JP5916017B2 - 新規なｍｕｃ１抗体 - Google Patents

Description

本発明は、抗体分野の技術に関する。より特定すると、ムチン−１に対する抗体およびこれを用いたがん治療技術に関する。

ムチンの一種であるムチン−１（Ｍｕｃｉｎ１、本明細書以下ＭＵＣ１とも記載する）は、腫瘍関連抗原であり、多くの腺がんで発現している高分子量糖タンパク質である。このタンパク質に不可欠な膜糖タンパク質の細胞外ドメインは、セリン、トレオニンおよびプロリンに富む２０個のアミノ酸コア配列（本明細書以下「Ｔｎ２０マー」とも称する；ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ(配列番号１）)の３０〜９０タンデム型反復から主として構成されることが知られている。また「Ｔｎ２０マー」は、個体によって発現される反復数が異なっており、これらは遺伝的に決定され、サイズ多型を生じる。

腫瘍ＭＵＣ１は、一般には低グリコシル化されていて、グリコシル化部位はしばしば異常型糖鎖伸長を有する。この異常型グリコシル化が正常な潜在的（ｃｒｙｐｔｉｃ）ペプチドエピトープの露出および新規炭水化物エピトープの創出という結果を生じる。それらの高分子量（２×１０^５〜５×１０^７ダルトン）ならびに広範囲なグリコシル化のために、細胞膜ムチンは柔軟な杆状体として存在し、細胞表面から比較的大きな距離で突出している。したがって、ムチンは、多糖外皮の重要な成分を形成し、おそらく抗体と免疫系の細胞との細胞接触の第１のポイントと考えられる。

過去に、精製したＭＵＣ１並びにＭＵＣ１に由来する合成ペプチド及びグリコペプチドに対する多数のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が製造されてきた（特許文献１−５、非特許文献１−２）。これらの抗体のほとんどの最小配列認識は、ＡＰＤＴＲＰＡＰ(配列番号１０）内に存在すると考えられる。ＭＵＣ１タンデム型反復中の配列ＳＡＰＤＴＲＰ(配列番号１１）は、免疫優性Ｂ細胞エピトープであり、配列ＰＤＴＲＰ(配列番号１２）は、タンデム型反復のＴ細胞エピトープに位置付けられている。これらの配列中に含まれるスレオニンについては、重度にＯ−グリコシル化されているため、ＭＵＣ１に結合する抗体の選択性およびそのアフィニティに影響を及ぼすことが考えられる。しかし、上記のいずれのモノクローナル抗体も、エピトープであるペプチドへの糖鎖結合の有無による差異は認識できたとしてもその糖鎖構造の差異までは認識できなかったため、がん細胞に対する選択性が充分とは言えなかった。

特許第３６９８３７０号明細書 特表２００２−５０２６２１公報 特表２００３−５１９０９６公報 米国特許出願公開２００６／０２９２６４３ 特表２０１０−５０５７７５公報

Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５５： １３３７−１３４７ （２００６） Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． ２１， Ｎｏ． ４， １９７−２１０， （２０００）

本発明は、がん細胞で高発現する糖鎖構造を有するＭＵＣ１細胞に特異性を有する抗体を提供することを課題とする。

上記課題は、本発明者らが、ＳＴｎ型糖鎖（化合物番号４）を付加したペプチド（ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ(配列番号１）のアミノ酸配列に従ったエピトープを抗原として用いて動物を免疫することによって得られた抗体が、複数の種類からなるがん特異的な糖鎖に特異性を有しており、ひいてはＭＵＣ１を発現するがん細胞に対する特異性が従来の抗体よりも顕著に高いことを見出したことによって、解決した。

別の局面において、本発明は、ＭＵＣ１のがん関連構造に対する特異性が、ＭＵＣ１の正常組織関連構造に対するものに比べ４０倍以上である、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

より特定すると、本発明は、ＭＵＣ１のがん関連構造に対するＭＵＣ１の正常組織関連構造の交差反応性比が４０倍以上である、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子であって、該正常組織関連構造は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα−ＲおよびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒからなる群より選択され、該がん関連構造は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−Ｒ＜本明細書におけるＳＴｎ（化合物４）に対応する。＞、Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ＜本明細書におけるＳＴ２−６（化合物１０）に対応する。Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ＜本明細書におけるｄＳＴ（化合物１１）に対応する。＞からなる群より選択され、ここで、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸であり、Ｇａｌはガラクトースであり、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミンであり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンであり、Ｒは非糖部分である、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

別の実施形態において、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子のがん関連構造への特異性は、ＳＴｎ（化合物４）に対する交差反応性によって表現することができる。交差反応性は、（ＳＴｎ（化合物４）に対するＩＣ５０／比較する糖鎖構造に対するＩＣ５０）×１００（％）の計算式で求められる。１つの実施形態において、本発明の抗体は、がん関連構造のＮｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−Ｒ（１００％）に対して、前記正常組織関連構造のいずれについてもその交差反応性が約２％以下であり、５０倍以上の特異性を有することが示される。

さらに別の局面では、本発明は、がん細胞に対する特異性が正常細胞に対するものより少なくとも２０倍強い抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

１つの実施形態として、本発明は、乳がん細胞に対する特異性が乳腺上皮細胞に対するものより約７０倍強い抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

１つの実施形態として、本発明は、ＭＵＣ１のがん関連構造Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−Ｒに対する前記正常組織関連構造の交差反応性比が５０倍以上である、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

１つの実施形態として、本発明は、ＦＡＣＳによる細胞への結合評価において、蛍光シグナルシフトで特異性を評価したときの、Ｔ−４７Ｄ細胞に対する特異性が１８４Ａ１細胞に対するものより１００倍以上強い、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

さらに別の局面では、本発明は、Ｔｎ２０マー（あるいは、配列番号１で示されるアミノ酸）のタンデムリピート依存性が低いことを特徴とする、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。ここで、依存性の低さは、Ｔｎ２０マービオチンを用いた場合の４５０ｎｍの吸光度（Ａ２０）と、Ｔｎ１００マービオチンを用いた場合の４５０ｎｍの吸光度（Ａ１００）の比（Ａ１００／Ａ２０）が２以下であり、好ましくは、１．５倍以下であることが一つの特徴でありうる。

さらに特定の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）を含む少なくとも１つの抗原結合部位を有する抗体であって、該重鎖可変ドメインは、その配列中に、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は、ＳＨＤＭＳ（配列番号４）またはその改変体からなり、ＣＤＲ２は、ＡＩＮＳＤＧＤＮＴＹＹＰＤＴＭＥＲ（配列番号５）またはその改変体からなり、ＣＤＲ３は、ＬＴＬＲＮＷＹＦＤＶ（配列番号６）またはその改変体からなり、該軽鎖可変ドメインは、その配列中に、超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’を含み、ＣＤＲ１’は、ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＱＮＹＬＡ（配列番号７）またはその改変体からなり、ＣＤＲ２’は、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号８）またはその改変体からなり、ＣＤＲ３’は、ＱＱＹＹＲＹＰＰＴ（配列番号９）またはその改変体からなる、抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

より特定すると、本発明は、抗体１２Ｄ１０の全長配列、あるいは配列番号２および３を有する抗体、その抗原結合性断片に関する。

さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む医薬に関する。

さらに別の局面では、本発明の医薬は、抗がん剤である。

さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子をコードする核酸分子（たとえば、ＤＮＡなど）を提供する。

さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む診断剤に関する。

さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を用いた、がんの診断方法に関する。

さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む診断キットに関する。

さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子であって、標識されたものに関する。

さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を用いる、イムノアッセイに関する。

さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を用いる、ＭＵＣ１またはその関連分子の検出方法に関する。

さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を用いた、生物学的サンプル中のＭＵＣ１のがん関連構造の量を測定する工程、および該生物学的サンプル中のＭＵＣ１のがん関連構造の量が健常人由来の生物学的サンプル中のＭＵＣ１のがん関連構造の量と比べて多いと認められる場合にがん患者由来の生物学的サンプルであると判定する工程、を含むがん患者由来の生物学的サンプルを選別する方法に関する。

本発明の抗体は、タンデム依存性が低いが、これは以下の理由で有用である。すなわち、ＭＵＣ１には、多種の糖鎖が付いているが、タンデムリピート依存性の低い抗体の方がＭＵＣ１にその繰り返し構造の回数に依存することなく結合することが可能となるので、ＭＵＣ１の検出能が優れていることが予想されるからである。

すなわち、タンデム依存性が高い抗体は、エピトープ構造(○)が繰り返される部分にしか強く結合できないが (○−○−○−○−○への親和性は高いが、□−△−○−■−▲への親和性は低い（ここで、▲、△、■および□は互いに異なりそれぞれ○とは異なる別のエピトープ構造を示す。）)、タンデム依存性が低い抗体は、エピトープ構造(○)が1つでも強く結合できる(○−○−○−○−○への親和性は高く、□−△−○−■−▲への親和性も高い)と説明することができる。

これらのすべての局面において、本明細書に記載される各々の実施形態は、適用可能である限り、他の局面において適用されうることが理解される。

正常細胞にあまり結合せずにがん細胞に対して従来にない高い特異性または選択性で結合する抗体が提供された。この抗体は、さらにがん細胞殺傷能力すら有し得、副作用の少ない抗がん剤として期待される。

ＭＵＣ１抗体（１２Ｄ１０）とがん細胞で高発現する糖鎖構造（ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０(表１の化合物番号４)の結合に対する各種ＭＵＣ１糖ペプチドによる置換曲線を示す。縦軸は、各種ＭＵＣ１糖ペプチドを添加しない場合の４５０ｎｍの吸光度を１００％とした時の、各種ＭＵＣ１糖ペプチド添加した場合の４５０ｎｍの吸光度の割合を示し、横軸は各種ＭＵＣ１糖ペプチドの濃度を示す。いずれの図においても、黒菱形は、ＳＴｎを示し、白四角は、ＳＴ２−６を示し、黒三角はｄＳＴを示し、白丸は２３ＳＴ６Ｌを示し、白三角は２，３ＳＴ６ＳＬを示す。 ＭＵＣ１抗体（ＰａｎｋｏＭａｂ）とがん細胞で高発現する糖鎖構造（ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０(表１の化合物番号４)の結合に対する各種ＭＵＣ１糖ペプチドによる置換曲線を示す。縦軸は、各種ＭＵＣ１糖ペプチドを添加しない場合の４５０ｎｍの吸光度を１００％とした時の、各種ＭＵＣ１糖ペプチド添加した場合の４５０ｎｍの吸光度の割合を示し、横軸は各種ＭＵＣ１糖ペプチドの濃度を示す。いずれの図においても、黒菱形は、ＳＴｎを示し、白四角は、ＳＴ２−６を示し、黒三角はｄＳＴを示し、白丸は２３ＳＴ６Ｌを示し、白三角は２，３ＳＴ６ＳＬを示す。 ＭＵＣ１抗体（ＶＵ−２Ｇ７）とがん細胞で高発現する糖鎖構造（ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０(表１の化合物番号４)の結合に対する各種ＭＵＣ１糖ペプチドによる置換曲線を示す。縦軸は、各種ＭＵＣ１糖ペプチドを添加しない場合の４５０ｎｍの吸光度を１００％とした時の、各種ＭＵＣ１糖ペプチド添加した場合の４５０ｎｍの吸光度の割合を示し、横軸は各種ＭＵＣ１糖ペプチドの濃度を示す。いずれの図においても、黒菱形は、ＳＴｎを示し、白四角は、ＳＴ２−６を示し、黒三角はｄＳＴを示し、白丸は２３ＳＴ６Ｌを示し、白三角は２，３ＳＴ６ＳＬを示す。 ＭＵＣ１抗体（ＳＭ３）とがん細胞で高発現する糖鎖構造（ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０(表１の化合物番号４)の結合に対する各種ＭＵＣ１糖ペプチドによる置換曲線を示す。縦軸は、各種ＭＵＣ１糖ペプチドを添加しない場合の４５０ｎｍの吸光度を１００％とした時の、各種ＭＵＣ１糖ペプチド添加した場合の４５０ｎｍの吸光度の割合を示し、横軸は各種ＭＵＣ１糖ペプチドの濃度を示す。いずれの図においても、黒菱形は、ＳＴｎを示し、白四角は、ＳＴ２−６を示し、黒三角はｄＳＴを示し、白丸は２３ＳＴ６Ｌを示し、白三角は２，３ＳＴ６ＳＬを示す。 抗体１２Ｄ１０のＭＵＣ１タンデムリピート依存性を示す。縦軸は、４５０ｎｍの吸光度を示し、横軸は、ＭＵＣ１糖ペプチドの種類を示す。左（白ぬき）からそれぞれ、２０マー（ＳＴｎ−２０ｍｅｒ）、４０マー（ＳＴｎ−４０ｍｅｒ）、６０マー（ＳＴｎ−６０ｍｅｒ）、８０マー（ＳＴｎ−８０ｍｅｒ）、および１００マー（ＳＴｎ−１００ｍｅｒ）（右端、黒塗り）を示す。 がん細胞膜表面に発現するＭＵＣ１タンパク質と１２Ｄ１０抗体が結合するかどうかを、ＦＡＣＳにて調べた実験結果を示す。ＦＡＣＳＡｒｉａで解析した結果を示す。左は、乳がん細胞Ｔ−４７Ｄに対する結果を示し、中央は、ヒト肺がん培養細胞Ｃａｌｕ−３細胞を示し、右は、コントロールである乳腺上皮細胞１８４Ａに対する結果を示す。点線はコントロールＩｇＧを示し、実線は、１２Ｄ１０抗体を示す。この結果から、１２Ｄ１０抗体は、乳がん細胞および肺がん細胞と強く反応するが、乳腺上皮細胞とは、ほとんど反応しないことが示された。 抗体１２Ｄ１０の可変領域のアミノ酸配列（配列番号２および３）を示す。上２列は重鎖（Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ；配列番号２）を示し、下２列は軽鎖（Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ；配列番号３）を示す。下線は各ＣＤＲ部位を示す。 抗体１２Ｄ１０を用いたサンドイッチイムノアッセイによるＭＵＣ１の定量のための標準曲線を示す。

以下、本発明に関して、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

（用語の定義）
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。

本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。

本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。あるいは、対立遺伝子変異体もこの範囲内に入る。

本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。

本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでも目的とする機能が保持される限りいずれでもよい。

アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。

本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「糖」、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。代表的には、約２０種類の単糖（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体など）が鎖状につながった物質で、生体の細胞内外のタンパク質または脂質に付いている。単糖の配列によって機能が異なり、通常は複雑に枝分かれしていて、人体には数百種類以上の多様な構造の糖鎖があると予想されており、さらに、人体において有用な構造は数万種類以上あると考えられている。細胞間での分子・細胞認識機能などタンパク質や脂質が生体内で果たす高次機能に関係していると見られているが、そのメカニズムは未解明の部分が多い。核酸、タンパク質に次ぐ第３の生命鎖として現在のライフサイエンスで注目されている。とりわけ、細胞認識におけるリガンド（情報分子）としての糖鎖の機能が期待され、その高機能材料開発への応用が研究されている。

本明細書において「糖鎖基」とは、糖鎖が別の基と結合したときに付される名称である。糖鎖基は場合に応じて一価または二価のものを指す。例えば、糖鎖基としては、シアリルルイスＸ基、Ｎ−アセチルラクトサミン基、α１−６マンノビオース基が挙げられる。

本明細書で使用される糖の略称のうち、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸であり、Ｇａｌはガラクトースであり、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミンであり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンであり、Ｒは非糖部分（たとえば、ペプチド、タンパク質、脂質など）である。

また、糖鎖の特定の名称については、以下のように定義される。
２，３ＳＴ６Ｇ：Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ、
２，３ＳＴ６Ｌ：Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ
２，３ＳＴ６ＳＬ：Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ
２，３ＳＴ：Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−Ｒ
ＳＴｎ：Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−Ｒ
ＳＴ２−６：Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ
ｄＳＴ：Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ
Ｔｎ：ＧａｌＮＡｃα−Ｒ
Ｔ：Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−Ｒ

本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも８０％同一である場合、好ましくは少なくとも９０％同一である場合、より好ましくは少なくとも９５％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。

本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９（２００４．５．１２ 発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。

本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＭＵＣ１）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。

本明細書において「フラグメント」または「断片」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。断片の長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用な断片の長さは、その断片の基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。

本明細書において、「改変体」、「改変配列」または「アナログ」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、８０％以上の相同性、より好ましくは、９０％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。

本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよいが、天然のアミノ酸が好ましい。

このようなポリペプチドをコードする核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。

本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能（例えば、抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子においてはＭＵＣ１への結合など）が保持される限り、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＭＵＣ１への結合など）が保持される限り、制限されない。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの５％以内、または２５個以下などであり得る。

本明細書において「類似するアミノ酸」とは、保存的置換の関係にあるアミノ酸をいい、以下のアミノ酸が該当する。そして、本発明の特定の配列（たとえば、１２Ｄ１０）から、以下の置換が行われた改変体もまた、本発明の範囲内に入ることが理解される。
Ａ：Ｇ，Ｉ，Ｖ，Ｌ
Ｃ：Ｍ（含Ｓアミノ酸）
Ｄ：Ｎ、ＱまたはＥ
Ｅ：Ｎ、ＱまたはＤ
Ｆ：Ｙ、Ａなど
Ｇ：Ａ
Ｈ：Ｗなど
Ｉ：Ａ，Ｌ，Ｖ，（Ｇ）
Ｋ：Ｒ
Ｌ：Ａ，Ｉ，Ｖ，（Ｇ）
Ｍ：Ｓなど
Ｎ：Ｅ、ＤまたはＱ
Ｐ：ＨｙＰ
Ｑ：Ｎ、ＥまたはＤ
Ｒ：Ｋ
Ｓ：Ｔ、Ｙ
Ｔ：Ｓ，Ｙ
Ｖ：Ｉ，Ｌ，Ａ、（Ｇ）
Ｗ：Ｈ
Ｙ：Ｆ、Ｓ，Ｔ
これらのアミノ酸の間の置換は、本明細書において「保存的置換」ともいう。

本明細書において、生物学的サンプル中のＭＵＣ１のがん関連構造の「量」とは、対象となる物質の物理量を直接示す尺度（例えば、モル量、重量等）をいい、生物学的サンプル中のＭＵＣ１のがん関連構造の「レベル」とは、対象となる物質の物理量を反映した他の尺度（例えば、免疫学的手法での量以外の指標（例えば、吸光度等）で表示されうる）をいう。生物学的サンプル中のＭＵＣ１のがん関連構造のレベル等は、物理化学的手法などを用いて直接量を測定してもよく、免疫学的手法などを用いて間接的に量を測定してもよく、あるいは、量が不明であっても、存在量を反映するレベル（例えば、免疫学的手法での量以外の指標で表示されうる）で表示することによってスクリーニングを実施することができる。

本明細書において「健常人」とは、正常で健康なヒト、またはがんに罹患していないことが判明しているヒトをいう。

本明細書において「ＭＵＣ１」とは、ムチンの一種であるムチン１のタンパク質またはその遺伝子、ＤＮＡ、核酸をいう。腫瘍関連抗原であり、多くの腺がんで発現する高分子量糖タンパク質である。このタンパク質は、不可欠な膜糖タンパク質の細胞外ドメインは、セリン、トレオニンおよびプロリンに富む２０個のアミノ酸コア配列（本明細書以下「Ｔｎ２０マー」とも称する；ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ（配列番号１）の３０〜９０タンデム型反復から主として構成されることが示されている。「Ｔｎ２０マー」は、個体によって発現される反復数は、遺伝的に決定され、サイズ多型を生じる。

（抗体）
本明細書において「抗体」とは、免疫反応において、抗原の刺激によって生体内でつくられ、抗原と特異的に結合したり反応したりするタンパク質またはそれらと同じ配列を有するものを化学合成等で生産したものを総称していう。実体は免疫グロブリンであり、Ａｂとも称する。

本明細書において抗体の「抗原結合性断片」とは、ある抗体について、その抗体の抗原と同じ抗原に対して結合性を有する断片をいう。そのような「抗原結合性断片」の範囲に入るかどうかは、本明細書に記載される親和性のアッセイによって評価することができる。本明細書中においては、そのような親和性は、抗体に対する標識ＭＵＣ１分子の結合量を５０％阻害する濃度（ＩＣ_５０値）を指標として示すことができ、ＩＣ_５０値は、例えばｌｏｇｉｓｔｉｃ曲線による回帰モデル（Ｒｏｄｂａｒｄら、Ｓｙｎｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ＲＩＡ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐ１６５，Ｉｎｔ．Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｇｅｎｃｙ，１９７４）で算出することができる。

本明細書において「ＭＵＣ１結合分子」とは、単独または他の分子と関連して、いずれかでＭＵＣ１抗原に結合し得る任意の分子をいう。したがって、ＭＵＣ１結合分子には定義上抗体および抗体の抗原性結合断片以外の結合分子（アプタマー等）、抗体および抗体の抗原性結合断片等の結合部分を含む他の分子（例えば、抗体複合分子、抗原性結合断片複合分子またはアプタマー結合分子）等が含まれることが理解される。このような結合反応は、抗体の親和性の試験と同様の試験で判定することができる。本明細書では、「抗体複合分子」または「抗原性結合断片複合分子」は、抗体または抗原結合性断片と他の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、糖、脂質等）が結合した分子をいう。好ましくは、抗体複合分子または抗原性結合断片複合分子は、もとの抗体または抗原性結合断片の結合性を保持している。

本明細書において「抗ＭＵＣ１抗体」および「ＭＵＣ１抗体」は、交換可能に使用され、ＭＵＣ１に対して惹起されたか、あるいは、それと同等の結合能を有する抗体をいう。

本明細書において「抗体依存的細胞傷害活性」とは、抗体に依存して細胞を殺傷する能力をいう。この能力を測るためには、たとえば、本明細書において記載されるクロミウム遊離試験などを用いることができる。

本明細書において「正常組織関連構造」とは、がん化していない正常細胞または正常組織において高発現している構造（例えば、糖鎖構造）をいう。この構造は、がん組織やがん細胞において発現量が低いことが知られている。このような正常組織関連構造の糖鎖としては、たとえば、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ（２，３ＳＴ６Ｌ）およびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ（２，３ＳＴ６ＳＬ）などをあげることができる。

本明細書において「がん関連構造」とは、がん組織またはがん細胞において高発現している構造（例えば、糖鎖構造）をいう。この構造は、正常組織や正常細胞において発現量が低いことが知られている。このようながん関連構造の糖鎖としては、たとえば、Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−Ｒ＜ＳＴｎ（化合物４）に対応＞、Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ＜ＳＴ２−６（化合物１０）に対応＞、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ＜ｄＳＴ（化合物１１）に対応＞、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−Ｒ（２，３ＳＴ），ＧａｌＮＡｃα−Ｒ（Ｔｎ）およびＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−Ｒ（Ｔ）などを挙げることができる。ここで、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸であり、Ｇａｌはガラクトースであり、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミンであり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンであり、Ｒは非糖部分である。

本明細書において正常組織関連構造に比べたがん関連構造に対する「特異性」とは、正常組織関連構造に比べて、がん関連構造により親和性の高い性質をいう。

このような特異性は、交差反応性比によって表現することができる。交差反応性比は、（がん関連構造ＳＴｎに対するＩＣ_５０／比較する糖鎖構造に対するＩＣ_５０）×１００（％）の計算式で求められる。本明細書において特異性があるとは、例えば、２倍以上の差があることをいう。あるいは、直接交差反応性比を比較した場合、交差反応性比が、例えば、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、あるいはそれより高い倍率でありうる。本明細書では、特定の実施形態では、ＭＵＣ１のがん関連構造Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−Ｒに対する前記正常組織関連構造の交差反応性比で特異性を比較することができる。

あるいは、このような特異性は、ＦＡＣＳによる細胞への結合評価において、蛍光シグナルシフトで特異性を評価することによって比較することができる。例えば、特定の実施形態では、ＦＡＣＳによる細胞への結合評価において、蛍光シグナルシフトで特異性を評価したときの、Ｔ−４７Ｄ細胞に対する特異性が１８４Ａ１細胞に対するものより約２倍以上強い、約３倍以上強い、約４倍以上強い、約５倍以上強い、約１０倍以上強い、約２０倍以上強い、約３０倍以上強い、約４０倍以上強い、約５０倍以上強い、あるいはそれより高い倍率のものを挙げることができる。

また、本明細書においてＩＣ_５０とは、５０％阻害濃度のことで、ある抗体と抗原の結合を５０％阻害するのに必要な濃度をいう。ＩＣ_５０値はｌｏｇｉｓｔｉｃ曲線による回帰モデル（Ｒｏｄｂａｒｄら、Ｓｙｎｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ＲＩＡ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐ１６５，Ｉｎｔ．Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｇｅｎｃｙ，１９７４）で算出することができる。

本明細書において「がん細胞」とは、腫瘍細胞と同じ意味で用いられ、悪性の細胞をいう。本発明が対象とする代表的ながん細胞としては、ＭＵＣ１の発現細胞が挙げられる。固形腫瘍の約７５％は、ＭＵＣ１を異常に発現することが知られている。ＭＵＣ１は、９０％以上の乳がんの９０％以上、前立腺がんの約５０％、および卵巣がん、結腸直腸がん、肺がんおよび膵臓がんでも高い割合で発現していることが知られている。ＭＵＣ１を発現するがん細胞として具体的には、例えば、乳がん細胞のＴ−４７Ｄ細胞や肺がん細胞であるＣａｌｕ−３細胞を挙げることができる。

本明細書において「正常細胞」とは、がん化していない細胞をいう。具体的には、例えば、ＭＵＣ１を発現している正常細胞として知られている乳腺上皮細胞である１８４Ａ１細胞や、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞などを挙げることができる。

本明細書において「タンデムリピート依存性」とは、ＭＵＣ１のタンデム構造のリピートが多いものほど抗体が強く結合する性質のことをいう。タンデムリピート依存性は、例えば、Ｔｎ２０マービオチンおよびＴｎ１００マービオチン（Ｔｎ２０マーを５回リピートさせたタンデム構造）に対する親和性の比によって表すことができる。たとえば、実施例において記載されている方法によれば、Ｔｎ２０マービオチンを用いた場合の４５０ｎｍの吸光度（Ａ２０）と、Ｔｎ１００マービオチン（を用いた場合の４５０ｎｍの吸光度（Ａ１００）の比（Ａ１００／Ａ２０）の値で表すことができる。

本明細書において「タンデムリピート依存性が低い」とは、このタンデム構造の数にかかわらず（一つであっても）反応することができることを意味する。具体的には、前記のＡ１００／Ａ２０の値が２以下、好ましくは１．５以下である場合をさす。

本明細書において免疫グロブリン「重鎖可変ドメイン（ＶＨ）」および「軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン」とは、当該分野において通常用いられる意味で用いられる。免疫グロブリンは、基本構造は同じで２本のＬ鎖（軽鎖、ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）と２本のＨ鎖（重鎖、ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）とがＳ−Ｓ結合でつながり、Ｈ鎖はＣ末端側のＦｃ（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）とＮ末端側のＦａｂ（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）の２断片がヒンジ部（ちょうつがい部）で折れ曲ってつながり、全体としてＹ字形をとる。Ｌ鎖およびＨ鎖ともにＮ末端から約１１０個のアミノ酸(Ｌ鎖の約半分の長さ)の配列は、抗原特異性に応じて部分的に異なった配列の仕方をしている。この部分を可変部(可変領域、Ｖ部）とよび、抗原特異性の決定にはＬ鎖とＨ鎖の両方の可変部（ＶＬ、ＶＨ）が関係している．可変部以外の部分は各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定であり、定常部（定常領域、ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ、Ｃ部）とよぶ。定常部は約１１０個のアミノ酸からなるポリペプチド単位（相同単位）がＬ鎖では一つ（ＣＬ）、Ｈ鎖では、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤで３個（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ＩｇＭ、ＩｇＥで４個つながっていて、各単位あるいは向かいあった部位と結合して生じた部域をドメイン（ｄｏｍａｉｎ）という。

（抗体分子の表現方法、抗原結合性断片、結合分子）
本明細書では、格別に他の意味であると指示しない限り、抗体などの任意のポリペプチド鎖は、Ｎ終末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ）で開始しＣ終末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ）で終結するアミノ酸配列を有するものとして記載する。抗原結合部位がＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメイン両方を含むとき、これらは同一ポリペプチド分子に位置し得るか、好ましくは、各ドメインは別の鎖に位置し得、この場合、Ｖ_Ｈドメインは免疫グロブリンすなわち抗体の重鎖またはその断片の一部であり、またＶ_Ｌは免疫グロブリンすなわち抗体の軽鎖またはその断片の一部である。

本明細書において使用される「抗体または抗原結合性断片」の例には、Ｂ細胞またはハイブリドーマにより産生されるような抗体およびキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体もしくはヒトの抗体またはその任意の断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片および単鎖抗体が含まれる。したがって、本明細書において使用される「ＭＵＣ１結合分子」の例には、これらのＢ細胞またはハイブリドーマにより産生されるような抗体およびキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体もしくはヒトの抗体またはその任意の断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、単鎖抗体および単一ドメイン抗体に他の分子が結合したものなどが含まれることが理解される。

単鎖抗体は、１０から３０アミノ酸、好ましくは１５から２５アミノ酸からなるペプチドリンカーにより共有結合する抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインからなる。そのため、その構造は重鎖および軽鎖の定常部分を含まず、小さなペプチドスペーサーは全定常部分よりも抗原性が低いと考えられている。「キメラ抗体」とは、重鎖もしくは軽鎖またはその両方の定常領域がヒト等の特定動物由来である一方、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインはその特定動物以外（例えば、非ヒト）由来(例えば、マウス)であるか、またはその特定動物（例えば、ヒト）由来であるが、別のその特定動物（例えば、ヒト）抗体から誘導される抗体を意味する。「ＣＤＲ移植抗体」とは、超可変部位領域(ＣＤＲ)が、特定動物に関していう場合、非特定動物（例えば、特定動物がヒトの場合、マウス)）抗体または別の特定動物（例えば、ヒト）抗体のようなドナー抗体から誘導される一方、免疫グロブリンの他の部分すべてまたは実質的にすべて、例えば定常領域および可変ドメインの高保存部分、すなわち、フレームワーク領域が、アクセプター抗体、例えば、特定動物（例えば、ヒト）由来の抗体から誘導される抗体を意味する。しかし、ＣＤＲ移植抗体は、フレームワーク領域中、例えば超可変領域に隣接するフレームワーク領域の一部にドナー配列の数アミノ酸を含む。「ヒト化抗体」とは、重鎖および軽鎖両方の定常および可変領域がすべてヒト由来であるか実質的にヒト由来配列と同一であり、必ずしも同一抗体由来である必要はなく、そしてマウス免疫グロブリン可変部分および定常部分の遺伝子がヒト対応物(ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ)、例えば欧州特許０５４６０７３Ｂ１、米国特許５５４５８０６等において一般の用語で記載されるようなものにより置換えられるマウス産生抗体が含まれる抗体を意味する。

したがって、好ましい抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、重鎖および軽鎖の可変ドメインはヒト由来であり、例えば、配列番号２および／または３の改変体（たとえば、１または数個のアミノ酸の置換・挿入、付加もしくは欠失を含むものが挙げられるがこれに限定されない。）において示される配列を有しうる。定常領域ドメインはまた、好ましくは、適当なヒト定常領域ドメイン、例えば、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈに記載されているものが含まれる。可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）にあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を見いだすことができる。ＣＤＲ領域の配列は、本発明の所望する生物学的活性（たとえば、結合活性または中和活性）が保持される範囲内であれば、少なくとも１つの付加・挿入、置換または欠失による改変体も本発明に含まれる。また、各ＣＤＲ領域との相同性が９０〜１００％の配列であるものが挙げられる。

本明細書において「抗体価（ｔｉｔｅｒ）」とは、血清反応において、抗血清の単位容量中に含まれている、抗原に対して結合する抗体量をいう。実際の測定は抗血清の希釈系列に対して一定量の抗原を加えて行い、測定値は反応の生じる終末点における希釈倍数であらわす。

本明細書において「親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」とは抗体とその認識物質間の結合力をいう。本明細書中においては、抗体と抗原などその認識物質の解離定数を指標として親和性（Ｋ_Ｄ）を示される。親和性（Ｋ_Ｄ）の測定方法は、この分野の当業者にとって常識であり、たとえば、センサーチップを用いても求めることができる。

本明細書において使用されるフレームワークは、任意の種類のフレームワーク領域に関連し得るが、好ましくはヒト由来のものである。適当なフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．らの文献を参照すれば選択できる。好ましい重鎖フレームワークは、ヒト重鎖フレームワークであり、例えば、配列番号２において示される抗ＭＵＣ１抗体のフレームワークである。それは、配列番号２に示す配列から、上記文献を参照して決定することができ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４領域の配列からなる。同様の方法で、抗ＭＵＣ１軽鎖フレームワークについては、配列番号３に示す配列から、上記文献を参照して決定することができ、ＦＲ１’、ＦＲ２’、ＦＲ３’およびＦＲ４’領域の配列からなる。

好ましい実施形態では、本発明はまた、配列番号２（１２Ｄ１０のＶ_Ｈ配列）のフレームワークと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第１のドメイン、または配列番号３（１２Ｄ１０のＶ_Ｌ配列）のフレームワークと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第２のドメイン、のいずれかを含む少なくとも１つの抗原結合部位を含むＭＵＣ１結合分子を提供する。

すべてのヒトに天然に見られるタンパク質に対し生ずるモノクローナル抗体は、典型的に、非ヒト系、例えばマウスで生産することができる。この直接の結果として、ヒトに投与されたとき、ハイブリドーマにより産生されるような異種個体抗体は、異種個体免疫グロブリンの定常部分により優勢的に仲介される望ましくない免疫応答を顕在化する。これは、長期間にわたり投与できないような抗体の使用を明らかに制限する。そのため、単一鎖、単一ドメイン、キメラ、ＣＤＲ移植、または特に、ヒトに投与したときに実質的なアレルギー応答を示さないと予測されるヒトの抗体の使用が特に好ましい。

本発明のより好ましい抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片、またはＭＵＣ１結合分子は、少なくともａ）（ｉ）配列中に超可変部位、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、ＣＤＲ１は、ＳＨＤＭＳ（配列番号４）という配列またはその改変体を有し、ＣＤＲ２は、ＡＩＮＳＤＧＤＮＴＹＹＰＤＴＭＥＲ（配列番号５）という配列またはその改変体を有し、ＣＤＲ３は、ＬＴＬＲＮＷＹＦＤＶ（配列番号６）という配列またはその改変体を有する、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）またはその断片および（ｉｉ）ヒト重鎖の定常部分またはその断片、そしてｂ）（ｉ）配列中に超可変部位、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含み、この場合、ＣＤＲ１’は、ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＱＮＹＬＡ（配列番号７）という配列またはその改変体を有し、ＣＤＲ２’は、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号８）という配列またはその改変体を有し、ＣＤＲ３’は、ＱＱＹＹＲＹＰＰＴ（配列番号９）という配列またはその改変体を有する、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインまたはその断片および（ｉｉ）ヒト軽鎖の定常部分またはその断片、ならびにそれらの直接の等価物を含む抗体から選択される。

他に、本発明の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、ａ）配列中に超可変領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、当該超可変領域は、配列番号２に示すようなアミノ酸配列を有する、第１のドメイン、ｂ）配列中に超可変部位、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含み、この場合、当該超可変領域は、配列番号３に示すようなアミノ酸配列を有する、第２のドメイン、ｃ）第１のドメインのＮ終末端および第２のドメインのＣ終末端に、または第１のドメインのＣ末端および第２のドメインのＮ末端に、いずれかに結合するペプチドリンカーおよびそれらの直接の等価物を含む抗原結合部位を含む単一鎖結合分子から選択され得る。

周知のように、１アミノ酸もしく複数のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換のようなマイナーチェンジによって、実質的に同一性を有するオリジナルタンパク質に対応するタンパク質を生産することができる。

本明細書において上記「直接の等価物」は、抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子であって、（ｉ）超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、全体として、配列番号４，５または６に示す超可変領域に対し、少なくとも８０％以上の相同性、好ましくは少なくとも９０％以上の相同性、より好ましくは少なくとも９５％以上の相同性がある、任意の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子であって、（ｉｉ）超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’は、全体として、配列番号７，８または９に示す超可変領域に対し、少なくとも８０％以上の相同性、好ましくは少なくとも９０％以上の相同性、より好ましくは少なくとも９５％以上の相同性がある分子のいずれかを意味する。本明細書では、複数のアミノ酸配列には、当該配列を最適に並べると同様な位置で少なくとも８０％以上同一アミノ酸残基を有する場合、お互いに対し少なくとも８０％以上相同性があり、この場合、アミノ酸配列中のギャップまたは挿入が非同一残基として数えられる。

ヒト重鎖の定常部分は、γ_１、γ_２、γ_３、γ_４、μ、α_１、α_２、δまたはεタイプ、好ましくはγタイプ、より好ましくはγ_１タイプであり得、一方、ヒト軽鎖の定常部分は、κまたはλタイプ（λ_１、λ_２およびλ_３サブタイプを含む）であり得るが、好ましくはκタイプである。すべてこれら定常部分のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔらより提供される。

通常の手法において、従って、（ｉ）本発明の単一ドメインＭＵＣ１結合分子、本発明の単一鎖ＭＵＣ１結合分子、本発明の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子の重鎖もしくは軽鎖またはその断片をコードするＤＮＡ分子（ｉｉ）組換え手段による本発明の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子の産生のための本発明のＤＮＡ分子の使用が提供される。

（抗体の作製）
本発明の抗体は、当該分野において周知の任意の方法を用いて生産することができる。そのような方法の例示は、実施例に記載されるがそれに限定されない。例えば、抗原を用いて動物を免疫することによって、抗体が産生される。

ここで、抗原の調製は、組換えＤＮＡ法または化学合成により調製したＭＵＣ１の一部のアミノ酸配列の一部のペプチドおよびその糖鎖結合ペプチドなどが挙げられる。そのような方法は、実施例において例示されている。得られたヒトＭＵＣ１は、アジュバントと混合し抗原として用いる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。

また、モノクローナル抗体は、それらの哺乳動物から脾臓またはリンパ節を採取し、それらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。細胞融合の方法は既知の方法で行うことができ、例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））に従って作製することができる。目的タンパク質を認識する特異抗体を作製するために、上記に記載した方法に従って目的動物（たとえば、マウス）を免疫する。十分に血中抗体力価が上昇していることを確認し、採血または脾臓細胞を分離する。モノクローナル抗体、特に、Ｃ末端やリングを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、このようにして分離した脾臓細胞とミエローマ細胞を融合して作製し得る。脾臓細胞は前記で免疫した動物、好ましくはマウス由来である。ミエローマ細胞は、哺乳類由来であり、好ましくはマウスミエローマ細胞である。細胞の融合にはポリエチレングリコールなどを用い得る。融合により得られたハイブリドーマをスクリーニングおよびクローニングすることにより、望ましいハイブリドーマを選択し得る。モノクローナル抗体を作製するには、得られたハイブリドーマをインビトロまたはインビボで培養する。好ましくは、インビボで培養する。例えば、マウスモノクローナルを含む腹水を産生させるために、マウスの腹腔内に前記ハイブリドーマを投与する。モノクローナル抗体は、産生された腹水から、当業者に公知の方法により容易に精製され得る。最終免疫後３〜１０日目に免疫動物から脾臓細胞を採取することが好ましいがこれに限定されない。

得られた免疫細胞からハイブリドーマを得るには、例えば、「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂 堀江武一ら，１９９４）等に記載されている方法により、継体培養可能な細胞とすることを目的として、例えば、センダイウイルス、ポリエチレングリコール存在下、形質細胞腫細胞と抗体を産生する免疫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ることができる。ここで用いられる形質細胞腫細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物由来の形質細胞腫細胞を用いることが望ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。形質細胞腫細胞は公知のものを利用できる。

ハイブリドーマは、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択し、コロニーが確認された段階で、培養上清に分泌される抗体と抗原との結合を調べる（スクリーニングする）ことにより目的の抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。

スクリーニングする方法としては、例えば、スポット法、凝集反応法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などの一般に抗体の検出に用いられている種々の方法が挙げられるが、好ましくは、例えば実施例に例示されるように、ハイブリドーマの培養上清について、ＭＵＣ１糖ペプチドとの反応性を指標とするＥＬＩＳＡ法に従い実施される。このスクリーニングによって、がん細胞に特異的な糖鎖を有するＭＵＣ１と特異的に反応する目的抗体産生株をスクリーニングすることができる。

スクリーニングの結果得た目的抗体産生株のクローニングは、通常の限界希釈法、軟寒天法などにより実施できる。クローニングされたハイブリドーマは、必要に応じて、血清培地または無血清培地で大量培養することができる。この培養によれば、比較的高純度の所望抗体を培養上清として得ることができる。また、ハイブリドーマと適合性のある哺乳動物、例えばマウスなどの腹腔に、ハイブリドーマを接種して、所望抗体をマウス腹水として大量に回収することもできる。本発明の抗体産生ハイブリドーマの培養上清およびマウスなどの腹水は、そのまま粗製抗体液として用いることができる。またこれらは常法に従って、硫酸アンミモニウム分画、塩析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー法などにより精製して、精製抗体とすることができる。

ポリクローナル抗体は、例えば免疫原で免疫した哺乳動物から採血することにより得られる。該方法において、免疫原で免疫される哺乳動物としては、一般には、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットなどが用いられる。

免疫方法は一般的方法により、例えば免疫原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射などにより投与することにより行い得る。より具体的には、例えば免疫原を生理食塩水含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、生理食塩水などで適当濃度に希釈し、所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に２〜３週間間隔で数回投与する。マウスを用いる場合は、一回の投与量を一匹あたり５０〜１００μｇ程度とする。ここで前記アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的に抗原に対する免疫反応を増強する物質をいう。通常用いられるアジュバントとしては、百日咳ワクチン、フロインドアジュバントなどを例示できる。最終免疫後３〜１０日目に哺乳動物の採血を行うことによって、抗血清を得ることができる。抗血清についてはそのままでも、また精製してポリクローナル抗体としても使用できる。

ポリクローナル抗体の精製方法としては非特異的精製法と特異的精製法が挙げられる。非特異的精製法とは塩析法やイオン交換クロマトグラフィー法などにより主にイムノグロブリン画分を取得することを目的とする。特異的精製法としては固定化抗原によるアフィニティークロマトグラフィー法などが挙げられる。

本明細書において抗体を作製するときに使用される「免疫原」とは、本明細書で使用される場合、生物において免疫応答を生じる、または引き起こす能力を有する物質を表す。本発明の抗体の製造に用いられる免疫原は、活性化ハプテンとキャリアタンパク質を用いて、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）等に記載されている活性エステル法により作製することができる。またＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）等に記載のその他の方法、例えば、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ法等によっても作製できる。

本明細書において抗体を作製するときに使用される「キャリアタンパク質」には、抗原性を高めることが知られている各種のタンパク質をいずれも使用できる。その例としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシチログロブリン（ＢＴＧ）、カギアナカサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）などの高分子物質のほかに合成ポリペプチドなどを例示できる。

本明細書において抗体を作製するときに使用される「ハプテン」とは、部分的な、または不完全な抗原である。ハプテンは主として低分子量の物質であり、単独では抗体の産生を刺激する能力はないが、化学的方法や架橋剤によりキャリアタンパク質と結合させて人工抗原として免疫するとハプテンに対する抗体を得ることができる。本発明においてはＭＵＣ1糖ペプチド単独で抗体を産生することは難しいと考えられることから通常は異種のタンパク質や合成ポリペプチドなどのキャリアタンパク質との複合体を調製して免疫原に用いた。

（免疫学的測定法）
本免疫測定方法に用いる単一特異的な抗体としては、安定的に供給しうるモノクローナル抗体が望ましいがそれに限定されず、任意の分子を用いることができる。以下、モノクローナル抗体を用いて例示する。抗体（第１のモノクローナル抗体）を固相に固定し、抗原を含む資料と共にインキュベートする工程、さらに標識した第２のモノクローナル抗体を加えて、得られた混合物をインキュベートする工程、および混合物中の生成した標識された抗原抗体複合体を検出する工程を包含するサンドイッチ免疫学的測定法が例示される。また、本発明の免疫学的測定法では、試料と、固相化した第１のモノクローナル抗体および標識した第２のモノクローナル抗体とを同時にインキュベートしてもよい。サンドイッチ免疫学的測定法としては、その検出方法により、サンドイッチ放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、サンドイッチ酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、サンドイッチ蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、サンドイッチ発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、サンドイッチ発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、サンドイッチ法に基づく免疫クロマトグラフ法などの全てのサンドイッチ免疫測定法が応用しうる。定量のためには、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法が好ましい。

本明細書において「交差反応性（以下、ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙともいう。）」は、免疫交差反応性のことをいう。ある抗原で免疫することにより得られた抗体が別の抗原（関連抗原）とも結合反応を示すときに、この反応を交差反応という。目的とする抗原とその抗体の反応量を基準とした場合に関連抗原とその抗体との反応量の程度を交差反応性として示すことができる。本明細書中においては代表的には１％、または２％、３％、あるいは０．５％、０．２％、０．１％などの親和性の相対値（％）で示すものであれば交差反応性が低いといえる。値が低いほど交差反応性が低く、目的の抗原に対して特異性を有することを示す。主に目的抗原と関連抗原の構造が非常に類似しているために起こることが多い。

本発明の（抗ＭＵＣ１）抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、マイクロタイタープレート、ビーズ、チューブ、メンブレン、濾紙、プラスチック性カップなどの担体に固相することができ、特に、ポリエチレンビーズが好適に用いられる。測定する試料は、ヒトの血漿、血清、血液、尿などヒトＭＵＣ１を含む試料であり得る。本発明の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片または、ＭＵＣ１結合分子は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、または目視判定可能な官位測定法などでは金コロイドや着色ラテックスなどにより標識され得る。標識に用いられる放射性同位元素としては、¹⁴Ｃ、³Ｈ、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉなどであり、特に、¹²⁵Ｉが好適に用いられる。これらは、クロラミンＴ法、ペルオキシダーゼ法、Ｉｏｄｏｇｅｎ法、ボルトハンター法などにより、モノクローナル抗体に結合され得る。標識に用い得る酵素としては、例えば、βガラクトシダーゼ（βＧＡＬ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などを含む。これらは、過ヨウ素酸架橋法（仲根法）、石川らの方法（医学書院；酵素免疫測定法，第３版，７５−１２７，（１９８７）．）などによりモノクローナル抗体に結合され得る。標識に用いる蛍光物質としては、フルオレセイン、フルオレサミン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどがある。標識に用いる発光物質としては、ルシフェリン、ルミノール誘導体、アクリジニウムエステルなどがある。簡易測定法などでは、金コロイドや着色ラテックスを用いてもよい。

本発明の１つの実施態様によれば、サンドイッチＲＩＡ法が行われ得る。サンドイッチＲＩＡ法は、具体的には、標準溶液または試料に、第１のモノクローナル抗体を固相したビーズを加えて混和し、４℃から４５℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１から４時間、好ましくは２時間インキュベートする（第１反応）。洗浄後、例えば¹²⁵Ｉで標識した第２のモノクローナル抗体を含む溶液を加え、４℃〜４５℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１から４時間好ましくは２時間インキュベートし、ビーズ上に抗体／抗体複合体を形成する（第２反応）。洗浄後、ビーズに結合した抗原抗体複合体の放射活性をガンマーカウンターなどで検出することによりの量を測定し得る。他の好ましい実施態様によれば、サンドイッチＥＩＡ法が行われ得る。サンドイッチＥＩＡ法は、具体的には、標準溶液または試料に、第１のモノクローナル抗体を固定したビーズを加えて混和し、４℃から４５℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１から４時間、好ましくは２時間インキュベートする（第１反応）。洗浄後、酵素標識、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した第２のモノクローナル抗体を含む溶液を加え、４℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃で、１〜４時間好ましくは２時間インキュベートし、ビーズ上に抗体−抗体からなる免疫複合体を形成する（第２反応）。ビーズ上の酵素活性を、酵素に特異的な基質、例えば、標識酵素がＨＲＰであればテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を介して比色法により測定し、それによりビーズ上の捕獲された量を測定し得る。比色定量は、通常の分光光度計などで行われ得る。

本発明の１つの実施形態において、抗原結合能の測定は、次のようにして測定することができる。抗原結合測定のためのＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレートでは、次のようにして調製する。ヒト乳がん細胞Ｔ−４７Ｄ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３３）を、細胞培養用９６穴プレートの６０穴に１×１０^６個の細胞数で播き込む。これをＣＯ_２インキュベーターで１日培養し（１０％の牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）、細胞を接着させる。培養液を捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄する。４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（以下、ＰＦＡ／ＰＢＳと称す）を各穴に１００μｌ加え、氷上で１０分間静置し、細胞を固相化する。ＰＦＡ／ＰＢＳを捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄後、２５０μｌのＤＢでブロッキングする。ＭＵＣ１抗体１００μｌを各穴に加え、室温にて２時間インキュベートしＲＢで洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合第２抗体１００μｌを加える。室温にて１時間インキュベートしＲＢで洗浄ののち、基質溶液を加え、次に４０５／６５５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定する。

中和活性は、抗体依存性細胞傷害活性を指標に測定することができる。

本発明の１つの実施形態において、抗体依存性細胞傷害活性は以下のようにして測定することができる。すなわち、クロミウム遊離試験による抗体依存性細胞傷害活性を解析することができる。ヒト末梢血単核球（Ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）は、健常者の末梢血からＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて添付文書に従って分離する。分離したＰＢＭＣは、４×１０^６個／ｍｌになるように１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭを加える。

１×１０^６個のヒト乳がん細胞株（たとえば、Ｔ−４７Ｄ）あるいはヒト乳腺上皮細胞株（たとえば、１８４Ａ１）を含むＤＭＥＭに、^５１Ｃｒを含む生理食塩水を加え、３７℃で１時間反応させる。その後、ＤＭＥＭで適宜洗浄し、規定化された量（たとえば、５×１０^４個/ｍｌ）になるようにＤＭＥＭを加える。この細胞に１２Ｄ１０またはマウスＩｇＧ２ａ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を加え、３７℃で１時間反応させ、適量（たとえば、１００μｌ／ウェル）になるように９ウェルｖ底プレートに加える。その後、適量、たとえば１００μｌのＰＢＭＣを加え、３７℃で２時間反応させる。その後、ｐｌａｔｅを５分間、５００×ｇ、室温で遠心し、１００μｌの上清のγ線を測定器（たとえば、ＡＲＣ−７００１（アロカ社製））にて測定する。抗体特異的な細胞傷害活性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，％）は、次の計算式を用いる。

細胞傷害活性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，％）＝（実験値−自然遊離）／（最大遊離−自然遊離）×１００
当該分野での技術水準によれば、当業者は、例えばＣＤＲグラフティング法（例えば、ＥＰ ２３９４００）により、ヒト化抗体を作製することができる。

本発明は、以下に記載のような抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子の産生のための第１および第２のＤＮＡ構成物を含む。

第１のＤＮＡ構成物は、重鎖またはその断片をコードし、ａ)フレームワークおよび超可変領域を含み、この場合、超可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列であり、そのアミノ酸配列が配列番号４，５または６で示される、可変ドメインをコードするＶ_Ｈ領域、；このＶ_Ｈ領域は、可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンから始まり可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、そしてｂ)重鎖の定常領域の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりその定常領域またはその断片の最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる重鎖定常領域またはその断片、その後に続くストップコドンを含む。

たとえば、この第１のＤＮＡ構成物は、上述のＶ_Ｈ領域と、ヒト重鎖の定常領域、より好ましくはヒトγ１鎖の定常領域をコードする。この定常領域は、ゲノム由来のＤＮＡ断片（イントロンを含む）またはｃＤＮＡ断片（イントロンを伴わない）であり得る。

第２のＤＮＡ構成物は、軽鎖またはその断片をコードし、ａ）フレームワークおよび超可変領域を含み、この場合、超可変領域は、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’であり、そのアミノ酸配列が配列番号７，８または９で示される、可変ドメインをコードするＶＬ領域；このＶＬ領域は、可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンから始まり可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、そしてｂ）軽鎖の定常領域の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりその定常領域またはその断片の最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる軽鎖定常領域またはその断片、その後に続くストップコドンを含む。好ましくは、定常領域は、ヒト軽鎖の定常領域、より好ましくは、ヒトκ鎖の定常領域をコードする。

本発明はまた、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’またはＣＤＲ３’のうちの１つ以上の残基が、例えば、変異、例えば対応するＤＮＡ配列の部位特異的変異誘発により、配列番号２に示される残基から誘導された抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む。本発明は、その変化した抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子をコードするＤＮＡ配列を含む。特に、本発明は、ＣＤＲ１’またはＣＤＲ２’の１つ以上の残基が配列番号７または８に示される残基から変化した抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む。

上述の第１および第２のＤＮＡ構成物では、第１および第２の部分は、イントロンで分離され得、エンハンサーは、通常、第１および第２の部分の間のイントロン中に位置し得る。転写されるが翻訳されないエンハンサーの存在は、効果的な転写を補助し得る。特定の実施態様では、第１および第２のＤＮＡ構成物は、有利にはヒト起源の重鎖遺伝子のエンハンサーを含む。

本発明の抗体は、キメラ抗体として作製することができ、そのようなキメラ抗体の発現ベクターは、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断片がクローニングされれば、これらのマウスＶ領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結して発現させることによってキメラ抗ヒト抗体が得られる。キメラ抗体を作製するための基本的な方法は、クローン化されたｃＤＮＡに存在するリーダー配列およびＶ領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結することを含んでなる。あるいは、クローン化されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列およびＶ領域配列をヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結することを包含する。

ヒト抗体Ｃ領域の断片は、任意のヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域のものとすることができ、例えばヒトＨ鎖のものについてはＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３またはＣγ４、およびＬ鎖のものについてはＣλまたはＣκを各々挙げることができる。

各ＤＮＡ構成物は、適当な制御配列の制御下、特に適当なプロモーターの制御下に置かれる。任意の種類のプロモーターが使用され得るが、ただし、それは、ＤＮＡ構成物が発現のため移される宿主生物に適用されるものである。キメラ抗体の製造のためには、エンハンサー／プロモーター系のような発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、ならびにエンハンサー／プロモーター系のような発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む単一の発現ベクター（例えば、ＷＯ９４／１１５２３参照）を作製する。次に、この発現ベクターにより哺乳類細胞のような宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をインビトロまたはインビボで培養してキメラ抗体を製造する（例えば、ＷＯ９１／１６９２８参照）。

望ましい抗体が細胞培養中またはトランスジェニック動物で産生され得る。適当なトランスジェニック動物は、適当な制御配列の下に置かれる第１および第２のＤＮＡ構成物を卵にマイクロインジェクションし、調製された卵を適当な偽妊娠の雌に移し、そして望ましい抗体を発現する子孫を選択することを含む標準的方法に従い得られ得る。

抗体鎖が細胞培養中で産生されるとき、当該ＤＮＡ構成物は、最初に、単一の発現ベクター中にまたは２つ別々であるが適合性の発現ベクター中に挿入されなければならないが、後者の場合のほうが好ましい。

従って、本発明はまた、上記のうちの少なくとも１つのＤＮＡ構成物を含む原核細胞系または真核細胞系で複製できる発現ベクターを提供する。

次いで、ＤＮＡ構成物を含む各発現ベクターは、適当な宿主生物に移される。ＤＮＡ構成物が２つの発現ベクターに別々に挿入されるとき、それらは、別々に、すなわち、細胞あたりの１つの型のベクターで移され得るか、共に移され得る（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）。適当な宿主生物は、微生物、酵母、または哺乳類細胞系であり、後者が好ましい。より好ましくは、哺乳類細胞系は、リンパ球由来、例えば、骨髄腫、ハイブリドーマまたは通常の不死化Ｂ細胞であり、それらは、通常、任意の内因的抗体重鎖または軽鎖を発現しない。

したがって、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、（ｉ）上記のような発現ベクターで形質転換される生物を培養すること、および（ｉｉ）当該培養物から抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を回収すること、によって作製することができる。

ＤＮＡの精製および塩基配列の決定のために、以下の方法を用いることができる。ＰＣＲ産物について、公知手法に従ってアガロースゲル電気泳動を行い、目的とするＤＮＡ断片を切り出した後、ＤＮＡの回収および精製を行い、ベクターＤＮＡに連結する。ＤＮＡの精製は、フェノールおよびクロロホルムで抽出するか（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、市販のキット（例えばＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ；ＢＩ０１０１）を用いて行われる。ＤＮＡ断片を保持するためのベクターＤＮＡには公知のもの（例えばｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることができる。

このようなＤＮＡとベクターＤＮＡとを、公知のライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させ、組換えベクターを得る。次に、得られる組換えベクターを大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（ニッポンジーン）等に導入した後アンピシリン耐性コロニーを選抜し、公知方法に基づいてベクターＤＮＡを調製する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。目的とするＤＮＡの塩基配列は、上記ベクターＤＮＡを制限酵素で消化した後、公知方法（例えばジデオキシ法）により決定する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。本発明では、自動塩基配列決定装置（たとえば、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７３Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることができる。

本発明は、ヒト化抗体としても提供されうる。そのようなヒト化抗体の作製のためにまず、ヒト抗体との相同性検索を行う。

すなわち、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植されているヒト化抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体のＦＲとヒト抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが望ましい。従って、マウス抗ヒトＴＦモノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域を、データベースを用いて構造が解明されているすべての既知抗体のＶ領域と比較する。また、同時にＫａｂａｔらにより、抗体のＦＲの長さ、アミノ酸の相同性等によって分類されたヒト抗体のサブグループ（ＨＳＧ：Ｈｕｍａｎ ｓｕｂｇｒｏｕｐ）（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、ＵＳ Ｄｅｐ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅｓ，１９９１）との比較を行う。

ヒトＨ鎖Ｖ領域の場合は、ＫａｂａｔらによるＨＳＧ分類により、ＨＳＧＩ〜ＩＩＩに分類することができる。一方、ヒトＬ鎖κ鎖Ｖ領域は、ＫａｂａｔらによるＨＳＧ分類により、ＨＳＧＩ〜ＩＶに分類することができる。

従来の技術によりマウス抗体をヒト化する場合には、必要によっては、ヒト化Ｖ領域のＣＤＲの構造をより一層もとのマウス抗体の構造に近づけるために、ＣＤＲを支持しているマウス抗体のＶ領域のＦＲの一部のアミノ酸配列をヒトＶ領域のＦＲに移植する場合がある。しかしながら、マウス抗体のＶ領域ＦＲのどのアミノ酸をヒト抗体Ｖ領域のＦＲに移植すべきかについては、一定の法則がない。従って、ＣＤＲの構造を保持するために必須のアミノ酸を特定することは、多くの努力を必要とすることが、他方、ＣＤＲが特定されると、一定の結合特異性を有することが推測されることから、本発明においては、１２Ｄ１０が有するＣＤＲの配列を有するものであれば、他の配列が変更されていてもよいことが理解される。

（医薬）
本発明の抗体は、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが好ましい。また、それら医薬製剤は、動物および人に使用される。

本発明の抗体の有効用量および投与回数は、投与形態、患者の年令、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により異なるが、通常、投与量は、１回につき体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは５〜５０ｍｇであり、投与回数は、１日１回または分割して投与するのが好ましい。

（アッセイ・検出・診断）
１つの局面において、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を用いるがん（非上皮性悪性炎症性疾患、腺がん、乳がん、大腸がん、膵臓がん、肺腺がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、子宮内膜がん、および結腸直腸がん）の他、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患などの診断法、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む診断剤、あるいは抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む診断キットを提供する。本発明の診断法、診断剤または診断キットにおいて含まれる抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、上述した本発明の抗体その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子の任意の実施形態でありうることが理解される。特に、本発明の抗体、抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、特定のがんで発現する糖鎖構造に特異的に結合することから、これらのがんの診断に使用されうる。

別の局面において、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を用いる、イムノアッセイを提供する。あるいは、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を用いる、ＭＵＣ１またはその関連分子の検出方法を提供する。あるいは、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む検出剤、あるいは抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む検出キットを提供する。本発明のがんの検出法、検出剤または検出キットにおいて含まれる抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、上述した本発明の抗体その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子の任意の実施形態でありうることが理解される。本発明の抗体、抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、特定のがんで発現する糖鎖構造に特異的に結合することから、これらのがんまたは腫瘍細胞の検出に使用されうる。

本発明の抗体、抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子には、安定性や抗体価を向上させるために、修飾剤が結合された修飾抗体でありうる。この修飾剤としては、例えば、糖鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の高分子などが挙げられる。

また、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、標識されうる。この場合、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイなどの標識イムノアッセイ等のイムノアッセイで使用されうる。標識イムノアッセイは、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被検試料を分析できるうえに、分析に要する時間と労力が少なくてすみ、しかも、分析が高精度であるという特徴がある。

なお、一般に診断用に用いる抗体は、マウス、ウサギ、ヤギなどのヒト以外の動物を免疫して作成される。しかし、動物の免疫系では、自己の体を構成する分子に結合する抗体を産生するリンパ球は、排除または不活性化される。つまり、動物を免疫して作成した本発明の抗体のうち、ヒトのものと動物のものとで酷似した部分を抗原決定領域とした抗体は含まれない。

本発明の抗体、抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、がんの診断のためまたは患者における疾患の進行をモニターするためのマーカーとして使用され得る。１つの実施態様において、患者のがんは、患者から得られる生物学的サンプルを、ＭＵＣ１レベルについて、あらかじめ決定されたカットオフ値と比較して評価することにより診断され得る。本明細書中で使用される適切な「生物学的サンプル」は、血液、血清、尿および/またはがん組織分泌物を含む。

本発明において、サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するための結合パートナーを使用することに関して、当業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。ある実施態様において、アッセイは、サンプルの残余物からのポリペプチドに結合し、そしてそれを除去するための固相支持体上に固定された結合パートナーの使用を含む。次いで、結合ポリペプチドは、レポーター基を含む第２の結合パートナーを使用して検出され得る。適切な第２の結合パートナーは、結合パートナー/ポリペプチド複合体に結合する抗体を含む。あるいは、競合アッセイが利用され得、ここでは、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そして結合パートナーとサンプルとのインキュベーション後に固定された結合パートナーに結合し得る。サンプルの成分が標識ポリペプチドの結合パートナーへの結合を阻害する程度は、サンプルと固定された結合パートナーとの反応性の指標である。

本発明において使用されうる固相支持体は、抗原が付着し得る、当業者に公知の任意の物質であり得る。例えば、固相支持体は、マイクロタイタープレートの試験ウェルまたはニトロセルロースもしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス、ファイバーガラス、ラテックス、またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルのようなプラスチック物質）であり得る。支持体はまた、例えば米国特許第5,359,681号に開示されるような磁性粒子または光学繊維センサーであり得る。結合因子は、当業者に公知の種々の技術（これは、特許および科学文献において十分に記載されている）を使用して、固相支持体上に固定され得る。本発明の状況において、用語「固定」は、非共有結合的な会合（例えば、吸着）および共有結合的な付着（これは抗原と支持体上の官能基との間の直接の結合であり得るか、または架橋剤を介する結合であり得る）の両方をいう。吸着によるマイクロタイタープレート中のウェルへのまたは膜への固定を用いてもよい。このような場合、吸着は、結合因子を、適切な緩衝液中で固相支持体と適切な時間量の間で接触させることにより達成され得る。接触時間は温度とともに変化するが、代表的には約１時間〜約１日の間である。一般に、プラスチック製のマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルと、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合因子との接触は、適切な量の結合因子を固定するのに十分である。

本発明において、結合因子の固相支持体への共有結合的な付着は、一般に、支持体および結合因子上の官能基（例えば、ヒドロキシルまたはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持体を最初に反応させることにより達成され得る。例えば、結合因子は、ベンゾキノンを使用するかまたは支持体上のアルデヒド基と結合パートナー上のアミンおよび活性水素との縮合により、適切なポリマーコーティングを有する支持体に共有結合的に付着され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９１ Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）。

特定の実施態様において、アッセイは２抗体サンドイッチアッセイである。このアッセイは、固相支持体（通常、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定された抗体とサンプルとを最初に接触させ、それによりサンプル中のポリペプチドを固定された抗体に結合させることにより行われ得る。次いで、非結合のサンプルを固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去し、そしてポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（レポーター基を含む）が添加される。次いで、固相支持体に結合して留まる第２の抗体の量が、特定のレポーター基に適切な方法を使用して決定される。

より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定されると、支持体上の残存するタンパク質結合部位は、代表的にはブロックされる。当業者に公知の任意の適切なブロッキング試薬は、例えばウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ ２０^ＴＭ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）である。次いで、固定された抗体はサンプルとともにインキュベートされ、そしてポリペプチドは抗体に結合され得る。サンプルは、インキュベーション前に、例えばリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）のような適切な希釈剤で希釈され得る。一般に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、がんを有する個体から得られたサンプル中のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間の期間である。好ましくは、接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡において達成されるレベルの少なくとも約９５％である結合のレベルを達成するのに十分である。当業者は、平衡に達するのに必要な時間が、ある時間に渡って生じる結合のレベルをアッセイすることにより容易に決定され得ることを認識する。室温において、約30分のインキュベーション時間は、一般に十分である。

次いで、非結合サンプルは、固相支持体を適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０^ＴＭを含むＰＢＳ）で洗浄することにより除去され得る。次いで、レポーター基を含む第２の抗体が固相支持体に添加され得る。例示的なレポーター基は、酵素、（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光基およびビチオンを含む。抗体のレポーター基への結合は、当業者に公知の標準的な方法を使用して達成され得る。

次いで、第２の抗体は、固定された抗体−ポリペプチド複合体とともに、結合ポリペプチドを検出するのに十分な時間量の間、インキュベートされる。適切な時間量は一般に、ある時間に渡って生じる結合のレベルをアッセイすることにより決定され得る。次いで、非結合の第２の抗体は除去され、そして結合した第２の抗体がレポーター基を使用することにより検出される。レポーター基を検出するために用いられる方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基については、シンチレーションカウンティング法またはオートラジオグラフ法が一般に適切である。分光学的な方法は、色素、発光基、および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（通常は、放射性基もしくは蛍光基または酵素）と結合したアビジンを使用して検出され得る。酵素のレポーター基は一般に、基質の添加（一般に、特定の時間の間）、それに続く反応産物の分光学的分析または他の分析により検出され得る。

がんの存在または非存在を決定するために、固相支持体に結合して留まるレポーター基から検出されるシグナルは、一般に、あらかじめ決定されたカットオフ値に対応するシグナルと比較される。１つの実施態様において、カットオフ値は、固定された抗体ががんを有さない患者からのサンプルとともにインキュベートされた場合に得られるシグナルの平均値である。一般に、あらかじめ決定されたカットオフ値を上回る３つの標準偏差であるシグナルを生じるサンプルは、がんについて陽性であると考えられる。別の実施態様において、カットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８５，１０６−７頁の方法によるＲｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ Ｃｕｒｖｅを使用して決定される。簡潔には、この実施態様において、カットオフ値は、診断試験結果のそれぞれの可能なカットオフ値に対応する真の陽性の割合（すなわち、感受性）および偽陽性の割合（100％−特異性）の組のプロットから決定され得る。上部左隅に最も近いプロット上のカットオフ値（すなわち、最大領域を含む値）は最も正確なカットオフ値であり、そして本発明の方法により決定されるカットオフ値より高いシグナルを生じるサンプルは陽性であると考えられ得る。あるいは、カットオフ値は、プロットに沿って、偽陽性の割合を最小にするために左にシフトし得るか、または偽陰性の割合を最小にするために右にシフトし得る。一般に、本方法により決定されるカットオフ値より高いシグナルを生じるサンプルは、そのがんについて陽性であるとされる。

関連する実施態様において、アッセイは、フロースルーまたはストリップ試験形式において実施され、ここで抗体は、膜上（例えば、ニトロセルロース）に固定化されている。フロースルー試験において、サンプルが膜を通過する際にサンプル内のポリペプチドは固定化抗体に結合する。次いで、第２の抗体を含む液体が膜を通過する際に、第２の標識抗体は、抗体−ポリペプチド複合体に結合する。次いで、結合された第２の抗体の検出は、上記のように実施され得る。ストリップ試験形式において、抗体が結合している膜の一端はサンプルを含む溶液に浸される。第２の抗体を含む領域を通る膜に沿ってそして固定化抗体の領域にまでサンプルが移動する。固定化抗体の領域における第２の抗体の濃度は、がんの存在を示す。代表的には、この部位における第２の抗体の濃度は、パターン（例えば、線）を形成し、これは、視覚的に読まれ得る。このようなパターンの非存在は、陰性の結果を示す。一般に、膜上の固定化抗体の量は、上記の形式において２抗体サンドイッチアッセイにおける陽性シグナルを生成するのに十分なレベルのポリペプチドを生物学的サンプルが含む場合、視覚的に認識し得るパターンを生成するように選択される。好ましくは、膜上の固定化抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇである。このような試験は代表的には、非常に少量の生物学的サンプルと共に実施され得る。

もちろん、本発明の抗体または抗体との使用に適切な多数の他のアッセイプロトコルが存在する。上記は、単なる例示であることが意図される。

本発明はまた、本発明の医薬組成物またはアッセイキットを製造するシステム、装置、キットにも関する。そのようなシステム、装置、キットの構成要件は、当該分野において公知のものを利用することができ、当業者は適宜設計することができることが理解される。

本発明はまた、本発明の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの水和物等プロドラッグを使用するシステム、装置、キットにも関する。そのようなシステム、装置、キットの構成要件は、当該分野において公知のものを利用することができ、当業者は適宜設計することができることが理解される。

本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、この実施例等により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。以下に示した実施例において使用した試薬、樹脂等は、特に言及しない限り和光純薬、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ等から得ることができる。

本実施例で用いられる略語は以下の意味を有する。
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＨＢＴＵ：１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシドヘキサフルオロホスファート
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
Ｆｍｏｃ：（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシカルボニル
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
ＣＭＰ−ＮＡＮＡ： シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸２ナトリウム
ＵＤＰ−Ｇａｌ：ウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−ガラクトース２ナトリウム

本実施例のマイクロ波照射下における反応は、マイクロ波式有機化学合成装置グリーン・モチーフ・Ｉ（東京電子株式会社製）を用いた。

（実施例１：ＭＵＣ１Ｔｎ２０マー糖ペプチドの合成）
（実施例化合物１の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （１）
糖ペプチド固相合成は、固相担体としてＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ−ＰＥＧＡ樹脂 （０．０５ ｍｍｏｌ／ｇ，５００ ｍｇ，２５ μｍｏｌ）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０ Ｗ、２４５０ ＭＨｚ、５０ ℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（７５ μｍｏｌ）、 ＨＢＴＵ （７５ μｍｏｌ）とＨＯＢｔ （７５ μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ （１５０ μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で５分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ６ ｃｏｒｅ１）−ＯＨ ： Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｏ−［Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）］−４，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル｝−Ｌ−スレオニンを１．５等量使用して同様の条件下２０分間反応した。１３ｍＭ ＨＯＢｔ の無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（４．７５：２．２５：９３ ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下５分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程(i)各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、(ii)アセチル化処理、(iii)脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＳ（９３：５：２ ｖ／ｖ／ｖ）で１時間処理した。反応液を濾過し溶媒を留去した後、得られた残渣にエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、糖のアセチル保護体を得た。得られた保護体をメタノールに溶解して、１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ １２．０−１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１を得た。

凍結乾燥粉末 （２６ｍｇ，収率 ４６％）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_９４Ｈ_１５２Ｎ_２７Ｏ_３７ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２２５１．１， ｆｏｕｎｄ ２２５０．７．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_９４Ｈ_１４９Ｎ_２７Ｏ_３７ ［Ｍ−２Ｈ］^２− １１２４．０３０４， ｆｏｕｎｄ １１２４．０３２５ ［Ｍ−２Ｈ］^２−．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａｌａ（４）３．９， Ａｓｐ（１）１．０， Ａｒｇ（１）１．０， Ｇｌｙ（２）２．０， Ｈｉｓ（１）１．１， Ｐｒｏ（５）５．４， Ｓｅｒ（２）１．７， Ｔｈｒ（３）２．８， Ｖａｌ（１）１．０。

（実施例化合物２の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （２）
化合物１ （２２．５ｍｇ）、ＣＭＰ−ＮＡＮＡ（３２．９ ｍｇ）とα２，３−（Ｏ）−シアル酸糖転移酵素（４４ｍＵ）の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ 緩衝液 （１０ ｍＭ ＭｎＣｌ_２，０．１％ ＢＳＡ，ｐＨ７．０）（５．０ｍｌ）溶液の条件下、２５ ℃で２４時間静置反応した。反応混合物は、逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製して凍結乾燥粉末として化合物２を得た。

凍結乾燥粉末（２０ｍｇ，収率 ８０％）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_９４Ｈ_１５２Ｎ_２７Ｏ_３７ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２２５１．１， ｆｏｕｎｄ ２２５０．７．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_９４Ｈ_１４９Ｎ_２７Ｏ_３７ ［Ｍ−２Ｈ］^２− １１２４．０３０４， ｆｏｕｎｄ １１２４．０３２５ ［Ｍ−２Ｈ］^２−．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａｌａ（４）３．９， Ａｓｐ（１）１．０， Ａｒｇ（１）１．０， Ｇｌｙ（２）２．０， Ｈｉｓ（１）１．１， Ｐｒｏ（５）５．４， Ｓｅｒ（２）１．７， Ｔｈｒ（３）２．８， Ｖａｌ（１）１．０。

（実施例化合物３の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （３）
化合物１と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ３ Ｔｎ）−ＯＨ ： Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｌ−スレオニンを用い合成した。

凍結乾燥粉末（１５ｍｇ，収率 １４％）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_８８Ｈ_１４１Ｎ_２７Ｏ_３２ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２０８９．０， ｆｏｕｎｄ ２０８９．１．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_８８Ｈ_１４３Ｎ_２７Ｏ_３２ ［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ６９７．０１５７， ｆｏｕｎｄ ６９７．０１７４．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａｌａ（４）４．０， Ａｓｐ（１）１．０， Ａｒｇ（１）１．０， Ｇｌｙ（２）１．９， Ｈｉｓ（１）１．０， Ｐｒｏ（５）５．２， Ｓｅｒ（２）１．７， Ｔｈｒ（３）２．８， Ｖａｌ（１）１．０。

（実施例化合物４の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （４）
化合物１と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ６ Ｓｉａｌｙｌ Ｔｎ）−ＯＨ：Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｏ−｛［メチル−（５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル）オナト−（２→６）］−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル｝−Ｌ−スレオニンを用いて、合成した。糖部分の脱アセチル化を行った後、水に溶解して１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ １２．０以下に調整して室温下６時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、精製を行い凍結乾燥粉末として化合物４を得た。

凍結乾燥粉末（２ｍｇ，収率 １５％）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_９９Ｈ_１５８Ｎ_２８Ｏ_４０ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２３８０．１， ｆｏｕｎｄ ２３８０．１．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_９９Ｈ_１５８Ｎ_２８Ｏ_４０ ［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ７９４．０４７５， ｆｏｕｎｄ ７９４．０４９４．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａｌａ（４）３．９， Ａｓｐ（１）１．０， Ａｒｇ（１）１．０， Ｇｌｙ（２）１．９， Ｈｉｓ（１）０．８， Ｐｒｏ（５）５．１， Ｓｅｒ（２）１．７， Ｔｈｒ（３）２．８， Ｖａｌ（１）１．０。

（実施例化合物５の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｇａｌβ１→３［ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ− Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （５）
化合物１と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ７ ｃｏｒｅ２−ＯＨ ：Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｏ−｛（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）−Ｏ−［２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）］−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル｝−Ｌ−スレオニンを用いて化合物５を得た。

凍結乾燥粉末 （５１ｍｇ，収率： ５２％）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１０２Ｈ_１６５Ｎ_２８Ｏ_４２ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２４５４．２， ｆｏｕｎｄ ２４５４．５．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１０２Ｈ_１６３Ｎ_２８Ｏ_４２ ［Ｍ−Ｈ］⁻ ２４５２．１４７９， ｆｏｕｎｄ ２４５２．１４７５．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａｌａ（４）３．７， Ａｓｐ（１）１．０， Ａｒｇ（１）１．０， Ｇｌｙ（２）１．９， Ｈｉｓ（１）０．９， Ｐｒｏ（５）５．２， Ｓｅｒ（２）１．６， Ｔｈｒ（３）２．６， Ｖａｌ（１）０．９。

（実施例化合物６の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （６）
化合物５およびＣＭＰ−ＮＡＮＡとα２，３−（Ｏ）−シアル酸転移酵素（５ ｍＵ／ｍｌ）の ５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ （１０ ｍＭ ＭｎＣｌ_２， ０．１％ ＢＳＡ， ｐＨ ７．０）溶液で反応して化合物６を得た。

凍結乾燥粉末（６ｍｇ， ｑｕａｎｔ．），ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１１３Ｈ_１８２Ｎ_２９Ｏ_５０：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２７４５．３， ｆｏｕｎｄ ２７４５．８．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１１３Ｈ_１８０Ｎ_２９Ｏ_５０ ［Ｍ−Ｈ］⁻ ２７４３．２４３４， ｆｏｕｎｄ ２７４３．２４１０。

（実施例化合物７の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （７）
化合物５およびＵＤＰ−Ｇａｌ，ＣＭＰ−ＮＡＮＡ、β１，４−ガラクトース転移酵素（１００ ｍＵ／ｍｌ）とα２，３−（Ｏ）−シアル酸転移酵素（５ ｍＵ／ｍｌ）の ５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ （１０ ｍＭ ＭｎＣｌ_２， ０．１％ ＢＳＡ， ｐＨ ７．０）溶液で反応して化合物７を得た。

凍結乾燥粉末（７ｍｇ，ｑｕａｎｔ．），ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃ
ａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１１９Ｈ_１９２Ｎ_２９Ｏ_５５ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２９０７．３， ｆｏｕｎｄ ２９０６．５．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１１９Ｈ_１９０Ｎ_２９Ｏ_５５ ［Ｍ−Ｈ］⁻ ２９０５．２９６２， ｆｏｕｎｄ ２９０５．２９２２。

（実施例化合物８の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （８）
化合物５およびＵＤＰ−Ｇａｌ， ＣＭＰ−ＮＡＮＡ、 β１，４−ガラクトース転移酵素 （１００ ｍＵ／ｍｌ）、 α２，３−（Ｏ）−シアル酸転移酵素（５ ｍＵ／ｍｌ）とα２，３−（Ｎ）−シアル酸転移酵素（７４ ｍＵ／ｍｌ）の ５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ （１０ ｍＭ ＭｎＣｌ_２， ０．１％ ＢＳＡ， ｐＨ ７．０）溶液で反応して化合物８を得た。

凍結乾燥粉末（７ｍｇ，収率 ４６％）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１３０Ｈ_２０９Ｎ_３０Ｏ_６３ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３１９８．４， ｆｏｕｎｄ ３１９８．０．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１３０Ｈ_２０７Ｎ_３０Ｏ_６３ ［Ｍ−Ｈ］⁻ ３１９６．３９１６， ｆｏｕｎｄ ３１９６．３８９９。

（実施例化合物９の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃβ１→６ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （９）
化合物４と同様の条件下、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ５ ｃｏｒｅ６）−ＯＨ：Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｏ−｛［３，４，６−トリ−Ｏ−アセチ−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）］−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル｝−Ｌ−スレオニンを用いて合成した。

凍結乾燥粉末（１７ｍｇ，収率 ３０％）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_９６Ｈ_１５５Ｎ_２８Ｏ_３７ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２２９２．１， ｆｏｕｎｄ ２２９０．６．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_９６Ｈ_１５４Ｎ_２８Ｏ_３７ ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋ １１４６．５５９３， ｆｏｕｎｄ １１４６．５５６８．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａｌａ（４）４．１， Ａｓｐ（１）１．０， Ａｒｇ（１）１．０， Ｇｌｙ（２）２．０， Ｈｉｓ（１）１．０， Ｐｒｏ（５）５．４， Ｓｅｒ（２）１．７， Ｔｈｒ（３）２．８， Ｖａｌ（１）１．０。

（実施例化合物１０の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→６］ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （１０）
化合物１と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ６ ２，６−Ｓｉａｌｙｌ Ｔ）−ＯＨ：Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｏ−｛［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）］−Ｏ−［メチル−（５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル）オナト−（２→６）］−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル｝−Ｌ−スレオニンを用いて化合物８を得た。

凍結乾燥粉末（６ｍｇ，収率 ３９％）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１０５Ｈ_１６９Ｎ_２８Ｏ_４５ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２５４２．２， ｆｏｕｎｄ ２４５２．６．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１０５Ｈ_１７０Ｎ_２８Ｏ_４５ ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋ １２７１．５９３７， ｆｏｕｎｄ １２７１．５９４５．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａｌａ（４）３．８， Ａｓｐ（１）１．０， Ａｒｇ（１）１．０， Ｇｌｙ（２）１．９， Ｈｉｓ（１）０．９， Ｐｒｏ（５）５．２， Ｓｅｒ（２）１．６， Ｔｈｒ（３）２．７， Ｖａｌ（１）０．９。

（実施例化合物１１の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→６］ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （１１）
化合物２と同様の条件により合成した。

凍結乾燥粉末（２ｍｇ，ｑｕａｎｔ．）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１１６Ｈ_１８６Ｎ_２９Ｏ_５３ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２８３３．３， ｆｏｕｎｄ ２８３３．２．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１１６Ｈ_１１８７Ｎ_２９Ｏ_５３ ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋ １４１７．１４１５， ｆｏｕｎｄ １４１７．１４４６．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａｌａ（４）３．８， Ａｓｐ（１）１．０， Ａｒｇ（１）１．０， Ｇｌｙ（２）１．９， Ｈｉｓ（１）０．８， Ｐｒｏ（５）５．２， Ｓｅｒ（２）１．６， Ｔｈｒ（３）２．７， Ｖａｌ（１）０．９．
（実施例化合物１２の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα）−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （１２）
化合物２と同様の条件により合成した。

凍結乾燥粉末（２ｍｇ，収率 １４％）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１０５Ｈ_１６９Ｎ_２８Ｏ_４５ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２５４２．２， ｆｏｕｎｄ ２４５１．６．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１０５Ｈ_１６８Ｎ_２８Ｏ_４５ ［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ８４８．０６５１， ｆｏｕｎｄ ８４８．０６６８．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａｌａ（４）４．０， Ａｓｐ（１）１．０， Ａｒｇ（１）１．０， Ｇｌｙ（２）２．０， Ｈｉｓ（１）０．８， Ｐｒｏ（５）５．３， Ｓｅｒ（２）１．７， Ｔｈｒ（３）２．８， Ｖａｌ（１）１．０。

（実施例化合物１３の合成）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ− Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２（１３）
化合物１と同様の条件により合成した。

凍結乾燥粉末（１１ｍｇ，収率 ２０％）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１６０Ｈ_２５３Ｎ_５１Ｏ_５４ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３７５３．９， ｆｏｕｎｄ ３７５１．１．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１６０Ｈ_２５３Ｎ_５１Ｏ_５４ ［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ９３９．２２３３， ｆｏｕｎｄ ９３９．２２４５．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａｌａ（４）４．１， Ａｓｐ（１）１．０， Ａｒｇ（１）１．０， Ｇｌｙ（２）２．０， Ｈｉｓ（１）０．９， Ｐｒｏ（５）５．３， Ｓｅｒ（２）１．７， Ｔｈｒ（３）２．８， Ｖａｌ（１）０．９。

（実施例化合物１４の合成）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｌｉｎｋｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ_２ （１４）
ビオチン化糖ペプチド固相合成は、前述と同様の合成に従った。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｏ−｛Ｏ−４’，７’，８’，９’−テトラ−Ｏ−アセチル−５’−Ｎ−アセトアミド−ノイラミン酸メチル−（２’→６）−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル｝−Ｌ−スレオニンを１．５等量使用して、最終段階で５等量のＰＥＧ試薬、ビオチンを縮合させて合成した。

凍結乾燥粉末（２ｍｇ，収率 ７．４％），ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１１９Ｈ_１９１Ｎ_３２Ｏ_４６Ｓ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２８３６．３， ｆｏｕｎｄ ２８３６．６。

（実施例化合物１５の合成）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｌｉｎｋｅｒ−［Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ］_２−ＮＨ_２ （１５）［４０ｍｅｒ 糖ペプチド］
化合物１２と同様にして、合成した。

凍結乾燥粉末（２．０ｍｇ，収率 ７．７％）， ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_２１８Ｈ_３４６Ｎ_５９Ｏ_８６Ｓ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ５１９８．４， ｆｏｕｎｄ ５２０６．５。

（実施例化合物１６の合成）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｌｉｎｋｅｒ−［Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ］_３−ＮＨ_２ （１６）［６０ｍｅｒ 糖ペプチド］
化合物１２と同様にして、合成した。

凍結乾燥粉末（１．８ｍｇ，収率 ４．７％）， ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_３１７Ｈ_５０１Ｎ_８６Ｏ_１２６Ｓ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ７５６０．５， ｆｏｕｎｄ ７５７６．３．
（実施例化合物１７の合成）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｌｉｎｋｅｒ−［Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ］_４−ＮＨ_２ （１７）［８０ｍｅｒ 糖ペプチド］
化合物１２と同様にして、合成した。

凍結乾燥粉末（１．１ｍｇ，収率 ２．３％）， ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_４１６Ｈ_６５６Ｎ_１１３Ｏ_１６６Ｓ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ９９２２．６， ｆｏｕｎｄ ９９３０．８。

（実施例化合物１８の合成）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ｌｉｎｋｅｒ−［Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ］_５−ＮＨ_２ （１８）［１００ｍｅｒ 糖ペプチド］
化合物１２と同様にして、合成した。

凍結乾燥粉末（１．７ｍｇ，収率 ２．７％），ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ
ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_５１５Ｈ_８１１Ｎ_１４０Ｏ_２０６Ｓ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ １２２８４．７， ｆｏｕｎｄ １２２０１．９。

（実施例化合物１９の合成）
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｏ−Ｍｅ Ａｃ６ Ｓｉａｌｙｌ Ｔｎ）−ＯＨ ： Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｏ−｛Ｏ−４’，７’，８’，９’−テトラ−Ｏ−アセチル−５’−Ｎ−アセトアミド−ノイラミン酸メチル−（２’→６）−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル｝−Ｌ−スレオニンを１．５等量使用して同様の条件下２０分間反応した。１３ｍＭ ＨＯＢｔの無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（４．７５：２．２５：９３ ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下５分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０ Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（ｉ）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（ｉｉ）アセチル化処理、（ｉｉｉ）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＳ（９３：５：２ ｖ／ｖ／ｖ）で１時間処理した。反応液を濾過し溶媒を留去した後、得られた残渣にエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、糖のアセチル保護体を得た。得られた保護体をメタノールに溶解して、１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ １２．０−１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。次に、得られたメチルエステル体を水に溶解して、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ １０．５−１１．０に調整して室温下１時間処理した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１を得た。

凍結乾燥粉末（１７ｍｇ，収率 ２２％）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１０２Ｈ_１６４Ｎ_２９Ｏ_４１Ｓ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２４８３．１， ｆｏｕｎｄ ２４８２．２．１。

以下に、実施例化合物の化学構造式を示す。
化合物１

化合物２

化合物３

化合物４

化合物５

化合物６

化合物７

化合物８

化合物９

化合物１０

化合物１１

化合物１２

化合物１３

化合物１４

化合物１５

化合物１６

化合物１７

化合物１８

化合物１９

化合物番号１から１９までの名称を表１のように命名した。

（実施例２：ＭＵＣ１特異的抗体の生産）
（免疫原の調製）
４．１８ｍｇのＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０−Ｃｙｓを０．４１８ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、１０ｍｇのＩｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含む水溶液１ｍｌを加え、室温にて２時間、さらに、４℃で一晩反応させた。反応液を精製水に対して透析した後に、凍結乾燥し、免疫原とした。

調製した免疫原１００μｇをフロイント完全アジュバントと共に４週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、２１日後及び４２日後に免疫原１００μｇをフロイント不完全アジュバントと共に投与し、追加免疫とした。さらに７１日後に免疫原１００μｇを生理食塩水０．１ｍｌに縣濁した溶液を腹腔内投与し、最終免疫とした。

（ハイブリドーマの作製）
最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３×６３−Ａｇ８．Ｕ１、東京腫瘤研究所）を５０％のポリエチレングリコール４０００を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。

（ＭＵＣ１抗体の選定）
細胞融合１０日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたＥＬＳＩＡは以下の通りである。３８４穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに０．３５μｇの抗マウスＩｇＧ抗体（シバヤギ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を３５μｌ加えて４℃１６時間固定した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本住友製薬社製）を２００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを９０μｌの洗浄液で１回洗浄した後、１０μｌのハイブリドーマ培養上清と１０μｌの緩衝液Ａ（０．５％ ウシ血清アルブミン、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ８０、０．０５％ Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４）及び０．０１ｎｇのＢｉｏｔｉｎ−ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０−Ｃｙｓと２ｎｇのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を含む１０μｌの緩衝液Ａを加え、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、２５μｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、２５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

スクリーニングの結果から、ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０と強い親和性を示すクローン（１２Ｄ１０）を得た。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、１２Ｄ１０のアイソタイプはＩｇＧ１であった。この１２Ｄ１０抗体について、常法を用いて可変領域の配列を決定した。その結果を図４に示す。

（実施例３：抗体の特異性の測定）
（糖鎖特異性）
抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレートに、ＭＵＣ１抗体を含む１５μｌの緩衝液Ａを加え、室温で３時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰとＢｉｏｔｉｎ−ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、およびＴ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、２，３−ＳＴ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、Ｔｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、２，３ＳＴ６Ｇ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、２，３ＳＴ６Ｌ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、２，３−ＳＴ６ＳＬ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、Ｃ６（ＤＴ＊Ｒ）−２０、ＳＴ２−６（ＤＴ＊Ｒ）−２０、ｄＳＴ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、２，３ＳＴ（ＶＴ＊Ｓ）−２０、４０をそれぞれ含む１５μｌの緩衝液Ａを加え、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、１５μｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、１２Ｄ１０は、がん細胞で高発現する糖鎖構造（ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、ＳＴ２−６（ＤＴ＊Ｒ）−２０、ｄＳＴ（ＤＴ＊Ｒ）−２０）に対して高い親和性を示すが、正常細胞で高発現する糖鎖構造（２，３ＳＴ６Ｌ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、２，３−ＳＴ６ＳＬ（ＤＴ＊Ｒ）−２０）との交差反応性は低いことが示された（図１ａ、表２）。以上のことから、１２Ｄ１０は、がん細胞で高発現する糖鎖型ＭＵＣ１に対して特異性が高いことが示された。一方、その他のＭＵＣ１抗体であるＰａｎｋｏＭａｂ（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２００６年、第５５巻、１３３７−１３４７ページ、米国特許出願公開２００６／０２９２６４３）、ＶＵ−２Ｇ７（Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． ２１、 Ｎｏ． ４、 １９７−２１０ページ、２０００年）およびＳＭ３は、１２Ｄ１０よりもがん細胞で高発現する糖鎖構造（ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、ＳＴ２−６（ＤＴ＊Ｒ）−２０、ｄＳＴ（ＤＴ＊Ｒ）−２０に対する親和性が低く、正常細胞で高発現する糖鎖構造（２，３ＳＴ６Ｌ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、２，３−ＳＴ６ＳＬ（ＤＴ＊Ｒ）−２０）との交差反応性は、１２Ｄ１０よりも高いことが示された（図１ｂ、ｃ、ｄ、表２）。以上のことから、ＰａｎｋｏＭａｂ、ＶＵ−２Ｇ７およびＳＭ３よりも１２Ｄ１０の方が、がん細胞で高発現するＭＵＣ１に対して特異性が高いことが示された。

（タンデムリピート依存性）
３８４穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに０．３５μｇのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を３５μｌ加えて４℃１６時間固定した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本住友製薬社製）を２００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ固相化プレート）。各ウェルを９０μｌの洗浄液で１回洗浄した後、Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０、Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−４０、Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−６０、Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−８０、Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−１００をそれぞれ含む１５μｌの緩衝液Ａを加え、室温で３０分間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、ＭＵＣ１抗体を含む１５μｌの緩衝液Ａを加え、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、１５μｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、１２Ｄ１０は、Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−４０、Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−６０、Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−８０、Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−１００との反応性はほぼ同じであり、タンデムリピートの長さ依存性が低い抗体であることが示された（図２）。

（抗体の親和性）
センサーチップＳＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にＢｉｏｔｉｎ−ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）−２０を固相化し、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００を用いて１２Ｄ１０の解離定数を解析した結果、１２Ｄ１０の解離定数Ｋ_Ｄは、９．１×１０^−９（Ｍ）であった（表３）。

（ＦＡＣＳによる抗体のがん細胞への結合評価）
がん細胞表面に発現するＭＵＣ１タンパク質と１２Ｄ１０抗体が結合するかどうかをＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）にて調べた。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養したヒト乳がん培養細胞株Ｔ−４７Ｄ（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＨＴＢ−１３３）、ヒト肺がん培養細胞Ｃａｌｕ−３（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＨＴＢ−５５）およびＭａｍｍａｒｙ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＯＮＺＡ社製）で培養したヒト乳腺細胞１８４Ａ１（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＣＲＬ−８７９８）を、トリプシン−ＥＤＴＡにて回収し、５％ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ）に懸濁する。ＭＵＣ１抗体を５μｇ／ｍｌになるように加えて、室温で２時間反応させた。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後に、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２００倍希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えて、室温で１時間反応させた。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後に、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ベクトンディッキンソン社製）にて解析した。その結果、コントロールマウスＩｇＧ１抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）と比較して、１２Ｄ１０抗体はＴ−４７Ｄでは、蛍光シグナルが１４０倍シフトし、Ｃａｌｕ−３では、蛍光シグナルが４０倍シフトした。一方、１８４Ａ１では、蛍光シグナルが２倍シフトした。つまり、２０〜７０倍の差が見られた。この結果から、１２Ｄ１０抗体は、乳がん細胞や肺がん細胞などのがん関連構造を有するＭＵＣ１発現細胞とは強く結合するが、乳腺上皮細胞などの正常組織関連構造を有するＭＵＣ１発現細胞とは、ほとんど結合しないことが示された（図３）。

（実施例４：１２Ｄ１０抗体を用いたＭＵＣ１の定量）
ＭＵＣ１を定量するサンドイッチイムノアッセイは以下の方法で行った。９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク社製）に、１μｇのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を１００ｕｌ加えて４℃、１６時間固定した。これらのウェルを２５０μｌの洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本住友製薬社製）を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った。各ウェルを２５０μｌの洗浄液で２回洗浄した後、１００ｎｇのビオチン化１２Ｄ１０抗体を含む１００ｕｌの緩衝液Ａ（０．９％ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％ＰｒｏＣｌｉｎを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５）を加えて、室温で１時間反応させた。各ウェルを２５０μｌの洗浄液で２回洗浄した後、１００ｕｌの標準溶液（Ｔ−４７Ｄ培養上清）を加え、４℃、１６時間静置した。各ウェルを２５０μｌの洗浄液で３回洗浄した後、５０ｎｇのＨＲＰ標識１２Ｄ１０抗体を含む１００ｕｌの緩衝液Ａを加え、１時間反応させる。各ウェルを２５０μｌの洗浄液で３回洗浄した後、１００ｕｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１００μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。この結果から、１２Ｄ１０抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイにて、ＭＵＣ１を定量することが可能であることが示された。なお、標準溶液（Ｔ−４７Ｄ）の単位（Ｕ／ｍｌ）は、１２Ｄ１０抗体によるサンドイッチイムノアッセイにて、シアル化糖鎖抗原ＫＬ−６キット（エイテストＫＬ−６、三光純薬株式会社）に付属の標準抗原を測定した際の値から決定した。図５に標準曲線を示す。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

糖鎖構造レベルで、正常細胞とがん細胞の違いを認識できる抗体が提供された。このような特徴を有する抗体は、医薬、診断薬のほか研究試薬として有用である。

配列番号１：Ｔｎ２０マーのアミノ酸配列
配列番号２：抗体１２Ｄ１０の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３：抗体１２Ｄ１０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４：抗体１２Ｄ１０のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５：抗体１２Ｄ１０のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６：抗体１２Ｄ１０のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７：抗体１２Ｄ１０のＣＤＲ１’のアミノ酸配列
配列番号８：抗体１２Ｄ１０のＣＤＲ２’のアミノ酸配列
配列番号９：抗体１２Ｄ１０のＣＤＲ３’のアミノ酸配列
配列番号１０：最小配列認識ＡＰＤＴＲＰＡＰ
配列番号１１：ＭＵＣ１タンデム型反復中の配列ＳＡＰＤＴＲＰ
配列番号１２：五量体ＰＤＴＲＰ

Claims (7)

1. ＭＵＣ１のがん関連構造に対するＭＵＣ１の正常組織関連構造の交差反応性比が４０倍以上である、抗体またはその抗原結合性断片であって、該正常組織関連構造は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα−ＲおよびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒからなる群より選択され、該がん関連構造は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−Ｒ、Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒ、およびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→６］ＧａｌＮＡｃα−Ｒからなる群より選択され、ここで、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸であり、Ｇａｌはガラクトースであり、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミンであり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンであり、Ｒは非糖部分であり、かつ、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含む少なくとも１つの抗原結合部位を有しており、該重鎖可変領域ドメインは、その配列中に、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は、ＳＨＤＭＳ（配列番号４）からなり、ＣＤＲ２は、ＡＩＮＳＤＧＤＮＴＹＹＰＤＴＭＥＲ（配列番号５）からなり、ＣＤＲ３は、ＬＴＬＲＮＷＹＦＤＶ（配列番号６）からなり、該軽鎖可変領域ドメインは、その配列中に、超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’を含み、ＣＤＲ１’は、ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＱＮＹＬＡ（配列番号７）からなり、ＣＤＲ２’は、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号８）からなり、ＣＤＲ３’は、ＱＱＹＹＲＹＰＰＴ（配列番号９）からなる、抗体またはその抗原結合性断片。
2. 配列番号２および３を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
3. 請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物。
4. 抗がん剤である、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、診断キット。
6. 請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸分子。
7. 請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片を用いた、生物学的サンプル中のＭＵＣ１のがん関連構造の量を測定する工程、
   および該生物学的サンプル中のＭＵＣ１のがん関連構造の量が健常人由来の生物学的サンプル中のＭＵＣ１のがん関連構造の量と比べて多いと認められる場合にがん患者由来の生物学的サンプルであると判定する工程、
   を含むがん患者由来の生物学的サンプルを選別する方法。