FI96143C

FI96143C - Biospesifinen määritysmenetelmä

Info

Publication number: FI96143C
Application number: FI931151A
Authority: FI
Inventors: Antti Juhana Iitiae; Timo Nils-Erik Loevgren; Kim Sverker Immanue Pettersson
Original assignee: Wallac Oy
Priority date: 1993-03-16
Filing date: 1993-03-16
Publication date: 1996-05-10
Also published as: US7192786B1; FI931151L; FI931151A0; EP0617287A3; EP0617287A2; FI96143B; JPH06317592A

Description

96143

BIOSPESIFINEN MÄÄRITYSMENETELMÄ - BIOSPECIFIK BESTÄMNINGSMETOD

Keksinnön kohteena on biospesifinen määritysmenetelmä, jossa määritettävä analyytti saatetaan sitoutumaan mikropartikkeleiden pintaan kyseistä analyyttia sitovan bioaffiniteettikomponentin välityksellä, ja mitataan 5 yksittäisiin mikropartikkeleihin sitoutunut analyyttimäärä.

Perinteiset radioimmunomääritykset tehtiin alussa liuoksessa koeputkia ja monimutkaisia erotusmenetelmiä käyttäen. Kiinteän faasin teknologian tultua markkinoille erilaiset merkkiaineet ovat korvanneet radioisotooppeja, ja 10 erityisesti monoklonaalisia vasta-aineita on sovellettu lisääntyvässä määrin.

Nämä parannukset ovat erilaistaneet perinteisiä immunomäärityksiä sekä muita bioaffiniteettimäärityksiä (esim. Alternative Immunoassays, W.P. Collins, Wiley, 15 Chichester 1985 ja Luminescense Immunoassay and Molecular Applications, Ed. Knox van Dyke, CRC Press, Boston 1990 ja R.P. Ekins et al., Clin. Chem. 1991? 37:1955 - 1967). Kiinteän faasin määrityksistä on tullut rutiinimenetelmiä sekä kilpailevien että ei-kilpailevien määritysten 20 alueella, ja perinteinen koeputki on usein korvattu *. vaihtoehtoisella kiinteällä faasilla. Rutiininomaisessa hormoonimäärityksessä esiteltiin mikrotiterlevy kiinteänä faasina vuonna 1984 Wallac Oy:n (Turku, Finland) tuodessa DELFIA-teknologian markkinoille. Muut kaupalliset yritykset 25 ovat myös ottaneet käyttöönsä mikrotiterlevyn vastaavissa, mutta eri leimausteknologioihin perustuvissa rutiinimäärityksissä.

Eri materiaaleista tehdyt mikropartikkelit ovat jo pitemmän ajan tarjonneet bioaffiniteettimäärityksille vaihtoehtoisen 30 kiinteän faasin (esim. Molday W.J. et ai., J. Cell. Biol.; 1975: 64, 75 ja Nustad K. et ai.,: Microspheres. Medical and biological applications, Ed. A. Rembaum ja Z.A. Tökes, 2 96143

Boca Raton, Florida, CRC Press 1988). Verrattuna mikrotiterlevyyn mikropartikkelit tarjoavat useita etuja, joista mainittakoon erityisesti tuotantomittakaavaan helpommin sovellettava bioaffiniteettikomponenttien 5 immobilisointiprosessi sekä mikropartikkeleilla saavutettavissa oleva suurempi reaktionopeus. Kiinteän faasin kapasiteetti mikropalloilla on myös helposti säädettävissä yksinkertaisesti annostelemalla kyseiseen sovellutukseen optimaalinen partikkelimäärä.

10 Mikropartikkeleiden suurimmat haitat bioaffiniteettimäärityksissä ovat perinteisesti löytyneet nesteenkäsittelypuolella (esimerkiksi pesut). Magneettisten mikropallojen ansiosta tämä ongelma on osittain poistunut ja viime vuosina yhä useammat kaupalliset automaattiset 15 immunomääritysjärjestelmät perustuvat niiden käyttöön.

Nykyään on saatavissa uusien valmistusmenetelmien ansiosta mikropartikkeleita, joiden koko on tarkasti ja toistettavasti määriteltävissä (esimerkiksi läpimitta 0.04 - 20 μιη). Lisäksi bioaf f initeettikomponenttien 20 immobilisointi mikropartikkeleihin voidaan tehdä käyttäen erilaisia kemiallisia vaihtoehtoja.

Kilpaileva biospesifinen määritysmenetelmä voidaan kuvata seuraavasti: Mikropartikkelit on päällystetty bioaffiniteettikomponentilla A, jonka sitoutumispaikoista : 25 kilpailee toisaalta näytteen sisältämä analyytti ja toisaalta bioaffiniteettikomponentti B, joka tässä tapauksessa on sopivalla leimalla leimattu analyytti. Jos on immunomäärityksestä kysymys käytetään bioaffiniteettikomponentti B:nä leimattua antigeeniä, 30 jolloin antigeeni on sama kuin näytteen sisältämä ' antigeeni. Koska näytteen sisältämä analyytti ja leimattu analyytti kilpailevat keskenään bioaffiniteettikomponentti A:n sitoutumiskohdista tulee mikropartikkeliin välillisesti sitoutunut leimamäärä, ja siten 35 mikropartikkelista lähtevä signaalitaso, olemaan kääntäen verrannollinen näytteen sisältämään analyyttipitoisuuteen.

• · 11 3 96143

Ei-kilpaileva biospesifinen määritysmenetelmä voidaan kuvata seuraavasti: Mikropartikkelit on päällystetty bioaffiniteettikomponentilla A, jonka sitoutumispaikkoihin kulkeutuu ainoastaan näytteen sisältämä analyytti.

5 Bioaffiniteettikomponentti B, joka tässä tapauksessa on sopivalla leimalla leimattu, näytteen sisältämään analyyttiin suunnattu komponentti, sitoutuu analyyttiin, joka bioaffiniteettikomponentin A välityksellä on kytketty mikropartikkeliin. Jos on immunomäärityksestä kysymys 10 käytetään bioaffiniteettikomponentti B:nä leimattua vasta-ainetta, joka on suunnattu näytteen sisältämään antigeeniin. Mikropartikkeliin välillisesti sitoutunut leimamäärä, ja siten mikropartikkelista lähtevä signaalitaso, tulee olemaan suoraan verrannollinen näytteen 15 sisältämään analyyttipitoisuuteen.

Kilpailevan ja ei-kilpailevan immunomäärityksen herkkyyttä on aikaisemmin laajalti käsitelty (Ekins R.P. et ai., Pure and Appi. Chem., 1985; 57: 473 - 482 ja Ekins R.P. et ai., Clin. Chem., 1991; 37: 1955 - 1967). Tämän keksinnön 20 kannalta on olennaista tarkastella kummankin määritysperiaatteen herkkyyteen ja toimivuuteen vaikuttavia tekijöitä.

Maksimaalinen herkkyys kilpailevassa immunomäärityksessä : käytettäessä vasta-ainetta (bioaffiniteettikomponenttia), 25 jonka affiniteettivakio on K, saadaan signaalitason suhteellisesta virheestä O-pitoisuudessa jaettuna K:11a. Signaalitason virheeseen vaikuttaa kaksi osakomponenttia, eli kokeellinen virhekomponentti, joka tulee pipetoinnista ja muusta manipuloinnista, sekä signaalitason mittauksen 30 virhekomponentti, esimerkisi signaalitason mittauksen statistinen virhe. Yksinkertaisuuden vuoksi voidaan olettaa, että signaalitason mittauksesta tuleva virhe on 0, mikä yleensä on tilanne kun käytetyn merkkiaineen spesifinen aktiivisuus on korkea. Tällöin kilpailevan 35 määrityksen maksimaalinen saavutettavissa oleva herkkyys on €/K, jossa € on kokeellisten tekijöiden yhteinen 4 96143 suhteellinen virhe. Esimerkiksi olettaen, että kokeellinen virhe on suuruusluokkaa 1 %, niin maksimaalinen saavutettavissa oleva herkkyys vasta-aineella, jolla on mahdollisimman korkea affiniteettivakio kuten 1012 5 litraa/mooli, on suuruusluokkaa 0.01 pmoolia/litra.

Herkkyysmääritelmällä on myös osoitettavissa, että jollei kokeellista virhettä melkein täysin eliminoida (<0.1 %), ei herkkyysetua saavuteta käyttämällä merkkiainetta, jolla on erittäin korkea spesifinen aktiivisuus.

10 Vastaavasti ei-kilpailevan määrityksen herkkyyteen vaikuttavat seuraavat tekijät: a) mitattavan signaalitason suhteellinen virhe (a) kun mitattavaa analyyttiä ei ole läsnä, eli leimatun vasta-aineen (bioaffiniteettikomponentin) epäspesifisestä 15 sitoutumisesta aiheutunut virhe b) epäspesifisesti sitoutuneen leimatun vasta-aineen suhteellinen osuus (k), ja c) vasta-aineen affiniteettivakio (K)

Ei-kilpailevan määrityksen herkkyys on tällöin k/K x a.

20 Sekä kilpailevan että ei-kilpailevan määrityksen herkkyys on kääntäen verrannollinen käytetyn vasta-aineen affiniteettivakioon, mutta ei-kilpailevaan määritykseen vaikuttaa leimatun vasta-aineen epäspesifisen sitoutumisen aiheuttama suhteellinen virhe sekä leimatun vasta-aineen ' 25 suhteellinen sitoutuminen, joille esimerkiksi molemmille voisi antaa arvoksi 1 %. Tällöin ei-kilpailevan määrityksen maksimaalinen herkkyys on 0.0001 x 1/K, eli 0.1 fmoolia/litra, jos käytetyn vasta-aineen affiniteettivakio on 10 litraa/mooli, mitä pidetään yleensä korkeimpana 30 mahdollisena. Ei-kilpailevassa määrityksessä on syytä ; huomioida käytettävän merkkiaineen spesifinen aktiivisuus, koska tämä vaikuttaa tekijöihin a) ja b), jolloin määrityksen herkkyyttä on mahdollista parantaa.

Bioaffiniteettireaktioita käyttävissä määrityksissä on 35 huomioitava rakenteellisesti erilaisten määritysten « · herkkyyttä rajoittavat tekijät, mikä on myös tämän

II

5 96143 keksinnön kannalta oleellista, koska mittaukset tehdään yksittäisiltä mikropartikkeleilta erittäin pienten analyyttimäärien läsnäollessa.

Keksinnön kohteena on biospesifinen määritysmenetelmä, 5 jossa sekoitetaan mikropartikkeleita, jotka ovat päällystetty määritettävää analyyttia sitovalla bioaffiniteettikomponentilla A; analysoitava näyte; ja merkkiaineella leimattu bioaffiniteettikomponentti B. Sitoutumisreaktion jälkeen kvantitoidaan 10 mikropartikkeleihin sitoutuneen leimatun bioaffiniteettikomponentin B aiheuttama signaalitaso näytteen analyyttipitoisuuden määrittämiseksi. Keksinnön mukaan käytetään määrityksessä sellaista mikropartikkelimäärää, joka sidottuaan näytteen analyytin 15 aiheuttaa jokaiselle yksittäiselle mikropartikkelille sellaisen signaalitason, jonka perusteella pystytään tunnistamaan näytteen analyyttipitoisuus koko sillä alueella, jossa näytteen analyyttipitoisuus tyypillisesti vaihtelee, ja mitataan erikseen jokaisen mikropartikkelin 20 antama signaalitaso.

Keksinnön avulla saadaan näytteen analyytti määritettyä mahdollisimman pienestä analyyttipitoisuudesta ja -tilavuudesta valitsemalla sellainen mikropartikkelimäärä, että yksittäisen mikropartikkelin pintaan sitoutunut 25 analyyttimäärä on mitattavissa käytössä olevalla herkällä merkkiaineteknologialla. Biospesifinen reaktio voi olla immunomääritys, nukleiinihappo-hybridisaatio, ligandi-lektiini-määritys tai ligandi-reseptorimääritys.

Bioaffiniteettireaktio suoritetaan edullisesti 30 mikropartikkelille, jonka halkaisija on pienempi kuin 1 mm. Analyytin pitoisuus mikropartikkelin pinnalla mitataan käyttäen merkkiaineella leimattua bioaffiniteettikomponenttia B, jolloin merkkiaineena käytetään fluoresenssia, aika-erotteista fluoresenssia, 35 kemiluminesenssia tai bioluminesenssia aiheuttavaa ainetta.

• ·

Keksinnön mukaan on mahdollista määrittää sekä korkeimman 6 96143 että alhaisimman mitattavan analyytin pitoisuus yksittäisistä mikropartikkeleista. Määrityksen herkkyyttä sekä mitta-alueen laajuutta säädellään määrityksessä käytettävien mikropartikkeleiden määrällä.

5 Keksintöä voidaan soveltaa moniin erityyppisiin biospesifisiin affiniteettireaktioihin, vaikka kaikkein yleisin on immunokemiallinen reaktio. Tästä syystä keksintöä kuvataan ensisijassa immunokemialliseksi määritykseksi. Kysymykseen tulevat biospesifiset 10 affiniteettireaktiot (immunoreaktiot) ovat joko kilpailevia (kompetitiiviset) tai ei-kilpailevia (non-kompetitiiviset). Molemmat immunomääritysperiaatteet ovat yleisesti tunnettuja. Kyseisten immunomääritysperiaatteiden herkkyyteen vaikuttavat tekijät ovat tiedossa ja 15 määritysten optimaalinen herkkyys on laskettavissa. Kilpailevan määrityksen suurin saavutettavissa oleva herkkyys on noin 10 fmoolia/1. Herkkyys ei ole parannettavissa nostamalla käytetyn merkkiaineteknologian spesifistä aktiivisuutta. Herkkyyttä voidaan parantaa 20 tiettyyn rajaan saakka käyttämällä mahdollisimman pientä vasta-ainepitoisuutta. Kilpailevassa määrityksessä mitattavan merkkiaineen antama signaalitaso on kääntäen verrannollinen määritettävän näytteen pitoisuuteen.

Ei-kilpailevan määrityksen suurin saavutettavissa oleva 25 herkkyys on noin 0.1 - 0.01 fmoolia/1. Herkkyys on parannettavissa, jos käytössä on merkkiaine, jonka spesifinen aktiivisuus on hyvin korkea. Herkkyyttä voidaan parantaa tiettyyn rajaan saakka käyttämällä mahdollisimman suurta pitoisuutta leimattua vasta-ainetta edellyttäen, 30 että määrityksen tausta (epäspesifinen sitoutuminen pintaan) ei nouse. Ei-kilpailevassa määrityksessä mitattavan merkkiaineen antama signaalitaso on suoraan verrannollinen määritettävän näytteen pitoisuuteen.

Kilpailevassa immunomäärityksessä voidaan olettaa, että 35 määritettävän analyytin mittausalue on tyypillisesti 100-

II

7 96143 kertainen, eli niin laaja, että suhde korkeimman ja alhaisimman mittausarvon välillä on 100. Kilpailevassa määrityksessä alhaisin pitoisuus antaa korkeimman signaalitason ja korkein pitoisuus antaa alhaisimman 5 signaalitason. Mikropartikkeleilla tehtävässä kilpailevassa määrityksessä, jossa tulos luetaan yksittäisiltä partikkeleilta, on täten pystyttävä lukemaan sekä alhaisimman että korkeimman näytepitoisuuden antama signaalitaso. Olettaen, että mitattavan näytteen 10 mittausalue on 1 - 0.01 pmoolia/1, niin pitoisuus 0.01 pmoolia/1 antaa korkeimman signaalitason ja 1 pmoolia/1 antaa alhaisimman. Kyseisen esimerkkianalyytin pitoisuus on 1 - 0.01 attomoolia/μΐ, joka tarkoittaa, että käytettäessä 1 μ1:η näytemäärää (1 - 0.01 attomoolia määritettävää 15 analyyttia), on yhdestä mikropartikkelista pystyttävä mittaamaan sekä korkein (0.01 attomoolia näytettä) että alhaisin (1 attomoolia näytettä) signaalitaso. Tämä tarkoittaa sitä, että kun kilpailevan analyytin pitoisuus on alhainen saadaan mahdollisimman monta leimattua 20 analyyttimolekyylia eli bioaffiniteettikomponenttia spesifisesti tarttumaan yksittäisen spesifisellä vasta-aineella eli toisella bioaffiniteettikomponentilla pinnoitetun mikropartikkelin pintaan. Alhaisin analyyttipitoisuus merkitsee, että 1 μ1:η näyte sisältää 25 noin 6000 molekyyliä määritettävää analyyttia, kun taas korkein pitoisuus vastaa noin 600 000 molekyylia mikrolitraa kohti. Kilpailevalle määritykselle tyypillisesti signaalitaso putoaa noin 100 %:sta noin 5 -25 %:in analyyttipitoisuuden noustessa. Mikropartikkeleiden 30 määrä ja niihin pinnoitetun analyyttispesifisen vasta-aineen määrä suhteutetaan mahdollisimman pieneen näytevolyymiin niin, että korkeimmalla näytepitoisuudella saadaan 75 - 95 %:n korvautuminen (määritettävä analyytti korvaa leimatun analyytin). Tällöin käytetyllä 35 merkkiaineteknologialla jäljellä oleva signaalitaso on vielä toistettavasti mitattavissa yksittäisten mikropartikkeleiden pinnalta ja samalla alhaisiromalla analyyttipitoisuudella mitattava signaalitaso (leimatun 8 96143 analyytin spesifinen sitoutuminen päällystettyyn mikropartikkeliin) ei ylitä yksittäisten partikkeleiden sitomiskapasiteettia. Eri määritysten vaatimaa mitta-aluetta säädetään vaihtelemalla määrityksessä käytettävien 5 mikropartikkeleiden ja vasta-aineiden määrää aina niin, että mittaus on mahdollista suorittaa yksittäisiltä mikropartikkeleilta.

Ei-kilpailevan immunomäärityksen herkkyys on parhaimmillaan 0.01 - 0.1 fmoolia/1 ja mitta-alueen laajuus on 10 tyypillisesti yli 100-kertainen, eli suhde korkeimman ja alhaisimman mittausarvon välillä on suurempi kuin 100. Määrityksessä mitattava signaalitaso on suoraan verrannollinen määritettävän analyytin pitoisuuteen. Olettaen, että määritettävän analyytin herkkyysvaatimus 15 näytemittauksessa on 0.01 pmoolia/1 ja että mittausalueen laajuus on 1000-kertainen sisältää 1 μ1:η näytevolyymi 0.01 - 10 attomoolia määritettävää analyyttia. Jos käytettävän merkkiaineteknologian herkkyys on noin 6000 molekyylia mikropartikkelia kohti ja kun signaalitaso on suoraan 20 verrannollinen analyytin pitoisuuteen voidaan 1 μ1:η sisältämä analyyttimäärä kerätä yhden mikropartikkelin pintaan ja sen määrä mitata. Määrityksessä käytettävien mikropartikkeleiden määrä voidaan nostaa näytetilavuutta muuttamatta, jos merkkiaineteknologian herkkyys on 25 edellistä suurempi tai useampia merkkiainemolekyylejä kytketään leimattavaan analyyttispesifiseen vasta-aineeseen (bioaffiniteettikomponenttiin). Vastaavasti jos merkkiaineteknologian herkkyys on edellistä alhaisempi huononee määrityksen herkkyys tai sitten tarvittava 30 analyyttimäärä yksittäisen mikropartikkelin pintaan on kerättävä suuremmasta näytevolyymistä mikä toisaalta kaventaa mitta-alueen laajuutta. Määrityksessä käytettävien, analyytille spesifisellä vasta-aineella eli bioaffiniteettikomponentilla päällystettyjen 35 mikropartikkeleiden määrä sekä määritettävän analyytin määrä mikropartikkelia kohti säädetään niin, että mahdollisimman pienestä analyyttipitoisuudesta ja 11 9 96143 tilavuudesta saadaan yksittäisten mikropartikkeleiden pintaan tarttumaan analyyttimäärä, joka on mitattavissa leimatulla spesifisellä vasta-aineella (leimatulla bioaffiniteettikomponentilla) käytössä olevalla herkällä 5 merkkiaineteknologialla. Eri vaatimusten edellyttämää mitta-alueen laajuutta ja määrityksen herkkyyttä säädetään vaihtelemalla määrityksessä käytettävien mikropartikkeleiden määrä ja tarvittaessa näytteen tilavuutta.

10 Muut spesifiset bioaffiniteettimääritykset kuten nukleiinihappo-hybridisaatio-määritykset, ligandi-lektiini-määritykset ja ligandi-reseptorimääritykset käyttäytyvät edellä kuvattujen immunomääritysvaihtoehtojen mukaisesti.

Yksittäisiä mikropartikkeleita voidaan määrittää 15 esimerkiksi virtaussytometria, aika-erotteista mikroskooppia tai aika-erotteista mikrofluorometriä tai muita aika-erotteiseen teknologiaan perustuvia mittalaitteita hyväksikäyttäen (US 5,028/545? Seveus L et ai.. Cytometry 13: 329 - 338 (1992).

20 Mikropartikkeleita voidaan myös tarvittaessa käyttää multiparametrimäärityksissä/ jolloin samanaikaisesti määritetään samasta näytetilavuudesta useita analyyttejä. Multiparametrimäärityksessä käytetään mikropartikkeliseosta, jossa eri analyyttiä määrittävät 25 partikkelit ovat pinnoitettu analyyttispesifisellä bioaffiniteettikomponentilla. Mittaustilanteessa analyyttispesifiset mikropartikkeliluokat tunnistetaan esimerkiksi koon, fluoresenssin, aika-erotteisen fluoresenssin, kemiluminesenssin tai bioluminesenssin 30 perusteella. Bioaffiniteettireaktioon perustuvat multiparametrimääritykset mikropartikkeleilla toimivat edellä esitetyn menetelmän mukaisesti. Mikäli määritetään useita eri analyyttejä samanaikaisesti säädetään määrityksessä käytettävien analyyttispesifisten 35 mikropartikkeleiden määrä analyytin vaatimusten mukaisesti 10 96143 noudattaen yllä esitettyjä periaatteita.

Keksintö on lisäksi kuvattu seuraavin ei-rajoittavin esimerkein.

Esimerkki 1 5 Merkkiaineinaärän (fluoresoiva Eu-kelaatti) kvantitointi mikropartikkelia kohti sekä immunomäärityksen mittaus yksittäisiltä mikropartikkeleilta käyttäen mallina ei-kilpailevää hCG-määritystä ja aika-erotteiseen fluoresenssiin perustuvaa mittausta.

10 hCG-määritys (hCG = human corionic gonadotropin) on tehty tyypillisenä ei-kilpailevana immunomäärityksenä, jossa β-alayksikkö spesifinen monoklonaalinen vasta-aine on biotinyloitu ja sidottu streptavidiinilla pinnoitettuihin 20 μιη mikropartikkeleihin. Leimattuna 15 bioaffiniteettikomponenttina on käytetty fluoresoivalla Eu-kelaatilla leimattua monoklonaalista vasta-ainetta, joka spesifisesti tunnistaa hCG:n α-alayksikön. Immunomääritys on suoritettu yksivaiheisena, jolloin vasta-aineella pinnoitetut mikropartikkelit, hCG standardi (2-10000 U/l, 20 jossa U/l = yksikkö/1) ja leimattu vasta-aine ovat kaikki samanaikaisesti mukana. Immunomäärityksen jälkeen mikropartikkelien määrä on tarkistettu laskemalla ja tunnetusta mikropartikkelimäärästä on Eu-pitoisuus mitattu käyttäen DELFIA-kehitysliuosta, jonka jälkeen Eu-25 molekyylien määrä mikropartikkelia kohti on laskettavissa. Lisäksi yksittäiset mikropartikkelit on mitattu aika-erotteisella mikrofluorometrillä, jolloin fluoresoivalla i Eu-kelaatilla leimatun hCG spesifisen vasta-aineen pitoisuus partikkelia kohti on mitattavissa.

30 Esimerkkitapauksena käytettyä hCG määritystä ei ole tarkoin optimoitu.

Tulokset: Taulukossa 1 on esitetty hCG määrityksen tulos käytettäessä 20 |im mikropartikkeleita. Käytetyissä

II

11 96143 määritysolosuhteissa on pienimmällä hCG pitoisuudella saatu n. 5000 Eu-molekyyliä mikropartikkelia kohti, joskin hajonta kokeessa on vielä suuri. Lisäksi mittausalueen laajuus on vähintään 1000-kertainen. Kuviossa 1 on esitetty 5 hCG standardikuvaaja, joka on saatu kun mitataan yksittäisiä mikropartikkeleita aika-erotteisella mikrofluorometrillä.

Esimerkki 2

Vasta-aineella (bioaffiniteettikomponentilla) 10 pinnoitettujen mikropartikkeleiden määrän vaikutus määrityksen herkkyyteen käyttäen mallina ei-kilpailevaa hCG:n immunomääritystä ja aika-erotteiseen fluoresenssiin perustuvaa yksittäisten mikropartikkeleiden mittausta mikrofluorometrillä.

15 hCG:n immunomääritys tehtiin edellisen esimerkin mukaisesti. Määrityksessä käytettiin 20 μ1:η kokonaistilavuutta, kolmea standardipatoisuutta (0, 250, 2500 U/l) sekä kolmea eri mikropartikkelimäärää. Immunoreaktion jälkeen yksittäiset mikropartikkelit 20 mitattiin aika-erotteisella mikrofluorometrillä.

Tulokset: Taulukosta 2 sekä kuviosta 2 on nähtävissä miten mikropartikkeleiden määrä vaikuttaa yksittäisistä partikkeleista mitattavaan signaalitasoon (fotonia/s/partikkeli), eli kun mikropartikkeleiden määrä 25 pienenee saadaan näytteen sisältämä hCG (analyytti) määrä kerättyä suuremmassa pitoisuudessa yksittäisten mikropartikkeleiden pintaan, jolloin käytettyjen • mikropartikkeleiden määrällä ja näytetilavuudella säädetään määrityksen herkkyys ja tarvittaessa myös mitta-alueen 30 laajuus niin, että mittaus on suoritettavissa yksittäisiltä mikropartikkeleilta. Määrityksen toistettavuutta voidaan parantaa mittaamalla useampia yksittäisiä . . . mikropartikkeleita.

12 96143

Esimerkki 3

Mikropartikkelimäärän vaikutus nukleiinihappohybridisaatioreaktioon käyttäen kahta eri kohde-nukleiinihappopitoisuutta.

5 Mikropartikkelit, halkaisijaltaan 20 μπι, pinnoitettiin streptavidiinilla ja käytettiin hybridisaatiomäärityksessä, jossa kohteena oli biotiinilla leimattu synteettinen oligonukleotiidi ja koettimena fluoresoivalla Eu-kelaatilla leimattu synteettinen oligonukleotiidi. Koe tehtiin 10 kahdella eri kohde oligonukleotiidimäärällä (109 ja 1010 molekyyliä). Määrityksen kokonaistilavuus oli 20 μΐ ja jokaista määritystä kohden käytettiin 2.0 ng fluoresoivalla Eu-kelaatilla leimattua koetinta. Molemmilla kohde-oligonukleotiidipitoisuuksilla käytettyjen 15 mikropartikkeleiden määrä koetta kohti vaihdeltiin 10 -10000. Hybridisaatioreaktion jälkeen Eu-pitoisuus partikkeleiden pinnalta mitattiin käyttäen aika-erotteista mikrofluorometriä.

Tulokset: Taulukosta 3 sekä kuviosta 3 on nähtävissä miten 20 mikropartikkeleiden määrä vaikuttaa yksittäisistä partikkeleista mitattavaan signaalitasoon, eli kun mikropartikkeleiden määrä pienenee saadaan näytteen sisältämä kohde-oligonukleotiidimäärä kerättyä suuremmassa pitoisuudessa yksittäisten mikropartikkeleiden pintaan, 25 joten jälleen käytettyjen mikropartikkeleiden määrällä ja näytetilavuudella saadaan määrityksen herkkyys ja tarvittaessa myös mitta-alueen laajuus säädettyä niin, että mittaus on suoritettavissa yksittäisiltä mikropartikkeleilta.

30 Alan ammattimiehelle on selvää, että keksinnön erilaiset sovellutusmuodot voivat vaihdella jäljempänä esitettävien patenttivaatimusten puitteissa.

11 13 96143 > σι i—I i—I n in O o cm cm p m dp CN o r-~ Ή LT) Γ- CM P CM M* o > Μ ο ,η id r* cm m <0 m oo σι t*» o •H ι-h oo vo vo m o .X m n oo oo oo σι ra <—I m r-ι cm oo 0) vo σι

Ai vo

4-1 ro r-l CM CM O VO

Jh o m e- cm r- σι σι vo vo p m o o cm (0 ro o in noun cm σ o cmovo ootnoo ft i—I oo σι r- oo *r r- cm o ^vom1 vonvo v- m vo o vo oo o o o in o o r- σι oo oo • 31 r-4 cm rf m n r-* in oo σ σι vo cm Λ ΜΛ roinin m m m σι m t"

U X

Φ ro · o O O O σ> CO 9 91 CO CO 00 f* f-* r«*.

J" , | CM CSJ Cs» M N H »-H «—«

+J 1 I I III III III III

4J MO o o ooo ooo ooo ooo

•pH (0 rH H iH H H iH iH H rH H H H rH rH iH

U O. X X X XXX XXX XXX XXX

:<0 s cm m oo vo oo n m r-· in mmmo iovoh :(ö 3|p m rH n n h cm « ο ήπιο vo o cm e M o · · · ............

g oo rH m [ σι h »—(σι σι οι vo vo r—I h »h

•H

3 in 3 cm cm m m r— to goo σι mmm οιιίη cn Μη · vo in U η- σ p- p oo n meno ... en . .

• \ vo oo r~ hpoi ... vo cm in cm m o (0 31 <—t · · · ... in cm cmocm cn^vo P WO o o cm vof'-io σι t"- r- r- in in hoooi ra g •Η Ή Ό (H σι (0 cm cm vo m nr vo vo cm in 3

Ό rH 00 σν rH VO O rH 00 r-l vo cm η* vo · m σι -H

3 0O O CM invon SlHOl ...rH·. 0 «3 31 g · ........m* oi oo o oo oo in

P Wm o o o ooo σι σι r~ hpp M

to Φ

I X

0 0

U *H

Λ P

(0 C 10

Q)p -H

•Η ·Η V4 I—I rH (0 Φ Φ >

X X

-XX -H

•Η -H rH rH

p p m -rj· o r-~ o mmm m ·<* r-' οο» oooh Φ (H iH rH (N rt Tf PHOI OUO Οι Ol CM Ol M· CM VO σι VO τί* (0 3 Cu vo 0 Tj· σ σι o cmhh cm in r-~ σι 00 n omm 3 a O AS uiHP n- vo vo n- vo oo r-σιοο m r- Γ" vo vo 0

•H

C -p ·· (0

6 *H

=t M

<0 00 >

CM CO

(0 P

P P CD 0 - • »0 ·Η v.

*- P -H CO P

:3 3 P cm vo m 3 :3 33 m cm m· r^^rvo r- p in Φ

g 30 0 in r- rfWVO ooioo *H

I OP 00 o o o o vo noun oih^ cm cm p vo cm m U

•3 ·Η 0 p v v mvo p vo o cm m p coho tj« p p >h p W id p p p m 00 00 P ppp r~ r-~ r~~ p p p p p OP Φ «3 0

* P O

Ο Φ 0

h) Ai o 0 0 II

Ora 0 p 0000 << 3 U \ 00000 >

Eh .3 D cm p p p m p U

14 96143 TAULUKKO 2

Partikkelimäärän vaikutus signaalitasoon

hCG partikkelixnäärä sianaalitaso CV

5 U/l fotonia/s/part. % 0 100 252 6.5 250 100 490 26.15 2500 100 1671 23.1 0 1000 277 10.39 10 250 1000 345 15.76 2500 1000 418 19.98 0 10000 278 7.05 250 10000 366 23.34 2500 10000 401 38.5 15 Määrityksen tilavuus 20 μΐ, josta standardin osuus 5 μΐ. Partikkelien koko 20 μπι. Mikrofluorometrimittaukset, laserviritys, vaimennus 1:100.

TAULUKKO 3

partikkelimäärä ana1wttimäärä sianaalitaso CV

20 kpl molekyylejä fotonia/s/part. % 10000 109 497 34 1000 " 1005 48 100 " 1885 22 10 M 3852 24 25 ei analyyttiä/100 1358 40 10000 1010 1622 31 1000 " 5613 25 100 · 13236 33 10 " 15594 45 30 ei analyyttiä/100 1887 43

II

Claims

96143

1. Biospesifinen määritysmenetelmä, jossa - sekoitetaan mikropartikkeleita, jotka ovat päällystetty määritettävää analyyttia sitovalla bioaffiniteettikomponentilla A; analysoitava näyte; ja 5 merkkiaineella leimattu bioaffiniteettikomponentti B, jolloin alkaa sitoutumisreaktio bioaffiniteettikomponentti A:n, bioaffiniteettikomponentti B:n ja analyytin välillä, ja - kvantitoidaaan mikropartikkeleihin sitoutuneen leimatun 10 bioaffiniteettikomponentin B aiheuttama signaalitaso näytteen analyyttipitoisuuden määrittämiseksi - ja mitataan erikseen jokaisen mikropartikkelin antama signaalitaso tunnettu siitä, että 15 käytetään määrityksessä sellaista näytetilavuutta ja mikropartikkelimäärää, että mikropartikkelimäärä sidottuaan valitun näytetilavuuden analyytin aiheuttaa jokaiselle yksittäiselle mikropartikkelille sellaisen eignaalitason, jonka perusteella pystytään tunnistamaan 20 näytteen analyyttipitoisuus koko sillä alueella, jossa näytteen analyyttipitoisuus tyypillisesti vaihtelee.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmenetelmä tunnettu siitä, että mikropartikkeleiden määrä 25 säädetään niin, että näytteen pienin määritettävä analyyttipitoisuus on mitattavissa yksittäisistä mikropartikkeleista käytössä olevalla herkällä merkkiaineteknologialla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmenetelmä 30 tunnettu siitä, että mikropartikkeleiden määrä säädetään niin, että näytteen suurin määritettävä analyyttipitoisuus on mitattavissa yksittäisistä mikropartikkeleista käytössä olevalla herkällä merkkiaineteknologialla. ψ · 96143

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen määritysmenetelmä tunnettu siitä, että sekä kilpailevassa että ei-kilpailevassa määrityksessä otetaan tavallista suurempi näytetilavuus.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen määritysmenetelmä tunnettu siitä, että sekä kilpailevassa että ei-kilpailevassa määrityksessä otetaan tavallista pienempi näytetilavuus.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen 10 määritysmenetelmä tunnettu siitä, että määritys on ei-kilpaileva immunomääritys, jolloin merkkiaineella leimattu bioaffiniteettikomponentti B on analyytin antigeeniä vastaan suunnattu vasta-aine.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen 15 määritysmenetelmä tunnettu siitä, että määritys on nukleiinihappohybridisaatiomääritys, jossa merkkiaineella leimattu bioaffiniteettikomponentti B on nukleiinihappokoetin.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen 20 määritysmenetelmä tunnettu siitä, että määritys on kilpaileva immunomääritys, jolloin merkkiaineella leimattu bioaffiniteettikomponentti B on antigeeni ja bioaffiniteettikomponentti A on vasta-aine, jonka sitomispaikoista leimattu antigeeni ja analyytin antigeeni 25 kilpailevat.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen määritysmenetelmä tunnettu siitä, että vasta-aineella A pinnoitettujen mikropartikkeleiden määrä säädetään niin, että mitattavan analyytin pienin pitoisuus antaa 30 yksittäisiä mikropartikkeleita mitattaessa korkeimman signaalin käytössä olevalla merkkiaineteknologialla. • «

10. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista mukainen II 96143 määritysmenetelmä tunnettu siitä, että merkkiaineena käytetään fluoresenssia, aika-erotteista fluoresenssia, kemiluminesenssia tai bioluminesenssia aiheuttavaa ainetta.

11. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista mukainen määritysmenetelmä tunnettu siitä, että käytetty mikropartikkelimäärä on eri analyyttejä tunnistavien mikropartikkeleiden seos, jolloin pystytään samanaikaisesti määrittämään useita analyyttejä samasta näytteestä.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen määritysmenetelmä tunnettu siitä, että eri analyyttejä tunnistavat mikropartikkelit erotetaan toinen toisistaan käyttäen merkkiaineteknologiana fluoresenssia, aika-erotteista fluoresenssia, kemiluminesenssia tai bioluminesenssia tai 15 näiden kombinaatioita. m · 1 96143