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CN118140144A - 用于诊断癌症的糖蛋白生物标志物 - Google Patents

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CN118140144A
CN118140144A CN202280070816.4A CN202280070816A CN118140144A CN 118140144 A CN118140144 A CN 118140144A CN 202280070816 A CN202280070816 A CN 202280070816A CN 118140144 A CN118140144 A CN 118140144A
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cancer
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CN202280070816.4A
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J·泰克
T·贝托克
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Glycanostics
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Abstract

本发明涉及一种用于诊断受试者是否处于癌症风险中或是否患有癌症的方法，其中与对照样品相比结合剂与生物标志物糖蛋白的特定聚糖结构的(显著)更低或(显著)更高的结合指示所述受试者处于癌症风险中或患有癌症。本发明还涉及一种用于实施用于诊断受试者是否处于癌症风险中或是否患有癌症的方法的试剂盒，其包含能够结合生物标志物蛋白的聚糖结构的结合剂。

Description

用于诊断癌症的糖蛋白生物标志物
本申请要求于2021年8月26日递交的欧洲专利申请No.21193158.9的优先权的权益，在此通过引用将其全部内容并入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明涉及一种用于诊断受试者是否处于癌症风险中或是否患有癌症的方法，其中与对照样品相比结合剂与生物标志物糖蛋白的特定聚糖结构的(显著)更低或(显著)更高的结合指示所述受试者处于癌症风险中或患有癌症。本发明还涉及一种用于实施用于诊断受试者是否处于癌症风险中或是否患有癌症的方法的试剂盒，其包含能够结合生物标志物蛋白的聚糖结构的结合剂。
背景技术
癌症是目前文明中最大的稻草人之一。男性癌症死亡的最常见原因是前列腺癌(PCa)。尽管事实上这种癌症确诊是严重的，但通过早期发现和适当的治疗，预后是良好的(Tkac等，Interface Focus(2019),9:20180077)。通常通过分析前列腺特异性抗原(PSA)来进行PCa的筛选和诊断。该蛋白在受癌症影响的前列腺组织中形成，但也在健康前列腺和受其它疾病影响的前列腺中形成(Damborska等，Acta(2017),184:3049-3067)。由于PSA对PCA的特异性低，因此需要识别新的、更高特异性的生物标志物。先前已将糖蛋白ZAG(锌α-2-糖蛋白)识别为前列腺癌的潜在生物标志物(Katafigioti等，Ital.Urol.Androl.(2016),88:195-200)。ZAG在多种组织中表达，包括在例如乳腺、前列腺或肝脏中发现的几种类型的分泌性上皮细胞。一些研究表明，在该疾病的初期，尿和血液中都存在ZAG水平升高，这使得ZAG成为前列腺癌和其它泌尿生殖器癌的可能生物标志物(Katafigiotis等，BJU Int.(2012),110:E688-E693)。然而，由于ZAG也存在于非癌细胞表面，因此仅通过检测ZAG水平来诊断是不够的。
发明内容
需要克服这些和其它缺点。因此，本发明解决了这些需要和技术目标，并提供了如本文所述和如权利要求书中所限定的方案。
本发明涉及一种用于诊断受试者是否处于癌症风险中或是否患有癌症的方法，包括
(1)将自所述受试者获得的样品与结合剂接触，所述样品包含生物标志物糖蛋白，所述结合剂能够(特异性地)结合所述生物标志物糖蛋白的聚糖结构，
其中所述生物标志物糖蛋白的存在或过表达(如，至少约1.5倍、至少约2倍或至少约3倍的过表达)或低表达(如，至少约1.5倍、至少约2倍或至少约3倍的低表达；例如当聚糖结构为O-聚糖或N-聚糖，优选为O-聚糖时低表达)指示所述癌症的风险和/或存在所述癌症，和
其中所述聚糖结构与在未处于所述癌症风险中或未患有所述癌症的受试者中表达的所述生物标志物糖蛋白的聚糖结构存在偏差，以及
(2)测定所述结合剂是否结合所述生物标志物糖蛋白的聚糖结构，
其中与对照样品相比，所述结合剂与所述生物标志物糖蛋白的所述聚糖结构的(显著)更低或(显著)更高(优选为显著更高)的结合指示所述受试者处于癌症风险中或患有癌症，
优选地其中所述生物标志物糖蛋白是ZAG和/或PAP，更优选为ZAG。
如本文所用和本领域通常已知的，本文所用的“糖蛋白(或”糖基化蛋白“)意指含有一个或多个N-、O-、S-或C-共价连接的各种类型的碳水化合物的蛋白，例如，从单糖到支链聚糖(包括它们的修饰形式，比如磺基-或磷酸基团附着)。N-连接聚糖是与天冬酰胺的-NH2基团结合的碳水化合物。O-连接的聚糖是与丝氨酸、苏氨酸或羟基化氨基酸的-OH基团结合的碳水化合物。S-连接的聚糖是与半胱氨酸的–SH基团结合的碳水化合物。C-连接的聚糖是通过C-C键与色氨酸结合的碳水化合物。
术语”聚糖“是指糖-RNA和/或由糖苷连接的单糖组成的化合物，并且还可以是指糖缀合物的碳水化合物部分，例如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖，即使碳水化合物仅为单糖或低聚糖。
在本发明的一个实施方案中，所述处于癌症风险中或患有癌症的受试者是人。
如在本发明的上下文中已经令人惊讶地发现，如果受试者处于癌症的风险中或患有癌症，则可以指示癌症(如，泌尿生殖器癌，包括前列腺癌、肾癌、膀胱癌或睾丸癌)风险和/或存在的一些生物标志物糖蛋白(如，此类生物标志物糖蛋白的存在或过表达)表现出聚糖结构改变。在本发明的上下文中，这导致了令人惊讶的发现，即与相同糖蛋白的”正常“聚糖结构存在偏差的此类糖蛋白上的特定聚糖结构可以指示癌症(如，泌尿生殖器癌，包括前列腺癌、肾癌、膀胱癌或睾丸癌)风险和/或存在。根据本发明，使用能够结合此类聚糖结构的合适结合剂来识别此类生物标志物糖蛋白上的该种改变的聚糖结构，然后允许诊断受试者是否处于癌症(例如，泌尿生殖器癌，包括前列腺癌、肾癌、膀胱癌或睾丸癌)风险中或是否患有癌症。
在这种情况下，根据本发明，可以使用能够结合非癌状态的生物标志物糖蛋白的聚糖结构的结合剂，根据本文所述和提供的方法的步骤(1)使所述结合剂与样品接触，并比较所述结合剂与本文提供方法中所述的对照样品(健康样品，即其不含癌状态的生物标志物糖蛋白，该种生物标志物糖蛋白与非癌状态的生物标志物糖蛋白的聚糖结构相比具有改变的聚糖结构，或者含有更少(如，至少约1.5x，至少约2x，至少约2.5x，或至少约3x更少)的癌状态的生物标志物糖蛋白，该种生物标志物糖蛋白与非癌状态的生物标志物糖蛋白的聚糖结构相比具有改变的聚糖结构)中包含的生物标志物糖蛋白的聚糖结构的结合能力。如果与对照样品相比，结合剂以更低的程度(优选显著更低的程度，例如至少约1.5X、至少约2X、至少约2.5X或至少约3X更低的程度)结合可能处于癌症风险中或可能患有癌症的受试者样品中所含生物标志物糖蛋白的聚糖结构，则指示所述受试者处于癌症风险中或患有癌症。
同样，根据本发明，也可以使用能够结合癌状态的生物标志物糖蛋白的聚糖结构的结合剂，根据本文所述和提供的方法的步骤(1)使所述结合剂与样品接触，并比较所述结合剂与本文提供方法中所述的对照样品(健康样品，即其不含癌状态的生物标志物糖蛋白，该种生物标志物糖蛋白与非癌状态的生物标志物糖蛋白的聚糖结构相比具有改变的聚糖结构，或者含有更多(如，至少约1.5x，至少约2x，至少约2.5x，或至少约3x更多)的癌状态的生物标志物糖蛋白，该种生物标志物糖蛋白与非癌状态的生物标志物糖蛋白的聚糖结构相比具有改变的聚糖结构)中包含的生物标志物糖蛋白的聚糖结构的结合能力。如果与对照样品相比，结合剂以更高的程度(优选显著更高的程度，例如至少约1.5X、至少约2X、至少约2.5X或至少约3X更高的程度)结合可能处于癌症风险中或可能患有癌症的受试者样品中所含生物标志物糖蛋白的聚糖结构，则指示所述受试者处于癌症风险中或患有癌症。
在本发明的一个实施方案中，所述受试者可能处于风险中的或受试者可能患有的癌症可以是泌尿生殖器癌。在一个具体实施方案中，所述泌尿生殖器癌可以为前列腺癌、肾癌、膀胱癌或睾丸癌，优选为前列腺癌(PCa)。
根据本发明，在本文描述和提供的方法中使用的能够(特异性地)结合至本文描述的生物标志物糖蛋白的聚糖结构的结合剂可以是能够结合至聚糖结构的任何种类的试剂。优选地，此类结合剂是其与聚糖结构的结合可以被测量和定量的试剂，所述结合可以被测量和定量例如，可以是结合本身可以被检测和测量，和/或结合剂包含可以以合适的方法检测的标记分子。在本发明的上下文中，合适的结合剂的非限制性实例可以包括凝集素、抗-聚糖抗体、适体(核酸适体，如DNA或RNA适体，或肽适体)，或硼酸或其衍生物。在本发明的一个实施方案中，在本文描述和提供的方法中使用的结合剂是凝集素。在本文描述和提供的本发明方法的上下文中的另一个实例中，所述结合剂能够(特异性地)结合以与半乳糖的3或6位α或β连接的N-乙酰半乳糖胺为末端的聚糖结构或包含LacdiNAc表位(GalNAc1-4GlcNAc)的聚糖结构，优选结合以与半乳糖的3或6位α或β连接的N-乙酰半乳糖胺为末端的聚糖结构。
通常，如本文所用的，如本文所用的“结合剂”(或“识别分子”)包括包含一个或多个能够结合靶表位的结合结构域的多肽(如，凝集素或抗-聚糖抗体或其片段)，以及能够结合聚糖结构的其它分子(例如，适体或硼酸及其衍生物)。换言之，结合剂为所述一个或多个结合结构域提供骨架，使得所述结合结构域可以与给定的靶结构/抗原/表位结合/相互作用。术语“结合结构域”在本发明中表征与给定靶表位特异性结合/相互作用的多肽的结构域。“表位”是抗原性的，因此术语表位在本文中有时也称为“抗原结构”或“抗原决定簇”。在本发明的上下文中，聚糖结构可以作为结合剂的抗原结构，所述结合剂为例如凝集素、抗-聚糖抗体、适体(核酸适体，如DNA或RNA适体，或肽适体)，或硼酸或其衍生物，优选为一种或多种凝集素和/或抗-聚糖抗体，优选一种或多种凝集素。因此，结合结构域是“抗原相互作用位点”。根据本发明，术语“抗原相互作用位点”定义了多肽的基序，其能够与特定抗原或特定抗原集(如不同物种中的相同抗原)特异性相互作用。也可以将所述结合/相互作用理解为定义“特异性识别”。
术语“表位”还指抗原上结合剂结合的位点。优选地，表位是分子上结合剂将结合的位点，所述结合剂例如凝集素、抗-聚糖抗体、适体(核酸适体，如DNA或RNA适体，或肽适体)，或硼酸或其衍生物，优选为一种或多种凝集素和/或抗-聚糖抗体，优选为一种或多种凝集素。
如本文所用的术语“适体”是指与特定靶分子结合的核酸、寡核苷酸或肽分子。除非另有明确定义，否则本文所用术语“核酸”或“核酸分子”与“寡核苷酸”、“核酸链”等同义使用，并且意指包含一个、两个或更多个核苷酸的，如单链或双链的聚合物。
如本文所用的术语“凝集素”指任何类型和来源的碳水化合物结合蛋白，包括凝集素、半乳凝素、选择素、重组凝集素或前述物质的片段，以及连接至骨架的聚糖结合位点的片段。本文所用的术语“凝集素”还包括能够与聚糖结构结合的凝集素片段。凝集素可以是对一个或多个碳水化合物部分高度特异性的(例如，凝集素特异性地与其他分子的末端糖苷残基反应，比如糖蛋白的聚糖(糖蛋白的支链糖分子，比如本发明含义内的靶多肽和本文中表1所述的生物标志物))。凝集素是本领域公知的。技术人员容易获得以确定哪种凝集素可以用于结合一种或多种目标碳水化合物部分，如附着于蛋白质的聚糖的一种或多种碳水化合物部分。本文描述了本发明上下文中应用的优选凝集素。术语“凝集素”也包括Siglecs(结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素)。值得注意的是，本文使用的术语“凝集素”也指聚糖-结合抗体。因此，当在本文使用时，术语“凝集素”涵盖凝集素、Siglecs、以及聚糖-结合抗体。
可以使用本领域已知的常规方法分离和任选地纯化如本文所述的和本发明上下文所采用的凝集素。例如，当从其天然来源分离时，可以在适当的固定的碳水化合物基质上，并用适当的半抗原洗脱将凝集素纯化至均质。参见，Goldstein&Poretz(1986)In Thelectins.Properties,functions and applications in biology and medicine(Liener等编辑),pp.33-247.Academic Press,Orlando,Fla.；Rudiger(1993)In Glycosciences:Status and perspectives(Gabius&Gabius编辑),pp.415-438.Chapman and Hall,Weinheim,Germany。或者，可以根据已建立的方法通过重组方法产生凝集素。参见Streicher&Sharon(2003)Methods Enzymol.363:47-77。作为另一种选择，可以使用标准肽合成技术或使用本领域熟知的化学切割方法，基于已知凝集素或本文公开的凝集素(例如US 9169327B2)的氨基酸序列产生凝集素。另一种选择可以是通过对任何上述特定凝集素进行化学修饰而制备的人工凝集素(参见Y.W.Lu,C.W.Chien,P.C.Lin,L.D.Huang,C.Y.Chen,S.W.Wu,C.L.Han,K.H.Khoo,C.C.Lin,Y.J.Chen,BAD-Lectins:Boronic Acid-Decorated Lectins with Enhanced Binding Affinity for the Selective Enrichmentof Glycoproteins,Analytical Chemistry,85(2013)8268-8276.)。
在本发明的上下文中，在聚糖与凝集素结合(或反之亦然)的情况下，结合亲和力优选在约10-1至10-10(KD)的范围内，优选为约10-2至10-8(KD)，更优选为约10-3至10-5(KD)。如本文所用，当结合剂为凝集素时，在结合剂与聚糖结构结合的上下文中，术语“特异性地”或“特异性的”可以优选地意指约10-2至10-8(KD)，更优选地约10-3至10-5(KD)的结合亲和力。测量聚糖与凝集素结合的相应KD的方法是本领域已知的，并且这些方法是本领域技术人员容易获得的。
在本发明的一个实施方案中，在本发明的上下文中使用的结合剂可以是抗体。当在本文中使用时“抗体”是包含一种或多种基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的多肽(包含一个或多个结合结构域，优选抗原结合结构域)的蛋白质。在本文中术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”互换使用。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量的免疫球蛋白可变区基因。
特别地，本文所用的“抗体”是典型地由两个轻(L)链(每个约25kDa)和两个重(H)链(每个约50kDa)组成的四聚体糖基化蛋白。在抗体中可以发现两种轻链，称作λ和κ。取决于重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白划分为五个主要类别：A、D、E、G和M，这些中若干类别可进一步划分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgM抗体由5个基本异源四聚体单元连同一个另外的称为J链的多肽组成，并含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含与J链组合的2-5个可聚合形成多价聚集体的基本4-链单元。在IgG的情况下，4-链单元通常约150,000道尔顿。
每个轻链包括一个N端可变(V)结构域(VL)和一个恒定(C)结构域(CL)。每个重链包括一个N端V结构域(VH)、三或四个C结构域(CH)和一个铰链区。所述恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合。
VH和VL配对一起形成单一抗原-结合位点。离VH最近的CH结构域被指定为CH1。每个L链通过一个共价二硫键连接到H链，而两个H链则通过一个或多个二硫键彼此连接，具体取决于H链同种型。所述VH和VL结构域包括四个相对保守的序列区域，称为构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其为三个高变序列区域(互补决定区，CDR)形成支架。所述CDR包含负责抗体与抗原的特异性相互作用的大部分残基。CDR被称作CDR1、CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR成分被称作H1、H2和H3，而轻链上的CDR成分被称作L1、L2和L3。
术语“可变(的)”是指免疫球蛋白结构域中在其序列上展现出可变性并且参与决定特定抗体的特异性和结合亲和性的部分(即所述的“可变结构域”)。可变性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域；而是集中于每个重链可变区和轻链可变区的亚结构域。这些亚结构域称为“互补性决定区”(CDR)。可变结构域中更保守(即非高变的)部分称为“框架”区(FRM)。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区，其主要采取由三个高变区连接的β折叠构型，该三个高变区形成连接β片结构且在一些情况下形成β片结构的一部分的环。各链中的高变区通过FRM紧邻地保持在一起且与来自其他链的高变区一起促成抗原结合位点的形成(参见Chothia等，J MoI Biol(1987),196:901；和MacCallum等，J MoIBiol(1996),262:732)。恒定结构域不直接参与抗原结合，但显示各种效应子功能，比如抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性和补体活化。
术语“CDR”及其复数“CDRs”是指这样的互补性决定区(CDR)：其三个(CDRL1、CDRL2和CDRL3)构成轻链可变区的结合特征，并且三个(CDRH1、CDRH2和CDRH3)构成重链可变区的结合特征。CDR促进抗体分子的功能活性并被包含支架或框架区的氨基酸序列分开。精确的定义上的CDR边界和长度从属于不同的分类和编号系统。尽管边界不同，但这些系统中每一个都在构成可变序列内的所谓的“高变区”方面具有一定程度的重叠。因此，关于邻近的框架区，根据这些系统的CDR定义在长度和边界区域上可能不同。参见例如Kabat、Chothia和/或MacCallum(Chothia等，J MoI Biol(1987),196:901；和MacCallum等，J MoI Biol(1996),262:732)。
如本文所用的术语“氨基酸”或“氨基酸残基”典型地是指具有本领域所认识的定义的氨基酸，比如选自下述的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(He或I)：亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；和缬氨酸(Val或V)，但也可根据需要使用经修饰的、合成的或稀有的氨基酸。通常，氨基酸可分组为具有非极性侧链(例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；带负电荷侧链(例如Asp、Glu)；带正电荷侧链(例如Arg、His、Lys)；或不带电荷极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。
术语“框架区”是指抗体可变区中存在于更相异的(即高变的)CDR之间的领域公认部分。该框架区典型地是指框架1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)，并且在三维空间为六个CDR(三个来自重链，三个来自轻链)的呈现提供支架以形成抗原-结合表面。
当在本文使用时，术语“抗体”不仅指免疫球蛋白(或完整的抗体)，还指其片段，并涵盖任何包含抗原-结合片段或抗原-结合结构域的多肽。优选地，所述片段诸如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb以及其他保有抗原-结合功能的抗体片段。典型地，这样的片段将包含抗原-结合结构域并与本文所述抗体具有相同的性质。
如本文所用的术语“抗体”包括竞争结合与本发明抗体结合的表位相同的表位的抗体，优选地该种抗体可通过本文其它地方所述的产生抗体的方法获得。
为了确定测试抗体是否可以竞争结合相同的表位，可以进行交叉阻断测定，例如竞争性ELISA测定。在示例性竞争性ELISA测定中，将微量滴定板的表位包被的孔或表位包被的琼脂糖珠用候选竞争性抗体或不与候选竞争性抗体预温育，然后加入本发明的生物素标记的抗体。使用抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物和合适的底物测量与孔中或珠上与表位结合的标记抗体的量。
或者，可以用例如放射性、酶或荧光标记或一些其它可检测和可测量的标记来标记抗体。结合抗原的标记抗体的量与候选竞争抗体(测试抗体)竞争结合抗原上的相同表位的能力具有负相关性，即测试抗体对相同表位的亲和力越大，则结合抗原包被的孔的标记抗体越少。
如果与不存在候选竞争性抗体(但可能存在已知的非竞争性抗体)时平行进行的对照相比，候选抗体可以阻断抗体的结合的至少20％，优选地至少20-50％，甚至更优选地至少50％，则认为候选竞争性抗体是与本发明的抗体基本上结合相同的表位的抗体或竞争结合相同的表位的抗体。应当理解，可以对该测定进行变化以达到相同的定量值。
术语“抗体”还包括、但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性(比如双特异性)、非特异性、人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移植和体外产生的抗体，其中多克隆抗体是优选的。所述术语还包括结构域抗体(dAb)和纳米抗体。
因此，术语“抗体”还涉及纯化的血清，即纯化的多克隆血清。因此，所述术语优选涉及血清，更优选地涉及多克隆血清，最优选地涉及纯化的(多克隆)血清。抗体/血清是可获得的，并且优选地例如通过本文所述的方法或用途获得。
“多克隆抗体”或“多克隆抗血清”指含有对一种(单价或特异性抗血清)或多种(多价抗血清)抗原具有特异性的抗体混合物的免疫血清，其可以由采用一种或多种抗原免疫的动物的血液来制备。
另外，本发明所用术语“抗体”也涉及本文描述的与所述抗体具有相同特异性的所述抗体的衍生物或变体。“抗体变体”的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和性成熟的”抗体(参见如Hawkins等，J Mol Biol(1992),254,889-896和Lowman等，Biochemistry(1991),30:10832-10837)和具有改变的效应功能的抗体突变体(参见如美国专利5,648,260)。
当在本文中使用时，术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“抗体结合区”是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸。由抗体特异性识别和结合的抗原部分称为如上文所描述的“表位”。如上文所提及，抗原结合结构域可典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其无需同时包含该两者。举例而言，Fd片段具有两个VH区且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体的抗原-结合片段的实例包括(1)Fab片段，其为具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab')2片段，其为在绞链区具有两个由二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(3)Fd片段，其具有两个VH和CH1结构域；(4)Fv片段，其具有抗体的单臂的VL和VH结构域，(5)dAb片段(Ward等,(1989)Nature341:544-546)，其具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)，和(7)单链Fv(scFv)。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由独立基因编码，但它们可使用重组方法通过合成连接物相连，该合成连接物使它们能够成为单一蛋白质链，在该单一蛋白质链中VL区与VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等，(1988)Science(1988),242:423-426；和Huston等，(1988)PNAS USA(1988),85:5879-5883。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，且片段的功能以与完整抗体相同的方式评估。
本文所用术语“单克隆抗体”是指化学修饰的单克隆抗体或其片段，以及从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，所述群体即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰(如异构化、酰胺化)之外，构成所述群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(determinant)(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们是由杂交瘤培养物合成的，不会被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的特征，而不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler等，Nature(1975),256:495首次描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组DNA方法(参见，如，美国专利No.4,816,567)产生。还可以采用例如Clackson等，Nature(1991),352:624-628；和Marks等J Mol Biol(1991),222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体库中分离“单克隆抗体”。
单克隆抗体在此具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类别的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类别的抗体中的对应序列相同或同源，以及包括这些抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性即可(美国专利No.4,816,567；Morrison等，PNAS USA(1984),81:6851-6855)。本文的目标嵌合抗体包括“原始化(primitized)”抗体，其包含源自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是主要为人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(比如，抗体的Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或其它抗原结合亚序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。大多数情况下，人源化抗体是其中来自受体的高变区(也称CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)比如小鼠、大鼠或兔的高变区(其具有所需的特异性、亲和力和能力)的残基取代的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。而且，如本文所用，“人源化抗体”还可以包含在受体抗体和供体抗体中均未发现的残基。进行这些修饰以进一步完善和优化抗体的性能。理想地，人源化抗体还将会包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地，包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。进一步细节参见：Jones等，Nature(1986),321:522-525；Reichmann等，Nature(1988),332:323-329；和Presta,Curr.Op.Struct Biol(1992),2:593-596。
术语“人抗体”包括具有与本领域已知的人种系免疫球蛋白序列基本上对应的可变区和恒定区的抗体，包括，例如，Kabat等所述的抗体(参见Kabat，等，在上述引文中)。本发明的人抗体可以例如在CDR、特别是CDR3中包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如，通过体外的随机或位点特异性诱变或通过体内的体细胞突变引入的突变)。人抗体可以具有至少1、2、3、4、5或更多个被不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基取代的位置。
如本文所用，“体外产生的抗体”是指其中全部或部分的可变区(如，至少一个CDR)是在非免疫细胞选择(例如，体外噬菌体展示、蛋白质芯片或其中可以测试候选序列的抗原结合能力的任何其他方法)中产生的抗体。因此，该术语优选地排除通过免疫细胞中的基因组重排产生的序列。
“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过许多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab’片段的连接。参见，如，Songsivilai&Lachmann,Clin Exp Immunol(1990),79:315-321；Kostelny等，J Immunol(1992),148:1547-1553。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一结合结构域多肽，比如Fab’片段，其经由免疫球蛋白恒定区与第二结合结构域多肽连接。
本领域技术人员已知的许多种方法均可用于获得抗体或其抗原结合片段。例如，可以使用重组DNA方法产生抗体(美国专利4,816,567)。也可以根据已知方法通过产生杂交瘤产生单克隆抗体(参见，如，Kohler和Milstein Nature(1975),256:495-499)。通过该方式形成的杂交瘤则使用标准方法进行筛选以识别出一种或多种产生特异性结合特定抗原的抗体的杂交瘤，所述标准方法比如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振(BIACORETM)分析。可以将任何形式的特定抗原用作免疫原，如，重组抗原、天然存在形式、其任意变体或片段以及其抗原性肽。
制备抗体的一个示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于例如美国专利No.5,223,409；Smith,Science(1985),228:1315-1317；Clackson等，Nature(1991),352:624-628；Marks等，J MoI Biol(1991),222:581-597WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO92/09690和WO 90/02809。
在另一个实施方案中，自非人动物中获得单克隆抗体，然后对其进行修饰，如，人源化、去免疫化(deimmunized)、嵌合，可以使用本领域已知的重组DNA技术产生。已经描述了许多种用于制备嵌合抗体的方法。参见，如，Morrison等，PNAS USA(1985),81:6851；Takeda等，Nature(1985),314:452；U.S.专利No.4,816,567；U.S.专利No.4,816,397；EP171496；EP 173494,GB 2177096。人源化抗体也可以使用例如转基因小鼠产生，该转基因小鼠表达人重链和轻链基因，但不能表达内源性小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因。Winter描述了一种示例性的CDR-移植方法，其可以用于制备本文所述的人源化抗体(美国专利No.5,225,539)。特定人抗体的全部CDR均可以被至少一部分非人CDR取代，或者仅一些CDR可以被非人CDR取代。只需取代人源化抗体与预定抗原结合所需数量的CDR即可。
人源化抗体或其片段可以通过以下产生：将Fv可变结构域的不直接参与抗原结合的序列用来自人Fv可变结构域的等同序列取代。Morrison,Science(1985),229:1202-1207；Oi等，BioTechniques(1986),4:214；US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US5,859,205；和US 6,407,213中提供了用于产生人源化抗体或其片段的示例性方法。这些方法包括从重链或轻链中的至少一个分离、操纵和表达编码全部或部分免疫球蛋白Fv可变结构域的核酸序列。这些核酸可以获自如上所述产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤，以及获自其它来源。然后可以将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆到适当的表达载体中。
在某些实施方案中，通过引入保守置换、共有序列置换、种系置换和/或回复突变，对人源化抗体进行优化。这些改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的若干技术中的任意者产生(如，Teng等，PNAS USA(1983),80:7308-731；Kozbor等，Immunology Today(1983),4:7279；Olsson等，Meth Enzymol(1982),92:3-16)，并且可以根据WO 92/06193或EP 239400的教导产生。
在抗体的情况下，据信特异性结合由结合结构域氨基酸序列中的特异性基序实现，该基序和抗原由于它们的一级、二级或三级结构以及由于所述结构的二次修饰而彼此结合。抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用也可导致所述位点与抗原的简单结合。此外，抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可以另外可选地导致信号的引发，例如由于诱导抗原构象的改变、抗原的低聚化等。符合本发明的结合结构域的一个实例是抗-聚糖抗体。在本上下文中，当结合剂是抗体时，当结合亲和力高于10-1M时，认为结合是特异性的。优选地，当结合亲和力为约10-5至10-12M(KD)、优选地约10-8至10-12M时，认为结合是特异性的(当结合剂为抗体时)。如果必要，通过改变结合条件，可以在基本上不影响特异性结合的情况下减少非特异性结合。识别分子是否如本文上文所定义特异性地反应可以很容易地测试，尤其是，通过将所述识别分子与表位的反应和所述识别分子与其他蛋白质的反应进行比较。
根据本发明，其存在或过表达(如，至少约1.5倍、至少约2倍或至少约3倍过表达)指示癌症(如，泌尿生殖器癌，包括前列腺癌、肾癌、膀胱癌或睾丸癌)风险和/或存在的生物标志物糖蛋白(在本文中也称为生物标志物或生物标志物蛋白)可以是任何糖蛋白，与未处于发展此类癌症风险或未患有此类癌症的(人)受试者的细胞相比，所述任何糖蛋白在处于发展癌症(如，泌尿生殖器癌，包括前列腺癌、肾癌、膀胱癌或睾丸癌)风险或患有癌症的(人)受试者的细胞中存在或过表达(如，至少1.5倍、2倍或3倍过表达)。优选地，在本发明的上下文中，与非癌状态相比，在癌状态下这种生物标志物糖蛋白具有不同的聚糖结构。例如，与没有处于发展前列腺癌的风险中或未患有前列腺癌的(人)受试者相比，在处于发展前列腺癌(PCa)的风险中或患有前列腺癌(PCa)的(人)受试者细胞中存在或过表达诸如如下的糖蛋白：ZAG(锌α-2-糖蛋白)、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、PSA(前列腺特异性抗原)、TIMP-1(金属蛋白酶组织抑制因子-1)、fPSA(游离PSA)、tPSA(总PSA)、骨桥蛋白、PSMA(前列腺特异性膜抗原)和/或spondin-2，并且因此它们可以用作根据本发明的生物标志物糖蛋白。因此，在本发明的一个实施方案中，其存在或过表达(如至少1.5倍、2倍或3倍过表达)或低表达(如至少1.5倍、2倍或3倍低表达)指示癌症(如泌尿生殖器癌，包括前列腺癌、肾癌、膀胱癌或睾丸癌)(特别是当此类癌症是前列腺癌时)风险和/或存在的生物标志物糖蛋白(本文也称为生物标志物或生物标志物蛋白)可以是ZAG、PAP、PSA、TIMP-1、fPSA、tPSA、骨桥蛋白、PSMA或spondin-2。
如本文所用，糖蛋白或蛋白质的“过表达”可以指与未处于此类癌症风险中或未患此类癌症的受试者的细胞相比，在处于本文所述的癌症风险中或患有所述癌症的受试者的细胞中产生更高量的所述糖蛋白或蛋白质的任何方式。例如，根据本发明，“过表达”可以指翻译或转录速率增加，或此类糖蛋白或蛋白质的合成总体增加，而低表达可以指翻译或转录速率下降，或此类糖蛋白或蛋白质的合成总体下降。
如本发明上下文中已经发现的，与来自未处于前列腺癌风险中或未患列腺癌的受试者的样品中所含有的ZAG相比，来自处于前列腺癌风险中或患有前列腺癌的受试者的样品中的ZAG表现出不同的聚糖结构。在本发明的具体实施方案中，特别是当所述受试者被诊断的癌症是前列腺癌时，所述生物标志物糖蛋白是ZAG和/或PAP，优选为ZAG或PAP，更优选为ZAG。
本发明的方法还可以包括其它生物标志物的另外的分析。因此，在本发明的方法中，一种或多种其它生物标志物糖蛋白可以选自PSA、TIMP-1、fPSA、tPSA、骨桥蛋白和spondin-2。
在本发明的上下文中，在本文描述和提供的方法中使用的能够结合本文描述的生物标志物糖蛋白的聚糖结构的结合剂结合本文描述的生物标志物糖蛋白的聚糖结构。在本发明的一个实施方案中，结合剂(优选凝集素)能够(特异性)结合以下中的一种或多种：核心岩藻糖、触角岩藻糖、含有Fucα1-6GlcNAc-N-Asn的N-连接的低聚糖、Fucα1-6/3GlcNAc、α-L-Fuc、Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc、Fucα1-2Gal、Fucα1-6GlcNAc、Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc、支链N-连接的六糖、Manα1-3Man、α-D-Man、(GlcNAcβ1-4、Galβ1-4GlcNAc、GlcNAcα1-4Galβ1-4GlcNAc、(GlcNAcβ)1-4、Neu5Ac(唾液酸)、Galβ1-3GalNAc-丝氨酸/苏氨酸、Galα1-3GalNAc、Galβ1-6Gal、Galβ1-4GlcNAc、Galβ1-3GalNAc、GalNAcα1-3GalNAc、GalNAcα1-3Gal、GalNAcα/β1-3/4Gal、α-GalNAc、GalNAcβ1-4Gal、GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal、GalNAcα1-2Gal、GalNAcα1-3GalNAc、GalNAcβ1-3/4Gal、GalNAc-丝氨酸/苏氨酸(Tn抗原)、Galβ1-3GalNAc-丝氨酸/苏氨酸(T抗原)、GalNAcβ1-4GlcNAc(LacdiNAc)、α-2,3Neu5Ac(α2-3连接的唾液酸)、α-2,6Neu5Ac(α2-6连接的唾液酸)、α-2,8Neu5Ac(α2-8连接的唾液酸)、唾液酸(α-2,3Neu5Ac、α-2,6Neu5Ac或α-2,8Neu5Ac)、Neu5Acα4/9-O-Ac-Neu5Ac、Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc/GlcNAc、Neu5Acα2-6Gal/GalNAc、N-连接的双触角、N-连接的三/四触角、支链β1-6GlcNAc、Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3/4GlcNAc、Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc、Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc、Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc、高甘露糖、唾液酸化路易斯a(唾液酸化Lea)抗原、唾液酸化路易斯x(唾液酸化Lex)抗原、路易斯x(Lex)抗原、唾液酸化Tn抗原、唾液酸化T抗原、路易斯Y(LeY)抗原、硫酸化核心1聚糖、Tn抗原、T抗原、核心2聚糖、路易斯a(Lea)抗原、(GlcNAcβ1-4)n、β-D-GlcNAc、GalNAc、Gal-GlcNAc、GlcNAc、Galα1-3Gal、Galβ1-3GalNAc、α-Gal、α-GalNAc、(GlcNAc)n或支链(LacNAc)n)。
如本文所述，在本发明的一个实施方案中，在本文所述和提供的方法中使用的结合剂可以尤其能够(特异性)结合以与半乳糖的3或6位α或β连接的N-乙酰半乳糖胺为末端的聚糖结构，或结合包含LacdiNAc表位(GalNAc1-4GlcNAc)的聚糖结构，优选结合以与半乳糖的3或6位α或β连接的N-乙酰半乳糖胺为末端的聚糖结构。如在本发明上下文中已令人惊奇地发现的，与来自未处于前列腺癌风险中或未患有前列腺癌的受试者样品中所含有的ZAG相比，来自处于前列腺癌风险中或患有前列腺癌的受试者的样品中所含有的ZAG(“癌性ZAG”)表现出不同的聚糖结构。根据本发明，可以使用本文所述的能够结合此类“癌性ZAG”的聚糖结构的结合剂来检测此类“癌性ZAG”。如本发明上下文中进一步发现的，可以通过使用特定凝集素(多花紫藤(Wisteria floribunda)凝集素(WFA/WFL))结合(并因此检测)来自处于前列腺癌风险中或患有前列腺癌的受试者的样品中所含的ZAG(“癌性ZAG”)。因此，在本发明的一个实施方案中，在本文描述和提供的方法中采用的能够结合本文描述的生物标志物糖蛋白的聚糖结构的所述结合剂能够以一定的亲和力与多花紫藤凝集素(WFA/WFL)(特异性)结合相同的聚糖结构，所述一定的亲和力为多花紫藤凝集素(WFA/WFL)结合该聚糖结构的亲和力的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。测定结合剂(例如凝集素)与聚糖结构的亲和力水平的方法通常是本领域已知的，并且尤其包括表面等离子体共振、等温微量热法或ELISA和ELISA样形式，优选表面等离子体共振。
在本发明的一个更具体的实施方案中，在本文描述和提供的方法中使用的能够结合本文描述的生物标志物糖蛋白的聚糖结构的所述结合剂可以是多花紫藤凝集素(WFA/WFL)、L-选择素、P-选择素、E-选择素、AAL(橙黄网孢盘菌(Aleuria aurantia)凝集素)、MAA(朝鲜槐(Maackia amurensis)凝集素/凝集素)、GNL(雪钟花(Galanthus nivalis)凝集素)、PSL(豌豆(Pisum sativum)凝集素)或PHA-E(菜豆红细胞凝集素(Phaseolus vulgariserythroagglutinin))。在本发明的一个具体实施方案中，所述结合剂是多花紫藤凝集素(WFA/WFL)或PHA-E，优选多花紫藤凝集素(WFA/WFL)。
在本发明的上下文中，还可以将两种或更多种结合剂组合以用于本文描述和提供的方法中，所述结合剂能够结合本文描述的生物标志物糖蛋白的聚糖结构。在一些情况下，通过将两种或更多种此类结合剂组合，可以增加诊断潜力。在这种情况下，根据本发明，可以在本发明方法的步骤(1)中在同一测定中使用两种或更多种结合剂(例如凝集素)，或者-优选地-在不同测定(使用相同样品)中使用这两种或更多种结合剂(例如凝集素)，然后在步骤(2)中分别测定各个所述结合剂中的每一种是否结合所述生物标志物糖蛋白的聚糖结构，然后将由此获得的信息组合以用于诊断受试者是否处于癌症风险中或者是否患有癌症。在本发明的一个实施方案中，如果在本发明的方法中使用两种(或更多种)这样的结合剂，则此类结合剂都是凝集素。在本文的具体实施方案中，如果在本发明的方法中使用两种(或更多种)此类结合剂，则此类凝集素是或包括多花紫藤凝集素(WFA/WFL)和PHA-E。
对于本发明上下文中描述和提供的方法，可以使用任何合适的可以检测和定量本文所述的结合剂与本文所述的生物标志物糖蛋白的结合的测定法。此类合适的测定法通常是本领域已知的，并且包括ELISA或蛋白质印迹(特别是当结合剂是抗体时)，或基于凝集素的测定(参见，例如，WO2019/185515中描述的测定)，或酶联凝集素结合测定ELLBA(在细胞上，CELLBA；参见，例如，Gavérieux等，J Immunol Methods(1987),104(1-2):173-182)。在本发明的一个实施方案中，使用基于凝集素的测定。在本发明的另一个具体实施方案中，使用酶联凝集素结合测定(ELLBA)或磁性酶联凝集素测定(MELLA)，优选使用ELLBA。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含如本文所述的能够结合所述生物标志物蛋白的聚糖结构的结合剂。在本发明的一个实施方案中，所述结合剂可以是凝集素。在本发明的一个更具体的实施方案中，用于本文描述和提供的方法中的能够结合本文描述的生物标志物糖蛋白的聚糖结构的所述结合剂能够以一定的亲和力与多花紫藤凝集素凝集素(WFA/WFL)(特异性)结合相同的聚糖结构，所述一定的亲和力为多花紫藤凝集素(WFA/WFL)结合该聚糖结构的亲和力的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。在本发明的甚至更具体的实施方案中，所述结合剂可以是例如WFA/WFL、L-选择素、P-选择素、E-选择素、AAL、MAA、GNL、PSL或PHA-E，优选为WFA/WFL。在一些情况下，通过将两种或更多种这样的结合剂组合可以增加诊断潜力。因此，在本发明的一个实施方案中，本文描述和提供的试剂盒包含两种或更多种这样的结合剂。在本上下文中，在本发明的一个具体实施方案中，所述试剂盒包含的两种此类结合剂或包含的此类结合剂中的至少两种是凝集素。在本发明更具体的实施方案中，所述试剂盒包含的所述两种或更多种凝集素是WFA/WFL和PHA-E或包含他们。
本发明上下文中描述和提供的试剂盒还可以包含本领域技术人员容易理解的其它合适成分，例如，通过使用本文所述的合适测定法(例如，ELISA、蛋白质印迹、基于凝集素的测定、ELLBA、MELA或其它)进行所述方法所需的酶和缓冲液。
本发明还涉及以下项目：
1.用于诊断受试者是否处于癌症风险中或是否患有癌症的方法，包括
(1)将自所述受试者获得的样品与结合剂接触，所述样品包含生物标志物糖蛋白，所述结合剂能够结合所述生物标志物糖蛋白的聚糖结构，
其中所述生物标志物糖蛋白的存在或过表达指示所述癌症的风险和/或存在所述癌症，和
其中所述聚糖结构与在未处于所述癌症风险中或未患有所述癌症的受试者中表达的所述生物标志物糖蛋白的聚糖结构存在偏差，以及
(2)测定所述结合剂是否结合所述生物标志物糖蛋白的聚糖结构，
其中与对照样品相比，所述结合剂与所述生物标志物糖蛋白的所述聚糖结构的更低或更高的结合指示所述受试者处于癌症风险中或患有癌症。
2.根据项目1所述的方法，其中所述受试者是人。
3.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述癌症是泌尿生殖器癌，优选为前列腺癌(PCa)。
4.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述结合剂是凝集素、抗-聚糖抗体、适体或硼酸或其衍生物。
5.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述生物标志物糖蛋白选自ZAG、PAP、PSA、TIMP-1、fPSA、tPSA、骨桥蛋白和spondin-2。
6.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述结合剂结合以下中的一种或多种：核心岩藻糖、触角岩藻糖、含有Fucα1-6GlcNAc-N-Asn的N-连接的低聚糖、Fucα1-6/3GlcNAc、α-L-Fuc、Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc、Fucα1-2Gal、Fucα1-6GlcNAc、Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc、支链N-连接的六糖、Manα1-3Man、α-D-Man、(GlcNAcβ1-4、Galβ1-4GlcNAc、GlcNAcα1-4Galβ1-4GlcNAc、(GlcNAcβ1-4、Neu5Ac(唾液酸)、Galβ1-3GalNAc-丝氨酸/苏氨酸、Galα1-3GalNAc、Galβ1-6Gal、Galβ1-4GlcNAc、Galβ1-3GalNAc、GalNAcα1-3GalNAc、GalNAcα1-3Gal、GalNAcα/β1-3/4Gal、α-GalNAc、GalNAcβ1-4Gal、GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal、GalNAcα1-2Gal、GalNAcα1-3GalNAc、GalNAcβ1-3/4Gal、GalNAc-丝氨酸/苏氨酸(Tn抗原)、Galβ1-3GalNAc-丝氨酸/苏氨酸(T抗原)、GalNAcβ1-4GlcNAc(LacdiNAc)、α-2,3Neu5Ac(α2-3连接的唾液酸)、α-2,6Neu5Ac(α2-6连接的唾液酸)、α-2,8Neu5Ac(α2-8连接的唾液酸)、唾液酸(α-2,3Neu5Ac、α-2,6Neu5Ac或α-2,8Neu5Ac)、Neu5Acα4/9-O-Ac-Neu5Ac、Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc/GlcNAc、Neu5Acα2-6Gal/GalNAc、N-连接的双触角、N-连接的三/四触角、支链β1-6GlcNAc、Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3/4GlcNAc、Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc、Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc、Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc、高甘露糖、唾液酸化路易斯a(唾液酸化Lea)抗原、唾液酸化路易斯x(唾液酸化Lex)抗原、路易斯x(Lex)抗原、唾液酸化Tn抗原、唾液酸化T抗原、路易斯Y(LeY)抗原、硫酸化核心1聚糖、Tn抗原、T抗原、核心2聚糖、路易斯a(Lea)抗原、(GlcNAcβ1-4)n、β-D-GlcNAc、GalNAc、Gal-GlcNAc、GlcNAc、Galα1-3Gal、Galβ1-3GalNAc、α-Gal、α-GalNAc、(GlcNAc)n或支链(LacNAc)n)。
7.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述结合剂结合以与半乳糖的3或6位α或β连接的N-乙酰半乳糖胺为末端的聚糖结构，或包含LacdiNAc表位(GalNAc1-4GlcNAc)的聚糖结构。
8.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述结合剂以一定亲和力结合与WFA/WFL所结合的聚糖结构相同的聚糖结构，所述一定亲和力为WFL结合所述聚糖结构的亲和力的至少80％。
9.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述结合剂是WFL/WFA、L-选择素、P-选择素、E-选择素、AAL、MAA、GNL、PSL或PHA-E。
10.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述结合剂是WFL/WFA。
11.根据前述项目中任一项所述的方法，其中采用基于凝集素的测定。
12.根据项目11所述的方法，其中采用酶联凝集素结合测定(ELLBA)。
13.用于实施前述项目中任一项所述的方法的试剂盒，其包含能够结合所述生物标志物蛋白的聚糖结构的结合剂。
14.根据项目13所述的试剂盒，其中所述结合剂是凝集素。
15.根据项目13或14所述的试剂盒，其中所述凝集素是WFA或以一定亲和力结合与WFA/WFL所结合的聚糖结构相同的聚糖结构的结合剂，所述一定亲和力为WFL/WFA结合所述聚糖结构的亲和力的至少80％。
在本文中描述了、在实施例中示例性说明了和在权利要求中反映了表征本发明的实施方案。
需要指出的是，除非上下文另有明确指示，否则本文所用单数形式“一(a)”、“一种(an)”和“所述/该(the)”包括所复数指代。因此，例如，提及的“一种试剂”包括一种或多种这样不同的试剂，提及“所述方法”包括提及本领域普通技术人员已知的可修饰或置换本文所述的方法的等效步骤和方法。
除非另有说明，否则一系列要素之前的术语“至少”将被理解为是指该系列中的每一个要素。本领域技术人员将认识到或采用常规实验能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等价方案。本发明旨在涵盖此类等价方案。
术语“和/或”无论在本文何处使用均包括“和”、“或”以及“所述术语所连接的要素的全部或任何其它组合”。
如本文所用的术语“约”或“近似”是指在给定值或范围的20％内，优选在10％内，并且更优选地在5％或2％内。
本说明书及随后的权利要求中，除非上下文有其它要求，否则词语“包括/包含(comprise)”以及变形词语诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”将被理解为意指包括陈述的整数或步骤或者整数或步骤的集合，但并不排除任何其它的整数或步骤或者整数或步骤的集合。当本文使用时，术语“包括/包含(comprising)”能够用术语“含有(containing)”或“包括(including)”替代或有时在本文中使用时用术语“具有(having)”替代。
当本文使用时，“由...组成”排除了在权利要求要素中未规定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由…组成”不排除实质上不影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。
在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”中的任一个可以用其它两个术语中的任一个来替代。
应该理解的是，本发明并不限于本文所述的具体的方法学、方案、和试剂等，因为这些能够改变。本文所使用的术语只用于描述特定实施方案的目的而并不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
本说明书全文所引用的所有出版物和专利(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指导书等)，无论在前还是在后，其通过引用以其整体并入本文。本文的任何内容均不能被解释为承认本发明由于在先发明而不早于这样的公开物。在通过引入方式并入的材料与本说明书矛盾或不一致时，本说明书将取代任何这样的材料。
通过以下实施例进一步示例性说明本发明。然而，其中所述的实施例和具体实施方案不应被解释为将本发明限制于这些具体实施方案。
实施例
本文所用的方法学是众所周知的，并且也公开在如Mislovicová等，Biointerfaces(2012),94:163-169中。将多克隆抗-ZAG抗体固定在ELISA板孔的底部。洗涤步骤后，(用人血清白蛋白)封闭表面，并用先前优化的方案再次洗涤。随后(在以下每个步骤之后进行另外的洗涤步骤)，将(i)稀释的人血清样品，(ii)生物素化的凝集素和(iii)链霉亲和素-过氧化物酶(来自辣根)加入到板中以完成夹心构型。使用OPD/过氧化氢系统产生信号，使用硫酸终止反应，在450nm下读取信号。尽管可以考虑使用磁珠并且使用磁珠应该产生至少一样清楚的结果，但是由于ZAG在血液中的浓度比PSA高得多，因此无需使用磁珠预先富集ZAG，由此通过不使用磁珠来简化了测定形式。
如先前报道的(参见Bertokova等，Bioorganic&Medicinal Chemistry(2021),116156；Bertok等，Glycoconjugate Journal(2020),37:703-711)，使用软件和RStudio免费版中的R，分别使用个体标志物(PSA水平、ZAG水平、年龄和个体凝集素)及它们的组合的ROC曲线和AUC参数来评价个体样品(至少一式两份测量)对凝集素结合的应答。
从Slovakia大学医院收集真实血清样品。本研究中血清样品的总量为n＝69，进行两个独立的实验，即CASE1：良性组(n＝18)vs.已经在治疗中的PCa组(n＝15)的比较，以及CASE2：BPH组(n＝21)vs.早期检测到PCa的患者(n＝15)的比较。
结果表明ZAG的糖谱分析可用于将早期PCa与BPH区分开(CASE2)。区分早期PCa与BPH(CASE2)的最佳凝集素是AUC为0.892的WFL(表1)(本文所用的WFL是多花紫藤凝集素(WFA/WFL))。
为了进一步增强使用ZAG糖谱的区分潜力，可以将两种凝集素组合。在一些情况下，使用两种凝集素更适于区分PCa和BPH(CASE2)，其中两种凝集素的最佳组合是AUC为0.917的WFL+PHA-E(表1)。
表1：参数(AUC值，具有左侧置信区间和右侧置信区间)、特异性、灵敏度和个体WFL标志物(第一行)以及其与其它标志物的组合的测定精确性。
标志物 AUC CI左侧 CI右侧 特异性 灵敏度 精确性
WFL 0.892 0.768 0.994 0.857 0.933 0.902
WFL+AAL 0.908 0.784 1 0.857 1 0.940
WFL+MALII 0.914 0.809 0.990 0.810 0.933 0.882
WFL+SNA 0.895 0.762 0.994 0.857 0.933 0.902
WFL+PHAL 0.898 0.771 0.997 0.857 0.933 0.902
WFL+Esel 0.905 0.784 0.990 0.857 0.933 0.902
WFL+Psel 0.892 0.759 0.994 0.857 0.933 0.902
WFL+Lsel 0.905 0.790 0.990 0.857 0.933 0.902
WFL+WGA 0.898 0.765 0.994 0.905 0.867 0.883
WFL+RCAI 0.892 0.765 0.990 0.857 0.933 0.902
WFL+GNL 0.914 0.787 1 0.905 0.933 0.921
WFL+PHAE 0.917 0.806 1 0.857 0.933 0.902
WFL+ZAG 0.898 0.775 0.987 0.857 0.933 0.902
WFL+PSA 0.921 0.816 0.994 0.857 0.933 0.902
WFL+Age 0.927 0.829 0.990 0.905 0.867 0.883

Claims (15)

1.用于诊断受试者是否处于癌症风险中或是否患有癌症的方法，包括
(1)将自所述受试者获得的样品与结合剂接触，所述样品包含生物标志物糖蛋白，所述结合剂能够结合所述生物标志物糖蛋白的聚糖结构，
其中所述生物标志物糖蛋白的存在或过表达指示所述癌症的风险和/或存在所述癌症，和
其中所述聚糖结构与在未处于所述癌症风险中或未患有所述癌症的受试者中表达的所述生物标志物糖蛋白的聚糖结构存在偏差，以及
(2)测定所述结合剂是否结合所述生物标志物糖蛋白的聚糖结构，
其中与对照样品相比，所述结合剂与所述生物标志物糖蛋白的所述聚糖结构的更低或更高的结合指示所述受试者处于癌症风险中或患有癌症，
其中所述生物标志物糖蛋白是ZAG和/或PAP。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是泌尿生殖器癌，优选为前列腺癌(PCa)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合剂是凝集素、抗-聚糖抗体、适体或硼酸或其衍生物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一种或多种进一步的生物标志物糖蛋白选自PSA、TIMP-1、fPSA、tPSA、骨桥蛋白和spondin-2。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述结合剂结合以下中的一种或多种：核心岩藻糖、触角岩藻糖、含有Fucα1-6GlcNAc-N-Asn的N-连接的低聚糖、Fucα1-6/3GlcNAc、α-L-Fuc、Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc、Fucα1-2Gal、Fucα1-6GlcNAc、Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc、支链N-连接的六糖、Manα1-3Man、α-D-Man、(GlcNAcβ1-4、Galβ1-4GlcNAc、GlcNAcα1-4Galβ1-4GlcNAc、(GlcNAcβ1-4、Neu5Ac(唾液酸)、Galβ1-3GalNAc-丝氨酸/苏氨酸、Galα1-3GalNAc、Galβ1-6Gal、Galβ1-4GlcNAc、Galβ1-3GalNAc、GalNAcα1-3GalNAc、GalNAcα1-3Gal、GalNAcα/β1-3/4Gal、α-GalNAc、GalNAcβ1-4Gal、GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal、GalNAcα1-2Gal、GalNAcα1-3GalNAc、GalNAcβ1-3/4Gal、GalNAc-丝氨酸/苏氨酸(Tn抗原)、Galβ1-3GalNAc-丝氨酸/苏氨酸(T抗原)、GalNAcβ1-4GlcNAc(LacdiNAc)、α-2,3Neu5Ac(α2-3连接的唾液酸)、α-2,6Neu5Ac(α2-6连接的唾液酸)、α-2,8Neu5Ac(α2-8连接的唾液酸)、唾液酸(α-2,3Neu5Ac、α-2,6Neu5Ac或α-2,8Neu5Ac)、Neu5Acα4/9-O-Ac-Neu5Ac、Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc/GlcNAc、Neu5Acα2-6Gal/GalNAc、N-连接的双触角、N-连接的三/四触角、支链β1-6GlcNAc、Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3/4GlcNAc、Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc、Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc、Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc、高甘露糖、唾液酸化路易斯a(唾液酸化Lea)抗原、唾液酸化路易斯x(唾液酸化Lex)抗原、路易斯x(Lex)抗原、唾液酸化Tn抗原、唾液酸化T抗原、路易斯Y(LeY)抗原、硫酸化核心1聚糖、Tn抗原、T抗原、核心2聚糖、路易斯a(Lea)抗原、(GlcNAcβ1-4)n、β-D-GlcNAc、GalNAc、Gal-GlcNAc、GlcNAc、Galα1-3Gal、Galβ1-3GalNAc、α-Gal、α-GalNAc、(GlcNAc)n或支链(LacNAc)n)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合剂结合以与半乳糖的3或6位α或β连接的N-乙酰半乳糖胺为末端的聚糖结构，或包含LacdiNAc表位(GalNAc1-4GlcNAc)的聚糖结构。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合剂以一定亲和力结合与WFA/WFL所结合的聚糖结构相同的聚糖结构，所述一定亲和力为WFL结合所述聚糖结构的亲和力的至少80％。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合剂是WFL/WFA、L-选择素、P-选择素、E-选择素、AAL、MAA、GNL、PSL或PHA-E。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合剂是WFL/WFA。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中采用基于凝集素的测定。
12.根据权利要求11所述的方法，其中采用酶联凝集素结合测定(ELLBA)。
13.用于实施前述权利要求中任一项所述的方法的试剂盒，其包含能够结合所述生物标志物蛋白的聚糖结构的结合剂。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述结合剂是凝集素。
15.根据权利要求13或14所述的试剂盒，其中所述凝集素是WFA或以一定亲和力结合与WFA/WFL所结合的聚糖结构相同的聚糖结构的结合剂，所述一定亲和力为WFL/WFA结合所述聚糖结构的亲和力的至少80％。
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