CN103361328A

CN103361328A - 介导整合的hiv-1前病毒基因敲除的锌指核酸内切酶及其制法和应用

Info

Publication number: CN103361328A
Application number: CN2012100910633A
Authority: CN
Inventors: 朱焕章; 曲喜英; 王鹏飞
Original assignee: Fudan University
Current assignee: SHANGHAI XINHAO BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2032-03-30
Also published as: CN103361328B

Abstract

本发明涉及介导整合的HIV-1前病毒基因敲除的锌指核酸内切酶及其制法和应用。本发明提供了一种在HIV病毒各亚型中高度保守的、可供锌指核酸内切酶特异性识别的靶序列。本发明还提供了特异性识别所述靶序列并专一性切割靶序列相应位点的一对锌指核酸内切酶。试验表明，本发明的锌指核酸酶可高效专一地清除整合于宿主基因组内的HIV-1前病毒，可用于HIV的基因治疗。

Description

介导整合的HIV-1前病毒基因敲除的锌指核酸内切酶及其制法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及介导整合的HIV-1前病毒基因敲除的锌指核酸内切酶及其制法和应用。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由HIV感染引起的一种严重危害人们生命健康的传染性疾病。据WHO统计，全球艾滋病患者己超过5000万，每年新增患者500万，而每年死于艾滋病的人数约为300万。

目前，艾滋病临床治疗方法主要是高效抗逆传录病毒疗法(Highly active antiretroviral therapy，HAART)，该疗法不仅控制HIV复制，并且能重建AIDS患者的免疫功能，为AIDS的治疗打开了希望之门。但该疗法仅能抑制病毒复制，不能彻底清除病毒，其原因在于HIV感染细胞后，即可整合在宿主靶细胞染色体上形成前病毒(provirus)，并能随染色体的复制而遗传，不仅为病毒转录提供稳定模板，也为其逃脱机体免疫系统及药物攻击提供了避风港。

如何靶向清除整合在宿主靶细胞染色体上的HIV前病毒是目前HIV/AIDS治疗研究领域最富有挑战性、亟待解决的重大科学问题。目前本领域还没有针对该问题的有效手段，因此，本领域迫切需要开发一种定向清除靶细胞染色体上的HIV前病毒的方法，从而从根本上解决HIV/AIDS的治疗问题。

发明内容

本发明的目的就是提供一种介导整合HIV-1前病毒基因敲除的锌指核酸内切酶及其制法和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种锌指核酸内切酶，所述的锌指核酸内切酶特异性地识别并切割整合于宿主染色体的HIV前病毒。

在另一优选例中，所述的宿主为人或非人哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述的锌指核酸内切酶为单体形式或二聚体形式，其中所述二聚体由二个锌指核酸内切酶单体所构成；较佳地所述的二聚体是异二聚体。

在另一优选例中，所述单体包括单体1和单体2，每个单体都具有识别元件和切割元件，并且所述单体1的识别元件识别HIV前病毒SEQ ID NO.：2所示的序列，所述单体2的识别元件识别HIV前病毒SEQ ID NO.：3所示的序列。

在另一优选例中，单体1的识别元件具有如SEQ ID NO.：10所示的氨基酸序列，和/或单体1的切割元件具有如SEQ ID NO.：6所示的氨基酸序列；和/或

单体2的识别元件具有如SEQ ID NO.：11所示的氨基酸序列，和/或单体2的切割元件具有如SEQ ID NO.：7所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述锌指核酸内切酶的单体还包括连接识别元件和切割元件的肽接头。

在另一优选例中，所述肽接头的长度为1-30个氨基酸残基，较佳地2-15个氨基酸残基，更佳地3-5个氨基酸残基。

在另一优选例中，所述的锌指核酸内切酶单体1和单体2是相同的或不同的。

在另一优选例中，在另一优选例中，所述的锌指核酸内切酶是异二聚体，所述的异二聚体能特异识别并切割整合于宿主基因组上的HIV前病毒的5′-LTR和3′-LTR序列。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的锌指核酸内切酶。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明的第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体还含有编码3Flag肽的核苷酸序列和/或编码核定位信号的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的载体为pUC表达质粒。

在另一优选例中，所述的载体具有如SEQ ID NO.：4或SEQ ID NO.：5所示的序列。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明的第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为真核细胞，较佳地，所述宿主细胞为：Jurkat细胞、CHO细胞、COS细胞、293T细胞、RSF细胞等，更佳地为HIV感染的Jurkat细胞(较佳地HIV-1感染的Jurkat细胞)、293T细胞、T淋巴细胞、单核细胞、巨嗜细胞、少突胶质细胞，造血干细胞，树突状细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明第一方面所述锌指核酸内切酶的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，从而表达出第一方面所述的锌指核酸内切酶；和分离所述锌指核酸内切酶。

在本发明的第六方面，提供了第一方面所述锌指核酸内切酶的用途，用于制备：(a)治疗艾滋病的药物，或(b)切割整合于宿主染色体的HIV前病毒的组合物。

在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有：(a)活性成分以及(b)药学上可接受的载体，所述活性成分(a)选自：(i)本发明第一方面所述的锌指核酸内切酶；或(ii)用于表达所述锌指核酸内切酶(i)的核苷酸或载体。

在本发明的第八方面，提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子为任选自下组的多核苷酸：

(1)序列如SEQ ID NO.：1所示的多核苷酸；

(2)序列如SEQ ID NO.：2所示的多核苷酸；

(3)序列如SEQ ID NO.：3所示的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的核酸分子来源于HIV病毒的5’LTR和/或3’LTR。

在本发明的第九方面，提供了本发明的第八方面所述核酸分子的用途，用于提供锌指核酸内切酶识别并切割的靶位点。

在本发明的第十方面，提供了一种体外非治疗性的、切割和清除整合于宿主细胞染色体内的HIV前病毒的方法，包括步骤：

将含有本发明第一方面所述的锌指核酸内切酶与宿主细胞接触，或将用于表达所述锌指核酸内切酶的核苷酸或载体导入宿主细胞，从而切割和清除整合于宿主细胞染色体内的HIV前病毒。

在本发明的第十一方面，提供了一种切割和清除整合于宿主的染色体内的HIV前病毒的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第七方面所述的药物组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了重组质粒pZFN1结构示意图。

图2显示了重组质粒pZFN2结构示意图。

图3显示了重组质粒pZFN1的全序列，735bp-803bp为编码3flag肽段的核苷酸序列；804bp-869bp为编码核定位信号的核苷酸序列；870bp-1364bp为编码锌指结构域的序列；1365bp-1376bp为接头；1377bp-1976bp为编码内切酶FokI的序列。

图4显示了重组质粒pZFN2的全序列，813bp-881bp为编码3flag肽段的核苷酸序列；882bp-947bp为编码核定位信号的核苷酸序列；948bp-1355bp为编码锌指结构域的序列；1356bp-1367bp为接头；1368bp-1961bp为编码内切酶FokI的序列。

图5显示一对ZFN(pZFN1和pZFN2)在HIV感染细胞介导前病毒基因切除的显微镜观察结果。

图6显示一对ZFN(pZFN1和pZFN2)在HIV感染细胞介导前病毒基因切除的PCR扩增结果。

图7显示一对ZFN(pZFN1和pZFN2)在HIV感染细胞介导前病毒基因切除的PCR产物序列分析结果，显示了有三种DNA切除后连接形式。

图8显示pZFN1和pZFN2在HIV-1慢病毒FUGW感染的293T细胞内介导HIV-1重组PCR产物序列分析结果示意图。

图9显示pZFN1和pZFN2在HIV-1慢病毒FUGW感染的293T细胞内介导重组前后gag基因的拷贝数。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的HIV病毒的序列筛选，获得了一种在HIV病毒中高度保守的、可供锌指核酸内切酶特异性识别的靶序列，本发明还提供了特异性识别所述靶序列并专一性切割靶序列相应位点的锌指核酸内切酶。试验表明，本发明的锌指核酸酶可高效专一地清除整合于宿主基因组内的HIV-1前病毒，可用于HIV的基因治疗。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“锌指核酸酶”、“锌指核酸内切酶”、“zinc finger nuclease”、“ZFN”、“锌指蛋白核酸酶”，可以互换使用，都是指一种人工改造的核酸内切酶。所述核酸内切酶为单体形式或二聚体形式，其中所述二聚体由二个锌指核酸内切酶单体所构成。较佳地，所述的锌指核酸内切酶包括单体1和单体2，每个单体都具有识别元件和切割元件。其中，DNA识别元件赋予锌指核酸酶的特异性，使锌指核酸酶在DNA特定位点结合，而非特异性核酸内切酶元件(切割元件)具有剪切功能，使得锌指核酸酶可在DNA特定位点进行定点断裂。当锌指结构识别并结合到其特异的靶标位点时，两个融合核酸酶结构域相互靠近，当两个互补的ZFN分子间相距适当的距离时(6～8bp)，对双链进行切割，形成双链断裂缺口(double strand break，DSB)。当细胞内源的非同源末端连接或者通过DNA同源重组对这一损伤进行修复时，目的基因的有效敲除就可以实现。

锌指核酸酶中DNA识别域(识别元件)是由一系列Cys2-His2锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白识别并结合3′到5′方向DNA链上一个特异的三联体碱基以及5′到3′方向的一个碱基。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI羧基端96个氨基酸残基组成的DNA剪切域，FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点。

本发明提供了一种特异性介导HIV-1病毒基因敲除的锌指核酸内切酶ZFN单体和二聚体，所述的锌指核酸内切酶单体能够专一性识别HIV-15’LTR和3’LTR中的保守序列：CCAGATCTGAGCCTGGGAgctctCTGGCTAACTAGGGA (SEQ ID NO.：1)。由于该序列在300多种HIV-1的亚型中的保守程度高达90％以上，因此本发明的锌指核酸内切酶对各种HIV-1均有良好的识别效果。

具体地，该保守序列与上述5’LTR和3’LTR位置关系如表1：

表1

本领域的普通技术人员可以使用通用的方法设计针对特定位点的锌指核酸内切酶。在获知了待切割的靶位点后，就能够获得一个或多个识别结构的氨基酸序列，如可以参考表2进行锌指蛋白的设计，例如，如果目的核苷酸位点为TTT，则与其识别的锌指蛋白须具有SPNGLII的氨基酸序列，如目的核苷酸位点为AGC，则与其识别的锌指蛋白须具有ERSHLRE的氨基酸序列。

由于核苷酸和氨基酸具有对应关系及密码子的简并性，由获得的氨基酸序列可以得到一个或多个核苷酸序列。

表2

注：上标为1的数据来源于参考文献1；上标为1的数据来源于参考文献2。

在本发明的一个优选例中，锌指核酸内切酶单体ZFN1识别元件的氨基酸序列为：

FQCRICMRNFSRSDHLSTHIRTHTGEKPFACDICGRKFADSSARKKHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDALSEHIRTHTGEKPFACDICGKKFATSSSRKKHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDNLSQHIRTHTGEKPFACDICGRKFAASNDRKKHTKIH(SEQ ID NO.：10)

ZFN2识别元件的氨基酸序列为：

FQCRICMRKFAQSGHLSRHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSRSDNLSTHIRTHTGEKPFACDICGRKFADRSNRKTHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSQSSDLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFARRDALLMHTKIH(SEQ ID NO.：11)

锌指核酸酶还包括切割结构域(切割元件)FokI，FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性。

ZFN1中典型的切割元件FokI的氨基酸序列为：

qlvkseleek kselrhklky vpheyielie iarnstqdri lemkvmeffm kvygyrgkhl 60

ggsrkpdgai ytvgspidyg vivdtkaysg gynlpigqad emeryveenq trdkhlnpne 120

wwkvypssvt efkflfvsgh fkgnykaqlt rlnhitncng avlsveelli ggemikagtl 180

tleevrrkfn ngeinfrs 198

SEQ ID NO.：6

ZFN2中典型的切割元件FokI的氨基酸序列为：

qlvkseleek kselrhklky vpheyielie iarnstqdri lemkvmeffm kvygyrgkhl 60

ggsrkpdgai ytvgspidyg vivdtkaysg gynlpigqad emqryvkenq trnkhinpne 120

wwkvypssvt efkflfvsgh fkgnykaqlt rlnrktncng avlsveelli ggemikagtl 180

tleevrrkfn ngeinf 196

SEQ ID NO.：7

切割结构域和识别结构域之间还可以具有连接序列(肽接头)，在本发明的一个优选例中，所述肽接头的长度为1-30个氨基酸残基，较佳地2-15个氨基酸残基，更佳地3-5个氨基酸残基。一个典型的肽接头的编码序列为：CTGCGGGGATCC。

根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的核酸序列。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。

作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，包含编码本发明的锌指核酸酶的序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。优选地，所述的表达调控序列可以是3flag肽，或用于定位的和定位信号(NLS)。

表达载体可采用市售的例如但不限于：pUC18、pIRES、pDR等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。

根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的锌指核酸酶编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。

本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的锌指核酸酶的编码序列。所述的宿主细胞可原核细胞和真核细胞，优选的是真核细胞，例如但不限于Jurkat细胞，CHO，COS细胞，293T细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是HIV(较佳地HIV-1)感染的Jurkat细胞或293T细胞，其可良好地表达本发明的锌指核酸酶，可获得结合活性良好，稳定性良好的锌指核酸酶。

本发明还提供一种用重组DNA制备本发明锌指核酸酶的方法，包括步骤：

1)提供编码本发明锌指核酸酶的核苷酸序列；

2)将1)的核苷酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；

3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；

4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；

5)收集上清液，并纯化锌指核酸酶产物。

将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法，腺病毒载体，腺相关病毒载体，慢病毒载体。

有关宿主细胞的培养和表达采用常规方法。当采用分泌表达时，可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。还可通过琼脂糖凝胶电泳等技术进行鉴定。

可将上述制备获得的锌指核酸酶纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当锌指核酸酶为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如采用Millipore、Pellicon等公司产品对表达上清进行浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均

可利用含有所述锌指核酸酶的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的锌指核酸酶进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述的锌指核酸酶的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His或8-His等。这些标签可用于对锌指核酸酶进行纯化。

药物组合物及施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-90wt％；较佳的0.1-50wt％；更佳的，5-40wt％)的本发明的锌指核酸内切酶单体或二聚体，以及药学上可接受的载体。

通常，可将本发明的锌指核酸内切酶单体或二聚体配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的锌指核酸内切酶单体或二聚体以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述的锌指核酸内切酶单体或二聚体的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：锌指核酸内切酶单体或二聚体的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的融合蛋白每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的锌指核酸酶对所有HIV亚型调控区LTR上的靶位点具有很高的特异性和专一性；

(2)本发明的锌指核酸酶可以高效地切除整合于宿主基因组内的各亚型HIV-1前病毒，能更广泛应用于HIV/AIDS临床治疗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

确定锌指核酸内切酶在HIV前病毒中的识别位点

由于HIV-1的易变性和复杂性，导致其很容易逃避免疫系统、药物和疫苗的攻击，所以锌指核酸内切酶识别位点的确定是关键步骤。在本实施例中，发明人仔细比对了344种HIV-1亚型，最终确定了以下序列作为识别位点序列：

CCAGATCTGAGCCTGGGAgctctCTGGCTAACTAGGGA(SEQ ID NO.：1)

该序列在HIV-15’LTR和3’LTR中非常保守，在344种HIV-1亚型中，该序列在HIV-15’LTR和3’LTR保守序列的保守程度高达93％以上。

实施例2

构建一对ZFN-LTR质粒(pZFN1质粒和pZFN2质粒)

在本实施例中，发明人制备了一对携带编码锌指核酸内切酶(ZFN1或者ZFN2)核苷酸序列的pUC质粒，即识别CCAGATCTGAGCCTGGGA(SEQ ID NO.：2)位点的pZFN1和识别CTGGCTAACTAGGGA(SEQ ID NO.：3)位点的pZFN2。

pZFN1和pZFN2质粒的制法如下：合成3flag-NLS-zinc finger-FokI段寡核苷酸序列，并于5’和3’端分别引入NcoI和AvaI酶切位点，寡核苷酸片段及pZFN骨架质粒分别经NcoI和AvaI双酶切后连接，转化受体菌，卡那霉素抗性(KanR)平板筛选单克隆，抽提质粒，酶切鉴定，进一步序列分析确认。

图1、图2为分别一对ZFN-LTR质粒pZFN1和pZFN2的结构示意图。

图3为重组质粒pZFN1的全序列，其中，735bp-803bp为编码3flag肽段的核苷酸序列；804bp-869bp为编码核定位信号的核苷酸序列；870bp-1364bp为编码锌指结构域的序列；1365bp-1376bp为编码连接肽(linker)的序列；1377bp-1976bp为编码内切酶ForkI的序列。

图4为重组质粒pZFN2的全序列，其中，813bp-881bp为编码3flag肽段的核苷酸序列；882bp-947bp为编码核定位信号的核苷酸序列；948bp-1355bp为编码锌指结构域的序列；1356bp-1367bp为编码连接肽(linker)的序列； 1368bp-1961bp为编码内切酶ForkI的序列。

实施例3

ZFN-LTR在HIV-1感染细胞内介导整合的HIV前病毒重组切除

HIV-1感染Jurkat细胞的构建制备：用携带EGFP报告基因的HIV-1假病毒pNL4-3-EGFP(pNL4-3-EGFP购自美国国立卫生院AIDS试剂分发中心)感染市售的常规的人T淋巴细胞Jurkat株，通过细胞分选获得表达GFP阳性和阴性细胞群。其中GFP阳性细胞群作为HIV感染的细胞模型用于后续实验。

携带EGFP报告基因的HIV感染细胞模型培养铺板，Nucleofector核转染或脂质体转染不同剂量的ZFN-LTR表达质粒，以转染ZFN空质粒或未转染的细胞作为阴性或空白对照，转染后2，3，4，5，6天分别收集细胞，流式细胞仪检测在ZFN导入HIV感染细胞模型后GFP阳性细胞比例，GFP阴性细胞作为ZFN切除HIV前病毒的细胞，计算细胞水平前病毒基因缺失的效率。同时，提取细胞基因组DNA。为了鉴定切除后重组，在LTR上ZFN靶位点的上下游或HIV整合位点基因组上下游分别设计引物，引物序列如下：

F-LTR：5’-GATCCTTGATCTGTGGATCTACCA-3’SEQ ID NO.：8；和

R-LTR：5’-ACACTGACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’SEQ ID NO.：9。

结果表明，在ZFN-LTR处理组中，通过共聚焦显微镜观察，许多感染细胞(简称为“IN感染细胞”)荧光消失(图5)。未做任何处理组(Mock)和转入ZFN empty vector的IN感染细胞都没有扩增出任何条带，而转入ZFN-LTR的IN细胞扩增出585bp左右的条带，说明ZFN-LTR在IN细胞内介导了重组(图6)。

为了确定这种荧光的消失确实是由于ZFN-LTR将HIV剪切后产生的，发明人将PCR产物进行测序，发现IN感染细胞内HIV基因确实发生了重组，而且有3种不同的重组方式(图7)。

结果说明，ZFN-LTR质粒转入细胞内，可以借助细胞的转录翻译系统表达出有活性的ZFN1和ZFN2蛋白，ZFN1和ZFN2蛋白单体识别结合位点形成二聚体(ZFN-LTR)后，与ZFN蛋白相连的FokI发挥内切酶活性，从而将整合在基因组内的HIV-1前病毒DNA剪切掉。

实施例4

ZFN-LTR在基于HIV-1慢病毒感染的293T细胞中介导内介导整合的HIV前病毒切除

为了确认实施例2制备的ZFN-LTR不止在一种HIV-1感染阳性细胞中发挥作用，本实施例采用基于HIV-1慢病毒感染的293T细胞作为HIV-1阳性细胞。

该感染的293T细胞的来源或制备方法：用携带EGFP报告基因的HIV-1假病毒(pNL4-3-EGFP)(pNL4-3-EGFP购于美国国立卫生院AIDS试剂分发中心)感染人293T细胞株，通过细胞分选获得表达GFP阳性和阴性细胞群，其中GFP阳性细胞群作为HIV感染的细胞模型。

将ZFN-LTR电转入HIV-1慢病毒感染的293T细胞内，3天后，抽提293T细胞的基因组DNA，根据设计的引物进行PCR扩增，将扩增产物连到T载体上，进行DNA测序分析。引物序列同实施例3。

结果发现HIV-1慢病毒感染293T细胞内HIV-1基因发生了重组(图8)。

通过real time PCR检测在ZFN-LTR转染后细胞内gag基因拷贝数的变化来确定ZFN-LTR的重组效率，从图9中可以看到，ZFN-LTR的重组效率可以达到43.75％。

实施例5

药物组合物的制备

利用本领域技术人员熟知的常规技术，混合以下组分，制得终浓度为1wt％锌指核酸内切酶二聚体溶液，其配方如下：

锌指核酸内切酶二聚体 10mg

生理盐水加至10ml

调节pH至6.8-7.1。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献：

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2.Wright DA，Thibodeau-Beganny S，Sander JD，Winfrey RJ，Hirsh AS，Eichtinger M，Fu FL，Porteus MH，Dobbs D，Voytas DF，Joung JK.Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly Nat Protoc，2006，1(3)：1637-1652。