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JP5976726B2 - 前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロｒｎａに基づく方法及び組成物 - Google Patents

前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロｒｎａに基づく方法及び組成物 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
[0001]本出願は、２００８年２月２８日出願の米国仮出願番号６１／０６７，５１８の権益を主張し、その全ての開示は参照により本明細書に明確に組み入れられる。
連邦政府委託の研究に関する宣言
[0002]本発明は、ＮＩＨのIntramural Research Program、National Cancer Institute、Center for Cancer Research及びNational Institutes of Health の助成金番号 CAO81534及びCA128609のもと、政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有す
る。
本発明の技術分野及び産業上の利用可能性
[0003]本発明は一般的には分子生物学の分野に関する。本発明のある側面は、前立腺関連障害の診断法、治療法及び予後診断法における応用を含む。
[0004]このセクションで開示された背景技術が合法的に先行技術を構成すると認められるものではない。
[0005]遺伝子マイクロアレイから導き出された発現プロファイルは、前立腺癌の生物学に新しい見識を提供する。前立腺腫瘍におけるｍＲＮＡ発現のパターンは、グリーソンスコア、浸潤性腫瘍サブタイプ及び疾患再発に関連付けられてきた（１；２）。加えて、原発性腫瘍から導き出されたｍＲＮＡ発現シグネチャーは、前立腺癌の早期発見のための新規候補診断マーカー、例えば、ａ−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼの発見を導いた（３）。これらの発見は、切除された腫瘍の遺伝子発現プロファイルが、前立腺癌のための新しい診断及び予後マーカーを同定する機会を与えることを示している。
[0006]最近、マイクロＲＮＡと名付けられた小さなＲＮＡの新規クラスが記述されており（４）、それは、ｍＲＮＡ安定性及びタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳の両方を変調することにより、ｍＲＮＡ機能を調節することが発見された（５；６）。マイクロＲＮＡ遺伝子は、多シストロン性配置に複数のマイクロＲＮＡをコードすることができる、ｐｒｉ−ｍＲＮＡと呼ばれる大きな前駆体ＲＮＡとして発現される（７）。これらの前駆体は、核リボヌクレアーゼＩＩＩ酵素、ドローシャ及びサイトゾルリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素、ダイサーにより１９〜２５ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡに変換される。これらの二つの酵素及びそれらの補助因子、例えば、ＤＧＣＲ８／Ｐａｓｈａ、ＴＲＢＰ、及びＥＩＦ２Ｃ２／アルゴノート−２は、マイクロＲＮＡプロセッシング活性の鍵となる成分である。それらの発現レベルの変化は、細胞機能を変化させることができ、そして細胞形質転換を誘発する（８）。
[0007]癌におけるマイクロＲＮＡの決定的な役割が示されてきた（９）。それらの発現は、一般に固形ヒト腫瘍において変えられている（１０−１３）。マイクロＲＮＡ発現プロファイルは、発生系列及び分化状態によっても腫瘍を分類する（１０；１４）。複数のマイクロＲＮＡが発癌特性を有していること（１５−１７）、又は腫瘍抑制遺伝子のように働くこと（１８；１９）が示されてきた。これらのマイクロＲＮＡはオンコｍｉＲ（oncomiR）と名付けられている（２０）。それらの発現における変化は、癌発生の原因とし
て関係がある。
Glinsky,G.V., Glinskii,A.B., Stephenson,A.J., Hoffrnan,R.M., and Gerald,W.L. 2004. Gene expression profiling predicts clinical outcome of prostate cancer. J Clin.Invest 113:913-923. Lapointe,J., Li,C., Higgins,J.P., Van De,R.M., Bair,E., Montgomery,K., Ferrari,M., Egevad,L., Rayford,'VW., Bergerheim,U, et al. 2004. Gene expression profiling identifies clinically relevant subtypes of prostate cancer. Prot Natl Acad Sc. U.S.A 101:811-816. Bradford,T.J., Tomlins,S.A., Wang,X., and Chinnaiyan,A.M. 2006. Molecular markers of prostate cancer. Urol. Oncol. 24:538-551. Barte1,D.P. 2004. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116:281-297. Lim,L.P., Lau,N.C., Garrett-Engele,P., Grimson,A., Schelter,J.M., Castle,J., Bartel,D.P., Linsley,P.S., and Johnson,J.M. 2005. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature 433:769-773. He,L. and Hannon,G.J. 2004. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat. Rev. Genet. .5:522-531. Yu,J., Wang,F., Yang,G.H., Wang,F.L., Ma,Y.N., Du,Z.W., and Zhang,J.W. 2006. Human microRNA clusters: genomic organization and expression profile in leukemia cell lines. Biochern Biophys.Res Commmn.. 349:59-68. Kumar,M.S., Lu,J., Mercer,K.L., Golub,T.R., and Jacks,T. 2007. Impaired microRNA processing enhances cellular transformation and tumorigenesis. Nat. Genet.. 39:673-677. Calin,G.A. and Croce,C.M. 2006. MicroRNA signatures in human cancers. Nat.Rev.Cancer 6:857-866. Volinia,S., Calin,G.A., Liu,C.G., Ambs,S., Cimmino,A., Petrocca,F., Visone,R., Iorio,M., Roldo,C., Ferracin,M. et al. 2006. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc.Natl.Acad Sci U.S .A 103:2257-2261. Michael,M.Z., O’Connor,S.M., Hoist Pellekaan,N.G., Young,G.P., and James,R.J. 2003. Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia. Mol. Cancer Res. 1:882-891. Iorio,M.V., Ferracin,M., Liu,C.G., Veronese,A., Spizzo,R., Sabbioni,S., Magri,E., Pedriali,M., Fabbri,M., Campiglio,M. et al. 2005. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res 65:7065-7070. Roldo,C., Missiaglia,E., Hagan,J.P., Falconi,M., Capelli,P., Bersani,S., Calin,G.A., Volinia,S., Liu,C.G., Scarpa,A. et al. 2006. MicroRNA expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors are associated with distinctive pathologic features and clinical behavior. J Clin Oncol. 24:4677-4684. Lu,J., Getz,G., Miska,E.A., Alvarez-Saavedra,E., Lamb,J., Peck,D., Sweet-Cordero,A., Ebert,B.L., Mal:,R.H., Ferrando,A.A. et al. 2005. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature 435:834-838. He,L., Thomson,J.M.,Hemann,M.T., Hernando-Monge,E., Mu,D., Goodson,S., Powers,S., Cordon-Cardo,C., Lowe,S.W., Hannon,G.J. et al. 2005. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature 435:828-833. Voorhoeve,P.M., le Sage,C., Schrier,M., Gillis,A.J., Stoop,H., Nagel,R., Liu,Y.P., van Duijse,J., Drost,J., Griekspoor,A. et al. 2006. A genetic screen implicates miRNA-372 and miRNA-373 as oncogenes in testicular germ cell tumors. Cell 124:1169-1181. Costinean,S., Zanesi,N., Pekarsly,Y., Tili,E., Volinia,S., Heerema,N., and Croce,C.M. 2006. Pre-B cell proliferation and lymphoblastic leukemia/high-grade lymphoma in E(mu)-miR155 transgenic mice. Proc Natl.Acad.,Sci U.S.A 103:7024-7029. Cimmino,A., Calin,G.A., Fabbri,M., Iorio,M.V., Ferracin,M., Shimizu,M., Wojcik,S.E., Ageilan,R.I., Zupo,S., Dono,M. et al. 2005. miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc.Natl.Acad.Sci U,S.A 102:13944-13949. Welch,C., Chen,Y., and Stallings,R.L. 2007. MicroRNA-34a functions as a potential tumor suppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells. Oncogene 26:5017-5022. Esquela-Kerscher,A. and Slack,F.J. 2006. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nat. Rev. Cancer 6:259-269.
[0008]これらの疾患を治療するための療法についてのかなりの研究にもかかわらず、現在でも効果的に診断する及び治療するのが困難であり、患者で観察された死亡率は、前立腺癌の診断、治療及び予防の改善が必要とされていることを示している。
要約
[0009]第一の広範な側面において、対象が前立腺関連障害を有する、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する、前立腺癌関連障害を有する対象の予後を決定する、及び／又は前立腺関連障害を有する対象において前立腺関連障害を治療する方法が本明細書に記載され、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較した、該試験サンプル中の該バイオマーカーのレベルの変化は、該対象が該障害を有するか、又は発症するリスクがあることを示す。
[00010]ある態様において、該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーの
レベルは、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも低い。
[00011] ある態様において、該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルは、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも高い。
[00012]ある態様において、腫瘍組織及び非腫瘍組織間で差次的に発現される該少なく
とも一つのバイオマーカーは、図１１−表２に列挙されたｍｉＲ又はそれらの機能的変異体の一つ又はそれ以上である。
[00013]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、前立腺腫瘍におい
て上方調節されている、図１１−表２に列挙された一つ以上のｍｉＲ：ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−２６ａ−ｌ／２、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−１９６ａ−１／２、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−１９４−１／２、ｍｉＲ−１８１ａ−ｌ／２、ｍｉＲ−３４ｂ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−４４９、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９２−１／２、ｍｉＲ−１２５ａ、又はそれらの機能的変異体から選択される。
[00014]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、前立腺腫瘍におい
て下方調節されている、図１１−表２に列挙された一つ以上のｍｉＲ：ｍｉＲ−５２０ｈ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９０、ｍｉＲ−１３３ａ−ｌ、ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−１２８ａ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−７−１／２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−４８７、ｌｅｔ−７ｂ、又はそれらの機能的変異体から選択される。
[00015]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、前立腺外の疾患に
関連し、図１２−表３に列挙されたｍｉＲ：ｍｉＲ−１０１−１／２、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−１９６ａ−ｌ／２、ｍｉＲ−３０ｃ−ｌ／２、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１９５、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−４１０及びｍｉＲ−４９１、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
[00016]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、前立腺腫瘍におい
てｍｉＲ−１及び標的遺伝子転写体レベル間で逆相関を示し、図１３Ａ−表４Ａに列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
[00017]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、図１３Ｂ−表４Ｂ
に列挙されたｍｉＲ：ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１２８ａ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−３６９、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４４８、ｍｉＲ−４９０、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−５２０ h、及びｌｅｔ−７ｉ、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
[00018]ある態様において、該方法は、前立腺腫瘍におけるｍｉＲ−１８１ａと負の相
関を示しているプローブセットを含み、該プローブセットは図１４−表５に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上を含む。
[00019]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、アンドロゲン応答
性バイオマーカーであり、図１５−表６に列挙されたｍｉＲ：ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉｒ−１８１ｂ−ｌクラスター、ｍｉＲ１８１ｃクラスター、ｍｉＲ−２１９−５ｐ及びｍｉＲ２２１クラスター、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
[00020]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、図１６−表７に列
挙されたｍｉＲ：ｍｉＲ−１２６ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１８１ｂ−ｌｍｉＲ−１８１ｂ−ｌｍｉＲ−１８１ｂ−ｌｍｉＲ−１８１ｂ−ｌｍｉＲ−１８１ｂ−ｌｍｉＲ−１８１ｃｍｉＲ−１８１ｃｍｉＲ−２１９−１ｍｉＲ−２１９−１ｍｉＲ−２１９−１ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−３３８、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
[00021]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、前立腺癌において
神経周囲の浸潤を伴った腫瘍中で上方調節されており、図２３−表９に列挙された、ｍｉＲ：ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０（ａ／ｂ）、ｍｉＲ−１２５ｂ（−１／２）、ｍｉＲ−３０ａ／ｂ／ｃ−２／ｄ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−２４（−１／２）、ｍｉＲ−１５ａ−２、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ／ｂ、ｍｉＲ−２６ａ（−１／２）、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１８１ａ−ｌ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１５１、ｌｅｔ−７ｇ又はそれらの機能的変異
体の一つ以上から選択される。
[00022]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、ＰＮＴ腫瘍組織及
び非ＰＮＴ腫瘍組織間で差次的に発現され、及び図２４−表１２に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上である。
[00023]ある態様において、方法は、前立腺腫瘍におけるＤｉｃｅｒ及びＤＧＣＲ８、
及び／又は高グリーソンスコアを有する腫瘍におけるＤｉｃｅｒ及びアルゴノート−２をコードするＥＩＦ２Ｃ２の一つ以上の増加した発現を含む。
[00024]ある態様において、該サンプルは血液サンプルを含む。
[00025]ある態様において、該サンプルは血清又は血漿血液サンプルの一つ以上を含む
。
[00026]別の側面において、腫瘍組織及び非腫瘍組織間で差次的に発現され、図１１−
表２に列挙されたｍｉＲ又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00027]別の側面において、前立腺腫瘍において上方調節されている、図１１−表２に
列挙された一つ以上のｍｉＲ：ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−２６ａ−１／２、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−１９６ａ−ｌ／２、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−１９４−１／２、ｍｉＲ−１８１ａ−ｌ／２、ｍｉＲ−３４ｂ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−４４９、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９２−１／２、ｍｉＲ−１２５ａ、又はそれらの機能的変異体から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00028]別の側面において、前立腺腫瘍において下方調節されている、図１１−表２に
列挙された一つ以上のｍｉＲ：ｍｉＲ−５２０ｈ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９０、ｍｉＲ−１３３ａ−ｌ、ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−１２８ａ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−７−１／２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−４８７、ｌｅｔ−７ｂ、又はそれらの機能的変異体から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00029]別の側面において、前立腺外疾患に関連し、そして図１２−表３に列挙された
ｍｉＲ：ｍｉＲ−１０１−１／２、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−１９６ａ−ｌ／２、ｍｉＲ−３０ｃ−ｌ／２、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１９５、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−４１０及びｍｉＲ−４９１、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00030]別の側面において、図１３Ａ−表４Ａに列挙された遺伝子又はそれらの機能的
変異体の一つ以上を含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00031]別の側面において、図１３Ｂ−表４Ｂに列挙されたｍｉＲ：ｍｉＲ−１、ｍｉ
Ｒ−３１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１２８ａ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−３６９、ｍｉＲ−４
０９−３ｐ、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４４８、ｍｉＲ−４９０、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−５２０ｈ、及びｌｅｔ−７ｉ、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択されるバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00032]別の側面において、前立腺腫瘍においてｍｉＲ−１８１ａと逆相関を示すプロ
ーブセットを含むバイオマーカーが本明細書に記載されており、該プローブセットは、図１４−表５に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上を含む。
[00033]別の側面において、アンドロゲン応答性バイオマーカーであり、そして図１５
−表６に列挙されたｍｉＲ：ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉｒ−１８１ｂ−ｌクラスター、ｍｉＲ１８１ｃクラスター、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、及びｍｉＲ２２１クラスター、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択された少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00034]別の側面において、図１６−表７に列挙されたｍｉＲ：ｍｉＲ−１２６、ｍｉ
Ｒ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１８１ｂ−ｌ、ｍｉＲ−１８１ｂ−ｌ、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１８１ｂ−ｌ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−３３８、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00035]別の側面において、図２３−表９に列挙された、前立腺癌で神経周囲の浸潤を
有する腫瘍において上方調節されているｍｉＲ：ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０（ａ／ｂ）、ｍｉＲ−１２５ｂ（−１／２）、ｍｉＲ−３０ａ／ｂ／ｃ−２／ｄ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−２４（−１／２）、ｍｉＲ−１５ａ−２、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ／ｂ、ｍｉＲ−２６ａ（−１／２）、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１８１ａ−ｌ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１５１、ｌｅｔ−７ｇ、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00036]別の側面において、ＰＮＴ腫瘍組織及び非ＰＮＴ腫瘍組織間で差次的に発現さ
れ、図２４−表１２に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00037]別の側面において、前立腺腫瘍におけるダイサー及びＤＧＣＲ８、及び／又は
高グリーソンスコアを有する腫瘍におけるダイサー及びアルゴノート−２をコードするＥＩＦ２Ｃ２；の一つ以上の増加した発現を含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00038]別の側面において、前立腺腫瘍における特有のマイクロＲＮＡ発現シグネチャ
ーが本明細書に記載され、腫瘍マイクロＲＮＡプロセッシングを調節する一つ以上のバイオマーカーの発現の変化を含む。
[00039]別の側面において、前立腺腫瘍における標的ｍＲＮＡの転写体存在量及び／又
はタンパク質発現に影響を及ぼす方法が本明細書に記載され、それを必要とする対象において一つ以上のマイクロＲＮＡを調節解除することを含む。
[00040]ある態様において、該方法はさらに、癌関連遺伝子のタンパク質発現を抑制す
ることを含む。
[00041] ある態様において、癌関連遺伝子のタンパク質発現を阻害するため、ｍｉＲ−３２及びｍｉＲ−１０６ｂの一つ以上の発現を変化させることをさらに含む。
[00042] 別の側面において、ヒト前立腺腫瘍で生じるマイクロＲＮＡ機能の変化を同定するための、マイクロＲＮＡ及びタンパク質コードＲＮＡの両方の大規模遺伝子発現プロファイリングの使用が、本明細書に記載される。
[00043]別の側面において、前立腺関連障害についての腫瘍遺伝子シグネチャーが本明
細書に記載され、これは、上方調節されたｍｉＲ−３２、続いてｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１９６ａ及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスター；の一つ以上；並びに／又は有意に下方制御されたｍｉＲ−５２０ｈ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９０及びｍｉＲ−ｌ−１３３ａクラスターの一つ以上；を含む。
[00044] 別の側面において、低誤差で前立腺外疾患進展に関連する腫瘍シグネチャーが本明細書に記載され、ｍｉＲ−１０１を含んでいる。
[00045]ある態様において、該バイオマーカーは、前立腺腫瘍で増加した、前立腺腫瘍
における宿主遺伝子発現を含む。
[00046]ある態様において、該バイオマーカーは、上方調節されたＣ９ｏｒｆ５及びＭ
ＣＭ７の一つ以上を含み、そしてその発現は、イントロン性マイクロＲＮＡ、それぞれｍｉＲ−３２及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの発現と相関している。
[00047]別の側面において、前立腺癌細胞中のＥ２Ｆ１及び／又はＣＤＫＮ１Ａ遺伝子
を標的とするｍｉＲ−１０６ｂの使用、及び／又はＥ２Ｆ１及び／又はＣＤＫＮ１Ａ遺伝子のタンパク質発現を抑制することにおける使用が、本明細書に記載される。
[00048]別の側面において、前立腺癌細胞中のｍｉＲ−１の発現を変化させることによ
り、ＸＰ０６及びＰＴＫ９の一つ以上の調節が、本明細書に記載される。
[00049]別の側面において、哺乳類細胞中の標的とされたｍＲＮＡの分解及び／又は蓄
積を導く、３’ＵＴＲ配列へのマイクロＲＮＡの結合の使用が、本明細書に記載される。
[00050]別の側面において、マイクロＲＮＡ標的遺伝子を予測する、ヒト組織における
マイクロＲＮＡとｍＲＮＡ間の逆及び／又は正の相関の使用が、本明細書に記載される。
[00051]別の側面において、マイクロＲＮＡによって調節されているｍＲＮＡを同定す
る方法が本明細書に記載され、ヒト組織中のマイクロＲＮＡ及びｍＲＮＡ発現の相関分析を行うことを含む。
[00052]別の側面において、ｍｉＲ発現アンチセンス阻害剤が本明細書に記載され、ｍ
ｉＲ−３２及びｍｉＲ−１０６ｂの一つ以上を含む。
[00053]別の側面において、前立腺障害又は疾患のオンコｍｉＲバイオマーカーが本明
細書に記載され、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−３２、及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの一つ以上を含む。
[00054]別の側面において、前立腺癌細胞中のｍｉＲ−１、ｍｉＲ−３２、及びｍｉＲ
−１０６ｂ−２５クラスターの一つ以上の発現を変調することを含む、前立腺癌細胞中のタンパク質発現を調節するための方法が本明細書に提供される。
[00055]別の側面において、前立腺癌細胞中のエクスポーチン−６及びＰＴＫ９の一つ
以上の発現を阻止するための組成物が本明細書に記載され、該組成物は、ｍｉＲ−１又は
それらの機能的変異体を含む。
[00056]別の側面において、Ｅ２Ｆ１及びｐ２１／ＷＡＦｌタンパク質レベルの一つ以
上を調節することを、それを必要とする対象において行う方法が本明細書に記載され、ｍｉＲ−１０６ｂ又はそれらの機能的変異体を使用することを含む。
[00057]別の側面において、前立腺癌細胞におけるｐ２１／ＷＡＦｌ及び／又はＥ２Ｆ
１タンパク質レベルを、それを必要とする対象において増加させるために有用なアンチセンスｍｉＲ−１０６ｂを含む組成物が、本明細書に記載される。
[00058]ある態様において、該方法は前立腺癌を有する対象の予後を決定することを含
み、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含んでおり、ここで：ｉ）該バイオマーカーは、前立腺癌の予後不良に関連し；そしてｉｉ）対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較して、前立腺試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの変化は、予後不良を示す。
[00059]ある態様において、該方法は対象が前立腺癌を有するか、又は発症するリスク
があるかどうかを診断する方法を提供し、（１）対象から得られた試験サンプルからのＲＮＡを逆転写して、標的オリゴデオキシヌクレオチドの組を提供し；（２）該標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて該試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；及び、（３）該試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルと対照サンプルから生成されたハイブリダイゼーションプロファイルを比較することを含み、少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化は、該対象が前立腺癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す。
[00060]ある態様において、該少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルは、対照サンプ
ルから生成されたシグナルと比較して下方調節されており、及び／又は該少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルは、対照サンプルから発生させたシグナルと比較して上方調節されている。
[00061]ある態様において、表２、表３、表４Ａ、表４Ｂ、表５、表６、表７、表９又
は表１０に列挙された群より選択される少なくとも一つのバイオマーカーのシグナルの変化は、該対象が予後不良の前立腺癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す。
[00062]別の側面において、対照細胞と比較して、少なくとも一つのバイオマーカーが
対象の癌細胞で下方調節又は上方調節されている前立腺癌を有する対象において、前立腺癌を治療する方法が本明細書に記載され、（１）該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが下方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも一つの単離されたバイオマーカー、又は単離された変異体又はそれらの生物学的に活性な断片の有効量を該対象に投与すること；又は（２）該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが上方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することを含む。
[00063]別の側面において、対象の前立腺癌を治療する方法が本明細書に記載され：（
１）対照細胞と比較して、前立腺癌細胞中の少なくとも一つのバイオマーカーの量を決定すること；そして（２）（ｉ）もし、該癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも少ないならば、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーの有効量を該対象に投与することにより；又は（ｉｉ）もし、該癌細
胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも多いならば、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することにより、前立腺癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量を変化させること；を含む。
[00064]別の側面において、少なくとも一つの単離されたバイオマーカー及び薬学的に
許容できる担体を含む、前立腺癌を治療するための医薬組成物が本明細書に記載される。
[00065]ある態様において、該医薬組成物は、対照細胞と比較して前立腺癌細胞中で下
方調節されているバイオマーカーに対応する、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーをその中に含む。
[00066]ある態様において、該医薬組成物は少なくとも一つのｍｉＲ発現阻害化合物及
び薬学的に許容できる担体を含む。
[00067]別の側面において、抗前立腺癌剤を同定する方法が本明細書に記載され、細胞
に試験剤を与えること、そして前立腺癌細胞中の減少した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの増加は、該試験剤が抗前立腺癌剤であることを示す。
[00068]別の側面において、抗前立腺癌剤を同定する方法が本明細書に記載され、細胞
に試験剤を与えること、そして前立腺癌細胞中の増加した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの減少は、該試験剤が抗前立腺癌剤であることを示す。
[00069]別の側面において、前立腺癌関連疾患を予防する、診断する及び／又は治療す
るための療法の有効性を評価する方法が本明細書に記載され：ｉ）その有効性が評価されている療法を動物に供すること；そしてｉｉ）表２、表３、表４Ａ、表４Ｂ、表５、表６、表７、表９又は表１０の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを評価することにより、該疾患を治療する又は予防することについて試験されている治療の有効性のレベルを決定すること；を含む。
[00070]ある態様において、該候補療法剤は、医薬組成物、栄養補助食品組成物及びホ
メオパシー組成物の一つ以上を含む。
[00071]ある態様において、評価されている療法は、ヒト対象での使用のためである。
[00072]別の側面において、製品が本明細書に記載され：表２、表３、表４Ａ、表４Ｂ
、表５、表６、表７、表９又は表１０の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前立腺癌関連疾患のためのマーカーに結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む。
[00073]別の側面において、前立腺癌関連疾患を治療する療法剤の候補化合物をスクリ
ーニングするためのキットが本明細書に記載され、該キットは：表２、表３、表４Ａ、表４Ｂ、表５、表６、表７、表９又は表１０の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーの一つ以上の試薬、及び少なくとも一つのバイオマーカーを発現している細胞を含む。
[00074]ある態様において、該バイオマーカーの存在は、少なくとも一つのバイオマー
カーと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される。
[00075]別の側面において、個体における該疾患合併症を治療する、予防する、逆行さ
せる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、前立腺癌関連疾患応答シグナル伝達経路を妨害する剤の使用が本明細書に記載され、該剤は、表２、表３、表４Ａ、表４Ｂ、表５、表６、表７、表９又は表１０の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。
[00076]別の側面において、前立腺癌関連疾患合併症を治療する、予防する、逆行させ
る、又は重症度を限定することを、それを必要とする個体で行う方法が本明細書において記載され：少なくとも前立腺癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤を該個体に投与することを含んでおり、該剤は、表２、表３、表４Ａ、表４Ｂ、表５、表６、表７、表９又は表１０の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。
[00077]別の側面において、個体の前立腺癌関連疾患合併症を治療する、予防する、逆
行させる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、少なくとも前立腺癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤の使用が、本明細書に記載され、該剤は、表２、表３、表４Ａ、表４Ｂ、表５、表６、表７、表９又は表１０の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。
[00078]別の側面において、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−３２及びｍｉＲ−１０６ｂの一つ以
上のアンチセンス阻害剤を含む組成物が、本明細書に記載される。
[00079]別の側面において、前立腺障害を治療することを、それを必要とする対象にお
いて行う方法が本明細書に記載され、該組成物の療法的に有効量を対象に投与することを含む。
[00080]ある態様において、該組成物は予防的に投与される。
[00081]ある態様において、該組成物の投与は、障害の一つ以上の症状の発症を遅延さ
せる。
[00082]ある態様において、該ペプチドの投与は、前立腺癌の発生を抑制する。
[00083]ある態様において、該組成物の投与は、腫瘍の増殖を抑制する。
[00084]ある態様において、該ペプチドの投与は、感染を抑制する。
[00085]別の側面において、生物学的サンプル中の前立腺癌の存在を検出する方法が本
明細書に記載され：該方法は：ａ）前立腺癌を含有すると疑われる生物学的サンプルを、それらのためのマーカーに暴露すること；そしてｂ）もしあれば、該サンプル中の該マーカーの存在又は不存在を検出すること；を含む。
[00086]ある態様において、該マーカーは検出可能な標識を含む。
[00087]ある態様において、該方法は、該対象からの生物学的サンプル中の該マーカー
の量と、正常対象からの対応する生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較することをさらに含む。
[00088]ある態様において、該方法は、異なる時点で対象から複数の生物学的サンプル
を集めること、及び各生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較して、時間とともに該対象において該マーカーの量が増加している又は減少しているかどうかを決定することをさらに含む。
[00089]別の側面において、対象の前立腺癌を治療する方法が本明細書に記載され、該
方法は：前立腺レセプターアゴニストの療法的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでいる。
[00090]ある態様において、該レセプターアゴニストは、ｍｉＲ−ｌ、ｍｉＲ−２１及
びｍｉＲ−１０６ｂの一つ以上のアンチセンス阻害剤である。
[00091]別の側面において、前立腺癌の治療のための薬剤を製造するため、表２、表３
、表４Ａ、表４Ｂ、表５、表６、表７、表９又は表１０に示したｍｉＲ、それらから派生する配列、こうしたｍｉＲの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の内から選択される核酸分子を含む使用が、本明細書に記載される。
[00092]ある態様において、該使用は、該薬剤が、表２に列挙されたｍｉＲ、こうした
ｍｉＲから派生する配列、こうしたｍｉＲの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の中から選択される配列を示す核酸分子を含むことを含む。
[00093]別の側面において、前立腺癌細胞の分化を誘発するために有効な療法剤又は療
法剤の組み合わせを同定するためのインビトロの方法が本明細書に記載され、該方法は：ｉ）前立腺腫瘍に由来する細胞を培養すること、ｉｉ）該細胞株の培養培地に少なくとも一つの化合物を添加すること、ｉｉｉ）段階（ｉ）及び（ｉｉ）間の少なくとも一つのｍｉＲの発現レベルの進展を分析すること、及びｉｖ）段階（ｉ）及び（ｉｉ）間のｍｉＲの発現レベルの変化を誘発する化合物又は化合物の組み合わせを同定する；段階を含む。
[00094]ある態様において、段階（ｉｉｉ）は、少なくとも一つのｍｉＲの発現レベル
の分析を含む。
[00095]ある態様において、段階（ｉｖ）は、少なくとも一つのｍｉＲの発現レベルを
変調する化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む。
[00096]ある態様において、段階（ｉｖ）は、少なくとも一つのｍｉＲの発現レベルを
減少させる化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む。
[00097]ある態様において、該化合物は癌の治療のための療法剤である。
[00098]別の側面において、対象からの前立腺組織を分類する方法が本明細書に記載さ
れ：ａ）試験細胞集団中の表２、表３、表４Ａ、表４Ｂ、表５、表６、表７、表９又は表１０に列挙された群より選択される一つ以上の核酸配列の発現を測定すること、ここで、前記試験細胞集団中の少なくとも一つの細胞は、表２、表３、表４Ａ、表４Ｂ、表５、表６、表７、表９又は表１０に列挙された群より選択される一つ以上の核酸配列を発現することができる；ｂ）該核酸配列（単数又は複数）の発現と、前立腺癌分類が既知である少なくとも一つの細胞を含む参照細胞集団中の核酸配列（単数又は複数）の発現を比較すること；及びｃ）存在するならば、該試験細胞集団及び参照細胞集団中から成る群より選択される一つ以上の核酸配列の発現レベルの相違を同定し、それにより該対象の前立腺癌を分類すること；を含む。
[00099]ある態様において、相違する該参照細胞集団と比較して該試験細胞集団におけ
る核酸（単数又は複数）の発現、該試験細胞集団が該参照細胞集団からの細胞とは異なった分類を有することを示す。
[000100]ある態様において、類似する該参照細胞集団と比較して該試験細胞集団における核酸（単数又は複数）の発現パターンは、該試験細胞集団が該参照細胞集団からの細胞と同一の分類を有することを示す。
[000101]ある態様において、該参照細胞集団は、多数の細胞又はデータベースである。
[000102]ある態様において、該参照細胞集団は：正常前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団、良性前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団、及び悪性前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団；から成る群より選
択される。
[000103]本発明の種々の目的及び利点は、付随する図面を照らし合わせて読むことにより、好ましい態様の以下の詳細な説明から、当業者には明らかになるであろう。
[000104]本特許又は出願ファイルは一枚以上のカラーで仕上げられた図及び／又は一つ以上の写真を含む。カラーの図及び／又は写真を含むこの特許又は特許出願印刷物のコピーは、依頼及び必要な料金の支払い後、本特許事務所により提供されるであろう。
[000105]図１Ａ−１Ｂ：前立腺組織におけるマイクロＲＮＡ転写体存在量とそれらの各標的ｍＲＮＡとの関連性の分析。示されているのは、ｍＲＮＡとｍｉＲ−１０６ｂ（図１Ａ）及びｍＲＮＡとｍｉＲ−１８１ａ（図１Ｂ）間のピアソン相関係数の全体的分布である。黒い線で引いた曲線は、全てのｍＲＮＡについての相関係数の分布を示す。赤い線で引いた曲線は、ｍｉＲ−１０６ｂ又はｍｉＲ−１８１ａのいずれかの予測標的であるｍＲＮＡのみについての相関係数の分布を示す。赤い線で引いた曲線は、追加の肩（矢印）を有しているので、標的ｍＲＮＡの富化を示し、その転写体レベルはマイクロＲＮＡの転写体レベルと負に相関している。 図１Ａ−１Ｂ：前立腺組織におけるマイクロＲＮＡ転写体存在量とそれらの各標的ｍＲＮＡとの関連性の分析。示されているのは、ｍＲＮＡとｍｉＲ−１０６ｂ（図１Ａ）及びｍＲＮＡとｍｉＲ−１８１ａ（図１Ｂ）間のピアソン相関係数の全体的分布である。黒い線で引いた曲線は、全てのｍＲＮＡについての相関係数の分布を示す。赤い線で引いた曲線は、ｍｉＲ−１０６ｂ又はｍｉＲ−１８１ａのいずれかの予測標的であるｍＲＮＡのみについての相関係数の分布を示す。赤い線で引いた曲線は、追加の肩（矢印）を有しているので、標的ｍＲＮＡの富化を示し、その転写体レベルはマイクロＲＮＡの転写体レベルと負に相関している。 [000106]図２Ａ−２Ｂ：ｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１０６ｂによるタンパク質発現の抑制。ＬＮＣａＰ及びＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞を、マイクロＲＮＡ前駆体（ｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１０６ｂ）又はアンチセンスマイクロＲＮＡ（アンチセンスｍｉＲ−１及びアンチセンスｍｉＲ−１０６ｂ）又はそれらの各ベクター対照、スクランブル前駆体マイクロＲＮＡ（スクランブルＰ）及びスクランブルアンチセンスマイクロＲＮＡ（スクランブルＡ）のいずれかでトランスフェクトした。タンパク質抽出物をトランスフェクション４８時間後に調製し、タンパク質発現をウエスタンブロット分析により試験した。添加：レーン当たり５０μｇタンパク質。 図２Ａ−２Ｂ：ｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１０６ｂによるタンパク質発現の抑制。ＬＮＣａＰ及びＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞を、マイクロＲＮＡ前駆体（ｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１０６ｂ）又はアンチセンスマイクロＲＮＡ（アンチセンスｍｉＲ−１及びアンチセンスｍｉＲ−１０６ｂ）又はそれらの各ベクター対照、スクランブル前駆体マイクロＲＮＡ（スクランブルＰ）及びスクランブルアンチセンスマイクロＲＮＡ（スクランブルＡ）のいずれかでトランスフェクトした。タンパク質抽出物をトランスフェクション４８時間後に調製し、タンパク質発現をウエスタンブロット分析により試験した。添加：レーン当たり５０μｇタンパク質。 [000107]図３Ａ−３Ｂ：ｍｉＲ−１０６ｂは３’ＵＴＲ仲介機構によりＥ２Ｆ１タンパク質発現を抑制する。[000108]図３Ａ：ＬＮＣａＰ及びＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞を、マイクロＲＮＡ前駆体（ｍｉＲ−１０６ｂ）又はアンチセンスマイクロＲＮＡ（アンチセンスｍｉＲ−１０６ｂ）、又はそれらの各ベクター対照、スクランブル前駆体マイクロＲＮＡ（スクランブルＰ）及びスクランブルアンチセンスマイクロＲＮＡ（スクランブルＡ）のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後にタンパク質抽出物を調製し、タンパク質発現を、ウエスタンブロット分析により試験した。相対的強度値を得るため、Ｅ２Ｆ１発現をβアクチンに規格化した。 図３Ａ−３Ｂ：ｍｉＲ−１０６ｂは３’ＵＴＲ仲介機構によりＥ２Ｆ１タンパク質発現を抑制する。[000109]図３Ｂ：Ｅ２Ｆ１遺伝子内のｍｉＲ−１０６ｂの野生型又は変異３’ＵＴＲ標的配列を含有するｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーター構築物を、前駆体マイクロＲＮＡ陰性対照又はｍｉＲ−１０６ｂ前駆体（各ｎ＝３）のいずれかとＬＮＣａＰ細胞内に共トランスフェクトした。比較のため、３’ＵＴＲを含有していないｐＧＬ３対照ベクターでも細胞をトランスフェクトした。２４時間後、細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性を決定した。野生型Ｅ２Ｆ１ ３’ＵＴＲの存在下、前駆体ｍｉＲ−１０６ｂでのトランスフェクションは、ベクター対照と比較した場合、ルシフェラーゼレポーターの有意な抑制を導いた（Ｐ＝０．０４５、両側t検定）。 [000110]図３Ｃ−３Ｄ：ｍｉＲ−３２は、３’ＵＴＲ仲介機構によりＢｉｍタンパク質発現を抑制する。[000111]図３Ｃ：ＬＮＣａＰ及びＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞を、マイクロＲＮＡ前駆体（ｍｉＲ−３２）又はアンチセンスマイクロＲＮＡ（アンチセンスｍｉＲ−３２）、又はそれらの各ベクター対照、スクランブル前駆体マイクロＲＮＡ（スクランブルＰ）及びスクランブルアンチセンスマイクロＲＮＡ（スクランブルＡ）のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後にタンパク質抽出物を調製し、タンパク質発現をウエスタンブロット分析により試験した。相対的強度値を得るため、Ｂｉｍ発現をβアクチンで規格化した。 図３Ｃ−３Ｄ：ｍｉＲ−３２は、３’ＵＴＲ仲介機構によりＢｉｍタンパク質発現を抑制する。[000112]図３Ｄ：ＢＣＬ２Ｌ１１（Ｂｉｍ）遺伝子内のｍｉＲ−３２の野生型又は変異３’ＵＴＲ標的配列を含有するｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーター構築物を、前駆体マイクロＲＮＡ陰性対照又はｍｉＲ−３２前駆体のいずれかとＬＮＣａＰ細胞内に共トランスフェクトした（各ｎ＝３）。比較のため、３’ＵＴＲを含有していないｐＧＬ３対照ベクターでも細胞をトランスフェクトした。２４時間後、細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性を決定した。野生型ＢＣＬ２Ｌ１１ ３’ＵＴＲの存在下、ｍｉＲ−３２でのトランスフェクションは、ベクター対照と比較した場合、ルシフェラーゼレポーターの有意な抑制を導いた（Ｐ＝０．００３、両側t検定）。この抑制は、もしレポーター構築物がｍｉＲの変異３’ＵＴＲ標的配列を含んでいたならば減弱した。 [000113]図４Ａ−４Ｂ：ＤＩＣＥＲ（図４Ａ）及びＤＧＣＲ８（図４Ｂ）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析。 図４Ａ−４Ｂ：ＤＩＣＥＲ（図４Ａ）及びＤＧＣＲ８（図４Ｂ）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析。 [000114]図５Ａ−５Ｄ：前立腺癌患者からの非腫瘍前立腺組織（正常）及び腫瘍（腫瘍）における、ｍｉＲ−３２（図５Ａ）、ｍｉＲ−１０６ｂ（図１Ｂ）、ｍｉＲ−１０６ａ（図５Ｃ）及びｍｉＲ−１（図５Ｄ）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析。プロットされているのは、個々のサンプルについての相対的マイクロＲＮＡ発現値、及びサンプルセットについての中央値である。ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−１０６ａは、非腫瘍組織中よりも腫瘍中で有意により高く発現された：ｍｉＲ−３２についてはＰ＝０．０３７（両側t検定）；ｍｉＲ−１０６ｂについてはＰ＝０．００９（両側t検定）；ｍｉＲ−１０６ａについてはＰ＝０．０１５（両側t検定）。 図５Ａ−５Ｄ：前立腺癌患者からの非腫瘍前立腺組織（正常）及び腫瘍（腫瘍）における、ｍｉＲ−３２（図５Ａ）、ｍｉＲ−１０６ｂ（図１Ｂ）、ｍｉＲ−１０６ａ（図５Ｃ）及びｍｉＲ−１（図５Ｄ）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析。プロットされているのは、個々のサンプルについての相対的マイクロＲＮＡ発現値、及びサンプルセットについての中央値である。ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−１０６ａは、非腫瘍組織中よりも腫瘍中で有意により高く発現された：ｍｉＲ−３２についてはＰ＝０．０３７（両側t検定）；ｍｉＲ−１０６ｂについてはＰ＝０．００９（両側t検定）；ｍｉＲ−１０６ａについてはＰ＝０．０１５（両側t検定）。 図５Ａ−５Ｄ：前立腺癌患者からの非腫瘍前立腺組織（正常）及び腫瘍（腫瘍）における、ｍｉＲ−３２（図５Ａ）、ｍｉＲ−１０６ｂ（図１Ｂ）、ｍｉＲ−１０６ａ（図５Ｃ）及びｍｉＲ−１（図５Ｄ）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析。プロットされているのは、個々のサンプルについての相対的マイクロＲＮＡ発現値、及びサンプルセットについての中央値である。ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−１０６ａは、非腫瘍組織中よりも腫瘍中で有意により高く発現された：ｍｉＲ−３２についてはＰ＝０．０３７（両側t検定）；ｍｉＲ−１０６ｂについてはＰ＝０．００９（両側t検定）；ｍｉＲ−１０６ａについてはＰ＝０．０１５（両側t検定）。 図５Ａ−５Ｄ：前立腺癌患者からの非腫瘍前立腺組織（正常）及び腫瘍（腫瘍）における、ｍｉＲ−３２（図５Ａ）、ｍｉＲ−１０６ｂ（図１Ｂ）、ｍｉＲ−１０６ａ（図５Ｃ）及びｍｉＲ−１（図５Ｄ）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析。プロットされているのは、個々のサンプルについての相対的マイクロＲＮＡ発現値、及びサンプルセットについての中央値である。ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−１０６ａは、非腫瘍組織中よりも腫瘍中で有意により高く発現された：ｍｉＲ−３２についてはＰ＝０．０３７（両側t検定）；ｍｉＲ−１０６ｂについてはＰ＝０．００９（両側t検定）；ｍｉＲ−１０６ａについてはＰ＝０．０１５（両側t検定）。 [000115]図６：前立腺腫瘍における、ＸＰＯ６とｍｉＲ−１転写体レベル間の関係。 [000116]図７：ｍｉＲ−１０６ｂはＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１）３’ＵＴＲ仲介機構によりルシフェラーゼレポーター活性を阻害する。 [000117]図８Ａ〜８Ｂ：抗癌剤処理された細胞における、ｍｉＲクラスターによるカスパーゼ３／カスパーゼ７活性化の有意な抑制。 図８Ａ〜８Ｂ：抗癌剤処理された細胞における、ｍｉＲクラスターによるカスパーゼ３／カスパーゼ７活性化の有意な抑制。 [000118]図９Ａ〜９Ｂ：成熟ｍｉＲ−３３８及びｍｉＲ−２２１のｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、それらの発現レベルがアンドロゲン調節されていることを示した。 図９Ａ〜９Ｂ：成熟ｍｉＲ−３３８及びｍｉＲ−２２１のｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、それらの発現レベルがアンドロゲン調節されていることを示した。 [000119]図１０：表１：研究母集団の臨床的特徴。 [000120]図１１−表２：腫瘍及び非腫瘍組織間で差次的に発現されているマイクロＲＮＡ。 [000121]図１２：表３：前立腺外疾患に関連するマイクロＲＮＡ。 [000122]図１３Ａ：表４Ａ：前立腺腫瘍におけるｍｉＲ−１及び標的遺伝子転写体レベルの間の逆の相関関係。 [000123]図１３Ｂ：表４Ｂ：前立腺腫瘍についての３７プローブセットＰＡＭ予測変数。 [000124]図１４−表５：前立腺腫瘍においてｍｉＲ−１８１ａと逆に相関しているｍｉＲ−１８１ａの標的遺伝子。 [000125]図１５−表６：アンドロゲン応答性マイクロＲＮＡ。 [000126]図１６−表７：マイクロＲＮＡの隣接配列における推定アンドロゲンレセプター結合部位。 [000127]図１７−１７Ｂ：２３５マイクロＲＮＡの発現に基づいた５７前立腺腫瘍の教師なし（Unsupervised）階層的クラスター分析。[000128]図１７Ａ：マイクロＲＮＡ発現は独特のマイクロＲＮＡプロファイルを有する二つの主なクラスターを与えた。クラスター＃１は全ての非ＰＮＩ腫瘍を含有する。 図１７−１７Ｂ：２３５マイクロＲＮＡの発現に基づいた５７前立腺腫瘍の教師なし（Unsupervised）階層的クラスター分析。[000129]図１７Ｂ：二つのクラスター間のＰＮＩ状態による腫瘍の非ランダム分布（Ｐ＝０．００２；両側フィッシャーの直接確率検定）。 [000130]図１８：ＰＮＩ腫瘍と非ＰＮＩ腫瘍を比較して差次的に発現された遺伝子について富化されているジーンオントロジー生物学的プロセスのクラスター分析。クラスター分析の結果はヒートマップに示されており、赤い色は生物学的プロセス、例えば、エイコサノイド代謝、個別比較には、例えば、ＰＮＩ腫瘍対非ＰＮＩ腫瘍（「神経周囲の浸潤」）、において差次的に発現された遺伝子の富化を示している。該ヒートマップは高（７〜９）対低（５〜６）グリーソンスコア比較（「合計グリーソンスコア」）、ｐＴ３対ｐＴ２比較（「病理学的病期」）、及び陽性対陰性の前立腺外進展 比較（「前立腺外進展」）についてのクラスター分析も示す。分析は、遺伝子発現相違が非ランダムであり、四つの比較について頻繁に影響される生物学的プロセスの独特のパターンを作り出していることを明らかにした。拡大したクラスターは、ＰＮＩ腫瘍と非ＰＮＩ腫瘍を比較すると差次的に発現された遺伝子について独特に富化されている生物学的プロセスを示す。エイコサノイド代謝、脂質代謝及び軸索形成も、ｐＴ３対ｐＴ２を比較すると差次的に発現された遺伝子について富化されている。 [000131]図１９Ａ−１９Ｄ：免疫組織化学による、前立腺腫瘍におけるメタロチオネインの発現。パネルは腫瘍上皮におけるメタロチオネイン発現の例を示している。同一の腫瘍での、神経細胞から遠位の癌細胞における際だったメタロチオネインの細胞質発現（図１９Ａ）及び神経周囲癌細胞におけるこの発現の不存在（図１９Ｂ）。メタロチオネインの発現は、腫瘍細胞が神経に接近するにつれ減少する（図１９Ｃ、１９Ｄ）。矢印及び「Ｎ」は、褐色に染色された神経幹の位置を示す。対比染色：メチルグリーン。 [000132]図２０Ａ−２０Ｄ：免疫組織化学による、前立腺腫瘍におけるコクサッキーアデノウイルスレセプターの発現。パネルは、腫瘍上皮におけるレセプター発現の例を示している。同一の腫瘍での、神経細胞から遠位の癌細胞（図２０Ａ）、及び神経周囲癌細胞（図２０Ｂ）におけるレセプターのための膜性及び細胞質染色。コクサッキーアデノウイルスレセプターの発現は、神経周囲癌細胞において減少した（図２０Ｃ、２０Ｄ）。Ｎ：神経幹。対比染色：メチルグリーン。 [000133]図２１Ａ−２１Ｄ：インサイツハイブリダイゼーションによる前立腺腫瘍中のｍｉＲ−２２４。示されているのは、腫瘍上皮におけるｍｉＲ−２２４の細胞質発現の代表的な例である。顆粒状褐色染色は、ｍｉＲ−２２４の存在を示す。ほとんどの腫瘍は、ｍｉＲ−２２４の弱いラベリングを示した（図２１Ａ）。腫瘍の下位集団において、中程度から強いｍｉＲ−２２４ラベリングが神経周囲癌細胞において観察された（図２１Ｂ、２１Ｃ、２１Ｄ）。Ｎ＝神経幹。対比染色：ヘマトキシリン。 [000134]図２２：表８：神経周囲の浸潤（ＰＮＩ）治験対象母集団の臨床的特徴。 [000135]図２３−表９：ＰＮＩを有する腫瘍において上方調節されたマイクロＲＮＡ（ＦＤＲ＜１０％）。 [000136]図２４−表１０：ＰＮＩ及び非ＰＮＩ腫瘍間で差次的発現を有するタンパク質コードＲＮＡ。 [000137]図２５−表１１：選択された遺伝子についてのｑＲＴ−ＰＣＲによるマイクロアレイ結果の検証。 [000138]図２６−表１２：ＰＮＩ腫瘍と非ＰＮＩ腫瘍を比較したとき、差次的に発現された遺伝子に対して最も有意に富化された生物学的プロセス。
本発明の詳細な記述
[000139]本開示を通して、種々の刊行物、特許及び公開された特許明細書は引用を特定することにより参照される。これらの刊行物、特許及び公開された特許明細書の開示は、本発明が関与する分野の状態をより完全に記述するために、本開示に引用文献として組み入れられる。
[000140]本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の製剤又はプロセスパラメーター（それ自体、もちろん変化することができるので）に限定されないことを理解すべきである。本明細書で使用された用語法は、本発明の特定の態様を説明する目的でのみ使用され、限定する意図がないことも理解すべきである。
[000141]本明細書に記載したものと類似の又は均等な多くの方法及び材料を、本発明の実施において使用し得るが、好ましい材料及び方法が本明細書に記載されている。
[000142]マイクロＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子の発現を調節する短鎖非コードＲＮＡである。前立腺癌におけるマイクロＲＮＡの関与を評価するため、６０の原発性前立腺腫瘍及び１６の非腫瘍前立腺組織中のマイクロＲＮＡ及びｍＲＮＡのゲノム全域にわたる発現を決定した。
[000143]マイクロＲＮＡ発現は、前立腺癌の発生及び進行とともに変化する。これらのマイクロＲＮＡのいくつかは、前立腺癌細胞において癌関連遺伝子の発現を調節する。
[000144]本明細書で互換的に使用される、「ｍｉＲ遺伝子産物」「マイクロＲＮＡ」「ｍｉＲ」又は「ｍｉＲＮＡ」とは、ｍｉＲ遺伝子からの、プロセッシングを受けていない又はプロセッシングされたＲＮＡ転写体を指す。
[000145]本明細書で使用される「バイオマーカー」は、「ｍｉＲ遺伝子産物」「マイクロＲＮＡ」「ｍｉＲ」又は「ｍｉＲＮＡ」、又はタンパク質コードＲＮＡの一つ以上を含むことができる。
[000146]活性１９−２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、天然のプロセッシング経路（例えば、無傷の細胞又は細胞可溶化物を使用して）又は合成的プロセッシング経路（例えば、単離されたダイサー、アルゴノート又はリボヌクレアーゼＩＩＩのような単離されたプロセッシング酵素を使用して）を介してｍｉＲ前駆体から得ることが可能である。活性１９−２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、ｍｉＲ前駆体を加工処理せずに、生物学的又は化学的合成により直接的に生成することが可能であることもわかっている。マイクロＲＮＡが名称により本明細書で参照された場合、特に示されない限り、名称は前駆体及び成熟型の両方に対応する。
[000147]本発明は、対象が前立腺関連障害を有するか、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する方法を包含する。本明細書で使用される「対象」は、前立腺癌を有する、又は有すると疑われる任意の哺乳動物であり得る。
[000148]ｍＲＮＡ分析は、マイクロＲＮＡプロセッシング及びいくつかのマイクロＲＮＡ宿主遺伝子、例えば、ＭＣＭ７及びＣ９ｏｒｆ５の鍵となる成分が、前立腺腫瘍において有意に上方調節されていることを明らかにした。これらの発見と一致して、腫瘍は、Ｍｃｍ７のイントロン１３に位置するｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスター及びＣ９ｏｒｆ５のイントロン１４に位置するｍｉＲ−３２を、非腫瘍前立腺よりも有意に高いレベルで発現した。
[000149]ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスター相同体及びｍｉＲ−ｌ−１３３ａクラスターを含む他のマイクロＲＮＡの発現レベルも、前立腺腫瘍において変化した。
[000150]マイクロＲＮＡ存在量における追加の相違が、器官に限定された腫瘍及び前立腺外疾患進展を有する腫瘍間で見出された。
[000151]マイクロＲＮＡの調節解除が、前立腺におけるタンパク質コード標的遺伝子の転写体存在量に影響する証拠も発見された。
[000152]細胞培養において、Ｅ２Ｆ１及びｐ２１／ＷＡＦ１がｍｉＲ−１０６ｂの、ＢｉｍがｍｉＲ−３２の、及びエクスポーチン６及びＰＴＫ９がｍｉＲ−１の標的として同定された。
[000153]遺伝子に基づいた分類手段は、疾患診断を改善することにおける、及び臨床挙動予測のための強力な診断的及び予後予測ツールであり得る。我々は、腫瘍と非腫瘍組織
間を識別するマイクロＲＮＡシグネチャーを同定するためにＰＡＭ応用を使用した。ＰＡＭは、腫瘍及び非腫瘍組織間を最も良く区別する７プローブセット及び３７プローブセットから成る二つのマイクロＲＮＡシグネチャーを同定した（図１３Ｂ−表４Ｂ、ここで７プローブセットシグネチャーは＊により示されている）。
[000154]７プローブセットシグネチャーは、１６非腫瘍組織の内の１４（８８％）及び６０腫瘍の内の４９（８２％）の正しい分類を達成した。このシグネチャーは、四つのマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−４９０及びｍｉＲ−５２０ｈのみの発現パターンに基づいている。
[000155]総合的予測精度のさらなる改善は、２３のマイクロＲＮＡを示す３７プローブセットシグネチャーで得られた（図１１［表５］）。このシグネチャーは、７プローブセットシグネチャーと完全に重複している。３７プローブセットシグネチャーにより、ＰＡＭは１６非腫瘍組織の内の１６（１００％）及び６０腫瘍の内の４８（８０％）の正しい分類を達成した。
[000156]本発明は以下の実施例でさらに説明され、特に記載しない限り、全ての部分及びパーセンテージは重量によるものであり、度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、例示のためにのみ与えられていることを理解すべきである。上記の議論及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確かめることができ、そしてそれらの精神及び範囲から離れることなく、多様な使用及び条件に適合させるために本発明の多様な変形及び修正を行うことができる。本明細書で言及された、特許及び非特許文献を含む全ての出版物は、本明細書において特別に援用される。
[000157]実施例Ｉ
[000158]臨床サンプル
[000159]６０の新鮮凍結前立腺腫瘍は、NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource（ＣＰＣＴＲ）及びメリーランド大学病理学部（ＵＭＤ）から受け取った。書面に
よるインフォームドコンセントは、全てのドナーから得られた。腫瘍は、前立腺切除術に先だっては何の治療も受けていない腺癌を切除した。マクロ解剖腫瘍試料は病理学者により再検討され、凍結標本中の腫瘍の存在が確認された。周辺非腫瘍前立腺組織は、前立腺癌を有する１６人の患者から採取した。全ての組織は、２００２年から２００４年の間に採取された。人種／民族性についての情報は、診療記録（ＣＰＣＴＲ）から抽出するか又は疫学的アンケート調査（ＵＭＤ）のいずれかを介して取得した。前立腺切除術時の年齢、組織学、グリーソンスコア、病理学的病期、診断時のＰＳＡ、腫瘍サイズ、前立腺外進展、辺縁病変及び精嚢浸潤を含む患者の臨床病理学的特性はＣＰＣＴＲから得られた。ＵＭＤ症例については、この情報は、もし入手可能ならば、診療記録及び病理学的記録から抽出した。本研究は、関与施設の治験審査委員会により認可された。
[000160]ＲＮＡ抽出
[000161]全ＲＮＡは、製造者の取扱説明書に従い、ＴＲＩＺＯＬ試薬を使用して単離した（Invitrogen, Carlsbad, CA）。各サンプルについてのＲＮＡの完全性は、Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）で確認した。各ＲＮＡサンプ
ルは次ぎに、２分割量に分け、マイクロＲＮＡマイクロアレイ又はｍＲＮＡマイクロアレイのために処理した。
[000162]遺伝子マイクロアレイ
[000163]特別注文マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドチップ。マイクロＲＮＡ標識及びハイブリダイゼーションは、以前に記載した如く実施した（２１）。マイクロＲＮＡマイ
クロアレイ（Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Version 3.0）は、３２９のヒト及び２４９のマウスマイクロＲＮＡについて四通りにスポットされたプローブを含む。アレイプラットホームに関するより詳細な情報は、ArrayExpress及びＧＥＯデータベースで、それぞれ受入番号Ａ−ＭＥＸＰ−６２０及びＧＳＥ８１２６のもと見ることができる。
[000164]Affymetrix GeneChip（商標）
[000165]ＲＮＡ標識及びハイブリダイゼーションは、Affymetrix標準プロトコルに従って実施した(Santa Clara,CA)。簡単には、全ＲＮＡの５μｇを、５’末端にＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するオリゴ（ｄＴ）プライマーで逆転写した。第二鎖合成にｃＲＮＡ生成が続き、Enzo Life Sciences（Farmingdale,NY）からのBioArray High Yield RNA Transcript Labeking Kit T3を使用してビオチン化リボヌクレオチドを取り込ませた。標識化ｃＲＮＡは断片化し、Affymetrix GeneChip HG-U133A 2.0アレイにハイブリダイズさせた。このアレイは、およそ１３，０００のヒトタンパク質コード遺伝子を提示する２２，２８３のプローブセットを含む。ハイブリダイゼーションシグナルは、フィコエリトリン−コンジュゲートストレプトアビジン（Invitrogen）で可視化し、GeneChip Scanner 3000 7G（Affymetrix）を使用してスキャンした。Minimum Information About a Microarray Experiment（ＭＩＡＭＥ）ガイドラインに従って我々は、マイクロアレイデー
タ及び追加の患者情報のＣＥＬファイルをＧＥＯリポジトリー（ncbi.nlm.nih.zov/aeo/
）に寄託した。マイクロＲＮＡ及びｍＲＮＡプロファイリングデータのＧＥＯ提出受入番号は、それぞれＧＳＥ８１２６及びＧＳＥ６９５６である。
[000166]マイクロアレイのデータ規格化及び統計分析
[000167]Affymetrixチップは、ロバストマルチチップ分析（robust multichip analysis）（ＲＭＡ）法（２２）を使用して正規化した。中央値−中心（Median-centric）正規
化を、特別注文のマイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドチップに対して使用した。有意に差次的に発現された遺伝子のリストを発生させるため、生じたデータセットをマイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）法（２３）にかけた。両側ｔ検定及び意図された誤検出率（false discovery rates（ＦＤＲ））からの両方のＰ値に基づいて遺伝子リストを発生させ
た。ＦＤＲ計算は、Storey and Tibshirani（２４）により記載されている方法に従った
。組織を意図されたカテゴリー、例えば、腫瘍又は非腫瘍組織に分類するため、マイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）（２５）を使用した。この分析において、トレーニングエラー率及び変動係数（ＣＶ）エラー率両方のについての最良の補償に基づいて、閾値デルタを選択した。ＰＡＭにおける適切な閾値パラメータを決定するため、サンプルの１０％を除外することにより交差検定を実行した。
[000168]マイクロＲＮＡ標的予測
[000169]マイクロＲＮＡ標的予測のため、TargetScanS（http://genes.mit.edu/tscan/taraetscanS.html）を使用した。３’ＵＴＲ内に位置するマイクロＲＮＡの予測結合部位のみを種を越えて保存し、我々の分析で考慮した。分析及びデータ出力のため、データをWholePathwayScope データベース用にフォーマットした（２６）。ヒト前立腺組織において、それらの標的ｍＲＮＡの転写体存在量を調節するマイクロＲＮＡを同定するため、相関分析を実行した。そのため、ピアソン相関係数を計算した。ピアソン相関係数の統計的有意性は、両側t検定によって決定した。
[000170]定量的リアルタイムＰＣＲ
[000171]成熟マイクロＲＮＡの存在量は、公開されたプロトコル（２７）に従って、ステムループTaqMan（商標）マイクロＲＮＡアッセイキット（Applied Biosystems, Foster
City, CA）を使用して測定した。簡単には、製造元の取扱説明書に従って、TaqMan（商
標）マイクロＲＮＡアッセイキットからの特異的マイクロＲＮＡプライマー及びTaqMan（
商標）マイクロＲＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems）からの試薬を使用し、１０ｎｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写した。Applied Biosystems Tagman 2X Universal PCR
マスター混合物及び問題とする各マイクロＲＮＡについて適切な5X TaqMan（商標）マイクロＲＮＡアッセイ混合物で、ｃＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲを実行した。３重の反応物をApplied Biosystems 7500リアルタイムＰＣＲシステム内の９６ウェルプレート
中、９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒及び６０℃で１分を４０サイクル、インキュベートした。各サンプルについて、閾値サイクル（Ｃｔ）をABI 7500配列検出システムソフトウェアにより算出した。検量線をサンプル中のマイクロＲＮＡ濃度を決定するために使用し、それは次ぎにＵ６ ＲＮＡで正規化した。
[000172]マイクロＲＮＡによるタンパク質発現の調節。
[000173]ＬＮＣａＰ及びＰＣ３ヒト前立腺癌細胞（ＡＴＣＣ、Manassas,VA）を、５０
％コンフルエントまで増殖させ、リポフェクタミン２０００試薬（Invitrogen）を使用し、１００ｎＭ最終濃度のマイクロＲＮＡ前駆体又はアンチセンスマイクロＲＮＡ阻害剤（両方ともAmbion、Austin、TX）のいずれかでトランスフェクトした。４８時間後、細胞をこすり取ることにより採取し、タンパク質をＲＩＰＡ緩衝液（Pierce Biotechnology, Rockford, IL）で抽出した。ブラッドフォードアッセイ（BioRad Laboratories, Hercules,
CA: #500-0006）を実施してタンパク質濃度を決定し、タンパク質の５０ｕｇを、ウエスタンブロット分析のためにゲルに添加した。以下のマイクロＲＮＡ前駆体を使用した：ｐｒｅ−マイクロＲＮＡ陰性対照（AM17110）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１（カタログ番号AM17100
製品ID: PM10617）；ｈｓａ−ｍｉＲ−３２（カタログ番号AM17100 製品ID: PM12584）
及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ（カタログ番号AM17100 製品ID: PM10067）。以下のマイ
クロＲＮＡ阻害剤（アンチセンス）を使用した：抗マイクロＲＮＡ陰性対照（AM 17010）；ｈｓａ−ｍｉＲ−１（カタログ番号AM17000 製品ID: AM10617）；ｈｓａ−ｍｉＲ−３
２（カタログ番号AMI7000 製品 ID: AM12584）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ（カタログ番号AM17000 製品ID: AM10067）。ウエスタンブロット分析によるタンパク質発現を視覚
化するため、以下の一次抗体を使用した：ポリクローナルウサギ抗エクスポーチン６抗体、１：２００（Protein Tech Group, Chicago, IL:11408-1-AP）；モノクローナルマウス抗ＰＴＫ９抗体、１：５００（Abnova Corp., Taipei, Taiwan:クローン1E2）；モノクローナルマウス抗Ｅ２Ｆｌ抗体、１：２００（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA: sc-251）；モノクローナルマウス抗ｐ２１／ＷＡＦ１抗体、１：２００（Santa Cruz Biotechnology: sc-6246）及びポリクローナルウサギ抗ＢＩＭ抗体、１：１０００（Cell Signaling/Santa Cruz Biotechnology: #2819）。タンパク質発現の定量化は、AIDA Biopackage, 2D-Densitometry（raytest Isotopenmessgeraete GmbH, Straubenhardt, Germany）で得られた。
[000174]Ｅ２ＦＩ及びＢＣＬ２Ｌ１１の３’ＵＴＲを含有するレポーター構築物のルシフェラーゼアッセイ
[000175]予測ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−３２標的配列を含有する、それぞれＥ２ＦＩ及びＢＣＬ２Ｌ１１（Ｂｉｍをコードする）３’ＵＴＲを、ゲノムＤＮＡ（２９３Ｔ細胞）から増幅し、ｐＧＬ３ホタルルシフェラーゼ対照ベクター（Promega, Madison, WI）のルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ下流のＸｂａ１制限部位にクローン化した。変異標的配列を有する３’ＵＴＲを生成するため、QuikChange部位特異的突然変異導入キット（Stratagene, La Jolla, CA）を使用し、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−３２シード領域相補的部位内に最初の３ヌクレオチド欠失を生じさせた。ｍｉＲ−１０６ｂあるいはｍｉＲ−３２によるルシフェラーゼレポーター遺伝子の翻訳抑制は、ＬＮＣａＰ細胞においてアッセイした。簡単には、ウェル当たり１．２ｘ１０５ＬＮＣａＰ細胞を２４ウェルプレートに播種した。翌日、取扱説明書（Invitrogen）に従ってリポフェクタミン２０００試薬を使用し、５００ｎｇのレポータープラスミド、２ｎｇのウミシイタケレポーター、及び１００ｎＭ最終濃度でのマイクロＲＮＡ陰性対照あるいはマイクロＲＮＡ前駆体で細
胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは３重に実施した。細胞を、ｐｒｅ−マイクロＲＮＡ陰性対照（AM17110）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ（カタログ番号AM17100
製品ID: PM10067）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−３２前駆体（カタログ番号AM17100 製品ID: PM12584）のいずれかでトランスフェクトした。２４時間後、細胞を、Promega標準プロトコルに従って溶解し、相対的ルシフェラーゼ活性を DYNEX Technologies MLXルミノメーターを使用して決定した。レポーター活性は、細胞抽出物中のタンパク質濃度で規格化した。
[000176]アンドロゲンレセプターアゴニストによる前立腺癌細胞の処理
[000177]ＤＵ−１４５（１ｘ１０６）及びＬＮＣａＰ（２ｘ１０６）ヒト前立腺癌細胞（ＡＴＣＣ）を、７５ｃｍ２フラスコに播種し、１０％ＰＢＳ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００単位／ｍｌペニシリン及び０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを補給したＲＰＭＩ１６４０で２４時間培養した。続いてホルモンを枯渇させるため、細胞を５％デキストラン被覆活性炭処理ＰＢＳを含有するフェノールレッドフリーＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen）内に、４８時間おいた。次ぎに細胞を、１０ｎＭ Ｒ１８８１（メチルトリエノロン、PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA）あるいは溶媒（エタノール）で処理した。２４時間後、細胞を採取し、全ＲＮＡをmirVana PARISキット（Ambionjnc）を使用して単離した。この実験を５回繰り返した。マイクロＲＮＡ標識及びハイブリダイゼーションは以前に記載したように実施し（２１）、マイクロＲＮＡの広範囲の発現は、Ohio State University Comprehensive Cancer Centerマイクロアレイ（バージョン
４．０）上で決定した。
[000178]実施例Ｉの結果
[000179]前立腺腫瘍におけるダイサーの上方調節
[000180]前立腺腫瘍は、限局性疾患を有するアフリカ系アメリカ人及びヨーロッパ系アメリカ人患者から採取された（図１０−表１）。
[000181]これらの腫瘍からの、及び１６の非腫瘍組織からの全ＲＮＡの単離後、約１３，０００のタンパク質コード遺伝子及び３２９の特有のヒトマイクロＲＮＡをマイクロアレイで決定した。
[000182]最初に、これらのサンプルの遺伝子発現プロファイルは、マイクロＲＮのプロセッシングを調節することが示されているｍＲＮＡ（例えば、中でもドローシャ又はダイサーをコードするｍＲＮＡ）の発現における癌関連変化について探索した。非腫瘍組織と比較した場合、ダイサーが前立腺腫瘍において有意に高く発現されていることを我々の分析は明らかにした（１．６倍；ＦＤＲ＜１％）。ドローシャの必須な補因子をコードするＤＧＣＲ８も、非腫瘍組織と比較した場合、ダイサーよりも低い程度ではあったが、腫瘍において上方調節されていた（１．２倍；ＦＤＲ＜１％）。ドローシャの必須な補因子をコードしたＤＧＣＲ８も、腫瘍において上方調節されていた（１．２倍；ＦＤＲ＜１％）。腫瘍におけるダイサー及びＤＧＣＲ８の発現増加は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより確認され、それはマイクロアレイで示されたよりも大きな相違倍数を明らかにした（図４Ａ〜４Ｂ）。
[000183]さらなる分析は、ダイサー及びＥＩＦ２Ｃ２（両方ともＲＩＳＣ複合体の成分）が、低合計グリーソンスコア（スコア５〜６）を有する腫瘍におけるよりも、高合計グリーソンスコア（スコア７〜９）を有する腫瘍において、より高く発現されたことを示した。しかしながら、これらの発現相違はむしろ穏やかであった（ダイサー：１．２倍；ＥＩＦ２Ｃ２：１．３倍）。高頻度の宿主遺伝子及びイントロンマイクロＲＮＡの共発現がヒト細胞で観察されているので（２８）、前立腺腫瘍におけるマイクロＲＮＡ宿主遺伝子の発現も調べた。
[000184]マイクロＲＮＡについての宿主遺伝子の中で（２８；２９）、５つの発現が前立腺癌で変化していることが見出された（全てＦＤＲ＜１％）。これらの内、ｍｉＲ−３２の宿主であるＣ９ｏｒｆ５（２．１倍上方調節）及びｍｉＲ−２５クラスター （ｍｉＲ−２５／ｍｉＲ−９３／ｍｉＲ−１０６ｂ）の宿主であるＭＣＭ７（１．７倍上方調節）が腫瘍中で最も高く過剰発現されていた。ＮＦＹＣ（ｍｉＲ−３０ｃ−ｌの宿主）、ＳＭＣ４Ｌ１（ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−１６−２の宿主）及びＰＴＰＲＮ２（ｍｉＲ−１５３−２の宿主）は、非腫瘍組織と比較した場合、より穏やかな３０％〜４０％の増加した発現を示した。
[000185]前立腺癌のマイクロＲＮＡ遺伝子シグネチャー
[000186]最初に、腫瘍及び非腫瘍組織間で差次的発現を示したマイクロＲＮＡについて探索した。図１１−表２に示したように、前立腺腫瘍において複数のマイクロＲＮＡの発現が変化した。
[000187]非腫瘍組織よりも腫瘍においてより低い転写体レベルを有するマイクロＲＮＡの中で、ｍｉＲ−５２０ｈ、ｍｉＲ−４９４、及びｍｉＲ−４９０が最も高度に減少していた。このリストにおいて他の二つの注目に値するマイクロＲＮＡはｍｉＲ−ｌ（−２）及びｍｉＲ−１３３ａ（−ｌ）であった。これら二つのマイクロＲＮＡは、同じｐｒｉ−ｍＲＮＡによりコードされている。ｍｉＲ−３２が最も有意に上方調節され、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−３１、及びｍｉＲ−２６ａが続く。より高く発現された腫瘍マイクロＲＮＡのリストは、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの全てのメンバー（ｍｉＲ−１０６ｂ／ｍｉＲ−９３／ｍｉＲ−２５）及びｍｉＲ−９９ｂクラスターの二つのメンバー（ｍｉＲ−９９ｂ及びｍｉＲ−１２５ａ）も含んでいる。ｍｉＲ−３２及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスター両方の上方調節は、前立腺腫瘍におけるそれら各々の宿主遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ５及びＭＣＭ７の増加した発現と一致している。
[000188]マイクロアレイデータの統計分析は、Ｃ９ｏｒｆ５及びｍｉＲ−３２の組織転写体レベルが統計的に有意に相関していることを確認した（Ｐ＝０．０００３）。ピアソン係数は、この相関が全てのサンプルにわたって中程度に強かったことを示した（０．３９；９５％信頼区間：０．１８〜０．５７；ｎ＝７６）。類似のデータが、ＭＣＭ７とｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスター転写体レベル間の相関についても得られた（ｍｉＲ−１０６ｂ：０．３７（ピアソン係数）、Ｐ＝０．００１；ｍｉＲ−９３：０．３５、Ｐ＝０．００２；ｍｉＲ−２５：０．２３、Ｐ＝０．０４）。
[000189]腫瘍及び非腫瘍組織の無作為下位集団の選択されたマイクロＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、マイクロアレイデータを実証した。マイクロアレイと一致して、成熟ｍｉＲ−３２（３．２倍）及びｍｉＲ−１０６ｂ（３．０倍）は、非腫瘍組織よりも腫瘍においてより高く発現されていることが見出された（図５Ａ−５Ｄ）。非腫瘍組織と比較した場合、腫瘍において成熟ｍｉＲ−１が下方調節され（平均：０．４４倍）、そしてｍｉＲ−１０６ａ（ｍｉＲ−１０６ｂ相同体）が過剰発現（平均：３．７倍）されていることも見出された。
[000190]その周辺非腫瘍組織が入手可能であった、本研究の１０の腫瘍について、マイクロアレイデータの対応のある検定も実行した。対応のある検定は我々の以前の発見を実証した。ＦＤＲ＜１０％では、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３０ｃ−ｌ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−３７５、及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの全てのマイクロＲＮＡが腫瘍において上方調節されていることが見出された（１．５倍〜２．５倍）。最も有意に下方制御された腫瘍マイクロＲＮＡはｍｉＲ−４９４（０．４倍）及びｍｉＲ−１２６
（０．６倍）であった。しかしながら、ｍｉＲ−１３３ａクラスターは、この腫瘍下位集団においては有意に差次的に発現されていないことが見出された。
[000191]マイクロＲＮＡと前立腺外進展及びグリーソンスコアの関連
[000192]次ぎに、腫瘍の前立腺外進展に関連したマイクロＲＮＡ発現の相違について我々のデータセットを分析した。前立腺外進展は、前立腺癌腫を有する患者において好ましくない予後因子である。ＦＤＲ＜２０％で、疾患の前立腺外進展を示した腫瘍（ｎ＝１７）及び示していない腫瘍（ｎ＝３５）間の発現において相違を有する１５のマイクロＲＮＡを見出した（図１２−表３）。
[000193]ｍｉＲ−１０１は、前立腺（prostate gland）外に広がった限局性前立腺腫瘍において最も一貫して過剰発現されていたマイクロＲＮＡであった（ＦＤＲ＜１％）。前立腺外進展は、腫瘍シグネチャーとそのマイクロＲＮＡシグネチャーの一部を共有した（図１１−表２）。
[000194]二つのマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−９９ｂ及びｍｉＲ−１９６ａは、両シグネチャーに共通している。前立腺外進展シグネチャーの他の二つのマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−２００ａ及びｍｉＲ−２００ｂは、腫瘍シグネチャー中のｍｉＲ−２００ｃと広範囲の相同性を有する。本研究でこの特徴を有すると診断された腫瘍はわずかであったが、マイクロＲＮＡと精嚢浸潤の関連も調べた。ＦＤＲ＜２０％で、一つのマイクロＲＮＡのみが、精嚢浸潤を有する腫瘍（ｎ＝９）及び浸潤を有していない腫瘍（ｎ＝４３）間で差次的に発現された。このマイクロＲＮＡはｍｉＲ−１９９ａ−ｌであり、他の腫瘍と比較した場合、精嚢浸潤を有する腫瘍において２．３倍増加していた。
[000195]マイクロＲＮＡ発現プロファイリングは、グリーソンスコアに対するロバスト（robust）シグネチャーを明らかにしなかった。非常にわずかなマイクロＲＮＡのみが、ＦＤＲ＜２０％で差次的に発現されていることが見出された。低合計グリーソンスコアを有する腫瘍（スコア５−６、ｎ＝１５）と比較した場合、高合計グリーソンスコアを有する腫瘍（スコア７−９、ｎ＝４５）において有意に上方調節されていたマイクロＲＮＡ（Ｐ＜０．０１）は、ｍｉＲ−９２−２（１．３倍）、ｍｉＲ−２５及びｍｉＲ−３２相同体、及びｍｉＲ−３３５（１．２倍）であり、そして有意に下方制御されていたマイクロＲＮＡ（Ｐ＜０．０１）は、ｍｉＲ−１−１３３ａクラスター（０．７倍）及びｍｉＲ−１３０（０．８倍）であった。
[000196]本研究の腫瘍は、臨床病理学的パラメータがよく一致していたアフリカ系アメリカ人及びヨーロッパ系アメリカ人患者から集められたので（図１０−表１）、アフリカ系アメリカ人（ｎ＝３０）及びヨーロッパ系アメリカ人（ｎ＝３０）間の腫瘍マイクロＲＮＡシグネチャーを比較した。わずかなマイクロＲＮＡしか差次的に発現されなかった（Ｐ＜０．０１）。ＦＤＲ＜２０％では、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１９６ｂ及びｍｉＲ−３４２が、ヨーロッパ系アメリカ人の腫瘍においてよりもアフリカ系アメリカ人の腫瘍においてより少ない量であることが見出された（２０％〜３０％より低く）。この分析から、腫瘍マイクロＲＮＡが人種／民族性により非常に差次的に発現されることはないようである。
[000197]マイクロＲＮＡによる腫瘍及び非腫瘍組織の分類
[000198]遺伝子に基づいた分類は、疾患診断を改善することにおける、及び臨床挙動予測のための強力な診断的及び予後予測ツールであり得る。我々は、腫瘍と非腫瘍組織間、器官限局性腫瘍及び前立腺外進展を有する腫瘍間、及び高及び低合計グリーソンスコアを有する腫瘍間を識別するマイクロＲＮＡシグネチャーを同定するためにＰＡＭ応用を使用した。ＰＡＭは、腫瘍及び非腫瘍組織間を最も良く区別する７プローブセット及び３７プ
ローブセットから成る二つのマイクロＲＮＡシグネチャーを同定した。７プローブセットシグネチャーは、１６非腫瘍組織の内の１４（８８％）及び６０腫瘍の内の４９（８２％）の正しい分類を達成した。このシグネチャーは、四つのマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−４９０及びｍｉＲ−５２０ｈのみの発現パターンに基づいており（図１３Ｂ−表４Ｂ）、それらはすべて最も有意に上方又は下方調節されている腫瘍マイクロＲＮＡであった（図１１−表２）。総合的予測精度のさらなる改善は、２３のマイクロＲＮＡを示す３７プローブセットシグネチャーで得られた（図１４−表５）。
[000199]このシグネチャーは、７プローブセットシグネチャーと完全に重複している。３７プローブセットシグネチャーにより、ＰＡＭは１６非腫瘍組織の内の１６（１００％）及び６０腫瘍の内の４８（８０％）の正しい分類を達成した。ＰＡＭは、前立腺外進展及びグリーソンスコアについての良好な分類指標を同定することができなかった。グリーソンスコアのための不十分から中程度の分類指標は１４９プローブセットを必要とした（データは示していない）。
[000200]前立腺組織におけるマイクロＲＮＡの転写体存在量とそれらの標的ｍＲＮＡの関係
[000201]マイクロＲＮＡは、標的特異性翻訳抑制によりタンパク質コード遺伝子の発現を調節する（４）。しかしながら、いくつかのマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１）は、哺乳類細胞において多数の標的遺伝子の転写体レベルを下方制御し得ることが最近示された。ｍｉＲ−１は、前立腺腫瘍において最も有意に下方制御されたマイクロＲＮＡであるので、これらの腫瘍におけるｍｉＲ−１発現レベルと予測ｍｉＲ−１標的遺伝子の発現レベル間の相関分析を実行した。この試験は、弱められたｍｉＲ−１発現のため、前立腺腫瘍中で過剰発現されるようになる候補ｍｉＲ−１標的遺伝子を同定するために実施した。分析により、前立腺腫瘍において上方調節されていることが見出され（ＦＤＲ＜１％）、そしてｍｉＲ−１発現と逆相関している推定標的ｍＲＮＡを得た（図１３−表４））。
[000202]これらの中で、ＷＤＲ６、ＸＰ０６及びＳＭＡＲＣＡ４のための転写体が腫瘍ｍｉＲ−１発現と最も有意な逆相関関係を示した（各々Ｐ＜１ｘ１０−１０）。前立腺腫瘍におけるＸＰＯ６とｍｉＲ−１転写体レベル間の関係は、図６に描かれている。
[000203]該腫瘍におけるＸＰＯ６タンパク質レベルが、ｍｉＲ−１と逆相関していることも見出した（−０．２９、スピアマン相関係数；ｎ＝８）。しかしながら、ｍｉＲ−１の全ての予測標的が、腫瘍においてｍｉＲ−１転写体レベルと逆相関を示したわけではない。例えば、ＴＷＦｌ（ＰＴＫ９とも称される）は、ｍｉＲ−１と正に相関しており、マイクロＲＮＡのその標的配列への結合が、時にはｍＲＮＡ隔離及び抑制されたｍＲＮＡの細胞内蓄積を導くことができることを示唆している（３０）。
[000204]我々の分析を、前立腺腫瘍において有意に上方あるいは下方調節されている他のマイクロＲＮＡに拡大した。ここで、我々は最初に、問題とするマイクロＲＮＡと、ＨＧ−Ｕ１３３Ａ２．０アレイにより探査された全てのｍＲＮＡあるいはマイクロＲＮＡの予測標的であるｍＲＮＡのみの間のピアソン相関係数の全体的分布を決定した。二つのマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−１８１ａについて、相関係数の分布は、全てのｍＲＮＡと、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−１８１ａの予測標的であるｍＲＮＡとの間で著しく異なっていた（図１Ａ−１Ｂ）。
[000205]ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−１８１ａの予測標的ｍＲＮＡについての分布曲線は、負のピアソン相関係数に向かって広がった特有の肩を示した。このパターンは正規分布からの逸脱であり、３’ＵＴＲ中に予測マイクロＲＮＡ標的配列を有する、ｍＲＮＡの下位集団の組織転写体レベルが、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−１８１ａにより減少す
ることを示す。腫瘍において有意に下方調節されている（ＦＤＲ＜１％）、及びその転写体レベルがｍｉＲ−１８１ａ発現と逆相関している標的遺伝子のリストが図１４−表５に示されている。
[000206]これらの標的遺伝子と、白血病サンプル中のｍｉｒ−１８１ａ転写体レベルに相関する遺伝子のリスト（３１）との比較は、数個（例えば、ＳＬＣ９Ａ６、ＲＩＮ２、ＫＬＨＬ２及びＧＨＩＴＭ）が両方のリストのｍｉｒ−１８１ａと負に相関していることを示した。
[000207]前立腺癌細胞における候補オンコｍｉＲによるタンパク質発現の抑制
[000208]腫瘍研究からの我々の結果は、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−３２及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターは前立腺癌においてオンコｍｉＲであり、ｍｉＲ−３２及びｍｉＲ−２５は高度の相同性を共有し、そしてそれらの予測標的遺伝子は同一である（targetscan.org）ことを示唆する。さらに、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターは、既知のオンコｍｉＲ、ｍｉＲ−１７−９２クラスター（１５；３２）と高度に相同しており、そしてｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−１０６ｂの予測標的は同一である。ｍｉＲ−１７−９２クラスターの標的は、Ｅ２Ｆ１である（３２）。
[000209]ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−３２、及びｍｉＲ−１０６ｂがこれらの細胞において癌関連遺伝子のタンパク質発現を調節しているかどうかを調べるため、二つのヒト前立腺癌細胞株を前駆体及びアンチセンスマイクロＲＮＡでトランスフェクトした。
[000210]細胞株中のこれらのマイクロＲＮＡの内在性発現は、ｑＲＴ−ＰＣＲによりｍｉＲ−１０６＞ｍｉＲ−３２＞ｍｉＲ−１であった。ｍｉＲ−１は、検出限界であった。ｍｉＲ−１について、マイクロＲＮＡ転写体存在量と腫瘍組織中のそれらの標的ｍＲＮＡの間の関連性がマイクロＲＮＡ標的を同定するために有用であるかどうかを試験し、そしてエクスポーチン−６（ＸＰＯ６）のタンパク質発現及びタンパク質チロシンキナーゼ９（ＴＷＦｌ）がｍｉＲ−１によって調節されているかどうかを試験した。ｍｉＲ−１での前立腺癌細胞のトランスフェクションは、それがエクスポーチン−６及びＰＴＫ９両方を、両方の前立腺癌細胞株においてタンパク質レベルで抑制することを確信させた（図２Ａ）。ｍｉＲ−３２又はｍｉｒ−１０６ｂのいずれも、これらのタンパク質の発現を変化させなかった（データは示していない）。
[000211]次に、ｍｉＲ−１０６ｂによるＥ２Ｆ１及びｐ２１／ＷＡＦ１タンパク質レベルの調節について調べた。両方のタンパク質とも、それらの３’ＵＴＲ中にｍｉＲ−１０６ｂの予測標的配列を有するｍＲＮＡによりコードされている。前立腺腫瘍における転写体レベルにはＥ２Ｆ１が相関しなかったのに対し、これらの腫瘍において、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１をコードする）の発現とｍｉＲ−１０６ｂとの間には、有意な逆相関が存在した（−０．３４；９５％ＣＩ；；−０．９〜−０．５５；Ｐ＝０．００３）。
[000212]図２Ｂに示したように、二つの細胞株において、トランスフェクトされた前駆体ｍｉＲ−１０６ｂはｐ２１／ＷＡＦ１タンパク質レベルを減少させ、そしてアンチセンスｍｉＲ−１０６ｂはｐ２１／ＷＡＦ１タンパク質レベルを増加させた。前駆体及びアンチセンスｍｉＲ−１０６ｂでの前立腺癌細胞トランスフェクション後、Ｅ２Ｆ１についても同じ結果を得た（図３Ａ）。
[000213]Ｂｉｍタンパク質発現に対するｍｉＲ−３２の効果も研究した。Ｂｉｍは、ＢＣＬ２Ｌ１１によりコードされており、ｍｉＲ−３２の予測標的である。前駆体ｍｉＲ−３２による前立腺癌細胞のトランスフェクションは、Ｂｉｍタンパク質レベルを減少させ、一方、アンチセンスｍｉＲ−３２はＢｉｍタンパク質レベルを増加させた（図３Ｃ）。
ＢｉｍはＢＣＬ２Ｌ１１によりコードされており、ｍｉＲ−３２の予測標的である。ＢＣＬ２Ｌ１１及びｍｉＲ−３２転写体レベルは、組織サンプルでは相関しておらず、ｍｉＲ−３２はこの標的をほとんど翻訳抑制により調節することができることを示唆している。
[000214]これらの細胞株において、Ｅ２Ｆ１及びｐ２１／ＷＡＦ１のタンパク質発現は、ｍｉＲ−３２により影響されず、Ｂｉｍのタンパク質発現もｍｉＲ−１０６ｂにより影響されなかった（データは示していない）。
[000215]Ｅ２ＦＩ及びＢｉｍは、ｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−３２の直接的標的である
[000216]我々の発見をさらに実証するため、及びこれらのタンパク質がｍｉＲ−Ｉ０６ｂ及びｍｉＲ−３２の直接標的である証拠を提出するため、ＬＮＣａＰ細胞を、マイクロＲＮＡ前駆体及び、二つの遺伝子、Ｅ２Ｆ１及びＢＣＬ２Ｌ１１（Ｂｉｍをコードする）の野生型あるいは変異３’ＵＴＲのいずれかをそれぞれ含有する、のｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーター構築物で共トランスフェクトした。変異３’ＵＴＲはｍｉＲ−１０６ｂ及びｍｉＲ−３２シード相補領域部位中に、最初の３ヌクレオチドの欠失を含有する。該３’ＵＴＲは、マイクロＲＮＡが標的配列に結合した時、ルシフェラーゼレポーターの翻訳抑制を導くであろう位置に置かれている。
[000217]図３Ｂ及び図３Ｄに示したように、Ｅ２Ｆ１の野生型３’ＵＴＲを含有するレポーター構築物によるｍｉＲ−１０６ｂ、あるいはＢＣＬ２Ｌ１１の野生型３’ＵＴＲを含有するレポーター構築物によるｍｉＲ−３２の共トランスフェクションは、前駆体マイクロＲＮＡ陰性対照と比較した場合、ルシフェラーゼレポーターの有意な抑制を生じた。３’ＵＴＲの非存在下でのマイクロＲＮＡによるレポーターの抑制はなかった。変異３’ＵＴＲの存在は、マイクロＲＮＡの効果を無効にするかあるいは減弱した。本結果は、３’ＵＴＲ標的配列への結合による、タンパク質翻訳に対するマイクロＲＮＡの直接効果と一致している。こうした機構は、ヒト結腸及び胃癌細胞における、ｍｉＲ−１０６ｂによるｐ２１／ＷＡＦ１の調節に対しても確立されている（１３、１４）。従って、ｍｉＲ−１０６ｂはＬＮＣａＰ細胞において、ＣＤＫＮ１Ａ ３Ｓ ＵＴＲ仲介機構によりルシフェラーゼレポーターを阻害することが観察された（図７）。
[000218]２２Ｒｖ１ヒト前立腺癌細胞における、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターによるカスパーゼ活性化の阻害
[000219]我々の以前のデータは、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１０６ｂ及びそれらの相同体（例えば、ｍｉＲ−２５）はＢｉｍ及びＥ２Ｆ１のアポトーシス促進性機能を標的とするので、それらは癌遺伝子として働くことができることを示している。ドキソルビシン及びエトポシドにより誘発されたアポトーシスに対するｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの影響を評価するため、非転移性ヒト前立腺癌細胞株である２２Ｒｖ１細胞を、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターをコードするレンチウイルス発現構築物に感染させた。カスパーゼ−Ｇｌｏアポトーシスアッセイを使用し、抗癌薬処理細胞において、このクラスターによるカスパーゼ３／カスパーゼ７活性化の有意な阻害を観察した（図８Ａ〜８Ｂ）。データは、前立腺癌細胞におけるｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターの抗アポトーシス機能と一致している。
[000220]アンドロゲン調節マイクロＲＮＡの同定
[000221]アンドロゲンは、前立腺の生理学及び腫瘍生物学において鍵となる役割を果たす。我々は、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ細胞において、アンドロゲンによるマイクロＲＮＡの調節を検討した。Ｒｌ８８１によるＤＵ１４５細胞の処理は、マイクロＲＮＡ発現において何ら有意な変化を与えなかった。対照的に、Ｒｌ８８１処理後、ＬＮＣａＰ細胞においては多数のマイクロＲＮＡの発現が有意に変化した（ＦＤＲ＜５％）（図１５−表６
）。
[000222]一つのマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−３３８が有意に上方調節された。ｍｉＲ−１２６−５、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ及びｍｉＲ１８１ｂ−ｌ、ｍｉＲ−１８１ｃ及びｍｉＲ−２２１クラスターの全てのメンバーを含む他のマイクロＲＮＡは下方調節された。培養ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ細胞におけるベースラインマイクロＲＮＡ発現の分析は、アンドロゲン応答性ＬＮＣａＰ細胞におけるよりも、アンドロゲン非応答性ＤＵ１４５細胞において、三つのマイクロＲＮＡクラスターの全てのメンバーが有意に高い発現を有していたことを明らかにした（ＦＤＲ＜５％）。
[000223] Genomatix転写因子結合部位データベースでのモチーフ検索を使用し、前記のマイクロＲＮＡが、それらの隣接領域に推定アンドロゲンレセプター結合部位を有することを見出した（図１６−表７）。さらに、１あるいは１０ｎｍｏｌ／Ｌ Ｒｌ８８１で１２、２４及び４８時間処理されたＬＮＣａＰ細胞での実験において、マイクロアレイ結果をさらに実証した。成熟ｍｉＲ−３３８及びｍｉＲ−２２１のｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、それらの発現レベルがアンドロゲン調節であることを示した（図９Ａ−９Ｂ）。
[000224]実施例Ｉの考察
[000225]我々は、前立腺腫瘍における特有のマイクロＲＮＡ発現シグネチャー及び腫瘍マイクロＲＮＡプロセッシングを調節する遺伝子発現の変化をここに発見した。さらに、マイクロＲＮＡの調節解除が、前立腺における転写体存在量及び標的ｍＲＮＡのタンパク質発現に影響することを見出した。細胞培養において、前立腺癌における候補オンコｍｉＲ、例えば、ｍｉＲ−３２及びｍｉＲ−１０６ｂが癌関連遺伝子のタンパク質発現を抑制することを示した。本結果は、ヒト前立腺発癌における変化したマイクロＲＮＡ発現の病因的役割と一致している。
[000226]これは、ヒト前立腺腫瘍で生じるマイクロＲＮＡ機能の変化を同定するため、マイクロＲＮＡ及びタンパク質コードＲＮＡ両方の大規模遺伝子発現プロファイリングを使用する最初の研究である。本研究の他の強みは、大きなサンプルサイズであり、そしてアフリカ系アメリカ人及びヨーロッパ系アメリカ人患者の両方を含むことである。それ故、本研究結果は米国において最も高い前立腺癌負担を有する二つの人種／民族群を代表するものである（３４）。
[000227]我々は、前立腺腫瘍におけるダイサー及びＤＧＣＲ８、及び高グリーソンスコアを有する腫瘍におけるダイサー及びＥＩＦ２Ｃ２（アルゴノート−２をコードする）の増加した発現を見出した。前立腺癌においてダイサーが上方調節されているという観察は最近の報告（３５）に一致しており、マイクロＲＮＡ前駆体を成熟マイクロＲＮＡにプロセッシングすることにおいて、前立腺腫瘍は正常前立腺組織よりもより効率的であり得ることを示している。マイクロＲＮＡのプロセッシング障害は、マウスにおいて腫瘍形成を増強することが最近示されており（８）、及び他の報告は、マイクロＲＮＡプロセッシングは一般に、癌において下方調節されていると仮定している（３６）。
[000228]しかしながら、前立腺腫瘍においては、前立腺癌細胞におけるダイサーの増加したタンパク質発現及び転移性疾患におけるダイサー及びＥＩＦ２Ｃ２の過剰発現を示した我々のデータ及び前記の研究（３５）により示されたように、増強されたマイクロＲＮＡプロセッシングの逆の効果が起こることもできる。
[000229]マイクロＲＮＡ発現プロファイルは、ヒト癌を分類する（１０；１４）。乳癌、結腸癌、肺癌及び膵臓癌を含むいくつかの上皮癌の特有のシグネチャーが報告されている（１１；１２；３７；３８）。他の二つの研究は、前立腺癌におけるマイクロＲＮＡ発
現を調べている（３９；４０）。Baylorの前立腺データ（４０）と一致して、我々は前立腺腫瘍においてｍｉＲ−４５が有意に下方調節されていることを観察した。しかしながら、これら二つの公表された研究は、我々の研究と比較した場合、かなり小規模でそしてわずかな腫瘍のみを検討している。
[000230]我々は、上方及び下方調節されたマイクロＲＮＡを含む腫瘍遺伝子シグネチャーを同定した。
[000231]最も高く上方調節されたマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−３２であり、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２００ｃ及びｍｉＲ−１９６ａが続いていた。過剰発現された腫瘍マイクロＲＮＡのリストはｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターも含んでおり、いくつかのヒト悪性腫瘍におけるｍｉｒ−２５、ｍｉＲ−９３及びｍｉＲ−１０６ｂのコピー数の観察された増加と一致している（４１）。
[000232]最も有意に下方調節されたマイクロＲＮＡにはｍｉＲ−５２０ｈ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９０及びｍｉＲ−ｌ−１３３ａクラスターが含まれる。
[000233]ヒト癌においてマイクロＲＮＡの変化した発現は、多数の研究で観察されている。腫瘍におけるマイクロＲＮＡの上方調節は普通であり（５、６、８）、多くのマイクロＲＮＡの既知の発癌活性と一致している（２２−２５）。上方調節の機構には、転写活性化及び遺伝子コピー数の増加が含まれる。成熟マイクロＲＮＡの存在量の減少は、最近示されたように（２６）、変化したプロセッシングから生じてもよく、それは成熟マイクロＲＮＡの無差別なより低い発現を導くであろう。本研究においてはそれは観察されなかった。もしくは、変異又はゲノム変化（２１）又はマイクロＲＮＡ座位エピジェネティックサイレンシング（２７、２８）のためにマイクロＲＮＡ発現を失う可能性もある。エピジェネティックサイレンシングは、前立腺癌において重要な機構であり（２９）、将来の研究は、この機構が前立腺腫瘍においてマイクロＲＮＡ発現を遅らせているかどうかに取り組まなければならないであろう。
[000234]これらのマイクロＲＮＡの大部分の機能についてはほとんど知られていない。ｍｉＲ−３２はｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−３６３及びｍｉＲ−３６７の相同体である。これらのマイクロＲＮＡのいくつかも、前立腺腫瘍において上方調節されている。ｍｉＲ−３２は結腸及び膵臓癌で増加しており（１０）、ヒト細胞の抗ウイルス防御のメディエーターである（４２）。既知の前立腺癌感受性遺伝子のいくつかが宿主防御にも関与するので（４３）、その変化した発現及び前立腺癌発生の間にｍｉＲ−３２のこの機能が関連している可能性がある。他のマイクロＲＮＡについて示されたように、ｍｉＲ−３２は標的遺伝子のタンパク質発現を調節するはずである。
[000235]ｍｉＲ−３２が、ＢＣＬ−２ファミリーのアポトーシス促進性メンバー、Ｂｉｍ（４４）の発現を抑制するという新たな観察がなされた。Ｂｉｍはハプロ不全であり、一つのアレルの不活性化がＭｙｃ誘発腫瘍形成を促進するのに十分である（４５）。Ｂｉｍは、上皮腫瘍のアポトーシスに重要な役割を果たし、化学療法の抗腫瘍効果を仲介する（４６）。それ故、ｍｉＲ−３２によるＢｉｍの下方調節は、腫瘍環境のアポトーシス刺激への腫瘍細胞の抵抗性に寄与することができる。
[000236]既知の機能を有する他の注目に値するマイクロＲＮＡには、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ及びｍｉＲ−１９６ａが含まれる。ｍｉＲ−ｌ−１３３ａクラスターは、筋細胞で優先的に発現され、細胞分化を調節することが示されている（４７；４８）。ｍｉＲ−１は、乳癌における転移の抑制因子であるｍｉＲ−２０６の相同体である（３４）。ｍｉＲ−１が前立腺腫瘍において下方調節されているという発明者の発見は、その相同体の腫瘍抑制因子機能と一致している。
[000237]ｍｉＲ−１を試験し、前立腺腫瘍及び培養前立腺癌細胞において、このマイクロＲＮＡの発現が、エクスポーチン−６及びタンパク質チロシンキナーゼ９（Ａ６／ツインフィリンとも名付けられている）の発現と逆相関していることを観察した。これら二つの遺伝子の機能についてはあまり知られていないが、最近のデータは両方とも細胞アクチン動態を調節していることを示唆している（４９−５１）。ｍｉＲ−１９６ａはＨＯＸＢ８の抑制因子として同定されており（５２）、ｍｉＲ−１９６ａの上昇した発現は膵臓癌において悪い生存率を予測する（３８）。このマイクロＲＮＡは、我々の研究の腫瘍シグネチャー及び前立腺外進展シグネチャーの両方に共通であり、前立腺癌でのｍｉＲ−１９６ａの上方調節は、疾患進行の因子であり得ることを示している。
[000238]マイクロＲＮＡシグネチャーは、ヒト癌において診断的及び予後診断的意義の両方を有していることが示されてきた（１３；３８；５３；５４）。
[000239]マイクロＲＮＡと、患者の腫瘍診断、前立腺外進展、グリーソンスコア及び人種／民族性の関連性を調べることにより、前立腺癌におけるマイクロＲＮＡ発現の診断的及び予後診断的意義を決定した。アフリカ系アメリカ人患者及びヨーロッパ系アメリカ人患者の腫瘍マイクロＲＮＡシグネチャーを、これら二つの患者群間で腫瘍生物学における差異が存在してもよいという最近の証拠（５５）が現れたので比較した。マイクロＲＮＡ発現の大きな差異が前立腺の腫瘍と非腫瘍組織間で見出されたが、前立腺（prostate gland）から広がった腫瘍及び広がっていない腫瘍間、＞７のグリーソンスコアを有する腫瘍及びスコア＜７を有する腫瘍間、アフリカ系アメリカ人患者及びヨーロッパ系アメリカ人患者からの腫瘍間では相対的に少数のマイクロＲＮＡしか差次的に発現されなかった。
[000240]さらに、４マイクロＲＮＡから成る７プローブセットシグネチャーが、腫瘍及び非腫瘍前立腺組織を区別できるＰＡＭにより同定された。しかしながら、ＰＡＭ分析は、前立腺外進展、グリーソンスコア又は人種／民族性については良好な分類指標を作り出せなかった。
[000241]我々は、低誤差で前立腺外疾患進展に関連していた一つのマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−１０１を同定した。このマイクロＲＮＡの機能は、未知である。我々は前立腺腫瘍の特有の不均一性が、前立腺癌の好ましくない予後因子に関連するより多くのマイクロＲＮＡの発見を妨げていると確信している。
[000242]マイクロＲＮＡの遺伝子位置の解析は、腫瘍における変化したマイクロＲＮＡ発現を引き起こすそれらの推定機能及び機構についての手掛かりを提供し得る（５６）。最近の研究は、マイクロＲＮＡが高頻度でタンパク質コード遺伝子のイントロン内に位置し、これらの宿主遺伝子と共発現されることを示している（２８；２９）。我々は、前立腺腫瘍における宿主遺伝子発現を調べ、それらのいくつかが前立腺腫瘍において増加したことを見出した。Ｃ９ｏｒｆ５及びＭＣＭ７は、二つの最も高く上方調節された宿主遺伝子であり、それらの発現は、それぞれイントロンマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−３２及びｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターと相関していた。本データは、前立腺腫瘍における宿主遺伝子の上方調節及び同時転写されたマイクロＲＮＡを導く共通の機構を示唆する。
[000243]癌におけるＣ９ｏｒｆ５の役割は知られていないが、ＭＣＭ７増幅は以前に前立腺癌と関連付けられている。ＭＣＭ７座位は、癌再発の症例の８８％において増幅されていることが見出されている（５７）。ＭＣＭ７過剰発現は前立腺癌に限定されておらず、子宮頸癌を含む他の悪性腫瘍において観察されている（５８）。
[000244]前立腺癌細胞においてｍｉＲ−１０６ｂがＥ２Ｆ１及びＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１をコードする）を標的としているかどうかを検討し、これらの遺伝子のタンパク質発現がｍｉＲ−１０６ｂにより抑制されていることを見出した。ｍｉＲ−１０６ｂ−
２５クラスターは、候補ヒト癌遺伝子である二つの他のマイクロＲＮＡクラスター、ｍｉＲ−１７−９２クラスター及びｍｉＲ−１０６ａ−３６３クラスターと広範囲な相同体を有している（１５；５９；６０）。Ｅ２Ｆ１は、ｍｉＲ−１７−９２クラスター中のｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−２０ａの標的でもあり（３２）、癌遺伝子及び腫瘍抑制因子機能の両方を有している（６１；６２）。Ｂｉｍ同様、翻訳されたＥ２Ｆ１はアポトーシス促進性であり、腫瘍抑制因子ｐ５３と協同してアポトーシスを仲介する（６３）。その過剰発現は、ＬＮＣａＰ細胞においてアポトーシスを誘発し（６４）、ｍｉＲ−１０６ｂによるＥ２Ｆ１翻訳の阻害は、腫瘍環境においてアポトーシスから前立腺癌細胞を保護し得ることを示す。
[000245]ｐ２１／ＷＡＦ１は、ｐ５３腫瘍抑制のメディエーターである（６５）。前立腺癌におけるｐ２１／ＷＡＦ１の増殖阻害効果が示されており（６６）、それは、抗癌剤に応答して前立腺癌細胞の細胞周期停止を仲介する（６７；６８）。我々はｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターが抗アポトーシス活性を有しているかどうか試験し、それが２２Ｒｖ１細胞において、ドキソルビシン及びエトポシドによるカスパーゼ活性化を阻害することを見出した。
[000246]これらのデータは、Ｅ２Ｆ１及びｐ２１／ＷＡＦ１タンパク質発現を抑制するその能力のため、一部、前立腺癌におけるｍｉＲ−１０６ｂの発癌機能と一致している。
[000247]ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−３２又はｍｉＲ−１０６ｂ−２５クラスターのいずれも、ＬＮＣａＰ細胞のアンドロゲン刺激により調節されなかった。しかしながら、我々はアンドロゲン処理により上方又は下方調節されたいくつかの他のマイクロＲＮＡを同定した。これらには中でも、ｍｉＲ−３３８及びｍｉＲ−１２６、及びｍｉＲ−１８１ｂ−ｌ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−２２１クラスターが含まれていた。モチーフ検索は、これらのマイクロＲＮＡが、それらの隣接領域に推定アンドロゲンレセプター結合部位を有していることを示した。
[000248]ｍｉＲ−３３８は、唯一の有意に上方調節されたマイクロＲＮＡであった。このマイクロＲＮＡの機能についての報告はないが、それは３つの上皮癌で頻繁にコピー数増加を伴う領域に位置している。
[000249]ｍｉＲ−１８１ファミリーメンバーは造血系分化に影響し（６９）、それらの発現は、白血病及びいくつかの固形腫瘍で変化している（１０；３１）。ｍｉＲ−２２１クラスターは、ｐ２７Ｋｉｐｌ腫瘍抑制因子を調節することが見出されており、前立腺癌において発癌性を有することができる（７０；７１）。しかしながら、本クラスターは、癌遺伝子ｃ−Ｋｉｔ及び血管形成も阻害する（７２）。
[000250]特異的マイクロＲＮＡにより調節されているタンパク質コード遺伝子の同定は、マイクロＲＮＡ標的を予測するためのコンピューターアプローチの開発にもかかわらず、困難であることが証明されている（７３；７４）。標的ｍＲＮＡを発見する能力は、マイクロＲＮＡの標的選択性が細胞内微小環境に依存してもよいという事実によりさらに複雑化される。
[000251]我々は、探索型アプローチを使用し、前立腺組織におけるマイクロＲＮＡ発現とｍＲＮＡ発現間の相関分析を行った。理論に縛られるわけではないが、本発明者は、このアプローチは、もし問題とするマイクロＲＮＡが標的ｍＲＮＡの転写体存在量に影響するならば成功するであろうが、もし標的遺伝子が翻訳抑制によってのみ調節されているならば、それは失敗するであろうと考えている。
[000252]ｍｉＲ−１の発現が、前立腺腫瘍において、いくつかのコンピューターにより
予測された標的遺伝子、例えば、ＸＰＯ６と逆相関していることが見出された。しかしながら、腫瘍ｍｉＲ−１発現が予測標的、例えば、ＰＴＫ９の転写体レベルと正に相関していたことも見出した。細胞培養におけるこれらの観察の続いての検証は、前立腺癌細胞において、ＸＰ０６及びＰＴＫ９は両方ともｍｉＲ−１により調節されていることを確証した。
[000253]データは、３’ＵＴＲ配列へのマイクロＲＮＡの結合が哺乳類細胞における標的化されたｍＲＮＡの分解及び蓄積両方を導くことができ、そしてヒト組織におけるマイクロＲＮＡとｍＲＮＡ間の逆及び正の相関の両方がマイクロＲＮＡ標的遺伝子を示し得る、新しい証拠を提供する。よって、ヒト組織におけるマイクロＲＮＡ及びｍＲＮＡ発現の相関分析は、マイクロＲＮＡによって調節されるｍＲＮＡの同定において有用であると証明するだろう。
[000254]ヒト前立腺腫瘍で生じ、及びこれらの組織におけるタンパク質コード遺伝子の発現変動と相関するマイクロＲＮＡ発現の変化がここに同定された。細胞培養における実験は、腫瘍マイクロＲＮＡがヒト前立腺癌細胞における癌関連遺伝子の発現を調節し得ることを示した。これらの結果は、前立腺癌生物学におけるマイクロＲＮＡの病因的役割を示している。
[000255]実施例ＩＩ
[000256]序
[000257]前立腺癌は、米国人男性において最も頻繁に悪性腫瘍と診断され、２番目に高頻度の癌死亡率の原因である［１］。死亡率は、前立腺を越えた癌細胞の拡散が寄与しているのであろう。神経周囲浸潤（ＰＮＩ）は、前立腺癌における局所浸潤の主要経路であり、疾患の前立腺外拡散の機構でもある［２］。さらに、ＰＮＩの予後重要性は議論の余地が残されている［３〜５］。いくつかの研究が、ＰＮＩと転帰不良のマーカーの関連性を観察しているが［２，６〜８］、他者は、それが前立腺癌の予後因子であることを見出していない［９〜１２］。
[000258]ＰＮＩの発生は、臨床疾患の発生の相対的に初期のイベントであり、根治的前立腺切除術からのほとんどの腫瘍試料はＰＮＩ陽性である［２］。臨床サンプルにおけるこのＰＮＩの高出現率（８５％〜１００％）及びその生物学の不適切な知識が、前立腺癌進行及び該疾患の転帰におけるＰＮＩの役割についての我々の理解を制限している。
[000259]ＰＮＩは、癌細胞が神経に接着しそして周りを包むプロセスである［１３，１４］。それは、膵臓、頭部及び頸部癌を含む、多くの他のタイプの癌において発生する［１５，１６］。神経周囲位置を有する前立腺癌細胞は、生存及び増殖優位性を獲得し、神経から離れて位置する細胞と比較した場合、減少したアポトーシス及び増加した増殖を示す［１７，１８］。前立腺癌細胞及び隣接した神経の両方で、接着分子の変化した発現がＰＮＩで観察されており、これらの分子の変化した発現が、神経の近くで癌細胞がよく成長することを可能にする［１４，１９］。
[000260]それにもかかわらず、ＰＮＩを導く分子機構は、依然として不明なところが多いままである。
[000261]実施例ＩＩにおいて、発明者は、ヒト前立腺癌におけるＰＮＩに関連する遺伝子発現変化を同定するため、マイクロＲＮＡ及びタンパク質コード遺伝子両方の遺伝子発現プロファイルを適用した。発明者は、非ＰＮＩ腫瘍からＰＮＩを識別する遺伝子発現シグネチャーが、非侵襲性腫瘍からＰＮＩを有する腫瘍への移行時に起こる分子変化を明らかにするであろうかを調べた。癌におけるマイクロＲＮＡの重要な役割が示されてきているので［２０，２１］、マイクロＲＮＡをアッセイした。それらの発現プロファイルは、
発生系列及び分化状態で腫瘍を分類した［２２，２３］。
[000262]実施例ＩＩの材料及び方法
[000263]組織サンプル
[000264]凍結腫瘍試料は、NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource（ＣＰ
ＣＴＲ）から得られた。腫瘍は、前立腺切除術に先だっては何の治療も受けていない腺癌を切除した。マクロ解剖腫瘍試料は病理学者により再検討され、凍結標本中の腫瘍の存在が確認された。全ての組織は、２００２年から２００４年の間に採取された。組織採取は、関与施設の治験審査委員会により認可された。
[000265]ＲＮＡ抽出
[000266]全ＲＮＡは、製造者の取扱説明書に従い、ＴＲＩＺＯＬ試薬を使用して分離した（Invitrogen, Carlsbad, CA）。各サンプルについてのＲＮＡの完全性は、Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）で確認した。各ＲＮＡサンプ
ルは次ぎに、２分割量に分け、マイクロＲＮＡマイクロアレイ又はｍＲＮＡマイクロアレイのために処理した。
[000267]遺伝子マイクロアレイ
[000268]マイクロＲＮＡ標識及びハイブリダイゼーションは、以前に記載した如く実施した［２４］。マイクロＲＮＡマイクロアレイ（Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Version 3.0）は、２３５のヒト及び２２２のマウスマイクロＲＮＡについて四通りにスポットされたプローブを含む［２４］。ｍＲＮＡの標識及びハイブリダイゼーションは、Affymetrix標準プロトコルに従って実施した(Santa Clara,CA)。簡単には、全ＲＮＡの５μｇを、５’末端にＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するオリゴ（ｄＴ）プライマーで逆転写した。第二鎖合成にｃＲＮＡ生成が続き、Enzo Life Sciences（Farmingdale,NY）からのBioArray High Yield RNA Transcript Labeking Kit T3を使用してビオチン化リボヌクレオチドを取り込ませた。標識化ｃＲＮＡは断片化し、Affymetrix GeneChip HG-U133A 2.0アレイにハイブリダイズさせた。このアレイは、およそ１３，０００のヒトタンパク質コード遺伝子を提示する２２，２８３のプローブセットを含む。ハイブリダイゼーションシグナルは、フィコエリトリン−コンジュゲートストレプトアビジン（Invitrogen）で可視化し、GeneChip Scanner 3000 7G（Affymetrix）を使用してスキャンした。Minimum Information About a Microarray Experiment（ＭＩＡＭＥ）ガ
イドラインに従って我々は、マイクロアレイデータ及び追加の患者情報のＣＥＬファイルをＧＥＯリポジトリー（ncbi.nlm.nih.zov/aeo/）に寄託した。マイクロＲＮＡ及びｍＲ
ＮＡプロファイリングデータ両方のＧＥＯ提出受入番号は、ＧＳＥ７０５５である。特別注文のマイクロＲＮＡマイクロアレイ、バージョン２．０についての追加の情報は、ＡrrayExpress受入番号：Ａ−ＭＥＸＰ−２５８に見ることができる。
[000269]データ正規化及び統計分析
[000270]中央値−中心（Median-centric）正規化を、特別注文のマイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドチップに対して使用した。Affymetrixチップは、ロバストマルチチップ分析（robust multichip analysis）（ＲＭＡ）法［２５］を使用して正規化した。有意に差
次的に発現された遺伝子のリストを生成するため、生じたデータセットをマイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）法［２６］にかけた。両側ｔ検定及び意図された誤検出率（false discovery rates（ＦＤＲ））からの両方のＰ値に基づいて遺伝子リストを生成した。
ＦＤＲ計算は、Storey and Tibshirani［２７］により記載されている方法に従った。教
師なし（Unsupervised）階層的クラスター分析は、Eisen et al．［２８］により記載さ
れている原理に従って実行した。
[000271]マイクロＲＮＡ及びｍＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ分析
[000272] 成熟マイクロＲＮＡの存在量は、公開されたプロトコル［２９］に従って、
ステムループTaqMan（商標）マイクロＲＮＡアッセイキット（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用して測定した。製造元の取扱説明書に従って、１０ｎｇの全ＲＮＡ
を使用し、TaqMan（商標）マイクロＲＮＡアッセイキットからの成熟マイクロＲＮＡ特異的ループ化プライマー及びTaqMan（商標）マイクロＲＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems）からの試薬を使用し、成熟ＲＮＡを５’−伸長ｃＤＮＡに逆転写した。Applied Biosystems Taqman 2X Universal PCR マスター混合物及び問題とする各マイクロＲＮＡに
ついて適切な5X TaqMan（商標）マイクロＲＮＡアッセイ混合物で、ｃＤＮＡに対するリ
アルタイムＰＣＲを実行した。３重の反応物をApplied Biosystems 7500リアルタイムＰ
ＣＲシステム内の９６ウェルプレート中、９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒及び６０℃で１分を４０サイクル、インキュベートした。各サンプルについて、閾値サイクル（Ｃｔ）をABI 7500配列検出システムソフトウェアにより算出した。検量線をサンプル中のマイクロＲＮＡ濃度を決定するために使用し、それは次ぎにＵ６ ＲＮＡで正規化した。ｍＲＮＡの存在量は、以前に記述した定量的リアルタイム（ｑＲＴ）ＰＣＲ法［３０］に従って決定した。従って、全ＲＮＡの１００ｎｇを、High-Capacity cDNA Archiveキット（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用し、逆転写した。続いて、検証されて
いる遺伝子に特異的な、前もって最適化されたプローブ及びプライマーセットを含む、TaqMan遺伝子発現アッセイ（Applied Biosystems）を使用してｑＲＴ−ＰＣＲを３重に実施した。検証された遺伝子のアッセイＩＤ番号は、以下の通りである：メタロチオネイン１ＦについてＨｓ００７４４６６１＿ｓＨ及びメタロチオネイン１ＭについてＨｓ００８２８３８７＿ｇｌ。データは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）７５００配列検出システムを使用して集めた。１８ＲＮＡは、内部基準として用いた。正規化発現は、記述されているように比較ＣＴ法を使用して計算し、倍率変化は、各遺伝子の２−ΔΔＣｔ値から導いた［３０］。
[000273]免疫組織化学
[000274]神経周囲及び非神経周囲癌細胞におけるタンパク質発現は、ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍切片上で、免疫組織化学的に評価した。腫瘍（ｎ＝３０）は、Baltimore VA Hospital 及びメリーランド大学医療センターで根治的前立腺切除術によって治療された前立腺患者からのものである。５ミクロン切片を免疫組織化学的に、神経幹のためのマーカー、Ｓ１００について染色し、ＰＮＩの領域を視覚化した。１４の腫瘍からの切片が神経周囲及び非神経周囲癌細胞を有する代表的領域を含有することが見出された。抗原回復のため、脱パラフィン切片を１ｘ Citra緩衝液（Biogenex, San Ramon, CA）中で
マイクロ波処理した。免疫組織化学的染色は、Dako Envision システム（DakoCytomation, Carpinteria, CA）で実行した。以下の一次抗体を使用した：Ｓ１００のための１：５
００希釈ウサギポリクロナール抗体（Ventana, Tucson, AR）；コクサッキーアデノウイ
ルスレセプター（ＣＸＡＤＲ）のための１：１０００希釈マウスモノクロナール抗体（Atlas Antibodies, Stockholm, Sweden）；及びメタロチオネインのための１：５００希釈
マウスモノクロナール抗体（DakoCytomation）。この抗体（Ｅ９）はメタロチオネイン−１及び−２ファミリーメンバーを認識する（＃Ｍ０６３９）。陽性対照：腸（ＣＸＡＤＲ）及び肝臓（メタロチオネイン）。一次抗体を除いたものが陰性対照であった。マイクロアレイ結果を知らされていない病理学者が神経周囲及び非神経周囲癌細胞の免疫染色の強度を評価し、非神経周囲癌細胞と比較した場合、神経周囲癌細胞中でより弱い、同じ、より強いと分類した。代表的領域のイメージをとり、発現差異を記録した。
[000275]インサイツハイブリダイゼーション
[000276]インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を、GenPoint(商標) 触媒シグ
ナル増幅システム (DakoCytomation)を使用して、製造業者プロトコルに従って実行した
。簡単には、スライドを６０℃で３０分インキュベートし、記述されているように脱パラフィンした。切片を、プロテイナーゼＫ（DakoCytomation）で、室温で３０分処理し、ｄ
Ｈ２Ｏで数回濯ぎ、風乾前に９５％エタノールに１０秒浸漬した。スライドを、インサイツハイブリダイゼーション緩衝液（Enzo Life Sciences, Inc. Farmingdale, NY）で１時間、５４℃にてプリハイブリダイズした後、５０ｎＭの最終濃度の５’ビオチン標識ｍｉＲ−２２４ miRCURY（商標）ＬＮＡ検出プローブ（Exiqon, Woburn, MA）又はスクラン
ブル陰性対照プローブ（Exiqon）のいずれかを含有する緩衝液中、５４℃で一晩インキュベーションした。スライドは、ＴＢＳＴ及びGenPoint（商標）ストリンジェント洗浄溶液（５４℃で３０分）の両方で洗浄した。スライドは次ぎにＨ２Ｏ２ブロッキング溶液（DakoCytomation）に２０分暴露し、そしてさらにブロッキング緩衝液（DakoCytomation, X0909）中で３０分ブロックした後、製造業者プロトコルに従って一次ストレプトアビジン
−ＨＲＰ抗体、ビオチニル−チラミド、二次ストレプトアビジン−ＨＲＰ抗体及びＤＡＢ色素原溶液に暴露した。スライドは次ぎに短時間ヘマトキシリン中で対比染色し、マウント前にＴＢＳＴ及び水の両方ですすいだ。病理学者は、免疫組織化学で使用されたものと同一の基準を用いて神経周囲及び非神経周囲癌細胞中のｍｉＲ−２２４のＩＳＨ強度を評価した。
[000277]パスウェイ解析
[000278]この解析は、自家製ＷＰＳソフトウェア［３１］で実行した。パスウェイは、ジーンオントロジーバイオロジカルプロセス（ＧＯＢＰ）（Gene Ontology Consortium:geneontology.org）に従ってアノテートした。我々のデータベースは、ＧＯＢＰについて
アノテートされた１６，７６２ヒト遺伝子を有していた。遺伝子は、マイクロアレイ上のそれらの対応するプローブセットのＦＤＲ（＜３０％）に基づいてパスウェイ解析内に含ませた。もしいくつかのプローブセットが同一の遺伝子をコードしていたならば、ソフトウェアはこれを認識し、該遺伝子はパスウェイレベルでの有意性試験について一度のみ計数されることを保証された。どの生物学的プロセスが差次的に発現された遺伝子の統計的に有意な富化を有していたかを決定するため、片側フィッシャーの直接確率検定を使用した（Ｐ＜０．０５）。クラスター解析のためにフィッシャーの直接確率検定結果をコンパイルし、結果をカラーコード化ヒートマップに示し、有意に変化した生物学的プロセスのパターンを明らかにした。ヒートマップのカラーコーディングは、生物学的プロセスにおける遺伝子の富化に関係し（−Ｌｏｇ（Ｐ値）−基づいて）、赤い色はより高い富化を示している。
[000279]実施例ＩＩの結果
[000280]臨床サンプル及び遺伝子発現分析
[000281]我々は５７前立腺癌患者の根治的前立腺摘除術からのマクロ解剖腫瘍試料を集めた（図２２−表８）。腫瘍の７つ（１２％）は、ＰＮＩについて陰性であった。文献と一致して、これらの腫瘍は、ＰＮＩ陽性腫瘍よりもより小さなサイズ及びより低いグリーソンスコアを有していた。加えて、すべてのＰＮＩ陰性腫瘍は前立腺に限定されていた。我々は、ＰＮＩを有する腫瘍及びＰＮＩについて陰性であった腫瘍間の遺伝子発現差異を調べた。これらの腫瘍からの遺伝子発現プロファイルは、２３５のヒトマイクロＲＮＡを示す特別注文のマイクロＲＮＡマイクロアレイ及びおよそ１３，０００ヒトタンパク質コード遺伝子を示すAffymetrix GeneChip HG-U133A 2.0アレイの両方を使用して生成された。
[000282]我々のデータセットの初期解析において、マイクロＲＮＡ及びｍＲＮＡの発現がＰＮＩを有する腫瘍及びＰＮＩのない腫瘍間を識別し得るかどうかを試験するため、教師なし階層的クラスター分析を応用した。ｍＲＮＡの広範囲の発現に基づいた階層的クラスター分析は、非ＰＮＩ症例からＰＮＩ症例を分離できなかった（データは示していない）。しかしながら、これらのサンプルのマイクロＲＮＡの発現パターンは、特有のマイクロＲＮＡプロファイルを有する二つの卓越したクラスターを与えた（図１７Ａ−１７Ｂ）。クラスター＃１は全ての非ＰＮＩ腫瘍及びＰＮＩを有する腫瘍のサブグループを含有し
ていた。クラスター＃２は、有意にクラスター＃１中の腫瘍よりも高いグリーソンスコア（≧７）及び前立腺外疾患進展を有するようである（Ｐ＜０．０５，それぞれ；両側フィッシャーの直接確率検定）。
[000283]マイクロアレイの有意性分析データは、１９マイクロＲＮＡ及び３４タンパク質コード遺伝子がＰＮＩと非ＰＮＩ腫瘍間で有意に差次的に発現された（ＦＤＲ＜１０％で）ことを明らかにした。この閾値では全てのマイクロＲＮＡはＰＮＩを有する腫瘍において上方調節されており（図２３−表９）、一方、全てのｍＲＮＡは、非ＰＮＩ腫瘍よりＰＮＩ腫瘍においてより低い発現を有していた（図２４−表１０）。
[000284]差次的に発現されたマイクロＲＮＡのこのリストは、我々のデータセットのＰＮＩと非ＰＮＩ腫瘍間の比較で独特であった。これらのマイクロＲＮＡのいずれも、腫瘍グレード又はステージによっては、有意に差次的に発現されなかった（ＦＤＲ＜３０％）。ＰＮＩと非ＰＮＩとの比較とは対照的に、非常に少数のマイクロＲＮＡのみが、高（合計スコア７〜９）及び低（合計スコア５〜６）グリーソンスコア間（例えば、ｍｉＲ−１は、高グリーソンスコアを有する腫瘍中において下方調節されていた）及び器官限局性腫瘍及び前立腺外進展を有する腫瘍間で有意に差次的に発現された。ＰＮＩ及び非ＰＮＩ腫瘍間で差次的に発現されたタンパク質コード遺伝子の中で、多くはメタロチオネイン（メタロチオネインＩＦ、ＩＧ、ＩＨ、ＩＭ、ＩＸ、２Ａ）あるいはミトコンドリア局在性のタンパク質（４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、フェロケラターゼ、長鎖アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｌ３９／Ｓ１）をコードする。これらの遺伝子の下位集団も、低グリーソンスコア腫瘍と比較した場合、高グリーソンスコアを有する腫瘍において下方調節されていた（図１９Ａ−１９Ｄ）。腫瘍ステージにより差次的に発現された遺伝子との重複はない。
[000285]ｑＲＴ−ＰＣＲによるマイクロアレイデータの検証
[000286]五つのマイクロＲＮＡ及び二つのｍＲＮＡが、ｑＲＴ−ＰＣＲによる検証のために選択された（図２５−表１１）。マイクロアレイデータと一致して、非ＰＮＩ腫瘍と比較した場合、ＰＮＩ腫瘍において成熟ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ及びｍｉＲ−１００の有意に高い発現が観察された。メタロチオネイン１Ｍ及び１Ｆの転写体レベルは、非ＰＮＩ腫瘍と比較した場合、ＰＮＩ腫瘍において有意に低く、それも我々のマイクロアレイデータと一致していた。
[000287]ＰＮＩ状態で差次的に発現されたタンパク質コード遺伝子のパスウェイ関連性
[000288]そのｍＲＮＡがＰＮＩ及び非ＰＮＩ腫瘍間で差次的に発現された（ＦＤＲ＜３０％）ＧＯＢＰアノテート遺伝子（ｎ＝６２）に基づいたパスウェイ解析を実行した。本解析は、ＰＮＩ腫瘍を非ＰＮＩ腫瘍と比較して差次的に発現された遺伝子について富化されたいくつかの生物学的プロセスを明らかにした。最も多く有意に変化した生物学的プロセスには、有機（カルボン）酸／脂肪酸、アミノ酸及び（ポリ）アミンの輸送及び代謝が含まれる（図２６−表１２）。これらは「神経発生」の生物学的プロセスも含んでおり、ＰＮＩにおける腫瘍細胞と神経間の既知の相互作用と一致する。
[000289]腫瘍ＰＮＩ状態（ＰＮＩ陽性対ＰＮＩ陰性）によるが、グリーソンスコア（高対低グリーソンスコア）、病理学的ステージ（ｐＴ３対ｐＴ２）又は前立腺外進展の存在（イエス対ノー）にはよらずに差次的に発現された遺伝子について富化された生物学的プロセスを同定するために、クラスター分析を実行した。ヒートマップにより示されるように、本解析はＰＮＩ陽性とＰＮＩ陰性腫瘍と比較して差次的に発現された遺伝子について富化されたいくつかの生物学的プロセスを同定した（図１８）。これらの生物学的プロセスには、前記の有機（カルボキシの）酸／脂肪酸、アミノ酸及び（ポリ）アミンの代謝及び輸送以外に、プログラム化された細胞死の負の調節に関連するプロセスも含まれる。
[000290]神経周囲癌細胞におけるメタロチオネイン、コクサッキーアデノウイルスレセプター及びｍｉＲ−２２４の発現
[000291]マイクロアレイに基づいた分析は、ＰＮＩ及び非ＰＮＩ腫瘍はそれらの遺伝子発現パターンが異なっていることを示したが、このアプローチは神経周囲及び非神経周囲癌細胞におけるこれらの遺伝子の発現に関しては有益ではない。神経周囲及び非神経周囲癌細胞における、二つのタンパク質コード遺伝子、メタロチオネイン（メタロチオネイン−１及び−２）及びコクサッキーアデノウイルスレセプター（ＣＸＡＤＲ）、及びｍｉＲ−２２４の相対的発現を調べるため、免疫組織化学及びインサイツハイブリダイゼーションを使用した。免疫組織化学は神経周囲及び非神経周囲癌細胞の代表的領域を含有する１４の腫瘍からの切片に対して実施した。インサイツハイブリダイゼーションは１１の腫瘍からの切片に対して実施した。
[000292]メタロチオネイン、ＣＸＡＤＲ及びｍｉＲ−２２４は、腫瘍上皮に発現されていることが見出された（図１９Ａ−１９Ｄ、図２０Ａ−２０Ｄ及び図２１Ａ−２１Ｄ）。メタロチオネイン（上皮、細胞質、核）及びＣＸＡＤＲ（上皮、膜性、細胞質）の標識パターンは、他の研究者により記載されたものと一致した［３２，３３］。同一の組織の非神経周囲癌細胞と比較した場合、メタロチオネイン及びＣＸＡＤＲのより低い発現が、それぞれ６腫瘍（４３％）及び７腫瘍（５０％）の神経周囲癌細胞において観察された（図１９Ａ−１９Ｄ、図２０Ａ〜２０Ｄ）。一つ（７％）を除いて他の腫瘍中では相違は観察されず、そこではメタロチオネインの発現が、非神経周囲癌細胞よりも神経周囲癌細胞においてより高くスコア化されていた。神経周囲癌細胞において著しく増加したｍｉＲ−２２４の発現が４腫瘍（３６％）で観察された（図２１Ａ〜２１Ｄ）。こうした差異は他の７腫瘍においては観察されず、ｍｉＲ−２２４発現の大部分は低く、腫瘍上皮では検出されない。
[000293]実施例ＩＩの考察
[000294]ＰＮＩ及び非ＰＮＩ腫瘍の遺伝子発現プロファイルを調べ、それらの間のマイクロＲＮＡ及びｍＲＮＡ発現に有意な差異を見出した。最も際だっては、２３５マイクロＲＮＡの発現に基づいた教師なし階層的クラスター分析から二つの主な腫瘍クラスターが得られ、その一つは全ての非ＰＮＩ腫瘍を含んでいた。１３，０００のタンパク質コード転写体の発現に基づいてはこうした分類は達成できず、前立腺癌において局所浸潤に関連するｍＲＮＡ発現シグネチャーを見出せなかった他の研究に一致する［３４］。
[000295]我々の発見は、非ＰＮＩ腫瘍と比較した場合、マイクロＲＮＡ発現は、ｍＲＮＡ発現よりもＰＮＩ腫瘍のより特有な特色である可能性があることを示している。これらの発見は、発生系列及び分化状態により腫瘍を分類することにおいて、マイクロＲＮＡ発現プロファイルはｍＲＮＡ発現プロファイルよりも優れていることが可能であることを示している以前の報告と一致している［２２，２３］。
[000296]１９のマイクロＲＮＡが、非ＰＮＩ腫瘍よりもＰＮＩ腫瘍においてより高い発現であることが見出されている。それらの内、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−２１、及びｍｉＲ−１２５ｂは、候補癌遺伝子である［３５−３７］。さらに、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２２４は、ヒト前立腺癌において増加した遺伝子発現を有することが見出されている悪性度関連染色体領域に位置している［３８］。前立腺癌を含むいくつかのヒト固形癌に共通なマイクロＲＮＡ発現シグネチャーが記載されている［２３］。その研究及び我々のＰＮＩシグネチャー間で共有されているマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２４、及びｍｉＲ−３０ｃである。しかしながら、最も注目すべきは、ＰＮＩシグネチャーと、実験条件下で発見された他のマイクロＲＮＡシグネチャーとの重複である。
[000297]低酸素は、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−２７、及びｍｉＲ−１８１を誘発することが発見されている［３９］。これらのマイクロＲＮＡもＰＮＩ腫瘍において上方調節されている。さらにより重要なことは、ＰＮＩシグネチャーとＬＰＳ処理されたマウスの肺の炎症によって誘起されたマイクロＲＮＡシグネチャー間の類似性である。ここで、ＬＰＳは、いくつかの他のマイクロＲＮＡの中で、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１００及びｍｉＲ−２２４を誘発する［４０］。それ故、観察されたＰＮＩマイクロＲＮＡシグネチャーは、一部、炎症促進性環境及び癌性前立腺における低酸素の結果であり得る。
[000298]ＰＮＩシグネチャーにおける腫瘍グレード及びステージによる交絡効果の可能性を評価するため、ＰＮＩと非ＰＮＩ腫瘍間で差次的に発現されたマイクロＲＮＡのリストと、高及び低グリーソンスコア腫瘍及び器官限局性腫瘍と前立腺外進展を示した腫瘍を比較している同じリストを比較した。この追加の分析は、ＰＮＩシグネチャーはこれら二つの対比により共有されていないことを明らかにした。その代わり、非常に少数のマイクロＲＮＡのみが、腫瘍グレード及びステージにより有意に差次的に発現されていることが見出された。前立腺腫瘍の不均一性は、これら二つの予後因子に関連するマイクロＲＮＡシグネチャーを発見する我々の能力を制限することができる。もしくは、ＰＮＩシグネチャーは、非ＰＮＩからＰＮＩの移行に非常に特有及び独特であることができ、神経と癌細胞間の相互作用を特異的に含むことができる。このシグネチャーは、癌細胞の過渡的現象であることもでき、これらの細胞がそれらの神経周囲部位から広まった時には消失する。神経周囲及び非神経周囲癌細胞において、ＰＮＩ状態により最も差次的に発現されるマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−２２４の発現を分析し、腫瘍の下位集団の神経周囲癌細胞における、その増加した発現を見出した。全ての腫瘍が神経周囲癌細胞においてｍｉＲ−２２４の上方調節を示すわけではないが、本観察は、癌細胞が神経に接着する機構にｍｉＲ−２２４の誘導が関与する可能性があることを示している。
[000299]ｍＲＮＡ発現プロファイルの分析は、ＰＮＩ腫瘍において下方調節されている３４の遺伝子を＜１０％のＦＤＲ閾値で、明らかにした。我々は、非ＰＮＩ腫瘍よりもＰＮＩ腫瘍においてより高く発現される遺伝子、例えば、ＣＲＩＳＰ３、ＰＳＣＡ、ＢＭＰ７又はＢＣＬ２、を観察したけれども、それらの高いＦＤＲのため、有意に差次的に発現された遺伝子の我々のリストから除外された。ＤＵ−１４５前立腺癌細胞と神経細胞の共培養モデルを使用するただ二つの他の研究は、ＰＮＩに関連するｍＲＮＡの発現プロファイルを検討した［１８，１９］。これらの研究は、ＰＮＩにおいてビスチン及びＰｉｍ−２をコードする遺伝子が上方調節されていることを発見した。我々は、ＰＮＩ腫瘍において対応するｍＲＮＡの増加を検出しなかった。異なった方法論は、多様な研究で発生した遺伝子リスト間の相違のいくつかを説明することができる。加えて、我々のチップは、ビスチンをコードする遺伝子のためのプローブセットを含んでいない。
[000300]３４の差次的に発現された遺伝子のいくつかは、メタロチオネイン遺伝子ファミリーのメンバーであった。こうした遺伝子は、染色体１６ｑｌ３上の遺伝子クラスター中に位置しており［４１］、プロモーター過剰メチル化及び減少した亜鉛利用可能性により、前立腺癌において下方調節されていることが見出されている［３２，４２，４３］。免疫組織化学により、前立腺腫瘍の下位集団において、メタロチオネイン発現は非神経周囲癌細胞と比較した場合、神経周囲癌細胞においては著しく低いことが確認できた。非ＰＮＩ腫瘍からＰＮＩ腫瘍への移行時の下方調節は、該疾患のこのステージで起こる癌細胞の金属代謝の重要な変化を示しているのかもしれない。我々の差次的に発現された遺伝子リスト中のいくつかの遺伝子は、ミトコンドリア局在化を伴うタンパク質、例えば、中でも４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、フェロケラターゼ及び長鎖アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼをコードする。アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ及び長鎖アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼは、細胞の有機（カルボン）酸代謝（例えば、ケトン体、脂肪酸
）において鍵となる遺伝子であり、一方、フェロケラターゼは、ヘムの生合成に関与する［４４］。ミトコンドリアにおける代謝及びゲノム中の変化は、前立腺癌発癌においては一般的なイベントである［４５−４７］。我々のデータは、これらの変化のいくつかが、ＰＮＩ陽性腫瘍への移行時に起こることができることを示す。
[000301]ＰＮＩ腫瘍で下方調節されることが見出されている他の遺伝子は、スペルミンシンターゼ、ｖ−ＭＡＦ癌遺伝子相同体（ＭＡＦ）及びＣＸＡＤＲをコードするものである。スペルミンシンターゼは、スペルミジンからスペルミンへの転換を触媒する、ポリアミン合成経路の鍵となる酵素である。前立腺癌におけるポリアミン合成経路の転写調節不全が観察されている［４８］。スペルミンは、前立腺癌細胞増殖の内因性阻害剤である［４９］。それ故、スペルミンシンターゼの下方調節は、神経周囲環境において前立腺癌細胞の増加した増殖及び生存を可能にすることができる。ＭＡＦは、リンパ腫及び骨髄腫においては癌遺伝子であるが、前立腺癌においては癌抑制遺伝子候補であることが見出されている［５０］。ＣＸＡＤＲは、ヒト細胞内へのアデノウイルスの取込みにおいて、極めて重要な機能を有する［５１］。このレセプターは、正常前立腺と比較した場合、局所的に進行した前立腺癌において下方調節されていることが見出されている［３３］。
[000302]単一遺伝子効果はＰＮＩを起こしそうもないので、ＰＮＩ腫瘍と非ＰＮＩ腫瘍間で差次的に発現されたタンパク質コード遺伝子についてのパスウェイ解析を実施した。この解析は、非ＰＮＩ腫瘍と比較した場合、ＰＮＩ腫瘍において最も有意に変化した生物学的プロセスは細胞及びエネルギー代謝を調節するプロセスであることを明らかにした。他の変化した生物学的プロセスは、神経発生及び神経インパルスの伝達のような神経機能に、及び細胞死の負の調節に関連する。後者は、神経周囲部位の前立腺癌細胞は減少したアポトーシス及び増加した生存を示す以前の発見［１７，１８］と一致している。
[000303]非ＰＮＩ腫瘍からＰＮＩ腫瘍への移行時にマイクロＲＮＡ及びｍＲＮＡ発現において有意な変化が観察された。教師なし階層的クラスター分析は、非ＰＮＩ腫瘍がＰＮＩ腫瘍より特有であることを、それらのｍＲＮＡ発現プロファイルよりもそれらのマイクロＲＮＡ発現プロファイルにより明らかにした。ＰＮＩにおいて機能的に重要であり得るミトコンドリア機能及び細胞代謝に関連する、多様な遺伝子及び生物学的プロセスも同定した。
[000304]それらの使用及び定義の例
[000305]本発明の実施は、特に示されない限り、当業者が習得している薬理学、化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術及び免疫学の従来の方法を用いるであろう。こうした技術は文献に十分に説明されている。例えば、Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); A.
L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In
Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)を参照されたい。
[000306]そのようであるので、本明細書の定義はさらなる説明のために提供されており、限定と解釈してはならない。
[000307]本明細書で使用される冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的目的語の一つ又は一つより多く（即ち、少なくとも一つ）を指す。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は一つの要素又は一つより多くの要素を意味する。
[000308]「マーカー」及び「バイオマーカー」は、遺伝子及び／又はタンパク質又はそれらの機能的変異体であり、正常又は健康な組織又は細胞におけるその発現レベルから、
組織又は細胞において変化した発現のレベルは、障害及び／又は疾患状態に関連する。
[000309]マーカーの発現の「正常」レベルとは、障害及び／又は疾患状態に罹患していないヒト対象又は患者の細胞におけるマーカーの発現のレベルである。
[000310]マーカーの「過剰発現」又は「有意により高いレベルの発現」とは、発現を評価するために用いられたアッセイの標準誤差よりも大きく、及びある態様では、対照サンプル（例えば、マーカー関連障害及び／又は疾患状態を有していない健康な対象からのサンプル）中のマーカーの発現レベルの少なくとも２倍、他の態様では、３、４、５又は１０倍、及びある態様においては、いくつかの対照サンプル中のマーカーの平均発現レベルである、試験サンプル中の発現レベルを指す。
[000311]マーカーの「有意により低いレベルの発現」とは、対照サンプル（例えば、マーカー関連障害及び／又は疾患状態を有していない健康な対象からのサンプル）中のマーカーの発現レベルの少なくとも２分の１、及びある態様では、３、４、５又は１０分の１、及びある態様においては、いくつかの対照サンプル中のマーカーの平均発現レベルである、試験サンプル中の発現レベルを指す。
[000312]キットは、マーカーの発現を特異的に検出するための少なくとも一つの試薬、例えば、プローブを含むいずれかの製品（例えば、パッケージ又は容器）である。該キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして、宣伝し、流通させ、又は販売することができる。
[000313]「タンパク質」は、マーカータンパク質及びそれらの断片；変異体マーカータンパク質及びそれらの断片；マーカー又は変異体マーカータンパク質の少なくとも１５アミノ酸セグメントを含むペプチド及びポリペプチド；マーカー又は変異体マーカータンパク質、又はマーカー又は変異体マーカータンパク質の少なくとも１５アミノ酸セグメントを含む融合タンパク質を包含する。
[000314]本明細書に記載された組成物、キット及び方法は中でも以下の非制限的使用を有する：
１）対象が、障害及び／又は疾患状態を患っているかどうかを評価すること；
２）対象の障害及び／又は疾患状態のステージを評価すること；
３）対象の障害及び／又は疾患状態のグレードを評価すること；
４）対象の障害及び／又は疾患状態の性質を評価すること；
５）対象が障害及び／又は疾患状態を発生する可能性を評価すること；
６）対象の障害及び／又は疾患状態に関連する細胞の組織学的タイプを評価すること；
７）対象の障害及び／又は疾患状態を治療するために有用である抗体、抗体断片又は抗体誘導体を作製すること；
８）対象の細胞における障害及び／又は疾患状態の存在を評価すること；
９）対象の障害及び／又は疾患状態を抑制するための一つ以上の試験化合物の有効性を評価すること；
１０）対象の障害及び／又は疾患状態を抑制するための療法の有効性を評価すること；
１１）対象の障害及び／又は疾患状態の進行をモニターすること；
１２）対象の障害及び／又は疾患状態を抑制するための組成物又は療法を選択すること；１３）障害及び／又は疾患状態を患った対象を治療すること；
１４）対象の障害及び／又は疾患状態を抑制すること；
１５）試験化合物が有害である可能性を評価すること；及び
１６）障害及び／又は疾患状態の発症のリスクを有する対象においてそれらを予防すること。
[000315] スクリーニング法
[000316]動物モデルを作り出すことができ、対象の障害及び／又は疾患状態を治療する又は予防するために有用な療法剤のスクリーニングを可能にするであろう。従って、本方法は対象の障害及び／又は疾患状態を治療する又は予防するための療法剤を同定するために有用である。本方法は、本明細書に記載された方法により作製された動物モデルに候補剤を投与し、そして、候補剤が投与されていない対照動物モデルと比較し、該動物モデルにおける少なくとも一つの応答を評価すること含む。もし、少なくとも一つの応答が症状を軽減し又は発症が遅延したならば、該候補剤は該疾患を治療する又は予防する剤である。
[000317]該候補剤は、当該技術分野ですでに公知である薬理的剤であってもよく、又は何らかの薬理学的活性を有する以前には知られていなかった剤でもよい。該剤は、天然に生じたものでも又は実験室で設計されたものでもよい。それらは、微生物、動物又は植物から単離されたものでもよく、又は組換え的に産生された、又は適した化学合成法により合成されてもよい。それらは、小分子、核酸、タンパク質、ペプチド又はペプチド模倣物であることができる。ある態様において、候補剤は、５０以上及び約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物である。候補剤は、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基も含む。候補剤は、限定されるわけではないが：ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体又はそれらの組み合わせを含む生体分子の中でも発見されている。
[000318]候補剤は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む広範囲の起源から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、広範囲の有機化合物及び生体分子の無作為及び方向付けられた合成に、多数の手段が利用可能である。もしくは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、又は容易に産生される。加えて、天然に又は合成的に産生されたライブラリー及び化合物群は、慣用的な化学的、物理的及び生化学的手段を介して容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを産生するために使用することができる。ある態様において、該候補剤は、非制限例として：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並行固相又は液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「一ビーズ一化合物」ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法によるものを含む、コンビナトリアルライブラリー法分野における多数のアプローチのいずれかを使用して得ることが可能である。
[000319]さらなるある態様において、ある種の薬理学的剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような方向付けられた又は無作為の化学修飾にかけることができ、構造類似体が生成される。
[000320]対象の障害及び／又は疾患状態を治療するための療法剤を同定するためと同じ方法を、インビトロ研究から生じたリード化合物／剤を検証するためにも使用し得る。
[000321]該候補剤は、対象の障害及び／又は疾患状態応答経路の一つ以上を上方又は下方調節する剤であることができる。ある態様において、該候補剤は、こうした経路に影響するアンタゴニストであることができる。
[000322]障害及び／又は疾患状態を治療するための方法
[000323]本明細書において障害及び／又は疾患状態応答を治療する、抑制する、寛解する又は逆行させるための方法が提供される。本明細書に記載された方法において、シグナル伝達カスケードを妨害する剤が、限定されるわけではないが、こうした合併症がまだ明白ではない、及びすでに少なくとも一つのこうした応答を有する対象のような、それを必要とする個体に投与される。
[000324]前の例において、こうした治療は、こうした応答の発生を予防するため及び／又はそれらが生じる程度を軽減するために有用である。後の例において、こうした治療は、こうした応答の発生の程度を軽減する、それらのさらなる発生を予防する、又は該応答を逆行させるために有用である。
[000325]ある態様において、該応答カスケードを妨害する剤は、こうした応答に特異的な抗体であることができる。
[000326] バイオマーカー（単数又は複数）の発現
[000327]マーカーの発現は、多くの方法で抑制することが可能であり、非制限例として、マーカー（単数又は複数）の転写、翻訳又は両方を抑制するため、疾患細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し得ることを含む。もしくは、マーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体又は抗体断片をコードし、適切なプロモーター／調節因子領域と機能可能なように連結されたポリヌクレオチドを、該タンパク質の機能又は活性を抑制するであろう細胞内抗体を発生させるために細胞に提供し得る。マーカーの発現及び／又は機能は、マーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体又は抗体断片で該疾患細胞を治療することによっても抑制することができる。本明細書に記載された方法を使用し、多様な分子（特に、細胞膜を通過可能な十分に小さい分子を含む）を、マーカーの発現を抑制する又はマーカータンパク質の機能を抑制する分子を同定するためにスクリーニングすることが可能である。そうのように同定された化合物を、対象の疾患細胞を抑制するために該対象に提供し得る。
[000328]いずれのマーカー又はマーカーの組み合わせ、ならびに該マーカーと組み合わされたいずれのマーカーも、本明細書に記載された組成物、キット及び方法で使用することができる。一般に、疾患細胞中のマーカーの発現のレベル及び正常系細胞中の同じマーカーの発現のレベル間の相違が可能な限り大きなマーカーを使用するのが望ましい。この相違はマーカーの発現を評価するための方法の検出限界ほど小さくすることができるけれども、相違は少なくとも評価法の標準誤差よりも大きく、及びある態様において、正常組織中の同一マーカーの発現のレベルよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、１００、５００、１０００倍またはそれ以上の相違が望ましい。
[000329]ある種のマーカータンパク質が細胞を取り巻く細胞外空間に分泌されることが認められている。こうしたマーカータンパク質は、組織バイオプシサンプルよりもヒト対象からより容易に集めることができる体液サンプル中で検出することができるので、これらのマーカーが、組成物、キット及び方法のある態様において使用された。加えて、マーカータンパク質の検出のためのインビボ技術には、該タンパク質に対して方向付けられた標識抗体を対象内へ導入することが含まれる。例えば、該抗体を放射性マーカーで標識することができ、対象中でのその存在及び位置を標準イメージング技術により検出し得る。
[000330]どの特定のタンパク質が分泌されたタンパク質であるかを決定するため、マーカータンパク質が、例えば、ヒト細胞株のような哺乳類細胞中で発現され、細胞外液を集め、細胞外液中のタンパク質の存在又は不存在を評価する（例えば、該タンパク質に特異的に結合する標識抗体を使用する）。
[000331]こうした細胞を含んでいる対象のサンプルを、本明細書に記載された方法において使用できることが理解されるであろう。これらの態様において、該マーカーの発現のレベルは、サンプル中の量（例えば、絶対量又は濃度）を評価することにより評価し得る。該細胞サンプルは、もちろん、サンプル中のマーカー量を評価することに先立って、多様な採取後調製及び保存技術（例えば、核酸及び／又はタンパク質抽出、固定、保存、凍結、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心分離など）にかけることができる。
[000332]該マーカーは、細胞から、例えば、呼吸器系、消化器系、血流及び／又は間質腔内へ排出することもできることも理解されるであろう。該排出マーカーは、例えば、痰、ＢＡＬ、血清、血漿、尿、便などを試験することにより試験し得る。
[000333]本組成物、キット及び方法は、発現する細胞の表面上に提示された少なくとも一つの部分を有する、マーカータンパク質の発現を検出するために使用し得る。例えば、全細胞上のこうしたタンパク質を検出するために免疫学的方法を使用することができ、少なくとも一つの細胞外ドメインの存在を予測するために、コンピューター支援配列分析法を使用することができる（即ち、分泌されたタンパク質及び少なくとも一つの細胞表面ドメインを有するタンパク質の両方を含む）。細胞の表面上に提示されている少なくとも一つのタンパク質を有するマーカータンパク質の発現は、細胞を溶解する必要なく検出することができる（例えば、該タンパク質の細胞表面ドメインに特異的に結合する標識抗体を使用して）。
[000334]マーカーの発現は、転写された核酸又はタンパク質の発現を検出するための多種多様な方法のいずれかにより評価することができる。こうした方法の非制限例には、分泌された、細胞表面、細胞質又は核タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能又は活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法及び核酸増幅法が含まれる。
[000335]特定の態様において、マーカーの発現は、その正常翻訳後修飾を全て又は一部を受けたマーカータンパク質を含むマーカータンパク質又はそれらの断片と特異的に結合する、抗体（例えば、放射標識された、発色団標識された、フルオロフォア標識された又は酵素標識された抗体）、抗体誘導体（例えば、基質又はタンパク質リガンド対のタンパク質又はリガンドとコンジュゲートされた抗体）又は抗体断片（例えば、一本鎖抗体、単離された抗体高頻度可変ドメインなど）を使用して評価される。
[000336]別の特定の態様において、マーカーの発現は、対象サンプル中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（即ち、転写されたポリヌクレオチド）を調製することにより、及びｍＲＮＡ／ｃＤＮＡとマーカー核酸又はそれらの断片と相補的である参照ポリヌクレオチドをハイブリダイズすることにより評価される。ｃＤＮＡは、参照ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに先立って、多様なポリメラーゼ連鎖反応法のいずれかを使用して増幅されていてもよい；好ましくは、増幅されない。一つ以上のマーカーの発現も同様に、定量的ＰＣＲを使用して検出することが可能であり、マーカー（単数又は複数）の発現のレベルが評価される。もしくは、マーカーの突然変異又は変異体（一塩基多型性、欠失など）を検出する任意の多くの方法を対象におけるマーカーの出現を検出するために使用することができる。
[000337]関連する態様において、サンプルから得られた転写されたポリヌクレオチドの混合物と、マーカー核酸の少なくとも一部（例えば、少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、５００、又はそれ以上のヌクレオチド残基）と相補的又は相同的ポリヌクレオチドが固定された支持体を接触させる。もし、相補的又は相同的ポリヌクレオチドが支持体上で別個に検出可能ならば（例えば、異なる発色団又はフルオロフォアを使用して、又は異なって選択された位置に固定されて検出可能）、複数のマーカーの発現のレベルを、単一支持体（例えば、選択された位置に固定されたポリヌクレオチドの「遺伝子チップ」マイクロアレイ）を使用して同時に評価し得る。一つの核酸と別の核酸のハイブリダイゼーションを含んだマーカー発現の評価方法が使用された場合、ハイブリダイゼーションはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で実施されることが望ましい。
[000338]ある態様において、バイオマーカーアッセイは、質量分析法又は表面プラズモン共鳴法を使用して実施される。多様な態様において、対象の障害及び／又は疾患状態に対して活性な剤を同定する方法は：ａ）一つ以上のマーカー又はそれらの誘導体を含んでいる細胞のサンプルを提供すること；ｂ）こうした細胞から抽出物を調製すること；ｃ）該抽出物と、マーカー結合を含有する標識核酸プローブを混合すること；及びｄ）試験剤の存在又は不存在下でマーカー及び核酸プローブ間の複合体の形成を決定すること；の一つ以上を含み得る。決定工程は、前記抽出物／核酸プローブ混合物を電気泳動移動度シフトアッセイにかけることを含み得る。
[000339]ある態様において、該決定工程は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光に基づいたアッセイ及び超高スループットアッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）又は蛍光相関分光法（ＦＣＳ）アッセイから選択されるアッセイを含む。こうした態様において、ＳＰＲは金属誘電性表面での小さな屈折率変化に敏感であるので、ＳＰＲセンサーは生体分子相互作用の直接リアルタイム観察に有用である。ＳＰＲは、およそ２００ｎｍのＳＰＲセンサー／サンプルインターフェース内の１０５〜１０６屈折率（ＲＩ）単位の変化に感受性である表面技術である。従って、ＳＰＲ分光法は、センシング層上に堆積された薄い有機フィルムの成長のモニタリングのために有用である。
[000340]本組成物、キット及び方法は、一つ以上のマーカーの発現レベルの相違の検出に依存しているので、マーカーの発現のレベルは、少なくとも一つの正常細胞及び癌に冒された細胞中での発現を評価するために使用される方法の最小検出限界よりも有意に大きなことが望まれる。
[000341]一つ以上のマーカーを使用する追加の対象サンプルのルーチンスクリーニングにより、ある種のマーカーが、対象の特定の障害及び／又は疾患状態を含む、多様なタイプの細胞中で過剰発現されていることに気付くであろうことが理解される。
[000342]加えて、非常に多くの対象サンプルがマーカーの発現について評価され、及びサンプルが得られた個々の対象の結果が関連付けられるので、ある種のマーカーの変化した発現が対象の障害及び／又は疾患状態と強く関連付けられること、及び他のマーカーの変化した発現が他の疾患と強く関連付けられることも確認されるであろう。本組成物、キット、及び方法はそれ故、対象の障害及び／又は疾患状態のステージ、グレード、組織学的型、及び性質の一つ以上を特徴付けるために有用である。
[000343]本組成物、キット、及び方法が、対象の障害及び／又は疾患状態のステージ、グレード、組織学的型、及び性質の一つ以上を特徴付けるために使用される場合、マーカー又はマーカーのパネルは、対応するステージ、グレード、組織学的型、又は性質の障害及び／又は疾患状態を患っている少なくとも約２０％、及びある態様においては、少なくとも約４０％、６０％又は８０％、及び実質的に全ての対象において陽性結果が得られるように選択される。本発明のマーカー又はマーカーのパネルは、一般集団については約１０％より大きな陽性予測値が得られるように選択される（非制限例において、８０％より大きなアッセイ特異性と組み合わされる）。
[000344]複数のマーカーが本組成物、キット及び方法で使用される場合、対象サンプル中の各マーカーの発現レベルは、単一反応混合物（即ち、各マーカーについて異なった蛍光プローブのような試薬を使用して）か、あるいは一つ以上のマーカーに対応する個々の反応混合物中で、同一タイプの非障害及び／又は非疾患サンプル中の複数のマーカーの各々の発現の正常レベルと比較し得る。一つの態様において、対応する正常レベルと比べ、サンプルにおける複数のマーカーの一つより多くの発現の有意に増加したレベルは、該対
象が障害及び／又は疾患状態を患らっていることの指標である。複数のマーカーが使用される場合、２、３、４、５、８、１０、１２、１５、２０、３０又は５０又はそれ以上の個々のマーカーを使用し得る；ある態様において、より少ないマーカーの使用が望ましいであろう。
[000345]本組成物、キット及び方法の感度を最大にするため（即ち、対象サンプル中の系起源の細胞に起因する妨害による）、本明細書で使用されるマーカーは、限定された組織分布を有する、例えば、非系組織では通常発現されないマーカーであることが望ましい。
[000346]本組成物、キット及び方法は、対象において障害及び／又は疾患状態を発症する増強されたリスクを有する対象及びその医学的アドバイザーに対して特に役に立つであろうことが認められる。障害及び／又は疾患を発症する増強されたリスクを有すると認められる対象には、例えば、こうした障害又は疾患の家族歴を持つ対象が含まれる。
[000347]正常ヒト系組織中のマーカーの発現レベルは、多様な方法で評価し得る。一つの態様において、この発現の正常レベルは、正常と思われる系細胞の一部におけるマーカーの発現のレベルを評価することにより、及びこの発現の正常レベルを、異常であると疑われている系細胞の一部における発現のレベルと比較することにより評価される。もしくは、及び特に、さらなる情報が本明細書に記載されたルーチン検査の結果として入手可能であるので、該マーカーの正常発現についての集団平均値を使用することができる。他の態様において、マーカーの発現の「正常」レベルは、非罹患対象から得られた対象サンプル、対象に障害及び／又は疾患状態の発症が疑われる以前の患者サンプル、保存された対象サンプルなどのマーカーの発現を評価することにより決定することができる。
[000348]本明細書において、サンプル（例えば、保存された組織サンプル又は対象から得られたサンプル）中の障害及び／又は疾患状態細胞の存在を評価するための組成物、キット及び方法も提供される。これらの組成物、キット及び方法は、上記のものと実質的に同一であるが、但し必要な場合、該組成物、キット及び方法は、対象サンプル以外のサンプルでの使用に適用される。例えば、使用されるべきサンプルがパラフィン処理された保存ヒト組織サンプルである場合、該サンプル中でのマーカー発現のレベルを評価するため、組成物中、キット中、又は方法において化合物の比を調節する必要があろう。
[000349] キット及び試薬
[000350]該キットは、疾患細胞（例えば、対象サンプルのようなサンプル中の）の存在を評価するために有用である。該キットは、複数の試薬を含み、その各々は、マーカー核酸又はタンパク質と特異的に結合することが可能である。マーカータンパク質との結合に適した試薬には、抗体、抗体誘導体、抗体断片などが含まれる。マーカー核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライスされたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）との結合に適した試薬には、相補的核酸が含まれる。例えば、該核酸試薬は、支持体に固定化されたオリゴヌクレオチド（標識又は非標識）、支持体と結合されていない標識オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマーの対、分子指標プローブなどを含むことができる。
[000351]該キットは、本明細書に記載の方法を実行するために有用な追加の成分を場合により含んでいてもよい。例としては、該キットは、相補的核酸のアニーリングのため、抗体とそれが特異的に結合するタンパク質との結合のために適した液体（例えば、ＳＳＣ緩衝液）、一つ以上のサンプル区画、該方法の実施を記述している取扱説明書、正常システム細胞のサンプル、癌関連疾患細胞のサンプルなどを含むことができる。
[000352]抗体を産生する方法
[000353]対象が障害及び／又は疾患状態を患らっているかどうかを評価するために有用な抗体を産生する、単離されたハイブリドーマを作製する方法も本明細書において提供される。この方法において、マーカータンパク質の全体又はセグメントを含むタンパク質又はペプチドが合成され又は単離される（例えば、それが発現される細胞からの精製により、又はインビボ又はインビトロでの、該タンパク質ペプチドをコードする核酸の転写及び翻訳により）。脊椎動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ又はヒツジのような哺乳類を、該タンパク質又はペプチドを使用して免疫化する。該脊椎動物が該タンパク質又はペプチドに対して強い免疫応答を示すように、少なくとも追加の一回、場合により（及び好ましくは）免疫化してもよい。免疫化された脊椎動物の脾臓細胞を単離し、多様な方法のいずれかを使用して、不死化細胞株と融合させてハイブリドーマを形成させる。このようにして形成されたハイブリドーマは、標準法を使用してスクリーニングし、該マーカータンパク質又はそれらの断片と特異的に結合する抗体を産生する、一つ以上のハイブリドーマを同定した。この方法により作製されたハイブリドーマ、及びこうしたハイブリドーマを使用して作製された抗体も本明細書で提供される。
[000354]有効性評価の方法
[000355]疾患細胞を抑制するための試験化合物の効力を評価する方法も本明細書において提供される。上記のように、該マーカーの発現のレベルの相違は、対象細胞の異常状態と相関する。ある種のマーカーの、発現のレベルの変化はこうした細胞の異常状態により生じたようであるが、他のマーカーの、発現のレベルにおける変化が、これらの細胞の異常状態を誘導し、維持し及び促進することも同様に認められている。それ故、対象の障害及び／又は疾患状態を抑制する化合物は、一つ以上の該マーカーの発現のレベルを、そのマーカー発現の正常レベルにより近いレベル（即ち、正常細胞におけるマーカの発現レベル）への変化を起こすであろう。
[000356]この方法は従って、試験化合物の存在下で維持された第一の細胞サンプルにおけるマーカーの発現、及び試験化合物の不存在下で維持された第二の細胞サンプルにおけるマーカーの発現を比較することを含む。試験化合物の存在下におけるマーカーの有意に減少した発現は、試験化合物が関連疾患を抑制することの指標である。該細胞サンプルは例えば、対象から得られた正常細胞の単一サンプルの一部、対象から得られた正常細胞のプールされたサンプル、正常細胞株の細胞、対象から得られた関連疾患細胞の単一サンプルの一部、対象から得られた関連疾患細胞のプールされたサンプル、関連疾患細胞株の細胞などであることができる。
[000357]一つの態様において、該サンプルは対象から得られた癌関連疾患細胞であり、多様な癌関連疾患を抑制することについて有効であると信じられている複数の化合物を、対象の癌関連疾患を最もよく抑制するであろう化合物を同定するために試験した。
[000358]この方法は同様に、対象の関連疾患を抑制するための療法の効力を評価するために使用することができる。この方法において、対（一方は療法を受けさせ、他方は療法を受けさせなかった）のサンプル中の一つ以上のマーカーの発現のレベルを評価した。試験化合物の効力を評価する方法として、もし該療法がマーカーの発現の有意に低いレベルを誘導すれば、該療法は癌関連疾患を抑制について有効である。上記のように、選択された対象からのサンプルがこの方法で使用されるなら、該対象の癌関連疾患を抑制するために最も有効であるらしい療法を選択するため、代替療法をインビトロで評価することが可能である。
[000359]上記のように、ヒト細胞の異常状態は、該マーカーの発現のレベルの変化と相関する。試験化合物が有害な可能性を評価する方法も提供される。この方法は、試験化合物の存在下又は不存在下で、ヒト細胞の分離した一定分量を維持することを含む。各一定
分量中のマーカーの発現が比較される。試験化合物の存在下で維持された一定分量におけるマーカー発現の有意に高いレベル（試験化合物の不存在下で維持された一定分量と比べて）は、試験化合物が有害である可能性を有する指標である。多様な試験化合物の相対的有害可能性は、発現のレベルが増強された又は抑制されたマーカーの数を比較することにより、関連マーカーの発現レベルの増強又は抑制の程度を比較することにより、又は両方を比較することにより、評価し得る。多様な側面が、以下の副節により詳細に説明されている。
[000360]単離されたタンパク質及び抗体
[000361]一つの側面は、単離されたマーカータンパク質及びそれらの生物学的に活性な部分、ならびに、マーカータンパク質又はそれらの断片に対して方向付けられた抗体を上昇させるための免疫原として使用するのに適したポリペプチド断片に関する。一つの態様において、天然のマーカータンパク質は、標準タンパク質精製技術を使用する、適切な精製スキームにより、細胞又は組織源から単離し得る。別の態様において、マーカータンパク質の全体又はセグメントを含むタンパク質又はペプチドが、組換えＤＮＡ技術により産生される。組換え発現の代わりに、こうしたタンパク質又はペプチドは、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
[000362]「単離された」又は「精製された」タンパク質又はそれらの生物学的に活性な部分とは、タンパク質が由来する細胞又は組織源からの細胞材料又は他の夾雑タンパク質を含んでいないか、又は化学的に合成された場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含んでいない。用語「実質的に細胞材料を含んでいない」には、該タンパク質が単離された又は組換え的に産生された細胞の細胞性成分から分離されたタンパク質の調製物が含まれる。従って、実質的に細胞材料を含んでいないタンパク質には、約３０％、２０％、１０％、又は５％（乾燥重量による）未満の異種タンパク質（本明細書において夾雑タンパク質とも称される）を有するタンパク質の調製試料が含まれる。
[000363]タンパク質又はそれらの生物学的に活性な部分が組換え的に産生される場合、培養培地を実質的に含んでいないのも好ましい、即ち、培養培地は、タンパク質調製試料の約２０％、１０％、又は５％未満の量に相当する。タンパク質が化学合成により生成される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含んでいないのが好ましく、即ち、それは、該タンパク質の合成に関与した化学的前駆体又は他の化学物質から分離されている。従って、こうしたタンパク質の調製試料は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の、化学的前駆体又は目的のポリペプチド以外の化合物しか含んでいない。
[000364]マーカータンパク質の生物学的に活性な部分には、マーカータンパク質のアミノ酸配列と十分に同一である又はマーカータンパク質のアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれ、それは、完全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、及び対応する完全長タンパク質の少なくとも一つの活性を示す。典型的には、生物学的に活性な部分は対応する完全長タンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメイン又はモチーフを含む。マーカータンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００又はそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。さらに、マーカータンパク質の他の領域が欠損する他の生物学的に活性な部分は、組換え技術により調製することが可能であり、マーカータンパク質の天然形態の機能活性の一つ以上を評価する。ある態様において、有用なタンパク質は、これらの配列の一つと実質的に同一であり（例えば、少なくとも約４０％、及びある態様において、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％）、天然のアレル変異又は変異発生によりアミノ酸配列は異なっているが、対応する天然に存在するマーカータンパク質の機能的活性を保持している。
[000365]加えて、マーカータンパク質のセグメントのライブラリーを、スクリーニング及び続いての変異体マーカータンパク質又はそれらのセグメントの選択のためのポリペプチドの変化に富んだ集団を生成するために使用し得る。
[000366]予測医薬
[000367]予測医薬の分野における動物モデル及びマーカーの使用も本明細書において提供され、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス及び臨床治験のモニタリングが予後（予測）目的のために使用され、それにより個体を予防的に治療する。従って、個体が特定の障害及び／又は疾患を発症するリスクを有するかどうかを決定するため、一つ以上のマーカータンパク質又は核酸の発現のレベルを決定するための診断アッセイも本明細書において提供される。こうしたアッセイは、予後の又は予測目的のために使用され、それにより該障害及び／又は疾患の発症に先立って個体を予防的に治療する。
[000368]別の側面において、該方法は少なくとも同一個体の定期的スクリーニングに有用であり、個体の発現パターンを変化させる化学物質又は毒物に、個体が暴露されたかどうかが判る。
[000369]さらに別の側面は、臨床治験におけるマーカーの発現又は活性に対する、障害及び／又は疾患を抑制するために又はいずれか他の障害を治療するため又は予防するために（例えば、こうした治療が有することができる何らかの系の効果を理解するために）投与された剤（例えば、薬剤又は他の化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
[000370]医薬組成物
[000371]該化合物は、適した医薬担体中、局所的、局部的又は全身的投与のための製剤であることができる。E. W. Martin (Mark Publishing Company, 1975) によるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Edition、は典型的な坦体及び製造法を記載してい
る。該化合物は、細胞への標的化のための生分解性又は非生分解性ポリマー又はタンパク質又はリポソームから形成された、適した生体適合性マイクロカプセル、微粒子又はミクロスフェア内に被包することもできる。こうしたシステムは、当業者にはよく知られており、適切な核酸での使用に最適化することができる。
[000372]核酸送達のための多様な方法が、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; 及び Ausubel et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York、に記載されている。こうした核酸送達システムは、限定されるわけではないが例として、「裸の」核酸のような「裸の」形態か、又はカチオン性分子又はリポソーム形成脂質との複合体のような、又はベクターの成分又は医薬組成物の成分として、送達に適したビヒクル中に配合されている、所望の核酸を含む。核酸送達システムは、細胞とそれを直接接触させることによるように直接的に、又はいずれかの生物学的プロセスの作用を介して間接的に提供し得る。
[000373]局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体及び粉体を含むことができる。慣用的医薬坦体、水性、粉体又は油性基剤、又は増粘剤を必要に応じ使用し得る。
[000374]例えば、関節内（関節中に）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内及び皮下経路のような非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有できる水性及び非水性の等張な無菌注射液、及び懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、分散剤、安定剤及び保存剤を含有できる水性及び非水性滅菌懸濁液、溶液又は乳剤が含まれる。注射用製剤は、単位投与剤形、例えば、添加された
保存剤を有するアンプル又は多用量容器、で提供することができる。当業者は、必要以上の実験を行うことなく、化合物を調製する及び配合するための種々のパラメータを容易に決定し得る。化合物は、単独又は他の適した成分と組み合わせて使用し得る。
[000375]一般に、核酸を含む化合物の投与方法は、当業者には公知である。特に、核酸療法にすでに使用中の投与の経路は、現在使用中の製剤とともに、選択された核酸の好ましい投与経路及び製剤を提供し、特定の製剤、治療されている対象の状態の重度、及び療法的効力に必要とされる用量のような因子にもちろん依存するであろう。本明細書で一般的に使用されるように、「有効量」とは、化合物を受け取っていないマッチした対象と比較し、製剤が投与された対象において、障害の一つ以上の症状を治療できる、障害の一つ以上の症状の進行を逆転できる、障害の一つ以上の症状の進行を停止できる、又は障害の一つ以上の症状の発生を防止できる量である。化合物の実際の有効量は、利用されている具体的化合物又はそれらの組み合わせ、配合された特定の組成物、投与の様式、及び個体の年齢、体重、状態及び治療されている症状又は状態の重症度に従って変化し得る。
[000376]当業者には既知のいずれかの許容できる方法を、製剤を対象に投与するために使用することができる。投与は、治療されている状態に依存し、局部的（即ち、特定の領域、生理学的システム、組織、器官又は細胞タイプへの）又は全身的であることができる。
[000377]薬理ゲノミクス
[000378]該マーカーは、薬理ゲノミクスマーカーとしても有用である。本明細書で使用される「薬理ゲノミクスマーカー」は、その発現レベルが、対象の特定の臨床薬剤応答又は感受性と相関する客観的な生化学的マーカーである。薬理ゲノミクスマーカー発現の存在又は量は、対象の予測応答、及びより詳細には、特定の薬剤又は薬剤のクラスによる療法に対する対象腫瘍の予測応答に関連する。対象における一つ又はそれより多くの薬理ゲノミクスマーカーの発現の存在又は量を評価することにより、対象に最も適切である、又はより大きな成功度を有すると予測される薬剤療法を選択することができる。
[000379]臨床治験のモニタリング
[000380]マーカー発現のレベルに対する剤（例えば、薬剤化合物）の影響をモニタリングすることは、基礎的薬剤スクリーニングのみでなく、臨床治験においても適応し得る。例えば、マーカー発現に影響する剤の有効性は、癌関連疾患の治療を受けている対象の臨床治験でモニターし得る。
[000381]一つの非制限的態様において、本発明は剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣剤、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、又は他の薬剤候補）による対象の治療の有効性をモニタリングするための方法を提供し、
ｉ）剤の投与に先だって、対象から投与前サンプルを得ること；
ｉｉ）投与前サンプル中の、一つ以上の選択されたマーカーの発現のレベルを検出すること；
ｉｉｉ）対象から一つ以上の投与後サンプルを得ること；
ｉｖ）投与後サンプル中のマーカー（単数又は複数）の発現のレベルを検出すること；
ｖ）投与前サンプル中のマーカー（単数又は複数）の発現のレベルと、投与後サンプル中のマーカー（単数又は複数）の発現のレベルを比較すること；及び
ｖｉ）それに合わせて、対象への剤の投与を変化させること；の工程を含む。
[000382]例えば、治療の過程間のマーカー遺伝子（単数又は複数）の増加した発現は、有効ではない用量を示し、望ましくは用量を増加させる。反対に、マーカー遺伝子（単数又は複数）の減少した発現は、有効な治療を示し、用量を変化させる必要はない。
[000383]電子装置可読媒体、システム、配列及びそれを用いた方法
[000384]本明細書で使用される「電子装置可読媒体」とは、電子装置により読み出し及び直接的にアクセスし得るデータ又は情報を保存する、保持する又は含有する任意の適した媒体を指す。こうした媒体は、限定されるわけではないが、フロッピー（登録商標）
ディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープのような磁気記憶媒体；コンパクトディスクのような光学記憶媒体；ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどのような電子記憶媒体；及び一般的なハードディスク及び磁気／光学記憶媒体のようなこれらのカテゴリーの混成物を含み得る。媒体は本明細書に記載されたように、それらにマーカーが記録されるよう適合又は設定されている。
[000385]本明細書で使用される用語「電子装置」とは、データ又は情報を保存するよう設計された又は適合された任意の適切な演算又は処理装置および他の装置を含むことを意味する。本発明での使用に適した電子装置の例には、独立型コンピューター装置；ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）インターネット、イントラネット及びエクストラネットを含むネットワーク；携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯電話、ポケットベルなどのような電子機器；及びローカル及び分散型処理システムが含まれる。
[000386]本明細書で使用される「記録される」とは、電子装置可読媒体上に情報を保存する又はエンコードするためのプロセスを指す。当業者は、本明細書に記載されたマーカーを含む器具を生成するため、媒体上に情報を記録するための任意の方法を容易に採択し得る。
[000387]多様なソフトウエアプログラム及びフォーマットを、本発明のマーカー情報を該電子装置可読媒体上に保存するために使用し得る。無数のデータ処理装置構成フォーマット（例えば、テキストファイル又はデータベース）を、その上にマーカーが記録された媒体を得る又は作製するために採用することができる。マーカーを可読なフォームで供給することで、マーカー配列情報にさまざまな目的でごく普通にアクセスし得る。例えば、当業者は標的の配列又は標的の構造モチーフと、データ保存手段内に保存された配列情報を比較するため、可読フォームのヌクレオチド又はアミノ酸配列を使用し得る。特定の標的配列又は標的モチーフに一致する、配列の断片又は領域を同定するために検索手段が用いられる。
[000388]従って、対象が癌関連疾患あるいは癌関連疾患の素因を有しているかどうかを決定する方法を実行する命令を保持するための媒体も提供され、ここで、該方法は、マーカーの存在又は不存在を決定すること、そしてマーカーの存在又は不存在に基づいて、該対象が癌関連疾患又は癌関連疾患への素因を有しているかどうかを決定すること、及び／又は癌関連疾患又は前癌関連疾患状態のための特定の治療を推奨することの工程を含む。
[000389]電子システム及び／又はネットワークにおいて、対象が癌関連疾患又はマーカーに関連する癌関連疾患の素因を有するかどうかを決定するための方法も本明細書において提供され、該方法は、マーカーの存在又は不存在を決定すること、そしてマーカーの存在又は不存在に基づいて、該対象が特定の障害及び疾患及び／又はこうした障害及び疾患への素因を有するかどうかを決定すること、及び／又はこうした障害及び疾患及び／又はこうした前癌関連疾患状態に対する特定の治療を推奨すること、の工程を含む。該方法はさらに、該対象に関連する表現型情報を受け取ること、及び／又は該対象に関連するネットワーク表現型情報を獲得すること、の工程を含む。
[000390]対象が障害及び／又は疾患又はマーカーに関連する障害及び／又は疾患への素
因を有するかどうかを決定するためのネットワーク方法も本明細書において提供され、該方法は、マーカーに関連する情報を受け取ること、対象に関連する表現型情報を受け取ること、マーカー及び／又は障害及び／又は疾患に対応するネットワークから情報を獲得すること、そして一つ以上の表現型情報、該マーカー、及び該獲得した情報に基づいて、該対象が障害及び／又は疾患又はそれらへの素因を有するかどうかを決定すること、の工程を含む。該方法は、該障害及び／又は疾患又はそれらへの素因のための特定の治療を推奨する工程をさらに含むことができる。
[000391]対象が障害及び／又は疾患又はそれらへの素因を有するかどうかを決定するためのビジネスモデルも本明細書において提供され、該方法は、該マーカーに関連する情報を受け取ること、該対象に関連する表現型情報を受け取ること、該マーカー及び／又は障害及び／又は疾患に対応するネットワークから情報を獲得すること、そして一つ以上の表現型情報、該マーカー、及び該獲得した情報に基づいて、該対象が障害及び／又は疾患又はそれらへの素因を有するかどうかを決定すること、の工程を含む。該方法は、それらへの特定の治療を推奨する工程をさらに含むことができる。
[000392]アレイ中で一つ以上の遺伝子の発現をアッセイするために使用し得るアレイも本明細書において提供される。一つの態様において、該アレイは、組織における遺伝子発現をアッセイするために使用することが可能であり、アレイ中の遺伝子の組織特異性が確認される。このようにして、約７０００までの又はそれ以上の遺伝子が、発現について同時にアッセイし得る。このことは、一つ以上の組織で特異的に発現された遺伝子の集団を示しているプロファイルが展開されるのを可能にする。
[000393]こうした定性的決定に加え、遺伝子発現の定量化が本明細書において提供される。従って、組織特異性のみならず、組織中の遺伝子の集団の発現レベルも確認可能である。従って、遺伝子は、それらの組織発現それ自体及びその組織中での発現のレベルに基づいてグループ化し得る。このことは、例えば、組織間又は組織中での遺伝子発現の関係を確認することにおいて有用である。従って、一つの組織を撹乱させることが可能であり、そして第二の組織中の遺伝子発現に対する影響を決定し得る。これに関連して、生物学的刺激に応答した、別の細胞タイプに対する一つの細胞タイプの影響を決定し得る。
[000394]こうした決定は、例えば、遺伝子発現レベルでの細胞間相互作用の効果を知る上で有用である。もし一つの剤が、一つの細胞タイプを治療するために療法的に投与されて、別の細胞タイプに望まれない効果を有しているならば、本方法は、望まれない効果の分子基盤を決定するアッセイを提供し、そしてそれ故、相殺する剤を同時投与する、さもなければ望まれない効果を治療する機会を提供する。同様に、単一細胞タイプ内でも、望まれない生物学的効果を分子レベルで決定し得る。それ故、標的遺伝子以外の発現に対する、一つの剤の効果を確認及び相殺することが可能である。
[000395]別の態様において、該アレイは、アレイ中で一つ以上の遺伝子の発現の時間経過をモニターするために使用し得る。このことは、本明細書に開示したように、多様な生物学的状況で起こり得る；例えば、障害及び／又は疾患の発症、それらの進行、及びそれらに関連する細胞形質転換のようなプロセス。
[000396]該アレイは、同一細胞における、又は異なった細胞における遺伝子の発現又は他の遺伝子の発現の効果を確認するためにも有用である。このことは、例えば、もし最終又は下流標的を調節できないならば、治療介入のための代替分子標的の選択を提供する。
[000397]該アレイは、正常及び異常細胞における一つ又はそれより多くの遺伝子の発現差異パターンを確認するためにも有用である。このことは、診断又は治療介入のための分
子標的として働くことができる遺伝子の集団を提供する。
[000398]代理マーカー
[000399]該マーカーは、一つ以上の障害又は疾患状態のための、又はそれらへ導く状態のための代理マーカーとして働くことができる。本明細書で使用される「代理マーカー」とは、疾患又は障害の不存在又は存在と、又は疾患又は障害の進行と相関する、客観的生化学的マーカーである。こうしたマーカーの存在又は量は、該疾患とは独立である。それ故、これらのマーカーは、治療の特定の経過が、疾患状態又は障害を軽減することに有効であるかどうかを示すために働くことができる。代理マーカーは、疾患状態又は障害の存在又は程度が標準方法論ではアクセスすることが困難である場合、又は危険な臨床的エンドポイントに到達する可能性がある前に疾患進行の評価が望まれる場合に特別に使用される。
[000400]該マーカーは、薬力学的マーカーとしても有用である。本明細書で使用される「薬力学的マーカー」は、薬剤効果と特異的に相関する客観的生化学的マーカーである。薬力学的マーカーの存在又は量は、薬剤が投与される疾患状態又は障害とは関係しない；それ故、該マーカーの存在又は量は、対象中の薬剤の存在又は活性を示す。例えば、薬力学的マーカーは、生物学的組織内において当該薬剤のレベルに関連して該マーカーが発現もしくは転写され、または発現もしくは転写されない点において、生物学的組織における当該薬剤の濃度を示すことができる。このようにして、該薬剤の分布又は取り込みを薬力学的マーカーによりモニターすることができる。同様に、薬力学的マーカーの存在または量は薬剤の代謝産物の存在または量に比例することができるので、該マーカーの存在または量は、インビボにおける当該薬剤の相対的な分解率を示す。
[000401]薬力学的マーカーは、特に薬剤が低用量で投与される場合、薬剤効果の検出の感度を増加させることにおいて特に有用である。少量の薬剤でさえも、マーカーの転写又は発現を複数回活性化するのに十分であることができるため、増幅されたマーカーは多量にあり、それは薬剤それ自身よりも容易に検出可能である。また、該マーカーは、マーカー自身の性質によってさらに容易に検出されることができる；例えば、本明細書に記載した方法を使用し、抗体をタンパク質マーカーの免疫に基づいた検出システムで用いることができ、又はマーカー特異的放射標識プローブをｍＲＮＡマーカーの検出に使用することができる。さらに、薬力学的マーカーの使用は、直接観察可能な範囲を超えた薬剤治療によるリスクの機構に基づいた予測を与えることができる。
[000402]試験のためのプロトコル
[000403]障害及び／又は疾患のための試験法は、例えば、対象由来の生物学的サンプル中の、各マーカー遺伝子の発現レベルを時間とともに測定すること、および対照生物学的サンプル中のマーカー遺伝子とレベルを比較することを含むことができる。
[000404]マーカー遺伝子が本明細書に記載された遺伝子の内の一つで、発現レベルが差次的に発現される場合（例えば、対照の場合より高く又は低く）、対象は障害及び／又は疾患の影響を受けていると判断される。マーカー遺伝子の発現レベルが許容範囲内にある場合は、対象がそれらに影響を受けていることはありそうもない。
[000405]発現レベルを比較するため、対照についての標準値を、対照におけるマーカー遺伝子の発現レベルを測定することにより前もって決定できる。例えば標準値は、上述した対照におけるマーカー遺伝子の発現レベルに基づいて決定し得る。例えば、ある態様において、許容範囲を標準値に基づいて±２Ｓ．Ｄ．とする。標準値が決定されたら、試験法は、対象からの生物学的サンプル中の発現レベルのみを測定すること、その値と対照について決定された標準値を比較することにより実施することができる。
[000406]マーカー遺伝子の発現レベルには、マーカー遺伝子からｍＲＮＡへの転写、およびタンパク質への翻訳が含まれる。従って、障害及び／又は疾患を試験する一つの方法は、マーカー遺伝子に相当するｍＲＮＡの発現強度、又はマーカー遺伝子によりコードされているタンパク質の発現レベルの比較に基づいて実施される。
[000407]障害及び／又は疾患について試験することにおけるマーカー遺伝子の発現レベルの測定は、様々な遺伝子分析法に従って実施することができる。具体的には、例えばこれらの遺伝子とハイブリダイズする核酸をプローブとして使用するハイブリダイゼーション技術、あるいはマーカー遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとして用いる遺伝子増幅技術を使用し得る。
[000408]試験に用いるプローブ又はプライマーは、該マーカー遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計し得る。それぞれのマーカー遺伝子のヌクレオチド配列に対する識別番号が、本明細書に記載されている。
[000409]さらに、高等生物は一般に高い頻度で遺伝子多型を伴うことを理解すべきである。スプライシングプロセスの間に互いに異なったアミノ酸配列を含むアイソフォームを産生する多くの分子もある。マーカー遺伝子と同様の活性を有する癌関連疾患に関連するいずれの遺伝子も、たとえそれが遺伝子多型による又はアイソフォームであることによるヌクレオチド配列相違を有しても、マーカー遺伝子に含まれる。
[000410]マーカー遺伝子はヒトに加え、他の種の相同体を含むことができることも理解すべきである。従って、特に規定しない限り、表現「マーカー遺伝子」は、種に固有のマーカー遺伝子の相同体、又は個体内に導入されている外来のマーカー遺伝子を指す。
[000411]「マーカー遺伝子の相同体」は、ストリンジェント条件下でプローブとしてヒトマーカー遺伝子にハイブリダイズできる、ヒト以外の種由来の遺伝子も指すことを理解すべきである。こうしたストリンジェント条件は、実験的に又は経験的に同様のストリンジェンシーを生み出す適切な条件を選択できる当業者においては公知である。
[000412]マーカー遺伝子のヌクレオチド配列、又はマーカー遺伝子のヌクレオチド配列の相補鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、少なくとも１５のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドは、プライマー又はプローブとして使用し得る。それ故、「相補鎖」は、他の鎖に関する二本鎖ＤＮＡの一つの鎖を意味し、Ａ：Ｔ（ＲＮＡについてはＵ）及びＧ：Ｃ塩基対から構成される。
[000413]さらに、「相補的」は少なくとも１５の連続したヌクレオチド領域に対して完全に相補的なもののみでなく、場合によっては少なくとも４０％、場合によっては５０％、場合によっては６０％、場合によっては７０％、場合によっては８０％、場合によっては９０％及び場合によっては９５％又はより高い。ヌクレオチド配列間の相同性の程度はＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムによって決定し得る。
[000414]こうしたポリヌクレオチドは、マーカー遺伝子を検出するためのプローブ又はマーカー遺伝子を増幅するためのプライマーとして有用である。プライマーとして用いる場合、該ポリヌクレオチドは通常１５ｂｐ〜１００ｂｐ、及びある態様においてはヌクレオチドの１５ｂｐ〜３５ｂｐを含む。プローブとして用いる場合、ＤＮＡはマーカー遺伝子の全ヌクレオチド配列（又はそれの相補鎖）、又は少なくとも１５ｂｐのヌクレオチドを有するそれの部分的配列を含む。プライマーとして用いる場合、３’領域はマーカー遺伝子に対して相補的でなくてはならないが、一方、５’領域は制限酵素認識配列又はタグ
と連結し得る。
[000415]「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ又はＲＮＡのどちらでもよい。これらのポリヌクレオチドは合成又は天然起源のどちらでもよい。また、ハイブリダイゼーション用のプローブとして用いるＤＮＡは通常標識化されている。当事者はこうした標識化法を容易に理解している。本明細書で、用語「オリゴヌクレオチド」とは、相対的に少ない重合度のポリヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドに含まれている。
[000416]ハイブリダイゼーション法を用いた障害及び／又は疾患のための試験は、例えばノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、又はＤＮＡマイクロアレイ技術などを用いて実施し得る。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ法のような遺伝子増幅技術も使用できる。ＲＴ−ＰＣＲの遺伝子増幅段階の間にＰＣＲ増幅モニタリング法を使用することにより、マーカー遺伝子の発現のより定量的分析を達成し得る。
[000417]ＰＣＲ遺伝子増幅モニタリング法において、検出ターゲット（ＤＮＡ又はＲＮＡの逆転写体）は蛍光色素及び蛍光を吸収する消光剤で標識したプローブとハイブリダイズされる。ＰＣＲが進行してＴａｑポリメラーゼが５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するプローブを分解すると、蛍光色素及び消光剤は互いに引き離れ、蛍光が検出される。蛍光はリアルタイムで検出される。標的のコピー数が既知である標準サンプルを同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅が線形の場合、対象サンプル中の標的のコピー数をサイクル数で求めることができる。また、当業者はＰＣＲ増幅モニタリング法を、いずれかの適切な手法を使用して実行し得ることを認識している。
[000418]癌関連疾患の試験法は、マーカー遺伝子によりコードされたタンパク質を検出することでも実行し得る。以後、マーカー遺伝子によりコードされたタンパク質を「マーカータンパク質」と記載する。こうした試験法として、例えば、各マーカー遺伝子に結合する抗体を使用し、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、及びＥＬＩＳＡ法を用いることができる。
[000419]マーカータンパク質に結合する検出に使用された抗体は、如何なる適切な技術でも産生できる。また、マーカータンパク質を検出するため、こうした抗体を適切に標識できる。もしくは、抗体を標識する代わりに、抗体に特異的結合する物質、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧを標識化してマーカータンパク質を間接的に検出できる。より具体的には、こうした検出法はＥＬＩＳＡ法を含み得る。
[000420]抗原として使用したタンパク質又はそれの部分的ペプチドを、例えば、マーカー遺伝子又はその一部を発現ベクターに挿入し、構成物を適切な宿主細胞に導入して形質転換体を産生し、形質転換体を培養して組み換えタンパク質を発現させ、発現された組み換えタンパク質を培養物または培地の上清から精製する。もしくは、遺伝子によりコードされたアミノ酸配列、又は完全長ｃＤＮＡによりコードされたアミノ酸配列の一部を含むオリゴペプチドを免疫原として用いるために化学合成した。
[000421]さらに、癌関連疾患のための試験は、マーカー遺伝子の発現レベルの指標のみならず、生物学的サンプル中のマーカータンパク質の活性の指標として使用して実施し得る。マーカータンパク質の活性とは、タンパク質固有の生物学的活性を意味する。多様な方法が、各タンパク質の活性を測定するために使用し得る。
[000422]症状が示されているにも関わらず、対象が定期試験において障害及び／又は疾患に罹患していないと診察されても、こうした対象が障害及び／又は疾患に罹患しているかどうかは、本明細書に記載された方法に従って試験を実施することにより容易に決定し
得る。
[000423]より具体的には、ある態様において、該マーカー遺伝子が本明細書に記載された遺伝子の一つである場合、その症状が障害及び／又は疾患への少なくとも感受性を示唆する対象における発現レベルの増加又は減少は、症状が主としてそれらにより引き起こされていることを示す。
[000424]加えて、本試験は障害及び／又は疾患が対象において改善しているかどうかを決定する上で有用である。言い換えると、本明細書に記載された方法は、それらのための治療の療法効果を判断するために使用し得る。さらに、該マーカー遺伝子が本明細書に記載された遺伝子の一つの場合、それらに罹患していると診断された対象における該マーカー遺伝子の発現レベルの増加又は減少は、疾病がより進行していることを暗示する。
[000425]障害及び／又は疾患の重症度及び／又は感受性は、発現レベルの相違に基づいても決定することができる。例えば、該マーカー遺伝子が本明細書に記載された遺伝子の一つの場合、該マーカー遺伝子の発現レベルの増加の程度は、障害及び／又は疾患の存在及び／又重症度と相関する。
[000426]動物モデル
[000427]別の側面において、一つ以上のマーカー遺伝子又は該マーカー遺伝子と機能的に均等な遺伝子の発現レベルが動物モデルにおいて上昇されている、障害及び／又は疾患のための動物モデルを作製し得る。本明細書で使用される「機能的に均等な遺伝子」とは、一般的に、該マーカー遺伝子によりコードされたタンパク質の既知の活性と同様の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。機能的に均等な遺伝子の代表的例には、該動物に固有である対象動物のマーカー遺伝子のカウンターパートが含まれる。
[000428]動物モデルは、障害及び／又は疾患による生理学的変化を検出するために有用である。ある態様において、該動物モデルは、マーカー遺伝子の追加の機能を明らかにするため、及び標的がマーカー遺伝子である薬剤を評価するために有用である。
[000429]動物モデルは、カウンターパート遺伝子の発現レベルを制御することにより、又はカウンターパート遺伝子を投与することにより作製し得る。該方法は、本明細書に記載した遺伝子のグループから選択される遺伝子の発現レベルを制御することにより、動物モデルを作製することを含み得る。別の態様において、該方法は、本明細書に記載された遺伝子によりコードされたタンパク質を投与することにより、又は該タンパク質に対する抗体を投与することにより、動物モデルを作製することを含み得る。ある他の態様において、該マーカーが適切な方法を使用して測定できるように、該マーカーを過剰発現させることが可能であることも理解すべきである。別の態様において、動物モデルは、遺伝子のこうした群より選択される遺伝子を導入することにより、又はこうした遺伝子によりコードされたタンパク質を投与することにより作製し得る。別の態様において、障害及び／又は疾患は、遺伝子のこうした群より選択される遺伝子の発現を、又はこうした遺伝子によりコードされたタンパク質の活性を抑制することにより誘発し得る。アンチセンス核酸、リボザイム、又はＲＮＡｉが該発現を抑制するために使用し得る。タンパク質の活性は、抗体のような、活性を抑制する物質を投与することにより効果的に制御し得る。
[000430]該動物モデルは、障害及び／又は疾患の根底にある機構を評価するため、及びスクリーニングにより得られた化合物の安全性を試験するためにも有用である。例えば、動物モデルが特定の障害及び／又は疾患の症状を発症した場合、又はある種の障害及び／又は疾患に関与する測定値が動物中で変化した場合、疾患を寛解する活性を有する化合物を探索するため、スクリーニングシステムを構築し得る。
[000431]本明細書で使用される表現「発現レベルの増加」とは、以下のいずれか一つを指す：外来遺伝子として導入されたマーカー遺伝子が人工的に発現された場合；対象動物に固有のマーカー遺伝子の転写及びタンパク質へのそれらの翻訳が増強された場合；翻訳生成物であるタンパク質の加水分解が抑制された場合。
[000432]本明細書で使用される表現「発現レベルの減少」とは、対象動物のマーカー遺伝子の転写、及びタンパク質へのそれらの翻訳が抑制された状態、又は翻訳産物である該タンパク質の加水分解が増強された状態を指す。遺伝子の発現レベルは、例えば、ＤＮＡチップ上のシグナル強度の相違により決定し得る。さらに、翻訳産物（タンパク質）の活性は、正常状態のものと比較することにより決定し得る。
[000433]該動物モデルはトランスジェニック動物を含むことも企図された範囲内であり、例えば、マーカー遺伝子が導入されており、そして人工的に発現される動物；マーカー遺伝子ノックアウト動物；及び別の遺伝子でマーカー遺伝子が置換されているノックイン動物が含まれる。マーカー遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ効果を有するポリヌクレオチド、又はデコイ核酸もしくはそうしたものとして機能するＤＮＡが導入されているトランスジェニック動物がトランスジェニック動物として使用できる。こうしたトランスジェニック動物には、例えば、遺伝子のコード領域内に突然変異を導入すること、又はアミノ酸配列が修飾されて加水分解に対して抵抗性又は感受性となることにより、マーカータンパク質の活性が増強されている又は抑制されている動物が含まれる。アミノ酸配列中の突然変異には、置換、欠失、挿入及び付加が含まれる。
[000434]発現の例
[000435]加えて、マーカー遺伝子の発現それ自身を、該遺伝子の転写調節領域内に突然変異（単数又は複数）を導入することにより制御し得る。当業者はこうしたアミノ酸置換を理解している。また、活性が維持されている限り、変異されたアミノ酸の数は特に制限されない。通常、それは５０アミノ酸以内、ある非制限態様においては３０アミノ酸以内、１０アミノ酸以内又は３アミノ酸以内である。突然変異の部位は、活性が維持されている限り、いずれの部位であってもよい。
[000436]さらに別の側面において、特定の障害及び／又は疾患を治療する療法剤のための候補化合物についてのスクリーニング法が本明細書において提供される。一つ以上のマーカー遺伝子が本明細書に記載した遺伝子の群から選択される。癌関連疾患のための療法剤は、マーカー遺伝子（単数又は複数）の発現レベルを増加させる又は減少させることが可能な化合物を選択することにより得ることが可能である。
[000437]表現「遺伝子の発現レベルを増加させる化合物」とは、遺伝子転写、遺伝子翻訳又はタンパク質活性の発現のいずれか一つの段階を促進する化合物を指す。一方、本明細書で使用される表現「遺伝子の発現レベルを減少させる化合物」は、これらの段階のいずれか一つを阻害する化合物を指す。
[000438]特定の側面において、障害及び／又は疾患の療法剤についてのスクリーニング法は、インビボかあるいはインビトロで実施し得る。このスクリーニング法は、例えば、１）候補化合物を動物対象に投与すること；
２）動物対象からの生物学的サンプル中のマーカー遺伝子（単数又は複数）の発現レベルを測定すること；又は
３）候補化合物に接触していない対照中のレベルと比較し、マーカー遺伝子（単数又は複数）の発現レベルを増加させる又は減少させる化合物を選択すること、により実施し得る。
[000439]さらに別の側面において、動物対象と候補化合物を接触させ、そして該動物対象に由来する生物学的サンプル中のマーカー遺伝子（単数又は複数）の発現レベルに対する化合物の効果をモニタリングすることにより、マーカー遺伝子（単数又は複数）の発現レベルに対する医薬品のための候補化合物の効力を評価する方法が本明細書において提供される。該動物対象に由来する生物学的サンプル中のマーカー遺伝子（単数又は複数）の発現レベルにおける変動は、上記の試験法に使用した同一技術を使用してモニターし得る。さらに、評価に基づいて、医薬品のための候補化合物をスクリーニングにより選択し得る。
[000440]本明細書で引用した全ての特許、特許出願及び参照文献は、その全体が本明細書において援用される。本発明は当業者がそれを作製する及び使用するのに十分に詳しく説明され及び例示されてきたが、本発明の精神及び範囲から離れることなく、多様な変形、修正及び改善ができるのは明らかなはずである。本発明は、課題を実行し、そして記述した目的及び利点、ならびにここに固有のものを得るためにうまく適用されることを、当業者は容易に理解する。
[000441]ある種の核酸塩基配列
[000442]本明細書に記載された成熟ｍｉＲＮＡ及びそれらの対応するステムループ配列の核酸塩基配列は、http://microrna.sanger.ac.uk/ で見出されたｍｉＲＮＡ配列のオンライン検索可能なデータベース及びアノテーション（annotation）、ｍｉＲＢａｓｅで見出された配列である。ｍｉＲＢａｓｅ配列データベースへのエントリーで、成熟ｍｉＲＮＡ配列の位置及び配列についての情報を伴った、ｍｉＲＮＡ転写体の推定ヘアピン部分（ステムループ）が示される。データベース中のｍｉＲＮＡステムループ配列は、厳密には前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）ではなく、ある場合は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及び推定一次転写体からのいくらかの隣接配列を含む。本明細書に記載されたｍｉＲＮＡ核酸塩基配列は、ｍｉＲＢａｓｅ配列データベースのリリース１０．０に記載されている配列及びｍｉＲＢａｓｅ配列データベースのより以前のいずれかのリリースに記載されている配列を含む、いずれのバージョンのｍｉＲＮＡも包含する。配列データベースリリースは、ある種のｍｉＲＮＡの改称を生じさせることがある。配列データベースリリースは、成熟ｍｉＲＮＡ配列の変化を生じさせることがある。こうした修飾オリゴヌクレオチドを包含することができる該化合物は、本明細書に記載されたｍｉＲＮＡのいずれの核酸塩基配列バージョンとも相補的であることができる。
[000443]本明細書に示したいずれの核酸塩基配列も、糖部分、ヌクレオシド間結合又は核酸塩基への何らかの修飾とは独立であることが理解される。さらに、Ｕを含む核酸塩基配列は、Ｕを有する一つ以上の位置でＵがＴにより置き換えられた同一の核酸塩基配列も包含することが理解される。逆に、Ｔを含む核酸塩基配列は、Ｔを有する一つ以上の位置でＴがＵにより置き換えられた同一の核酸塩基配列も包含することが理解される。
[000444]ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体と相補的である核酸塩基配列を有し、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれ以上の核酸塩基の領域にわたって、ｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であること、又は二つの配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。従って、ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、その標的ｍｉＲＮＡ又は標的ｍｉＲＮＡ前駆体配列に関して一つ以上の不適正な塩基対を有することができ、
そしてその標的配列へハイブリダイズすることが可能である。ある態様において修飾オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体と１００％相補的である核酸塩基配列を有する。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、ｍｉＲＮＡに完全長相補性を有する。
[000445]ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）療法
[000446]いくつかの態様において、本発明は、対象において一つ以上の遺伝子の発現を抑制するマイクロＲＮＡを提供する。マイクロＲＮＡ発現プロファイルは、新しい種類の癌バイオマーカーとして働き得る。
[000447]本明細書に含まれるのは、一つ以上のＭｉＲを使用した、遺伝子発現及び／又は活性を抑制する方法である。いくつかの態様において、ｍｉＲ（単数又は複数）は、タンパク質の発現を阻害する。他の態様において、ｍｉＲＮＡ（単数又は複数）は、遺伝子活性を阻害する（例えば、細胞侵入活性）。
[000448]ｍｉＲＮＡは、細胞又は組織から単離する、組換え的に産生する、又は当業者には公知である多様な技術によりインビトロで合成することができる。一つの態様において、ｍｉＲＮＡは細胞又は組織から単離される。細胞又は組織からｍｉＲＮＡを単離する技術は、当業者には公知である。例えば、ｍｉＲＮＡは、Ambion, Incの mirVana ｍｉＲＮＡ単離キットを使用し、全ＲＮＡから単離し得る。別の技術は、flashIPAGE（商標）Fractionator System（Ambion, Inc.）を小さな核酸のＰＡＧＥ精製に利用する。
[000449]ｍｉＲＮＡ療法の使用については、インビボで投与された核酸が取り込まれ、そして細胞及び組織に分布することが当業者には認識されている。
[000450]核酸は、剤及び／又は核酸送達システムの組織特異的取込みを可能にする、適した様式で送達することができる。本明細書に記載された製剤は、限定されるわけではないが、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性剤の投与、天然アミノ酸、ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体及び生物学的応答修飾物質を含む、いずれかの既知の慣用的療法による治療状態を補うことができる。二つ又はそれ以上を組み合わせた化合物を一緒に又は連続的に使用することができる。
[000451]本発明のある態様は、（ａ）一つ以上の核酸又は小分子化合物及び（ｂ）一つ以上の他の化学療法剤を含有する医薬組成物を提供する。
[000452]追加の有用な定義
[000453]「対象」とは、治療又は療法のために選択されたヒト又は非ヒト動物を意味する。「有することが疑われる対象」とは、障害、疾患又は状態の一つ以上の臨床指標を示している対象を意味する。
[000454]「予防すること」又は「予防」とは、状態又は疾患の開始、発症又は進行を週、月、年を含む一時期、遅延させる又は未然に防ぐことを指す。「治療」又は「治療する」とは、障害及び／又は疾患の治癒又は寛解のために使用された一つ以上の具体的過程の適用を意味する。ある態様において、具体的過程は一つ以上の医薬品の投与である。
[000455]「寛解」とは、状態又は疾患の少なくとも一つの指標の重症度の緩和を意味する。ある態様において、寛解は、状態又は疾患の一つ以上の指標の進行を遅延させる又は減速することを含む。指標の重症度は、当業者には公知である主観的又は客観的測定により決定することができる。
[000456]「それを必要とする対象」とは、療法又は治療を必要としていると同定された対象を意味する。
[000457]「投与すること」とは、対象に医薬品又は組成物を提供することを意味し、限定されるわけではないが、医療専門家による投与及び自己投与を含む。
[000458]「非経口投与」とは、注射又は注入を介した投与を意味する。非経口投与には、限定されるわけではないが、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与及び頭蓋内投与が含まれる。「皮下投与」は、皮膚直下への投与を意味する。
[000459]「機能を改善する」とは、正常パラメータに向かう機能の変化を意味する。ある態様において、機能は、対象の体液に観察される分子を測定することにより評価される。「医薬組成物」とは、医薬品を含み、個体に投与するために適した物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は修飾オリゴヌクレオチド及び滅菌水性溶液を含んでいてもよい。
[000460]「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、「標的ＲＮＡ転写体」及び「核酸標的」はすべて、アンチセンス化合物により標的化されることが可能な核酸を意味する。「標的化」とは、標的核酸にハイブリダイズし、そして所望の効果を誘発するであろう核酸塩基配列の設計及び選択のプロセスを意味する。「へ標的化された」とは、標的核酸へのハイブリダイゼーションを可能にして所望の効果を誘発するであろう核酸塩基配列を有していることを意味する。ある態様において、所望の効果は標的核酸の減少である。
[000461]「変調」とは、機能又は活性の摂動を意味する。ある態様において、変調は遺伝子発現の増加を意味する。ある態様において、変調は遺伝子発現の減少を意味する。
[000462]「発現」とは、遺伝子のコードされた情報が、存在する構造体に変換されそして細胞中で作動する、いずれかの機能及び段階を意味する。
[000463]「領域」とは、核酸内の連結されたヌクレオシドの一部を意味する。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、標的核酸の領域と相補的である核酸塩基配列を有する。例えば、あるこうした態様において、修飾オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡステムループ配列の領域と相補的である。あるこうした態様において修飾オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡ配列の領域と１００％同一である。
[000464]「セグメント」とは、領域よりも小さな又は副部分を意味する。
[000465]「核酸塩基配列」とは、いかなる糖、連結及び／又は核酸塩基修飾とは無関係に、５’から３’方向における近接核酸塩基の順序を意味する。
[000466]「近接核酸塩基」とは、核酸中のお互いにすぐ隣接した核酸塩基を意味する。
[000467]「核酸塩基相補性」とは、水素結合を介して非共有結合で対となる二つの核酸塩基の能力を意味する。「相補的」とは、第一の核酸塩基配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれ以上の核酸塩基の領域にわたって、第二の核酸塩基配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一又は１００％同一であることを意味し、該二つの配列はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。ある態様において、ｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体と１００％相補的である核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの全長にわたってｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体と１００％相補的でなくてもよい。
[000468]「相補性」とは、第一の核酸及び第二の核酸間の核酸塩基対形成能力を意味する。「完全長相補性」とは、第一の核酸の各々の核酸塩基が、第二の核酸中の対応する位
置の各々の核酸塩基と対形成することができることを意味する。例えば、ある態様において、各核酸塩基がｍｉＲＮＡ中の核酸塩基に相補性を有する修飾オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡに対する完全長相補性を有する。
[000469]「パーセント相補的」とは、核酸の長さで割られた、核酸中の相補的核酸塩基の数を意味する。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドのパーセント相補性とは、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基数で割られた、標的核酸と相補的である核酸塩基の数を意味する。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドのパーセント相補性とは、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の数で割られた、ｍｉＲＮＡと相補的である核酸塩基の数を意味する。
[000470]「パーセント結合領域」とは、オリゴヌクレオチド領域との領域相補性のパーセントを意味する。パーセント結合領域は、オリゴヌクレオチドと相補性である標的領域の核酸塩基の数を、標的領域の長さで割ることにより計算される。ある態様において、パーセント結合領域は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％である。
[000471]「パーセント同一性」とは、第一の核酸中の核酸塩基の総数で割られた、第二の核酸中の対応する位置の核酸塩基と同一である第一の核酸中の核酸塩基の数を意味する。
[000472]本明細書で使用する「実質的に同一」とは、第一と第二の核酸塩基配列が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれ以上の核酸塩基の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一又は１００％同一であることを意味する。
[000473]「ハイブリダイズする」とは、核酸塩基相補性を介して生じる相補的核酸のアニーリングを意味する。
[000474]「不適正」とは、第二の核酸の対応する位置の核酸塩基と対形成ができない、第一の核酸核酸塩基を意味する。
[000475]「非相補的核酸塩基」とは、水素結合を介して対形成ができない二つの核酸塩基を意味する。
[000476]「同一」とは、同じ核酸塩基配列を有していることを意味する。
[000477]「ｍｉＲＮＡ」又は「ｍｉＲ」とは、コードＲＮＡにハイブリダイズし、そして発現を調節する、１８から２５の間の核酸塩基長の非コードＲＮＡを意味する。ある態様において、ｍｉＲＮＡは酵素ダイサーによるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ切断の生成物である。ｍｉＲＮＡの例は、ｍｉＲＢａｓｅとして知られているｍｉＲＮＡデータベース（http://microrna.sanger.ac.uk/）にある。
[000478]「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」又は「ｐｒｅ−ｍｉＲ」とは、ｍｉＲＮＡを含むヘアピン構造を有する非コードＲＮＡを意味する。ある態様において、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ドローシャとして知られている二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼによるｐｒｉ−ｍｉＲの切断の生成物である。
[000479]「ステムループ配列」とは、ヘアピン構造を有し、成熟ｍｉＲＮＡ配列を含有
するＲＮＡを意味する。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列及びステムループ配列は、重複することができる。ステムループ配列の例は、ｍｉＲＢａｓｅとして知られているｍｉＲＮＡデータベース（http://microrna.sanger.ac.uk/）にある。
[000480]「ｍｉＲＮＡ前駆体」とは、ゲノムＤＮＡを起源とし、一つ以上のｍｉＲＮＡ配列を含んでいる非コード、構造化ＲＮＡを含む転写体を意味する。例えば、ある態様において、ｍｉＲＮＡ前駆体はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。ある態様において、ｍｉＲＮＡ前駆体はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡである。
[000481]「アンチセンス化合物」とは、標的核酸へのハイブリダイゼーションを可能にするであろう核酸塩基配列を有している化合物を意味する。ある態様において、アンチセンス化合物は標的核酸と相補的な核酸塩基配列を有しているオリゴヌクレオチドである。
[000482]「オリゴヌクレオチド」とは、その各々がお互いに独立して修飾され得る又は修飾されていない、連結されたヌクレオシドのポリマーを意味する。「天然に存在するヌクレオシド間連結」とは、ヌクレオシド間の３’−５’ホスホジエステル結合を意味する。「天然核酸塩基」とは、その天然に存在する形態と比較して修飾されていない核酸塩基を意味する。「ｍｉＲアンタゴニスト」とは、ｍｉＲＮＡの活性を妨害する又は阻害するように設計された剤を意味する。ある態様において、ｍｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物を含む。ある態様において、ｍｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体の核酸塩基配列と相補的である核酸塩基配列を有している修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある態様において、ｍｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡの活性を妨害する又は阻害する小分子などを含む。
[000483]本明細書に記載された方法及び試薬は、好ましい態様の代表であり、例であり、本発明の範囲の制限を意図するものではない。それらの中の修正及び他の使用を当業者は思いつくであろう。これらの修正は本発明の精神内に包含され、特許請求の範囲により規定される。本発明の範囲及び精神から離れることなく、置換及び修正を変化させることを本明細書に開示した発明に行うことができることも、当業者には容易に明らかになるであろう。
[000484]本発明を、好ましい態様及び随意の特徴により具体的に開示してきたが、本明細書に開示した概念の修正及び変形を当業者は考えることができ、こうした修正及び変形は付随する請求の範囲に規定した本発明の範囲内であると考えられる。
[000485]本発明を多様な及び好ましい態様を参照して説明してきたが、本発明の本質的範囲から離れることなく、多様な変形を行うことができ、そして均等物でそれらの要素を置換することができることを当業者は理解するであろう。加えて、多くの修正を、その本質的範囲から離れることなく、本発明の教示による特定の状況又は材料に適合させるために行うことができる。
[000486]参照文献
[000380]本発明を明らかにする又は本発明の実行についての追加の詳細を提供するため、本明細書で使用された刊行物及び他の材料が参照文献としてここに取り込まれ、そして都合がよいように下記の文献目録に提供されている。
[000381]本明細書に列挙したいずれの文書の引用も、いずれの先行文献も適切な先行技術であるとの承認を目的とするものではない。日付に関する全ての記載又はこれらの文書の内容に関する全ての表現は、出願者に入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関する承認を構成するものではない。
実施例ＩＩについての参考文献

Claims (1)

  1. 前立腺癌を有する対象における前立腺癌細胞中のＸＰＯ６タンパク質発現を減少させるための医薬組成物であって、前立腺癌細胞中のＸＰＯ６タンパク質レベルを減少させるために十分な有効量のｍｉＲ−１遺伝子産物を含む、前記医薬組成物。
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