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JP5881626B2 - 組換えａａｖベクターの高力価ヘルパーなし調製物を生成するための方法 - Google Patents

組換えａａｖベクターの高力価ヘルパーなし調製物を生成するための方法 Download PDF

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Description

（発明の分野）
本発明は、一般的に、遺伝子移入に使用され得る、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターおよびその調製物の分野に関する。より詳細には、本発明は、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）および細胞性タンパク質を実質的に含まない、組換えＡＡＶベクターの高力価の調製物の生成方法に関する。
（発明の背景）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療のためのベクターとして魅力的な独特の特徴を有する。アデノ随伴ウイルスは、広範囲の細胞型に感染する。しかし、アデノ随伴ウイルスは、形質転換性でなく、そして、いずれのヒト疾患の病因とも関係していない。ＤＮＡのレシピエント宿主細胞への導入は、一般的に、その細胞の正常の代謝を妨げることなく、そのＤＮＡの長時間の残留および発現をもたらす。
遺伝子移入、特にヒト遺伝子治療における使用のための組換えＡＡＶベクター調製物の、所望される特徴は、少なくとも３つ存在する。第１に、このベクターが、標的組織における細胞の有効な集団に形質導入するために、十分に高い力価で生成されるべきであることが、好ましい。インビトロでの遺伝子治療は、代表的には、大多数のベクター粒子を必要とする。例えば、いくつかの処置は、１０８を超える粒子を必要とし得、そして気道への直接的送達による嚢胞性線維症の処置には、１０１０を超える粒子を必要とし得る。第２に、このベクター調製物が、複製コンピテントなＡＡＶ（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下において複製し得る、表現型としての野生型ＡＡＶ）を、実質的に含まないべきであることが、好ましい。第３に、このｒＡＡＶベクター調製物は、全体として、他のウイルス（例えば、ＡＡＶ生成に使用されるヘルパーウイルス）ならびにヘルパーウイルスタンパク質および細胞性タンパク質、および脂質および糖質のような他の成分を、実質的に含まず、その結果、遺伝子治療の状況において、免疫応答を生じる危険性を、最小化するか、または除去することが、好ましい。この後者の点は、ＡＡＶの状況において特に顕著である。なぜならＡＡＶは、ＡＡＶ生成のプロセスの間に、有効に複製されて、そしてパッケージングされるために、ヘルパーウイルス（代表的にはアデノウイルス）との同時トランスフェクションまたはヘルパーウイルス機能のその他の提供が必要である、「ヘルパー依存性」ウイルスであるからである。さらに、アデノウイルスは、遺伝子治療適用の状況において、宿主免疫応答を生じることが観察されている（例えば、Ｂｙｒｎｅｓら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６６：１０１５、１９９５；ＭｃＣｏｙら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１５５３、１９９５；およびＢａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：１５１、１９９５を参照のこと）。本発明の方法は、以下に詳細に記載および説明されるように、ｒＡＡＶベクター調製物のこれらおよび他の所望の特徴に取り組む。
ＡＡＶウイルス学、および遺伝学の一般的な総説は、他で利用可能である。読者は、特にＣａｒｔｅ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」、第Ｉ巻、１６９〜２２８ページ（１９８９）、およびＢｅｒｎｓ、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、１７４３〜１７６４ページ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、（１９９０）を参照し得る。以下は、読者の便宜のための、手短な概要である。ＡＡＶは、複製欠損ウイルスであり、このことは、宿主細胞におけるＡＡＶの複製およびパッケージングサイクルを完成するために、ＡＡＶがヘルパーウイルスに依存することを意味する。ＡＡＶゲノムは、一般的に、パッケージング遺伝子ｒｅｐおよびｃａｐ（他の必要な機能は、ヘルパーウイルスおよび宿主細胞からトランスで提供される）を含む。
ＡＡＶ粒子は、３つのキャプシドタンパク質である、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を有する、タンパク質様キャプシドを含み、そして、約４．６ｋｂの直鎖状１本鎖ＤＮＡゲノムを内包する。個々の粒子は、１つのＤＮＡ分子鎖のみをパッケージングするが、このＤＮＡ鎖は、プラス鎖またはマイナス鎖のいずれかであり得る。いずれかの鎖を含有する粒子は、感染性であり、そして親の感染している１本鎖から２本鎖形態への変換、およびその後の増幅（この増幅によって、子孫１本鎖が追い出され、そしてキャプシドにパッケージングされる）によって複製が生じる。ＡＡＶゲノムの２本鎖または１本鎖コピー（時として、「プロウイルスＤＮＡ」または「プロウイルス」という）は、細菌プラスミドまたはファージミドに挿入され得、そしてアデノウイルス感染細胞にトランスフェクトされ得る。
説明の目的で、ＡＡＶ２血清型の直鎖状ゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列によっていずれかの末端で終結する。ＩＴＲの間には、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するために使用される、３つの転写プロモーターｐ５、ｐ１９、およびｐ４０が存在する（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９７９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：５５６７〜５５７１）。ＩＴＲ配列は、シスにおいて必要であり、そして、機能的な複製起点、細胞ゲノムへの組み込み、ならびに宿主細胞染色体または組換えプラスミドからの効率的な切り出しおよびレスキューを提供するのに十分である。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物は、ウイルスゲノムの複製およびキャプシド化の機能を、それぞれ提供し、そしてこれらの産物は、トランスで存在することで、その機能には十分である。
ｒｅｐ遺伝子は、２つのプロモーター、ｐ５およびｐ１９から発現し、そしてＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０と称される４つのタンパク質を生成する。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８のみが、ＡＡＶの２重鎖ＤＮＡ複製に必要であるが、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、子孫にとっての、１本鎖ＤＮＡの蓄積に必要なようである（Ｃｈｅｊａｎｏｖｓｋｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７３：１２０、１９８９）。Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８は、ＡＡＶ ＩＴＲのヘアピンコンホメーションに特異的に結合し、そして複製物をＡＡＶ末端で分解するために必要とされる、いくつかの酵素活性を有する。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８はまた、ＡＡＶ遺伝子およびいくつかの異種プロモーターからの発現のポジティブおよびネガティブ調節、ならびに細胞増殖の阻害効果を含む、多面発現性調節活性を示す。ｃａｐ遺伝子は、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。これらのタンパク質は、共通の重複配列を共有するが、ＶＰ１およびＶＰ２は、代わりの開始コドンの使用により、ｐ４０プロモーターから転写される、さらなるアミノ末端配列を含む。３つのタンパク質の全ては、効果的なキャプシド生成にとって必要である。
ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：２０７７〜２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８３、Ｇｅｎｅ ２３：６５〜７３）、または、直接的な平滑末端の連結（ＳｅｎａｎｐａｔｈｙおよびＣａｒｔｅｒ、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：４６６１〜４６６６）のような手順によって、細菌プラスミド中に導入されてきた。そのようなＡＡＶ組換えプラスミドの哺乳動物細胞への、適切なヘルパーウイルスを使用する、トランスフェクションは、全くプラスミド配列を含まないＡＡＶゲノムのレスキューおよび切り出し、レスキューされたゲノムの複製、および子孫の感染性ＡＡＶ粒子の生成をもたらす。
治療目的の異種ポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶベクターは、細菌プラスミド中のＡＡＶコード配列の部分を、異種ポリヌクレオチドで置換することによって、構築され得る。ｒＡＡＶベクター構築の一般的原理はまた、別に概説されている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ、１９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｏｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：５３３〜５３９；およびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７〜１２９を参照のこと。ＡＡＶのＩＴＲは、一般的に保持されている。なぜなら、ベクターのパッケージングは、ＩＴＲがシスで存在することを必要とするからである。しかし、ＡＡＶゲノムの他のエレメント、特に、１つ以上のパッケージング遺伝子は、省略され得る。ベクタープラスミドは、省略されたパッケージング遺伝子を、代替的な供給源を介してトランスで供給することにより、ＡＡＶ粒子中にパッケージングされ得る。
１つのアプローチにおいて、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する配列（ｒＡＡＶベクター配列）、およびトランスで提供されるＡＡＶパッケージング遺伝子は、別個の細菌プラスミドにおいて、宿主細胞中に導入される。このアプローチの例は、Ｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３（１９８８）；およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９（１９８８）に記載される。Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２〜３８２８）は、アデノウイルス由来のＩＴＲによって内包される、ＲｅｐおよびＣａｐコード領域からなる、ｐＡＡＶ／Ａｄと呼ばれるパッケージングプラスミドを記載している。嚢胞性線維症患者由来のヒト気道上皮細胞は、ｐＡＡＶ／ＡｄパッケージングプラスミドおよびＡＡＶ ｐ５プロモーターを介して発現する選択マーカー遺伝子ｎｅｏを含むプラスミドを使用して調製されたＡＡＶベクターを使用して、形質導入されている（Ｆｌｏｔｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９、１９９２）。
第２のアプローチは、ベクター配列、またはＡＡＶパッケージング遺伝子のいずれかを、ＡＡＶ複製のために使用される哺乳動物細胞においてエピソーム型のプラスミドの形態において提供することである。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号は、ベクター配列が、高コピーのエピソーム型プラスミドとして存在する細胞株を記載する。この細胞株は、トランス相補性のＡＡＶ機能のｒｅｐおよびｃａｐで形質導入され、ＡＡＶベクターの調製物を生成し得る。このアプローチは理想的ではない、なぜなら、１細胞あたりのコピー数は、厳密には制御され得ず、そしてエピソーム型ＤＮＡは、再編成され、ベクター副産物の生成をもたらす可能性が高いからである。
第３のアプローチは、複製のために使用される哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれる、ベクター配列か、またはＡＡＶパッケージング遺伝子、あるいはその両方のいずれかを提供することである。
１つの例示的な技術が、国際特許出願ＷＯ９５／１３３６５（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＪｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）および対応する米国特許第５，６５８，７７６号（Ｆｌｏｔｔｅらによる）において概説される。この例は、哺乳動物細胞を、安定に組み込まれたｒＡＡＶベクターの少なくとも１つのインタクトなコピーとともに使用し、ここで、このベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲおよび標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結した転写プロモーターを含むが、ここで、ｒｅｐの発現は制限されている。好ましい実施態様において、細胞中に導入された異種ＡＡＶに作動可能に連結したｒｅｐ遺伝子を含むＡＡＶパッケージングプラスミドは、細胞に導入され、次にその細胞は、ＡＡＶベクター配列の複製、および粒子へのパッケージングを可能にする条件下でインキュベートされる。
第２の例示的な技術は、特許出願ＷＯ９５／１３３９２（Ｔｒｅｍｐｅら）において概説される。この例は、機能的なＲｅｐタンパク質の発現を可能にするように、異種プロモーターと作動可能に連結したＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を有する安定な哺乳動物細胞株を使用する。種々の好ましい実施態様において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、安定に提供され得るか、または一過性に導入され得る（例えば、プラスミド上で）。組換えＡＡＶベクターはまた、安定にか、または一過的に導入され得る。
別の例示的な技術は、特許出願ＷＯ９６／１７９４７（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｌｌｅｎ）において概説される。この例は、安定に組み込まれたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、および異種プロモーターに作動可能に連結し、そしてヘルパーウイルスによって誘導可能な、安定に組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む哺乳動物細胞を使用する。種々の好ましい実施態様において、ベクター配列を含むプラスミドはまた、細胞に導入（安定的か、または一過性のいずれかで）される。次に、ＡＡＶベクター粒子のレスキューは、ヘルパーウイルスの導入によって開始される。
これら種々の例は、十分に高力価のＡＡＶを提供し、ベクターとパッケージング成分の間の組換えを最小限にし、そして哺乳動物細胞株におけるＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の発現に関連する可能性のある困難さを減少するか、または回避するという、問題に取り組む（なぜなら、Ｒｅｐタンパク質は、それ自体の発現を制限し得るばかりではなく、細胞の代謝にも影響を及ぼし得るからである）。しかし、ＡＡＶベクターのウイルス粒子中へのパッケージングは、いまだ、ＡＡＶについての適切なヘルパーウイルスの存在か、またはヘルパーウイルス機能の提供に依存する。ＡＡＶ複製を補助し得るヘルパーウイルスは、アデノウイルスによって例示されるが、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスのような他のウイルスを含む。ＡＡＶベクターの調製における感染性ヘルパーウイルスの十分な量の存在は、その調製がヒト投与における使用を意図する場合に、問題となる。非複製性のヘルパーウイルス成分の存在でさえも、処置される患者において、受け入れられない免疫反応を生じ得る。
ヘルパーウイルス抗原によって誘発される可能性のある問題は、近年のいくつかの研究において、示されている。Ｂｙｒｎｅｓら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６６：１０１５、１９９５）は、Ｅ１領域が欠失した、非複製性５型ヒトアデノウイルスを、同系ラットの脳に注入した。細胞へのウイルス感染による新しいウイルスタンパク質の発現に起因するというよりはむしろ、粒子の投与に起因する、炎症応答が観察された。ウイルスの存在は、ＭＨＣクラスＩの発現の増加およびマクロファージおよびＴ細胞の大量の浸潤と関連する。ＭｃＣｏｙら（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１５５３，１９９５）は、インタクトなアデノウイルス、不完全なゲノムのアデノウイルス、または紫外線光によって不活化されたアデノウイルスを、マウスの肺に滴下した。全ての誘導された肺の炎症、および肺組織における炎症細胞の数は、その３つの全ての形態のウイルスについて、量的に類似していた。Ｂａｒｒら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：１５１、１９９５）によって行われた、正常マウスおよび免疫不全マウスにおける、アデノウイルス構築物を使用した比較実験は、抗アデノウイルス免役応答が主にＴ細胞媒介性であり、そしてその後の用量に影響する記憶応答を生じることを示す。
従って、遺伝子治療における使用のためのような組換えＡＡＶベクターの開発において、この方法が、同時に遺伝子治療技術への実際の適用に適切なスケールにおいて有効に使用され得るように、ＡＡＶの高力価をなお達成しながら、最終調製物中に存在するヘルパーウイルスならびにヘルパーウイルスタンパク質および細胞性タンパク質の量を最小化する戦略の必要性が存在する。
ＡＡＶベクター調製物の高力価は、特に有用であるが、高力価のｒＡＡＶの生成（特にラージスケール生成において）が、混入するヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスすなわち「Ａｄ」）、ヘルパーウイルスタンパク質（例えば、Ａｄタンパク質）、および／または細胞性タンパク質の有意な量を生じ得るので、混入するウイルスおよび／またはウイルス性もしくは細胞性タンパク質を実質的に含まない高力価調製物の生成のために使用され得る、ｒＡＡＶの拡大縮小可能な生成方法を設計することが特に重要となった。本開示は、これらの拮抗する目的を達成する方法を提供し、そして組換えＡＡＶベクター調製物のラージスケール生成のために使用され得る技術を示す。
（発明の要旨）
本発明は、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、および細胞性タンパク質および他の成分を実質的に含まない、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の高力価調製物を生成する、方法および物質を提供する。
本発明の実施態様は、以下を含むが、これらに限定されない。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の集団を生成する方法であって、この方法は、以下の工程：ａ）ＡＡＶプロデューサー細胞であって、以下、（ｉ）１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子であって、ここでこのＡＡＶパッケージング遺伝子の各々は、ＡＡＶ複製タンパク質またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する、異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）プロベクター；ならびに（ｉｉｉ）ＡＡＶのためのヘルパーウイルス、を含むＡＡＶプロデューサー細胞を提供する工程；ｂ）工程ａ）において提供されたプロデューサー細胞を、ＡＡＶの複製を許容する条件下でインキュベートする工程；ｃ）工程ｂ）のインキュベーション後にプロデューサー細胞を溶解して、ＡＡＶプロデューサー細胞溶解物を生成する工程；ならびにｄ）少なくとも１つの正に荷電した陰イオン交換樹脂、および少なくとも１つの負に荷電した陽イオン交換樹脂を含む、複数のイオン交換樹脂上で、工程ｃ）のＡＡＶプロデューサー細胞溶解物をクロマトグラフィーして、ｒＡＡＶベクター粒子の精製された集団を生成するか、または工程ｃ）のＡＡＶプロデューサー細胞溶解物を、陰イオン交換樹脂、その後の接線流濾過（ＴＦＦ）によってクロマトグラフィーをする工程、を包含する。
請求項１に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、ここで、このヘルパーウイルスがアデノウイルスであるか、または温度感受性ヘルパーウイルスであり、そしてプロデューサー細胞をインキュベートするこの工程が、ＡＡＶの複製を許容するが、温度感受性ヘルパーウイルスの複製の許容しない温度で行われる、方法。
ｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、ここで、プロデューサー細胞をインキュベートする工程が、組織培養フラスコ、ローラーボトル、スピナー（ｓｐｉｎｅｒ）フラスコ、タンクリアクター、ファーメンター、およびバイオリアクター、からなる群から選択される容器において行われ、必要に応じてマイクロキャリアを使用し、そして好ましくは、懸濁に適合した哺乳動物細胞株を使用する、方法。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の集団を生成する方法であって、以下の工程：ａ）ＡＡＶプロデューサー細胞であって、以下、（ｉ）１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子であって、ここで、このＡＡＶパッケージング遺伝子の各々がＡＡＶ複製タンパク質またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する、異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）プロベクター；ならびに（ｉｉｉ）ＡＡＶのためのヘルパーウイルス、または少なくとも１つのヘルパーウイルス機能をコードするこのヘルパーウイルスのポリヌクレオチド配列、を含むＡＡＶプロデューサー細胞を提供する工程；ｂ）工程ａ）において提供されたプロデューサー細胞を、致死量未満のストレスに供する工程；ならびにｃ）工程ｂ）のストレスを受けたプロデューサー細胞を、ＡＡＶの複製を許容する条件下でインキュベートする工程、を包含する方法。致死量未満のストレスの可能性のある形態は、栄養ストレス、浸透圧ストレス、ｐＨストレス、温度ストレス、有酸素性ストレス、機械的ストレス、放射線ストレス、および毒性ストレス、からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。栄養ストレスを負わせる非限定的な例は、プロデューサー細胞を１つ以上のアミノ酸の欠失する培地において培養することによる。さらなる説明を以下に提供する。
ｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、ここで、この精製されたｒＡＡＶベクター粒子の集団は、複製コンピテントなＡＡＶおよびヘルパーウイルスおよび細胞性タンパク質を実質的に含まない、方法。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の集団を生成する方法であって、以下の工程：ａ）ＡＡＶプロデューサー細胞であって、以下、（ｉ）１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子であって、ここで、このＡＡＶパッケージング遺伝子の各々が、ＡＡＶ複製タンパク質またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する、異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）プロベクター；ならびに（ｉｉｉ）ＡＡＶのためのヘルパーウイルス、を含むＡＡＶプロデューサー細胞を提供する工程；ｂ）工程ａ）において提供されたプロデューサー細胞を、ＡＡＶの複製を許容し、そしてＡＡＶプロデューサー細胞の致死量未満のストレスの誘導を含む条件下でインキュベートする工程；ｃ）工程ｂ）のインキュベーション後にプロデューサー細胞を溶解して、ＡＡＶプロデューサー細胞溶解物を生成する工程；ならびにｄ）このＡＡＶプロデューサー細胞を精製して、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の集団を生成する工程、を包含する、方法。適切な精製方法は、本開示において、他の場所において記載されるものを含む。例示的な精製手順は、工程ｃ）のＡＡＶプロデューサー細胞溶解物を、正に荷電した陰イオン交換樹脂、および負に荷電した陽イオン交換樹脂からなる群から選択される、少なくとも１つのクロマトグラフィー樹脂上でクロマトグラフをして、精製されたｒＡＡＶベクター粒子の集団を生成する工程を、包含する（好ましい方法としては、陰イオン交換後の、陽イオン交換または接線流濾過（ＴＦＦ）が挙げられる）。説明のためのクロマトグラフィー手順（イオン交換クロマトグラフィーおよびヘパラン硫酸（ｈｅｐａｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）でのクロマトグラフィー精製を含む）は、以下に例示の目的で、提供される。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を、高効率で生成するための宿主細胞は、以下：ａ）１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子であって、ここで、このＡＡＶパッケージング遺伝子の各々は、ＡＡＶ複製タンパク質またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子；ｂ）ｒＡＡＶプロウイルスを使用してこの宿主細胞に導入された異種ポリヌクレオチドであって、ここでこのｒＡＡＶプロベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する異種ポリヌクレオチドを含み、そしてこのベクターは、このＡＡＶパッケージング遺伝子において欠損している、ポリヌクレオチド；ｃ）ＡＡＶについて温度感受性ヘルパーウイルス（ｔｓＨＶ）のようなヘルパーウイルスであって、ここでこのｔｓＨＶは、自己複製について温度感受性である、ヘルパーウイルス、を包含する。
本発明の生成方法のいずれかに従って生成される、ｒＡＡＶ粒子の集団。好ましくは、粒子の集団は、１，０００の感染性ｒＡＡＶ粒子あたり、約１以下の感染性アデノウイルス粒子を含み、好ましくは、１０６ｒＡＡＶあたり１未満であり、さらにより好ましくは、１０９中に約１未満である。
例えば、ウイルス調製物の力値測定において、ならびにウイルス複製に影響する因子のスクリーニングにおいて使用され得る高スループットアッセイ技術もまた、提供される。
本発明のこれら、および他の実施態様は、下記の記載において概説される。
図１は、ｒＡＡＶベクター中に含有される、モデルＣＦ治療的遺伝子についてのプローブを使用した、ｒＡＡＶベクター生成についてのサザン分析の、ハーフトーンの複写である。１．４ｋｂの顕著なバンドは、調製物中のｒＡＡＶの存在を示す。ヘルパー機能を、５型アデノウイルス（Ａｄ５）によってか、またはアデノウイルス温度感受性株ｔｓ１４９によって、供給した。 図２は、各調製物に存在するｒＡＡＶのレベルを定量するための、ｒＡＡＶベクター生成についてのスロットブロット分析のハーフトーン複写である。ヘルパー機能が、ｔｓ１４９によって供給される場合、標準的な培養条件下で生成されるｒＡＡＶの量は、Ａｄ５存在下で生成される場合より数桁低い。 図３は、ｒＡＡＶのサザン分析のハーフトーン複写であり、これは、ｔｓ１４９のレベルの上昇がｒＡＡＶ生成のレベルを改善しないことを示す。 図４は、培養時間が５日を越える場合、ｔｓ１４９の存在下における生成されたｒＡＡＶの量における劇的な増加を示す、棒グラフである（斜線の棒）。このことは、温度感受性でないアデノウイルスをヘルパー機能の供給のために使用した場合の５日目以降に生じる、ｒＡＡＶの実質的な減少（黒色の棒）と著しく対照的である。 図５は、３７℃（丸）または３２℃（四角）における懸濁培養において増殖するＨｅＬａ Ｓ３細胞の、生存細胞密度（ＶＣＤ）を示す折れ線グラフである。 図６は、懸濁培養において増殖するＨｅＬａ Ｓ３細胞での、２つの異なる速度における接線流濾過の効果を示す線グラフである。 図７は、ミクロフルイダイゼーション（ＭＦ）の７日目に検出されたレベルと比較した、３２℃の許容温度での懸濁物中に３〜７日間培養された感染されたＨｅＬａ Ｓ３細胞において検出されたｔｓ１４９の生成を示す、棒グラフである。 図８は、ＰＩマトリクス上での陰イオン交換クロマトグラフィー（ｐＨ８．０、９００〜１３００ミリ当量のＮａＣｌ勾配での溶出）によるｔｓ１４９の精製を示す組み合わせグラフである。 図９は、ＰＩ陰イオン交換マトリクス上（ｐＨ８．０、８００〜１３００ミリ当量のＮａＣｌ勾配での溶出）でのアデノウイルスの精製を示す組み合わせグラフである。棒：感染性アッセイにおいて測定されたウイルス活性；実線：Ａ２８０（総タンパク質の尺度）；破線：緩衝液伝導率（ｍｓ）。 図１０は、アデノウイルスおよび組換えＡＡＶの分離を示す組み合わせグラフである。上部のパネルは、ＰＩ陰イオン交換マトリクス上（ｐＨ８．０、０〜１０００ミリ当量のＮａＣｌ勾配での溶出）での分離を示す。下部のパネルは、引き続いての、ＨＳ陽イオン交換マトリクス上（ｐＨ８．０、０〜５００ミリグラム当量のＮａＣｌ勾配での溶出）での、混入物からのアデノウイルスの分離を示す。 図１１は、培養培地におけるｒＡＡＶ生成に対する、胎児ウシ血清レベル（ＦＢＳ）の効果を示す、２つの棒グラフである。培養培地における血清の欠損は、ウイルス粒子の生成を増強するためにプロデューサー細胞が供され得る多数のストレス要素の１つである。 図１２は、精製工程の間のＡＡＶタンパク質についてのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析の、ハーフトーン複写である。ＡＡＶ調製物を、陰イオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ ５０ ＰＩ）でのクロマトグラフィー後に、接線流濾過に供した。銀染色したゲルは、最終的な大量の物質中の、高度に精製されたＡＡＶキャプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を示す。 図１３は、ヘパラン硫酸（ｈｅｐａｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）カラムでのＡＡＶの濃縮を示すクロマトグラフィーである。０〜１Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を用いてヘパラン硫酸から溶出する場合（右側の軸に示されるｍｓでの伝導率）、約１８分の溶出における、２８０ｎｍでの吸光度（左側の軸）のシャープなピークは、ＡＡＶ画分（陰イオン交換および接線流濾過の後）を示す。
（発明の詳細な説明）
本発明の目的は、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、ならびに細胞性タンパク質および他の成分を実質的に含まない、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の高力価調製物を生成するための方法および物質を提供することである。
哺乳動物細胞においてＡＡＶ粒子を生成および処理するための種々の方法は、以下に詳細に記載され、そして、そのような技術の使用の例証は、以下の実施例において提供される。
導入の目的で、宿主細胞または「プロデューサー」細胞を、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングのために使用することは、代表的である。そのようなプロデューサー細胞（通常は、哺乳動物宿主細胞）は、一般的に、ｒＡＡＶ生成のためのいくつかの異なるタイプの成分を、含むか、または含むように改変される。第１の成分は、複製し得、そして宿主パッケージング細胞によって、ベクター粒子中にパッケージングされ得る、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターゲノム（すなわち、「ｒＡＡＶプロベクター」）である。このｒＡＡＶプロベクターは、異種ポリヌクレオチド（または「トランスジーン」）を、通常含有する。この異種ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子治療の状況において、他の細胞を遺伝子改変することが所望される（なぜなら、そのようなトランスジーンのｒＡＡＶベクター粒子へのパッケージングは、種々の哺乳動物細胞にそのトランスジーンを送達するために、有効に使用され得るからである）。このトランスジーンは、一般的に、ＡＡＶベクターの切り出し、複製およびパッケージング、ならびにベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込みの間に認識される配列を含む、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する。第２の成分は、ＡＡＶ複製にヘルパー機能を提供し得るヘルパーウイルスである。アデノウイルスが、一般的に使用されるが、当該分野において公知である他のヘルパーウイルスもまた、使用され得る。あるいは、必要とされるヘルパーウイルス機能は、ヘルパーウイルスから遺伝子的に単離され得、そしてそのコードする遺伝子は、トランスにおいてヘルパーウイルス機能を提供するために使用され得る。ＡＡＶベクターエレメントおよびそのヘルパーウイルス（またはヘルパーウイルス機能）は、同時にか、または任意の順番で連続的にのいずれかで、その宿主細胞に導入され得る。そのプロデューサー細胞において提供されるＡＡＶ生成のための最終成分は、複製タンパク質およびキャプシド化タンパク質をそれぞれ提供する、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子のような「ＡＡＶパッケージング遺伝子」である。ＡＡＶパッケージング遺伝子のいくつかの異なるバージョンが、提供され得る（野生型ｒｅｐ−ｃａｐカセット、ならびにｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が、ネイティブプロモーターの制御下におかれたままであり得るか、または異種プロモーターに作動可能に連結され得る、改変ｒｅｐおよび／またはｃａｐカセットを含む）。そのようなＡＡＶパッケージング遺伝子は、当該分野において公知であり、そして以下により詳細に記載されるように、一過性にか、または安定的にのいずれかで、宿主パッケージング細胞中に導入され得る。
ＡＡＶ複製およびキャプシド化を許容する条件下で、その宿主細胞を培養した後、その細胞および細胞成分の画分を処理して、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、および細胞性タンパク質を実質的に含まない、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の高力価調製物を生成し得る。そのような技術を使用する、処置技術および例示的プロトコールの詳細な記載は、以下に提供される。
（定義）
本明細書において使用する場合、「ベクター」とは、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドと会合して、そして細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用され得る、高分子または高分子の会合物をいう。例示的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。
「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、そして、ウイルス自体か、またはその誘導体を参照するために使用され得る。この用語は、そうでないことが要求される場合を除いて、すべてのサブタイプ、ならびに、天然の形態および組換え形態の両方を包含する。略語「ｒＡＡＶ」とは、組換えアデノ随伴ウイルスをいい、そしてまた、組換えＡＡＶベクター（すなわち、「ｒＡＡＶベクター」）としても呼ばれる。
本明細書において使用する場合、「ｒＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド（すなわち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）配列（代表的には、細胞の遺伝子形質転換のための、目的の配列）を含むＡＡＶベクターをいう。本発明の好ましいベクター構築物において、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、好ましくは２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する。この用語ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質の全て）、およびキャプシド化されたポリヌクレオチドからなる、ウイルス粒子をいう。その粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達されるトランスジーンのような、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、代表的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶベクター」という。
「パッケージング」とは、ＡＡＶ粒子のアセンブリおよびキャプシド化を生じる、一連の細胞内事象をいう。
ＡＡＶの「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子とは、アデノ随伴ウイルスの複製およびキャプシド化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をいう。これらは、試験された全てのＡＡＶ血清型において見出され、そして当該分野において以下に記載される。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書においてＡＡＶ「パッケージング遺伝子」という。
ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」とは、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）の哺乳動物細胞内による複製およびパッケージングを可能にするウイルスをいう。ＡＡＶのための種々のそのようなヘルパーウイルスは、当該分野において公知であり、これはアデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスのようなポックスウイルスを含む。サブグループＣの５型アデノウイルスが最も一般的に使用されるが、このアデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含する。ヒト、非ヒト哺乳動物およびトリ起源の多数のアデノウイルスが、公知であり、そしてＡＴＣＣのような寄託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる；これらもまた、ＡＴＣＣのような寄託機関から入手可能である。
用語「ｔｓＨＶ」とは、温度感受性ヘルパーウイルスをいう。このウイルスは、ＡＡＶの複製およびパッケージングのためにヘルパー機能を提供し得るが、それ自体の複製に関して、温度感受性である（すなわち、このウイルスは、「許容」温度では複製し得るが、「非許容」温度においては、低効率で複製するか、または好ましくは、全く複製しない）。ｔｓＨＶがＡＡＶ複製の補助を提供する能力はまた、温度感受性であり得るが、本発明の使用に好ましいｔｓＨＶは、ＡＡＶが複製し得るが、ｔｓＨＶの複製にとっては非許容的な温度で、ＡＡＶの複製を効率的に支持する。そのようなｔｓＨＶの例を以下に記載する。
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、ウイルス種が向性（ｔｒｏｐｈｉｃ）である細胞に送達され得るポリヌクレオチド成分を含むものである。この用語は、ウイルスの複製能力を意味する必要は、全くない。感染性ウイルス粒子を計数するアッセイは、本開示および当該分野において、他の箇所に記載される。
「複製コンピテント」ウイルス（例えば、複製コンピテントＡＡＶ、時として「ＲＣＡ」と省略される）とは、感染性の野生型表現型ウイルスをいい、そしてまた、感染した細胞（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下）において複製し得る。ＡＡＶの場合、複製コンピテンスは、機能的なＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を、一般的に必要とする。本明細書に記載される好ましいｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠損のために、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）において複製コンピテントでない。好ましくは、そのようなｒＡＡＶベクターは、ＲＣＡがＡＡＶパッケージング遺伝子と進入するｒＡＡＶベクターとの間の組換えによって生じる可能性を最少化するために、ＡＡＶパッケージング遺伝子配列を完全に欠損する。本明細書において記載される好ましいｒＡＡＶベクター調製物は、ＲＣＡを（存在するとしても）ほとんど含まない調製物である（好ましくは、１０２ｒＡＡＶ粒子あたり、約１ＲＣＡ未満、より好ましくは、１０４ｒＡＡＶ粒子あたり約１ＲＣＡ未満、さらにより好ましくは、１０８ｒＡＡＶ粒子あたり約１ＲＣＡ未満、なおより好ましくは、１０１２ｒＡＡＶ粒子あたり約１ＲＣＡ未満、最も好ましくは、ＲＣＡを含まない）。
用語「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドあるいはそれらのアナログを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいう。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）を含み得、そして非ヌクレオチド成分によって中断され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリマーへのアセンブリの、前または後になされ得る。本明細書において使用する場合、用語ポリヌクレオチドとは、互換可能に、２本鎖および１本鎖分子をいう。他に特定されるか、または必要とされない限り、本明細書に記載の任意の実施態様において、ポリヌクレオチドは、２本鎖形態、および２本鎖形態を形成することが公知であるかまたは予想される、２つの相補的な１本鎖形態の各々の両方を含む。
「遺伝子」とは、転写そして翻訳された後に、特定のタンパク質をコードし得る、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドをいう。
ポリヌクレオチドに適用される場合、「組換え体」とは、そのポリヌクレオチドが、クローニング、制限または連結工程、ならびに天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物を生じる他の手順の種々の組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。この用語は、それぞれ、起源のポリヌクレオチド構築物の複製物、および起源のウイルス構築物の子孫を含む。
「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの機能的調節（ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳または分解を含む）に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。この調節は、プロセスの頻度、速度または特異性に影響し得、その性質を増強、または阻害し得る。当該分野において公知の制御エレメントとしては、例えば、プロモーターおよびエンハンサーのような転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、特定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして通常下流に位置するコード領域の転写をプロモーターから（３’方向に）開始し得るＤＮＡ領域である。
「作動可能に連結した」とは、遺伝子エレメントの近傍位置をいい、ここで、このエレメントは、予想された様式において、作動することを許容する関係に存在する。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を補助する場合、そのプロモーターは、コード領域に作動可能に連結する。そのプロモーターとコード領域の間には、この機能的関係が維持される限り、介在残基が存在し得る。
「発現ベクター」とは、目的のポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、そして意図された標的細胞においてタンパク質の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、コード領域に作動可能に連結された制御エレメントを含み、その標的でのタンパク質の発現を容易にする。制御エレメント、および発現のためにその制御エレメントが作動可能に連結された遺伝子（単数または複数）の組み合わせは、時として、「発現カセット」といい、当該分野において公知でありそして利用可能な大多数の発現カセットが、当該分野において利用可能な成分から容易に構築され得る。
「異種」とは、比較されるその他の実体とは遺伝型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技術によって、異なる種由来のプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。そのネイティブなコード配列から取り出され、そして天然には連結されていることが見出されないコード配列に作動可能に連結したプロモーターは、異種プロモーターである。
「遺伝子改変」とは、遺伝子エレメントが、有糸分裂または減数分裂以外によって細胞中に導入されるプロセスをいう。このエレメントは、細胞にとって異種であり得るか、またはその細胞に既に存在するエレメントのさらなるコピーか、もしくは改善されたバージョンであり得る。遺伝子改変は、例えば、当該分野において公知の任意のプロセス（例えば、エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム沈殿、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体との接触）を介して、細胞を組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによって、行われ得る。遺伝子改変はまた、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのウイルスまたはウイルスベクターを用いる形質導入か、または感染によって行われ得る。好ましくは、遺伝子エレメントは、細胞中の染色体またはミニクロモソーム中に導入される；しかし、細胞およびその子孫の表現型および／または遺伝子型を変更する任意の改変は、この用語に含まれる。
遺伝子配列が、インビトロにおける細胞の延長された培養の間に、その機能の実施のために利用可能である場合、その細胞は、この配列で「安定的に」改変、形質導入、または形質転換されると言われる。好ましい例において、そのような細胞は、改変された細胞の子孫によってまた遺伝される遺伝子改変が導入されるという点で、「遺伝的に」改変される。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において、互換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。この用語はまた、改変された（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リピド化、または標識成分との結合）アミノ酸のポリマーを含む。
「ＣＦＴＲ」、「ｐ５３」、「Ｅ１Ａ」などのようなポリペプチドは、遺伝子治療およびそのための組成物の状況において、インタクトなタンパク質の所望の生物学的機能を保持する、各々のインタクトなポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは遺伝的に操作された誘導体をいう。同様に、ＣＦＴＲ、ｐ５３、Ｅ１Ａ遺伝子および遺伝子治療における使用のための他のこのような遺伝子は（代表的に、レシピエント細胞に送達される「トランスジーン」という）、インタクトなポリペプチド、または所望の生物学的機能を有する、任意のフラグメントもしくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
「単離された」プラスミド、ウイルス、または他の物質とは、この物質または類似物質が天然に存在するかまたはもともとそこから調製されるところに存在し得る他の成分の少なくともいくつかを欠く物質の調製物をいう。それゆえ、例えば、単離された物質は、供給源混合物から、この物質を富化する精製技術を使用することにより調製され得る。富化は絶対基準（例えば、溶液中の容量あたりの重量）に対して測定され得るか、または供給源混合物中に存在する第２の潜在的に干渉する物質に関して測定され得る。本発明の実施態様の富化を増加することは、さらにより好ましい。従って、例えば、２倍の富化が好ましく、１０倍の富化はより好ましく、１００倍の富化はより好ましく、１０００倍の富化はさらにより好ましい。
ＡＡＶの調製物は、感染性ＡＡＶ粒子に対する感染性ヘルパーウイルス粒子の比が少なくとも約１０２：１；好ましくは、少なくとも約１０４：１；より好ましくは、少なくとも約１０６：１；なおより好ましくは、少なくとも約１０８：１である場合、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」といわれる。調製物はまた、好ましくは、等量のヘルパーウイルスタンパク質を含まない（すなわち、もし上に記載のヘルパーウイルス粒子不純物が破壊された形態で存在するならば、タンパク質はヘルパーウイルスのそのようなレベルの結果と同程度に存在する）。ウイルスおよび／または細胞タンパク質の夾雑物は、ＳＤＳゲル上のクマシー染色のバンドの存在として、一般的に、観察され得る（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３に対応するバンド以外のバンドの出現）。
ウイルスの生成、複製、またはパッケージングの記載において使用される場合、「効率」とは、方法の有用な性質（特に、増殖速度、および１細胞あたり生成さえるウイルス粒子の数）をいう。「高効率」生成は、特定の培養期間の課程にわたり、１細胞あたり少なくとも１００のウイルス粒子、好ましくは１細胞あたり、約１０，０００、そしてより好ましくは、少なくとも約１００，０００粒子の生成を示す。
本発明に従って処置される「個体」または「被検体」とは、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーをいい、そしてこれには家畜動物、競技用動物およびヒトを含む霊長類を含むが、これらに限定されない。
個体または細胞の「処置」は、処置が開始される時点での、その個体またはその細胞の本来の経過を変化させようとする、任意の型の介入である。例えば、個体の処置は、任意の病理学的状態（遺伝性および誘発型遺伝的欠損、ウイルスか、細菌か、寄生生物による感染、新生物または形成不全状態、あるいは自己免疫または免役抑制のような免疫系機能不全を含むがこれらに制限されない）により生じる病理を減少するか、または制限するために行われ得る。処置は、組成物（例えば、薬学的組成物）の投与、および組成物で処置された適合性細胞の投与を含むがこれらに制限されない。処置は、予防的かまたは治療的のいずれか（すなわち、病理学的事象の開始または病因の因子との接触の、前または後のいずれか）に行われ得る。
（一般的技術）
本発明の実施は、他に示さない限り、当業者にとって公知である、従来の分子生物学、ウイルス学、動物細胞培養および生化学の技術を使用する。そのような技術は、文献において十分に例示される。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、１９８９）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編、１９８７）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ、編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら、編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」（Ｊｏｈｎ Ｅ Ｃｏｌｉｇａｎら、編、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９５）；ならびに「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」（Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９４）を参照のこと。
本明細書の上記および下記の両方において言及される全ての特許、特許出願、文献および刊行物は、本明細書において参考として援用される。
（ＡＡＶベクターおよびＡＡＶパッケージング遺伝子の選択および調製）
本発明の組換えＡＡＶベクターは、通常ＡＡＶゲノムの大部分を構成するＡＡＶのｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の代わりに、目的の異種（すなわち、非ＡＡＶ）ポリヌクレオチドを含む。しかし、野生型ＡＡＶゲノムにおける場合のように、ｒＡＡＶプロベクターは、好ましくは、上記の２つのＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する。ｒＡＡＶ構築物が単一の（代表的には改変された）ＩＴＲに隣接するバリエーションもまた、当該分野において記載され、そして本発明との関連において使用され得る。
任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが、適切である。なぜなら、種々の血清型は、遺伝子レベルにおいてさえ、機能的および構造的に関連するからである（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ、編（１９８８）の１６５〜１７４頁；およびＲｏｓｅ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１、１９７４を参照のこと）。全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される、明らかに類似の複製特性を示す；そして、その全ては一般的に３つの関連するキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２で発現されるタンパク質）を有する。関連性の程度は、ゲノム長の全体にわたる、血清型の間の広範な交差ハイブリダイゼーションを示すヘテロ２重鎖分析；およびＩＴＲに対応する末端での、類似の自己アニーリングする部分の存在によって、さらに示唆される。類似の感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が、類似の調節性制御下にあることを、示唆する。種々のＡＡＶ血清型の中で、ＡＡＶ２が最も一般に使用される。
本発明のＡＡＶベクターは、代表的には、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチドを含有する。このポリヌクレオチドは、代表的には、遺伝子治療（例えば、特定の表現型の発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）の状況において、標的細胞に機能を提供する能力のために、目的のものである。そのような、異種ポリヌクレオチドまたは「トランスジーン」は、一般的に、所望の機能またはコードされる配列を提供するのに、十分な長さのものである。ＡＡＶ２粒子内へのキャプシド化のために、トランスジーンは、好ましくは、約５ｋｂ未満であるが、より長い配列のＡＡＶウイルス粒子内へのパッケージングを可能とするために、他の血清型および／または改変が使用され得る。
異種ポリヌクレオチドの転写が意図される標的細胞において所望される場合、これはそれ自体のプロモーターか、または異種プロモーター（例えば、当該分野において公知のように、標的細胞内の転写の所望のレベルおよび／または特異性に依存する）に、作動可能に連結され得る。種々の型のプロモーターおよびエンハンサーが、この状況での使用に適切である。構成性プロモーターは、遺伝子転写の継続するレベルを提供し、そして治療的ポリヌクレオチドが継続する状態で発現することが所望される場合に好ましい。誘導性プロモーターは、一般的に、インデューサーの非存在下において、低活性を示し、そしてインデューサーの存在下でアップレギュレートされる。発現が特定の時間または特定の状況下においてのみ所望される場合か、または誘導剤を使用して発現レベルを滴定することが所望される場合、これらのプロモーターは、好ましくあり得る。プロモーターおよびエンハンサーはまた、組織特異的であり得る；すなわち、これらは、特定の細胞型においてのみ、（おそらくそれらの細胞においてのみ独特に見出される遺伝子調節エレメントに起因して）その活性を示す。
プロモーターの説明のための例示は、シミアンウイルス４０由来のＳＶ４０後期プロモーター、バキュロウイルス多面体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）エンハンサー／プロモーターエレメント、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ｔｋ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーターおよびＬＴＲエレメントを含む種々のレトロウイルスプロモーターである。誘導性プロモーターとしては、重金属イオン誘導性プロモーター（例えば、マウス乳腺癌ウイルス（ｍＭＴＶ）プロモーターまたは種々の成長ホルモンプロモーター）、ならびにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性なＴ７ファージ由来のプロモーターが、挙げられる。例証のために、組織特異的プロモーターの例としては、種々のサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）プロモーター（肺における発現のため）、ミオシンプロモーター（筋肉における発現のため）、およびアルブミンプロモーター（肝臓での発現のため）が挙げられる。非常に多種の他のプロモーターが公知であり、そして一般的に当該分野において入手可能であり、そして、そのようなプロモーターの多くの配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのような配列データベースにおいて入手可能である。
意図された標的細胞において、翻訳もまた所望される場合、異種ポリヌクレオチドはまた、好ましくは、翻訳を容易にする制御エレメントもまた含有する（例えば、リボソーム結合部位、すなわち、「ＲＢＳ」、およびポリアデニル化シグナル）。従って、異種ポリヌクレオチドは、一般的に、適切なプロモーターを作動可能に連結した、少なくとも１つのコード領域を含み、そして、例えば、作動可能に連結したエンハンサー、リボソーム結合部位、およびポリＡシグナルを含有し得る。異種ポリヌクレオチドは、１つのコード領域、または同一かまたは異なるプロモーターの制御下の１つより多いコード領域を含有し得る。制御エレメントおよびコード領域の組み合わせを含む全体のユニットは、しばしば、発現カセットと称される。
異種ポリヌクレオチドは、組換え技術によって、ＡＡＶゲノムのコード領域中に、または好ましくは、その代わりに（すなわち、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の代わりに）組み入れられるが、一般的に、いずれかの末端が、ＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域に隣接する。このことは、ＩＴＲがコード配列の上流および下流の両方に、いずれか一方は直接の近傍位置において、好ましくは（必要ではないが）複製コンピテントなＡＡＶゲノムを再生し得る組換えの可能性を減少するために、ＡＡＶ起源の介在配列を全く含まずに出現することを意味する。最近の証拠は、単一のＩＴＲが、通常２つのＩＴＲを含む配置に関連する機能を行うのに十分であり得（ＷＯ９４／１３７８８）、従って、単一のＩＴＲのみを有するベクター構築物は、本発明のパッケージング方法および生成方法に関連して使用され得ることを、示唆する。
ｒｅｐのネイティブのプロモーターは、自己調節性であり、そして生成されるＡＡＶ粒子の量を制限し得る。ｒｅｐ遺伝子はまた、異種プロモーターと作動可能に連結され得る（ｒｅｐは、ベクター構築物の一部として提供されるか、または別々に提供される）。ｒｅｐ遺伝子の発現によって、強力にはダウンレギュレートされない異種プロモーターはいずれも適切である；しかし、誘導性プロモーターは、好ましい。なぜなら、ｒｅｐ遺伝子の構成性発現は、宿主細胞に負の影響を与え得るからである。非常に多種の誘導性プロモーターが、当該分野において公知であり、これには、例示の目的で、重金属イオン誘導性プロモーター（メタロチオネインプロモーター）；ステロイドホルモン誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴＶプロモーターまたは成長ホルモンプロモーター）；および例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下において活性な、Ｔ７ファージ由来のプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの特に好ましいサブクラスは、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングを相補するために使用されるヘルパーウイルスによって誘導されるサブクラスである。多数のヘルパーウイルス誘導性プロモーターもまた、記載され、これには、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質によって誘導可能なアデノウイルス初期遺伝子プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター；ＶＰ１６または１ＣＰ４のようなヘルペスウイルスタンパク質によって誘導されるヘルペスウイルスプロモーター；ならびにワクシニアまたはポックスウイルス誘導性プロモーターが、挙げられる。
ヘルパーウイルス誘導性プロモーターを同定および試験する方法は、Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｌｌｅｎら）による、ＷＯ９６／１７９４７として公開された共有の同時係属中の出願に記載されている。従って、候補プロモーターがヘルパーウイルス誘導性プロモーターであるか否か、およびそれらが高効率パッケージング細胞の生成に有用であるか否かを決定するための方法は当該分野で公知である。簡単に述べれば、１つのこのような方法は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子のｐ５プロモーターを、推定のヘルパーウイルス誘導性プロモーター（当該分野で公知であるか、またはプロモーターのない「レポーター」遺伝子への連結のような周知の技術を用いて同定される）で置換することを含む。好ましくは、（ｐ５が置換された）ＡＡＶ ｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子のようなポジティブ選択可能なマーカーに連結され、次いで適切な宿主細胞（以下に例示されるＨｅＬａまたはＡ５４９細胞など）に安定に組み込まれる。選択条件下（例えば、抗生物質の存在下）で比較的良好に増殖し得る細胞は、次いで、ヘルパーウイルスの添加に際しｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するそれらの能力について試験される。ｒｅｐおよび／またはｃａｐ発現に対する初期試験として、細胞を、免疫蛍光を用いて容易にスクリーニングしＲｅｐおよび／またはＣａｐタンパク質を検出し得る。次いで、バッケージング能力および効率の確認を、入来するｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングについての機能的試験により決定し得る。この方法を用い、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のヘルパーウイルス誘導性プロモーターを、ｐ５プロモーターの適切な置換体として同定し、そして高力価のｒＡＡＶ粒子を産生するために用いられた（ＷＯ９６／１７９４７、Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに記載）。
種々のＡＡＶゲノムの相対的なキャプシド化サイズ制限を考慮すれば、大きな異種ポリヌクレオチドのゲノム中への挿入は、ＡＡＶ配列の一部分の除去を余儀なくさせる。１つ以上のＡＡＶ遺伝子の除去は、複製コンピテントＡＡＶ（「ＲＣＡ」）を生成する可能性を減少させるためにいずれの場合でも所望され得る。従って、ｒｅｐ、ｃａｐ、またはその両方のコード配列またはプロモーター配列は、好ましくは除去される。なぜなら、これらの遺伝子により提供される機能はトランスで提供され得るからである。
得られるベクターは、これら機能において「欠損」していると称される。ベクターを複製およびバッケージするために、失われた機能は、種々の失われたｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子産物に代わる必要な機能を一緒にコードする単一または複数のパッケージング遺伝子により相補される。このパッケージング遺伝子または遺伝子カセットは、好ましくは、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接せず、そして好ましくは、ｒＡＡＶゲノムとの任意の実質的な相同性を共有しない。従って、複製の間に、ベクター配列と別に提供されるパッケージング遺伝子との間の相同的組換えを最小にするために、２つのポリヌクレオチド配列の重複を避けることが望ましい。相同性のレベルおよび組換えの対応する頻度は、相同配列の長さが増すにつれ、および共有される同一性のそれらのレベルとともに増加する。所定の系における問題をもたらす相同性のレベルは、当該分野で公知のように、理論的に決定され得、そして実験的に確認され得る。しかし、代表的には、その全長にわたって少なくとも８０％同一である場合に重複配列が約２５ヌクレオチド配列より少ない場合、その全長にわたって少なくとも７０％同一である場合に重複配列が約５０ヌクレオチド配列より少ない場合、組換えを実質的に減少またはなくし得る。勿論、さらにより低いレベルの相同性が好適である。なぜなら、それらは組換えの可能性をさらに低減するからである。重複する相同性が全くない場合でさえ、ＲＣＡを生成するある程度の残存頻度があるようである。（例えば、非相同的組換えによる）ＲＣＡを生成する頻度のさらなる減少でさえ、１９９６年１２月１８に出願され、１９９８年６月２５日にＷＯ９８／２７２０４として国際公開された、Ａｌｌｅｎら、米国特許出願０８／７６９，７２８号（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により記載されるように、ＡＡＶの複製およびキャプシド化機能を「分割」することにより得られ得る。
ｒＡＡＶベクター構築物、および相補的パッケージング遺伝子構築物は、本発明において、多くの異なる形態で実施され得る。ウイルス粒子、プラスミド、および安定に形質転換された宿主細胞は、すべて、このような構築物を、一時的であれ、安定にであれ、パッケージング細胞中に導入するために用いられ得る。
本発明の特定の実施態様では、ＡＡＶベクターおよび存在する場合相補的パッケージング遺伝子は、細菌プラスミド、ＡＡＶ粒子、またはそれらの任意の組み合わせの形態で提供される。他の実施態様では、ＡＡＶベクター配列、パッケージング遺伝子のいずれか、またはその両方が、遺伝子的に改変された（好ましくは、遺伝的に改変された）真核生物細胞の形態で提供される。遺伝的に改変されて、ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶパッケージング遺伝子、または両方を発現する宿主細胞の開発は、信頼性あるレベルで発現される物質の確立された供給源を提供する。
従って、種々の異なる遺伝子的に改変された細胞を、本発明の状況で用いられ得る。例として、哺乳動物宿主細胞を、安定に組み込まれたｒＡＡＶベクターの少なくとも１つのインタクトなコピーとともに用い得る。プロモーターに作動可能に連結された少なくともＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含むＡＡＶパッケージングプラスミドを用いて、複製機能を供給し得る（Ｆｌｏｔｔｅらにより共有され、今や米国特許第５，６５８，７７６号である出願に記載のように）。あるいは、プロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を有する安定な哺乳動物細胞株を用いて、複製機能を供給し得る（例えば、Ｔｒｅｍｐｅら（ＵＳＳＮ ０８／３６２，６０８、１９９５年１月９日、ＷＯ９５／１３３９２、１９９５年５月１８日）；Ｂｕｒｓｔｅｉｎら（１９９６年１２月１８に出願されたＵＳＳＮ ０８／７７０，１２２、ＷＯ９８／２３０１８、１９９８年６月２５日）；およびＪｏｈｎｓｏｎら（１９９４年６月６日に出願され、米国特許第５，６５６，７８５号として発行された１９９７年８月１９日、ＵＳＳＮ ０８／２５４，３５８を参照のこと））。上記のように、キャプシド化タンパク質を提供するＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子とともにかまたは別に提供され得る（例えば、上記で参照した出願および特許、ならびに１９９６年１２月１８日に出願されたＡｌｌｅｎら、ＵＳＳＮ ０８／７６９，７２８、１９９８年６月２５日のＷＯ９８／２７２０４（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を参照のこと）。その他の組み合わせが可能であり、そして本発明の範囲に含まれる。
（細胞中への遺伝物質の導入）
当該分野で記載され、そして本明細書および上記で引用された参考文献中に説明されるように、（ＡＡＶの産生のための哺乳動物「プロデューサー」細胞のような）細胞を形質転換または形質導入するための任意の種々の手段を用いて、このような細胞に遺伝物質を導入し得る。例として、このような技術は、例えば、細菌プラスミドを用いたトランスフェクション、ウイルスベクターを用いた感染、エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム沈殿、および脂質を基礎にした種々の任意の組成物を用いる導入（しばしば「リポフェクション」と呼ばれるプロセス）を含む。これらの技術を実施するための方法および組成物は、当該分野で記載され、そして広く利用可能である。
適切に改変された細胞の選択は、当該分野の任意の技術により実施され得る。例えば、細胞を改変するために用いられるポリヌクレオチド配列は、当該分野で公知のような１つ以上の検出可能または選択可能マーカーと同時にまたはそれに作動可能に連結して導入され得る。例として、選択可能マーカーとして薬物耐性遺伝子を利用し得る。次いで、薬物耐性細胞をつり上げそして増殖させ、次いで所望の配列、すなわち、パッケージング遺伝子産物、または適切な場合、異種ポリヌクレオチドの産物の発現について試験し得る。導入されたポリヌクレオチドの獲得、局在化および／または維持についての試験は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを基礎にした技術（サザンブロッティングおよび当該分野で公知の他の手順など）を用いて実施され得る。発現の試験は、遺伝子的に改変された細胞から抽出されたＲＮＡのノーザン分析によるか、または対応する遺伝子産物に対する間接的免疫蛍光により容易に実施され得る。パッケージング能力および効率の試験および確認は、細胞に、ＡＡＶの残りの機能的成分およびヘルパーウイルスを導入し、ＡＡＶ粒子の産生を試験することにより得られ得る。細胞が、複数のポリヌクレオチド構築物で遺伝的に改変される場合、一般に、それらを、細胞に別々に導入し、各工程を順次確証することが（必須ではないが）より便利である。このような技術を記載する参考文献は、本明細書に引用されたものを含む。
（ヘルパーウイルスの選択および調製）
上記のように、ＡＡＶは、自己複製欠損であるパルボウイルスであり、そして一般に、特定の複製機能を供給するヘルパーウイルスに依存しなければならない。多くのこのようなヘルパーウイルスが同定され、これらは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１、サイトメガロウイルスおよびＨＨＶ−６を含むがこれらに限定されない）、およびポックスウイルス（特にワクシニア）を含む。これらウイルスの任意を本発明とともに用い得る。
頻繁に、ヘルパーウイルスは、意図される宿主細胞に感染し得る、あるタイプおよびサブグループのアデノウイルスである。サブグループＣのヒトアデノウイルス、特に血清型１、２、４、６、および７が一般に用いられる。血清型５が一般に好ましい。
アデノウイルスの特徴および増殖パターンは当該分野で公知である。読者は、例えば、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｆｉｅｌｄｓら編、中の、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、７７１〜８１６頁を参照し得る。パッケージされたアデノウイルスゲノムは、末端タンパク質複合体を通じて左手および右手末端でアデノウイルスＩＴＲにより連結され、サークルを形成する線状ＤＮＡ分子である。初期、中期、および後期成分の制御およびコード領域は、ゲノム内で重複する。初期領域遺伝子は、アデノウイルスゲノムの複製に関与し、そしてそれらの位置に依存して、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４領域にグループ分けされる。
必須ではないが、原則的に、ヘルパーウイルス株は、最終的に遺伝子治療を受ける被験体中で複製欠損であることが所望される。従って、ｒＡＡＶ調製物中に存在する任意の残存ヘルパーウイルスは、複製不能である。Ｅ１Ａ、またはＥ１ＡおよびＥ３領域の両方が除去されたアデノウイルスは、大部分のヒト細胞に対して感染性ではない。それらは、失われた活性を相補し得る許容細胞株（例えば、ヒト２９３細胞株）中で複製され得る。ヘルパー機能と関連するように見えるアデノウイルスの領域、およびそうでない領域は、同定され、そして当該分野で記載されている（例えば、Ｐ．Ｃｏｌｏｓｉら、ＷＯ９７／１７４５８、およびそこに引用される参考文献を参照のこと）。
（条件的感受性ヘルパーウイルスの使用）
本明細書で記載される「条件的感受性」ヘルパーウイルスもまた、ヘルパーウイルス活性を提供するために採用され得る。このようなヘルパーウイルス株は、ＡＡＶがそれ自身効果的なゲノム複製を行わない少なくとも１セットの条件下で、宿主細胞中でのＡＡＶ複製を支持し得る性質を最小限有さなければならない。ヘルパーウイルス活性が、インタクトなウイルス粒子として提供される場合、それはまた、一般に、このウイルスが、第２のセットの条件下で、宿主細胞中で複製し得ることが必要である。第１のセットの条件は、第２のセットの条件と、容易に制御可能な特徴（（カチオンのような）必要なコファクターの存在または非存在、阻害薬物の存在または非存在、または温度のような環境条件におけるシフトなど）が異なる。最も簡便には、２つの条件の差異は、温度であり、そしてこのような条件的感受性ウイルスは、それゆえ、温度感受性ヘルパーウイルス（ｔｓＨＶ）と呼ばれる。
本開示の目的には、「温度感受性」または「ｔｓ」ヘルパーウイルスは、特定の温度範囲（「許容」温度範囲）、代表的には約１５〜３５℃、そして好ましくは約２０〜３２℃で、真核細胞中でその遺伝物質を複製し得るものである。しかし、「非許容」温度では、たとえその他の条件が同じに保たれたとしても、遺伝物質の複製の速度は、実質的により低く、少なくとも１０倍より低く；通常少なくとも約１００倍より低く；および好ましくは少なくとも約１０００倍より低い。代表的には、この温度は、約３５〜５０℃、一般に、約４２℃である。このような、ｔｓヘルパーウイルスの代表的な実施例では、このウイルスは、約２０〜３２℃の温度のような比較的低温度で効率的に複製し得るが、約３７〜４２℃の温度のような比較的高温で効果的に複製し得ない。ウイルス感染細胞は、それにもかかわらず、非許容温度で、ＡＡＶ産生のためのヘルパー機能を含むがこれに限定されない、ウイルスに起因し得るいくつかの代謝プロセスを示し得ることが理解される。
温度感受性ヘルパーウイルスは、感染細胞を許容温度で培養することにより、大量に産生し得る。次いでＡＡＶベクターは、ベクター要素および温度感受性ヘルパーウイルスを含む細胞を、非許容温度で培養することにより産生され得る。ベクター調製物は、ヘルパーウイルス成分を実質的に含んでいない。
多数の温度感受性アデノウイルス改変体が当該分野で記載されている；例えば、とりわけ、Ｅｎｓｉｎｇｅｒら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０：３２８、１９７２）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．１１：９５、１９７１）；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６５：３０４、１９７０）；Ｌｕｎｄｈｏｌｍら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：８２７、１９７１）；およびＳｈｉｒｏｋｉら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：４７４、１９７４）により記載された改変体を参照のこと。相補性分析は、このような改変体が、複数の異なる相補性グループに入ることを示している（Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．３４：４１９、１９７４）。このことは、アデノウイルス複製サイクル中の多くの工程に温度感受性を与え得ることを示唆する。
ＡＡＶ複製のヘルパー機能は、アデノウイルスサイクルの一部分のみがインタクトであることを必要とするので、非許容温度で、種々の変異体のヘルパー機能を試験することは、ヘルパー機能をマッピングする手段を提供する。例えば、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７、１９７１）は、温度感受性トリアデノウイルス改変体がＡＡＶ１およびＡＡＶ２の複製を支持することを報告した。Ｉｔｏらは、ヒトアデノウイルス７の温度感受性変異体ｔｓ１３（Ａｄ７ｔｓ１３）が、野生株と同じく効率的に非許容温度でＡＡＶ複製を補助することを報告した。Ｄｒａｋｅら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６０：２３０、１９７４）は、３つのグループの、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）の温度感受性変異体によるＡＡＶ４抗原合成の相補を報告した。Ｈａｎｄａら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ． ２９：２３９、１９７５）は、ヒトアデノウイルス変異体Ａｄ５ｔｓ３６、Ａｄ５ｔｓ１２５、Ａｄ５ｔｓ１４９、Ａｄ１２ｔｓＡ２７５、Ａｄ１２ｔｓＢ２２１、およびＡｄ１２ｔｓＣ２９５によるＡＡＶ１ウイルス産生に対するヘルパー活性を報告した。Ｏｓｔｒｏｖｅら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４：５０２、１９８０）は、温度感受性変異体、Ａｄ５ｔｓ１２５、Ａｄ５ｔｓ１３５、Ａｄ５ｔｓ１５７、Ａｄ５ｔｓ１１６、およびＡｄ５ｔｓ１４２、ならびに宿主範囲変異体ｈｒ６がＡＡＶ複製を支持する（ｈｒ３は支持しない）ことを報告した。Ｍａｙｏｒら（Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３５：５４５、１９７７）は、Ａｄ３１ｔｓ９４ではなくＡｄ３１ｔｓ１３が、非許容温度でＡＡＶ１産生を支持したことを報告した。
Ｓｔｒａｕｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：７４２、１９７６）は、Ａｄ５ｔｓ１２５が、アデノウイルスがそれ自身複製しない条件下で、ＡＡＶ２複製を支持したことを報告した。かれらは、この性質を用いてＡＡＶ複製の間に形成されるＤＮＡ中間体を研究した。Ｍｙｅｒｓら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６５、１９８０）は、ヘルパー機能に関して定量的研究を実施し、そしてＡｄ５ｔｓ１４９が非許容温度で、１細胞あたり２０，０００の感染性ＡＡＶ粒子の産生を支持したが、その一方、Ａｄ５ｔｓ１０７は、１細胞あたりほんの約１００粒子を生産したに過ぎないことを示した。Ａｄ５ｔｓ１０７は、７２ｋＤａ ＤＮＡ結合タンパク質コード領域中に変異を有するので、かれらは、このタンパク質が、ＡＡＶ ＲＮＡ発現において役割を演じていると結論付けた。より最近、Ｃａｒｔｅｒら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：４７３、１９９２）は、完全に機能的な７２ｋＤａタンパク質が、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の定量的な転写後の発現に必要であることを提案した。
背景技術のセクションで概説したように、温度感受性アデノウイルスの存在は、多少は、時折、知られていた。しかし、遺伝子治療に用いられ得るような、組換えＡＡＶベクターの生成における条件的ヘルパーウイルスの実際の使用に関する有効な教示または示唆はなかった。
説明の一部分は、組換えベクターを用いる場合、ＡＡＶの作用可能な力価を得ることの困難さであり得る。とりわけ、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、見かけ上、ｐ５プロモーターを通じてそれら自身の発現をダウンレギュレートする（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：２８８４、１９８６）。さらに、組換えＡＡＶベクターの産生に用いられ得るようなパッケージング細胞株中のｒｅｐ遺伝子の発現が、細胞の増殖および／または代謝を阻害する傾向にあることを観察した（例えば、Ａｌｌｅｎらによる、Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＯ９６／１７９４７を参照のこと）。
野生型ＡＡＶベクターと組換えＡＡＶベクターの生成の間の差異は、産生に関して考慮される場合、極めて劇的である傾向にある。特に、組換えＡＡＶベクターの産生が野生型ＡＡＶ粒子の産生より実質的に低く、しかも小量の混入野生型ＡＡＶの存在または生成でさえ、最終的に組換えＡＡＶベクターに数で勝り得る野生型ウイルスの優先的産生を生じる傾向にあることが観察された。
これらの現象は、本開示の実施例１および２、ならびに図１に記載される結果によりさらに説明される。アデノウイルス温度感受性変異体ｔｓ１４９がＡＡＶ粒子複製を支持することが他で報告されている（Ｍｙｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６５、１９８０）。しかし、実施例２は、この変異体を、標準的な条件下で異種プロモーターを有するＡＡＶベクターの産生を支持するために用いる場合、産生のレベルが、野生型アデノウイルスにより支持されるより数オーダーの程度低いことを示す。
この開示は、温度感受性ヘルパーウイルスが、作用可能な力価で組換えＡＡＶベクターを調製するために実際用いられ、見かけの産生障害物を克服し得ることを示す。以下の記載は、遺伝子治療の目的に十分なＡＡＶを提供するために温度感受性ヘルパーウイルスをどのように選択し、そしてどのように条件を最適化するかを説明する。
特に、ｔｓＡｄをヘルパーとして用いる場合、ＡＡＶの複製期間を延長することが、産生されるＡＡＶベクターの量を、劇的に増加することが示される（実施例３）。これは反直感的である。なぜなら、野生型Ａｄを同様に用いる場合、複製期間を延長することは、少なくとも１オーダーの大きさＡＡＶベクターの量を減少させるからである。ＡＡＶ産生のための条件を最適化することを求める当業者は、論理的には、より短い培養時間およびより高い濃度のヘルパーウイルスに行くであろう：その両者は、本明細書では有効ではないことが示される。
本発明は、定量的な量の温度感受性アデノウイルスを調製するための改良された培養および分離方法をさらに提供する。本発明の特定の実施態様の実施のために厳密には要求されないが、これらの方法により得られる温度感受性アデノウイルスの調製は、遺伝子治療の目的に、ＡＡＶそれ自身の産生に特に適合される。
ヘルパーウイルスの選択された株の条件感受性改変体は、適切な変異誘発および選択戦略により生成され得る。例えば、ウイルスは、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、または５−ブロモ−２−デオキシウリジンで変異誘発され得る。所望の許容条件下で、適切な真核細胞において増加し得るが、所望の非許容条件下ではそうではない候補が選択される。例として、例えば、３２℃で増加するが、３９．５℃では増加しないアデノウイルス温度感受性変異体が得られ得る。３９．５℃対３２℃でのプラーク形成効率比は、好ましくは、１０-4より少なく、そしてより好ましくは１０−５より少ない。温度感受性アデノウイルスの適切な選択プロセスのさらなる例は、例えば、Ｅｎｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０：３２８、１９７２；およびＷｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．１１：９５、１９７１に見出され得る。温度感受性ではなく、宿主範囲感受性であるアデノウイルス改変体の記載は、Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：３１９、１９７７に見出され得る。本発明における使用に有効な温度感受性変異体は、例えば、代替のヘルパーウイルス様単純ヘルペス１（ＨＳＶ１）、または単純ヘルペス２（ＨＳＶ２）から調製され得る。例えば、ＨＳＶ１についてＳｃｈａｆｆｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：５７、１９７３；ＨＳＶ２についてＥｓｐａｒｚａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：５５４、１９７４を参照のこと。背景のセクションで示したように、多数の条件感受性ヘルパーウイルスが記載され、そしてそれらを開発または記載した科学者から、または公的な寄託機関から得られ得る。
前記で列挙したウイルスのすべての条件感受性改変体が本発明で作用するとは限らない。特に、株は、非許容条件下でブロックされる機能が、ＡＡＶの高効率複製に必要であるものではないような、その複製サイクルにおけるステージで条件感受性を与えなければならない。使用のためのそのヘルパーウイルス株の選択は、ヘルパーウイルスおよびＡＡＶの複製条件の両方の公知の生物学を参照してなされ得る。
本発明で使用のための例示のヘルパーウイルスは、Ａｄ５血清型の温度感受性アデノウイルスｔｓ１４９（Ａｄ５ｔｓ１４９）である。実施例のセクションで示されるように、最適化条件下で、この株を用いて、野生型Ａｄ５により支持されるレベルに一致またはそれを超えるレベルでｒＡＡＶを産生し得る。ｔｓ１４９は、位置７５６３においてＣ−ＧからＡ−Ｔへの単一のトランジションを有する（Ｒｏｏｖｅｒｓら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ４：５３、１９９０）。これは、ＤＮＡポリメラーゼの残基４１１のアミノ酸ロイシンのフェニルアラニンへの変化を生じる。このＤＮＡポリメラーゼは、アデノウイルスのＥ２転写ユニット内に含まれる。しかし、この領域にマッピングされるその他のｔｓ変異体は、より適切ではない。特に、このＥ２転写ユニットはまた、７２ｋＤａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）のコード領域を含む。検出可能なＤＢＰを産生しない株（Ａｄｄ／８０２）は、ＡＡＶ複製を支持するが、そのレベルは１オーダーの大きさ減少する（Ｃａｒｔｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：４７３、１９９２）。これもまたＤＢＰコード領域にマッピングされる変異を含むＡｄｔｓ１２５は、野生型Ａｄ５を用いるよりも一般にかなり低いレベルであるが（Ｍｙｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６５、１９８０）、ＡＡＶ複製を支持する（Ｓｔｒａｕｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０、１９７６）。従って、本発明における使用のための適切な温度感受性アデノウイルスベクターは、感受性が、ゲノムのＥ２Ａ領域、好ましくはＤＮＡポリメラーゼコード領域にマップされるベクターを含む。
当業者は、候補ヘルパーウイルス株のパネルを、候補細胞中で、そのヘルパーの自己複製に非許容的である条件下で用いるｒＡＡＶ複製アッセイを実施することにより、ヘルパーウイルスとしての使用にどのウイルス株が適切であることを容易に決定し得る。温度感受性改変体について、スクリーニングは、株の既知の性質に従って非許容温度で行われる。非許容温度は、一般に、許容温度より高く、代表的には約３５〜５０℃、好ましくは３８〜４５℃、より好ましくは約３９．５℃である。対応する野生型ウイルスにより支持されるレベルの１オーダーの大きさの中にあるレベルでＡＡＶ複製を支持する改変体が好ましい。スクリーニングを実施することで、当業者は、本開示の他の教示を取り込むべきである。特に、野生型ウイルスでピークのＡＡＶ産生を与える時間培養することによるスクリーニングは、不十分である。候補ヘルパーウイルスをより長い期間用い、次いでピーク収穫時間にある野生型ウイルスと比較する速度論的マトリックスが設定されるべきである。この分析のより詳細な説明は、本開示の実施例３に提供される。
一旦、適切なヘルパーウイルス株が選択されたなら、それは、本発明において多くの異なる形態で履行され得る。ウイルス粒子、ウイルスプラスミド、および安定に形質転換された宿主細胞のすべてが用いられ得る。
１つの実施態様では、ヘルパーウイルスのゲノム（または最小限、ヘルパー機能をコードするヘルパーウイルスゲノムの領域）が宿主細胞中に導入され、ＤＮＡプラスミド、または相補的機能を提供する複数のプラスミドの形態にあるｖＡＡＶベクターの複製に用いられる。アデノウイルスの実験操作のための手順は、当該分野で公知である。読者は、Ｇｒａｈａｍら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ」：Ｍｕｒｒａｙ ＥＪ編、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第７巻、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ：Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９１：１０９−１２８を参照し、これは、アデノウイルスの増殖、滴定、および精製、同時トランスフェクションおよびインビボ組換えの詳細なプロトコールを提供する。アデノウイルスプラスミドは、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａから市販されている。
別の実施態様では、宿主細胞は、アデノウイルス遺伝子で安定にトランスフェクトされるか、または遺伝子的に改変されてｒＡＡＶ複製に必須の機能を提供する。あるいは、宿主細胞は、アデノウイルスゲノムの部分のみが遺伝子的に改変され得、次いでアデノウイルス粒子またはプラスミドで感染またはトランスフェクトされる。特許出願ＷＯ９５／２７０７１およびＷＯ９５／３４６７１は、遺伝的に改変されてアデノウイルス機能を提供する宿主細胞を記載し、これは、種々の欠損アデノウイルス構築物の複製性質を相補する。
なお別の実施態様では、ＡＡＶ複製に用いられる宿主細胞は、自己複製し得る（しかし非許容条件下ではそうではない）ヘルパーウイルスで感染される。十分なＭＯＩを提供する必要な株の任意の調製物が用いられ得る。ＧＭＰおよびその他の規制条件を維持することにおいて、および商業的目的のスケールアップを容易にするために、好ましくは、ヘルパーウイルスの調製物は、高密度の感染粒子を含み、そして細胞残渣およびその他の混入物を実質的に含まない。所望の性質は以下を含む：
・ＴＣＩＤ５０アッセイで測定したとき、少なくとも１０６、好ましくは少なくとも約１０8、より好ましくは少なくとも約１０１０ＩＵ／ｍｌの密度。
・総タンパク質またはアデノウイルスヘキソンに対するアデノウイルスＤＮＡの比は、ウイルス粒子の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約８０％が、アデノウイルスＤＮＡを含むことを示す。
・タンパク質について染色されたＳＤＳゲル、またはエチジウムブロマイドで染色された制限ヌクレアーゼ消化物のアガロースゲルにより検出されるとき、タンパク質またはＤＮＡレベルの非アデノウイルス物質による、２０％より少ない、好ましくは約１０％より少ない、より好ましくは約１％より少ない混入物。
・生産バッチあたり、合計少なくとも１０９、好ましくは少なくとも約１０１１、より好ましくは少なくとも約１０１３ＩＵ。
ヘルパーウイルスは、ウイルス複製について許容性である任意の細胞において調製され得る。アデノウイルスについて、好ましい細胞は、２９３細胞およびＨｅＬａ細胞を含む。伝統的に、これらの細胞は、アデノウイルスの複製のために用いられる場合、それらは、プレート培養において使用されてきた。しかし、実施例４に示されるように、これらの方法は、一般に、野生型アデノウイルスよりも１または２対数分低いレベルで温度感受性アデノウイルスの複製を支持する。
従って、播種密度の増加を許容する培養技術を使用することが好ましい。懸濁培養に適合させた２９３細胞およびＨｅＬａ細胞変異体が利用可能である。ＨｅＬａは、細胞増殖、生存度、および懸濁物中の形態の理由のために好ましい。実施例５に示すように、これらの細胞を充分な密度（２ｘ１０６／ｍｌ）で増殖させて、温度感受性アデノウイルス株の複製速度の低下を補い得る。一旦樹立されると、細胞にそのウイルスを感染させ、そして充分な時間（一般的に３〜７日間および代表的に約５日間）許容温度で培養する。
接線流濾過は、当該分野において、その灌流、濃縮および採取の目的のために大容量の哺乳動物細胞を処理するために使用される技術である。例えば、Ｄｏｒｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．６：４９４、１９９０；Ｍａｉｏｒｅｌｌａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３７：１２１、１９９１を参照のこと。この技術は、本発明における使用のためのヘルパーウイルスの調製のために懸濁培養物を用いて使用することが推奨される。実施例５は、ＨｅＬａＳ３細胞は、７５０〜１５００秒-1の剪断力に耐え、これにより細胞の濃縮および使用した培地のダイアフィルトレーションが可能になる。
ウイルスを、使用した培地からまたはその細胞の微量流動化によるかのいずれかで、その培養物から採取する。その培養物において産生されたヘルパーウイルスのレベルは、代表的に少なくとも１０７ＩＵ／ｍｌであり、そして好ましくは少なくとも約３ｘ１０７ＩＵ／ｍｌである。
上記の記載に従って調製されたヘルパーウイルスは、ｒＡＡＶ複製のために使用される宿主細胞を感染させるために直接使用され得る。より通常には、このウイルスは、使用前に単離および濃縮される。ヘルパーウイルスを精製および濃縮するための現在の方法は、代表的に、等密度ＣｓＣｌ勾配を含む。この方法は、時間集約的および労働集約的であり、多数の開放処理工程を必要とし、そして規模拡大が困難である。その代わり、クロマトグラフィーによる精製が推奨される。読者は一般に、Ｐｒｉｏｒら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３０、１９９５；およびＨｕｙｇｈｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１４０３、１９９５を参照する。アデノウイルスの温度感受性株の単離のために特に好ましいのは、アニオン交換クロマトグラフィー、特にｐＨ７．４での連続的なＮａＣｌ勾配を用いる特にポリエチレンイミンの樹脂においてである。ポリエチレンイミン分離方法の詳細な説明は実施例６に提供される。
（ヘルパーウイルスおよびＡＡＶを含む宿主細胞の提供）
いくつかの基準が、本明細書に記載されるようなｒＡＡＶ粒子を産生するのに使用するための細胞の選択に影響を与える。最初の事項として、その細胞は、選択されたヘルパーウイルスを用いる場合、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングに許容性でなければならない。しかし、ほとんどの哺乳動物細胞は、ＡＡＶによって生産的に感染され得、そして多くの細胞もまたアデノウイルスのようなヘルパーウイルスによって感染され得るので、多くの種々の哺乳動物細胞および細胞株がこれらの基準を有効に満足することは明白である。これらのうち、より好ましい細胞および細胞株は、組換えＡＡＶベクター調製物の大規模生産を容易にするために培養物中で容易に増殖され得るものである。しかし、このような細胞の多くもまた、この基準を有効に満たす。大規模生産が所望される場合、産生方法の選択はまた、宿主細胞の選択にも影響を与える。例えば、以下および当該分野においてより詳細に記載されるように、いくつかの生産技術および培養容器もしくはチャンバーが付着または接着細胞の増殖のために設計されており、他方、他のものが懸濁細胞増殖のために設計されている。後者の場合、従って、宿主細胞は、好ましくは、懸濁増殖に適合されたかまたは適合可能である。しかし、接着またはアンカー依存性とみなされる細胞および細胞株の場合でさえ、（以下に記載されるように）懸濁増殖しうる細胞について連続的に選択することによってアンカー依存性親株の懸濁適合性改変体を誘導させることが可能である。
温度感受性のヘルパーウイルスが使用される場合、その細胞は、そのヘルパーウイルスの複製に非許容性である条件下でｒＡＡＶベクターを有効に複製し得なければならない。例示のために、アデノウイルスｔｓ１４９をｔｓへルパーウイルスとして使用する場合（以下に記載されそして例示されるように）、その細胞は、３２℃を充分超える、好ましくは、約３９．５℃を超える温度でｒＡＡＶ複製およびパッケージングを支持し得なければならない。ヒト２９３細胞は、これらの規準を満たす細胞株の一例であるが、他の多くの細胞および細胞株がこの比較的高温でｒＡＡＶを複製し得る。
最終的に、複製およびパッケージングに必要であるヘルパーウイルス、ｒＡＡＶベクター配列、およびすべてのＡＡＶ配列は、同じ細胞に存在しなければならない。１以上のＡＡＶパッケージング遺伝子がベクターから別個に提供される場合、以下を含む宿主細胞が提供される：（ｉ）１以上のＡＡＶパッケージング遺伝子、ここでこのＡＡＶパッケージング遺伝子は各々が、ＡＡＶ複製またはキャプシド化タンパク質をコードする；（ｉｉ）ｒＡＡＶベクターまたはプロベクターを使用してこの宿主細胞に導入された異種ポリヌクレオチド、ここで、このｒＡＡＶベクターまたはプロベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲに隣接してその異種ポリヌクレオチドを含み、そしてそのＡＡＶパッケージング遺伝子において欠損している；ならびに（ｉｉｉ）必要なヘルパーウイルス機能をコードするヘルパーウイルスまたは配列。しかし、これらのエレメントの１以上が単一のレプリコンにおいて合わせられ得ることにも注意すべきである。例示のために、ヘルパーウイルスはまた、ｒＡＡＶプロウイルスまたはＡＡＶパッケージング遺伝子を含み得る。
ヘルパーウイルスは好ましくは、培養物中の細胞のほとんどを感染させるのに充分なレベルで細胞培養物中に導入されるが、そうでなければ得られた調製物に存在するヘルパーウイルスの量を制限するために、最低限に維持され得る。１〜１００の感染多重度すなわち「ＭＯＩ」が使用され得るが、５〜１０のＭＯＩが代表的に適切である。
同様に、ＡＡＶベクターおよび／またはパッケージング遺伝子が一過的にパッケージング細胞に導入される場合（安定に導入されるのとは反対に）、それらは、好ましくは、培養物中の細胞のほとんどを遺伝的に改変するのに充分なレベルで導入される。一般的に必要な量は、細菌プラスミドとして供給される場合１０6細胞あたり１０μｇのオーダーであり；あるいはＡＡＶ粒子として供給される場合は、１０５細胞あたり１０８粒子である。最適な量の決定は、当業者の範囲内である慣用的な力価決定の実施である。
これらのエレメントは、同時または任意の順に連続的に、その細胞に導入され得る。その細胞がそのエレメントのいずれかによって遺伝的に変化している場合、その細胞は、次のエレメントが導入される前に、選択され得そして増殖させられ得る。
１つの好ましい実施態様において、ヘルパーウイルスは、最後に細胞に導入されて、常在性のｒＡＡＶベクターのレスキューおよびパッケージングを行う。この細胞は、一般的に、ＡＡＶパッケージング遺伝子に必要な程度にまでスクリーニン既に補充されている。好ましくは、ｒＡＡＶベクターまたはパッケージング遺伝子のいずれか、またはより好ましくはその両方が、その細胞に安定に組み込まれる。他の組合せも可能であることも容易に理解される。このような組合せは、本発明の範囲内に含まれる。
一旦宿主細胞に必要なエレメントが提供されると、その細胞は、ＡＡＶ複製に許容性である条件下で培養されて、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングをさせる。培養時間は好ましくは、産生レベルのピークに対応するように調整され、そして代表的には３〜６日間である。好ましくは、少なくとも１００のウイルス粒子が１細胞当たり産生され；より好ましくは１細胞当たり、少なくとも約１０００粒子、なおより好ましくは１細胞当たり少なくとも約１０，０００粒子産生される。好ましくは、２ｘ１０５細胞当たり，少なくとも０．５ｘ１０６、より好ましくは少なくとも約１ｘ１０６細胞、さらにより好ましくは少なくとも約２ｘ１０６ＲＵ／ｍｌ ＡＡＶベクターが、培養期間の間に産生される。必要に応じて、大規模生産方法（例えば、懸濁培養または接線流濾過が）使用され得る。次いで、ＡＡＶ粒子が収集され、そしてそれらを調製するために使用された細胞から単離される。
本発明のｒＡＡＶ粒子の調製物は、好ましくは、高密度の感染性ＡＡＶ粒子を含み、そしてヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質および細胞砕片、および他の混入物を実質的に含まない。所望の特性は、以下を含む：
○公知の標準を用いて複製アッセイまたは定量ハイブリダイゼーション比較において決定される場合、少なくとも１０７、好ましくは少なくとも約１０８、より好ましくは少なくとも約１０９ＲＵ／ｍｌの濃度
○１０８ＲＵのｒＡＡＶ粒子あたり、１０３以下、好ましくは約１０２以下、より好ましくは１０１以下のヘルパーウイルスの感染性粒子
○ＳＤＳゲルの密度分析によるか、またはヘルパーウイルス特異的タンパク質（例えば、アデノウイルスのヘキソンまたはペントンファイバー）についてのイムノアッセイのいずれかによって検出される、タンパク質ベース（重量／重量）で、５％未満、好ましくは約１％未満、より好ましくは約０．０１％未満、さらにより好ましくは約０．００１％未満のヘルパーウイルスによる混入物
○ＳＤＳゲルの密度分析によるか、またはヘルパーウイルス特異的タンパク質または細胞特異的タンパク質についてのイムノアッセイのいずれかによって検出される、５％未満、好ましくは約１％未満、より好ましくは約０．０１％未満、さらにより好ましくは約０．００１％未満のヘルパーウイルスまたは細胞タンパク質（重量／重量）による混入物
○好ましくは、その調製物はまた、細胞の脂質、炭水化物、および／または核酸のような他の潜在的な細胞成分を実質的に含まない。
本開示に概説される方法は、小さな実験バッチまたは１０〜１００リットル以上の調製バッチを調製するのに適切である。大規模バッチ調製について、以下の特性もまた所望される：
○この調製物において、合計少なくとも１０１０、好ましくは１０１２、そしてより好ましくは１０１４ＲＵのＡＡＶベクター粒子。
必要に応じて、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ粒子について富化するため、ヘルパーウイルス粒子を涸渇させるため、または他の方法で被験体への投与に適切にさせるためにさらに処理され得る。精製技術は、等密度勾配遠心分離およびクロマトグラフィー技術を含み得る。感染性ヘルパーウイルス活性の減少は、当該分野で公知なように、熱処理またはｐＨ処理による不活化を含み得る。他の処理としては、濃縮、濾過、ダイアフィルトレーション、または適切な緩衝液もしくは薬学的な賦形剤との混合が挙げられ得る。調製物は、分配のために単位用量および多用量アリコートに分割され得、これは、そのバッチの本質的な特徴（例えば、抗原性内容物および遺伝的内容物の均質性、および混入するヘルパーウイルスの相対比）を保持する。
上記に記載のような種々の所望の特性を示すヘルパーウイルスおよびＡＡＶの調製物の生成のための例示的な技術は、以下の節においておよび以下の実施例において提供される。
ウイルス調製物の感染性力価の決定のための種々の方法が当該分野で公知である。しかし、力価決定のための好ましい方法は、本明細書に提供されるような高処理能力力価決定アッセイである。例示的な高処理能力力価決定アッセイにおいて、各々が哺乳動物細胞のアリコートおよびウイルス調製物のアリコートを含む培養ウェル（ならびに、例えば、細胞単独、ウイルス単独を含むコントロールウェル、および何も含まないコントロールウェル）のアレイが確立される。培養ウェルのアレイは、例えば、マイクロタイター容器の形態においてであり得る。代表的に、力価測定されるウイルス調製物のアリコート（例えば、連続希釈したアリコート）をその細胞に添加し、次いで、その細胞およびウイルスを、ウイルスの複製を可能にする条件（代表的には、哺乳動物宿主細胞に適した増殖条件）下でインキュベートする。ウイルスの複製後、ウイルス核酸を、哺乳動物細胞の溶解によって総合的に放出させる（必要に応じて溶解を促進する条件または薬剤を用いて）。好ましい実施態様において、複数の溶解物における核酸（ウイルス核酸を含む）を、核酸を結合する条件下で（タンパク質および他の混入物を除去するのに適切な洗浄）メンブレンに移しそして固定する。このメンブレンは好ましくは、もとのアレイの個々のウェルが、次いで、（各培養ウェルの溶解物由来の）核酸（これは、そのメンブレン上の対応する位置に結合している）の「プール」によって表される培養アレイの複製または鏡像である。次いで、そのメンブレンと、標識したウイルス特異的（またはウイルス挿入物特異的）プローブとをハイブリダイズすることを使用して、そのアレイの点の各々、および対応して、もとの培養ウェルの各々における、ウイルス特異的核酸の相対量を同定および定量し得る。核酸の移動、結合、洗浄、およびハイブリダイゼーションのための条件および材料は、慣用的な分子生物学技術から適合され得る（例えば、「ドットブロット」ハイブリダイゼーション（当該分野で記載されるような、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出に記載される分子生物学的な技術を参照のこと））。これらの技術の例示的な適用を以下に提供する。
従って、これらの方法は、ウイルス調製物の感染性力価の決定において使用され得る高処理能力感染性アッセイを提供する。図４に示すように、この迅速かつ定量的な方法によって決定されたウイルス力価は、より古典的な技術によって決定された力価に密接に対応する。しかし、さらに、この高処理能力方法は、多くのウイルス複製反応の同時の処理および分析を可能にし、従って、以下にさらに記載されるように、例えば、ウイルス複製および感染性について許容性であるかもしくは非許容性である細胞株のスクリーニング、ならびにウイルス複製に影響を与える薬剤のスクリーニングを含む他の多くの用途を有する。
（本発明における使用のために好ましい、ヘルパーウイルス産生および精製）
本発明の種々の好ましい局面において、本明細書において記載されるようなｒＡＡＶベクターの産生における使用に適したヘルパーウイルスの生成のための産生および精製の方法が使用される。ＡＡＶの産生のために一般的に使用されるヘルパーウイルスは、アデノウイルス、代表的には、Ａｄ５であるが、他のヘルパーウイルスもまた、本明細書においておよび当該分野で記載されるように使用され得る。
例示の目的で、「上流」および「下流」の相へとウイルス産生および精製の議論を分割することが簡便である。「上流」プロセスとは、一般的に、適切な宿主細胞におけるウイルス産生、および溶解物のような「粗」ウイルス調製物を産生するためにその細胞からそのウイルスを放出または取り出すことをいう。「下流」処理は、その粗ウイルス調製物を精製するために使用され得る（例えば、細胞タンパク質および／または他の混入物からそのウイルスを単離するために）。アデノウイルスを含むヘルパーウイルスの産生および処理のための種々の技術が公知である（例えば、ＣｓＣｌ遠心分離、ならびにＷＯ９６／２７６７７に記載されるもののような他の技術）。次いで、このような技術を用いて産生されたヘルパーウイルスは、本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶベクターの産生において使用され得る。
以下の節は、例示の目的で、アデノウイルスの産生のために使用され得る技術を記載するが、他の技術が当該分野で公知であり、そして本明細書において使用され得る。
（（ｉ）ヘルパーウイルス上流）
ヘルパーウイルス（例えば、Ａｄ５）は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）に感染することによって容易に産生され得る。以下に記載される例示的な例において、細胞は、培地およびその宿主細胞の増殖に適した培養容器中で増殖され、感染前に濃縮され、次いで穏やかに攪拌しながらヘルパーウイルスに感染される（例えば、１〜５のＭＯＩで）。感染後、細胞を、新鮮な培地に再懸濁し得、そしてヘルパーウイルスの複製およびパッケージングを可能にするために、さらなる期間（代表的には、約２日間）インキュベートし得る。インキュベーション後、細胞を採取し、そしてこれを溶解してヘルパーウイルスを放出させ得る。溶解後、その細胞溶解物は、好ましくは、ウイルス粒子にキャプシド化された核酸を分解させずに、遊離の核酸（例えば、細胞核酸）を分解するためにヌクレアーゼで処置される。この溶解物を、明澄化（例えば、濾過および／または遠心分離による）し得、そしてまた以下に記載されそして例示されるように、その調製物におけるそのヘルパーウイルスを精製および濃縮するために、さらに精製技術に供され得る。
このようなプロセスの例示的な例として、細胞を、約１×１０６細胞／ｍｌの密度で、スピナーフラスコのような容器中の培地中で増殖し得る。次いで、インキュベーション後、細胞を約１０７細胞／ｍｌにまで濃縮し得、そして穏やかに攪拌しながら１〜２感染単位／細胞で、その細胞をＡｄ５に感染させ得る。次いで、細胞を培地に、約１０６細胞／ｍｌで再懸濁し得、そして約２日間のインキュベーション期間の間ウイルスを産生させる。次いで、細胞を採取し、培地または緩衝液中に再懸濁（例えば、約５ｘ１０６細胞／ｍｌ）し、次いで、例えば、機械的溶解（例えば、８０００ｐｓｉでの微量流動機を通過させることまたは等価の技術（例えば、凍結融解または超音波処理）によって破壊し得る。この溶解物を、ヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）で、３７℃で１時間処理し得る。この溶解物を、フィルター（例えば、１．０μフィルター）を通すかまたは遠心分離によって明澄化し得る。類似の技術およびその改変は、さらに以下に記載される。
（（ｉｉ）ヘルパーウイルス下流）
ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）の下流処理のために好ましい技術は、そのヘルパーウイルスの精製のためにイオン交換クロマトグラフィー手順を使用する。
例示のために、上記に記載されるようなアデノウイルス濾過物を、緩衝液（例えば、ＴＭＥＧ、これは本明細書においてクロマトグラフィー緩衝液Ａとも称する：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール）で平衡化したクロマトグラフィーカラム中のアニオン交換樹脂（例えば、Ｎ荷電アミノまたはイミノ樹脂（例えば、ＰＯＲＯＳ５０ＰＩ、または任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、三級もしくは四級アミン、またはＰＥＩベースの樹脂））にロードし得る。
次いで、このカラムを、複数のカラム容量のＴＭＥＧ（例えば、５〜６容量）で洗浄し、次いで、複数の容量の生理食塩水（例えば、５〜６容量の８００ｍＭ ＮａＣｌを有するＴＭＥＧ（クロマトグラフィー緩衝液「Ｂ」：６０％ ＴＥＭＧおよび２Ｍ ＮａＣｌを有する４０％ＴＭＥＧ））で洗浄する。このアデノウイルスは、１３００ｍＭ ＮａＣｌを有するＴＭＥＧを用いて溶出され得る（３５％ クロマトグラフィー緩衝液Ａ、６５％ クロマトグラフィー緩衝液Ｂ）。
アデノウイルスのピークは、当該分野で記載されているように、感染性アッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションもしくはイムノアッセイによって画分中に同定され得る。このピークは、０．２μ滅菌フィルターを通して滅菌濾過され得る。必要に応じて、このピークは、接線流濾過、例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ ＵｌｔｒａｓｅｔｔｅまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎユニットによって濃縮され得る。そのピークまたは濃縮物は、この系において適切な緩衝液（例えば、ＰＢＳおよび５％スクロース）へとダイアフィルトレートされ得る。あるいは、このアデノウイルスは、溶出緩衝液に残存し得る。この最終のアデノウイルス産物は、０．２μフィルターを通して滅菌濾過され得、そして使用のために保存され得る。本明細書において記載されそして例示されるように、温度感受性のヘルパーウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）もまた使用され得る。
このようなヘルパーウイルスの調製および使用を記載する実施例は、さらに例示の目的のために以下に提供される。
（本発明における使用に好ましいＡＡＶ産生および精製技術）
ヘルパーウイルスについて、「上流」および「下流」のプロセスの相へとＡＡＶ産生および精製の議論を分割することが例示の目的のために簡便である。「上流」プロセスとは、一般的に、適切な宿主細胞におけるＡＡＶ産生、および「粗」ＡＡＶ調製物を産生するためにその細胞からそのウイルスを放出または取り出すことをいう。「下流」処理は、その粗ＡＡＶ調製物を精製するために使用され得る（例えば、細胞タンパク質および／または他の混入物からそのＡＡＶを単離するために）。
本発明の好ましい局面において、ＡＡＶの上流および下流のプロセスは、混入する細胞タンパク質、ならびに混入する任意のヘルパーウイルス（例えば、Ａｄ）またはヘルパーウイルスタンパク質を実質的に減少および／または除去するように設計された様式で実施される。これらの物質のいずれも、遺伝子移入のために使用される最終のｒＡＡＶベクター調製物において実質的なレベルで存在する場合、免疫応答の誘発に寄与し得る。
以下の節は、例示の目的で、ｒＡＡＶの産生のために使用され得る技術を記載する。
（（ｉ）ｒＡＡＶ上流処理）
ＡＡＶベクターは、必要なＡＡＶパッケージング遺伝子（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）；少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）プロベクター；およびＡＡＶのためのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）を含む、哺乳動物細胞株から産生され得る。これらの成分は、上記に記載および以下に例示されるように、種々の構成で細胞中に導入され得る。ＡＡＶは、任意の種々の哺乳動物細胞において複製され得そしてパッケージングされ得るので、ＡＡＶの産生のために改変され得そして使用され得る多数の細胞株が存在する。
例示のために、ＡＡＶベクターは、細胞株（例えば、「Ｃ１２」（Ｋ．Ｒ．Ｃｌａｒｋら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、３：１１２４−１１３２、１９９６によって記載される）または「Ｃ１３７．５」株（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｊ．Ａｌｌｅｎら、ＷＯ９６／１７９７４による、共有に係る同時係属中の出願に記載される）から産生され得る。この細胞株は、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ構築物ならびにベクター構築物を含むように操作されている。必要に応じて、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ構築物を含む、Ｃ１２またはｃｌ３７のような細胞株は、ベクター構築物を含むプラスミド（例えば、ｐｔｇＡＡＶ−ＣＦ）でトランスフェクトされ得る。または、ｒｅｐおよびｃａｐを含むプラスミド（例えば、ｐＲＳ５）、ならびにベクター構築物を含むプラスミドで細胞がトランスフェクトされ得る。この細胞は、アデノウイルスに感染させられ得るか、またはアデノウイルス遺伝子を含むＤＮＡでトランスフェクトされ得る。
種々のこのようなＡＡＶ「プロデューサー」細胞が、本明細書において引用された参考文献および当該分野で記載されるように、産生され得る。
ＡＡＶプロデューサー細胞は、哺乳動物細胞の増殖に一般的に適切であり、ＡＡＶ複製にもまた一般的に許容性である条件（培地、温度などを含む）下で増殖され得る。例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２懸濁培地は、その細胞の増殖について好ましく、そしてＤＭＥＭ培地単独は、ＡＡＶベクター産生について好ましい。当該分野で公知であるように、いくつかの細胞型および細胞株は、接着依存性である傾向にあるが、他の細胞は、懸濁物中で増殖し得；そして多くの接着依存性細胞もまた、懸濁増殖し得る改変体について富化しそして最終的に選択する手段として懸濁条件下で細胞のサイクルを行うことにより、懸濁物中での増殖に「適合」され得る。したがって、ＡＡＶ産生のための細胞増殖は、その選択されたプロデューサー細胞株が、比較的接着依存性であるか、または懸濁適合されているか否かに一部依存して、任意の種類の容器において、実施され得る。接着依存性細胞の増殖のためのこのような容器は、例えば、組織培養フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリアおよびバイオリアクター（例えば、中空繊維、充填ベッドまたは流動化ベッドのバイオリアクター）を含む。懸濁適合した哺乳動物細胞株のための容器は、例えば、スピナーフラスコ、タンクリアクター、およびエアリフト醗酵槽を含む。
ＡＡＶ複製は、一定時間、およびウイルス産生が最適になる、増殖周期における点まで進行し（好ましくは、中期から後期の対数増殖期（代表的には１〜３日間））、その時点の後、その細胞を採取し得、そして溶解させて子孫のウイルスを放出させ得る。例えば、細胞は、約１〜１０ｘ１０６細胞／ｍｌに、増殖培地中に再懸濁され得、そして４８時間産生させ得る。次いで、細胞を採取し（例えば、遠心分離により）、そして緩衝液（例えば、ＴＭＥＧ、（または、「クロマトグラフィー緩衝液Ａ」）：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール）中に、約１〜１０ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁され得る。
ＡＡＶは、必要なＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびヘルパーウイルス機能が比較的同時に提供される場合、形質導入した細胞において高コピー数（例えば、１０5〜１０6ゲノム／細胞）にまで複製され得る。Ｃａｐタンパク質もまた提供される場合、ＡＡＶ粒子は、感染した細胞の核にアセンブルし、そこで、それらは、結晶配列でアセンブルする傾向がある。したがって、生産物回収における第一の工程は、細胞破壊である。凍結融解および／または超音波処理が使用されて、細胞を破壊（アデノウイルスに関して）し得るが、このような技術は、大規模調製にはそれほど適していない。従って、機械的溶解（微量流動化のような技術を使用する）がこれらの点で好ましい。変性剤および他の化学薬剤もまた、溶解を媒介または容易にするために使用され得る。ヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を用いた溶解物の処理が粘度を減少させ、そして濾過可能性を改善するために役立つことが見出された。明澄化（例えば、細胞砕片の少なくともいくらかの部分からベクターを分離するための微量濾過による）もまた、回収および精製を促進するために役立つ。
例示のために、細胞は、（代表的に、約８０００ｐｓｉで、２つの通過を用いて）微量流動化機を連続的に通過させることによってインキュベーション時間後に機械的に溶解され得る。他の一般的に使用される技術は、当該分野で公知のように、凍結融解サイクルおよび超音波処理を含む。この溶解物はまた、ヌクレアーゼで処理されて、ウイルス粒子にパッケージングされることによっては有効に「保護」されていない核酸（例えば、細胞核酸またはウイルス核酸）を分解し得る。本発明者らは、代表的に、３７℃で約１時間のＢｅｎｚｏｎａｓｅ消化を使用する。この溶解物はまた、明澄化され得る。明澄化のための方法は、フィルター（例えば、１μフィルター）を通過させること、および遠心分離を含む。
接線流濾過（ＴＦＦ）は、大容量の細胞を処理しそして採取するために都合よく使用され得る。ＴＦＦは、動物細胞を灌流し、濃縮し、そして採取するために使用され得る。例えば、ＴＦＦを使用して、１秒あたり３０００までの平均壁剪断速度での層流条件下で細胞を処理し得る（たとえば、Ｍａｉｏｒｅｌｌａ、Ｂ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３７：１２１−１２６、１９９１）。ＴＦＦ限外濾過を用いるウイルスの大規模濃縮は、Ｒ．Ｐａｕｌら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、４：６０９−６１５、１９９３により記載されている。
このような技術を用いた例示的な産生の実施は、以下に記載される。
（（ｉｉ）ＡＡＶ下流処理）
上記に記載されるように、ヘルパーウイルス粒子（例えば、Ａｄ粒子）を実質的に含まないＡＡＶの調製物を得ることは特に有利である。さらに、ＡＡＶベクター調製物はまた、好ましくは、ヘルパーウイルスおよび細胞タンパク質（これはまた、免疫原性であり得る）を実質的に含まない。しかし、ＡＡＶ産生のための技術の適性に影響を与えるさらなるセットの限定が存在する。すなわち、遺伝子治療のためのＡＡＶの産生に特に有用であるために、その技術は、「大規模化可能」である（すなわち、大規模製造用デバイスおよび手順に関して適用可能である）ことが最も所望される。この後者のセットの限定は、塩化セシウム分離（これは、大規模調製手順にはあまり適していない）のような利用可能な標準的な技術の有用性を有効に減少または除去する。
本発明者らは、ヘルパーウイルス粒子、ならびにヘルパーウイルスおよび細胞タンパク質およびそのような他の混入物を実質的に含まないＡＡＶ調製物の生成について、大規模化可能であるとともにかつ顕著に有効である手順の組合せを見出した。本発明者らの好ましい手順の組合せは、例えば、ＡＡＶまたはＡｄの可能な精製について当該分野において言及されている種々の手順とは対照的である、イオン交換クロマトグラフィー手順を使用する。特に、当該分野で記載されているこのような手順は、代表的に、単一の型のイオン性分離、時に他の種類のクロマトグラフィー手順との組合せを使用する（例えば、Ｋ．Ｔａｍａｙｏｓｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：５０７−５１３（１９９６）、およびＷＯ９６／２７６７７、１９９６年９月１２日）。しかし、ＡＡＶ産生の場合、本発明者らは、連続的な反対のイオン交換クロマトグラフィーの組合せが、ヘルパーウイルス粒子およびタンパク質、ならびに細胞タンパク質を実質的に含まないＡＡＶ調製物の生成に特に有効であることを見出した。
これらの発見に鑑みて、ＡＡＶは、アニオン交換およびカチオン交換クロマトグラフィーの両方に「適合」されているのみならず、このような両方の反対のイオン性交換の組合せが、その生成およびＡＡＶベクター調製物において代表的に生じる種々の粒子およびタンパク質混入物の全て除去するのに特に有効でもあるようである。任意の種々のカチオン交換樹脂およびアニオン交換樹脂がこれらの手順に関して使用され得、その基礎的な特性は、それぞれ、負荷電基および正荷電基の利用可能性であり、それらの基に対して、ＡＡＶは、少なくともある程度（最も好ましくは、上記に記載のような１つ以上の混入物、すなわち、Ａｄ粒子およびタンパク質、ならびに哺乳動物細胞タンパク質の相対的結合親和性とは実質的に異なる程度に）結合し得る。理論に拘束されることは望まないが、アニオン交換工程は、アデノウイルスからＡＡＶを分離するのに特に有効であると考えられる；一方、両方の工程（しかし、特にカチオン交換工程）が、細胞タンパク質からＡＡＶを分離するのに特に有効であると考えられる。本発明者らはまた、以下に記載および例示されるように、アニオン交換次いで接線流濾過を使用した。以下にさらに記載されるように、本発明者らは、ＡＡＶ調製物がヘパリン硫酸上のクロマトグラフィーによって高度に濃縮され得ることを見出した。
例示のために、上記のように明澄化したＡＡＶ溶解物は、正荷電したアニオン交換カラム（例えば、Ｎ荷電アミノ樹脂またはイミノ樹脂（例えば、ＰＯＲＯＳ ５０＿ＰＩ、または任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、三級アミンもしくは四級アミン、またはＰＥＩベースの樹脂））または負荷電したカチオン交換カラム（例えば、ＨＳ、ＳＰ、ＣＭまたは任意のスルホ、ホスホ、もしくはカルボキシベースのカチオン樹脂）にロードされ得る。そのカラムは、緩衝液（例えば、クロマトグラフィー緩衝液Ａ／ＴＭＥＧ）で洗浄され得る。そのカラムは、ＮａＣｌ濃度の増加勾配で溶出され得、そして画分が集められ得、そしてＡＡＶおよび／または混入物の存在についてアッセイされ得る。
他の手順が、当該分野で公知なように、荷電以外の特徴によって媒介される分子間会合に基づいて、上記のアニオンおよびカチオン交換手順に代わり、好ましくはそれに加えて、使用され得る。このような他の手順は、リガンド−レセプター対（例えば、抗体−抗原、またはレクチン−炭水化物相互作用）に基づく分子間会合、ならびにその分子の他の属性に基づく分離（例えば、サイズおよび／または形状に基づく分子篩クロマトグラフィー）を含む。ほんの一つの例をみると、濾過物および部分精製したＡＡＶ調製物が、ＡＡＶ特異的抗体を含むカラムにロードされ得る。このカラムは、ＡＡＶを結合し得る。このカラムは、緩衝液でリンスして、混入するタンパク質を除去し得、次いで漸増濃度のＮａＣｌの勾配または段階を用いて溶出し、そして画分が集められ得る。あるいは、このようなカラムは、ロード緩衝液のｐＨとは異なるｐＨの緩衝液で溶出され得る。
ＡＡＶおよびアデノウイルスのピークは、感染性アッセイあるいは核酸ハイブリダイゼーションまたは免疫アッセイによって画分において同定され得る。このピークをプールし得、そしてそのプールを緩衝液（例えば、ＴＭＥＧまたは等価物）を用いて希釈または透析またはダイアフィルトレートして塩濃度を減少させ得る。
このプールは、正荷電したアニオン交換カラムおよび／または負荷電したカチオン交換カラム（例えば、上記に言及されるもの）に注入され得る。このカラムは緩衝液（例えば、クロマトグラフィー緩衝液Ａ／ＴＭＥＧ）で洗浄され得る。このカラムは、漸増濃度のＮａＣｌの勾配で溶出され得、そして画分が集められ得る。ＡＡＶおよびアデノウイルスのピークは、感染性アッセイによってあるいは核酸ハイブリダイゼーションまたは免疫アッセイによって画分中で同定され得る。そのピークは、これらのアッセイのいずれかの結果に基づいてプールされ得る。
上記のアニオン交換カラムから溶出されたＡＡＶ含有画分のプールは、接線流濾過（ＴＦＦ）（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ ＵｌｔｒａｓｅｔｔｅまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎユニット）によって濃縮され得そして精製され得る。適切な分子量カットオフ（例えば、１００．００または３００，０００カットオフ）のメンブレンは、代表的に再生セルロースまたはポリエーテルスルホンのようなポリマーから構成される。この調製物は、そのメンブレンを通して濾過され、そしてその産物が保持される。保持された物質は、リンゲル平衡塩溶液および５％グリセロールのような適切な緩衝液の連続的な洗浄を使用して、そのメンブレンを用いてダイアフィルトレートされ得る。最終のサンプルは、その産物について非常に富化されており、そして０．２μフィルターを通して滅菌濾過され得、そして使用のために保存され得る。
接線流濾過を用いたアニオン交換カラム後の物質からのＡＡＶの精製および濃縮において、３００，０００分子量カットオフメンブレンは、１００，０００分子量カットオフメンブレンよりも、高収量の複製単位をもたらした。
アデノウイルスの除去のために用いられ得る、さらなる工程は、所望である場合、熱不活化工程（本明細書において記載されるような）を用いた溶離液プールを処置する工程、次いで濾過（例えば、その調製物をＴＴＦに供する前に）を包含する。しかし、本発明者らは、上記の「アニオン交換からＴＦＦ」手順が検出可能なアデノウイルスを含まないＡＡＶ調製物を生じ、そしてより良い収率の精製されたＡＡＶをもたらしたこと見い出した。
例示的な産生は、以下に記載されるような技術を使用して行う。
（産生を増強するためのＡＡＶプロデューサー細胞の増殖条件の変更）
種々の培地および培養容器における本発明者らのＡＡＶを用いる産生試験の経過の間に、本発明者らは、代表的に、種々の増殖および／または代謝パラメーター（例えば、細胞密度、グルコースおよびアミノ酸の利用可能性、およびアンモニアおよび乳酸のような代謝副産物の産生）に関して培養物をモニターした。このような成分は、標準的な技術（例えば、当該分野で記載されるような、ＨＰＬＣおよび酵素アッセイ）を用いて容易にモニターされ得る。
以下の実施例に記載されるように、本発明者らは、特定のアミノ酸、特にアスパラギン酸およびグルタミン酸が、バッチおよび灌流培養の両方において迅速に涸渇することを見出した。実際、種々のバッチおよび灌流実験において、本発明者らは、利用可能なａｓｐおよびｇｌｕの９０〜９９％が２４〜４８時間後に実質的にこのような培養物から除去されることを見出した。ａｓｐおよびｇｌｕのレベルがこのような培地では最適未満であるようなので、従って本発明者らは、さらなる量の一方または両方のアミノ酸を提供した。これらのような培養維持および最適化技術は、大規模生物学的産生の状況において慣用的に適用されている（例えば、Ｇｌａｃｋｅｎ、Ｍ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２８：１３７６〜１３８９、１９８６；Ｇｌａｃｋｅｎ、Ｍ．Ｗ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１０４１−１０５０、１９８８；Ｂｉｂｉｌａ、Ｔ．Ａ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１０：８７−９６、１９９４；ならびにＢｏｒｙｓ、Ｍ．Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、４３：５０５−５１４、１９９４を参照のこと）。
本発明者らが驚いたことに、これらの涸渇したアミノ酸の置換が、ＡＡＶ産生の急激な低下をもたらした、例えば、以下に記載される実験において、標準的な培地（ＤＭＥＭ）に、さらなるａｓｐおよびｇｌｕを補充すると、一桁を超える程度に産生効率が（１細胞あたり約１８００ＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）から１細胞当たり約１４０ＤＲＰへと）低下したが、生存度は若干増強された。
哺乳動物プロデューサー細胞の増殖のための、別の一般的な培地成分は、血清成分（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））であり、これは、代表的には、約１０％のレベルで培地に含まれる。以下に記載されるように、ＡＡＶ産生のための血清レベルが増加される場合（２０％に）、ＡＡＶベクター産生は、２倍を超えて低下した。対照的に、その細胞が漸減的に低下する血清レベルに供された場合、ＡＡＶベクター産生は劇的に増加した。例えば、血清レベルが通常の出発レベルの１／１０に（すなわち、１％に）減少した場合、ベクター産生は、４倍を超えて増加した。
理論に拘束されることは望まないが、今や、プロデューサー細胞を、代謝的または以下に記載される他の手段のいずれかによってストレスを与えることで、ＡＡＶベクターの産生が劇的に増加し得るようである。
ストレスは、細胞増殖および／または代謝に対する、ストレス条件またはストレス因子の負の効果に基づいて、有効に特徴付けられそして試験され得る。実際、ストレスは、細胞増殖および／または代謝を阻害する任意の条件または因子の導入によってか、あるいは細胞増殖および／または代謝に関して最適ではなくさせるように、予め存在する条件または因子のレベルを変更することによって達成され得る。多くの種々のこのような条件が公知および／または明白であり、これには、栄養ストレス（１以上の栄養が増殖および／または代謝にとって最適レベル未満で存在する）、温度ストレス（最適未満の温度、これは、細胞をより低いかまたは高い温度で増殖させること、またはその細胞を冷ショックまたは熱ショックのような一過性の温度ショックに供することを含み得る）、浸透圧ストレス（最適未満の浸透圧レベル、これは、低浸透圧または高浸透圧であり得る）、ｐＨストレス（最適未満のｐＨ，これは、酸性またはアルカリ性であり得る）、通気ストレス（例えば、酸素または気体交換の最適未満のレベル）、機械的ストレス（例えば、培養物混合において生じるような剪断ストレス）、照射ストレス、および毒性ストレス（増殖および／または代謝を阻害する、１以上の化学物質または他の因子の存在）が含まれる。このような因子および条件の（すべてではないにせよ）ほとんどについて、その細胞をそのストレスに連続的または一過的に供することが可能である。例示のために、温度ストレスの場合、その細胞は、最適温度より高いかまたは低い温度で増殖され得るか（代表的に、その最適温度は、その細胞が由来する動物のほぼ通常の体温である）、またはその細胞は、一過的な温度ショック（例えば、冷ショックまたは熱ショック）に供され得る。このようなストレス条件の現在好ましい例は：栄養ストレス（例えば、アミノ酸または血清限定）、通気レベルおよび攪拌の変更、浸透圧レベルの変更（例えば、非代謝性炭水化物（例えばソルビトール）を用いる）、および化学的因子（例えば、飽和脂肪性カルボン酸（例えば、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸およびカプロイン酸ならびにそれらの有機もしくは無機塩基との塩）、Ｎ，Ｎ’ジアシル化ジアミン（例えば、ペンタメチレンビスアセトアミド、ヘキサメチレンビスアセアセトアミド、およびヘプタメチレンビスアセトアミド）、有機イオウ化合物（例えば、ジメチルスルホキシド）、ならびにグルココルチコイド（例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、アルドステロン、トリアムシノロンおよびコルテキソロン）の含有を包含する。他のこのような因子にはまた、遺伝子毒性薬剤（例えば、化学的発ガン物質、ＵＶ、熱ショック、ＤＮＡ合成の代謝インヒビター（例えば、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、アフィジコリン、トポイソメラーゼに影響する薬物（例えば、アムサクリン、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｈｅｃｉｎ）、エトポシドおよびノボビオシン）が含まれる。
上記のように、プロデューサー細胞はまた、ｐＨを変更することによって致死量未満のストレスに供され得る。以下に例示するように、本発明者らは、培地ｐＨを増加することによって誘導されるｐＨストレスが、ＡＡＶを増加させるだけでなく、それはまた、培養培地中に放出されたＡＡＶの相対比の劇的なシフトを生じたことを見出した。従って、以下にさらに記載するように、この技術は、ＡＡＶ精製を容易にするためおよび産生を強化するために使用され得る。
種々のストレス条件を使用することによってＡＡＶの産生を最適化するための例示的な手順は、以下に提供される。その結果は、異なる種々のストレス条件の適用がＡＡＶ産生レベルを有効に増強するために使用され得ることを示す。
（遺伝子治療のためのｒＡＡＶの使用）
本発明において具現化されるのは、治療的に関連する遺伝子配列を用いたポリヌクレオチドを含むベクター組成物である。本発明のＡＡＶウイルスベクターは、遺伝子治療の目的のために、個体に投与するために使用され得る。遺伝子治療に適した疾患は、ウイルス感染、細菌感染または寄生生物感染によって誘導される疾患、種々の悪性状態および過剰増殖性状態、自己免疫状態および感染性欠損を含むがこれらに限定されない。
遺伝子治療は、その細胞内のまたはそれによって分泌されるかのいずれかの特定のタンパク質の発現レベルを増強するように実施され得る。本発明のベクターを使用して、遺伝子標識、欠失または欠損した遺伝子の置換、または治療遺伝子の挿入のいずれかのために細胞を遺伝子的に変更し得る。あるいは、発現レベルを減少させるポリヌクレオチドが細胞に提供され得る。これは、悪性の経過の間に増幅または過剰発現された遺伝子、あるいは微生物感染経過の間に増幅または過剰発現された遺伝子の産物のような所望されない表現型の抑制のために使用され得る。発現レベルは、例えば、標的遺伝子またはＲＮＡ転写物（アンチセンス治療）のいずれかとの安定なハイブリッドを形成し得る配列、関連するｍＲＮＡを切断するリボザイムとして作用し得る配列、あるいは標的遺伝子の産物についてのデコイとして作用し得る配列を含む治療ポリヌクレオチドを供給することによって減少され得る。
特に興味深いのは、気道上皮に対して適切に機能する嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）を提供することによって、嚢胞性線維症の遺伝子欠損を矯正することである。Ａｆｉｏｎｅら、（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３２３５、１９９６）およびＣｏｎｒａｄら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：印刷中、１９９６）は、単回用量のＡＡＶベクターを用いた霊長類肺への安定なインビボＣＦＴＲ遺伝子移入を示した。嚢胞性線維症患者に由来する細胞においてＣＦＴＲ機能不全を再構築し得る種々のＣＦＴＲポリペプチドが存在する。Ｒｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：２０５（１９９１）は、ＣＦＴＲ由来の欠失アミノ酸残基７０８〜８３５を記載した。これは、塩化物イオンを輸送し得、そして天然に存在するＣＦＴＲ欠損を矯正し得た。Ｅｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５８：５８１（１９９２）は、別のＣＦＴＲ誘導体（無関連のタンパク質由来の約２５アミノ酸、次いで残基１１９に始まるネイティブＣＦＴＲの配列を含む）を記載した。これはまた、正常なＣＦＴＲの電気生理学的特徴を回復させ得た。Ａｒｉｓｐｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１５３９（１９９２）は、残基４３３〜５８６を含むＣＦＴＲフラグメントが、脂質二重層中で正しい塩化イオンチャネルを再構成するに充分であったことを示した。Ｓｈｅｐｐａｒｄら、Ｃｅｌｌ ７６：１０９１（１９９４）は、残基８３６でそのほぼ半分の長さに短縮したＣＦＴＲポリペプチドはなお、調節された塩化イオンチャネルを形成し得ることを示した。従って、ネイティブＣＦＴＲタンパク質のコードタンパク質を伴うＡＡＶベクターならびにその変異体およびフラグメントは、すべて、本発明の好ましい実施態様である。
特に興味深いのはまた、特定の腫瘍型に局所的に欠損する、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子を、腫瘍部位に適切に機能するｐ５３遺伝子を供給することによる矯正である（Ｈｕｙｇｈｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１４０３，１９９５）。
本発明の組成物は、インビボおよびエキソビボで使用され得る。インビボ遺伝子治療は、本発明のベクターを被験体に直接投与する工程を包含する。薬学的組成物は、液体溶液または懸濁物として、乳濁液として、または使用前の液体中への溶解または懸濁に適した固体形態として、供給され得る。呼吸管への投与について、好ましい投与形態は、適切なエアロゾル化デバイスとともに用いられる場合は固体または液体エアロゾルのいずれかを提供する組成物を用いて、エアロゾルによる。呼吸管への別の好ましい投与形態は、ベクターを滴下するために可撓性の光ファイバー気管支鏡を用いることである。代表的に、ウイルスベクターは、リンゲル平衡化塩溶液（ｐＨ７，４）のような発熱物質を含まない、薬学的に適切な緩衝液中に存在する。必要ではないが、薬学的組成物は、必要に応じて、正確な量の投与に適切な単位投薬形態で供給され得る。
ウイルスの有効量は、処置の目的に依存して投与される。有効量は、単回または分割された用量で与えられうる。少量の割合の形質導入が遺伝子欠損を治癒し得る場合、処置の目的は、一般的に、形質導入のこのレベルに合致するかまたは超過している。いくつかの場合、形質導入のこのレベルは、標的細胞のほんの約１〜５％であるが、しかし、より代表的には、所望の組織型の細胞の２０％、通常は少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そしてさらにより好ましくは所望の組織型の細胞の少なくとも約９９％の形質導入によって達成され得る。ガイドとして、気管支鏡によって与えられる単回用量中に存在するベクター粒子の数は、一般に、少なくとも約１ｘ１０８であり、そしてより代表的には、５ｘ１０８、１ｘ１０１０、そしていくつかの場合、１ｘ１０１１の粒子であり、これは、ＤＮａｓｅ耐性およびＤＮａｓｅ感受性粒子の両方を含む。ＤＮａｓｅ耐性粒子に関して、その用量は、一般に１ｘ１０６〜１０１４粒子の間であり、より一般的には、約１０８〜１０１２粒子の間である。この処置は、必要に応じて２または３週間おきほどの頻度で反復され得るが、１８０日に１回の処置で充分であり得る。
遺伝子変化の有効性は、いくつかの規準によってモニターされ得る。生検または手術切除によって除去されたサンプルは、インサイチュハイブリダイゼーション、ベクター特異的なプローブを用いるＰＣＲ増幅、ＲＮａｓｅ保護、免疫組織学、または免疫傾向細胞計数によって分析され得る。そのベクターが気管支鏡によって投与される場合、肺機能試験が実施され得、そして気管支洗浄液が炎症性サイトカインの存在について評価され得る。処置された被験体はまた、臨床的特徴について、および治療的ポリヌクレオチドによって運ばれることが意図される機能をその細胞が発現するかどうかを決定するためにモニターされ得る。
インビボまたはエキソビボ治療で使用するか否かの決定および特定の組成物、用量、および投与経路の選択は、処置される状態の特徴および被験体を含むがそれらに限定されない多数の種々の因子に依存する。このような特徴の評価および適適な治療レジメンの設計は、最終的には、処置する内科医の責任である。
上記の記載は、とりわけ、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）および細胞タンパク質を実質的に含まない組換えＡＡＶベクターの高力価の調製物を生成するための方法を提供する。本発明の精神から逸脱することなく、これらの方法に改変が当業者によって適用されることが理解される。
以下に提示される実施例は、当業者にとってさらなるガイドとして提供され、そしていかなる形でも限定することは意図されない。
（実施例）
（実施例１ 野生型ヘルパーウイルス（ＡＤ５）および温度感受性ヘルパーウイルス（ＡＤ Ｔｓ１４９）を用いた組換えＡＡＶベクターの例示的産生）
本実施例は、モデル治療遺伝子を含む組換えＡＡＶベクター粒子の複製のためのヘルパー機能を提供する、野生型ヘルパーウイルス（Ａｄ５）および温度感受性ヘルパーウイルス（Ａｄ ｔｓ１４９）の使用を例示する。
ｐｔｇＡＡＶＣＦプラスミドは、左側のＡＡＶ２ＩＴＲ；全長嚢胞性線維症膜貫通調節因子ｃＤＮＡ；マウスβグロビンポリアデニル化配列に基づく合成ポリアデニル化配列；ｃａｐコード配列の下流のＡＡＶ２配列；およびｐＢＲ３２２プラスミド骨格中の右側のＡＡＶ２ ＩＴＲからなる（Ａｆｉｏｎｅら、１９９６）。ｐＧＥＭ−ＲＳ５パッケージングプラスミドは、ｐＨＩＶｒｅｐプラスミドに由来し（Ａｎｔｏｎｉら、１９９１）、そしてＨＩＶ−１ ＬＴＲ由来のＵ３およびＲ領域；ｐ１９およびｐ４０プロモーターを含むＡＡＶ２由来のｒｅｐおよびｃａｐ領域；細菌複製および選択のためのｐＢＲ３２２およびｐＧＥＭプラスミド配列；ならびにＨＩＶＬＴＲの上流のヒトＡｌｕ反復細胞ＤＮＡの小領域からなる。
アデノウイルス５型は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ）から入手したストックから増殖させた。Ａｄ５ｔｓ１４９（Ｅｎｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０：３２８，１９７２）は、Ｈａｒｏｌｄ Ｓ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇから入手した。
Ａｄ５およびＡｄ５ｔｓ１４９（ｔｓ１４９）の作業用ストックを、それぞれ３７℃および３２℃で、それぞれ感染多重度（ＭＯＩ）５および１で２９３−１細胞を感染させることによって生成した。４時間後、培養物に、新鮮な培地を与え、そして湿潤１０％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。７２時間後、細胞を取り出し、１０００ｘｇで１５℃でペレット化し、そして０．１ｇ／ＬのＭｇＣｌ２および０．１ｇ／ＬのＣａＣｌ２を含むＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、細胞懸濁物を、３回凍結および融解し、１８ゲージ針を通して３回剪断し、そして１０００ｇ、１５℃で遠心分離することにより明澄化した。次いで、明澄化した溶解物を、２ｍｇ／ｍｌの最終濃度のＤＮａｓｅＩで３０分間３７℃で処置した。処置した溶解物を、２．０ｍｌの水中のＣｓＣｌ（１．４０ｍｇ／ｃｍ３）に対して重層化した４．０ｍｌのＣｓＣｌ（１．２５ｇ／ｃｍ３）を含む水中のＣｓＣｌの不連続な段階勾配上に重層化し、そして３５，０００ＲＰＭで１〜２時間、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１ローター中で遠心分離した。各チューブからのアデノウイルスバンドを除去し、プールし、そして水中に１．３５ｇ／ｃｍ３のＣｓＣｌへと希釈し、そしてＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ５５ローター中で一晩３５，０００ＲＰＭで一晩遠心分離した。アデノウイルスバンドをプールし、１０％グリセロールに調整し、そして１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０％グリセロールを補充した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５緩衝液に対して徹底的に透析した。
２９３−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）を、湿潤１０％ＣＯ２インキュベーター中で、Ｔフラスコ中の１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）補充したＤＭＥＭ 高グルコース培地（ＪＲＨ）中で維持した。この実施例について、１０％ＦＢＳおよび２．０ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭを有する組織培養フラスコ中の２９３−１細胞に４．４ｘ１０４細胞／ｃｍ２で播種した。そして、これを、湿潤１０％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で２４時間インキュベートした。
次いで、この細胞（１フラスコ当たり約１０７細胞）に、Ａｄ５またはｔｓ１４９のいずれかの作業用ストックを、１時間でＭＯＩ５で感染させ、次いでベクターの一過性トランスフェクションおよびプラスミドのパッケージングを行った。一過性のｐｔｇＡＡＶＣＦベクタープラスミドおよびｐＧＥＭ−ＲＳ５ヘルパープラスミドの同時トランスフェクションを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて実施した。そのプロセスにおいて、３７．５μｇの各プラスミドを、１５０μｌ ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭとともに混合して、そして４．７５ｍｌの無血清ＭＥＭ中に希釈した。このアデノウイルス種菌を取り出し、そしてプラスミド−ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ混合物を、その細胞に添加し、そして４時間５％ＣＯ２インキュベーター中で適切な温度でインキュベートした。プラスミド−ＬＩＰＯＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ混合物を、その培養物から４時間後に取り出し、そして新鮮な培地に置換した。
野生型ウイルスに感染した細胞を、３７℃で培養し、そしてＡｄｔｓ１４９に感染した細胞を３９．５℃でインキュベートした。７２時間後、それらの細胞を採取し、ペレット化し、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５中に再懸濁した。次いで、懸濁物を、氷水浴中でＢｒａｎｓｏｎカップホーン超音波処理機を使用して、４回の１５秒間パルスを利用して超音波処理することによって溶解し、そしてｒＡＡＶＣＦおよびアデノウイルス産生についてアッセイした。
（実施例２） ベクター調製物中のｒＡＡＶおよびアデノウイルス力価の定量
先の実施例からの細胞溶解物を、Ｃ３７複製アッセイによりｒＡＡＶＣＦベクターの産生についてアッセイし、そしてスロット−ブロットハイブリダイゼーションによりアデノウイルス産生について分析した。
ｒＡＡＶベクター複製のためのＡＡＶＲｅｐタンパク質の誘導可能な発現を可能にするように、ＨｅＬａＣ３７を構築した。簡単に述べれば、マウスメタロチオネインＩブロモーター、ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにＡＡＶ転写停止部位からなるＡＡＶＲｅｐ／Ｃａｐ発現カセットを構築した。このプラスミドにはまた、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子、ＳＶ４０小ＴイントロンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルも含まれる。ＨｅＬａ細胞を、このプラスミドでトランスフェクトし、そしてクローンをＧ４１８中で選択した。クローンのパネルをｒＡＡＶベクター増幅アッセイによりスクリーニングした。１つのクローンＣ３７が、形質導入およびアデノウイルス感染後に、一致し、かつ容量依存性のｒＡＡＶベクターの増幅を示した。
複製するベクターの検出は、ＤＮＡ単離、その後のＣＦＴＲプローブへのハイブリダイゼーションにより達成される。詳細には、ＨｅＬａ Ｃ３７細胞を、１０％ＦＢＳおよび２．０ｍＭ Ｌ−グルタミンを補填したＤＭＥＭを用い、組織培養フラスコに４．４ｘ１０４細胞／ｃｍ２で接種し、そして５％ＣＯ２の湿潤インキュベーター中３７℃で２４時間シンキュベートした。次いで細胞に、アデノウイルス（ＭＯＩ＝５）を接種し、そしてｒＡＡＶＣＦの希釈物を７２時間サンプルリングした。細胞を掻き取ることにより収穫し、そしてサザンブロット分析のために調製した。総細胞ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲル上で電気泳動し、ナイロン６６メンブレンにトランスファーし、次いで３２Ｐ標識ヒトＣＦＴＲｃＤＮＡ制限フラグメントとハイブリダイズした。このプローブは、ＡＡＶＣＦベクターからの約１．５ｋｂフラグメント（推定される１．４８８ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントに対応する）を検出する。ベクター複製を、内因性ゲノムＣＦＴＲバンドと比較して定量化し、そして複製単位として表現した。１複製単位（ＲＵ）は、約１．８ｋｂである内因性ゲノムＣＦＴＲバンドのシグナル強度に相当するシグナル強度として規定される。いくつかの実験では、連続的に希釈された既知のベクター標準物の直線回帰を用いて、サンプル中のベクター濃度を外挿および計算した。
アデノウイルスＤＮＡスロットブロットアッセイは以下のように行った。サンプルのアリコートを、１．０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡとともに０．４Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ中６５℃で変性した。サンプルおよびアデノウイルス標準物を希釈し、そしてスロットブロットマニホールドを用いてナイロンメンブレン上に濾過し、そして０．４Ｍ ＮａＯＨで洗浄した。このフィルターを、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子配列に対応する３２Ｐ標識プローブとハイブリダイズした。完全Ａｄ５ゲノムは、Ｇｅｎｂａｎｋで受託番号Ｘ０２９９６で入手可能である。本発明者らは、１ｋｂのＳｓｐＩ−ＸｂａＩフラグメント（ヌクレオチド３３９−１３３９に対応する）を用い、そしてホスホルイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）上のブロットを分析した。１ゲノム等量は、１アデノウイルス粒子に対応すると考えられた。
図１は、許容温度（３７℃）および非許容温度（３９．５℃）における、Ａｄ５またはｔｓ１４９を用いて調製された溶解物中のｒＡＡＶＣＦベクターに対する複製アッセイの結果を示す。組換えベクターの産生は、３９．５℃でｔｓ１４９により支持されたが、生産性は、Ａｄ５より約２〜３倍少なかった。
図２は、アデノウイルスの量を測定するためのスロットブロットアッセイの結果を示す。アデノウイルスゲノムの産生は、温度感受性変異体の使用により、野生型に比較して３〜４対数減少した。
（実施例３） ｒＡＡＶ産生を改善するためのヘルパー機能の最適化
この実施例は、温度感受性ヘルパーウイルスを用いる場合、得られるｒＡＡＶのレベルを改善するための種々の試みを例示する。ヘルパーウイルスの感染レベルを増加することは役にたたなかったが、動力学を調節することは驚くほど有効であった。
ベクター産生に対する感染の多重度を増加する影響をまず評価した。２９３−１細胞を、５のＭＯＩでＡｄ５または種々のＭＯＩでｔｓ１４９のいずれかを用いて感染し、次いでベクターで一時的同時トランスフェクトし、そしてプラスミドをパッケージングした。７２時間後、細胞を溶解し、そしてＣ３７ベクター複製アッセイによりｒＡＡＶＣＦベクターの産生についてアッセイし、そしてスロット−ブロットハイブリダイゼーションによりアデノウイルス産生について分析した。５のＭＯＩでｔｓ１４９を用いて感染させた細胞については、さらに９６時間の時点で収集した。
図３は、種々のＭＯＩでｔｓ１４９を用いて調製された細胞溶解物について実施されたｒＡＡＶＣＦ複製アッセイの結果を示す。ｔｓ１４９のＭＯＩを増加することは、（１．４ｋｂハイブリダイゼーションバンドの強度により示されるように）Ａｄ５で観察されたレベルまでベクター生産性を回復しなかった。しかし、より高いレベルのベクター産生が９６時間の時点で観察された。スロットブロット分析により検出される溶解物中のｔｓ１４９の濃度は、増加するＭＯＩとともに増加したが、Ａｄ５と比較してなお３〜４対数低かった。
先の実験で、９６時間におけるｔｓ１４９を用いた増加したベクター生産性の観察に従って、経時的および産生動力学研究を実施した。２９３−１細胞を５のＭＯＩのＡｄ５またはｔｓ１４９のいずれかで感染し、その後ベクターで一時的同時トランスフェクションを行い、そしてプラスミドをパッケージングした。Ａｄ５およびｔｓ１４９で感染した細胞を、それぞれ、３７℃および３９．５℃で６日間培養した。３、４、５および６日からの溶解物を、ベクター複製アッセイによりベクター産生についてアッセイし、そしてスロット−ブロットハイブリダイゼーションによりアデノウイルスについて分析した。
図４はベクター産生の動力学を図示する。斜線の密度が大きい棒は、ヘルパーとして野生型Ａｄ５を用いて産生された溶解物を示し、斜線の密度が小さい棒は、ヘルパーとしてｔｓ１４９を用いて産生された溶解物を示す。Ａｄ５を用いた場合、最大のベクター産生は、４日でピークになる約２．０ｘ１０６ＲＵ／ｍｌであった。この時点で、ｔｓ１４９を用いて得られたベクター産生は約０．３ｘ１０６ＲＵ／ｍｌより少なかった。しかし、５日に、２つのヘルパーウイルスの相対的効力に劇的な変化があった。Ａｄ５により支持されたベクター産生は、０．３ｘ１０６ＲＵ／ｍｌ未満に低下した。対照的に、ｔｓ１４９により支持されるベクター産生は、２ｘ１０６ＲＵ／ｍｌより上に急上昇した。ｔｓ１４９を用いた場合観察されたアデノウイルスゲノムレベルは、Ａｄ５を用いた場合より有意に低かった。
（実施例４） ウイルス力価をアッセイすることをおよび高スループットアッセイ技術
先行する実施例において用いた温度感受性および野生型アデノウイルスストックを、組織培養フラスコ中の２９３−１細胞で産生した。この実施例では、２９３−１細胞により産生されるアデノウイルスのレベルを、ＴＣＩＤ５０終点アッセイまたは感染度アッセイにより定量した。
ＴＣＩＤ５０アッセイは以下のように行った：１．０ｘ１０３の２９３−１細胞を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中に置き、そしてアデノウイルスストックの系列希釈物で感染し、そして湿潤５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃でインキュベートした。各希釈物の１００μｌの８つの複製物を細胞上に接種した。感染３日後、細胞をメタノール固定し、ＰＢＳで洗浄し、そしてＦＩＴＣ結合抗ヘキソン抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）で染色し、その後ヨウ化プロピジウム染色して細胞核を可視化した。ＰＢＳですすいだ後、プレートを、蛍光顕微鏡下で検査し、そしてヘキソン含有細胞の存在を計数した。終点における力価は、ホワソン（Ｐｏｉｓｓｏｎ）分布を用いて計算した。５０％のヘキソン陽性複製サンプルを生じるウイルス希釈物は、０．５ＩＵ／１００μｌ接種物を有する。感染力価は、この希釈の逆数の結果であり、０．５ＩＵ／１００μｌおよび１０（ｍｌへの変換係数）は、ｍｌあたりの最終感染力価を与える。
感染性ウイルスを測定するための高スループットマイクロタイター感染度アッセイは以下のように行った。系列希釈された細胞を含まない上清液のアリコート（１０μｌ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で増殖させたＨｅＬａ細胞に接種した。３日後、感染細胞を、変性溶液（１／１０容量の４．０Ｍ ＮａＯＨ、１０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１００ｍＭ ＥＤＴＡの添加）で処理および溶解させた。溶解物を、Ｓｉｌｅｎｔ Ｍｏｎｉｔｏｒ ＢｉｏｄｙｎｅＢプレート（Ｐａｌｌ）に移し、そしてナイロンメンブレン上に真空濾過した。メンブレンを洗浄し、変性し、３２Ｐ標識アデノウイルスＥ１Ａ ｃＤＮＡ制限フラグメントとハイブリダイズし、そしてホルホルイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）上で分析した。ＴＣＩＤ５０アッセイにより力価測定したアデノウイルス標準物を用い、サンプル中の感染性アデノウイルス力価を計算するために、系列希釈アデノウイルス標準物の直線回帰分析を用いた。
比ウイルス生産性を、溶解物中の感染性ウイルス力価を、感染時の細胞数に標準化することにより計算した。結果を表１に示す：
Figure 0005881626
これらの結果は、２９３−１細胞におけるＡｄｔｓ１４９の比産生が、Ａｄ５よりも１〜２対数低かったことを示す。
力価が既知のＡｄ５ウイルス調製物は、マイクロタイター感染度アッセイにおける直線回帰を基に、１２．５〜５００ＩＵ／ウェルに広がる直線範囲を示した。
上記のように、ウイルス感染度アッセイを、マイクロタイターアレイフォーマットと組み合わせることにより、迅速および定量的の両方であり、そして自動化に高度に適した技術が得られた。
上記のような高スループット感染度アッセイはまた、他のウイルス（例えば、ｒＡＡＶおよびｗｔＡＡＶ）をアッセイすることに適用し得る。このアッセイは、適切な哺乳動物細胞（例えば、ｒＡＡＶについてＨｅＬａＣ３７細胞またはｗｔＡＡＶについて２９３細胞）を用いて本質的に上記のように、そしてアッセイされるウイルスの複製を許容する条件下（例えば、ｒＡＡＶおよびｗｔＡＡＶについてはヘルパーウイルスの存在下）で実施され得る；次いで溶解物が調製され得、そして上記溶解物中の核酸は、上記のようにメンブレンに移され得る。結合した核酸プールのアレイを含むメンブレンのハイブリダイゼーション（各プールは、対応する培養フェルの細胞から放出される）は、代表的には、適切なウイルス特異的プローブを用いて実施される（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐに特異的なプローブを用いてｗｔＡＡＶを検出し得、または組換えＡＡＶベクターの場合、挿入されたトランスジーンに特異的なプローブを用い得る）。
上記の高スループット感染度アッセイは、比較的広範な範囲の濃度に亘ってｒＡＡＶ力価の測定において直線的応答を示した。例えば、（改変感染中心アッセイにより測定されたような）既知の力価のウイルス調製物を、２４００感染単位または「ＩＵ／ウェル」から出発して、系列的に１：２希釈し、そして連続的に１：５希釈された各力価が未知の２つの精製ｔｇＡＡＶＣＦ調製物の力価測定の標準として用いた場合、マイクロタイターアッセイは、直線回帰を基に、７５〜６００ＩＵ／ウェルに広がる直線範囲を示した。ｗｔＡＡＶの力価の測定は、好ましくは、制限希釈フォーマットを利用した（例えば、力価が既知の８つの系列制限希釈のｗｔＡＡＶ調製物をアッセイした場合、マイクロタイターアッセイにより測定された力価は、標準のＴＣＩＤ５０アッセイにより測定された力価、３×１０９ＩＵ／ｍｌと本質的に同じであった）。
制限希釈を用いるか、または既知の標準に対する比較のいずれかにより、感染性ウイルス力価が測定され得、それは、より古典的な技術（例えば、感染中心アッセイまたはＴＣＩＤ５０５０％終点分析）により測定される力価に対応する。ウイルス力価の測定におけるその使用の他に、この高スループット感染度アッセイは、多くの他の使用を有し、ウイルス複製および感染度を許容または許容しない細胞株のスクリーニング（例えば、マイクロタイターアレイの異なるウェルにおける種々の哺乳動物細胞またはその改変体を含めることによる）；およびウイルス複製に影響する薬剤のスクリーニング（例えば、上記のようにマイクロタイターアレイの異なるウェルに種々の薬剤を含め、そして薬剤の、得られるウイルスの感染性力価に対する影響を測定することによる）などを含むがこれらに限定されない。とりわけ、ウイルス感染度および／または複製を増強する薬剤または条件について迅速にスクリーニングする能力は、特に、ウイルスベクターの産生を進展または最適化する意味で有用である。逆に、ウイルス感染度／複製を抑制する薬剤または条件を迅速にスクリーニングする能力は、抗ウイルス治療剤を同定する意味で極めて有用である。
（実施例５）
ヘルパーウイルスを産生するための懸濁培養の開発
先の実施例は、従来の培養技術により産生された温度感受性アデノウイルスのレベルが低いことを示す。これは、ＡＡＶベクターの産生にヘルパーとして温度感受性アデノウイルスを用いる能力を制限する。本実施例は、感度感受性アデノウイルスをより多くの量で産生することを可能にする改良された方法を提供する。この改良の中心は、懸濁培養で増殖する宿主細胞の使用にある。
２９３ Ｎ３ＳおよびＨｅＬａ Ｓ３は、それぞれ、２９３−１ヒト胎児腎臓およびＨｅＬａヒト頸部癌腫細胞株の懸濁改変体である。懸濁培養を、５００ｍｌのスピナーフラスコ（Ｂｅｌｌｃｏ）中、実容量２５０〜３００ｍｍで実施した。ＨｅＬａ Ｓ３（ＡＴＣＣ ２．２−ＣＣＬ）を、７．５％ＦＢＳおよび２．０ｍＭ Ｌ−グルタミンを補填した１５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で維持した。２９３−１ Ｎ３Ｓ（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）は、７．５％ＦＢＳおよび２．０ｍＭ Ｌ−グルタミンを補填したＪｏｋｌｉｋ ＭＥＭ中で継代した。スピナーフラスコは５０〜６５ＲＰＭで撹拌した。
増殖挙動は以下の実験で評価した。２９３ Ｎ３ＳおよびＨｅＬａ Ｓ３を、二連の５００ｍｌスピナーフラスコで懸濁して連続的に継代し、そして細胞増殖および生存率をモニターした。フラスコに、２〜５ｘ１０５細胞／ｍｌの細胞密度で接種し、次いで２〜３日間培養した。接種密度の差異を制御するため、集団倍化レベル（ＰＤＬ）を二連の培養について比較した。平均ＰＤＬは、ＨｅＬａ Ｓ３および２９３ Ｎ３Ｓについて、それぞれ２．０±０．４９（平均±ＳＤ．）および１．１±０．６２（ｎ＝１４）であった。より高い細胞倍化が、ＨｅＬａ Ｓ３細胞で一致して観察された。懸濁中の細胞形態は、２つの株で劇的に異なった。ＨｅＬａ細胞は単一細胞または小凝集物として増殖した。対照的に、２９３ Ｎ３Ｓ細胞は、それぞれが５０〜１００細胞の大きな凝集物を形成した。大きなクランプの中心には顕著な数の非生存細胞が観察された。ストックを、遠心分離後ピペットで穏やかに破壊し、凝集物から非生存細胞を放出することにより前培養した。２９３ Ｎ３Ｓの初期培養生存率は、ＨｅＬａ Ｓ３に比べ一致してより低かった。
懸濁中の細胞増殖、生存率および形態をもとに、ＨｅＬａ Ｓ３細胞株を、さらなるプロセス開発のために選択した。許容温度における増殖および生存率を評価した。ＨｅＬａ Ｓ３細胞を５００ｍｌスピナーフラスコ中に５ｘ１０５細胞／ｍｌで接種し、そして７日間毎日モニターした。
図５は、３２℃（四角）および３７℃（丸）で増殖したＨｅＬａ Ｓ３細胞の生存細胞密度（ＶＣＤ）を示す。３２℃の時点の回りの棒は、二連の５００ｍｌスピナーフラスコで観察された値の範囲を示す。３７℃で増殖した細胞は、５日に２．５ｘ１０６細胞／ｍｌでピークとなり、その一方３２℃で増殖した細胞は、６日に２ｘ１０６細胞／ｍｌでピークとなった。（トリパンブルー排除により測定した）生存率は、初めから終わりまで少なくとも約９０％であった。
接線流または交差流濾過は、細胞の濃縮または除去、高分子の濃縮、および培地／緩衝液交換を含む広範な種類の大スケール生体薬学的適用に多能な技術である。接線流プロセッシングは、感染のための細胞の濃縮のため、および大スケールで感染細胞を回収するために必要である。
接線流濾過において細胞生存率に対する薄層せん断の影響は、ＨｅＬａ Ｓ３細胞を濃縮およびダイアフィルトレーションすることにより評価した。ＨｅＬａ Ｓ３細胞を、３リットルのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター中４ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で接種し、そして７．５％ＦＢＳ、２．０ｍＭグルタミン、１ｘＭＥＭアミノ酸、１ｘＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１％ ＰｌｕｒｏｎｉｃポリオールＦ−６８および２ｇ／Ｌグルコースを補填した、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＪＲＨ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で２ｘ１０６細胞／ｍｌまで培養した。バイオリアクターの実容量は２リットルであった。溶存酸素、ｐＨ、温度および撹拌を、ＦＥＲＭＣＯＮＴＭ（Ｓｃｉｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）コントローラーシステムを用いて、それぞれ、６０％（空気飽和に対して）、７．２、３７℃および１００ｒｐｍで制御した。
接線流濾過実験は、混合セルロースエステル中空繊維膜（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ）を用いて実施した。ポアサイズおよび表面積は、それぞれ０．２μおよび７２５ｃｍ２であった。０．２μのフィルターを選択して細胞を保持し、その一方消費した培地の通過を可能にした。細胞は、中空繊維の内径を通じてポンプ（Ｃｏｌｅ Ｐａｌｍｅｒ）輸送した。再循環速度を調節して７５０および１５００／秒の平均壁せん断速度を提供した。交差流が一旦確立されたなら、それぞれ３０および９０ｍｌ／分の透過液フロー制御が、透過液ライン上に配置されたポンプ（Ｃｏｌｅ Ｐａｌｍｅｒ）により達成された。細胞濃縮の間、透過液の引き抜きを、所望の倍数の濃縮が達成されるまで継続した。ダイアフィルトレーションの間、バイオリアクターに入る培地供給を、所望の倍数の培地交換が達成されるまで活性化した。生存細胞を各処理の前後で計数した。
図６は、例示の実験における接線流プロセッシング前後のＨｅＬａＳ３細胞の成長曲線を示す。２リットルの細胞を３リットルバイオリアクターで培養した。３日（矢印）に、細胞を、２リットルの実容量から７倍濃縮し、６倍容量の増殖培地に対してダイアフィルトレートし、そしてもとの実容量にした。結果は、細胞が、７５０／秒（四角）および１５００／秒（丸）の壁せん断により損傷されず、そして高細胞密度まで増殖を継続したことを示す。
次いで、ＨｅＬａ Ｓ３細胞の懸濁培養を、ｔｓ１４９産生のための宿主細胞として試験し、または３００ｍｌ懸濁培養におけるそれらの能力を調査した。３００ｍｌ懸濁培養（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）からのＨｅＬａ Ｓ３細胞を遠心分離し、濃縮し、そしてｔｓ１４９で感染した（ＭＯＩ＝３）。１時間後、培養物をスピナーフラスコに移し、培地中に再懸濁し、そして３２℃で７日間培養した。ＨｅＬａ Ｓ３細胞を、感染時の約１ｘ１０６細胞／ｍｌから５日までに約２ｘ１０６細胞／ｍｌまで増殖を継続した。７日に生存率は約６０％まで減少した。
図７は、ＨｅＬａ Ｓ３細胞培養によるｔｓ１４９の産生を示す。培養物を毎日サンプリングし、そして溶解物を、アデノウイルス感染度アッセイによるウイルス産生の分析のために凍結−融解により調製した。ウイルス産生は、約３〜５日までに、約４．５ｘ１０７ＩＵ／ｍｌ培地に到達した。７日に、細胞を遠心分離により集め、ＴＭＥＧ緩衝液中に再懸濁し、そして微小流動（ＭＦ）により溶解した。微小流動した溶解物の感染性力価は、凍結融解溶解物サンプルの感染性力価に匹敵し、微小流動による回収は、凍結−融解法に匹敵したことを示す。
（実施例６）
温度感受性ヘルパーウイルス（ＡＤ ｔｓ１４９）の産生のための改良された精製方法
ＣｓＣｌ勾配を用いる生成は大スケール産生にはわずらわしい。この実施例は、イオン交換クロマトグラフィーによるｔｓ１４９の精製を説明する。
クロマトグラフィーは、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＢＩＯＣＡＤＴＭクロマトグラフィーワークステーション上で実施した。用いた樹脂は、ポリエチレンイミン（ＰＩ）弱アニオン交換体（ＰＯＲＯＳＴＭ５０ＰＩ）であった。カラムは、ＴＭＥＧ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール）で平衡化した。クロマトグラフィーは、オンラインでｐＨ、伝導度および２８０ｎｍにおける光学密度をモニターした。
ＭＯＩが２のｔｓ１４９で感染した懸濁ＨｅＬａ Ｓ３を回収し、そして遠心分離した。ペレットをＴＭＥＧ中に再懸濁し、そして微小流動機（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を用いて３０００ＰＳＩにおけるキャビテーションにより溶解した。溶解物を、５μシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＳＶ）次いで０．４５μシリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）により清澄化した。清澄化した溶解物を、１．６ｍｌＰＯＲＯＳＴＭ５０ＰＩアニオン交換カラムに１ｍｌ／分のランでロードした。カラムを、１０カラム容量の、９００ｍＭ ＮａＣｌを含むＴＭＥＧで洗浄し、そしてｔｓ１４９は、９００〜１３００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。０．５ｍｌのフラクションを集め、そしてアデノウイルスの存在について感染度アッセイおよびスロットブロットによりアッセイした。
図８は、連続するカラム画分について行われた感染度アッセイの結果を示す。感染性アデノウイルスの大部分は、約２５分に約１００ｍｓで溶出する吸光度のピークと一致して、フラクション２６〜２８に見出された。ｔｓ１４９は、より高い塩濃度のこの大ピークの直前で溶出された。並行して行われた感染度およびスロットブロットアッセイは、粒子および感染性ウイルスが同じピーク画分に存在したことを確認した。
溶解物およびＰＩピーク画分をまた、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により総タンパク質についてアッセイした。タンパク質濃度は、溶解物中１．８ｍｇ／ｍｌであり、そしてＰＩプールでは３０．０μｇ／ｍｌより少なかった。ビリオンを、単一の工程で細胞タンパク質の大部分から分離し、そして単一ピークとして溶出した。このビリオンは、カラムからそれらを溶出するために必要な比較的高塩濃度により証明されるように、ＰＩマトリックスに非常に高い親和性を示した。
温度感受性ヘルパーウイルスの大スケール産生方法は、これらの実施例に記載されたすべての改良を取り込み得る。１つの例示では、ウイルス産生は以下の工程を包含し得る；
・懸濁バイオリアクター中の細胞培養
・濃縮／培地交換・ヘルパーウイルスでの感染
・ウイルス産生
・回収：濃縮／ダイアフィルトレーション
・微小流動による溶解
・ＰＩイオン交換クロマトグラフィー
・濃縮／ダイアフィルトレーション
・滅菌濾過
このタイプのアプローチは、本質的に、スケールアップ可能であり、かつ現在の商品製造慣行に従順である。
このような技術のさらなる例示の説明を以下に提供する。
（実施例７ ヘルパーウイルス産生についての第１および第２世代プロセスの比較）
（Ａ．例示の第１世代ヘルパーウイルス産生およびプロセシング）
ヘルパーウイルス産生についての例示的な「第１世代」プロセスにおいて、哺乳動物細胞を４０のＴ２２５フラスコ中で増殖させ、次いでこの細胞に約１のＭＯＩでＡｄ５を感染させた。インキュベーション後、この細胞を遠心分離で収集し、凍結融解およびニードルの通過により溶解した。この溶解物をＤＮａｓｅＩでの処理に供し、次に段階ＣｓＣｌ勾配および等密度勾配にかけた。精製された物質を透析し、そして滅菌濾過した。
この第１世代プロセスを使用して、本発明者らは４ｘ１０８細胞から約１ｘ１０１２粒子（または約１ｘ１０１１感染単位）を得た。
（Ｂ．例示の第２世代ヘルパーウイルス産生およびプロセシング）
ヘルパーウイルス産生についての例示的な「第２世代」プロセスにおいて、哺乳動物細胞（ＨｅＬａＳ３）を１０Ｌバイオリアクター中で増殖させ、次いでこの細胞に約１のＭＯＩでＡｄ５（ＡＴＣＣから、続いて２９３細胞でプラーク精製し、ＨｅＬａＳ３細胞について連続的に広げ、そしてＣｓＣｌ勾配遠心分離により二重精製した）を感染させた。インキュベーション後、この細胞をダイアフィルトレーションにより濃縮および収集し、そしてミクロフルイダイゼーションにより溶解した。この溶解物をベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（ヌクレア−ゼ）での処理に供し、次いで濾過した。次いでこの濾過物を濃縮およびダイアフィルトレートされた陰イオン交換カラム（ＰＩ）に流し、最終的に滅菌濾過した。
この第２世代プロセスを使用して、本発明者らは１×１０１０細胞から約１×１０１４粒子（または約５ｘ１０１２感染単位）を得た。
図９は、上記のとおり陰イオン交換クロマトグラフィーを使用するヘルパーウイルスの下流プロセシングの結果を示す。バー：感染力アッセイで測定されたウイルス活性；実線：Ａ２８０；点線：緩衝液伝導率（ｍｓ）。
ウイルス活性の分画とＡ２８０吸光度との比較から明らかなように、これらのプロセシング手順は、このヘルパーウイルスの、細胞性タンパク質および核酸を含むと予想される汚染物質のバルクからの実質的な分離を生じた。
（実施例８ 組換えＡＡＶベクター産生についての第１および第２世代プロセスの比較）
（Ａ．例示の第１世代ｒＡＡＶ産生およびプロセシング）
ｒＡＡＶベクター産生についての例示的な「第１世代」プロセスにおいて、哺乳動物細胞を４０のＴ２２５フラスコ内で増殖させ、次いでこの細胞に約５のＭＯＩでＡｄ５を感染させた。インキュベーション後、この細胞を遠心分離により収集し、そして超音波処理により溶解した。この溶解物を、ＤＮａｓｅＩでの処理に供し、次いで一連の２つのＣｓＣｌ勾配にかけた。精製された物質を透析し、そして滅菌濾過した。この第１世代プロセスを使用して、本発明者らは４ｘ１０３細胞から約５×１０６複製単位ＲＵを得た。
（Ｂ．例示の第２世代ｒＡＡＶ産生およびプロセシング）
ｒＡＡＶベクター産生についての例示的な「第２世代」プロセスにおいて、哺乳動物細胞を１０Ｌバイオリアクター中で増殖させ、次いでこの細胞に約５のＭＯＩでＡｄ５を感染させた。インキュベーション後、この細胞をダイアフィルトレーションにより濃縮および収集し、そしてミクロフルイダイゼーションにより溶解した。この溶解物をベンゾナーゼ（ヌクレアーゼ）での処理に供し、次いで濾過した。次いでこの濾過物を陰イオン交換カラムに流した後、陽イオン交換カラムに流した。ＡＡＶを含む溶出物画分をプール、濃縮、およびダイアフィルトレートし、最終的に滅菌濾過した。この第２世代プロセスは１ｘ１０１０細胞から１ｘ１０１１複製単位より多いＲＵを得ると期待される。
図１０は、イオン交換カラム上；まず陰イオン交換マトリックス（上側のパネル）上、次いで陽イオン交換マトリックス（下側のパネル）上の、連続的な分画の結果を示す。バー：アデノウイルスまたはＡＡＶのいずれかについての感染力アッセイにおいて測定したウイルス活性；実線：Ａ２８０（総タンパク質の測定）；点線：緩衝液伝導率（ｍｓ）。分析した画分から明らかなように、本発明の技術を用いて、ＡＡＶおよびＡ２８０吸収物質（大部分のタンパク質）間と同様に、ＡＡＶおよびアデノウイルス間の極めて高レベルの分離を得ることが可能である。特に、この結果は、ＡＡＶベクターが陰イオン交換カラムおよび陽イオン交換カラムの両方に保持され得ること、および陰イオンおよび陽イオン交換の両方を使用するＡＡＶの差次的な溶出は、目的の主な汚染物質（アデノウイルスならびに細胞性タンパク質を含む）の全てからＡＡＶを分離する能力の劇的な増強をもたらした。
ｒＡＡＶベクター産生についての別の例示的な第２世代プロセスにおいて、この濾過物を上述のように調製し、次いで陰イオン交換カラムに流した後、ＡＡＶを含む溶出物画分をプールし、次いでこのプールした陰イオン交換溶出物を接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＴＦＦ）に供した。以下に記述のとおり、この陰イオン交換からＴＦＦまでの手順は、高度に濃縮および精製されたＡＡＶ調製物をもたらすことが見出された。
このような第２世代技術を使用して、上述および当該分野における技術（感染力アッセイ、スロットブロット分析、およびＳＤＳゲル電気泳動法を含む）を使用して得たＡＡＶの詳細な分析は、この物質が高品質なものであり、汚染アデノウイルス粒子（およびアデノウイルスタンパク質およびＤＮＡ）を実質的に含まず、かつまた汚染細胞性タンパク質およびＤＮＡをも実質的に含まないというさらなる確証を提供した。ＳＤＳゲルは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３（すなわちＡＡＶカプシドタンパク質）に対応するバンドの存在を示した。他のいかなるバンドもクマシー染色後に現れなかった。これらのデータは、図１０〜１１に示すとおり、カラム分画分析の結果と一致する。
例示の陰イオン交換からＴＦＦまでの手順として、以下は、１Ｌの陰イオン交換クロマトグラフィーからプールした画分で開始する例示的な精製および濃縮プロセスである。所望ならば（上記のとおり）、このプールを熱失活後、濾過工程（例えば、０．２２μｍフィルターを使用する）に供し得る。接線流濾過（ＴＦＦ）について、本発明者らは、入圧および出圧について４０／０で操作した３００，０００分子量カットオフメンブランを備えた消毒Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬシステムを使用した。１Ｌのプールされた物質を、５００ｍｌ容量でこのシステムにロードし、次いで２５０ｍｌに濃縮した。ダイアフィルトレーションを、５ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）（１２５０ｍｌ）の改変リンガー溶液＋５％グリセロールで行った。ダイアフィルトレーション後、保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を最終容量１４ｍｌまで濃縮した。総プロセス時間は約３．２５時間である（消毒時間を含まず）。銀染色ＳＤＳゲル、スロットブロット、および感染力アッセイは、このＡＡＶ調製（約１０１０複製単位を含む）が、汚染アデノウイルスならびにアデノウイルスタンパク質および細胞性タンパク質を実質的に含まないことを確認した。
以下は、感染性ウイルス力価および総ウイルス力価をそれぞれＲＵ（複製単位）およびＤＲＰ（ＤＮＡｓｅ耐性粒子）として示す、このような手順からの結果である：
Figure 0005881626
図１２に示されるデータは、陰イオン交換カラム後の接線流濾過を使用するＡＡＶ産生作業の結果を説明する。ＰＯＲＯＳ ５０ＰＩカラムで精製された物質を、３００，０００分子量カットオフメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ）を使用して濃縮した。この濃縮された物質を、５連続容量（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ ｖｏｌｕｍｅ）のリンガー平衡塩溶液＋５％グリセロールでダイアフィルトレートした。次にこの物質をこのメンブランで１０倍に濃縮した。図１２は銀染色で染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルの網版複写であり、これは、最終精製バルク物質中の、高度に精製されたＡＡＶカプシドタンパク質、ＶＰ１（８５ｋＤ）、ＶＰ２（７２ｋＤ）、およびＶＰ３（６２ｋＤ）を示す。
本明細書中に示されるデータから明らかであるように、ＡＡＶの調製および精製についてのこれらの第２世代技術は、以前に記述した方法と比較して、実質的に改良した方法をもたらす。
アデノウイルスヘルパーを増殖するための、およびｒＡＡＶを調製するための例示的な培地を以下の表に詳述する：
Figure 0005881626
Figure 0005881626
（Ｃ．ヘパリン硫酸クロマトグラフィーを使用するＡＡＶベクターの精製）
上述のように、クロマトグラフィー技術を、本発明に従ってＡＡＶ調製物をさらに精製および濃縮するために使用し得る。例として、粗製形態（例えば、溶解物）である、または陰イオン交換または陽イオン交換カラムから溶出され、および／または接線流濾過により濃縮されたＡＡＶの調製物は、ヘパリン硫酸を含むカラムに結合させることにより精製され得る。次にＡＡＶを、塩を含有する緩衝液（例えば、ＮａＣｌの直線勾配）を使用して、このようなカラムから溶出し得る。
ヘパリン硫酸クロマトグラフィー使用の例示として、「ＰＩ」プールから得られたＡＡＶ（以下実施例９中に記載されるとおり）をまず４倍に濃縮し、そして３００Ｋ接線流濾過メンブランを使用してＴＭＥＧ＋１００ｍＭ ＮａＣｌ中にダイアフィルトレートした。次にこの濃縮物を、１ｍｌヘパリン硫酸カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ“Ｈｉ−Ｔｒａｐ Ｈｅｐａｉｎ”カラム）に注入し、そしてＮａＣｌの直線勾配を使用して溶出した。
図１３は、ヘパリン硫酸カラム上に得られたＡＡＶの濃度を示すクロマトグラムである。約１８分溶出時間での２８０ｎｍでの吸光度（左座標軸）における鋭いピークは、０〜１Ｍ ＮａＣｌの直線勾配（右座標軸に示されるｍｓでの伝導率）を用いてヘパリン硫酸から溶出したＡＡＶ画分を示す。
（実施例９ 組換えＡＡＶベクター産生および試験）
産生作業の別のセットにおいて、本発明者らはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを増殖培地として使用して、セルファクトリー（Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ）において増殖した３〜４ｘ１０９細胞を使用した。細胞に約２０のＭＯＩでＡｄを感染させ、そしてこれを感染後７２時間で収集した。収集した細胞を約５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度でＴＭＥＧ＋ＮａＣｌ中に懸濁した。機械的な溶解（ミクロフルイダイゼーション、８０００ｐｓｉで２回通過）後、溶解物をベンゾナーゼで処理し（２５ユニット／ｍｌ、３７℃、１時間）、次いで５ミクロンフィルター（Ｐａｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅ ＩＩ）を通して濾過した。
例示的な陰イオン交換カラムとして、本発明者らはＰＯＲＯＳ ５０ ＰＩカラム（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手）を使用した。簡単には、この濾過物を約１００ｍｌでカラムにロードし、そして５００ｍＭまでのＮａＣｌの勾配で溶出した。（感染力アッセイによって）大部分のこのＡＡＶを含むことが決定された画分を、収集およびプールした（「ＰＩプール」と称する）。
次いでこのＰＩプールをＴＭＥＧで約１：７に希釈し、そして５０ｍｌ Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ ＳＰ６５０Ｃカラムにロードし、ならびに５００ｍＭ ＮａＣｌまでの勾配で溶出した。（感染力アッセイによって）大部分のこのＡＡＶを含むことを決定された画分を収集およびプールした（「ＳＰプール」と称する）。このＳＰプールをＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １０Ｋフィルターを使用して濃縮し、次いで０．２ミクロンフィルターを通して滅菌した。
この結果は、この組換えＡＡＶが検出可能な感染性アデノウイルスを本質的に含まないことを示した（２９３細胞での連続増幅およびＴＣＩＤ５０アッセイを用いた検出限界分析により決定したとおり）。この調製物はまた、アデノウイルスＤＮＡを本質的に含まず（スロットブロット分析により決定されたとおり）、細胞性タンパク質も（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析により決定されたとおり）、細胞性ＤＮＡ（ＰＣＲ分析により測定されるとおり）も本質的に含まず、そしてまた表現型野生型ＡＡＶも本質的に含まない（連続増幅およびサザン分析により測定したとおり）。
（実施例１０ 栄養ストレスによるＡＡＶ産生の増強）
上述のとおり、ＡＡＶ産生は、ＡＡＶプロデューサー細胞の増殖または代謝に効果的なストレスを与える（または脱至適化する（ｄｅ−ｏｐｔｉｍｉｚｅ））任意の多様な薬剤および／または条件を使用して増強され得ると考えられる。この実施例において、培養中に生じるような特定のアミノ酸の枯渇は、ＡＡＶ産生における相対的な増強と関連すること、および逆に、栄養ストレスを除去するための培地補充物は実際にベクター収量に劇的な減少をもたらすことが示される。
（ａ バッチ培養および灌流培養中の栄養ストレス）
ＪＬ１４細胞を、２Ｌバイオリアクター中に約４ｘ１０５細胞／ｍｌで接種し、バッチ様式または灌流（接線流濾過を使用して、１日目は０．４容量／日で、２〜３日は１．２容量／日で、４日目は２容量／日で、および５日目は４容量／日で）のいずれかにより、表２中に示されるｒＡＡＶ培地中で増殖させた。培養物を、標準の技術を使用して、細胞密度、グルコース、乳酸、およびアミノ酸についてモニターした。
この分析は、この細胞密度が、バッチ培養において２日目に１ｘ１０６細胞／ｍｌで、および灌流培養において６日目に８ｘ１０６細胞／ｍｌでピークに達することを示した。グルコースはそれぞれの場合で限定的ではなく（＞１ｇ／ｌ）、乳酸は阻害性ではなかった。
しかしアミノ酸分析は、グルタミン酸およびアスパラギン酸が共に、以下の表に示されるように、バッチおよび灌流培養の両方において急速に枯渇することを示した：
Figure 0005881626
Figure 0005881626
（ｂ 増強したＡＡＶ産生に関連した栄養ストレス）
追跡研究を、培養培地中のグルタミン酸およびアスパラギン酸の相対的な欠乏の重要性を確認するために行った。ＪＬ１４細胞をスピナーフラスコから得、および２つのセットに分割した。各セットに３ｘ１０９感染単位の１７０−３７Ａｄ５を接種した。細胞の一方のセットを１０％ＦＢＳおよび１％Ｌ−グルタミン（３００ｍｌ）を含むｒＡＡＶ培地（表２）中に１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。他方を、１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、１０ｍｇ／Ｌアスパラギン酸、および１１０ｍｇ／Ｌグルタミン酸を含むｒＡＡＶ培地中に再懸濁した。
各セットはスピナーフラスコ中に３７℃で７２時間インキュベートした。この細胞を、収集し、８０００ｐｉｓで２回ミクロフルイダイゼートし、ベンゾナーゼ処理し、感染力アッセイ中にプレートし、収集およびプローブした。
結果は、対照スピナーフラスコが細胞あたり６．２ＲＵを産生することを示した。アスパラギン酸およびグルタミン酸を補充したスピナーフラスコは、細胞あたり０．９４ＲＵを産生した。
これは、アスパラギン酸およびグルタミン酸の枯渇が、過剰のこれらのアミノ酸を提供することにより妨害される場合、ｒＡＡＶ産生は、この細胞を栄養ストレスに供することができなかったことにより損なわれることを示す。
さらなる試験をＨｅＬａ由来細胞株Ｄ６を使用して行った。この細胞株は、組込まれたｒＡＡＶベクター（ＩＴＲ−（ＣＭＶプロモーター）−（β−ｇａｌレポーター遺伝子）−ＩＴＲ）、ならびに野生型ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子のコピーを有する。
この細胞を３０ｍｌ完全ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン）中Ｔ−２２５フラスコあたり５×１０６細胞で播種し、そして３７℃で１０％ＣＯ２中に２日間インキュベートするとすぐに、この細胞はフラスコあたり２×１０７細胞の密度に到達した。２つの同一フラスコ中の細胞に、１０のＭＯＩでＡｄ５を感染させた。１つのフラスコは完全なＤＭＥＭを含み、もう１つは５ｘアスパラギン酸およびグルタミン酸を補充した完全なＤＭＥＭを含んだ。細胞を培養７２時間後、収集および計数した。
この完全なＤＭＥＭは８８％生存度で２．６ｘ１０７細胞を生じた。アスパラギン酸／グルタミン酸補充培地は、９１％生存度で３．８ｘ１０７細胞を生じた。細胞を再懸濁し、超音波処理し、ベンゾナーゼで処理（２５Ｕ／ＭＬ）し、浄化し、およびスロットブロット分析によりアッセイした。
結果は以下のとおりであった：Ｄ６ウイルスは、完全な（補充していない）ＤＭＥＭ中に、１．８ｘ１０１０ＤＲＰ／ｍＬ（細胞あたり１８００ＤＲＰ）で産生された。Ｄ６ウイルスは、アスパラギン酸／グルタミン酸補充したＤＭＥＭ中に、１．４ｘ１０９ＤＲＰ／ｍｌ（１４０ＤＲＰ／細胞）で産生された。
（実施例１１ 血清ストレス下での組換えＡＡＶベクター産生）
ストレス条件下でのｒＡＡＶ産生の例として、本発明者らは、上述のとおりの技術と共に、減少血清ストレスを使用した。簡単には、ＪＬ１４細胞を、継続的な連続培養様式で改変ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳのスピナーフラスコで増殖させ、そして３〜４日毎に分割した。懸濁培養物からの細胞を、１６のＮｕｎｃセルファクトリー、１０スタック（ｓｔａｃｋ）に、３ｘ１０８細胞／ファクトリーで、３〜４日のローテーションで配置した。増殖に使用した培地は、血清の１０倍減少（すなわち、ＤＭＥＭ＋１％ＦＢＳ）を有し、これによりこの細胞を血清ストレス下に置いた。
播種後２４時間で、ファクトリー中の培地を除去し、３ｘ１０９Ａｄ単位／ｍｌを含む新鮮培地を添加した。３７℃での培養７２時間後、この細胞を軽くたたきながらファクトリーから取り外し、細胞を含む培地を収集し、そしてこの細胞をペレット化し、そしてＴＭＥＧ＋１００ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁し、次いで８０００ｐｓｉでのミクロフルイダイゼーションを介した通過により溶解した。この溶解物を、５ミクロンフィルターを通して浄化し、この浄化した溶解物を５００ｍｌ ＰＩ陰イオン交換カラム上にロードした。このカラムをＴＭＥＧ緩衝液中の増加するＮａＣｌ（５００ｍＭまで）の勾配で溶出した。画分を収集し、そしてＡｌｌｅｎら（ＷＯ９６／１７９４７、前出）により記述のとおりＣｌｏｎｅ３７アッセイを使用してアッセイした。次にＡＡＶベクターのほとんどを含む画分をプールし、そしてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心濃縮器を１０００ｘｇで３０分間使用して１０倍に濃縮した。この濃縮された物質を５％グリセロールを有するリンガー平衡塩溶液に対して透析し、そして−７０℃で貯蔵した。このＡＡＶをＣｌｏｎｅ３７アッセイ、ならびにスロットブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイした。この物質をまた、アデノウイルス、アデノウイルスタンパク質、および細胞性ＤＮＡ、ならびに他の可能性のある汚染の存在についてもアッセイした。
図１１は、フラスコあたり１０７細胞でＴ−２２５フラスコ中にセットアップしたＧＡＫ−０００３プロデューサー細胞を使用して得た、および２日目に１０のＭＯＩでＤＡＢ−００３アデノウイルスを接種した結果を示す。異なるフラスコを、この図に示されるように、異なるパーセントのＦＢＳを含む新鮮ＤＭＥＭ中に３７℃で７２時間培養した。５日目に各フラスコを収集し、既に述べたとおり、この細胞を計数し、再懸濁し、超音波処理し、ベンゾナーゼ処理し、そしてベクターの産生を測定するためにプレートした。
至適ベクター産生は、１％のＦＢＳパーセンテージで観察された。従って、ＦＢＳを欠乏する培地（２．５％より低い、好ましくは、２％より低いが０％よりも多い）は、プロデューサー細胞を血清ストレスに供するための条件として好ましい。
（実施例１２ ｐＨストレス下の組換えＡＡＶベクター産生）
ストレス条件下でのｒＡＡＶ産生のさらなる例として、本発明者らは、上述のとおりの技術と共にｐＨストレスを使用した。簡単には、ＡＡＶプロデューサー細胞を上述のとおりバイオリアクター中で増殖させた。次いで細胞にＭＯＩ＝１０でＡｄ５を感染させ、そしてこれを１．５Ｌバイオリアクター中の懸濁液中の低血清培地（実施例１１に記載のとおり）に接種した。培養物を多様な高いｐＨレベル（７．２から８．０）で維持した。次いで培養物を、細胞数、生存度、グルコース消費、乳酸産生、ｐＨ、浸透圧、およびＡＡＶ産生について毎日モニターした。以下に示されるように、ｐＨが７．４まで上昇した場合、ＡＡＶ産生に増加が見られた；上清中に放出されたＡＡＶ粒子の数のさらにより劇的な増加を伴った（これはｐＨが上昇するにつれ増加した）：
Figure 0005881626
要するに、ｐＨが上昇すると、本発明者らは、上清中に放出されたＡＡＶ粒子の数の急激な増加、および上清：細胞結合粒子のパーセンテージの変化（ｐＨ７．２ではほとんど全てが細胞結合であり、ｐＨ８．０ではほとんどが上清である（９２％））を観察した。プロデューサー細胞を溶解する必要なしに上清から直接ＡＡＶ粒子を回収する能力は、ＡＡＶ産生および精製の点で強力な利点を示す。ｐＨストレスを使用して上清から単離されたＡＡＶは、本明細書に記載の技術（例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよび／または接線流濾過）を使用して、容易に濃縮され得、そして精製され得る。

Claims (12)

  1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の集団を生成する方法であって、以下の工程：
    ａ）以下を含むＡＡＶプロデューサー細胞を提供する工程：
    （ｉ）１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子であって、ここで該ＡＡＶパッケージング遺伝子の各々は、ＡＡＶ複製またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子；
    （ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）プロベクター；および
    （ｉｉｉ）ＡＡＶのヘルパーウイルスまたは少なくとも１つのヘルパーウイルス機能をコードする該ヘルパーウイルスのポリヌクレオチド配列；
    ｂ）工程ａ）で提供されるプロデューサー細胞を、致死量未満のストレスに供する工程、ここで、致死量未満のストレスが、プロデューサー細胞を１つ以上のアミノ酸が欠乏している培地中で培養することを包含する、栄養性ストレスおよびｐＨを８．０まで上げることを包含する、ｐＨストレスからなる群から選択される、工程；ならびに
    ｃ）工程ｂ）の該ストレスを受けたプロデューサー細胞を、ＡＡＶの複製を可能にする条件下でインキュベートする工程、
    を包含する、方法。
  2. 請求項１に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、前記栄養性ストレスが、前記プロデューサー細胞をアスパラギン酸が欠乏している培地中で培養することを包含する、方法。
  3. 請求項１に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、前記栄養性ストレスが、前記プロデューサー細胞をグルタミン酸が欠乏している培地中で培養することを包含する、方法。
  4. 請求項２に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、前記欠乏培地が、１０μｍｏｌ／Ｌ未満のアスパラギン酸を含有する、方法。
  5. 請求項３に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、前記欠乏培地が、２μｍｏｌ／Ｌ未満のグルタミン酸を含有する、方法。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、ＡＡＶ粒子を含む画分をヘパリン硫酸クロマトグラフィーに供する工程を包含する、方法。
  7. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の集団を生成する方法であって、以下の工程：
    ａ）以下を含むＡＡＶプロデューサー細胞を提供する工程：
    （ｉ）１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子であって、ここで該ＡＡＶパッケージング遺伝子の各々が、ＡＡＶ複製またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子；
    （ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）プロベクター；および
    （ｉｉｉ）ＡＡＶのヘルパーウイルス；
    ｂ）工程ａ）で提供されるプロデューサー細胞を、ＡＡＶの複製が可能な条件下でインキュベートする工程であって、該ＡＡＶプロデューサー細胞において致死量未満のストレスを誘導することを含み、ここで、致死量未満のストレスが、プロデューサー細胞を１つ以上のアミノ酸が欠乏している培地中で培養することを包含する、栄養性ストレスおよびｐＨを８．０まで上げることを包含する、ｐＨストレスからなる群から選択される、工程；
    ｃ）工程ｂ）のインキュベーションの後に該プロデューサー細胞を溶解して、ＡＡＶプロデューサー細胞溶解物を生成する工程；ならびに
    ｄ）該ＡＡＶプロデューサー細胞溶解物を精製して、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の集団を生成する工程、
    を包含する、方法。
  8. 請求項７に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、前記精製する工程ｄ）が、工程ｃ）のＡＡＶプロデューサー細胞溶解物を、正に荷電した陰イオン交換樹脂上でクロマトグラフィーにかけ、続いて接線流濾過によりｒＡＡＶベクター粒子の精製された集団を生成する工程を含む、方法。
  9. 請求項７に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、前記ｒＡＡＶプロベクターが、２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む、方法。
  10. 請求項７に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、前記ＡＡＶプロデューサー細胞が、該ＡＡＶプロデューサー細胞のゲノムに安定に組み込まれている少なくとも１つのＡＶＶパッケージング遺伝子を含む、方法。
  11. 請求項７に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、前記ＡＡＶプロデューサー細胞が、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含む、方法。
  12. 請求項７に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であって、前記ヘルパーウイルスがアデノウイルスである、方法。
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