JP7628702B2 - がん検出方法、がん検査方法、及びこれらに用いるキット - Google Patents

Description

本発明は、がん検出方法、がん検査方法、及びこれらに用いるキットに関し、より詳しくは、前立腺がんを検出する方法、及び前立腺がんを検査する方法、並びに、これらの方法に用いるキットに関する。

腫瘍マーカー等のバイオマーカーは、悪性腫瘍等の疾患の検出や、治療方針決定の指針、治療効果判定のためのモニタリングマーカーとして有用であり、近年盛んに研究されている。このようなバイオマーカーとしては、例えば、ＣＥＡ（癌胎児性抗原：Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）が挙げられる。ＣＥＡは、１９６５年にＧｏｌｄ Ｐ．とＦｒｅｅｄｍａｎ Ｓ．Ｏ．とによってヒト大腸癌組織抽出液から見出された、分子量約２０万の糖タンパク質であり、ＣＤ６６ｅ又はＣＥＡＣＡＭ５としても知られている。ＣＥＡのタンパク質部分は約７００個のアミノ酸よりなる１本鎖のポリペプチドであり、１分子のＣＥＡには２８箇所のＮ型糖鎖修飾部位があり、その大部分に複合型糖鎖が結合して５０％以上の糖鎖を含むことが報告されている（非特許文献１）。ＣＥＡは、健常者（がんに罹患していない者の意、以下同じ）においても血中に検出されるが、消化器がん、特に大腸がん、膵がん、胃がん等のがん患者においてはその濃度が上昇することが知られており、また、肺がん、子宮がん、卵巣がん、胎児性癌がん等でも血中の濃度が高値を示す例が報告されている。

そのため、ＣＥＡは、これらのがんの検出や、治療方針決定の指針、治療効果判定のためのモニタリングマーカーとして従来から用いられており、例えば、固相化した抗ＣＥＡ抗体（捕捉体）で試料中に存在するＣＥＡを捕捉し、そこに標識化した抗ＣＥＡ抗体（標識体）を結合させるサンドイッチ法で試料中のＣＥＡを測定するためのキットとして、「ルミパルスプレスト（登録商標）ＣＥＡ」が富士レビオ株式会社によって製造販売されている。

また、前立腺がんの検出や、治療方針決定の指針、治療効果判定には、例えば、従来から血中のＰＳＡ（前立腺特異抗原：Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）量が指標として用いられている。さらに、前立腺がん患者のＰＳＡにおいては、健常者に比べてＧａｌＮＡｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン）が有意に増加することが報告されている（非特許文献２等）。また、例えば、特許文献１には、試料中の遊離型ＰＳＡ量と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα２、３結合した糖鎖（α２－３シアル酸）を有するＰＳＡ量との比率から前立腺がんを判定する方法が記載されている。しかしながら、ＰＳＡ量は前立腺がん患者のみならず前立腺肥大患者においても上昇することから、低濃度帯にカットオフ値を設定した場合には、前立腺がんの的中率が低くなる傾向にあることが課題となっている。また、ホルモン治療等によってＰＳＡ量が上昇しなくなった前立腺がん患者においては、これをモニタリングマーカーとして採用することができないという課題もあった。

国際公開第２０１９／２２１２７９号

山下克子ら，日本分子腫瘍マーカー研究会誌，１９巻，２００３年，ｐ．１－２ Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０年，ｖｏｌ．２０，ｎｏ．４，ｐ．４５２－４６０

上記のように、ＣＥＡにおける糖鎖の含有率は５０％にも達するものの、その糖鎖構造は未だ十分に明らかになっておらず、これらの糖鎖には、がん検出のための新たなバイオマーカーとしての可能性が期待される。

また、上記のようにＣＥＡは健常者の血中においても少量は検出されるため、従来のＣＥＡを測定する方法では、通常カットオフ値を設定し、それを指標に上記のがん等の陰性及び陽性の予測又は判別を行う。しかしながら、かかる従来のＣＥＡを測定する方法では、抗ＣＥＡ抗体の１種のみを用いるため、がん種ごとの特異性が未だ十分ではない。さらに、前立腺がん患者において、ＣＥＡの測定値が前立腺がんの罹患を原因として上昇することは稀であり、従来のＣＥＡを測定する方法によっては、前立腺がん患者と健常者又は前立腺肥大患者とをより高精度で判別するためには不十分であることを本発明者らは見出した。

本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、新たなバイオマーカーを指標とした、高精度で前立腺がんを特異的に検出可能ながん検出方法及びがん検査方法、並びに、これらの方法に用いるキットを提供することを目的とする。

本発明者らは、既存抗体では測定できなかった新たな腫瘍マーカーとしての糖鎖の探索を目的として、抗ＣＥＡ抗体に加えて、水溶性高分子からなる水溶性担体と前記水溶性担体に固定された標識物質及びレクチンとを備える複合体（ブロック化標識レクチン）も用いてスクリーニングを行った。その結果、レクチンとしてＭＡＭを用いた場合に検出される分子の量、すなわち、レクチン結合性糖鎖であるα２－３シアル酸が付加したＣＥＡ（α２－３シアル酸付加ＣＥＡ）の量が、健常者に比べて、前立腺がん患者で有意に増加することを見出した。そのためα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定することにより、前立腺がんを特異的に検出し、かつ、前立腺がん患者と健常者又は前立腺肥大患者とを、抗ＣＥＡ抗体のみでＣＥＡを測定した場合よりもさらに高精度で判別することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。

かかる知見により得られた本発明の態様は次のとおりである。
［１］
前立腺がんを検出する方法であり、試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定する測定工程を含むことを特徴とする、方法。
［２］
前立腺がんを検査する方法であり、被検者由来の試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定する測定工程を含むことを特徴とする、方法。
［３］
前立腺がんであると予測される被検者をスクリ－ニングする方法であり、被検者由来の試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定する測定工程と、測定されたα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を指標として被検者を選別する選別工程と、を含むことを特徴とする、［２］に記載の方法。
［４］
α２－３シアル酸付加ＣＥＡにおいて、α２－３シアル酸がＭＡＭに結合するＭＡＭ結合型糖鎖であることを特徴とする、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［５］
前記測定工程が、前記試料と、ＣＥＡに特異的に結合可能な第１のプローブ分子及びα２－３シアル酸に特異的に結合可能な第２のプローブ分子と、を接触させる工程であることを特徴とする、［１］～［４］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［６］
第１のプローブ分子が、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗体であることを特徴とする、［５］に記載の方法。
［７］
第２のプローブ分子が、α２－３シアル酸に特異的に結合可能なレクチンであることを特徴とする、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］
前記測定工程が、前記試料と、捕捉体及び標識体と、を接触させる工程であり、
前記捕捉体が、非水溶性担体と、前記非水溶性担体に固定された第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちのいずれか一方と、を備えるものであり、かつ、
前記標識体が、標識物質と、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちの他方と、を備えるものである、
ことを特徴とする、［５］～［７］のうちのいずれか一項に記載の方法。
［９］
前記捕捉体が、非水溶性担体と、前記非水溶性担体に固定された第１のプローブ分子と、を備えるものであり、かつ、
前記標識体が、水溶性担体と、前記水溶性担体に固定された標識物質及び第２のプローブ分子と、を備え、第２のプローブ分子がα２－３シアル酸に特異的に結合可能なレクチンであるブロック化標識レクチンである、
ことを特徴とする、［８］に記載の方法。
［１０］
［５］～［９］のうちのいずれか一項に記載の方法に用いるためのキットであり、ＣＥＡに特異的に結合可能な第１のプローブ分子と、α２－３シアル酸に特異的に結合可能な第２のプローブ分子と、を備えることを特徴とする、キット。
［１１］
第１のプローブ分子が、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗体であることを特徴とする、［１０］に記載のキット。
［１２］
第２のプローブ分子が、α２－３シアル酸に特異的に結合可能なレクチンであることを特徴とする、［１０］又は［１１］に記載のキット。
［１３］
非水溶性担体と、前記非水溶性担体に固定された第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちのいずれか一方と、を備える捕捉体、並びに、
標識物質と、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちの他方と、を備える標識体、
を備えることを特徴とする、［１０］～［１２］のうちのいずれか一項に記載のキット。
［１４］
前記捕捉体が、非水溶性担体と、前記非水溶性担体に固定された第１のプローブ分子と、を備えるものであり、かつ、
前記標識体が、水溶性担体と、前記水溶性担体に固定された標識物質及び第２のプローブ分子と、を備え、第２のプローブ分子がα２－３シアル酸に特異的に結合可能なレクチンであるブロック化標識レクチンである、
ことを特徴とする、［１３］に記載のキット。

本発明によれば、新たなバイオマーカーを指標とした、高精度で前立腺がんを特異的に検出可能ながん検出方法及びがん検査方法、並びに、これらの方法に用いるキットを提供することが可能となる。

健常人群及び前立腺癌群のＣＥＡの測定結果を示すグラフである。 健常人群及び前立腺癌群のＣＥＡ／ＭＡＭの測定結果を示すグラフである。 前立腺肥大群及び前立腺癌群のＣＥＡの測定結果を示すグラフである。 前立腺肥大群及び前立腺癌群のＣＥＡ／ＭＡＭの測定結果を示すグラフである。 ＣＥＡの測定値とＣＥＡ／ＭＡＭの測定値との関係を示すグラフである。 ＰＳＡの測定値とＣＥＡ／ＭＡＭの測定値との関係を示すグラフである。 健常人群及び前立腺癌群のＣＥＡ／ＷＦＡの測定結果を示すグラフである。

以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。

＜がん検出方法、がん検査方法＞
本発明のがん検出方法は、前立腺がんを検出する方法であり、試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定する測定工程を含む方法である。また、本発明のがん検査方法は、前立腺がんを検査する方法であり、被検者由来の試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定する測定工程を含む方法である。

［がん］
本発明において、「がん」には、上皮性の悪性腫瘍（癌）及び非上皮性の悪性腫瘍（肉腫）が含まれる。本発明の方法において検出又は検査の対象となるがんは、前立腺がんである。本発明に係る前立腺がんとは、前立腺に発生するがんを示し、例えば、前立腺癌、前立腺小細胞癌、前立腺導管癌、前立腺肉腫、前立腺扁平上皮癌、前立腺腺扁平上皮癌、前立腺基底細胞癌、前立腺粘液癌、前立腺印環細胞癌が挙げられる。これらの中でも、本発明に係る前立腺がんとしては、前立腺癌が好ましい。

［α２－３シアル酸付加ＣＥＡ］
本発明において、「α２－３シアル酸付加ＣＥＡ」とは、糖鎖であるα２－３シアル酸（α２，３結合型シアル酸）が結合して付加されており、これを含むＣＥＡ分子のことをいい、「α２－３シアル酸含有ＣＥＡ」ともいう。本発明において、「ＣＥＡ」とは、糖タンパク質である癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）のことを示す。ＣＥＡは、細胞接着、増殖、分化、腫瘍抑制等の様々なプロセスに関与するＣＥＡＣＡＭ（癌胎児性抗原関連接着分子）ファミリーを構成する分子の一つであり、「ＣＤ６６ｅ」又は「ＣＥＡＣＡＭ５（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ５）」としても知られるが、本明細書中では、ＣＤ６６ｅ又はＣＥＡＣＡＭ５とＣＥＡとを同義で用いる。ＣＥＡは、典型的には、約７００個のアミノ酸よりなる１本鎖のポリペプチドであるタンパク質部分と、それに結合した複数の糖鎖からなる糖鎖部分とからなる。

本発明に係るα２－３シアル酸付加ＣＥＡは、前記糖鎖部分として少なくともα２－３シアル酸を含む。本発明において、「α２－３シアル酸」とは、単糖であるガラクトース（Ｇａｌ）の３位炭素に、シアル酸の２位炭素がグリコシド結合した糖鎖（シアル酸α２－３Ｇａｌ）を示す。１分子のα２－３シアル酸付加ＣＥＡにおいて、α２－３シアル酸は複数存在していてよく、ＣＥＡのタンパク質部分とα２－３シアル酸とは直接結合していても、他の糖鎖を介して結合していてもよい。本発明に係るα２－３シアル酸付加ＣＥＡとしては、α２－３シアル酸を、ＭＡＭに結合するＭＡＭ結合型糖鎖として含んでいることが好ましく、末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα２、３結合した糖鎖（シアル酸α２－３Ｇａｌ）として含んでいることがより好ましく、ＣＥＡのタンパク質部分のアミド部分にＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がβ結合したＮ型糖鎖修飾部位の末端α２－３シアル酸（シアル酸α２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）として含んでいることがより好ましい。

このようなα２－３シアル酸付加ＣＥＡの平均質量（ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）によるマーカーでの検量による平均質量、以下同じ）としては、特に限定されないが、１００，０００～３００，０００Ｄａであることが好ましく、１８０，０００～２００，０００Ｄａであることがより好ましい。また、１分子のα２－３シアル酸付加ＣＥＡにおける前記糖鎖部分の含有量としては、特に限定されないが、４０～６０質量％であることが好ましい。

［被検者］
本発明において、「被検者」とは、本発明のがん検査方法を行う対象を示し、好ましくは人である。本発明に係る被検者としては、スクリーニング等を目的とした、健常者であっても、前立腺がんに罹患しているが自覚症状のない者であってもよい。また、予後の決定、治療方針の決定、治療効果の確認、再発の確認等を目的とした、既に前記がんに罹患していることが既知の患者や過去に前記がんに罹患した患者であってもよい。また、本発明において、「健常者」とは、検査の対象となるがん（すなわち、前立腺がん）に罹患していない者を示す。なお、被検者が真に前立腺がんに罹患していることは、被検者から採取された前立腺組織の生検によって決定（確定診断）される。

［試料］
本発明のがん検出方法及びがん検査方法（本明細書中、場合により、これらを総称して単に「本発明の方法」という）に用いられる「試料」としては、α２－３シアル酸付加ＣＥＡが存在し得る試料である限り特に制限はない。一般的には、前記被検者等、がん検査の対象から採取された血清、血漿、及び全血等の血液検体；尿、痰、唾液、汗、髄液、消化液、精液、リンパ液、腹水等の血液以外の体液検体；口腔粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜等の粘膜検体；並びに各種生検検体等が挙げられる。また、前記試料としては、培養細胞や細胞培養液であってもよい。本発明に係る試料としては血液検体が好ましく、血清（「血清検体」ともいう）がより好ましい。

これらの試料は、必要に応じて希釈液で希釈又は懸濁したものであっても、適宜前処理が施されたものであってもよい。前記希釈液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液等の緩衝液が挙げられる。前記前処理としては、粉砕、凍結、加熱、濃縮、分画、脱塩等の処理；ｐＨ調整剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、界面活性剤等の添加処理；精製処理等が挙げられ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。前記精製処理としては、特に制限されないが、例えば、カラムによる処理；非水溶性担体に固定された試料中の夾雑物に吸着する抗体等の物質により夾雑物を吸着してα２－３シアル酸付加ＣＥＡを含む試料中から除去する処理；非水溶性担体に固定された抗ＣＥＡ抗体によってα２－３シアル酸付加ＣＥＡを含むＣＥＡを捕捉して夾雑物を洗浄等により除去してから遊離させる処理等が挙げられる。

［測定工程］
本発明の方法は、試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定する測定工程を含む。α２－３シアル酸付加ＣＥＡ量の測定方法としては、α２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定することができる方法である限り特に制限されず、従来公知の方法やそれに準じた方法、又はそれらの組み合わせを適宜採用することができる。例えば、α２－３シアル酸付加ＣＥＡに特異的に結合可能なプローブ分子を用いる方法；高速液体クロマトグラフィー同位体希釈質量分析法（ＬＣ－ＩＤＭＳ）；誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ－ＯＥＳ）；誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ－ＭＳ）；原子吸光分光法（Ａｔｏｍｉｃ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＡＡＳ）；ＨＰＬＣ；ＦＰＬＣ；ＮＭＲ；ＩＲ；ＦＴＩＲ；ＵＶ－ＶＩＳ吸光光度計測法；フローサイトメトリ；質量分析法；及びこれらを組み合わせた方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

中でも、本発明に係る測定工程としては、α２－３シアル酸付加ＣＥＡに特異的に結合可能なプローブ分子を用いる方法であることが好ましい。このようなプローブ分子としては、例えば、抗体；プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ等の結合タンパク質；アビジンＤ、ストレプトアビジン等のアビジン類；レクチン；ガレクチン、糖鎖受容体、免疫受容体等が挙げられる。なお、本発明において、「抗体」には、完全な抗体の他、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディー等）や抗体の可変領域を結合させた低分子化抗体も含まれる。

α２－３シアル酸付加ＣＥＡに特異的に結合可能なプローブ分子としては、ＣＥＡに特異的に結合可能なプローブ分子（本発明において、「第１のプローブ分子」という）とα２－３シアル酸に特異的に結合可能なプローブ分子（本発明において、「第２のプローブ分子」という）との組み合わせであることが好ましい。

〔第１のプローブ分子〕
本発明において、「ＣＥＡに特異的に結合可能」とは、特に断りの無い場合、ＣＥＡのうち、α２－３シアル酸（より好ましくは、シアル酸α２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ糖鎖）以外の部位に対して特異的に結合可能なことを示す。「α２－３シアル酸以外の部位」としては、タンパク質部分の全体又はその一部であっても、α２－３シアル酸以外の糖鎖部分の全体又は一部であっても、これらのうちの２種以上の組み合わせであってもよい。ＣＥＡに特異的に結合可能な第１のプローブ分子としては、例えば、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗体（ＣＥＡのタンパク質部分を認識部位とする抗タンパク質抗体、ＣＥＡの糖鎖部分を認識部位とする抗糖鎖抗体、及びＣＥＡのタンパク質部分と糖鎖部分とを認識部位とする抗体を含む。本明細書中、場合により「抗ＣＥＡ抗体」という）、抗ＣＥＡＣＡＭファミリー抗体（ＣＥＡと他のＣＥＡＣＡＭファミリー分子とを認識部位とする抗体）が挙げられ、中でも、抗ＣＥＡ抗体が好ましく、ＣＥＡのタンパク質部分の少なくとも一部を認識部位とする抗ＣＥＡタンパク質抗体であることがより好ましく、また、α２－３シアル酸と第２のプローブ分子との結合に干渉しない抗体であることが好ましい。

前記抗ＣＥＡ抗体としては、ＣＥＡへの結合能を有する限り特に制限はなく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質性や安定性の観点からはモノクローナル抗体であることが好ましい。抗ＣＥＡ抗体は、従来公知の産生方法を適宜採用、改良することによって産生することができ、また、一般に流通されているものを適宜用いてもよい。

本発明に係る抗ＣＥＡ抗体としては、例えば、第２のプローブ分子として下記のレクチンを用いる場合に、当該レクチンが抗体糖鎖も認識して検出感度が低下することを抑制するために、酸化処理、グリコシダーゼ処理、プロテアーゼ処理等によって、レクチン結合性の糖鎖が除去若しくは破壊されたもの；抗体分子中の糖鎖付加アミノ酸を含む領域が除去されたもの；又は、抗体遺伝子を発現させた遺伝子組み換え大腸菌や細胞を用いたり抗体産生細胞の培養における栄養条件を制限したりすることよって糖鎖付加が起こらない条件で産生された抗体であることが好ましい。

〔第２のプローブ分子〕
α２－３シアル酸に特異的に結合可能な第２のプローブ分子としては、例えば、α２－３シアル酸に特異的に結合可能な抗体（本明細書中、場合により「抗α２－３シアル酸抗体」という）、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録標章）のようなα２－３シアル酸結合型人工タンパク質、α２－３シアル酸に特異的に結合可能なレクチン（例えば、イヌエンジュレクチン（ＭＡＭ／ＭＡＬ／ＭＡＡ－ＩＩ）、イヌエンジュレクチン（ＭＡＨ／ＭＡＡ－Ｉ）等のイヌエンジュレクチン；ヤナギマツタケレクチン（ＡＣＧ）；ジャックフルーツレクチン（Ｊａｃａｌｉｎ））が挙げられ、中でも、α２－３シアル酸に特異的に結合可能なレクチンが好ましく、イヌエンジュレクチンがより好ましく、ＭＡＭが特に好ましい。なお、ＭＡＭ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ Ｌｅｃｔｉｎ；ＭＡＬ又はＭＡＡ－ＩＩともいう）は、α２－３シアル酸の糖鎖構造（特に、シアル酸α２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）を認識して結合活性を示すタンパク質であり、植物であるイヌエンジュの種子に由来するマメ科レクチンである。前記レクチンとしては、糖鎖認識活性の特異性の増大等を目的として、変異が導入された改変レクチンとしたものや人工的に合成されたものであってもよい。また、一般に流通されているものを適宜用いてもよい。

第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子を用いる場合、前記測定工程では、前記試料と、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子と、を接触させる。これにより、α２－３シアル酸とＣＥＡのα２－３シアル酸以外の部分とがいずれも認識され、両者を含むα２－３シアル酸付加ＣＥＡを検出して測定することができる。前記試料と第１のプローブ分子との接触及び前記試料と第２のプローブ分子との接触は、互いに同時であってもよいし、別時であってもよいし、別時の場合にはいずれの接触が先であってもよい。

〔標識物質〕
本発明において、α２－３シアル酸付加ＣＥＡ量の測定は、α２－３シアル酸付加ＣＥＡに特異的に結合可能なプローブ分子（好ましくは、第１のプローブ分子及び／又は第２のプローブ分子）に付加した、又はこれらの分子を認識する分子（例えば、二次抗体やプロテインＡ）に付加した標識物質によって生じるシグナルを検出することによって行うことが好ましい。検出したシグナルの量を測定し、必要に応じてこれを半定量又は定量することによって、α２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定することができる。前記「シグナル」には、呈色（発色）、消光、反射光、発光、蛍光、放射性同位体による放射線等が含まれ、肉眼で確認できるものの他、シグナルの種類に応じた測定方法・装置によって確認できるものも含まれる。本発明において、測定されるα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量としては、標準試料等を用いて半定量又は定量してもよいが、より簡便かつ迅速な観点からは、前記シグナル量をそのまま本発明のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量としてよい。

本発明に係る標識物質としては、公知の免疫学的測定方法やそれに準じた方法において標識物質として用いられているものを特に制限なく用いることができる。例えば、酵素；アクリジニウム誘導体等の発光物質；ユーロピウム等の蛍光物質；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びフィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）等の蛍光蛋白質；^１２５Ｉ等の放射性物質；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の低分子量標識物質；金粒子；アビジン；ビオチン；ラテックス；ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）が挙げられ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。例えば、前記標識物質として酵素を用いた場合には、発色基質、蛍光基質、化学発光基質等を基質として添加することにより、当該基質に応じて種々の測定を行うことができる。前記酵素としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

〔サンドイッチ法〕
第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子を用いる測定方法としては、サンドイッチ法、競合法、及び免疫比濁法等の免疫学的測定方法や、これらの原理に準じた測定方法が挙げられ、特に制限されない。かかる測定方法では、例えば、一般的に、ＥＬＩＳＡ、デジタルＥＬＩＳＡ、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、ＣＬＩＡ（化学発光免疫測定法）、ＥＣＬＩＡ（電気化学免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）等の、マイクロプレートや粒子等を担体とする方法；イムノクロマト；表面プラズモン共鳴分析法；蛍光共鳴エネルギー移動による検出方法等を採用することができる。

本発明に係る測定方法としては、より感度及び特異度の高い測定システムを構築可能な傾向にある観点からは、サンドイッチ法が好ましい。以下、本発明に係る測定工程について、サンドイッチ法を例に挙げてより具体的な態様を説明する。

前記サンドイッチ法を用いる場合の態様としては、
前記測定工程が、前記試料と、捕捉体及び標識体と、を接触させる工程であり、
前記捕捉体が、非水溶性担体と、前記非水溶性担体に固定された第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちのいずれか一方と、を備えるものであり、かつ、
前記標識体が、標識物質と、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちの他方と、を備える、
態様（以下、場合により「第１の態様」という）が挙げられる。第１の態様において、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子は、それぞれ、前記捕捉体及び前記標識体のうちのいずれに備えられていてもよいが、一方が捕捉体に含まれ、もう一方が標識体に含まれる。これによりα２－３シアル酸及びＣＥＡをいずれも捕捉することで、α２－３シアル酸付加ＣＥＡを高精度かつ簡便に捕捉して検出することができる。

前記サンドイッチ法の他の態様としては、上記に限られず、例えば、前記標識体が、第１の標識物質と、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちのいずれか一方と、を備える第１の標識体、並びに、第２の標識物質と、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちの他方と、を備える第２の標識体であり、かつ、前記捕捉体が、非水溶性担体と、前記非水溶性担体に固定されたプローブ分子と、を備える捕捉体である態様（以下、場合により「第２の態様」という）としてもよい。第２の態様において、第１の標識物質と第２の標識物質とは互いに異なるシグナルを生じるものである。また、この場合の前記捕捉体に備えられるプローブ分子としては、α２－３シアル酸付加ＣＥＡに特異的に結合可能なプローブ分子（第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子を含む）；第１のプローブ分子及び／又は第２のプローブ分子に特異的に結合可能なプローブ分子が挙げられる。

このようなサンドイッチ法としては、２ステップ法であるフォワードサンドイッチ法（捕捉体と試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡとの反応、捕捉体に結合したα２－３シアル酸付加ＣＥＡと標識体との反応を逐次的に行う方法）、リバースサンドイッチ法（予め標識体と試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡとを反応させ、生成した複合体を捕捉体と反応させる方法）、及び１ステップ法（試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ、捕捉体、標識体の反応を同時に１ステップで行う方法）を挙げることができるが、これらのいずれも採用可能である。

例えば、フォワードサンドイッチ法では、先ず、前記試料と前記捕捉体とを接触させ、前記捕捉体のプローブ分子とα２－３シアル酸付加ＣＥＡとの結合（例えば、第１のプローブ分子とＣＥＡとの結合）を介してα２－３シアル酸付加ＣＥＡを当該捕捉体に捕捉させる（１次反応：捕捉ステップ）。次いで、前記捕捉体に捕捉されたα２－３シアル酸付加ＣＥＡに前記標識体を接触させて、前記標識体のプローブ分子とα２－３シアル酸付加ＣＥＡとの結合（例えば、第２のプローブ分子とα２－３シアル酸との結合）を介して標識する（２次反応：標識ステップ）。この反応により、捕捉体－α２－３シアル酸付加ＣＥＡ－標識体を含む複合体が形成される。結合しなかった試料及び標識体を必要に応じて洗浄して除去（洗浄ステップ）した後、前記標識物質に応じた所定の方法で、当該標識物質に由来するシグナルを測定する（測定ステップ）。

（捕捉体）
本発明に係る「捕捉体」は、非水溶性担体と、前記非水溶性担体に固定されたα２－３シアル酸付加ＣＥＡに特異的に結合可能なプローブ分子と、を備える複合体であって、前記非水溶性担体と前記プローブ分子とが直接的又は間接的に結合した結合体である。第１の態様に係る捕捉体に備えられる前記プローブ分子としては、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちのいずれか一方であることが好ましく、この場合、当該捕捉体に備えられるプローブ分子としては、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちのいずれであってもよいが、第２のプローブ分子としてレクチンを用いる場合には、より捕捉性が高い観点からは、前記捕捉体に備えられるプローブ分子としてはＣＥＡに特異的に結合可能な第１のプローブ分子であることが好ましく、抗ＣＥＡ抗体であることがより好ましい。

〈非水溶性担体〉
前記捕捉体に含まれる非水溶性担体は、主に前記プローブ分子を担持し、固相化する担体として機能するものであり、非水溶性の物質である。本発明において、「非水溶性の物質」とは、常温常圧下において水に不溶（水に対する溶解度が０．００１ｇ／ｍＬ以下、好ましくは０．０００１ｇ／ｍＬ以下、以下同様）である物質を示す。

このような非水溶性担体の材質としては、一般的に免疫学的測定及びそれに準じた測定に用いられているものを用いることができ、特に制限はされず、例えば、高分子ポリマー（ポリスチレン、（メタ）アクリル酸エステル、ポリメチルメタクリレート、ポリイミド、ナイロン等）、ゼラチン、ガラス、ラテックス、シリカ、金属（金、白金等）、及び金属化合物（酸化鉄、酸化コバルト、ニッケルフェライト等）からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。また、前記非水溶性担体の材質としては、これらの複合材や、これら物質と他の物質との複合材であってもよく、例えば、前記高分子ポリマー、ゼラチン、及びラテックスからなる群から少なくとも１種の有機高分子と、酸化鉄（スピネルフェライト等）、酸化コバルト、及びニッケルフェライトからなる群から少なくとも１種の金属化合物と、からなる有機無機複合材であってもよい。さらに、前記非水溶性担体としては、カルボキシ基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、アジド基、アルデヒド基、カーボネート基、アリル基、アミノオキシ基、マレイミド基、チオール基等の活性基で表面修飾されたものであってもよい。

また、本発明において、前記非水溶性担体の形状としても特に制限はされず、例えば、プレート、繊維、膜、粒子等のいずれであってもよいが、反応効率の観点からは、粒子であることが好ましく、自動化・短時間化の観点からは、磁性粒子であることがより好ましい。このような非水溶性担体としては、従来公知のものを適宜用いることができ、市販のものを適宜用いることもできる。

〈捕捉体の構成及び製造方法〉
前記捕捉体において、前記プローブ分子の含有量としては特に制限されず、該プローブ分子とα２－３シアル酸付加ＣＥＡとの結合のしやすさ等に応じて適宜調整することができるが、例えば、前記非水溶性担体（好ましくは粒子）の質量（非水溶性担体が２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計）１００質量部に対するプローブ分子の質量（プローブ分子が２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計）が、０．１～１０質量部であることが好ましく、１～５質量部であることがより好ましい。

前記捕捉体は、前記非水溶性担体に前記プローブ分子を固定することによって製造することができる。かかる製造方法としては、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、前記非水溶性担体に前記プローブ分子を直接固定してもよく、間接的に固定してもよい。

直接固定する場合には、例えば、前記非水溶性担体及び／又は前記プローブ分子として、カルボキシ基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、アジド基、アルデヒド基、カーボネート基、アリル基、アミノオキシ基、マレイミド基、チオール基等の活性基を有するものを用い、又は必要に応じて前記活性基を付与して、これらを結合させることにより、前記プローブ分子を前記非水溶性担体に直接固定することができる。

間接的に固定する場合には、例えば、前記プローブ分子に結合するリンカーを前記非水溶性担体に固定し、該リンカーに前記プローブ分子を結合させることにより、前記プローブ分子を前記非水溶性担体に間接的に固定することができる。前記リンカーとしては、特に制限されず、例えば、プローブ分子に結合可能な二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ、光分解可能な光切断型リンカー、前記活性基を有するリンカー分子（例えば、ヒドラジン塩、ヒドラジド）等が挙げられる。また、前記プローブ分子に何らかの修飾を行い、その修飾部分を捕捉する物質を前記非水溶性担体に固定化して、前記非水溶性担体上にプローブ分子を固定してもよい。例えば、前記修飾部分の代表例としてはビオチンが、その修飾部分を捕捉する物質の代表例としてはストレプトアビジンが、それぞれ挙げられるが、これらに限定されるものではない。

これらの反応に供する非水溶性担体及びプローブ分子の比率は、上記の捕捉体における比率の好ましい範囲を達成するように適宜選択することができる。また、必要に応じて、前記プローブ分子や非水溶性担体への非特異的な吸着を防ぐことを目的として、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で前記非水溶性担体のブロッキングを行ってもよい。さらに、このような捕捉体としては、市販のものを適宜用いてもよい。

（標識体）
本発明に係る「標識体」は、標識物質と、α２－３シアル酸付加ＣＥＡに特異的に結合可能なプローブ分子と、を備える複合体であって、前記標識物質と前記プローブ分子とが直接的又は間接的に結合した結合体である。第１の態様に係る標識体に備えられる前記プローブ分子としては、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうち、捕捉体に備えられる分子の他方の分子であることが好ましく、この場合、当該標識体に備えられるプローブ分子としては、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちのいずれであってもよいが、抗原に対する親和性の高い抗ＣＥＡ抗体のような分子を第１のプローブ分子として捕捉体に備えて使用するという観点からは、α２－３シアル酸に特異的に結合可能な第２のプローブ分子であることが好ましく、α２－３シアル酸に特異的に結合可能なレクチンであることがより好ましく、ＭＡＭであることが特に好ましい。

（ブロック化標識レクチン）
本発明において、前記標識体としては、前記標識物質と前記抗体（抗ＣＥＡ抗体、抗α２－３シアル酸抗体等）とを備える標識化抗体、前記標識物質とレクチンとを備える標識化レクチン、ブロック化標識レクチンが挙げられ、これらのうちの１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。これらの中でも、本発明、特に第１の態様における標識体としては、ブロック化標識レクチンであることが好ましい。本発明において、「ブロック化標識レクチン」とは、水溶性高分子からなる水溶性担体と、前記水溶性担体に固定された標識物質及びレクチンとを備える複合体であって、水溶性担体と標識物質とレクチンとが直接的又は間接的に結合した結合体である。本発明において、前記ブロック化標識レクチンでは、第２のプローブ分子としてα２－３シアル酸に特異的に結合可能なレクチンを備える。この場合、前記捕捉体に備えられるプローブ分子は第１のプローブ分子であることが好ましい。前記レクチンとしては上述したとおりであり、好ましくはＭＡＭである。また、前記標識物質としては、その好ましい態様も含めて、上述したとおりである。

前記ブロック化標識レクチンにおいては、前記水溶性担体に前記標識物質及びレクチンが担持されていればよく、水溶性担体に標識物質及びレクチンが互いに独立して結合していても、水溶性担体、標識物質、及びレクチンのいずれもが他の２者と結合していても、水溶性担体に標識物質を介してレクチンが結合していても、水溶性担体にレクチンを介して標識物質が結合していてもよい。一般に、レクチンとレクチン結合性糖鎖構造との各々の結合点における親和性は弱いが、このようなブロック化標識レクチンでは、複数のレクチンが高分子である水溶性担体によって一連となった複合体を形成する。そのため、これを用いることで一つの複合体に複数の結合点が生じるため、全体としての親和性が向上し、対象であるα２－３シアル酸を高感度で検出可能になる。

〈水溶性担体〉
前記ブロック化標識レクチンに含まれる水溶性担体は、主に前記標識物質及びレクチンを担持する担体として機能するものであり、水溶性高分子からなる。本発明に係る水溶性担体を構成する水溶性高分子（以下、「第１の水溶性高分子」という）としては、前記標識物質及びレクチンを固定させて担持できる水溶性高分子である限り特に制限はない。本発明において、「水溶性高分子」とは、常温常圧下で水に対する溶解度が０．０１ｇ／ｍＬを超える、好ましくは０．０５ｇ／ｍＬ以上である、より好ましくは０．１ｇ／ｍＬ以上である高分子化合物を示す。

本発明に係る第１の水溶性高分子としては、重量平均分子量（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるポリスチレン換算での重量平均分子量、以下同じ）が、測定の感度の観点及び水溶性であるという観点から、６，０００～４，０００，０００であることが好ましく、２０，０００～１，０００，０００であることがより好ましい。

また、本発明に係る第１の水溶性高分子としては、平均質量が、より好ましい平均粒子径のブロック化標識抗体を得られる傾向にある観点から、７０，０００～１，０００，０００Ｄａであることも好ましく、１５０，０００～７００，０００Ｄａであることもより好ましい。

また、前記ブロック化標識レクチンとしては、一つのブロック化標識レクチンに、第１の水溶性高分子として、重量平均分子量が異なる複数種の水溶性高分子が含まれていてもよい。さらに、前記ブロック化標識レクチンとしては、第１の水溶性高分子の重量平均分子量が２００，０００以上である高分子量ブロック化標識レクチンと、第１の水溶性高分子の重量平均分子量が１００，０００未満（より好ましくは１００，０００以下）である低分子量ブロック化標識レクチンと、の組み合わせであることも好ましく、第１の水溶性高分子の重量平均分子量が２００，０００～７００，０００（さらに好ましくは２５０，０００～５００，０００）である高分子量ブロック化標識レクチンと、第１の水溶性高分子の重量平均分子量が２０，０００～１００，０００（さらに好ましくは５０，０００～７０，０００）である低分子量ブロック化標識レクチンと、の組み合わせであることがより好ましい。前記ブロック化標識レクチンとして、かかる高分子量ブロック化標識レクチンと前記低分子量ブロック化標識レクチンとを組み合わせる場合、これらの質量比（高分子量ブロック化標識レクチンの質量：低分子量ブロック化標識レクチンの質量）としては、１０：１～１：１０であることが好ましく、５：１～１：５であることがより好ましく、３：１～１：３であることがさらに好ましい。

本発明に係る第１の水溶性高分子としては、例えば、デキストラン、アミノデキストラン、フィコール（商品名）、デキストリン、アガロース、プルラン、各種セルロース（例えば、ヘミセルロースやリグリン等）、キチン、及びキトサン等の多糖類；β―ガラクトシダーゼ；サイログロブリン；ヘモシアニン；ポリリジン；ポリペプチド；ＤＮＡ；並びに、これらの修飾体（例えば、ジエチルアミノエチルデキストランやデキストラン硫酸ナトリウム等）が挙げられ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。これらの中でも、本発明に係る第１の水溶性高分子としては、安価で大量に入手可能であり、また、官能基の付加、カップリング反応などの化学的な加工が比較的容易である観点からは、多糖類及びその修飾体からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、デキストラン及びアミノデキストラン、並びに、これらの修飾体からなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましく、デキストランであることがさらに好ましい。

〈ブロック化標識レクチンの構成及び製造方法〉
前記ブロック化標識レクチンにおいて、前記標識物質の含有量としては特に制限されず、測定機構等に応じて適宜調整することができるが、測定感度をより向上させるために、第１の水溶性高分子１分子に結合する標識物質の分子数ができるだけ多くなるように設定することが好ましく、例えば、前記標識物質が酵素である場合、第１の水溶性高分子の質量（第１の水溶性高分子が２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計、以下同じ）１００質量部に対する標識物質の質量（標識物質が２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計）が、１００～１，０００質量部であることが好ましく、３００～８００質量部であることがより好ましい。

前記ブロック化標識レクチンにおいて、レクチンの含有量としては特に制限されないが、測定感度をより向上させるために、第１の水溶性高分子１分子に結合するレクチンの分子数ができるだけ多くなるように設定することが好ましく、例えば、第１の水溶性高分子の質量１００質量部に対するレクチンの質量（レクチンが２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計）が、１００～２，０００質量部であることが好ましく、３００～１，５００質量部であることがより好ましい。

また、前記ブロック化標識レクチンとしては、ブロック化標識レクチン１分子あたりの重量平均分子量が、１，０００，０００～１０，０００，０００であることが好ましく、１，５００，０００～５，０００，０００であることがより好ましい。前記重量平均分子量が１，０００，０００以上であると、測定感度がより高くなる傾向にあり、他方、１０，０００，０００以下であると、水溶液中における凝集等をより十分に抑制できる傾向にある。

前記ブロック化標識レクチンは、前記水溶性担体に前記標識物質及びレクチンを固定することによって製造することができる。かかる製造方法としては、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、前記水溶性担体に前記標識物質及びレクチン（以下、場合により「被担持物質」と総称する）を直接固定してもよく、間接的に固定してもよい。

前記被担持物質を前記水溶性担体に直接固定する方法としては、例えば、前記被担持物質及び／又は前記水溶性担体を構成する第１の水溶性高分子に、カルボキシ基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、アジド基、アルデヒド基、カーボネート基、アリル基、アミノオキシ基、マレイミド基、チオール基、ピリジルジスルフィド基等の活性基を付与し、或いは、前記被担持物質及び／又は水溶性担体としてこれらの活性基を有する水溶性高分子を用い、これらを結合させることによって固定する方法が挙げられる。前記活性基を付与した被担持物質及び第１の水溶性高分子としては、市販のものをそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で被担持物質及び水溶性高分子表面に前記活性基を導入して調製してもよい。一例として、チオール基の導入は、例えば、Ｓ－アセチルメルカプト無水コハク酸や２－イミノチオラン塩酸塩等の市販の試薬を用いて行うことができる。また、前記被担持物質及び／又は前記水溶性担体を構成する第１の水溶性高分子上のアミノ基へのマレイミド基の導入は、例えば、Ｎ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドやＮ－（４－マレイミドブチリロキシ）スクシンイミド等の市販の試薬を用いて行うことができる。ピリジルジスルフィド基の導入は、例えば、Ｎ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＰＤＰ）やＮ－｛６－［３－（２－Ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌｏｘｙ｝ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（Ｓｕｌｆｏ－ＡＣ５－ＳＰＤＰ）等の市販の試薬を用いて行うことができる。また、ピリジルジスルフィド基の導入後に還元してチオール基とすることで、これを導入することもできる。

前記被担持物質を前記水溶性担体に間接的に固定する方法としては、例えば、ポリヒスチジン、ポリエチレングリコール、システイン及び／又はリジンを含むオリゴペプチド、前記活性基を有するリンカー分子（例えば、上記の捕捉体の製造方法で挙げたもの）等のリンカーを介して固定する方法が挙げられる。前記リンカーの選択及びその大きさは、前記被担持物質との結合の強さや前記被担持物質を前記水溶性担体に固定化したことによる立体障害等を考慮して適宜設定することができる。

前記ブロック化標識レクチンの製造方法においては、前記水溶性担体に前記標識物質及びレクチンを一度に固定しても、これらを別々に順次固定してもよいが、製造のしやすさ、並びに、標識物質及びレクチン量の制御しやすさの観点からは、前記水溶性担体にいずれか一方を固定してから他方を固定することが好ましい。また、前記ブロック化標識レクチンは、前記標識物質とレクチンとをそれぞれ別の水溶性担体に固定し、一の水溶性担体に固定された標識物質（ブロック化標識物質）と、他の水溶性担体に固定されたレクチン（ブロック化レクチン）とを直接、又は前記リンカー等を介して、結合させることで製造することもできる。

前記ブロック化標識レクチンの製造方法としては、特に制限されず、例えば、下記の実施例に記載のように、前記標識物質が酵素であり、前記第１の水溶性高分子が多糖類や糖タンパク質である場合、先ず、第１の水溶性高分子を過ヨウ素酸ナトリウムのような酸化剤で酸化してアルデヒド基を付与し、ヒドラジン塩酸塩と反応させた後、これをジメチルアミンボラン（ＤＭＡＢ）等の還元剤と反応させてヒドラジン化する。一方、前記酵素も過ヨウ素酸ナトリウムのような酸化剤で酸化してその糖鎖にアルデヒド基を付与させる。次いで、上記で付与したヒドラジン残基とアルデヒド基とを反応させてヒドラゾン結合させ、第１の水溶性高分子－酵素結合体を得る。得られた第１の水溶性高分子－酵素結合体を、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド及びマレイミド基を各末端に有するクロスリンカー（例えば、ＳＭ（ＰＥＧ）_４、ＳＭＣＣ等）で処理し、マレイミド基を導入する。一方、レクチンをチオール化試薬でチオール化してチオール基を付与し、又は分子内にジスルフィド結合を持つレクチンの場合は還元によってチオール基を得る。最後に、第１の水溶性高分子－酵素結合体に導入したマレイミド基と、レクチンに付与したチオール基とを結合させることにより、第１の水溶性高分子（水溶性担体）－酵素－レクチンの三者を共有結合させることができる。この方法によれば、２分子以上の第１の水溶性高分子が酵素を介して結合したものに、レクチンが結合したものが得られる。これらの反応に供する第１の水溶性高分子、標識物質、レクチンの比率は、上記のブロック化標識レクチンにおける各含有量の好ましい範囲を達成するように適宜選択することができる。

（捕捉ステップ）
前記捕捉ステップにおいて、前記試料と前記捕捉体とを接触させる方法としては、特に制限されず、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、例えば、前記非水溶性担体がプレートである場合にはこれ（プローブ分子固定化プレート）に前記試料を注入する方法や、前記非水溶性担体が粒子である場合には前記試料中に前記捕捉体（プローブ分子固定化粒子）を添加する方法が挙げられる。

前記捕捉ステップにおける前記試料と前記捕捉体との反応において、前記捕捉体及び前記試料を含む反応液中の、捕捉体の含有量（終濃度）（捕捉体が２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計、以下同じ）としては、特に制限されず、試料の種類、濃度等に応じて適宜調整されるものであるため特に制限されないが、短時間に効率よく捕捉する観点から、例えば、０．０１～１．５質量％であることが好ましく、０．０５～１質量％であることがより好ましく、０．１～０．５質量％であることがさらに好ましい。

また、前記捕捉ステップの条件としても特に制限されず、適宜調整することができ、例えば、室温～４５℃、好ましくは２０～３７℃、ｐＨ６～９程度、好ましくはｐＨ７～８で、５秒～１０分程度、好ましくは３０秒～５分程度行うことができるが、これらの条件に限定されるものではない。

（標識ステップ）
前記標識ステップにおける前記標識体とα２－３シアル酸付加ＣＥＡとの反応において、前記標識体及びα２－３シアル酸付加ＣＥＡを含む反応液中の、標識体の含有量（終濃度）（標識体が２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計、以下同じ）としては、特に制限されず、試料の種類、濃度等に応じて適宜調整されるものであるため特に制限されないが、過剰に用いると高いバックグラウンドシグナルを生じる可能性がある観点から、例えば、０．００１～１０μｇ／ｍＬであることが好ましく、０．０１～５μｇ／ｍＬであることがより好ましく、０．１～１μｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。

また、前記標識ステップの他の条件としても特に制限されず、適宜調整することができ、例えば、室温～３７℃、好ましくは２０～３７℃、ｐＨ５．０～７．０、好ましくは５．５～６．５で、３分～１２０分程度、好ましくは、５分～１０分程度行うことができるが、これらの条件に限定されるものではない。

（洗浄ステップ）
前記サンドイッチ法には、前記捕捉ステップ及び／又は前記標識ステップの後に、前記捕捉体に結合したα２－３シアル酸付加ＣＥＡと、それ以外の前記捕捉体に結合していない（捕捉されていない）夾雑物とを分離し、前記夾雑物を除去する洗浄ステップをさらに含むことが好ましい。前記夾雑物を除去する方法としては、特に制限されず、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、例えば、前記捕捉体が前記プローブ分子固定化プレートである場合にはプレート上から液相（上清）を除去する方法や、前記プローブ分子固定化粒子である場合には前記粒子を遠心や集磁によって回収して液相（上清）を除去する方法が挙げられる。また、前記洗浄ステップにおいては、必要に応じて、洗浄液の注入及び除去を繰り返してもよい。前記洗浄液としては、例えば、中性（好ましくは、ｐＨ６～９）の公知の緩衝液（ナトリウムリン酸バッファー、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＦＢ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシンバッファー、ビシンバッファー、グリシンバッファー等）が挙げられ、また、ＢＳＡ等の安定化蛋白や界面活性剤等が添加されたものであってもよい。

本発明に係る測定工程として前記サンドイッチ法を用いる場合、前記試料としては、上記のように希釈液で希釈して用いてもよいが、前記捕捉体が前記プローブ分子固定化粒子等である場合には、その粒子懸濁媒（粒子液）に懸濁して用いてもよく、さらに、前記試料と前記捕捉体及び／又は前記標識体との反応系には、他の反応用バッファーを適宜添加してもよい。これらの粒子懸濁媒、反応用バッファーとしては、特に制限されないが、例えば、それぞれ独立に、公知の緩衝液（ナトリウムリン酸バッファー、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＦＢ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシンバッファー、ビシンバッファー、グリシンバッファー等）が挙げられ、また、それぞれ独立に、ＢＳＡ等の安定化蛋白や血清等が添加されたものであってもよい。

また、前記標識体として前記ブロック化標識レクチンを用いる場合、前記試料と前記標識体との反応系には、測定感度をさらに向上させる観点から、他に、水溶性高分子（以下、「第２の水溶性高分子」という；前記標識物質及びレクチンを担持していない遊離の水溶性高分子である点で前記水溶性担体を構成する第１の水溶性高分子とは異なる）、遊離レクチン（前記水溶性担体にも前記標識物質にも固定されていない点で前記ブロック化標識レクチン等に含まれるレクチンとは異なる）等を共存させてもよい。

第２の水溶性高分子としては、第１の水溶性高分子として挙げたものと同様のものが挙げられ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。また、第１の水溶性高分子と同種の高分子であってよい。これらの中でも、第２の水溶性高分子としては、測定感度がより向上する傾向にある観点からは、多糖類及びその修飾体からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、デキストラン及びアミノデキストラン、並びに、これらの修飾体からなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましく、デキストランであることがさらに好ましい。

また、第２の水溶性高分子の重量平均分子量としては、測定感度がより向上する傾向にある観点からは、５００，０００～５，０００，０００であることが好ましく、１，０００，０００～３，０００，０００であることがより好ましく、１，５００，０００～２，５００，０００であることがさらに好ましい。

第２の水溶性高分子の量としては、特に限定されないが、前記試料、ブロック化標識レクチン、及び第２の水溶性高分子を含む反応液中における第２の水溶性高分子の含有量（第２の水溶性高分子が２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計）が、０．０１～１０ｗ／ｖ％であることが好ましく、０．５～３ｗ／ｖ％であることがより好ましい（ｗ／ｖ％：重量／容量（ｇ／ｍＬ）パーセント、以下同じ）。

前記遊離レクチンとしては、上記でレクチンとして挙げたものと同様のものが挙げられ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。また、ブロック化標識レクチンに含まれるレクチンと同種のものであってよい。これらの中でも、前記遊離レクチンとしては、反応性の向上とバックグラウンドの抑制の観点からは、ブロック化標識レクチンに含まれるレクチンと同種のものであることが特に好ましい。

前記遊離レクチンの量としては、特に限定されないが、前記試料、ブロック化標識レクチン、及び前記遊離レクチンを含む反応液中において、ブロック化標識レクチンの含有量１００質量部に対する遊離レクチンの含有量（遊離レクチンが２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計）が、１～１０，０００質量部であることが好ましく、１０～５，０００質量部であることがより好ましい。

（測定ステップ）
前記測定ステップにおいては、前記標識物質に応じてシグナルを測定する。例えば、前記標識物質が酵素である場合には、当該酵素に対応する発色基質や発光基質を添加して反応させることによって生じるシグナル（例えば、発色や発光）を測定する。これにより、試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量をシグナル量として検出することができ、また、必要に応じて標準試料における測定値との比較をすることによって試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を定量することができる。

［がん検出方法］
本発明のがん検出方法によれば、上記の測定工程によって測定されたα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を指標とすることにより、前記試料又は試料が由来する被検者における前立腺がんの存在の有無を検出することができる。かかるがん検出方法は、創薬等の研究目的の他、本発明のがん検査方法に用いることができる。

［がん検査方法］
本発明のがん検査方法では、被検者由来の試料中におけるα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定し、それを指標として前立腺がんの有無を検出することで、当該被検者において、前立腺がんに罹患しているか否かの予測、前記がんの罹患の有無若しくはその可能性の判別、又は、前記がんの進行度若しくは重症度の評価をすることができる。

すなわち、本発明のがん検査方法の態様としては具体的に、例えば、次の態様：
前立腺がんであると予測される被検者をスクリ－ニングする方法であり、被検者由来の試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定する測定工程と、測定されたα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を指標として被検者を選別する選別工程と、を含むことを特徴とする、スクリーニング方法；
被検者における前立腺がんの罹患の有無を鑑別する方法であり、被検者由来の試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定する測定工程と、測定されたα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を指標として被検者を判別する判別工程と、を含むことを特徴とする、鑑別方法；
被検者における前立腺がんの進行度又は重症度を評価する方法であり、被検者由来の試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定する測定工程と、測定されたα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を指標として被検者を評価する評価工程と、を含むことを特徴とする、評価方法；
が挙げられる。

〔スクリ－ニング方法〕
本発明において、「スクリ－ニング」とは、前立腺がんに罹患している可能性がある被検者を選別することを示す。前記スクリ－ニング方法には、本発明では具体的に、被検者を、前立腺がんに罹患（再発を含む）している可能性が高いと予測して、前記可能性が無い又は低い群から選別する方法が含まれる。前記スクリーニング方法においては、その目的に応じて、例えば、中程度の可能性が期待できるレベルで被検者を選別してもよい。

より具体的には、例えば、前記がんに真に罹患している者からなる群（陽性群）と前記がんに罹患していない者からなる群（正常群：陰性群）との２群に切り分け、被検者を、陽性群に含まれると予測して、正常群（陰性群）から選別する。この場合の予測基準としては、例えば、陰性一致率（当該スクリ－ニングによって正常群と予測された被検者が真に正常群にある割合）が９５％以上であることが好ましい。

〔鑑別方法〕
本発明において、「鑑別」とは、前立腺がんを他の疾患又は状態と区別して、被検者が当該がんに罹患しているか否かを判別することを示す。また、前記罹患の有無の判別のみならず、罹患の可能性がある場合におけるその程度の評価（高い／中程度／低い等の評価）を含む。前記鑑別方法には、本発明では具体的に、症状の有無に関わらず、被検者において、前立腺がんに罹患しているか否か又はその可能性が高いか否かを判別する方法を含み、例えば、被検者が罹患しているがんが、前立腺がんであるか否かを判別する方法、又は前記がんである可能性が高いと判別する方法；被検者が過去に罹患していた前立腺がんが再発したか否かを判別する方法、又は前記がんが再発した可能性が高いと判別する方法も含む。

より具体的には、例えば、前記がんに真に罹患している者からなる群（陽性群）と前記がんに罹患していない者からなる群（正常群：陰性群）との２群に切り分け、被検者が、前記陽性群に含まれるのか陰性群に含まれるのかを判別する。かかる鑑別は、医師等による前立腺がんの診断の補助に適用することができる。この場合の判別基準としては、例えば、陰性一致率（当該鑑別によって正常群と判別された被検者が真に正常群にある割合）が９５％以上であることが好ましい。

〔評価方法〕
本発明において、前記評価方法には、例えば、被検者が罹患している前立腺がんの進行度又は重症度を評価する方法；被検者が罹患している前記がんの治療方針決定のための指標を提供する方法；前記がんの治療効果の判定方法を含む。

より具体的には、例えば、前記がんに罹患していない者又は前記がんの進行度若しくは重症度の低い者からなる群におけるα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量と、被検者のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量とを比較し、被検者における量の方が多ければ進行度若しくは重症度が高いと評価し、少なければ進行度若しくは重症度が低いと評価することができる。また、被検者の前記がんの発見当初若しくは治療前におけるα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量と現在のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量とを比較し、量が増加していればその治療効果は低いと評価し、減少していればその治療効果は高いと評価することができる。

（カットオフ値）
前記スクリーニング方法の選別工程及び前記鑑別方法の判別工程では、例えば、前記測定工程で測定されたα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を、予め定められたカットオフ値と比較して、前記α２－３シアル酸付加ＣＥＡ量が前記カットオフ値よりも高い被検者を、前立腺がんに罹患している（又は罹患している可能性が高い）と予測又は判別する。

本発明において、「カットオフ値」とは、前記α２－３シアル酸付加ＣＥＡ量によって判定するための基準となる予め定められた値であり、上記陽性群と陰性群とを判定するための境界値のことを示す。このようなカットオフ値は、本発明のがん検査方法の目的、α２－３シアル酸付加ＣＥＡ量の測定方法、被検者や試料の性質、希釈条件等によって適宜設定されるものであるため、特に限定されるものではない。例えば、カットオフ値を比較的低値に設定することで、検出感度を高く、すなわち、前記がんの初期段階にある患者をある程度広く拾集でき、早期発見が可能となる。他方、α２－３シアル酸付加ＣＥＡは健常者由来の試料においても少量は検出されるため、前記カットオフ値を比較的高値に設定することで、前記スクリーニング及び前記鑑別をより高精度で行うことが可能となる。

カットオフ値の一例としては、例えば、前記試料を血清検体とし、体積比で１／１０に希釈し、前記捕捉体として抗ＣＥＡ抗体固定化粒子を用い、かつ、前記標識体としてブロック化標識ＭＡＭを用いたサンドイッチイムノアッセイで測定したα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を、前記標識物質をＡＬＰ及び基質をＡＭＰＰＤとして波長４６３ｎｍに極大吸収を有する光の発光強度（カウント）で示す場合（実施例１の場合）には、２１０，０００～３２０，０００カウントが挙げられ、好ましくは２７０，０００～３００，０００カウントが挙げられるが、これに限定されるものではない。なお、前記範囲で定められるカットオフ値は、本発明のがん検査方法の目的、α２－３シアル酸付加ＣＥＡ量の測定方法、被検者や試料の性質に応じて、その範囲内からいずれか１点が選択されて適用される。

このような本発明のがん検査方法によれば、他のがんと区別して、前立腺がんに特異的な治療方針の決定等のための情報を提供することが可能となる。また、前立腺がんに罹患（再発を含む）している、又はその可能性が高い被検者を特定し、さらなる検査や確定診断を行うことにより、前立腺がんの早期発見や早期治療介入等が可能となる。さらに、がんに由来する糖鎖構造の情報はがんの浸潤性の指標となることが報告されていることから、本発明のがん検査方法によってがんの悪性度や予後についての情報を得ることも可能となる。なお、本発明の方法は、医師等による前立腺がんの診断を補助する方法、又は医師等による前立腺がんの診断のための情報を提供する方法でもある。

さらに、本発明の方法は、従来のＣＥＡ測定方法や他のモニタリングマーカーの測定方法と組み合わせるための方法としても好適であり、これにより、前立腺がんの検出感度や診断の精度をさらに向上させることが可能となる。

＜キット＞
本発明のキットは、上記本発明のがん検出方法又はがん検査方法に用いるためのキットであり、ＣＥＡに特異的に結合可能な第１のプローブ分子と、α２－３シアル酸に特異的に結合可能な第２のプローブ分子と、を備えるキットである。第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子としては、それぞれ、これらの好ましい態様も含めて、上述のとおりである。

また、本発明のキットとしては、非水溶性担体と、前記非水溶性担体に固定された第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちのいずれか一方と、を備える捕捉体、並びに、標識物質と、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちの他方と、を備える標識体、を備えることも好ましい。前記捕捉体及び前記標識体としては、それぞれ、これらの好ましい態様も含めて、上述のとおりである。

本発明のキットにおいて、第１のプローブ分子、第２のプローブ分子、前記捕捉体、及び前記標識体としては、それぞれ独立に、固体（粉末）状であっても緩衝液に溶解された液体状であってもよい。液体状である場合、各溶液における第１のプローブ分子、第２のプローブ分子、前記捕捉体、及び前記標識体の濃度は、特に限定されないが、それぞれ独立に、例えば、０．０１～１０μｇ／ｍＬであることが好ましく、０．１～５．０μｇ／ｍＬであることがより好ましく、０．５～３．０μｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。

本発明のキットとしては、他に、ＥＬＩＳＡ、ＣＬＥＩＡ、イムノクロマト等の通常の免疫学的測定方法及びそれに準じた方法で備えるべき構成をさらに備えていてもよい。例えば、上記のサンドイッチ法を本発明に係る測定方法の原理とする場合には、前記プローブ分子を固相化するための磁性ビーズやプレート、センサーチップ、前記標準試料（各濃度）、対照試薬、前記粒子懸濁媒、前記反応用バッファー、前記洗浄液、第２の水溶性高分子、遊離レクチンからなる群から選択される少なくとも１種をさらに備えていてもよい。また、前記標識物質が酵素である場合には、当該標識物質の検出・定量に必要な基質や反応停止液等をさらに含んでいてもよい。

さらに、本発明のキットは、必要に応じて、前記希釈液や、試料の前処理を行うための前処理液；希釈用カートリッジ；前処理の反応停止液又は中和液を備えていてもよい。また、前記サンドイッチ法としてイムノクロマトを採用する場合には、前記捕捉体及び／又は前記標識体を担持したゾーンを含むデバイスをさらに含んでいてもよい。前記デバイスとしては、展開液パッドや吸収パッド等、イムノクロマトに適したその他の構成要素を備えることができる。さらに、本発明のキットには、当該キットの使用説明書をさらに含んでいてもよい。

以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、各実施例及び比較例において、「％」の表示は、特に記載のない場合、重量／容量（ｗ／ｖ：ｇ／ｍＬ）パーセントを示す。

（実施例１） ブロック化標識レクチン（ＭＡＭ）を用いた血清検体に含まれるＭＡＭ結合型糖鎖付加ＣＥＡ（ＣＥＡ／ＭＡＭ）の測定
（１）ヒドラジン化デキストランの調製
４．８ｍＬの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に分子量５００ｋのデキストラン（ＣａｒｂｏＭｅｒ社製）を２４０．０ｍｇ添加し、２５℃の暗所で３０分間攪拌して溶解させた。次いで、１５０ｍＭ ＮａＩＯ_４を２．６６４ｍＬ、及びイオン交換水を０．５３６ｍＬ添加して、２５℃の暗所で３０分間攪拌した。次いで、ＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填カラム：以下単に「Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５」）を用いて、０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ６．０）でバッファー交換を行い、２０．０ｍＬの溶液を得た。得られた溶液に、５．０４ｇのＮＨ_２ＮＨ_２・ＨＣｌを添加し、２５℃の暗所で２時間攪拌した。８００ｍｇのＤＭＡＢ（ジメチルアミンボラン）を加え、さらに２５℃の暗所で２時間攪拌した。ＲＣ５０Ｋ（分子量５万の再生セルロース）透析膜を用いてイオン交換水４Ｌによる透析を暗所で３時間行った後、４℃で一晩静置した。０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いたゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５）でバッファー交換を行い、８５．０ｍＬの溶液を得た。デキストランの濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように調整し、ヒドラジン化デキストランの溶液を得た。

（２）デキストラン－酵素結合体の調製
１０ｍｇ／ｍＬのアルカリホスファターゼ（オリエンタル酵母社製、ＡＬＰ－５０）３０．０ｍＬについて、０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いたゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５）でバッファー交換を行い、３．０ｍｇ／ｍＬの溶液を９０．６ｍＬ調製した。次いで、２７ｍＭ ＮａＩＯ_４を４５．３ｍＬ添加して、２５℃の暗所で３分間攪拌した。次いで、０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いたゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５）でバッファー交換を行い、０．５ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。実施例１の（１）で調製した１．０ｍｇ／ｍＬヒドラジン化デキストランをヒドラジド基（アミノ基）の濃度が２５μＭになるように添加し、２５℃の暗所で１６時間攪拌した。ＤＭＡＢを８５ｍｇ添加し、２５℃の暗所で２時間攪拌した。次いで、１．５Ｍ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ９．０）を１０．１ｍＬ添加し、２５℃の暗所で２時間攪拌した。Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に限外濾過モジュール（ペリコンＸＬ５０、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を取り付け１５ｍＬまで濃縮し、０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を用いたゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ）を行い、３．０ｍｇ／ｍＬのデキストラン－酵素結合体の溶液１４ｍＬを得た。

（３）デキストラン－酵素結合体のマレイミド－ＰＥＧ化
実施例１の（２）で調製したデキストラン－酵素結合体に０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を加えて２ｍｇ／ｍＬデキストラン－酵素結合体を７５０μＬ調製した。これにＤＭＳＯ中に溶解した２５０ｍＭのＳＭ（ＰＥＧ）_４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＳＭ（ＰＥＧ）_４）を８．３５μＬ添加、混合し、２５℃の暗所で１時間転倒混和した。反応後、ＰＤ－１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５）を用いて２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．５％ ＣＨＡＰＳを含む０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ６．３）にバッファー交換を行った。バッファー交換後に遠心式フィルター（Ｍｅｒｃｋ社製、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ５０Ｋ）を用いてマレイミド－ＰＥＧ化デキストラン－酵素結合体の濃縮を行い、最終濃度を２ｍｇ／ｍＬに調整した。

（４）レクチンのチオール化
６ｍｇのイヌエンジュレクチン（ＭＡＭ；Ｊ－ケミカル社製）を３ｍＬの０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ７．０）中に溶解し、２ｍｇ／ｍＬ ＭＡＭ溶液を得た。２．５ｍＬのＭＡＭ溶液に１００μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（ｐＨ８．０）を添加して混和し、次いで、７５μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ２－イミノチオラン塩酸塩溶液を添加し、２５℃の暗所で１時間転倒混和した。反応後、ＰＤ－１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５）を用いて２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．５％ ＣＨＡＰＳを含む０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ６．３）にバッファー交換を行った。バッファー交換後のＭＡＭは６５０μｇ／ｍＬに調整した。

（５）カップリング
実施例１の（４）で得たチオール化して６５０μｇ／ｍＬに調整したＭＡＭ ２ｍＬに対して、実施例１の（３）で得たマレイミド－ＰＥＧ化デキストラン－酵素結合体の溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を５００μＬ添加し、２５℃の暗所で１時間転倒混和し、ＭＡＭとデキストラン－酵素結合体とをカップリングさせた。反応後、２５μＬの２００ｍＭ ３－Ｍｅｒｃａｐｔｏ－１，２－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌを添加し、２５℃の暗所で３０分間転倒混和した。さらにその後、５０μＬの２００ｍＭ ２－Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅを添加し、２５℃の暗所で３０分間転倒混和した。反応後の溶液は遠心式フィルター（Ｍｅｒｃｋ社製、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ５０Ｋ）を用いて濃縮した後にφ０．２２μｍフィルターを通過させ、ゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ、バッファー：０．１Ｍ ＭＥＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ_２、５ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．０５％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ６．８）によって精製し、最終的に３８２．１μｇ／ｍＬのブロック化標識レクチン（ＭＡＭ）（デキストラン－酵素－ＭＡＭ結合体）の溶液を２．０ｍＬ得た。

（６）測定試薬の調製
２４ｍｇの抗ＣＥＡ抗体結合磁性粒子（富士レビオ社製）に対して６ｍＬの２０ｍＭ 過ヨウ素酸ナトリウム溶液（２０ｍＭ ＮａＩＯ_４、１００ｍＭ ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を添加して混合し、４℃遮光下で３０分間転倒混和を行うことで粒子に結合した抗体の糖鎖を酸化した。酸化処理後の粒子は６ｍＬの０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）で３回洗浄した。洗浄した粒子は１０ｍＭ グリシンを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）に置換し、２５℃遮光下で１時間転倒混和を行うことで、抗体の糖鎖の酸化によって生じたアルデヒド基をグリシンでブロックした。さらに、反応後の抗体結合粒子液に１００μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＡＢを添加して２５℃遮光下で３０分間転倒混和を行い、抗体糖鎖由来のアルデヒド基とグリシンとの不安定な結合を安定化させた。反応後の粒子は０．６ｍＬの２％ ＢＳＡを含むバッファー（５０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ ＢＳＡ、０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ ３００、ｐＨ６．０）で３回洗浄し、同バッファー、３７℃の条件で１６時間転倒混和することにより、ＢＳＡを物理吸着させた。ＢＳＡを物理吸着させた抗体結合粒子は保存バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２％ ＢＳＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ ３００、ｐＨ７．２）で３回洗浄し、同バッファー中に４℃で保存した。得られた酸化処理済み抗ＣＥＡ抗体結合磁性粒子を抗体結合粒子の濃度が０．００５％となるように５０ｍＭ Ｔｒｉｓをベースとする溶液に希釈して、酸化処理済み抗ＣＥＡ抗体結合粒子液を調製した。

また、実施例１の（５）で得られたブロック化標識レクチン（ＭＡＭ）を、濃度が０．５μｇ／ｍＬとなるように５０ｍＭ ＭＥＳをベースとする溶液に希釈して標識体液を調製した。

（７）血清検体に含まれるＣＥＡ及びＭＡＭ結合型糖鎖付加ＣＥＡ（ＣＥＡ／ＭＡＭ）の測定
健常人から採取した血清検体１０例（健常人群：健常人１～１０）、前立腺肥大患者から採取した血清検体１０例（前立腺肥大群：前立腺肥大１～１０）、及び、前立腺癌患者から採取した血清検体１５例（前立腺癌群：前立腺癌１～１５）について、それぞれ、検体希釈液（富士レビオ社製）を用いて体積比で１／１０濃度に希釈した。

希釈した各検体について、ルミパルス（登録商標）Ｌ－２４００（富士レビオ社製）を用いて、血清検体に含まれるＭＡＭ結合型糖鎖付加ＣＥＡ（ＣＥＡ／ＭＡＭ）の測定を行った。すなわち、５０μＬの各希釈検体溶液を、実施例１の（６）で調製した酸化処理済み抗ＣＥＡ抗体結合粒子液５０μＬと混和し、３７℃で８分間反応させた。次いで、磁性粒子を集磁し、ルミパルス（登録商標）洗浄液（富士レビオ社製）で５回洗浄した。次いで、実施例１の（６）で調製した標識体液をそれぞれ５０μＬ添加し、３７℃で８分間反応させた。次いで、磁性粒子を集磁し、５回洗浄した後、ＡＭＰＰＤ（３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）を含むルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社製）を５０μＬ添加し、３７℃で４分間反応させた。磁性粒子に結合したブロック化標識レクチン（ＭＡＭ）のアルカリホスファターゼの触媒作用によりＡＭＰＰＤが分解されることで放出される、波長４６３ｎｍに極大吸収を有する光の発光強度（カウント）を、ルミパルス（登録商標）Ｌ－２４００（富士レビオ社製）を用いて計測し、測定結果とした。

また、上記で希釈した各検体に含まれるＣＥＡは、抗ＣＥＡ抗体結合粒子及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗ＣＥＡ抗体を備えるルミパルスプレスト（登録商標）ＣＥＡ（富士レビオ社製）を用いて、上記と同様にルミパルス（登録商標）Ｌ－２４００（富士レビオ社製）によって測定した。測定結果は、上記と同様に基質（ＡＭＰＰＤ）の発光強度（カウント）で出力した。各検体における測定結果を下記の表１に示す。なお、表示の結果は、二重測定の平均値を示す。

（８）健常人、前立腺肥大、及び前立腺癌の各群間での測定値の比較
表１の結果について、健常人群と前立腺癌群との間で統計学的に有意な差が認められるか検討した。図１に健常人群及び前立腺癌群のＣＥＡの測定結果を、図２に健常人群及び前立腺癌群のＣＥＡ／ＭＡＭの測定結果を、図３に前立腺肥大群及び前立腺癌群のＣＥＡの測定結果を、図４に前立腺肥大群及び前立腺癌群のＣＥＡ／ＭＡＭの測定結果を、それぞれ示す。

Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定によって検定を行ったところ、健常人群と前立腺癌群との間にはＣＥＡの測定値については有意な差が認められなかった（図１、ｐ＝０．１０１８）のに対して、ＣＥＡ／ＭＡＭの測定値については有意な差が認められた（図２、ｐ＝０．０２４７）。同様に、前立腺肥大群と前立腺癌群との間でも、ＣＥＡの測定値については有意な差が認められなかった（図３、ｐ＝０．９３３７）のに対して、ＣＥＡ／ＭＡＭの測定値については有意な差が認められた（図４、ｐ＝０．０００６）。

また、図５に、ＣＥＡの測定値とＣＥＡ／ＭＡＭの測定値との関係を示す。図５に示されるように、ＣＥＡの測定値とＣＥＡ／ＭＡＭの測定値との間に明確な相関関係は示されなかった（回帰直線：ＣＥＡ／ＭＡＭ（カウント）＝２５７１７３．５８－１０．６４３３８８×ＣＥＡ（カウント）、Ｒ^２＝０．０１５１１２、分散分析のｐ値＝０．４８１７）。このことから、ＣＥＡ／ＭＡＭの測定値は単にＣＥＡの存在量を表すものではなく、ＣＥＡ（ＭＡＭ結合型糖鎖以外の部位に対して特異的に結合可能な抗ＣＥＡ抗体に認識される）とは異なるバイオマーカーであることが示された。

以上より、ＣＥＡ／ＭＡＭの測定は、健常人と前立腺癌患者との判別、又は、前立腺肥大患者と前立腺癌患者との判別の新規の指標となることが示された。

（９）ＣＥＡ／ＭＡＭの測定値とＰＳＡ測定値との比較
先ず、実施例１の（７）で用いたものと同様の前立腺肥大患者から採取した血清検体１０例、前立腺癌患者から採取した血清検体１５例について、検体中に含まれるＰＳＡ量を測定した。測定は、各検体について、希釈は行わず、抗ＰＳＡ抗体結合粒子及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗ＰＳＡ抗体を備えるルミパルスプレスト（登録商標）ＰＳＡ（富士レビオ社製）を用いて、ルミパルス（登録商標）Ｌ－２４００（富士レビオ社製）によって測定した。測定結果は、ＰＳＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）で出力した。各検体における測定結果を下記の表２に示す。

次いで、表２の結果に対して、ＰＳＡ測定値の一般的なカットオフ値である４ｎｇ／ｍＬを用い、カットオフ値を上回る検体を陽性とした場合の前立腺癌患者の検出能力を試験した。その結果、前記カットオフ値で陽性と判定されたのは前立腺癌群では１５検体中４検体であり、２６．７％であった。また、前立腺肥大群では１０検体中１検体が前記カットオフ値で陽性と判定され、擬陽性となった。

他方、ＣＥＡ／ＭＡＭの測定値（表１）についても、健常人群の測定値からカットオフ値を算出し、カットオフ値を上回る検体を陽性とした場合の前立腺癌患者の検出能力を試験した。カットオフ値は、健常人郡の測定値の平均に健常人群の測定値の標準偏差の値に２を乗じた値を加算して、２９９，２１６カウント以下と算出された。その結果、このカットオフ値で陽性と判定されたのは前立腺癌群では１５検体中８検体であり、５３．３％であった。また、健常人群と前立腺肥大群とを合わせた２０検体全てが陰性と判定された。

さらに、図６に、ＰＳＡの測定値とＣＥＡ／ＭＡＭの測定値との関係を示す。図６に示されるように、今回の結果からは、ＰＳＡの測定値とＣＥＡ／ＭＡＭの測定値との間に明確な相関関係は示されなかった（回帰直線：ＣＥＡ／ＭＡＭ（カウント）＝２３３８５３．６８－４０５６．１９５２×ＰＳＡ（ｎｇ／ｍＬ）、Ｒ^２＝０．００８８５１、分散分析のｐ値＝０．６５４６）。

以上より、ＣＥＡ／ＭＡＭの測定による前立腺癌の検出能力（感度、特異度）はＰＳＡと比較しても十分に高く、さらに、ＰＳＡとは独立した診断指標として利用できることが示された。

（比較例１） ＭＡＭ以外のレクチンを用いたブロック化標識レクチンによる糖鎖付加ＣＥＡの測定
ＭＡＭに代えて、Ｎ－アセチルガラクトサミンを認識するノダフジレクチン（ＷＦＡ、ＶＥＣＴＯＲ社製）を結合させたブロック化標識レクチン（ＷＦＡ）を調製した。すなわち、ＭＡＭに替えてＷＦＡを用い、かつ、デキストランを分子量２５０ｋのもの（ＣａｒｂｏＭｅｒ社製）に変更した以外は、実施例１の（１）～（５）と同様の方法で、最終的に３７３．９μｇ／ｍＬのブロック化標識レクチン（ＷＦＡ）（デキストラン－酵素－ＷＦＡ結合体）の溶液を２．０ｍＬ得た。なお、デキストランのサイズは、レクチンの糖鎖型特異性に影響するものではない。

ブロック化酵素レクチン（ＭＡＭ）に代えて、得られたブロック化酵素レクチン（ＷＦＡ）を用いたこと以外は、実施例１の（６）～（７）と同様の方法で、実施例１の（７）で用いたものと同様の健常人から採取した血清検体１０例（健常人群：健常人１～１０）、及び前立腺癌患者から採取した血清検体１５例（前立腺癌群：前立腺癌１～１５）について、各検体に含まれるＷＦＡ結合型糖鎖付加ＣＥＡ（ＣＥＡ／ＷＦＡ）の測定を行った。各検体における測定結果を下記の表３に示す。

表３の結果について、健常人群と前立腺癌群との間で統計学的に有意な差が認められるか検討した。図７に健常人群及び前立腺癌群のＣＥＡ／ＷＦＡの測定結果を示す。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定によって検定を行ったところ、健常人群と前立腺癌群との間にはＣＥＡ／ＷＦＡの測定値について有意な差が認められなかった（図７、ｐ＝０．４５４０）。以上より、ＣＥＡとＭＡＭ結合型糖鎖との組み合わせを測定するＣＥＡ／ＭＡＭの測定は、健常人と前立腺癌患者との判別に特異的な新規の指標となることが示された。

本発明によれば、新たなバイオマーカーを指標とした、高感度で前立腺がんを特異的に検出可能ながん検出方法及びがん検査方法、並びに、これらの方法に用いるキットを提供することが可能となる。

Claims (14)

1. 前立腺がんを検出するための方法であり、試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定する測定工程を含むことを特徴とする、方法。
2. 前立腺がんを検査するための方法であり、被検者由来の試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定する測定工程を含むことを特徴とする、方法。
3. 前立腺がんであると予測される被検者をスクリ－ニングする方法であり、被検者由来の試料中のα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を測定する測定工程と、測定されたα２－３シアル酸付加ＣＥＡ量を指標として被検者を選別する選別工程と、を含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. α２－３シアル酸付加ＣＥＡにおいて、α２－３シアル酸がＭＡＭに結合するＭＡＭ結合型糖鎖であることを特徴とする、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の方法。
5. 前記測定工程が、前記試料と、ＣＥＡに特異的に結合可能な第１のプローブ分子及びα２－３シアル酸に特異的に結合可能な第２のプローブ分子と、を接触させる工程であることを特徴とする、請求項１～４のうちのいずれか一項に記載の方法。
6. 第１のプローブ分子が、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗体であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 第２のプローブ分子が、α２－３シアル酸に特異的に結合可能なレクチンであることを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
8. 前記測定工程が、前記試料と、捕捉体及び標識体と、を接触させる工程であり、
   前記捕捉体が、非水溶性担体と、前記非水溶性担体に固定された第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちのいずれか一方と、を備えるものであり、かつ、
   前記標識体が、標識物質と、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちの他方と、を備えるものである、
   ことを特徴とする、請求項５～７のうちのいずれか一項に記載の方法。
9. 前記捕捉体が、非水溶性担体と、前記非水溶性担体に固定された第１のプローブ分子と、を備えるものであり、かつ、
   前記標識体が、水溶性担体と、前記水溶性担体に固定された標識物質及び第２のプローブ分子と、を備え、第２のプローブ分子がα２－３シアル酸に特異的に結合可能なレクチンであるブロック化標識レクチンである、
   ことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 請求項５～９のうちのいずれか一項に記載の方法に用いるためのキットであり、ＣＥＡに特異的に結合可能な第１のプローブ分子と、α２－３シアル酸に特異的に結合可能な第２のプローブ分子と、を備えることを特徴とする、キット。
11. 第１のプローブ分子が、ＣＥＡに特異的に結合可能な抗体であることを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
12. 第２のプローブ分子が、α２－３シアル酸に特異的に結合可能なレクチンであることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のキット。
13. 非水溶性担体と、前記非水溶性担体に固定された第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちのいずれか一方と、を備える捕捉体、並びに、
    標識物質と、第１のプローブ分子及び第２のプローブ分子のうちの他方と、を備える標識体、
    を備えることを特徴とする、請求項１０～１２のうちのいずれか一項に記載のキット。
14. 前記捕捉体が、非水溶性担体と、前記非水溶性担体に固定された第１のプローブ分子と、を備えるものであり、かつ、
    前記標識体が、水溶性担体と、前記水溶性担体に固定された標識物質及び第２のプローブ分子と、を備え、第２のプローブ分子がα２－３シアル酸に特異的に結合可能なレクチンであるブロック化標識レクチンである、
    ことを特徴とする、請求項１３に記載のキット。