420                 425                 430         
          Lys Gly Thr Gly Asn Lys Val Trp Met Asp Pro Leu Thr Lys Glu Asn 
                  435                 440                 445             
          Asn Ile Tyr Lys Glu Gly Gln Ser Lys Cys Leu Leu Thr Asp Met Pro 
              450                 455                 460                 
          Leu Trp Thr Leu Leu Phe Gly Tyr Thr Asp Trp Cys Lys Lys Asp Thr 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Asn Trp Asp Leu Pro Leu Asn Tyr Arg Leu Val Leu Ile Cys Pro 
                          485                 490                 495     
          Tyr Thr Phe Pro Lys Leu Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asp Tyr Gly Tyr 
                      500                 505                 510         
          Ile Pro Tyr Ser Tyr Lys Phe Gly Ala Gly Gln Met Pro Asp Gly Ser 
                  515                 520                 525             
          Asn Tyr Ile Pro Phe Gln Phe Arg Ala Lys Trp Tyr Pro Thr Val Leu 
              530                 535                 540                 
          His Gln Gln Gln Val Met Glu Asp Ile Ser Arg Ser Gly Pro Phe Ala 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Lys Val Glu Lys Pro Ser Thr Gln Leu Val Met Lys Tyr Cys Phe 
                          565                 570                 575     
          Asn Phe Asn Trp Gly Gly Asn Pro Ile Ile Glu Gln Ile Val Lys Asp 
                      580                 585                 590         
          Pro Ser Phe Gln Pro Thr Tyr Glu Ile Pro Gly Thr Gly Asn Ile Pro 
                  595                 600                 605             
          Arg Arg Ile Gln Val Ile Asp Pro Arg Val Leu Gly Pro His Tyr Ser 
              610                 615                 620                 
          Phe Arg Ser Trp Asp Met Arg Arg His Thr Phe Ser Arg Ala Ser Ile 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Arg Val Ser Glu Gln Gln Glu Thr Ser Asp Leu Val Phe Ser Gly 
                          645                 650                 655     
          Pro Lys Lys Pro Arg Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Thr Gln Glu Glu 
                      660                 665                 670         
          Ser Ser His Ser Leu Gln Arg Glu Ser Arg Pro Trp Glu Thr Glu Glu 
                  675                 680                 685             
          Glu Ser Glu Thr Glu Ala Leu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Val Pro Phe 
              690                 695                 700                 
          Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Lys Leu Arg Gln 
          705                 710                 715                 720 
          Gly Ile Lys Val Leu Phe Glu Gln Leu Ile Arg Thr Gln Gln Gly Val 
                          725                 730                 735     
          His Val Asn Pro Cys Leu Arg 
                      740             
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 194]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Ile Val Lys Asp Pro Ser Phe Gln Pro 
                  35                  40                  45              
          Thr Tyr Glu Ile Pro Gly Thr Gly Asn Ile Pro Arg Arg Ile Gln Val 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Pro Arg Val Leu Gly Pro His Tyr Ser Phe Arg Ser Trp Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Met Arg Arg His Thr Phe Ser Arg Ala Ser Ile Lys Arg Val Ser Glu 
                          85                  90                  95      
          Gln Gln Glu Thr Ser Asp Leu Val Phe Ser Gly Pro Lys Lys Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Thr Gln Glu Glu Ser Ser His Ser Leu 
                  115                 120                 125             
          Gln Arg Glu Ser Arg Pro Trp Glu Thr Glu Glu Glu Ser Glu Thr Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Val Pro Phe Gln Gln Gln Leu Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Lys Leu Arg Gln Gly Ile Lys Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Phe Glu Gln Leu Ile Arg Thr Gln Gln Gly Val His Val Asn Pro Cys 
                      180                 185                 190         
          Leu Arg 
          <![CDATA[<210> 23]]>
          <![CDATA[<211> 113]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 23]]>
          Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Ala Gln Lys Ser Leu Gly Ser Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gln Asn Lys Lys Pro Lys Lys Lys Ala His Ile His Ser Lys Glu Asn 
              50                  55                  60                  
          Arg Asp Arg Gly Arg Pro Arg Lys Lys Ala Arg Gln Lys Pro Ser Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Arg Ala Lys Arg Ser Pro Ser Asn Ser Ser Cys Ser Ser Ser Thr 
                          85                  90                  95      
          Lys Ser Ser Ser Ser Ser Asp Arg Glu Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser 
          <![CDATA[<210> 24]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 24]]>
          atggcgaag                                                                9
          <![CDATA[<210> 25]]>
          <![CDATA[<400> 25]]>
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          <![CDATA[<210> 26]]>
          <![CDATA[<400> 26]]>
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          <![CDATA[<210> 27]]>
          <![CDATA[<400> 27]]>
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          <![CDATA[<210> 28]]>
          <![CDATA[<400> 28]]>
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          <![CDATA[<210> 29]]>
          <![CDATA[<400> 29]]>
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          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<400> 30]]>
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          <![CDATA[<211> 2979]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 54]]>
          taataaatat tcaacaggaa aaccacctaa tttaaattgc cgaccacaaa ccgtcactta       60
          gttccccttt ttgcaacaac ttctgctttt ttccaactgc cggaaaacca cataatttgc      120
          atggctaacc acaaactgat atgctaatta acttccacaa aacaacttcc ccttttaaaa      180
          ccacacctac aaattaatta ttaaacacag tcacatcctg ggaggtacta ccacactata      240
          ataccaagtg cacttccgaa tggctgagtt tatgccgcta gacggagaac gcatcagtta      300
          ctgactgcgg actgaacttg ggcgggtgcc gaaggtgagt gaaaccaccg aagtcaaggg      360
          gcaattcggg ctagttcagt ctagcggaac gggcaagaaa cttaaaatta ttttattttt      420
          cagatgagcg actgctttaa accaacatgc tacaacaaca aaacaaagca aactcactgg      480
          attaataacc tgcatttaac ccacgacctg atctgcttct gcccaacacc aactagacac      540
          ttattactag ctttagcaga acaacaagaa acaattgaag tgtctaaaca agaaaaagaa      600
          aaaataacaa gatgccttat tactacagaa gaagacggta caactacaga cgtcctagat      660
          ggtatggacg aggttggatt agacgccctt ttcgcagaag atttcgaaga aaaagaaggg      720
          taagacctac ttatactact attcctctaa agcaatggca accgccatat aaaagaacat      780
          gctatataaa aggacaagac tgtttaatat actatagcaa cttaagactg ggaatgaata      840
          gtacaatgta tgaaaaaagt attgtacctg tacattggcc gggagggggt tctttttctg      900
          taagcatgtt aactttagat gccttgtatg atatacataa actttgtaga aactggtgga      960
          catccacaaa ccaagactta ccactagtaa gatataaagg atgcaaaata acattttatc     1020
          aaagcacatt tacagactac atagtaagaa tacatacaga actaccagct aacagtaaca     1080
          aactaacata cccaaacaca catccactaa tgatgatgat gtctaagtac aaacacatta     1140
          tacctagtag acaaacaaga agaaaaaaga aaccatacac aaaaatattt gtaaaaccac     1200
          ctccgcaatt tgaaaacaaa tggtactttg ctacagacct ctacaaaatt ccattactac     1260
          aaatacactg cacagcatgc aacttacaaa acccatttgt aaaaccagac aaattatcaa     1320
          acaatgttac attatggtca ctaaacacca taagcataca aaatagaaac atgtcagtgg     1380
          atcaaggaca atcatggcca tttaaaatac taggaacaca aagcttttat ttttactttt     1440
          acaccggagc aaacctacca ggtgacacaa cacaaatacc agtagcagac ctattaccac     1500
          taacaaaccc aagaataaac agaccaggac aatcactaaa tgaggcaaaa attacagacc     1560
          atattacttt cacagaatac aaaaacaaat ttacaaatta ttggggtaac ccatttaata     1620
          aacacattca agaacaccta gatatgatac tatactcact aaaaagtcca gaagcaataa     1680
          aaaacgaatg gacaacagaa aacatgaaat ggaaccaatt aaacaatgca ggaacaatgg     1740
          cattaacacc atttaacgag ccaatattca cacaaataca atataaccca gatagagaca     1800
          caggagaaga cactcaatta tacctactct ctaacgctac aggaacagga tgggacccac     1860
          caggaattcc agaattaata ctagaaggat ttccactatg gttaatatat tggggatttg     1920
          cagactttca aaaaaaccta aaaaaagtaa caaacataga cacaaattac atgttagtag     1980
          caaaaacaaa atttacacaa aaacctggca cattctactt agtaatacta aatgacacct     2040
          ttgtagaagg caatagccca tatgaaaaac aacctttacc tgaagacaac attaaatggt     2100
          acccacaagt acaataccaa ttagaagcac aaaacaaact actacaaact gggccattta     2160
          caccaaacat acaaggacaa ctatcagaca atatatcaat gttttataaa ttttacttta     2220
          aatggggagg aagcccacca aaagcaatta atgttgaaaa tcctgcccac cagattcaat     2280
          atcccatacc ccgtaacgag catgaaacaa cttcgttaca gagtccaggg gaagccccag     2340
          aatccatctt atactccttc gactatagac acgggaacta cacaacaaca gctttgtcac     2400
          gaattagcca agactgggca cttaaagaca ctgtttctaa aattacagag ccagatcgac     2460
          agcaactgct caaacaagcc ctcgaatgcc tgcaaatctc ggaagaaacg caggagaaaa     2520
          aagaaaaaga agtacagcag ctcatcagca acctcagaca gcagcagcag ctgtacagag     2580
          agcgaataat atcattatta aaggaccaat aacttttaac tgtgtaaaaa aggtgaaatt     2640
          gtttgatgat aaaccaaaaa accgtagatt tacacctgag gaatttgaaa ctgagttaca     2700
          aatagcaaaa tggttaaaga gacccccaag atcctttgta aatgatcctc ccttttaccc     2760
          atggttacca cctgaacctg ttgtaaactt taagcttaat tttactgaat aaaggccagc     2820
          attaattcac ttaaggagtc tgtttattta agttaaacct taataaacgg tcaccgcctc     2880
          cctaatacgc aggcgcagaa agggggctcc gcccccttta acccccaggg ggctccgccc     2940
          cctgaaaccc ccaagggggc tacgccccct tacaccccc                            2979
          <![CDATA[<210> 55]]>
          <![CDATA[<211> 99]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 55]]>
          Met Ser Asp Cys Phe Lys Pro Thr Cys Tyr Asn Asn Lys Thr Lys Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr His Trp Ile Asn Asn Leu His Leu Thr His Asp Leu Ile Cys Phe 
                      20                  25                  30          
          Cys Pro Thr Pro Thr Arg His Leu Leu Leu Ala Leu Ala Glu Gln Gln 
                  35                  40                  45              
          Glu Thr Ile Glu Val Ser Lys Gln Glu Lys Glu Lys Ile Thr Arg Cys 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile Thr Thr Glu Glu Asp Gly Thr Thr Thr Asp Val Leu Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Met Asp Glu Val Gly Leu Asp Ala Leu Phe Ala Glu Asp Phe Glu Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Gly 
          <![CDATA[<210> 56]]>
          <![CDATA[<211> 203]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 56]]>
          Met Ser Asp Cys Phe Lys Pro Thr Cys Tyr Asn Asn Lys Thr Lys Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr His Trp Ile Asn Asn Leu His Leu Thr His Asp Leu Ile Cys Phe 
                      20                  25                  30          
          Cys Pro Thr Pro Thr Arg His Leu Leu Leu Ala Leu Ala Glu Gln Gln 
                  35                  40                  45              
          Glu Thr Ile Glu Val Ser Lys Gln Glu Lys Glu Lys Ile Thr Arg Cys 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile Thr Thr Glu Glu Asp Gly Thr Thr Thr Asp Val Leu Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Met Asp Glu Val Gly Leu Asp Ala Leu Phe Ala Glu Asp Phe Glu Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Gly Phe Asn Ile Pro Tyr Pro Val Thr Ser Met Lys Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Arg Tyr Arg Val Gln Gly Lys Pro Gln Asn Pro Ser Tyr Thr Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Thr Ile Asp Thr Gly Thr Thr Gln Gln Gln Leu Cys His Glu Leu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Thr Gly His Leu Lys Thr Leu Phe Leu Lys Leu Gln Ser Gln Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Ser Asn Cys Ser Asn Lys Pro Ser Asn Ala Cys Lys Ser Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          Lys Arg Arg Arg Lys Lys Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Ser Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Ser Asp Ser Ser Ser Ser Cys Thr Glu Ser Glu 
                  195                 200             
          <![CDATA[<210> 57]]>
          <![CDATA[<211> 219]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 57]]>
          Met Ser Asp Cys Phe Lys Pro Thr Cys Tyr Asn Asn Lys Thr Lys Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr His Trp Ile Asn Asn Leu His Leu Thr His Asp Leu Ile Cys Phe 
                      20                  25                  30          
          Cys Pro Thr Pro Thr Arg His Leu Leu Leu Ala Leu Ala Glu Gln Gln 
                  35                  40                  45              
          Glu Thr Ile Glu Val Ser Lys Gln Glu Lys Glu Lys Ile Thr Arg Cys 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile Thr Thr Glu Glu Asp Gly Thr Thr Thr Asp Val Leu Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Met Asp Glu Val Gly Leu Asp Ala Leu Phe Ala Glu Asp Phe Glu Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Gly Ala Arg Ser Thr Ala Thr Ala Gln Thr Ser Pro Arg Met 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Asn Leu Gly Arg Asn Ala Gly Glu Lys Arg Lys Arg Ser Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Ala His Gln Gln Pro Gln Thr Ala Ala Ala Ala Val Gln Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Asn Asn Ile Ile Ile Lys Gly Pro Ile Thr Phe Asn Cys Val Lys Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Val Lys Leu Phe Asp Asp Lys Pro Lys Asn Arg Arg Phe Thr Pro Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Phe Glu Thr Glu Leu Gln Ile Ala Lys Trp Leu Lys Arg Pro Pro 
                      180                 185                 190         
          Arg Ser Phe Val Asn Asp Pro Pro Phe Tyr Pro Trp Leu Pro Pro Glu 
                  195                 200                 205             
          Pro Val Val Asn Phe Lys Leu Asn Phe Thr Glu 
              210                 215                 
          <![CDATA[<210> 58]]>
          <![CDATA[<211> 666]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 58]]>
          Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys Gln 
                  35                  40                  45              
          Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp Cys 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe Ser 
                          85                  90                  95      
          Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu Cys 
                      100                 105                 110         
          Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg Tyr 
                  115                 120                 125             
          Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr Ile 
              130                 135                 140                 
          Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His Ile 
                          165                 170                 175     
          Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys Ile 
                      180                 185                 190         
          Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala Thr 
                  195                 200                 205             
          Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys Asn 
              210                 215                 220                 
          Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser Val 
                          245                 250                 255     
          Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser Phe 
                      260                 265                 270         
          Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr Gln 
                  275                 280                 285             
          Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn Arg 
              290                 295                 300                 
          Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe Asn 
                          325                 330                 335     
          Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys Ser 
                      340                 345                 350         
          Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp Asn 
                  355                 360                 365             
          Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu Pro 
              370                 375                 380                 
          Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp Pro 
                          405                 410                 415     
          Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu Ile 
                      420                 425                 430         
          Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln Lys 
              450                 455                 460                 
          Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys Trp 
                          485                 490                 495     
          Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu Gln 
                      500                 505                 510         
          Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn Ile 
                  515                 520                 525             
          Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro Lys 
              530                 535                 540                 
          Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro 
                          565                 570                 575     
          Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr 
                      580                 585                 590         
          Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val 
                  595                 600                 605             
          Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu 
              610                 615                 620                 
          Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu 
          625                 630                 635                 640 
          Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg 
                          645                 650                 655     
          Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 
                      660                 665     
          <![CDATA[<210> 59]]>
          <![CDATA[<211> 148]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 59]]>
          Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Lys Arg Arg Ile Gln Tyr Pro Ile Pro Arg Asn Glu His Glu Thr 
                  35                  40                  45              
          Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro 
                          85                  90                  95      
          Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser 
                  115                 120                 125             
          Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Leu Lys Asp Gln 
          145             
          <![CDATA[<210> 60]]>
          <![CDATA[<211> 82]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 60]]>
          Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Lys Arg Arg Ser Gln Ile Asp Ser Asn Cys Ser Asn Lys Pro Ser 
                  35                  40                  45              
          Asn Ala Cys Lys Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Lys Lys Lys Lys Lys 
              50                  55                  60                  
          Tyr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Ser Asp Ser Ser Ser Ser Cys Thr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Glu 
          <![CDATA[<210> 61]]>
          <![CDATA[<400> 61]]>
          000
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          <![CDATA[<400> 62]]>
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          <![CDATA[<400> 63]]>
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          <![CDATA[<210> 64]]>
          <![CDATA[<400> 64]]>
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          <![CDATA[<400> 67]]>
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          <![CDATA[<400> 83]]>
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          <![CDATA[<400> 84]]>
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          <![CDATA[<400> 89]]>
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          <![CDATA[<211> 71]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 105]]>
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          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<400> 118]]>
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          <![CDATA[<211> 71]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 119]]>
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          sncncccccc cccgcgcat                                                    79
          <![CDATA[<210> 123]]>
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          c                                                                      121
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 156]]>
          cccccccccg cgcat                                                        15
          <![CDATA[<210> 157]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 157]]>
          gcgcggggcc ccccccc                                                      17
          <![CDATA[<210> 158]]>
          <![CDATA[<211> 13]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 158]]>
          gcggggggct ccg                                                          13
          <![CDATA[<210> 159]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 159]]>
          ccccccggcc ccccccg                                                      17
          <![CDATA[<210> 160]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 160]]>
          cgcgctgcgc gcgccgccca gtagggggag ccatgc                                 36
          <![CDATA[<210> 161]]>
          <![CDATA[<211> 78]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 161]]>
          ccgccatctt aagtagttga ggcggacggt ggcgtgagtt caaaggtcac catcagccac       60
          acctactcaa aatggtgg                                                     78
          <![CDATA[<210> 162]]>
          <![CDATA[<211> 172]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 162]]>
          cttaagtagt tgaggcggac ggtggcgtga gttcaaaggt caccatcagc cacacctact       60
          caaaatggtg gacaatttct tccgggtcaa aggttacagc cgccatgtta aaacacgtga      120
          cgtatgacgt cacggccgcc attttgtgac acaagatggc cgacttcctt cc              172
          <![CDATA[<210> 163]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 163]]>
          cgcgctgcgc gcgccgccca gtagggggag ccatgc                                 36
          <![CDATA[<210> 164]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 164]]>
          gcgctdcgcg cgcgcgccgg ggggctgcgc cccccc                                 36
          <![CDATA[<210> 165]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 165]]>
          gcgcttcgcg cgccgcccac tagggggcgt tgcgcg                                 36
          <![CDATA[<210> 166]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 166]]>
          gcgctgcgcg cgccgcccag tagggggcgc aatgcg                                 36
          <![CDATA[<210> 167]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 167]]>
          gcgctgcgcg cgcggccccc gggggaggca ttgcct                                 36
          <![CDATA[<210> 168]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 168]]>
          gcgctgcgcg cgcgcgccgg gggggcgcca gcgccc                                 36
          <![CDATA[<210> 169]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 169]]>
          gcgcttcgcg cgcgcgccgg ggggctccgc cccccc                                 36
          <![CDATA[<210> 170]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 170]]>
          gcgcttcgcg cgcgcgccgg ggggctgcgc cccccc                                 36
          <![CDATA[<210> 171]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 171]]>
          gcgctacgcg cgcgcgccgg ggggctgcgc cccccc                                 36
          <![CDATA[<210> 172]]>
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          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 172]]>
          gcgctacgcg cgcgcgccgg ggggctctgc cccccc                                 36
          <![CDATA[<210> 173]]>
          <![CDATA[<400> 173]]>
          000
          <![CDATA[<210> 174]]>
          <![CDATA[<400> 174]]>
          000
          <![CDATA[<210> 175]]>
          <![CDATA[<400> 175]]>
          000
          <![CDATA[<210> 176]]>
          <![CDATA[<400> 176]]>
          000
          <![CDATA[<210> 177]]>
          <![CDATA[<400> 177]]>
          000
          <![CDATA[<210> 178]]>
          <![CDATA[<400> 178]]>
          000
          <![CDATA[<210> 179]]>
          <![CDATA[<400> 179]]>
          000
          <![CDATA[<210> 180]]>
          <![CDATA[<400> 180]]>
          000
          <![CDATA[<210> 181]]>
          <![CDATA[<400> 181]]>
          000
          <![CDATA[<210> 182]]>
          <![CDATA[<400> 182]]>
          000
          <![CDATA[<210> 183]]>
          <![CDATA[<400> 183]]>
          000
          <![CDATA[<210> 184]]>
          <![CDATA[<400> 184]]>
          000
          <![CDATA[<210> 185]]>
          <![CDATA[<211> 743]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 185]]>
          Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Arg Lys Thr Arg Thr Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Phe Arg Arg 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Arg Lys Ala Lys Leu Ile Ile Lys Leu Trp Gln Pro Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Lys Arg Cys Arg Ile Lys Gly Tyr Ile Pro Leu Ile Ile Ser Gly 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Thr Phe Ala Thr Asn Phe Thr Ser His Ile Asn Asp Arg Ile 
                      100                 105                 110         
          Met Lys Gly Pro Phe Gly Gly Gly His Ser Thr Met Arg Phe Ser Leu 
                  115                 120                 125             
          Tyr Ile Leu Phe Glu Glu His Leu Arg His Met Asn Phe Trp Thr Arg 
              130                 135                 140                 
          Ser Asn Asp Asn Leu Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ala Ser Val Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Tyr Arg His Pro Asp Gln Asp Phe Ile Val Ile Tyr Asn Arg Arg 
                          165                 170                 175     
          Thr Pro Leu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Leu His Pro Gly 
                      180                 185                 190         
          Asn Ala Ile Leu Ala Lys His Lys Ile Leu Val Pro Ser Leu Gln Thr 
                  195                 200                 205             
          Arg Pro Lys Gly Arg Lys Ala Ile Arg Leu Arg Ile Ala Pro Pro Thr 
              210                 215                 220                 
          Leu Phe Thr Asp Lys Trp Tyr Phe Gln Lys Asp Ile Ala Asp Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Phe Asn Ile Met Ala Val Glu Ala Asp Leu Arg Phe Pro Phe Cys 
                          245                 250                 255     
          Ser Pro Gln Thr Asp Asn Thr Cys Ile Ser Phe Gln Val Leu Ser Ser 
                      260                 265                 270         
          Val Tyr Asn Asn Tyr Leu Ser Ile Asn Thr Phe Asn Asn Asp Asn Ser 
                  275                 280                 285             
          Asp Ser Lys Leu Lys Glu Phe Leu Asn Lys Ala Phe Pro Thr Thr Gly 
              290                 295                 300                 
          Thr Lys Gly Thr Ser Leu Asn Ala Leu Asn Thr Phe Arg Thr Glu Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Ile Ser His Pro Gln Leu Lys Lys Pro Asn Pro Gln Ile Asn Lys 
                          325                 330                 335     
          Pro Leu Glu Ser Gln Tyr Phe Ala Pro Leu Asp Ala Leu Trp Gly Asp 
                      340                 345                 350         
          Pro Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Asn Glu Asn Lys Ser Leu Asn Asp Ile 
                  355                 360                 365             
          Ile Glu Lys Ile Leu Ile Lys Asn Met Ile Thr Tyr His Ala Lys Leu 
              370                 375                 380                 
          Arg Glu Phe Pro Asn Ser Tyr Gln Gly Asn Lys Ala Phe Cys His Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Gly Ile Tyr Ser Pro Pro Tyr Leu Asn Gln Gly Arg Ile Ser Pro 
                          405                 410                 415     
          Glu Ile Phe Gly Leu Tyr Thr Glu Ile Ile Tyr Asn Pro Tyr Thr Asp 
                      420                 425                 430         
          Lys Gly Thr Gly Asn Lys Val Trp Met Asp Pro Leu Thr Lys Glu Asn 
                  435                 440                 445             
          Asn Ile Tyr Lys Glu Gly Gln Ser Lys Cys Leu Leu Thr Asp Met Pro 
              450                 455                 460                 
          Leu Trp Thr Leu Leu Phe Gly Tyr Thr Asp Trp Cys Lys Lys Asp Thr 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Asn Trp Asp Leu Pro Leu Asn Tyr Arg Leu Val Leu Ile Cys Pro 
                          485                 490                 495     
          Tyr Thr Phe Pro Lys Leu Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asp Tyr Gly Tyr 
                      500                 505                 510         
          Ile Pro Tyr Ser Tyr Lys Phe Gly Ala Gly Gln Met Pro Asp Gly Ser 
                  515                 520                 525             
          Asn Tyr Ile Pro Phe Gln Phe Arg Ala Lys Trp Tyr Pro Thr Val Leu 
              530                 535                 540                 
          His Gln Gln Gln Val Met Glu Asp Ile Ser Arg Ser Gly Pro Phe Ala 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Lys Val Glu Lys Pro Ser Thr Gln Leu Val Met Lys Tyr Cys Phe 
                          565                 570                 575     
          Asn Phe Asn Trp Gly Gly Asn Pro Ile Ile Glu Gln Ile Val Lys Asp 
                      580                 585                 590         
          Pro Ser Phe Gln Pro Thr Tyr Glu Ile Pro Gly Thr Gly Asn Ile Pro 
                  595                 600                 605             
          Arg Arg Ile Gln Val Ile Asp Pro Arg Val Leu Gly Pro His Tyr Ser 
              610                 615                 620                 
          Phe Arg Ser Trp Asp Met Arg Arg His Thr Phe Ser Arg Ala Ser Ile 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Arg Val Ser Glu Gln Gln Glu Thr Ser Asp Leu Val Phe Ser Gly 
                          645                 650                 655     
          Pro Lys Lys Pro Arg Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Thr Gln Glu Glu 
                      660                 665                 670         
          Ser Ser His Ser Leu Gln Arg Glu Ser Arg Pro Trp Glu Thr Glu Glu 
                  675                 680                 685             
          Glu Ser Glu Thr Glu Ala Leu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Val Pro Phe 
              690                 695                 700                 
          Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Lys Leu Arg Gln 
          705                 710                 715                 720 
          Gly Ile Lys Val Leu Phe Glu Gln Leu Ile Arg Thr Gln Gln Gly Val 
                          725                 730                 735     
          His Val Asn Pro Cys Leu Arg 
                      740             
          <![CDATA[<210> 186]]>
          <![CDATA[<211> 68]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 186]]>
          Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Arg Lys Thr Arg Thr Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Phe Arg Arg 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Arg Lys 
          65              
          <![CDATA[<210> 187]]>
          <![CDATA[<211> 212]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 187]]>
          Ala Lys Leu Ile Ile Lys Leu Trp Gln Pro Ala Val Ile Lys Arg Cys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ile Lys Gly Tyr Ile Pro Leu Ile Ile Ser Gly Asn Gly Thr Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Thr Asn Phe Thr Ser His Ile Asn Asp Arg Ile Met Lys Gly Pro 
                  35                  40                  45              
          Phe Gly Gly Gly His Ser Thr Met Arg Phe Ser Leu Tyr Ile Leu Phe 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu His Leu Arg His Met Asn Phe Trp Thr Arg Ser Asn Asp Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ala Ser Val Lys Ile Tyr Arg His 
                          85                  90                  95      
          Pro Asp Gln Asp Phe Ile Val Ile Tyr Asn Arg Arg Thr Pro Leu Gly 
                      100                 105                 110         
          Gly Asn Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Leu His Pro Gly Asn Ala Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Ala Lys His Lys Ile Leu Val Pro Ser Leu Gln Thr Arg Pro Lys Gly 
              130                 135                 140                 
          Arg Lys Ala Ile Arg Leu Arg Ile Ala Pro Pro Thr Leu Phe Thr Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Tyr Phe Gln Lys Asp Ile Ala Asp Leu Thr Leu Phe Asn Ile 
                          165                 170                 175     
          Met Ala Val Glu Ala Asp Leu Arg Phe Pro Phe Cys Ser Pro Gln Thr 
                      180                 185                 190         
          Asp Asn Thr Cys Ile Ser Phe Gln Val Leu Ser Ser Val Tyr Asn Asn 
                  195                 200                 205             
          Tyr Leu Ser Ile 
              210         
          <![CDATA[<210> 188]]>
          <![CDATA[<211> 133]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 188]]>
          Asn Thr Phe Asn Asn Asp Asn Ser Asp Ser Lys Leu Lys Glu Phe Leu 
          1               5                   10                  15      
          Asn Lys Ala Phe Pro Thr Thr Gly Thr Lys Gly Thr Ser Leu Asn Ala 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Thr Phe Arg Thr Glu Gly Cys Ile Ser His Pro Gln Leu Lys 
                  35                  40                  45              
          Lys Pro Asn Pro Gln Ile Asn Lys Pro Leu Glu Ser Gln Tyr Phe Ala 
              50                  55                  60                  
          Pro Leu Asp Ala Leu Trp Gly Asp Pro Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asn Lys Ser Leu Asn Asp Ile Ile Glu Lys Ile Leu Ile Lys Asn 
                          85                  90                  95      
          Met Ile Thr Tyr His Ala Lys Leu Arg Glu Phe Pro Asn Ser Tyr Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Asn Lys Ala Phe Cys His Leu Thr Gly Ile Tyr Ser Pro Pro Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Asn Gln Gly Arg 
              130             
          <![CDATA[<210> 189]]>
          <![CDATA[<211> 166]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 189]]>
          Ile Ser Pro Glu Ile Phe Gly Leu Tyr Thr Glu Ile Ile Tyr Asn Pro 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Thr Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Val Trp Met Asp Pro Leu Thr 
                      20                  25                  30          
          Lys Glu Asn Asn Ile Tyr Lys Glu Gly Gln Ser Lys Cys Leu Leu Thr 
                  35                  40                  45              
          Asp Met Pro Leu Trp Thr Leu Leu Phe Gly Tyr Thr Asp Trp Cys Lys 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Thr Asn Asn Trp Asp Leu Pro Leu Asn Tyr Arg Leu Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Cys Pro Tyr Thr Phe Pro Lys Leu Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asp 
                          85                  90                  95      
          Tyr Gly Tyr Ile Pro Tyr Ser Tyr Lys Phe Gly Ala Gly Gln Met Pro 
                      100                 105                 110         
          Asp Gly Ser Asn Tyr Ile Pro Phe Gln Phe Arg Ala Lys Trp Tyr Pro 
                  115                 120                 125             
          Thr Val Leu His Gln Gln Gln Val Met Glu Asp Ile Ser Arg Ser Gly 
              130                 135                 140                 
          Pro Phe Ala Pro Lys Val Glu Lys Pro Ser Thr Gln Leu Val Met Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Cys Phe Asn Phe Asn 
                          165     
          <![CDATA[<210> 190]]>
          <![CDATA[<211> 164]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> α細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 190]]>
          Trp Gly Gly Asn Pro Ile Ile Glu Gln Ile Val Lys Asp Pro Ser Phe 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Thr Tyr Glu Ile Pro Gly Thr Gly Asn Ile Pro Arg Arg Ile 
                      20                  25                  30          
          Gln Val Ile Asp Pro Arg Val Leu Gly Pro His Tyr Ser Phe Arg Ser 
                  35                  40                  45              
          Trp Asp Met Arg Arg His Thr Phe Ser Arg Ala Ser Ile Lys Arg Val 
              50                  55                  60                  
          Ser Glu Gln Gln Glu Thr Ser Asp Leu Val Phe Ser Gly Pro Lys Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Arg Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Thr Gln Glu Glu Ser Ser His 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Gln Arg Glu Ser Arg Pro Trp Glu Thr Glu Glu Glu Ser Glu 
                      100                 105                 110         
          Thr Glu Ala Leu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Val Pro Phe Gln Gln Gln 
                  115                 120                 125             
          Leu Gln Gln Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Lys Leu Arg Gln Gly Ile Lys 
              130                 135                 140                 
          Val Leu Phe Glu Gln Leu Ile Arg Thr Gln Gln Gly Val His Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Cys Leu Arg 
          <![CDATA[<210> 191]]>
          <![CDATA[<400> 191]]>
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          <![CDATA[<210> 192]]>
          <![CDATA[<400> 192]]>
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          <![CDATA[<400> 194]]>
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          <![CDATA[<400> 195]]>
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          <![CDATA[<400> 198]]>
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          <![CDATA[<400> 199]]>
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          <![CDATA[<400> 200]]>
          000
          <![CDATA[<210> 201]]>
          <![CDATA[<400> 201]]>
          000
          <![CDATA[<210> 202]]>
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          000
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          <![CDATA[<400> 209]]>
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          <![CDATA[<400> 213]]>
          000
          <![CDATA[<210> 214]]>
          <![CDATA[<400> 214]]>
          000
          <![CDATA[<210> 215]]>
          <![CDATA[<211> 666]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 215]]>
          Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys Gln 
                  35                  40                  45              
          Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp Cys 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe Ser 
                          85                  90                  95      
          Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu Cys 
                      100                 105                 110         
          Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg Tyr 
                  115                 120                 125             
          Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr Ile 
              130                 135                 140                 
          Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His Ile 
                          165                 170                 175     
          Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys Ile 
                      180                 185                 190         
          Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala Thr 
                  195                 200                 205             
          Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys Asn 
              210                 215                 220                 
          Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser Val 
                          245                 250                 255     
          Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser Phe 
                      260                 265                 270         
          Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr Gln 
                  275                 280                 285             
          Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn Arg 
              290                 295                 300                 
          Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe Asn 
                          325                 330                 335     
          Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys Ser 
                      340                 345                 350         
          Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp Asn 
                  355                 360                 365             
          Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu Pro 
              370                 375                 380                 
          Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp Pro 
                          405                 410                 415     
          Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu Ile 
                      420                 425                 430         
          Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln Lys 
              450                 455                 460                 
          Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys Trp 
                          485                 490                 495     
          Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu Gln 
                      500                 505                 510         
          Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn Ile 
                  515                 520                 525             
          Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro Lys 
              530                 535                 540                 
          Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro 
                          565                 570                 575     
          Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr 
                      580                 585                 590         
          Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val 
                  595                 600                 605             
          Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu 
              610                 615                 620                 
          Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu 
          625                 630                 635                 640 
          Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg 
                          645                 650                 655     
          Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 
                      660                 665     
          <![CDATA[<210> 216]]>
          <![CDATA[<211> 38]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 216]]>
          Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Lys Arg Arg Val Arg 
                  35              
          <![CDATA[<210> 217]]>
          <![CDATA[<211> 208]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 217]]>
          Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro 
                  35                  40                  45              
          Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe Ser Val Ser Met Leu Thr Leu 
              50                  55                  60                  
          Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr Ile Val Arg Ile His Thr Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu 
                  115                 120                 125             
          Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr 
              130                 135                 140                 
          Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys Ile Phe Val Lys Pro Pro Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro 
                          165                 170                 175     
          Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val 
                      180                 185                 190         
          Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val Thr Leu Trp Ser Leu Asn Thr 
                  195                 200                 205             
          <![CDATA[<210> 218]]>
          <![CDATA[<211> 128]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> β細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 218]]>
          Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser Val Asp Gln Gly Gln Ser Trp 
          1               5                   10                  15      
          Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser Phe Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr Gln Ile Pro Val Ala Asp Leu 
                  35                  40                  45              
          Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn Arg Pro Gly Gln Ser Leu Asn 
              50                  55                  60                  
          Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr Phe Thr Glu Tyr Lys Asn Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe Asn Lys His Ile Gln Glu His 
                          85                  90                  95      
          Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys Ser Pro Glu Ala Ile Lys Asn 
                      100                 105                 110         
          Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp Asn Gln Leu Asn Asn Ala Gly 
                  115                 120                 125             
          <![CDATA[<210> 219]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<400> 219]]>
          Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu Pro Ile Phe Thr Gln Ile Gln 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu Asp Thr Gln Leu Tyr Leu Leu 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp Pro Pro Gly Ile Pro Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu Ile Tyr Trp Gly Phe Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr Asn Ile Asp Thr Asn Tyr Met 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln Lys Pro Gly Thr Phe Tyr Leu 
                          85                  90                  95      
          Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu Gly Asn Ser Pro Tyr Glu Lys 
                      100                 105                 110         
          Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys Trp Tyr Pro Gln Val Gln Tyr 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu Gln Thr Gly Pro Phe Thr Pro 
              130                 135                 140                 
          Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn Ile Ser Met Phe Tyr Lys Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Phe Lys 
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          <![CDATA[<400> 220]]>
          Trp Gly Gly Ser Pro Pro Lys Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Gln Tyr Pro Ile Pro Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu 
                      20                  25                  30          
          Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp 
              50                  55                  60                  
          Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr 
                          85                  90                  95      
          Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg 
                      100                 105                 110         
          Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp 
                  115                 120                 125             
          Gln 
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          <![CDATA[<400> 227]]>
          Leu Val Leu Thr Gln Trp Gln Pro Asn Thr Val Arg Arg Cys Tyr Ile 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gly Tyr Leu Pro Leu Ile Ile Cys Gly Glu Asn Xaa Xaa Xaa Thr 
                      20                  25                  30          
          Thr Ser Arg Asn Tyr Ala Thr His Ser Asp Asp Thr Ile Gln Lys Gly 
                  35                  40                  45              
          Pro Phe Gly Gly Gly Met Ser Thr Thr Thr Phe Ser Leu Arg Val Leu 
              50                  55                  60                  
          Tyr Asp Glu Tyr Gln Arg Phe Met Asn Arg Trp Thr Tyr Ser Asn Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Leu Asp Leu Ala Arg Tyr Leu Gly Cys Lys Phe Thr Phe Tyr Arg 
                          85                  90                  95      
          His Pro Asp Xaa Asp Phe Ile Val Gln Tyr Asn Thr Asn Pro Pro Phe 
                      100                 105                 110         
          Lys Asp Thr Lys Leu Thr Ala Pro Ser Ile His Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 
                  115                 120                 125             
          Xaa Gly Met Leu Met Leu Ser Lys Arg Lys Ile Leu Ile Pro Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Lys Thr Arg Pro Lys Gly Lys His Tyr Val Lys Val Arg Ile Gly Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Lys Leu Phe Glu Asp Lys Trp Tyr Thr Gln Ser Asp Leu Cys Asp 
                          165                 170                 175     
          Val Pro Leu Val Xaa Leu Tyr Ala Thr Ala Ala Asp Leu Gln His Pro 
                      180                 185                 190         
          Phe Gly Ser Pro Gln Thr Asp Asn Pro Cys Val Thr Phe Gln Val Leu 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Xaa Tyr Asn Lys His Leu Ser Ile Ser Pro 
              210                 215                 220 
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          Ser Asn Phe Glu Phe Pro Gly Ala Tyr Thr Asp Ile Thr Tyr Asn Pro 
          1               5                   10                  15      
          Leu Thr Asp Lys Gly Val Gly Asn Met Val Trp Ile Gln Tyr Leu Thr 
                      20                  25                  30          
          Lys Pro Asp Thr Ile Xaa Asp Lys Thr Gln Ser Xaa Xaa Xaa Lys Cys 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Glu Asp Leu Pro Leu Trp Ala Ala Leu Tyr Gly Tyr Val Asp 
              50                  55                  60                  
          Phe Cys Glu Lys Glu Thr Gly Asp Ser Ala Ile Ile Xaa Asn Xaa Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Leu Ile Arg Cys Pro Tyr Thr Lys Pro Pro Leu Tyr Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Lys Gly Phe Val Pro Tyr Ser Thr Asn Phe 
                      100                 105                 110         
          Gly Asn Gly Lys Met Pro Gly Gly Ser Gly Tyr Val Pro Ile Tyr Trp 
                  115                 120                 125             
          Arg Ala Arg Trp Tyr Pro Thr Leu Phe His Gln Lys Glu Val Leu Glu 
              130                 135                 140                 
          Asp Ile Val Gln Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Lys Asp Glu Lys Pro Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Gln Leu Val Met Lys Tyr Cys Phe Asn Phe Asn 
                          165                 170         
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          Trp Gly Gly Asn Pro Ile Ser Gln Gln Val Val Arg Asn Pro Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asp Ser Gly Xaa Xaa Xaa Ser Gly Xaa Gly Arg Gln Pro Arg Ser Val 
                      20                  25                  30          
          Gln Val Val Asp Pro Lys Tyr Met Gly Pro Glu Tyr Thr Phe His Ser 
                  35                  40                  45              
          Trp Asp Trp Arg Arg Gly Leu Phe Gly Glu Lys Ala Ile Lys Arg Met 
              50                  55                  60                  
          Ser Glu Gln Pro Thr Asp Asp Glu Ile Phe Thr Gly Gly Xaa Pro Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Pro Arg Arg Asp Pro Pro Thr Xaa Gln Xaa Pro Glu Glu Xaa Xaa 
                          85                  90                  95      
          Xaa Xaa Gln Lys Glu Ser Ser Ser Phe Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
                      100                 105                 110         
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Trp Glu Ser Ser Ser Gln Glu 
                  115                 120                 125             
          Xaa Glu Ser Glu Ser Gln Glu Glu Glu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
              130                 135                 140                 
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
          145                 150                 155                 160 
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gln Thr Val Gln Gln Gln Leu 
                          165                 170                 175     
          Arg Gln Gln Leu Arg Glu Gln Arg Arg Leu Arg Val Gln Leu Gln Leu 
                      180                 185                 190         
          Leu Phe Gln Gln Leu Leu Lys Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Ala Gly Leu 
                  195                 200                 205             
          His Ile Asn Pro Leu Leu Leu Ser Gln Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
              210                 215                 220                 
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
          225                 230                 235                 240 
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
                          245                 250                 255     
          Xaa Xaa 
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<222> (138)..(141)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
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          <![CDATA[<221> SITE]]>
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          <![CDATA[<222> (179)..(179)]]>
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          <![CDATA[<400> 230]]>
          Leu Lys Gln Trp Gln Pro Ser Thr Ile Arg Lys Cys Lys Ile Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Leu Pro Leu Phe Gln Cys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Asn Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Gln Tyr Lys Glu Ser Ile Val Pro His His Glu Pro Gly Gly Gly 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ser Ile Gln Gln Phe Thr Leu Gly Ala Leu Tyr Glu Glu His 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Leu Arg Asn Trp Trp Thr Lys Ser Asn Asp Gly Leu Pro Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Val Arg Tyr Leu Gly Cys Thr Ile Lys Leu Tyr Arg Ser Glu Asp Thr 
                          85                  90                  95      
          Asp Tyr Ile Val Thr Tyr Gln Arg Cys Tyr Pro Met Thr Ala Thr Lys 
                      100                 105                 110         
          Leu Thr Tyr Leu Ser Thr Gln Pro Ser Arg Met Leu Met Asn Lys His 
                  115                 120                 125             
          Lys Ile Ile Val Pro Ser Lys Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Lys Lys 
              130                 135                 140                 
          Lys Lys Pro Tyr Lys Lys Ile Phe Ile Lys Pro Pro Ser Gln Met Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Lys Trp Tyr Phe Gln Gln Asp Ile Ala Asn Thr Pro Leu Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Leu Thr Xaa Thr Ala Cys Ser Leu Asp Arg Met Tyr Leu Ser Ser Asp 
                      180                 185                 190         
          Ser Ile Ser Asn Asn Ile Thr Phe Thr Ser Leu Asn Thr Asn Phe Phe 
                  195                 200                 205             
          Gln Asn Pro Asn Phe Gln 
              210                 
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          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Leu Tyr Phe Glu 
          1               5                   10                  15      
          Cys Arg Tyr Asn Pro Phe Lys Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Val Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Val Ser Asn Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Gly Trp 
                  35                  40                  45              
          Asp Pro Pro Thr Asp Pro Asp Leu Ile Ile Glu Gly Phe Pro Leu Trp 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Leu Trp Gly Trp Leu Asp Trp Gln Lys Lys Leu Gly Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Asn Ile Asp Thr Asp Tyr Ile Leu Val Ile Gln Ser Xaa Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ile Pro Pro Xaa Xaa Xaa Lys Leu Pro Tyr Tyr Val Pro Leu Asp Xaa 
                      100                 105                 110         
          Asp Xaa Xaa Phe Leu His Gly Arg Ser Pro Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
                  115                 120                 125             
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Ser Asp Lys Gln 
              130                 135                 140                 
          His Trp His Pro Lys Val Arg Phe Gln Xaa Glu Thr Ile Asn Asn Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Lys Leu Pro Asn Gln Lys Ser Ile 
                          165                 170                 175     
          Gln Ala His Met Lys Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys 
                      180                 185         
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          Trp Gly Gly Cys Pro Ala Pro Met Glu Thr Ile Thr Asp Pro Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Lys Tyr Pro Ile Pro Asn Asn Leu Leu Gln Thr Thr Ser Leu 
                      20                  25                  30          
          Gln Xaa Pro Thr Thr Pro Ile Glu Thr Tyr Leu Tyr Lys Phe Asp Glu 
                  35                  40                  45              
          Arg Arg Gly Leu Leu Thr Lys Lys Ala Ala Lys Arg Ile Lys Lys Asp 
              50                  55                  60                  
          Xaa Thr Thr Glu Thr Thr Leu Phe Thr Asp Thr Gly Xaa Xaa Thr Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Thr Leu Pro Thr Xaa Xaa Gln Thr Glu Thr Thr Gln Glu Glu Xaa 
                          85                  90                  95      
          Thr Ser Glu Glu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Thr Leu Leu Gln Gln 
                      100                 105                 110         
          Leu Gln Gln Leu Arg Arg Lys Gln Lys Gln Leu Arg Xaa Arg Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Leu Gln Leu Leu Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
              130                 135                 140                 
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
          145                 150                 155                 160 
          Xaa Xaa Xaa 
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          Thr Ile Pro Leu Lys Gln Trp Gln Pro Glu Ser Ile Arg Lys Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly Tyr Gly Thr Leu Val Leu Gly Ala Glu Gly Arg Gln Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Cys Tyr Thr Asn Glu Lys Asp Glu Tyr Thr Pro Pro Lys Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Gly Phe Gly Val Glu Leu Phe Ser Leu Glu Tyr Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Gln Trp Lys Ala Arg Asn Asn Ile Trp Thr Lys Ser Asn Xaa Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Asp Leu Cys Arg Tyr Thr Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Arg His 
                          85                  90                  95      
          Pro Thr Thr Asp Phe Ile Val Xaa Tyr Ser Arg Gln Pro Pro Phe Glu 
                      100                 105                 110         
          Ile Asp Lys Xaa Thr Tyr Met Xaa Xaa His Pro Gln Xaa Leu Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Arg Lys His Lys Lys Ile Ile Leu Ser Lys Ala Thr Asn Pro Lys Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Phe Phe Gln Lys Gln Phe Ala Xaa Tyr Gly Leu Val Gln Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ala Ala Ala Cys Asx Leu Arg Tyr Pro Arg Leu Gly Cys Cys Asn 
                      180                 185                 190         
          Glu Asn Arg Leu Ile Thr Leu Tyr Tyr Leu Asn 
                  195                 200             
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          Leu Pro Ile Val Val Ala Arg Tyr Asn Pro Ala Xaa Asp Thr Gly Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly Asn Lys Xaa Trp Leu Xaa Ser Thr Leu Asn Gly Ser Xaa Trp Ala 
                      20                  25                  30          
          Pro Pro Thr Thr Asp Lys Asp Leu Ile Ile Glu Gly Leu Pro Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Leu Tyr Gly Tyr Trp Ser Tyr Xaa Lys Lys Val Lys Lys Asp 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Ile Leu Gln Ser His Met Phe Val Val Lys Ser Pro Ala Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Leu Xaa Thr Ala Thr Thr Gln Xaa Thr Phe Tyr Pro Xaa Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Asn Ser Phe Ile Gln Gly Lys Xaa Pro Tyr Asp Glu Pro Xaa Thr 
                      100                 105                 110         
          Xaa Asn Gln Lys Lys Leu Trp Tyr Pro Thr Leu Glu His Gln Gln Glu 
                  115                 120                 125             
          Thr Ile Asn Ala Ile Val Glu Ser Gly Pro Tyr Val Pro Lys Leu Asp 
              130                 135                 140                 
          Asn Gln Lys Asn Ser Thr Trp Glu Leu Xaa Tyr Xaa Tyr Thr Phe Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Lys 
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          Trp Gly Gly Pro Gln Ile Pro Asp Gln Pro Val Glu Asp Pro Lys Xaa 
          1               5                   10                  15      
          Gln Gly Thr Tyr Pro Val Pro Asp Thr Xaa Gln Gln Thr Ile Gln Ile 
                      20                  25                  30          
          Xaa Asn Pro Leu Lys Gln Lys Pro Glu Thr Met Phe His Asp Trp Asp 
                  35                  40                  45              
          Tyr Arg Arg Gly Ile Ile Thr Ser Thr Ala Leu Lys Arg Met Gln Glu 
              50                  55                  60                  
          Asn Leu Glu Thr Asp Ser Ser Phe Xaa Ser Asp Ser Glu Glu Thr Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Xaa Xaa Lys Lys Lys Lys Arg Leu Thr Xaa Glu Leu Pro Xaa Pro Gln 
                          85                  90                  95      
          Glu Glu Thr Glu Glu Ile Gln Ser Cys Leu Leu Ser Leu Cys Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Ser Thr Cys Gln Glu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asn Leu Gln 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Ile His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Lys His Asn 
              130                 135                 140                 
          Ile Leu Lys Leu Leu Ser Asp Leu Lys Glx Lys Gln Arg Leu Leu Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Gln Thr Gly Ile Leu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
                          165                 170                 175     
          Xaa 
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          gccauuuuaa guagcugacg ucaaggauug acguaaaggu uaaaggucau ccucggcgga       60
          agcuacacaa aauggu                                                       76
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          <![CDATA[<400> 301]]>
          gcguacguca caagucacgu ggaggggacc cgcuguaacc cggaaguagg ccccgucacg       60
          ugacuuacca cgugugua                                                     78
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          gccauuuuaa guagcugacg ucaaggauug acgugaaggu uaaaggucau ccucggcgga       60
          agcuacacaa aauggug                                                      77
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          gcacacguca uaagucacgu gguggggacc cgcuguaacc cggaaguagg ccccgucacg       60
          ugauuuguca cgugugua                                                     78
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          cuuccggguc auaggucaca ccuacgucac aagucacgug gggaggguug gcguauagcc       60
          cggaag                                                                  66
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          gccggggggc ugccgccccc cccggggaaa ggggggggcc ccccccgggg ggggguuugc       60
          cccccggc                                                                68
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          gacugugacg uguguggc                                                     78
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          cauuuuaagu aaggcggaag cagcucggcg uacacaaaau ggcggcggag cacuuccggc       60
          uugcccaaaa ugg                                                          73
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          gucacaaguc acguggggag gguuggcguu uaacccggaa gccaauccuc uuacguggcc       60
          ugucacguga c                                                            71
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          cgaccgcguc ccgaaggcgg guacccgagg ugaguuuaca caccgagguu aagggccaau       60
          ucgggcuugg                                                              70
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          ccgccauuuu gugacuuccu uccgcuuuuu caaaaaaaaa gaggaagugu gacguagcgg       60
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          cgccaucuua aguaguugag gcggacggug gcgugaguuc aaaggucacc aucagccaca       60
          ccuacucaaa auggug                                                       76
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          cuugcccaaa aug                                                          73
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          cguggccugu cacgu                                                        75
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          uacacaaaau gg                                                           72
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          uccucggcgg uaaccgcaaa                                                   20
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          ccgagcgtta gcgaggagtg cgaccctacc ccctgggccc acttcttcgg agccgcgcgc       60
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          gcgcggggcc cccccccgcg gggggctccg ccccccggcc cccc                       104
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          <![CDATA[<222> (7)..(7)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (9)..(10)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
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          Tyr Asn Pro Xaa Xaa Asp Xaa Gly Xaa Xaa Asn 
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          taaaatggcg ggagccaatc attttatact ttcactttcc aattaaaaat ggccacgtca       60
          caaacaaggg gtggagccat ttaaactata taactaagtg gggtggcgaa tggctgagtt      120
          taccccgcta gacggtgcag ggaccggatc gagcgcagcg aggaggtccc cggctgccca      180
          tgggcgggag ccgaggtgag tgaaaccacc gaggtctagg ggcaattcgg gctagggcag      240
          tctagcggaa cgggcaagaa acttaaaaca atatttgttt tacagatggt tagtatatcc      300
          tcaagtgatt tttttaagaa aacgaaattt aatgaggaga cgcagaacca agtatggatg      360
          tctcaaattg ctgactctca tgataatatc tgcagttgct ggcatccatt tgctcacctt      420
          cttgcttcca tatttcctcc tggccacaaa gatcgtgatc ttactattaa ccaaattctt      480
          ctaagagatt ataaagaaaa atgccattct ggtggagaag aaggagaaaa ttctggacca      540
          acaacaggtt taattacacc aaaagaagaa gatatagaaa aagatggccc agaaggcgcc      600
          gcagaagaag accatacaga cgccctgttc gccgccgccg tagaaaactt cgaaaggtaa      660
          agagaaaaaa aaaatcttta attgttagac aatggcaacc agacagtata agaacttgta      720
          aaattatagg acagtcagct atagttgttg gggctgaagg aaagcaaatg tactgttata      780
          ctgtcaataa gttaattaat gtgcccccaa aaacaccata tgggggaggc tttggagtag      840
          accaatacac actgaaatac ttatatgaag aatacagatt tgcacaaaac atttggacac      900
          aatctaatgt actgaaagac ttatgcagat acataaatgt taagctaata ttctacagag      960
          acaacaaaac agactttgtc ctttcctatg acagaaaccc accttttcaa ctaacaaaat     1020
          ttacataccc aggagcacac ccacaacaaa tcatgcttca aaaacaccac aaattcatac     1080
          tatcacaaat gacaaagcct aatggaagac taacaaaaaa actcaaaatt aaacctccta     1140
          aacaaatgct ttctaaatgg ttcttttcaa aacaattctg taaataccct ttactatctc     1200
          ttaaagcttc tgcactagac cttaggcact cttacctagg ctgctgtaat gaaaatccac     1260
          aggtattttt ttattattta aaccatggat actacacaat aacaaactgg ggagcacaat     1320
          cctcaacagc atacagacct aactccaagg tgacagacac aacatactac agatacaaaa     1380
          atgacagaaa aaatattaac attaaaagcc atgaatacga aaaaagtata tcatatgaaa     1440
          acggttattt tcaatctagt ttcttacaaa cacagtgcat atataccagt gagcgtggtg     1500
          aagcctgtat agcagaaaaa ccactaggaa tagctattta caatccagta aaagacaatg     1560
          gagatggtaa tatgatatac cttgtaagca ctctagcaaa cacttgggac cagcctccaa     1620
          aagacagtgc tattttaata caaggagtac ccatatggct aggcttattt ggatatttag     1680
          actactgtag acaaattaaa gctgacaaaa catggctaga cagtcatgta ctagtaattc     1740
          aaagtcctgc tatttttact tacccaaatc caggagcagg caaatggtat tgtccactat     1800
          cacaaagttt tataaatggc aatggtccgt ttaatcaacc acctacactg ctacaaaaag     1860
          caaagtggtt tccacaaata caataccaac aagaaattat taatagcttt gtagaatcag     1920
          gaccatttgt tcccaaatat gcaaatcaaa ctgaaagcaa ctgggaacta aaatataaat     1980
          atgtttttac atttaagtgg ggtggaccac aattccatga accagaaatt gctgacccta     2040
          gcaaacaaga gcagtatgat gtccccgata ctttctacca aacaatacaa attgaagatc     2100
          cagaaggaca agaccccaga tctctcatcc atgattggga ctacagacga ggctttatta     2160
          aagaaagatc tcttaaaaga atgtcaactt acttctcaac tcatacagat cagcaagcaa     2220
          cttcagagga agacattccc aaaaagaaaa agagaattgg accccaactc acagtcccac     2280
          aacaaaaaga agaggagaca ctgtcatgtc tcctctctct ctgcaaaaaa gataccttcc     2340
          aagaaacaga gacacaagaa gacctccagc agctcatcaa gcagcagcag gagcagcagc     2400
          tcctcctcaa gagaaacatc ctccagctca tccacaaact aaaagagaat caacaaatgc     2460
          ttcagcttca cacaggcatg ttaccttaac cagatttaaa cctggatttg aagagcaaac     2520
          agagagagaa ttagcaatta tatttcatag gccccctaga acctacaaag aggaccttcc     2580
          attctatccc tggctaccac ctgcacccct tgtacaattt aaccttaact tcaaaggcta     2640
          ggccaacaat gtacacttag taaagcatgt ttattaaagc acaaccccca aaataaatgt     2700
          aaaaataaaa aaaaaaaaaa aaaaataaaa aattgcaaaa attcggcgct cgcgcgcatg     2760
          tgcgcctctg gcgcaaatca cgcaacgctc gcgcgcccgc gtatgtctct ttaccacgca     2820
          cctagattgg ggtgcgcgcg ctagcgcgcg caccccaatg cgccccgccc tcgttccgac     2880
          ccgcttgcgc gggtcggacc acttcgggct cgggggggcg cgcctgcggc gcttttttac     2940
          taaacagact ccgagccgcc atttggcccc ctaagctccg cccccctcat gaatattcat     3000
          aaaggaaacc acataattag aattgccgac cacaaactgc catatgctaa ttagttcccc     3060
          ttttacaaag taaaagggga agtgaacata gccccacacc cgcaggggca aggccccgca     3120
          cccctacgtc actaaccacg cccccgccgc catcttgggt gcggcagggc gggggc         3176
          <![CDATA[<210> 887]]>
          <![CDATA[<211> 124]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 887]]>
          Met Val Ser Ile Ser Ser Ser Asp Phe Phe Lys Lys Thr Lys Phe Asn 
          1               5                   10                  15      
          Glu Glu Thr Gln Asn Gln Val Trp Met Ser Gln Ile Ala Asp Ser His 
                      20                  25                  30          
          Asp Asn Ile Cys Ser Cys Trp His Pro Phe Ala His Leu Leu Ala Ser 
                  35                  40                  45              
          Ile Phe Pro Pro Gly His Lys Asp Arg Asp Leu Thr Ile Asn Gln Ile 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Arg Asp Tyr Lys Glu Lys Cys His Ser Gly Gly Glu Glu Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asn Ser Gly Pro Thr Thr Gly Leu Ile Thr Pro Lys Glu Glu Asp 
                          85                  90                  95      
          Ile Glu Lys Asp Gly Pro Glu Gly Ala Ala Glu Glu Asp His Thr Asp 
                      100                 105                 110         
          Ala Leu Phe Ala Ala Ala Val Glu Asn Phe Glu Arg 
                  115                 120                 
          <![CDATA[<210> 888]]>
          <![CDATA[<211> 271]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 888]]>
          Met Val Ser Ile Ser Ser Ser Asp Phe Phe Lys Lys Thr Lys Phe Asn 
          1               5                   10                  15      
          Glu Glu Thr Gln Asn Gln Val Trp Met Ser Gln Ile Ala Asp Ser His 
                      20                  25                  30          
          Asp Asn Ile Cys Ser Cys Trp His Pro Phe Ala His Leu Leu Ala Ser 
                  35                  40                  45              
          Ile Phe Pro Pro Gly His Lys Asp Arg Asp Leu Thr Ile Asn Gln Ile 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Arg Asp Tyr Lys Glu Lys Cys His Ser Gly Gly Glu Glu Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asn Ser Gly Pro Thr Thr Gly Leu Ile Thr Pro Lys Glu Glu Asp 
                          85                  90                  95      
          Ile Glu Lys Asp Gly Pro Glu Gly Ala Ala Glu Glu Asp His Thr Asp 
                      100                 105                 110         
          Ala Leu Phe Ala Ala Ala Val Glu Asn Phe Glu Ser Gly Val Asp His 
                  115                 120                 125             
          Asn Ser Met Asn Gln Lys Leu Leu Thr Leu Ala Asn Lys Ser Ser Met 
              130                 135                 140                 
          Met Ser Pro Ile Leu Ser Thr Lys Gln Tyr Lys Leu Lys Ile Gln Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Lys Thr Pro Asp Leu Ser Ser Met Ile Gly Thr Thr Asp Glu Ala 
                          165                 170                 175     
          Leu Leu Lys Lys Asp Leu Leu Lys Glu Cys Gln Leu Thr Ser Gln Leu 
                      180                 185                 190         
          Ile Gln Ile Ser Lys Gln Leu Gln Arg Lys Thr Phe Pro Lys Arg Lys 
                  195                 200                 205             
          Arg Glu Leu Asp Pro Asn Ser Gln Ser His Asn Lys Lys Lys Arg Arg 
              210                 215                 220                 
          His Cys His Val Ser Ser Leu Ser Ala Lys Lys Ile Pro Ser Lys Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Arg His Lys Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Ser 
                          245                 250                 255     
          Ser Ser Ser Ser Ser Arg Glu Thr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Asn 
                      260                 265                 270     
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          <![CDATA[<400> 889]]>
          Met Val Ser Ile Ser Ser Ser Asp Phe Phe Lys Lys Thr Lys Phe Asn 
          1               5                   10                  15      
          Glu Glu Thr Gln Asn Gln Val Trp Met Ser Gln Ile Ala Asp Ser His 
                      20                  25                  30          
          Asp Asn Ile Cys Ser Cys Trp His Pro Phe Ala His Leu Leu Ala Ser 
                  35                  40                  45              
          Ile Phe Pro Pro Gly His Lys Asp Arg Asp Leu Thr Ile Asn Gln Ile 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Arg Asp Tyr Lys Glu Lys Cys His Ser Gly Gly Glu Glu Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asn Ser Gly Pro Thr Thr Gly Leu Ile Thr Pro Lys Glu Glu Asp 
                          85                  90                  95      
          Ile Glu Lys Asp Gly Pro Glu Gly Ala Ala Glu Glu Asp His Thr Asp 
                      100                 105                 110         
          Ala Leu Phe Ala Ala Ala Val Glu Asn Phe Glu Arg Ser Ala Ser Asn 
                  115                 120                 125             
          Phe Arg Gly Arg His Ser Gln Lys Glu Lys Glu Asn Trp Thr Pro Thr 
              130                 135                 140                 
          His Ser Pro Thr Thr Lys Arg Arg Gly Asp Thr Val Met Ser Pro Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Leu Gln Lys Arg Tyr Leu Pro Arg Asn Arg Asp Thr Arg Arg Pro 
                          165                 170                 175     
          Pro Ala Ala His Gln Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Pro Pro Gln Glu 
                      180                 185                 190         
          Lys His Pro Pro Ala His Pro Gln Thr Lys Arg Glu Ser Thr Asn Ala 
                  195                 200                 205             
          Ser Ala Ser His Arg His Val Thr Leu Thr Arg Phe Lys Pro Gly Phe 
              210                 215                 220                 
          Glu Glu Gln Thr Glu Arg Glu Leu Ala Ile Ile Phe His Arg Pro Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Thr Tyr Lys Glu Asp Leu Pro Phe Tyr Pro Trp Leu Pro Pro Ala 
                          245                 250                 255     
          Pro Leu Val Gln Phe Asn Leu Asn Phe Lys Gly 
                      260                 265         
          <![CDATA[<210> 890]]>
          <![CDATA[<211> 50]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 890]]>
          Met Arg Arg Arg Arg Thr Lys Tyr Gly Cys Leu Lys Leu Leu Thr Leu 
          1               5                   10                  15      
          Met Ile Ile Ser Ala Val Ala Gly Ile His Leu Leu Thr Phe Leu Leu 
                      20                  25                  30          
          Pro Tyr Phe Leu Leu Ala Thr Lys Ile Val Ile Leu Leu Leu Thr Lys 
                  35                  40                  45              
          Phe Phe 
              50  
          <![CDATA[<210> 891]]>
          <![CDATA[<211> 662]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 891]]>
          Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 
          1               5                   10                  15      
          Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Arg Lys Val Lys Arg Lys Lys Lys Ser Leu Ile Val Arg Gln 
              50                  55                  60                  
          Trp Gln Pro Asp Ser Ile Arg Thr Cys Lys Ile Ile Gly Gln Ser Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Val Val Gly Ala Glu Gly Lys Gln Met Tyr Cys Tyr Thr Val Asn 
                          85                  90                  95      
          Lys Leu Ile Asn Val Pro Pro Lys Thr Pro Tyr Gly Gly Gly Phe Gly 
                      100                 105                 110         
          Val Asp Gln Tyr Thr Leu Lys Tyr Leu Tyr Glu Glu Tyr Arg Phe Ala 
                  115                 120                 125             
          Gln Asn Ile Trp Thr Gln Ser Asn Val Leu Lys Asp Leu Cys Arg Tyr 
              130                 135                 140                 
          Ile Asn Val Lys Leu Ile Phe Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Asp Phe Val 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Ser Tyr Asp Arg Asn Pro Pro Phe Gln Leu Thr Lys Phe Thr Tyr 
                          165                 170                 175     
          Pro Gly Ala His Pro Gln Gln Ile Met Leu Gln Lys His His Lys Phe 
                      180                 185                 190         
          Ile Leu Ser Gln Met Thr Lys Pro Asn Gly Arg Leu Thr Lys Lys Leu 
                  195                 200                 205             
          Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Ser Lys Trp Phe Phe Ser Lys 
              210                 215                 220                 
          Gln Phe Cys Lys Tyr Pro Leu Leu Ser Leu Lys Ala Ser Ala Leu Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Arg His Ser Tyr Leu Gly Cys Cys Asn Glu Asn Pro Gln Val Phe 
                          245                 250                 255     
          Phe Tyr Tyr Leu Asn His Gly Tyr Tyr Thr Ile Thr Asn Trp Gly Ala 
                      260                 265                 270         
          Gln Ser Ser Thr Ala Tyr Arg Pro Asn Ser Lys Val Thr Asp Thr Thr 
                  275                 280                 285             
          Tyr Tyr Arg Tyr Lys Asn Asp Arg Lys Asn Ile Asn Ile Lys Ser His 
              290                 295                 300                 
          Glu Tyr Glu Lys Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Gly Tyr Phe Gln Ser Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Leu Gln Thr Gln Cys Ile Tyr Thr Ser Glu Arg Gly Glu Ala Cys 
                          325                 330                 335     
          Ile Ala Glu Lys Pro Leu Gly Ile Ala Ile Tyr Asn Pro Val Lys Asp 
                      340                 345                 350         
          Asn Gly Asp Gly Asn Met Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Ala Asn Thr 
                  355                 360                 365             
          Trp Asp Gln Pro Pro Lys Asp Ser Ala Ile Leu Ile Gln Gly Val Pro 
              370                 375                 380                 
          Ile Trp Leu Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Asp Tyr Cys Arg Gln Ile Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Asp Lys Thr Trp Leu Asp Ser His Val Leu Val Ile Gln Ser Pro 
                          405                 410                 415     
          Ala Ile Phe Thr Tyr Pro Asn Pro Gly Ala Gly Lys Trp Tyr Cys Pro 
                      420                 425                 430         
          Leu Ser Gln Ser Phe Ile Asn Gly Asn Gly Pro Phe Asn Gln Pro Pro 
                  435                 440                 445             
          Thr Leu Leu Gln Lys Ala Lys Trp Phe Pro Gln Ile Gln Tyr Gln Gln 
              450                 455                 460                 
          Glu Ile Ile Asn Ser Phe Val Glu Ser Gly Pro Phe Val Pro Lys Tyr 
          465                 470                 475                 480 
          Ala Asn Gln Thr Glu Ser Asn Trp Glu Leu Lys Tyr Lys Tyr Val Phe 
                          485                 490                 495     
          Thr Phe Lys Trp Gly Gly Pro Gln Phe His Glu Pro Glu Ile Ala Asp 
                      500                 505                 510         
          Pro Ser Lys Gln Glu Gln Tyr Asp Val Pro Asp Thr Phe Tyr Gln Thr 
                  515                 520                 525             
          Ile Gln Ile Glu Asp Pro Glu Gly Gln Asp Pro Arg Ser Leu Ile His 
              530                 535                 540                 
          Asp Trp Asp Tyr Arg Arg Gly Phe Ile Lys Glu Arg Ser Leu Lys Arg 
          545                 550                 555                 560 
          Met Ser Thr Tyr Phe Ser Thr His Thr Asp Gln Gln Ala Thr Ser Glu 
                          565                 570                 575     
          Glu Asp Ile Pro Lys Lys Lys Lys Arg Ile Gly Pro Gln Leu Thr Val 
                      580                 585                 590         
          Pro Gln Gln Lys Glu Glu Glu Thr Leu Ser Cys Leu Leu Ser Leu Cys 
                  595                 600                 605             
          Lys Lys Asp Thr Phe Gln Glu Thr Glu Thr Gln Glu Asp Leu Gln Gln 
              610                 615                 620                 
          Leu Ile Lys Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Leu Leu Lys Arg Asn Ile 
          625                 630                 635                 640 
          Leu Gln Leu Ile His Lys Leu Lys Glu Asn Gln Gln Met Leu Gln Leu 
                          645                 650                 655     
          His Thr Gly Met Leu Pro 
                      660         
          <![CDATA[<210> 892]]>
          <![CDATA[<211> 215]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 892]]>
          Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 
          1               5                   10                  15      
          Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Arg Lys Trp Gly Gly Pro Gln Phe His Glu Pro Glu Ile Ala 
              50                  55                  60                  
          Asp Pro Ser Lys Gln Glu Gln Tyr Asp Val Pro Asp Thr Phe Tyr Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Ile Gln Ile Glu Asp Pro Glu Gly Gln Asp Pro Arg Ser Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          His Asp Trp Asp Tyr Arg Arg Gly Phe Ile Lys Glu Arg Ser Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Arg Met Ser Thr Tyr Phe Ser Thr His Thr Asp Gln Gln Ala Thr Ser 
                  115                 120                 125             
          Glu Glu Asp Ile Pro Lys Lys Lys Lys Arg Ile Gly Pro Gln Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Val Pro Gln Gln Lys Glu Glu Glu Thr Leu Ser Cys Leu Leu Ser Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Lys Lys Asp Thr Phe Gln Glu Thr Glu Thr Gln Glu Asp Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Gln Leu Ile Lys Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Leu Leu Lys Arg Asn 
                      180                 185                 190         
          Ile Leu Gln Leu Ile His Lys Leu Lys Glu Asn Gln Gln Met Leu Gln 
                  195                 200                 205             
          Leu His Thr Gly Met Leu Pro 
              210                 215 
          <![CDATA[<210> 893]]>
          <![CDATA[<211> 129]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 893]]>
          Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 
          1               5                   10                  15      
          Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Arg Lys Ile Ser Lys Gln Leu Gln Arg Lys Thr Phe Pro Lys 
              50                  55                  60                  
          Arg Lys Arg Glu Leu Asp Pro Asn Ser Gln Ser His Asn Lys Lys Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Arg His Cys His Val Ser Ser Leu Ser Ala Lys Lys Ile Pro Ser 
                          85                  90                  95      
          Lys Lys Gln Arg His Lys Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 
                      100                 105                 110         
          Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Glu Thr Ser Ser Ser Ser Ser Thr 
                  115                 120                 125             
          Asn 
          <![CDATA[<210> 894]]>
          <![CDATA[<400> 894]]>
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          <![CDATA[<400> 904]]>
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          <![CDATA[<400> 925]]>
          Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 
          1               5                   10                  15      
          Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Arg Lys Val Lys Arg Lys Lys Lys Ser Leu Ile Val Arg Gln 
              50                  55                  60                  
          Trp Gln Pro Asp Ser Ile Arg Thr Cys Lys Ile Ile Gly Gln Ser Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Val Val Gly Ala Glu Gly Lys Gln Met Tyr Cys Tyr Thr Val Asn 
                          85                  90                  95      
          Lys Leu Ile Asn Val Pro Pro Lys Thr Pro Tyr Gly Gly Gly Phe Gly 
                      100                 105                 110         
          Val Asp Gln Tyr Thr Leu Lys Tyr Leu Tyr Glu Glu Tyr Arg Phe Ala 
                  115                 120                 125             
          Gln Asn Ile Trp Thr Gln Ser Asn Val Leu Lys Asp Leu Cys Arg Tyr 
              130                 135                 140                 
          Ile Asn Val Lys Leu Ile Phe Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Asp Phe Val 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Ser Tyr Asp Arg Asn Pro Pro Phe Gln Leu Thr Lys Phe Thr Tyr 
                          165                 170                 175     
          Pro Gly Ala His Pro Gln Gln Ile Met Leu Gln Lys His His Lys Phe 
                      180                 185                 190         
          Ile Leu Ser Gln Met Thr Lys Pro Asn Gly Arg Leu Thr Lys Lys Leu 
                  195                 200                 205             
          Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Ser Lys Trp Phe Phe Ser Lys 
              210                 215                 220                 
          Gln Phe Cys Lys Tyr Pro Leu Leu Ser Leu Lys Ala Ser Ala Leu Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Arg His Ser Tyr Leu Gly Cys Cys Asn Glu Asn Pro Gln Val Phe 
                          245                 250                 255     
          Phe Tyr Tyr Leu Asn His Gly Tyr Tyr Thr Ile Thr Asn Trp Gly Ala 
                      260                 265                 270         
          Gln Ser Ser Thr Ala Tyr Arg Pro Asn Ser Lys Val Thr Asp Thr Thr 
                  275                 280                 285             
          Tyr Tyr Arg Tyr Lys Asn Asp Arg Lys Asn Ile Asn Ile Lys Ser His 
              290                 295                 300                 
          Glu Tyr Glu Lys Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Gly Tyr Phe Gln Ser Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Leu Gln Thr Gln Cys Ile Tyr Thr Ser Glu Arg Gly Glu Ala Cys 
                          325                 330                 335     
          Ile Ala Glu Lys Pro Leu Gly Ile Ala Ile Tyr Asn Pro Val Lys Asp 
                      340                 345                 350         
          Asn Gly Asp Gly Asn Met Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Ala Asn Thr 
                  355                 360                 365             
          Trp Asp Gln Pro Pro Lys Asp Ser Ala Ile Leu Ile Gln Gly Val Pro 
              370                 375                 380                 
          Ile Trp Leu Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Asp Tyr Cys Arg Gln Ile Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Asp Lys Thr Trp Leu Asp Ser His Val Leu Val Ile Gln Ser Pro 
                          405                 410                 415     
          Ala Ile Phe Thr Tyr Pro Asn Pro Gly Ala Gly Lys Trp Tyr Cys Pro 
                      420                 425                 430         
          Leu Ser Gln Ser Phe Ile Asn Gly Asn Gly Pro Phe Asn Gln Pro Pro 
                  435                 440                 445             
          Thr Leu Leu Gln Lys Ala Lys Trp Phe Pro Gln Ile Gln Tyr Gln Gln 
              450                 455                 460                 
          Glu Ile Ile Asn Ser Phe Val Glu Ser Gly Pro Phe Val Pro Lys Tyr 
          465                 470                 475                 480 
          Ala Asn Gln Thr Glu Ser Asn Trp Glu Leu Lys Tyr Lys Tyr Val Phe 
                          485                 490                 495     
          Thr Phe Lys Trp Gly Gly Pro Gln Phe His Glu Pro Glu Ile Ala Asp 
                      500                 505                 510         
          Pro Ser Lys Gln Glu Gln Tyr Asp Val Pro Asp Thr Phe Tyr Gln Thr 
                  515                 520                 525             
          Ile Gln Ile Glu Asp Pro Glu Gly Gln Asp Pro Arg Ser Leu Ile His 
              530                 535                 540                 
          Asp Trp Asp Tyr Arg Arg Gly Phe Ile Lys Glu Arg Ser Leu Lys Arg 
          545                 550                 555                 560 
          Met Ser Thr Tyr Phe Ser Thr His Thr Asp Gln Gln Ala Thr Ser Glu 
                          565                 570                 575     
          Glu Asp Ile Pro Lys Lys Lys Lys Arg Ile Gly Pro Gln Leu Thr Val 
                      580                 585                 590         
          Pro Gln Gln Lys Glu Glu Glu Thr Leu Ser Cys Leu Leu Ser Leu Cys 
                  595                 600                 605             
          Lys Lys Asp Thr Phe Gln Glu Thr Glu Thr Gln Glu Asp Leu Gln Gln 
              610                 615                 620                 
          Leu Ile Lys Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Leu Leu Lys Arg Asn Ile 
          625                 630                 635                 640 
          Leu Gln Leu Ile His Lys Leu Lys Glu Asn Gln Gln Met Leu Gln Leu 
                          645                 650                 655     
          His Thr Gly Met Leu Pro 
                      660         
          <![CDATA[<210> 926]]>
          <![CDATA[<211> 58]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 926]]>
          Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 
          1               5                   10                  15      
          Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Arg Lys Val Lys Arg Lys Lys Lys 
              50                  55              
          <![CDATA[<210> 927]]>
          <![CDATA[<211> 202]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 927]]>
          Ser Leu Ile Val Arg Gln Trp Gln Pro Asp Ser Ile Arg Thr Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ile Gly Gln Ser Ala Ile Val Val Gly Ala Glu Gly Lys Gln Met 
                      20                  25                  30          
          Tyr Cys Tyr Thr Val Asn Lys Leu Ile Asn Val Pro Pro Lys Thr Pro 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Gly Gly Phe Gly Val Asp Gln Tyr Thr Leu Lys Tyr Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu Tyr Arg Phe Ala Gln Asn Ile Trp Thr Gln Ser Asn Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Asp Leu Cys Arg Tyr Ile Asn Val Lys Leu Ile Phe Tyr Arg Asp 
                          85                  90                  95      
          Asn Lys Thr Asp Phe Val Leu Ser Tyr Asp Arg Asn Pro Pro Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Leu Thr Lys Phe Thr Tyr Pro Gly Ala His Pro Gln Gln Ile Met Leu 
                  115                 120                 125             
          Gln Lys His His Lys Phe Ile Leu Ser Gln Met Thr Lys Pro Asn Gly 
              130                 135                 140                 
          Arg Leu Thr Lys Lys Leu Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Phe Phe Ser Lys Gln Phe Cys Lys Tyr Pro Leu Leu Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Lys Ala Ser Ala Leu Asp Leu Arg His Ser Tyr Leu Gly Cys Cys Asn 
                      180                 185                 190         
          Glu Asn Pro Gln Val Phe Phe Tyr Tyr Leu 
                  195                 200         
          <![CDATA[<210> 928]]>
          <![CDATA[<211> 79]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 928]]>
          Asn His Gly Tyr Tyr Thr Ile Thr Asn Trp Gly Ala Gln Ser Ser Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Tyr Arg Pro Asn Ser Lys Val Thr Asp Thr Thr Tyr Tyr Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Lys Asn Asp Arg Lys Asn Ile Asn Ile Lys Ser His Glu Tyr Glu Lys 
                  35                  40                  45              
          Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Gly Tyr Phe Gln Ser Ser Phe Leu Gln Thr 
              50                  55                  60                  
          Gln Cys Ile Tyr Thr Ser Glu Arg Gly Glu Ala Cys Ile Ala Glu 
          65                  70                  75                  
          <![CDATA[<210> 929]]>
          <![CDATA[<211> 160]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 929]]>
          Lys Pro Leu Gly Ile Ala Ile Tyr Asn Pro Val Lys Asp Asn Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Gly Asn Met Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Ala Asn Thr Trp Asp Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Pro Lys Asp Ser Ala Ile Leu Ile Gln Gly Val Pro Ile Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Asp Tyr Cys Arg Gln Ile Lys Ala Asp Lys 
              50                  55                  60                  
          Thr Trp Leu Asp Ser His Val Leu Val Ile Gln Ser Pro Ala Ile Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Tyr Pro Asn Pro Gly Ala Gly Lys Trp Tyr Cys Pro Leu Ser Gln 
                          85                  90                  95      
          Ser Phe Ile Asn Gly Asn Gly Pro Phe Asn Gln Pro Pro Thr Leu Leu 
                      100                 105                 110         
          Gln Lys Ala Lys Trp Phe Pro Gln Ile Gln Tyr Gln Gln Glu Ile Ile 
                  115                 120                 125             
          Asn Ser Phe Val Glu Ser Gly Pro Phe Val Pro Lys Tyr Ala Asn Gln 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ser Asn Trp Glu Leu Lys Tyr Lys Tyr Val Phe Thr Phe Lys 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210> 930]]>
          <![CDATA[<211> 163]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> γ細環病毒屬]]>
          <![CDATA[<400> 930]]>
          Trp Gly Gly Pro Gln Phe His Glu Pro Glu Ile Ala Asp Pro Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gln Glu Gln Tyr Asp Val Pro Asp Thr Phe Tyr Gln Thr Ile Gln Ile 
                      20                  25                  30          
          Glu Asp Pro Glu Gly Gln Asp Pro Arg Ser Leu Ile His Asp Trp Asp 
                  35                  40                  45              
          Tyr Arg Arg Gly Phe Ile Lys Glu Arg Ser Leu Lys Arg Met Ser Thr 
              50                  55                  60                  
          Tyr Phe Ser Thr His Thr Asp Gln Gln Ala Thr Ser Glu Glu Asp Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Lys Lys Lys Lys Arg Ile Gly Pro Gln Leu Thr Val Pro Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Glu Glu Thr Leu Ser Cys Leu Leu Ser Leu Cys Lys Lys Asp 
                      100                 105                 110         
          Thr Phe Gln Glu Thr Glu Thr Gln Glu Asp Leu Gln Gln Leu Ile Lys 
                  115                 120                 125             
          Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Leu Leu Lys Arg Asn Ile Leu Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ile His Lys Leu Lys Glu Asn Gln Gln Met Leu Gln Leu His Thr Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Met Leu Pro 
          <![CDATA[<210> 931]]>
          <![CDATA[<400> 931]]>
          000
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          <![CDATA[<210> 933]]>
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          <![CDATA[<210> 934]]>
          <![CDATA[<400> 934]]>
          000
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          <![CDATA[<210> 949]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223> W或F]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (2)..(8)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (10)..(12)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (14)..(14)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (16)..(20)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<400> 949]]>
          Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa 
          1               5                   10                  15      
          Xaa Xaa Xaa Xaa His 
                      20      
          <![CDATA[<210> 950]]>
          <![CDATA[<211> 203]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 未知物]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知物之描述：指環病毒科序列]]>
          <![CDATA[<400> 950]]>
          Lys Ile Ile Ile Arg Gln Trp Gln Pro Asn Tyr Thr Arg Arg Cys Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ile Val Gly Tyr Met Pro Leu Leu Ile Cys Gly Glu Asn Thr Val Ala 
                      20                  25                  30          
          Thr Asn Tyr Ala Thr His Ser Asp Asp Ser Tyr Tyr Pro Gly Pro Phe 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Met Thr Thr Asp Lys Phe Thr Leu Arg Ile Leu Tyr Asp 
              50                  55                  60                  
          Glu Tyr Lys Arg Phe Met Asn Tyr Trp Thr Ser Ser Asn Glu Asp Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Leu Cys Arg Tyr Leu Gly Cys Thr Leu Tyr Cys Phe Arg His Pro 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Asp Phe Ile Ile Ile Ile Asn Thr Ser Pro Pro Phe Leu Asp 
                      100                 105                 110         
          Thr Glu Ile Thr Gly Pro Ser Ile His Pro Gly Met Met Ala Leu Asn 
                  115                 120                 125             
          Lys Arg Ser Arg Trp Ile Pro Ser Ile Lys Asn Arg Pro Gly Arg Lys 
              130                 135                 140                 
          His Tyr Ile Lys Ile Lys Val Gly Ala Pro Arg Met Phe Thr Asp Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Tyr Pro Gln Thr Asp Leu Cys Asp Met Thr Leu Leu Thr Ile Phe 
                          165                 170                 175     
          Ala Ser Ala Ala Asp Met Gln Tyr Pro Phe Gly Ser Pro Leu Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Thr Ile Val Val Ser Phe Gln Val Leu Gln Ser 
                  195                 200             
          <![CDATA[<210> 951]]>
          <![CDATA[<211> 203]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 未知物]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知物之描述：指環病毒科序列]]>
          <![CDATA[<400> 951]]>
          Lys Ile Ile Ile Arg Gln Trp Gln Pro Asn Tyr Arg Arg Arg Cys Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ile Val Gly Tyr Leu Pro Ile Leu Ile Cys Gly Gly Asn Thr Val Ser 
                      20                  25                  30          
          Arg Asn Tyr Ala Thr His Ser Asp Asp Thr Asn Tyr Pro Gly Pro Phe 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Met Thr Thr Asp Lys Phe Ser Leu Arg Ile Leu Tyr Asp 
              50                  55                  60                  
          Glu Tyr Lys Arg Phe Met Asn Tyr Trp Thr Ala Ser Asn Glu Asp Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Leu Cys Arg Tyr Leu Gly Cys Thr Phe Tyr Phe Phe Arg His Pro 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Asp Phe Ile Ile Lys Ile Asn Thr Met Pro Pro Phe Leu Asp 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Ile Thr Ala Pro Ser Ile His Pro Gly Leu Met Ala Leu Asp 
                  115                 120                 125             
          Lys Arg Ala Arg Trp Ile Pro Ser Leu Lys Asn Arg Pro Gly Lys Lys 
              130                 135                 140                 
          His Tyr Ile Lys Ile Arg Val Gly Ala Pro Lys Met Phe Thr Asp Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Tyr Pro Gln Thr Asp Leu Cys Asp Met Thr Leu Leu Thr Ile Tyr 
                          165                 170                 175     
          Ala Thr Ala Ala Asp Met Gln Tyr Pro Phe Gly Ser Pro Leu Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Thr Val Val Val Asn Ser Gln Val Leu Gln Ser 
                  195                 200             
          <![CDATA[<210> 952]]>
          <![CDATA[<211> 203]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 未知物]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知物之描述：指環病毒科序列]]>
          <![CDATA[<400> 952]]>
          Lys Ile Ile Ile Lys Gln Trp Gln Pro Asn Phe Ile Arg Arg Cys Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ile Gly Cys Leu Pro Leu Val Phe Cys Gly Glu Asn Thr Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Gln Asn Tyr Ala Thr His Ser Asp Asp Met Ile Ser Lys Gly Pro Tyr 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Met Thr Thr Thr Lys Phe Thr Leu Arg Ile Leu Tyr Asp 
              50                  55                  60                  
          Glu Phe Thr Arg Phe Met Asn Phe Trp Thr Val Ser Asn Glu Asp Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Leu Cys Arg Tyr Val Gly Cys Lys Leu Ile Phe Phe Lys His Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Val Asp Phe Met Val Gln Ile Asn Thr Gln Pro Pro Phe Leu Asp 
                      100                 105                 110         
          Thr Ser Leu Thr Ala Ala Ser Ile His Pro Gly Ile Met Met Leu Ser 
                  115                 120                 125             
          Lys Arg Arg Ile Leu Ile Pro Ser Leu Lys Thr Arg Pro Ser Arg Lys 
              130                 135                 140                 
          His Arg Val Val Val Arg Val Gly Ala Pro Arg Leu Phe Gln Asp Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Tyr Pro Gln Ser Asp Leu Cys Asp Thr Val Leu Leu Ser Ile Phe 
                          165                 170                 175     
          Ala Thr Ala Arg Asp Leu Gln Tyr Pro Phe Gly Ser Pro Leu Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Asn Pro Cys Val Asn Phe Gln Ile Leu Gly Pro 
                  195                 200             
          <![CDATA[<210> 953]]>
          <![CDATA[<211> 203]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 未知物]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知物之描述：指環病毒科序列]]>
          <![CDATA[<400> 953]]>
          Lys Ile Ile Ile Lys Gln Trp Gln Pro Asn Phe Ile Arg Arg Cys Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ile Gly Tyr Leu Pro Leu Ile Phe Cys Gly Glu Asn Thr Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Phe Ala Thr His Ser Asp Asp Met Ile Ala Lys Gly Pro Trp 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Met Thr Thr Thr Lys Phe Thr Leu Arg Ile Leu Tyr Asp 
              50                  55                  60                  
          Glu Phe Thr Arg Phe Met Asn Phe Trp Thr Val Ser Asn Glu Asp Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Leu Cys Arg Tyr Val Ser Cys Lys Leu Ile Phe Phe Lys His Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Val Asp Phe Ile Val Arg Ile Asn Thr Glu Pro Pro Phe Leu Asp 
                      100                 105                 110         
          Thr Asn Leu Thr Ala Ala Gln Ile His Pro Gly Ile Met Met Leu Ser 
                  115                 120                 125             
          Lys Lys His Ile Leu Ile Pro Ser Leu Lys Thr Arg Pro Ser Arg Lys 
              130                 135                 140                 
          His Arg Val Val Val Arg Val Gly Pro Pro Arg Leu Phe Gln Asp Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Tyr Pro Gln Ser Asp Leu Cys Asp Thr Val Leu Leu Ser Val Phe 
                          165                 170                 175     
          Ala Thr Ala Cys Asp Leu Gln Tyr Pro Phe Gly Ser Pro Leu Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Asn Pro Cys Val Asn Phe Gln Ile Leu Gly His 
                  195                 200             
          <![CDATA[<210> 954]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知物之描述：指環病毒科序列]]>
          <![CDATA[<400> 954]]>
          Lys Leu Ile Ile Lys Gln Trp Gln Pro Asn Phe Ile Arg His Cys Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ile Gly Tyr Met Pro Leu Ile Ile Cys Gly Glu Asn Thr Phe Ser 
                      20                  25                  30          
          His Asn Tyr Ala Thr His Ser Asp Asp Met Leu Ser Thr Gly Pro Tyr 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Met Thr Thr Thr Lys Phe Thr Leu Arg Ile Leu Phe Asp 
              50                  55                  60                  
          Glu Tyr Gln Arg His Leu Asn Phe Trp Thr Val Ser Asn Gln Asp Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Leu Ala Arg Tyr Leu Gly Thr Lys Ile Ile Phe Phe Arg His Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Val Asp Phe Val Val Gln Ile His Thr Gln Pro Pro Phe Gln Asp 
                      100                 105                 110         
          Thr Glu Ile Thr Ala Pro Ser Ile His Pro Gly Met Leu Ile Leu Ser 
                  115                 120                 125             
          Lys Lys His Ile Leu Ile Pro Ser Leu Lys Thr Arg Pro Ser Lys Lys 
              130                 135                 140                 
          His Tyr Val Lys Val Arg Val Gly Ala Pro Arg Leu Phe Gln Asp Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Tyr Pro Gln Ser Glu Leu Cys Asp Val Thr Leu Leu Val Ile Tyr 
                          165                 170                 175     
          Ala Thr Ala Cys Asp Leu Gln Tyr Pro Phe Gly Ser Pro Gln Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Asn Val Cys Val Asn Phe Gln Ile Leu Gly Gln 
                  195                 200             
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          <![CDATA[<211> 204]]>
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          <![CDATA[<223> 未知物之描述：指環病毒科序列]]>
          <![CDATA[<400> 955]]>
          Thr Leu Ile Leu Arg Gln Trp Gln Pro Asp Cys Ile Arg His Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Thr Gly Trp Met Pro Leu Ile Ile Cys Gly Lys Gly Ser Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Phe Asn Tyr Ile Thr His Ala Asp Asp Ile Thr Pro Arg Gly Ala Ser 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Gly Asn Phe Thr Asn Met Thr Phe Ser Leu Glu Ala Ile Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Gln Phe Leu Tyr His Arg Asn Arg Trp Ser Ala Ser Asn His Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Glu Leu Cys Arg Tyr Lys Gly Thr Thr Leu Lys Leu Tyr Arg His 
                          85                  90                  95      
          Pro Glu Val Asp Tyr Ile Val Thr Tyr Ser Arg Thr Gly Pro Phe Glu 
                      100                 105                 110         
          Ile Ser His Met Thr Tyr Leu Ser Thr His Pro Met Leu Met Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Asn Lys His His Ile Val Val Pro Ser Leu Lys Thr Lys Pro Arg Gly 
              130                 135                 140                 
          Arg Lys Ala Ile Lys Val Arg Ile Arg Pro Pro Lys Leu Met Asn Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Tyr Phe Thr Arg Asp Phe Cys Asn Ile Gly Leu Phe Gln Leu 
                          165                 170                 175     
          Trp Ala Thr Gly Leu Glu Leu Arg Asn Pro Trp Leu Arg Met Ser Thr 
                      180                 185                 190         
          Leu Ser Pro Cys Ile Gly Phe Asn Val Leu Lys Asn 
                  195                 200                 
          <![CDATA[<210> 956]]>
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          <![CDATA[<400> 956]]>
          Thr Leu Val Leu Arg Gln Trp Gln Pro Asp Val Ile Arg His Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Thr Gly Arg Met Pro Leu Ile Ile Cys Gly Lys Gly Ser Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Phe Asn Tyr Ile Thr His Ala Asp Asp Ile Thr Pro Arg Gly Ala Ser 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Gly Asn Phe Thr Asn Met Thr Phe Ser Leu Glu Ala Ile Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Gln Phe Leu Tyr His Arg Asn Arg Trp Ser Ala Ser Asn His Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Glu Leu Cys Arg Tyr Lys Gly Thr Thr Leu Lys Leu Tyr Arg His 
                          85                  90                  95      
          Pro Asp Val Asp Tyr Ile Val Thr Tyr Ser Arg Thr Gly Pro Phe Glu 
                      100                 105                 110         
          Ile Ser His Met Thr Tyr Leu Ser Thr His Pro Leu Leu Met Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Asn Lys His His Ile Val Val Pro Ser Leu Lys Thr Lys Pro Arg Gly 
              130                 135                 140                 
          Arg Lys Ala Ile Lys Val Arg Ile Arg Pro Pro Lys Leu Met Asn Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Tyr Phe Thr Arg Asp Phe Cys Asn Ile Gly Leu Phe Gln Leu 
                          165                 170                 175     
          Trp Ala Thr Gly Leu Glu Leu Arg Asn Pro Trp Leu Arg Met Ser Thr 
                      180                 185                 190         
          Leu Ser Pro Cys Ile Gly Phe Asn Val Leu Lys Asn 
                  195                 200                 
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          <![CDATA[<223> 未知物之描述：指環病毒科序列]]>
          <![CDATA[<400> 957]]>
          Lys Leu Val Leu Thr Gln Trp Asn Pro Gln Thr Val Arg Lys Cys Val 
          1               5                   10                  15      
          Ile Arg Gly Phe Leu Pro Leu Phe Phe Cys Gly Gln Gly Ala Tyr His 
                      20                  25                  30          
          Arg Asn Phe Thr Asp His Tyr Asp Asp Val Phe Pro Lys Gly Pro Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly His Gly Ser Met Val Phe Asn Leu Ser Phe Leu Tyr Gln 
              50                  55                  60                  
          Glu Phe Lys Lys His His Asn Lys Trp Ser Arg Ser Asn Leu Asp Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Leu Val Arg Tyr Lys Gly Thr Val Ile Lys Leu Tyr Arg His Gln 
                          85                  90                  95      
          Asp Phe Asp Tyr Ile Val Trp Ile Ser Arg Thr Pro Pro Phe Gln Glu 
                      100                 105                 110         
          Ser Leu Leu Thr Val Met Thr His Gln Pro Ser Val Met Leu Gln Ala 
                  115                 120                 125             
          Lys Lys Cys Ile Ile Val Lys Ser Tyr Arg Thr His Pro Gly Gly Lys 
              130                 135                 140                 
          Pro Tyr Val Thr Ala Lys Val Arg Pro Pro Arg Leu Leu Thr Asp Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Tyr Phe Gln Ser Asp Phe Cys Asn Val Pro Leu Phe Ser Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Phe Ala Leu Ala Glu Leu Arg Phe Pro Ile Cys Ser Pro Gln Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Thr Asn Cys Ile Asn Phe Leu Val Leu Asp Asp 
                  195                 200             
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          <![CDATA[<400> 958]]>
          Lys Leu Ile Ile Lys Leu Trp Gln Pro Ala Val Ile Lys Arg Cys Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly Tyr Ile Pro Leu Ile Ile Ser Gly Asn Gly Thr Phe Ala 
                      20                  25                  30          
          Thr Asn Phe Thr Ser His Ile Asn Asp Arg Ile Met Lys Gly Pro Phe 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly His Ser Thr Met Arg Phe Ser Leu Tyr Ile Leu Phe Glu 
              50                  55                  60                  
          Glu His Leu Arg His Met Asn Phe Trp Thr Arg Ser Asn Asp Asn Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ala Ser Val Lys Ile Tyr Arg His Pro 
                          85                  90                  95      
          Asp Gln Asp Phe Ile Val Ile Tyr Asn Arg Arg Thr Pro Leu Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Asn Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Leu His Pro Gly Asn Ala Ile Leu Ala 
                  115                 120                 125             
          Lys His Lys Ile Leu Val Pro Ser Leu Gln Thr Arg Pro Lys Gly Arg 
              130                 135                 140                 
          Lys Ala Ile Arg Leu Arg Ile Ala Pro Pro Thr Leu Phe Thr Asp Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Tyr Phe Gln Lys Asp Ile Ala Asp Leu Thr Leu Phe Asn Ile Met 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Glu Ala Asp Leu Arg Phe Pro Phe Cys Ser Pro Gln Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Asn Thr Cys Ile Ser Phe Gln Val Leu Ser Ser 
                  195                 200             
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          <![CDATA[<400> 959]]>
          Arg Leu Val Leu Thr Gln Trp Ser Pro Gln Thr Val Arg Asn Cys Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ile Arg Gly Ile Val Pro Met Val Ile Cys Gly His Thr Lys Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Arg Asn Tyr Ala Ile His Ser Glu Asp Phe Thr Thr Gln Ile Gln Pro 
                  35                  40                  45              
          Phe Gly Gly Ser Phe Ser Thr Thr Thr Trp Ser Leu Lys Val Leu Trp 
              50                  55                  60                  
          Asp Glu His Gln Lys Phe Gln Asn Arg Trp Ser Tyr Pro Asn Thr Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Asp Leu Ala Arg Tyr Arg Gly Val Thr Phe Trp Phe Tyr Arg Asp 
                          85                  90                  95      
          Gln Lys Thr Asp Tyr Ile Val Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Phe Lys 
                      100                 105                 110         
          Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Ala Met Tyr His Pro Gly Met Met Met Gln 
                  115                 120                 125             
          Ala Lys Arg Lys Leu Val Val Pro Ser Phe Gln Thr Arg Pro Lys Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Lys Arg Tyr Arg Val Thr Ile Lys Pro Pro Asn Met Phe Ala Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Tyr Thr Gln Glu Asp Leu Cys Pro Val Pro Leu Val Gln Ile 
                          165                 170                 175     
          Val Val Ser Ala Ala Ser Leu Leu His Pro Phe Cys Pro Pro Gln Thr 
                      180                 185                 190         
          Asn Asn Pro Cys Ile Thr Phe Gln Val Leu Lys Asp 
                  195                 200                 
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          <![CDATA[<400> 960]]>
          Lys Leu Val Leu Thr Gln Trp His Pro Asn Thr Met Arg Arg Cys Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly Ile Val Pro Leu Val Ile Cys Gly His Thr Arg Trp Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Asn Tyr Ala Leu His Ser Lys Asp Tyr Thr Glu Glu Gly Arg Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Thr Thr Thr Trp Ser Leu Lys Val Leu 
              50                  55                  60                  
          Tyr Asp Glu His Leu Lys His His Asp Phe Trp Gly Tyr Pro Asn Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Leu Asp Leu Ala Arg Tyr Lys Gly Ala Lys Phe Thr Phe Tyr Arg 
                          85                  90                  95      
          His Lys Lys Thr Asp Phe Ile Ile Phe Phe Asn Arg Lys Pro Pro Phe 
                      100                 105                 110         
          Lys Leu Asn Lys Tyr Ser Cys Ala Ser Tyr His Pro Gly Met Leu Met 
                  115                 120                 125             
          Gln Gln Arg His Lys Ile Leu Leu Pro Ser Tyr Glu Thr Lys Pro Lys 
              130                 135                 140                 
          Gly Arg Pro Lys Ile Thr Val Arg Ile Lys Pro Pro Thr Leu Leu Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Lys Trp Tyr Thr Gln Gln Asp Leu Cys Asp Val Asn Leu Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Leu Val Val Thr Ala Ala Asp Phe Arg His Pro Leu Cys Ser Pro Gln 
                      180                 185                 190         
          Thr Asn Thr Pro Thr Thr Thr Phe Gln Val Leu Lys Asp 
                  195                 200                 205 
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          Arg Leu Ile Leu Arg Gln Trp Gln Pro Ala Thr Arg Arg Arg Cys Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ile Thr Gly Tyr Leu Pro Ile Val Phe Cys Gly His Thr Arg Gly Asn 
                      20                  25                  30          
          Lys Asn Tyr Ala Leu His Ser Asp Asp Tyr Thr Pro Gln Gly Gln Pro 
                  35                  40                  45              
          Phe Gly Gly Ala Leu Ser Thr Thr Ser Phe Ser Leu Lys Val Leu Phe 
              50                  55                  60                  
          Asp Gln His Gln Arg Gly Leu Asn Lys Trp Ser Phe Pro Asn Asp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Asp Leu Ala Arg Tyr Arg Gly Cys Lys Phe Ile Phe Tyr Arg Thr 
                          85                  90                  95      
          Lys Gln Thr Asp Trp Val Gly Gln Tyr Asp Ile Ser Glu Pro Tyr Lys 
                      100                 105                 110         
          Leu Asp Lys Tyr Ser Cys Pro Asn Tyr His Pro Gly Asn Met Ile Lys 
                  115                 120                 125             
          Ala Lys His Lys Phe Leu Ile Pro Ser Tyr Asp Thr Asn Pro Arg Gly 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Lys Ile Ile Val Lys Ile Pro Pro Pro Asp Leu Phe Val Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Tyr Thr Gln Glu Asp Leu Cys Ser Val Asn Leu Val Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Ser Ala Ala Ser Phe Leu His Pro Phe Gly Ser Pro Gln Thr 
                      180                 185                 190         
          Asp Asn Pro Cys Tyr Thr Phe Gln Val Leu Lys Glu 
                  195                 200                 
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          Lys Leu Ile Leu Thr Gln Trp Asn Pro Ala Ile Val Lys Arg Cys Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly Gly Leu Pro Ile Ile Ile Cys Gly Glu Pro Arg Ala Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Asn Tyr Gly Tyr His Met Glu Asp Tyr Thr Pro Gln Pro Phe Pro 
                  35                  40                  45              
          Phe Gly Gly Gly Met Ser Thr Val Thr Phe Ser Leu Lys Ala Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Asp Gln Tyr Leu Lys His Gln Asn Arg Trp Thr Phe Ser Asn Asp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Asp Leu Ala Arg Tyr Arg Gly Cys Lys Leu Arg Phe Tyr Arg Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Cys Asp Phe Ile Val His Tyr Asn Leu Ile Pro Pro Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Met Asn Gln Phe Thr Ser Pro Asn Thr His Pro Gly Leu Leu Met Leu 
                  115                 120                 125             
          Ser Lys His Lys Ile Ile Ile Pro Ser Phe Gln Thr Arg Pro Gly Gly 
              130                 135                 140                 
          Arg Arg Phe Val Lys Ile Arg Leu Asn Pro Pro Lys Leu Phe Glu Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Tyr Thr Gln Gln Asp Leu Cys Lys Val Pro Leu Val Ser Ile 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Thr Ala Ala Asp Leu Arg Tyr Pro Phe Cys Ser Pro Gln Thr 
                      180                 185                 190         
          Asn Asn Pro Cys Thr Thr Phe Gln Val Leu Arg Lys 
                  195                 200                 
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          <![CDATA[<400> 963]]>
          Lys Ile Val Leu Thr Gln Trp Asn Pro Gln Thr Thr Arg Lys Cys Ile 
          1               5                   10                  15      
          Ile Arg Gly Met Met Pro Val Leu Trp Ala Gly Met Gly Thr Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Arg Asn Tyr Ala Val Arg Ser Asp Asp Tyr Val Val Asn Lys Gly Phe 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ser Phe Ala Thr Glu Thr Phe Ser Leu Lys Val Leu Tyr Asp 
              50                  55                  60                  
          Gln Phe Gln Arg Gly Phe Asn Arg Trp Ser His Thr Asn Glu Asp Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Leu Ala Arg Tyr Arg Gly Cys Arg Trp Thr Phe Tyr Arg His Lys 
                          85                  90                  95      
          Asp Thr Asp Phe Ile Val Tyr Phe Thr Asn Asn Pro Pro Met Lys Thr 
                      100                 105                 110         
          Asn Gln Phe Ser Ala Pro Leu Thr Thr Pro Gly Met Leu Met Arg Ser 
                  115                 120                 125             
          Lys Tyr Lys Val Leu Ile Pro Ser Phe Gln Thr Arg Pro Lys Gly Arg 
              130                 135                 140                 
          Lys Thr Val Thr Val Lys Ile Arg Pro Pro Lys Leu Phe Gln Asp Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Tyr Thr Gln Gln Asp Leu Cys Ser Val Pro Leu Val Gln Leu Asn 
                          165                 170                 175     
          Val Thr Ala Ala Asp Phe Thr His Pro Phe Gly Ser Pro Leu Thr Glu 
                      180                 185                 190         
          Thr Pro Cys Val Glu Phe Gln Val Leu Gly Asp 
                  195                 200             
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          <![CDATA[<400> 964]]>
          Lys Leu Asn Ile Lys Glu Trp Gln Pro Ile Thr Ile Arg Lys Thr Lys 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Gly Leu Tyr Pro Ala Phe Leu Cys Asn Asp Gln Arg Ile Gly 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Ala Ile Gln Tyr Leu Asp Ser Ile Ala Pro His His Phe Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Gly Phe Gly Ile Ile Gln Phe Thr Leu Gln Gly Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Gln Phe Ile Lys Ala Thr Asn Trp Trp Thr Gln Thr Asn Cys Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Leu Ile Arg Tyr Asn Phe Cys Lys Leu Lys Phe Tyr Arg Thr 
                          85                  90                  95      
          Ala Asn Val Asp Tyr Val Val Lys Ile Ile Arg Cys Tyr Pro Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Ala Thr His Asp Leu Tyr Met Gln Thr Gln Pro Ser Ile Leu Met Arg 
                  115                 120                 125             
          Asp Lys His Ser Ile Leu Ile Pro Cys Met Lys Asn Gly Arg Asn Arg 
              130                 135                 140                 
          Lys Thr Tyr Lys Thr Ile Lys Val Arg Pro Pro Thr Gln Met Thr Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Trp Phe Phe Gln Lys Asp Leu Cys Asn Phe Pro Leu Leu Val Ile 
                          165                 170                 175     
          Leu Ala Thr Ala Ala Ser Phe Asp Arg Tyr Tyr Thr Asn Ser Lys Ala 
                      180                 185                 190         
          Lys Ser Thr Thr Ile Gly Phe Ile Ser Leu Asn Thr 
                  195                 200                 
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          Lys Ile Arg Ile Ser Glu Trp Gln Pro Thr Lys Ile Ile Lys Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Gly Ile Tyr Pro Cys Phe Leu Ser Asn His Lys Arg Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Phe Val Gln Trp Ile Asp Ser Thr Thr Ala His Leu Met Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Gly Phe Gly Ile Ile Gln Phe Thr Leu Asn Gly Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Leu Phe Cys Lys Ala Gln Asn Trp Trp Thr Lys Ser Asn Cys Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Leu Val Arg Phe Cys Gly Thr Thr Leu Lys Phe Trp Ala Ala 
                          85                  90                  95      
          Glu Asn Tyr Asp Tyr Val Val His Ile Gln Arg Cys Tyr Pro Met Cys 
                      100                 105                 110         
          Cys Thr Asp Leu Met Tyr Met Ser Cys Gln Pro Phe Ile Met Met Met 
                  115                 120                 125             
          Thr Lys Asn Thr Ile Phe Val Pro Cys Thr Lys Asn Lys Pro Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Arg Tyr Lys Lys Ile Phe Val Lys Pro Pro Ala Gln Met Thr Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Trp Tyr Phe Gln Ser Gln Leu Ala Lys Thr Gly Leu Ile Ile Ile 
                          165                 170                 175     
          Arg Thr Ala Ala Cys Ser Leu Asp Arg Ile Tyr Thr Ser Ser Thr Ala 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Thr Thr Ile Gly Leu Val Ser Leu His Thr 
                  195                 200                 
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          Thr Ile Arg Leu Arg Gln Trp Asn Pro Arg Thr Thr Arg Leu Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly His Ile Pro Leu Ile Ile Cys Gly Arg Asp Arg Gln Ile 
                      20                  25                  30          
          Phe Asn Trp Met Gln Tyr Tyr Asp Ser Ile Gly Pro Val Glu Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Gly Trp Ser Ser Ile Val Phe Ser Leu Gly Ala Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gln Gln Phe Lys Arg Leu Met Asn Trp Trp Thr Lys Asp Asn Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Leu Val Gln Tyr Arg Gly Cys Lys Phe Lys Phe Tyr Lys Ser 
                          85                  90                  95      
          Trp Asp Cys Asp Tyr Ile Val Thr Ala Gln Thr Cys Pro Pro Met Thr 
                      100                 105                 110         
          Asp Thr Glu Tyr Lys His Leu Asp Ser His Pro Tyr Arg Gln Leu Met 
                  115                 120                 125             
          Asn Lys Arg Pro Ile Ile Val Pro Asn Leu Val Arg Lys Pro Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Lys Thr Tyr Lys Ile Lys Arg Phe Pro Pro Pro Ser Leu Leu Gln Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Tyr Phe Gln Gln Asp Phe Cys Ala Thr Asn Leu Leu Met Leu 
                          165                 170                 175     
          Thr Thr Ser Ala Ala Ser Phe Asp Gln Phe Trp Leu Pro Asn Asp Glu 
                      180                 185                 190         
          Ile Ser Gln Val Ile Thr Phe His Ser Leu Asn Thr 
                  195                 200                 
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          Lys Ile Ile Leu Lys Gln Phe Gln Pro Gln Thr Ile Lys Arg Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Arg Leu Glu Cys Leu Phe His Cys Asn Ala Lys Lys Ile Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Asn Leu Gln Met Tyr Glu Thr Ser Thr Val Pro Pro His Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Gly Trp Ser Cys Lys Val Phe Thr Leu Asn Ala Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Asp Ala Phe Lys His Cys Arg Asn Val Trp Thr Gly Ser Asn His Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Leu Val Arg Tyr Met Gly Cys Lys Phe Thr Leu Tyr Gln Ser 
                          85                  90                  95      
          Glu Thr Gln Asp Tyr Val Phe Lys Tyr Gln Asn His Tyr Pro Met Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Thr Ile Glu Ser Tyr Asn Ala Cys Gln Pro Ser Met Leu Met Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Asn Arg Thr Lys Lys Ile Pro Ser Lys Lys Thr Lys His Lys Arg 
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          Lys Pro Tyr Thr Ile Val Lys Ile Arg Pro Pro Ala Gln Met Gln Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Tyr Phe Thr His Asp Ile Ala Asn Thr Pro Leu Leu Leu Ile 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ser Ala Ala Cys Ser Phe Asp Asn Tyr Tyr Ile Ser Thr Asp Ser 
                      180                 185                 190         
          Glu Ser Thr Asn Ile Ser Ile Pro Leu Leu Arg Thr 
                  195                 200                 
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          Thr Ile Thr Val Lys Gln Phe Gln Pro Pro Asn Val Arg Lys Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly Leu Met Asn Leu Ile Tyr Phe Asn Gln Lys Arg Leu Ile 
                      20                  25                  30          
          Phe Asn Ser Val Met Tyr Glu Asn Ser Leu Val Pro Glu Glu His Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Gly Phe Ser Val Ile Lys Leu Ser Leu Glu Thr Met Tyr 
              50                  55                  60                  
          Asp Ser His Leu Arg Cys His Asn Trp Trp Thr Thr Ser Asn Glu Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Leu Val Arg Tyr Ser Gly Met Thr Val Lys Leu Tyr Gln Ser 
                          85                  90                  95      
          Lys Tyr Thr Asp Tyr Val Phe Lys Tyr Gln Asn Tyr Leu Pro Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Ser Thr Tyr Leu Thr Tyr Pro Ala Cys Gln Pro Ser Met Met Met Met 
                  115                 120                 125             
          Ala Lys Asn Ser Val Ile Val Pro Ser Leu Glu Thr Lys Arg Arg Arg 
              130                 135                 140                 
          Lys Pro Tyr Lys Lys Ile His Ile Lys Pro Thr Ser Gln Leu Gln Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Tyr Phe Gln Thr Asp Leu Asn Lys Thr Pro Leu Ala Ile Phe 
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Ala Ala Cys Ser Leu Thr Ser Tyr Tyr Leu Ser Pro Asp Trp 
                      180                 185                 190         
          Glu Ser Asn Asn Ile Ser Ile Leu His Leu Asn Thr 
                  195                 200                 
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          Thr Ile Pro Leu Lys Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly Gln Asp Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly 
                      20                  25                  30          
          Met Asn Ser Thr Met Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Ser Phe Ser Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Asp Ile His Lys Leu Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Leu Val Arg Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Thr Asp Tyr Ile Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn 
                      100                 105                 110         
          Ser Asn Lys Leu Thr Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met 
                  115                 120                 125             
          Ser Lys Tyr Lys His Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys 
              130                 135                 140                 
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          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
          His Cys Thr Ala Cys Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys 
                      180                 185                 190         
          Leu Ser Asn Asn Val Thr Leu Trp Ser Leu Asn Thr 
                  195                 200                 
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          <![CDATA[<400> 970]]>
          Lys Leu Thr Leu Lys Glu Trp Gln Pro Lys Thr Ile Arg Lys Ser Cys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly Leu His Cys Leu Phe Ile Val Thr Glu Asp Thr Ile Ser 
                      20                  25                  30          
          Arg Asn Tyr Arg Met Tyr Glu His Ser Phe Thr Gly Glu His Trp Pro 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Gly Gly Phe Ser Val Thr Lys Tyr Thr Leu Asp Gly Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Gln His Gln Leu Asp Arg Asn Trp Trp Thr Lys Pro Asn Thr Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Met Pro Leu Val Arg Tyr Leu Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser 
                          85                  90                  95      
          Trp Glu Val Asp Tyr Val Cys Asn Ile Asn Leu Thr Trp Pro Met Val 
                      100                 105                 110         
          Ala Thr Asn Leu Leu Tyr Leu Ser Cys His Pro Asn Phe Met Met Met 
                  115                 120                 125             
          Asn His Lys Ala Ile Phe Val Pro Ser Lys Ile Thr Lys Arg Leu Arg 
              130                 135                 140                 
          Arg Gly Lys Lys Thr Val Arg Leu Arg Pro Pro His Gln Met Ile Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Tyr Phe Ala Lys Glu Leu Ala Lys Thr Gly Leu Val Met Leu 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Ala Ala Ala Ser Phe Asp His Tyr Tyr Ile Gly Ser Asp Lys 
                      180                 185                 190         
          Leu Ser Asn Asn Cys Thr Phe Thr Ser Leu Asn Pro 
                  195                 200                 
          <![CDATA[<210> 971]]>
          <![CDATA[<211> 204]]>
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          <![CDATA[<223> 未知物之描述：指環病毒科序列]]>
          <![CDATA[<400> 971]]>
          Lys Ile Pro Ile Tyr Gln Trp Gln Pro Asp Ser Ile Arg Lys Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly Val Gly Thr Leu Val Leu Gly Ala His Gly Lys Gln Phe 
                      20                  25                  30          
          Val Cys Tyr Thr Asp Val Glu Thr Arg Ala Pro Pro Pro Lys Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Gly Phe Gly Cys Lys Gln Phe Ser Leu Gln Tyr Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu Tyr Arg Phe Arg Asn Asn Ile Trp Thr His Thr Asn Ile Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Asp Leu Val Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Phe Thr Phe Tyr Arg His 
                          85                  90                  95      
          Pro Asp Ile Asp Phe Ile Ile Asn Tyr Asp Arg Gln Pro Pro Phe Tyr 
                      100                 105                 110         
          Leu Asp Lys Phe Thr Tyr Pro Leu Cys His Pro Gln Asn Leu Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Gly Lys His Lys Ile Ile Leu Leu Ser Lys Ala Ser Lys Pro Asn Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Lys Lys Arg Ile Ile Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Ile Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Phe Phe Gln Glu Gln Phe Thr Thr Gln Pro Leu Leu Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Arg Ala Ala Ala Ala Ser Phe Gln Tyr Pro His Ile Gly Cys Cys Met 
                      180                 185                 190         
          Pro Asn Arg Val Val Thr Phe Ser Ala Leu Asn Pro 
                  195                 200                 
          <![CDATA[<210> 972]]>
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          <![CDATA[<400> 972]]>
          Ser Leu Ile Val Arg Gln Trp Gln Pro Asp Ser Ile Arg Thr Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ile Gly Gln Ser Ala Ile Val Val Gly Ala Glu Gly Lys Gln Met 
                      20                  25                  30          
          Tyr Cys Tyr Thr Val Asn Lys Leu Ile Asn Val Pro Pro Lys Thr Pro 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Gly Gly Phe Gly Val Asp Gln Tyr Thr Leu Lys Tyr Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu Tyr Arg Phe Ala Gln Asn Ile Trp Thr Gln Ser Asn Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Asp Leu Cys Arg Tyr Ile Asn Val Lys Leu Ile Phe Tyr Arg Asp 
                          85                  90                  95      
          Asn Lys Thr Asp Phe Val Leu Ser Tyr Asp Arg Asn Pro Pro Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Leu Thr Lys Phe Thr Tyr Pro Gly Ala His Pro Gln Gln Ile Met Leu 
                  115                 120                 125             
          Gln Lys His His Lys Phe Ile Leu Ser Gln Met Thr Lys Pro Asn Gly 
              130                 135                 140                 
          Arg Leu Thr Lys Lys Leu Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Phe Phe Ser Lys Gln Phe Cys Lys Tyr Pro Leu Leu Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Lys Ala Ser Ala Leu Asp Leu Arg His Ser Tyr Leu Gly Cys Cys Asn 
                      180                 185                 190         
          Glu Asn Pro Gln Val Phe Phe Tyr Tyr Leu Asn His 
                  195                 200                 
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          <![CDATA[<400> 973]]>
          Thr Leu Ile Val Arg Gln Trp Gln Pro Asp Ser Ile Val Leu Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly Tyr Asp Ser Ile Ile Trp Gly Ala Glu Gly Thr Gln Phe 
                      20                  25                  30          
          Gln Cys Ser Thr His Glu Met Tyr Glu Tyr Thr Arg Gln Lys Tyr Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Gly Gly Phe Gly Val Gln Leu Tyr Ser Leu Glu Tyr Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Asp Gln Trp Lys Leu Arg Asn Asn Ile Trp Thr Lys Thr Asn Gln Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Asp Leu Cys Arg Tyr Leu Lys Cys Val Met Thr Phe Tyr Arg His 
                          85                  90                  95      
          Gln His Ile Asp Phe Val Ile Val Tyr Glu Arg Gln Pro Pro Phe Glu 
                      100                 105                 110         
          Ile Asp Lys Leu Thr Tyr Met Lys Tyr His Pro Tyr Met Leu Leu Gln 
                  115                 120                 125             
          Arg Lys His Lys Ile Ile Leu Pro Ser Gln Thr Thr Asn Pro Arg Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Leu Lys Lys Lys Lys Thr Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Phe Phe Gln Gln Gln Phe Ala Lys Tyr Asp Leu Leu Leu Ile 
                          165                 170                 175     
          Ala Ala Ala Ala Cys Ser Leu Arg Tyr Pro Arg Ile Gly Cys Cys Asn 
                      180                 185                 190         
          Glu Asn Arg Met Ile Thr Leu Tyr Cys Leu Asn Thr 
                  195                 200                 
          <![CDATA[<210> 974]]>
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          <![CDATA[<400> 974]]>
          Lys Ile Thr Ile Lys Gln Trp Gln Pro Asp Ser Val Lys Lys Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly Tyr Ser Thr Leu Val Met Gly Ala Gln Gly Lys Gln Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asn Cys Tyr Thr Asn Gln Ala Ser Asp Tyr Val Gln Pro Lys Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Gly Gly Phe Gly Cys Glu Val Phe Asn Leu Lys Trp Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gln Glu Tyr Thr Ala His Arg Asn Ile Trp Thr Lys Thr Asn Glu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Asp Leu Cys Arg Tyr Thr Gly Ala Gln Ile Ile Leu Tyr Arg His 
                          85                  90                  95      
          Pro Asp Val Asp Phe Ile Val Ser Trp Asp Asn Gln Pro Pro Phe Leu 
                      100                 105                 110         
          Leu Asn Lys Tyr Thr Tyr Pro Glu Leu Gln Pro Gln Asn Leu Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Ala Arg Arg Lys Arg Ile Ile Leu Ser Gln Lys Ser Asn Pro Lys Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Leu Arg Ile Lys Leu Arg Ile Pro Pro Pro Lys Gln Met Ile Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Phe Phe Gln Arg Asp Phe Cys Asp Val Asn Leu Phe Lys Leu 
                          165                 170                 175     
          Cys Ala Ser Ala Ala Ser Phe Arg Tyr Pro Gly Ile Ser His Gly Ala 
                      180                 185                 190         
          Gln Ser Thr Ile Phe Ser Ala Tyr Ala Leu Asn Thr 
                  195                 200                 
          <![CDATA[<210> 975]]>
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          <![CDATA[<400> 975]]>
          Phe Leu Lys Leu Val Gln Trp Gln Pro Asp Arg Ile Arg Lys Cys Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ile Lys Gly Arg Gly Thr Leu Val Met Gly Ala His Gly Arg Gln Met 
                      20                  25                  30          
          Ile Cys Phe Thr Asn Val Lys Asp Arg Leu Thr Pro Ser Arg Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Ala Gly Gly Gly Phe Gly Val Glu Arg Ile Thr Leu Ala His Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu Trp Lys Ala Arg Asn Asn Val Trp Thr Ala Thr Asn Glu Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Asp Leu Gly Arg Tyr Thr Gly Cys Lys Ile Ser Phe Tyr Arg His 
                          85                  90                  95      
          Leu Asp Thr Asp Phe Ile Ile Lys Tyr Ser Arg Asn Pro Pro Phe Asn 
                      100                 105                 110         
          Leu Glu Lys Tyr Ser Tyr Met Tyr Met Gln Pro Gln Glu Leu Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Gly Lys His Lys Arg Ile Leu Leu Ser Lys Lys Thr Asn Pro Lys Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Leu Lys Thr Thr Leu Lys Ile Gly Pro Pro Lys Leu Leu Thr Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Trp Leu Leu Gln Ser Glu Leu Ala Lys Gln Asp Leu Val Glu Ile 
                          165                 170                 175     
          Ser Ala Ala Ala Ala Ser Phe Thr Tyr Pro Thr Ile Gly Cys Cys Asn 
                      180                 185                 190         
          Glu Asn Arg Ile Leu Asn Leu Tyr Ser Ile Asn Thr 
                  195                 200                 
          <![CDATA[<210> 976]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 976]]>
          kkgtktctr                                                                9
          <![CDATA[<210> 977]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 977]]>
          gtaccayttr                                                              10
          <![CDATA[<210> 978]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 978]]>
          gttwgtggts                                                              10
          <![CDATA[<210> 979]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 979]]>
          caccgacva                                                                9
          <![CDATA[<210> 980]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 980]]>
          ctcggagtg                                                                9
          <![CDATA[<210> 981]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 981]]>
          gcactcctc                                                                9
          <![CDATA[<210> 982]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 982]]>
          cggagtctg                                                                9
          <![CDATA[<210> 983]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 983]]>
          cccactcac                                                                9
          <![CDATA[<210> 984]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 984]]>
          gtaccactta                                                              10
          <![CDATA[<210> 985]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 985]]>
          gtaccacttg                                                              10
          <![CDATA[<210> 986]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 986]]>
          gtaccattta                                                              10
          <![CDATA[<210> 987]]>
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          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 987]]>
          gtaccatttg                                                              10
          <![CDATA[<210> 988]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 988]]>
          gaccacaaac                                                              10
          <![CDATA[<210> 989]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 989]]>
          gaccactaac                                                              10
          <![CDATA[<210> 990]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 990]]>
          caccacaaac                                                              10
          <![CDATA[<210> 991]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 991]]>
          caccactaac                                                              10
          <![CDATA[<210> 992]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (6)..(7)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (9)..(9)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (15)..(16)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<400> 992]]>
          Tyr Asn Cys Ser Pro Xaa Xaa Asp Xaa Gly Ala Ser Lys Arg Xaa Xaa 
          1               5                   10                  15      
          Asn Thr Ser Val Ala Lys 
                      20          
          <![CDATA[<210> 993]]>
          <![CDATA[<211> 51]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> modified_base]]>
          <![CDATA[<222> (45)..(45)]]>
          <![CDATA[<223> a、c、t、g、未知物或其他]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 關於取代及較佳實施例之詳細描述，請參見申請的說明書]]>
          <![CDATA[<400> 993]]>
          aggtgagtga aaccaccgaa gtcaaggggc aattcgggct agggncagtc t                51
          <![CDATA[<210> 994]]>
          <![CDATA[<211> 50]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 994]]>
          aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc                  50
          <![CDATA[<210> 995]]>
          <![CDATA[<211> 50]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 995]]>
          aggtgagtga aaccaccgaa gtcaaggggc aattcgggct agatcagtct                  50
          <![CDATA[<210> 996]]>
          <![CDATA[<211> 50]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 996]]>
          aggtgagtga aaccaccgag gtctaggggc aattcgggct agggcagtct                  50
          <![CDATA[<210> 997]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 997]]>
          agcaacaggt aatggaggac                                                   20
          <![CDATA[<210> 998]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 998]]>
          tgaagctggg gtctttaac                                                    19
          <![CDATA[<210> 999]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成探針]]>
          <![CDATA[<400> 999]]>
          tctacctagg tgcaaagggc c                                                 21
          <![CDATA[<210> 1000]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 1000]]>
          cgaatggyw                                                                9
          <![CDATA[<210> 1001]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 1001]]>
          ttgcccctt                                                                9
          <![CDATA[<210> 1002]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 1002]]>
          ytgyggbtg                                                                9
          <![CDATA[<210> 1003]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 1003]]>
          yagamacmm                                                                9
          <![CDATA[<210> 1004]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 1004]]>
          gtaccayttr                                                              10
          <![CDATA[<210> 1005]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 1005]]>
          saccacwaac                                                              10
          <![CDATA[<210> 1006]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 1006]]>
          caccgacva                                                                9
          <![CDATA[<210> 1007]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 1007]]>
          cactccgag                                                                9
          <![CDATA[<210> 1008]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 1008]]>
          gcactcctc                                                                9
          <![CDATA[<210> 1009]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 1009]]>
          cagactccg                                                                9
          <![CDATA[<210> 1010]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 1010]]>
          cccactcac                                                                9
          <![CDATA[<210> 1011]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成引子]]>
          <![CDATA[<400> 1011]]>
          cttcgccat                                                                9
          <![CDATA[<210> 1012]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (2)..(8)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (10)..(12)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (14)..(14)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (16)..(20)]]>
          <![CDATA[<223> 任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<400> 1012]]>
          Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa 
          1               5                   10                  15      
          Xaa Xaa Xaa Xaa His 
                      20      
          <![CDATA[<210> 1013]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成6xHis標籤]]>
          <![CDATA[<400> 1013]]>
          His His His His His His 
          1               5
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Figure 12_A0101_SEQ_0280
Figure 12_A0101_SEQ_0281
Figure 12_A0101_SEQ_0282
Figure 12_A0101_SEQ_0283
Figure 12_A0101_SEQ_0284
Figure 12_A0101_SEQ_0285
Figure 12_A0101_SEQ_0286

Claims (28)

  1. 一種向先前已經投與第一複數個指環載體之人類個體遞送外源性效應子之方法，該方法包含： 向該個體投與第二複數個指環載體，其中： (i)該等第一複數個指環載體包含： (a)蛋白質外部，其包含ORF1分子； (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼外源性效應子之核酸序列(例如DNA序列)，且 (ii)該等第二複數個指環載體包含： (a)包含ORF1分子之蛋白質外部，該ORF1分子與該第一複數個指環載體中之該蛋白質外部中之該ORF1分子具有至少90%胺基酸序列一致性；及 (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼該外源性效應子之核酸序列(例如DNA序列)； 藉此向該個體遞送該效應子。
  2. 如請求項1之方法，其包含向該個體投與該等第一複數個指環載體。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該等第二複數個指環載體之該ORF1分子與該等第一複數個指環載體之該蛋白質外部中的該ORF1分子具有至少95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性。
  4. 如前述請求項中任一項之方法，其中該等第二複數個指環載體係在向該個體投與該等第一複數個指環載體之後至少1、2、3或4週，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月投與該個體。
  5. 如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與第三、第四、第五及/或另外複數個指環載體，該等指環載體包含： (a)包含ORF1分子之蛋白質外部，該ORF1分子與該第一複數個指環載體中之該蛋白質外部中之該ORF1分子具有至少90%胺基酸序列一致性，及 (b)遺傳元件，其包含啟動子元件及編碼該外源性效應子之核酸序列(例如DNA序列)。
  6. 如前述請求項中任一項之方法，其中該等第二複數個指環載體包含該第一複數個中之指環載體數目的90%-110%，例如95%-105%。
  7. 如前述請求項中任一項之方法，其中該第一複數個及該第二複數個指環載體係經由相同投與途徑投與，例如經由靜脈內投與。
  8. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該第一複數個及該第二複數個指環載體係經由不同投與途徑投與。
  9. 如前述請求項中任一項之方法，其中該等第二複數個指環載體包含與該等第一複數個指環載體相同之蛋白質外部。
  10. 如前述請求項中任一項之方法，其中該等第二複數個指環載體包含與該等第一複數個指環載體所包含之該ORF1分子具有相同胺基酸序列的ORF1分子。
  11. 如前述請求項中任一項之方法，其中該等第一複數個指環載體之該效應子為外源性效應子。
  12. 如前述請求項中任一項之方法，其中包含於該等第一複數個指環載體中之該遺傳元件在其投與之後至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150天，例如藉由高解析度熔融(HRM)分析，可在該個體中偵測到。
  13. 如前述請求項中任一項之方法，其中包含於該等第二複數個指環載體中之該遺傳元件在其投與之後至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150天，例如藉由高解析度熔融(HRM)分析，可在該個體中可偵測到。
  14. 如前述請求項中任一項之方法，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該遺傳元件包含指環病毒5' UTR (例如，SEQ ID NO: 16之核苷酸170-240、SEQ ID NO: 54之核苷酸323-393或SEQ ID NO: 886之核苷酸185-254)或與其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。
  15. 如前述請求項中任一項之方法，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該遺傳元件包含SEQ ID NO: 41之核苷酸323-393之核酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。
  16. 如前述請求項中任一項之方法，其中該等第一及/或第二複數個指環載體之該遺傳元件包含長度為至少100個核苷酸之序列，其在至少80%位置處係由G或C組成。
  17. 如前述請求項中任一項之方法，其中該等第一及/或第二複數個指環載體包含核酸序列，其編碼選自表12之ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
  18. 如前述請求項中任一項之方法，其中該等第一及/或第二複數個指環載體不包含與指環病毒ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。
  19. 如前述請求項中任一項之方法，其中該等第一及/或第二複數個指環載體為複製缺陷型。
  20. 如前述請求項中任一項之方法，其中該效應子包含： (i)胞內核酸(例如，miRNA或siRNA)； (ii)分泌多肽，其選自抗體分子、酶、激素、細胞介素分子、補體抑制劑、生長因子或生長因子抑制劑或前述任一者之功能變異體；或 (iii)在突變時引起人類疾病之多肽或該多肽之功能變異體。
  21. 一種引子，其包含根據SEQ ID NO: 1、3、4、6、8、10、12、14、17、19、21或23中之任一者之核酸序列。
  22. 一種混合物，其包含複數個不同引子，該等引子包含根據SEQ ID NO: 1、3、4、6、8、10、12、14、17、19、21或23中之任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11個或所有的核酸序列。
  23. 如請求項22之混合物，其中該複數個中之各引子之長度為9個核苷酸。
  24. 如請求項22之混合物，其中各引子包含一或多個(例如1或2個)硫代磷酸酯鍵聯。
  25. 一種擴增包含指環病毒序列之環狀DNA分子的方法，該方法包含： (a)提供樣品，該樣品包含有包含指環病毒序列之環狀DNA分子，及具有與該指環病毒序列之一部分互補的至少7、8或9個核苷酸之第一引子；且 (b)使該環狀DNA分子與DNA依賴型DNA聚合酶分子接觸； 其中該接觸引起該DNA分子或其一部分之線性擴增(例如滾環擴增或多股置換擴增)。
  26. 如請求項25之方法，其中該樣品包含複數個引子，該等複數個引子具有與該指環病毒序列之一部分互補的至少7、8或9個核苷酸。
  27. 如請求項26之方法，其中該等複數個引子包含根據SEQ ID NO: 1、3、4、6、8、10、12、14、17、19、21或23或其任何組合之核酸序列。
  28. 如請求項25至27中任一項之方法，其中該DNA依賴型DNA聚合酶分子包含Phi29。
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IN2012DN02305A (zh) * 2009-08-21 2015-08-21 Virginia Tech Intell Prop
EP2653562A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-23 Institut Pasteur Anellovirus genome quantification as a biomarker of immune suppression
EP3638797A1 (en) * 2017-06-13 2020-04-22 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions comprising curons and uses thereof
WO2019213624A1 (en) * 2018-05-04 2019-11-07 The Regents Of The University Of California Spiked primers for enrichment of pathogen nucleic acids among background of nucleic acids
EP3894568A2 (en) * 2018-12-12 2021-10-20 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellosomes for delivering secreted therapeutic modalities
JP2022513459A (ja) * 2018-12-12 2022-02-08 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド タンパク質代替治療モダリティを送達するためのアネロソーム

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