CN105056250B - 一种microRNA在制备治疗前列腺癌的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及miR‑487在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，以及一种以miR‑487为活性成分的药物组合物，本发明所提供的药物组合物能够通过miR‑487对前列腺癌细胞转移能力的抑制作用来抑制前列腺癌的发展过程，抑制效率高达80％。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种microRNA在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
背景技术
前列腺癌是男性生殖中最常见的恶性肿瘤，发病随年龄而增加，仅次于肺癌，是男性因癌症死亡的第二大原因。2009年，美国估计有192280例前列腺癌新发患者和27360例死亡患者。由于我国人口老龄化，前列腺癌发病率有所增加。临床上，手术或放疗针对局限前列腺癌是有效的，但是对于转移者是不可治愈的，针对转移性前列腺癌治疗仍然缺乏有效的药物。miRNA是调节基因表达的内源性非编码小分子RNA，在转录后水平对基因表达进行调控，参与细胞周期、凋亡、发育、分化和新陈代谢等生理过程。miRNA在细胞中表达失调会导致癌症在内的多种疾病的发生，最新研究表明，一些miRNA在前列腺中异常表达，但何种miRNA与前列腺癌的发生、发展有关仍未达成共识。
因此有必要寻找与前列腺癌发生、发展有关的miRNA，从而为临床上治疗转移性前列腺癌提供一种有效手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制前列腺癌发展的含有miRNA的药物组合物，为临床上治疗转移性前列腺癌提供可能。
本发明的发明人在对前列腺癌的转移机制进行研究的过程中发现miR-487在前列腺癌上皮细胞系PC-3、DU145细胞中表达显著性降低，同时发现miR-487能够抑制癌细胞增殖和迁移、促进细胞凋亡，miR-487能够抑制裸鼠体内前列腺肿瘤细胞的转移。前列腺癌细胞中miR-487的表达量高低可作为癌细胞转移的一个分子标记物。
本发明的一个方面提供了miR-487在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，所述miR-487的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
可选的，所述应用包括制备抑制前列腺癌细胞迁移、侵袭和增殖的药物。
可选的，所述应用包括将miR-487与载体结合后与抗肿瘤药物和/或药物可接受的辅料复配制成药物组合物。
本发明的一个方面提供了miR-487在制备抑制前列腺癌细胞高转移性细胞系PC-3和/或DU145的迁移能力的药物中的应用。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物以miR-487为活性成分，其中，所述miR-487的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
可选的，所述药物组合物含有与载体结合的miR-487和/或药物可接受的辅料。
在本发明所提供的药物组合物中，载体可以为本领域常用的适合于miRNA在宿主细胞中表达的载体种类，例如，所述载体可以为脂质体、壳聚糖或慢病毒表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为慢病毒表达载体，优选的，所述慢病毒表达载体可以为pWPXL、pMD2.G或psPAX2慢病毒表达载体。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述药物组合物还任选地包含一种或多种其他对前列腺癌有效的肿瘤药物，可选的，所述药物组合物中含有铂类抗肿瘤药物，还可以包含以铂类抗肿瘤药为基础的联合化疗方案中常规使用的其他肿瘤药物，这些其他肿瘤药物是本领域技术人员所熟知的。
可选的，所述抗肿瘤药物为顺铂或卡铂。
当将miR-487与铂类抗肿瘤药物联合使用时，铂类抗肿瘤药物的用量可以减少至常规化疗方案中用量的20-80％。
本发明中，所述药物组合物的给药途径为静脉内、动脉内灌注或局部注射等，也可以采用本领域技术人员所熟知的靶向给药技术进行睾丸或肿瘤靶向给药。
本发明所提供的药物组合物能够通过miR-487对前列腺癌细胞转移能力的抑制作用来抑制前列腺癌的发展过程，抑制效率高达80％。见图5.
附图说明
图1为miR-487抑制细胞增殖及克隆成球。
其中，(A)为miR-487转染PC-3，Q-PCR检测miR-487的表达量；(B)为miR-487转染PC-3后检测细胞增殖；(C)为克隆成球能力检测。
图2为miR-487能够促进前列腺癌细胞凋亡结果图。
其中，(A)为miR-487转染PC-3后，Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡；(B)为凋亡细胞数目量化图。
图3为miR-487抑制前列腺癌细胞迁移和侵袭结果图。
其中，(A-D)为miR-487转染PC-3细胞，细胞刮痕实验检测细胞迁移；(E)为miR-487转染PC-3细胞，transwell实验检测细胞迁移；(F)为miR-487转染PC-3后，transwell实验检测细胞侵袭。
图4为Western blot检测细胞迁移侵袭相关蛋白分子变化。
其中，(A)为PC-3转染miR-487后细胞形态发生变化。(B)为western blot检测miR-487转染PC-3后E-cad和N-cad的表达变化。
图5为经过转化miR-487后的PC-3细胞接种到裸鼠皮下的成瘤情况
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
在本发明中，术语“miR-487”是指包含SEQ ID No.1所示序列或其同源序列的微小RNA。本领域中已知各种来源的miR-487，例如，人、鼠、兔等，这些同源序列均包含在本发明的术语miR-487中。本发明的术语中还包含上述天然存在的miR-487序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰后仍具有miR-487生物活性的衍生RNA。本发明中，人工合成的以及可以通过购买市售商品方式获得的具有miR-487生物学活性的miR-487模拟物也属于本发明的保护范围。
此外，本发明所述的miR-487也可以为前体形式，miR-487前体是指在被施用对象的细胞内或体内可以被加工成为miR-487的前体。获得天然存在的miR-487前体的方法为本领域技术人员所公知。
本领域技术人员公知，miR-487的初始转录产物经过一系列的加工后，形成成熟的miR-487。miR-487前体只有在加工成成熟的miR-487后才具有相应的生物学功能。
本发明所提供的组合物可以用于治疗前列腺癌。所述组合物中含有有效量的本发明的miR-487。
在本发明中，所述药物可接受的辅料包括各种赋形剂、稀释剂和佐剂。辅料其本身并不是必要的活性成分，且使用后没有过分的毒性。这类辅料包括但不限于：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇等。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物的形式适合于：直接裸microRNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法或复制缺陷腺病毒携带目的DNA法等。
本发明的miR-487的有效剂量可以随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等进行相应的调整。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员综合各因素来确定。所述因素包括但不限于：miR-487的药代动力学参数、被治疗的患者的健康状况、体重、给药途径等。
本发明中，所述药物组合物的给药途径为静脉内、动脉内灌注或局部注射等，也可以采用本领域技术人员所熟知的给药技术进行给药。
本发明的药物组合物可以与其它治疗手段联合，用于前列腺癌的治疗。
实施例1
实例中所使用的细胞PC-3购自ATCC，即美国模式培养物保藏所，转染试剂lipofectamine 2000购自invitrogen，miR-487mimic购自Life TechnologiesCorporation(产品ID号为MC10648)miR-487 inhibitor购自Life TechnologiesCorporation(产品ID号为MH10648)。
本实施例通过体外细胞生物学实验证明miR-487对前列腺肿瘤细胞转移的功能的抑制作用。
培养PC-3细胞系，分为实验组和对照组分别转染miR-NC(阴性对照)和miR-487，检测细胞增殖、迁移以及凋亡变化。
(1)miR-487能够抑制细胞增殖及克隆成球：
用lipofectamine 2000将miR-487的模拟物miR-487mimics转染(用转染试剂lipofectamine 2000直接转染)前列腺细胞系PC-3，并用Q-PCR检测其表达量如图1A，结果表明，miR-487mimics转染PC-3后细胞中miR-487表达量显著性上升，证明mimics能够模拟miR-487的表达。miR-487mimics转染PC-3细胞24、36、48、72和96h后，体外用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，如图1B，结果表明，miR-487能够显著性抑制前列腺癌细胞的增殖。用软琼脂培养克隆形成实验检测细胞群体依赖性和增殖能力。取对数生长期的单层培养细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中备用。将细胞悬液倍数稀释接种于软琼脂培养板中，静置培养10-14周，计算克隆形成率，如图1C，结果表明miR-487能够显著性抑制PC-3的克隆成球能力。
(2)miR-487能够促进前列腺癌细胞凋亡。
将miR-487mimics转染PC-3后Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术检测凋亡细胞的数目。
结果见图2：miR-487mimics转染PC-3能够显著提高Annexin V阳性的细胞数，证明miR-487能够显著引起PC-3细胞凋亡，
(3)miR-487能够抑制前列腺癌细胞迁移和侵袭。
miR-487mimics转染PC-3细胞，细胞划痕实验检测细胞的迁移，如图3A-D，另外用transwell侵袭实验验证细胞的迁移和侵袭能力，如图3E-F，结果表明miR-487mimics转染PC-3，细胞迁移和侵袭能力下降。
(4)Western blot检测细胞迁移侵袭相关的蛋白分子变化
miR-487mimics转染PC-3细胞24小时后，细胞形态发生变化，如图4A所示，提取蛋白质，检测细胞粘附蛋白N-caderin(神经钙粘素)和E-caderin(上皮细胞钙黏蛋白)的表达，结果表明，miR-487能够抑制癌细胞表面N-caderin，促进E-caderin的表达，如图4B所示，表明miR-487能够抑制前列腺癌上皮间质转化，抑制癌细胞发生转移。
实施例2
本实施例通过体内实验证明miR-487对前列腺肿瘤细胞转移的功能的抑制作用。
将10只裸鼠随机分为两组，对照组尾静脉注射表达对照miRNA的PC-3M-luc(该细胞为将荧光素酶报告载体转染来源于ATCC的PC-3细胞获得)。细胞个数为6×106；实验组注射表达miR-487的PC-3M-luc细胞系，细胞个数为6×106；注射细胞5周后，每只鼠每周注射100μl浓度为30μg/μl的荧光素酶底物D-luciferin，然后小动物活体成像观察荧光素酶分布，连续三周统计癌细胞转移率。PC-3细胞系转染miR-NC和miR-487后，用transwell方法检测细胞的迁移变化，用CCK-8试剂盒检测细胞增殖变化，用Annexin V/PI方法检测细胞凋亡变化。体内转移实验用小动物活体成像观察细胞转移到的器官部位，进行相关统计。
10周后对取小鼠的肿瘤部分，进行称重和比较，miR-487转化的PC-3细胞成瘤大小明显低于对照组，经体积和称重结果统计抑制效率为80％。结果见图5。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.miR-487在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，所述miR-487的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括制备抑制前列腺癌细胞迁移、侵袭和增殖的药物。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，包括将miR-487与载体结合后与抗肿瘤药物和/或药物可接受的辅料复配制成药物组合物。
4.miR-487在制备抑制前列腺癌细胞高转移性细胞系PC-3和/或DU145的迁移能力的药物中的应用，所述miR-487的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
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