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CN104080799B - 具有病毒感染增强性质的肽及其用途 - Google Patents

具有病毒感染增强性质的肽及其用途 Download PDF

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CN104080799B CN201280041341.2A CN201280041341A CN104080799B CN 104080799 B CN104080799 B CN 104080799B CN 201280041341 A CN201280041341 A CN 201280041341A CN 104080799 B CN104080799 B CN 104080799B
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Abstract

本发明涉及肽及其功能性衍生物以及其用于提高病毒侵入靶细胞的转导效率的用途。

Description

具有病毒感染增强性质的肽及其用途
本发明涉及肽及其功能性衍生物以及其用于提高病毒侵入靶细胞的转导效率的用途。
背景技术
基因治疗方法经常因靶细胞对重组病毒载体的低转导效率而受阻碍。逆转录病毒载体，尤其是基于人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的慢病毒载体(LV)是有前途的用于基因治疗的运载体（vehicle）(D'Costa等人，2009)。这些载体目前在临床应用中用于治疗各种疾病，如免疫缺陷疾病、神经变性或神经性疾病、贫血、HIV感染。一些逆转录病毒载体的应用依赖于特异性靶细胞的离体转导，如表达CD34标志物的造血干/祖细胞（造血干细胞/造血祖细胞）。对使用重组慢病毒颗粒的限制因素是在生产重组慢病毒载体颗粒的过程中获得具有高感染滴度的能力。避免这种限制的一种方法是在纯化步骤中浓缩病毒上清(Rodrigues等人，2007)。然而，对于一些LV，很难建立纯化工序，这取决于用于假型病毒颗粒的包膜糖蛋白-如GALVTR-LV(具有融合到双嗜性鼠白血病病毒(MLV-A)包膜糖蛋白的胞质尾的长臂猿白血病病毒包膜糖蛋白的假型LV(Sandrin等人，2002))就是这种情况。因此，许多慢病毒载体制剂具有低滴度，并被限制了转导功效。另一个限制因素是慢病毒载体自身感染靶细胞的能力。多种包膜糖蛋白如VSV-G、RD114TR、GALVTR可用于假型慢病毒载体，并对靶细胞如CD34+细胞具有可变的感染性(Sandrin等人，2002)。避免这些限制的一种策略是添加辅助因子以优化转导工序，如阳离子聚合物(如聚凝胺)或纤连蛋白片段(如Retronectin)(Davis等人，2004；Pollok等人，1999)。美国专利No.7,759,467公开了利用逆转录病毒以增加造血细胞转导效率的方法，其包括在纤连蛋白或纤连蛋白片段存在的情况下感染细胞。然而，所提出的方法并不能令人完全满意，至少由于以下两个原因：首先，用于提高逆转录病毒效率的纤连蛋白片段存在显著的经济上的弊端，这是因为其通常含有约270或更多的氨基酸。此外，使用纤连蛋白或纤连蛋白片段需要将培养板包被并将病毒上清预装载到固定化的纤连蛋白片段上。这两个步骤是难以标准化的，并可能导致一定程度的依赖于所使用的纤连蛋白片段和病毒上清的浓度的靶细胞转导的饱和(Novelli等人，1999)。
有趣的是，最近人类精液中的称之为SEVI的天然阳离子肽被鉴定为强HIV-1感染性增强子(Munch等人，2007；Roan等人，2009)。这一家族的肽也公开在国际申请No.PCT/EP2007/050727中，该国际申请公开了促进细胞病毒感染的人前列腺酸性磷酸酶的240-290的氨基酸残基片段。
国际申请No.PCT/FR02/01772中公开了在pH7.4具有大于或等于2的绝对电荷的两亲阳离子肽，并且包含至少一种亲水部分，所述部分包括至少三个残基，其能够于pH值小于7.4时被质子化以转运核酸或蛋白到细胞内。此文献没有公开或暗示使用该类肽以提高病毒或病毒载体的转导效率。此外，这些两亲阳离子肽含有抗菌活性(Mason等人，2009)。
本发明的目的是提供用于提高病毒或病毒载体的转导效率的方法，如用于提高将基因导入靶细胞。由于肽在其生物可降解性质、其缩小的尺寸、表征和大规模生产的简易性方面是令人感兴趣的，已进行了大量研究来鉴定能替代纤连蛋白和SEVI肽的替代物。
发明内容
本发明人已发现，如权利要求中所定义的特定的肽具有在真核细胞中促进病毒转导效率的性质，特别是在人原代造血祖/干细胞中。
根据一个方面，本发明涉及LAH4肽或其功能性衍生物在促进病毒或病毒载体感染真核细胞中的用途。
根据另一个方面，本发明涉及一种用病毒或病毒载体感染真核细胞的方法，特别是一种体外或离体的方法，其包含在LAH4肽或其功能性衍生物存在的情况下，将细胞与病毒或病毒载体相接触。
根据另一个方面，本发明涉及一种用病毒载体增加基因转运到靶细胞中的效率的方法，特别是一种体内或离体的方法，其包含在LAH4肽或其功能性衍生物存在的情况下，将病毒载体与靶细胞相接触，以促进核酸序列(如基因、cDNA、siRNA、shRNA、允许产生反义寡核苷酸的序列)转运到靶细胞中。
根据另一个方面，本发明涉及一种诊断受试者中病毒感染的方法，其包括将受试者的样品与真核细胞和LAH4肽或其功能性衍生物进行孵育，以扩增包含于所述样品的任何病毒，并鉴定所扩增的病毒。
根据另一个方面，本发明涉及新的LAH4衍生肽。
根据另一个方面，本发明涉及用于基因治疗的用于促进病毒或病毒载体感染真核细胞的肽。本发明进一步涉及在基因治疗中与病毒或病毒载体联合使用的肽。
具体实施方案
在本文中，术语“LAH4肽”是指具有由SEQ ID NO:1组成的氨基酸序列的肽。
如本文所用，术语“LAH4功能性衍生物”和其类似语（declination）是指其序列基于LAH4肽的一级结构进行设计并且具有改善病毒或病毒载体的转导效率的能力的任何的肽。在具体的实施方式中，LAH4功能性衍生物是具有改善病毒在真核细胞中转导效率的能力的肽，其中所述病毒被GALV、RD114、MLV、VSV或GP64包膜壳体化（encapsidated），其中所述真核细胞特别是人、小鼠、大鼠、猴、狗或仓鼠细胞，特别是人CD34+细胞。在一个具体的实施方式中，LAH4功能性衍生物是具有改善由GALV包膜壳体化的病毒在人CD34+细胞中的转导效率的能力的肽。
根据本发明的LAH4功能性衍生物还应该包括以下特点：
-其包括19个或更多个氨基酸，特别是20、21或更多个氨基酸。在一个具体的实施方式中，所述肽包含20至30个之间的氨基酸，特别是21至26个之间，特别是24至26之间；
-其N-末端包含一个或多个在pH7.4时带正电荷的氨基酸残基。在一个具体的实施方式中，N-末端包含一个或两个在pH7.4时带正电荷的残基。在一个具体的实施方式中，这些氨基酸残基是赖氨酸和/或精氨酸；和
-当根据本领域熟知的Schiffer-Edmundson轮状表示法显示时，其中心区域形成螺旋(Schiffer等人，1967)，并且对应于可能形成肽的中心结构域的18个氨基酸残基。在一个具体的实施方式中，根据Schiffer-Edmundson轮状表示法，螺旋是α-螺旋。在另一个实施方式中，根据本发明的肽是阳离子两亲肽或含有非极性螺旋的肽。根据此实施方式，所述肽的中心螺旋区对应的氨基酸残基具有形成螺旋的强倾向性(Georgescu等人，2010)。在此实施方式中，所述肽的中心螺旋区可以：
-要么是非极性螺旋，其包含位于螺旋一侧的疏水氨基酸残基簇以及在螺旋另一侧的连续丙氨酸残基，所述连续丙氨酸残基定义了Schiffer-Edmundson轮状表示法中的60至180°的角度，并且优选140°的角度；
-要么是两亲螺旋，其包含位于螺旋一侧的疏水氨基酸残基簇以及在螺旋另一侧的2至4个组氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义了包含60°至180°之间的角度，并且优选140°的角度。
在一个具体的实施方式中，LAH4功能性衍生物的氨基酸选自丙氨酸、组氨酸、亮氨酸和赖氨酸。
在本文中，术语“两亲肽”表示包含疏水性和亲水性氨基酸的肽，其易于定义如Schiffer-Edmundson轮状表示法中表示的至少一个亲水区和至少一个不同的疏水区。
在本文中，术语“非极性螺旋肽”表示包含丙氨酸和疏水性氨基酸残基的肽，其易于定义如Schiffer-Edmundson轮状表示法中表示的至少一个不同的疏水区。可出现在本发明的肽中的代表性疏水性残基具有大于或等于+1.9的疏水指数(Kyte等人，1982)。因此，可出现在本发明的肽中的代表性疏水性残基包括缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。在一个优选的实施方式中，疏水性残基是亮氨酸残基。
在本文中，术语“阳离子肽”表示在pH7.4时具有绝对正电荷（positive absolutecharge）的肽。在一个优选的实施方式中，正电荷是由精氨酸和/或赖氨酸残基提供的。不由遗传密码编码的阳离子天然氨基酸如鸟氨酸也能提供本发明的肽中的正电荷。
在另一个实施方式中，带正电荷的部分被连接到氨基酸残基上。如本领域熟知的，这样的带正电荷的部分包括如氮丙啶、精胺和亚精胺。
用于本发明的LAH4功能性衍生物肽具有增加病毒或病毒载体的转导效率的性质，并且可以由本领域技术人员容易地利用如实例中描述的方法筛选出。本文描述的是用于鉴定这样的LAH4肽的功能性衍生物的方法。在一个具体的实施方式中，所述方法包括
-选择LAH4肽或其已知的功能性衍生物(例如在下文SEQ ID NO:1-27中所述的一个)、目标病毒或病毒载体以及目标细胞；
-修饰LAH4肽或其已知的功能性衍生物以制备变体肽；和
-测量当变体肽存在时病毒或病毒载体的细胞转导效率，
其中当测到有效转导时认为变体肽是功能性衍生物。
所述方法还可以包括比较由变体肽获得的病毒或病毒载体的转导效率与不存在变体肽时所获得的转导效率，或与由已知的具有提高病毒或病毒载体进入细胞的转导效率能力的肽获得的转导效率的步骤。
修饰LAH4肽或其已知的功能性衍生物的步骤可包括修饰，如突变LAH4肽或其已知的功能性衍生物的第一氨基酸残基以制备变体肽。在一个变体的实施方式中，修饰包括在LAH4肽或其下述的已知功能性衍生物上共价修饰一个或多个氨基酸残基。根据另一个变体，修改包括天然发生的L氨基酸被D氨基酸代替(在肽的一个或多个位置上，特别是在所有的位置上)。
可以用这样的方法进行测试的示例性的LAH4肽的功能性衍生物包括优选的如SEQID NO:2-27所示的功能性衍生物。那些SEQ ID NO:2-27的相同功能性衍生物和SEQ IDNO:1的LAH4肽也可以为根据本发明设计进一步的功能性衍生物提供基础。此外，SEQ ID NO:1-27的肽可在根据本发明的鉴定功能性衍生物的方法中作为对照使用。
在本发明的具体实施方式中，肽包括选自丙氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸的氨基酸残基。
在本发明的用途和方法的具体的实施方式中，肽的N-末端包含一个、两个或三个正电荷。在本实施方式的具体变体中，位于肽的N-末端的正电荷由精氨酸或赖氨酸残基提供。在另一个变体中，带有正电荷的残基位于N-端的最末端。在另一个变体的实施方式中，第一氨基酸(例如第一个或第一个和第二个残基，或第一个和第三个等)是中性残基。
在本发明的用途和方法的另一个实施方式中，最C-端的残基是丙氨酸，并且在另一个方面，当肽的C-末端包含在pH7.4时带正电荷的氨基酸残基时，其紧邻C-末端的丙氨酸或位于N-端的最末端。
能在C-末端提供正电荷的代表性残基是精氨酸和/或赖氨酸残基。
在本发明的用途和方法的具体实施方式中，所述肽包含4个组氨酸残基。在一个具体的实施方式中，所述组氨酸残基在根据Schiffer-Edmundson轮状所示的螺旋中形成2对相邻的组氨酸。根据此实施方式的变体，LAH4衍生肽在由组氨酸对之间的最小角度所定义的α-螺旋的部分中仅有亮氨酸残基或仅有丙氨酸残基。
根据一个具体的实施方式，所述肽包含4个组氨酸残基，并且具有序列
(K/R)a(K/R)b(K/A/L)cLdL(A/H/L)(A/H/L)(A/L)L(A/H/L)(A/H/L)(A/L)(A/L)(A/L)(H/L)(A/L)(H/L)(A/H/L)(A/L)(A/L)(A/H/L)(A/H/L)eLf(K/R)g(K/R)hAi
其中:
a、b、c和d代表0或1，附加条件是a+b+c+d等于2或3或优选是4；
e、f、g、h和i独立地代表0或1，且e+f+g+h+i等于2或3或4或优选是5。
在一个变体的实施方式中，组氨酸残基被其它在酸性pH时被质子化的基团所取代：这些其它的基团包括含有咪唑的基团或二氨基丙酸残基。
具体的用于本发明的肽可以是如SEQ ID NO:1至27所示的肽:
LAH4:KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA(SEQ ID NO:1)
LAH4-L1:KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA(SEQ ID NO:2)
LAH4-L1-dKC:KKALLAHALHLLALLALHLAHALA(SEQ ID NO:3)
LAH4-L1-R:RRALLAHALHLLALLALHLAHALRRA(SEQ ID NO:4)
LAH4-L0:KKALLAHALAHLALLALHLALHLKKA(SEQ ID NO:5)
LAH4-L2:KKALLALALHHLALLALHLAHALKKA(SEQ ID NO:6)
LAH4-L3:KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA(SEQ ID NO:7)
LAH4-L4iso:KKALLHLALLHAALLAHHLALALKKA(SEQ ID NO:8)
LAH4-L5:KKALLHLALLHAALLAHLAALHLKKA(SEQ ID NO:9)
LAH4-L6iso:KKALLHLALLLAALHAHLAALHLKKA(SEQ ID NO:10)
LAH4-A1:KKALLAHALHLLAALALHLAHLLKKA(SEQ ID NO:11)
LAH4-A2:KKALLLAALHHLAALALHLAHLLKKA(SEQ ID NO:12)
LAH4-A3:KKALLLAALHHLLALAHHLAALLKKA(SEQ ID NO:13)
LAH4-A4:KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(SEQ ID NO:14)
LAII4-A5:KKALLIIALLAIILAALLIIALLAIILKKA(SEQ ID NO:15)
LAH4-A6iso:KKALLHALLAALLAHLHALLAHLKKA(SEQ ID NO:16)
LAH4-A4-K1N:KALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(SEQ ID NO:17)
LAH4-A4-K3N:KKKLLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(SEQ ID NO:18)
LAH4-A4-dKC:KKALLHAALAHLLALAHHLLALLA(SEQ ID NO:19)
LAH4-A4-d1aa:KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKK(SEQ ID NO:20)
LAH4-A4-d2aa:KKLLHAALAHLLALAHHLLALLKK(SEQ ID NO:21)
LAH4-A4-d2Caa:KKALLHAALAHLLALAHHLLALKK(SEQ ID NO:22)
LAH4-A4-d3aa:KKLHAALAHLLALAHHLLALLKK(SEQ ID NO:23)
LAH4-A4-d5aa:KKLHAALAHLLALAHHLLAKK(SEQ ID NO:24)
LAH2-A6:KKALLHAALAHLLALAAALLALLKKA(SEQ ID NO:25)
K2-L10A12-K2:KKALLAAALAALLALAAALLALLKKA(SEQ ID NO:26)
LAH4-A4-Leu:KKLLLHALLAHLLALLHHLLALLKKL(SEQ ID NO:27).
根据第二方面，本发明涉及新的LAH4衍生肽。在该第二方面中，本发明涉及阳离子两亲肽，其包含
-19个或更多个的氨基酸，特别是20、21或更多个氨基酸。在一个具体的实施方式中，所述肽包含20至30个之间的氨基酸，特别是21至26个之间，特别是24至26个之间；
-N-末端，其包含一个或多个在pH7.4时带正电荷的氨基酸残基；
-至少2个组氨酸残基，特别是4个组氨酸残基，其定义了在Schiffer-Edmundson轮状表示法中的在80°至180°之间包括的亲水角度，更具体地为140°的角度；
-肽的其它氨基酸，其选自丙氨酸和亮氨酸残基；
其中，在Schiffer-Edmundson轮状表示法中，所述肽在由所述组氨酸残基所定义的最小角度中的最远组氨酸残基间仅包括丙氨酸残基。
这些第二方面的新肽是如上所述的LAH4肽的功能性衍生物。
在第二方面的一个具体的实施方式中，所述亲水角度包含120至180°之间，最优选的角度为140°。
根据该第二方面的一个具体的实施方式，本发明的肽的N-末端在pH7.4时包含1个、2个或3个(特别是1个或2个)正电荷(具体由精氨酸或赖氨酸残基提供，优选赖氨酸残基)。带正电荷的残基优选地位于N-端的最末端，并且如果存在多于一个的带正电荷的残基，优选其连续存在。
在第二方面的另一个具体的实施方式中，本发明的肽的C-末端包含一个或多个在pH7.4时带正电荷的氨基酸残基。在C-末端的能提供正电荷的代表性残基是精氨酸和/或赖氨酸残基。
在第二方面的另一个实施方式中，C-末端残基是丙氨酸，且在另一个方面，当肽的C-末端包含在pH7.4时带正电荷的氨基酸残基时，其紧邻C-端的丙氨酸或位于N-端的最末端。
根据第二方面的另一个实施方式，本发明的肽包含4个组氨酸残基。在一个具体的实施方式中，，所述组氨酸残基在根据Schiffer-Edmundson轮状显示的α-螺旋中形成2对相邻的组氨酸。
在第二方面的另一个实施方式中，LAH4衍生肽是LAH4肽的异构体，也就是说，其在一级序列上包含不同顺序的相同顺序的丙氨酸、组氨酸、亮氨酸和赖氨酸残基。
通过此定义所涵盖的第二方面的代表性肽如SEQ ID NO:11-25和27所示。因此，本发明涉及的肽选自SEQ ID NO:11-25和27。
在第三方面中，本发明涉及新的LAH4衍生肽，其包括：
-19个或更多个氨基酸，特别是20、21或更多个氨基酸。在一个具体的实施方式中，所述肽包含20至30个之间的氨基酸，特别是21至26个之间，特别是24至26个之间；
-N-末端，其包含一个或多个在pH7.4时带正电荷的氨基酸残基；
-非极性螺旋，其包含在螺旋一侧的疏水氨基酸残基簇以及在螺旋另一侧的连续丙氨酸残基，其在Schiffer-Edmundson轮状表示法中限定60至180°的角度并优选140°的角度。
在此第三方面的一个具体的变体中，肽的其它氨基酸选自丙氨酸和亮氨酸残基。
这些第三方面的新肽是如上所述的LAH4肽的功能性衍生物。
这些肽含有非极性螺旋，即螺旋的氨基酸残基是疏水性(或非极性)的。优选包含在本发明的肽的非极性螺旋中的代表性疏水氨基酸残基包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸残基，特别是丙氨酸和亮氨酸残基。
在第三方面的一个具体的实施方式中，在疏水氨基酸簇中的氨基酸选自亮氨酸和丙氨酸残基。在另一个具体的实施方式，在疏水氨基酸簇中的氨基酸是亮氨酸残基。
肽K2-L10A12-K2(SEQ ID NO:26)是根据此定义的代表性肽。
根据第三方面的一个具体实施方式，本发明的肽的N-末端在pH7.4时包含1个、2个或3个(特别是1个或2个)正电荷(具体由精氨酸或赖氨酸提供，优选是赖氨酸残基)。带正电荷的残基优选地位于N-端的最末端，并当存在多于一个的带正电荷的残基时，优选其连续存在。
在第三方面的另一个具体的实施方式中，本发明的肽的C-末端包含一个或多个在pH7.4时带正电荷的氨基酸残基。在C-末端能提供正电荷的代表性残基是精氨酸和/或赖氨酸残基。
在第三方面的另一个实施方式中，C-端残基是丙氨酸，并且在另一个方面，当肽的C-端包含在pH7.4时带正电荷的氨基酸残基时，其紧邻C-端的丙氨酸或位于N-端的最末端。
根据第四方面，本发明涉及属于LAH4功能性衍生物的阳离子两亲肽，其包括
-19个或更多个氨基酸，特别是20、21或更多个氨基酸。在一个具体的实施方式中，所述肽包含20至30个之间的氨基酸，特别是21至26个之间，特别是24至26个之间；
-N-末端，其包含一个或多个在pH7.4时带正电荷的氨基酸残基；
-至少2个组氨酸残基，优选4个组氨酸残基，在Schiffer-Edmundson轮状表示法中，定义了具有包括在140°至180°之间的亲水角度，更具体地为140°的角度；
其中，在Schiffer-Edmundson轮状表示法中，所述肽在由所述组氨酸残基所定义的最小角度中的最远组氨酸残基之间仅包括亮氨酸残基。
在此第四方面的一个具体的实施方式中，肽的其它氨基酸选自丙氨酸和亮氨酸残基。
此第四方面的肽不是具有SEQ ID NO:36的LAH4-L4肽并且不是具有SEQ ID NO:37的LAH4-L6肽。
在此第四方面的一个具体的实施方式中，本发明的肽是具有SEQ ID NO:1的LAH4肽的异构体，其氨基酸序列由8个丙氨酸、4个组氨酸、10个亮氨酸和4个赖氨酸残基组成。
根据此第四方面的一个具体的实施方式，本发明的肽的N-末端在pH7.4时包含1个、2个或3个(特别是1个或2个)正电荷(具体由精氨酸或赖氨酸残基提供，优选是赖氨酸残基)。带正电荷的残基优选地位于N-端的最末端，并且在存在多于一个的带正电荷的残基时，优选其连续存在。
在第四方面的另一个具体的实施方式中，本发明的肽的C-末端包含一个或多个在pH7.4时带正电荷的氨基酸残基。在C-末端能提供正电荷的代表性残基是精氨酸和/或赖氨酸残基。
在第四方面的另一个实施方式中，C-端残基是丙氨酸，并且在另一个方面，当肽的C-末端包含在pH7.4时带正电荷的氨基酸残基时，其紧邻C-端的丙氨酸或位于N-端的最末端。
第四方面所涵盖的代表性的肽包括肽LAH4-L4iso、LAH4-L5和LAH4-L6iso(SEQ IDNO:8-10)。因此，本发明还涉及选自SEQ ID NO:8-10的肽。
多种用于产生本发明的肽的方法对于本领域技术人员而言是可获得的且是已知的。根据第一方法，编码本发明的肽的核酸序列表达于细菌如大肠杆菌（E.coli）或任何其它表达系统。再根据常规方法对肽进行纯化。根据第二方法，用合成仪合成所述肽(参见例如Bechinger，1996)。
本发明的肽衍生于LAH4肽。尽管后者被认为能在真核细胞中促进核酸的转染，但其促进病毒转导的有利性质却从未被公开或被暗示。此处，本发明人表明，LAH4肽及其衍生物促进靶细胞的病毒感染并增强病毒对细胞的感染性。
本发明的其他实施方式是衍生自如上所述的LAH4肽或其功能性衍生物的肽并且其具有如下共价修饰中的至少一种：
-酰化、乙酰化、至非肽大分子载体基团的连接；优选在N-端；
-酰胺化、至非肽大分子载体基团的连接；优选在C-端；
-糖基化，优选在氨基酸侧链；
-至促进将肽吸收到细胞中的衔接蛋白的连接，或至疏水基团的连接，优选脂质、脂肪酸、丹磺酰基、苄氧羰基或叔丁氧羰基基团；
-氧化、硫化、酯化、内酯形成和/或磷酸化。
本发明还涵盖如上所述的肽的多聚体，如二聚体或三聚体。在本文中，“多聚体”是指共价连接在一起的功能性LAH4肽。二聚体，是连接在一起的2个功能性LAH4肽，可以例如通过在C或N-端引入硫醇基团而获得–然后，这些基团可以用于通过形成二硫桥产生二聚体。当然，其它试剂也可以用来产生这样的多聚体。
根据本发明，LAH4肽或其功能性衍生物(例如，SEQ ID NO:1-27中的任何一个)在其C-端被酰胺化或在C-端没有修饰。
优选的大分子载体基团是聚乙二醇(PEG)、聚氧化烯二醇（polyoxyalkyleneglycol）、聚山梨酯类、甘露聚糖、支链淀粉（amylopectin）、芽霉菌糖（pullulan）、自聚集疏水化多糖的水凝胶纳米颗粒、聚赖氨酸、抗体或白蛋白。
根据一个具体的实施方式，本发明还包括如上所述的肽的逆（retro）、反（inverso）或逆-反（retro-inverso）衍生物，其保留了本文公开的转导促进性质。肽可以包含至少一个D氨基酸以及亚胺基氨基酸和稀有氨基酸。本发明还涉及根据本发明的肽的肽模拟物。这些可被表征，例如通过一个或多个肽键的修饰，例如通过反向肽键或通过酯键。但其也包括具有β或γ-氨基酸的肽等…
本发明的肽促进细胞的病毒感染。如本文所用，“病毒”涉及天然存在的病毒以及人工病毒。例如，副粘病毒(如呼吸道合胞病毒、麻疹病毒)、正粘病毒(如流感病毒)、黄病毒(如丙型肝炎病毒)、嗜肝性DNA病毒(如乙型肝炎病毒)、弹状病毒(如狂犬病病毒、VSV)、冠状病毒(如SARS)、披膜病毒(如辛德毕斯(Sindbis)病毒、基孔肯亚(Chikungunya)病毒)、纤丝病毒(如埃博拉病毒)、沙粒病毒、痘病毒、疱疹病毒、布尼亚病毒、博尔纳病毒、动脉病毒、杆状病毒。根据一个具体的实施方式，病毒是人造病毒，其可例如包括设计用于基因治疗的核酸。在一个优选的实施方式中，病毒是有包膜的病毒。在一个优选的实施方式中，病毒是反转录病毒，特别是慢病毒。本发明人已经表明，本发明的肽可以促进HIV-1衍生的慢病毒载体(LV)感染真核细胞，其包括具有来源于水泡性口炎病毒(VSV)、修饰的猫内源性逆转录病毒(RD114)、双嗜性鼠白血病病毒(MLV)，修饰的长臂猿白血病病毒(GALV)的糖蛋白，甚至具有来源于AcMNPV杆状病毒(GP64)的糖蛋白的假型包膜，后者是一种通常对昆虫细胞特异的病毒。考虑到由本发明的肽所获得的转导效率以及在公开实验中所用的糖蛋白的多样性，明显地，本发明的肽可以用作用于提高包膜的病毒对真核细胞的转导效率的常规方法。
靶细胞可以是任何种类的真核细胞，如哺乳动物细胞，特别是人类、小鼠、大鼠、猴、狗或仓鼠细胞。在具体的实施方式中，靶细胞是CD34+细胞，尤其是收集于需要基因治疗的患者（他/她）的定向造血干细胞谱系（hematopoietic lineage）的CD34+细胞。其它代表性的、非限制性的靶组织/细胞是皮肤、肌肉、肝、眼、神经元、淋巴细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、成肌细胞、肝细胞、肿瘤细胞和更多通常已知是病毒靶点或会被鉴定为病毒靶点的任何真核细胞。
肽与给定的病毒和给定的靶细胞的活性可以通过使用报告基因分析进行测定，例如通过使用如实施例中提供的荧光素酶分析或GFP表达分析。特别地，肽可以按照下述方法进行测试：
-细胞(例如HCT116细胞或293T细胞)接种于培养皿中，例如12孔板(例如105个细胞/孔)，并在37℃下保持过夜；
-含有GFP转基因的病毒在不存在或存在各种浓度的肽(如3、6和/或12μg/ml)的情况下于37℃孵育15min；
-然后病毒要么单独地要么与肽混合地与细胞混合；
-任选地，在足以出现感染的时间之后，例如在前述步骤后的6小时之后，去除培养基并替换为新鲜培养基；
-进一步将细胞培养2至3天；
-通过用合适的手段如流式细胞术监测GFP表达来测定转导效率。
鉴定用于通过（包膜的）载体促进细胞转导的肽的方法也是本发明的一部分。这种方法可以实施前述段落中提供的用于鉴定能增强病毒感染细胞的能力的肽的步骤，当与不存在所述肽时病毒感染细胞的情况相比，其增强病毒感染细胞至少2个因子，更优选3、5或10个因子。
在本发明的用途和方法中，使用有效量的LAH4肽及其功能性衍生物。在本发明中，术语肽的“有效量”是指显著提高病毒载体转导效率所需要的量。此有效量通常将依赖于所测试的具体的肽、靶细胞和所使用的病毒载体。这个量可以根据本领域熟知的方法，特别是根据如上所述的报告基因分析的方法以及实施例中阐释的方法进行确定。例如，本发明人已经表明，促进利用GALVTR-LV转导CD34+细胞所需的LAH4-L1的最佳浓度是约12μg/ml(转导介质中的终浓度)。
根据另一个方面，本发明涉及LAH4肽或其功能性衍生物与病毒颗粒，特别是与包膜的病毒颗粒，更具体地是与用于基因治疗的包膜的病毒载体的复合物。此外，本发明的另一方面涉及用于制备这类复合物的方法，其包括将所述肽与病毒颗粒相混合。
根据另一个方面，本发明涉及LAH4肽或其功能性衍生物与病毒颗粒(特别是包膜的病毒颗粒，更具体地是与用于基因治疗的包膜的病毒载体)以及与细胞的混合物。此外，本发明的另一个方面涉及用于制备这种混合物的方法，其包括将肽与病毒颗粒和细胞相混合。
根据本发明的肽可以用于药物组合物。因此，本发明涉及包含如上所定义的肽和合适的药学上可接受的运载体的组合物。本发明的药物组合物包括一种或多种本发明的肽或肽的生理上可接受的盐。根据本发明的药物组合物也可以包含药学上常用的辅助剂，其有助于如组合物的溶解性、稳定性或无菌度或增加吸收进体内的效率。
本发明的一个方面还涉及如上所定义的肽，其用作药物。在一个具体的实施方式中，所述药物用于增加基因治疗病毒载体的效率(D'Costa等人，2009)。
包含肽的药物组合物的形式和含量取决于给药的途径。优选地，选择盖仑（galenic）制剂以及应用方式，其中使肽以非降解状态到达靶位点。药物可以以注射剂、滴剂、喷雾剂、片剂、栓剂、乳膏、软膏、凝胶等方式进行局部给药。其可以以推注的方式进行给药或在一段时间内反复给药。
本发明的肽、复合物或药物组合物或药物可以体内给药，如通过肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或颅内途径进行注射。因此，本发明还涉及用于基因治疗的方法，包括对有需要的患者施用如上所述的肽、复合物或药物组合物。所述方法还包括在施用本发明的肽之前、之后或同时，施用用于基因治疗的病毒载体。
在一个具体的方面，本发明还涉及包括在培养基中的如上所述的肽的组合物，所述组合物旨在用作感染促进剂，以促进病毒或病毒载体，特别是包膜的病毒或病毒载体转导细胞。因此，本发明还涉及一种病毒感染促进剂，其包含在合适介质中的本发明的肽，特别是在合适的培养基中。
根据另一个方面，本文所公开的是LAH4肽或其功能性衍生物作为抗生素的用途。
根据另一个方面，本文所公开的是LAH4功能性衍生物作为细胞穿透肽(CPP)的用途。具体地，肽用作例如核酸的生物活性化合物的递送系统，所述核酸例如质粒DNA、siRNA、反义寡核苷酸以及其它生物活性化合物(肽或蛋白质，特别是治疗性肽或蛋白、标记肽、抗体等)。所述CPP可以共价地或非共价地连接至生物活性化合物。在一个具体的实施方式中，所述肽是LAH4肽功能性衍生物。
根据另一个方面，本发明还提供了编码本发明的肽的核酸和用于本发明的肽的表达载体，如质粒、粘粒和病毒载体。
本文所述的肽可用于广泛范围的治疗性和诊断性应用，并且是用于实施和研究病毒进入细胞的有价值的实验室工具。
本发明的一个优选实施方式是LAH4肽或其功能性衍生物作为病毒感染或转导效率的通用增强剂的用途，其用于基于病毒载体系统的常规实验室操作或基因治疗途径。所述肽在体外、离体或体内增强了为基因治疗所设计的载体进入细胞的能力。所述肽也可以与用于基因治疗的病毒载体联合给药并介导病毒载体进入靶细胞。肽也可体外使用，因为其促进细胞吸收病毒。因此，其可作为用于研究病毒及其作用机制的工具使用。本发明的另一个实施方式是LAH4肽或其功能性衍生物用于诊断途径的用途，尤其是那些如HIV-1和其它包膜病毒的病毒。LAH4肽和其功能性衍生物增强了病毒颗粒的感染滴度，从而增强了细胞的吸收，允许检测残留的病毒污染。因此，其可以用于从来自受试者的如血清、血、血浆、精液或组织的样品中分离病毒颗粒，特别是从怀疑受病毒感染的人类受试者，更具体地是包膜病毒。根据本发明的肽也可用于研究来自水、食品(禽流感、SARS)的病毒颗粒或在生物恐怖主义中使用的任何(包膜的)病毒。与常规诊断方法相比成功的病毒分离可能会好好几倍。优选的方法是结合亲和力分析和用以从怀疑或已知包含病毒的溶液中定量清除病毒而获得安全溶液的方法。在此类方法中，本发明的肽优选共价结合到支持物或柱上。
本发明还涉及编码本发明的肽的多核苷酸，这样的多核苷酸优选由DNA、RNA、基因组DNA或PNA构成。本发明的另一个方面涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及包含本发明的载体的遗传工程化的宿主细胞。
本发明的肽可一般地用于增强病毒颗粒进入靶细胞的能力。肽也可以作为包膜的病毒颗粒的感染/转导率的一般增强子使用，包膜的病毒颗粒携带有外源的包膜糖蛋白(假颗粒，pseudoparticles)，如水泡性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)、MLV的包膜（Env）蛋白等。本发明的上述肽促进了所有所分析的包膜病毒颗粒的感染率。这就可使我们进行一些以前并不可行的感染实验，特别是在原代细胞中。因此，本发明的肽可作为体外的实验工具使用。
本发明的肽也可以用于在基于载体系统的离体或体内基因治疗方法中增强基因传递速率，特别是基于包膜的载体的系统。因此，本发明还涉及如上所述的肽，其用于基因治疗以在有需要的受试者中促进病毒或病毒载体感染真核细胞。本发明的肽可以在基因治疗中与病毒或病毒载体组合使用。肽可以与基因治疗载体同时、分隔或顺序给药。产生用于基因治疗，特别是用于干细胞的离体基因治疗的高感染性逆转录病毒载体是一个困难的过程。具体地，用于干细胞的逆转录病毒载体的转导效率是低的。然而，在本发明的肽存在的情况下，与不含肽的样品相比较，逆转录病毒载体可以有效地转导干细胞和细胞系，使基因传递进靶细胞的效率更高。
在本发明的体外和离体方法中，肽可预先或并不预先固定于固体支持物上。有利的是，为了获得提高的转导效率，不需要对其进行固定。
在本发明的体外方法的一个具体的实施方式中，另一种提高转导的手段是将LAH4肽或其功能性衍生物一起使用。例如，在一个具体的实施方式中，利用本发明的两个肽以及利用Retronectin或SEVI肽增加了转导效率。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含如上所定义的肽和病毒或病毒载体的试剂盒。
本发明进一步通过下述实施例进行说明。
附图说明
图1.LAH4-L1增强感染性LV滴度的能力。A)用GALVTR-LV、MLV-A-LV、RD114TR-LV、VSV-G-LV及VLP转导HCT116细胞(1,2x10E5TU/ml或200ng/ml的HIV-1p24，用作VLP)。用GP64-LV转导293T细胞(0,8x10E5TU/ml)。在不存在或存在3、6或12μg/ml的LAH4-L1的情况下进行转导。数据显示为具有一式三份情况下的标准偏差(SD)的GFP+细胞百分比。B)在(A)中获得的数据表示为由LAH4-L1介导的增强倍数，空白条件归一化为1。
图2.测定LAH4-L1促进GALVTR-LV转导人CD34+细胞的最佳浓度。A)与不同浓度的LAH4-L1预孵育或不与其预孵育的GALVTR-LV(2x10E6TU/ml，MOI16)转导预激活的hCD34+细胞。转导效率(黑格子)表示为转导后5天所获得的GFP+细胞的百分比将细胞DNA用7-AAD标记并转导2天之后，对死亡率(灰色圆圈)进行评估。B)用与优选浓度的LAH4-L1(12μg/ml)预孵育或不与其预孵育的两种不同剂量的GALVTR-LV(1和2x10E6TU/ml，MOI8和16)转导hCD34+细胞。数据获自六个不同的脐带血供体(每个GALVTR-LV剂量三个供体)。横线表示分布的平均值。
图3.在“人体免疫系统”(BALB-Rag/γC)小鼠模型中评估LAH4-L1的安全性。
在给同窝出生的7只rag-/-/γC-/-小鼠注射之前，hCD34+细胞保留未被转导（三角）或被转导了存在任一的12μg/ml的LAH4-L1(正方形)或20μg/cm2的Retronectin(圆)的GALVTR-LV(MOI8)。A)注射12周后，通过使用流式细胞技术获得转导的(GFP+)hCD45+细胞在血液、骨髓(BM)、脾脏和胸腺中的比例来检测HIS(BALB-Rag/γC)小鼠的有效植入水平。B)和C)通过将人TCRα/β标记物表达于hCD45+细胞亚群中并将人CD4和CD8标记物表达于hCD3+细胞亚群中，体内研究胸腺中的人T淋巴细胞增殖。T淋巴细胞增殖任一地在未转导的(B)或转导的(C)细胞中进行分析。D)至G)通过分别将人CD19、CD14和CD56标志物表达于未转导的(D和F)或转导的(E和G)hCD45+细胞亚群中，体内研究了脾脏(D和E)和BM(F和G)中的人B淋巴细胞发育、人单核细胞和人自然杀伤细胞。通过将人CD34标记物表达于hCD45+细胞亚群中，也分析了BM中的人造血祖细胞。
图4.在LAH4-L1衍生物存在时用GALVTR-LV转导人CD34+细胞。A)各种LAH4-L1衍生物的肽序列的表格(D-LAH4-L1序列与LAH4-L1相同，但具有D-氨基酸)。B)用任一的与LAH4-L1或不同的LAH4-L1衍生物(12μg/ml)预孵育或不与其预孵育（空白）的GALVTR-LV(10E6TU/ml，MOI8)转导hCD34+细胞。转导效率表示为与LAH4-L1对照条件相比的百分比。C)将细胞DNA用7-AAD标记并转导2天之后，对死亡率进行评估。数据是两次平行进行的2个独立实验的平均值和SD。
图5.在LAH4-L1异构体存在时用GALVTR-LV转导人CD34+细胞。LAH4-L1异构体的L系列(A)和A系列(D)的肽序列的表格。B)和E)LAH4-L1异构体的两亲α-螺旋区(aa6到aa23)的Schiffer-Edmundson螺旋轮状表示。肽的名称和由亲水性组氨酸残基(下划线)所形成的极角标注于轮状投影内部。C)和F)与任一的12μg/ml的LAH4-L1或不同的L系列(C)或A系列(F)的LAH4-L1异构体预孵育的GALVTR-LV(10E6TU/ml，MOI8)转导hCD34+细胞。转导效率表示为转导5天后所获得的GFP+细胞的百分比。数据表示为一式两份进行的2个独立实验的平均值和SD。
图6.在用GALVTR-LV转导人CD34+细胞过程中，LAH4-L1、LAH4-A4和LAH4-A5的剂量-反应曲线。A)与各种浓度的LAH4-L1、LAH4-A4和LAH4-A5(3、6和12μg/ml)预孵育或不与其预孵育的GALVTR-LV(10E6TU/ml，MOI8)转导hCD34+细胞。转导效率表示为转导5天后所获得的GFP+细胞的含SD的百分比。B)如图4C所示，评估死亡率。
图7.在LAH4-A4组氨酸衍生物存在时，用GALVTR-LV转导人CD34+细胞。LAH4-A4、LAH2-A4、LAH2-A6和K2-L10A12-K2的肽序列的表格。B)LAH4-A4组氨酸衍生物的两亲α-螺旋区(aa6到aa23)的Schiffer-Edmundson螺旋轮状表示。肽的名称和由亲水性组氨酸残基(下划线)所形成的极角标注于轮状投影内部。C)与任一的LAH4-A4或不同的LAH4-A4组氨酸衍生物（12μg/ml）预孵育的GALVTR-LV(10E6TU/ml，MOI8)转导hCD34+细胞。转导效率表示为与LAH4-A4对照条件相比的百分比。D)如图4C所示，评估死亡率。数据是一式两份进行的2个独立实验的平均值和SD。
图8.在LAH4-A4赖氨酸衍生物存在时，用GALVTR-LV转导人CD34+细胞。A)LAH4-A4、LAH4-A4-dKN、LA4-A4-K1N、LAH4-A4-K3N和LAH4-A4-dKC的肽序列的表格。B)与任一的LAH4-A4或不同的LAH4-A4赖氨酸衍生物(12μg/ml)预孵育的GALVTR-LV(10E6TU/ml，MOI8)转导hCD34+细胞。转导效率表示为与LAH4-A4对照条件相比的百分比。C)如图4C所示，评估死亡率。数据是一式两份的2个独立实验的平均值和SD。
图9.在各种LAH4-A4衍生物存在时用GALVTR-LV转导人CD34+细胞。A)肽序列的表格。B)与任一的LAH4-A4或不同的LAH4-A4衍生物(12μg/ml)预孵育的GALVTR-LV(10E6TU/ml，MOI8)转导hCD34+细胞。转导效率表示为与LAH4-A4对照条件相比的百分比。C)如图4C所示，评估死亡率。数据是一式两份的2个独立实验的平均值和SD。
图10.在LAH4-A4或SEVI肽存在时用GALVTR-LV转导人CD34+细胞。A)与任一的LAH4-A4(12μg/ml，2,2μM)或SEVI肽(20μg/ml，2,2μM)预孵育的GALVTR-LV(10E6TU/ml，MOI8)转导hCD34+细胞。转导效率表示为转导5天后所获得的GFP+细胞的百分比。B)如图4C所示，评估死亡率。数据来自三个不同的一式两份的脐带血供体。横线表示分布的平均值。
图11.在LAH4-A4、LAH4-L1或K2-L10A12-K2肽存在时用pEGFP转染293T细胞。将pEGFP-C1(1μg)在50μl的150mM的NaCl溶液中与任一的3μg、4,5μg、6μg或9μg的LAH4-A4或6μg的LAH4-L1或6μg的K2-L10A12-K2相混合。之后，将DNA/肽混合物在不含FCS的200μl的DMEM中稀释，并装载到细胞单层上。转染3小时后，将培养基更换为含10％FCS的DMEM。48h后，通过使用流式细胞技术监测GFP的表达来评估转染效率。数据是一式两份的2次独立实验的平均值和SD。
图12.LAH4-A4对RD114TR-LV和GALV-MLV假型的效果。在不存在或存在12μg/ml的LAH4-L1、LAH4-L4ISO、LAH4-A4或LAH4-A5肽时，用任一的RD114TR-LV(3.8x10E6TU/ml)或莫罗尼逆转录病毒载体GALV-MLV(5x10E5TU/ml)的粗上清转导hCD34+细胞。转导效率表示为转导5天后所获得的GFP+细胞的百分比加SD。RD114TR-LV的数据获自一式两份的两个不同的脐带血供体，或GALV-MLV的数据来自一式一份（simplicate）的三个不同的脐带血供体。
实施例
材料与方法
肽和试剂
肽通过标准的Fmoc固相肽合成法生产，通过制备性RP HPLC进行纯化，并通过HPLC和MS(Genecust,Dudelange,Luxembourg)进行分析。除了LAH4-A4-dNH2和SEVI，所有的肽的C-末端都被酰胺化。7-氨基-放线菌素D(7-AAD)购自Sigma-Aldrich(St QuentinFallavier,法国)。Retronectin购自Takara Bio Inc.(St-Germain-en-laye,法国)。pEGFP-C1质粒购自Clontech(St-Germain-en-laye,法国)。抗体购自Miltenyi(Paris,法国)。
除了SEQ ID NO:1-27所示的肽，以下的肽也用于本研究:
LAH4-A4-P14:KKALLHAALAHLLPLAHHLLALLKKA(SEQ ID NO:28).
LAK4-L1:KKALLAKALKLLALLALKLAKALKKA(SEQ ID NO:29)
LAH8-L1:HHALLAHALHLLALLALHLAHALHHA(SEQ ID NO:30)
LAH4-L1-dK:ALLAHALHLLALLALHLAHALA(SEQ ID NO:31)
LAH4-L1-dKN:ALLAHALHLLALLALHLAHALKKA(SEQ ID NO:32)
LAH4-A4-dKN:ALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(SEQ ID NO:33)
LAH2-A4:KKALLAAALAALLALAHHLLALLKKA(SEQ ID NO:34)
SEVI:GIHKQKEKSRLQGGVLVNEILNHMKRATQIPSYKKLIMY(SEQ ID NO:35)
细胞系培养
来源于人结直肠癌的HCT116细胞(CCL-247,ATCC,Manassas,VA,USA)和293T细胞(Merten等人，2011)于37℃和5％CO2的条件下在补充有10％热灭活的胎牛血清(FCS)(Invitrogen/Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM+Glutamax,Invitrogen/Gibco,Cergy-Pontoise,法国)中进行培养。
制备病毒载体和载体滴度测定
HIV-1衍生的慢病毒载体(LV)通过用4种质粒瞬时磷酸钙转染293T细胞而产生：表达GFP的转运载体质粒(pCCLsin-cPPT-hPGK-eGFP-WPRE)(Follenzi等人，2000)；编码HIV-1Rev的质粒(pK.Rev)(Merten等人，2011)；编码HIV-1gagpol的质粒(pKLgagpol)(Merten等人，2011)；以及适当的包膜糖蛋白(GP)构建物：用pMDG(水泡性口炎病毒GP(Naldini等人，1996))产生VSV-G-LV；用pHCMV-RD114TR(修饰的猫内源性逆转录病毒GP(Sandrin等人，2002)）产生RD114TR-LV；用pBA-Ampho(双嗜性鼠白血病病毒GP)产生MLV-A-LV；用pBA_AcMNPV_gp64(杆状病毒GP)产生GP64-LV并用pBA-GALVampho-Kana(修饰的长臂猿白血病病毒GP(Sandrin等人，2002)产生GALVTR-LV。转染48h后收集病毒上清、过滤(0.45μ)、等分并储存于-80℃。如上所述(Kutner等人，2009)，通过流式细胞技术(FacsCalibur,BDBiosciences,San Jose,CA,美国)测定感染滴度。简言之，用一系列稀释的载体储液转染HCT116细胞，洗涤并在3天后，通过监测GFP的表达测定转导效率。对于hCD34+细胞的转导，最终滴度表示为每毫升的转导单位(TU/ml)并且定义了感染复数(MOI)。物理颗粒滴度通过使用商业化的ELISA试剂盒(PerkinElmer life science,Boston,MA,美国)测量HIV-1p24衣壳含量(ng/ml)来确定。
用GALV包膜糖蛋白假型化的MLV逆转录病毒载体的病毒上清获自生产细胞（producer cell）系PG13-MFG-GFP(Merten2004)。
细胞系转导
HCT116细胞(293T细胞用于GP64-LV的转导)铺于12孔板(105个细胞/孔)。次日，将不存在或存在不同浓度的LAH4-L1(3、6或12μg/ml)的LV在37℃下孵育15min。之后，LV装载到细胞单层上。转导6小时后，洗涤细胞并再培养2至3天。转导效率通过使用流式细胞技术监测GFP的表达来确定。
人CD34+细胞的来源、培养和转导
在符合法国国家生物伦理法的情况下，于法国埃夫里Louise Michel医院，从非复杂生产（uncomplicated birth）中获得的脐带血样本的单核细胞部分免疫磁珠筛选（Miltenyi Biotec,Paris,法国）获得脐带血祖CD34+细胞。首先，hCD34+细胞在补充有先前所述的细胞因子(charrier等人，2011)的X-vivo20培养基(Lonza,Levallois Perret,法国)中过夜预活化。然后，将预活化的hCD34+细胞接种于48孔板(2,5x104个细胞/孔，于100μl的预活化培养基中)。在不存在或存在肽的情况下，于37℃通过加入100μl的LV上清预先孵育LV上清15min完成转导。转导6小时后，将所有条件用分化培养基（differentiationmedium）(含有50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺(Gibco/Invitrogen)、SCF(25ng/ml)、Flt-3配体(50ng/ml)、IL-6(20ng/ml)和IL-3(10ng/ml)(R&D Systems,Lille,France)的X-Vivo20)稀释至1ml。转导2天后，半数细胞悬浮液替换为新鲜分化培养基。丢弃细胞的存活率在经7-AAD标记后通过流式细胞技术进行评估。转导5至6天后，转导效率通过用流式细胞技术检测细胞群中GFP表达的百分比进行评估。在存在Retronectin的情况下进行慢病毒转导方案的情况下，按先前所述(Jacome等人，2009)，我们使用动态预压方案将GALVTR-LV装载于Retronectin包被的板(20μg/cm2)上。
HIS(BALB-Rag/γC)小鼠的产生和监测
BALB/c rag2-/-γC-/-小鼠饲养于Genethon的无特定病原体的条件下，并根据动物伦理委员会的指导，遵照CE11003(批准日期03/01/2011–03/01/2012)协议进行处理。简言之，将转导或未转导的hCD34+细胞(105个细胞/小鼠)肝内（intra-hepatically）注射到经辐照的BALB/c rag2-/-γC-/-新生幼崽。注射11至13周之后，将HIS(BALB-Rag/γC)小鼠处死并用流式细胞技术监测血液、胸腺、脾脏和骨髓的人类造血细胞的有效植入水平。
用LAH4-L1衍生物转染细胞系
在转染前一天，将293T细胞(1,5x10E5/孔)接种于48孔板。为了转染，将1μg的pEGFP-C1与所需量的肽混合于50μl的150mM NaCl溶液中，涡旋并于室温孵育15min。之后，将DNA/肽混合物在200μl不含FCS的DMEM中稀释并装载到细胞单层上。转染3小时后，将培养基替换为含10％FCS的DMEM。48h后，用流式细胞技术通过监测GFP表达评估转染效率。
结果与讨论
LAH4-L1对用基因治疗中使用的原型LV转导的靶细胞的效果。
为了研究LAH4-L1对于LV感染性的效果，用GALVTR-LV、RD114TR-LV、MLV-A-LV以及VSV-G-LV转导HCT116细胞(或用GP64-LV转导293T细胞)(图1A)。如图1B所示，LAH4-L1在不同程度上促进了LV的感染性，观察到GALVTR-LV具有最好效果。有趣的是，病毒样颗粒(VLP)，其对应于在没有任何包膜糖蛋白构建物时生产的LV，不能转导靶细胞，即使在存在LAH4-L1的情况下也是如此(图1A)。这一结果表明，LAH4-L1对于LV的活性依赖于受体介导的进入细胞的途径的建立。
LAH4-L1对用GALVTR-LV转导人造血祖细胞的效果。
GALVTR-LV是基因治疗方法中常常选用的，设计来靶向人造血祖细胞(Jacome等人，2009)。因此，从脐带血(UCB)样品中获得人CD34+细胞并将其在不存在或存在各种浓度的LAH4-L1的情况下用GALVTR-LV进行转导。LAH4-L1促进转导hCD34+细胞所必需的最佳浓度定义为12μg/ml(图2A)，比在HCT116细胞中所观察到的略高(图1A)。在LAH4-L1低于32μg/ml时，我们并没有观察到任何细胞毒性作用(图2A)。此外，在LAH4-L1存在时，hCD34+细胞的转导随GALVTR-LV的输入而按比例增加并且从一个UCB供体到另一个UCB供体具有重现性(图2B)。
移植了GALVTR-LV-转导的-hCD34+细胞的HIS(BALB-rag/gC)小鼠的监测：LAH4-L1肽的安全性评估。
对新生的BALB/c rag2-/-γC-/-免疫缺陷小鼠注射hCD34+细胞重建了强烈的人体免疫系统。由此产生的动物称为“人类免疫系统”(HIS)(BALB-Rag/γC)小鼠(Legrand等人，2008)。该动物模型用于对与人类造血祖细胞相接触的化合物进行安全性评估。因此，我们决定在rag2-/-/γC-/-模型中对在LAH4-L1或Retronectin（对照）存在时用GALVTR-LV转导hCD34+细胞的人类造血干细胞移植的性质进行研究。如图3A所示，在rag2-/-/γC-/-鼠中注射12周后，在LAH4-L1或Retronectin存在时转导的人CD45+细胞很容易在血液、骨髓(BM)、脾和胸腺中被检测到。为了排除任何LAH4-L1对总的人类细胞群的细胞毒性或不利影响，对未转导(图3B-D-F)和也转导了(图3C-E-G)人类细胞的HIS(BALB-Rag/γC)鼠中的有效移植水平进行检测。如图3B和3C所示，如通过人TCRα/β表达、人双阳性CD4/CD8和单阳性CD4和CD8人T细胞的百分比所证明的，所有小鼠在胸腺中都表现出有活性的人胸腺生成（thymopoiesis）(图3B-C)。小鼠的脾和BM(图3D至3G)含有大群的人CD19+细胞，表明了活性的人B淋巴细胞的发育，以及人单核细胞和自然杀伤细胞的细胞群。也可以在BM中检测到人类造血祖细胞(hCD34+hCD45+细胞)(图3F-G)。总之，我们并没有在这些小鼠中观察到任何LAH4-L1对人类免疫系统重建的细胞毒性或有害作用。无论在转导或未转导的细胞中，我们都观察到了人体免疫系统的不同细胞亚群的正常发育，我们指出，LAH4-L1是安全且高效的培养添加剂。
LAH4-L1的结构-功能研究。
已合成LAH4-L1的衍生物以便更好地了解赖氨酸和组氨酸残基在LV感染性增强（potentialization）中的具体作用(图4A)。如图4B所示，将4个组氨酸残基替换为4个赖氨酸残基(LAK4-L1对改进用GALVTR-LV转导CD34+细胞是有害的但并没有产生强的细胞毒性作用(图4C)。在我们的中性pH培养条件下，LAH4-L1上的组氨酸残基未质子化，允许了LAH4-L1采用跨膜取向。当在LAK4-L1中时，在中性pH下，沿整个肽分布的赖氨酸残基被质子化，并自然阻止后者采用跨膜取向。此外，虽然在中性pH存在9个阳离子电荷，LAK4-L1仍是低效率的。这个结果强烈地表明，LAH4-L1通过并不仅仅受在病毒和细胞膜表面的相斥电荷的中和作用的抑制的分子机制起作用。
之后，我们把注意力集中于存在于LAH4-L1的两个最末端的2个赖氨酸残基。将4个赖氨酸残基替代为4个精氨酸残基(LAH4-L1-R)并没有不良影响。对于促进用GALVTR-LV转导hCD34+细胞而言，LAH4-L1-R与LAH4-L1的效率一样(图4B)，并没有明显的细胞毒性(图4C)。反之地，将4个赖氨酸残基替换为组氨酸残基(LAH8-L1)则是有害的。因此，在中性pH存在阳离子电荷(赖氨酸或精氨酸)似乎对增强LV感染性是必需的。为了确定哪个赖氨酸残基是关键的，任一地在N-端或C-端的最末端设计3个LAH4-L1衍生物(图4A)：LAH4-L1-dK(无赖氨酸)、LAH4-L1-dKN(缺失N-末端赖氨酸残基)以及LAH4-L1-dKC(缺失C末端赖氨酸残基)。如图4B所示，在LAH4-L1-dK和LAH4-L1-dKN存在时检测不到GALVTR-LV转导hCD34+细胞。在LAH4-L1的N-端的最末端缺失赖氨酸残基是有害的。相反地，对于促进hCD34+细胞转导而言，LAH4-L1-dKC与LAH4-L1的效率一样。
为了确定是否可以用D-氨基酸取代L-氨基酸，合成具有D-氨基酸的LAH4-L1肽(D-LAH4-L1)。如图4B所示，D-LAH4-L1仍可促进慢病毒的转导，但与LAH4-L1相比，其效率较低(43％)。
用Schiffer-Edmundson轮状表示法设计并检测由组氨酸残基包起的（subtended）在角度(60°至180°)之间的含有亮氨酸或丙氨酸残基的LAH4-L1异构体。
制备LAH4-L1异构体的肽系列(图5A和D)。这些LAH4-L1异构体的第一特征是当肽在中性pH采用α-螺旋构象时，由组氨酸残基包含的角度有差异(60至180°)(图5B和E)。第二特征是当肽采用α-螺旋构象时，位于两对相邻组氨酸残基之间的氨基酸残基的选择。这些残基任一地由对于L系列的亮氨酸残基(图5B)和对于A系列的丙氨酸残基(图5E)组成。因此，肽名字的命名反映了存在于用Schiffer-Edmundson轮状表示法中两对相邻组氨酸残基之间的丙氨酸或亮氨酸残基的数量。例如，称为LAH4-A4的肽是在两对相邻组氨酸残基之间含有4个丙氨酸残基而导致140°的亲水角度的肽(图5E)。已经测试了所有这些肽的促进用GALVTR-LV转导hCD34+细胞的能力。有趣的是，在L和A系列中，最有效的肽含有140°的亲水角度，即LAH4-L4和LAH4-A4。LAH4-A5，其具有160°的亲水角度，也具有较高效率。这些数据已在剂量反应曲线中证实了(图6A)。在3和6μg/ml时，LAH4-A4是LAH4-L1效率的约5倍且没有明显的细胞毒性(图6B)。
LAH4-A4的结构-功能研究。
为了研究组氨酸残基的作用，设计了3个LAH4-A4衍生物(图7A)：LAH2-A4，只含有2个组氨酸残基，在Schiffer-Edmundson轮状表示法中定义100°的亲水角度(图7B)；LAH2-A6，只含有2个组氨酸残基，定义具有140°的亲水角度(图7B)和K2-L10-A12-K2，其是在螺旋的每一端都具有赖氨酸残基的非极性螺旋肽。此肽与LAH4-A4相对应，其中所有组氨酸残基被丙氨酸残基替换(图7A)。如图6C所示，LAH2-A6在促进用GALVTR-LV转导hCD34+细胞时，其效率与LAH4-A4一样，且没有明显的细胞毒性(图7D)。相反地，LAH2-A4无功能。这种肽含有被在Edmundson轮状表示法中的2个组氨酸残基包含的非最优角度(100°)(图7B)。有趣的是，K2-L10A12-K2肽与LAH4-A4相比，促进17％的hCD34+转导水平。因此，组氨酸残基提高了LAH4-A4肽的效率，但对于促进慢病毒转导而言，不是严格必需的。
为了更好地定义赖氨酸残基的作用，任一地在LAH4-A4的N-端或C-端的最末端设计4个LAH4-A4衍生物(图8A)：LAH4-A4-dKN(缺失N-末端赖氨酸残基)、LAH4-A4-K1N(只缺失一个N-末端赖氨酸残基)、LAH4-A4-K3N(在位置3处用赖氨酸替换丙氨酸)以及LAH4-A4-dKC(缺失C-末端赖氨酸残基)。当LAH4-A4-dKN存在时，未检测到GALVTR-LV转导hCD34+细胞(图8B)。这种转导的缺失并不是强细胞毒性作用的结果(图8C)。在LAH4-A4-K1N的N-端最末端仅存在一个赖氨酸残基，与LAH4-A4相比，其足以恢复60％的hCD34+转导水平。此外，LAH4-A4的作用并不因在N-端最末端添加额外的赖氨酸而提高。实际上，LAH4-A4-K3N与LAH4-A4的效率一样(图8B)。
为了定义LAH4-A4中的最小活性序列，设计了短肽(图9A)。如图9B所示，缺失C末端丙氨酸(LAH4-A4-d1aa)轻微降低了LAH4-A4的效率。在肽的两侧各缺失1个氨基酸残基(LAH4-A4-d2aa)时，与LAH4-A4相比，降低效率至30％。最后，在C-末端侧缺失2个氨基酸残基(LAH4-A4-d2Caa)或3个氨基酸残基(LAH4-A4-d3aa)或5个氨基酸残基(LAH4-A4-d5aa)时，与LAH4-A4相比，降低效率至15％以下。总之，LAH4-A4肽长度的轻微缩短对促进慢病毒转导hCD34+细胞有害。
为了确定定义LAH4-A4的4个丙氨酸残基是否是仅有的4个对于LAH4-A4效力所必需的丙氨酸残基，将LAH4-A4中的所有其它丙氨酸残基(位置3、8、16和26)用亮氨酸残基替换(LAH4-A4-Leu)。这种肽仍然有活性，但是效力比LAH4-A4弱两倍(图9B)。
之后，为了确定LAH4衍生物的螺旋结构是否对于促进慢病毒转导是关键的，设计在螺旋的中间(位置14)含有脯氨酸的肽(LAH4-A4-P14)。如图9B所示，插入破坏螺旋的脯氨酸去除了80％的慢病毒转导，这表明LAH4-A4的螺旋结构在促进慢病毒转导中起关键作用。
由于所有测试的LAH4衍生物都是酰胺化的，合成了未酰胺化的LAH4-A4肽(LAH4-A4-dNH2)。如图9B所示，酰胺化LAH4-A4比未酰胺化的效率高约2倍。
2007年，从精液中分离了鉴定为HIV-1感染性的强增强子的人类前列腺酸性磷酸酶的片段(氨基酸残基240至290)(Munch等人，2007)。这种被称之为SEVI(人类精液病毒感染增强子)的肽能促进慢病毒载体的转导(Wurm等人，2010)。我们测试了SEVI和LAH4-A4对于促进用GALVTR-LV转导hCD34+细胞的能力。使用2,2μM的相同摩尔浓度的LAH4-A4或SEVI肽。如图10A所示，从3个不同的脐带血供体所获得的数据表明，存在LAH4-A4时的转导比存在SEVI时的转导更为有效，并在转导2天后没有明显的细胞毒性(图10B)。
先前已公开了LAH4衍生物作为DNA转染试剂(Kichler等人，2003)。因此，我们用表达GFP蛋白的质粒测试LAH4-A4转染293T细胞的能力。如图11所示，12μg/ml的LAH4-A4不足以有效地促进293T细胞的转染。然而，增加LAH4-A4浓度至24μg/ml则能2高效转染93T细胞，如在LAH4-L1对照肽中所观察到的。有趣的是，在同样的24μg/ml的浓度下，K2-L10A12-K2无法促进细胞转染。组氨酸残基的缺失对于这一活性有害，然而同时，与LAH4-A4相比，仅12μg/ml的K2-L10A12-K2仍然能够促进一些慢病毒转导(图7B)。
LAH4-L1、LAH4-L4ISO、LAH4-A4和LAH4-A5对用RD114TR-LV或GALV-MLV转导人造血祖细胞的作用。
因此，从脐带血(UCB)样品中获的人CD34+细胞，并在存在或不存在12μg/ml的LAH4-L1、LAH4-L4ISO、LAH4-A4或LAH4-A5的情况下，用携带有GFP报告基因的RD114TR-LV(3.8x10E6TU/ml)或GALVTR-MLV(5x10E5TU/ml)转导该细胞。我们没有观察到任何肽的细胞毒性作用，并且它们都促进了这2种病毒的侵入(图12)。LAH4-A4肽是最有效的。
用GALVTR-MLV病毒进行的实验证明，甚至用不同于HIV的病毒基因组时，转染也被提高。
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Figure IDA0000469211730000061
Figure IDA0000469211730000071
Figure IDA0000469211730000081
Figure IDA0000469211730000091
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Figure IDA0000469211730000111
Figure IDA0000469211730000121

Claims (22)

1.一种由SEQ ID NO:14所示序列组成的肽。
2.如权利要求1所述的肽用于促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的体外或离体的用途。
3.一种用病毒或病毒载体感染真核细胞的体外或离体的方法，其包括在存在如权利要求1所述的肽的情况下，将病毒或病毒载体与细胞相接触。
4.如权利要求3所述的方法，其中细胞为造血祖细胞/造血干细胞。
5.如权利要求3所述的方法，其中细胞为CD34+细胞。
6.如权利要求3所述的方法，其中细胞为人CD34+细胞。
7.一种增加病毒载体将核酸转运进靶细胞的效率的体外或离体的方法，其包括在存在如权利要求1所述的肽的情况下，将病毒载体与靶细胞相接触，以促进核酸转运进靶细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其中核酸选自基因、cDNA、siRNA、shRNA或反义寡核苷酸序列。
9.如权利要求7所述的方法，其中细胞为造血干细胞/造血祖细胞。
10.如权利要求7所述的方法，其中细胞为CD34+细胞。
11.如权利要求7所述的方法，其中细胞为人CD34+细胞。
12.如权利要求8所述的方法，其中细胞为造血干细胞/造血祖细胞。
13.如权利要求8所述的方法，其中细胞为CD34+细胞。
14.如权利要求8所述的方法，其中细胞为人CD34+细胞。
15.如权利要求1所述的肽在制备用于诊断受试者中病毒感染的药物中的用途。
16.如权利要求1所述的肽在制备用于在基因治疗中促进病毒或病毒载体对真核细胞的感染的药物中的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其用于制备用于在基因治疗中与病毒或病毒载体联合使用的药物。
18.如权利要求2所述的用途，其中病毒或病毒载体是包膜的病毒或病毒载体。
19.如权利要求3至6任一项所述的方法，其中病毒或病毒载体是包膜的病毒或病毒载体。
20.如权利要求7至14任一项所述的方法，其中病毒载体是包膜的病毒载体。
21.如权利要求15所述的用途，其中病毒是包膜的病毒。
22.如权利要求16或17所述的用途，其中病毒或病毒载体是包膜的病毒或病毒载体。
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