ES2939850T3 - Diagnósticos basados en lectina de cánceres - Google Patents
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Abstract
La presente descripción se refiere al diagnóstico no invasivo de cánceres, especialmente cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas y cáncer de próstata, sobre la base de patrones de glicosilación alterados de biomarcadores asociados con el cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Diagnósticos basados en lectina de cánceres
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere al diagnóstico no invasivo de cánceres, en particular, del cáncer de páncreas, basándose en patrones de glicosilación alterados de biomarcadores asociados con cáncer, especialmente CA19-9.
Antecedentes de la invención
La presente divulgación se refiere al cáncer de mama (BrCa), que es la segunda causa principal de muerte por cáncer en mujeres en todo el mundo. La incidencia es muy baja entre las mujeres menores de 30 años, pero aumenta después de los 45 años. La mucina-1 (MUC1 también conocida como CA15-3), ubicada en la superficie apical de las células epiteliales humanas, es una glicoproteína transmembrana grande con un peso molecular que oscila entre 500 y 1000 kDa con una parte extracelular que consiste en unidades de repetición de 20 aminoácidos altamente conservadas (repeticiones en tándem) dentro de la cual hay cinco sitios de glicosilación potenciales. El antígeno CA15-3 se secreta por las células tumorales y es un marcador serológico bien establecido para monitorizar el curso clínico de pacientes con cáncer de mama, aunque tiene poca sensibilidad, siendo positivo solo en el 17% de todas las pacientes con cáncer de mama (Fleisher M. et al. 2002). El ensayo de CA15-3 no es adecuado como prueba de diagnóstico debido a su baja sensibilidad en la enfermedad en estadio I y II, pero en los carcinomas de mama avanzados, los cambios en los niveles de antígeno proporcionan un indicador no invasivo útil de recaída temprana, presencia de enfermedad residual y remisión continua de mal pronóstico. Por tanto, existe la necesidad urgente de un biomarcador de BrCa mejorado, especialmente para la detección temprana de lesiones primarias, pero también para una monitorización más temprana y más precisa de la malignidad, el grado de progresión y los efectos terapéuticos sobre el cáncer.
También existe la necesidad de biomarcadores mejorados para cánceres tales como cánceres gastrointestinales, incluyendo el cáncer colorrectal y el cáncer de páncreas, y el cáncer de próstata. Poruk et al. (Curr Mol Med. 2013, 13(3): 340-351) da a conocer CA19-9 y CEA como biomarcadores para el cáncer de páncreas y proporciona una evaluación de la precisión de estos biomarcadores en la discriminación entre enfermedad pancreática maligna y benigna.
Breve descripción de la invención
La invención proporciona un método de determinación del estado patológico del cáncer de páncreas en un sujeto. El método comprende las etapas de: i) someter a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar el nivel de una glicoforma de CA19-9 que se une a DC-SIGN mediante la determinación de la unión de CA19-9 a DC-SIGN; ii) comparar el nivel detectado de dicha glicoforma de CA19-9 de unión a lectina en dicha muestra con el de una muestra de control o un valor umbral predeterminado; y iii) determinar el estado patológico del cáncer de páncreas en dicho sujeto basándose en dicha comparación. En algunas realizaciones, el método puede comprender además someter a ensayo dicha muestra también para determinar el antígeno de proteína CA19-9 convencional.
El nivel aumentado de una cualquiera de las glicoformas o los biomarcadores expuestos anteriormente en una muestra sometida a ensayo en comparación con el de una muestra de control o un valor umbral predeterminado puede ser indicativo de que dicho sujeto tiene o está en riesgo de tener cáncer de páncreas.
En algunas realizaciones, el método anterior de determinación del estado patológico del cáncer de páncreas en un sujeto puede llevarse a cabo para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar dicho cáncer. En algunas realizaciones, dicha monitorización es para monitorizar la aparición de dicho cáncer, para monitorizar cualquier cambio en el riesgo de tener o desarrollar dicho cáncer, para monitorizar la respuesta al tratamiento, para monitorizar la recidiva de dicho cáncer, o para monitorizar la recaída de dicho cáncer.
En aspectos adicionales, la presente divulgación proporciona un kit para su uso en el método expuesto anteriormente o en una cualquiera de sus realizaciones. El kit comprende un agente de unión a CA19-9 y DC-SIGN, en el que o bien dicho agente de unión a CA19-9 o bien dicho DC-SIGN comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, las lectinas pueden inmovilizarse en una nanopartícula detectable o puede marcarse con un marcador detectable.
En algunas realizaciones, el kit puede comprender además una o más lectinas seleccionadas del grupo que consiste en SBA, SNA, PNA, MAA II, AAL, UEA, PHA-E, RCA, WGA, WFA, PSA, WL, TJA-II, DSL, HPA, MGL, DC-SIGN, MMR, MBL, Siglec-2, Siglec-3, Siglec-5, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Galectina-3, Galectina-4, E-selectina, DSL y Gal4, proporcionadas opcionalmente como inmovilizadas en una nanopartícula.
En algunos aspectos adicionales, la invención proporciona el uso de DC-SIGN para determinar el estado patológico del cáncer de páncreas en un sujeto sometiendo a ensayo por una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar el nivel de la glicoforma de CA19-9 que se une a DC-SIGN. En cualquiera de estas realizaciones, la lectina en cuestión puede inmovilizarse en una nanopartícula o marcarse con un marcador detectable.
Otros objetivos, aspectos, realizaciones, detalles y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de las siguientes figuras, la descripción detallada, los ejemplos y las reivindicaciones dependientes.
Breve descripción de los dibujos
A continuación, se describirá la invención en mayor detalle por medio de realizaciones preferidas o variaciones dadas a conocer con referencia a los dibujos adjuntos, en los que
La figura 1 es una representación esquemática de diferentes formatos de ensayo. La figura 1A ilustra un inmunoensayo de CA15-3 convencional, en el que los AcM de captura e indicadores detectan el núcleo proteico y los epítopos de hidrato de carbono sialilado de CA15-3, respectivamente. La figura 1B ilustra un inmunoensayo de lectina combinado, en el que se captura CA15-3 con un AcM específico y se rastrea con lectinas, recubiertas sobre nanopartículas-Eu+3, que se unen a restos de glicano de CA15-3.
La figura 2 muestra la unión de nanopartículas-lectina (NP-lectina) a CA15-3 capturado en A) AcM Ma552 biotinilado, o B) AcM Ma695 biotinilado. El eje X muestra diferentes NP-lectina usadas, mientras que el eje Y muestra las razones de señal con respecto a fondo. Solo las lectinas MGL y WGA muestran unión significativa con CA15-3 asociado a BrCa.
La figura 3 muestra las tasas de recuperación en un ensayo de CA15-3MGL. Se compararon señales específicas de ensayos de CA15-3MGL paralelos con CA15-3 asociado con BrCa enriquecido o bien en una matriz simple (TSA-BSA) o bien en una matriz compleja, concretamente suero. Se observó una recuperación excelente tanto en el tampón con enriquecimiento como en el suero de hombre sano combinado con enriquecimiento (>95%) con una sensibilidad analítica extrapolada excelente (1 U/ml).
La figura 4 muestra una curva de respuesta a la dosis para el ensayo de CA15-3WGA en suero de hombre sano combinado y enriquecido. Se capturaron de cinco a 250 U/ml de CA15-3 procedentes de la línea celular de BrCa en AcM Ma552 biotinilado. Se usaron WGA-NP como indicador. El límite de detección extrapolado fue de 1 U/ml de CA15-3 asociado a BrCa.
La figura 5 demuestra la reactividad cruzada de AcM de captura. El ensayo de CA15-3MGL no muestra reactividad cruzada con CA125 de OvCa cuando se utiliza como captura el AcM anti-CA15-3, ya sea bioMa695 (A) o Ma552 (B) . El ensayo de CA125MGL muestra una unión 10 veces menor con CA15-3 asociado a BrCa en comparación con CA125 asociado a OvCa cuando se utilizó AcM anti-CA125 bio0v197 como agente de captura (C).
La figura 6 muestra un análisis de diagrama de cajas del inmunoensayo de CA15-3 convencional (A) y el ensayo de CA15-3MGL (B y C) entre pacientes con cáncer de mama (BC) y controles sanos (HC). Todas las muestras de BC longitudinales (n = 199) de 45 pacientes con BC diferentes se compararon con muestras de 31 HC. El ensayo 1 de CA15-3MGL se basa en el AcM Ma552 (B), mientras que el ensayo 2 de CA15-3MGL se basa en el AcM Ma696 (C) como los agentes de captura. Dentro de las figuras se facilita la diferencia de veces entre las medianas de las concentraciones medidas en los grupos de BC y HC. La línea no es indicativa de la diferencia de veces.
La figura 7 muestra un diagrama de cajas del inmunoensayo de CA15-3 convencional (A) y el ensayo de CA15-3mgl (B y C) entre pacientes con cáncer de mama (BC) y controles sanos (HC). Las primeras muestras (n=45) entre un total de 199 muestras longitudinales de 45 pacientes con BC diferentes se compararon con 31 HC. El ensayo 1 de CA15-3MGL se basa en el AcM Ma552 (B), mientras que el ensayo 2 de CA15-3MGL se basa en el AcM Ma696 como agente de captura. Se muestra la diferencia de veces entre las medianas de concentraciones medidas en los grupos de BC y HC.
La figura 8 muestra un diagrama de cajas del ensayo de CA15-3WGA entre controles sanos (HC, n=18) y las primeras muestras obtenidas de pacientes con cáncer de mama (BC, n=41). Hay una diferencia de 3,7 veces en la mediana entre HC y BC.
La figura 9 muestra las curvas ROC para los tres ensayos de CA15-3 (inmunoensayo de CA15-3 convencional “CA153IA1st45”, ensayo 1 de CA15-3MGL “CA153MGL11st45” y ensayo 2 de CA15-3MGL “CA153MGL21st45”) generados usando las primeras muestras de pacientes con BrCa (n=45) y controles sanos (n=31). El AUC es el más alto para el ensayo 1 de CA15-3MGL (0,897), seguido por el ensayo 2 de CA15-3MGL (0,848) y el más bajo para el inmunoensayo de CA15-3 convencional (0,805).
La figura 10 muestra las curvas ROC para el inmunoensayo de CA15-3 convencional “CA153IA1st41” y el ensayo de CA15-3WGA “CA153WGA1st41” generado usando muestras de plasma de casos de BrCa (n=41) y controles de
mujeres sanas (n=18). El AUC es mayor para el ensayo de CA15-3WGA (0,880) que para el inmunoensayo de CA15-3 convencional (0,833).
La figura 11 demuestra la correlación entre los ensayos de CA15-3MGL y CA15-3WGA Se observó una escasa correlación entre los ensayos en las 41 muestras de plasma de pacientes con BrCa, lo que indica que los ensayos reconocen diferentes epítopos del CA15-3 capturado.
La figura 12 demuestra la correlación entre el IA de CA15-3 convencional y el ensayo de CA15-3MGL. Se observó una escasa correlación entre los ensayos en (A) todas las muestras (n=199) longitudinales de pacientes con cáncer de mama así como en (B) las primeras muestras (n=45) observadas lo que indica que los ensayos reconocen diferentes epítopos del CA15-3 capturado.
La figura 13 demuestra la correlación entre el IA de CA15-3 convencional y el ensayo de CA15-3WGA. Se observó escasa correlación entre los ensayos en 41 muestras de plasma de pacientes con BrCa, lo que indica que los ensayos reconocen diferentes epítopos del CA15-3 capturado.
La figura 14 muestra curvas ROC y AUC de tres ensayos del ejemplo 4, concretamente los ensayos de CA15-3 convencional (AUC=0,833), CA15-3MGL (AUC=0,865) y CA15-5WGA (0,939) usando muestras de plasma de casos de cáncer de mama metastásico (n=54) y controles de mujeres sanas (n=23).
La figura 15 muestra curvas ROC y AUC de tres ensayos del ejemplo 4, concretamente el ensayo de CA15-3 convencional (AUC=0,826), el ensayo de CA15-3WGA marcado con quelatos de Eu (AUC=0,890), y el ensayo de CA15-3WGA - nanopartícula de Eu (0,926).
La figura 16 muestra una comparación del inmunoensayo de CEA convencional (figura 16A) y los ensayos de glicovariante de CEA DC-Sign (figura 16B) y CEAMGL (figura 16C) de pacientes con CRC (tanto no tratados como con tratamiento en el momento de la toma de muestras) y controles sanos que tenían CEA en plasma <5 ng/ml.
La figura 17 muestra los niveles de CEA medidos con los ensayos de CEA convencional y de lectina en pacientes con colitis y CRC (figura 17A). En la figura 17B, los pacientes con CRC se agrupan en dos categorías: los pacientes que estaban vivos al final del seguimiento y los pacientes que fallecieron durante el seguimiento. Prueba U de Mann-Whitney p < 0,01:**, p < 0,05: *, y p > 0,05: Las barras horizontales cortas presentan las medianas. La línea horizontal larga presenta el punto de corte de 5 ng/ml para el inmunoensayo de CEA comercial, y las líneas de puntos los niveles de punto de corte prospectivos para diferentes ensayos de CEA glicovariante.
La figura 18 muestra curvas ROC para CEA en plasma de los ensayos de lectina MGL, MBL y DC-SIGN en comparación con el inmunoensayo de CEA convencional. Se realizó ROC para CEA en plasma con EDTA de pacientes con cáncer colorrectal (n = 23) y pacientes con colitis (n = 14). La línea discontinua presenta el inmunoensayo de CEA convencional y la línea continua los ensayos CEA de lectina.
La figura 19A muestra las concentraciones plasmáticas de CA19-9 (U/ml) medidas con el inmunoensayo de CA19-9 comercial. Solo tres de las muestras de cáncer de páncreas tenían concentraciones de CA19-9 por encima del punto de corte de 37 U/ml. No se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa en la mediana de las concentraciones de CA19-9 entre pacientes con cáncer de páncreas (n=10) y controles benignos (n=27). Las barras horizontales cortas presentan los valores de las medianas de CA19-9.
La figura 19B muestra las concentraciones plasmáticas de CA19-9 glicovariante (es decir, CA19-9DC-SIGN) (U/ml) medidas con el ensayo de nanopartículas-lectina-C19-9 Las concentraciones plasmáticas de CA19-9 glicovariante están elevadas en el cáncer de páncreas y en algunas de las enfermedades gastrointestinales benignas. Ocho de los diez pacientes con cáncer de páncreas tenían concentraciones plasmáticas de CA19-9 glicovariante por encima del punto de corte de 10 U/ml. Hubo una diferencia estadísticamente significativa en la mediana de las concentraciones de CA19-9 glicovariante entre pacientes con cáncer de páncreas (n=10) y controles sanos, así como controles benignos (n=27). Las barras horizontales cortas presentan los valores de las medianas de CA19-9.
La figura 20 muestra las curvas de respuesta a la dosis (señales de fluorescencia media medidas por triplicado) de diferentes formas de PSA con ensayo de glicovariante de PSAMGL. Curvas de calibración de PSA de LNCaP (O) y PSA en plasma seminal de donantes sanos (□)
La figura 21 muestra la señal de fluorescencia de nanopartículas acopladas a MGL que miden la glicovariante de PSA en lisados procedentes de tejido de próstata canceroso y benigno desde el punto de vista histológico. Hubo un aumento estadísticamente significativo en la glicovariante de PSAMGL en el tejido canceroso en comparación con el tejido benigno.
La figura 22 muestra las señales de fluorescencia corregidas por PSA totales del ensayo de glicovariante de PSAMGL a partir de PSA de orina procedente de pacientes con cáncer de próstata (n=74), pacientes con BPH
(n=69) y hombres jóvenes sanos (n=11). Las señales de fluorescencia corregidas por tPSA se calcularon como la fluorescencia medida a partir de las nanopartículas de Eu, dividido entre la concentración de tPSA en la muestra. Comparación de la señal de fluorescencia corregida por tPSA de nanopartículas acopladas a MGL del PSA en orina entre hombres jóvenes sanos (n= 11), hombres con biopsia negativa para PCA o cáncer de próstata con puntuación de Gleason 6 (n=69), y pacientes con cáncer de próstata con puntuación de Gleason 7-9 (n=74) y puntuación de Gleason 9 (n=11). En las figuras se marcan los percentiles de 25/10/50/75/90.
La figura 23 muestra las señales de fluorescencia, como señales de fluorescencia medias de tres repeticiones, en el ensayo de glicovariante de PSAWGA (figura 23A), PSAGAL4 (figura 23B) y PSADectin 2 (figura 23C). Comparación de la señal de fluorescencia de nanopartículas acopladas a WGA del PSA en orina entre hombres jóvenes (n=6), hombres con biopsia negativa para PCa o puntuación de Gleason 6 para PCa (n=14) y hombres con PCa clínicamente significativo (n=17) (figura 22A). Comparación de la señal de fluorescencia de nanopartículas acopladas a GAl4 del PSA en orina entre hombres jóvenes (n=9), hombres con biopsia negativa para PCa o puntuación de Gleason 6 para PCa (n=19) y hombres con PCa clínicamente significativo (n=26) (figura 23B). Comparación de la señal de fluorescencia de nanopartículas acopladas a GAl4 del PSA en orina entre hombres jóvenes (n=9), hombres con biopsia negativa para PCa o puntuación de Gleason 6 para PCa (n=9) y hombres con PCa clínicamente significativo (n=26) (figura 23C).
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación se basa, al menos en parte, en estudios que tienen como objetivo identificar glicoformas de biomarcadores de cáncer conocidos con sensibilidad mejorada con respecto a otras especies de los mismos biomarcadores. Según este objetivo, la presente divulgación proporciona medios y métodos de determinación del el estado de cáncer en un sujeto que se sospecha que padece o está en riesgo de padecer cáncer, especialmente para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar dicho cáncer. Según realizaciones específicas, dicho cáncer es cáncer de páncreas. También se da a conocer que dicho cáncer es cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, tal como cáncer colorrectal o cáncer de próstata.
Tal como se usa en el presente documento, el término “o” tiene el significado tanto de “y” como de “o” (es decir, “y/o”). Además, el significado de un sustantivo en singular incluye el de un sustantivo en plural y, por tanto, un término en singular, a menos que se especifique lo contrario, también puede tener el significado de su forma en plural. Dicho de otro modo, el término “un” o “una” puede significar uno o más.
Tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a un animal, preferiblemente a un mamífero, más preferiblemente a un ser humano, y en algunas variaciones dadas a conocer lo más preferiblemente a una mujer como en las variaciones dadas a conocer relacionadas con el cáncer de mama, mientras que en algunas otras variaciones dadas a conocer lo más preferiblemente a un hombre como en las variaciones dadas a conocer para el cáncer de próstata. Dependiendo de una variación dada a conocer en cuestión, dicho sujeto puede padecer cáncer con o sin diagnóstico, puede sospecharse que padece cáncer, que está en riesgo de padecer cáncer, o puede haberse tratado ya por cáncer. En el presente documento, los términos “sujeto humano”, “paciente” e “individuo” son intercambiables.
Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra” se refiere a una muestra de tejido, tal como una muestra de biopsia tomada de tejido de mama, y a una muestra de un líquido corporal, tal como líquido ascítico, orina, sangre, plasma, suero y líquido de la cavidad peritoneal, obtenida de un sujeto. En algunas realizaciones o variaciones dadas a conocer, dicha muestra de tejido puede ser una muestra de tejido fijada con formalina o incluida en parafina. Generalmente, la obtención de la muestra que va a analizarse de un sujeto no forma parte del presente método de determinación del estado patológico del cáncer de un sujeto. Una muestra de sangre, suero o plasma es el tipo de muestra más preferido para usar en el presente método y todas sus realizaciones o variaciones dadas a conocer.
El término “muestra” también incluye muestras que se han manipulado o tratado de cualquier modo adecuado después de su obtención incluyendo, pero sin limitarse a, centrifugación, filtración, precipitación, diálisis, cromatografía, tratamiento con reactivos, lavado o enriquecimiento de un determinado componente de la muestra tal como una población celular.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “biomarcador” y “marcador” son intercambiables y se refieren a una molécula que está presente de manera diferente en una muestra tomada de un sujeto que padece cáncer en comparación con una muestra comparable tomada de un sujeto aparentemente sano. Por consiguiente, el biomarcador puede denominarse biomarcador de cáncer. Los biomarcadores de cáncer a modo de ejemplo incluyen CA15-3, CA125, CEA, CA19-9 y PSA, y especialmente determinadas glicoformas de unión a lectina de los mismos. Tal como se usan en el presente documento, los términos “CA15-3”, “CA125”, “CEA”, “CA19-9” y “PSA” se refieren a los antígenos de proteína convencionales CA15-3, CA125, CEA, CA19-9 y PSA, respectivamente, que son detectables mediante inmunoensayos convencionales. Tal como se usan en el presente documento, los términos CA15-3lectina, CA125lectina, c EAlectina, CA19-9lectina y p s a lectina se refieren a las glicoformas de unión a lectina de estos biomarcadores. A modo de ejemplo, el término “CA15-3WGA” se refiere a
glicoformas de CA15-3 que se unen a WGA.
En realizaciones o variaciones dadas a conocer que se refieren a la evaluación del nivel de más de un biomarcador, pueden usarse para cada evaluación muestras iguales o diferentes obtenidas de un sujeto cuyo estado patológico del cáncer va a determinarse. Dichas muestras diferentes pueden ser del mismo o diferente tipo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “nivel” es intercambiable con los términos “cantidad” y “concentración”, a menos que se indique lo contrario.
Para determinar si un nivel detectado de un biomarcador es indicativo de la presencia o del riesgo de la presencia de una enfermedad asociada con dicho biomarcador, debe determinarse su nivel en un control relevante. Una vez que se conocen los niveles de control, pueden compararse los niveles de marcador determinados con ellos y puede evaluarse la importancia de la diferencia usando métodos estadísticos convencionales. En algunas realizaciones o variaciones dadas a conocer, una diferencia estadísticamente significativa entre el nivel de biomarcador determinado y el nivel de control es indicativa de la enfermedad en cuestión. En algunas realizaciones adicionales o variaciones dadas a conocer, antes de compararlos con el control, los niveles de biomarcadores se normalizan usando métodos convencionales.
La comparación del nivel sometido a ensayo de un biomarcador en una muestra que ha de analizarse con el de un control relevante o un valor de umbral predeterminado puede realizarse en algunas realizaciones o variaciones dadas a conocer por un procesador de un dispositivo informático.
Independientemente de si se usa o no el procesador del dispositivo informático para dicha comparación, el nivel del nivel sometido a ensayo de un biomarcador se determina, al menos en algunas realizaciones o variaciones dadas a conocer, como “aumentado” o “más alto” si el nivel del biomarcador en la muestra es, por ejemplo, de al menos aproximadamente 1,5 veces, 1,75 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces o 30 veces el nivel umbral predeterminado o el nivel del biomarcador en una muestra de control. En algunas realizaciones o variaciones dadas a conocer, la diferencia entre el nivel del biomarcador en la muestra que va a analizarse y el nivel umbral predeterminado o el nivel del biomarcador en una muestra de control tiene que ser estadísticamente significativo con el fin de proporcionar un diagnóstico adecuado, pronóstico o resultado predictivo.
La concentración de un biomarcador en una muestra obtenida de un sujeto cuyo estado patológico del cáncer va a determinarse o que va a examinarse, diagnosticarse, pronosticarse o monitorizarse para cáncer se considera “no aumentada” o “normal” si la concentración detectada del mismo es menor, esencialmente igual o no está esencialmente alterada en comparación con la de una muestra de control relevante o un valor umbral predeterminado.
Tal como se usa en el presente documento, el término “control” puede referirse a una muestra de control obtenida de un individuo aparentemente sano o de un grupo de individuos aparentemente sanos, o puede referirse a un valor umbral predeterminado, es decir, un valor de punto de corte, que es indicativo de la presencia o ausencia de la enfermedad en cuestión. Los métodos estadísticos para determinar los valores umbral apropiados resultarán fácilmente evidentes para los expertos habituales en la técnica. Los valores umbral pueden haberse determinado, si es necesario, a partir de muestras de sujetos de la misma edad, características demográficas y/o estado patológico, etc. El valor umbral puede originarse a partir de un solo individuo no afectado por la enfermedad en cuestión o puede ser un valor combinado de más de uno de tales individuos.
En algunas realizaciones o variaciones dadas a conocer, el término “muestra de control” se refiere a una muestra obtenida del mismo sujeto cuyo estado patológico del cáncer va a determinarse, pero obtenida en un punto de tiempo diferente del punto de tiempo de la determinación del estado patológico. Los ejemplos no limitativos de tales puntos de tiempo diferentes incluyen uno o más puntos de tiempo antes del diagnóstico de la enfermedad, uno o más puntos de tiempo después del diagnóstico de la enfermedad, uno o más puntos de tiempo antes del tratamiento de la enfermedad, uno o más puntos de tiempo durante el tratamiento de la enfermedad, y uno o más puntos de tiempo después del tratamiento de la enfermedad. Normalmente, tales muestras de control obtenidas del mismo sujeto se usan cuando el propósito de la determinación del estado patológico del cáncer de mama es monitorizar dicha enfermedad, especialmente para monitorizar la aparición de la enfermedad, o el riesgo de desarrollo de la enfermedad, la respuesta al tratamiento, la recidiva de la enfermedad o la recaída de la enfermedad.
Tal como se usa en el presente documento, el término “aparentemente sano” se refiere a un individuo o grupo de individuos que no muestran signos de cáncer y, por tanto, se cree que no están afectados por el cáncer o que se prevé que no desarrollarán cáncer.
Tal como se usa en el presente documento, el término “indicativo de una enfermedad”, cuando se aplica a un biomarcador, se refiere a un nivel que, usando métodos estadísticos de rutina que establecen niveles de confianza en un mínimo del 95%, es diagnóstico de dicha enfermedad o un estadio de dicha enfermedad, de manera que el
nivel detectado se encuentra significativamente más a menudo en sujetos con dicha enfermedad o un estadio de dicha enfermedad que en sujetos sin dicha enfermedad u otro estadio de dicha enfermedad. Preferiblemente, el nivel que es indicativo de una enfermedad se encuentra en al menos el 80% de los sujetos que tienen la enfermedad y se encuentra en menos del 10% de los sujetos que no tienen la enfermedad. Más preferiblemente, el nivel que es indicativo de dicha enfermedad se encuentra en al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o más en sujetos que tienen la enfermedad y se encuentra en menos del 10%, menos del 8%, menos del 5%, menos del 2,5% o menos del 1% de los sujetos que no tienen la enfermedad.
Los inmunoensayos de CA15-3 existentes que se usan de manera rutinaria en diagnósticos se basan en la determinación de los niveles de antígeno CA15-3 en suero o plasma mediante dos anticuerpos monoclonales diferentes que reconocen diferentes epítopos de CA15-3. Se da a conocer que uno de los anticuerpos puede ser específico para un epítopo de proteína mientras que el otro puede ser específico para un epítopo de hidrato de carbono, tal como un epítopo de hidrato de carbono sialilado. Tales inmunoensayos convencionales, denominados en el presente documento “someter a ensayo una muestra para la concentración del antígeno CA15-3”, están disponibles comercialmente de varios proveedores diferentes. Por consiguiente, el término “CA15-3” se refiere a la especie de CA15-3 reconocible por los inmunoensayos convencionales. Se da a conocer que pueden emplearse niveles de punto de corte tales como 20 U/ml, 22 U/ml, 25 U/ml, 30 U/ml o 35 U/ml.
En los experimentos que dieron lugar a algunas variaciones de la presente divulgación, dos lectinas, concretamente la lectina de tipo galactosa de macrófagos (MGL) y la aglutinina de germen de trigo (WGA), entre un panel de 28 lectinas vegetales o humanas diferentes sometidas a prueba, mostraron una reactividad notablemente alta hacia CA15-3 derivado de una línea celular de cáncer de mama. También la lectina de Datura stramonium (DSL) y la galectina-4 (Gal4) mostraron algo de reactividad hacia el CA15-3 canceroso.
Por motivos de simplicidad, “CA15-3lectina” se usa como un término general para referirse a una o más glicoformas de unión a lectina de CA15-3, incluyendo, por ejemplo, CA15-3MGL, CA15-3WGA, CA15-3DSL o CA15-3GAL4, que se refieren a especies de CA15-3 que se unen a MGL, WGA, DSL y Gal4, respectivamente.
La aplicabilidad clínica de los resultados obtenidos con CA15-3 aislado derivado de cáncer de mama se verificó en una pequeña cohorte de muestras obtenidas de pacientes con cáncer de mama metastásico. Al someter a ensayo las muestras para CA15-3MGL o CA15-3WGA, los sujetos con cáncer de mama pudieron distinguirse de los controles sanos con mayor sensibilidad que mediante el uso de un inmunoensayo de CA15-3 convencional. Además, la mediana de diferencia de veces entre los controles sanos y las pacientes con cáncer de mama fue solo 2 veces con el inmunoensayo de CA15-3 existente, mientras que fue > 200 veces con el ensayo de CA15-3MGL. En una cohorte diferente, la mediana de diferencia de veces entre los controles sanos y las pacientes con cáncer de mama fue solo 2,8 veces con el inmunoensayo de CA15-3 existente, mientras que fue >400 veces con el ensayo de CA15-3MGL. Se da a conocer que CA15-3WGA es la lectina preferida que ha de usarse.
Un modo de comparar el rendimiento de diferentes biomarcadores es trazar curvas ROC y comparar sus valores de AUC, tasas de falsos positivos, tasas de falsos negativos y tasas de éxito. Tal como se demuestra en la parte experimental, la tasa de falsos negativos del ensayo de CA15-3MGL fue menor que la del ensayo convencional. Además, se obtuvieron valores de AUC más altos tanto en los ensayos de CA15-3MGL como de CA15-3WGA que en los ensayos de CA15-3 convencionales.
Las curvas de características operativas del receptor (ROC) pueden utilizarse para demostrar el equilibrio entre la sensibilidad y la especificidad de un marcador, tal como conocen bien los expertos. La sensibilidad es una medida de la capacidad del marcador para detectar la enfermedad y la especificidad es una medida de la capacidad del marcador para detectar la ausencia de la enfermedad. El eje X horizontal de la curva ROC representa la especificidad 1, que aumenta con la tasa de falsos positivos. El eje Y vertical de la curva representa la sensibilidad, que aumenta con la tasa de verdaderos positivos. Por tanto, para un punto de corte particular seleccionado, pueden determinarse los valores de especificidad y sensibilidad. Dicho de otro modo, los puntos de datos en las curvas ROC representan la proporción de clasificaciones de verdaderos positivos y falsos positivos en diversos límites de decisión. Los resultados óptimos se obtienen cuando la proporción de verdaderos positivos se aproxima a 1,0 y la proporción de falsos positivos se aproxima a 0,0. Sin embargo, a medida que se cambia el punto de corte para aumentar la especificidad, habitualmente se reduce la sensibilidad y viceversa.
Tal como se usa en el presente documento, el término “falso positivo” se refiere a un resultado de prueba que clasifica incorrectamente a un sujeto no afectado como sujeto afectado. Asimismo, “falso negativo” se refiere a un resultado de prueba, que clasifica incorrectamente a un sujeto afectado como sujeto no afectado.
Tal como se usa en el presente documento, el término “verdadero positivo” se refiere a un resultado de prueba, que clasifica correctamente a un sujeto que tiene una enfermedad como sujeto afectado. Asimismo, “verdadero negativo” se refiere a un resultado de prueba, que clasifica correctamente a un sujeto no afectado como no afectado.
Según lo anterior, el término “tasa de éxito” se refiere a la proporción expresada en porcentaje de individuos
afectados con un resultado positivo, mientras que el término “tasa de falsos positivos” se refiere a la proporción expresada en porcentaje de individuos no afectados con un resultado positivo.
El área bajo la curva ROC, a menudo denominada AUC, es una medida de la utilidad de un marcador en la identificación correcta de sujetos con enfermedad. Por tanto, el AUC puede usarse para determinar la efectividad de la prueba. Un área de 1 representa una prueba perfecta; un área de 0,5 representa una prueba sin valor. Una guía aproximada tradicional para clasificar la precisión de una prueba diagnóstica o predictiva es la siguiente: los valores de AUC de 0,9 a 1 representan una prueba con excelente poder de diagnóstico o pronóstico, los valores de AUC de 0,80 a 0,90 representan una prueba con buen poder de diagnóstico o pronóstico, los valores de AUC 0,70 a 0,80 representan una prueba con poder de diagnóstico o pronóstico aceptable, los valores de AUC de 0,60 a 0,70 representan una prueba con poder de diagnóstico o pronóstico deficiente, y los valores de AUC de 0,50 a 0,60 representan una prueba con poder de diagnóstico o pronóstico fallido.
Los ensayos de CA15-3MGL y CA15-3WGA no se correlacionaron bien entre sí o con el inmunoensayo convencional. Por tanto, se prevé que, en algunas variaciones, sería ventajoso usar estos ensayos en combinación para complementar su rendimiento.
Según lo anterior, se da a conocer un método de determinación del estado de cáncer de mama en un sujeto sometiendo a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para CA15-3MGL y/o CA15-3WGA. El nivel aumentado de dicho CA15-3MGL y/o CA15-3WGA en dicha muestra en comparación con el de una muestra de control o un valor umbral predeterminado es indicativo de que dicho sujeto tiene o está en riesgo de tener cáncer de mama. Por otro lado, el nivel no aumentado o normal de CA15-3MGL y CA15-3WGA en dicha muestra en comparación con la de una muestra de control o un valor umbral predeterminado es indicativo de que dicho sujeto está aparentemente sano con respecto al cáncer de mama o no está en riesgo de tener o desarrollar cáncer de mama. Se prevé que puesto que los resultados de los ensayos de CA15-3MGL y CA15-3WGA no se correlacionaron bien en los análisis clínicos realizados, la sensibilidad del método puede mejorarse realizando ensayos tanto para CA15-3MGL como para CA15-3WGA
Se da a conocer que en algunas variaciones del método anterior, una muestra obtenida de un sujeto cuyo estado patológico del cáncer de mama va a determinarse, puede someterse a ensayo adicionalmente para determinar uno o ambos de CA15-3DSL y CA15-3GAL4 con el fin de mejorar el rendimiento de la determinación del estado patológico. Por consiguiente, dicha muestra puede someterse a ensayo para determinar CA15-3MGL y CA15-3DSL; CA15-3MGL y CA15-3GAL4; CA15-3WGA y CA15-3DSL; CA15-3WGA y CA15-3GAL4; CA15-3MGL, CA15-3DSL y CA15-3GAL4; CA15-3WGA, CA15-3DSL, y CA15-3GAL4; o CA15-3MGL, CA15-3WGA, CA15-3DSL y CA15-3GAL4
Se da a conocer que el valor umbral predeterminado para CA15-3LECTINA puede ser de aproximadamente 2 U/ml a aproximadamente 3 U/ml, por ejemplo aproximadamente 2,5 U/ml. Sin embargo, dependiendo de la sensibilidad y especificidad deseadas, pueden usarse otros valores umbral predeterminados para CA15-3lectina Los ejemplos no limitativos de tales otros valores umbral incluyen cualquier valor que se encuentre dentro de los intervalos de desde aproximadamente 2 U/ml hasta aproximadamente 7 U/ml, desde aproximadamente 2 U/ml hasta aproximadamente 6 U/ml, desde aproximadamente 2 U/ml hasta aproximadamente 5 U/ml, y desde aproximadamente 2 U/ml hasta aproximadamente 4 U/ml. Para fines de examen y otros usos en los que es necesario maximizar la sensibilidad clínica del ensayo, también pueden usarse valores umbral de tan solo de aproximadamente 0,5 a 2 U/ml, por ejemplo, aproximadamente 1 U/ml o 1,5 U/ml. Por otro lado, en el diagnóstico u otras variaciones dadas a conocer en las que se necesita maximizar la especificidad clínica del ensayo, también pueden usarse valores umbral de hasta aproximadamente de 5 a 20 U/ml, por ejemplo, aproximadamente 10 U/ml o 15 U/ml. Sin embargo, estos intervalos también pueden variar dependiendo de las especificaciones de la técnica de detección.
Debido a la mala correlación entre los ensayos de CA15-3MGL o CA15-3WGA y el inmunoensayo de CA15-3 convencional, se prevé que la sensibilidad del método también puede mejorarse incluyendo CA15-3 como un biomarcador adicional en el método. Por consiguiente, se da a conocer que el método de determinación del estado patológico del cáncer de mama de un sujeto puede comprender someter a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar una o más especies de CA15-3LECTINA expuestas anteriormente, y someter a ensayo la misma muestra o una muestra diferente obtenida de dicho sujeto para determinar la concentración de CA15-3 de manera convencional. En tal método, el nivel aumentado de al menos una de las especies de CA15-3LECTINA o el nivel aumentado de CA15-3 sería indicativo de que dicho sujeto tiene o está en riesgo de tener cáncer de mama. Por otro lado, el nivel no aumentado o normal de todas las especies de CA15-3LECTINA sometidas a ensayo en combinación con un nivel no aumentado o normal de CA15-3 sería indicativo de que dicho sujeto no tiene o no está en riesgo de tener cáncer de mama, es decir, aparentemente está sano. Dependiendo del rendimiento deseado, por ejemplo, en relación con la sensibilidad y la especificidad, el método puede comprender someter a ensayo muestras iguales o diferentes para determinar cualquiera de
CA15-3MGL y CA15-3;
CA15-3WGA y CA15-3;
CA15-3MGL, CA15-3WGA y CA15-3;
CA15-3MGL, CA15-3DSL y CA15-3;
CA15-3MGL, CA15-3GAL4 y CA15-3;
CA15-3wga, CA15-3dsl y CA15-3;
CA15-3WGA, CA15-3GAL4 y CA15-3;
CA15-3MGL, CA15-3DSL, CA15-3GAL4 y CA15-3;
CA15-3wga, CA15-3dsl, CA15-3GAL4 y CA15-3; o
CA15-3MGL, CA15-3WGA, CA15-3DSL, CA15-3GAL4,y CA15-3.
El antígeno de cáncer humano 125 (CA125), también conocido como mucina 16 o MUC16, es una glicoproteína transmembrana compleja y el biomarcador usado más ampliamente para el cáncer de ovario epitelial. Sin embargo, su expresión también puede estar elevada en otros tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas y cáncer de hígado. Por consiguiente, se da a conocer que puede usarse una o más glicoformas de unión a lectina de CA125, denominadas colectivamente en el presente documento CA125lectina, en algunas variaciones de los presentes métodos como marcadores adicionales para determinar el estado patológico del cáncer de mama de un sujeto. Dependiendo del rendimiento deseado del método para determinar el estado patológico del cáncer de mama de un sujeto, tal como la sensibilidad o la especificidad, puede someterse a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar cualquiera de
CA15-3MGL y CA125LECTINA;
CA15-3WGA y CA125LECTINA;
CA15-3MGL, CA15-3WGA y CA125LECTINA;
CA15-3MGL, CA15-3DSL y CA125LECTINA;
CA15-3MGL, CA15-3GAL4 y CA125LECTINA;
CA15-3wga, CA15-3DSL y CA125LECTINA;
CA15-3wga, CA15-3GAL4 y CA125LECTINA;
CA15-3MGL, CA15-3DSL, CA15-3GAL4 y CA125LECTINA;
CA15-3WGA, CA15-3DSL, CA15-3GAL4 y CA125LECTINA; o
CA15-3MGL, CA15-3WGA, CA15-3DSL, CA15-3GAL4 y CA125LECTINA.
Preferiblemente, CA125LECTINA es CA125MGL, pero también puede ser una cualquiera o más especies de unión a lectina de CA125. Dicho de otro modo, dicha “LECTINA” en el término general CA125LECTINA puede referirse a una cualquiera o más lectinas de unión a CA125, en la que dicha lectina se selecciona del grupo que consiste en SBA, SNA, PNA, MAA II, AAL, UEA, PHA-E, RCA, WGA, WFA, PSA, WL, TJA -II, DSL, HPA, MGL, DC-SIGN, MMR, MBL, Siglec-2, Siglec-3, Siglec-5, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Galectina-3, Galectina-4 y E-selectina. Someter a ensayo para determinar una cualquiera de las combinaciones de CA15-3LECTINA y CA125LECTINA dadas a conocer anteriormente puede comprender además someter a ensayo para determinar CA15-3 y/o CA125 convencionales. En algunas variaciones no limitativas, puede emplearse un valor de punto de corte de 35 U/ml para CA125. El antígeno carcinoembrionario (CEA) es un biomarcador glicoproteico ampliamente usado, especialmente para cánceres del intestino grueso (cáncer de colon y recto). Sin embargo, su expresión también está elevada en muchos otros cánceres, incluyendo los cánceres de mama, tracto gastrointestinal, hígado, pulmón, ovario, páncreas y próstata. Por consiguiente, se da a conocer una o más glicoformas de unión a lectina de CEA, denominadas colectivamente en el presente documento CEALECTINA, que pueden usarse en algunas variaciones de los presentes métodos como marcadores adicionales para determinar el estado patológico del cáncer de mama de un sujeto. Dependiendo del rendimiento deseado del método para determinar el estado patológico del cáncer de mama de un sujeto, tal como la sensibilidad o la especificidad, puede someterse a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar cualquiera de
CA15-3MGL y CEALECTINA;
CA15-3WGA y CEALECTINA;
CA15-3MGL, CA15-3WGA y CEALECTINA;
CA15-3MGL, CA15-3DSL y CEAlectina;
CA15-3MGL, CA15-3GAL4 y CEALECTINA;
CA15-3WGA, CA15-3DSL y CEALECTINA;
CA15-3wga, CA15-3GAL4 y CEALECTINA;
CA15-3MGL, CA15-3DSL, CA15-3GAL4 y CEAlectina;
CA15-3WGA, CA15-3DSL, CA15-3GAL4 y CEALECTINA; o
CA15-3MGL, CA15-3WGA, CA15-3DSL, CA15-3GAL4 y CEALECTINA.
Preferiblemente, CEALECTINA es CEAMBL, CEADC-SIGN y/o CEAMGL, pero también puede ser cualquier otra o más especies de unión a lectina de CEA. Dicho de otro modo, dicha “LECTINA” en el término general CEALECTINA puede referirse a una cualquiera o más lectinas de unión a CEA, en la que dicha lectina se selecciona del grupo que consiste en SBA, SNA, PNA, MAA II, AAL, UEA, PHA-E, RCA, WGA, WFA, PSA, WL, TJA -II, DSL, HPA, MGL, DC-SIGN, MMR, MBL, Siglec-2, Siglec-3, Siglec-5, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Galectina-3, Galectina-4 y E-selectina. Someter a ensayo para determinar una cualquiera de las combinaciones de CA15-3LECTINA y CEALECTINA dadas a conocer anteriormente puede comprender además someter a ensayo para determinar CA15-3 y/o CEA convencionales. En algunas variaciones no limitativas, puede emplearse cualquier valor de punto de corte que oscile entre aproximadamente 2,5 |jg/l y aproximadamente 10 jig/l, tal como 2,7 |jg/l o 5 |jg/l, para CEA.
Además, en algunas variaciones, el presente método de determinación del estado patológico del cáncer de mama de un sujeto puede comprender someter a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar cualquiera de
CA15-3MGL, CA125LECTINA y CEALECTINA;
CA15-3WGA, CA125LECTINA y CEALECTINA;
CA15-3MGL, CA15-3WGA, CA125lectina y CEALECTINA;
CA15-3MGL, CA15-3DSL, CA125LECTINA y CEALECTINA;
CA15-3MGL, CA15-3GAL4, CA125LECTINA y CEALECTINA;
CA15-3WGA, CA15-3DSL, CA125LECTINA y CEALECTINA;
CA15-3wga, CA15-3GAL4, CA125lectina y CEALECTINA;
CA15-3MGL, CA15-3DSL, CA15-3GAL4, CA125LECTINA y CEALECTINA;
CA15-3WGA CA15-3DSL, CA15-3GAL4, CA125LECTINA y CEALECTINA; o
CA15-3MGL, CA15-3WGA, CA15-3DSL, CA15-3GAL4, CA125LECTINA y CEALECTINA.
Preferiblemente, CA125LECTINA es CA125MGL, y CEALECTINA es CEAMBL, CEADC-SIGN y/o CEAMGL, pero dicha “LECTINA” en los términos generales CA125LECTINA y CEALECTINA pueden referirse, independientemente entre sí, a una cualquiera o más lectinas de unión a CA125- o CEA, en la que dicha lectina se selecciona del grupo que consiste en SBA, SNA, PNA, MAA II, AAL, UEA, PHA-E, RCA, WGA, WFA, PSA, WL, TJA-II, DSL, HPA, MGL, DC-SIGN, MMR, MBL, Siglec-2, Siglec-3, Siglec-5, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Galectina-3, Galectina-4 y E-selectina, respectivamente. Someter a ensayo una cualquiera de las combinaciones de CA15-3LECTINA, CA125LECTINA y CEALECTINA dadas a conocer anteriormente puede comprender además someter a ensayo para determinar CA15-3, CA125 y/o CEA convencionales.
Se da a conocer que el presente método de determinación del estado patológico del cáncer de mama de un sujeto puede comprender someter a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar
CEAMBL
c e a dc-s'gn
CEAMGL,
CEAMBL y CEADC-SIGN,
CEAMBL y CEAMGL,
CEADC-SIGN y CEAMGL,
CEAMBL, CEADC-SIGN y CEAMGL,
CEAMBL y CA15-3MGL,
CEADC-SIGN y CA15-3MGL,
CEAMGL y CA15-3MGL,
CEAMBL y CA15-3WGA,
CEADC-SIGN y CA15-3WGA,
CEAMGL y CA15-3WGA,
CEAMBL, CA15-3MGL y CA15-3WGA,
CEAMBL, CA15-3MGL y CA15-3DSL,
CEAMBL, CA15-3MGL y CA15-3GAL4,
CEAMBL, CA15-3WGA y CA15-3DSL,
CEAMBL, CA15-3WGA y CA15-3GAL4,
CEAMBL, CA15-3MGL, CA15-3DSL y CA15-3GAL4,
CEAMBL, CA15-3WGA, CA15-3DSL y CA15-3GAL4,
CEAMBL, CA15-3MGL, CA15-3WGA, CA15-3DSL y CA15-3GAL4, CEADC'SIGN, CA15-3MGL y CA15-3WGA, CEADC-SIGN, CA15-3MGL y CA15-3DSL,
CEADC-SIGN, CA15-3MGL y CA15-3GAL4,
CEADC-SIGN, CA15-3WGA y CA15-3DSL,
CEADC-SIGN, CA15-3WGA y CA15-3GAL4,
CEADC-SIGN, CA15-3MGL, CA15-3dsl y CA15-3GAL4,
CEADC-SIGN, CA15-3WGA, CA15-3DSL y CA15-3GAL4,
CEADC-SIGN, CA15-3MGL, CA15-3WGA CA15-3DSL y CA15-3GAL4,
CEAMGL y CA15-3MGL,
CEAMGL y CA15-3WGA
CEAMGL, CA15-3MGL y CA15-3WGA,
CEAMGL, CA15-3MGL y CA15-3DSL;
CEAMGL, CA15-3MGL y CA15-3GAL4,
CEAMGL, CA15-3WGA y CA15-3DSL,
CEAMGL, CA15-3WGA y CA15-3GAL4,
CEAMGL, CA15-3MGL, CA15-3DSL y CA15-3GAL4,
CEAMGL, CA15-3WGA, CA15-3dsl y CA15-3GAL4,
CEAMGL, CA15-3MGL, CA15-3WGA, CA15-3DSL y CA15-3GAL4,
CEAMBL, CEADC-SIGN y CA15-3MGL,
CEAMBL, CEAMGL y CA15-3MGL,
CEADC-SIGN, CEAMGL y CA15-3MGL,
CEAMBL, CEADC-SIGN y CA15-3WGA,
CEAMBL, CEAMGL y CA15-3WGA,
Ce a dc-sign, CEAmgl y CA15-3WGA,
CEAdc-sign, CEAmbl, CA15-3mgl y CA15-3WGA,
CEADC-SIGN, CEAmbl, CA15-3mgl y CA15-3DSL,
CEADC-SIGN, CEAMBL, CA15-3MGL y CA15-3GAL4;
CEADC-SIGN, CEAMBL, CA15-3WGA y CA15-3DSL,
CEADC-SIGN CEAMBL, CA15-3WGA y CA15-3GAL4,
CEAMGL, CEAMBL, CA15-3MGL y CA15-3WGA,
CEAMGL, CEAMBL, CA15-3MGL y CA15-3DSL,
CEAMGL, CEAMBL, CA15-3MGL y CA15-3GAL4,
CEAMGL, CEAMBL, CA15-3WGA y CA15-3DSL,
CEAMGL, CEAMBL, CA15-3WGA y CA15-3GAL4,
CEADC'SIGN, CEAMBL, CA15-3MGL y CA15-3WGA,
Ce a dc-sign, CEAmgl, CA15-3mgl y CA15-3DSL
CEADC-SIGN, CEAMGL, CA15-3MGL y CA15-3GAL4;
CEADC-SIGN, CEAMGL, CA15-3WGA y CA15-3DSL,
Ce a dc-sign, CEAmgl, CA15-3wga y CA15-3GAL4,
CEAMBL, CEADC'SIGN, CEAMBL, CA15-3MGL, CA15-3DSL y CA15-3GAL4,
CEAMBL, CEADC-SIGN, CEAMBL, CA15-3WGA, CA15-3DSL y CA15-3GAL4, o
CEAMBL, CEADC-SIGN, CEAMBL, CA15-3MGL, CA15-3WGA CA15-3DSL, y
CA15-3GAL4.
Someter a ensayo una muestra para determinar una cualquiera de las combinaciones de biomarcadores expuestas anteriormente, puede comprender además someter a ensayo también para determinar uno o más biomarcadores asociados con cáncer de mama seleccionados del grupo que consiste en una o más especies de CA125LECTINA (por ejemplo, CA125MGL), una o más especies de CA19-9LECTINA (por ejemplo, CA19-9DC'SIGN), CEA convencional, CA15-3 convencional, CA125 convencional y CA19-9 convencional.
Más generalmente, el presente método de determinación del estado patológico del cáncer de mama de un sujeto puede comprender en algunas variaciones someter a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar una o más especies de unión a lectina de un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en CEALECTINA (por ejemplo CEAMBL, CEADC-SIGN y/o CEAMGL), CA19-9LECTINA (por ejemplo CA19-9DC-SIGN), CA125LECTINA (por ejemplo CA125mgl), y CA15-3lectina (por ejemplo CA15-3MGL y/o Ca 15-3wga, opcionalmente en combinación con Ca 15-3dsl y/o CA15-3GAL4), y opcionalmente, someter a ensayo una muestra también para determinar uno o más biomarcadores asociados con cáncer de mama convencionales seleccionados del grupo que consiste en CEA, CA19-9, CA125 y CA15-3.
En cualquiera de las variaciones dadas a conocer expuestas anteriormente, el método de determinación de un estado patológico del cáncer de mama en un sujeto puede formularse más específicamente como un método de examen, diagnóstico, pronóstico y/o monitorización del cáncer de mama, ya sea de novo o aparición de recaída o sospecha de cáncer de mama.
Según lo anterior, el presente método está dirigido en algunas variaciones a diagnosticar cáncer de mama, es decir, a determinar si un sujeto tiene o no o está en riesgo de tener o desarrollar cáncer de mama. Esto también pretende incluir casos en los que no se determina finalmente la presencia o el riesgo de cáncer de mama, pero se justifican pruebas de diagnóstico adicionales. En tales casos, el método no es por sí mismo determinante de la presencia o ausencia, o del riesgo de cáncer de mama en el sujeto, pero puede indicar que se necesitan o serían beneficiosos pruebas de diagnóstico adicionales. Por tanto, el presente método puede combinarse con uno o más de otros métodos de diagnóstico para la determinación final de la presencia o ausencia, o del riesgo de cáncer de mama en el sujeto. Tales otros métodos de diagnóstico los conoce bien un experto en la técnica.
Al ser no invasivo y adecuado para analizar muestras de orina y suero, el presente método y sus variaciones pueden incorporarse fácilmente en un protocolo de examen de población para identificar sujetos que tienen o están en riesgo de tener o desarrollar cáncer de mama. Esto permitiría no solo el diagnóstico temprano del cáncer de mama, sino también la vigilancia activa de la aparición de cáncer de mama en sujetos con riesgo aumentado identificado de desarrollar cáncer de mama más adelante en la vida. Además, la detección temprana del cáncer de mama permitiría tratar la enfermedad de forma temprana cuando las posibilidades de curación son máximas.
El presente método y sus variaciones pueden usarse no solo con fines de diagnóstico, sino también para pronosticar o predecir el desenlace del cáncer de mama, o para monitorizar la aparición del cáncer de mama, cualquier desarrollo con riesgo de cáncer de mama, la recuperación del sujeto o la supervivencia del cáncer de mama, cualquier posible recidiva o recaída de la enfermedad, o la respuesta al tratamiento. En algunas variaciones, el método comprende monitorizar el cáncer de mama en dicho sujeto comparando el nivel de una o más especies de CA15-3LECTINA expuestas anteriormente, con o sin comparar de manera concomitante el nivel de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en CA15-3, CA125LECTINA, CA125, CEALECTINA y CEA como se expuso anteriormente, con el nivel respectivo en una o más de otras muestras obtenidas del mismo sujeto en un punto de tiempo diferente. Las muestras que pueden emplearse en la monitorización incluyen, pero sin limitarse a, muestras recogidas en diferentes puntos de tiempo después del diagnóstico de cáncer de mama y/o antes, durante y después de la intervención terapéutica, por ejemplo, mediante cirugía, radioterapia, quimioterapia, cualquier otro tratamiento terapéutico adecuado, o cualquier combinación de los mismos, para aliviar o curar el cáncer de mama. En algunas variaciones, dicha monitorización se lleva a cabo repitiendo la etapa de someter a ensayo al menos dos veces en diferentes puntos de tiempo, en la que dichos puntos de tiempo se seleccionan, independientemente entre sí, de los puntos de tiempo expuestos anteriormente. En algunas variaciones, la monitorización se lleva a cabo durante o después del tratamiento del cáncer de mama, y/o el método comprende determinar que dicho sujeto tiene recidiva o recaída de cáncer de mama o que está en riesgo de recidiva o recaída de cáncer de mama, si el nivel de al menos uno de los biomarcadores es mayor que en una o más muestras anteriores obtenidas del mismo sujeto, o mayor que en un control relevante o por encima de un valor umbral predeterminado.
En algunas variaciones, el presente método es particularmente adecuado para el diagnóstico temprano del cáncer de mama y para la detección temprana de recibida, recaída y progresión del cáncer de mama. Por consiguiente, CA15-3MGL y/o CA15-3WGA, opcionalmente en combinación con uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en CA15-3DSL, CA15-3GAL4, CA15-3, CA125LECTINA, CA125, CEALECTINA y CEA, tal como se expuso anteriormente, pueden servir como marcadores tumorales tempranos para el cáncer de mama, así como para la recibida, recaída y/o progresión del cáncer de mama. Por tanto, el presente método y cualquier combinación de biomarcadores dada a conocer en el presente documento pueden usarse no solo con fines de diagnóstico, pronóstico y monitorización, sino también para examinar mujeres asintomáticas para determinar cáncer de mama o riesgo de desarrollar cáncer de mama.
En algunos aspectos, la presente divulgación también proporciona el uso de CA15-3LECTINA, preferiblemente CA15-3MGL, como biomarcador para determinar el estado patológico distinto del cáncer de mama de un sujeto. Los inventores tienen evidencia experimental de que el biomarcador CA15-3MGL puede usarse para identificar correctamente a los sujetos o bien como sujetos con cáncer de ovario epitelial (EOC) o endometriosis, o bien como aparentemente sanos. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona el uso de CA15-3LECTINA,
preferiblemente CA15-3MGL, como biomarcador para determinar el estado patológico de EOC de un sujeto, o para diagnosticar, pronosticar o monitorizar el EOC. También se da a conocer un método de determinación del estado patológico de EOC en un sujeto, así como un método de diagnóstico, pronóstico o monitorización de EOC en un sujeto, en el que el método comprende someter a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar c A 15-3lectina, preferiblemente para determinar CA15-3MGL. El nivel aumentado de dicho CA15-3lectina, preferentemente de dicho CA15-3MGL, es indicativo de que dicho sujeto tiene o está en riesgo de tener EOC. Opcionalmente dicho CA15-3LECTINA, preferentemente dicho CA15-3MGL, puede usarse en cualquier combinación con uno o más biomarcadores asociados con el cáncer de mama convencionales incluyendo, pero sin limitarse a, CA125, CEA y CA15-3, y/o una o más especies de unión a lectina de los mismos, incluyendo, pero sin limitarse a, CA125MGL, c Ea dc-sign y/o CEAMBL. Por consiguiente, los métodos de determinación del estado patológico de EOC en un sujeto o de examen, diagnóstico, pronóstico o monitorización de EOC en un sujeto puede comprender además someter a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para uno o más de los biomarcadores adicionales expuestos anteriormente. Cualquier detalle de las variaciones dadas a conocer en el presente documento con respecto al cáncer de mama se aplica a las variaciones relacionadas con EOC, aunque no se repitan en el presente documento.
En algunas variaciones adicionales, cualquier combinación de biomarcadores dada a conocer con respecto al cáncer de mama también puede usarse para determinar el estado patológico de EOC de un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar EOC en un sujeto.
En algunos otros aspectos, la presente divulgación proporciona múltiples usos de diversas especies de biomarcadores de unión a lectina asociados con cánceres gastrointestinales, tales como el cáncer colorrectal y el cáncer de páncreas, tal como se ejemplifica con más detalle a continuación. Además, se proporciona un método de determinación del estado de un cáncer gastrointestinal en un sujeto, así como un método de examen, diagnóstico, pronóstico o monitorización de un cáncer gastrointestinal en un sujeto. Cualquier detalle de las variaciones dadas a conocer en el presente documento con respecto al cáncer de mama se aplica a las variaciones relacionadas con los cánceres gastrointestinales, aunque no se repitan en el presente documento.
La presente divulgación también da a conocer el uso de CA15-3LECTINA (por ejemplo, CA15-3MGL y/o CA15-3WGA, opcionalmente en combinación con CA15-3DSL y/o CA15-3GAL4) como biomarcador para determinar el estado patológico del cáncer colorrectal de un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer colorrectal en dicho sujeto. También se da a conocer un método de determinación del estado patológico del cáncer colorrectal en un sujeto, así como un método de examinen, diagnóstico, pronóstico o monitorización del cáncer colorrectal en un sujeto, en el que el método comprende someter a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar dicho CA15- 3LECTINA. El nivel aumentado de dicho CA15-3LECTINA sería indicativo de que dicho sujeto tiene o está en riesgo de tener cáncer colorrectal. Opcionalmente, dicho CA15-3LECTINA puede usarse en cualquier combinación con uno o más biomarcadores asociados con el cáncer colorrectal convencionales incluyendo, pero sin limitarse a, CEA, CA19-9, CA125 y CA15-3, y/o una o más especies de unión a lectina de los mismos, incluyendo, pero sin limitarse a, CEALECTINA (por ejemplo, CEAMBL , CEADC-SIGN y/o CEAMGL), CA19-9LECTINA (por ejemplo, CA19-9DC-SIGN) y CA125LECTINA (por ejemplo, CA125MGL). Por consiguiente, los métodos de determinación del estado patológico del cáncer colorrectal en un sujeto o de examen, diagnóstico, pronóstico o monitorización del cáncer colorrectal en un sujeto pueden comprender además someter a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar uno o más de los biomarcadores adicionales expuestos anteriormente.
Según la evidencia experimental de los inventores, la MGL, molécula de adhesión intercelular específica de células dentríticas-3 no asociada a integrina (DC-SIGN) y la lectina de unión a manosa (MBL) muestran alta reactividad con varias preparaciones de CEA derivadas de cáncer colorrectal. Por tanto, CEAMBL, CEADC-SIGN y/o CEAMGL son biomarcadores particularmente potentes para su uso en diversos aspectos del diagnóstico del cáncer colorrectal expuestos anteriormente, y pueden usarse o bien solos o bien en cualquier combinación con uno o más biomarcadores asociados con cáncer colorrectal convencionales incluyendo, pero sin limitarse a, CEA, CA19-9, CA125 y CA15-3, y/o una o más especies de unión a lectina de los mismos seleccionados del grupo que consiste en incluyendo, pero sin limitarse a, CA19-9LECTIN (por ejemplo, CA19-9DC-SIGN), y CA125LECTINA (por ejemplo CA125MGL), CA15-3LECTINA (por ejemplo, CA15-3MGL y/o CA15-3WGA, opcionalmente en combinación con CA15-3DSL y/o CA15-3GAL4) , y adicionalmente especies de c e Alectina
Tal como se demuestra en el ejemplo 5, diferentes ensayos de CEA glicovariante, concretamente ensayos para determinar CEADC'Sign, CEAMGL o CEAMBL pueden mejorar la especificidad de cáncer colorrectal del marcador tumoral CEA. Pacientes con CRC y controles sanos que tenían niveles plasmáticos de CEA en el intervalo normal se detectaron diferencialmente con los ensayos de CEA glicovariante con lectina, con cantidad aumentada de glicoformas de CEA en CRC. El número de falsos negativos disminuyó significativamente usando el ensayo de CEADC'SIGN, CEAMGL o CEAMBL. Por tanto, algunas variaciones de los presentes métodos y usos relacionados con el cáncer colorrectal se basan en y/o comprenden someter a ensayo una muestra obtenida de un sujeto cuyo estado patológico del cáncer colorrectal va a determinarse, para determinar i) CEAMBL con o sin CEA; ii) CEAD(C SIGN con o sin CEA; iii) CEAMGL con o sin CEA; iv) CEAMBL y CEADC'SIGN con o sin CEA; v) CEAMBL y CEAMGL con o sin CEA; vi) CEADC'SIGN y CEAMGL con o sin CEA; o vi) CEAMBL, CEADC'SIGN y CEAMGL con o sin CEA. Cualquier variación y detalles de los mismos dados a conocer en el presente documento con respecto a otros cánceres,
especialmente al cáncer de mama, se aplican a las variaciones relacionadas con el cáncer colorrectal, aunque no se repitan en el presente documento.
El antígeno de hidrato de carbono (CA19-9) es un biomarcador ampliamente usado, especialmente para el cáncer de páncreas. Sin embargo, su expresión también está elevada en muchos otros cánceres gastrointestinales, incluyendo el cáncer colorrectal y cáncer de hígado. Por consiguiente, una o más glicofomas de unión a lectina de CA19-9, denominadas colectivamente en el presente documento como CA19-9lectina, pueden usarse en algunas realizaciones de los presentes métodos como marcadores adicionales para determinar el estado patológico de un cáncer gastrointestinal de un sujeto, tal como cáncer colorrectal y cáncer de páncreas. Una especie de CA19-9 preferida es CA19-9DC-SIGN. En algunas realizaciones no limitativas, pueden emplearse valores de punto de corte, tales como aproximadamente 26 U/ml o aproximadamente 37 U/ml para CA19-9.
En algunas realizaciones, la presente divulgación también proporciona el uso de CA15-3LECTINA (por ejemplo, CA15-3mgl y/o CA15-3WGA, opcionalmente en combinación con CA15-3DSL y/o CA15-3GAL4) como biomarcador para determinar el estado patológico del cáncer de páncreas de un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer de páncreas en dicho sujeto. También se proporciona un método de determinación del estado patológico del cáncer de páncreas en un sujeto, así como un método de examen, diagnóstico, pronóstico o monitorización de cáncer de páncreas en un sujeto, en el que el método comprende someter a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar CA15-3LECTINA. El nivel aumentado de dicho CA15-3LECTINA sería indicativo de que dicho sujeto tiene o está en riesgo de tener cáncer de páncreas. Opcionalmente, dicho CA15-3LECTINA puede usarse en cualquier combinación con uno o más biomarcadores asociados con cáncer de páncreas convencionales incluyendo, pero sin limitarse a, CEA, CA19-9, CA125, y CA15-3, y/o una o más especies de unión a lectina de los mismos incluyendo, pero sin limitarse a, CEALECTINA (por ejemplo, CEADC-SIGN y/o CEAMBL), CA19-9LECTINA (por ejemplo, CA19-9DC-SIGN), y CA125LECTINA (por ejemplo, CA125MGL). Por consiguiente, los métodos de determinación del estado patológico del cáncer de páncreas en un sujeto o de examen, diagnóstico, pronóstico o monitorización de cáncer de páncreas en un sujeto pueden comprender además someter a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar uno o más de los biomarcadores adicionales expuestos anteriormente.
Tal como se demuestra en el ejemplo 6, CA19-9DC-SIGN mejoró la discriminación de pacientes con cáncer de páncreas de controles sanos y controles benignos (es decir, pacientes que tienen enfermedad benigna del hígado o el tracto biliar) en comparación con el inmunoensayo de CA19-9 convencional. Además, el ensayo de CA19-9DC-SIGN disminuyó el número de falsos negativos, mejorando significativamente la sensibilidad. Por tanto, algunas realizaciones preferidas de los presentes métodos y usos relacionados con el cáncer de páncreas se basan en y/o comprenden someter a ensayo una muestra obtenida de un sujeto cuyo estado patológico del cáncer de páncreas va a determinarse, para determinar CA19-9DC-SIGN con o sin someter a ensayo el antígeno CA19-9 convencional. cualquier variación y detalles de los mismos dados a conocer en el presente documento con respecto a otros cánceres, especialmente al cáncer de mama, se aplican a las variaciones relacionadas con el cáncer de páncreas, aunque no se repitan en el presente documento.
Alternativamente, puede emplearse cualquier combinación apropiada de especies de biomarcadores de unión a lectina seleccionadas del grupo que consiste en CEALECTINA (por ejemplo, CEAMBL ,CEADC-SIGN y/o CEAMGL), CA19-9lectina (por ejemplo, CA19-9DC'SIGN), CA125LECTINA (por ejemplo, CA125MGL), y CA15-3LECTINA (por ejemplo, CA15-3mgl y/o CA15-3WGA, opcionalmente en combinación con CA15-3DSL y/o CA15-3GAL4), opcionalmente con cualquier combinación deseada de CEA, CA19-9, CA125 y CA15-3 convencionales, en cualquiera de las realizaciones o variaciones dadas a conocer expuestas anteriormente relacionadas con cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer colorrectal y cáncer de páncreas. En una alternativa no limitativa más específica, CEAMBL, CEADC'SIGN y/o CEAMGL se usan en cualquier combinación con uno o más biomarcadores asociados con cáncer gastrointestinal convencionales incluyendo, pero sin limitarse a, CEA, CA19-9, CA125 y CA15-3, y/o una o más especies de unión a lectina de los mismos seleccionados del grupo que consiste en CA19-9LECTINA (por ejemplo, CA19-9DC'SIGN), y CA125LECTINA (por ejemplo, CA125MGL), CA15-3LECTINA (por ejemplo, CA15-3MGL y/o CA15-3WGA, opcionalmente en combinación con CA15-3DSL y/o CA15-3GAL4), y especies de CEALECTINA adicionales. En algunas variaciones adicionales, también puede usarse cualquier combinación de biomarcadores dada a conocer con respecto al cáncer de mama para determinar el estado de un cáncer gastrointestinal en un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar un cáncer gastrointestinal en un sujeto, en el que dicho cáncer gastrointestinal incluye, pero no se limita a cáncer colorrectal y cáncer de páncreas.
Además, se da a conocer el uso de una o más especies de unión a lectina del antígeno específico de próstata, es decir PSALECTINA, preferiblemente PSAMGL, una o más especies de CEALECTINA, tales como CEAMBL, CEADC'SIGN y/o CEAMGL, y/o una o más especies de CA19-9LECTINA tales como CA19-9DC'SIGN, o bien sola o bien en cualquier combinación de las mismas, para su uso como biomarcadores para determinar el estado patológico del cáncer de próstata de un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer de próstata en dicho sujeto. Opcionalmente, puede usarse uno cualquiera o más de los biomarcadores de unión a lectina expuestos anteriormente en cualquier combinación con los biomarcadores PSA, CEA y/o CA19-9 convencionales. En algunas variaciones específicas, las especies de biomarcadores de unión a lectina que van a someterse a ensayo incluyen, pero sin limitarse a:
PSAMGL;
q Ea dc-s'gn’
CEAMBL;
CA19-9lectina;
PSAMGL y CEADC-SIGN;
PSAMGL y CEAMBL;
PSAMGL y CA19-9LECTINA;
Ce a dc-sign y CEAMBL;
CEADC-SIGN y CA19-9LECTINA;
CEAMBL y CA19-9LECTINA;
PSAMGL, CEADC-SIGN y CEAMBL;
PSAMGL, CEADC-SIGN y CA19-9LECTINA;
PSAMGL, CEAMBL y CA19-9LECTINA;
CEADC-SIGN, CEAMBL y CA19-9LECTINA; o
PSAMGL, CEADC-SIGN, CEAMBL y CA19-9LECTINA.
Someter a ensayo una muestra para determinar una cualquiera de las combinaciones de biomarcador específicas expuestas anteriormente puede comprender además someter a ensayo también para determinar uno o más biomarcadores convencionales seleccionados de PSA, CEA y CA19-9.
Tal como se demuestra en el ejemplo 7, PSAMGL puede discriminar entre el antígeno PSA canceroso y no canceroso. Por tanto, algunas variaciones preferidas de los presentes métodos y usos relacionados con cáncer de próstata se basan en y/o comprenden someter a ensayo una muestra obtenida de un sujeto cuyo estado patológico del cáncer de próstata va a determinarse, para determinar PSAMGL con o sin someter a ensayo el antígeno PSA convencional. Cualquier variación y detalles de los mismos dados a conocer en el presente documento con respecto a otros cánceres, especialmente al cáncer de mama, se aplican a las variaciones relacionadas con el cáncer de próstata, aunque no se repitan en el presente documento.
En algunas variaciones adicionales, pueden usarse PSAWGA, PSAGal4 y/o PSADectin2 para determinar el estado patológico del cáncer de próstata en un sujeto. Por tanto, algunas variaciones de los presentes métodos y usos relacionados con cáncer de próstata se basan en y/o comprenden someter a ensayo una muestra obtenida de un sujeto cuyo estado patológico del cáncer de próstata va a determinarse, para determinar PSAWGA, PSAGal4 o PSADentin2; PSAMGL y PSAWGA; PSAMGL y PSAGal4; PSAMGL y PSADentin2; PSAWGA y PSAGal4; PSAWGA y PSADentin2 ; PSAGal4 y PSADentin2; PSAMGL, PSAWGA y PSAGal4; PSAMGL, PSAWGA y PSADentin2; PSAWGA, PSAGal4 y PSADentin2; PSAMGL, PSAGal4 y PSADentin2;' o PSAMGL, PSAWGA, PSAGal4 y PSADentin2 Cualquiera de estas variaciones también puede comprender someter a ensayo el antígeno PSA convencional.
Por motivos de simplicidad, los biomarcadores asociados con cáncer convencionales dados a conocer en el presente documento, concretamente CA15-3, CA125, CEA, CA19-9 o PSA, se denominan colectivamente por el término general “GlycoProt”, mientras que las glicofomas de unión a lectina de los mismos se denominan por el término general “GlycoProtLECTINA”. Dependiendo de la realización o la variación dada a conocer en cuestión, los términos pueden referirse a uno o más biomarcadores o glicoformas englobados por términos, respectivamente, tal como entienden fácilmente los expertos en la técnica. Las especies de GlycoProtLECTINA preferidas incluyen, pero sin limitarse a, CA15-3MGL, CA15-3WGA, CA15-3DSL, CA15-3GAL4, CA125MGL, CEADC'SIGN, CEAMBL y PSAMGL. Someter a ensayo una muestra para determinar cualquier GlycoProtLECTINA dado a conocer en el presente documento puede llevarse a cabo mediante cualquier medio, métodos o técnicas disponibles en la técnica. Un ejemplo preferido, pero no limitativo, es determinar el nivel de unión de GlycoProt a la lectina en cuestión. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante un ensayo de tipo sándwich, en el que se usa un anticuerpo específico frente a GlycoProt, preferiblemente un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab), como agente de captura y la lectina en cuestión se usa como indicador. Para su uso como indicador, dicha lectina puede marcarse de manera detectable, o bien directa o bien indirectamente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una estructura de inmunoglobulina que comprende dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Los anticuerpos pueden existir como inmunoglobulinas intactas o como cualquiera de varios fragmentos de unión a antígeno bien caracterizados o variantes de cadena sencilla de los mismos, estando englobados todos ellos en el presente documento por el término “anticuerpo”. Los ejemplos no limitativos de dichos fragmentos de unión a antígeno incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fv. Dichos fragmentos y variantes pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas, tal como se conoce bien en la técnica. El término “anticuerpo” también incluye, pero no se limita a, anticuerpos policlonales, monoclonales y recombinantes de las clases de isotipo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y subtipos de los mismos.
En algunas otras realizaciones o variaciones, puede realizarse un ensayo de tipo sándwich de forma inversa. En tales casos, la lectina en cuestión se usa como agente de captura y un anticuerpo específico frente a GlycoProt, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, como indicador marcado de manera detectable directa o indirectamente. Dado que la orina contiene menos moléculas glicosiladas que interfieren que la sangre, el ensayo de tipo sándwich inverso puede funcionar mejor con muestras de orina que con muestras de sangre.
En algunas realizaciones o variaciones, un ensayo de tipo sándwich puede comprender una o más etapas de lavado después de una etapa de captura con el fin de eliminar cualquier especie de GlycoProt que no sea específica para el agente de captura. Las disoluciones y condiciones de lavado apropiadas (por ejemplo, tiempo y temperatura) las conocen los expertos en la técnica.
Los ensayos de tipo sándwich según diversas realizaciones de la presente invención o variaciones dadas a conocer pueden realizarse o bien en una superficie sólida, tal como una placa de microtitulación, o bien en formato de flujo lateral. Los medios y métodos para unir un agente de captura a una superficie sólida, por ejemplo, a través de un complejo de estreptavidina-biotina, o incorporando un agente de captura a un ensayo de flujo lateral se conocen en la técnica y son fácilmente evidentes para un experto en la técnica.
Los sustratos adecuados para su uso en los presentes ensayos de tipo sándwich en fase sólida incluyen, pero sin limitarse a, vidrio, sílice, aluminosilicatos, borosilicatos, óxidos metálicos tales como alúmina y óxido de níquel, oro, diversas arcillas, nitrocelulosa o nailon. Tal como se indicó anteriormente, el sustrato puede recubrirse en algunas realizaciones o variaciones con un compuesto apropiado para potenciar la unión de un agente de captura (es decir, o bien un anticuerpo anti-GlycoProt o bien una lectina) al sustrato. En algunas realizaciones o variaciones adicionales, también pueden unirse al sustrato uno o más anticuerpos de control o lectinas de control.
Puede usarse uno cualquiera o más anticuerpos anti-GlycoProt, preferiblemente monoclonales, en los ensayos de tipo sándwich mencionados anteriormente, o bien como agentes de captura o bien como indicadores. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos anti-CA15-3 comerciales adecuados incluyen Ma552 y Ma695, mientras que los ejemplos no limitativos de anticuerpos anti-CA125 comerciales adecuados incluyen Ov185, Ov197 y OvK95, disponibles al menos de Fujirebio Diagnostics, Suecia. Anticuerpos monoclonales específicos frente a GlycoProt adicionales están disponibles en la técnica o pueden producirse según métodos bien conocidos en la técnica. Para su uso como indicador, un anticuerpo anti-GlycoProt puede marcarse con cualquier marcador apropiado conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, marcadores fluorescentes, marcadores bioluminiscentes, marcadores quimioluminiscentes. En algunas realizaciones o variaciones, dicho anticuerpo anti-GlycoProt puede marcarse de manera detectable indirectamente, por ejemplo, a través de la inmovilización en una nanopartícula detectable.
Las lectinas están disponibles comercialmente de múltiples fuentes. Algunas lectinas, tales como MGL y DC-SIGN, están disponibles con o sin fusión C-terminal con Fc de IgG1 humana. Ambas formas pueden emplearse en los presentes métodos. En algunas realizaciones o variaciones se prefieren las formas fusionadas con Fc.
Para su uso como indicador, las lectinas pueden marcarse de manera detectable de diversas formas, tal como se conoce bien en la técnica. En algunas realizaciones o variaciones, una o más lectinas que van a emplearse para someter a ensayo una muestra para determinar el nivel de GlycoProtLECTINA pueden marcarse directamente con cualquier marca detectable disponible usando técnicas convencionales. Por ejemplo, GlycoProtLECTINA puede marcarse directamente con un quelato de lantánido, tal como un quelato de europio (III), terbio (III), samario (III), disprosio (III), iterbio (III), erbio (III) o neodinio (III), o hacerse detectable a través de detección colorimétrica, por ejemplo conjugando el GlycoProtLECTINA con peroxidasa de rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina (AP). En algunas otras realizaciones o variaciones, una o más lectinas que van a emplearse pueden marcarse de manera detectable indirectamente, por ejemplo, inmovilizando dichas una o más lectinas en una nanopartícula detectable. Tales lectinas inmovilizadas en nanopartículas se denominan NP-lectina para abreviar.
Tal como se usa en el presente documento, el término “nanopartícula” (NP) se refiere a una partícula, sintética o natural, que tiene una o más dimensiones, por ejemplo, un diámetro, de menos de aproximadamente 1000 nm, por ejemplo, aproximadamente 500 nm o menos, aproximadamente 100 nm o menos, o aproximadamente 50 nm o
menos. Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a un intervalo de valores ± el 10% de un valor especificado. Por ejemplo, la expresión “aproximadamente 100 nm” incluye ± el 10% de 100 nm, o desde 90 nm hasta 110 nm. Las nanopartículas pueden tener generalmente una forma esférica, pero también pueden usarse formas no esféricas tales como formas elipsoidales. En algunas realizaciones o variaciones, todas las dimensiones de dicha nanopartícula son menores de aproximadamente 1000 nm, aproximadamente 500 nm o menos, aproximadamente 100 nm o menos, o aproximadamente 50 nm o menos.
Puede utilizarse una variedad de materiales diferentes en las presentes nanopartículas. Los ejemplos no limitativos de polímeros adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), poliestireno, polietileno, poli(ácido acrílico), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), polisacáridos y copolímeros o combinaciones de los mismos. Otros materiales de nanopartícula adecuados incluyen, pero sin limitarse a, oro coloidal, plata, puntos cuánticos, carbono, silicio poroso y liposomas. Materiales de nanopartícula adecuados adicionales incluyen nanopartículas de proteínas, nanopartículas minerales, nanopartículas de vidrio, cristales de nanopartícula, nanopartículas de metal y nanopartículas de plástico.
Las nanopartículas adecuadas para su uso en diversas realizaciones de la presente invención o variaciones dadas a conocer pueden ser detectables cualitativa o cuantitativamente directa o indirectamente por cualquier medio conocido. Por ejemplo, las nanopartículas pueden ser detectables debido a una calidad inherente como en el caso de, por ejemplo, nanopartículas de conversión ascendente (UCNP), partículas de resonancia, puntos cuánticos y partículas de oro. En algunas otras realizaciones o variaciones dadas a conocer, las nanopartículas pueden hacerse detectables, por ejemplo, mediante marcadores fluorescentes, marcadores bioluminiscentes, marcadores quimioluminiscentes. En algunas realizaciones adicionales o variaciones dadas a conocer, el marcaje o dopaje con lantánidos, es decir, iones de lantánidos luminiscentes con emisión de luminiscencia en las longitudes de onda visible o casi infrarroja o infrarroja y extinción de fluorescencia prolongada, tales como europio (III), terbio (III), samario (III ), disprosio (III), iterbio (III), erbio (III) y neodinio (III), son medios preferidos para hacer detectables las presentes nanopartículas.
Las lectinas pueden inmovilizarse en nanopartículas mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, el dado a conocer en el ejemplo 1. En aquellas realizaciones o variaciones que implican más de una lectina diferente, dichas lectinas diferentes pueden inmovilizarse en nanopartículas iguales o diferentes en cualquier razón deseada.
En algunas realizaciones o variaciones no limitativas, las nanopartículas más preferidas son nanopartículas de poliestireno que tienen un diámetro o bien de aproximadamente 97 nm o bien de aproximadamente 107 nm. Tales nanopartículas están disponibles comercialmente al menos de Thermo Scientific y Seradyn Inc. Nanopartículas preferidas adicionales incluyen nanopartículas dopadas con quelato de europio. Las ventajas de tales nanopartículas incluyen i) la amplificación de señal proporcionada por un gran número de quelatos por partícula, ii) una afinidad funcional reforzada (avidez) de las lectinas por sus epítopos de glicoestructura diana que permite la alta densidad de lectinas inmovilizadas en la partícula, y iii) la especificidad de la glicoestructura de las lectinas usadas que permite la creación de las nanopartículas multivalentes. Sin embargo, las nanopartículas son solo una forma preferida de proporcionar un efecto de avidez y una amplificación de señal adecuados para llevar a cabo la presente invención o divulgación y sus diversas realizaciones o variaciones.
Además, en aquellas realizaciones o variaciones que implican más de una lectina diferente, puede someterse a ensayo una muestra para diferentes especies de GlycoProtLECTINA, o bien en mismo ensayo (es decir, de manera concomitante) o bien en ensayos diferentes (es decir, en paralelo), ya sea de manera simultánea o secuencial. En cualquiera de tales ensayos, dichas lectinas diferentes pueden haberse marcado de manera detectable, o bien directa o bien indirectamente, con marcadores iguales o diferentes. En algunas realizaciones o variaciones, la multiplexación, por ejemplo, mediante el uso de nanopartículas marcadas de manera diferente que portan diferentes especies de lectina en un solo ensayo, puede ser un formato preferido para llevar a cabo cualquiera de los métodos o realizaciones o variaciones de los mismos dados a conocer en el presente documento.
En algunas realizaciones o variaciones específicas, se usan como indicadores una o más lectinas inmovilizadas en nanopartículas iguales o diferentes marcadas con un marcador detectable, tal como un quelato de lantánido seleccionado de europio (III), terbio (III), samario (III) y disprosio (III). En algunas realizaciones o variaciones más específicas, se usa quelato de europio como marcador detectable. En una realización o variación preferida no limitativa, se usa NP-lectina como indicador y se dopa con aproximadamente 30000 quelatos de Eu. En algunas otras realizaciones o variaciones específicas, la lectina en cuestión se une a partículas de fósforo de conversión ascendente (UCP), que son particularmente adecuadas para su uso como indicadores en el formato de flujo lateral.
También es posible crear una señal detectable usando cualquier tecnología de sensor disponible. Por ejemplo, una superficie sólida puede incorporar un elemento de reconocimiento (transductor) capaz de convertir la reacción de unión en una señal detectable con o sin el uso de restos de marcadores. Pueden emplearse diferentes tipos de transductores, incluyendo los basados en detección electroquímica u óptica. La detección también puede basarse en técnicas de detección homogéneas o heterogéneas, tal como es evidente para los expertos en la técnica.
Recubrir con las lectinas la superficie de las nanopartículas en lugar de recubrir superficies sólidas con ellas, tales como pocillos de microtitulación, matrices o sensores, genera beneficios significativos en lo que se refiere al rendimiento del ensayo, especialmente en formatos de ensayo no competitivos donde las lectinas se usan en combinación con anticuerpos específicos. Cuando tales anticuerpos se unen a la fase sólida, la afinidad normalmente mayor de manera significativa de los anticuerpos en comparación con la de las lectinas puede aprovecharse por completo para capturar las moléculas de biomarcador diana sobre la fase sólida con alta eficiencia y estabilidad como primera etapa. Dada la alta afinidad de los anticuerpos, también pueden capturarse con alta estabilidad moléculas diana pequeñas con solo una copia del epítopo seleccionado como diana. Una vez que se capturan las moléculas diana, el efecto de avidez de las nanopartículas-lectina, es decir, el efecto en el que varias lectinas contiguas pueden unirse a las moléculas diana capturadas contiguas, lo que aumenta significativamente la fuerza de unión en comparación con las moléculas de lectina individuales, también puede utilizarse en su totalidad.
Combinado además con el hecho de que las nanopartículas normalmente permiten una intensificación significativa de la señal medible, el enfoque de NP-lectina/fase sólida-anticuerpo combina de manera óptima la alta especificidad de ambos componentes de la unión, la alta fuerza de unión de anticuerpos individuales, la alta fuerza de unión de múltiples lectinas contiguas en múltiples glicoestructuras contiguas (el efecto de avidez), y el alto nivel de señal detectable para cada nanopartícula unida, dando como resultado la combinación óptima de alta sensibilidad y alta especificidad, en lo que se refiere tanto a atributos analíticos como clínicos.
Además, mientras que las lectinas normalmente tienen una alta especificidad frente a las glicoestructuras diana (glicoformas), tales formas también pueden existir en otras moléculas distintas de la seleccionada como diana. Por tanto, en algunas realizaciones o variaciones preferidas, se emplea una etapa de lavado entre la fase de captura del anticuerpo de la molécula diana y la fase de unión de NP-lectina, para eliminar por lavado todas las moléculas no diana y no unidas que pueden comprender en algunos casos las mismas glicoestructuras que la moléculas seleccionadas como diana y, por tanto, plantean un riesgo de detección inespecífica basándose en la reactividad cruzada entre especies. Una vez que las moléculas diana específicas se capturan mediante el uso de anticuerpos y otras moléculas se eliminan por lavado antes de la etapa de unión de lectina, se elimina el riesgo de unión inespecífica de dianas no deseadas por parte de lectinas. Una etapa de lavado de este tipo también se prefiere para impedir la competencia de la molécula diana para unirse a sitios distantes alrededor de la NP-lectina, aunque esto ocurriría con una baja afinidad en muchos casos. Sin embargo, tanto el riesgo de reactividad cruzada como el de unión distante aumentan cuando la molécula diana tiene varias glicoestructuras reactivas, como en el caso de muchas moléculas de alto peso molecular, tal como CA15-3, donde las lectinas contiguas pueden unirse a glicoestructuras contiguas en la misma molécula diana. En tal caso, el uso del enfoque no competitivo de NP-lectina/fase sólida-anticuerpo con una etapa de lavado antes de la reacción de unión de NP-lectina da como resultado un ensayo significativamente más sensible y específico de diana, en comparación con las plataformas en las que las lectinas están se unen a la fase sólida, o en las que las NP-lectina se emplean sin una etapa de lavado intermedia. De manera similar, debido a la falta casi total del efecto de avidez, las plataformas de ensayo en las que las lectinas (en lugar de los anticuerpos) se unen a la fase sólida tienen un rendimiento deficiente con moléculas diana pequeñas tales como PSA, que solo tiene un resto de glicoestructura por molécula.
La presente divulgación también proporciona un kit para su uso en los presentes métodos y diversas realizaciones o variaciones de los mismos. En su forma más amplia, el kit comprende reactivos para someter a ensayo una o más especies de unión a lectina de biomarcadores glicoproteicos asociadas con cáncer, seleccionados del grupo que consiste en CA15-3, CA125, CEA, C19-9 y PSA. Dicho de otro modo, el kit comprende reactivos para someter a ensayo una muestra para determinar cualquier especie de GlycoProtLECTINA deseada o combinación de la misma seleccionada del grupo que consiste en CA15-3lectina, CA125lectina, CEALECTINA, CA19-9lectina y PSALECTINA Para cada GlycoProtLECTINA que va a someterse a ensayo, al menos un reactivo es un agente de unión a GlycoProt específico para el GlycoProt en cuestión, tal como un anticuerpo monoclonal anti-GlycoProt, y al menos uno de los reactivos es la lectina en cuestión, preferiblemente inmovilizada en una nanopartícula. O bien dicho agente de unión a GlycoProt o bien dicha lectina está marcado de forma detectable. La lectina puede marcarse indirectamente a través de una nanopartícula detectable sobre la que se inmoviliza. Las especies de GlycoProtLECTINA que van a someterse a ensayo y, por tanto, los reactivos que van a incluirse en el kit, dependen del propósito previsto de uso del kit, especialmente en el cáncer que va a examinarse, diagnosticarse, pronosticarse o monitorizarse, y las combinaciones preferidas se hacen evidentes a partir de la divulgación anterior.
Opcionalmente, el kit también puede comprender reactivos para someter a ensayo uno o más antígenos GlycoProt convencionales, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en CA15-3, CA125, CA19-9, CEA y PSA. Los ejemplos no limitativos de reactivos típicos para someter a ensayo dichos antígenos GlycoProt convencionales incluyen dos agentes de unión a GlycoProt para cada antígeno GlycoProt convencional que va a someterse a ensayo, tal como dos anticuerpos monoclonales anti-GlycoProt, que se unen a diferentes epítopos en dicho GlycoProt. Para cada GlycoProt específico, uno de los agentes de unión puede ser el mismo que el agente de unión a GlycoProt proporcionado para someter a ensayo un GlycoProtLECTINA respectivo. No obstante, uno de los agentes de unión a GlycoProt puede inmovilizarse sobre una superficie sólida o proporcionarse para su uso como agente de captura en formato de flujo lateral, mientras que el otro agente de unión a GlycoProt puede comprender un marcador detectable. Los antígenos GlycoProt convencionales que se van a someterse a ensayo y, por tanto,
los reactivos que han de incluirse en el kit, dependen del propósito previsto del uso del kit, especialmente del cáncer que va a examinarse, diagnosticarse, pronosticarse o monitorizarse, y las combinaciones preferidas se hacen evidentes a partir de la divulgación anterior.
En algunas variaciones dadas a conocer, el kit se proporciona para determinar el estado patológico del cáncer de mama de un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer de mama en dicho sujeto. En tales casos, el kit comprende un agente de unión a CA15-3, tal como un anticuerpo monoclonal anti-CA15-3, y MGL y/o WGA, opcionalmente inmovilizadas sobre una nanopartícula igual o diferente. En algunas variaciones adicionales, también pueden proporcionarse DSL y/o Gal4, opcionalmente inmovilizadas sobre una nanopartícula igual o diferente. O bien dicho agente de unión a CA15-3 o bien dicha lectina comprende un marcador detectable o se ha inmovilizado sobre una superficie sólida, tal como una placa de microtitulación. En algunas variaciones adicionales, para dicha unión se usan el recubrimiento con estreptavidina de las placas y la biotinilación del anticuerpo. Las formas alternativas de lograr esto están fácilmente disponibles para un experto.
En algunas variaciones adicionales, un kit proporcionado para determinar el estado patológico del cáncer de mama de un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer de mama en dicho sujeto también puede comprender reactivos para someter a ensayo biomarcadores adicionales seleccionados del grupo que consiste en, CA15-3, CA125LECTINA (por ejemplo, CA125MGL), CA125, CEALECTINA (por ejemplo, CEAMBL, CEADC-SIGN y/o CEAMGL) y CEA. Los reactivos adecuados para estos ensayos se desprenden de lo anterior.
Por consiguiente, en algunas variaciones, especialmente en relación con cáncer de mama, el kit puede comprender además uno o más reactivos para someter a ensayo la concentración de la proteína CA15-3. Los ejemplos no limitativos de reactivos típicos para someter a ensayo la concentración de la proteína CA15-3 incluyen dos agentes de unión a CA15-3, tales como dos anticuerpos monoclonal anti-CA15-3, que se unen a diferentes epítopos de proteína en CA15-3. Uno de los agentes de unión a CA15-3 puede ser igual que el agente de unión a CA15-3 proporcionado para someter a ensayo CA15-3MGL o CA15-3WGA. Uno de los dos agentes de unión a CA15-3 puede inmovilizarse sobre una superficie sólida o proporcionarse para su uso como agente de captura en formato de flujo lateral, mientras que el otro agente de unión a CA15-3 puede comprender un marcador detectable. Alternativamente o además, los reactivos correspondientes pueden estar comprendidos en el kit para someter a ensayo una muestra para determinar CA125 y/o CEA.
Opcionalmente, el kit también puede comprender un control para comparar con un valor medido de unión de CA15-3 a MGL y/o WGA. En algunas variaciones, el control es un valor umbral para comparar con el valor medido.
En algunas variaciones dadas a conocer, se proporciona un kit para determinar el estado patológico del cáncer colorrectal de un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer colorrectal en dicho sujeto. En tales casos, el kit comprende un agente de unión a CEA, tal como un anticuerpo monoclonal anti-CEA, y al menos una lectina seleccionada del grupo que consiste en MBL, DC-SIGN y MGL, opcionalmente inmovilizada sobre una nanopartícula. Si va a usarse más de una lectina, puede inmovilizarse sobre nanopartículas iguales o diferentes. En algunas variaciones, la lectina que va a usarse puede ser CEAMBL, CEADC'SIGN o CEAMGL, mientras en otras variaciones se usan las lectinas CEAMBL y CEADC'SIGN; CEAmbl y CEAMGL; CEADC'SIGN y CEAMGL; o CEA; o CEAMBL, CEADC-SIGN y CEAMGL en combinación. O bien dicho agente de unión a CEA o bien dicha lectina comprende un marcador detectable o se ha inmovilizado sobre una superficie sólida, tal como una placa de microtitulación. En algunas variaciones adicionales, para dicha unión se usan el recubrimiento con estreptavidina de las placas y la biotinilación del anticuerpo. Las formas alternativas de lograr esto están fácilmente disponibles para un experto.
En algunas variaciones adicionales dadas a conocer, un kit proporcionado para determinar el estado patológico del cáncer colorrectal de un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer colorrectal en dicho sujeto también puede comprender reactivos para someter a ensayo biomarcadores adicionales tales como CEA. Por consiguiente, en algunas variaciones, el kit puede comprender además uno o más reactivos para someter a ensayo la concentración de la proteína CEA. Los reactivos adecuados para este fin están fácilmente disponibles en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales anti-CEA. En algunas variaciones, pueden emplearse dos anticuerpos monoclonales anti-CEA, que se unen a diferentes epítopos de proteína en CEA. Uno de los agentes de unión a CEA puede ser igual que el agente de unión a CEA proporcionado para someter a ensayo CEAMBL, CEADC'SIGN y/o CEAMGL. Uno de los dos agentes de unión a CEA puede inmovilizarse sobre una superficie sólida o proporcionarse para su uso como agente de captura en formato de flujo lateral, mientras que el otro agente de unión a CEA puede comprender un marcador detectable.
Opcionalmente, el kit también puede comprender un control para comparar con un valor medido de unión de CEA a MBL, DC-SIGN y/o MGL. En algunas variaciones, el control es un valor umbral para comparar con el valor medido.
En algunas realizaciones, se proporciona un kit para determinar el estado patológico del cáncer de páncreas de un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer de páncreas en dicho sujeto. En tales casos, el kit comprende un agente de unión a CA19-9, tal como un anticuerpo monoclonal anti-CA19-9, y al menos DC-SIGN, opcionalmente inmovilizada sobre una nanopartícula. O bien dicho agente de unión a CA19-9 o bien
dicha lectina comprende un marcador detectable o se ha inmovilizado sobre una superficie sólida, tal como una placa de microtitulación. En algunas realizaciones adicionales, para dicha unión se usan el recubrimiento con estreptavidina de las placas y la biotinilación del anticuerpo. Las formas alternativas de lograr esto están fácilmente disponibles para un experto.
En algunas realizaciones adicionales, un kit proporcionado para determinar el estado patológico del cáncer de páncreas de un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer de páncreas en dicho sujeto también puede comprender reactivos para someter a ensayo biomarcadores adicionales tales como CA19-9. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el kit puede comprender además uno o más reactivos para someter a ensayo la concentración de la proteína CA19-9. Los reactivos adecuados para este fin están fácilmente disponibles en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales anti-CA19-9. En algunas realizaciones, pueden emplearse dos anticuerpos monoclonales anti-CA19-9, que se unen a diferentes epítopos de proteína en CA19-9. En tales casos, uno de los agentes de unión a CA19-9 puede ser igual que el agente de unión a CA19-9 proporcionado para someter a ensayo CA19-9DC-SIGN Uno de los dos agentes de unión a CA19-9 puede inmovilizarse sobre una superficie sólida o proporcionarse para su uso como agente de captura en formato de flujo lateral, mientras que el otro agente de unión a CA19-9 puede comprender un marcador detectable.
Opcionalmente, el kit también puede comprender un control para comparar con un valor medido de unión de CA19-9 a DC-SIGN. En algunas realizaciones, el control es un valor umbral para comparar con el valor medido.
En algunas variaciones dadas a conocer, se proporciona un kit para determinar el estado patológico del cáncer de próstata de un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer de próstata en dicho sujeto. En tales casos, el kit comprende un agente de unión a PSA, tal como un anticuerpo monoclonal anti-PSA o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y al menos una lectina, preferiblemente MGL, opcionalmente inmovilizada sobre una nanopartícula. O bien dicho agente de unión a PSA o bien dicha lectina comprende un marcador detectable o se ha inmovilizado sobre una superficie sólida, tal como una placa de microtitulación. En algunas variaciones adicionales, para dicha unión se usan el recubrimiento con estreptavidina de las placas y la biotinilación del anticuerpo. Las formas alternativas de lograr esto están fácilmente disponibles para un experto.
En algunas variaciones adicionales, un kit proporcionado para determinar el estado patológico del cáncer de próstata de un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer de próstata en dicho sujeto también puede comprender reactivos para someter a ensayo biomarcadores adicionales tales como PSA. Por consiguiente, en algunas variaciones, el kit puede comprender además uno o más reactivos para someter a ensayo la concentración de la proteína PSA. Los reactivos adecuados para este fin están fácilmente disponibles en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales anti-PSA y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas variaciones, pueden emplearse dos anticuerpos monoclonales anti-PSA, que se unen a diferentes epítopos de proteína en PSA. En tales casos, uno de los agentes de unión a PSA puede ser igual que el agente de unión a PSA proporcionado para someter a ensayo PSAMGL. Uno de los dos agentes de unión a PSA puede inmovilizarse sobre una superficie sólida o proporcionarse para su uso como agente de captura en formato de flujo lateral, mientras que el otro agente de unión a PSA puede comprender un marcador detectable.
Opcionalmente, el kit también puede comprender un control para comparar con un valor medido de unión de PSA a MGL. En algunas variaciones, el control es un valor umbral para comparar con el valor medido.
En algunas realizaciones adicionales o variaciones dadas a conocer, el kit también puede comprender un medio legible por ordenador que comprende instrucciones ejecutables por ordenador para realizar cualquier método de la presente invención o divulgación.
Además de los reactivos para someter a ensayo una muestra para determinar las combinaciones de biomarcadores expuestas anteriormente, el kit también puede comprender reactivos para someter a ensayo dichas muestras para determinar cualquier otro biomarcador, especialmente para uno o más biomarcadores asociados con cualquier enfermedad distinta del cáncer en cuestión, tal como otros cánceres. Por tanto, el kit puede usarse no solo para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer, sino también para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar, por ejemplo, otros cánceres, dependiendo de la especificidad y sensibilidad del uno o más de otros biomarcadores cuyas concentraciones van a someterse a ensayo.
Diversos detalles y realizaciones o variaciones del presente método también se aplican al presente kit, tal como entiende fácilmente un experto. Por tanto, en el presente documento no se repiten las propiedades y características de las nanopartículas adecuadas con respecto al kit.
También se da a conocer el uso de MGL y/o WGA, opcionalmente en cualquier combinación con DSL y/o Gal4, o el uso de cualquier composición, tal como una composición de nanopartículas que comprende las mismas, para determinar el estado de cáncer de mama en un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer de mama en un sujeto. Todos los detalles y pormenores dados a conocer con respecto al presente método y sus variaciones se aplican a los diversos usos de estos biomarcadores aunque los detalles y pormenores no se repitan en el presente documento.
También se da a conocer el uso de MBL, DC-SIGN y/o MGL, o el uso de cualquier composición, tal como una composición de nanopartículas que comprende las mismas, para determinar el estado de cáncer colorrectal en un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer colorrectal en un sujeto. Todos los detalles y pormenores dados a conocer con respecto al presente método y sus variaciones se aplican a los diversos usos de estos biomarcadores aunque los detalles y pormenores no se repitan en el presente documento.
También se proporciona el uso de DC-SIGN, o el uso de cualquier composición, tal como una composición de nanopartículas que comprende la misma, para determinar el estado de cáncer de páncreas en un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer de páncreas en un sujeto. Todos los detalles y pormenores dados a conocer con respecto al presente método y sus realizaciones se aplican a los diversos usos de estos biomarcadores aunque los detalles y pormenores no se repitan en el presente documento.
También se da a conocer el uso de MGL, o el uso de cualquier composición, tal como una composición de nanopartículas que comprende la misma, para determinar el estado de cáncer de próstata en un sujeto, o para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar el cáncer de próstata en un sujeto. Todos los detalles y pormenores dados a conocer con respecto al presente método y sus variaciones se aplican a los diversos usos de estos biomarcadores aunque los detalles y pormenores no se repitan en el presente documento.
También se proporcionan los usos de otras especies diversas de biomarcadores de unión a lectina y cualquier combinación de los mismos. Cualquier detalle y características de tales usos resultarán evidentes a partir de la divulgación anterior.
A un experto en la técnica le resultará obvio que, a medida que avanza la tecnología, el concento inventivo puede implementarse de varios modos. La invención y sus realizaciones no se limitan a los ejemplos descritos a continuación, sino que pueden variar dentro del alcance de las reivindicaciones.
Ejemplos
Cáncer de mama (parte de la divulgación)
Ejemplo 1: Materiales y métodos
Origen de CA15-3 y muestras clínicas
Se obtuvo CA15-3 canceroso procedente de una línea celular de cáncer de mama (BrCa) primario de Fujirebio Diagnostics, Suecia.
La Universidad de Tampere, Finlandia proporcionó todas las muestras clínicas, con los permisos y consentimientos informados apropiados según las directrices éticas del Distrito Hospitalario de Pirkanmaa. Las muestras clínicas incluyeron una cohorte de muestras de plasma longitudinales (n=199) de 45 pacientes con BrCa diferentes y muestras de suero/plasma de mujeres aparentemente sanas como controles (HC, n=31).
Anticuerpos anti-CA15-3
Se obtuvieron dos anticuerpos monoclonales anti-CA15-3 diferentes, concretamente Ma552 y Ma695, que detectan el núcleo proteico y el epítopo de hidrato de carbono sialilado del antígeno de MUC-1 (CA15-3), respectivamente, de Fujirebio Diagnostics, Suecia.
Para su uso como agentes de captura en fase sólida, los anticuerpos se biotinilaron durante 4 horas a temperatura ambiente (TA) con un exceso molar de 40 veces de isotiocianato de biotina usando un procedimiento convencional conocido en la técnica. Los anticuerpos biotinilados se purificaron con columnas de filtración en gel NAP-5 y NAP-10 (GE Healthcare, Schenectady, NY, EE. UU.) usando Tris-HCl 50 mmol/l (pH 7,75), que contenía NaCl 150 mmol/l y NaN30,5 g/l. Los anticuerpos marcados se estabilizaron con BSA 1 g/l (Bioreba, Nyon, Suiza) y se almacenaron a 4°C.
Lectinas
Se adquirió un panel de 15 lectinas vegetales de VECTOR lab y un panel de 13 lectinas humanas de RnD System.
Tabla 1. Lectinas empleadas en los presentes experimentos
Se inmovilizaron las lectinas sobre nanopartículas de poliestireno Fluoro-Max™ modificadas con carboxilo, monodispersas y dopadas con quelato de europio (97 nm de diámetro) que se obtuvieron de Thermo Scientific Seradyn Inc., Indianápolis, IN). Las nanopartículas empleadas producen una fluorescencia de larga duración equivalente a 30.000 iones quelados por partícula.
Los grupos amino primarios de las lectinas se acoplaron covalentemente a los grupos carboxilo activados de las nanopartículas usando un procedimiento descrito anteriormente con algunas modificaciones menores (Soukka et al., Anal. Chem. 2001, 73, 2254-2260). Las nanopartículas (1e1012 partículas) se suspendieron en tampón fosfato 10 mmol/l (pH 7,0), y sus superficies se activaron con N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida 0,75 mmol/l (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida 10 mmol/l (Sigma-Aldrich). Las concentraciones de lectinas en las reacciones de acoplamiento fueron de 0,625 mg/ml y las reacciones contenían NaCl 100 mmol/l. Las partículas activadas se mezclaron con las lectinas. Las reacciones de acoplamiento se incubaron durante 2 h a 23°C con agitación vigorosa. Se realizaron lavados finales y bloqueo de los grupos activos restantes en tampón basado en Tris (Tris 10 mmol/l, NaN30,5 g/l, pH 8,5), y los conjugados nanopartícula-lectina se almacenaron en el mismo tampón complementado con BSA 2 g/l a 4°C. Antes del primer uso, las partículas se mezclaron completamente, se sonicaron y se centrifugaron ligeramente (350 g, 5 min) para separar los agregados
no coloidales de la suspensión monodispersa.
Inmunoensayo de CA15-3 convencional
Se analizaron las concentraciones de CA15-3 en suero mediante ELISA usando el kit CanAg CA15-3 EIA (Fujirebio Diagnostics) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron el AcM de captura biotinilado (bioMa695) y el AcM indicador conjugado con HRP (Ma552) a pocillos de microtitulación recubiertos con estreptavidina (SAv) junto con muestras de calibrador y suero/plasma clínico de dilución 1:41. Después de 2 h de incubación, los pocillos se lavaron seis veces y se añadió sustrato TMB y se midió la densidad óptica a 450 nm después de añadir la disolución de parada. El principio básico de este inmunoensayo de CA15-3 convencional se ilustra en la figura 1A.
Ensayo de tipo sándwich de anticuerpo anti-CA15-3-nanopartículas-lectina
El tampón de ensayo RED, el tampón de lavado y las placas de microtitulación de baja fluorescencia recubiertas con estreptavidina usadas en estos experimentos se adquirieron de Kaivogen Oy, Turku, Finlandia.
Se inmovilizaron anticuerpos biotinilados en fase sólida (100 ng), concretamente bioMa695 o bioMa552, en pocillos de microtitulación recubiertos con estreptavidina en 40 |jl del tampón de ensayo. Después de 1 h de incubación a TA y agitación a 900 rpm, los pocillos se lavaron dos veces con la disolución de lavado y se usaron inmediatamente en los ensayos.
A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 j l de muestras diluidas (1:40 en tampón de ensayo) y se incubaron durante 1 h a TA con agitación. Se analizaron los antígenos CA15-3 capturados de ese modo en los pocillos mediante fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) usando nanopartículas-lectina marcadas con Eu3+ para detectar los epítopos de glicano de unión a lectina de CA15-3. Esto se llevó a cabo de la siguiente manera: se añadieron a cada pocillo 25 j l de tampón de ensayo que contenía 1e7 Eu3+-NP recubiertas con diversas lectinas, con CaCh 6 mM adicional para CLR (DC-SIGN, Mg L, MBL, MMR), y se incubaron durante 2 h a TA con agitación. Después de la incubación, los pocillos se lavaron 6 veces con el tampón de lavado. Se midió la fluorescencia resuelta en el tiempo para el europio (lex: 340 nm; lem: 615 nm) de pocillos secos utilizando el contador Victor3V 1420 Multilabel.
Ejemplo 2: Ensayo de tipo sándwich de anticuerpo anti-CA15-3-nanopartículas-lectina (parte de la divulgación)
En estos experimentos, se usaron 5, 10 o 100 U/ml de CA15-3 purificado de la línea celular de BrCa (Fujirebio Diagnostics) con enriquecimiento de TSA-BSA (Tris-azida sódica con BSA al 7,5%). El CA15-3 asociado con BrCa se capturó primero con anticuerpo anti-CA15-3 biotinilado o bien Ma552 o bien Ma695 en pocillos de microtitulación recubiertos con estreptavidina. Se usó un panel de lectinas vegetales o humanas recubiertas con NP dopadas con Eu como indicadores para examinar las lectinas que reconocen CA15-3 de BrCa, tal como se ilustra esquemáticamente en la figura 1B y se describe con más detalle en el ejemplo 1.
La lectina humana MGL y la lectina vegetal WGA mostraron una reactividad superior con el antígeno CA15-3 de BrCa entre las lectinas sometidas a prueba. La razón de señal con respecto a fondo (S/B) fue superior a 2 a una tasa de 5U/ml con ambas NP-lectina (figura 2). DSL y Gal-4 también mostraron unión a CA15-3 de BrCa, pero las razones S/B fueron más bajas que con WGA y MGL. Se obtuvieron resultados correspondientes independientemente de si se utilizó Ma552 o Ma695 como anticuerpo de captura.
Debido a su nivel significativamente alto de unión al antígeno CA15-3 de BrCa, se eligieron MGL-NP y WGA-NP para el desarrollo y la optimización del ensayo de CA15-3-lectina.
A continuación, se determinó la recuperación de CA15-3 derivado de BrCa en una matriz compleja, concretamente suero humano. Para este propósito, se enriqueció con de 5 a 100 U/ml de CA15-3 en paralelo en suero combinado de hombres sanos o en tampón TSA-BSA simple. Primero se capturó CA15-3 con AcM Ma552 o Ma695 biotinilado en placas de microtitulación con estreptavidina y, después del lavado, se rastreó finalmente con MGL-NP para ver la tasa de recuperación. Se logró una recuperación excelente (95-110%) con una sensibilidad analítica extrapolada de 1U/ml (figura 3). Los resultados indican que los componentes séricos inherentes no interfieren con el ensayo.
Se observó una recuperación y una sensibilidad analítica igualmente excelentes con WGA-NP (figura 4). En estos experimentos, se enriqueció con de 5 a 250 U/ml de CA15-3 derivado de BrCa en suero combinado de hombres sanos, se usó Ma552 biotinilado como anticuerpo de captura y se usaron WGA-NP como indicadores.
Para confirmar la exactitud de los resultados, se sometió a ensayo la reactividad cruzada de los anticuerpos usados en el ensayo de CA15-3MGL y en los ensayos de CA125MGL (figura 5). No se encontró reactividad cruzada con CA125 derivado del cáncer de ovario en el ensayo de CA15-3MGL, en el que se usó el AcM anti-CA15-3 como agente de captura (figuras 5A y 5B). Por otro lado, se observó determinada reactividad cruzada con el antígeno CA15-3 de BrCa en un ensayo de CA125MGL, en el que se usó el AcM anti-CA125 como anticuerpo de captura. Se
detectó una diferencia de 10 veces entre las concentraciones medidas de CA125 y CA15-3 (figura 5C).
Ejemplo 3: Análisis de muestras clínicas (parte de la divulgación)
Con el fin de someter a ensayo si los resultados obtenidos con el antígeno CA15-3 basado en la línea celular de cáncer de mama podrían traducirse al contexto clínico, se analizó una pequeña cohorte de muestras clínicas junto con el presente ensayo de NP-lectina y el inmunoensayo de CA15-3.
Análisis de diagramas de cajas
En las figuras 6A a 6C se muestran análisis de diagramas de caja de muestras clínicas de cáncer de mama (n=199 de 45 pacientes con cáncer de mama diferentes) y controles sanos (n=31) con respecto a su contenido de proteína CA15-3 (convencional) y el contenido de la glicoforma CA15-3MGL. Según los resultados, el IA de CA15-3 convencional detectó CA15-3 también en mujeres sanas. Se detectó una mediana de diferencia de 2 veces entre controles sanos y pacientes con cáncer de mama con el IA de CA15-3 convencional, mientras que con el presente ensayo de CA15-3 MGL se detectó una diferencia de >200 veces entre estos grupos clínicos (figura 6). Se obtuvieron resultados correspondientes independientemente de si se usó Ma552 o Ma695 como anticuerpo de captura. Sin embargo, cabe destacar que el 77% de los controles sanos (24/31) fueron indetectables (es decir, 0 U/ml) con el presente ensayo de CA15-3MGL cuando se usó Ma552 como anticuerpo de captura.
Se realizó otra serie de análisis de diagramas de cajas usando solo las primeras muestras de suero para cada paciente con cáncer de mama (n=45) y todas las muestras de control (n=31). En estos análisis, se detectó una mediana de diferencia de 2,8 veces entre controles sanos y pacientes con cáncer de mama con el IA de CA15-3 convencional, mientras que con el presente ensayo de CA15-3 MGL se detectó una diferencia de >400 veces entre estos grupos clínicos independientemente de que se usara Ma552 o Ma695 como anticuerpo de captura (figura 7).
El ensayo de CA15-3WGA también se sometió al análisis de diagrama de cajas. Por razones prácticas, en el análisis se usaron las primeras muestras de suero de solo 41 pacientes con cáncer de mama y solo 18 muestras de control. Los resultados indican claramente que CA15-3WGA puede usarse para distinguir pacientes con cáncer de mama de controles sanos de manera satisfactoria (figura 8).
Análisis de AUC y curva ROC
Se realizaron análisis de curvas ROC para discriminar el cáncer de mama de controles sanos con respecto a CA15-3, CA15-3MGL y CA15-3WGA. Las curvas ROC se muestran en las figuras 9 y 10, mientras que los valores de AUC obtenidos se resumen a continuación.
Tabla 2. Valores de AUC obtenidos a partir del análisis de ROC realizado para discriminar el cáncer de mama (n=45, 1a muestras de cada paciente) de controles sanos (n=31)
Tabla 3. Valores de AUC obtenidos a partir de análisis de ROC realizado para discriminar el cáncer de mama (n=41, 1a muestra de cada paciente) de controles sanos (n=18)
Según los resultados, ambos ensayos de CA15-3MGL y CA15-3WGA pudieron discriminar mejor entre pacientes con cáncer de mama y controles sanos que el inmunoensayo de CA15-3 convencional.
Evaluación de tasas de éxito
Se determinaron las tasas de éxito para los marcadores CA15-3 y CA15-3MGL con respecto a los casos de cáncer de mama (n = 45, la primera muestra secuencial de cada paciente). Cada muestra de suero se clasificó como negativa o positiva para cada marcador usando los siguientes valores de punto de corte: 25 Ul/ml para CA15-3 y 2 Ul/ml para CA15-3MGL.
Tabla 4. Distribución de muestras de suero de pacientes con cáncer de mama (n=45) basándose en la positividad o negatividad de su marcador
Estos resultados indican que en la cohorte clínica empleada, la tasa de éxito de CA15-3MGL para identificar correctamente a las pacientes con cáncer de mama como individuos afectados es superior (71,5%) en comparación con la del inmunoensayo de CA15-3 convencional (60%). El uso combinado de los ensayos mejoró la tasa de éxito hasta el 77%.
Correlaciones entre diferentes ensayos
Como se muestra en la figura 2, tanto MGL como WGA cuando se inmovilizan en nanopartículas con Eu (III) (ensayos de CA15-3MGL y CA15-3WGA, respectivamente) fueron capaces de reconocer CA15-3 asociado a BrCa. Sin embargo, los resultados no se correlacionaron bien cuando los ensayos se aplicaron en muestras clínicas (figura 11). Este resultado indica que el patrón de glicosilación de CA15-3 puede variar entre diferentes pacientes con cáncer de mama y que el someter a ensayo tanto CA15-3MGL como CA15-3WGA puede potenciar la sensibilidad al disminuir la tasa de falsos negativos.
Además, la correlación entre en ensayo de CA15-3MGL y el inmunoensayo (IA) de CA15-3 convencional parecía muy escasa (R2 = 0,26) en muestras clínicas de pacientes con BrCa (n=199) tal como se demuestra en la figura 12. Nuevamente, este resultado indica que cada uno de los ensayos detecta CA15-3 de manera diferente, pero pueden usarse para complementarse entre sí.
Además, el ensayo de CA15-3WGA el ensayo se correlacionó escasamente con el inmunoensayo de CA15-3 convencional (figura 13). Sin embargo, la correlación fue mejor que la correlación entre el ensayo de CA15-3MGL y el inmunoensayo de CA15-3 convencional.
Ejemplo 4. Análisis adicionales de muestras clínicas (parte de la divulgación)
Se analizó una cohorte de pacientes con cáncer de mama metastásico y controles sanos para CA15-3WGA y CA15-3MGL o bien inmovilizando las lectinas sobre nanopartículas detectables o bien mediante marcaje directo con quelato de Eu.
Ensayo de nanopartículas con Eu de CA15-3WGA y CA15-3MGL
Se generaron curvas ROC para ambas lectinas como biomarcadores basados en NP y ensayos de CA15-3 convencionales, usando muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama metastásico de referencia (n=54) y mujeres sanas como muestras de control (n=23). El AUC (área bajo la curva) de ambos ensayos de biomarcadores basados en lectina pareció ser superior al ensayo convencional (AUC=0,833), y mejor con CA125WGA (0,939) (figura 14). Por tanto, este nuevo concepto de nanopartículas de CA15-3-lectina (Mg L y WGA) puede aumentar sustancialmente la sensibilidad clínica sin afectar a la especificidad en comparación con los inmunoensayos de CA15-3 convencionales.
Ensayo basado en CA15-3 WGA-quelato de Eu
De las numerosas nanopartículas-lectina investigadas, las NP-lectina WGA vegetal y MGL humana recombinante mostraron meramente un buen potencial para la detección de las glicoformas de CA15-3 asociadas a la línea celular de BCa. Como el rendimiento del ensayo de NP de WGA fue superior al ensayo de NP de MGL y también debido a que WGA es una lectina vegetal y mucho más barata que MGL recombinante, la WGA se marcó directamente con quelatos de EU solubles. w Ga marcada directamente funcionó igual de bien que la nanopartícula de WGA (véanse las tablas a continuación).
Se conoce bien que las lectinas tienen poca afinidad. Por tanto, se usaron Eu-NP para aumentar su afinidad de unión a través del efecto de avidez. Sin embargo, al menos WGA funciona extremadamente bien con el marcaje de quelato de Eu (sin requerir una mejora de la afinidad). Sin limitarse a ninguna teoría, esto podría deberse a la buena afinidad de la propia WGA y también a que el epítopo de glucano reactivo con WGA (GlcNAc) puede estar presente en varias posiciones en CA15-3, siendo una glicoproteína grande de 200-1000 kDa. Por tanto, muchas moléculas de WGA-quelatos de Eu pueden unirse con un solo CA15-3, lo que da como resultado una sensibilidad cercana a la de W g A-NP.
Tabla 5. Razón de señal con respecto a fondo de NP de CA15-3 WGA y CA15-3 WGA-quelatos de Eu. Ambos ensayos parecen ser igualmente sensibles
Tabla 6. Señales de un conjunto de muestras de BrCa y muestras sanas como controles (HC) con NP de CA15-3 WGA y CA15-3 WGA-quelatos de Eu. La razón de BrCa y HC fueron muy similares en ambos ensayos
Se generaron curvas ROC para NP de CA15-3WGA, biomarcadores basados en CA15-3WGA-quelato de Eu y ensayos de CA15-3 convencionales, usando muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama metastásico de referencia (n=53) y mujeres sanas como muestras de control (n=20). El AUC (área bajo la curva) del ensayo de biomarcadores basados en WGA marcados o bien con nanopartículas o bien con quelatos de Eu fue superior al ensayo convencional (AUC = 0,826). El mejor rendimiento se obtuvo con CA15-3WGA basado en nanopartículas-Eu (0,926). Sin embargo, el AUC de CA15-3WGA basado en quelato de Eu (AUC=0,890) estuvo cerca del ensayo basado en nanopartículas (AUC=0,926) (figura 15).
Cáncer colorrectal
Ejemplo 5. Ensayos de nanopartículas-lectina de glicovariante de CEA para determinar cáncer colorrectal (parte de la divulgación)
Materiales y métodos
Muestras clínicas
Se adquirieron muestras de plasma con EDTA de pacientes con colitis (n = 14) y pacientes con cáncer colorrectal (n = 34) del biobanco Auria (Turku, Finlandia). De los pacientes con cáncer colorrectal (CRC), se tomaron 23 muestras con EDTA antes del tratamiento, se analizaron como una entidad y se compararon con muestras de plasma con EDTA de pacientes con colitis usando los ensayos de nanopartículas-lectina con glicovariante de CEA desarrollados y un inmunoensayo de CEA comercial (Fujirebio Diagnostics Ltd., Gotemburgo, Suecia). Se comparó plasma con EDTA de pacientes con CRC que tenían CEA <5 ng/ml (n=23) con voluntarios sanos (n=11) que tenían CEA en el mismo intervalo.
Materiales
Se adquirieron DC-sign humana (molécula de adhesión intercelular específica de células dendríticas 3 no asociada a integrina) fusionada con Fc de IgG1 humana (fragmento de la inmunoglobulina G1, cristalizable) y MBL humana (lectina de unión a manosa) de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, Minnesota, Estados Unidos). La MGL humana (lectina de tipo galactosa de macrófagos) era de Sino Biological, Inc. (Pekín, China). El AcM (anticuerpo monoclonal) anti-CEA 12-140-1 y una preparación de CEA se adquirieron de Fujirebio Diagnostics Ltd. (Goteborg, Suecia). El AcM anti-CEA T84.66 y una preparación de CEA fueron amables obsequios de Kjell Nustad en el Norwegian Radium Hospital (Oslo, Noruega). Se adquirió otra preparación de CEA de Hytest Ltd. (Turku, Suomi). Kaivogen Ltd. (Turku, Finlandia) fabricó especialmente placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina amarillas. El tampón de ensayo RED se adquirió de Kaivogen Ltd. El agitador de placas DELFIA, el lavador de placas DELFIA y el fluorómetro Victor™ se fabricaron por Wallac Oy (Turku, Finlandia). La disolución de ID-diluyente 1 con bromelaína era de DiaMed (Cressier FR, Suiza). Las columnas de intercambio de tampones NAP-5 y NAP-10 se adquirieron de GE Healthcare (Chicago, Illinois, Estados Unidos).
Fragmentación de captura
Para producir fragmentos de anticuerpo Fab2 de 12-140-1 (fragmento, unión a antígeno), se cambió el tampón del AcM 12-140-1 (1,15 mg) por NaCl al 0,9% usando una columna NAP-5 y se digirió incubando con ID-diluyente-1 (50 |jl por 1 mg de AcM ) durante dos horas en tampón de reacción (Tris-HCl 50 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, EDTA 3 mM) a 37°C. La digestión se detuvo añadiendo N-etilmaleimida (NEM) 0,2 M para una concentración final de NEM 0,02 M. Los fragmentos de anticuerpo Fab2 se purificaron usando purificación por afinidad con proteínas G.
Biotinilación
Los tampones de AcM anti-CEA fragmentados y completos se cambiaron por NaCl al 0,9%. Los anticuerpos se conjugaron con biotina mediante la adición de un exceso molar de 40 veces de BITC (isotiocianato de biotina) y 1/10 del volumen total de reacción del tampón Na2CO3500 mM (pH 9,8). La reacción se incubó durante cuatro horas a TA, lejos de la luz directa. Las mezclas se purificaron con dos rondas de intercambios de tampón por tampón TSA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,75, NaCl 150 mM, NaN3 al 0,05%) y se añadió a todas las mezclas BSA (albúmina de suero bovino) tratada con DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético) al 1%.
Preparación de manchas (spots) de Fab
2
de 12-140-1 biotinilado
Los fragmentos Fab2 de 12-140-1 biotinilado (30 jg/m l) se imprimieron en un formato de matriz de pocillos en placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina amarillas (Kaivogen, Finlandia) con un instrumento de microdispensación sin contacto Nano-Plotter (GeSiM, Alemania) usando los ajustes: 70% de humedad, pulso 50 js , tensión 90 V, retardo 250 js , frecuencia 100 Hz. El tampón de impresión contenía solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) con glicerol al 10% (v/v).
Ensayos de nanopartícula-lectina
Las lectinas se recubrieron sobre nanopartículas dopadas con europio tal como se describe en el ejemplo 1. Todos los ensayos se realizaron en placas de microtitulación de 96 pocillos amarillas recubiertas con estreptavidina. Se usaron triplicados en un volumen total de 25 j l por pocillo en todas las incubaciones de ensayo, que se realizaron a TA con agitación lenta. El patrón de CEA se preparó mezclando cantidades iguales de las tres preparaciones de CEA y diluyendo la mezcla hasta concentraciones de 200, 100, 50, 15, 5, 2 y 0 ng/ml en tampón TSA-BSA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,75, NaCl 150 mM, NaN3 al 0,05%, BSA al 0,1%). Se añadieron 50 ng por pocillo de los AcM 12 140-1 y T84.66, en tampón de ensayo RED y se inmovilizaron mediante incubación durante una hora para su uso como capturas en los ensayos de MBL y d C-SIGN, respectivamente. Se usó Fab2 de 12-140-1 biotinilado como manchas en placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina como captura en el ensayo de MGL humana. Las muestras y los patrones se diluyeron 5 veces en tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,75, CaCl2 175 mM, NaCl 350 mM, heparina 37,5 U/ml, DTPA 100 jM , Tween 40 al 0,01%, Y-globulina bovina 0,5 mg/ml, BSA 5 mg/ml) para ensayos de MBL y DC-SIGN y tampón B (Tris- HCl 50 mM, pH 7,75, CaCl2175 mM, NaCl 350 mM, IgG nativa de ratón 5 jg/ml, HBR-25 jg/ml, MAK-335 jg/ml, heparina 105 U/ml, DTPA 100 jM , Tween 40 al 0,01%, Y-globulina bovina 0,5 mg/ml de, BSA 5 mg/ml) para el ensayo de MGL humana. Después de lavar los pocillos dos veces, se añadieron las muestras y los patrones y se incubaron durante una hora. Las nanopartículas con lectina se diluyeron en tampón de ensayo RED con adición de CaCh 3 mM para ensayos de MBL y DC-SIGN y adición CaCl212 Mm para el ensayo de MGL humana. Las concentraciones de nanopartículas-lectina añadidas fueron 20*106, 15*106 y 35*106 partículas por pocillo para ensayos de MBL, DC-SIGN y MGL, respectivamente. Los pocillos se lavaron dos veces y se añadieron las disoluciones de nanopartículas. Las placas se incubaron durante dos horas y se lavaron seis veces. Se midió la fluorescencia resuelta en el tiempo del europio a una longitud de onda de 615 nm usando una longitud de onda de excitación de 340 nm. El ciclo de medición fue de 1000 js con un retardo de 400 js y un tiempo de ventana de medición de 400 js .
Resultados
Se comparó el plasma con EDTA de pacientes con CRC que tenían CEA <5 ng/ml con voluntarios sanos que tenían CEA en el mismo intervalo usando el inmunoensayo de CEA comercial y los ensayos de glicovariante de CEADC_Sign y CEAMGL (figura 16). Los pacientes con CRC y los controles sanos que tenían niveles equivalentes de CEA en plasma se detectaron diferencialmente con los ensayos de CEA glicovariante-lectina, con cantidad aumentada de glicoformas de CEA en el CRC. Siete de los controles sanos fueron indetectables con el ensayo de CEAMGL.
Se representaron gráficamente los valores de CEA convencionales de pacientes con colitis o CRC (figura 17). La prueba de la U de Mann-Whitney con un intervalo de confianza del 95% fue la prueba usada para determinar la significación estadística. Las diferencias entre los dos grupos en la figura 17A con todos los ensayos fueron significativas. Cuando se usó el inmunoensayo de CEA comercial, solo diez de los 23 pacientes con CRC (que tenían las muestras antes del tratamiento) tenían un valor de CEA en plasma por encima del intervalo de referencia de 5 ng/ml, y 13 pacientes con CRC dieron falsos negativos. Los ensayos de CEA glicovariante permitieron disminuir el número de falsos negativos a 6 con ensayos de CEAMBL y CEAMGL y a 8 con el ensayo de CEA DC-Sign.
Cuando el grupo de CRC se dividió en los subgrupos, los pacientes vivos (n=13) después del seguimiento y los
pacientes muertos (n=10) después del seguimiento (figura 17B), todos excepto las diferencias entre el grupo con colitis y el grupo “vivo” con ensayo de CEA convencional y de MGL siguieron siendo significativos.
Se calculó la ROC (características operativas del receptor) para todos los ensayos (figura 18). El AUC (valor del área bajo la curva) fue de 0,823 para el ensayo de CEA convencional. Las AUC del ensayo de MBL y un modelo de regresión que combina los valores de los tres ensayos de lectina fueron más altos que los del ensayo convencional, 0,837 y 0,848, respectivamente. Las AUC de los ensayos de MGL y DC-sign fueron más bajas que las del ensayo convencional, 0,758 y 0,817, respectivamente.
Entre las 32 lectinas sometidas a prueba, MBL, DC-SIGN y MGL mostraron la mayor reactividad para el antígeno CEA canceroso y bajos fondos en plasma con EDTA.
Mejora con ensayos de lectina-CEA en comparación con el inmunoensayo de CEA comercial
Los diferentes ensayos de CEA glicovariante (CEADC-Sign, CEAMGL o CEAMBL) pueden mejorar la especificidad del cáncer colorrectal del marcador tumoral CEA. Se detectaron de manera diferencial pacientes con CRC y controles sanos que tenían niveles de CEA en plasma en el intervalo normal con los ensayos de CEA glicovariante con lectina, con una cantidad aumentada de glicoformas de CEA en CRC. El número de falsos negativos disminuyó significativamente usando los ensayos de CEADC'Sign, CEAMGL o CEAMBL.
Cáncer de páncreas
Ejemplo 6. Ensayo de nanopartículas-lectina de glicovariante de CA19-9
Materiales y métodos
Muestras clínicas y muestras de control
Se recogió plasma con EDTA de 16 voluntarios jóvenes sanos en el Departamento de Biotecnología, Universidad de Turku, con los permisos y consentimientos informados apropiados. Se adquirieron muestras de plasma con EDTA de 11 muestras de control de pacientes diagnosticados con enfermedades gastrointestinales y en los que se midieron con frecuencia niveles elevados de CA19-9 de Auria Biobank (Turku, Finlandia). De estos controles, cinco pacientes fueron diagnosticados con fibrosis y cirrosis hepática, dos pacientes con hepatitis crónica, un paciente con enfermedad hepática alcohólica, tres pacientes se diagnosticaron con otras enfermedades del tracto biliar. Se adquirieron muestras adicionales de plasma con EDTA de 16 controles con un valor de CA19-9 >5 U/ml (intervalo de hasta 4852 U/ml) y sin incidencia de cáncer de ningún tipo, así como 10 muestras de pacientes con cáncer de páncreas de Auria Biobank. De los pacientes con cáncer de páncreas, ocho se clasificaron con adenocarcinoma, uno con carcinoma neuroendocrino y dos con carcinoma metastásico. Los 11 pacientes con enfermedades gastrointestinales y los 16 controles con CA19-9 >5 U/ml se consideraron controles benignos.
Materiales
Se adquirió el AcM anti-CA19-9 (anticuerpo monoclonal) c241 de Fujirebio Diagnostics Ltd. (Goteborg, Suecia). Se adquirió DC-sign humana (molécula de adhesión intercelular específica de células dendríticas-3 no asociada a integrina) fusionada con Fc de IgG1 humana (fragmento de inmunoglobulina G1, cristalizable) de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, Minnesota, Estados Unidos). Kaivogen Ltd. (Turku, Finlandia) fabricó especialmente placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina amarillas. El tampón de ensayo RED se adquirió de Kaivogen Ltd. El agitador de placas DELFIA, el lavador de placas DELFIA y el fluorómetro Victor™ se fabricaron por Wallac Oy (Turku, Finlandia).
Se combinó la misma cantidad de antígeno CA19-9 de Fujirebio Diagnostics Ltd. y HyTest Ltd. (Turku, Finlandia) y se usó como calibrador, y se realizaron diluciones de 1, 5, 10, 20, 50 100 U/ml en tampón Tris-solución salinaazida (Tris 50 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, NaN30,5 g/l, pH 7,7) que contenía BSA 5 g/l, y se usó por triplicado.
Métodos
El ensayo de nanopartículas-lectina de glicovariante de CA19-9 desarrollado se llevó a cabo en un formato de tipo sándwich de tres etapas, donde se usó un anticuerpo monoclonal anti-CA19-9 como captura y nanopartículas recubiertas de lectina como indicador. Todas las etapas posteriores se llevaron a cabo a temperatura ambiente y las incubaciones se realizaron con agitación lenta.
El anticuerpo monoclonal anti-CA19-9 c241 biotinilado (75 ng/pocillo), usado como anticuerpo de captura, se inmovilizó en pocillos recubiertos con estreptavidina en 25 |jl de tampón de ensayo RED durante una hora de incubación. Después de lavar dos veces, se añadieron 5 jL de muestra o calibrador y 20 jL de tampón de ensayo RED con adición de CaCb 50 mM, en tres repeticiones, y se incubó durante una hora. Los pocillos se lavaron dos
veces y se añadió DC-sign acoplado a nanopartículas teñidas con quelato de Eu (III) (1,0 * 107partículas/pocillo) en 30 |jl de tampón de ensayo RED con adición de CaCh 12,5 mM. Después de incubar las nanopartículas durante dos horas, se lavaron los pocillos seis veces y se midió la TRF de los bioconjugados de nanopartículas unidas directamente desde la superficie del pocillo.
Se usó un kit comercial de inmunoensayo de CA19-9 (Fujirebio Ldt) como método de referencia para comparar el ensayo de nanopartículas-lectina de glicovariante de CA19-9 desarrollado.
Resultados
Con el ensayo de nanopartículas-lectina de glicovariante de CA19-9, la mediana de concentración para pacientes con cáncer de páncreas fue de 20,8 U/ml (intervalo intercuartílico: 9,45, 38 U/ml), para pacientes benignos fue de 5,9 U/ml (intervalo intercuartílico: 2,6, 16,8 U/ml) y para voluntarios sanos fue de 4,9 U/ml (intervalo intercuartílico: 2,7, 6,8 U/ml). El ensayo de nanopartículas-lectina de glicovariante de CA19-9 mejoró la discriminación de pacientes con cáncer de páncreas de controles sanos (p = 0,0001) y controles benignos (p = 0,028) en comparación con el inmunoensayo de CA19-9 convencional, donde solo se observó una diferencia estadísticamente significativa límite entre pacientes con cáncer de páncreas y controles sanos (p=0,041) (figura 1). No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los pacientes con cáncer de páncreas y los controles benignos cuando se usó el inmunoensayo de CA19-9 convencional (p=0,105).
Además, solo tres de los diez pacientes con cáncer de páncreas tenían valores de CA19-9 por encima del punto de corte recomendado de 37 U/ml en el inmunoensayo de CA19-9 convencional, dando como resultado que el 70% (7/10) de los pacientes con cáncer de páncreas sometidos a prueba se determinara como falsos negativos. Mediante el uso del ensayo de nanopartículas-lectina con 'de glicovariante de CA19-9, con el punto de corte de 10 U/ml, ocho de los diez pacientes con cáncer de páncreas se determinaron correctamente como positivos, lo que mejoró significativamente la sensibilidad.
Entre las 27 lectinas sometidas a prueba, DC-SIGN demostró una de las reactividades más altas para el antígeno canceroso CA19-9 y un buen rendimiento cuando se usó plasma o suero con EDTA.
Mejora con el ensayo de nanopartículas-lectina de glicovariante de CA19-9
El ensayo de nanopartículas-lectina de glicovariante de CA19-9 mejoró la discriminación de pacientes con cáncer de páncreas de controles sanos y controles benignos, pacientes que tienen enfermedad benigna del hígado o el tracto biliar, en comparación con el inmunoensayo de CA19-9 convencional. Además, el ensayo de glicovariante de CA19-9 disminuyó el número de falsos negativos, mejorando significativamente la sensibilidad.
Cáncer de próstata
Ejemplo 7. Ensayos de nanopartículas-lectina de glicovariante de PSA (parte de la divulgación)
Reactivos e instrumentación
Se obtuvo el PSA de plasma seminal de donantes sanos del Departamento de Química Clínica del Hospital Universitario de Lund (Malmo, Suecia) con los permisos y consentimientos informados apropiados. El PSA purificado de la línea celular de cáncer de próstata, LNCaP, procedía del Departamento de Biotecnología, Universidad de Turku. La MGL humana (lectina de tipo galactosa de macrófagos) era de Sino Biological, Inc. (Pekín, China). La WGA (aglutinina de germen de trigo) no conjugada procedía de Vector Laboratories, Peterborough, Reino Unido. Gal4 humana recombinante (Galectina 4) y Dectin 2 eran de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, Minnesota, Estados Unidos). Los pocillos de microtitulación recubiertos con estreptavidina, el concentrado de tampón de lavado y el tampón de ensayo RED se adquirieron de Kaivogen Ltd (Turku, Finlandia). El agitador de placas DELFIA, el lavador de placas DELFIA y el fluorómetro Victor™ se fabricaron por Wallac Oy (Turku, Finlandia).
Se usó PSA de LNCaP como calibrador y se realizaron diluciones (1-200 jg /l de PSA de LNCaP) en tampón Trissolución salina-azida (Tris 50 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, NaN30,5 g/l, pH 7,7) que contenía BSA 5 g/l, y se usó por triplicado.
Muestras clínicas y muestras de control
Se obtuvieron muestras de tejido de próstata de 36 pacientes con PCa (12 histológicamente benignos y 24 cancerosos, clasificados como Gleason 2-4) a partir de prostatectomías radicales (PR) inmediatamente después de la cirugía del Hospital Universitario de Turku, Finlandia. Los tejidos de muestra se almacenaron a -20°C en 1 ml de tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con inhibidores de proteasa añadidos (comprimidos cOmplete Roche Diagnostics, Manheim, Alemania) hasta su procesamiento adicional. El conjunto de proteínas se recuperó usando el detergente Triton-X-100 de Acros Organics, ThermoFischer Scientific (Geel, Bélgica)
añadiendo 1/10 del volumen de muestra de tampón de lisis PBS 10x (pH 7,4, con inhibidores de proteasa añadidos, EDTA 20 mM, Tritón-X-100 al 10%). La lisis se realizó en hielo con agitación lenta durante dos horas y el sobrenadante se almacenó a -20°C. Para el análisis de cada muestra se realizó una dilución 1:10 en tampón Trissolución salina-azida con BSA 5 g/l.
Las muestras de orina se obtuvieron del Hospital Universitario de Turku. La cohorte de estudio incluyó 143 hombres consecutivos con sospecha clínica de cáncer de próstata (PCa), incluidos en un ensayo IMPROD prospectivo y registrado (identificador de ClinicalTri-als.gov NCT01864135). Se obtuvo plasma con EDTA de 45 hombres registrados en el ensayo IMPROD. Se recogieron muestras de orina de 11 hombres voluntarios (menores de 35 años) en el Departamento de Biotecnología, Universidad de Turku.
Métodos
Preparación de manchas de Fab de 5A10 biotinilado
El fragmento Fab de 5A10 biotinilado (100 |jg/ml) se imprimió en un formato de matriz de pocillos en placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina amarillas (Kaivogen, Finlandia) con un instrumento de microdispensación sin contacto Nano-Plotter (GeSiM, Alemania) usando los ajustes: 70% humedad, pulso 50 js , tensión 90 V, retardo 250 js , frecuencia 100 Hz. El tampón de impresión contenía solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) con glicerol al 10% (v/v).
Ensayos de nanopartículas-lectina para determinar lisados tisulares
El ensayo de nanopartículas-lectina de la glicovariante de PSAMGL desarrollado se realizó en un formato de tipo sándwich de tres etapas y todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente, con agitación lenta. El fragmento Fab de 5A10 recombinante específico de PSA libre biotinilado (150 ng/pocillo), usado como anticuerpo de captura, se inmovilizó en pocillos recubiertos con estreptavidina en 100 j l de tampón de ensayo Red durante una hora de incubación. Después de lavar dos veces, se añadieron 50 j l de dilución de lisado tisular o calibrador y 50 j l de tampón de ensayo Red con adición de IgG nativa de ratón 5 jg/ml, HBR-25 jg/ml, MAK-335 jg/ml, por triplicado, y se incubó durante una hora. Los pocillos se lavaron dos veces y se añadió MGL acoplado a nanopartículas teñidas con quelato de Eu (III) (2,0 * 107partículas/pocillo) en 100 j l de tampón de ensayo RED con adición de CaCh 3 mM. Después de incubar las nanopartículas durante dos horas, los pocillos se lavaron seis veces y se midió directamente la fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) de los bioconjugados de nanopartículas unidas desde la superficie del pocillo.
Se estudió el PSA secretado por las células LNCaP y el PSA de plasma seminal de donantes sanos usando el ensayo de nanopartículas-lectina de glicovariante de PSAMGL. La fluorescencia de diferentes formas de PSA en un intervalo de concentración de 1-180 ng/ml se muestra en la figura 20. El ensayo se realizó como para los lisados tisulares, excepto en la incubación de la muestra en que se usaron 25 j l de diferentes concentraciones de PSA y 75 j l de tampón de ensayo RED.
Ensayos de nanopartículas-lectina para muestras de orina y plasma con EDTA
Se usó Fab de 5A10 biotinilado (100 jg/m l) depositado en manchas sobre placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina como captura en el ensayo de glicovariante de fPSAMGL. Se añadieron Fab de 5A10 biotinilado (80 ng/pocillo) para los ensayos de fPSADectin2 y fPSAWGA y el AcM H117 (120 ng/pocillo) para el ensayo de PSAGal4 total se añadieron en tampón de ensayo RED a placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina y se incubaron durante una hora.
Después de lavar dos veces, se añadieron 20 j l de muestra o calibrador y 30 j l de tampón de ensayo RED con IgG nativa de ratón 5 jg/ml, HBR-2 5 jg/ml, MAK-33 5 jg/m l para el ensayo de fPSAMGL; para todos los demás ensayos se usaron 10 j l de muestra o calibrador y 40 j l de tampón de ensayo. Las muestras y los calibradores se agregaron por triplicado y se incubaron durante 1 hora. Las nanopartículas-lectina se diluyeron en tampón de ensayo RED con CaCh 6 mM. Después de lavar dos veces, las concentraciones de nanopartículas-lectina añadidas fueron 7*106, 4*107, 5*106 y 2*107 partículas por pocillo para los ensayos de fPSAMGL, fPSADectin2, fPSAWGA y PSAGal4 total, respectivamente. Las placas se incubaron durante dos horas, se lavaron seis veces y se midió la TRF.
Resultados
El PSA en plasma seminal de donantes sanos y el PSA derivado de la línea celular de cáncer de próstata, LNCaP, se detectaron diferencialmente con el ensayo de glicovariante de PSAMGL desarrollado, ya que el ensayo solo detectaba el PSA canceroso (figura 20).
Se estudió el PSA de 12 lisados tisulares de próstata benignos y 24 cancerosos usando el inmunoensayo de lectina basado en nanopartículas fPSAMGL en un formato de pocillo completo. El tejido tumoral mostró un aumento
estadísticamente significativo (p=0,002) en la glicovariante de PSAMGL en comparación con el tejido benigno de pacientes con PCa (figura 21). Todas las muestras de tejido benigno procedían de pacientes con PCa, pero tenían un aspecto microscópico de tejido prostético normal y, lo más probablemente, ya podría haberse producido una glicosilación alterada en el PSA en el tejido benigno, dando como resultado señales de fluorescencia medibles con el ensayo de glicovariante de fPSAMGL.
Se analizaron muestras de orina de 143 hombres con sospecha clínica de PCa en un ensayo prospectivo controlado (IMPROD, NCT01864135) con el ensayo de glicovariante de fPSAMGL, con Fab de 5A l0 de captura depositado en manchas sobre placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina. De los 143 hombres, 74 fueron diagnosticados con PCa clínicamente significativo (puntuación de Gleason >7), 20 hombres con que tenían de Gleason 6 se clasificaron con PCa y 49 con una biopsia de próstata negativa (denominado biopsia negativa). Además, se incluyó la orina de 11 hombres jóvenes sanos. Las señales de fluorescencia corregidas para PSA totales del ensayo de glicovariante de PSAMGL procedente de PSA en orina se presenta en la figura 22. Hubo un aumento estadísticamente significativo (p = 0,006) en la mediana de las concentraciones de la glicovariante de PSA en orina en hombres con PCa clínicamente significativo en comparación con los hombres que tenían una biopsia de PCa negativa o un PCa con una puntuación de Gleason de 6. El contenido de glicovariante de PSA en orina parecía estar más elevado en los cánceres de próstata con puntuación de Gleason de 9 más agresivos. El PSA en orina de hombres jóvenes no se detectó usando el ensayo de glicovariante de fPSAMGL, aunque las concentraciones de PSA en orina estaban en el mismo intervalo para todos los grupos sometidos a prueba. En la tabla 7 se presentan las concentraciones de PSA en orina para pacientes que tenían un PCa clínicamente significativo, la biopsia de próstata negativa o un PCa con Gleason 6 y hombres jóvenes sanos.
En la figura 23 se presentan ensayos de glicovariante de PSA adicionales que tienen potencial para mejorar adicionalmente la discriminación de cánceres de próstata clínicamente significativos. El plasma con EDTA de hombres con PCa confirmado o con sospecha de cáncer de próstata, pero con una biopsia negativa se comparó con el de hombres sanos. Los ensayos de las glicovariantes PSAWGA, PSAGal4 y PSADectin2 mostraron un aumento en la mediana del contenido de glicovariantes de PSA en hombres con PCa clínicamente significativo.
Entre las 30 lectinas sometidas a prueba, MGL demostró una capacidad superior para discriminar entre el antígeno PSA canceroso y no canceroso.
Tabla 1. Concentraciones de PSA en orina (|jg/l) para hombres con PCa; hombres que tienen biopsia negativa y hombres jóvenes
Mejora con el ensayo de glicovariante de fPSAMGL
El ensayo de glicovariante de fPSAMGL puede mejorar la especificidad de cáncer de PSA y ayudar a discriminar pacientes con PCa clínicamente significativo, ya que el ensayo detecta glicoformas de PSA presentes en el tejido con cáncer de próstata y la orina de pacientes con PCa. El pSa en orina de hombres jóvenes, incluso cuando está en altas concentraciones, es indetectable con el ensayo de glicovariante de fPSAMGL. El uso de muestras de orina en lugar de muestras de sangre tiene la ventaja de no ser invasivo y no hay necesidad de personal para la toma de muestras. Los inmunoensayos convencionales de PSA total o libre incapaces de diferenciar el intervalo de concentración de PSA son idénticos en hombres jóvenes, pacientes con PCa y hombres con biopsia de PCa negativa.
Dado que el ensayo de glicovariante de PSAMGL es adecuado para lisados tisulares y muestras de orina, puede aplicarse a muestras de suero, tal como se ha demostrado con los otros marcadores tumorales.
Claims (16)
- REIVINDICACIONESi . Método de determinación del estado patológico del cáncer de páncreas en un sujeto, comprendiendo dicho método:someter a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar el nivel de una glicoforma de CA19-9 que se une a DC-SIGN mediante la determinación de la unión de CA19-9 a DC-SIGN, comparar el nivel detectado de dicha glicoforma de CA19-9 de unión a lectina en dicha muestra con el de una muestra de control o un valor umbral predeterminado, ydeterminar el estado patológico del cáncer de páncreas en dicho sujeto basándose en dicha comparación.
- 2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho método comprende ademássometer a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para el antígeno de proteína CA19-9, y comparar el nivel detectado de dicho uno o más biomarcadores en dicha muestra con el de una muestra de control o un valor umbral predeterminado.
- 3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que el nivel aumentado de dicha glicoforma o dicho biomarcador en dicha muestra en comparación con el de una muestra de control o un valor umbral predeterminado indica que dicho sujeto tiene o está en riesgo de tener dicho cáncer.
- 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para examinar, diagnosticar, pronosticar o monitorizar dicho cáncer.
- 5. Método según la reivindicación 4, en el que dicha monitorización es para monitorizar la aparición de dicho cáncer, para monitorizar cualquier cambio en el riesgo de tener o desarrollar dicho cáncer, para monitorizar la respuesta al tratamiento, para monitorizar la recidiva de dicho cáncer, o para monitorizar la recaída de dicho cáncer.
- 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que someter a ensayo para determinar el nivel de dicha una o más glicofomas de unión a lectina de un biomarcador se lleva a cabo mediante un ensayo de unión que comprende:someter dicha muestra a un anticuerpo específico para dicho biomarcador con el fin de capturar el biomarcador contenido en la muestra,someter dicho biomarcador capturado a una o más lectinas, ymedir el nivel de unión de dicho biomarcador capturado a dicha una o más lectinas con la ayuda de una señal detectable.
- 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que someter a ensayo para determinar el nivel de dicha una o más glicofomas de unión a lectina de un biomarcador se lleva a cabo mediante un ensayo de unión que comprende:someter dicha muestra a una o más lectinas con el fin de capturar una o más glicofomas de unión a lectina de dicho biomarcador contenido en la muestra,someter dicho biomarcador capturado a un anticuerpo específico para el biomarcador, ymedir el nivel de unión de dicho biomarcador capturado a un anticuerpo específico para el biomarcador con la ayuda de una señal detectable.
- 8. Método según la reivindicación 6 o 7, en el que o bien dicha lectina o bien dicho anticuerpo se inmoviliza en una nanopartícula.
- 9. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en muestras de orina, sangre, suero, plasma, líquido de la cavidad peritoneal y tejido.
- 10. Kit para su uso en el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende:un agente de unión a CA19-9 y DC-SIGN,en el que o bien dicho agente de unión a CA19-9 o bien dicho DC-SIGN comprende un marcador detectable.
- 11. Kit según la reivindicación 10, que comprende además una o más lectinas seleccionadas del grupo que consiste en SBA, SNA, PNA, MAA II, AAL, UEA, PHA-E, RCA, WGA, WFA, PSA, WL, TJA-II, DSL, HPA, MGL, DC-SIGN, MMR, MBL, Siglec-2, Siglec-3, Siglec-5, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Galectina-3, Galectina-4, E-selectina, DSL y Gal4.
- 12. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en el que dicha lectina está inmovilizada en una nanopartícula.
- 13. Método según la reivindicación 8 o kit según la reivindicación 12, en el que todas las dimensiones de dicha nanopartícula son menores de aproximadamente 1000 nm, aproximadamente 500 nm o menos, aproximadamente 100 nm o menos, o aproximadamente 50 nm o menos, yopcionalmente, en el que dicha nanopartícula se selecciona del grupo que consiste en nanopartículas de proteína, nanopartículas minerales, nanopartículas de vidrio, cristales de nanopartícula, nanopartículas de metal, nanopartículas de plástico, nanopartículas de poliestireno, nanopartículas de polietilenglicol, nanopartículas de polietileno, nanopartículas de poli(ácido acrílico), nanopartículas poli(metacrilato de metilo), nanopartículas de polisacárido, nanopartículas de oro coloidal, nanopartículas de plata, puntos cuánticos, nanopartículas de carbono, nanopartículas de sílice porosa, y liposomas, y/u opcionalmente, en el que dicha nanopartícula está dopada con un quelato de lantánido, tal como europio(III).
- 14. Uso de DC-SIGN para determinar el estado patológico del cáncer de páncreas en un sujeto sometiendo a ensayo una muestra obtenida de dicho sujeto para determinar el nivel de la glicoforma de CA19-9 que se une a DC-SIGN.
- 15. Uso según la reivindicación 14, en el que la lectina se inmoviliza en una nanopartícula o se marca con un marcador detectable.
- 16. Uso según la reivindicación 14 o 15 para examinar, diagnosticar, pronosticar y/o monitorizar dicho cáncer en un sujeto.
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