JP5798294B2

JP5798294B2 - コラーゲンゲル収縮剤

Info

Publication number: JP5798294B2
Application number: JP2010014046A
Authority: JP
Inventors: 金　辰也; 辰也金; 伸夫魚津; 大川越; 優落合
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2009-08-03
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2030-01-26
Also published as: JP2011051967A

Description

本発明は、コラーゲンゲル収縮剤に関する。

近年、真皮組織モデルとして、コラーゲンゲルが、薬剤評価に利用されている。前記コラーゲンゲルは、コラーゲン液に線維芽細胞を懸濁し、前記線維芽細胞の培養条件下でゲル化させたものである。前記線維芽細胞は、前記コラーゲンゲル内で三次元的に培養され、その形状は、単層培養と異なり、生体内と類似の二極化した紡錘状となる。また、前記コラーゲンは、ゲル化によりコラーゲン繊維が再配列し、真皮組織に似た構造となる。前記コラーゲンゲルは、ｉｎｖｉｖｏ試験との相関性が高く、また、再現性が高いことから、細胞毒性試験、ｉｎｖｉｔｒｏ眼刺激性試験に用いられ、近年は、皮膚の弾力性、たるみ、ハリ、しわ改善評価モデル（例えば、特許文献１）や、創傷治癒促進（例えば、特許文献２）または創収縮の評価モデル（例えば、特許文献３）としても、用いられている。

特開２００３−１７６２０８号公報特開２００１−０６４１９６号公報特開２００４−３５５２６号公報

本発明の目的は、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させる、コラーゲンゲル収縮剤を提供する。創傷治癒促進や収縮の評価モデルなどに利用可能である。

リンゴ抽出物に着目して、試験した結果コラーゲン収縮能があることを知見し、さらにコラーゲントリペプチドとの併用によってコラーゲン収縮を増強できることを見出して、本発明に至った。更に、研究を進めた結果、リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチドとの併用によって、シワ形成抑制機能、ＤＮＡ損傷抑制機能、角質層水分量保持機能、表皮肥厚抑制機能があることを知見した。
１．コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるコラーゲンゲル収縮剤であって、リンゴ由来のポリフェノール及び平均分子量が４００以下のコラーゲントリペプチドを含有するコラーゲン収縮剤を有効成分とする紫外線被爆によるシワ形成抑制用経口剤。
２．コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるコラーゲンゲル収縮剤であって、リンゴ由来のポリフェノール及び平均分子量が４００以下のコラーゲントリペプチドを含有するコラーゲン収縮剤を有効成分とする紫外線被曝による角質層水分量の減少を抑制する角質層水分量保持用経口剤。
３．コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるコラーゲンゲル収縮剤であって、リンゴ由来のポリフェノール及び平均分子量が４００以下のコラーゲントリペプチドを含有するコラーゲン収縮剤を有効成分とする紫外線被曝による表皮肥厚抑制用経口剤。

本発明のコラーゲンゲル収縮剤は、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させることができる。リンゴポリフェノールとコラーゲントリペプチドを併用することにより、低濃度領域でコラーゲンゲルを収縮する機能が顕著に向上することが認められた。更に、リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチドを併用することにより、シワ形成抑制、ＤＮＡ損傷抑制、角質層水分量保持、表皮肥厚抑制に効果があることが認められた。これらの機能は、特に、日光などに含まれる紫外線被曝を原因とする障害に対して、有効な効果である。

リンゴポリフェノール添加による評価サンプルのコラーゲンゲル収縮率の結果を示すグラフ。コラーゲントリペプチド添加による評価サンプルのコラーゲンゲル収縮率の結果を示すグラフ。リンゴポリフェノールとコラーゲントリペプチド併用による評価サンプルのコラーゲンゲル収縮率の結果を示すグラフ。シワ体積率を示すグラフ。経皮水分蒸散量 TEWLを示すグラフ。角質層水分量 SC hydrationを示すグラフ。表皮厚を示すグラフ。 DNA傷害（8-OH dG）を示すグラフ。 PCNA（細胞増殖マーカー）を示すグラフ。皮膚ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を示すグラフ。

本発明者は、先にリンゴ抽出物に、コラーゲンゲル収縮作用があることを知見し、リンゴ抽出物を有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤に関する特許出願（特願２００９−８３８１８号）を行った。本発明者は、さらに、リンゴ抽出物のコラーゲンゲル収縮作用について探求を続けた結果、コラーゲントリペプチドを併用することにより、飛躍的にコラーゲンゲル収縮作用が増強されることを見出した。本発明のコラーゲンゲル収縮剤は、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させる、コラーゲンゲル収縮剤である。また、リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチドとの併用成分を有効成分とする、シワ形成抑制剤、ＤＮＡ損傷抑制剤、角質層水分量保持剤、表皮肥厚抑制剤である。
本発明のコラーゲンゲル収縮剤は、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させる。コラーゲンゲルの収縮とは、例えば、ゲルの大きさが小さくなることをいう。コラーゲンゲルの大きさの指標としては、特に制限されないが、例えば、コラーゲンゲルの直径、表面積、体積などが挙げられる。
また、リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチドとの併用成分は、シワ形成抑制、ＤＮＡ損傷抑制、角質層水分量保持、表皮肥厚抑制としても有効成分となる。特に、日光などに含まれる紫外線被曝を原因とするシワ形成、ＤＮＡ損傷、角質層水分量減少、表皮肥厚などの障害に対して抑制作用として有効に機能する。

＜コラーゲンゲル＞
本発明において、コラーゲンゲルは、収縮可能な形状であれば良く、ゲル状以外に、例えば、固形状であっても良い。
コラーゲンゲルに含まれるコラーゲンの種類は、特に制限されず、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型コラーゲンなどが挙げられ、好ましくは、Ｉ型コラーゲンである。また、コラーゲンは、例えば、コラーゲンを加工処理したものであっても良い。加工処理としては、特に制限されないが、例えば、熱処理、酵素処理などが挙げられる。熱処理したコラーゲンとしては、例えば、ゼラチンなどが挙げられ、酵素処理したコラーゲンとしては、例えば、アテロコラーゲン、コラーゲンペプチドなどが挙げられる。コラーゲンゲル中の前記コラーゲン濃度は、特に制限されず、例えば、形状などに応じて、適宜設定可能である。
コラーゲンゲルにおいて、線維芽細胞の由来組織は、特に制限されず、例えば、皮膚、肺、心臓などが挙げられ、好ましくは、皮膚である。線維芽細胞の由来種は、特に制限されず、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウサギ、ラット、マウスなどがあげられ、好ましくは、ヒトである。コラーゲンゲル中の線維芽細胞の細胞密度は、特に制限されず、適宜設定可能である。
コラーゲンゲルは、例えば、コラーゲンおよび線維芽細胞以外のその他成分を含んでも良い。その他成分としては、特に制限されず、例えば、培養液、血清などが挙げられる。

＜リンゴ抽出物＞
リンゴ抽出物が、リンゴ果実の抽出物であるのが好ましい。特に、リンゴ幼果抽出物に含まれるポリフェノールを主成分とすることが好ましい。
リンゴ抽出物には、ポリフェノール、有機酸、アミノ酸などを含むことが知られている。
リンゴ抽出物は、血管機能改善作用を高めることが可能なBNP調節剤として抽出物を有効成分として含有してなるBNP調節剤、血行促進剤（特開２００７−００８８３７号公報、特開２００６−２６５２２０号公報）や飲料（特開２００４−３０５０８７号公報）、化粧料配合剤（特開２００１−１８７７２４号公報）、消臭剤成分（特開平１１−３１９０５１号公報）、香料成分（特開平０８−０２３９３９号公報）などに用いられることが知られている。
しかしながら、リンゴ抽出物およびリンゴ由来のポリフェノールについて、コラーゲンゲル収縮効果は、未だ報告されていない。

リンゴ抽出物において、リンゴ（Ｍａｌｕｓｐｕｍｉｌａ）の品種は、例えば、ふじ、国光、王林、紅玉、ジョナゴールド、デリシャス、さんさ、千秋などが挙げられ、特に制限されない。リンゴの抽出部位は、特に制限されず、例えば、果実、葉、幹、花などが挙げられ、好ましくは、果実である。前記果実は、例えば、未熟果（幼果）でも良く、完熟果でも良く、特に制限されない。抽出に用いる前記果実の部位は、特に制限されず、例えば、全果、果肉、果皮、種などが挙げられる。リンゴ抽出物は、これらの部位を、単独で、または２種以上組み合わせて抽出しても良い。

リンゴ抽出物を抽出する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。抽出方法の具体例としては、例えば、以下のようであっても良い。まず、リンゴの全果を、水洗後、グラインダーなどにより粉砕する。この粉砕物を、ペクチナーゼ処理に供し、遠心分離後、抽出溶媒により分配ろ過して、リンゴ抽出物を調製しても良い。前記ペクチナーゼ処理としては、特に制限されないが、例えば、２０〜６０℃の温度条件化で、ペクチナーゼを１０〜５０ppm添加して行っても良い。抽出溶媒としては、特に制限されないが、例えば、ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒が挙げられる。

リンゴ抽出物は、例えば、市販のリンゴ抽出物を用いても良く、リンゴ果実から抽出して調製しても良く、特に制限されない。
コラーゲンゲル収縮剤中に含まれるリンゴ抽出物含量は、特に制限されないが、例えば、０．００１〜９９重量％、好ましくは、０．００１〜５重量％である。コラーゲンやゼラチンとの併用によって、コラーゲンゲル収縮能が飛躍的に向上するので、０．０１以下で十分である。コラーゲンゲル収縮剤は、リンゴ由来のポリフェノールを含むリンゴ抽出物が好ましい。

ポリフェノールの分画方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。ポリフェノールは、例えば、リンゴ抽出物をカラムに通液後、カラムの吸着物を溶出し、この溶出画分を減圧留去濃縮して分画しても良い。また、さらに、この濃縮液に粉末助剤を添加し、凍結乾燥または噴霧乾燥して、ポリフェノール粉末を調製しても良い。
ポリフェノールは、例えば、市販のリンゴ由来のポリフェノール含有物を用いても良く、リンゴ果実から抽出および分画して調製しても良く、特に制限されない。本発明のコラーゲンゲル収縮剤中に含まれる前記ポリフェノール含量は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜９９重量％、好ましくは、０．１〜５０重量％である。

＜コラーゲントリペプチド＞
リンゴ抽出物を併用するコラーゲントリペプチドは、平均分子量が４００以下のものを含有するトリペプチドであり、通常一般のコラーゲンと称するものとは区別されるものである。さらに詳しくは、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であるペプタイドが好ましく、特に好ましくはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのものである。本発明のコラーゲントリペプチドは、豚などの動物由来、魚由来いずれも使用可能である。
本発明のコラーゲントリペプチドは、主にコラーゲンを加水分解して製造することができる。コラーゲン加水分解物は、既に市販されているが、これらの酵素的に加水分解されたコラーゲンの多くは、分子量の分布範囲が二千から八万である。これらの加水分解物は水に対する分散性の向上を目的とするものである。
これに対して本発明のコラーゲン加水分解物は、特定の有効成分として分子量で
約４００以下のペプタイドを含むことを特徴とする。
添加量は、０．０１％以上が好ましい。本試験系の試験ではコラーゲンゲルの収縮は８０％程度が上限と想定されるので、コラーゲンゲルの収縮が７０％程度以上は、添加濃度を増やしても増加効果は小さい。したがって、マイナスとなることは無いと言う意味では、上限は無いが、実質的には１．０％程度が上限となる。

〔試験例１〕
＜リンゴ抽出物に関するコラーゲンゲル収縮作用試験＞
この試験では、コラーゲンゲル収縮剤として、リンゴ抽出物（商品名：アップルフェノンＳＨ；アサヒフードアンドヘルスケア社製）を用い、以下のように、コラーゲンゲル収縮作用を測定した。
［材料］
（１）アテロコラーゲン（商品名：AteloCell、アテロコラーゲン（牛真皮由来）５mg/ml（２）DMEM（粉末）（商品名：ダルベッコ変法イーグル培地(2)、日水）
（３）ＤＭＥＭ（液体）（商品名；Ｇｉｂｃｏ）
［評価検体］
（１）リンゴ抽出物（リンゴポリフェノール）
商品名：アップルフェノンSH（アサヒフードアンドヘルスケア（株）製）
規格；全ポリフェノール量９８％以上（ＵＶ法）

［試験方法］
予め継代培養した皮膚線維芽細胞（新生児由来）を細胞懸濁液（６×１０⁵cells/ml 溶媒１０％FBS含有DMEM）として調整した。氷冷中でアテロコラーゲン（５mg/ml）４ml、３倍濃度DMEM（D-Glc1.2M及びアップルフェノンＳＨ０．０３％含有）２ml、FBS（牛血清）０．６７ml、１０％FBS含有DMEM ３．３４ml及び細胞懸濁液２mlを混合し、平底１２ウェルプレートに１mlずつ添加した。３７℃５％CO₂インキューベーターで培養し、５時間後にアテロコラーゲンが再線維化することでゲル化することを認めた。
添加から６時間後に滅菌したスパチュラの柄を用いてゲルをウェルプレートから剥がした後、１０％FBS含有DMEM溶液（アップルフェノン含有）１mlを添加して、再び３７℃５％CO₂インキューベーターで７日間培養した。
培養液は１日おきに評価薬剤を任意の濃度に溶解させた１０％FBS含有DMEM溶液１ｍｌを培地交換した。培養終了後、培養液を完全に除去しPBSで洗浄後、１０％中性ホルマリン溶液（Wako）で２４時間浸潤しゲルを固定した。
その後、１％（ｗ／ｖ）Triton−X溶液に置換して、ゲル直径の計測を行った。
リンゴ抽出物（リンゴポリフェノール）は、ゲル形成後に添加した場合と、ゲル内包時に添加した場合の試験を行った。添加量は表１に記載したとおりである。

表１に記載の添加濃度Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４の添加濃度はゲル形成後に添加する10％FBS含有DMEM溶液１ml中にリンゴ抽出物を添加させた数値を示している。
また、表１に記載の添加濃度Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３はゲル内包時にリンゴ抽出物を添加したゲル容量１ml中の添加濃度を示している。すなわちゲル１mlを組成する各試料の容量は（１）アテロコラーゲン333.3μl、（２）1.2ＭＤ−グルコース含有３倍濃度DMEM166.7μl、（３）FBS（牛血清）55.8μl、（４）10％FBS含有DMEM277.5μl、（５）細胞懸濁液166.7μlから構成されており、評価検体のリンゴ抽出物は（２）３倍濃度DMEMの溶媒に対して、0.3％の濃度で調整したリンゴ抽出物含有1.2ＭＤ−グルコース含有３倍濃度DMEM溶液はゲル添加濃度として0.3％×（166.7μl／ゲル容量１ml）＝0.05％のＢ１に示した添加濃度となる。同様に、Ｂ２およびＢ３の添加濃度はそれぞれ0.1％および0.03％のリンゴ抽出物含有1.2ＭＤ−グルコース含有3倍濃度DMEM溶液をそれぞれ調整してゲル内包時に添加したことで、それぞれＢ２→0.0167％、Ｂ３→0.005％の添加濃度としてコラーゲンゲル収縮率を求めた。

［ゲル直径の計測およびゲル面積の算出］
ゲルの形状はウェルプレートと同様に真円状になることを利用してゲル面積を算出した。
上記処理方法によって調整したゲルを２方向について直径を計測し、２直線の平均値を算出した。そのゲル直径の平均値からゲル半径が算出され、ゲル面積は次の式で算出することができる。

ゲル面積＝（ゲル半径 cm）×（ゲル半径 cm）×円周率

薬剤未処理のコラーゲンゲルのゲル面積に対する薬剤処理時のコラーゲンゲルのゲル面積の面積比からコラーゲンゲル収縮率（％）を算出した。

コラーゲンゲル収縮率（％）＝１００×{（薬剤未処理のゲル面積）−（薬剤処理時のゲル面積）}／（薬剤未処理のゲル面積）

一つのデータについてn=3ウェルで評価し、平均±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）でグラフ表記した。

[試験結果]
表１及び図１に、リンゴ抽出物単独添加の試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。
リンゴ抽出物をゲル形成後に添加した場合もゲル内包時に添加した時もいずれの場合もコラーゲンゲル収縮能が濃度依存的に認められた。そして、0.005％(w/v)添加時のゲル収縮能はそれぞれ15.2±6.9％、16.3±6.5％で非常に近い値を示した。

〔試験例２〕
＜コラーゲントリペプチドに関するコラーゲンゲル収縮作用試験＞
この試験では、コラーゲンゲル収縮剤として、コラーゲントリペプチドを用い、以下のように、コラーゲンゲル収縮作用を測定した。
［材料］
（１）アテロコラーゲン（商品名：AteloCell、アテロコラーゲン（牛真皮由来）５mg/ml
（２）DMEM（粉末）（商品名：ダルベッコ変法イーグル培地(2)、日水）
（３）ＤＭＥＭ（液体）（商品名；Ｇｉｂｃｏ）
［評価検体］
（２）コラーゲントリペプチド
商品名：ＨＡＣＰ-01（ゼライス株式会社製）
規格；トリペプチド（Ｇ−Ｘ−Ｙ；Ｘ、Ｙは任意のアミノ酸）を15％以上含有

［試験方法］
予め継代培養した皮膚線維芽細胞（新生児由来）を細胞懸濁液（６×10⁵cells/ml 溶媒10％FBS含有DMEM）として調整した。氷冷中でアテロコラーゲン（５mg/ml）４ml、３倍濃度DMEM（D-Glc1.2M、およびＨＡＣＰ−０１含有）２ml、FBS（牛血清）0.67ml、10％FBS含有DMEM 3.33ml及び細胞懸濁液２mlを混合し、平底12ウェルプレートに１mlずつ添加した。37℃５％CO₂インキューベーターで培養し、５時間後にアテロコラーゲンが再線維化することでゲル化することを認めた。
添加から６時間後に滅菌したスパチュラの柄を用いてゲルをウェルプレートから剥がした後、10％FBS含有DMEM溶液１ml（１．０％、０．５％、０．１％ＨＡＣＰ−０１含有）を添加して、再び37℃５％CO₂インキューベーターで７日間培養した。
培養液は１日おきに評価薬剤を任意の濃度に溶解させた10％FBS含有DMEM溶液１mlを培地交換した。培養終了後、培養液を完全に除去しPBSで洗浄後、10％中性ホルマリン溶液（Wako）で24時間浸潤しゲルを固定した。
その後、１％（ｗ／ｖ）Triton−X溶液に置換して、ゲル直径の計測を行った。
コラーゲントリペプチドは、ゲル形成後に添加した場合と、ゲル内包時に添加した場合の試験を行った。添加量は表２に記載したとおりである。

表２に記載の添加濃度Ａ１、Ａ２、Ａ３の添加濃度はゲル形成後に添加する10％FBS含有DMEM溶液１ml中にコラーゲントリペプチドを添加させた数値を示している。
また、表２に記載の添加濃度Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３はゲル内包時にコラーゲントリペプチドを添加したゲル容量１ml中の濃度を示している。すなわちゲル１mlを組成する各試料の容量は（１）アテロコラーゲン333.3μl、（２）1.2ＭＤ−グルコース含有３倍濃度DMEM166.7μl、（３）FBS（牛血清）55.8μl、（４）10％FBS含有DMEM277.5μl、（５）細胞懸濁液166.7μlから構成されており、評価検体のコラーゲントリペプチドは（２）３倍濃度DMEMの溶媒に対して、6.0％の濃度で調整したコラーゲントリペプチド含有1.2ＭＤ−グルコース含有３倍濃度DMEM溶液はゲル添加濃度として６．０％×（１６６．７μl／ゲル容量１ml）＝１．０％のＢ１に示した添加濃度となる。同様に、Ｂ２およびＢ３の添加濃度はそれぞれ３．０％および０．６％のコラーゲントリペプチド含有1.2ＭＤ−グルコース含有３倍濃度DMEM溶液をそれぞれ調整してゲル内包時に添加したことで、それぞれＢ２→０．５％、Ｂ３→０．１％の添加濃度としてコラーゲンゲル収縮率を求めた。

［ゲル直径の計測およびゲル面積の算出］
ゲルの形状はウェルプレートと同様に真円状になることを利用してゲル面積を算出した。図４に示すコラーゲンゲル収縮剤のコラーゲンゲル収縮状態を示した図を参照。
上記処理方法によって調整したゲルを２方向について直径を計測し、２直線の平均値を算出した。そのゲル直径の平均値からゲル半径が算出され、ゲル面積は次の式で算出することができる。

ゲル面積＝（ゲル半径 cm）×（ゲル半径 cm）×円周率

薬剤未処理のコラーゲンゲルのゲル面積に対する薬剤処理時のコラーゲンゲルのゲル面積の面積比からコラーゲンゲル収縮率（％）を算出した。

コラーゲンゲル収縮率（％）＝１００×{（薬剤未処理のゲル面積）−（薬剤処理時のゲル面積）}／（薬剤未処理のゲル面積）

一つのデータについてn=３ウェルで評価し、平均±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）でグラフ表記した。

[試験結果]
表２及び図２に、コラーゲントリペプチド単独添加の試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。
コラーゲントリペプチドをゲル形成後に添加した場合もゲル内包時に添加した時もいずれの場合もコラーゲンゲル収縮能が濃度依存的に認められた。そして、0.1％(w/v)添加時のゲル収縮能はそれぞれ20.1±1.0％、24.2±15.5％で非常に近い値を示した。

［リンゴポリフェノール、コラーゲントリペプチド併用例］
リンゴポリフェノールとコラーゲントリペプチド併用試験を前記試験方法と同様に行った。リンゴポリフェノールをゲル内包時に添加し、ゲル形成後にコラーゲントリペプチドを添加した。その結果を表３、図３に示す。
リンゴポリフェノールとしてアップルフェノンＳＨを用い、コラーゲントリペプチドとして分子量約400の豚由来コラーゲントリペプチド(製品名：ＨＡＣＰ-01 ゼライス株式会社製)を用いた。

試験例１は、リンゴ抽出物であるアップルフェノンＳＨを0.005％添加した例である。試験例２はコラーゲントリペプチドであるＨＡＣＰ-01を0.1％添加した例である。
実施例１は、試験例１と試験例２を併用した例である。
実施例１は、想定される相加効果である参考に比べても顕著な効果を発揮することが分かる。
この結果、実施例1は、いずれも単独使用よりも格段にコラーゲンゲルを収縮させる作用を果たすことが確認された。また、単純に想定される相加数字である参考と比較しても顕著な効果を示し、これは、予想し得ない効果である。

[光老化抑制試験]
前記試験において、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるin vitroの試験系を用いて、リンゴ抽出物及びコラーゲントリペプチド併用することによりコラーゲンゲル収縮を相乗的に促進させる事を確認した。
長期間太陽（紫外線）に当たり続けると、顔、首筋の深いシワを増加させ、更に皮膚の乾燥及び肌荒れやシミ、ソバカス等の色素沈着を起こすことが知られており、この光老化による肌のトラブル対策として、新たに知見したリンゴ抽出物及びコラーゲントリペプチド併用が有するコラーゲン収縮能の活用試験を行った。すなわち、皮膚老化や皮膚の光老化現象を緩和、予防、抑制、改善する成分として、ポリフェノールを主成分とするリンゴ抽出物に着目して、試験を行った。

＜試験方法＞
ＵＶＡ波およびＵＶＢ波をヘアレスマウスに照射させてシワを形成させる試験系において被験物質であるそれぞれの食品原料を経口摂取させてシワの抑制および皮膚老化抑制効果について検討を行った。
試験開始時６週齢のヘアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ−１雌）を用いて以下の１）〜１１）の条件・方法で試験を行った。

１）試験対象物の調製および投与
ヘアレスマウスの群分けは投与開始日に、一般状態が良好な動物を体重により、群間での差が無いように１群６匹に振り分けた。なお、試験群５の「２者併用混餌」の群についてはｎ＝５で評価し、各群の個体は１ゲージ/群で飼育とした。
マウス用飼料ＭＦ（オリエンタルバイオサービス製）に、表４に示すそれぞれ被験物質が均一混ざるように混合処理を施し、混餌にて自由摂取させた。投与群の一覧を示す。混餌は動物搬入直後から解剖１８時間前まで実施した。

（１）リンゴ抽出物として、ポマクティブＨＦＶ（フランスのヴァル・デ・ヴィル・バイオアクティブズ社（ＶＶＢ社）製（日本代理店ユニテックフーズ））を用いた。ポマクティブＨＦＶは、フランス産シードル用リンゴを原料にしたリンゴポリフェノール製品。規格成分は全ポリフェノール９０％以上（ＵＶ法で算出）である。プロシアニジン、ケルセチン（配糖体）、フロリジン、カテキン類を主成分とする。
（２）コラーゲントリペプチド原料としてＨＡＣＰ−０１を用いた。
ＨＡＣＰ−０１（コラーゲントリペプチド原料）は、豚由来のコラーゲンを原料とし、ゼライス社が製造販売しているコラーゲントリペプチドである。
このコラーゲントリペプチドは、平均分子量が４００以下のものを含有するトリペプチドであり、通常一般のコラーゲンと称するものとは区別されるものである。さらに詳しくは、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であるペプタイドが好ましく、特に好ましくはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのものである。
コラーゲンペプチドは、豚などの動物由来、魚由来いずれも使用可能である。コラーゲントリペプチドは、主にコラーゲンを加水分解して製造することができる。コラーゲン加水分解物は、既に市販されているが、これらの酵素的に加水分解されたコラーゲンの多くは、分子量の分布範囲が２千から８万である。これらの加水分解物は水に対する分散性の向上を目的とするものである。
これに対してゼライス製のコラーゲン加水分解物ＨＡＣＰ−０１は、特定の有効成分として分子量で約４００以下のペプタイドを含むことを特徴とする。

２）ＵＶ照射（表４；試験概要）
ＵＶ照射時は、動物を専用のケージに移し、１群ずつＵＶＢ２０ｍＪ／ｃｍ^２およびＵＶＡ１０Ｊ／ｃｍ^２を照射した。照射は週三回の月曜、水曜、金曜で１０週間実施した。

３）経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の測定
経皮水分蒸散量の測定は、ｖａｐｏｍｅｔｅｒ（キーストンサイエンティフィック製）を用い、背部の尾付け根より首に向かい２ｃｍ、腰椎から右側に０.５ｃｍ部位に端末をあてて測定した。測定日は、試験開始日に実施し各群のＴＥＷＬ値にバラつきが無い事を確認し、その後、解剖直前に測定した。

４）角質層水分量の測定
角質層水分量の測定は、ＭｏｉｓｔｕｒｅＣｈｅｃｋｅｒＭＹ−８０８Ｓ（SCALAR 製）を用い、背部の尾付け根より首に向かい２ｃｍ、腰椎から右側に０.５ｃｍ部位に端末をあてて測定した。

５）解剖
各群、本飼育期間終了翌日より１８時間絶食後、氷冷したＡｖｅｒｔｉｎ（２，２，２−トリブロモエタノール）を０．５ｍｇ／ｋｇ体重腹腔内投与により麻酔を導入した。その後、皮膚背部の尾付け根より首に向かい２ｃｍ、腰椎から右側に０.５ｃｍ部位範囲で反射型レプリカ（（有）アサヒバイオメッド製）を採取した。その後、回腹し解剖を行った。皮膚組織は１０％中性ホルマリン浸潤、パラフィン包埋後にヘマトキシリン−エオシン染色した。

６）皮膚形態観察およびシワ体積率計測
皮膚表面部の写真撮影と採取したレプリカの判定を行った。シワ形成度合を指標としてＡＳＡ−０３ＲＸＤ（（有）アサヒバイオメッド製）を用いてシワ体積率％(μｍ^３／ｍｍ^２／１００) を算出した。

７）表皮肥厚
「５）解剖」の項で実施した皮膚組織のヘマトキシリン−エオシン染色により、表皮の厚さを計測した。同一染色画像５００μｍ中から任意に６箇所を選択し、それぞれの場所における表皮の厚さを計測し、その６点の平均値をその個体の表皮の厚さとした。

８）８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）測定
免疫組織染色によりＤＮＡ損傷のバイオマーカーである８−ＯＨｄＧの測定を表皮細胞に着目して実施した。
「５）解剖」の項で用意したパラフィン包埋済みの皮膚組織を５μｍ厚で切片を適宜作製し、脱パラフィン、親水化は公知の方法に基づいて実施した。抗原賦活化は０．０１Ｍクエン酸緩衝液（pＨ６．０）沸騰中でマイクロウェーブ処理５分を実施した。室温まで冷却後、常温下０.３％過酸化水素含有メタノールで30分反応させて内因性ペルオキシダーゼを阻害した。水洗、１０ｍＭＰＢＳ（−）洗浄後、ウサギ血清７５倍（希釈溶液はＰＢＳ（−））で３０分間室温放置してブロッキング反応を行った。血清をスライドガラスから落として１次抗体（Ｎ４５．１：日研ザイル(株)製）を５μｇ／ｍｌで４℃１晩放置して１次抗体を反応させた。ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ビオチン化二次抗体（ビオチン化ウサギ免疫グロブリンＭ；ＤＡＫＯ製）を３００倍希釈したものを３０分間室温にて２次抗体を反応させた。ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＡＢＣ試薬（ＡＢＣ−ＨＲＰ；Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ製）を３０分間室温にて反応させた。発色試薬としてＤＡＢ（３,３-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド：ＤＡＫＯ製）を用いて３分３０秒常温下で反応させた。水洗後、公知の方法に基づいて脱水、封入処理を行った。顕微鏡下で皮膚組織の染色状況を観察し、以下の基準に基づいてスコア化した。スコア化の判別が困難なものはその中間値０．５を足し、各群のスコアを算出した。

スコア
×；スコア3；表皮細胞よりも上層の細胞核が何層にも染色
△；スコア2；表皮細胞よりも上層の細胞核が染色
○；スコア1；表皮細胞の細胞核が染色
◎；スコア0; 表皮細胞の細胞核が点在する程度の染色

９）ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＣｅｌｌＮｕｃｌｅａｒＡｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ；増殖細胞核抗原）測定
ＰＣＮＡは細胞周期の細胞成長期後期からＤＮＡ合成期初期で発現が認められる核タンパク質であり、ＤＮＡ損傷時にＤＮＡポリメラーゼやＲＦＣ（複製因子Ｃ；クランプ装着因子）と複合体を形成し、新しくＤＮＡを合成・修復する。しかしながら、微弱な紫外線の連続照射といった常時ＰＣＮＡが発現している環境においては細胞周期が異常になり、引き続いて細胞増殖が過剰となり表皮細胞のターンオーバーが亢進して、角化不全や表皮肥厚を招き、最終的には光老化現象を引き起こすと考えられる。
免疫組織染色により細胞増殖のバイオマーカーであるＰＣＮＡの測定を表皮細胞に着目して実施した。
「５）解剖」の項で用意したパラフィン包埋済みの皮膚組織を５μｍ厚で切片を適宜作製し、脱パラフィン、親水化は公知の方法に基づいて実施した。抗原賦活化は０．０１Ｍクエン酸緩衝液（pＨ６．０）沸騰中でマイクロウェーブ処理５分間を実施した。室温まで冷却後、常温下０.３％過酸化水素含有メタノールで30分反応させて内因性ペルオキシダーゼを阻害した。水洗、ＰＢＳ（−）洗浄後、ウサギ血清７５倍（希釈溶液はＰＢＳ（−））で３０分間室温放置してブロッキング反応を行った。血清をスライドガラスから落として１次抗体（ＰＣ−１０：ＳａｎｔａＣｒｕｚ製）を１μｇ／ｍｌで４℃１晩放置して１次抗体を反応させた。ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ビオチン化二次抗体（ビオチン化ウサギ免疫グロブリンＭ；ＤＡＫＯ製）を３００倍希釈したものを３０分間室温にて２次抗体を反応させた。ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＡＢＣ試薬（ＡＢＣ−ＨＲＰ；Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ製）を３０分間室温にて反応させた。発色試薬としてＤＡＢ（３,３-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド：ＤＡＫＯ製）を用いて３分３０秒常温下で反応させた。水洗後、公知の方法に基づいて脱水、封入処理を行った。顕微鏡下で皮膚組織の染色状況を観察し、以下の基準に基づいてスコア化した。スコア化の判別が困難なものはその中間値０．５を足し、各群のスコアを算出した。

１０）皮膚ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）
皮膚タンパク質を塩酸加水分解し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりヒドロキシプロリン量を測定した。
「５）解剖」の項で凍結保存しておいたマウス皮膚からコラーゲン測定用に１０ｍｇを切り出した。その皮膚片を鋏で細かく切りスクリューキャップ付の試験管に入れた後、６Ｎ塩酸１ｍｌを加え、１１０℃で２４時間酸加水分解した。反応溶液をＭｉｌｌｉＱ水で５０倍に希釈した後に、フィルターろ過（φ＝０．４５mｍ）し、更に、ＭｉｌｌｉＱ水で１００倍希釈したものをヒドロキシプロリン測定用のサンプルとした。
ヒドロキシプロリンはＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムのＡＣＱＵＩＴＹ^(R) ＴＱＤ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して測定した。
ＬＣ条件
・カラムＨＳＳＴ３２．１Ｘ１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）
・流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度５０℃
・移動相Ａ:０．１％ギ酸
Ｂ:０．１％ギ酸、８０％アセトニトリル
・グラジエント

ＭＳ／ＭＳ条件
・イオン化ＥＳＩ＋（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）
・キャピラリー電圧０．５ｋＶ
・脱溶媒ガス１，０００Ｌ／Ｈｒ
・コーンガス５０Ｌ／Ｈｒ
・イオン源ヒーター１５０℃
・モニターＭＲＭ
・プリカーサーイオン（ｍ／ｚ）１３２．１６
・プロダクトイオン（ｍ／ｚ）８６．１
・Ｄｗｅｌｌ時間（秒）０．０５
・コーン電圧（Ｖ）２８
・コリジョンエネルギー（ｅＶ）１２
標準品のヒドロキシプロリン（Ｗａｋｏ製）とのピークエリアを比較する事で皮膚コラーゲン中のヒドロキシプロリン量（Ｈｙｐ）を算出した。

１１）統計処理
試験結果は平均値±標準偏差（ｍｅａｎ ± Ｓ.Ｄ.）で表し、多重比較（Ｓｔｅｅｌ’ｓｔｅｓｔ）をエクセル統計２００８の解析ソフトで有意差検定を行った。**⇒ｐ＜０．０１、*⇒ｐ＜０．０５とし、ｐ＜０．１については有意傾向として注意書きした。

＜試験結果＞
以下に、本実施例２の各試験例の結果を順次示す。

１．一般状態観察およびシワ体積率計測
紫外線照射第４週目頃よりＵＶ照射動物において、頭部の皮膚の軽度褐色化や頸部のしわの深さならびに後肢背部のしわがＵＶ非照射動物に比較して目立つようになった。
解剖時の外観観察にでは、ＵＶ照射動物で顔、頸部および後肢背部のしわが明瞭に確認されたが、ＵＶ照射においても２者併用混餌（ポマクティブＨＦＶ０．００６％およびＨＡＣＰ−０１０．５％混餌）したマウスにおいてその症状は軽度であり、２者併用混餌群ではしわの深度が浅く、肉眼的にはしわの程度が皆無であった。また、高濃度摂取動物は、コントロール群に比較して皮膚にしっとり感があった。
表６、図４のシワ体積率のグラフが示すように、紫外線照射により明確なシワの形成が認められ、同一紫外線照射条件下で混餌群では濃度依存的にシワ抑制効果が有意に認められた。一方、リンゴ混餌群およびコラーゲントリペプチド混餌群ではシワの抑制効果は極僅かなものであり、有意差検定により、ＵＶ＋群との有意なシワ体積率の抑制は認められなかった。一方、２者併用混餌群でのみ有意にシワ体積率を抑制した。

２．体重推移
表６に示すように体重推移は、各群大きな差異は認められなかった。

３．摂餌量
表６に示すように摂餌量についても体重推移同様に大きな差異は認められなかった。摂食量は、体重増加が緩慢になった紫外線照射６週間から１０週間における平均値から算出した。この摂取量は、ヒトが無理なく摂取できる量で光老化現象に伴うシワを抑制する事が出来ると考えられる。

４．肝臓重量
肝臓重量についても大きな差異は認められず異常な症状は観察されなかった。また、他の臓器についても異常は認められなかった。

５．経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）
結果を表６に示す。
経皮水分蒸散量はその数値が高いほど、角質層から水分が蒸発し皮膚の乾燥状態を引き起こしていると考えられる。ＵＶ照射により経皮水分蒸散量の上昇が一般的に知られており、本試験でも解剖日の経皮水分蒸散量はＵＶ−群に比較してＵＶ＋群では高くなり乾燥状態を裏付けていた。この時、ＵＶ＋照射およびポマクティブＨＦＶ混餌群は低いＴＥＷＬ値を示した。ＵＶ＋照射群に比較してＵＶ−群、リンゴ混餌群および２者併用群で有意に低いＴＥＷＬ値を示した。コラーゲントリペプチド混餌群では有意傾向（ｐ＝０．０９８７）として低いＴＥＷＬ値を示した。

６．角質層水分量
結果を表７に示す。
角質層水分量はその数値が低いほど、角質層の水分もしくは水分保持に関わる天然保湿因子（ＮａｔｕｒａｌＭｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇＦａｃｔｏｒ；ＮＭＦ）が減少し、皮膚の乾燥状態を引き起こしていると考えられる。ＵＶ照射により角質層水分量が減少すると一般的に知られており、本試験でも解剖日の角質層水分量は［ＵＶ−／コントロール食］群に比較して［ＵＶ＋／コントロール食］群では低くなり乾燥状態を裏付けていた。この時、リンゴ混餌群は角質層水分量の回復を示した。ＵＶ＋照射群に比較してリンゴ混餌群および２者併用群で有意に高い角質水分量を示した。

７．表皮肥厚
結果を表７に示す。
［ＵＶ＋/コントロール食］群に対し、[ＵＶ−/コントロール食]群、コラーゲントリペプチド混餌群および２者併用群で有意な表皮肥厚（アカントーシス）の抑制が証明された。また、０．００６％混餌群では有意傾向（ｐ＝０．０８３１）として表皮肥厚が抑制されていた。

８．８−ＯＨｄＧ
結果を表７に示す。
［ＵＶ＋/コントロール食］群に対し、[ＵＶ−/コントロール食]群、２者併用群で有意に８−ＯＨｄＧを抑制した。一方、リンゴ混餌群では８−ＯＨｄＧを抑制しなかった。また、コラーゲントリペプチド混餌群では有意傾向（ｐ＝０．０５９６）として８−ＯＨｄＧを抑制した。
８−ＯＨｄＧは細胞のＤＮＡ損傷の指標の一つであり、紫外線や放射線、化学汚染物質、タバコ煙など酸化ストレスの暴露によりＤＮＡのグアニンが酸化されて形成する。本試験での紫外線照射によりマウス皮膚の基底細胞層に８−ＯＨｄＧが増加していたのでＤＮＡ損傷が引き起こされた事およびリンゴとコラーゲントリペプチドの２者併用混餌群ではそのＤＮＡ損傷が抑制されていた事を示唆している。

９．ＰＣＮＡ
結果を表７に示す。
［ＵＶ＋/コントロール食］群に対し、[ＵＶ−/コントロール食]群、リンゴ混餌群および２者併用群で有意にＰＣＮＡを抑制した。コラーゲントリペプチド混餌群では有意傾向（ｐ＝０．０６４５）としてＰＣＮＡの発現が抑制された。
ＰＣＮＡは細胞増殖や細胞周期の指標の一つであり、細胞成長期後期〜ＤＮＡ合成期初期で発現増強し、ＤＮＡポリメラーゼや複製因子Ｃ（ＲＦＣ）などと複合体を形成してＤＮＡ損傷部位の切り出しと新たなＤＮＡの合成や修復を行う核タンパク質である。本試験において、紫外線照射で過剰に増加したＤＮＡ傷害を正常状態に修復するためにＰＣＮＡが過剰発現しＤＮＡが過剰に合成され表皮基底細胞の細胞周期異常を招き、引き続き基底細胞の増殖過剰が表皮のターンオーバー異常へとつながり、最終的には表皮の肥厚や皮膚外観のシワを引き起こしたと考えられる。このＰＣＮＡの過剰発現をリンゴとコラーゲントリペプチド２者併用混餌群で有意に抑制した事は、リンゴとコラーゲントリペプチド２者併用により未然に紫外線ダメージを緩和してシワ形成抑制や表皮肥厚抑制へと導いたと示唆される。

１０. 皮膚ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）
結果を表７に示す。
［ＵＶ＋/コントロール食］群に対し、２者併用群で有意傾向（ｐ＝０．０９３８）なＨｙｐの上昇が認められた。Ｈｙｐ上昇は皮膚組織におけるコラーゲン量の増加を示唆している。

上記各動物実験を総括すると、
各試験において、リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチドとの２者併用が効果を発揮することが確認できた。
特に、シワ体積率、８−ＯＨｄＧの２項目が紫外線照射条件においても２者併用群でのみ有意に抑制することが確認され、リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチドとの２者併用効果を発揮した。
その他、ＴＥＷＬ、角質層水分量、表皮厚においても２者併用群で有意に紫外線ダメージの影響を緩和・抑制しており、皮膚組織中のＨｙｐも２者併用群でのみ有意傾向として上昇を示した事も２者併用の有用性を示唆している。
本出願人は、添加量を変えてポマクティブＨＦＶのみを混餌した試験を本試験同内容について別途行った。添加量は０．００６重量％、０．０１２重量％、０．０６０重量％の３種類とした。この試験結果、濃度依存的に作用効果を発揮することが確認されている。例えば、シワ体積率を参考に示すと、それぞれの添加量応じて、３１．１％、１３．４％、９．０％である。コントロール食のＵＶ有無の結果は、本試験例と同じである。本試験例では、リンゴ抽出物０．００６重量％とコラーゲントリペプチド０．５重量％との２者併用は、１２．０％のシワ体積率を示していることは、低濃度添加において、顕著なシワ形成抑制能を発揮することが確認できる。このように、リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチドとの２者併用は、低濃度でも顕著な相乗作用を発揮する。

Claims

コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるコラーゲンゲル収縮剤であって、リンゴ由来のポリフェノール及び平均分子量が４００以下のコラーゲントリペプチドを含有するコラーゲン収縮剤を有効成分とする紫外線被爆によるシワ形成抑制用経口剤。
コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるコラーゲンゲル収縮剤であって、リンゴ由来のポリフェノール及び平均分子量が４００以下のコラーゲントリペプチドを含有するコラーゲン収縮剤を有効成分とする紫外線被曝による角質層水分量の減少を抑制する角質層水分量保持用経口剤。
コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるコラーゲンゲル収縮剤であって、リンゴ由来のポリフェノール及び平均分子量が４００以下のコラーゲントリペプチドを含有するコラーゲン収縮剤を有効成分とする紫外線被曝による表皮肥厚抑制用経口剤。